JP2004510426A - 多発性硬化症の治療におけるケモカイン変異体 - Google Patents
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Abstract
Description
発明の分野
本発明は、40’sループにおいて少なくとも2つの変異を含み、且つ野生型分子に比較して低下したGAG−結合活性を有するCCケモカインの変異体に関する;そのような変異ケモカインが多発性硬化症及び/又は脱髄疾患の治療において有効であることを発見した。
発明の背景
ケモカインは、白血球走化性及び活性特性を共なう小さな炎症誘発性サイトカインのファミリーを構成する。第1の保存されたシステインの位置に依存して、ケモカインファミリーは、C−C,C−X−C及びC−X3−Cケモカインに分類することができる(Baggiolini M.et al.,Adv Immunol.1994,55:97−179;Baggiolini M.et al.,Annu Rev Immunol.1997,15:675−705;Taub D.et al.,Cytokine Growth Factor Rev.1996,7(4):355−76)。
【0002】
多くのC−X−Cケモカイン、例えばインターロイキン−8(IL−8)は好中球に関して走化性であり、一方C−Cケモカインは、単球、リンパ球、好酸球、好塩基球、NK細胞及び樹状細胞を含む様々な白血球に対して活性である。
【0003】
ケモカインのNH2−末端ドメインは受容体結合に関与し、そしてNH2−末端プロセシングは、ケモカインを活性化するか又はケモカインを完全に不活性にすることができる。
【0004】
合成C−CケモカインのN−末端バリアントについて、天然に生じる形態の阻害剤又はアンタゴニストとしてのそれらの活性に関して試験された。8から9個のNH2−末端アミノ酸を欠くMCP−1,MCP−3及びRANTESは、単球上で不活性であり、受容体アンタゴニストとして有用である(Gong JH et al.,J Exp Med.1995,181(2):631−40及びGong JH et al.,J Biol Chem.1996,271(18):10521−7)。
【0005】
RANTESの1メチオニンの延長は当該分子の完全な不活性化をもたらし、そしてMet−RANTESは真正のものに関してのアンタゴニストとして挙動する(Proudfoot AE et al.,J Biol Chem.1996 Feb 2;271(5):2599−603)。
【0006】
WO 99/16877は、天然に生じるRANTESのアミノ酸の残基1、1−2、1−3又は1−4に相当するNH2−末端アミノ酸を欠き、且つケモカインのアンタゴニスト活性を有する、アミノ末端削除RANTES、並びにそれらをコードするcDNA配列、ケモカインの作用のアンタゴニスト活性が必要とされる疾患の治療及び/又は診断におけるそれらの使用に関する。RANTES(3−68)は好ましい末端削除ケモカインアンタゴニストである。
【0007】
RANTES及びCCケモカインの化学誘引活性は一般に特定の細胞膜受容体に関連して主に研究されてきたのであるとしても、RANTESは、包括的にはプロテオグリカン(PGs)と呼ばれるいくつかの蛋白質に転写後に付加された高可変性の分枝した糖官能基であるグリコサミノグリカン(GAGs)に相互作用し得る。そのような蛋白質は細胞膜上に存在し、特に単離されたGAGsが存在し得る細胞外マトリックス内及び血流中に存在する。
【0008】
GAGsとの相互作用は多くの細胞シグナリング可溶性分子(インターロイキン、成長因子)に共通の特徴である。PGs又は単離されたGAGsは、おそらく、細胞外環境において蛋白質分解からこの分子を防御する範囲において、可溶性分子と複合体を形成することができる。GAGsは細胞シグナリング分子のそれらの特定の受容体への正確な提示を助け、そして結局は標的細胞の活性化を変調することも助けるかもしれないとも、提案されている。
【0009】
ケモカインの場合、炎症部位における固定化勾配への濃度、及び結果的には細胞受容体との相互作用及びそれらの活性化状態は、異なる形態のGAGsにより変調されるようである(Hoogewerf AJ et al.,Biochemistry 1997,36(44):13570−8)。よって、そのような相互作用の変調は、炎症性疾患(Schwarz MK and Wells TN,Curr Opin Chem Biol.1999,3(4):407−17)及びHIV感染(Burns JM et al.,Proc Natl Acad Sci USA 1999,96(25):14499−504)における治療上のアプローチを代表するかもしれないことが示唆されてきた。
【0010】
GAG−RANTES相互作用の構造上の要求及び機能上の作用は様々なモデルにおいて研究されてきた。RANTESは、他のケモカイン、例えばMCP−1,IL−8又はMIP−1アルファよりも高い親和性及び特異性をもってマイクロモラー濃度にて、ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVECs)上でGAGsに結合する。そのような相互作用は、単純な静電気ではなく、長さのような他のパラメーター及びGAGsのN−及びO−硫酸化に依存するらしい(Kuschert GS et al.,Biochemistry 1999,38(39):12959−68)。GAG欠損細胞系は、ケモカインに結合できるが、細胞表面GAGsの存在は通常それらが低濃度のときに受容体上へのそれらの活性を強く増強させる(Ali S et al.,J Biol Chem 2000,275(16):11721−7)。他の実験は、GAG、特に硫酸ヘパリンがRANTESのマクロファージ細胞表面への相互作用を促進させて結果的にHIVの感染阻害を促進させることを示し、硫酸ヘパリンを不完全にしか発現しないこれらの細胞のよく知られた耐性から、RANTESの抗ウイルス作用までの結果と一致する(Oravecz T,et al.,J Immunol.1997,159(9):4587−92)。
【0011】
可溶性GAGsは細胞膜のGAGsと競合し、そしてRANTES誘導性活性化表面の特異的阻害剤として作用し得る(Appay V,et al.;Int Immunol 2000,12(8):1173−82)か又はHIV感染サプレッサーとして作用し得る(Burns JM et al.;Proc Natl Acad.Sci USA 1999,96(25):14999−504)。
【0012】
いくつかの構造−機能の研究がGAGsとの相互作用に必須のRANTESドメインの同定に試みられたのは、伝統的なコンセンサス配列(BBXB,但し、Bは塩基性残り基であり、Xはあらゆる残基であり得る)があまりに包括的だからである。エピトープのマッピングの研究が、組換えヒトRANTESに対して生じさせた、RANTESにより媒介される抗ウイルス作用と細胞なカルシウム移動の両方をブロックできるモノクローナル抗体を用いて実施された(Burns JM et al.,J.Exp.Med.1998,188(10):1917−27)。このアプローチは、そのような活性及びGAG相互作用の両方に必要な残基55−56を定義することを可能にさせ、GAGsの相互作用が標準の受容体により媒介されるのと相補な機能又は異なる機能を有するかもしれないことを論じ、変更された凝集特性を有するRANTESバリアントに関する研究においても暗示されたところである(Appay V et al.,J Biol Chem 1999,274(39):27505−12)。
【0013】
C−末端のアルファヘリックスセグメントを示す領域55−66はIL−8のような他のケモカインのGAG−結合ドメインに相同であり(Witt DP and Lander AD,Curr.Biol.1994,4(5):394−400)、そしてリジン及びアルギニンを含むカチオン部位(KKWVR)を含む。そのような結合領域は、N−末端に位置する細胞受容体のための結合部位とは異なり(Pakianathan DR et al.,Biochemistry 1997,36(32):9642−8)、そのような脱凝集変異がGAGsとの相互作用に影響しないらしいとしても、RANTESモノマーの凝集に関与するいくつかの残基を含む(Czaplewski LG et al.,J.Biol.Chem.1999,274(23):16077−84;WO 98/13495)。
【0014】
RANTESは、MIP−1α(Koopmann W and Krangel MS,J.Biol.Chem.1997,272(15):10103−9)及びMIP−1β(Koopmann W et al.,J Immunol,1999 163(4):2120−7)のような他のケモカインのGAG結合ドメインにおいて保存された残基44−47において別のカチオン性部位(RKNR)を含む。
【0015】
これらのカチオン性部位において単一の変異を含むヒトRANTESバリアントは、HIV感染及び炎症性又はアレルギー性疾患の処置において有力な治療上の適応性を有するRANTESアンタゴニストとして開示された(WO 99/33989)。
【0016】
44、45及び47の位置の3つの残基をアラニンで置換したRANTESの三重変異体のみがGAG−結合能力を喪失した(A.Proudfoot et al.,Chemokine Gordon Conference,Session I,2000年、7月24日、私信)。
発明の記載
いわゆる「40’sループ」のカチオン性部位において少なくとも2つの変異を含むCCケモカインが多発性硬化症及び/又は脱髄疾患の処置において有効であることを、今、発見した。この部位は、CCケモカインの中で保存されたGAG結合モチーフを示す(RANTES、MIP−1アルファ及びMIP−1ベータ、MIP−3,MIP−4,HCC1,I309,MCP−2)。これらの全てのケモカイン変異体は、野生型の相当する分子と比較した場合に、低下したGAG−結合活性を有する。
【0017】
少なくとも2つの変異が発明により存在するべきである領域、いわゆる40’sループは、図1において多くのCCケモカインに関して示される。特に、44、45及び47の位置の3つの塩基性残基がアラニンに置換されたRANTES三重変異体は多発性硬化症の処置のための動物モデルにおいて活性であることが発見された。このRANTESの三重変異体は、マウスEAEモデルにおいて用量関連性作用を示し、そして組換え体IFN−ベータによるサンショウ用処置に匹敵する効果を示した。類似の結果が、44、45及び47の位置の3つの残基をアラニンに置換し、且つN−末端残最初の2つのアミノ酸を欠いた、末端削除RANTES三重変異体を用いて見いだされた。この末端削除された変異体(配列番号3のアミノ酸配列を有する)は新規であり、そして本発明の別の目的を表す。
【0018】
類似の実験的な証拠がMIP−1アルファ及びMIP−1ベータの三重変異体に関しても作成されたが、それらは既に公知であり、そして本明細書ではMIP−1αの三重変異体R18A−R46A−R48A(Koopmann W and Krangel M.,J Biol Chem.1997,272(15):10103−9)及びMIP−1βの三重40’s変異体K45A−R46A−K48A(Laurence JS,Biochemistry 2001,40:4990−4999)と確認される。
【0019】
用語「低下したGAG結合活性」は、発明の変異体がGAGsに対して低い結合能力を有すること、即ち、これらの変異体の各々の低いパーセンテージが、対応する野生型分子に関して、GAGs(硫酸ヘパリンのように)に結合する。
【0020】
より好ましくは、野生型の44、45及び47の位置の3つのアミノ酸を他のアミノ酸に置換した、ヒトRANTES変異体である。そのような残基は、小さいか、脂肪族か、非極性か又はわずかに極性の残基、例えば、Ala,Ser,Thr,Pro及びGlyで置換できる。アラニンが好ましい。
【0021】
MSの処置において特に有効であることが発見されたRANTES変異体は、配列番号2及び配列番号3にて報告されたアミノ酸配列をそれぞれ有するものである。
【0022】
本発明の別の目的は、多発性硬化症及び/又は他の脱髄疾患を処置するための薬学組成物を生産するための、上で定義されたケモカイン変異体の使用である。 多発性硬化症(MS)は、脳及び脊髄における脱髄の散在性の斑点により特徴付けされる、進行の遅いCNS疾患であり、多発性及び変化に富んだ神経性の兆候及びサインをもたらし、通常は緩解するか悪化する(メルクマニュアル、16版を参照)。
【0023】
原因は未知であるが、免疫異常が疑わしく、特定の機構を示す手掛かりは現在ほとんどない。仮定された原因は、遅発型ウイルス又は潜在性ウイルスによる感染、及び酵素によるミエリン溶解を含む。IgGはCSF中で通常は上昇し、そして上昇した力価は、はしかを含む様々なウイルスに関連する。これらの発見の重要性及びHLAアロタイプ並びにT細胞の数の変更との報告された関連の重要性は不明であるが、証拠が矛盾するからである。家族の発病率の増加は遺伝子による感染性を暗示する;女性は男性よりもしばしばいくらか罹患性が高い。環境因子が存在するらしい。発病の年齢は通常20歳から40歳であるが、MSは患者が最初の15年間を過ごした地理学上の地域に結び付けて考えられてきた。15歳よりあとでの移動は、危険率が変らない。
【0024】
乏突起膠細胞の破壊及び血管周囲の炎症を伴う脱髄の斑又は島は、CNS、主に白質を通して広まり、側面及び背部の柱(特に、頸部及び背部の領域)、視神経及び室周囲エリアの偏好(predilection)を伴う。中脳、脳橋(pons)及び小脳の域も襲われて、小脳及び臍帯の両方の灰白質が襲われるかもしれない。
【0025】
細胞体及び軸索は、通常、特に初期の障害においては、保護される。のちに、軸索は、特に長い索において破壊され、そして繊維状の神経膠症は索に「硬化した」外観を与える。初期の障害及び後期の障害の両方が同時に発見されるかもしれない。ミエリンの脂質及び蛋白質の厚生における化学的な変化は、斑の中及び周囲において証明されてきた。
【0026】
当該疾患は様々な病気及びCNS機能不全の発見により特徴付けされ、緩解するか永続性の再発の悪化を伴う。
磁気共鳴映像法(MRI)はもっとも感度の高い診断映像法の技術である;それは多くのプラークを示すかもしれない。障害はコントラスト増強CTスキャン上で可視化されるかもしれない。
【0027】
多発性硬化症(MS)の治療上の進歩は、明らかになるのが遅かったが、一部には当該疾患の病因の理解の不完全さによる。経験に基づく処置に関して、先に行くための主な障害は、MSの高度に可変性な推移、最も重要な結果の測定の長期性、及び処置効果の特に短期間の客観的マーカーの欠如を含む。
【0028】
MSの病因は不明確なままであるが、自然の歴史は研究され続いている。磁気共鳴映像法(MRI)に基づく客観的な結果の測定が開発されて、臨床上の試みの多くの落とし穴が今は公知であり、改善された試験方法及び結果の良好な解釈を導いた。
【0029】
本発明の別の目的は、よって、発明のケモカイン変異体を有効量、薬学上受容可能な賦形剤と共に投与することによりMSを処置する方法である。
「有効な量」は、上記疾患の推移及び重度に影響するのに十分な活性成分の量を意味し、そのような病理の軽減又は緩解を導く。有効な量は投与の経路及び患者の状態に依存することになる。
【0030】
本発明の別の目的は、MS及び/又は脱髄疾患の処置のための、発明のケモカイン変異体を、一つ又は複数の薬学上受容可能な賦形剤の存在下で含む薬学組成物である。
【0031】
「薬学上受容可能な」は、活性成分の生物活性の有効性を干渉しない、即ち投与される宿主に毒性でない、あらゆる担体を包含することを意味する。例えば、非経口投与に関しては、上記の活性成分をユニット用量形態にて注射用に媒質、例えば塩水、デキストロース溶液、血清アルブミン及びリンゲル液中で製剤化してよい。
【0032】
薬学上受容可能な担体以外に、発明の組成物は、マイナーな量の付加物、例えば、安定剤、賦形剤、バッファー及び保存剤も含むことができる。
そのような活性成分の投与は、静脈内、筋肉内又は皮下経路によってよい。他の投与経路は、各々の成分の所望の血液レベルを確立してよく、本発明により構成される。
【0033】
活性成分の最適な用量は、投与経路、患者の状態及び特性(性別、年齢、体重、健康状態、サイズ)、兆候の程度、同時の処置、処置の頻度及び望まれる効果に従い、適宜選択してよい。確立された用量範囲の調節及び操作は、十分に、当業者の能力の範囲内である。
【0034】
通常、活性成分の1日の用量は体重キログラムあたり約0.01から100ミリグラムであり得る。普通、分割された用量においてか又は徐放性形態において1日あたりキログラムあたり1から40ミリグラムが所望の結果を得るのに有効である。第2回目又は次の投与は、個体に投与された最初の用量又は前の用量と同じか又はそれより低いか又はそれより多い用量にて実施することができる。
【0035】
本発明は、特定の態様に関して記載されてきたが、記載の内容は全ての修飾及び置換を含み、特許請求の範囲の意味及び目的を超えて拡大することなく、当業者によりもたらされ得る。
【0036】
発明は以下の実施例により今記載さるが、実施例は本発明を如何なる意味においても制限するように解釈されるべきではない。実施例は本明細書にて以下に特定される図面を参照することになる。
実施例
1.材料と方法
a)非ヘパリン結合RANTES変異体の生成
RANTESの変異導入は、逆ポリメラーゼ鎖反応技術により達成した。反対の方向のヒトRANTESコーディング配列(ジェンバンク受け入れ番号NM 002985)にハイブリダイズさせるのに使用した2つのプライマーの一つに点変異を導入した。プライマーのアニーリングの効率を改善するために(特に複数の変異を、プライマーに導入した場合)、DNAをアルカリ変性した。変性したDNAを約10pg/反応の濃度に希釈することにより、未変異DNAの形質転換反応への混入を回避した。
【0037】
実施例及び記載において与えられたアミノ酸ナンバリングは成熟蛋白質を考えており、即ち、Serから始まり、配列表によれば24位のアミノ酸である。よって、配列表のアミノ酸番号と実施例のそれの間を完全に対応させるには、実施例又は記載においての数字に23を加えるべきである。
【0038】
用いられた変異原性プライマーの配列は以下のとおりであり、変異塩基に下線を引く。
【0039】
【化1】
【0040】
DNA熱循環器(パーキンエルマーシータス480)内で35サイクルにてpfuturbo(登録商標)DNAポリメラーゼ(ストラタジーン)を用いて増幅を実施した。DNAを連結して、Top 10 F’コンピテントE.coli細胞(インビトロジェン)を形質転換した。変異体の配列をDNA配列決定により確認した。
b)野生型(WT)RANTES及びRANTES変異体のE.coliにおける発現及び精製
上記説明されたとおりにPCRにより得られたDNA断片をプラスミドpET24にクローン化して(図2)、一連のベクターを生成した。WT又は変異RANTESのコーディング配列をpT7プロモーターの3’のXbaI部位とNheI/XhoI部位の間にクローン化した。当該プラスミドは、2つのマーカー遺伝子(Km及びlacI)及び活性な複製オリジン(Ori fI)を含む。
【0041】
結果のベクターを用いてBL21(DE3)E.coli株を再度形質転換して、pT7/LacI系を用いた強い蛋白質発現を可能にさせる。蛋白質発現は、1mMのイソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド(IPTG)の培養物への添加により誘導した。細胞を回収して、溶解バッファー(50mM Tris−HCl,10mM MgCl2,5mM ベンズアミジン/HCl,1mM DTT,0.1mM フェニルメチルスルフォニルフルオリド(PMSF)、DNase 20mg/mL)に再懸濁した。細胞をフレンチプレッシャーセルユニットを3回通して破壊した。懸濁液を次に10,000 x gにて30分間4℃において遠心分離した。WT RANTES又はRANTES変異体の一つを含む封入体ペレットを、6M グアニジン/HCl及び1mM DTTを含む0.1M Tris−HCl,pH8.0に溶解して、30分間60℃において撹拌した。上記溶液を1%酢酸に対して3回透析した。不溶性物質を10,000 x gにて30分間における遠心分離により除去した。WT RANTES又はRANTES変異体の一つを含む上清を凍結乾燥した。
【0042】
凍結乾燥した粉末を、6M グアニジン/HCl及び1mM DTTを含む0.1M Tris−HCl,pH8.0に溶解して、約1mg/mlの濃度にした。上記蛋白質は、0.01mM酸化グルタチオン及び0.1mM還元グルタチオンを含む20mM Tris/HCl,pH8.0のグアニジン溶液の10x容量に滴下して希釈することにより、再生した。上記溶液を一晩4℃において撹拌した。不溶物質を10,000 x g30分間の遠心分離により除去した。pHは酢酸により4.5に調節して、水による希釈により伝導率を20 mSに調節した。上記溶液を、20mM酢酸ナトリウムにより前もって平衡化したHiLoad S 26/10カラムにのせて、蛋白質を同じバッファー中の直線0−2M NaCl勾配により溶出した。WT RANTES又はRANTES変異体蛋白質の一つを含む画分をプールして、酢酸に対して3回交換して透析して、凍結乾燥させた。
【0043】
凍結乾燥させた蛋白質を50mM Tris/HClバッファー、pH8.0に溶解した。上記クローニング法に由来するMKKKWPRリーダー配列を、エンドプロテイナーゼArg−C(1:600酵素:基質、w/w)による一晩37℃のインキュベーションにより、RANTES又はRANTES変異体蛋白質から分割した。分割された蛋白質を、6M尿素を含む20mM酢酸中の、pH4.5中で前もって平衡化したHiLoad S 26/10上のカチオン交換クロマトグラフィーにより未分割の蛋白質から分離し、そして蛋白質を同じバッファー中の直線0−2M NaCl勾配により溶出した。分割された画分をプールして、1%酢酸に対して2回交換して透析して、最後に0.1%トリフルオロ酢酸に対して透析し、次に、凍結乾燥した(Edgerton MD et al.,pg.33−40,及びProudfoot AE et al.,pg.75−87,in ”Chemokine Protocols”,Methods in Molecular Biology 2000,vol.138,Humana Press)。
【0044】
WT及びRANTES変異体蛋白質の真正度は質量分析により確認した。類似の手法により、NH2−末端伸長としてMetを含んだ別の変異体並びに単一又は三重変異の40’sRANTES変異体及び単一又は三重50’s変異体が生産された。
c)野生型(WT)RANTES及びRANTES変異体のPichia pastorisにおける発現と精製
成熟三重40’sRANTES変異体(R44A−K45A−R47A)をメガプライマーに基づくPCR変異導入を用いて創製した(Datta AK,Nucleic Acid Research 1995,23(21):4530−31)。それを、S.cerevisiaeのMatアルファプレ−プロシグナルペプチドとインフレームにてPichia pastoris発現ベクター、pPIC9Kにクローン化した。
【0045】
配列の確認後、上記プラスミドをエレクトロポレーションによりPichia pastoris宿主株GS115(his4)に移行させた。His+クローンをRANTES変異体の発現に関してスクリーンした。小スケールの発現研究を、インビトロジェン(ライフテクノロジーズ)からのPichia発現キットに記載されるとおりの標準手法を用いて実施した。簡単に云えば、上記培養物をグリセロールを炭素源として用いる富裕培地中で増殖させ、その後沈殿させてから、メタノールを含む富裕培地に再懸濁することにより、RANTES変異体蛋白質の発現を誘導した。培地中のRANTES変異体の選択は、クマジーブルー染色されたSDS−PAGE上で検出した。
【0046】
高いレベルのRANTES変異体(約500−750mg/l)を分泌するクローンを大きな振盪フラスコにおいてスケールアップして使用した。発酵させたブロスを5,000 rpmにより遠心分離して、上清を精製に使用した。
【0047】
蛋白質は、0.1M Tris/HClにより平衡化されたヘパリンセファロースカラム上での1回のクロマトグラフィー工程により上清から精製して、20カラム容量の同じバッファー中の0−2M NaClの直線勾配により溶出した。蛋白質の真正度を質量分析により確認したところ、そのような系においては、そうして生産されたRANTES変異体(R44A−K45A−R47A)も野生型分子と比較してN−末端が削除されていたこと、即ち最初の2アミノ酸を欠くことを発見した。そうして得られた変異体は、よって、三重40’sRANTES(3−68)変異体(R44A,K45A,R47A)として確認され、そのアミノ酸配列は配列番号3のそれである。
d)ヘパリン結合アッセイ
ヘパリンセファロースクロマトグラフィーは、50μgのWT又は変異RANTES蛋白質を用いて実施したが、25mM Tris/HCl,pH8.0及び50mM NaClにより平衡化されたヘパリンセファロースカラム上に負荷して、25mM Tris/HCl,pH8.0中の0−2M NaCl直線勾配により溶出した。
【0048】
ヘパリンセファロースクロマトグラフィーは、50μgのWT又は変異RANTES蛋白質を用いて実施したが、50mM 酢酸ナトリウムにより平衡化されたMonoSカチオン交換カラム上に負荷して、0−2M NaCl勾配により溶出した。
【0049】
競合結合アッセイは、WT RANTES、三重50’sRANTES変異体、及び三重40’sRANTES変異体(配列番号2 − 本明細書では「R44A−K45A−R47ARANTES」とも呼ばれる)を用いて実施し、アマシャムにより125Iで標識して2200 mCi/モルの比活性とした。96ウエルを有するフィルタープレートを結合バッファー(50mM HEPES,pH7.2,1mM CaCl2,5mM MgCl2,0.15M NaCl及び0.5%BSAを含む)に浸した。結合バッファー中でのヘパリンの連続希釈を実施することにより、20mg/mlから1μg/mlの濃度範囲をカバーした。上記アッセイは、25μlのヘパリン希釈液、25μLの0.4nM[125−I]−ケモカイン、25μlのヘパリンビーズ(0.2μg/ml、水中)及び25μlの結合バッファーを各ウエルに加えることにより、100μlの全容量にて実施した。上記アッセイは3通り実施した。プレートを室温において撹拌しながら4時間インキュベートした。フィルタープレートを200μlの洗浄バッファーにより真空ポンプを用いて洗浄することにより、未結合の標識ケモカインを除去した。次に、50μlのシンチラントを各ウエルに加えて、放射活性を計数した(1分/ウエル)。データをGraFitソフトウエアにより分析した。
e)平衡競合受容体結合アッセイ
CCR1又はCCR5を発現するCHOトランスフェクト体からの膜上で、シンチレーションプロキシミティアッセイ(SPA)を用いて、[125−I]−MIP1αをトレーサーとして用いて、アッセイを実施した。未標識のケモカインの結合バッファー中の連続希釈により競合剤を調製して、10−6−10−12Mの範囲をカバーした。用いた結合バッファーは、50mM HEPES,pH7.2であり、1mM CaCl2,5mM MgCl2,0.15M NaCl及び0.5% BSAを含んだ。コムギのSPAビーズ(アマシャム)をPBSに溶解することにより50mg/mlとして、結合バッファーで希釈して10mg/mlとして、そしてアッセイにおける最終濃度は0.25mg/ウエルであった。CCR1又はCCR5を発現するCHO細胞から調製した膜は−80℃に保存して、結合バッファーで80μg/mlに希釈した。等容量の膜とビーズストックをアッセイの実施前に混合することによりバックグラウンドを低下させた。最終の膜濃度は2μg/mlであり、そして[125−I]−MIP1αのそれは0.1nMであった。プレートを室温において撹拌しながら4時間インキュベートした。放射活性を測定して、データはヘパリン結合アッセイに関して記載されたとおりに分析した。
f)走化性アッセイ
単球の走化性をマイクロ−Boydenチェンバーアッセイを用いて実施した。単球は以下の単離法を用いて軟膜から精製した:100mlの軟膜溶液を100mlのPBSにより希釈して、Ficoll上に重層して、600 x gにて室温において20分間遠心分離した。界面を形成する細胞を回収して、PBSにより2回洗浄して、5%不活性ウシ胎児結成(FCS)、2mMグルタミン及び25mM HEPES,pH7.2を含むRPMI 1640培地に、40−100 x 106/mlの濃度にて懸濁した。それらをさらに106ヒツジ赤血球細胞/mlを加えることによりリンパ球から精製して、一晩4℃においてバラの花形にして(rosetted)、室温における20分間の900 x gにおける第2Ficoll勾配遠心分離により分離した。単球は、Ficollとバッファーの間に見いだされ、そしてT細胞はペレット中にあった。単球をPBSにより洗浄し、そしてRPMI 1640により2.5 x 106/mlに懸濁した。精製度をFACS分析により前方及び側方散乱により測定したところ、40−80%がドナー依存であることがわかった。ケモカインを希釈することにより、30μlの最終容量にして、RPMI培地中で10−6−10−12Mの濃度範囲をカバーするようにし、低部のウエルの中に入れた。単球に関しては5μmの孔サイズのフィルター(ニューロプローブ)、そしてT細胞に関しては8μmのフィルターを低部のウエルに入れて、空気の泡がないことを確認し、そしてシステムをシールした。RPMI培地中の50マイクロリットルの細胞懸濁液(2.5 x 106細胞/ml)を上部のウエルに入れた。チェンバーを、単球に関しては30分間、そしてT細胞に関しては1.5時間、37℃においてO2下でインキュベートした。次に、細胞を捨てて、破壊した膜の上部表面から細胞を落とし、そして次に膜をPBSにより洗浄した。膜をMeOHへの1分間の浸潤により固定して、空気乾燥し、そしてField A及びB溶液により染色した。IBASイメージ分析機用ソフトウエアを適合させた標準顕微鏡上で20x対物レンズにより各ウエルの視野をランダムに選択することにより、拡散した細胞を計数した。データはGraFitソフトウエアを用いて適合させた。
g)腹膜細胞補充アッセイ
最初のアッセイにおいて、0.2mlの滅菌塩水(LPS不含NaCl)により希釈した10μgのケモカインを8から12週齢のBALB/c雌マウスへ腹膜内注射することにより、細胞補充を誘導した。ケモカイン変異体(滅菌塩水0.2mlに希釈した10μgのケモカイン)をアゴニスト投与の30分前に投与した。16時間後に、CO2のエアロゾル散布によりマウスを犠牲にした。腹膜の洗浄を5mlのPBSで3回実施し、そして洗浄液は保存した。細胞を600 x gにて10分間遠心分離して、最終容量1mlに懸濁して、そして導き出された全白血球を血球計数計により計数した。
【0050】
第2のアッセイにおいては、蒸留水中の200μlのチオグリコール酸塩3%溶液を8から12週齢のBALB/c雌マウスへ腹膜内注射することにより、細胞補充を誘導した。ケモカイン変異体(滅菌塩水0.2mlに希釈した10μgのケモカイン)をチオグリコール酸塩の投与の30分前に投与した。ケモカイン変異体を毎日それ以後3日間投与した(2、3、及び4日目)。5日目に、CO2のエアロゾル散布によりマウスを犠牲にした。腹膜の洗浄を5mlのPBSで3回実施し、そして洗浄液は保存した。細胞を600 x gにて10分間遠心分離して、最終容量1mlに懸濁して、そして導き出された全白血球を血球計数計により計数した。
h)試験的自己免疫脳脊髄炎(EAE)
免疫化の手法
18−22グラムの体重の8週齢のC57 BL/6NCrIBR雌マウスに、0.25mgのMycobacterium tuberculosisを含む完全フロイントアジュバント(Mycobacterium butyricumを含むCFA、ディフコ、デトロイト、米国)中に200μgのMOG35−55ペプチド(ネオシステム、ストラスブルグ、米国)を含むエマルジョン0.1mlを頸部の後ろに皮下注射して免疫化した。皮下注射の前に、マウスは、尾部の静脈に、PBSに溶解した300ngの百日咳毒素(リストバイオロジカル社、キャンベル、CA、米国)を200μl皮下注射された。
【0051】
この手続は約8−10日から開始して、進行性の麻痺の出現をもたらし、尾部から生じて、前肢まで進行する。
研究のデザイン
研究は、各10匹の動物群を含んだ。免疫化プロトコルに従い、全ての群をCFA中のMOG35−55ペプチド及び百日咳毒素で免疫化した。
【0052】
群1:腹膜内経路により媒質(PBS)のみを投薬された陽性対照群
群2:皮下経路により媒質(PBS)のみを投薬された陽性対照群
群3:三重40’sRANTES変異体を10μg/マウスにて腹膜内投薬された
群4:三重40’sRANTES変異体を1μg/マウスにて腹膜内投薬された
群5:三重40’sMet−RANTES変異体を10μg/マウスにて腹膜内投薬された
群6:三重40’sMet−RANTES変異体を1μg/マウスにて腹膜内投薬された
群7:マウス組換えインターフェロンベータ(m−IFN−β)を10,000U/マウスにて皮下投薬された
群8:m−IFN−βを20,000U/マウスにて皮下投薬された。
【0053】
媒質
PBSを用いてRANTESの全40’s三重変異体、Met−RANTESの全40’s三重変異体及びm−IFN−βを適切な濃度に希釈した。
【0054】
投与経路
三重40’sRANTES変異体、三重40’sMet−RANTES変異体及びm−IFN−βを毎日腹膜内経路により200μ/マウスの投与用量にて投与した。群1、2は200μl/マウスのPBSを腹膜内投与した。
【0055】
処置期間
処置は各動物に関して実験4日間に開始して(疾患の通常の発症の約3−5日前)、14日間続けた(実験18日目に動物を犠牲に)。
【0056】
臨床上の観察
5日目から開始して、以下の臨床スコアにより麻痺に関して動物を個々に試験した。
【0057】
0=疾患の兆候なし
0.5=部分的に尾部が麻痺
1=尾部の麻痺
1.5=尾部の麻痺+部分的に片方の後肢が麻痺
2=尾部の麻痺+後肢の弱い麻痺又は部分的に後肢が麻痺
2.5=尾部の麻痺+部分的に後肢が麻痺(低度の異形(pelvi))
3=尾部の麻痺+完全な後肢の麻痺
3.5=尾部の麻痺+完全な後肢の麻痺+失禁
4=尾部の麻痺+後肢の麻痺+前肢の弱いか又は部分的な麻痺
5=瀕死又は死亡。
2.結果
a)ヘパリン結合アッセイ
1カ所又は3カ所に変異を有する精製されたRANTES蛋白質を、ヘパリンクロマトグラフィーにより分析して、それらを溶出するのに必要なNaClの濃度をWT RANTESの溶出プロフィールと比較した。ヘパリンとの相互作用が静電的であるから、変異体をMonoSカラム上のカチオン交換クロマトグラフィーにも供した。これはそれらを溶出するのに必要なNaCl濃度においてドロップをもたらすが、変異導入が塩基性残基を除去したからである。カチオン交換クロマトグラフィー上で得られたNaCl濃度の差をヘパリンクロマトグラフィー上で得られた濃度から差し引く。(表1)
ヘパリンへの結合の直接の測定を競合結合アッセイにおいて三重40’s及び50’sRANTES変異体により実施した。WT RANTES及び変異体をアマシャムによりヨウ素化したところ、全てが2,200 mCi/モルの同じ比放射活性を有した。しかしながら、ほんの約20%の三重40’s変異体しかヘパリンビーズに結合せず、WT RANTES及び50’s変異体に関する22,000 cpmに比較して、最大cpm数は4,000であった(図3)。これは、変異した40’sループ中のこれらの残基がRANTESのヘパリン結合能力の大部分に寄与することを証明する。他方、これは、50’sループ中の仮想GAG−結合モチーフが「真の」GAG−結合部位でないことも証明する。
b)平衡競合受容体結合アッセイ
CHO安定トランスフェクト体から調製された膜中の組換えCCR1及びCCR5への結合に関して[125I]MIP−1αに関して競合する、三重40’s及び三重50’sRANTES変異体の能力。両受容体に関してはいずれの単一変異も顕著な差異はなかった(データは示さず)。どの三重変異体も、WT RANTES蛋白質に比較して、CCR5への結合において差異は示さなかった。しかしながら、三重40’s変異体は親和性において100倍の低下を有したのに対して、三重50’s変異体は親和性のほんのわずかな(3倍)損失しか示さなかった(図4)。
c)走化性アッセイ
三重40’s及び三重50’s変異体は全てWT RANTESに匹敵する活性をもって単球の走化性を誘導できたが、三重40’s変異体は例外であり、1μMにおいて顕著な走化性を誘導できたにすぎなかった(図5)。単球走化アッセイにおいて得られた結果は、受容体結合アッセイにおいて得られた結果によく対応する。単球走化性における三重40’sRANTES変異体の活性の損失は、CCR1に関する親和性の損失に相当する。
d)腹膜細胞補充アッセイ
三重40’sRANTES変異体は、RANTESが実質上の補充を引き起こす用量において、腹膜への細胞の補充を誘導できなかった(図6)。
【0058】
さらに、10μgの変異体をRANTES投与の30分前に投与すれば、RANTESにより誘導される細胞の補充は阻害される。よって、GAG−結合の排除は、インビボにおけるケモカイン誘導性細胞補充の阻害剤を生産させた。
【0059】
類似の結果を、末端削除されたRANTES(3−68)三重40’s変異体(Pichia pastorisにおいて生産された)に関して図7に示し、MIP−1β三重40’s変異体(K45A−R46A−K48A)に関して図8に示し、そしてMIP−1α三重40’s変異体(R18A−R46A−R48A)に関して図9に示す。チオグリコール酸により刺激された細胞の補充は、三重40’sRANTES変異体によりなお阻害されたが、図10に示すとおりであった。
e)試験的自己免疫脳脊髄炎(EAE)
三重40’sRANTES変異体は、マウスEAEモデルにおいて用量関連性効果を示した。MOGによる一次免疫の10日後に開始した1μg及び10μg/マウスの両方の毎日の腹膜内投与された蛋白質が、参照用処置の組換えm−IFN−βに匹敵する効果を示した(図11)。疾患の発症は顕著に遅れ、そして疾患の重度(曲線下の面積により評価されるとおり)も顕著に低下した。さらに、実験の間に到達した最大臨床スコアの平均も減少した。他の変異体(三重40’sMet−RANTES変異体)は同じ実験において有益な効果を示すことはなかった。
【0060】
我々の結果は、全ての40’sRANTES三重変異体による処置の明白な有益な効果を示し、MOGによる免疫後のマウスにおいて慢性のEAEの臨床上の兆候を低下させる。よって、三重40’sRANTES変異体は治療上有益な効果を有し、そして慢性の脱髄疾患、例えばMSにおいての処置として使用することができる。
【0061】
【表1】
【0062】
以下の表2は、配列表及びテキストを通して報告された配列の正体を明確にする。
【0063】
【表2】
【0064】
【表3】
【図面の簡単な説明】
【図1】
図1は、40’sループのレベルと整列化した、いくつかの例示のCCケモカインの整列化を表す。この蛋白質セグメント及びカチオン性部位は、GAG結合モチーフに相当し、枠で囲まれている。
【図2】
図2は、野生型RANTES及びその変異体を実施例に従いクローン化するために使用したプラスミドのマップを示す。
【図3】
図3は、ヘパリンビーズアッセイにおけるヘパリンによる[125−I]−RANTES及び変異体の競合結合アッセイの結果を示す。
【図4】
図4は、RANTES及び三重40’sRANTES変異体の競合平衡結合アッセイを報告する。
【図5】
図5は、RANTES及び三重40’s及び50’sRANTES変異体による単球及びT細胞の誘導を示す。
【図6】
図6は、三重40’sRANTES変異体による腹膜細胞の補充の阻害を示す。
【図7】
図7は、Pichia pastorisにより生産された末端削除された三重40’sRANTES(3−68)変異体による、RANTES誘導性腹膜細胞補充の阻害を示す。
【図8】
図8は、MIP−1βの三重40’s変異体(K45AR46AK48A)によるMIP−1β誘導性腹膜細胞補充の阻害を示す。
【図9】
図9は、三重のMIP−1α変異体(R18A−R46A−R48A)によるMIP−1α誘導性腹膜細胞補充の阻害を示す。
【図10】
図10は、三重40’sRANTES変異体によるチオグリコールさん誘導性細胞の補充の阻害を示す。
【図11】
図11は、発明の全ての40’sRANTES三重変異体による試験的自己免疫脳脊髄炎の兆候の阻害を示す。
Claims (14)
- 配列番号3のアミノ酸配列を有する、末端削除されて且つ変異したヒトRANTES。
- 40’sループのカチオン性部位に少なくとも2つの変異を含み、そして野生型分子に比較して低下したGAG結合活性を有するCCケモカイン変異体の、多発性硬化症及び/又は他の脱髄疾患の処置のための薬学組成物の製造のための使用。
- ケモカイン変異体がRANTES変異体である、請求項2記載の使用。
- ケモカイン変異体が、40’sループのカチオン性部位中の3つの塩基性アミノ酸を他のアミノ酸に置換したRANTESの三重変異体である、請求項3記載の使用。
- 40’sループ中のカチオン性部位の3つの塩基性アミノ酸がアラニン、セリン、スレオニン、プロリン又はグリシンに置換されている、請求項4記載の使用。
- ケモカイン変異体が請求項1記載の末端削除されて変異したRANTESである、請求項2記載の使用。
- ケモカイン変異体が配列番号2のRANTES変異体である、請求項2記載の使用。
- ケモカイン変異体が配列番号4のMIP−1アルファ変異体である、請求項2記載の使用。
- ケモカイン変異体が配列番号5のMIP−1ベータ変異体である、請求項2記載の使用。
- 活性成分として請求項1ないし9に定義されたケモカイン変異体を薬学上受容可能な賦形剤と共に含む、多発性硬化症及び/又は脱髄疾患の処置のための薬学組成物。
- 請求項1記載の末端削除されて変異したRANTESをコードするDNA配列を含むDNA分子。
- 請求項11記載のDNA分子を含む発現ベクター。
- 請求項12記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
- 請求項13記載の細胞を適切な培養培地中で培養することを含む、請求項1記載のポリペプチドを製造するための組換え法。
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