JP2004510780A - 可変突出部位を含むオリゴヌクレオチドリンカー及び前記リンカーを用いたポリヌクレオチドライブラリーの調製方法 - Google Patents
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Abstract
オリゴヌクレオチド定常部位及び式（Ｎ）ｎ（式中、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ若しくはＵ、又はそれらの誘導体であり、かつ、ｎは１以上の整数である）で表されるオリゴヌクレオチド可変部位を含むリンカー又はリンカー群。前記リンカー又はリンカー群及び前記リンカーと結合した標的第一鎖ポリヌクレオチドを含むリンカ−ポリヌクレオチド又はリンカー−ポリヌクレオチド群。前記リンカー又はリンカー群の調製方法及び前記リンカー又はリンカー群を用いたリンカー−ポリヌクレオチドの調製方法。ｃＤＮＡライブラリー調製方法において利用可能なＧ−テーリングに代わるリンカー、及び前記リンカーを用いたｃＤＮＡライブラリー調製方法が提供される。
Description
【０００１】
技術分野
本発明は、オリゴヌクレオチド定常部位及びオリゴヌクレオチド可変部位を含むリンカー群並びに前記リンカー群の使用を含むポリヌクレオチドライブラリーの調製方法に関する。更に、本発明は特異的ライブラリーのためのマーカーとして改善されたリンカーに関する。
【０００２】
背景技術
オリゴヌクレオチドリンカー及びプライマーは、一本鎖ポリヌクレオチドのプライミング、結合又はアニーリングの従来技術において使用され、かつ、第ニポリヌクレオチド相補鎖合成を可能にする。
カルニンシ（Ｃａｒｎｉｎｃｉ）ら、１９９６、ゲノミクス（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）、３７、３２７−３３６；カルニンシ（Ｃａｒｎｉｎｃｉ）ら、１９９７、ＤＮＡリサーチ（ＤＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ） ４：６１−６６； カルニンシ（Ｃａｒｎｉｎｃｉ）ら、１９９８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ、９５：５２０−４； カルニンシ（Ｃａｒｎｉｎｃｉ）及び ハヤシザキ（Ｈａｙａｓｈｉｚａｋｉ）、１９９９， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ３０３：１９−４４は、ｃＤＮＡライブラリーの調製方法を開示している。これらのプロトコルにより、ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡハイブリッドは調製され、かつ、Ｃａｐトラッパー技術を用いて完全コーディング／完全長ｃＤＮＡｓが選択され、次いで、それぞれの一本鎖ｃＤＮＡはＧ−テールとライゲートされ、ｃＤＮＡ第二鎖が合成される。
しかし、Ｇ−テーリング法は、例えば、ｃＤＮＡクローンをタンパク質発現に使用する場合の配列決定（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）効率及び翻訳効率において、幾つかの欠点を示す。
【０００３】
Ｇ−テーリングは、ターミナル デオキシヌクレオチジル トランスフェラーゼを用いてｄＧＴＰのターミナル付加により行われる。しかし、付加されるＧの数を調節することは難しく、それは、一般的に１０から３０の間で変化し得る。長いＧ−テールは、長鎖シーケンス解読（ｌｏｎｇ ｒｅａｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を悪化させ、かつ配列決定効率を低減させるという欠点を有し、一方、短いＧ−テールは、プライミング効率の低下をもたらし、その結果サンプルが損失し、その再調製の必要が生じるという欠点を有する。
【０００４】
長いＧ−ストレッチ（長いＧ−テール）は、配列決定反応中に周囲の配列と相互に作用し、非常に強固な第二次構造を形成する。これは、典型的にはＧＣリッチである５’ＵＴＲ類との相互作用において、問題を起こすことがある。実際、典型的なｃＤＮＡは、制御部位として働くと考えられている５’−ＵＴＲ内に６０％のＧＣ含有量を有する。同様の問題は、クローニングサイトの隣にＳｆｉＩ又はＮｏｔＩ制限酵素サイトを含むＧＣリッチ部位を有するクローニングベクターにおいても観察された。
【０００５】
更に、テイリング反応に使用されるターミナル デオキシヌクレオチジル トランスフェラーゼは、重金属、例えば、ＭｎＣｌ２又はＣｏＣｌ２を必要とする。しかし、これらの重金属は、ｃＤＮＡ類の分解を引き起こすことがあり、長鎖、完全コーディング／完全長ｃＤＮＡの生成率を低減させてしまうことがある。
【０００６】
本発明の目的は、従来技術における幾つかの問題を解決し、かつ、効率のよい新たなｃＤＮＡライブラリー調製方法を提供することである。
より具体的には、本発明の目的は、ｃＤＮＡライブラリー調製方法において利用可能なＧ−テーリングに代わる新たなリンカーの提供、及び前記リンカーを用いたｃＤＮＡライブラリー調製方法を提供することにある。
【０００７】
発明の説明
本発明は、オリゴヌクレオチド定常部位及び式（Ｎ）ｎ（式中、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ若しくはＵ、又はそれらの誘導体であり、かつ、ｎは１以上の整数である）で表されるオリゴヌクレオチド可変部位を含むリンカーを提供することにより上記課題を解決する。ｎが２以上の整数の場合、可変部位のヌクレオチド（Ｎ）は、同一でも異なっていてもよい。
可変部位は、好ましくはランダムに調製される。
本発明によるリンカーは、一本鎖又は二本鎖リンカーであることができる。
【０００８】
さらに本発明は、本発明のリンカーを２つ以上含むリンカー群に関する。
【０００９】
本発明の１つの態様によれば、
（ａ）オリゴヌクレオチド一本鎖定常部位及びオリゴヌクレオチド一本鎖可変部位を含む第一オリゴヌクレオチド一本鎖の合成、
（ｂ）第一オリゴヌクレオチド一本鎖定常部位（ａ）に相補的なオリゴヌクレオチド一本鎖定常部位を含む第二オリゴヌクレオチド一本鎖の合成、及び
（ｃ）前記可変部位が二本鎖定常リンカー部位の外側に突出するように、前記第一オリゴヌクレオチド鎖（ａ）を前記第二オリゴヌクレオチド鎖（ｂ）へアニールすることにより調製される本発明によるリンカー又はリンカー群が提供される。
【００１０】
さらに本発明は、本発明によるリンカー又はリンカー群及び前記リンカーに結合した標的第１鎖ポリヌクレオチドを含むリンカー−ポリヌクレオチド生成物又はリンカー−ポリヌクレオチド生成物群に関する。
【００１１】
さらにまた本発明は、本発明によるリンカー−ポリヌクレオチドを含むベクターに関する。
【００１２】
加えて、本発明は、
（ａ）オリゴヌクレオチド一本鎖定常部位及びオリゴヌクレオチド一本鎖可変部位を含む第一オリゴヌクレオチド一本鎖の合成、
（ｂ）第一オリゴヌクレオチド一本鎖定常部位（ａ）に相補的なオリゴヌクレオチド一本鎖定常部位を含む第二オリゴヌクレオチド一本鎖の合成、及び
（ｃ）第一オリゴヌクレオチド鎖（ａ）を第二オリゴヌクレオチド鎖（ｂ）へアニールし、それにより可変部位が二本鎖定常部位の外側に突出する段階を含む、本発明によるリンカー又はリンカー群の調製方法に関する。
【００１３】
さらに本発明は、以下の方法に関する。
（１） 標的一本鎖ポリヌクレオチドとリンカーとを結合させる方法であって、
ｉ）本発明によるリンカーの調製；及び
ｉｉ）前記リンカーの可変部位を標的一本鎖ポリヌクレオチドへアニールする段階を含む方法；
【００１４】
（２）標的一本鎖ポリヌクレオチドとリンカーとを結合させる方法であって、
ｉ）本発明によるリンカーの調製；及び
ｉｉ）前記リンカーの一方の（第一）鎖の可変部位を標的一本鎖ポリヌクレオチドへアニールし、かつ前記リンカーの他方の（第二）鎖の定常部位を標的一本鎖ポリヌクレオチドとライゲートさせる段階を含む方法；
【００１５】
（３）標的一本鎖ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド群とリンカー群とを結合させる方法であって、
ｉ）本発明によるリンカー群の調製；及び
ｉｉ）前記リンカー群の可変部位を標的一本鎖ポリヌクレオチド群へアニールする段階を含む方法；
【００１６】
（４）標的一本鎖ポリヌクレオチド又は標的一本鎖ポリヌクレオチド群とリンカー群とを結合させる方法であって、
ｉ）本発明によるリンカー群の調製；及び
ｉｉ）前記リンカー群の第一鎖の可変部位を標的一本鎖ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド群へアニールし、かつ前記リンカー群の第二鎖の定常部位を標的一本鎖ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド群とライゲートさせる段階を含む方法；
【００１７】
（５）リンカー及び二本鎖ポリヌクレオチドを含むリンカー−ポリヌクレオチド生成物の調製方法であって、
ｉ）本発明によるリンカーの可変部位を標的第一鎖ポリヌクレオチドへアニールし、かつ
ｉｉ）前記標的第一鎖ポリヌクレオチドに相補的な第二鎖ポリヌクレオチドを合成する段階を含む方法；
【００１８】
（６）リンカー及び二本鎖ポリヌクレオチドを含むリンカー−ポリヌクレオチド生成物の調製方法であって、
ｉ）本発明によるリンカーの第一鎖の可変部位を標的一本鎖ポリヌクレオチドへアニールし、かつ前記標的一本鎖ポリヌクレオチドを前記リンカーの第二鎖の定常部位とライゲートさせ、そして、
ｉｉ）前記標的一本鎖ポリヌクレオチドに相補的な第二の一本鎖ポリヌクレオチドを合成する段階を含む方法；
【００１９】
（７）リンカー又はリンカー群及び二本鎖ポリヌクレオチド群を含むリンカー−ポリヌクレオチド生成物の調製方法であって、
ｉ）本発明によるリンカー又はリンカー群の可変部位を標的一本鎖ポリヌクレオチド又は標的一本鎖ポリヌクレオチド群へアニールし、かつ
ｉｉ）前記標的一本鎖ポリヌクレオチド又はその群に相補的な第二鎖ポリヌクレオチドを合成する段階を含む方法；
【００２０】
（８）リンカー又はリンカー群及び二本鎖ポリヌクレオチドを含むリンカー−ポリヌクレオチド生成物の調製方法であって、
ｉ）本発明によるリンカー又はリンカー群の可変部位を標的一本鎖ポリヌクレオチド又は標的一本鎖ポリヌクレオチド群へアニールし、
ｉｉ）前記標的一本鎖ポリヌクレオチド又は標的一本鎖ポリヌクレオチド群を前記リンカー又はリンカー群の第二鎖の定常部位とライゲートさせ、かつ
ｉｉｉ）前記標的一本鎖ポリヌクレオチド（類）に相補的な第二の一本鎖ポリヌクレオチド（類）を合成する段階を含む方法；
【００２１】
（９）ポリヌクレオチドライブラリーをマーキングし、かつ前記ライブラリーを識別する方法であって、定常部位及び可変部位を含むリンカー群（但し、定常部位は特異的又は特定の組織又は種を示す少なくとも１つのマーカーを含む）を提供し、前記特定のマーカーにより前記ライブラリーを選択及び分離する段階を含む方法；
【００２２】
（１０）リンカー又はリンカー群をｍＲＮＡと結合させる方法であって、
（ａ）ｍＲＮＡをフォスファターゼ処理してキャップされていないｍＲＮＡからリン酸基を除去し、
（ｂ）段階（ａ）の生成物を、キャップされたｍＲＮＡからＣＡＰ構造を除去するピロフォスファターゼで処理し、かつ
（ｃ）本発明によるリンカーの存在下、ＲＮＡリガーゼを添加する段階を含む方法；
【００２３】
（１１）リンカー−ポリヌクレオチド生成物の調製方法であって、
（ａ）ｍＲＮＡをフォスファターゼ処理してキャップされていないｍＲＮＡからリン酸基を除去し、
（ｂ）段階（ａ）の生成物を、キャップされたｍＲＮＡからＣＡＰ構造を除去するピロフォスファターゼで処理し、
（ｃ）本発明によるリンカーの存在下、ＲＮＡリガーゼを添加し、かつ
（ｄ）オリゴｄＴを添加して、前記ｍＲＮＡの完全配列に相補的なポリヌクレオチドを合成する段階を含む方法；
【００２４】
（１２）ＲＮＡリガーゼの添加を含む、標的一本鎖ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド群に本発明によるリンカー又はリンカー群を結合させる方法；
【００２５】
（１３）ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドの調製方法であって、
ｉ）完全長／コーディング又は長いポリＡ ｍＲＮＡ類を提供し、
ｉｉ）第一の制限酵素サイトを含む請求項１〜４１のいずれか一項に記載のリンカーと前記ｍＲＮＡをライゲート及び／又はアニールし、
ｉｉｉ）第二制限酵素サイトを含むオリゴｄＴプライマーを前記ｍＲＮＡへアニーリングし、
ｉｖ）ｃＤＮＡ鎖を合成し、
ｖ）導入された２つの特異的制限酵素サイトを認識する制限酵素を用いることによりハイブリッドを単離し、かつ
ｖｉ）クローニングする
段階を含む方法。
【００２６】
（１４）リンカー及び一本鎖ポリヌクレオチドを含むリンカー−ポリヌクレオチド生成物の調製方法であって、本発明によるリンカーの可変部位の標的第一鎖ポリヌクレオチドへのアニーリングを含む方法。
【００２７】
図面の簡単な説明
図１は、１例として可変部位ＧＮＮＮＮＮを含むリンカー群を用いた完全長ｃＤＮＡライブラリー調製工程の例を示す。
ＰｏｌｙＡ＋ＲＮＡは転写（Ａ）され、次いで酸化され、ビオチンへ結合される。Ｒｎａｓｅ Ｉ処理後（Ｂ）、完全長ｃＤＮＡのみがビオチンを有し、アビジンコートされた磁気ビーズに捕獲される（Ｃ）。
【００２８】
図２は、図１の続きで、１例として可変部位ＧＮＮＮＮＮを含むリンカー群を用いた完全長ｃＤＮＡライブラリー調製工程の例を示す。
ｃＤＮＡは、アルカリ処理によりビーズからはずされ、回収され（Ｄ）、リンカーがライゲートされる（Ｅ）。ＧＮ５リンカーが示されている。Ｎ６リンカーの場合、可変部位は、ＧＮＮＮＮＮに代えてＮＮＮＮＮＮである。第二鎖ｃＤＮＡが合成され（Ｆ）、制限酵素により消化され（Ｇ）、ラムダファージベクターヘライゲートされ（Ｈ）、かつ、パッケージされる（Ｉ）。
【００２９】
図３はテストｃＤＮＡとリンカーとの間のライゲーションの結果を示す。
５μｇの７．５ｋｂポリ（Ａ）−テールド（ｔａｉｌｅｄ） ＲＮＡ（ライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））から調製されたテスト第一鎖ｃＤＮＡが出発材料として使用された。リンカー（ＧＮ５−、レーン１−３；Ｎ６、レーン４−６）は、アニーリングされ、５０ｎｇの７．５ｋｂテストｃＤＮＡとライゲートされた。その後、１０ｎｇのリンカー結合材料のサンプルは、第二鎖ｃＤＮＡ合成に用いられ、次いでＯ．８％アルカリゲル電気泳動に掛けられた。
異なる量のリンカーが使用された：レーン１及び４は２００ｎｇ；レーン２及び５は５００ｎｇ並びにレーン３及び６は２μｇ。参照として、リンカーなしのｃＤＮＡは、第二鎖合成のテンプレートとして使用された（レーン７）。レーン８は、リンカーをなしの第一鎖ｃＤＮＡを含む。レーン９は、λ／ＨｉｎｄＤＩＩＩサイズマーカーを含む。
【００３０】
図４は、様々なモル比のリンカーを用いた細胞内ｃＤＮＡのリンカーライゲーションｃＤＮＡとリンカーとの比を調べた結果を示す。
２μｇのＮ６／ＧＮ５が混合されたリンカー（Ｎ６：ＧＮ５＝１：４）は、様々な分量のｃＤＮＡ（レーン１は１０００ｎｇ、レーン２は５００ｎｇ及びレーン３は２００ｎｇ）とライゲートされた。それらは、第二鎖ｃＤＮＡ合成に供給され、Ｏ．８％ゲル電気泳動により分析された。レーン４はマーカーを含む。
図左側の個々のレーンは、第一鎖ｃＤＮＡを表している。
【００３１】
図５は、従来技術に記載のＧ−テールを有する ｃＤＮＡ配列の配列決定チャートを示している。
第二鎖ｃＤＮＡ配列におけるＣ反復の存在下（第一鎖へＧ−テールと共に導入）、チャートに示されているように配列決定効率は低減した。
【００３２】
図６は、Ｎ６／ＧＮ６リンカー混合物（比率１：４）とライゲートされたｃＤＮＡ配列の配列決定チャートを示す。図６の配列決定されたクローンＤ０５＃０４２＃２−５Ｆ−ａｂ２は表１のサンプル２．０５と対応している。
【００３３】
図７は、ＧＮ５リンカーとライゲートされたｃＤＮＡ配列の配列決定チャートを示す。図７の配列決定されたクローンＧ０７＃０５２＃３−７Ｆ．ａｂ１は、表１のサンプル３．０７に対応している。
【００３４】
図８は、ループバイアス及びその可能な解決法を図で示している。図８（Ａ）ではバイアスを説明している。一本鎖リンカーの定常又は一定部位の一末端は、二本鎖リンカーから他方の一本鎖除去後、一本鎖ｃＤＮＡと相互作用してループを形成することがあり、続く第二鎖ｃＤＮＡ合成をブロックすることがある。
【００３５】
図８（Ｂ）に示されているように、保護基としてのＮＨ２は、一定又は定常下鎖（ｌｏｗｅｒ ｓｔｒａｎｄ）の一末端の場合３’末端へ結合する。ループ形成の可能性はなく、かつ、第二鎖ｃＤＮＡ合成は阻害されない。
【００３６】
図８（Ｃ）では、リンカーの定常又は不変第二鎖（図では下鎖）の３’末端と定常又は不変第一鎖（図では上鎖（ｕｐｐｅｒ ｓｔｒａｎｄ））の５’末端は、ループを形成するために共に結合される。これは、一本鎖ｃＤＮＡによるループ形成の可能性を妨げ、かつ、第二鎖ｃＤＮＡ合成は阻害されない。
【００３７】
発明の詳細な説明
本発明はオリゴヌクレオチド定常部位及びオリゴヌクレオチド可変部位を含むリンカー及びリンカー群を提供することにより、従来技術における上記問題を解決する。このようなリンカー及びリンカー群は、標的一本鎖ポリヌクレオチド又は標的ポリヌクレオチド群の末端に結合することができ、かつ、第二ポリヌクレオチド鎖合成を可能にする。
【００３８】
本発明の態様によれば、オリゴヌクレオチド定常部位及びオリゴヌクレオチド可変部位を含むリンカー及びリンカー群が提供される。定常部位は、好ましくは、リンカー群のいずれのリンカーにおいて不変のオリゴヌクレオチド部位である。リンカー定常部位は、一本鎖又は二本鎖オリゴヌクレオチドであることができ、好ましくは、二本鎖オリゴヌクレオチドである。定常部位は、好ましくは下記の内少なくとも１つを含む：制限サイト、組換えサイト、ポリメラーゼプロモーターサイト、マーカー又はタグ。
【００３９】
可変部位は、好ましくはランダムに合成される。この結果得られるリンカー群のリンカーは、不変部位、好ましくはその群内で共通の部位及び、群内のそれぞれのリンカー毎に異なる可変部位を有する。
【００４０】
本発明によるリンカー群は、可変部位として、標的一本鎖ポリヌクレオチドの３’末端又は５’末端に特異的なオリゴ配列を有する１つ以上のリンカーも含むことができる。前記オリゴ配列は、特に、標的ー本鎖ポリヌクレオチド群から１つ以上の特異的ターゲットポリヌクレオチドを結合及び単離するために選択される。
【００４１】
本発明によるリンカー可変部位は、例えば、長鎖完全コーディング又は完全長ｃＤＮＡのような第二鎖ポリヌクレオチド合成において、プライマーとして働くこともできる。
【００４２】
前記一本鎖オリゴヌクレオチドのランダムな可変部位は、どのような種類のヌクレオチドも含むことができる。好ましくは、可変部位は、式（Ｎ）ｎ（式中、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ若しくはＵ、又はその誘導体であり、かつ、ｎは１以上である）を有する。ｎが２以上の整数の場合、可変部位のヌクレオチドは、お互いに、同一でも、互いに異なっても良い。
整数ｎは、有利には１〜１０であり、好ましくは４〜８であり、より好ましくは、ｎは５又は６である。
【００４３】
一法としては、可変部位において、（Ｎ）ｎの第一から第三ヌクレオチド（図２に示すように、定常部位の側からフリー末端へ向かって数え始める）は、Ｇであることができる。鎖の長さ（即ちｎの長さ）が異なり、かつＧを含むか又は含まない混合物も本発明の対象に含まれる。好ましくは、それは、異なる比率のＮ６／ＧＮ５の混合物であり、その比率は好ましくは１：４である。
【００４４】
本発明は、更に、本発明によるリンカー、並びに前記リンカーの可変部位とアニーリング及び／又はライゲートする一本鎖又は二本鎖ポリヌクレオチドを含むリンカー−ポリヌクレオチド生成物、そして前記リンカー−ポリヌクレオチド生成物を含むベクターに関連している。
【００４５】
好ましくは、前記一本鎖又は二本鎖ポリヌクレオチドは、長鎖、完全コーディング／完全長ｃＤＮＡである。
【００４６】
従って、本発明は、標的一本鎖ポリヌクレオチドヘアニーリング及び／若しくはライゲートする本発明によるリンカーを含むリンカー−ポリヌクレオチド生成物又はポリヌクレオチドライブラリーの調製方法を開示する。
【００４７】
本発明は、更に、二本鎖ポリヌクレオチドヘアニーリング／ライゲートされた本発明によるリンカーを含むポリヌクレオチド生成物又はライブラリーの調製方法、好ましくは、長鎖、完全コーディング／完全長ｃＤＮＡライブラリーの調製方法に関する。
【００４８】
本発明は、更に、定常部位にマーカーを含む本発明によるリンカー群を提供することによるポリヌクレオチドライブラリーのマーキング方法にも関する。このマーキングシステムは、異なる種（例えば、ヒト、マウス、キイロショウジョウバエ、イネ等）のライブラリーを識別又は認識することを可能にし、かつ、それは、それぞれの種の異なる組織（例えば、肝臓、脳、肺等）のライブラリーを識別するために使用することができる。
【００４９】
本発明によれば、以下に記載されているリンカー又はリンカー群及び前記リンカー又はリンカー群と標的一本鎖ポリヌクレオチド又は標的一本鎖ポリヌクレオチド群との結合方法であって、
ｉ） オリゴヌクレオチド定常部位及びオリゴヌクレオチド可変一本鎖部位を含むリンカー又はリンカー群の調製；
ｉｉ） 標的一本鎖ポリヌクレオチド（類）と前記リンカーの可変部位（類）とのアニーリング、
の段階を含む方法が提供される。
【００５０】
以下、幾つかの場合、本発明は、簡潔化のため、リンカー群（リンカー群又は単にリンカー類としても記載されている）、並びに前記群の標的ポリヌクレオチドヘの結合方法及び二本鎖ポリヌクレオチド合成方法について記載される。しかし、本発明は、前記リンカー群に含まれる個々のリンカー及びそのような個々のリンカーの使用を含む方法も包含していることは明らかである。
【００５１】
本発明によるリンカー群に含まれる各リンカーの定常部位は、一本鎖又は二本鎖オリゴヌクレオチドであることができる。
好ましくは、リンカーと同様に定常部位は、二本鎖オリゴヌクレオチドであり、従って、その方法は以下の工程を含む：
ｉ） オリゴヌクレオチド二本鎖定常部位及びオリゴヌクレオチド可変一本鎖部位を含むリンカー又はリンカー群の調製、但し、前記可変部位は、前記二本鎖定常部位の外側に突き出している（従って、可変定常部位は粘着突出末端を形成する）；
ｉｉ） 標的一本鎖ポリヌクレオチド群とリンカー群の可変部位とのアニーリング、及び、好ましくは前記標的一本鎖ポリヌクレオチドのアニーリングされた末端と、リンカーの隣接する定常部位とのライゲーション（図２の段階（Ｆ）から（Ｇ）参照）。
【００５２】
前記リンカー又はリンカー類は、従来技術において知られているいずれかの方法、例えば、５’部位に定常核酸配列を、３’部位に可変核酸配列末端を含む５’−３’方向を有する一方のオリゴヌクレオチド鎖を用いて調製することができる。その後、定常核酸配列を含む他方のオリゴヌクレオチド鎖が調製される。最後に、一方の鎖の可変部位が二本鎖定常部位の外側に突き出すように、一方の鎖の定常部位及び他方の鎖の定常部位がアニーリングされる。リンカーは、もちろん工程の順序を逆さにして調製することができ、かつ、他の方法によっても調製することができる。
【００５３】
本発明発明によるリンカーが二本鎖リンカーである場合、本出願の目的のために、定常部位及び可変部位を含む鎖は、“第一鎖”とも呼ばれ、一方、第一鎖の定常部位に相補的な他方の鎖は、“第二鎖”と呼ばれる。
【００５４】
本発明は、更に、定常部位及び可変部位を含む一方のオリゴヌクレオチド鎖（“第一鎖”のみを含み、“第二鎖”を含まない）のみを含むリンカーに関する。リンカーが５’−３’方向を有する場合、この一本鎖オリゴヌクレオチドの末端の可変部位は、標的一本鎖ポリヌクレオチドの３’末端にアニーリングする。次いで、この標的一本鎖ポリヌクレオチドに相補的である第二鎖ポリヌクレオチドが合成される。
【００５５】
１つ又はそれ以上のリンカーは、可変部位を含む鎖が３’−５’の方向を有するように調製され得る。この結果、可変部位は５’末端に位置する。このように調製されたリンカーの５’末端可変部位は、標的ポリヌクレオチドの５’末端ヘアニーリングする。他方の鎖が存在する場合、その下鎖は、標的ポリヌクレオチドの５’末端ヘライゲートすることができる。
【００５６】
本発明は、本発明によるリンカー又はリンカー群及び二本鎖ポリヌクレオチドを含むリンカー−ポリヌクレオチド生成物の調製方法であって、
ｉ） オリゴヌクレオチド二本鎖定常部位及びオリゴヌクレオチド可変一本鎖部位を含むリンカー群の調製、但し、前記可変部位は、二本鎖定常部位の外側に突き出している（従って、可変部位は粘着突出末端を形成する）；
ｉｉ） 標的一本鎖ポリヌクレオチド群と前記リンカー群の可変部位とのアニーリング、及び前記標的一本鎖ポリヌクレオチド群と前記リンカーの隣接する（第二鎖）定常部位とのライゲーション；並びに
ｉｉｉ） 可変部位をプライマーとして使用することによる標的第一鎖に相補的な第二の一本鎖ポリヌクレオチドの合成
を含む方法も提供する。
【００５７】
ポリヌクレオチド配列は、本発明のによるリンカーの一方の鎖のみを用いて調製することも可能である。この場合、
ｉ） オリゴヌクレオチド定常部位及びオリゴヌクレオチド可変一本鎖部位を含む一本鎖リンカー群の調製；
ｉｉ） 標的第一鎖ポリヌクレオチド群とリンカー群の可変部位とのアニーリング；
ｉｉｉ） リンカーの可変部位をプライマーとして用いることによる標的第一鎖に相補的な第二の一本鎖ポリヌクレオチドの合成
の段階が含まれる。
【００５８】
リンカー又はリンカー群の定常オリゴヌクレオチド部位は、どのようなオリゴヌクレオチド配列でもよい。この定常配列は、好ましくは不変部位であり、従って、それは、同じ群のリンカーの全てについて共通する。この定常部位は、１つ以上のグループから成るオリゴ配列も含むことができ、そのため、この場合、定常部位は、同じ群内で幾つかの相違を示すことができる。しかし、本発明の目的のためには、任意の１つ以上のグループからなるこれらオリゴ配列は、定常部位のおおよその（ｇｅｎｅｒａｌ）構造を変化させないため、１つ以上のグループからなる可変オリゴ配列を含む定常部位も、含まない定常部位も、簡略化のために、定常部位として記されている。
【００５９】
定常部位は、リンカー群においても不変部位であることができる。すなわち、それは、群に含まれるいずれのリンカーについても同一のものとすることができる。
【００６０】
定常部位は、どのような種類のオリゴヌクレオチド配列（ＤＮＡ又はＲＮＡ）であることができ、それは、特定の実験又は特定のライブラリーに使用されるリンカー又はリンカー群について、同じであるか又はほぼ同じであることが好ましい。
【００６１】
リンカー定常部位は、従って、一本鎖又は二本鎖オリゴヌクレオチドの両方を意味することができ、好ましくは、それは、二本鎖オリゴヌクレオチドである。この場合、一本鎖可変部位は突出末端を形成する。可変部位は、第二鎖ポリヌクレオチド合成過程においてプライマーとして作用することができる。
【００６２】
定常（又は不変）部位は、好ましくは１つ以上の制限サイト、相同組換えサイト、ポリメラーゼプロモーターサイト、マーカー及び／又はタグを含む。好ましい制限サイトは、例えば、ＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩ、ＳｓｔＩ、ＳａＩＩ、又はＮｏｔＩ、その他、例えばＨｙｏｎｅ−ｍｙｏｎｇ Ｅｕｍ、“制限エンドヌクレアーゼ及び改質メチラーゼ（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｄｏｎｕｏｌｅａｓｅｓ ａｎｄ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｙｌａｓｅｓ）”の章に開示されているものである。
【００６３】
相同組換えサイトの例は、ａｔｔＢ、Ｇａｔｅｗａｙ（商標）（ライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））、Ｃｒｅ−ｌｏｘ（キングハ ルー（Ｑｉｎｇｈｕａ Ｌｉｕ）ら、１９９８、カレント・バイオロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、８：１３００−１３０９）Ｆｌｐ／ＦＲＴ （Ｊ．ワイルド（Ｗｉｌｄ）ら、１９９６、ジーン（Ｇｅｎｅ）、１７９：１８１−１８８）である。
【００６４】
更に、ポメラーゼプロモーターサイトについては、それは、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターサイト、例えば、Ｈｙｏｎｅ−Ｍｙｏｎｇ Ｅｕｎ、５２１ページに開示されたものの１つであることができる。好ましくは、それは、Ｔ３、Ｔ７、ＳＰ６、Ｋ１１及び／又はＢＡ１４ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターサイトであることができる。
【００６５】
マーカーは、いずれのヌクレオチド配列であることもでき、例えば、特定組織又は種について特異的な配列であることができる。
【００６６】
タグとしては、一方の鎖又は他方の鎖の定常部位の先端に結合することができるいずれの基又は分子でも使用することができる。実際、例えば温度の上昇により、リンカーの一本鎖が除去される場合、他方の一本鎖の末端は、標的一本鎖ポリヌクレオチドとループを形成する可能性がある（図８）。定常部位のみからなる鎖の末端が、主にこの鎖とライゲートした標的一本鎖ポリヌクレオチドとループを形成し、かつ第二鎖ポリヌクレオチド合成を阻害することを避けるため、保護基は、好ましくは、この定常部位のみからなる鎖の３’末端へ結合する（図８ Ａ）。従って、３’−ＯＨを持たず、ライゲートもＤＮＡポリメラーゼにより伸長することもできないいずれの基でも、本発明の目的のために使用することができる。
【００６７】
保護基としては、例えば、ｄｄＮＴＰ類を使用することができる。好ましくは、ＮＨ２基も保護基として使用される（図８、Ｂ）。
【００６８】
ループバイアスの問題を避けるために、更に特別な解決法として、可変部位の反対に位置するリンカーの定常部位の両鎖の末端がループを形成するように、両末端を一緒に結合させることができる（図８、Ｃ）。この解決法により、定常部位の末端は、標的一本鎖ポリヌクレオチドとループを形成することができず、第二鎖ポリヌクレオチド合成は阻害されない。
【００６９】
リンカー又はリンカー群のオリゴヌクレオチド可変部位は、好ましくは、ランダムにに合成される。従って、リンカー群内では、いずれのリンカーの可変部位が、好ましくはランダムに合成され、それぞれのリンカーが有する可変部位の配列及び／又は塩基数は、お互いに異なっている。従って、リンカー群は多数の異なる配列を有する突出末端を含む。このようなリンカー群は、多種のランダムな突出末端を含む。これらは、標的一本鎖ポリヌクレオチド群の相補末端を認識、アニール及び／又はライゲートする。これは、すなわちリンカー及び標的一本鎖ポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド配列を形成する完全長ｃＤＮＡ群である（図１及び２参照）。
従って、本発明は、本発明により調製される少なくとも２つのリンカーを含むリンカー群にも関する。好ましくは、本発明は、少なくとも２つのサブリンカー群（ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｌｉｎｋｅｒｓ）を含むリンカー群に関する。
【００７０】
リンカー群は、すべてのリンカーに含まれる定常部位が同一配列を有するオリゴヌクレオチド部位であるものであることができる。リンカー群は、２つ以上のサブリンカー群を含むこともあり、その中の１つのサブリンカー群は、定常部位が同一配列を有するオリゴヌクレオチド部位であるリンカーを含み、他のサブリンカー群の定常部位配列は相互に異なる。
【００７１】
好ましくは、リンカー群又はサブリンカー群において、リンカーの可変部位は、ランダムに合成される。好ましくは、その群又はサブ群において、リンカーの可変部位の配列は、相互に異なる。
【００７２】
可変部位は、標的一本鎖ポリヌクレオチドの末端（好ましくは３’末端）に相補的である特異的オリゴヌクレオチド配列であることもできる。
【００７３】
好ましくは、本発明のリンカー群は、可変部位のうち、標的ポリヌクレオチド群から選択しようとしている特異的標的ポリヌクレオチドの末端（類）を認識及びアニールすることができる１つ以上の特定の（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ）部位を含む。
【００７４】
標的一本鎖ポリヌクレオチドの末端は、リンカーの可変突出末端ヘア二一リングする。標的一本鎖ポリヌクレオチド群ヘリンカー群が付加される場合、好ましくはランダムに合成された、リンカー中の可変部位（突出末端）は、標的一本鎖ポリヌクレオチド群の末端を認識し、かつアニールする。
【００７５】
好ましくは、本発明によるリンカーは、定常部位（好ましくは、群のリンカーすべてについて不変の部位である）及び群のどのリンカーについても異なっている可変部位を含む二本鎖オリゴヌクレオチドである。第一の態様より、標的一本鎖ポリヌクレオチドの３’末端は、可変部位の突出末端の３’末端へアニールし、前記標的一本鎖ポリヌクレオチドの３’末端に隣接する他方の鎖の定常部位の５’末端ヘライゲートする。
【００７６】
リンカーは、第二の態様によれば、３’−５’方向を有する一方の鎖及び他方の鎖の定常部位により、構成されることもできる。この場合、標的一本鎖ポリヌクレオチドの５’末端は、リンカーのこの可変部位ヘアニールしライゲートする。
【００７７】
リンカーの可変一本鎖オリゴヌクレオチド部位は、どのような種類の核酸をも含むことができる。好ましくは、前記可変部位は、式（Ｎ）ｎ（式中、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ若しくはＵ又はそれらの誘導体であり、ｎは１以上であり、ｎが２以上の整数の場合、可変部位のヌクレオチド（Ｎ）は同一でも、互いに異なっても良い）を有する。好ましくは１≦ｎ≦１０であり、より好ましくは４≦ｎ≦８である。特に好ましいリンカーとしては、ｎは５又は６であり、すなわち、Ｎ６又はＮ５である。
【００７８】
定常部位に最も隣接している第一、第二及び／又は第三Ｎ（即ち、第一の態様の場合、リンカーの５’末端からくる可変部位のヌクレオチド）は、式（Ｇ）ｍ（Ｎ）ｎ−ｍ（式中、ｍ＝１〜３）によるＧであることもできる。好ましくは、リンカー可変部位は、ＧＮ４、ＧＮ５、Ｇ２Ｎ３、Ｇ２Ｎ４、Ｇ３Ｎ２、Ｇ３Ｎ３、Ｎ５、Ｎ６又はそれらの混合物であることができる。
【００７９】
より具体的には、本発明によるリンカー群は、（Ｎ）ｎリンカーと（Ｇ）ｍ（Ｎ）ｎ−ｍとの混合物であり、好ましくは異なる比率を有するＮ６／ＧＮ５、Ｎ６／Ｇ２Ｎ４又はＮ６／Ｇ３Ｎ３である。Ｎ６／ＧＮ５混合リンカーの比率は、Ｏ：１−１：Ｏであり、好ましくは１：３−１：５、より好ましくは１：４であることができる。ライゲーションは、従来技術において知られているいずれのライゲーション方法を用いても行うことが可能であり、好ましくはＤＮＡリガーゼ、より好ましくはＴ４ ＤＮＡリガーゼ若しくは大腸菌ＤＮＡリガーゼ（例えば、Ｈｙｏｎｅ−Ｍｏｎｇ Ｅｕｎ、「リガーゼ」の章参照）を用いるか、又はＲＮＡリガーゼ（マルヤマ（Ｍａｒｕｙａｍａ）ら、１９９５）を用いて行うことができる。
【００８０】
好ましくは、本発明によるライゲーション反応は、リガーゼ刺激剤（ｌｉｇａｓｅ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ）の添加を含む。好ましくは、リガーゼ刺激剤としては、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）、好ましくは分子量６０００−８０００のものが使用される。
【００８１】
アニーリング及び／又はライゲーション工程後、リンカーの可変部位（即ち、第一の態様のリンカーの突出又は遊離３’末端）は、本発明によるリンカー及び二本鎖ポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド配列を形成する第二鎖ポリヌクレオチド合成のためのプライマーとして作用することができる。
【００８２】
本発明によるリンカーの標的一本鎖ポリヌクレオチドヘのライゲーションは、オリゴ−キャッピング技術（Ｋ．マルヤマ（Ｍａｒｕｙａｍａ）ら、１９９５、ジーン（Ｇｅｎｅ）、１３８：１７１−１７４；及びＳ．カトー（Ｋａｔｏ）ら、１９９５、ジーン（Ｇｅｎｅ）、１５０：２４３−２５０）を用いて行うことも可能である。オリゴ−キャッピングは基本的に下記の工程を含む：ｉ）完全長でない（ｎｏｎ ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ）ｍＲＮＡ類からホスフェート（ｐｈｏｓｐｈａｔｅｓ）を除去するために、細胞から抽出されたｍＲＮＡ類は、脱リン酸酵素（ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｅｎｚｙｍｅ）、好ましくは、バクテリアアルカリフォスファターゼにより処理される（即ち、５’末端に水酸基を有するキャップされていないＲＮＡの５’末端を形成するが、キャップされた完全長ＲＮＡのＣＡＰ構造は除去しない）；ｉｉ） ｉ）において得られた混合物は、完全長ｍＲＮＡ類からＣＡＰ構造を除去し、リン酸基を完全長５’末端に残すピロフォスファターゼ、好ましくはタバコ酸性ピロフォスファターゼ（ＴＡＰ）により処理される；ｉｉｉ）５’末端にリン酸基を有する完全長ｍＲＮＡに、ＲＮＡリガーゼにより特異的ＲＮＡ又はＤＮＡアダプターをライゲートする。；ｉｖ）オリゴｄＴが添加され相補鎖が合成される。
【００８３】
本発明によるリンカーの標的ポリヌクレオチドヘの結合方法及び／又は本発明によるポリヌクレオチド配列の調製方法は、オリゴ−キャッピング法の変法をライゲーション工程として用いて下記のように行うことも可能である。
【００８４】
従って、標的一本鎖ポリヌクレオチド（オリゴ−キャッピング法として記載されたように調製されたＲＮＡ、ｍＲＮＡ、又はｃＤＮＡであることができる）は、リガーゼ存在下、本発明によるリンカーヘライゲートすることができる。
【００８５】
特に、本発明のリンカーが二本鎖リンカーである場合、標的一本鎖ポリヌクレオチドの一末端は、第二鎖（定常部位のみからなる）にライゲートし、かつ、そのリンカーの第一部位の可変部位ヘアニールする。
【００８６】
もう一つの可能性としては、標的ポリヌクレオチドは、リンカー（一本鎖又は二本鎖のいずれであることもできる）の可変部位ヘライゲートする。いずれの場合においても、オリゴｄＴが付加され、かつ、相補性ポリヌクレオチド、好ましくはｃＤＮＡが合成される。
【００８７】
ＲＮＡリガーゼの使用は、上記ＲＮＡ又はｍＲＮＡに限定されることなく、ＤＮＡをライゲートするためにも使用することができる。
【００８８】
従って、本発明によるリンカーと標的一本鎖ポリヌクレオチドを結合するためのＲＮＡリガーゼを用いたライゲーション方法は、
ｉ）一本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡへ；ｉｉ）一本鎖ＲＮＡを一本鎖ＲＮＡへ；そして、ｉｉｉ）一本鎖ＤＮＡを一本鎖ＲＮＡへ、又は、一本鎖ＲＮＡを一本鎖ＤＮＡへ
結合することができる。
【００８９】
１つの態様によれば、ポリヌクレオチドは、長鎖、完全コーディング／完全長ｍＲＮＡであり、リンカーは、ＤＮＡ（但し、ＲＮＡであることもできる）であり、第一制限酵素サイトを含む。
【００９０】
従って、一本鎖又は二本鎖ｃＤＮＡの調製方法であって、以下の段階を含む方法が提供される：
（Ｉ）ポリＡを含む、長鎖、完全コーディング／完全長ｍＲＮＡの提供；
（ＩＩ）第一制限酵素サイトを含む二本鎖リンカーの提供；
（ＩＩＩ） ｍＲＮＡの５’末端の（リガーゼ、例えばＲＮＡリガーゼを用いることによる）リンカーの第二鎖の定常部位とのライゲーション、及びリンカーの第一鎖の可変部位への５’末端のアニーリング；
（ＩＶ）第二制限酵素サイトを含むオリゴｄＴプライマーの提供、およびオリゴｄＴプライマーのｍＲＮＡのポリＡへのアニーリング；
（Ｖ）逆転写酵素及びＮＴＰ類の添加によるｃＤＮＡの合成、この段階中、新たに合成されたｃＤＮＡは、リンカーの第一鎖（定常部位及び可変部位を含むもの）を置換する；
（ＶＩ）ｍＲＮＡの除去及び一本鎖ｃＤＮＡの獲得。
【００９１】
更に、プライマーは、ｃＤＮＡの３’末端へ付加することができ、かつ、ポリメラーゼの存在下、相補ＤＮＡが合成され、二本鎖ｃＤＮＡが形成される。従って、形成された二本鎖は、一方の末端に第一制限酵素サイトを含み、他方の末端に第二制限酵素サイトを含む。
【００９２】
段階ＶＩ）でのｍＲＮＡの除去は、ＲＮａｓｅ Ｈ若しくはＲＮＡをフラグメントに切断し、それらを除去する他の酵素の添加によって、又は従来技術（サンブロック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、１９８９）で知られている方法に従ってアルカリ（例えばＮａＯＨ）を添加することによって行うこともできる。
【００９３】
次いで、二本鎖ポリヌクレオチド配列が、特異的制限酵素の使用によって、特別にリンカーにより導入された第一及び第二制限酵素サイトにおいて切断され、その結果、突出末端が形成される。次いで、突出末端を有する二本鎖ポリヌクレオチドがプラスミド若しくはファージ発現ベクター、又は配列決定ベクター（例えばサンブロック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、１９８９、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；インビトロゲン・カタログ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃａｔａｌｏｇ） １９９９；ストラジーン・カタログ（Ｓｔｒａｇｅｎｅ Ｃａｔａｌｏｇ） １９９９等に例えば記載されている）に挿入される。二本鎖ポリヌクレオチドは、部位特異的（ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）組換え（例えば、ａｔｔＢ−ａｔｔＰ）又は平滑末端方法（サンブロック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、１９８９）によりクローニングされることもできる。
【００９４】
ファージベクターの例としては、ｌａｍｂｄａ−ＺＡＰ、ｌａｍｂｄａ−Ｄａｓｈ （ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））を挙げることができる。
【００９５】
本発明は、従って、本発明によるポリヌクレオチド配列を含むファージ若しくはプラスミド発現又は配列決定ベクターにも関するが、これに限られるものではない。
【００９６】
本発明による一本鎖又は二本鎖ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ若しくはＤＮＡであり、又はＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドでもある。好ましくは、長鎖完全コーディング及び／又は完全長ｃＤＮＡである。前記長鎖完全コーディング／完全長ｃＤＮＡの３’末端は、ｍＲＮＡの５’Ｃａｐ末端に対応している。
【００９７】
本発明の目的のためには、完全長ｃＤＮＡという用語は、５’及び３’ＵＴＲ配列及びオリゴｄＴプライマー（即ち、ポリＡを含むｍＲＮＡに相補的である）を含むｃＤＮＡを意味する。それは、クローニングのための付加的な配列、例えば、制限酵素サイトも含むこともできる。完全コーディングｃＤＮＡにおいては、ｃＤＮＡ配列は少なくとも開始及び終止コドンを含む。長鎖ｃＤＮＡについては、ｃＤＮＡ配列は、ほぼ完全コーディング／完全長であり、３’末端（ｍＲＮＡの５’末端に相当）、又はｃＤＮＡ鎖がｍＲＮＡに相補的なｃＤＮＡに相補的である（すなわち、同じ遺伝子方向を有する）と考えるならば、５’末端において、１つ若しくは数個のヌクレオチドが欠損しているものと理解される。このようなｃＤＮＡ合成途中における合成反応の停止はｍＲＮＡの二次構造形成、例えばＣａｐ構造のレベルに起因する可能性がある。しかし、遺伝子、ヌクレオチド、ｃＤＮＡ類、ＲＮＡ又はｍＲＮＡのフラグメントも、本発明の応用の目的から除外されない。
【００９８】
ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドは、
（Ｉ）ポリＡを含む長鎖、完全コーディング又は完全長ｍＲＮＡの提供；
（ＩＩ）第一制限酵素サイトを含む二本鎖リンカーの提供；
（ＩＩＩ）ｍＲＮＡの５’末端の（リガーゼ、例えばＲＮＡリガーゼを用いることによる）リンカーの第二鎖の定常部位とのライゲーション、及びリンカーの第一鎖の可変部位への５’末端のアニーリング；
（ＩＶ）第二制限酵素サイトを含むオリゴｄＴプライマーの提供、及びオリゴｄＴプライマーのｍＲＮＡのポリＡへのアニーリング；
（Ｖ）逆転写酵素及びＮＴＰ類の添加によるｃＤＮＡの合成；この段階中、新たに合成されたｃＤＮＡは、リンカー第一鎖（定常部位及び可変部位を含むもの）を置換する；
（ＶＩ）オリゴｄＴプライマーの第二制限酵素サイトに相補的なオリゴヌクレオチドの添加、及びこのオリゴヌクレオチドのポリＡとのライゲーション；次いで、ハイブリッド二本鎖ポリヌクレオチドが形成される、
によって調製され得る。
ハイブリッド二本鎖ポリヌクレオチドは、上記のような特異的制限酵素によって切断されることができ、かつ上記のようなベクターへ挿入され得る。
【００９９】
リンカーの可変部位とアニールし、及び／又は隣接するリンカーの定常部位とライゲートする標的一本鎖ポリヌクレオチドは、従来技術において知られているいずれの技術を用いても調製することができる。
【０１００】
好ましくは、長鎖完全コーディング／完全長一本鎖ｃＤＮＡ類は、カルニンシ（Ｃａｒｎｉｎｃｉ）ら、１９９６、ゲノミクス（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）、３７、３２７−３３６；カルニンシ（Ｃａｒｎｉｎｃｉ）ら、１９９７、ＤＮＡリサーチ（ＤＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ） ４：６１−６６；カルニンシ（Ｃａｒｎｉｎｃｉ）ら、１９９８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｒｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ、９５：５２０−４；カルニンシ（Ｃａｒｎｉｎｃｉ）及びハヤシザキ（Ｈａｙａｓｈｉｚａｋｉ）、１９９９、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．３０３：１９−４４に開示されている５’ｍＲＮＡ Ｃａｐトラッピング技術により調製される。
【０１０１】
好ましくは、上記従来技術文献に記載されている全ての工程を行うが、例外としてＧ−テーリング工程の代わりに本発明によるリンカー群が提供される。
【０１０２】
好ましくは、図１及び２に記載されているＣａｐトラッピング法が使用されるが、標的一本鎖ポリヌクレオチドは、この技術により調製されるものに限られるものではない。例えば、他の第一鎖ｃＤＮＡの単離方法、例えば、エデリー（Ｅｄｅｒｙ）ら、１９９５、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１５：３３６３−７１に記載されているもの、又はオリゴキャッピング法（Ｋ．マルヤマ（Ｍａｒｕｙａｍａ）ら、１９９５、ジーン（Ｇｅｎｅ）、１３８：１７１−１７４；及びＳ．カトー（Ｋａｔｏ）ら、１９９５、ジーン（Ｇｅｎｅ）、１５０：２４３−２５０）も使用することができる。
【０１０３】
本発明による標的一本鎖ポリヌクレオチドは、ノーマライズ（ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ）及び／又はサブトラクト（ｓｕｂｔｒａｃｔｅｄ）（例えば、ソアレス（Ｓｏａｒｅｓ）ら、１９９４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ９１：９２２８−９２３２及びボナルド（Ｂｏｎａｌｄｏ）ら、１９９６、６：７９１−８０６）されることもできる。回収されたノーマライズ及び／又はサブトラクトされたポリヌクレオチド、好ましくはｃＤＮＡ類、より好ましくは長鎖完全コーディング／完全長ｃＤＮＡ類は、好ましくはＣａｐトラッピング技術により調製され、次いで本発明によるリンカー群ヘライゲートされるか、又は、前記単離されたｃＤＮＡ類は、本発明のリンカー群へ初めにアニール及び／又はライゲートされ、次いでノーマライズ及び／又はサブトラクトされる。
【０１０４】
標的一本鎖ポリヌクレオチドは、ループ又はヘアピンループ形成によるバイアスを示すことがある。例えば、合成された細胞内ｃＤＮＡの３’末端は、それ自身の内部部位（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｐｏｒｔｉｏｎ）とループを形成することがあり、続く本発明によるリンカーとのアニーリング及びライゲーションを妨げる。
【０１０５】
この問題を解決するために、標的一本鎖ポリヌクレオチドは、本発明によるリンカーとのアニーリング及び／又はライゲーションの前に、高温、２５℃から溶液の沸点（約１００℃）、好ましくは６５℃で任意に処理され（ｓｕｂｊｅｃｔｅｄ）、次いで好ましくは氷上で冷却される。
【０１０６】
変法として、二次構造は、化学試薬、例えば、ＮａＯＨ（例えば０．１Ｎ）、ホルムアミド５０−９９％、尿素６−８Ｍからなる溶液又は核酸の二次構造を消失／低減するか、若しくは二本鎖核酸を変性することで知られている同様の試薬により消失させることができる。この場合、そのような試薬は、続く酵素的反応の前に通常エタノール沈殿を用いて除去する必要がある。
【０１０７】
さらなる変法として、リンカーヘアニール及び／又はライゲートされた標的ポリヌクレオチドは、ヘアピン−ループ形成の可能性を除去するために、高温で（ホットスタート（ｈｏｔ ｓｔａｒｔ））処理されることができる。温度範囲は、２５℃から溶液の沸点（約１００℃）までであり、好ましくは６５℃である。
【０１０８】
しかし、温度上昇により、リンカーの一方の鎖（即ち、定常部位及び可変部位を含む鎖）が除去されることがあるため、後に同一鎖リンカー又はどのようなプライマーも、リンカーの他方の鎖及び標的一本鎖ポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド配列に付加することができる。ヘアピン−ループ形成の可能性があるが、それは、図８、Ｂ及びＣに記載されている解決法を用いて回避することができる。
【０１０９】
本発明による方法を用いると、アニーリング及びライゲーション工程は非常に効率的であり、そのため、続くクローニング工程は、ＰＣＲ増幅なしで高力価（ｈｉｇｈ−ｔｉｔｅｒ）ライブラリーの調製を可能にする。
【０１１０】
本発明による方法は、従来技術における方法に比べ、特にＧ−テーリング法に比べ、ライブラリー調製をより有利にする。
【０１１１】
Ｇ−テーリング法は、実際、図５に示されるように配列決定過程における重大な欠点を有している。第二鎖ｃＤＮＡは、Ｇ−テール配列に相補的なＣの反復（その長さは簡単に調節することができないため、長さ２０−３０Ｇまで達することがある）を含む。このＣの著しい（ｅｘｃｅｓｓｉｖｅ Ｃ ｓｔｒｅｎｇｔｈ）反復は、配列決定過程を停止させ、ＤＮＡ配列決定を妨げる。
【０１１２】
本発明によるリンカーを用いた方法は、この欠点を有さず（ランダム可変部位がＧを含む場合であっても、それらは統計的には少数である）、図６及び７に記載されているように効率のよい配列決定を可能にすることができる。
【０１１３】
図６のクローンは、配列番号３のヌクレオチド１２から４９に対応するリンカーＮ６の部位（図６の四角内にマークされている）を含む。ヌクレオチド１から１１（含有）は、図２の段階Ｇに示されているように切断された。図６のリンカーの可変部位は、ＧＧＣＧＡＡである（マークされた四角内に示されている）。
【０１１４】
図７のクローンは、配列番号１のヌクレオチド１２からヌクレオチド４９に対応するリンカーＧＮ５の部位（図７の四角内にマークされている）を含む。配列番号１のヌクレオチド１から１１（含有）は、図２の段階Ｇ）に示されているように切断された。図７のリンカーの可変部位はＧＧＣＧＡＡ（マークされた四角内に示されている）である。
【０１１５】
続いて、Ｇ−テーリング法の長いＧストレッチは、周囲の配列と相互作用し、非常に強固な二次構造を形成することがあり、この現象は配列決定、転写及び翻訳効率に影響を与える。一方、本発明によるリンカーはこれらの欠点を有さない。
【０１１６】
更に、Ｇ−テーリング反応に使用されるターミナル デオキシヌクレオチジル トランスフェラーゼは、重金属、例えばＭｎＣｌ２又はＣｏＣｌ２の存在を必要とする。これらの重金属は、ｃＤＮＡ類の分解を起こし、長鎖完全コーディング／完全長ｃＤＮＡ含有率を低減する。この問題も、重金属を必要とせず、低温、例えば、４−３７℃、好ましくは１２−２０℃、又は好ましくは１６℃で用いることができる本発明によるリンカーを用いることにより解決される。
【０１１７】
本発明のもう一つの態様によれば、本発明のリンカーの一定部位は、マーカーを含むことができる。例えば、容易に認識することができる特異的オリゴヌクレオチド配列、特異的配列又は配列の組み合わせである。
【０１１８】
このマーカーの存在は、同一若しくは異なる種の異なる組織（例えば、肝臓、脳、肺等）のライブラリー又は異なる種（例えば、ヒト、マウス、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）、イネ等）のライブラリーを識別するため、及び混同しないために非常に有用である。
【０１１９】
実際、異なる組織及び／又は種から得られた多種のライブラリーが、同一実験室内で構築され、大量配列決定に使用される場合、コロニーピッキング（ｃｏｌｏｎｙ ｐｉｃｋｉｎｇ）、ＤＮＡ調製、配列決定研究、クローンバンキング、再アレーイング（ｒｅ−ａｒｒａｙｉｎｇ）等のどの段階においてもライブラリー又はクローンを取りちがえたり、混入させたりする危険性がある。
【０１２０】
ｃＤＮＡ類の個々のマーキングは、幾つかの組織からの異なるマークされたｃＤＮＡ類の調製を可能にし、混合されたｃＤＮＡライブラリーの３’末端（５’ｍＲＮＡ末端と相補的である）を配列決定することにより組織発現プロファイリングを可能にする。
【０１２１】
【実施例】
本発明による方法及び態様を、下記実施例を参照して説明する。
実施例１
テストｃＤＮＡを用いたリンカー評価
リンカー調製
リンカーオリゴヌクレオチド群は、ギブコ−ＢＲＬ ライフ・テクノロジーズ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）から購入した。オリゴヌクレオチドは、一方の一本鎖（一本上鎖（ｓｉｎｇｌｅ ｕｐｐｅｒ ｓｔｒａｎｄｓ））（可変部位を含むＡ及びＣと表されている）並びに他方の一本鎖（一本下鎖（ｓｉｎｇｌｅ ｌｏｗｅｒ ｓｔｒａｎｄｓ））（Ｂと表されている）に区別された。次いで、ＡとＣのうちの１つとＢを、２つの異なる二本鎖群を形成するために一緒に結合させた。リンカーＡの群は、定常部位オリゴヌクレオチド（この場合、配列番号１の塩基１−４３）、及び、第一塩基がＧであり（即ち、塩基番号４４）そして続く塩基が、群のそれぞれのリンカーについて異なりランダムに調製されたＮＮＮＮＮ（塩基４５−４９）である可変部位（ＧＮ５）を有するリンカーを含む。
【０１２２】
リンカーＣの群は、一定部位オリゴヌクレオチド（配列番号３の塩基１−４３）及び群内のそれぞれのリンカー毎に異なり、ランダムに調製された可変部位ＮＮＮＮＮＮ（塩基４４−４９）を含む。
【０１２３】
Ａ）ＧＮ５ Ａ鎖、
５’−ＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＣＴＣＧＡＧＣＴＣＴＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＣＣＡＧＮＮＮＮＮ−３’ （配列番号：１）；
Ｂ）Ｂ鎖、
５’−ＴＧＧＴＴＣＴＡＴＡＧＴＧＴＣＡＣＣＴＡＡＡＴＡＧＡＧＣＴＣＧＡＧＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴ−３’ （配列番号：２）；
Ｂ鎖は、合成されたときに５’末端においてもリン酸化された。
Ｃ）Ｎ６ Ｃ鎖、
５’−ＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＣＴＣＧＡＧＣＴＣＴＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＣＣＡＮＮＮＮＮＮ−３’ （配列番号：３）。
【０１２４】
国際規則（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ）及びパテンチン・スタンダード２．１マニュアル（Ｐａｔｅｎｔｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄ ２．１Ｍａｎｕａｌ）に基づき、縮重（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）ヌクレオチドの場合には、ＶはＡ、Ｇ又はＣを示し、Ｎは全ての種類のヌクレオチドを示す。
【０１２５】
これらのオリゴヌクレオチドは、非特異的サイトを有するか又はアニーリングサイトを欠く可能性のある不純物を除去するために、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（サンブロック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）、Ｊ．、フリッチェ（Ｆｒｉｔｓｃｈ）、Ｅ． Ｆ．、及びマニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）、Ｔ． （１９８９） 「モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ）」、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）、ＮＹ．）により精製された。ＧＮ５及びＮ６と名付けられた２つのリンカー群を調製した。リンカーＧＮ５は、オリゴヌクレオチドＡ／Ｂ（配列番号：１／配列番号：２）により調製され、リンカーＮ６は、オリゴヌクレオチドＣ／Ｂ（配列番号：３／配列番号：２）により調製された。それらは、オリゴヌクレオチドをＮａＣｌ（最終濃度、１００ｍＭ）と混合し、かつ、６５℃で５分間、４５℃で５分間、３７℃で１０分間及び２５℃で１０分間インキュベートすることにより調製された。
【０１２６】
調製されたリンカーは、次いで、一本鎖ＤＮＡ（類）にアニールし、かつ、一本鎖ＤＮＡ（類）とライゲートするために使用された。
【０１２７】
テスト ｃＤＮＡ
ｃＤＮＡライブラリー調製時に適当なリンカーを構築するために、テスト第一鎖ｃＤＮＡが、カルニンシ（Ｃａｒｎｉｎｃｉ）及びハヤシザキ（Ｈａｙａｓｈｉｚａｋｉ）、１９９９に記載されている方法からＣＡＰトラッピング工程を除いた方法により５ μｇの７．５ｋｂ ポリ（Ａ）−テールドＲＮＡ（ライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））から生成された。［α‐３２Ｐ］ｄＧＴＰは、逆転写工程において取込ませた。調製された第一鎖ｃＤＮＡの量は、放射能取り込み率により評価した。次いで、５０ｎｇの７．５−ｋｂ ｃＤＮＡ及び実施例１の上記段階において調製した様々な量の（２００ｎｇから２μｇ）（図３の説明も参照）リンカー（Ｎ６又はＧＮ５）を混合し、反応体積を３０μｌとしてライゲーションを行った。反応は、終夜１０℃でインキュベートすることにより行なった。
【０１２８】
ライゲーション後、過剰リンカーを除去するために、リンカー結合一本鎖ｃＤＮＡサンプルを、１０ｍＭのＥＤＴＡ／０．２％ＳＤＳ（反応体積、４０μＬ）中の０．２ｍｇ／ｍＬのプロティナーゼＫと共に４５℃で１５分間インキュベートした。反応生成物は、フェノール／クロロホルム４０μＬを用いて抽出した。次いで、フェノール／クロロホルム混合物を、フェノール／クロロホルム混合物の界面に残っている反応生成物を抽出するために、６０μＬのカラム緩衝液（１０ ｍＭ トリス−ＨＣｌ、１ ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１ Ｍ ＮａＣｌ、０．１％ ＳＤＳ； ｐＨ ７．５）により処理した。抽出した反応生成物を、ゲル濾過カラム セファクリル（商標）（ＳｅｐｈａｃｒｙｌＴＭ）−３００（アマシャム・ファルマシア・バイオテク（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ））に載せ、４００ ｘ ｇで２分間の遠心分離により精製した。抽出したフラクション（精製されたリンカー第一鎖ｃＤＮＡサンプルを含む）は、イソプロパノールを用いて沈殿した。
【０１２９】
コントロールサンプル（一本鎖テストｃＤＮＡを含むがリンカーを含まない）を、第二鎖ｃＤＮＡ合成に使用した。第二鎖ｃＤＮＡ合成を補助するための本発明の方法の能力を評価するために、１０ｎｇの精製されたリンカーをライゲートしたサンプル（図３のレーン１−６）及びコントロールとしてライゲートされていない７．５−ｋｂの第一鎖ｃＤＮＡ（図３のレーン７）を、１μＬの１０Ｘ ＥｘＴａｑＴＭ緩衝液、１μｌの２．５ｍＭ ｄＮＴＰ類、０．５μＬの［α−３２Ｐ］ｄＧＴＰ、及び０．５μＬ のＥｘ−ＴａｑＴＭ（タカラ（Ｔａｋａｒａ））を含む１０μＬの反応溶液にそれぞれ混合した。得られたサンプルを、６５℃で５分間、６８℃で３０分間及び７２℃で１０分間インキュベートし、次いでアルカリゲル電気泳動を用いて分析した。
【０１３０】
アルカリゲル電気泳動は、５μｌのサンプルを１μｌの６ｘ アルカリ色素（サンブロック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）、６．７、６．１２ ）へ添加することにより行なった。電気泳動ゲルは、０．８％アガロース、５０ｍＭのＮａＯＨ、５ｍＭのＥＤＴＡを含むものを用い、緩衝液は５０ｍＭの ＮａＯＨ及び５ｍＭのＥＤＴＡ（サンブロック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ））を含むものを用いた。
【０１３１】
結果
レーン１−３は、５０ｎｇの一本鎖テストｃＤＮＡとそれぞれ２００ｎｇ、５００ｎｇ及び２μｇのリンカーＧＮ５とのライゲーションを示している。
レーン４−６は、５０ｎｇの一本鎖テストｃＤＮＡとそれぞれ２００ｎｇ、５００ｎｇ及び２μｇのリンカーＮ６とのライゲーションを示している。
レーン７はコントロールである。１０ ｎｇの一本鎖第一鎖ｃＤＮＡを、１μＬの１０Ｘ ＥｘＴａｑＴＭ緩衝液、１μＬの２．５ ｍＭ ｄＮＴＰ類、０．５ μｌの［α−３２Ｐ］ｄＧＴＰ、及び０．５ μＬのＥｘ−ＴａｑＴＭ （タカラ（Ｔａｋａｒａ））を含む１０μＬの反応溶液へ添加した。サンプルを、６５℃で５分間、６８℃で３０分間、及び７２℃で１０分間インキュベートした。一本鎖ｃＤＮＡは、ヘアピン構造を形成することにより伸長され、第二鎖ｃＤＮＡを形成した。これは、アルカリゲル電気泳動において１５ ｋｂの位置に検出された。
レーン８は、第一鎖ｃＤＮＡ（２３ｎｇ）（リンカーなし）を含む。これは、７．５ｋｂの位置に検出される。
レーン９は、マーカーを表す。
図３の電気泳動は、レーン１−６においてライゲーションは特に効果的であり（７．５ｋｂのレベルのスポット）、かつ、ライゲーションが起こらなかったものの量は無視できる程度であった（１５ｋｂのレベルのスポット）ことを示す。
【０１３２】
実施例２
完全長ｃＤＮＡライブラリー調製及びｃＤＮＡ分析
リンカー調製
リンカーは、実施例１に記載されているように調製した。
【０１３３】
ＲＮＡ 調製
マウス肝臓組織のスライス（０．５−１ｇ）を、１０ｍｌの懸濁液中でホモジナイズし（ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｄ）、１ｍｌの２Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）及び同量のフェノール／クロロホルム混合物（体積比５：１）により抽出した。抽出後、同量のイソプロパノールを、ＲＮＡを沈殿させるために水相に添加した。このサンプルを、氷上で１時間インキュベートし、それら沈殿物を回収するために４０００ｒｐｍで１５分間冷却しながら遠心分離した。得られた沈殿物を、７０％エタノールで洗浄し、８ｍｌの水に溶解した。２ｍｌの５Ｍ ＮａＣｌを１％ＣＴＡＢ（セチルトリエチルアンモニウムブロミド）、４Ｍ尿素、及び５０ｍＭトリスを含む１６ｍｌの水溶液（ｐＨ７．０）に添加することにより、ＲＮＡを沈殿させ、多糖類を除去した（ＣＴＡＢ沈殿）。４０００ｒｐｍで１５分間室温で遠心分離した後、ＲＮＡを４ｍｌの７Ｍグアニジン−Ｃｌ中に溶解した。次いで、２倍量のエタノールを溶液に添加し、１時間氷上でインキュベートし、４０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。得られた沈殿物を、７０％エタノールで洗浄し、回収した。沈殿物を、水に再溶解し、ＯＤ比２６０／２８０（＞１．８）及び２３０／２６０（＜０．４５）を測定することによりＲＮＡの純度を決定した。このようにして得られた全ＲＮＡは、続いて、全ＲＮＡのためのｍＲＮＡ単離キット ＭＡＣＳＴＭ（ミルテニイ・バイオテク（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ドイツ）を用いて精製され、ポリＡ＋を有するものを凝縮した。
【０１３４】
ｃＤＮＡ 合成
５から１０μｇのこのポリＡ＋リッチＲＮＡ、５μｇのＢａｍＨＩサイトを含む第一鎖プライマー５’−（ＧＡ）５ＡＧＧＡＴＣＣＡＡＧＡＧＣＴＣ（Ｔ）１６ＶＮ−３’ （配列番号：４）及び１１．２μｌの８０％グリセロールを、総体積が２４μｌになるように混合した。ＲＮＡ／プライマー混合物を、６５℃で１０分間変性させた。並行して、最終体積が７６μｌになるように、１８．２μｌの５Ｘ第一鎖合成緩衝液、９．１μｌの０．１Ｍ ＤＴＴ、６．０μｌの１０ｍＭ（それぞれ）ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、及び５−メチル−ｄＣＴＰ（ｄＣＴＰの代替）、２９．６μｌの飽和トレハロース〔約８０％、低金属含有量；フルカ・バイオケミカ（Ｆｌｕｋａ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｋａ）〕、及び１０．０μｌのスーパースクリプト（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ） ＩＩ逆転写酵素（２００Ｕ／μｌ）を混合した。１．０μｌの［α−３２Ｐ］ｄＧＴＰを第三チューブへ入れた。ｍＲＮＡ、グリセロール、及びプライマーは、氷上でスーパースクリプト（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ）を含む溶液と混合し、そのアリコット（２０％）を、 ［α−３２Ｐ］ｄＧＴＰを含むチューブへ即座に添加した。第一鎖ｃＤＮＡ合成は、加熱蓋を有するサーモサイクラー（ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ）（例えばＭＪリサーチ（Ｒｅｓｅａｒｃｈ））内で下記のように設定したプログラムに従い、行われた：段階１、４５℃で２分間；段階２、勾配アニーリング：３５℃へ冷却１分以上；段階３、完全アニーリング：３５℃で２分間；段階４、５０℃で５分間；段階５、０．１℃／秒で６０℃へ上昇；段階６、５５℃で２分間；段階７、６０℃で２分間；段階８、段階６に戻り更に１０サイクル。放射能取り込みにより、ｃＤＮＡ収量を評価することができた。 （カルニンシ（Ｃａｒｎｉｎｃｉ）及びハヤシザキ（Ｈａｙａｓｈｉｚａｋｉ）、１９９９）。ｃＤＮＡは、プロティナーゼＫ、フェノール／クロロホルム及びクロロホルム抽出により処理され、かつ、酢酸アンモニウムを塩として用いエタノール沈殿させた（カルニンシ（Ｃａｒｎｉｎｃｉ）及びハヤシザキ（Ｈａｙａｓｈｉｚａｋｉ）、１９９９）。
【０１３５】
ｍＲＮＡ ビオチン化
ビオチン化の前に、キャップ（ｃａｐ）のジオール基及びｍＲＮＡの３’末端を、第一鎖ｃＤＮＡを含む ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡの再懸濁物、６６ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ ４．５）、及び５ｍＭ ＮａＩＯ４を含む最終体積５０μｌの反応液内で酸化した。サンプルを、氷上で暗条件下、４５分間インキュベートした。ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡハイブリッドを、次いで、０．５μｌの１０％ ＳＤＳ、１１μｌのＮａＣｌ、及び６１μｌのイソプロパノールを添加することにより沈殿させた。暗条件下、氷上で４５分間インキュベートした後、サンプルは、１０分間１５，０００ｒｐｍで遠心分離された。最後に、ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡハイブリッドを、７０％エタノールで２回洗浄し、５０μｌの水に再懸濁した。続いて、キャップを、５μｌの１Ｍ 酢酸ナトリウム（ｐＨ６．１）、５μｌの１０％ ＳＤＳ、及び１５０μｌの１０ ｍＭビオチンヒドラジドロングアーム（ｌｏｎｇ−ａｒｍ）（ベクター・バイオシステム（Ｖｅｃｔｏｒ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ））を添加することにより、最終体積２１０μｌの反応液中でビオチン化した。室温で終夜（１３時間）インキュベート後、ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡハイブリッドを、７５μｌの１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ６．１）、５μｌの５Ｍ ＮａＣｌ、及び７５０μｌの無水エタノールの添加により沈殿させ、かつ、氷上で１時間インキュベートした。ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡハイブリッドを、１５，０００ ｒｐｍで１０分間の遠心分離によりペレット化し、次いで、ペレットを７０％エタノールで１回、８０％エタノールで１回洗浄した。ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡハイブリッドを、次いで７０μｌの０．１Ｘ ＴＥ（１ ｍＭ トリス［ｐＨ ７．５］、０．１ ｍＭ ＥＤＴＡ）中に再懸濁した。
【０１３６】
完全長 ｃＤＮＡ の吸着及び解離
５００μｌのＭＰＧストレプトアビジンビーズ及び１００μｇのＤＮＡを含まないｔＲＮＡを混合し、得られた混合物を、氷上で３０分間時々攪拌しながらインキュベートした。ビーズは、３分間、磁気スタンドを用いることにより分離し、上清を除去した。ビーズを、次いで５００μＬの洗浄／結合溶液（２Ｍ ＮａＣｌ、５０ ｍＭ ＥＤＴＡ［ｐＨ ８．０］）を用いて３回洗浄した。
【０１３７】
同時に、出発材料としたｍＲＮＡ１μｇ当たり１単位のＲＮａｓｅ Ｉ（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））が、製品の付属の緩衝液中のｍＲＮＡ／ｃＤＮＡハイブリッドサンプルへ添加された（最終体積、２００μｌ）；サンプルを、３７℃で１５分間インキュベートした。反応を終止させるために、サンプルを氷上に置き、１００μｇのｔＲＮＡ及び１００μｌの５ Ｍ ＮａＣｌを添加した。完全コーディング／完全長ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡハイブリッドを吸着するために、４００ μｌの洗浄／結合溶液に再懸濁したＲＮａｓｅ Ｉ処理されたビオチン化ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ及び洗浄したビーズを混合した。混合後、チューブを３０分間室温で穏やかに回転させた。完全コーディング／完全長ｃＤＮＡは、ビーズに吸着され、短いｃＤＮＡ類は吸着されなかった。ビーズを、磁気スタンドを用いて上清から分離した。非特異的吸着ｃＤＮＡ類を除去するために、ビーズを穏やかに洗浄した。洗浄／結合溶液による２回の洗浄を行なった。１回目は０．４％ ＳＤＳ、５０ μｇ／ｍｌ ｔＲＮＡを含むもの、２回目は１０ ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、４０ μｇ／ｍｌ ｔＲＮＡ、１０ｍＭ ＮａＣｌ、及び２０％グリセロールを含むのもを用い、かつ、５０μｇ／ｍｌ ｔＲＮＡ水溶液を用いた。
【０１３８】
ｃＤＮＡは、５０μｌの５０ｍＭ ＮａＯＨ、５ｍＭのＥＤＴＡを添加し、１０分間室温で時々攪拌しながらインキュベートすることによりビーズから解離した。次いで、磁気を用いてビーズを除去し、抽出したｃＤＮＡは、氷上の５０μｌの１Ｍ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．０を含むチューブに移した。溶出サイクルは、大部分のｃＤＮＡ（小型（ｈａｎｄ−ｈｅｌｄ）モニターを用いた放射性モニタリング測定により８０から９０％）がビーズから回収されるまで、５０ｍＭ ＮａＯＨ、５ｍＭ ＥＤＴＡの５０μｌアリコットを用いて、１回又は２回繰り返された。
【０１３９】
ＲＮＡの残さを除去するために、回収したｃＤＮＡに１μｌの ＲＮａｓｅ１（１０Ｕ／μｌ）を氷上で直ちに添加した；次いで、サンプルを、３７℃で１０分間インキュベートした。ｃＤＮＡを、プロティナーゼＫ処理し、次いで、フェノール／クロロホルム抽出、かつ、再抽出（ｂａｃｋ−ｅｘｔｒａｃｔｅｄ）した。その後、サンプルは、ミクロコン（Ｍｉｃｒｏｃｏｎ） １００（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））を用い、４０−６０分間、２０００ ｒｐｍの限外濾過を１ラウンドで行い濃縮された。
【０１４０】
ｃＤＮＡ の ＣＬ−４Ｂ スピンカラム分画 （ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ）
ｃＤＮＡサンプルは、次いで、マニュアル（Ｓ−４００スピンカラム、例えば、アマシャム−ファルマシア（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のものも使用することができる）に沿って、ＣＬ−４Ｂクロマトグラフィー（カルニンシ（Ｃａｒｎｉｎｃｉ）及びハヤシザキ（Ｈａｙａｓｈｉｚａｋｉ）、１９９９）により処理された。
【０１４１】
ｃＤＮＡ 類 − リンカーライゲーション
上記のように調製したＣａｐ−トラッパー（Ｔｒａｐｐｅｒ）完全長一本鎖ｃＤＮＡ類を、３つの異なるチューブに分注した。１つはＧ−テーリング用、第二のチューブはＧＮ５リンカー用、更に、最後のチューブはＮ６／ＧＮ５混合リンカー用とした。２００ｎｇのｃＤＮＡのアリコットは、従来技術に記載されているようにｄＧホモポリマーを用いて末端処理（ｔａｉｌｅｄ）し、かつ、コントロールｃＤＮＡライブラリー調製のために使用した（カルニンシ（Ｃａｒｎｉｎｃｉ）ら、ゲノミクス（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）、１９９６）。
【０１４２】
３００ｎｇのＣａｐ−トラッパー完全長第一鎖ｃＤＮＡ類を、ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）−ＢＲＬ／ライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｏｇｉｅｓ）により上記のように調製されたリンカーを用いたリンカーライゲーションのための基質として使用し、ｃＤＮＡライブラリー構築を行った（図１及び２に示す）。
【０１４３】
３００ｎｇの一本鎖ｃＤＮＡを、８００ｎｇの比率１：４のＮ６／ＧＮ５リンカー混合物及び８００ｎｇのＧＮ５リンカーへ添加した。
【０１４４】
ライゲーション基質（上記のように調製されたｃＤＮＡ／リンカー）、溶液Ｉ及び溶液ＩＩ（ライゲーションキット、タカラ（Ｔａｋａｒａ））を、１：２：１の比率で混合した。全ての工程を、製品に付属の説明書に従って行った。よって、反応体積は３０μｌであり、７．５μｌのサンプル、１５μｌの溶液Ｉ及び７．５μｌの溶液ＩＩを含んでいた。反応は１０℃で終夜行なった（図２Ｅ）。
【０１４５】
過剰リンカーからの単離
ｃＤＮＡとリンカーとの間のアニーリング及びライゲーションの後、ゲル濾過を行なった。上記のように、３０μｌのリンカー−ライゲーションサンプルは、１０ｍＭのＥＤＴＡ及び０．２％のＳＤＳ存在下、０．２ｍｇ／ｍｌのプロティナーゼＫにより処理した。それらを、４５℃で１５分間インキュベートし、次いで、フェノール／クロロホルム抽出した。サンプルは、６０μｌのカラム緩衝液（１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．１％ ＳＤＳ、ｐＨ７．５）を用いて再抽出（ｂａｃｋ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ）した。続いて、サンプルを、ゲル濾過セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ） Ｓ３００（アマシャム・ファルマシア。バイオテク（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ））用のスピンカラムに掛けた。スピンカラムの段階では、４００Ｘ ｇで２分間、遠心分離を行なった。溶出フラクションを回収し、イソプロパノールで沈殿した。
【０１４６】
精製段階後、第二鎖ｃＤＮＡ合成を行なった（図２Ｆ）。
第二鎖ｃＤＮＡを合成するために、全ての精製されたリンカーとライゲートしたサンプルを使用した。６μｌの１０ ｘ ＥｘＴａｑ緩衝液 タカラ（Ｔａｋａｒａ）、並びに６μｌの１０ｍＭ ｄＮＴＰ類及び０．５μｌの［α−３２Ｐ］ｄＧＴＰを、６０μｌのチューブ（ｔｈｅ ｔｕｂｅｓ ｉｎ ６０μｌ）に添加した。サンプルを、７２℃で１５秒間予めインキュベートし、次いで、０．５μｌのＥｘＴａｑを添加した。続いて、それらを７２℃で３０分間インキュベートした。
【０１４７】
サンプルを、アルカリゲル電気泳動で分析した。即ち、合成された第二鎖を含む０．５μｌのサンプルに、最終体積６μｌになるように１μｌの６ｘアルカリ色素（サンブロック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）、６．７、６．１２）を添加し、電気泳動を行なった。
【０１４８】
電気泳動は、０．８％のアガロース、５０ｍＭ ＮａＯＨ、５ｍＭ ＥＤＴＡを含むアガロースゲルを用い、かつ５０ｍＭ ＮａＯＨ及び５ｍＭ ＥＤＴＡ（サンブロック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ））を含む電気泳動バッファーを用いて行なった。
【０１４９】
サンプルは、フェノール／クロロホルムにより精製し、次いで、標準条件下、エタノール沈殿を行なった（サンブロック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）、Ｊ．、 フリッチェ（Ｆｒｉｔｓｃｈ）、 Ｅ． Ｆ．、及びマニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）、Ｔ． （１９８９）「モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ９：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ）」、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）、ＮＹ．）。
【０１５０】
続いて、ｃＤＮＡを、ＢａｍＨＩ（２５Ｕ／μｇのｃＤＮＡ類）及びＸｈｏ Ｉ（２５Ｕ／μｇのｃＤＮＡ類）を用いて３７℃で１時間切断し、かつ、フェノール／クロロホルムにより抽出した。水相は、ＣＬ４Ｂゲル濾過スピンカラム（アマシャム・ファルマシア・バイオテク（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ））を用いて精製し、次いで２ μｇのグリコーゲンの存在下、記載されているようにエタノール沈殿を行なった（カルニンシ（Ｃａｒｎｉｎｃｉ）及びハヤシザキ（Ｈａｙａｓｈｉｚａｋｉ）、１９９９）。
【０１５１】
ｐＢＳ ＩＶ ベクター構築
１０ｎｇのｐＢＳ ＳＫ＋（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））、２０μｌの１０ｘ ＮＥＢ緩衝液２（ニュー・イングランド・バイオラボズ社（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ））、２０μｌの１０ｍｇ／ｍｌ ウシ血清アルブミン（ＮＥＢ）、３０単位のＮｏｔ Ｉ（ＮＥＢ）、３０単位のＫｐｎ Ｉ（ＮＥＢ）及び１０単位のＸｈｏ Ｉ（ＮＥＢ）を、体積が２００μｌになるように混合し、３７℃で２時間インキュベートした。次いで、長いプラスミド部分を短いＤＮＡ断片から分離するために、この混合物を１ｘ ＴＡＥ／０．５μｇ／ｍｌのエチジウム ブロミド緩衝液中の０．８％ シープラーク（ＳｅａＰｌａｑｕｅ）アガロースゲル（ＦＭＣ バイオプロダクツ（Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ））／ １ｘ ＴＡＥ緩衝液／ ０．５ μｇ／ｍｌ エチジウム ブロミド （８ ｃｍ ｘ ８ ｃｍ）において、５０Ｖで１時間電気泳動に付した（分子クローニング）。長いプラスミド部分は、ゲルから切り出され、そのゲルをチューブへ移した。切断されたプラスミドを抽出し、ジーンクリーン（ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ） ＩＩ（商標）キット（バイオ１０１社（Ｂｉｏ １０１ Ｉｎｃ．））により精製した。プラスミドの濃度及び純度はアガロースゲル電気泳動を用いて、既にその濃度が分かっている標準プラスミドとの比較により確認した。
【０１５２】
二本鎖オリゴヌクレオチド調製
使用されたオリゴヌクレオチドは、ライフテクノロジー・ライフテックオリエンタル社（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ−Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈ Ｏｒｉｅｎｔａｌ）（東京、日本）に合成を依頼し（ｃｕｓｔｏｍ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ）、次いで、不純物を除去するために変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて精製した（マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）等）。Ｎｏｔ／Ｋｐｎ 二本鎖オリゴヌクレオチドは、下記の２つの一本鎖オリゴヌクレオチドを混合することにより調製した：
【０１５３】
一方の鎖（上鎖（Ｕｐｐｅｒ−ｓｔｒａｎｄ））
（５’ＧＧＣＣＧＣＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＧＣＡＴＡＣＡＴＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴＧＧＡＴＣＡＧＧＣＣＡＡＡＴＣＧＧＣＣＧＡＧＣＴＣＧＡＡＴＴＣＧＴＣＧＡＣＧＡＧＡＧＡＣＴＧＣＡＧＧＡＧＡＧＡＧＧＡＴＣＣＧＧＴＡＣ−３’）（配列番号：６）；及び
他方の鎖（下鎖（Ｌｏｗｅｒ−ｓｔｒａｎｄ））
ＮａＣｌ中の
（５’ＣＧＧＡＴＣＣＴＣＴＣＴＣＣＴＧＣＡＧＴＣＴＣＴＣＧＴＣＧＡＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＣＣＧＡＴＴＴＧＧＣＣＴＧＡＴＣＣＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＡＴＧＣＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴＧＣ −３’）（配列番号：７）（最終濃度、１００ｍＭ）。
【０１５４】
この混合物は、次いで、６５℃で５分間、４５℃で５分間、３７℃で１０分間、かつ、２５℃で１０分間インキュベートされた。
【０１５５】
ベクターオリゴヌクレオチドライゲーション
１００ｎｇのＫｐｎ Ｉ及びＮｏｔ Ｉサイトを末端に有するこのプラスミドと、３ｎｇのＮｏｔ／Ｋｐｎ二本鎖オリゴヌクレオチド、１μｌ １０ ｘ ライゲーション緩衝液（ＮＥＢ）及びＴ４ ＤＮＡ リガーゼ（ＮＥＢ）を、１０μｌ中で混合した。
【０１５６】
細胞形質転換
ライゲーションサンプルを含むチューブを、次いで、終夜１６℃でインキュベートした。ライゲーションサンプルは、２５０ｍＭのＮａＣｌ、１μｇのグリコーゲン及びイソプロパノールと混合し、次いで緩衝液を除去するために沈殿させた。続いて、それを、１０μｌの滅菌水に溶解した。得られたサンプルのうち１μｌを、エレクトロポレーション（製造者のプロトコルに従う）により大腸菌細胞ＤＨ１０Ｂ（ライフ・テック・オリエンタル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈ Ｏｒｉｅｎｔａｌ））の懸濁液へ形質転換するために添加した。形質転換された細胞は、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢプレート上で選択された。アンピシリン耐性クローンは、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含む ＬＢ液体培地中で、３７℃で１６時間攪拌しながら培養した。合成した二本鎖オリゴヌクレオチドの挿入に使用した組換えプラスミドは、アルカリＳＤＳ法（分子クローニング）により精製した。挿入した配列はＭ１３前プライマー（ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ）（配列番号：５）及びビッグダイキット（Ｂｉｇ ｄｙｅ ｋｉｔ）を用い、ＡＢＩ３７７ ＤＮＡシーケンサー（ＰＥ−アプライド・バイオシステムズ（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ））により確認された。
【０１５７】
ベクター調製
上記のようにして得られた１０μｇの改変ｐＢＳ ＳＫ（＋）プラスミド（ｐＢＳ ＩＶと呼ばれる）に、２０μｌの１０ｘ Ｂａｍ ＨＩ緩衝液、２０μｌの１０ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン（ニュー・イングランド・バイオラボズ社（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ））、３０単位のＢａｍＨ Ｉ（ニュー・イングランド・バイオラボズ社（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ））、３０単位のＳａｌ Ｉ（ニュー・イングランド・バイオラボズ社（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ））を添加し、体積が２００μｌになるように調整し、３７℃で１．５時間インキュベートした。続いて、１０単位のＰｓｔ Ｉ（ニュー・イングランド・バイオラボズ社（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ））を、チューブ中の混合物に添加し、３０分間インキュベートした。更に、０．５単位の温度感受性アルカリフォスファターゼＴｓＡＰ（ライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））によってプラスミド末端の脱リン酸化を行った。ＴｓＡＰは、部分的に切断されたプラスミドによるバックグラウンド（ｂａｃｋｇｒａｏｕｎｄ）を低減する。脱リン酸化された末端は、お互いにライゲートすることができない。チューブは、３７℃で３０分間インキュベートされた。ＴｓＡＰを不活性化するために、ＥＤＴＡ（最終濃度２０ｍＭ）を添加し、６５℃で３０分間インキュベートした。制限酵素／ＴｓＡＰ処理されたプラスミドは、ベクター構築段階において前述のように分離した。Ｂａｍ ＨＩ及びＳａｌ Ｉサイトを末端に有する線状プラスミドに対応するバンドを、ゲルから切り出し、このゲルをスライスして小断片とした。それを５００μｌの１ｘ βアガラーセ（β‐ａｇａｒａｓｅ）緩衝液（ＮＥＢ）を含むチューブへ入れ、氷上で３０分間放置した。緩衝液を１度交換し、更に氷上で３０分間放置した。
【０１５８】
このチューブを、ゲルを溶解するために６５℃で１０分間インキュベートした。溶液を１００μｌにするために、β‐アガラーセ緩衝液を添加した。次いで、それを、３分間４５℃にて冷却し、β‐アガラーセ （ＮＥＢ）を、３Ｕ／１００μｌ反応溶液の濃度になるように（ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ３Ｕ／１００μｌ ｒｅａｃｔｉｏｎ）添加した。この反応液を、４５℃で６時間インキュベートした。１０μｌの５Ｍ ＮａＣｌ及び１００μｌのフェノール／クロロホルムをチューブへ添加した。チューブを、５分間静かに上下を逆にするように振り、１５ ｋｒｐｍで３分間室温で遠心分離した。水相を回収し、次いで、クロロホルム抽出及びイソプロパノール沈殿を行なった。チューブは、１５ｋｒｐｍで１０分間４℃で遠心分離し、得られたペレットを、８０％エタノールで２回洗浄した。最終的に、ペレットを、最終濃度が１００ ｎｇ／μｌになるように滅菌水に溶解した。アガロースゲル電気泳動により、濃度が既にわかっている標準プラスミドと比較することによって、ベクターの濃度及び純度を確認した。
【０１５９】
クローニング
前段階で得られた１０ｎｇのｃＤＮＡと、１９０ｎｇの上記改変ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ（＋）（ＰｂｓＩＶ）（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））とを終夜ライゲートした。
ｃＤＮＡ−ベクターライゲーションは、２．５倍体積のＥｔＯＨを用いて沈殿させた。サンプルは、エレクトロポレーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）により大腸菌ＤＨ１０Ｂ（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ） ＢＲＬ）へ導入した。形質転換された細胞を、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢプレート上に塗布し、終夜３７℃で培養した。３６コロニーを無作為に採取し、ＬＢアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）液体培地中、終夜３７℃で培養した。３つの培養物から組換えプラスミドを抽出した（サンブロック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、１９８９）。これらの３つの精製されたプラスミドは、キットマニュアル指示書に従ってＡＢＩ３７００ ＤＮＡシーケンサー（ＰＥ−アプライド・バイオシステム（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍ））を用いることにより、ビッグダイターミネーターサイクル配列決定レディー反応キット（Ｂｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ）（ＰＥ−ＡＢＩ）及びＭ１３前プライマーＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ （配列番号：５）を用いて５’末端から配列決定された。
【０１６０】
実施例３
ライゲーション効率
上記のように調製したリンカーと、マウス肝臓由来のｃＤＮＡ類とのライゲーションにおいて、２μｇの混合リンカー（Ｎ６：ＧＮ５ ＝ １：４ ）を、様々な量のｃＤＮＡ類（１μｇ、０．５μｇ及び０．２μｇ、それぞれ図４のレーン１、２及び３）とライゲートした。その後、５０ｎｇのライゲートされたｃＤＮＡ類を第二鎖合成に使用し、かつ、アルカリゲル電気泳動で分析した。全ての電気泳動パターン及び取込み率は、同じであり（レーン１−３）、２μｇのリンカーは、いずれの異なる量のｃＤＮＡ類にも効率的にライゲートされたことを示している。リンカーの量が適当でない場合、過剰発現ｃＤＮＡバンドは、ヘアピン構造を形成することにより２倍のサイズに変化し得る。しかし、第一鎖ｃＤＮＡ及び全ての第二鎖ｃＤＮＡ類は同様のパターン（同じサイズ）を示した。
【０１６１】
実施例４
完全長 ｃＤＮＡ 類調製のリンカーライゲーション効率
肝臓マウスｃＤＮＡライブラリーは、ＣＡＰトラッパー技術を用いて上記と同様の方法により調製された。
上記実施例に記載されたリンカー法を用いることにより調製されたものが、完全長ｃＤＮＡであるか否かは、配列決定段階後、ＡＴＧ開始コドンの存在を確かめることによりチェックした。実際、開始ＡＴＧからの完全コーディング配列を含むそれらのｃＤＮＡ類は、完全長ｃＤＮＡ類としてみなされた（ａｃｃｅｐｔｅｄ）。５’配列を、ＢＬＡＳＴを用いて公共のヌクレオチドデータベースと比較した。（アルツシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）、Ｓ．Ｆ．、ギシュ（Ｇｉｓｈ）、Ｗ．、ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）、Ｗ．、マイヤーズ（Ｍｙｅｒｓ）、Ｅ．Ｗ．及びリプマン（Ｌｉｐｍａｎ）、Ｄ．Ｊ．、１９９０、「ベーシック・ローカル・アライメント・サーチ・ツール（Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ．）」 Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３−４１０）。
【０１６２】
塩基配列は、キットマニュアルに従いビッグダイターミネーターサイクル配列決定レディー反応キット（ＰＥ−ＡＢＩ）及びパーキン・エルマー−アプライド・バイオシステムズ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ） ＡＢＩ ３７００を用いて決定された。
【０１６３】
使用したシークエンシングプライマーは、５’側Ｍ１３プライマー（配列番号：５）である。
データは、表１に示されている。ＡＴＧの存在（転写が始まる位置）に、対応する位置を記した。例えば、サンプル２．０１を参照にすると、ＡＴＧコドンのアデノシンは位置６３であり、これは、このｃＤＮＡ配列が６２ｂｐ ５’−ＵＴＲを有することを示している。
【０１６４】
【表１】
【０１６５】
これらのデータは、本発明によるリンカー法を用いてｃＤＮＡ類が効率よく調製され、配列決定されることを示している。
表１のクローン２．０５の配列決定は、図６のチャートに示されている。
表１のクローン３．０７の配列決定は、図７のチャートに示されている。
【０１６６】
従来のＧ−テーリング ＣＡＰ−トラッピング に対するＣＡＰトラッピング‐リンカーの利点
Ｉ） Ｇ−テールの長さの調節は、何年もの間困難であった。第二鎖プライマーをアニールするために、ｃＤＮＡクローンは少なくとも１１のｄＧ類、平均１３−１５のｄＧ類を有している。Ｇ−テーリング反応は１５−３０ｎｔに自ら制限されているけれども（Ｈｙｏｎｅ−Ｍｙｏｎｇ Ｅｕｎ、１９９６、エンジモロジー・プライマー・フォー・リコンビナント・ＤＮＡテクノロジー（Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ Ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、４７７ページ）、約２０塩基より長いＧストレッチが得られることがしばしばあり、配列決定収率を著しく低減させ、又、最悪の場合失敗を招いていた。一方、短いＧストレッチの場合は、長い配列を読むことが困難だった（図５参照）。配列決定中、長いＧストレッチは、周囲の配列と相互作用し、非常に強固な二次構造を形成することがある。これは、典型的にはＧＣリッチである５’ＵＴＲ類との相互作用において問題を起こすことがある。これは、特に、Ｃａｐ−トラッピングライブラリーの場合のように、完全長ｃＤＮＡ類合成において深刻な問題である。
【０１６７】
本発明によるリンカーを用いた方法は、従来法とは異なり、このような欠点がなく（無作為可変部位がＧを含む場合でも、それらは統計的に少数に留まる）、効率の良い配列決定を可能にする（図６及び７）。
ＩＩ） Ｇ−ストレッチは、機能的研究、例えば、発現クローニングのようにタンパク質発現を必要とする場合、翻訳効率に影響を与えると予測される（キング（Ｋｉｎｇ） ＲＷ、 ラスチグ（Ｌｕｓｔｉｇ） ＫＤ、スツケンバーグ（Ｓｔｕｋｅｎｂｅｒｇ） ＰＴ、 マクガリ（ＭｃＧａｒｒｙ） ＴＪ、キルシェナー（Ｋｉｒｓｃｈｎｅｒ） ＭＷ． エクスプレッション・クローニング。イン・ザ・テスト・チューブ（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃｌｏｎｉｎｇ ｉｎ ｔｈｅ ｔｅｓｔ ｔｕｂｅ．） サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ．）１９９７；２７７：９７３−４）。一方、本発明のリンカー配列は、転写及び翻訳を阻害しない。
【０１６８】
産業上の利用可能性
本発明は、ｃＤＮＡライブラリーの調製のための新規かつ効率的な方法を提供する。より具体的には、本発明は、ｃＤＮＡライブラリーの調製方法において利用可能なＧ−テーリングに代わる新規リンカーを提供し、かつ前記リンカーを用いるｃＤＮＡライブラリーの調製方法を提供する。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、１例として可変部位ＧＮＮＮＮＮを含むリンカー群を用いた完全長ｃＤＮＡライブラリー調製工程の例を示す。
【図２】図２は、図１の続きで、１例として可変部位ＧＮＮＮＮＮを含むリンカー群を用いた完全長ｃＤＮＡライブラリー調製工程の例を示す。
【図３】図３はテストｃＤＮＡとリンカーとの間のライゲーションの結果を示す。
【図４】図４は、様々なモル比のリンカーを用いた細胞内ｃＤＮＡのリンカーライゲーションｃＤＮＡとリンカーとの比を調べた結果を示す。
【図５】図５は、従来技術に記載のＧ−テールを有する ｃＤＮＡ配列の配列決定チャートを示している。
【図６】図５は、従来技術に記載のＧ−テールを有する ｃＤＮＡ配列の配列決定チャートを示している。
【図７】図５は、従来技術に記載のＧ−テールを有する ｃＤＮＡ配列の配列決定チャートを示している。
【図８】図５は、従来技術に記載のＧ−テールを有する ｃＤＮＡ配列の配列決定チャートを示している。
【図９】図５は、従来技術に記載のＧ−テールを有する ｃＤＮＡ配列の配列決定チャートを示している。
【図１０】図６は、Ｎ６／ＧＮ６リンカー混合物（比率１：４）とライゲートされたｃＤＮＡ配列の配列決定チャートを示す。
【図１１】図６は、Ｎ６／ＧＮ６リンカー混合物（比率１：４）とライゲートされたｃＤＮＡ配列の配列決定チャートを示す。
【図１２】図６は、Ｎ６／ＧＮ６リンカー混合物（比率１：４）とライゲートされたｃＤＮＡ配列の配列決定チャートを示す。
【図１３】図６は、Ｎ６／ＧＮ６リンカー混合物（比率１：４）とライゲートされたｃＤＮＡ配列の配列決定チャートを示す。
【図１４】図６は、Ｎ６／ＧＮ６リンカー混合物（比率１：４）とライゲートされたｃＤＮＡ配列の配列決定チャートを示す。
【図１５】図７は、ＧＮ５リンカーとライゲートされたｃＤＮＡ配列の配列決定チャートを示す。
【図１６】図７は、ＧＮ５リンカーとライゲートされたｃＤＮＡ配列の配列決定チャートを示す。
【図１７】図７は、ＧＮ５リンカーとライゲートされたｃＤＮＡ配列の配列決定チャートを示す。
【図１８】図７は、ＧＮ５リンカーとライゲートされたｃＤＮＡ配列の配列決定チャートを示す。
【図１９】図７は、ＧＮ５リンカーとライゲートされたｃＤＮＡ配列の配列決定チャートを示す。
【図２０】図８は、ループバイアス及びその可能な解決法を図で示している。
技術分野
本発明は、オリゴヌクレオチド定常部位及びオリゴヌクレオチド可変部位を含むリンカー群並びに前記リンカー群の使用を含むポリヌクレオチドライブラリーの調製方法に関する。更に、本発明は特異的ライブラリーのためのマーカーとして改善されたリンカーに関する。
【０００２】
背景技術
オリゴヌクレオチドリンカー及びプライマーは、一本鎖ポリヌクレオチドのプライミング、結合又はアニーリングの従来技術において使用され、かつ、第ニポリヌクレオチド相補鎖合成を可能にする。
カルニンシ（Ｃａｒｎｉｎｃｉ）ら、１９９６、ゲノミクス（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）、３７、３２７−３３６；カルニンシ（Ｃａｒｎｉｎｃｉ）ら、１９９７、ＤＮＡリサーチ（ＤＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ） ４：６１−６６； カルニンシ（Ｃａｒｎｉｎｃｉ）ら、１９９８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ、９５：５２０−４； カルニンシ（Ｃａｒｎｉｎｃｉ）及び ハヤシザキ（Ｈａｙａｓｈｉｚａｋｉ）、１９９９， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ３０３：１９−４４は、ｃＤＮＡライブラリーの調製方法を開示している。これらのプロトコルにより、ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡハイブリッドは調製され、かつ、Ｃａｐトラッパー技術を用いて完全コーディング／完全長ｃＤＮＡｓが選択され、次いで、それぞれの一本鎖ｃＤＮＡはＧ−テールとライゲートされ、ｃＤＮＡ第二鎖が合成される。
しかし、Ｇ−テーリング法は、例えば、ｃＤＮＡクローンをタンパク質発現に使用する場合の配列決定（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）効率及び翻訳効率において、幾つかの欠点を示す。
【０００３】
Ｇ−テーリングは、ターミナル デオキシヌクレオチジル トランスフェラーゼを用いてｄＧＴＰのターミナル付加により行われる。しかし、付加されるＧの数を調節することは難しく、それは、一般的に１０から３０の間で変化し得る。長いＧ−テールは、長鎖シーケンス解読（ｌｏｎｇ ｒｅａｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を悪化させ、かつ配列決定効率を低減させるという欠点を有し、一方、短いＧ−テールは、プライミング効率の低下をもたらし、その結果サンプルが損失し、その再調製の必要が生じるという欠点を有する。
【０００４】
長いＧ−ストレッチ（長いＧ−テール）は、配列決定反応中に周囲の配列と相互に作用し、非常に強固な第二次構造を形成する。これは、典型的にはＧＣリッチである５’ＵＴＲ類との相互作用において、問題を起こすことがある。実際、典型的なｃＤＮＡは、制御部位として働くと考えられている５’−ＵＴＲ内に６０％のＧＣ含有量を有する。同様の問題は、クローニングサイトの隣にＳｆｉＩ又はＮｏｔＩ制限酵素サイトを含むＧＣリッチ部位を有するクローニングベクターにおいても観察された。
【０００５】
更に、テイリング反応に使用されるターミナル デオキシヌクレオチジル トランスフェラーゼは、重金属、例えば、ＭｎＣｌ２又はＣｏＣｌ２を必要とする。しかし、これらの重金属は、ｃＤＮＡ類の分解を引き起こすことがあり、長鎖、完全コーディング／完全長ｃＤＮＡの生成率を低減させてしまうことがある。
【０００６】
本発明の目的は、従来技術における幾つかの問題を解決し、かつ、効率のよい新たなｃＤＮＡライブラリー調製方法を提供することである。
より具体的には、本発明の目的は、ｃＤＮＡライブラリー調製方法において利用可能なＧ−テーリングに代わる新たなリンカーの提供、及び前記リンカーを用いたｃＤＮＡライブラリー調製方法を提供することにある。
【０００７】
発明の説明
本発明は、オリゴヌクレオチド定常部位及び式（Ｎ）ｎ（式中、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ若しくはＵ、又はそれらの誘導体であり、かつ、ｎは１以上の整数である）で表されるオリゴヌクレオチド可変部位を含むリンカーを提供することにより上記課題を解決する。ｎが２以上の整数の場合、可変部位のヌクレオチド（Ｎ）は、同一でも異なっていてもよい。
可変部位は、好ましくはランダムに調製される。
本発明によるリンカーは、一本鎖又は二本鎖リンカーであることができる。
【０００８】
さらに本発明は、本発明のリンカーを２つ以上含むリンカー群に関する。
【０００９】
本発明の１つの態様によれば、
（ａ）オリゴヌクレオチド一本鎖定常部位及びオリゴヌクレオチド一本鎖可変部位を含む第一オリゴヌクレオチド一本鎖の合成、
（ｂ）第一オリゴヌクレオチド一本鎖定常部位（ａ）に相補的なオリゴヌクレオチド一本鎖定常部位を含む第二オリゴヌクレオチド一本鎖の合成、及び
（ｃ）前記可変部位が二本鎖定常リンカー部位の外側に突出するように、前記第一オリゴヌクレオチド鎖（ａ）を前記第二オリゴヌクレオチド鎖（ｂ）へアニールすることにより調製される本発明によるリンカー又はリンカー群が提供される。
【００１０】
さらに本発明は、本発明によるリンカー又はリンカー群及び前記リンカーに結合した標的第１鎖ポリヌクレオチドを含むリンカー−ポリヌクレオチド生成物又はリンカー−ポリヌクレオチド生成物群に関する。
【００１１】
さらにまた本発明は、本発明によるリンカー−ポリヌクレオチドを含むベクターに関する。
【００１２】
加えて、本発明は、
（ａ）オリゴヌクレオチド一本鎖定常部位及びオリゴヌクレオチド一本鎖可変部位を含む第一オリゴヌクレオチド一本鎖の合成、
（ｂ）第一オリゴヌクレオチド一本鎖定常部位（ａ）に相補的なオリゴヌクレオチド一本鎖定常部位を含む第二オリゴヌクレオチド一本鎖の合成、及び
（ｃ）第一オリゴヌクレオチド鎖（ａ）を第二オリゴヌクレオチド鎖（ｂ）へアニールし、それにより可変部位が二本鎖定常部位の外側に突出する段階を含む、本発明によるリンカー又はリンカー群の調製方法に関する。
【００１３】
さらに本発明は、以下の方法に関する。
（１） 標的一本鎖ポリヌクレオチドとリンカーとを結合させる方法であって、
ｉ）本発明によるリンカーの調製；及び
ｉｉ）前記リンカーの可変部位を標的一本鎖ポリヌクレオチドへアニールする段階を含む方法；
【００１４】
（２）標的一本鎖ポリヌクレオチドとリンカーとを結合させる方法であって、
ｉ）本発明によるリンカーの調製；及び
ｉｉ）前記リンカーの一方の（第一）鎖の可変部位を標的一本鎖ポリヌクレオチドへアニールし、かつ前記リンカーの他方の（第二）鎖の定常部位を標的一本鎖ポリヌクレオチドとライゲートさせる段階を含む方法；
【００１５】
（３）標的一本鎖ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド群とリンカー群とを結合させる方法であって、
ｉ）本発明によるリンカー群の調製；及び
ｉｉ）前記リンカー群の可変部位を標的一本鎖ポリヌクレオチド群へアニールする段階を含む方法；
【００１６】
（４）標的一本鎖ポリヌクレオチド又は標的一本鎖ポリヌクレオチド群とリンカー群とを結合させる方法であって、
ｉ）本発明によるリンカー群の調製；及び
ｉｉ）前記リンカー群の第一鎖の可変部位を標的一本鎖ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド群へアニールし、かつ前記リンカー群の第二鎖の定常部位を標的一本鎖ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド群とライゲートさせる段階を含む方法；
【００１７】
（５）リンカー及び二本鎖ポリヌクレオチドを含むリンカー−ポリヌクレオチド生成物の調製方法であって、
ｉ）本発明によるリンカーの可変部位を標的第一鎖ポリヌクレオチドへアニールし、かつ
ｉｉ）前記標的第一鎖ポリヌクレオチドに相補的な第二鎖ポリヌクレオチドを合成する段階を含む方法；
【００１８】
（６）リンカー及び二本鎖ポリヌクレオチドを含むリンカー−ポリヌクレオチド生成物の調製方法であって、
ｉ）本発明によるリンカーの第一鎖の可変部位を標的一本鎖ポリヌクレオチドへアニールし、かつ前記標的一本鎖ポリヌクレオチドを前記リンカーの第二鎖の定常部位とライゲートさせ、そして、
ｉｉ）前記標的一本鎖ポリヌクレオチドに相補的な第二の一本鎖ポリヌクレオチドを合成する段階を含む方法；
【００１９】
（７）リンカー又はリンカー群及び二本鎖ポリヌクレオチド群を含むリンカー−ポリヌクレオチド生成物の調製方法であって、
ｉ）本発明によるリンカー又はリンカー群の可変部位を標的一本鎖ポリヌクレオチド又は標的一本鎖ポリヌクレオチド群へアニールし、かつ
ｉｉ）前記標的一本鎖ポリヌクレオチド又はその群に相補的な第二鎖ポリヌクレオチドを合成する段階を含む方法；
【００２０】
（８）リンカー又はリンカー群及び二本鎖ポリヌクレオチドを含むリンカー−ポリヌクレオチド生成物の調製方法であって、
ｉ）本発明によるリンカー又はリンカー群の可変部位を標的一本鎖ポリヌクレオチド又は標的一本鎖ポリヌクレオチド群へアニールし、
ｉｉ）前記標的一本鎖ポリヌクレオチド又は標的一本鎖ポリヌクレオチド群を前記リンカー又はリンカー群の第二鎖の定常部位とライゲートさせ、かつ
ｉｉｉ）前記標的一本鎖ポリヌクレオチド（類）に相補的な第二の一本鎖ポリヌクレオチド（類）を合成する段階を含む方法；
【００２１】
（９）ポリヌクレオチドライブラリーをマーキングし、かつ前記ライブラリーを識別する方法であって、定常部位及び可変部位を含むリンカー群（但し、定常部位は特異的又は特定の組織又は種を示す少なくとも１つのマーカーを含む）を提供し、前記特定のマーカーにより前記ライブラリーを選択及び分離する段階を含む方法；
【００２２】
（１０）リンカー又はリンカー群をｍＲＮＡと結合させる方法であって、
（ａ）ｍＲＮＡをフォスファターゼ処理してキャップされていないｍＲＮＡからリン酸基を除去し、
（ｂ）段階（ａ）の生成物を、キャップされたｍＲＮＡからＣＡＰ構造を除去するピロフォスファターゼで処理し、かつ
（ｃ）本発明によるリンカーの存在下、ＲＮＡリガーゼを添加する段階を含む方法；
【００２３】
（１１）リンカー−ポリヌクレオチド生成物の調製方法であって、
（ａ）ｍＲＮＡをフォスファターゼ処理してキャップされていないｍＲＮＡからリン酸基を除去し、
（ｂ）段階（ａ）の生成物を、キャップされたｍＲＮＡからＣＡＰ構造を除去するピロフォスファターゼで処理し、
（ｃ）本発明によるリンカーの存在下、ＲＮＡリガーゼを添加し、かつ
（ｄ）オリゴｄＴを添加して、前記ｍＲＮＡの完全配列に相補的なポリヌクレオチドを合成する段階を含む方法；
【００２４】
（１２）ＲＮＡリガーゼの添加を含む、標的一本鎖ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド群に本発明によるリンカー又はリンカー群を結合させる方法；
【００２５】
（１３）ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドの調製方法であって、
ｉ）完全長／コーディング又は長いポリＡ ｍＲＮＡ類を提供し、
ｉｉ）第一の制限酵素サイトを含む請求項１〜４１のいずれか一項に記載のリンカーと前記ｍＲＮＡをライゲート及び／又はアニールし、
ｉｉｉ）第二制限酵素サイトを含むオリゴｄＴプライマーを前記ｍＲＮＡへアニーリングし、
ｉｖ）ｃＤＮＡ鎖を合成し、
ｖ）導入された２つの特異的制限酵素サイトを認識する制限酵素を用いることによりハイブリッドを単離し、かつ
ｖｉ）クローニングする
段階を含む方法。
【００２６】
（１４）リンカー及び一本鎖ポリヌクレオチドを含むリンカー−ポリヌクレオチド生成物の調製方法であって、本発明によるリンカーの可変部位の標的第一鎖ポリヌクレオチドへのアニーリングを含む方法。
【００２７】
図面の簡単な説明
図１は、１例として可変部位ＧＮＮＮＮＮを含むリンカー群を用いた完全長ｃＤＮＡライブラリー調製工程の例を示す。
ＰｏｌｙＡ＋ＲＮＡは転写（Ａ）され、次いで酸化され、ビオチンへ結合される。Ｒｎａｓｅ Ｉ処理後（Ｂ）、完全長ｃＤＮＡのみがビオチンを有し、アビジンコートされた磁気ビーズに捕獲される（Ｃ）。
【００２８】
図２は、図１の続きで、１例として可変部位ＧＮＮＮＮＮを含むリンカー群を用いた完全長ｃＤＮＡライブラリー調製工程の例を示す。
ｃＤＮＡは、アルカリ処理によりビーズからはずされ、回収され（Ｄ）、リンカーがライゲートされる（Ｅ）。ＧＮ５リンカーが示されている。Ｎ６リンカーの場合、可変部位は、ＧＮＮＮＮＮに代えてＮＮＮＮＮＮである。第二鎖ｃＤＮＡが合成され（Ｆ）、制限酵素により消化され（Ｇ）、ラムダファージベクターヘライゲートされ（Ｈ）、かつ、パッケージされる（Ｉ）。
【００２９】
図３はテストｃＤＮＡとリンカーとの間のライゲーションの結果を示す。
５μｇの７．５ｋｂポリ（Ａ）−テールド（ｔａｉｌｅｄ） ＲＮＡ（ライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））から調製されたテスト第一鎖ｃＤＮＡが出発材料として使用された。リンカー（ＧＮ５−、レーン１−３；Ｎ６、レーン４−６）は、アニーリングされ、５０ｎｇの７．５ｋｂテストｃＤＮＡとライゲートされた。その後、１０ｎｇのリンカー結合材料のサンプルは、第二鎖ｃＤＮＡ合成に用いられ、次いでＯ．８％アルカリゲル電気泳動に掛けられた。
異なる量のリンカーが使用された：レーン１及び４は２００ｎｇ；レーン２及び５は５００ｎｇ並びにレーン３及び６は２μｇ。参照として、リンカーなしのｃＤＮＡは、第二鎖合成のテンプレートとして使用された（レーン７）。レーン８は、リンカーをなしの第一鎖ｃＤＮＡを含む。レーン９は、λ／ＨｉｎｄＤＩＩＩサイズマーカーを含む。
【００３０】
図４は、様々なモル比のリンカーを用いた細胞内ｃＤＮＡのリンカーライゲーションｃＤＮＡとリンカーとの比を調べた結果を示す。
２μｇのＮ６／ＧＮ５が混合されたリンカー（Ｎ６：ＧＮ５＝１：４）は、様々な分量のｃＤＮＡ（レーン１は１０００ｎｇ、レーン２は５００ｎｇ及びレーン３は２００ｎｇ）とライゲートされた。それらは、第二鎖ｃＤＮＡ合成に供給され、Ｏ．８％ゲル電気泳動により分析された。レーン４はマーカーを含む。
図左側の個々のレーンは、第一鎖ｃＤＮＡを表している。
【００３１】
図５は、従来技術に記載のＧ−テールを有する ｃＤＮＡ配列の配列決定チャートを示している。
第二鎖ｃＤＮＡ配列におけるＣ反復の存在下（第一鎖へＧ−テールと共に導入）、チャートに示されているように配列決定効率は低減した。
【００３２】
図６は、Ｎ６／ＧＮ６リンカー混合物（比率１：４）とライゲートされたｃＤＮＡ配列の配列決定チャートを示す。図６の配列決定されたクローンＤ０５＃０４２＃２−５Ｆ−ａｂ２は表１のサンプル２．０５と対応している。
【００３３】
図７は、ＧＮ５リンカーとライゲートされたｃＤＮＡ配列の配列決定チャートを示す。図７の配列決定されたクローンＧ０７＃０５２＃３−７Ｆ．ａｂ１は、表１のサンプル３．０７に対応している。
【００３４】
図８は、ループバイアス及びその可能な解決法を図で示している。図８（Ａ）ではバイアスを説明している。一本鎖リンカーの定常又は一定部位の一末端は、二本鎖リンカーから他方の一本鎖除去後、一本鎖ｃＤＮＡと相互作用してループを形成することがあり、続く第二鎖ｃＤＮＡ合成をブロックすることがある。
【００３５】
図８（Ｂ）に示されているように、保護基としてのＮＨ２は、一定又は定常下鎖（ｌｏｗｅｒ ｓｔｒａｎｄ）の一末端の場合３’末端へ結合する。ループ形成の可能性はなく、かつ、第二鎖ｃＤＮＡ合成は阻害されない。
【００３６】
図８（Ｃ）では、リンカーの定常又は不変第二鎖（図では下鎖）の３’末端と定常又は不変第一鎖（図では上鎖（ｕｐｐｅｒ ｓｔｒａｎｄ））の５’末端は、ループを形成するために共に結合される。これは、一本鎖ｃＤＮＡによるループ形成の可能性を妨げ、かつ、第二鎖ｃＤＮＡ合成は阻害されない。
【００３７】
発明の詳細な説明
本発明はオリゴヌクレオチド定常部位及びオリゴヌクレオチド可変部位を含むリンカー及びリンカー群を提供することにより、従来技術における上記問題を解決する。このようなリンカー及びリンカー群は、標的一本鎖ポリヌクレオチド又は標的ポリヌクレオチド群の末端に結合することができ、かつ、第二ポリヌクレオチド鎖合成を可能にする。
【００３８】
本発明の態様によれば、オリゴヌクレオチド定常部位及びオリゴヌクレオチド可変部位を含むリンカー及びリンカー群が提供される。定常部位は、好ましくは、リンカー群のいずれのリンカーにおいて不変のオリゴヌクレオチド部位である。リンカー定常部位は、一本鎖又は二本鎖オリゴヌクレオチドであることができ、好ましくは、二本鎖オリゴヌクレオチドである。定常部位は、好ましくは下記の内少なくとも１つを含む：制限サイト、組換えサイト、ポリメラーゼプロモーターサイト、マーカー又はタグ。
【００３９】
可変部位は、好ましくはランダムに合成される。この結果得られるリンカー群のリンカーは、不変部位、好ましくはその群内で共通の部位及び、群内のそれぞれのリンカー毎に異なる可変部位を有する。
【００４０】
本発明によるリンカー群は、可変部位として、標的一本鎖ポリヌクレオチドの３’末端又は５’末端に特異的なオリゴ配列を有する１つ以上のリンカーも含むことができる。前記オリゴ配列は、特に、標的ー本鎖ポリヌクレオチド群から１つ以上の特異的ターゲットポリヌクレオチドを結合及び単離するために選択される。
【００４１】
本発明によるリンカー可変部位は、例えば、長鎖完全コーディング又は完全長ｃＤＮＡのような第二鎖ポリヌクレオチド合成において、プライマーとして働くこともできる。
【００４２】
前記一本鎖オリゴヌクレオチドのランダムな可変部位は、どのような種類のヌクレオチドも含むことができる。好ましくは、可変部位は、式（Ｎ）ｎ（式中、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ若しくはＵ、又はその誘導体であり、かつ、ｎは１以上である）を有する。ｎが２以上の整数の場合、可変部位のヌクレオチドは、お互いに、同一でも、互いに異なっても良い。
整数ｎは、有利には１〜１０であり、好ましくは４〜８であり、より好ましくは、ｎは５又は６である。
【００４３】
一法としては、可変部位において、（Ｎ）ｎの第一から第三ヌクレオチド（図２に示すように、定常部位の側からフリー末端へ向かって数え始める）は、Ｇであることができる。鎖の長さ（即ちｎの長さ）が異なり、かつＧを含むか又は含まない混合物も本発明の対象に含まれる。好ましくは、それは、異なる比率のＮ６／ＧＮ５の混合物であり、その比率は好ましくは１：４である。
【００４４】
本発明は、更に、本発明によるリンカー、並びに前記リンカーの可変部位とアニーリング及び／又はライゲートする一本鎖又は二本鎖ポリヌクレオチドを含むリンカー−ポリヌクレオチド生成物、そして前記リンカー−ポリヌクレオチド生成物を含むベクターに関連している。
【００４５】
好ましくは、前記一本鎖又は二本鎖ポリヌクレオチドは、長鎖、完全コーディング／完全長ｃＤＮＡである。
【００４６】
従って、本発明は、標的一本鎖ポリヌクレオチドヘアニーリング及び／若しくはライゲートする本発明によるリンカーを含むリンカー−ポリヌクレオチド生成物又はポリヌクレオチドライブラリーの調製方法を開示する。
【００４７】
本発明は、更に、二本鎖ポリヌクレオチドヘアニーリング／ライゲートされた本発明によるリンカーを含むポリヌクレオチド生成物又はライブラリーの調製方法、好ましくは、長鎖、完全コーディング／完全長ｃＤＮＡライブラリーの調製方法に関する。
【００４８】
本発明は、更に、定常部位にマーカーを含む本発明によるリンカー群を提供することによるポリヌクレオチドライブラリーのマーキング方法にも関する。このマーキングシステムは、異なる種（例えば、ヒト、マウス、キイロショウジョウバエ、イネ等）のライブラリーを識別又は認識することを可能にし、かつ、それは、それぞれの種の異なる組織（例えば、肝臓、脳、肺等）のライブラリーを識別するために使用することができる。
【００４９】
本発明によれば、以下に記載されているリンカー又はリンカー群及び前記リンカー又はリンカー群と標的一本鎖ポリヌクレオチド又は標的一本鎖ポリヌクレオチド群との結合方法であって、
ｉ） オリゴヌクレオチド定常部位及びオリゴヌクレオチド可変一本鎖部位を含むリンカー又はリンカー群の調製；
ｉｉ） 標的一本鎖ポリヌクレオチド（類）と前記リンカーの可変部位（類）とのアニーリング、
の段階を含む方法が提供される。
【００５０】
以下、幾つかの場合、本発明は、簡潔化のため、リンカー群（リンカー群又は単にリンカー類としても記載されている）、並びに前記群の標的ポリヌクレオチドヘの結合方法及び二本鎖ポリヌクレオチド合成方法について記載される。しかし、本発明は、前記リンカー群に含まれる個々のリンカー及びそのような個々のリンカーの使用を含む方法も包含していることは明らかである。
【００５１】
本発明によるリンカー群に含まれる各リンカーの定常部位は、一本鎖又は二本鎖オリゴヌクレオチドであることができる。
好ましくは、リンカーと同様に定常部位は、二本鎖オリゴヌクレオチドであり、従って、その方法は以下の工程を含む：
ｉ） オリゴヌクレオチド二本鎖定常部位及びオリゴヌクレオチド可変一本鎖部位を含むリンカー又はリンカー群の調製、但し、前記可変部位は、前記二本鎖定常部位の外側に突き出している（従って、可変定常部位は粘着突出末端を形成する）；
ｉｉ） 標的一本鎖ポリヌクレオチド群とリンカー群の可変部位とのアニーリング、及び、好ましくは前記標的一本鎖ポリヌクレオチドのアニーリングされた末端と、リンカーの隣接する定常部位とのライゲーション（図２の段階（Ｆ）から（Ｇ）参照）。
【００５２】
前記リンカー又はリンカー類は、従来技術において知られているいずれかの方法、例えば、５’部位に定常核酸配列を、３’部位に可変核酸配列末端を含む５’−３’方向を有する一方のオリゴヌクレオチド鎖を用いて調製することができる。その後、定常核酸配列を含む他方のオリゴヌクレオチド鎖が調製される。最後に、一方の鎖の可変部位が二本鎖定常部位の外側に突き出すように、一方の鎖の定常部位及び他方の鎖の定常部位がアニーリングされる。リンカーは、もちろん工程の順序を逆さにして調製することができ、かつ、他の方法によっても調製することができる。
【００５３】
本発明発明によるリンカーが二本鎖リンカーである場合、本出願の目的のために、定常部位及び可変部位を含む鎖は、“第一鎖”とも呼ばれ、一方、第一鎖の定常部位に相補的な他方の鎖は、“第二鎖”と呼ばれる。
【００５４】
本発明は、更に、定常部位及び可変部位を含む一方のオリゴヌクレオチド鎖（“第一鎖”のみを含み、“第二鎖”を含まない）のみを含むリンカーに関する。リンカーが５’−３’方向を有する場合、この一本鎖オリゴヌクレオチドの末端の可変部位は、標的一本鎖ポリヌクレオチドの３’末端にアニーリングする。次いで、この標的一本鎖ポリヌクレオチドに相補的である第二鎖ポリヌクレオチドが合成される。
【００５５】
１つ又はそれ以上のリンカーは、可変部位を含む鎖が３’−５’の方向を有するように調製され得る。この結果、可変部位は５’末端に位置する。このように調製されたリンカーの５’末端可変部位は、標的ポリヌクレオチドの５’末端ヘアニーリングする。他方の鎖が存在する場合、その下鎖は、標的ポリヌクレオチドの５’末端ヘライゲートすることができる。
【００５６】
本発明は、本発明によるリンカー又はリンカー群及び二本鎖ポリヌクレオチドを含むリンカー−ポリヌクレオチド生成物の調製方法であって、
ｉ） オリゴヌクレオチド二本鎖定常部位及びオリゴヌクレオチド可変一本鎖部位を含むリンカー群の調製、但し、前記可変部位は、二本鎖定常部位の外側に突き出している（従って、可変部位は粘着突出末端を形成する）；
ｉｉ） 標的一本鎖ポリヌクレオチド群と前記リンカー群の可変部位とのアニーリング、及び前記標的一本鎖ポリヌクレオチド群と前記リンカーの隣接する（第二鎖）定常部位とのライゲーション；並びに
ｉｉｉ） 可変部位をプライマーとして使用することによる標的第一鎖に相補的な第二の一本鎖ポリヌクレオチドの合成
を含む方法も提供する。
【００５７】
ポリヌクレオチド配列は、本発明のによるリンカーの一方の鎖のみを用いて調製することも可能である。この場合、
ｉ） オリゴヌクレオチド定常部位及びオリゴヌクレオチド可変一本鎖部位を含む一本鎖リンカー群の調製；
ｉｉ） 標的第一鎖ポリヌクレオチド群とリンカー群の可変部位とのアニーリング；
ｉｉｉ） リンカーの可変部位をプライマーとして用いることによる標的第一鎖に相補的な第二の一本鎖ポリヌクレオチドの合成
の段階が含まれる。
【００５８】
リンカー又はリンカー群の定常オリゴヌクレオチド部位は、どのようなオリゴヌクレオチド配列でもよい。この定常配列は、好ましくは不変部位であり、従って、それは、同じ群のリンカーの全てについて共通する。この定常部位は、１つ以上のグループから成るオリゴ配列も含むことができ、そのため、この場合、定常部位は、同じ群内で幾つかの相違を示すことができる。しかし、本発明の目的のためには、任意の１つ以上のグループからなるこれらオリゴ配列は、定常部位のおおよその（ｇｅｎｅｒａｌ）構造を変化させないため、１つ以上のグループからなる可変オリゴ配列を含む定常部位も、含まない定常部位も、簡略化のために、定常部位として記されている。
【００５９】
定常部位は、リンカー群においても不変部位であることができる。すなわち、それは、群に含まれるいずれのリンカーについても同一のものとすることができる。
【００６０】
定常部位は、どのような種類のオリゴヌクレオチド配列（ＤＮＡ又はＲＮＡ）であることができ、それは、特定の実験又は特定のライブラリーに使用されるリンカー又はリンカー群について、同じであるか又はほぼ同じであることが好ましい。
【００６１】
リンカー定常部位は、従って、一本鎖又は二本鎖オリゴヌクレオチドの両方を意味することができ、好ましくは、それは、二本鎖オリゴヌクレオチドである。この場合、一本鎖可変部位は突出末端を形成する。可変部位は、第二鎖ポリヌクレオチド合成過程においてプライマーとして作用することができる。
【００６２】
定常（又は不変）部位は、好ましくは１つ以上の制限サイト、相同組換えサイト、ポリメラーゼプロモーターサイト、マーカー及び／又はタグを含む。好ましい制限サイトは、例えば、ＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩ、ＳｓｔＩ、ＳａＩＩ、又はＮｏｔＩ、その他、例えばＨｙｏｎｅ−ｍｙｏｎｇ Ｅｕｍ、“制限エンドヌクレアーゼ及び改質メチラーゼ（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｄｏｎｕｏｌｅａｓｅｓ ａｎｄ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｙｌａｓｅｓ）”の章に開示されているものである。
【００６３】
相同組換えサイトの例は、ａｔｔＢ、Ｇａｔｅｗａｙ（商標）（ライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））、Ｃｒｅ−ｌｏｘ（キングハ ルー（Ｑｉｎｇｈｕａ Ｌｉｕ）ら、１９９８、カレント・バイオロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、８：１３００−１３０９）Ｆｌｐ／ＦＲＴ （Ｊ．ワイルド（Ｗｉｌｄ）ら、１９９６、ジーン（Ｇｅｎｅ）、１７９：１８１−１８８）である。
【００６４】
更に、ポメラーゼプロモーターサイトについては、それは、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターサイト、例えば、Ｈｙｏｎｅ−Ｍｙｏｎｇ Ｅｕｎ、５２１ページに開示されたものの１つであることができる。好ましくは、それは、Ｔ３、Ｔ７、ＳＰ６、Ｋ１１及び／又はＢＡ１４ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターサイトであることができる。
【００６５】
マーカーは、いずれのヌクレオチド配列であることもでき、例えば、特定組織又は種について特異的な配列であることができる。
【００６６】
タグとしては、一方の鎖又は他方の鎖の定常部位の先端に結合することができるいずれの基又は分子でも使用することができる。実際、例えば温度の上昇により、リンカーの一本鎖が除去される場合、他方の一本鎖の末端は、標的一本鎖ポリヌクレオチドとループを形成する可能性がある（図８）。定常部位のみからなる鎖の末端が、主にこの鎖とライゲートした標的一本鎖ポリヌクレオチドとループを形成し、かつ第二鎖ポリヌクレオチド合成を阻害することを避けるため、保護基は、好ましくは、この定常部位のみからなる鎖の３’末端へ結合する（図８ Ａ）。従って、３’−ＯＨを持たず、ライゲートもＤＮＡポリメラーゼにより伸長することもできないいずれの基でも、本発明の目的のために使用することができる。
【００６７】
保護基としては、例えば、ｄｄＮＴＰ類を使用することができる。好ましくは、ＮＨ２基も保護基として使用される（図８、Ｂ）。
【００６８】
ループバイアスの問題を避けるために、更に特別な解決法として、可変部位の反対に位置するリンカーの定常部位の両鎖の末端がループを形成するように、両末端を一緒に結合させることができる（図８、Ｃ）。この解決法により、定常部位の末端は、標的一本鎖ポリヌクレオチドとループを形成することができず、第二鎖ポリヌクレオチド合成は阻害されない。
【００６９】
リンカー又はリンカー群のオリゴヌクレオチド可変部位は、好ましくは、ランダムにに合成される。従って、リンカー群内では、いずれのリンカーの可変部位が、好ましくはランダムに合成され、それぞれのリンカーが有する可変部位の配列及び／又は塩基数は、お互いに異なっている。従って、リンカー群は多数の異なる配列を有する突出末端を含む。このようなリンカー群は、多種のランダムな突出末端を含む。これらは、標的一本鎖ポリヌクレオチド群の相補末端を認識、アニール及び／又はライゲートする。これは、すなわちリンカー及び標的一本鎖ポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド配列を形成する完全長ｃＤＮＡ群である（図１及び２参照）。
従って、本発明は、本発明により調製される少なくとも２つのリンカーを含むリンカー群にも関する。好ましくは、本発明は、少なくとも２つのサブリンカー群（ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｌｉｎｋｅｒｓ）を含むリンカー群に関する。
【００７０】
リンカー群は、すべてのリンカーに含まれる定常部位が同一配列を有するオリゴヌクレオチド部位であるものであることができる。リンカー群は、２つ以上のサブリンカー群を含むこともあり、その中の１つのサブリンカー群は、定常部位が同一配列を有するオリゴヌクレオチド部位であるリンカーを含み、他のサブリンカー群の定常部位配列は相互に異なる。
【００７１】
好ましくは、リンカー群又はサブリンカー群において、リンカーの可変部位は、ランダムに合成される。好ましくは、その群又はサブ群において、リンカーの可変部位の配列は、相互に異なる。
【００７２】
可変部位は、標的一本鎖ポリヌクレオチドの末端（好ましくは３’末端）に相補的である特異的オリゴヌクレオチド配列であることもできる。
【００７３】
好ましくは、本発明のリンカー群は、可変部位のうち、標的ポリヌクレオチド群から選択しようとしている特異的標的ポリヌクレオチドの末端（類）を認識及びアニールすることができる１つ以上の特定の（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ）部位を含む。
【００７４】
標的一本鎖ポリヌクレオチドの末端は、リンカーの可変突出末端ヘア二一リングする。標的一本鎖ポリヌクレオチド群ヘリンカー群が付加される場合、好ましくはランダムに合成された、リンカー中の可変部位（突出末端）は、標的一本鎖ポリヌクレオチド群の末端を認識し、かつアニールする。
【００７５】
好ましくは、本発明によるリンカーは、定常部位（好ましくは、群のリンカーすべてについて不変の部位である）及び群のどのリンカーについても異なっている可変部位を含む二本鎖オリゴヌクレオチドである。第一の態様より、標的一本鎖ポリヌクレオチドの３’末端は、可変部位の突出末端の３’末端へアニールし、前記標的一本鎖ポリヌクレオチドの３’末端に隣接する他方の鎖の定常部位の５’末端ヘライゲートする。
【００７６】
リンカーは、第二の態様によれば、３’−５’方向を有する一方の鎖及び他方の鎖の定常部位により、構成されることもできる。この場合、標的一本鎖ポリヌクレオチドの５’末端は、リンカーのこの可変部位ヘアニールしライゲートする。
【００７７】
リンカーの可変一本鎖オリゴヌクレオチド部位は、どのような種類の核酸をも含むことができる。好ましくは、前記可変部位は、式（Ｎ）ｎ（式中、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ若しくはＵ又はそれらの誘導体であり、ｎは１以上であり、ｎが２以上の整数の場合、可変部位のヌクレオチド（Ｎ）は同一でも、互いに異なっても良い）を有する。好ましくは１≦ｎ≦１０であり、より好ましくは４≦ｎ≦８である。特に好ましいリンカーとしては、ｎは５又は６であり、すなわち、Ｎ６又はＮ５である。
【００７８】
定常部位に最も隣接している第一、第二及び／又は第三Ｎ（即ち、第一の態様の場合、リンカーの５’末端からくる可変部位のヌクレオチド）は、式（Ｇ）ｍ（Ｎ）ｎ−ｍ（式中、ｍ＝１〜３）によるＧであることもできる。好ましくは、リンカー可変部位は、ＧＮ４、ＧＮ５、Ｇ２Ｎ３、Ｇ２Ｎ４、Ｇ３Ｎ２、Ｇ３Ｎ３、Ｎ５、Ｎ６又はそれらの混合物であることができる。
【００７９】
より具体的には、本発明によるリンカー群は、（Ｎ）ｎリンカーと（Ｇ）ｍ（Ｎ）ｎ−ｍとの混合物であり、好ましくは異なる比率を有するＮ６／ＧＮ５、Ｎ６／Ｇ２Ｎ４又はＮ６／Ｇ３Ｎ３である。Ｎ６／ＧＮ５混合リンカーの比率は、Ｏ：１−１：Ｏであり、好ましくは１：３−１：５、より好ましくは１：４であることができる。ライゲーションは、従来技術において知られているいずれのライゲーション方法を用いても行うことが可能であり、好ましくはＤＮＡリガーゼ、より好ましくはＴ４ ＤＮＡリガーゼ若しくは大腸菌ＤＮＡリガーゼ（例えば、Ｈｙｏｎｅ−Ｍｏｎｇ Ｅｕｎ、「リガーゼ」の章参照）を用いるか、又はＲＮＡリガーゼ（マルヤマ（Ｍａｒｕｙａｍａ）ら、１９９５）を用いて行うことができる。
【００８０】
好ましくは、本発明によるライゲーション反応は、リガーゼ刺激剤（ｌｉｇａｓｅ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ）の添加を含む。好ましくは、リガーゼ刺激剤としては、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）、好ましくは分子量６０００−８０００のものが使用される。
【００８１】
アニーリング及び／又はライゲーション工程後、リンカーの可変部位（即ち、第一の態様のリンカーの突出又は遊離３’末端）は、本発明によるリンカー及び二本鎖ポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド配列を形成する第二鎖ポリヌクレオチド合成のためのプライマーとして作用することができる。
【００８２】
本発明によるリンカーの標的一本鎖ポリヌクレオチドヘのライゲーションは、オリゴ−キャッピング技術（Ｋ．マルヤマ（Ｍａｒｕｙａｍａ）ら、１９９５、ジーン（Ｇｅｎｅ）、１３８：１７１−１７４；及びＳ．カトー（Ｋａｔｏ）ら、１９９５、ジーン（Ｇｅｎｅ）、１５０：２４３−２５０）を用いて行うことも可能である。オリゴ−キャッピングは基本的に下記の工程を含む：ｉ）完全長でない（ｎｏｎ ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ）ｍＲＮＡ類からホスフェート（ｐｈｏｓｐｈａｔｅｓ）を除去するために、細胞から抽出されたｍＲＮＡ類は、脱リン酸酵素（ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｅｎｚｙｍｅ）、好ましくは、バクテリアアルカリフォスファターゼにより処理される（即ち、５’末端に水酸基を有するキャップされていないＲＮＡの５’末端を形成するが、キャップされた完全長ＲＮＡのＣＡＰ構造は除去しない）；ｉｉ） ｉ）において得られた混合物は、完全長ｍＲＮＡ類からＣＡＰ構造を除去し、リン酸基を完全長５’末端に残すピロフォスファターゼ、好ましくはタバコ酸性ピロフォスファターゼ（ＴＡＰ）により処理される；ｉｉｉ）５’末端にリン酸基を有する完全長ｍＲＮＡに、ＲＮＡリガーゼにより特異的ＲＮＡ又はＤＮＡアダプターをライゲートする。；ｉｖ）オリゴｄＴが添加され相補鎖が合成される。
【００８３】
本発明によるリンカーの標的ポリヌクレオチドヘの結合方法及び／又は本発明によるポリヌクレオチド配列の調製方法は、オリゴ−キャッピング法の変法をライゲーション工程として用いて下記のように行うことも可能である。
【００８４】
従って、標的一本鎖ポリヌクレオチド（オリゴ−キャッピング法として記載されたように調製されたＲＮＡ、ｍＲＮＡ、又はｃＤＮＡであることができる）は、リガーゼ存在下、本発明によるリンカーヘライゲートすることができる。
【００８５】
特に、本発明のリンカーが二本鎖リンカーである場合、標的一本鎖ポリヌクレオチドの一末端は、第二鎖（定常部位のみからなる）にライゲートし、かつ、そのリンカーの第一部位の可変部位ヘアニールする。
【００８６】
もう一つの可能性としては、標的ポリヌクレオチドは、リンカー（一本鎖又は二本鎖のいずれであることもできる）の可変部位ヘライゲートする。いずれの場合においても、オリゴｄＴが付加され、かつ、相補性ポリヌクレオチド、好ましくはｃＤＮＡが合成される。
【００８７】
ＲＮＡリガーゼの使用は、上記ＲＮＡ又はｍＲＮＡに限定されることなく、ＤＮＡをライゲートするためにも使用することができる。
【００８８】
従って、本発明によるリンカーと標的一本鎖ポリヌクレオチドを結合するためのＲＮＡリガーゼを用いたライゲーション方法は、
ｉ）一本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡへ；ｉｉ）一本鎖ＲＮＡを一本鎖ＲＮＡへ；そして、ｉｉｉ）一本鎖ＤＮＡを一本鎖ＲＮＡへ、又は、一本鎖ＲＮＡを一本鎖ＤＮＡへ
結合することができる。
【００８９】
１つの態様によれば、ポリヌクレオチドは、長鎖、完全コーディング／完全長ｍＲＮＡであり、リンカーは、ＤＮＡ（但し、ＲＮＡであることもできる）であり、第一制限酵素サイトを含む。
【００９０】
従って、一本鎖又は二本鎖ｃＤＮＡの調製方法であって、以下の段階を含む方法が提供される：
（Ｉ）ポリＡを含む、長鎖、完全コーディング／完全長ｍＲＮＡの提供；
（ＩＩ）第一制限酵素サイトを含む二本鎖リンカーの提供；
（ＩＩＩ） ｍＲＮＡの５’末端の（リガーゼ、例えばＲＮＡリガーゼを用いることによる）リンカーの第二鎖の定常部位とのライゲーション、及びリンカーの第一鎖の可変部位への５’末端のアニーリング；
（ＩＶ）第二制限酵素サイトを含むオリゴｄＴプライマーの提供、およびオリゴｄＴプライマーのｍＲＮＡのポリＡへのアニーリング；
（Ｖ）逆転写酵素及びＮＴＰ類の添加によるｃＤＮＡの合成、この段階中、新たに合成されたｃＤＮＡは、リンカーの第一鎖（定常部位及び可変部位を含むもの）を置換する；
（ＶＩ）ｍＲＮＡの除去及び一本鎖ｃＤＮＡの獲得。
【００９１】
更に、プライマーは、ｃＤＮＡの３’末端へ付加することができ、かつ、ポリメラーゼの存在下、相補ＤＮＡが合成され、二本鎖ｃＤＮＡが形成される。従って、形成された二本鎖は、一方の末端に第一制限酵素サイトを含み、他方の末端に第二制限酵素サイトを含む。
【００９２】
段階ＶＩ）でのｍＲＮＡの除去は、ＲＮａｓｅ Ｈ若しくはＲＮＡをフラグメントに切断し、それらを除去する他の酵素の添加によって、又は従来技術（サンブロック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、１９８９）で知られている方法に従ってアルカリ（例えばＮａＯＨ）を添加することによって行うこともできる。
【００９３】
次いで、二本鎖ポリヌクレオチド配列が、特異的制限酵素の使用によって、特別にリンカーにより導入された第一及び第二制限酵素サイトにおいて切断され、その結果、突出末端が形成される。次いで、突出末端を有する二本鎖ポリヌクレオチドがプラスミド若しくはファージ発現ベクター、又は配列決定ベクター（例えばサンブロック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、１９８９、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；インビトロゲン・カタログ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃａｔａｌｏｇ） １９９９；ストラジーン・カタログ（Ｓｔｒａｇｅｎｅ Ｃａｔａｌｏｇ） １９９９等に例えば記載されている）に挿入される。二本鎖ポリヌクレオチドは、部位特異的（ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）組換え（例えば、ａｔｔＢ−ａｔｔＰ）又は平滑末端方法（サンブロック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、１９８９）によりクローニングされることもできる。
【００９４】
ファージベクターの例としては、ｌａｍｂｄａ−ＺＡＰ、ｌａｍｂｄａ−Ｄａｓｈ （ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））を挙げることができる。
【００９５】
本発明は、従って、本発明によるポリヌクレオチド配列を含むファージ若しくはプラスミド発現又は配列決定ベクターにも関するが、これに限られるものではない。
【００９６】
本発明による一本鎖又は二本鎖ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ若しくはＤＮＡであり、又はＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドでもある。好ましくは、長鎖完全コーディング及び／又は完全長ｃＤＮＡである。前記長鎖完全コーディング／完全長ｃＤＮＡの３’末端は、ｍＲＮＡの５’Ｃａｐ末端に対応している。
【００９７】
本発明の目的のためには、完全長ｃＤＮＡという用語は、５’及び３’ＵＴＲ配列及びオリゴｄＴプライマー（即ち、ポリＡを含むｍＲＮＡに相補的である）を含むｃＤＮＡを意味する。それは、クローニングのための付加的な配列、例えば、制限酵素サイトも含むこともできる。完全コーディングｃＤＮＡにおいては、ｃＤＮＡ配列は少なくとも開始及び終止コドンを含む。長鎖ｃＤＮＡについては、ｃＤＮＡ配列は、ほぼ完全コーディング／完全長であり、３’末端（ｍＲＮＡの５’末端に相当）、又はｃＤＮＡ鎖がｍＲＮＡに相補的なｃＤＮＡに相補的である（すなわち、同じ遺伝子方向を有する）と考えるならば、５’末端において、１つ若しくは数個のヌクレオチドが欠損しているものと理解される。このようなｃＤＮＡ合成途中における合成反応の停止はｍＲＮＡの二次構造形成、例えばＣａｐ構造のレベルに起因する可能性がある。しかし、遺伝子、ヌクレオチド、ｃＤＮＡ類、ＲＮＡ又はｍＲＮＡのフラグメントも、本発明の応用の目的から除外されない。
【００９８】
ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドは、
（Ｉ）ポリＡを含む長鎖、完全コーディング又は完全長ｍＲＮＡの提供；
（ＩＩ）第一制限酵素サイトを含む二本鎖リンカーの提供；
（ＩＩＩ）ｍＲＮＡの５’末端の（リガーゼ、例えばＲＮＡリガーゼを用いることによる）リンカーの第二鎖の定常部位とのライゲーション、及びリンカーの第一鎖の可変部位への５’末端のアニーリング；
（ＩＶ）第二制限酵素サイトを含むオリゴｄＴプライマーの提供、及びオリゴｄＴプライマーのｍＲＮＡのポリＡへのアニーリング；
（Ｖ）逆転写酵素及びＮＴＰ類の添加によるｃＤＮＡの合成；この段階中、新たに合成されたｃＤＮＡは、リンカー第一鎖（定常部位及び可変部位を含むもの）を置換する；
（ＶＩ）オリゴｄＴプライマーの第二制限酵素サイトに相補的なオリゴヌクレオチドの添加、及びこのオリゴヌクレオチドのポリＡとのライゲーション；次いで、ハイブリッド二本鎖ポリヌクレオチドが形成される、
によって調製され得る。
ハイブリッド二本鎖ポリヌクレオチドは、上記のような特異的制限酵素によって切断されることができ、かつ上記のようなベクターへ挿入され得る。
【００９９】
リンカーの可変部位とアニールし、及び／又は隣接するリンカーの定常部位とライゲートする標的一本鎖ポリヌクレオチドは、従来技術において知られているいずれの技術を用いても調製することができる。
【０１００】
好ましくは、長鎖完全コーディング／完全長一本鎖ｃＤＮＡ類は、カルニンシ（Ｃａｒｎｉｎｃｉ）ら、１９９６、ゲノミクス（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）、３７、３２７−３３６；カルニンシ（Ｃａｒｎｉｎｃｉ）ら、１９９７、ＤＮＡリサーチ（ＤＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ） ４：６１−６６；カルニンシ（Ｃａｒｎｉｎｃｉ）ら、１９９８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｒｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ、９５：５２０−４；カルニンシ（Ｃａｒｎｉｎｃｉ）及びハヤシザキ（Ｈａｙａｓｈｉｚａｋｉ）、１９９９、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．３０３：１９−４４に開示されている５’ｍＲＮＡ Ｃａｐトラッピング技術により調製される。
【０１０１】
好ましくは、上記従来技術文献に記載されている全ての工程を行うが、例外としてＧ−テーリング工程の代わりに本発明によるリンカー群が提供される。
【０１０２】
好ましくは、図１及び２に記載されているＣａｐトラッピング法が使用されるが、標的一本鎖ポリヌクレオチドは、この技術により調製されるものに限られるものではない。例えば、他の第一鎖ｃＤＮＡの単離方法、例えば、エデリー（Ｅｄｅｒｙ）ら、１９９５、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１５：３３６３−７１に記載されているもの、又はオリゴキャッピング法（Ｋ．マルヤマ（Ｍａｒｕｙａｍａ）ら、１９９５、ジーン（Ｇｅｎｅ）、１３８：１７１−１７４；及びＳ．カトー（Ｋａｔｏ）ら、１９９５、ジーン（Ｇｅｎｅ）、１５０：２４３−２５０）も使用することができる。
【０１０３】
本発明による標的一本鎖ポリヌクレオチドは、ノーマライズ（ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ）及び／又はサブトラクト（ｓｕｂｔｒａｃｔｅｄ）（例えば、ソアレス（Ｓｏａｒｅｓ）ら、１９９４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ９１：９２２８−９２３２及びボナルド（Ｂｏｎａｌｄｏ）ら、１９９６、６：７９１−８０６）されることもできる。回収されたノーマライズ及び／又はサブトラクトされたポリヌクレオチド、好ましくはｃＤＮＡ類、より好ましくは長鎖完全コーディング／完全長ｃＤＮＡ類は、好ましくはＣａｐトラッピング技術により調製され、次いで本発明によるリンカー群ヘライゲートされるか、又は、前記単離されたｃＤＮＡ類は、本発明のリンカー群へ初めにアニール及び／又はライゲートされ、次いでノーマライズ及び／又はサブトラクトされる。
【０１０４】
標的一本鎖ポリヌクレオチドは、ループ又はヘアピンループ形成によるバイアスを示すことがある。例えば、合成された細胞内ｃＤＮＡの３’末端は、それ自身の内部部位（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｐｏｒｔｉｏｎ）とループを形成することがあり、続く本発明によるリンカーとのアニーリング及びライゲーションを妨げる。
【０１０５】
この問題を解決するために、標的一本鎖ポリヌクレオチドは、本発明によるリンカーとのアニーリング及び／又はライゲーションの前に、高温、２５℃から溶液の沸点（約１００℃）、好ましくは６５℃で任意に処理され（ｓｕｂｊｅｃｔｅｄ）、次いで好ましくは氷上で冷却される。
【０１０６】
変法として、二次構造は、化学試薬、例えば、ＮａＯＨ（例えば０．１Ｎ）、ホルムアミド５０−９９％、尿素６−８Ｍからなる溶液又は核酸の二次構造を消失／低減するか、若しくは二本鎖核酸を変性することで知られている同様の試薬により消失させることができる。この場合、そのような試薬は、続く酵素的反応の前に通常エタノール沈殿を用いて除去する必要がある。
【０１０７】
さらなる変法として、リンカーヘアニール及び／又はライゲートされた標的ポリヌクレオチドは、ヘアピン−ループ形成の可能性を除去するために、高温で（ホットスタート（ｈｏｔ ｓｔａｒｔ））処理されることができる。温度範囲は、２５℃から溶液の沸点（約１００℃）までであり、好ましくは６５℃である。
【０１０８】
しかし、温度上昇により、リンカーの一方の鎖（即ち、定常部位及び可変部位を含む鎖）が除去されることがあるため、後に同一鎖リンカー又はどのようなプライマーも、リンカーの他方の鎖及び標的一本鎖ポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド配列に付加することができる。ヘアピン−ループ形成の可能性があるが、それは、図８、Ｂ及びＣに記載されている解決法を用いて回避することができる。
【０１０９】
本発明による方法を用いると、アニーリング及びライゲーション工程は非常に効率的であり、そのため、続くクローニング工程は、ＰＣＲ増幅なしで高力価（ｈｉｇｈ−ｔｉｔｅｒ）ライブラリーの調製を可能にする。
【０１１０】
本発明による方法は、従来技術における方法に比べ、特にＧ−テーリング法に比べ、ライブラリー調製をより有利にする。
【０１１１】
Ｇ−テーリング法は、実際、図５に示されるように配列決定過程における重大な欠点を有している。第二鎖ｃＤＮＡは、Ｇ−テール配列に相補的なＣの反復（その長さは簡単に調節することができないため、長さ２０−３０Ｇまで達することがある）を含む。このＣの著しい（ｅｘｃｅｓｓｉｖｅ Ｃ ｓｔｒｅｎｇｔｈ）反復は、配列決定過程を停止させ、ＤＮＡ配列決定を妨げる。
【０１１２】
本発明によるリンカーを用いた方法は、この欠点を有さず（ランダム可変部位がＧを含む場合であっても、それらは統計的には少数である）、図６及び７に記載されているように効率のよい配列決定を可能にすることができる。
【０１１３】
図６のクローンは、配列番号３のヌクレオチド１２から４９に対応するリンカーＮ６の部位（図６の四角内にマークされている）を含む。ヌクレオチド１から１１（含有）は、図２の段階Ｇに示されているように切断された。図６のリンカーの可変部位は、ＧＧＣＧＡＡである（マークされた四角内に示されている）。
【０１１４】
図７のクローンは、配列番号１のヌクレオチド１２からヌクレオチド４９に対応するリンカーＧＮ５の部位（図７の四角内にマークされている）を含む。配列番号１のヌクレオチド１から１１（含有）は、図２の段階Ｇ）に示されているように切断された。図７のリンカーの可変部位はＧＧＣＧＡＡ（マークされた四角内に示されている）である。
【０１１５】
続いて、Ｇ−テーリング法の長いＧストレッチは、周囲の配列と相互作用し、非常に強固な二次構造を形成することがあり、この現象は配列決定、転写及び翻訳効率に影響を与える。一方、本発明によるリンカーはこれらの欠点を有さない。
【０１１６】
更に、Ｇ−テーリング反応に使用されるターミナル デオキシヌクレオチジル トランスフェラーゼは、重金属、例えばＭｎＣｌ２又はＣｏＣｌ２の存在を必要とする。これらの重金属は、ｃＤＮＡ類の分解を起こし、長鎖完全コーディング／完全長ｃＤＮＡ含有率を低減する。この問題も、重金属を必要とせず、低温、例えば、４−３７℃、好ましくは１２−２０℃、又は好ましくは１６℃で用いることができる本発明によるリンカーを用いることにより解決される。
【０１１７】
本発明のもう一つの態様によれば、本発明のリンカーの一定部位は、マーカーを含むことができる。例えば、容易に認識することができる特異的オリゴヌクレオチド配列、特異的配列又は配列の組み合わせである。
【０１１８】
このマーカーの存在は、同一若しくは異なる種の異なる組織（例えば、肝臓、脳、肺等）のライブラリー又は異なる種（例えば、ヒト、マウス、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）、イネ等）のライブラリーを識別するため、及び混同しないために非常に有用である。
【０１１９】
実際、異なる組織及び／又は種から得られた多種のライブラリーが、同一実験室内で構築され、大量配列決定に使用される場合、コロニーピッキング（ｃｏｌｏｎｙ ｐｉｃｋｉｎｇ）、ＤＮＡ調製、配列決定研究、クローンバンキング、再アレーイング（ｒｅ−ａｒｒａｙｉｎｇ）等のどの段階においてもライブラリー又はクローンを取りちがえたり、混入させたりする危険性がある。
【０１２０】
ｃＤＮＡ類の個々のマーキングは、幾つかの組織からの異なるマークされたｃＤＮＡ類の調製を可能にし、混合されたｃＤＮＡライブラリーの３’末端（５’ｍＲＮＡ末端と相補的である）を配列決定することにより組織発現プロファイリングを可能にする。
【０１２１】
【実施例】
本発明による方法及び態様を、下記実施例を参照して説明する。
実施例１
テストｃＤＮＡを用いたリンカー評価
リンカー調製
リンカーオリゴヌクレオチド群は、ギブコ−ＢＲＬ ライフ・テクノロジーズ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）から購入した。オリゴヌクレオチドは、一方の一本鎖（一本上鎖（ｓｉｎｇｌｅ ｕｐｐｅｒ ｓｔｒａｎｄｓ））（可変部位を含むＡ及びＣと表されている）並びに他方の一本鎖（一本下鎖（ｓｉｎｇｌｅ ｌｏｗｅｒ ｓｔｒａｎｄｓ））（Ｂと表されている）に区別された。次いで、ＡとＣのうちの１つとＢを、２つの異なる二本鎖群を形成するために一緒に結合させた。リンカーＡの群は、定常部位オリゴヌクレオチド（この場合、配列番号１の塩基１−４３）、及び、第一塩基がＧであり（即ち、塩基番号４４）そして続く塩基が、群のそれぞれのリンカーについて異なりランダムに調製されたＮＮＮＮＮ（塩基４５−４９）である可変部位（ＧＮ５）を有するリンカーを含む。
【０１２２】
リンカーＣの群は、一定部位オリゴヌクレオチド（配列番号３の塩基１−４３）及び群内のそれぞれのリンカー毎に異なり、ランダムに調製された可変部位ＮＮＮＮＮＮ（塩基４４−４９）を含む。
【０１２３】
Ａ）ＧＮ５ Ａ鎖、
５’−ＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＣＴＣＧＡＧＣＴＣＴＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＣＣＡＧＮＮＮＮＮ−３’ （配列番号：１）；
Ｂ）Ｂ鎖、
５’−ＴＧＧＴＴＣＴＡＴＡＧＴＧＴＣＡＣＣＴＡＡＡＴＡＧＡＧＣＴＣＧＡＧＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴ−３’ （配列番号：２）；
Ｂ鎖は、合成されたときに５’末端においてもリン酸化された。
Ｃ）Ｎ６ Ｃ鎖、
５’−ＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＣＴＣＧＡＧＣＴＣＴＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＣＣＡＮＮＮＮＮＮ−３’ （配列番号：３）。
【０１２４】
国際規則（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ）及びパテンチン・スタンダード２．１マニュアル（Ｐａｔｅｎｔｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄ ２．１Ｍａｎｕａｌ）に基づき、縮重（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）ヌクレオチドの場合には、ＶはＡ、Ｇ又はＣを示し、Ｎは全ての種類のヌクレオチドを示す。
【０１２５】
これらのオリゴヌクレオチドは、非特異的サイトを有するか又はアニーリングサイトを欠く可能性のある不純物を除去するために、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（サンブロック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）、Ｊ．、フリッチェ（Ｆｒｉｔｓｃｈ）、Ｅ． Ｆ．、及びマニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）、Ｔ． （１９８９） 「モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ）」、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）、ＮＹ．）により精製された。ＧＮ５及びＮ６と名付けられた２つのリンカー群を調製した。リンカーＧＮ５は、オリゴヌクレオチドＡ／Ｂ（配列番号：１／配列番号：２）により調製され、リンカーＮ６は、オリゴヌクレオチドＣ／Ｂ（配列番号：３／配列番号：２）により調製された。それらは、オリゴヌクレオチドをＮａＣｌ（最終濃度、１００ｍＭ）と混合し、かつ、６５℃で５分間、４５℃で５分間、３７℃で１０分間及び２５℃で１０分間インキュベートすることにより調製された。
【０１２６】
調製されたリンカーは、次いで、一本鎖ＤＮＡ（類）にアニールし、かつ、一本鎖ＤＮＡ（類）とライゲートするために使用された。
【０１２７】
テスト ｃＤＮＡ
ｃＤＮＡライブラリー調製時に適当なリンカーを構築するために、テスト第一鎖ｃＤＮＡが、カルニンシ（Ｃａｒｎｉｎｃｉ）及びハヤシザキ（Ｈａｙａｓｈｉｚａｋｉ）、１９９９に記載されている方法からＣＡＰトラッピング工程を除いた方法により５ μｇの７．５ｋｂ ポリ（Ａ）−テールドＲＮＡ（ライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））から生成された。［α‐３２Ｐ］ｄＧＴＰは、逆転写工程において取込ませた。調製された第一鎖ｃＤＮＡの量は、放射能取り込み率により評価した。次いで、５０ｎｇの７．５−ｋｂ ｃＤＮＡ及び実施例１の上記段階において調製した様々な量の（２００ｎｇから２μｇ）（図３の説明も参照）リンカー（Ｎ６又はＧＮ５）を混合し、反応体積を３０μｌとしてライゲーションを行った。反応は、終夜１０℃でインキュベートすることにより行なった。
【０１２８】
ライゲーション後、過剰リンカーを除去するために、リンカー結合一本鎖ｃＤＮＡサンプルを、１０ｍＭのＥＤＴＡ／０．２％ＳＤＳ（反応体積、４０μＬ）中の０．２ｍｇ／ｍＬのプロティナーゼＫと共に４５℃で１５分間インキュベートした。反応生成物は、フェノール／クロロホルム４０μＬを用いて抽出した。次いで、フェノール／クロロホルム混合物を、フェノール／クロロホルム混合物の界面に残っている反応生成物を抽出するために、６０μＬのカラム緩衝液（１０ ｍＭ トリス−ＨＣｌ、１ ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１ Ｍ ＮａＣｌ、０．１％ ＳＤＳ； ｐＨ ７．５）により処理した。抽出した反応生成物を、ゲル濾過カラム セファクリル（商標）（ＳｅｐｈａｃｒｙｌＴＭ）−３００（アマシャム・ファルマシア・バイオテク（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ））に載せ、４００ ｘ ｇで２分間の遠心分離により精製した。抽出したフラクション（精製されたリンカー第一鎖ｃＤＮＡサンプルを含む）は、イソプロパノールを用いて沈殿した。
【０１２９】
コントロールサンプル（一本鎖テストｃＤＮＡを含むがリンカーを含まない）を、第二鎖ｃＤＮＡ合成に使用した。第二鎖ｃＤＮＡ合成を補助するための本発明の方法の能力を評価するために、１０ｎｇの精製されたリンカーをライゲートしたサンプル（図３のレーン１−６）及びコントロールとしてライゲートされていない７．５−ｋｂの第一鎖ｃＤＮＡ（図３のレーン７）を、１μＬの１０Ｘ ＥｘＴａｑＴＭ緩衝液、１μｌの２．５ｍＭ ｄＮＴＰ類、０．５μＬの［α−３２Ｐ］ｄＧＴＰ、及び０．５μＬ のＥｘ−ＴａｑＴＭ（タカラ（Ｔａｋａｒａ））を含む１０μＬの反応溶液にそれぞれ混合した。得られたサンプルを、６５℃で５分間、６８℃で３０分間及び７２℃で１０分間インキュベートし、次いでアルカリゲル電気泳動を用いて分析した。
【０１３０】
アルカリゲル電気泳動は、５μｌのサンプルを１μｌの６ｘ アルカリ色素（サンブロック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）、６．７、６．１２ ）へ添加することにより行なった。電気泳動ゲルは、０．８％アガロース、５０ｍＭのＮａＯＨ、５ｍＭのＥＤＴＡを含むものを用い、緩衝液は５０ｍＭの ＮａＯＨ及び５ｍＭのＥＤＴＡ（サンブロック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ））を含むものを用いた。
【０１３１】
結果
レーン１−３は、５０ｎｇの一本鎖テストｃＤＮＡとそれぞれ２００ｎｇ、５００ｎｇ及び２μｇのリンカーＧＮ５とのライゲーションを示している。
レーン４−６は、５０ｎｇの一本鎖テストｃＤＮＡとそれぞれ２００ｎｇ、５００ｎｇ及び２μｇのリンカーＮ６とのライゲーションを示している。
レーン７はコントロールである。１０ ｎｇの一本鎖第一鎖ｃＤＮＡを、１μＬの１０Ｘ ＥｘＴａｑＴＭ緩衝液、１μＬの２．５ ｍＭ ｄＮＴＰ類、０．５ μｌの［α−３２Ｐ］ｄＧＴＰ、及び０．５ μＬのＥｘ−ＴａｑＴＭ （タカラ（Ｔａｋａｒａ））を含む１０μＬの反応溶液へ添加した。サンプルを、６５℃で５分間、６８℃で３０分間、及び７２℃で１０分間インキュベートした。一本鎖ｃＤＮＡは、ヘアピン構造を形成することにより伸長され、第二鎖ｃＤＮＡを形成した。これは、アルカリゲル電気泳動において１５ ｋｂの位置に検出された。
レーン８は、第一鎖ｃＤＮＡ（２３ｎｇ）（リンカーなし）を含む。これは、７．５ｋｂの位置に検出される。
レーン９は、マーカーを表す。
図３の電気泳動は、レーン１−６においてライゲーションは特に効果的であり（７．５ｋｂのレベルのスポット）、かつ、ライゲーションが起こらなかったものの量は無視できる程度であった（１５ｋｂのレベルのスポット）ことを示す。
【０１３２】
実施例２
完全長ｃＤＮＡライブラリー調製及びｃＤＮＡ分析
リンカー調製
リンカーは、実施例１に記載されているように調製した。
【０１３３】
ＲＮＡ 調製
マウス肝臓組織のスライス（０．５−１ｇ）を、１０ｍｌの懸濁液中でホモジナイズし（ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｄ）、１ｍｌの２Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）及び同量のフェノール／クロロホルム混合物（体積比５：１）により抽出した。抽出後、同量のイソプロパノールを、ＲＮＡを沈殿させるために水相に添加した。このサンプルを、氷上で１時間インキュベートし、それら沈殿物を回収するために４０００ｒｐｍで１５分間冷却しながら遠心分離した。得られた沈殿物を、７０％エタノールで洗浄し、８ｍｌの水に溶解した。２ｍｌの５Ｍ ＮａＣｌを１％ＣＴＡＢ（セチルトリエチルアンモニウムブロミド）、４Ｍ尿素、及び５０ｍＭトリスを含む１６ｍｌの水溶液（ｐＨ７．０）に添加することにより、ＲＮＡを沈殿させ、多糖類を除去した（ＣＴＡＢ沈殿）。４０００ｒｐｍで１５分間室温で遠心分離した後、ＲＮＡを４ｍｌの７Ｍグアニジン−Ｃｌ中に溶解した。次いで、２倍量のエタノールを溶液に添加し、１時間氷上でインキュベートし、４０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。得られた沈殿物を、７０％エタノールで洗浄し、回収した。沈殿物を、水に再溶解し、ＯＤ比２６０／２８０（＞１．８）及び２３０／２６０（＜０．４５）を測定することによりＲＮＡの純度を決定した。このようにして得られた全ＲＮＡは、続いて、全ＲＮＡのためのｍＲＮＡ単離キット ＭＡＣＳＴＭ（ミルテニイ・バイオテク（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ドイツ）を用いて精製され、ポリＡ＋を有するものを凝縮した。
【０１３４】
ｃＤＮＡ 合成
５から１０μｇのこのポリＡ＋リッチＲＮＡ、５μｇのＢａｍＨＩサイトを含む第一鎖プライマー５’−（ＧＡ）５ＡＧＧＡＴＣＣＡＡＧＡＧＣＴＣ（Ｔ）１６ＶＮ−３’ （配列番号：４）及び１１．２μｌの８０％グリセロールを、総体積が２４μｌになるように混合した。ＲＮＡ／プライマー混合物を、６５℃で１０分間変性させた。並行して、最終体積が７６μｌになるように、１８．２μｌの５Ｘ第一鎖合成緩衝液、９．１μｌの０．１Ｍ ＤＴＴ、６．０μｌの１０ｍＭ（それぞれ）ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、及び５−メチル−ｄＣＴＰ（ｄＣＴＰの代替）、２９．６μｌの飽和トレハロース〔約８０％、低金属含有量；フルカ・バイオケミカ（Ｆｌｕｋａ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｋａ）〕、及び１０．０μｌのスーパースクリプト（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ） ＩＩ逆転写酵素（２００Ｕ／μｌ）を混合した。１．０μｌの［α−３２Ｐ］ｄＧＴＰを第三チューブへ入れた。ｍＲＮＡ、グリセロール、及びプライマーは、氷上でスーパースクリプト（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ）を含む溶液と混合し、そのアリコット（２０％）を、 ［α−３２Ｐ］ｄＧＴＰを含むチューブへ即座に添加した。第一鎖ｃＤＮＡ合成は、加熱蓋を有するサーモサイクラー（ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ）（例えばＭＪリサーチ（Ｒｅｓｅａｒｃｈ））内で下記のように設定したプログラムに従い、行われた：段階１、４５℃で２分間；段階２、勾配アニーリング：３５℃へ冷却１分以上；段階３、完全アニーリング：３５℃で２分間；段階４、５０℃で５分間；段階５、０．１℃／秒で６０℃へ上昇；段階６、５５℃で２分間；段階７、６０℃で２分間；段階８、段階６に戻り更に１０サイクル。放射能取り込みにより、ｃＤＮＡ収量を評価することができた。 （カルニンシ（Ｃａｒｎｉｎｃｉ）及びハヤシザキ（Ｈａｙａｓｈｉｚａｋｉ）、１９９９）。ｃＤＮＡは、プロティナーゼＫ、フェノール／クロロホルム及びクロロホルム抽出により処理され、かつ、酢酸アンモニウムを塩として用いエタノール沈殿させた（カルニンシ（Ｃａｒｎｉｎｃｉ）及びハヤシザキ（Ｈａｙａｓｈｉｚａｋｉ）、１９９９）。
【０１３５】
ｍＲＮＡ ビオチン化
ビオチン化の前に、キャップ（ｃａｐ）のジオール基及びｍＲＮＡの３’末端を、第一鎖ｃＤＮＡを含む ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡの再懸濁物、６６ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ ４．５）、及び５ｍＭ ＮａＩＯ４を含む最終体積５０μｌの反応液内で酸化した。サンプルを、氷上で暗条件下、４５分間インキュベートした。ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡハイブリッドを、次いで、０．５μｌの１０％ ＳＤＳ、１１μｌのＮａＣｌ、及び６１μｌのイソプロパノールを添加することにより沈殿させた。暗条件下、氷上で４５分間インキュベートした後、サンプルは、１０分間１５，０００ｒｐｍで遠心分離された。最後に、ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡハイブリッドを、７０％エタノールで２回洗浄し、５０μｌの水に再懸濁した。続いて、キャップを、５μｌの１Ｍ 酢酸ナトリウム（ｐＨ６．１）、５μｌの１０％ ＳＤＳ、及び１５０μｌの１０ ｍＭビオチンヒドラジドロングアーム（ｌｏｎｇ−ａｒｍ）（ベクター・バイオシステム（Ｖｅｃｔｏｒ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ））を添加することにより、最終体積２１０μｌの反応液中でビオチン化した。室温で終夜（１３時間）インキュベート後、ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡハイブリッドを、７５μｌの１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ６．１）、５μｌの５Ｍ ＮａＣｌ、及び７５０μｌの無水エタノールの添加により沈殿させ、かつ、氷上で１時間インキュベートした。ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡハイブリッドを、１５，０００ ｒｐｍで１０分間の遠心分離によりペレット化し、次いで、ペレットを７０％エタノールで１回、８０％エタノールで１回洗浄した。ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡハイブリッドを、次いで７０μｌの０．１Ｘ ＴＥ（１ ｍＭ トリス［ｐＨ ７．５］、０．１ ｍＭ ＥＤＴＡ）中に再懸濁した。
【０１３６】
完全長 ｃＤＮＡ の吸着及び解離
５００μｌのＭＰＧストレプトアビジンビーズ及び１００μｇのＤＮＡを含まないｔＲＮＡを混合し、得られた混合物を、氷上で３０分間時々攪拌しながらインキュベートした。ビーズは、３分間、磁気スタンドを用いることにより分離し、上清を除去した。ビーズを、次いで５００μＬの洗浄／結合溶液（２Ｍ ＮａＣｌ、５０ ｍＭ ＥＤＴＡ［ｐＨ ８．０］）を用いて３回洗浄した。
【０１３７】
同時に、出発材料としたｍＲＮＡ１μｇ当たり１単位のＲＮａｓｅ Ｉ（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））が、製品の付属の緩衝液中のｍＲＮＡ／ｃＤＮＡハイブリッドサンプルへ添加された（最終体積、２００μｌ）；サンプルを、３７℃で１５分間インキュベートした。反応を終止させるために、サンプルを氷上に置き、１００μｇのｔＲＮＡ及び１００μｌの５ Ｍ ＮａＣｌを添加した。完全コーディング／完全長ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡハイブリッドを吸着するために、４００ μｌの洗浄／結合溶液に再懸濁したＲＮａｓｅ Ｉ処理されたビオチン化ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ及び洗浄したビーズを混合した。混合後、チューブを３０分間室温で穏やかに回転させた。完全コーディング／完全長ｃＤＮＡは、ビーズに吸着され、短いｃＤＮＡ類は吸着されなかった。ビーズを、磁気スタンドを用いて上清から分離した。非特異的吸着ｃＤＮＡ類を除去するために、ビーズを穏やかに洗浄した。洗浄／結合溶液による２回の洗浄を行なった。１回目は０．４％ ＳＤＳ、５０ μｇ／ｍｌ ｔＲＮＡを含むもの、２回目は１０ ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、４０ μｇ／ｍｌ ｔＲＮＡ、１０ｍＭ ＮａＣｌ、及び２０％グリセロールを含むのもを用い、かつ、５０μｇ／ｍｌ ｔＲＮＡ水溶液を用いた。
【０１３８】
ｃＤＮＡは、５０μｌの５０ｍＭ ＮａＯＨ、５ｍＭのＥＤＴＡを添加し、１０分間室温で時々攪拌しながらインキュベートすることによりビーズから解離した。次いで、磁気を用いてビーズを除去し、抽出したｃＤＮＡは、氷上の５０μｌの１Ｍ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．０を含むチューブに移した。溶出サイクルは、大部分のｃＤＮＡ（小型（ｈａｎｄ−ｈｅｌｄ）モニターを用いた放射性モニタリング測定により８０から９０％）がビーズから回収されるまで、５０ｍＭ ＮａＯＨ、５ｍＭ ＥＤＴＡの５０μｌアリコットを用いて、１回又は２回繰り返された。
【０１３９】
ＲＮＡの残さを除去するために、回収したｃＤＮＡに１μｌの ＲＮａｓｅ１（１０Ｕ／μｌ）を氷上で直ちに添加した；次いで、サンプルを、３７℃で１０分間インキュベートした。ｃＤＮＡを、プロティナーゼＫ処理し、次いで、フェノール／クロロホルム抽出、かつ、再抽出（ｂａｃｋ−ｅｘｔｒａｃｔｅｄ）した。その後、サンプルは、ミクロコン（Ｍｉｃｒｏｃｏｎ） １００（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））を用い、４０−６０分間、２０００ ｒｐｍの限外濾過を１ラウンドで行い濃縮された。
【０１４０】
ｃＤＮＡ の ＣＬ−４Ｂ スピンカラム分画 （ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ）
ｃＤＮＡサンプルは、次いで、マニュアル（Ｓ−４００スピンカラム、例えば、アマシャム−ファルマシア（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のものも使用することができる）に沿って、ＣＬ−４Ｂクロマトグラフィー（カルニンシ（Ｃａｒｎｉｎｃｉ）及びハヤシザキ（Ｈａｙａｓｈｉｚａｋｉ）、１９９９）により処理された。
【０１４１】
ｃＤＮＡ 類 − リンカーライゲーション
上記のように調製したＣａｐ−トラッパー（Ｔｒａｐｐｅｒ）完全長一本鎖ｃＤＮＡ類を、３つの異なるチューブに分注した。１つはＧ−テーリング用、第二のチューブはＧＮ５リンカー用、更に、最後のチューブはＮ６／ＧＮ５混合リンカー用とした。２００ｎｇのｃＤＮＡのアリコットは、従来技術に記載されているようにｄＧホモポリマーを用いて末端処理（ｔａｉｌｅｄ）し、かつ、コントロールｃＤＮＡライブラリー調製のために使用した（カルニンシ（Ｃａｒｎｉｎｃｉ）ら、ゲノミクス（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）、１９９６）。
【０１４２】
３００ｎｇのＣａｐ−トラッパー完全長第一鎖ｃＤＮＡ類を、ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）−ＢＲＬ／ライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｏｇｉｅｓ）により上記のように調製されたリンカーを用いたリンカーライゲーションのための基質として使用し、ｃＤＮＡライブラリー構築を行った（図１及び２に示す）。
【０１４３】
３００ｎｇの一本鎖ｃＤＮＡを、８００ｎｇの比率１：４のＮ６／ＧＮ５リンカー混合物及び８００ｎｇのＧＮ５リンカーへ添加した。
【０１４４】
ライゲーション基質（上記のように調製されたｃＤＮＡ／リンカー）、溶液Ｉ及び溶液ＩＩ（ライゲーションキット、タカラ（Ｔａｋａｒａ））を、１：２：１の比率で混合した。全ての工程を、製品に付属の説明書に従って行った。よって、反応体積は３０μｌであり、７．５μｌのサンプル、１５μｌの溶液Ｉ及び７．５μｌの溶液ＩＩを含んでいた。反応は１０℃で終夜行なった（図２Ｅ）。
【０１４５】
過剰リンカーからの単離
ｃＤＮＡとリンカーとの間のアニーリング及びライゲーションの後、ゲル濾過を行なった。上記のように、３０μｌのリンカー−ライゲーションサンプルは、１０ｍＭのＥＤＴＡ及び０．２％のＳＤＳ存在下、０．２ｍｇ／ｍｌのプロティナーゼＫにより処理した。それらを、４５℃で１５分間インキュベートし、次いで、フェノール／クロロホルム抽出した。サンプルは、６０μｌのカラム緩衝液（１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．１％ ＳＤＳ、ｐＨ７．５）を用いて再抽出（ｂａｃｋ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ）した。続いて、サンプルを、ゲル濾過セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ） Ｓ３００（アマシャム・ファルマシア。バイオテク（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ））用のスピンカラムに掛けた。スピンカラムの段階では、４００Ｘ ｇで２分間、遠心分離を行なった。溶出フラクションを回収し、イソプロパノールで沈殿した。
【０１４６】
精製段階後、第二鎖ｃＤＮＡ合成を行なった（図２Ｆ）。
第二鎖ｃＤＮＡを合成するために、全ての精製されたリンカーとライゲートしたサンプルを使用した。６μｌの１０ ｘ ＥｘＴａｑ緩衝液 タカラ（Ｔａｋａｒａ）、並びに６μｌの１０ｍＭ ｄＮＴＰ類及び０．５μｌの［α−３２Ｐ］ｄＧＴＰを、６０μｌのチューブ（ｔｈｅ ｔｕｂｅｓ ｉｎ ６０μｌ）に添加した。サンプルを、７２℃で１５秒間予めインキュベートし、次いで、０．５μｌのＥｘＴａｑを添加した。続いて、それらを７２℃で３０分間インキュベートした。
【０１４７】
サンプルを、アルカリゲル電気泳動で分析した。即ち、合成された第二鎖を含む０．５μｌのサンプルに、最終体積６μｌになるように１μｌの６ｘアルカリ色素（サンブロック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）、６．７、６．１２）を添加し、電気泳動を行なった。
【０１４８】
電気泳動は、０．８％のアガロース、５０ｍＭ ＮａＯＨ、５ｍＭ ＥＤＴＡを含むアガロースゲルを用い、かつ５０ｍＭ ＮａＯＨ及び５ｍＭ ＥＤＴＡ（サンブロック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ））を含む電気泳動バッファーを用いて行なった。
【０１４９】
サンプルは、フェノール／クロロホルムにより精製し、次いで、標準条件下、エタノール沈殿を行なった（サンブロック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）、Ｊ．、 フリッチェ（Ｆｒｉｔｓｃｈ）、 Ｅ． Ｆ．、及びマニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）、Ｔ． （１９８９）「モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ９：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ）」、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）、ＮＹ．）。
【０１５０】
続いて、ｃＤＮＡを、ＢａｍＨＩ（２５Ｕ／μｇのｃＤＮＡ類）及びＸｈｏ Ｉ（２５Ｕ／μｇのｃＤＮＡ類）を用いて３７℃で１時間切断し、かつ、フェノール／クロロホルムにより抽出した。水相は、ＣＬ４Ｂゲル濾過スピンカラム（アマシャム・ファルマシア・バイオテク（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ））を用いて精製し、次いで２ μｇのグリコーゲンの存在下、記載されているようにエタノール沈殿を行なった（カルニンシ（Ｃａｒｎｉｎｃｉ）及びハヤシザキ（Ｈａｙａｓｈｉｚａｋｉ）、１９９９）。
【０１５１】
ｐＢＳ ＩＶ ベクター構築
１０ｎｇのｐＢＳ ＳＫ＋（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））、２０μｌの１０ｘ ＮＥＢ緩衝液２（ニュー・イングランド・バイオラボズ社（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ））、２０μｌの１０ｍｇ／ｍｌ ウシ血清アルブミン（ＮＥＢ）、３０単位のＮｏｔ Ｉ（ＮＥＢ）、３０単位のＫｐｎ Ｉ（ＮＥＢ）及び１０単位のＸｈｏ Ｉ（ＮＥＢ）を、体積が２００μｌになるように混合し、３７℃で２時間インキュベートした。次いで、長いプラスミド部分を短いＤＮＡ断片から分離するために、この混合物を１ｘ ＴＡＥ／０．５μｇ／ｍｌのエチジウム ブロミド緩衝液中の０．８％ シープラーク（ＳｅａＰｌａｑｕｅ）アガロースゲル（ＦＭＣ バイオプロダクツ（Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ））／ １ｘ ＴＡＥ緩衝液／ ０．５ μｇ／ｍｌ エチジウム ブロミド （８ ｃｍ ｘ ８ ｃｍ）において、５０Ｖで１時間電気泳動に付した（分子クローニング）。長いプラスミド部分は、ゲルから切り出され、そのゲルをチューブへ移した。切断されたプラスミドを抽出し、ジーンクリーン（ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ） ＩＩ（商標）キット（バイオ１０１社（Ｂｉｏ １０１ Ｉｎｃ．））により精製した。プラスミドの濃度及び純度はアガロースゲル電気泳動を用いて、既にその濃度が分かっている標準プラスミドとの比較により確認した。
【０１５２】
二本鎖オリゴヌクレオチド調製
使用されたオリゴヌクレオチドは、ライフテクノロジー・ライフテックオリエンタル社（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ−Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈ Ｏｒｉｅｎｔａｌ）（東京、日本）に合成を依頼し（ｃｕｓｔｏｍ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ）、次いで、不純物を除去するために変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて精製した（マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）等）。Ｎｏｔ／Ｋｐｎ 二本鎖オリゴヌクレオチドは、下記の２つの一本鎖オリゴヌクレオチドを混合することにより調製した：
【０１５３】
一方の鎖（上鎖（Ｕｐｐｅｒ−ｓｔｒａｎｄ））
（５’ＧＧＣＣＧＣＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＧＣＡＴＡＣＡＴＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴＧＧＡＴＣＡＧＧＣＣＡＡＡＴＣＧＧＣＣＧＡＧＣＴＣＧＡＡＴＴＣＧＴＣＧＡＣＧＡＧＡＧＡＣＴＧＣＡＧＧＡＧＡＧＡＧＧＡＴＣＣＧＧＴＡＣ−３’）（配列番号：６）；及び
他方の鎖（下鎖（Ｌｏｗｅｒ−ｓｔｒａｎｄ））
ＮａＣｌ中の
（５’ＣＧＧＡＴＣＣＴＣＴＣＴＣＣＴＧＣＡＧＴＣＴＣＴＣＧＴＣＧＡＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＣＣＧＡＴＴＴＧＧＣＣＴＧＡＴＣＣＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＡＴＧＣＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴＧＣ −３’）（配列番号：７）（最終濃度、１００ｍＭ）。
【０１５４】
この混合物は、次いで、６５℃で５分間、４５℃で５分間、３７℃で１０分間、かつ、２５℃で１０分間インキュベートされた。
【０１５５】
ベクターオリゴヌクレオチドライゲーション
１００ｎｇのＫｐｎ Ｉ及びＮｏｔ Ｉサイトを末端に有するこのプラスミドと、３ｎｇのＮｏｔ／Ｋｐｎ二本鎖オリゴヌクレオチド、１μｌ １０ ｘ ライゲーション緩衝液（ＮＥＢ）及びＴ４ ＤＮＡ リガーゼ（ＮＥＢ）を、１０μｌ中で混合した。
【０１５６】
細胞形質転換
ライゲーションサンプルを含むチューブを、次いで、終夜１６℃でインキュベートした。ライゲーションサンプルは、２５０ｍＭのＮａＣｌ、１μｇのグリコーゲン及びイソプロパノールと混合し、次いで緩衝液を除去するために沈殿させた。続いて、それを、１０μｌの滅菌水に溶解した。得られたサンプルのうち１μｌを、エレクトロポレーション（製造者のプロトコルに従う）により大腸菌細胞ＤＨ１０Ｂ（ライフ・テック・オリエンタル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈ Ｏｒｉｅｎｔａｌ））の懸濁液へ形質転換するために添加した。形質転換された細胞は、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢプレート上で選択された。アンピシリン耐性クローンは、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含む ＬＢ液体培地中で、３７℃で１６時間攪拌しながら培養した。合成した二本鎖オリゴヌクレオチドの挿入に使用した組換えプラスミドは、アルカリＳＤＳ法（分子クローニング）により精製した。挿入した配列はＭ１３前プライマー（ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ）（配列番号：５）及びビッグダイキット（Ｂｉｇ ｄｙｅ ｋｉｔ）を用い、ＡＢＩ３７７ ＤＮＡシーケンサー（ＰＥ−アプライド・バイオシステムズ（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ））により確認された。
【０１５７】
ベクター調製
上記のようにして得られた１０μｇの改変ｐＢＳ ＳＫ（＋）プラスミド（ｐＢＳ ＩＶと呼ばれる）に、２０μｌの１０ｘ Ｂａｍ ＨＩ緩衝液、２０μｌの１０ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン（ニュー・イングランド・バイオラボズ社（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ））、３０単位のＢａｍＨ Ｉ（ニュー・イングランド・バイオラボズ社（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ））、３０単位のＳａｌ Ｉ（ニュー・イングランド・バイオラボズ社（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ））を添加し、体積が２００μｌになるように調整し、３７℃で１．５時間インキュベートした。続いて、１０単位のＰｓｔ Ｉ（ニュー・イングランド・バイオラボズ社（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ））を、チューブ中の混合物に添加し、３０分間インキュベートした。更に、０．５単位の温度感受性アルカリフォスファターゼＴｓＡＰ（ライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））によってプラスミド末端の脱リン酸化を行った。ＴｓＡＰは、部分的に切断されたプラスミドによるバックグラウンド（ｂａｃｋｇｒａｏｕｎｄ）を低減する。脱リン酸化された末端は、お互いにライゲートすることができない。チューブは、３７℃で３０分間インキュベートされた。ＴｓＡＰを不活性化するために、ＥＤＴＡ（最終濃度２０ｍＭ）を添加し、６５℃で３０分間インキュベートした。制限酵素／ＴｓＡＰ処理されたプラスミドは、ベクター構築段階において前述のように分離した。Ｂａｍ ＨＩ及びＳａｌ Ｉサイトを末端に有する線状プラスミドに対応するバンドを、ゲルから切り出し、このゲルをスライスして小断片とした。それを５００μｌの１ｘ βアガラーセ（β‐ａｇａｒａｓｅ）緩衝液（ＮＥＢ）を含むチューブへ入れ、氷上で３０分間放置した。緩衝液を１度交換し、更に氷上で３０分間放置した。
【０１５８】
このチューブを、ゲルを溶解するために６５℃で１０分間インキュベートした。溶液を１００μｌにするために、β‐アガラーセ緩衝液を添加した。次いで、それを、３分間４５℃にて冷却し、β‐アガラーセ （ＮＥＢ）を、３Ｕ／１００μｌ反応溶液の濃度になるように（ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ３Ｕ／１００μｌ ｒｅａｃｔｉｏｎ）添加した。この反応液を、４５℃で６時間インキュベートした。１０μｌの５Ｍ ＮａＣｌ及び１００μｌのフェノール／クロロホルムをチューブへ添加した。チューブを、５分間静かに上下を逆にするように振り、１５ ｋｒｐｍで３分間室温で遠心分離した。水相を回収し、次いで、クロロホルム抽出及びイソプロパノール沈殿を行なった。チューブは、１５ｋｒｐｍで１０分間４℃で遠心分離し、得られたペレットを、８０％エタノールで２回洗浄した。最終的に、ペレットを、最終濃度が１００ ｎｇ／μｌになるように滅菌水に溶解した。アガロースゲル電気泳動により、濃度が既にわかっている標準プラスミドと比較することによって、ベクターの濃度及び純度を確認した。
【０１５９】
クローニング
前段階で得られた１０ｎｇのｃＤＮＡと、１９０ｎｇの上記改変ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ（＋）（ＰｂｓＩＶ）（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））とを終夜ライゲートした。
ｃＤＮＡ−ベクターライゲーションは、２．５倍体積のＥｔＯＨを用いて沈殿させた。サンプルは、エレクトロポレーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）により大腸菌ＤＨ１０Ｂ（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ） ＢＲＬ）へ導入した。形質転換された細胞を、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢプレート上に塗布し、終夜３７℃で培養した。３６コロニーを無作為に採取し、ＬＢアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）液体培地中、終夜３７℃で培養した。３つの培養物から組換えプラスミドを抽出した（サンブロック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、１９８９）。これらの３つの精製されたプラスミドは、キットマニュアル指示書に従ってＡＢＩ３７００ ＤＮＡシーケンサー（ＰＥ−アプライド・バイオシステム（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍ））を用いることにより、ビッグダイターミネーターサイクル配列決定レディー反応キット（Ｂｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ）（ＰＥ−ＡＢＩ）及びＭ１３前プライマーＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ （配列番号：５）を用いて５’末端から配列決定された。
【０１６０】
実施例３
ライゲーション効率
上記のように調製したリンカーと、マウス肝臓由来のｃＤＮＡ類とのライゲーションにおいて、２μｇの混合リンカー（Ｎ６：ＧＮ５ ＝ １：４ ）を、様々な量のｃＤＮＡ類（１μｇ、０．５μｇ及び０．２μｇ、それぞれ図４のレーン１、２及び３）とライゲートした。その後、５０ｎｇのライゲートされたｃＤＮＡ類を第二鎖合成に使用し、かつ、アルカリゲル電気泳動で分析した。全ての電気泳動パターン及び取込み率は、同じであり（レーン１−３）、２μｇのリンカーは、いずれの異なる量のｃＤＮＡ類にも効率的にライゲートされたことを示している。リンカーの量が適当でない場合、過剰発現ｃＤＮＡバンドは、ヘアピン構造を形成することにより２倍のサイズに変化し得る。しかし、第一鎖ｃＤＮＡ及び全ての第二鎖ｃＤＮＡ類は同様のパターン（同じサイズ）を示した。
【０１６１】
実施例４
完全長 ｃＤＮＡ 類調製のリンカーライゲーション効率
肝臓マウスｃＤＮＡライブラリーは、ＣＡＰトラッパー技術を用いて上記と同様の方法により調製された。
上記実施例に記載されたリンカー法を用いることにより調製されたものが、完全長ｃＤＮＡであるか否かは、配列決定段階後、ＡＴＧ開始コドンの存在を確かめることによりチェックした。実際、開始ＡＴＧからの完全コーディング配列を含むそれらのｃＤＮＡ類は、完全長ｃＤＮＡ類としてみなされた（ａｃｃｅｐｔｅｄ）。５’配列を、ＢＬＡＳＴを用いて公共のヌクレオチドデータベースと比較した。（アルツシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）、Ｓ．Ｆ．、ギシュ（Ｇｉｓｈ）、Ｗ．、ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）、Ｗ．、マイヤーズ（Ｍｙｅｒｓ）、Ｅ．Ｗ．及びリプマン（Ｌｉｐｍａｎ）、Ｄ．Ｊ．、１９９０、「ベーシック・ローカル・アライメント・サーチ・ツール（Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ．）」 Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３−４１０）。
【０１６２】
塩基配列は、キットマニュアルに従いビッグダイターミネーターサイクル配列決定レディー反応キット（ＰＥ−ＡＢＩ）及びパーキン・エルマー−アプライド・バイオシステムズ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ） ＡＢＩ ３７００を用いて決定された。
【０１６３】
使用したシークエンシングプライマーは、５’側Ｍ１３プライマー（配列番号：５）である。
データは、表１に示されている。ＡＴＧの存在（転写が始まる位置）に、対応する位置を記した。例えば、サンプル２．０１を参照にすると、ＡＴＧコドンのアデノシンは位置６３であり、これは、このｃＤＮＡ配列が６２ｂｐ ５’−ＵＴＲを有することを示している。
【０１６４】
【表１】
これらのデータは、本発明によるリンカー法を用いてｃＤＮＡ類が効率よく調製され、配列決定されることを示している。
表１のクローン２．０５の配列決定は、図６のチャートに示されている。
表１のクローン３．０７の配列決定は、図７のチャートに示されている。
【０１６６】
従来のＧ−テーリング ＣＡＰ−トラッピング に対するＣＡＰトラッピング‐リンカーの利点
Ｉ） Ｇ−テールの長さの調節は、何年もの間困難であった。第二鎖プライマーをアニールするために、ｃＤＮＡクローンは少なくとも１１のｄＧ類、平均１３−１５のｄＧ類を有している。Ｇ−テーリング反応は１５−３０ｎｔに自ら制限されているけれども（Ｈｙｏｎｅ−Ｍｙｏｎｇ Ｅｕｎ、１９９６、エンジモロジー・プライマー・フォー・リコンビナント・ＤＮＡテクノロジー（Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ Ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、４７７ページ）、約２０塩基より長いＧストレッチが得られることがしばしばあり、配列決定収率を著しく低減させ、又、最悪の場合失敗を招いていた。一方、短いＧストレッチの場合は、長い配列を読むことが困難だった（図５参照）。配列決定中、長いＧストレッチは、周囲の配列と相互作用し、非常に強固な二次構造を形成することがある。これは、典型的にはＧＣリッチである５’ＵＴＲ類との相互作用において問題を起こすことがある。これは、特に、Ｃａｐ−トラッピングライブラリーの場合のように、完全長ｃＤＮＡ類合成において深刻な問題である。
【０１６７】
本発明によるリンカーを用いた方法は、従来法とは異なり、このような欠点がなく（無作為可変部位がＧを含む場合でも、それらは統計的に少数に留まる）、効率の良い配列決定を可能にする（図６及び７）。
ＩＩ） Ｇ−ストレッチは、機能的研究、例えば、発現クローニングのようにタンパク質発現を必要とする場合、翻訳効率に影響を与えると予測される（キング（Ｋｉｎｇ） ＲＷ、 ラスチグ（Ｌｕｓｔｉｇ） ＫＤ、スツケンバーグ（Ｓｔｕｋｅｎｂｅｒｇ） ＰＴ、 マクガリ（ＭｃＧａｒｒｙ） ＴＪ、キルシェナー（Ｋｉｒｓｃｈｎｅｒ） ＭＷ． エクスプレッション・クローニング。イン・ザ・テスト・チューブ（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃｌｏｎｉｎｇ ｉｎ ｔｈｅ ｔｅｓｔ ｔｕｂｅ．） サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ．）１９９７；２７７：９７３−４）。一方、本発明のリンカー配列は、転写及び翻訳を阻害しない。
【０１６８】
産業上の利用可能性
本発明は、ｃＤＮＡライブラリーの調製のための新規かつ効率的な方法を提供する。より具体的には、本発明は、ｃＤＮＡライブラリーの調製方法において利用可能なＧ−テーリングに代わる新規リンカーを提供し、かつ前記リンカーを用いるｃＤＮＡライブラリーの調製方法を提供する。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、１例として可変部位ＧＮＮＮＮＮを含むリンカー群を用いた完全長ｃＤＮＡライブラリー調製工程の例を示す。
【図２】図２は、図１の続きで、１例として可変部位ＧＮＮＮＮＮを含むリンカー群を用いた完全長ｃＤＮＡライブラリー調製工程の例を示す。
【図３】図３はテストｃＤＮＡとリンカーとの間のライゲーションの結果を示す。
【図４】図４は、様々なモル比のリンカーを用いた細胞内ｃＤＮＡのリンカーライゲーションｃＤＮＡとリンカーとの比を調べた結果を示す。
【図５】図５は、従来技術に記載のＧ−テールを有する ｃＤＮＡ配列の配列決定チャートを示している。
【図６】図５は、従来技術に記載のＧ−テールを有する ｃＤＮＡ配列の配列決定チャートを示している。
【図７】図５は、従来技術に記載のＧ−テールを有する ｃＤＮＡ配列の配列決定チャートを示している。
【図８】図５は、従来技術に記載のＧ−テールを有する ｃＤＮＡ配列の配列決定チャートを示している。
【図９】図５は、従来技術に記載のＧ−テールを有する ｃＤＮＡ配列の配列決定チャートを示している。
【図１０】図６は、Ｎ６／ＧＮ６リンカー混合物（比率１：４）とライゲートされたｃＤＮＡ配列の配列決定チャートを示す。
【図１１】図６は、Ｎ６／ＧＮ６リンカー混合物（比率１：４）とライゲートされたｃＤＮＡ配列の配列決定チャートを示す。
【図１２】図６は、Ｎ６／ＧＮ６リンカー混合物（比率１：４）とライゲートされたｃＤＮＡ配列の配列決定チャートを示す。
【図１３】図６は、Ｎ６／ＧＮ６リンカー混合物（比率１：４）とライゲートされたｃＤＮＡ配列の配列決定チャートを示す。
【図１４】図６は、Ｎ６／ＧＮ６リンカー混合物（比率１：４）とライゲートされたｃＤＮＡ配列の配列決定チャートを示す。
【図１５】図７は、ＧＮ５リンカーとライゲートされたｃＤＮＡ配列の配列決定チャートを示す。
【図１６】図７は、ＧＮ５リンカーとライゲートされたｃＤＮＡ配列の配列決定チャートを示す。
【図１７】図７は、ＧＮ５リンカーとライゲートされたｃＤＮＡ配列の配列決定チャートを示す。
【図１８】図７は、ＧＮ５リンカーとライゲートされたｃＤＮＡ配列の配列決定チャートを示す。
【図１９】図７は、ＧＮ５リンカーとライゲートされたｃＤＮＡ配列の配列決定チャートを示す。
【図２０】図８は、ループバイアス及びその可能な解決法を図で示している。
Claims (97)
- オリゴヌクレオチド定常部位及び式（Ｎ）ｎ（式中、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ若しくはＵ、又はそれらの誘導体であり、かつ、ｎは１以上の整数であり、ｎが２以上の整数の場合、ヌクレオチド類（Ｎ）は、同一でも、互いに異なっても良い）で表されるオリゴヌクレオチド可変部位を含むリンカー又はリンカー群。
- 前記可変部位がランダムに調製される請求項１に記載のリンカー。
- 前記ｎが１〜１０の整数である請求項１に記載のリンカー。
- 前記ｎが４〜８の整数である請求項１に記載のリンカー。
- 前記ｎが５または６である請求項１に記載のリンカー。
- 前記可変部位は、（Ｇ）ｍ（Ｎ）ｎ−ｍであり、かつｍは１〜３の整数である請求項１〜５のいずれか１項に記載のリンカー。
- 前記可変部位が、ＧＮ４、ＧＮ５、Ｇ２Ｎ３、Ｇ２Ｎ４、Ｇ３Ｎ２、Ｇ３Ｎ３、Ｎ５またはＮ６である請求項１〜６のいずれか一項に記載のリンカー。
- 前記オリゴヌクレオチド定常部位は、一本鎖又は二本鎖オリゴヌクレオチドである請求項１〜７のいずれか一項に記載のリンカー。
- 前記定常部位は、二本鎖オリゴヌクレオチドであり、一本鎖可変部位（Ｎ）ｎが上記二本鎖定常部位の外側に突出する請求項８に記載のリンカー。
- 配列番号１又は配列番号３の配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドである請求項１〜９のいずれか一項に記載のリンカー。
- 配列番号１／配列番号２又は配列番号３／配列番号２の配列を有する２本鎖オリゴヌクレオチドである請求項１〜９のいずれか一項に記載のリンカー。
- ａ）オリゴヌクレオチド一本鎖定常部位及びオリゴヌクレオチド一本鎖可変部位を含む第一オリゴヌクレオチド一本鎖、並びに
ｂ）相補的な第一オリゴヌクレオチド一本鎖定常部位（ａ）とアニーリングしたオリゴヌクレオチド一本鎖定常部位を含む第二オリゴヌクレオチド一本鎖
を含み、
それにより、式（Ｎ）ｎ（式中、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ若しくはＵ、又はそれらの誘導体であり、かつ、ｎは１以上の整数である）で表される前記可変部位が、リンカーの二本鎖定常部位の外側に突出する、二本鎖オリゴヌクレオチドリンカー又はリンカー群。 - 前記可変部位がランダムに調製される請求項１２に記載のリンカー。
- 前記ｎが１〜１０の整数である請求項１２に記載のリンカー。
- 前記ｎが４〜８の整数である請求項１２に記載のリンカー。
- 前記ｎが５または６である請求項１２に記載のリンカー。
- 前記可変部位は、（Ｇ）ｍ（Ｎ）ｎ−ｍであり、かつｍは１〜３である請求項１〜５のいずれか１項に記載のリンカー。
- 前記可変部位が、ＧＮ４、ＧＮ５、Ｇ２Ｎ３、Ｇ２Ｎ４、Ｇ３Ｎ２、Ｇ３Ｎ３、Ｎ５またはＮ６である請求項１２〜１７のいずれか一項に記載のリンカー。
- 配列番号１／配列番号２又は配列番号３／配列番号２を有する請求項１２〜１８のいずれか１項に記載のリンカー。
- 請求項１〜１９のいずれか一項に記載のリンカーを少なくとも２つ含むリンカー群。
- 請求項１〜２０のいずれか一項に記載のサブリンカー群を少なくとも２つ含むリンカー群。
- すべてのリンカーに含まれる定常部位が、同一配列を有するオリゴヌクレオチド部位である請求項１〜２１のいずれか一項に記載のリンカー群。
- ２つ以上のサブリンカー群を含むリンカー群であって、１つのサブリンカー群は定常部位が同一配列を有するオリゴヌクレオチド部位であるリンカー類を含み、かつ他のサブリンカー群の定常部位配列は相互に異なる、請求項１〜２２のいずれか一項に記載のリンカー群。
- 前記リンカー類の可変部位がランダムに合成される請求項１〜２３のいずれか一項に記載のリンカー群。
- 各リンカーに含まれる可変部位の配列が相互に異なる請求項１〜２４のいずれか一項に記載のリンカー群。
- （Ｎ）ｎ／（Ｇ）ｍ（Ｎ）ｎ−ｍ混合物として表される、（Ｎ）ｎリンカーと（Ｇ）ｍ（Ｎ）ｎ−ｍリンカーとの混合物である請求項１〜２５のいずれか一項に記載のリンカー群。
- ＧＮ４、ＧＮ５、Ｇ２Ｎ３、Ｇ２Ｎ４、Ｇ３Ｎ２、Ｇ３Ｎ３、Ｎ５又はＮ６からなる群から選ばれる可変部位のいずれかを有する２種以上のリンカーの混合物である請求項１〜２６のいずれか一項に記載のリンカー群。
- Ｎ６／ＧＮ５混合物、Ｎ６／Ｇ２Ｎ４混合物またはＮ６／Ｇ３Ｎ３混合物である請求項２７に記載のリンカー群。
- 混合比が０：１〜１：０である請求項２８に記載のリンカー群。
- 混合比が１：４である請求項２９に記載のリンカー群。
- （ａ）オリゴヌクレオチド一本鎖定常部位及びオリゴヌクレオチド一本鎖可変部位を含む第一オリゴヌクレオチド一本鎖の合成、
（ｂ）第一オリゴヌクレオチド一本鎖定常部位（ａ）に相補的なオリゴヌクレオチド一本鎖定常部位を含む第二オリゴヌクレオチド一本鎖の合成、及び
（ｃ）前記可変部位が二本鎖定常リンカー部位の外側に突出するように、前記第一オリゴヌクレオチド鎖（ａ）を前記第二オリゴヌクレオチド鎖（ｂ）へアニールすることにより調製される請求項１〜３０のいずれか一項に記載のリンカー又はリンカー群。 - 前記定常部位が、１つ以上の制限酵素サイト、組換えサイト、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターサイト、マーカー又はタグの配列を有する請求項１〜３１のいずれか一項に記載のリンカー又はリンカー群。
- 前記制限酵素サイトがＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩ、ＳｓｔＩ、ＳａＩＩまたはＮｏｔＩである請求項３２に記載のリンカー又はリンカー群。
- 前記組換えサイトがａｔｔＢ、ｃｒｅ−ｌｏｘ、又はＧａｔｅｗａｙ（商標）である請求項３２に記載のリンカー又はリンカー群。
- 前記ポリメラーゼプロモーターサイトが、Ｔ７、Ｔ３、Ｋ１１、ＳＰ６及びＢＡ１４ＲＮＡポリメラーゼからなる群から選ばれる請求項３２に記載のリンカー又はリンカー群。
- 前記マーカーが特異的配列又は複数のヌクレオチドである請求項３２に記載のリンカー又はリンカー群。
- 前記タグが、可変部位と反対側の、定常部位の２つの鎖の一方、または両方の末端に結合し、かつ前記末端が、前記リンカーとアニールされた標的一本鎖ポリヌクレオチドとの間に結合ループを形成する事を妨げる保護基である請求項３２に記載のリンカー又はリンカー群。
- 保護基がＮＨ２基である請求項３７に記載のリンカー又はリンカー群。
- 可変部位と反対側の、前記リンカーの定常部位の２つの鎖の末端が、前記リンカーがアニールした標的一本鎖ポリヌクレオチドと結合する事を妨げるように、互いに結合してループを形成している請求項３８に記載のリンカー又はリンカー群。
- 前記可変オリゴヌクレオチド配列が特異的オリゴヌクレオチド配列（但し、前記特異的オリゴヌクレオチド配列は、標的ポリヌクレオチドの群から選ばれるべき少なくとも１つの特定のポリヌクレオチドの末端と特異的にアニールし得る）である少なくとも１つのリンカーを含むリンカー群である請求項１〜３９のいずれか一項に記載のリンカー群。
- ＤＮＡ又はＲＮＡ又はそれらの混合物である請求項１〜４０のいずれか一項に記載のリンカー又はリンカー群。
- 請求項１〜４１のいずれか一項に記載のリンカー又はリンカー群及び前記リンカーに結合した標的第１鎖ポリヌクレオチドを含むリンカー−ポリヌクレオチド又はリンカー−ポリヌクレオチド群。
- 前記標的第１鎖ポリヌクレオチドの一方の末端が前記リンカーへアニール及び／又はライゲートされる請求項４２に記載のリンカー−ポリヌクレオチド又はリンカー−ポリヌクレオチド群。
- 前記標的第１鎖ポリヌクレオチドの一方の末端が前記リンカーの第１鎖の可変部位へアニールされ、かつ前記リンカーの第２鎖定常部位とライゲートされる請求項４２に記載のリンカー−ポリヌクレオチド又はリンカー−ポリヌクレオチド群。
- 前記リンカーが、リガーゼを用いて前記標的第１鎖ポリヌクレオチドとライゲートされる請求項４２〜４４のいずれか一項に記載のリンカー−ポリヌクレオチド又はリンカー−ポリヌクレオチド群。
- 前記リガーゼがＤＮＡリガーゼまたはＲＮＡリガーゼである請求項４５に記載のリンカー−ポリヌクレオチド又はリンカー−ポリヌクレオチド群。
- 前記標的第１鎖ポリヌクレオチドに相補的な第２鎖ポリヌクレオチドをさらに含む請求項４２〜４６のいずれか一項に記載のリンカー−ポリヌクレオチド又はリンカー−ポリヌクレオチド群。
- 第２鎖ポリヌクレオチドは、プライマーとして機能する可変部位によって、可変部位のフリー末端から合成される請求項４７に記載のリンカー−ポリヌクレオチド又はリンカー−ポリヌクレオチド群。
- ＲＮＡ又はＤＮＡ又はそれらの混合物である、請求項４５〜４８のいずれか一項に記載の一本鎖または二本鎖ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド群。
- ＤＮＡがｃＤＮＡである請求項４９に記載の一本鎖または二本鎖ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド群。
- 長鎖、完全コード及び／又は完全長ｃＤＮＡである請求項５０に記載の一本鎖または二本鎖ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド群。
- 請求項４２〜５１のいずれか一項に記載のリンカー−ポリヌクレオチドを含むベクター。
- ファージ、プラスミドベクターまたはシーケンシングのためのベクターである請求項５２に記載のベクター。
- （ａ）オリゴヌクレオチド一本鎖定常部位及びオリゴヌクレオチド一本鎖可変部位を含む第一オリゴヌクレオチド一本鎖の合成、
（ｂ）第一オリゴヌクレオチド一本鎖定常部位（ａ）に相補的なオリゴヌクレオチド一本鎖定常部位を含む第二オリゴヌクレオチド一本鎖の合成、及び
（ｃ）第一オリゴヌクレオチド鎖（ａ）を第二オリゴヌクレオチド鎖（ｂ）へアニールし、それにより可変部位がリンカーの二本鎖定常部位の外側に突出する段階を含む請求項１〜４１のいずれか一項に記載のリンカー又はリンカー群の調製方法。 - 標的一本鎖ポリヌクレオチドとリンカーとを結合させる方法であって、
ｉ）請求項１〜４１のいずれか一項に記載のリンカーの調製；及び
ｉｉ）前記リンカーの可変部位を標的一本鎖ポリヌクレオチドへアニールする段階を含む方法。 - 標的一本鎖ポリヌクレオチドとリンカーとを結合させる方法であって、
ｉ）請求項１〜４１のいずれか一項に記載のリンカーの調製；及び
ｉｉ）前記リンカーの第一鎖の可変部位を標的一本鎖ポリヌクレオチドへアニールし、かつ前記リンカーの第二鎖の定常部位を標的一本鎖ポリヌクレオチドとライゲートさせる段階を含む方法。 - 標的一本鎖ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド群とリンカー群とを結合させる方法であって、
ｉ）請求項１〜４１のいずれか一項に記載のリンカー群の調製；及び
ｉｉ）前記リンカー群の可変部位を標的一本鎖ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド群へアニールする段階を含む方法。 - 標的一本鎖ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド群とリンカー群とを結合させる方法であって、
ｉ）請求項１〜４１のいずれか一項に記載のリンカー群の調製；及び
ｉｉ）前記リンカー群の第一鎖の可変部位を標的一本鎖ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド群へアニールし、かつ前記リンカー群の第二鎖の定常部位を標的一本鎖ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド群とライゲートさせる段階を含む方法。 - リンカー及び二本鎖ポリヌクレオチドを含むリンカー−ポリヌクレオチドの調製方法であって、
ｉ）請求項１〜４１のいずれか一項に記載のリンカーの可変部位を標的第一鎖ポリヌクレオチドへアニールし、かつ
ｉｉ）前記標的第一鎖ポリヌクレオチドに相補的な第二鎖ポリヌクレオチドを合成する段階を含む方法。 - リンカー及び二本鎖ポリヌクレオチドを含むリンカー−ポリヌクレオチドの調製方法であって、
ｉ）請求項１〜４１のいずれか一項に記載のリンカーの第一鎖の可変部位を標的一本鎖ポリヌクレオチドへアニールし、かつ前記標的一本鎖ポリヌクレオチドを前記リンカーの第二鎖の定常部位とライゲートさせ、そして、
ｉｉ）前記標的一本鎖ポリヌクレオチドに相補的な第二の一本鎖ポリヌクレオチドを合成する段階を含む方法。 - リンカー及び二本鎖ポリヌクレオチドを含むリンカー−ポリヌクレオチドの調製方法であって、
ｉ）請求項１〜４１のいずれか一項に記載のリンカー又はリンカー群の可変部位を標的一本鎖ポリヌクレオチドまたは標的一本鎖ポリヌクレオチド群へアニールし、かつ
ｉｉ）前記標的一本鎖ポリヌクレオチド又はその群に相補的な第二鎖ポリヌクレオチドを合成する段階を含む方法。 - リンカー及び二本鎖ポリヌクレオチドを含むリンカー−ポリヌクレオチドの調製方法であって、
ｉ）請求項１〜４１のいずれか一項に記載のリンカー又はリンカー群の第一鎖の可変部位を標的一本鎖ポリヌクレオチド又は標的一本鎖ポリヌクレオチド群へアニールし、
ｉｉ）前記標的一本鎖ポリヌクレオチド又は標的一本鎖ポリヌクレオチド群を前記リンカー又はリンカー群の第二鎖の定常部位とライゲートさせ、かつ
ｉｉｉ）前記標的一本鎖ポリヌクレオチド（類）に相補的な第二の一本鎖ポリヌクレオチド（類）を合成する段階を含む方法。 - 前記標的第一鎖ポリヌクレオチドの一方の末端を、リンカーの可変部位へアニールし、かつ前記リンカーの第二鎖の定常部位とライゲートさせる、請求項５４〜６２のいずれか一項に記載の方法。
- 前記可変部位がランダムに合成される請求項５４〜６３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記リンカー群は、前記可変オリゴヌクレオチド部位が特異的オリゴヌクレオチド部位（但し、この特異的オリゴヌクレオチド部位は、標的ポリヌクレオチドの群から選ばれるべき少なくとも１つの特異的ポリヌクレオチド標的の末端に相補的である）である少なくとも１つのリンカーを含む請求項５５〜６４のいずれか一項に記載の方法。
- ライゲーションがリガーゼにより行われる請求項５５〜６５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記リガーゼがＤＮＡリガーゼまたはＲＮＡリガーゼである請求項６６に記載の方法。
- 前記ＤＮＡリガーゼがＴ４ ＤＮＡリガーゼまたは大腸菌ＤＮＡリガーゼである請求項６７に記載の方法。
- 前記ライゲーションがリガーゼ刺激剤の存在下で行われる請求項６６〜６８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記リガーゼ刺激剤がＰＥＧ（ポリエチレングリコール）である請求項６９に記載の方法。
- 前記リンカー及び前記標的第一鎖ポリヌクレオチド及び／又は前記標的に相補的な第二鎖ポリヌクレオチドがＤＮＡである請求項５５〜７０のいずれか一項に記載の方法。
- 前記標的第一鎖ポリヌクレオチド又は前記二本鎖ポリヌクレオチドが長鎖、完全コード及び／又は完全長ｃＤＮＡである請求項７１に記載の方法。
- 前記第一鎖ｃＤＮＡがｍＲＮＡの５’末端でのＣａｐトラッピングから得られる請求項７２に記載の方法。
- 前記ＣａｐトラッピングされたｃＤＮＡがリンカーとのライゲーションの前または後に、さらにノーマライゼーションまたはサブトラクションされる請求項７３に記載の方法。
- 前記リンカーを標的第一鎖ポリヌクレオチドにアニールする前、及び／又はポリヌクレオチド第二鎖の合成の後、温度を上昇させる段階を含む、請求項５５〜７４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記温度が２５〜１００℃の範囲である請求項７５に記載の方法。
- 前記温度が６５℃である請求項７６に記載の方法。
- 可変部位と反対側の、前記リンカーの定常部位の少なくとも一端が、保護基によってタグされる請求項５５〜７７のいずれか一項に記載の方法。
- 前記保護基がＮＨ２である請求項７８に記載の方法。
- 前記リンカー定常部位の２つの鎖の末端が、ループを作ることにより一緒に結合する請求項５５〜７９のいずれか一項に記載の方法。
- 前記リンカー−ポリヌクレオチドが、制限酵素サイトにおいて両方の末端で切断され、かつベクターに挿入される段階をさらに含む、請求項５５〜８０のいずれか一項に記載の方法。
- 前記リンカー−ポリヌクレオチドが平滑末端を残して切断され、かつベクターに挿入される段階をさらに含む、請求項５５〜８０のいずれか一項に記載の方法。
- ポリヌクレオチドライブラリーをマーキングし、かつ前記ライブラリーを識別する方法であって、定常部位及び可変部位を含むリンカー群（但し、定常部位は特異的又は特定の組織又は種を示す少なくとも１つのマーカーを含む）を提供し、前記特異的又は特定のマーカーにより前記ライブラリーを選択及び分離する段階を含む方法。
- 前記リンカー又はリンカー群は請求項１〜４１のいずれか一項に記載のものである請求項８３に記載の方法。
- 前記リンカー群の中のすべてのリンカー群に含まれる定常部位は、同一配列を有するオリゴヌクレオチド部位である請求項８３又は８４に記載の方法。
- リンカー又はリンカー群をｍＲＮＡと結合させる方法であって、
（ａ） ｍＲＮＡをフォスファターゼ処理してキャップされていないｍＲＮＡからリン酸基を除去し、
（ｂ）段階（ａ）の生成物を、キャップされたｍＲＮＡからＣＡＰ構造を除去するピロフォスファターゼで処理し、かつ
（ｃ）請求項１〜４１のいずれか一項に記載のリンカーの存在下、ＲＮＡリガーゼを添加する段階を含む方法。 - リンカー−ポリヌクレオチドの調製方法であって、
（ａ） ｍＲＮＡをフォスファターゼ処理してキャップされていないｍＲＮＡからリン酸基を除去し、
（ｂ）段階（ａ）の生成物を、キャップされたｍＲＮＡからＣＡＰ構造を除去するピロフォスファターゼで処理し、
（ｃ）請求項１〜４１のいずれか一項に記載のリンカーの存在下、ＲＮＡリガーゼを添加し、かつ
（ｄ）オリゴｄＴを添加して、前記ｍＲＮＡの完全配列に相補的なポリヌクレオチドを合成する段階を含む方法。 - 前記ｍＲＮＡに相補的なポリヌクレオチドがｃＤＮＡである請求項８７に記載の方法。
- 前記フォスファターゼがバクテリアアルカリフォスファターゼ（ＢＡＰ）である請求項８６〜８８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記フォスファターゼがタバコ酸性ピロフォスファターゼ（ＴＡＰ）である請求項８６〜８８のいずれか一項に記載の方法。
- 段階（ｃ）のリンカーがＤＮＡであり、かつ
（ｅ）ＲＮａｓｅ Ｈを添加し、
（ｆ）ＤＮＡポリメラーゼＩを添加し、そして
（ｇ）ｃＤＮＡ鎖を合成する
段階をさらに含む請求項８６〜９０のいずれか一項に記載の方法。 - ＲＮＡリガーゼを添加する段階を含む、標的一本鎖ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド群に請求項１〜４１のいずれか一項に記載のリンカー又はリンカー群を結合させる方法。
- 前記リンカー又はリンカー群の可変部位に相補的なオリゴヌクレオチドプライマー又はプライマー群の添加をさらに含む請求項９２に記載の方法。
- 前記プライマー群に含まれるプライマーがランダムに合成される請求項９３に記載の方法。
- 請求項９２〜９４のいずれか一項に記載の段階及び標的ポリヌクレオチドに相補的な第二鎖ポリヌクレオチドをさらに合成することを含む第二鎖ポリヌクレオチドの調製方法。
- ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドの調製方法であって、
ｉ）完全長／コーディング又は長いポリＡ ｍＲＮＡ類を提供し、
ｉｉ）第一の制限酵素サイトを含む請求項１〜４１のいずれか一項に記載のリンカーと前記ｍＲＮＡをライゲート及び／又はアニールし、
ｉｉｉ）第二制限酵素サイトを含むオリゴｄＴプライマーを前記ｍＲＮＡへアニーリングし、
ｉｖ）ｃＤＮＡ鎖を合成し、
ｖ）導入された２つの特異的制限酵素サイトを認識する制限酵素を用いることによりハイブリッドを単離し、かつ
ｖｉ）クローニングする
段階を含む方法。 - リンカー及び一本鎖ポリヌクレオチドを含むリンカー−ポリヌクレオチド生成物の調製方法であって、本発明によるリンカーの可変部位の標的第一鎖ポリヌクレオチドへのアニーリングを含む方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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