JP2004508290A - 免疫調節における粒状ベクターの使用 - Google Patents
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Abstract
本発明の目的は、免疫学的応答を調節する能力をもつ抗原以外の物質の免疫調節特性を改善するための方法において、イオンリガンドを支持するか又はしない、場合によって両親媒性化合物層で被覆された親水性粒子と前記物質を混合する段階を含むことを特徴とする方法にある。本発明は同様に、かくして得られた薬学組成物及び癌、ウイルス疾患及び感染性疾患の治療及び/又は予防のためのその利用にも関する。
Description
【0001】
本発明は、免疫学的応答を調節する能力をもつ、抗原以外の物質の免疫調節特性を改善するための方法において、イオンリガンドを支持するか又は支持せず場合によって両親媒性化合物層で被覆された親水性粒子と前記物質を混合させることから成る方法を目的としている。
【0002】
本発明は特に、治療用組成物特にワクチン組成物及びその調製方法に関する。
【0003】
本発明は、特に、癌の治療を目的とする医薬品の調製のためのインタロイキン2を取込んだ特定のベクターの利用を目的としている。
【0004】
【従来の技術】
癌は、免疫系の監視を逃れる或る種の細胞の無制御増殖を特徴とする疾病である。実際、免疫系の役割は、人間の体内に侵入しうる病原性の異物(ウイルス、細菌、寄生虫…)を拒否するだけでなく、異常な特徴を呈する細胞を除去することにもある。癌性細胞が、例えば腫瘍に特異的な或る種の抗原又は免疫系による認識に関わる分子(主要組織適合性複合体タンパク質)の発現を減少させることにより、免疫系の警戒から逃れることも時として可能である。その他のケースでは、腫瘍はきわめて免疫原性ではあるものの、癌性集積の近くではリンパ球がアネルギー状態にあることから、免疫系がこれを抑えこむことはできない。
【0005】
近年開発された新しい戦略は、免疫系の調整において1つの役割をもつ治療上有利なタンパク質を注入することにより免疫系を刺激することから成るものである。これらのタンパク質に入るものとしては、当然サイトカインのみならず、ケモカインといったようなその他の作用物質も挙げることができる。特に、インタロイキン、インタフェロン、TNF(腫瘍壊死誘発因子)、TGF(成長形質転換因子)、M−CSF及びGM−CSFといったような造血成長因子だけでなく、MIF又はRANTESといったような免疫細胞誘引因子も指摘することができる。
【0006】
免疫系の刺激において特に有利なサイトカインは、インタロイキン2(IL−2)である。これは、適切な細胞により提示される抗原による刺激に応答して、I型ヘルパーTリンパ球(Th1)により大部分が合成される。これは、数多くの細胞(Bリンパ球、Tリンパ球、NK天然キラー細胞)と相互作用して、それらを活性化しそれらの分化及び/又は増殖を誘発するという点で、特異的及び非特異的免疫応答の発達に関与する。かくして、IL−2は、異なる中実腫瘍、黒色腫、白血病又はリンパ腫などの退行を誘発することができるという点で抗腫瘍特性を有している。
【0007】
しかしながら、化学療法におけるIL−2の利用には、数多くの問題が立ちはだかっている。求める効果を得るためには、往々にして大用量のタンパク質を投与する必要があり、これは、わずらわしい副作用(発熱、紅斑、浮腫)をひき起す可能性がある。一方、このタンパク質は精製がむずかしく、一般に遺伝子工学によって産生されているためにコストが高い。又、サイトカインは、4℃という温度であっても、溶解状態で不安定であることが多く、そのため保存の問題がでてくる。その上、IL−2を含む溶液の調製方法は、往々にしてアルブミンである安定化タンパク質の添加段階を含み、このことは、アルブミンの利用によりもたらされるリスクのため、規制機関にとって受諾し難いことである。
【0008】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、通常の製剤に比べさらに高い活性特に抗腫瘍活性をもつ溶液を得ることを可能にするIL−2含有組成物の新しい処方方法を利用することによって、これらの異なる問題を解決することを提案している。この新しい製剤は同様に、IL−2の安定性を増大させることをも可能にする。その上、本発明は、有効成分の送達システムが、前述のシステムに比べきわめて大幅な改善を示すことから鼻腔内又は経口投与できる医薬品の製造のために利用することができる。要するに、本発明に従った製剤は、注入可能な形で投与することを目的とする、IL−2含有組成物中のアルブミンの存在から解放されることを可能にする。
【0009】
出願人は、以下「BVSMTM」とも呼ばれる特定の合成ベクターの調製においてその専門知識を開発した。
【0010】
第1のタイプのBVSM及びその調製方法は、欧州特許第344,040号の中で記述されていた。これは、内側から外側へ向かって以下のものを含む粒子である:
− さまざまなイオン基によって修飾され得る、自然に又は化学的に網状化された多糖類又はオリゴ糖マトリックスから成る、非液体親水性中心核;
− 核に対し、共有結合によりグラフト化された脂肪酸層;
− 特にリン脂質から成る単数又は複数の脂質層。
【0011】
この第一世代のBVSMの開発により、出願人は、特に輸送される有効成分に応じて改善された特性をもつ新しいBVSMを設計し調製するに至った。
【0012】
WO94/20078、WO96/06638及びEP782851という番号で公示された特許出願は、これらのBVSM、その製造、さまざまな有効成分に対するその会合、及び薬学組成物の調製のためのその利用について記述している。
【0013】
かくして、親水性核は、すでに記述した異なる方法(例えば特許EP344040号、WO92/21329号、WO94/20078号)によって得ることができ、網状化方法は、当業者にとって既知のものであり、多糖類は、重合体を構成する糖に対するカチオン又はアニオンのイオン基のグラフト化により正又は負に帯電している可能性がある。これらの基は、第4アンモニウム又はカルボキシメチル官能基の中から選択され得る。方法は、WO92/21329及び上述の特許の中で記述されていた。本発明に従った組成物のベクターの多糖類コアの電荷は、一般に好ましくは、正の電荷である。しかしながら、コアに負の電荷を含むベクターが時として、特に注入可能な形で利用するための組成物において好適でありうる。
【0014】
前述の特許は、同様に、当業者が脂質外部層の取込みのために利用できるプロトコルについても記述している。この外部層は、好ましくは、「DPPC様のもの」つまりDPPC(ジパルミトイルホスファチジルコリン)又はこの生成物と同じ物性をもちその中にコレステロールが添加されるその他のあらゆる化合物から成る。ただし、特に例えば生体膜の構成成分といったその他の成分を付加できるリン脂質又はセラミドといったその他の脂質化合物も利用することができる。好ましくは、DPPCとコレステロールの質量比は70/30である。
【0015】
BVSMの調製について自ら今日保有しているノウハウにより、出願人は、広範なタイプのBVSMを入手することができる。これらのBVSMは、ナノ粒子ゲルの形の網状化された親水性重合体、好ましくは多糖類で形成され、これらのBVSMはPSC(フランス語ではNPS)タイプと呼ばれている。
【0016】
上述のように、この重合体は場合によって、正のイオンリガンド、いわゆるカチオンBVSM又は、負のイオンリガンドすなわちアニオンBVSMを担持することができる。この荷電又は非荷電重合体は、任意には両親媒性化合物層、好ましくはリン脂質、PCT特許出願第WO94/20078号の中で記述されているLight タイプと呼ばれるBVSMで被覆されている。
【0017】
BVSMのサイズは、20〜200nm、好ましくは50〜100nm、より好ましくは60〜80nmの間に含まれる。
【0018】
BVSMは、ろ過により滅菌可能であり、有効成分に対するその会合は、完全に製造されたBVSM上で行なわれる(Major et al., Biochem. & Biophys. Acta(1997)、1327、32−40)。こうして、最適な条件下で特に脆い生体分子に働きかけることが可能となっている。
【0019】
BVSMは、分解から生体分子を保護する。(Prieur R.et al. Vaccins(1996)、第14巻、No.6.p511〜520、80nmのカチオンバイオベクターとhCMV組換え型IE1タンパク質の組合せ;タンパク質分解からの保護及びCD4に対する提示の増強作用)。
【0020】
同様に、それらが、酵素、抗原などといったようなペプチド及びタンパク質の生物活性を増大させることも示された。
【0021】
BVSMは、例えばペプチド、抗原又はオリゴヌクレオチドといったような活性物質の運搬体として利用されるものとして知られている。この利用においては、BVSMのカチオン核とアニオンオリゴヌクレオチドの間のイオン相互作用として、BVSMと活性物質間の真の複合体の形成が存在する。従って生物学的環境内で安定したイオン接合体の形成が存在する。このタイプの調製においては、オリゴヌクレオチド/BVSMの比は、5〜10%であり、測定上の会合効率は90%を上回る。
【0022】
WO96/06638という番号で公示されたPCT特許出願は、抗原/BVSMの単純な混合物によって得られた抗原の免疫原性の増大に関するものである。抗原はここでも又、疎水性及び/又はイオン結合により特定のベクターに会合されている。この結果を得るためには、例えば10mgのBVSMについてタンパク質GST〜e4 1mgをインキュベートし、これにより、利用されるBVSMタイプの如何に関わらず90%の平均会合率を得ることが可能となる(Prieur R. et al. Vaccins(1996)第14巻、N°6p511〜520)。
【0023】
出願人は、今BVSMが、免疫学的応答を調節する能力をもつ抗原以外の物質の免疫調節特性を改善できるようにするということを発見した。これらの物質は、より特定的には以下のようなものである。
− 免疫応答を増幅、調整又は修飾する能力をもつアジュバント、
− 免疫系細胞の活性を修飾するという固有の特性をもつサイトカイン及びケモカイン、
− アレルギー及び/又は移植片拒絶の治療におけるその利用を理由として、免疫抑制剤、
− Th1/Th2バランスを修飾する能力をもつ物質。
【0024】
免疫応答はリンパ球性細胞特にB細胞及びTリンパ球により引継がれるということを喚起しておく。これらの細胞は、表面抗原CD4及びCD8の発現に基づき2つの亜型に分類できる。CD4+細胞は一般に「ヘルパー」機能に関与している。特に、これらは、その他のリンパ球性細胞の増殖及び成熟を誘発するサイトカインを分泌する。かくして、ヘルパーTリンパ球のもつ次のような2つのプロフィールを定義づけすることができる:すなわち、
− 一方では、サイトカイン特にIL2、IL7及びガンマインタフェロンの誘発、CTLの刺激及びIgG2aタイプの抗体の誘発を伴う、細胞媒介応答を特徴づけるTh1プロフィール、そして
− 他方では、サイトカイン、特にIL4、IL5及びIL10の誘発及びIgG1及びIgEタイプの抗体の存在を伴う、体液媒介応答を特徴づけるTh2プロフィール。
【0025】
抗原提示細胞(APC)によるその提示が大部分クラスIIのCMHによって行なわれるタンパク質抗原は、Th2に方向づけされた応答を誘発する。逆に、トランスフェクションの後クラスIのCMH上で直接抗原を提示できるようにするADNは、免疫応答をTh1に向かって方向づけする。
【0026】
応答を大部分Th1又はTh2へと方向づけするためのいくつかのアジュバントが知られている。例えば、IgG1タイプの血清応答を誘発するアルミニウム塩は、Th2とみなされる。アジュバントとは逆に、IgG2a及びCTL応答を誘発する脂質Aの誘導体(MPL)又はQuilAの誘導体はTh1とみなされる。従って、Th1/Th2バランスに作用できるようにする手段を手に入れることが有用と思われ、これこそまさに本発明が実現すべく提供するものである。
【0027】
本発明の枠内で出願人により実施された研究作業は、BVSMが単独では免疫系の活性化を誘発しないことからアジュバントとして作用せず、提示細胞に対する抗原のより良い侵入及び/又はより良い提示を可能にする「キャリヤ」として作用することを示している。かくして、得られた結果は、CTB、MPL及びODNのアジュバント能に対するBVSM寄与を示していた。驚くべきことに、アジュバント能は、次のものに対して異なる形で視覚化される:
− 血清IgG応答については、CTBの場合強い相乗作用又はODN CpGの場合応答の加算が得られた。
− IgA応答については、MPLに関して相乗作用が明確に立証された。
− Th1/Th2バランスについては、数量的に等価の応答(IL2)の場合でさえ、特に細胞応答における差異を反映するIg1/IgG2aバランスにおいて応答の質的差異が観察される。
【0028】
【課題を解決するための手段】
従って、本発明はまず第1に、癌及び/又はウイルス性疾患の治療を目的とした1つの医薬品の調製を目的とした、液体でない親水性核を有するタイプのベクターの利用において、前記ベクターが該医薬品中で、免疫応答を調節する能力をもつ抗原以外の少なくとも1つの物質と結びつけられている利用を目的としている。
【0029】
ベクターは有利には、非液体親水性核並びに疎水性相互作用及び/又はイオン結合により核に結びつけられ両親媒性化合物で少なくとも部分的に構成されている外部層を含むタイプのものである。外部層はジパルミトイルホスファチジルコリン(DDPC)およびコレステロールで形成されている。
【0030】
非液体親水性核は、イオンリガンドが上にグラフト化された自然に又は化学的に網状化したオリゴ糖又は多糖類マトリクスで構成されている。
【0031】
イオンリガンドは、第4アンモニウムといったように正の電荷をもつ。
【0032】
非液体親水性核及び両親媒性化合物から成る外部層を有する粒子状ベクターについては、すでに、特に特許出願WO94/20078号において記述されていた。
【0033】
親水性核は、すでに記述した異なる方法(例えば特許EP344040号、WO92/21329号、WO94/20078号)によって得ることができ、網状化方法は、当業者にとって既知のものであり、多糖類は、重合体を構成する糖に対するカチオン又はアニオンのイオン基のグラフト化により正又は負に帯電している可能性がある。これらの基は、第4アンモニウム又はカルボキシメチル官能基の中から選択され得る。方法は、WO92/21329及び上述の特許の中で記述されていた。本発明に従った組成物のベクターの多糖類コアの電荷は、一般に好ましくは、正の電荷である。しかしながら、コアに負の電荷を含むベクターが時として、特に注入可能な形で利用するための組成物において好適でありうる。
【0034】
前述の特許は、同様に、当業者が脂質外部層の取込みのために利用できるプロトコルについても記述している。この外部層は、好ましくは、「DPPC様のもの」つまりDPPC(ジパルミトイルホスファチジルコリン)又はこの生成物と同じ物性をもちその中にコレステロールが添加されるその他のあらゆる化合物から成る。ただし、特に例えば生体膜の構成成分といったその他の成分を付加できるリン脂質又はセラミドといったその他の脂質化合物も利用することができる。好ましくは、DPPCとコレステロールの質量比は70/30である。
【0035】
本発明の利用においては、物質と粒子の重量比は約1%〜20%、好ましくは約5%〜10%の間に含まれている。有利には、(物質)/(核+外部層)の重量比は1対10である。
【0036】
免疫応答を調節する能力をもつ、抗原以外の第1のクラスの物質には、免疫系の機能において1つの役割を果たす治療上有利なタンパク質が含まれる。すなわちこれには特に、好ましくはインタロイキン、インタフェロン、TNF、TGF、G−CSF、GM−CSF、MIF、RANTES又はこれらの混合物を含むグループの中から選択されたサイトカイン又はケモカインである。
【0037】
前述のものを部分的にカバーする、免疫応答を調節する能力をもつ抗原以外の第2のクラスの物質には、アジュバントが含まれる。アジュバントというのは、1つの抗原の特異的免疫応答を増幅、調整又は方向づけできるようにする分子のことである。かくして、抗原以外の物質の免疫調節能に対するBVSMの特性を評価する目的で、細菌産物(内毒素、壁の成分)、サイトカイン、オリゴヌクレオチド(CpG)といったような主要なカテゴリのアジュバントに属するさまざまな分子が、本発明の枠内でテストされた。その中でもより特定的に以下のものを挙げることができる:
− CT、CTB、LTといったような細菌腸毒素、
− MPL及び脂質Aの誘導体といったようなリポ糖類誘導体;
− QS21タイプのサポニンの誘導体;
− ミョウバンといったようなアンモニウム塩及びその誘導体;
− DT又はTTタイプのタンパク質、
又はこれらの混合物。
【0038】
免疫応答を調節する能力をもつ、抗原以外の基板は、好ましくは以下のもの中から選択される:
− 免疫応答を増幅、調整又は修飾する能力をもつアジュバント、
− 免疫系の細胞の活性を修飾するという固有の特性をもつサイトカイン及びケモカイン、
− アレルギー及び/又は移植片拒絶の治療におけるその利用を理由として免疫抑制剤、
− Th1/Th2バランスを修飾する能力をもつ物質。
【0039】
この中でも、本発明では、より特定的に、免疫調節特性を改善することが望まれる物質として、免疫細胞の活性を刺激するサイトカイン、なかでもIL2、IL11及びGM−CSFが考慮されている。実際、サイトカインは、免疫細胞の活性を刺激又は阻害する。
【0040】
本発明のきわめて好ましい実施形態は、
(a)正の電荷又は負の電荷のイオンリガンドが上にグラフト化されている、自然に又は化学的に網状化された多糖類又はオリゴ糖マトリックスで構成された非液体親水性核、及び
(b)疎水性相互反応及び/又はイオン結合によって核に結びつけられた両親媒性化合物で少なくとも部分的に構成された外部層、
を含み
(c)インタロイキン2を取込んでいる、
ベクターの、癌の治療を目的とする医薬品の調製のための利用に関する。
【0041】
(a)イオンリガンドが上にグラフト化されている、自然に又は化学的に網状化された多糖類又はオリゴ糖基質で構成された非液体親水性核、及び
(b)疎水性相互反応及び/又はイオン結合によって核に結びつけられた両親媒性化合物で少なくとも部分的に構成された外部層、
を含み
(c)インタロイキン2を取込んでいる、
ベクターを含む、このような薬学組成物も同様に本発明の一部を成している。
【0042】
この利用においては、本発明は、免疫原性でない又は免疫原性の低いタイプの癌の治療および/又は、免疫応答を活性化するための治療的処置を補うものとして免疫調節剤が提案されたエイズ又は慢性肝炎といった特にウイルス性の感染の治療に関係する。この利用を実施するための組成物は、イオンリガンドを担持するか又はしない、そして場合によっては上述のような治療上有利なタンパク質又はアジュバントが取込まれた両親媒性化合物の層で被覆された親水性粒子を含んで成る。かかる組成物は、抗原を含まない。
【0043】
発明に基づく組成物によって治療可能な癌は、あらゆる種類のものであり得る。特に、ORL球、食道、膵臓、***、子宮頸部又は子宮体部、卵巣、腎臓、膀胱、骨又は甲状腺の癌が挙げられる。同じく気管支肺癌、悪性黒色腫、脳腫瘍、リンパ腫(ホジキン又は非ホジキン)、白血病(骨髄性又はリンパ性)、初期位置不明の癌も加えられる。これらの癌は、原発性である場合も転移性である場合もある。又これらの癌は、肉腫、腺腫、癌腫、腺癌、リンパ腫、骨髄腫、膠腫、芽腫、グリア芽腫タイプのものであり得る。本発明に従った組成物により治療され得る癌は、免疫原性であってもなくてもよい。出願人は、本発明に従った組成物が、ほとんど又は全く免疫原性でない癌の治療及び制御において特に有効であるということを示した。
【0044】
本発明に従った組成物及び医薬品は、さまざまな形、特に非経口で投与することができる。かくして、本発明に従った組成物を、静脈内、皮下、筋内又は皮内投与することができる。投与は、経口又は鼻腔内でも行なうことができる(これが発明の大きな利点である)。経口投与を可能にする組成物は、錠剤、ゼラチン嚢、粉末、顆粒又は経口用懸濁液又は溶液でありうる。これらの組成物には、舌下又は口腔投与形態も含まれる。
【0045】
本発明に従った医薬品組成物に対し、或る種の賦形剤を付加することも場合によって可能である。かくして、あらゆる種類の結合剤、界面活性剤、コーティング剤、分散剤又は給湿剤を利用することができる。
【0046】
出願人は、これらのベクターがきわめて効果的な形でIL−2を固定する能力をもつこと、タンパク質がその生物活性を保持すること、そして、予想外にもこの活性が、処方されていないタンパク質に比べ増大させられていることを立証した。
【0047】
出願人は同様に、本発明に従った処方が、アルブミンの存在下と同様の形で溶液状態のタンパク質を安定化することを可能にするものである、ということも立証した。かくして、
(a)正の電荷又は負の電荷のイオンリガンドが上にグラフト化されている、自然に又は化学的に網状化された多糖類又はオリゴ糖マトリックスで構成された非液体親水性核、及び
(b)疎水性相互反応及び/又はイオン結合によって核に結びつけられた両親媒性化合物で少なくとも部分的に構成された外部層、
を含み、
(c)IL−2を取込んでいる、
ベクターの、アルブミンの不在下での前記タンパク質IL−2の注入可能な形での投与のための医薬品の調製を目的とした利用も同様に本発明の一部を成している。
【0048】
その上、出願人は、ベクター/タンパク質の会合が(数カ月の保管後の活性の維持によって測定された場合に)安定した状態にとどまることを示しており、このことは、IL−2の治療用調製物を保存することができず、そのためコストをなお一層増大させることになる先行技術に比べて1つの改善である。
【0049】
最後に、出願人は、驚くべきことに、本発明に従って処方され鼻腔内経由で投与されたIL−2が、皮下といったようなより古典的な経路で投与されるIL−2と類似した又はそれを上回る活性を有することを示した。
【0050】
従って、本発明に従ったベクターの利用は、IL−2の利用の際に従来提起されてきた異なる全ての問題から解放されることを可能にする。
【0051】
従って、本発明に従ったベクターは、免疫応答の増強が求められる癌治療のために利用可能である。
【0052】
本発明は同様に、免疫応答を調節する能力をもつ、抗原以外の物質の免疫調節特性を改善するための方法において、非液体親水性核を有するタイプのベクターと前記物質の混合物を含むことを特徴とする、方法をもその目的としている。有利にも、ベクターは、非液体親水性核並びに疎水性相互作用及び/又はイオン結合によって核に会合された、少なくとも部分的に両親媒性化合物で構成された外部層を有するタイプのものである。前述のように、非液体親水性核は、特に第4アンモニウムといったような、正の電荷を持つイオンリガンドが上にグラフト化された自然に又は化学的に網状化したオリゴ糖又は多糖類マトリクスで構成されている。外部層は、例えばジパルミトイルホスファチジルコリン(DDPC)及びコレステロールで、特に70/30というDPPCとコレステロールの質量比で形成されている方法。好ましくは、物質とベクターの重量比は、約1%〜20%、好ましくは約5%〜10%の間に含まれている。
【0053】
前述のように、免疫応答を調節する能力をもつ、抗原以外の物質は、好ましくはインタロイキン、インタフェロン、TNF、TGF、G−CSF、GM−CSF、MIF、RANTES又はこれらの混合物を含むグループの中から選択された、サイトキン又はケモカインといったような、免疫系の機能において1つの役割を果たす治療上有利なタンパク質、
− 特に細菌腸毒素、リポ糖類誘導体、オリゴヌクレオチド、サポニン、アンモニウム塩及びその誘導体、DT又はTTタイプのタンパク質又はそれらの混合物を含むグループの中から選択されたアジュバント、
− Th1/Th2バランスを修飾する能力をもつ物質、
− 免疫抑制剤
の中から選ばれる。
【0054】
本発明は同様に、イオンリガンドが上にグラフト化された自然に又は化学的に網状化したオリゴ糖又は多糖類マトリクスで構成された非液体親水性核そして、疎水性相互作用及び/又はイオン結合により核に結びつけられ両親媒性化合物で少なくとも部分的に構成されている外部層を含むタイプのベクター、及び
− 少なくとも1つの治療上の有利なタンパク質、及び/又はアジュバント又はそれらの混合物、
を含むことを特徴とする薬学組成物にも関する。
【0055】
ベクター、治療上有利なタンパク質及びアジュバントは、前述のように定義される。
【0056】
本発明はさらに、特に治療又は予防用ワクチン組成物の調製のための前述の通りのベクターの利用において、前記粒子が前記抗原に対する免疫学的応答を調節する能力をもつ少なくとも1つの物質及び少なくとも1つの抗原と該組成物中で混合されている利用にも関する。治療上の利用の場合には、本発明は特に、ウイルス疾患、特にエイズ及び慢性肝炎のみならず免疫原性をもつ癌の治療及び/又は予防に関係する。
【0057】
従って、本発明は、特に、上述のとおりのベクター、及び抗原又は抗原混合物そして前記抗原の免疫学的応答を調節する能力をもつ少なくとも1つの物質を含むことを特徴とするワクチン組成物に関する。
【0058】
本発明の組成物中に存在する抗原に対する免疫学的応答を調節する能力をもつ物質は、好ましくはアジュバントである。これらのうち、本発明では、細菌産物(内毒素、壁の成分)、サイトカイン、オリゴヌクレオチド(CpG)が考慮されている。より特定的に言うと、これらのうち、次のものを挙げることができる:
− CT、CTB、LTといったような細菌腸毒素、
− MPL及び脂質Aの誘導体といったようなリポ糖類誘導体;
− QS21タイプのサポニンの誘導体;
− ミョウバンといったようなアンモニウム塩及びその誘導体;
− DT又はTTタイプのタンパク質、
又はこれらの混合物。
【0059】
前述のように、物質/粒子の重量比は、約1%〜20%、好ましくは約5%〜10%の間に含まれている。
【0060】
本発明は、特に鼻腔内といった粘膜投与のための組成物の調製に特に適しているが、例えば非経口といったような他のあらゆる投与様式も考慮することができる。
【0061】
本発明の特徴及び利点は、次のものに関する例から明らかになることだろう。
実施例1: BVSM−IL2の調製及び生物活性
実施例2: (ii)異なるアジュバントのものに対する三価のインフルエンザスプリットの免疫原性に対するBVSMの、マウスにおける効果及び、(iii)三価のインフルエンザスプリットの免疫原性に対する製剤及び異なるアジュバントの同時投与の、マウスにおける効果。
【0062】
以下の例は、本発明を例示することを目的とするものであるが、制限的意味はもたない。特に、示された値は、一例として与えられているにすぎず、本発明の実施に際して最適化され得るものである。
【0063】
【実施例1】
BVSM−IL2の調製及び生物活性
(1)IL−2がロードされた粒子の特徴づけ
A.IL−2がロードされたベクターの調製
この例で利用されているベクター(BVSM)については前述された。これは、DPPC−コレステロールの脂質層を有するカチオンベクターである。
【0064】
利用されるインタロイキン2(IL−2)は、Chiron社製である。これは、18・106UI=1.1mgの凍結乾燥タンパク質といったような、凍結乾燥された組換え型IL−2の形を呈している。
【0065】
本発明に従った組成物は、10/1の重量比で緩衝食塩溶液(PBS)中に2つの化合物を単に混合することによって、BVSM−IL2結合によって得られる。
【0066】
B.最適なBVSM−IL2比の決定
タンパク質との関係におけるBVSMの最適な質量比は、当業者にとって周知の方法に従って、ELISAを用いた分析により決定される。
【0067】
簡単に言うと、抗−IL2抗体でウェルをカバーし、BSA(ウシ血清アルブミン)で飽和させる。テストすべきIL−2調製物を添加し、次に、ビオチニル化された第2の抗IL−2抗体を添加する。ペルオキシダーゼに結合させたストレプトアビジンの添加とそれに続く前記ペルオキシダーゼの基質の付加により、比色計を用いて溶液中に存在するIL−2の量を決定することが可能となる。得られた値は、任意単位で表現され、値は、テスト対象溶液中に存在するIL−2に比例して高くなる。
【0068】
テスト対象調製物は、タンパク質の安定剤としてのBSAを伴って又は伴わずに、さまざまな割合でベクターが存在する中で又はその不在下で、同量のIL−2が導入された調製物である。
【0069】
結果は、図1に表わされている。BSAを含有する複数の調製物中に利用可能なIL−2がほぼ同じ割合で得られるか、又はBVSM/IL−2の質量比が10/1となるような特定のベクターの割合が得られるということがわかる。IL−2がPBS中に単独で存在しているか又は質量比が比較的低い場合、溶液状態で利用可能なIL−2は比較的少なくなる。
【0070】
従って、これらの結果は、ベクターが、IL−2を安定化させるため及び有効濃度の低下を妨げるためにアルブミンと同じ位効果的であることを示している。
【0071】
C.BVSMに対するIL−2の会合率の決定
メーカーの指示事項に従って、BiacoreX装置内のプラズモンの表面共鳴技術によりベクターに対するIL−2の会合率を決定する。この方法から、単色偏光での照明により、検出用チップと接触状態にある溶液の表面層の屈折率の差を検出することが可能になる。
【0072】
作業プロトコルは、以下の通りである:
− 検出用チップの表面上にBVSM(0.05g/l)を吸着させる;
− 注入したタンパク質の濃度の関数である標準曲線(共鳴単位RUとして表わされている)を決定するべく遊離IL−2(1〜6mg/ml)を注入する;
− 再生後、BVSM−IL2ならびに遊離IL−2が中に存在する、実施例1.Aで調製されたような調製物を注入する。この遊離IL−2のみが検出用チップの表面に固定されたBVSMに会合することができる。
【0073】
このプロトコルは、実施例1.Aの製剤中の遊離IL−2濃度を決定し、BVSMの会合率を推定できるようにする。
【0074】
図2のデータから、前記会合率が85%であることを計算することができる。
【0075】
(2)異なるベクターに会合したIL−2の生物活性の分析
この例は、IL−2の生物活性に対するベクターの層及び核の組成の重要性を示している。
【0076】
次のような4つの異なるタイプのベクターが利用される:
a.ホスホリポン/コレステロール(PPLpon/Chol)混合物、又は、
b.DPPC/コレステロール(P DPPC/Chol又はPY)混合物、
を含有する脂質層と共にアニオンコアを有する2つのベクター、
c.ホスホリポン/コレステロール(QAE PLpon/Chol)混合物又は、
d.DPPC/コレステロール(QAE DPPC/Chol又はKY)混合物、を含有する膜及びカチオンコアを有する2つのベクター。
【0077】
IL−2は1/10という質量比で、BVSMに添加される。
【0078】
3Hでマーキングされたチミジンの取込みによって計算される血中単核細胞の増殖を測定することにより、異なるBVSMに会合したIL−2の生物活性を評価する。これらの細胞は、IL−2に対する強い親和性を有するレセプタCD25の発現を誘発する化合物(PHA)によって、予め刺激されている。
【0079】
全てのBVSMによって、in vitroでは処方されていない対照IL−2と同等の活性を得ることが可能であり、BVSM QAE DPPC/Chol はこの生物活性を改善しさえする、ということがわかる(図3)。
【0080】
(3)IL−2調製物の安定性の研究
溶解状態のIL−2調製物は一般に、4℃の溶解状態ではIL−2がその生物活性を失なうことから安定していない。
【0081】
マウスCTLL−2細胞中の3Hでマーキングされたチミジンの取込みによって測定されるように、新鮮なIL−2の95%の生物活性が維持されることから、4℃で2ヵ月間の保管後、BVSM−IL2(QAE/DPPC/Chol)調製物は安定した状態にとどまる。
【0082】
(4)in vivo テスト、TS/A腫瘍
TS/A腫瘍(非免疫原性で未分化の乳腺癌)モデル、腫瘍移植拒絶モデル又は予め移植された腫瘍の治療モデルにおける、BVSM−IL2の活性(KY/IL2、質量比10/1)をテストした。
【0083】
A.腫瘍移植の拒絶
A.1.同じ脇腹内への同時投与
図4に示されたIL−2濃度に対応するBVSM−IL2(KY/IL−2)と共に、皮下(s.c.)経由で雌のマウスBALB/cに対し5・104個の腫瘍細胞を同時投与する。対照として、単独のベクター又は処方されていないIL−2、又は単純なPBSも投与する。腫瘍の移植及びそのサイズの推移を測定する。
【0084】
図4は、腫瘍細胞の移植及びベクター単独又はIL−2単独の投与後に腫瘍の成長が存在する一方で、ベクターKYと共に処方されたIL−2は腫瘍成長を遅延させることができるということを、明確に示している。
【0085】
A.2.対側投与
対側脇腹内に、図5に示されたIL−2濃度に対応するKY/IL−2と共に、s.c.経由でBALB/cマウスに対し5・104個のTS/A腫瘍細胞を投与する。対照としてPBS又は処方されていないIL−2を投与する。
【0086】
図5は、ベクターに複合されたIL−2の対側投与が腫瘍成長の減少を可能にすることを示しており、これは、たとえ100倍多い用量で利用されても処方されていないIL−2の場合には観察できない結果である。
【0087】
B.移植された腫瘍に対する治療及び保護効果:皮下投与
B.1.治療効果
1グループにつき10匹のマウスに対し5・104個のTS/A細胞をs.c.投与してから6日後に、対側脇腹内にs.c.経由でKY/IL−2を投与する。1つの部位(5・103単位のIL−2)又は、注入用量を一部位につき1・103単位として5カ所の全く異なる部位への投与を行う。
【0088】
かかるモデルにおいては、腫瘍は移植されたものであり、手で触れることができる(約40mmの表面)。腫瘍のサイズの増大を評価する。図6Aは、ベクターに複合されたIL−2が、IL−2単独よりも大幅に腫瘍成長を減速させることができるということを示している。なお、多数の部位への少用量注入の方が、唯一の部位へ大用量注入よりも効果が高いと思われる。
【0089】
唯一の部位にKY/IL−2の投与を受けた10匹のマウスのうち3匹は、30日後に検出可能な腫瘍を示さず、一方、5カ所の部位でKY/IL−2の投与を受けた10匹のうち6匹のマウスも同じく、検出可能な腫瘍を示していない。これら9匹の動物は、その後腫瘍を再発することもない。
【0090】
B.2.保護効果
IL−2の投与から46日後に腫瘍を示さなくなった前述の9匹のマウスに対し、再び25・104個のTS/A細胞を注入する。対照としてナイーブマウスを利用する。
【0091】
図6Bは、KY/IL−2の予備投与により、新しい抗原投与から部分的に動物を保護することができるということを示している。実際、9匹のうち4匹のマウスが腫瘍を発生せず、その他の動物においては、ナイーブ動物に比べ腫瘍発生が減速する。
【0092】
C.移植された腫瘍に対する治療及び保護効果: 鼻腔内投与
C.1.治療効果
5・104個のTS/A細胞を1グループにつき10匹のマウスにs.c.投与してから6日目に開始して、5日間、鼻腔内経路でKY/IL−2を投与する。1日あたり1回又は2回の投与を行なう。利用された対照は、IL−2単独(1日2回投与)、ベクター単独又はPBSである。
【0093】
かかるモデルにおいては、腫瘍は移植されたものであり、手で触れることができる(約40mmの表面)。腫瘍のサイズの増大を評価する。図7Aは、ベクターに複合されたIL−2が、IL−2単独よりも大幅に腫瘍成長を減速させることができるということを示している。なお、投与回数が観察結果に差異をもたらすとは思われない。
【0094】
1日1回鼻腔内でKY/IL−2の投与を受けた10匹のマウスのうち4匹は、35日後に検出可能な腫瘍を示さず、一方、1日2回KY/IL−2の投与を受けた10匹のうち6匹のマウスも同じく、検出可能な腫瘍を示していない。これら10匹の動物は、その後腫瘍を再発することもない。
【0095】
C.2.保護効果
IL−2の投与から48日後に腫瘍を示さなくなった前述の10匹のマウスに対し、再び25・104個のTS/A細胞を注入する。対照としてナイーブマウスを利用する。
【0096】
図7Bは、KY/IL−2の予備投与により、新しい抗原投与から部分的に動物を保護することができるということを示している。実際、10匹のうち4匹のマウスが腫瘍を発生せず、その他の動物においては、ナイーブ動物に比べ腫瘍発生が減速する。
【0097】
(5)CTLの誘発
移植された腫瘍を拒絶しより大用量での新たな抗原投与の後に腫瘍を再発しなかった、皮下(75日後)又は鼻腔内(79日後)経由で処置された4匹のマウスの脾臓を分離する(第4.B及び4.C項)。
【0098】
6日間TS/A細胞を用いてin vitroで脾臓を刺激し、TS/A細胞に対するCTL活性を研究する。
【0099】
皮下でKY/IL−2の投与を受けたマウスは、同系細胞WEHI164及び細胞YACが溶解されていないことから、TS/Aの特異的CTL活性を発現しない(図8A)ということがわかる。
【0100】
同様に、鼻腔内でKY/IL−2の投与を受けたマウスでも、特異的CTL活性が見られる。
【0101】
【実施例2】
異なるアジュバントのものに対する三価のインフルエンザスプリットの免疫原性に対するBVSMのマウスにおける効果及び三価のインフルエンザスプリットの免疫原性に対する製剤及び異なるアジュバントの同時投与の、マウスにおける効果
I.材料と方法
(1)材料
利用された動物は、Janvier飼育センタ(Route de Chenes−Sec−B.P.5−Le Genest−Saint−Isle)から入手した(研究当初、生後10週であった)雌のBALB/cJ/Rjマウスであり、研究を始める前に1かごあたり6匹の割合で7日間順化させる。
【0102】
(2)製品
a.BVSM TM
利用されるBVSMTMはKY:QAE=2mEq−DPPC/コレステロールタイプのものである。これは、グリシジルトリメチルアンモニウムによってグラフト化されDPPC/コレステロール層でとり囲まれた多糖核に対応する。このタイプのベクターは、EP687 173に記述されている。
【0103】
b.アジュバント
以下の4つのアジュバントが利用された:
− コレラ毒素のサブユニットB(CTB)(品番C9903、Sigma, St Quentin Fallavier, フランス)、
− モノホスフォリル、脂質A(MPL)(品番R−350、Ribi Immunochem Research, Inc, Hamilton, ミズーリ州)、
− 組換え型IL−2、プロロイキン活性16.3・106U/mg(Chiron France, Suresnes, フランス)
− オリゴヌクレオチドODN;5TCCATGACGTTCCTGAC′(Eurogentec, Bruxelles, ベルギー)
【0104】
c.3価インフルエンザスプリット
3価インフルエンザスプリット1mlあたり250μgのHA(83.3μg/菌株)溶液を、次の3つのBiochem Pharma(カナダ)の一価の卵スプリットを用いて調製する。
− B/Harbin7/94菌株から産生された1価の卵スプリット、
− A/Johannesburg 82/96菌株から産生された1価の卵スプリット、
− A/Nanchang933/95菌株から産生された1価の卵スプリット。
【0105】
これらのスプリットは、ウイルスタンパク質特にヘマグルチニン(HA)及び/イラミニダーゼの混合物で構成されている。
【0106】
d.製剤
− 抗原+BVSM TM 製剤
3価のインフルエンザスプリット1mlあたり250μgのHAの製剤(83.3μg/菌株)を、1/89に等しいHA/BVSM比 すなわち三価HA250μg/BVSM22.25mg/mlを得るべく上述の3つの1価卵スプリットを用いて調製する。
【0107】
この製剤は、各々の1価のスプリット1mlあたりHA250μg/BVSMTM22.25mgの3つの製剤を等体積で混合することによって得られる。
【0108】
− 抗原+BVSM TM +アジュバント製剤
抗原+BVSMTMの製剤から、アジュバントを伴うその他4つの製剤を調製した。これらの製剤は、アジュバントの存在下で及びアジュバントを添加することにより250μgのHA/mlで3価の製剤を希釈することによって得られる。希釈によって、免疫1回マウス1匹あたりの1価のHAの用量を1.2μg、つまり1mlあたり1価のHAが60μgに調整することができ、かつ希釈のために利用された体積中にアジュバントを追加することができる。
【0109】
e.対照
次の3つのタイプの対照を調整した:
− 1価の各スプリット1mlあたりHA250μgの3つの溶液を等体積で混合することにより調製された以下AS及びANと呼称される3価のスプリットの対照、
− 3価のスプリット+アジュバントの対照、
− ナイーブ対照(PBS 0.22X)。
【0110】
皮下(AS)又は鼻腔内(AN)投与経路に応じて、3価スプリット溶液をそれぞれリン酸緩衝液又は精製水で調製する。
【0111】
(3)方法
以下のスキーマに従って0日目と21日目に異なる処方(アジュバント±BVSM±Ag)を投与する:
【0112】
免疫原性は、35日目の追加免疫の後に評価される:
− 血清レベルでは、各1価スプリットの特異的IgGのELISAによる検出、
− 粘度レべルでは、鼻腔分泌物及び/又は膣分泌物中の各1価スプリットの特異的IgAのELISAによる検出。
【0113】
a.マウスの免疫化
− 投与
処方(BVSM±Adj±Ag)の投与は、麻酔せずにつまり以下の経路で実施される:
・ 皮下:対照について、背中のレベルで1ml入り注射器を用いて100μl、
・ 鼻腔:テスト対象の標本及び対照については、10μlのマイクロピペットを用いて20μl(10μl/鼻孔)
【0114】
各グループについて、免疫化には、同じ様式に従って実施される0日目及び21日目の2回の投与が含まれる。
【0115】
− 採血
0日目(対照)と35日目に、眼窩後静脈で約0.3mlの採血を行なう。
【0116】
血塊の形成及び遠心分離の後、利用するまで血清を−20℃に凍結させる。
【0117】
・ 鼻腔分泌物の採取
鼻腔洗浄は、鼻腔タービンの方向で気管内に導入されたリン酸緩衝液−BSA 1% 500μlを用いて実施される。かくして、作業は同じPBS−BSA 1%を用いて3度くり返される。鼻腔採取物は−20℃でエッペンドルフ管の中に保存される。鼻腔分泌物を35日目に回収する。
【0118】
b.採取物の分析
血清及び鼻腔分泌物の分析は、ELISAテストによって実施される。簡単に言うと、マイクロプレート(Nunc, Immunoplate maxisorb, polylabo)をインフルエンザのワクチン(炭酸塩緩衝液pH9.6中でウェルあたりHA100ng、2時間37℃)でコーティングする。洗浄(PBS−tween 緩衝液pH7.6で3回)及びウェルあたり250μlのPBS−BSA3%溶液による飽和(1時間37℃)の後、一連の血清又は鼻腔分泌物を37℃で一時間インキュベートし、PBS−tween pH7.6溶液で新たに洗い流す。洗浄(3回)の後、ペルオキシダーゼにカップリングされたマウス抗IgG(品番A4416 Sigma)又はマウス抗IgA(品番A4789 Sigma)によって検出する。最後の洗浄段階(5回)の後、OPD基質を添加する(品番P8287、Sigma, 5mlの顕示用緩衝液+50μlのH2O2中糖衣錠1個、100μl/ウェル)。37℃で30分のインキュベーション後、塩酸1N(品番30024−290、Prolabo)を添加し(50μl/ウェル)、490nmでの吸光度を測定する。0.1のDOを得ることのできる希釈度の逆数として力価が定義づけられる。
【0119】
II.BVSM TM /アジュバント/インフルエンザ製剤の調製様式の影響
BVSM/アジュバント/インフルエンザ製剤の最も優れた調製様式を評価するべく、表面プラズモン共鳴(RPS)BiacoreX(Pharmacia Biosensor Inc.)を利用することにより、アジュバント(CTB又はMPL)の存在下で、BVSM上のインフルエンザスプリットの会合を研究する。この研究では、BVSMの懸濁液(0.3倍のPBS 1mlあたり50μg)20μlを疎水性センサーチップ(HPA、Biacore, BR−1000−30)上に毎分5μlで導入する。
【0120】
図9は、CTBの濃度{PBS45mM中 1)2.5μg/ml; 2)25μg/ml; 3)250μg/ml}(これは0.3倍に対応する)に応じたHPAセンサーチップ上に固定化されたBVSM及びCTBの会合によって得られるセンサーグラムを示す。
【0121】
図10は、MPLの濃度{PBS45mM中、 1)1.56μg/ml; 2)3.125μg/ml; 3)6.25μg/ml; 4)12.5μg/ml; 5)25μg/ml; 6)50μg/ml}に応じたHPAセンサーチップ上に固定化されたBVSM及びMPLの会合によって得られるセンサーグラムを示す。
【0122】
CTB及びMPLの両方のケースにおいて、得られたセンサーグラムは、BVSM及びアジュバントの会合能力を確認するものである。
【0123】
このとき、BVSM/アジュバント/インフルエンザスプリットの製剤の調製様式を検討する。以下の2つの方法が利用される。
【0124】
第1の方法では、インフルエンザスプリットの添加前に、アジュバント溶液が導入される。
【0125】
第2の方法では、インフルエンザスプリットは、アジュバントの添加前に導入される。
【0126】
図11は、B Harbinスプリットの場合における結果をまとめたものである。可変量のCTBが、固定化されたBVSM上に導入される{PBS45mM中l、1)CTB無し; 2)2.5Mg/ml; 3)25μg/ml; 4)250μg/ml}。次に、25μg/mlのB Harbin 1価スプリットが、アジュバントの加わったBVSM上に被着させられる。CTBがスプリットの前に添加された場合、BVSM上のスプリットの会合が阻害されるということが明確にわかる。
【0127】
同様にして、図12は、MPL及び B Harbin スプリットの場合に得られた結果をまとめている。可変量のMPLが、固定化されたBVSM上に導入される{PBS45mM中、 1)1.56μg/ml; 2)3.12μg/ml; 3)6.25μg/ml; 4)12.5μg/ml; 5)25μg/ml; 6)50μg/ml}。次に、25μg/mlのスプリットが、アジュバントの加わったBVSM上に被着させられる。CTBの場合と同様に、MPLの量に比例してアジュバントがスプリットの前に添加された場合、BVSM上のスプリットの会合の阻害が存在する。
【0128】
図13は、CTBの場合の2つの調製様式を比較することによって得られたセンサーグラムを表わしている。Aでは、固定化されたBVSM上にCTBが添加され、次に1価のスプリットが導入される。
【0129】
Bでは、1価のスプリットは、固定化されたBVSM上に添加され、その後CTBが導入される。
【0130】
抗原がCTBの前に添加された場合、BVSM上のスプリットのこの会合の低下が存在するということがわかる。逆に、CTBがスプリットの後に添加された場合、BVSMは、CTBに対応する補足的量の材料の会合を可能にする。かくして、「キャリヤ抗原」としてのBVSMの役割を保つためには、BVSM/スプリット製剤上にCTBを添加する調製様式を維持することが重要である。
【0131】
同様にして、図14は、MPLの場合の2つの調製様式を比較することによって得られるセンサーグラムを表わしている。
【0132】
Aでは、MPLはスプリットの前に添加されている。Bではそれが逆になっている。
【0133】
抗原がMPLの前に添加される場合、スプリット/BVSM会合の有意な修飾は存在しないが、BVSMは、MPLに対応する補足的量の材料を会合できるようにする。
【0134】
従って、
− アジュバントがBVSM/抗原製剤上に添加される、
− 「キャリヤ抗原」としてのBVSMの役割が保たれる、
ようなアジュバント追加された製剤の調製様式を規定することが可能であると思われる。
【0135】
III.BVSM/インフルエンザ製剤の免疫学的応答に対するCTBの効果 (1)プロトコル
「材料及び方法」の部分で言及された通りに抗原製剤+BVSMTMを調製する。
【0136】
250μgのHA(83μg/菌株)/mlで三価のSplit をもたらすBVSMTMの不在下の同一条件下で、対照を実現する。
【0137】
アジュバントを含む製剤及び対応する対照を得るべく、これらの調製物の各々に対し、CTB溶液を添加する。
【0138】
36匹の雌BALB/cJ/Rjマウス(研究当初で生後10週間)を、1グループあたり6匹のマウスの割合で6つのグループに分割する。各グループについて、前述のように処置を施する。下表1は、各グループの処置をまとめたものである。
【0139】
【表1】
【0140】
各グループについて、「材料と方法」の部分で指示されている通り採血及び鼻腔分泌物の採取及びそれらの分析を実施する。
【0141】
(2)結果
図15は、マウスの血清(IgG)及び鼻腔分泌物(IgA)のプールのスプリットB/Harbin特異的滴定で得られた結果をまとめたものである。この図は、異なる対照に対しCTB(F−CTB)を含有する三価の製剤の結果を比較できるようにしている。これらの対照は、抗原単独の対照、又はCTBに会合された抗原の対照、又は基準製剤(HA/BVSM比;1/89)である。これらの結果は、スプリットB/Harbin及びA/Nanchangに対する個々の応答の分析によって確認された。
【0142】
予期した通り、基準製剤(FA)は、皮下投与(AS)された単独の抗原対照と等価のGタイプの抗体率及び鼻腔内投与(AN)(22.4倍)された単独の対照より高いIgG率を誘発する。
【0143】
鼻腔投与されたCTBに会合された抗原(ACTB)の対照は、同じ経路により投与された遊離抗原よりもはるかに高いIgGを誘発する(22.4倍の増大)。同時にこれらの製剤(Ag+CTB)(ACTB)は、強い粘膜免疫を誘発する。
【0144】
アジュバントCTB(FCTB)に会合した製剤は、基準製剤(FA)及びその基準対照(ACTB)よりもはるかに高い特異的IgG応答を誘発する。このアジュバントについては、CTBとBVSMTMの間に大きな相乗効果が存在し、かくして得られた血清IgG率は、基準製剤FAに比べ3.7倍となる。逆に、CTBの重大な粘膜アジュバント活性の存在下では、確実に生物学的応答の飽和作用を伴って、この段階でこのタイプのアジュバント及びBVSMTMについてのIgA応答の相乗作用の潜在性を定義することは困難である。
【0145】
IV.BVSM TM /インフルエンザ製剤の免疫学的応答についてのMPLの効果
(1)プロトコル
インフルエンザスプリット1mlにつき250μgのHA/ml(83.3μg/菌株)で、三価の製剤及び対応する対照を調製する。
【0146】
アジュバントを含む製剤及び対応する対照を得るべく、これらの調製物の各々に対し、MPL溶液を添加する。
【0147】
36匹の雌BALB/cJ/Rjマウス(研究当初で生後10週間)を、1グループあたり6匹のマウスの割合で6つのグループに分割する。各グループについて、「材料及び方法」の部分に記述されている通りに処置を施す。下表2は、各グループの処置をまとめたものである。
【0148】
【表2】
【0149】
各グループについて、方法の部分で記述されている通り採血及び鼻腔分泌物の採取を実施する。
【0150】
ELISAテストにより、血清及び鼻腔分泌物の分析を実施する。
【0151】
(2)結果
図16は、MPLによりアジュバント付加された製剤が投与されたマウスの血清(IgG)及びマウスの鼻腔分泌物(IgA)のプールのスプリットB/Harbin特異的滴定で得られた結果をまとめたものである。これらの結果は、スプリットB/Harbin及びA/Nanchangに対する個々の応答の分析によって確認された。
【0152】
MPL又はBVSMTMに会合されたインフルエンザウイルススプリットは、同じ経路により投与された遊離抗原よりもはるかに高い血清IgGを誘発する(それぞれ22.4倍及び7.3倍の増大)。同時にこれらの製剤は、強い粘膜免疫を誘発する。
【0153】
アジュバントMPLに会合した製剤は、基準製剤(FA)に類似した特異的IgG応答を誘発する。逆にこのアジュバントについては、MPLとBVSMTMの間に大きな相乗効果が存在する。かくして、得られたIgA率は、基準製剤(Ag/BVSM)に比べて2.7倍となる。かくして、IgG応答とは逆に、粘膜応答についてMPLとBVSMTMにの間に強い相乗作用潜在性を実証することができる。
【0154】
V.BVSM/インフルエンザ製剤の免疫学的応答についてのオリゴヌクレオチドの効果
(1)プロトコル
インフルエンザスプリット1mlにつき250μgのHA/ml(83.3μg/菌株)で、三価の製剤及び対応する対照を調製する。
【0155】
アジュバントを含む製剤及び対応する対照を得るべく、これらの調製物の各々に対し、オリゴヌクレオチド(ODN)溶液を添加する。
【0156】
42匹の雌BALB/cJ/Rjマウス(研究当初で生後10週間)を、1グループあたり6匹のマウスの割合で7つのグループに分割する。各グループについて、「材料及び方法」の部分に記述されている通りに処置を施す。下表3は、各グループの処置をまとめたものである。
【0157】
【表3】
【0158】
各グループについて、方法の部分で指示されている通り採血及び鼻腔分泌物の採取を実施する。
【0159】
ELISAテストにより、結成及び鼻腔分泌物の分析を実施する。
【0160】
(2)結果
図17は、オリゴヌクレオチドによりアジュバント付加された製剤が投与されたマウスの血清(IgG)及びマウスの鼻腔分泌物(IgA)のプールのスプリットB/Harbin特異的滴定で得られた結果をまとめたものである。これらの結果は、スプリットB/Harbin及びA/Nanchangに対する個々の応答の分析によって確認された。
【0161】
鼻腔投与されたODN又はBVSMTMに会合されたインフルエンザウイルススプリットは、同じ経路により投与された遊離抗原よりもはるかに高い血清IgGを誘発する(それぞれ22.4倍及び7.3倍の増大)。同時にこれらの製剤は、強い粘膜免疫を誘発する。
【0162】
アジュバントODNに会合した製剤は、基準製剤(FA)及びその基準対照(Ag+ODN)よりも高いIgG応答を誘発する。このアジュバントについては、製剤について得られたIgG力価が、抗原+ODN1(AODN1)について及び基準製剤(Ag+BVSMTM)(FA)について得られた応答の合計に等しいことから、応答の相加性が存在すると思われる。
【0163】
VI.BVSM/インフルエンザ製剤のアジュバント添加によるIgG2a/IgG1バランスの修飾
(1)プロトコル
インフルエンザスプリット1mlにつき250μgのHA/ml(83.3μg/菌株)で、三価の製剤及び対応する対照を調製する。3価の製剤から、以下の3つのアジュバント入り製剤を得る:
− BVSMTM/Ag/CTB:CTB溶液を3価の製剤上に添加することによる、
− BVSMTM/Ag/IL2:組換え型IL−2溶液を3価の製剤上に添加することによる、
− BVSMTM/Ag/MPL:MPL溶液を3価の製剤上に添加することによる。
【0164】
54匹の雌BALB/cJ/Rjマウス(研究当初で生後10週間)を、1グループあたり6匹のマウスの割合で9つのグループに分割する。各グループについて、「材料及び方法」の部分に記述されている通りに処置及び採取を行う。
【0165】
下表4は、これらの処置をまとめたものである。
【0166】
【表4】
【0167】
マウス抗IgG2a又はマウス抗IgG1を利用して、前述の通りにELISAテストにより血清の分析を実施する。
【0168】
(2)結果
下表5は、鼻腔内投与後のアジュバント付与された異なる製剤BVSMTM/インフルエンザ及び対応する対照のガンマグロブリン亜型(IgG2a及びIgG1)に関して得られた結果をまとめている。皮下投与された遊離抗原に比べ、鼻腔投与された製剤BVSMTM/インフルエンザは、特異的IgG2a産生のわずかな増大しか誘発しない。
【0169】
これに比較して、製剤Ag/BVSMTMに対してCTBを付加すると、Ig2a産生の著しい増加が誘発される(Ag s.cに対してIg2a/IgG1指数が5.4倍)。なお、抗原に対するCTBの会合によって得られた結果から、このTh1/Th2バランスの修飾を予想することはできないという点に留意することが重要である。実際、この対照グループでは、Ig2a/IgG1指数の低下が存在する。
【0170】
【表5】
【0171】
逆に、インフルエンザスプリットに会合された場合にIgG2a産生に有利に作用する(指数がAg s.cについての6.7に対し47.6の)MPLは、製剤Ag/BVSMTMとの会合後、Th1/Th2のわずかな修飾しかひき起こさない。
【0172】
最終的に、IgG2a/Ig1指数の低下に基づいて視覚化可能であるように、製剤Ag/BVSMTMに対するIL2の会合は、Th1/Th2バランスを修飾することを可能にする。
【0173】
かくして、免疫学的応答の量的修飾が不在である場合でも抗原/BVSMTM製剤に対するアジュバントの会合は、免疫学的応答の質的修飾を誘発できるようにする。この会合は、利用されるアジュバントの正しい選択により、提案されたワクチン戦略にTh1/Th2バランスを適合させることを可能にするはずである。
【図面の簡単な説明】
− 実施例1で参照指示されている図:
【図1】
特に有利なタンパク質とベクターの間の最適な質量比を計算することを可能にするBVSM−IL2相互作用のELISA分析。値は、任意単位(UA)で与えられている。
【図2】
Biacore(登録商標)装置上でのBVSM−IL2の分析。遊離IL−2組成物とBVSM−IL2組成物の間の屈折の比較。値は、屈折単位(RU)で与えられる。
【図3】
PHA及びさまざまな組成のBVSM−IL2によって予め刺激された末梢単核細胞の増殖。増殖は、3Hによりマーキングされたチミジンの取込みによって測定され、読取られた毎分ストローク数(cpm)に正比例する。
【図4】
同時投与後のTS/Aモデル内の腫瘍の移植及び成長に対する異なるIL−2製剤の効果。記号は、以下のものを表わしている: PBS、食塩水緩衝液; IL−2、処方されていないインタロイキン2; KY−カチオンコア及びDPPC/コレステロール層をもつベクター; KY/IL−2、IL−2を伴って処方されたKYベクター
【図5】
BALB/cマウスの対側脇腹内への投与の後の、TS/Aモデル内の腫瘍の移植及び成長に対する、異なるIL−2製剤の効果。記号は、前述のものと同じであり、指示された数値は、IL−2のUI値に対応する。
【図6】
A.移植後6日目の1つ又は5つの部位におけるBALB/cマウスの対側脇腹内のKY/IL−2の皮下投与による移植TS/A腫瘍の拒絶特性。記号は、前述のものと同じであり、指示された数値は、IL−2の値UIに対応する。B.腫瘍細胞TS/Aの再注入後の治癒したマウスの防御。2つの図において、腫瘍を呈するマウスの数がカッコ内に指示されている。
【図7】
A.移植から6日後に5日間、1日に1〜2回BALB/cマウスの対側脇腹内にKY/IL−2の鼻腔内投与による移植TS/A腫瘍の拒絶特性。記号は、前述のものと同じであり指示された数値は、IL−2のUI値に対応している。B.腫瘍細胞TS/Aの再注入後の治癒したマウスの防御。2つの図において、腫瘍を呈するマウスの数がカッコ内に指示されている。
【図8】
KY/IL−2の投与後の、TS/A細胞を拒絶したマウスにおける抗腫瘍CTL活性。A.皮下投与を受けたマウス、B.鼻腔内投与を受けたマウス。
− 実施例2で参照指示されている図:
【図9】
CTB濃度に応じたBVSMTMとCTBの会合のBiacoreでの分析(表面プラズモン共鳴)。
【図10】
MPL濃度に応じたBVSMTMとMPLの会合のBiacoreでの分析。
【図11】
増大した量のCTBの存在下でのBVSM上のB Harbinスプリットの会合の阻害。
【図12】
増大した量のMPLの存在下でのBVSM上のB Harbinスプリットの会合の阻害。
【図13】
センサーチップHPA上に固定化されたBVSM上のインフルエンザ抗原及びCTBの2つの調製様式を比較することによって得られたセンサーグラム。当初はCTBそして次に抗原が連続してBVSM上に(曲線A)、及び逆順序で(曲線B)被着される。
【図14】
センサーチップHPA上に固定化されたBVSM上のインフルエンザ抗原及びMPLの2つの調製様式を比較することによって得られたセンサーグラム。当初はMPLそして次に抗原が連続してBVSM上に(曲線A)、及び逆順序で(曲線B)被着される。
【図15】
CTBに会合された又はされていない抗原対照及び3価の製剤による投与を受けたマウスの血清(IgG)及び鼻腔分泌物(IgA)のB/Harbinスプリットの特異的滴定。
【図16】
MPLに会合された又はされていない抗原対照及び3価の製剤による投与を受けたマウスの血清(IgG)及び鼻腔分泌物(IgA)のB/Harbinスプリットの特異的滴定。
【図17】
オリゴヌクレオチドに会合された又はされていない抗原対照及び3価の製剤による投与を受けたマウスの血清(IgG)及び鼻腔分泌物(IgA)のB/Harbinスプリットの特異的滴定。
本発明は、免疫学的応答を調節する能力をもつ、抗原以外の物質の免疫調節特性を改善するための方法において、イオンリガンドを支持するか又は支持せず場合によって両親媒性化合物層で被覆された親水性粒子と前記物質を混合させることから成る方法を目的としている。
【0002】
本発明は特に、治療用組成物特にワクチン組成物及びその調製方法に関する。
【0003】
本発明は、特に、癌の治療を目的とする医薬品の調製のためのインタロイキン2を取込んだ特定のベクターの利用を目的としている。
【0004】
【従来の技術】
癌は、免疫系の監視を逃れる或る種の細胞の無制御増殖を特徴とする疾病である。実際、免疫系の役割は、人間の体内に侵入しうる病原性の異物(ウイルス、細菌、寄生虫…)を拒否するだけでなく、異常な特徴を呈する細胞を除去することにもある。癌性細胞が、例えば腫瘍に特異的な或る種の抗原又は免疫系による認識に関わる分子(主要組織適合性複合体タンパク質)の発現を減少させることにより、免疫系の警戒から逃れることも時として可能である。その他のケースでは、腫瘍はきわめて免疫原性ではあるものの、癌性集積の近くではリンパ球がアネルギー状態にあることから、免疫系がこれを抑えこむことはできない。
【0005】
近年開発された新しい戦略は、免疫系の調整において1つの役割をもつ治療上有利なタンパク質を注入することにより免疫系を刺激することから成るものである。これらのタンパク質に入るものとしては、当然サイトカインのみならず、ケモカインといったようなその他の作用物質も挙げることができる。特に、インタロイキン、インタフェロン、TNF(腫瘍壊死誘発因子)、TGF(成長形質転換因子)、M−CSF及びGM−CSFといったような造血成長因子だけでなく、MIF又はRANTESといったような免疫細胞誘引因子も指摘することができる。
【0006】
免疫系の刺激において特に有利なサイトカインは、インタロイキン2(IL−2)である。これは、適切な細胞により提示される抗原による刺激に応答して、I型ヘルパーTリンパ球(Th1)により大部分が合成される。これは、数多くの細胞(Bリンパ球、Tリンパ球、NK天然キラー細胞)と相互作用して、それらを活性化しそれらの分化及び/又は増殖を誘発するという点で、特異的及び非特異的免疫応答の発達に関与する。かくして、IL−2は、異なる中実腫瘍、黒色腫、白血病又はリンパ腫などの退行を誘発することができるという点で抗腫瘍特性を有している。
【0007】
しかしながら、化学療法におけるIL−2の利用には、数多くの問題が立ちはだかっている。求める効果を得るためには、往々にして大用量のタンパク質を投与する必要があり、これは、わずらわしい副作用(発熱、紅斑、浮腫)をひき起す可能性がある。一方、このタンパク質は精製がむずかしく、一般に遺伝子工学によって産生されているためにコストが高い。又、サイトカインは、4℃という温度であっても、溶解状態で不安定であることが多く、そのため保存の問題がでてくる。その上、IL−2を含む溶液の調製方法は、往々にしてアルブミンである安定化タンパク質の添加段階を含み、このことは、アルブミンの利用によりもたらされるリスクのため、規制機関にとって受諾し難いことである。
【0008】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、通常の製剤に比べさらに高い活性特に抗腫瘍活性をもつ溶液を得ることを可能にするIL−2含有組成物の新しい処方方法を利用することによって、これらの異なる問題を解決することを提案している。この新しい製剤は同様に、IL−2の安定性を増大させることをも可能にする。その上、本発明は、有効成分の送達システムが、前述のシステムに比べきわめて大幅な改善を示すことから鼻腔内又は経口投与できる医薬品の製造のために利用することができる。要するに、本発明に従った製剤は、注入可能な形で投与することを目的とする、IL−2含有組成物中のアルブミンの存在から解放されることを可能にする。
【0009】
出願人は、以下「BVSMTM」とも呼ばれる特定の合成ベクターの調製においてその専門知識を開発した。
【0010】
第1のタイプのBVSM及びその調製方法は、欧州特許第344,040号の中で記述されていた。これは、内側から外側へ向かって以下のものを含む粒子である:
− さまざまなイオン基によって修飾され得る、自然に又は化学的に網状化された多糖類又はオリゴ糖マトリックスから成る、非液体親水性中心核;
− 核に対し、共有結合によりグラフト化された脂肪酸層;
− 特にリン脂質から成る単数又は複数の脂質層。
【0011】
この第一世代のBVSMの開発により、出願人は、特に輸送される有効成分に応じて改善された特性をもつ新しいBVSMを設計し調製するに至った。
【0012】
WO94/20078、WO96/06638及びEP782851という番号で公示された特許出願は、これらのBVSM、その製造、さまざまな有効成分に対するその会合、及び薬学組成物の調製のためのその利用について記述している。
【0013】
かくして、親水性核は、すでに記述した異なる方法(例えば特許EP344040号、WO92/21329号、WO94/20078号)によって得ることができ、網状化方法は、当業者にとって既知のものであり、多糖類は、重合体を構成する糖に対するカチオン又はアニオンのイオン基のグラフト化により正又は負に帯電している可能性がある。これらの基は、第4アンモニウム又はカルボキシメチル官能基の中から選択され得る。方法は、WO92/21329及び上述の特許の中で記述されていた。本発明に従った組成物のベクターの多糖類コアの電荷は、一般に好ましくは、正の電荷である。しかしながら、コアに負の電荷を含むベクターが時として、特に注入可能な形で利用するための組成物において好適でありうる。
【0014】
前述の特許は、同様に、当業者が脂質外部層の取込みのために利用できるプロトコルについても記述している。この外部層は、好ましくは、「DPPC様のもの」つまりDPPC(ジパルミトイルホスファチジルコリン)又はこの生成物と同じ物性をもちその中にコレステロールが添加されるその他のあらゆる化合物から成る。ただし、特に例えば生体膜の構成成分といったその他の成分を付加できるリン脂質又はセラミドといったその他の脂質化合物も利用することができる。好ましくは、DPPCとコレステロールの質量比は70/30である。
【0015】
BVSMの調製について自ら今日保有しているノウハウにより、出願人は、広範なタイプのBVSMを入手することができる。これらのBVSMは、ナノ粒子ゲルの形の網状化された親水性重合体、好ましくは多糖類で形成され、これらのBVSMはPSC(フランス語ではNPS)タイプと呼ばれている。
【0016】
上述のように、この重合体は場合によって、正のイオンリガンド、いわゆるカチオンBVSM又は、負のイオンリガンドすなわちアニオンBVSMを担持することができる。この荷電又は非荷電重合体は、任意には両親媒性化合物層、好ましくはリン脂質、PCT特許出願第WO94/20078号の中で記述されているLight タイプと呼ばれるBVSMで被覆されている。
【0017】
BVSMのサイズは、20〜200nm、好ましくは50〜100nm、より好ましくは60〜80nmの間に含まれる。
【0018】
BVSMは、ろ過により滅菌可能であり、有効成分に対するその会合は、完全に製造されたBVSM上で行なわれる(Major et al., Biochem. & Biophys. Acta(1997)、1327、32−40)。こうして、最適な条件下で特に脆い生体分子に働きかけることが可能となっている。
【0019】
BVSMは、分解から生体分子を保護する。(Prieur R.et al. Vaccins(1996)、第14巻、No.6.p511〜520、80nmのカチオンバイオベクターとhCMV組換え型IE1タンパク質の組合せ;タンパク質分解からの保護及びCD4に対する提示の増強作用)。
【0020】
同様に、それらが、酵素、抗原などといったようなペプチド及びタンパク質の生物活性を増大させることも示された。
【0021】
BVSMは、例えばペプチド、抗原又はオリゴヌクレオチドといったような活性物質の運搬体として利用されるものとして知られている。この利用においては、BVSMのカチオン核とアニオンオリゴヌクレオチドの間のイオン相互作用として、BVSMと活性物質間の真の複合体の形成が存在する。従って生物学的環境内で安定したイオン接合体の形成が存在する。このタイプの調製においては、オリゴヌクレオチド/BVSMの比は、5〜10%であり、測定上の会合効率は90%を上回る。
【0022】
WO96/06638という番号で公示されたPCT特許出願は、抗原/BVSMの単純な混合物によって得られた抗原の免疫原性の増大に関するものである。抗原はここでも又、疎水性及び/又はイオン結合により特定のベクターに会合されている。この結果を得るためには、例えば10mgのBVSMについてタンパク質GST〜e4 1mgをインキュベートし、これにより、利用されるBVSMタイプの如何に関わらず90%の平均会合率を得ることが可能となる(Prieur R. et al. Vaccins(1996)第14巻、N°6p511〜520)。
【0023】
出願人は、今BVSMが、免疫学的応答を調節する能力をもつ抗原以外の物質の免疫調節特性を改善できるようにするということを発見した。これらの物質は、より特定的には以下のようなものである。
− 免疫応答を増幅、調整又は修飾する能力をもつアジュバント、
− 免疫系細胞の活性を修飾するという固有の特性をもつサイトカイン及びケモカイン、
− アレルギー及び/又は移植片拒絶の治療におけるその利用を理由として、免疫抑制剤、
− Th1/Th2バランスを修飾する能力をもつ物質。
【0024】
免疫応答はリンパ球性細胞特にB細胞及びTリンパ球により引継がれるということを喚起しておく。これらの細胞は、表面抗原CD4及びCD8の発現に基づき2つの亜型に分類できる。CD4+細胞は一般に「ヘルパー」機能に関与している。特に、これらは、その他のリンパ球性細胞の増殖及び成熟を誘発するサイトカインを分泌する。かくして、ヘルパーTリンパ球のもつ次のような2つのプロフィールを定義づけすることができる:すなわち、
− 一方では、サイトカイン特にIL2、IL7及びガンマインタフェロンの誘発、CTLの刺激及びIgG2aタイプの抗体の誘発を伴う、細胞媒介応答を特徴づけるTh1プロフィール、そして
− 他方では、サイトカイン、特にIL4、IL5及びIL10の誘発及びIgG1及びIgEタイプの抗体の存在を伴う、体液媒介応答を特徴づけるTh2プロフィール。
【0025】
抗原提示細胞(APC)によるその提示が大部分クラスIIのCMHによって行なわれるタンパク質抗原は、Th2に方向づけされた応答を誘発する。逆に、トランスフェクションの後クラスIのCMH上で直接抗原を提示できるようにするADNは、免疫応答をTh1に向かって方向づけする。
【0026】
応答を大部分Th1又はTh2へと方向づけするためのいくつかのアジュバントが知られている。例えば、IgG1タイプの血清応答を誘発するアルミニウム塩は、Th2とみなされる。アジュバントとは逆に、IgG2a及びCTL応答を誘発する脂質Aの誘導体(MPL)又はQuilAの誘導体はTh1とみなされる。従って、Th1/Th2バランスに作用できるようにする手段を手に入れることが有用と思われ、これこそまさに本発明が実現すべく提供するものである。
【0027】
本発明の枠内で出願人により実施された研究作業は、BVSMが単独では免疫系の活性化を誘発しないことからアジュバントとして作用せず、提示細胞に対する抗原のより良い侵入及び/又はより良い提示を可能にする「キャリヤ」として作用することを示している。かくして、得られた結果は、CTB、MPL及びODNのアジュバント能に対するBVSM寄与を示していた。驚くべきことに、アジュバント能は、次のものに対して異なる形で視覚化される:
− 血清IgG応答については、CTBの場合強い相乗作用又はODN CpGの場合応答の加算が得られた。
− IgA応答については、MPLに関して相乗作用が明確に立証された。
− Th1/Th2バランスについては、数量的に等価の応答(IL2)の場合でさえ、特に細胞応答における差異を反映するIg1/IgG2aバランスにおいて応答の質的差異が観察される。
【0028】
【課題を解決するための手段】
従って、本発明はまず第1に、癌及び/又はウイルス性疾患の治療を目的とした1つの医薬品の調製を目的とした、液体でない親水性核を有するタイプのベクターの利用において、前記ベクターが該医薬品中で、免疫応答を調節する能力をもつ抗原以外の少なくとも1つの物質と結びつけられている利用を目的としている。
【0029】
ベクターは有利には、非液体親水性核並びに疎水性相互作用及び/又はイオン結合により核に結びつけられ両親媒性化合物で少なくとも部分的に構成されている外部層を含むタイプのものである。外部層はジパルミトイルホスファチジルコリン(DDPC)およびコレステロールで形成されている。
【0030】
非液体親水性核は、イオンリガンドが上にグラフト化された自然に又は化学的に網状化したオリゴ糖又は多糖類マトリクスで構成されている。
【0031】
イオンリガンドは、第4アンモニウムといったように正の電荷をもつ。
【0032】
非液体親水性核及び両親媒性化合物から成る外部層を有する粒子状ベクターについては、すでに、特に特許出願WO94/20078号において記述されていた。
【0033】
親水性核は、すでに記述した異なる方法(例えば特許EP344040号、WO92/21329号、WO94/20078号)によって得ることができ、網状化方法は、当業者にとって既知のものであり、多糖類は、重合体を構成する糖に対するカチオン又はアニオンのイオン基のグラフト化により正又は負に帯電している可能性がある。これらの基は、第4アンモニウム又はカルボキシメチル官能基の中から選択され得る。方法は、WO92/21329及び上述の特許の中で記述されていた。本発明に従った組成物のベクターの多糖類コアの電荷は、一般に好ましくは、正の電荷である。しかしながら、コアに負の電荷を含むベクターが時として、特に注入可能な形で利用するための組成物において好適でありうる。
【0034】
前述の特許は、同様に、当業者が脂質外部層の取込みのために利用できるプロトコルについても記述している。この外部層は、好ましくは、「DPPC様のもの」つまりDPPC(ジパルミトイルホスファチジルコリン)又はこの生成物と同じ物性をもちその中にコレステロールが添加されるその他のあらゆる化合物から成る。ただし、特に例えば生体膜の構成成分といったその他の成分を付加できるリン脂質又はセラミドといったその他の脂質化合物も利用することができる。好ましくは、DPPCとコレステロールの質量比は70/30である。
【0035】
本発明の利用においては、物質と粒子の重量比は約1%〜20%、好ましくは約5%〜10%の間に含まれている。有利には、(物質)/(核+外部層)の重量比は1対10である。
【0036】
免疫応答を調節する能力をもつ、抗原以外の第1のクラスの物質には、免疫系の機能において1つの役割を果たす治療上有利なタンパク質が含まれる。すなわちこれには特に、好ましくはインタロイキン、インタフェロン、TNF、TGF、G−CSF、GM−CSF、MIF、RANTES又はこれらの混合物を含むグループの中から選択されたサイトカイン又はケモカインである。
【0037】
前述のものを部分的にカバーする、免疫応答を調節する能力をもつ抗原以外の第2のクラスの物質には、アジュバントが含まれる。アジュバントというのは、1つの抗原の特異的免疫応答を増幅、調整又は方向づけできるようにする分子のことである。かくして、抗原以外の物質の免疫調節能に対するBVSMの特性を評価する目的で、細菌産物(内毒素、壁の成分)、サイトカイン、オリゴヌクレオチド(CpG)といったような主要なカテゴリのアジュバントに属するさまざまな分子が、本発明の枠内でテストされた。その中でもより特定的に以下のものを挙げることができる:
− CT、CTB、LTといったような細菌腸毒素、
− MPL及び脂質Aの誘導体といったようなリポ糖類誘導体;
− QS21タイプのサポニンの誘導体;
− ミョウバンといったようなアンモニウム塩及びその誘導体;
− DT又はTTタイプのタンパク質、
又はこれらの混合物。
【0038】
免疫応答を調節する能力をもつ、抗原以外の基板は、好ましくは以下のもの中から選択される:
− 免疫応答を増幅、調整又は修飾する能力をもつアジュバント、
− 免疫系の細胞の活性を修飾するという固有の特性をもつサイトカイン及びケモカイン、
− アレルギー及び/又は移植片拒絶の治療におけるその利用を理由として免疫抑制剤、
− Th1/Th2バランスを修飾する能力をもつ物質。
【0039】
この中でも、本発明では、より特定的に、免疫調節特性を改善することが望まれる物質として、免疫細胞の活性を刺激するサイトカイン、なかでもIL2、IL11及びGM−CSFが考慮されている。実際、サイトカインは、免疫細胞の活性を刺激又は阻害する。
【0040】
本発明のきわめて好ましい実施形態は、
(a)正の電荷又は負の電荷のイオンリガンドが上にグラフト化されている、自然に又は化学的に網状化された多糖類又はオリゴ糖マトリックスで構成された非液体親水性核、及び
(b)疎水性相互反応及び/又はイオン結合によって核に結びつけられた両親媒性化合物で少なくとも部分的に構成された外部層、
を含み
(c)インタロイキン2を取込んでいる、
ベクターの、癌の治療を目的とする医薬品の調製のための利用に関する。
【0041】
(a)イオンリガンドが上にグラフト化されている、自然に又は化学的に網状化された多糖類又はオリゴ糖基質で構成された非液体親水性核、及び
(b)疎水性相互反応及び/又はイオン結合によって核に結びつけられた両親媒性化合物で少なくとも部分的に構成された外部層、
を含み
(c)インタロイキン2を取込んでいる、
ベクターを含む、このような薬学組成物も同様に本発明の一部を成している。
【0042】
この利用においては、本発明は、免疫原性でない又は免疫原性の低いタイプの癌の治療および/又は、免疫応答を活性化するための治療的処置を補うものとして免疫調節剤が提案されたエイズ又は慢性肝炎といった特にウイルス性の感染の治療に関係する。この利用を実施するための組成物は、イオンリガンドを担持するか又はしない、そして場合によっては上述のような治療上有利なタンパク質又はアジュバントが取込まれた両親媒性化合物の層で被覆された親水性粒子を含んで成る。かかる組成物は、抗原を含まない。
【0043】
発明に基づく組成物によって治療可能な癌は、あらゆる種類のものであり得る。特に、ORL球、食道、膵臓、***、子宮頸部又は子宮体部、卵巣、腎臓、膀胱、骨又は甲状腺の癌が挙げられる。同じく気管支肺癌、悪性黒色腫、脳腫瘍、リンパ腫(ホジキン又は非ホジキン)、白血病(骨髄性又はリンパ性)、初期位置不明の癌も加えられる。これらの癌は、原発性である場合も転移性である場合もある。又これらの癌は、肉腫、腺腫、癌腫、腺癌、リンパ腫、骨髄腫、膠腫、芽腫、グリア芽腫タイプのものであり得る。本発明に従った組成物により治療され得る癌は、免疫原性であってもなくてもよい。出願人は、本発明に従った組成物が、ほとんど又は全く免疫原性でない癌の治療及び制御において特に有効であるということを示した。
【0044】
本発明に従った組成物及び医薬品は、さまざまな形、特に非経口で投与することができる。かくして、本発明に従った組成物を、静脈内、皮下、筋内又は皮内投与することができる。投与は、経口又は鼻腔内でも行なうことができる(これが発明の大きな利点である)。経口投与を可能にする組成物は、錠剤、ゼラチン嚢、粉末、顆粒又は経口用懸濁液又は溶液でありうる。これらの組成物には、舌下又は口腔投与形態も含まれる。
【0045】
本発明に従った医薬品組成物に対し、或る種の賦形剤を付加することも場合によって可能である。かくして、あらゆる種類の結合剤、界面活性剤、コーティング剤、分散剤又は給湿剤を利用することができる。
【0046】
出願人は、これらのベクターがきわめて効果的な形でIL−2を固定する能力をもつこと、タンパク質がその生物活性を保持すること、そして、予想外にもこの活性が、処方されていないタンパク質に比べ増大させられていることを立証した。
【0047】
出願人は同様に、本発明に従った処方が、アルブミンの存在下と同様の形で溶液状態のタンパク質を安定化することを可能にするものである、ということも立証した。かくして、
(a)正の電荷又は負の電荷のイオンリガンドが上にグラフト化されている、自然に又は化学的に網状化された多糖類又はオリゴ糖マトリックスで構成された非液体親水性核、及び
(b)疎水性相互反応及び/又はイオン結合によって核に結びつけられた両親媒性化合物で少なくとも部分的に構成された外部層、
を含み、
(c)IL−2を取込んでいる、
ベクターの、アルブミンの不在下での前記タンパク質IL−2の注入可能な形での投与のための医薬品の調製を目的とした利用も同様に本発明の一部を成している。
【0048】
その上、出願人は、ベクター/タンパク質の会合が(数カ月の保管後の活性の維持によって測定された場合に)安定した状態にとどまることを示しており、このことは、IL−2の治療用調製物を保存することができず、そのためコストをなお一層増大させることになる先行技術に比べて1つの改善である。
【0049】
最後に、出願人は、驚くべきことに、本発明に従って処方され鼻腔内経由で投与されたIL−2が、皮下といったようなより古典的な経路で投与されるIL−2と類似した又はそれを上回る活性を有することを示した。
【0050】
従って、本発明に従ったベクターの利用は、IL−2の利用の際に従来提起されてきた異なる全ての問題から解放されることを可能にする。
【0051】
従って、本発明に従ったベクターは、免疫応答の増強が求められる癌治療のために利用可能である。
【0052】
本発明は同様に、免疫応答を調節する能力をもつ、抗原以外の物質の免疫調節特性を改善するための方法において、非液体親水性核を有するタイプのベクターと前記物質の混合物を含むことを特徴とする、方法をもその目的としている。有利にも、ベクターは、非液体親水性核並びに疎水性相互作用及び/又はイオン結合によって核に会合された、少なくとも部分的に両親媒性化合物で構成された外部層を有するタイプのものである。前述のように、非液体親水性核は、特に第4アンモニウムといったような、正の電荷を持つイオンリガンドが上にグラフト化された自然に又は化学的に網状化したオリゴ糖又は多糖類マトリクスで構成されている。外部層は、例えばジパルミトイルホスファチジルコリン(DDPC)及びコレステロールで、特に70/30というDPPCとコレステロールの質量比で形成されている方法。好ましくは、物質とベクターの重量比は、約1%〜20%、好ましくは約5%〜10%の間に含まれている。
【0053】
前述のように、免疫応答を調節する能力をもつ、抗原以外の物質は、好ましくはインタロイキン、インタフェロン、TNF、TGF、G−CSF、GM−CSF、MIF、RANTES又はこれらの混合物を含むグループの中から選択された、サイトキン又はケモカインといったような、免疫系の機能において1つの役割を果たす治療上有利なタンパク質、
− 特に細菌腸毒素、リポ糖類誘導体、オリゴヌクレオチド、サポニン、アンモニウム塩及びその誘導体、DT又はTTタイプのタンパク質又はそれらの混合物を含むグループの中から選択されたアジュバント、
− Th1/Th2バランスを修飾する能力をもつ物質、
− 免疫抑制剤
の中から選ばれる。
【0054】
本発明は同様に、イオンリガンドが上にグラフト化された自然に又は化学的に網状化したオリゴ糖又は多糖類マトリクスで構成された非液体親水性核そして、疎水性相互作用及び/又はイオン結合により核に結びつけられ両親媒性化合物で少なくとも部分的に構成されている外部層を含むタイプのベクター、及び
− 少なくとも1つの治療上の有利なタンパク質、及び/又はアジュバント又はそれらの混合物、
を含むことを特徴とする薬学組成物にも関する。
【0055】
ベクター、治療上有利なタンパク質及びアジュバントは、前述のように定義される。
【0056】
本発明はさらに、特に治療又は予防用ワクチン組成物の調製のための前述の通りのベクターの利用において、前記粒子が前記抗原に対する免疫学的応答を調節する能力をもつ少なくとも1つの物質及び少なくとも1つの抗原と該組成物中で混合されている利用にも関する。治療上の利用の場合には、本発明は特に、ウイルス疾患、特にエイズ及び慢性肝炎のみならず免疫原性をもつ癌の治療及び/又は予防に関係する。
【0057】
従って、本発明は、特に、上述のとおりのベクター、及び抗原又は抗原混合物そして前記抗原の免疫学的応答を調節する能力をもつ少なくとも1つの物質を含むことを特徴とするワクチン組成物に関する。
【0058】
本発明の組成物中に存在する抗原に対する免疫学的応答を調節する能力をもつ物質は、好ましくはアジュバントである。これらのうち、本発明では、細菌産物(内毒素、壁の成分)、サイトカイン、オリゴヌクレオチド(CpG)が考慮されている。より特定的に言うと、これらのうち、次のものを挙げることができる:
− CT、CTB、LTといったような細菌腸毒素、
− MPL及び脂質Aの誘導体といったようなリポ糖類誘導体;
− QS21タイプのサポニンの誘導体;
− ミョウバンといったようなアンモニウム塩及びその誘導体;
− DT又はTTタイプのタンパク質、
又はこれらの混合物。
【0059】
前述のように、物質/粒子の重量比は、約1%〜20%、好ましくは約5%〜10%の間に含まれている。
【0060】
本発明は、特に鼻腔内といった粘膜投与のための組成物の調製に特に適しているが、例えば非経口といったような他のあらゆる投与様式も考慮することができる。
【0061】
本発明の特徴及び利点は、次のものに関する例から明らかになることだろう。
実施例1: BVSM−IL2の調製及び生物活性
実施例2: (ii)異なるアジュバントのものに対する三価のインフルエンザスプリットの免疫原性に対するBVSMの、マウスにおける効果及び、(iii)三価のインフルエンザスプリットの免疫原性に対する製剤及び異なるアジュバントの同時投与の、マウスにおける効果。
【0062】
以下の例は、本発明を例示することを目的とするものであるが、制限的意味はもたない。特に、示された値は、一例として与えられているにすぎず、本発明の実施に際して最適化され得るものである。
【0063】
【実施例1】
BVSM−IL2の調製及び生物活性
(1)IL−2がロードされた粒子の特徴づけ
A.IL−2がロードされたベクターの調製
この例で利用されているベクター(BVSM)については前述された。これは、DPPC−コレステロールの脂質層を有するカチオンベクターである。
【0064】
利用されるインタロイキン2(IL−2)は、Chiron社製である。これは、18・106UI=1.1mgの凍結乾燥タンパク質といったような、凍結乾燥された組換え型IL−2の形を呈している。
【0065】
本発明に従った組成物は、10/1の重量比で緩衝食塩溶液(PBS)中に2つの化合物を単に混合することによって、BVSM−IL2結合によって得られる。
【0066】
B.最適なBVSM−IL2比の決定
タンパク質との関係におけるBVSMの最適な質量比は、当業者にとって周知の方法に従って、ELISAを用いた分析により決定される。
【0067】
簡単に言うと、抗−IL2抗体でウェルをカバーし、BSA(ウシ血清アルブミン)で飽和させる。テストすべきIL−2調製物を添加し、次に、ビオチニル化された第2の抗IL−2抗体を添加する。ペルオキシダーゼに結合させたストレプトアビジンの添加とそれに続く前記ペルオキシダーゼの基質の付加により、比色計を用いて溶液中に存在するIL−2の量を決定することが可能となる。得られた値は、任意単位で表現され、値は、テスト対象溶液中に存在するIL−2に比例して高くなる。
【0068】
テスト対象調製物は、タンパク質の安定剤としてのBSAを伴って又は伴わずに、さまざまな割合でベクターが存在する中で又はその不在下で、同量のIL−2が導入された調製物である。
【0069】
結果は、図1に表わされている。BSAを含有する複数の調製物中に利用可能なIL−2がほぼ同じ割合で得られるか、又はBVSM/IL−2の質量比が10/1となるような特定のベクターの割合が得られるということがわかる。IL−2がPBS中に単独で存在しているか又は質量比が比較的低い場合、溶液状態で利用可能なIL−2は比較的少なくなる。
【0070】
従って、これらの結果は、ベクターが、IL−2を安定化させるため及び有効濃度の低下を妨げるためにアルブミンと同じ位効果的であることを示している。
【0071】
C.BVSMに対するIL−2の会合率の決定
メーカーの指示事項に従って、BiacoreX装置内のプラズモンの表面共鳴技術によりベクターに対するIL−2の会合率を決定する。この方法から、単色偏光での照明により、検出用チップと接触状態にある溶液の表面層の屈折率の差を検出することが可能になる。
【0072】
作業プロトコルは、以下の通りである:
− 検出用チップの表面上にBVSM(0.05g/l)を吸着させる;
− 注入したタンパク質の濃度の関数である標準曲線(共鳴単位RUとして表わされている)を決定するべく遊離IL−2(1〜6mg/ml)を注入する;
− 再生後、BVSM−IL2ならびに遊離IL−2が中に存在する、実施例1.Aで調製されたような調製物を注入する。この遊離IL−2のみが検出用チップの表面に固定されたBVSMに会合することができる。
【0073】
このプロトコルは、実施例1.Aの製剤中の遊離IL−2濃度を決定し、BVSMの会合率を推定できるようにする。
【0074】
図2のデータから、前記会合率が85%であることを計算することができる。
【0075】
(2)異なるベクターに会合したIL−2の生物活性の分析
この例は、IL−2の生物活性に対するベクターの層及び核の組成の重要性を示している。
【0076】
次のような4つの異なるタイプのベクターが利用される:
a.ホスホリポン/コレステロール(PPLpon/Chol)混合物、又は、
b.DPPC/コレステロール(P DPPC/Chol又はPY)混合物、
を含有する脂質層と共にアニオンコアを有する2つのベクター、
c.ホスホリポン/コレステロール(QAE PLpon/Chol)混合物又は、
d.DPPC/コレステロール(QAE DPPC/Chol又はKY)混合物、を含有する膜及びカチオンコアを有する2つのベクター。
【0077】
IL−2は1/10という質量比で、BVSMに添加される。
【0078】
3Hでマーキングされたチミジンの取込みによって計算される血中単核細胞の増殖を測定することにより、異なるBVSMに会合したIL−2の生物活性を評価する。これらの細胞は、IL−2に対する強い親和性を有するレセプタCD25の発現を誘発する化合物(PHA)によって、予め刺激されている。
【0079】
全てのBVSMによって、in vitroでは処方されていない対照IL−2と同等の活性を得ることが可能であり、BVSM QAE DPPC/Chol はこの生物活性を改善しさえする、ということがわかる(図3)。
【0080】
(3)IL−2調製物の安定性の研究
溶解状態のIL−2調製物は一般に、4℃の溶解状態ではIL−2がその生物活性を失なうことから安定していない。
【0081】
マウスCTLL−2細胞中の3Hでマーキングされたチミジンの取込みによって測定されるように、新鮮なIL−2の95%の生物活性が維持されることから、4℃で2ヵ月間の保管後、BVSM−IL2(QAE/DPPC/Chol)調製物は安定した状態にとどまる。
【0082】
(4)in vivo テスト、TS/A腫瘍
TS/A腫瘍(非免疫原性で未分化の乳腺癌)モデル、腫瘍移植拒絶モデル又は予め移植された腫瘍の治療モデルにおける、BVSM−IL2の活性(KY/IL2、質量比10/1)をテストした。
【0083】
A.腫瘍移植の拒絶
A.1.同じ脇腹内への同時投与
図4に示されたIL−2濃度に対応するBVSM−IL2(KY/IL−2)と共に、皮下(s.c.)経由で雌のマウスBALB/cに対し5・104個の腫瘍細胞を同時投与する。対照として、単独のベクター又は処方されていないIL−2、又は単純なPBSも投与する。腫瘍の移植及びそのサイズの推移を測定する。
【0084】
図4は、腫瘍細胞の移植及びベクター単独又はIL−2単独の投与後に腫瘍の成長が存在する一方で、ベクターKYと共に処方されたIL−2は腫瘍成長を遅延させることができるということを、明確に示している。
【0085】
A.2.対側投与
対側脇腹内に、図5に示されたIL−2濃度に対応するKY/IL−2と共に、s.c.経由でBALB/cマウスに対し5・104個のTS/A腫瘍細胞を投与する。対照としてPBS又は処方されていないIL−2を投与する。
【0086】
図5は、ベクターに複合されたIL−2の対側投与が腫瘍成長の減少を可能にすることを示しており、これは、たとえ100倍多い用量で利用されても処方されていないIL−2の場合には観察できない結果である。
【0087】
B.移植された腫瘍に対する治療及び保護効果:皮下投与
B.1.治療効果
1グループにつき10匹のマウスに対し5・104個のTS/A細胞をs.c.投与してから6日後に、対側脇腹内にs.c.経由でKY/IL−2を投与する。1つの部位(5・103単位のIL−2)又は、注入用量を一部位につき1・103単位として5カ所の全く異なる部位への投与を行う。
【0088】
かかるモデルにおいては、腫瘍は移植されたものであり、手で触れることができる(約40mmの表面)。腫瘍のサイズの増大を評価する。図6Aは、ベクターに複合されたIL−2が、IL−2単独よりも大幅に腫瘍成長を減速させることができるということを示している。なお、多数の部位への少用量注入の方が、唯一の部位へ大用量注入よりも効果が高いと思われる。
【0089】
唯一の部位にKY/IL−2の投与を受けた10匹のマウスのうち3匹は、30日後に検出可能な腫瘍を示さず、一方、5カ所の部位でKY/IL−2の投与を受けた10匹のうち6匹のマウスも同じく、検出可能な腫瘍を示していない。これら9匹の動物は、その後腫瘍を再発することもない。
【0090】
B.2.保護効果
IL−2の投与から46日後に腫瘍を示さなくなった前述の9匹のマウスに対し、再び25・104個のTS/A細胞を注入する。対照としてナイーブマウスを利用する。
【0091】
図6Bは、KY/IL−2の予備投与により、新しい抗原投与から部分的に動物を保護することができるということを示している。実際、9匹のうち4匹のマウスが腫瘍を発生せず、その他の動物においては、ナイーブ動物に比べ腫瘍発生が減速する。
【0092】
C.移植された腫瘍に対する治療及び保護効果: 鼻腔内投与
C.1.治療効果
5・104個のTS/A細胞を1グループにつき10匹のマウスにs.c.投与してから6日目に開始して、5日間、鼻腔内経路でKY/IL−2を投与する。1日あたり1回又は2回の投与を行なう。利用された対照は、IL−2単独(1日2回投与)、ベクター単独又はPBSである。
【0093】
かかるモデルにおいては、腫瘍は移植されたものであり、手で触れることができる(約40mmの表面)。腫瘍のサイズの増大を評価する。図7Aは、ベクターに複合されたIL−2が、IL−2単独よりも大幅に腫瘍成長を減速させることができるということを示している。なお、投与回数が観察結果に差異をもたらすとは思われない。
【0094】
1日1回鼻腔内でKY/IL−2の投与を受けた10匹のマウスのうち4匹は、35日後に検出可能な腫瘍を示さず、一方、1日2回KY/IL−2の投与を受けた10匹のうち6匹のマウスも同じく、検出可能な腫瘍を示していない。これら10匹の動物は、その後腫瘍を再発することもない。
【0095】
C.2.保護効果
IL−2の投与から48日後に腫瘍を示さなくなった前述の10匹のマウスに対し、再び25・104個のTS/A細胞を注入する。対照としてナイーブマウスを利用する。
【0096】
図7Bは、KY/IL−2の予備投与により、新しい抗原投与から部分的に動物を保護することができるということを示している。実際、10匹のうち4匹のマウスが腫瘍を発生せず、その他の動物においては、ナイーブ動物に比べ腫瘍発生が減速する。
【0097】
(5)CTLの誘発
移植された腫瘍を拒絶しより大用量での新たな抗原投与の後に腫瘍を再発しなかった、皮下(75日後)又は鼻腔内(79日後)経由で処置された4匹のマウスの脾臓を分離する(第4.B及び4.C項)。
【0098】
6日間TS/A細胞を用いてin vitroで脾臓を刺激し、TS/A細胞に対するCTL活性を研究する。
【0099】
皮下でKY/IL−2の投与を受けたマウスは、同系細胞WEHI164及び細胞YACが溶解されていないことから、TS/Aの特異的CTL活性を発現しない(図8A)ということがわかる。
【0100】
同様に、鼻腔内でKY/IL−2の投与を受けたマウスでも、特異的CTL活性が見られる。
【0101】
【実施例2】
異なるアジュバントのものに対する三価のインフルエンザスプリットの免疫原性に対するBVSMのマウスにおける効果及び三価のインフルエンザスプリットの免疫原性に対する製剤及び異なるアジュバントの同時投与の、マウスにおける効果
I.材料と方法
(1)材料
利用された動物は、Janvier飼育センタ(Route de Chenes−Sec−B.P.5−Le Genest−Saint−Isle)から入手した(研究当初、生後10週であった)雌のBALB/cJ/Rjマウスであり、研究を始める前に1かごあたり6匹の割合で7日間順化させる。
【0102】
(2)製品
a.BVSM TM
利用されるBVSMTMはKY:QAE=2mEq−DPPC/コレステロールタイプのものである。これは、グリシジルトリメチルアンモニウムによってグラフト化されDPPC/コレステロール層でとり囲まれた多糖核に対応する。このタイプのベクターは、EP687 173に記述されている。
【0103】
b.アジュバント
以下の4つのアジュバントが利用された:
− コレラ毒素のサブユニットB(CTB)(品番C9903、Sigma, St Quentin Fallavier, フランス)、
− モノホスフォリル、脂質A(MPL)(品番R−350、Ribi Immunochem Research, Inc, Hamilton, ミズーリ州)、
− 組換え型IL−2、プロロイキン活性16.3・106U/mg(Chiron France, Suresnes, フランス)
− オリゴヌクレオチドODN;5TCCATGACGTTCCTGAC′(Eurogentec, Bruxelles, ベルギー)
【0104】
c.3価インフルエンザスプリット
3価インフルエンザスプリット1mlあたり250μgのHA(83.3μg/菌株)溶液を、次の3つのBiochem Pharma(カナダ)の一価の卵スプリットを用いて調製する。
− B/Harbin7/94菌株から産生された1価の卵スプリット、
− A/Johannesburg 82/96菌株から産生された1価の卵スプリット、
− A/Nanchang933/95菌株から産生された1価の卵スプリット。
【0105】
これらのスプリットは、ウイルスタンパク質特にヘマグルチニン(HA)及び/イラミニダーゼの混合物で構成されている。
【0106】
d.製剤
− 抗原+BVSM TM 製剤
3価のインフルエンザスプリット1mlあたり250μgのHAの製剤(83.3μg/菌株)を、1/89に等しいHA/BVSM比 すなわち三価HA250μg/BVSM22.25mg/mlを得るべく上述の3つの1価卵スプリットを用いて調製する。
【0107】
この製剤は、各々の1価のスプリット1mlあたりHA250μg/BVSMTM22.25mgの3つの製剤を等体積で混合することによって得られる。
【0108】
− 抗原+BVSM TM +アジュバント製剤
抗原+BVSMTMの製剤から、アジュバントを伴うその他4つの製剤を調製した。これらの製剤は、アジュバントの存在下で及びアジュバントを添加することにより250μgのHA/mlで3価の製剤を希釈することによって得られる。希釈によって、免疫1回マウス1匹あたりの1価のHAの用量を1.2μg、つまり1mlあたり1価のHAが60μgに調整することができ、かつ希釈のために利用された体積中にアジュバントを追加することができる。
【0109】
e.対照
次の3つのタイプの対照を調整した:
− 1価の各スプリット1mlあたりHA250μgの3つの溶液を等体積で混合することにより調製された以下AS及びANと呼称される3価のスプリットの対照、
− 3価のスプリット+アジュバントの対照、
− ナイーブ対照(PBS 0.22X)。
【0110】
皮下(AS)又は鼻腔内(AN)投与経路に応じて、3価スプリット溶液をそれぞれリン酸緩衝液又は精製水で調製する。
【0111】
(3)方法
以下のスキーマに従って0日目と21日目に異なる処方(アジュバント±BVSM±Ag)を投与する:
【0112】
免疫原性は、35日目の追加免疫の後に評価される:
− 血清レベルでは、各1価スプリットの特異的IgGのELISAによる検出、
− 粘度レべルでは、鼻腔分泌物及び/又は膣分泌物中の各1価スプリットの特異的IgAのELISAによる検出。
【0113】
a.マウスの免疫化
− 投与
処方(BVSM±Adj±Ag)の投与は、麻酔せずにつまり以下の経路で実施される:
・ 皮下:対照について、背中のレベルで1ml入り注射器を用いて100μl、
・ 鼻腔:テスト対象の標本及び対照については、10μlのマイクロピペットを用いて20μl(10μl/鼻孔)
【0114】
各グループについて、免疫化には、同じ様式に従って実施される0日目及び21日目の2回の投与が含まれる。
【0115】
− 採血
0日目(対照)と35日目に、眼窩後静脈で約0.3mlの採血を行なう。
【0116】
血塊の形成及び遠心分離の後、利用するまで血清を−20℃に凍結させる。
【0117】
・ 鼻腔分泌物の採取
鼻腔洗浄は、鼻腔タービンの方向で気管内に導入されたリン酸緩衝液−BSA 1% 500μlを用いて実施される。かくして、作業は同じPBS−BSA 1%を用いて3度くり返される。鼻腔採取物は−20℃でエッペンドルフ管の中に保存される。鼻腔分泌物を35日目に回収する。
【0118】
b.採取物の分析
血清及び鼻腔分泌物の分析は、ELISAテストによって実施される。簡単に言うと、マイクロプレート(Nunc, Immunoplate maxisorb, polylabo)をインフルエンザのワクチン(炭酸塩緩衝液pH9.6中でウェルあたりHA100ng、2時間37℃)でコーティングする。洗浄(PBS−tween 緩衝液pH7.6で3回)及びウェルあたり250μlのPBS−BSA3%溶液による飽和(1時間37℃)の後、一連の血清又は鼻腔分泌物を37℃で一時間インキュベートし、PBS−tween pH7.6溶液で新たに洗い流す。洗浄(3回)の後、ペルオキシダーゼにカップリングされたマウス抗IgG(品番A4416 Sigma)又はマウス抗IgA(品番A4789 Sigma)によって検出する。最後の洗浄段階(5回)の後、OPD基質を添加する(品番P8287、Sigma, 5mlの顕示用緩衝液+50μlのH2O2中糖衣錠1個、100μl/ウェル)。37℃で30分のインキュベーション後、塩酸1N(品番30024−290、Prolabo)を添加し(50μl/ウェル)、490nmでの吸光度を測定する。0.1のDOを得ることのできる希釈度の逆数として力価が定義づけられる。
【0119】
II.BVSM TM /アジュバント/インフルエンザ製剤の調製様式の影響
BVSM/アジュバント/インフルエンザ製剤の最も優れた調製様式を評価するべく、表面プラズモン共鳴(RPS)BiacoreX(Pharmacia Biosensor Inc.)を利用することにより、アジュバント(CTB又はMPL)の存在下で、BVSM上のインフルエンザスプリットの会合を研究する。この研究では、BVSMの懸濁液(0.3倍のPBS 1mlあたり50μg)20μlを疎水性センサーチップ(HPA、Biacore, BR−1000−30)上に毎分5μlで導入する。
【0120】
図9は、CTBの濃度{PBS45mM中 1)2.5μg/ml; 2)25μg/ml; 3)250μg/ml}(これは0.3倍に対応する)に応じたHPAセンサーチップ上に固定化されたBVSM及びCTBの会合によって得られるセンサーグラムを示す。
【0121】
図10は、MPLの濃度{PBS45mM中、 1)1.56μg/ml; 2)3.125μg/ml; 3)6.25μg/ml; 4)12.5μg/ml; 5)25μg/ml; 6)50μg/ml}に応じたHPAセンサーチップ上に固定化されたBVSM及びMPLの会合によって得られるセンサーグラムを示す。
【0122】
CTB及びMPLの両方のケースにおいて、得られたセンサーグラムは、BVSM及びアジュバントの会合能力を確認するものである。
【0123】
このとき、BVSM/アジュバント/インフルエンザスプリットの製剤の調製様式を検討する。以下の2つの方法が利用される。
【0124】
第1の方法では、インフルエンザスプリットの添加前に、アジュバント溶液が導入される。
【0125】
第2の方法では、インフルエンザスプリットは、アジュバントの添加前に導入される。
【0126】
図11は、B Harbinスプリットの場合における結果をまとめたものである。可変量のCTBが、固定化されたBVSM上に導入される{PBS45mM中l、1)CTB無し; 2)2.5Mg/ml; 3)25μg/ml; 4)250μg/ml}。次に、25μg/mlのB Harbin 1価スプリットが、アジュバントの加わったBVSM上に被着させられる。CTBがスプリットの前に添加された場合、BVSM上のスプリットの会合が阻害されるということが明確にわかる。
【0127】
同様にして、図12は、MPL及び B Harbin スプリットの場合に得られた結果をまとめている。可変量のMPLが、固定化されたBVSM上に導入される{PBS45mM中、 1)1.56μg/ml; 2)3.12μg/ml; 3)6.25μg/ml; 4)12.5μg/ml; 5)25μg/ml; 6)50μg/ml}。次に、25μg/mlのスプリットが、アジュバントの加わったBVSM上に被着させられる。CTBの場合と同様に、MPLの量に比例してアジュバントがスプリットの前に添加された場合、BVSM上のスプリットの会合の阻害が存在する。
【0128】
図13は、CTBの場合の2つの調製様式を比較することによって得られたセンサーグラムを表わしている。Aでは、固定化されたBVSM上にCTBが添加され、次に1価のスプリットが導入される。
【0129】
Bでは、1価のスプリットは、固定化されたBVSM上に添加され、その後CTBが導入される。
【0130】
抗原がCTBの前に添加された場合、BVSM上のスプリットのこの会合の低下が存在するということがわかる。逆に、CTBがスプリットの後に添加された場合、BVSMは、CTBに対応する補足的量の材料の会合を可能にする。かくして、「キャリヤ抗原」としてのBVSMの役割を保つためには、BVSM/スプリット製剤上にCTBを添加する調製様式を維持することが重要である。
【0131】
同様にして、図14は、MPLの場合の2つの調製様式を比較することによって得られるセンサーグラムを表わしている。
【0132】
Aでは、MPLはスプリットの前に添加されている。Bではそれが逆になっている。
【0133】
抗原がMPLの前に添加される場合、スプリット/BVSM会合の有意な修飾は存在しないが、BVSMは、MPLに対応する補足的量の材料を会合できるようにする。
【0134】
従って、
− アジュバントがBVSM/抗原製剤上に添加される、
− 「キャリヤ抗原」としてのBVSMの役割が保たれる、
ようなアジュバント追加された製剤の調製様式を規定することが可能であると思われる。
【0135】
III.BVSM/インフルエンザ製剤の免疫学的応答に対するCTBの効果 (1)プロトコル
「材料及び方法」の部分で言及された通りに抗原製剤+BVSMTMを調製する。
【0136】
250μgのHA(83μg/菌株)/mlで三価のSplit をもたらすBVSMTMの不在下の同一条件下で、対照を実現する。
【0137】
アジュバントを含む製剤及び対応する対照を得るべく、これらの調製物の各々に対し、CTB溶液を添加する。
【0138】
36匹の雌BALB/cJ/Rjマウス(研究当初で生後10週間)を、1グループあたり6匹のマウスの割合で6つのグループに分割する。各グループについて、前述のように処置を施する。下表1は、各グループの処置をまとめたものである。
【0139】
【表1】
【0140】
各グループについて、「材料と方法」の部分で指示されている通り採血及び鼻腔分泌物の採取及びそれらの分析を実施する。
【0141】
(2)結果
図15は、マウスの血清(IgG)及び鼻腔分泌物(IgA)のプールのスプリットB/Harbin特異的滴定で得られた結果をまとめたものである。この図は、異なる対照に対しCTB(F−CTB)を含有する三価の製剤の結果を比較できるようにしている。これらの対照は、抗原単独の対照、又はCTBに会合された抗原の対照、又は基準製剤(HA/BVSM比;1/89)である。これらの結果は、スプリットB/Harbin及びA/Nanchangに対する個々の応答の分析によって確認された。
【0142】
予期した通り、基準製剤(FA)は、皮下投与(AS)された単独の抗原対照と等価のGタイプの抗体率及び鼻腔内投与(AN)(22.4倍)された単独の対照より高いIgG率を誘発する。
【0143】
鼻腔投与されたCTBに会合された抗原(ACTB)の対照は、同じ経路により投与された遊離抗原よりもはるかに高いIgGを誘発する(22.4倍の増大)。同時にこれらの製剤(Ag+CTB)(ACTB)は、強い粘膜免疫を誘発する。
【0144】
アジュバントCTB(FCTB)に会合した製剤は、基準製剤(FA)及びその基準対照(ACTB)よりもはるかに高い特異的IgG応答を誘発する。このアジュバントについては、CTBとBVSMTMの間に大きな相乗効果が存在し、かくして得られた血清IgG率は、基準製剤FAに比べ3.7倍となる。逆に、CTBの重大な粘膜アジュバント活性の存在下では、確実に生物学的応答の飽和作用を伴って、この段階でこのタイプのアジュバント及びBVSMTMについてのIgA応答の相乗作用の潜在性を定義することは困難である。
【0145】
IV.BVSM TM /インフルエンザ製剤の免疫学的応答についてのMPLの効果
(1)プロトコル
インフルエンザスプリット1mlにつき250μgのHA/ml(83.3μg/菌株)で、三価の製剤及び対応する対照を調製する。
【0146】
アジュバントを含む製剤及び対応する対照を得るべく、これらの調製物の各々に対し、MPL溶液を添加する。
【0147】
36匹の雌BALB/cJ/Rjマウス(研究当初で生後10週間)を、1グループあたり6匹のマウスの割合で6つのグループに分割する。各グループについて、「材料及び方法」の部分に記述されている通りに処置を施す。下表2は、各グループの処置をまとめたものである。
【0148】
【表2】
【0149】
各グループについて、方法の部分で記述されている通り採血及び鼻腔分泌物の採取を実施する。
【0150】
ELISAテストにより、血清及び鼻腔分泌物の分析を実施する。
【0151】
(2)結果
図16は、MPLによりアジュバント付加された製剤が投与されたマウスの血清(IgG)及びマウスの鼻腔分泌物(IgA)のプールのスプリットB/Harbin特異的滴定で得られた結果をまとめたものである。これらの結果は、スプリットB/Harbin及びA/Nanchangに対する個々の応答の分析によって確認された。
【0152】
MPL又はBVSMTMに会合されたインフルエンザウイルススプリットは、同じ経路により投与された遊離抗原よりもはるかに高い血清IgGを誘発する(それぞれ22.4倍及び7.3倍の増大)。同時にこれらの製剤は、強い粘膜免疫を誘発する。
【0153】
アジュバントMPLに会合した製剤は、基準製剤(FA)に類似した特異的IgG応答を誘発する。逆にこのアジュバントについては、MPLとBVSMTMの間に大きな相乗効果が存在する。かくして、得られたIgA率は、基準製剤(Ag/BVSM)に比べて2.7倍となる。かくして、IgG応答とは逆に、粘膜応答についてMPLとBVSMTMにの間に強い相乗作用潜在性を実証することができる。
【0154】
V.BVSM/インフルエンザ製剤の免疫学的応答についてのオリゴヌクレオチドの効果
(1)プロトコル
インフルエンザスプリット1mlにつき250μgのHA/ml(83.3μg/菌株)で、三価の製剤及び対応する対照を調製する。
【0155】
アジュバントを含む製剤及び対応する対照を得るべく、これらの調製物の各々に対し、オリゴヌクレオチド(ODN)溶液を添加する。
【0156】
42匹の雌BALB/cJ/Rjマウス(研究当初で生後10週間)を、1グループあたり6匹のマウスの割合で7つのグループに分割する。各グループについて、「材料及び方法」の部分に記述されている通りに処置を施す。下表3は、各グループの処置をまとめたものである。
【0157】
【表3】
【0158】
各グループについて、方法の部分で指示されている通り採血及び鼻腔分泌物の採取を実施する。
【0159】
ELISAテストにより、結成及び鼻腔分泌物の分析を実施する。
【0160】
(2)結果
図17は、オリゴヌクレオチドによりアジュバント付加された製剤が投与されたマウスの血清(IgG)及びマウスの鼻腔分泌物(IgA)のプールのスプリットB/Harbin特異的滴定で得られた結果をまとめたものである。これらの結果は、スプリットB/Harbin及びA/Nanchangに対する個々の応答の分析によって確認された。
【0161】
鼻腔投与されたODN又はBVSMTMに会合されたインフルエンザウイルススプリットは、同じ経路により投与された遊離抗原よりもはるかに高い血清IgGを誘発する(それぞれ22.4倍及び7.3倍の増大)。同時にこれらの製剤は、強い粘膜免疫を誘発する。
【0162】
アジュバントODNに会合した製剤は、基準製剤(FA)及びその基準対照(Ag+ODN)よりも高いIgG応答を誘発する。このアジュバントについては、製剤について得られたIgG力価が、抗原+ODN1(AODN1)について及び基準製剤(Ag+BVSMTM)(FA)について得られた応答の合計に等しいことから、応答の相加性が存在すると思われる。
【0163】
VI.BVSM/インフルエンザ製剤のアジュバント添加によるIgG2a/IgG1バランスの修飾
(1)プロトコル
インフルエンザスプリット1mlにつき250μgのHA/ml(83.3μg/菌株)で、三価の製剤及び対応する対照を調製する。3価の製剤から、以下の3つのアジュバント入り製剤を得る:
− BVSMTM/Ag/CTB:CTB溶液を3価の製剤上に添加することによる、
− BVSMTM/Ag/IL2:組換え型IL−2溶液を3価の製剤上に添加することによる、
− BVSMTM/Ag/MPL:MPL溶液を3価の製剤上に添加することによる。
【0164】
54匹の雌BALB/cJ/Rjマウス(研究当初で生後10週間)を、1グループあたり6匹のマウスの割合で9つのグループに分割する。各グループについて、「材料及び方法」の部分に記述されている通りに処置及び採取を行う。
【0165】
下表4は、これらの処置をまとめたものである。
【0166】
【表4】
【0167】
マウス抗IgG2a又はマウス抗IgG1を利用して、前述の通りにELISAテストにより血清の分析を実施する。
【0168】
(2)結果
下表5は、鼻腔内投与後のアジュバント付与された異なる製剤BVSMTM/インフルエンザ及び対応する対照のガンマグロブリン亜型(IgG2a及びIgG1)に関して得られた結果をまとめている。皮下投与された遊離抗原に比べ、鼻腔投与された製剤BVSMTM/インフルエンザは、特異的IgG2a産生のわずかな増大しか誘発しない。
【0169】
これに比較して、製剤Ag/BVSMTMに対してCTBを付加すると、Ig2a産生の著しい増加が誘発される(Ag s.cに対してIg2a/IgG1指数が5.4倍)。なお、抗原に対するCTBの会合によって得られた結果から、このTh1/Th2バランスの修飾を予想することはできないという点に留意することが重要である。実際、この対照グループでは、Ig2a/IgG1指数の低下が存在する。
【0170】
【表5】
【0171】
逆に、インフルエンザスプリットに会合された場合にIgG2a産生に有利に作用する(指数がAg s.cについての6.7に対し47.6の)MPLは、製剤Ag/BVSMTMとの会合後、Th1/Th2のわずかな修飾しかひき起こさない。
【0172】
最終的に、IgG2a/Ig1指数の低下に基づいて視覚化可能であるように、製剤Ag/BVSMTMに対するIL2の会合は、Th1/Th2バランスを修飾することを可能にする。
【0173】
かくして、免疫学的応答の量的修飾が不在である場合でも抗原/BVSMTM製剤に対するアジュバントの会合は、免疫学的応答の質的修飾を誘発できるようにする。この会合は、利用されるアジュバントの正しい選択により、提案されたワクチン戦略にTh1/Th2バランスを適合させることを可能にするはずである。
【図面の簡単な説明】
− 実施例1で参照指示されている図:
【図1】
特に有利なタンパク質とベクターの間の最適な質量比を計算することを可能にするBVSM−IL2相互作用のELISA分析。値は、任意単位(UA)で与えられている。
【図2】
Biacore(登録商標)装置上でのBVSM−IL2の分析。遊離IL−2組成物とBVSM−IL2組成物の間の屈折の比較。値は、屈折単位(RU)で与えられる。
【図3】
PHA及びさまざまな組成のBVSM−IL2によって予め刺激された末梢単核細胞の増殖。増殖は、3Hによりマーキングされたチミジンの取込みによって測定され、読取られた毎分ストローク数(cpm)に正比例する。
【図4】
同時投与後のTS/Aモデル内の腫瘍の移植及び成長に対する異なるIL−2製剤の効果。記号は、以下のものを表わしている: PBS、食塩水緩衝液; IL−2、処方されていないインタロイキン2; KY−カチオンコア及びDPPC/コレステロール層をもつベクター; KY/IL−2、IL−2を伴って処方されたKYベクター
【図5】
BALB/cマウスの対側脇腹内への投与の後の、TS/Aモデル内の腫瘍の移植及び成長に対する、異なるIL−2製剤の効果。記号は、前述のものと同じであり、指示された数値は、IL−2のUI値に対応する。
【図6】
A.移植後6日目の1つ又は5つの部位におけるBALB/cマウスの対側脇腹内のKY/IL−2の皮下投与による移植TS/A腫瘍の拒絶特性。記号は、前述のものと同じであり、指示された数値は、IL−2の値UIに対応する。B.腫瘍細胞TS/Aの再注入後の治癒したマウスの防御。2つの図において、腫瘍を呈するマウスの数がカッコ内に指示されている。
【図7】
A.移植から6日後に5日間、1日に1〜2回BALB/cマウスの対側脇腹内にKY/IL−2の鼻腔内投与による移植TS/A腫瘍の拒絶特性。記号は、前述のものと同じであり指示された数値は、IL−2のUI値に対応している。B.腫瘍細胞TS/Aの再注入後の治癒したマウスの防御。2つの図において、腫瘍を呈するマウスの数がカッコ内に指示されている。
【図8】
KY/IL−2の投与後の、TS/A細胞を拒絶したマウスにおける抗腫瘍CTL活性。A.皮下投与を受けたマウス、B.鼻腔内投与を受けたマウス。
− 実施例2で参照指示されている図:
【図9】
CTB濃度に応じたBVSMTMとCTBの会合のBiacoreでの分析(表面プラズモン共鳴)。
【図10】
MPL濃度に応じたBVSMTMとMPLの会合のBiacoreでの分析。
【図11】
増大した量のCTBの存在下でのBVSM上のB Harbinスプリットの会合の阻害。
【図12】
増大した量のMPLの存在下でのBVSM上のB Harbinスプリットの会合の阻害。
【図13】
センサーチップHPA上に固定化されたBVSM上のインフルエンザ抗原及びCTBの2つの調製様式を比較することによって得られたセンサーグラム。当初はCTBそして次に抗原が連続してBVSM上に(曲線A)、及び逆順序で(曲線B)被着される。
【図14】
センサーチップHPA上に固定化されたBVSM上のインフルエンザ抗原及びMPLの2つの調製様式を比較することによって得られたセンサーグラム。当初はMPLそして次に抗原が連続してBVSM上に(曲線A)、及び逆順序で(曲線B)被着される。
【図15】
CTBに会合された又はされていない抗原対照及び3価の製剤による投与を受けたマウスの血清(IgG)及び鼻腔分泌物(IgA)のB/Harbinスプリットの特異的滴定。
【図16】
MPLに会合された又はされていない抗原対照及び3価の製剤による投与を受けたマウスの血清(IgG)及び鼻腔分泌物(IgA)のB/Harbinスプリットの特異的滴定。
【図17】
オリゴヌクレオチドに会合された又はされていない抗原対照及び3価の製剤による投与を受けたマウスの血清(IgG)及び鼻腔分泌物(IgA)のB/Harbinスプリットの特異的滴定。
Claims (51)
- 癌及び/又はウイルス性疾患の治療を目的とした1つの医薬品の調製を目的とした、液体でない親水性核を有するタイプのベクターの利用において、前記ベクターが該医薬品中で、免疫応答を調節する能力をもつ抗原以外の少なくとも1つの物質と結びつけられている利用。
- ベクターが、非液体親水性核並びに疎水性相互作用及び/又はイオン結合により核に結びつけられ両親媒性化合物で少なくとも部分的に構成されている外部層を含むタイプのものであることを特徴とする請求項1に記載の利用。
- 非液体親水性核が、イオンリガンドが上にグラフト化された自然に又は化学的に網状化したオリゴ糖又は多糖類マトリクスで構成されていることを特徴とする請求項1〜2のいずれか1項に記載の利用。
- イオンリガンドが正の電荷をもつことを特徴とする請求項3に記載の利用。
- 正の電荷をもつイオンリガンドが第4アンモニウムであることを特徴とする請求項4に記載の利用。
- 外部層が、ジパルミトイルホスファチジルコリン(DDPC)及びコレステロールで形成されていることを特徴とする請求項2〜5のいずれか1項に記載のベクターの利用。
- DPPCとコレステロールの質量比が70/30であることを特徴とする請求項6に記載の利用。
- 物質とベクターの重量比が約1%〜20%、好ましくは約5%〜10%の間に含まれていることを特徴とする請求項1〜7のいずれか1項に記載の利用。
- 免疫応答を調節する能力をもつ、抗原以外の物質が、免疫系の機能において1つの役割を果たす治療上有利なタンパク質、アジュバント又は、Th1/Th2バランスを修飾する能力をもつ物質、又はこれらの混合物であることを特徴とする請求項1〜8のいずれか1項に記載の利用。
- 治療上有利なタンパク質が、好ましくはインタロイキン、インタフェロン、TNF、TGF、G−CSF、GM−CSF、MIF、RANTES又はこれらの混合物を含むグループの中から選択されるサイトカイン又はケモカインであることを特徴とする請求項9に記載の利用。
- 治療上有利なタンパク質がインタロイキン2であることを特徴とする請求項10に記載の利用。
- アジュバントが、細菌腸毒素、リポ糖類誘導体、オリゴヌクレオチド、サポニン誘導体、アンモニウム塩及びその誘導体、DT又はTTタイプのタンパク質又はそれらの混合物を含むグループの中から選択されることを特徴とする請求項9に記載の利用。
- 治療対象の癌が、免疫原性でない又は免疫原性の低いタイプのものであることを特徴とする請求項1〜12のいずれか1項に記載のベクターの利用。
- 医薬品が、経鼻又は経口投与を目的とするものであることを特徴とする請求項1〜13のいずれか1項に記載の利用。
- (a)正の電荷又は負の電荷のイオンリガンドが上にグラフト化されている、自然に又は化学的に網状化された多糖類又はオリゴ糖基質で構成された非液体親水性核、及び
(b)疎水性相互反応及び/又はイオン結合によって核に結びつけられた両親媒性化合物で少なくとも部分的に構成された外部層、
を含み
(c)IL−2を取込んでいる、
ベクターの、アルブミンの不在下において注入可能な形でIL−2を投与するための医薬品の調製を目的とした利用。 - 免疫応答を調節する能力をもつ、抗原以外の物質の免疫調節特性を改善するための方法において、非液体親水性核を有するタイプのベクターと前記物質の混合物を含むことを特徴とする、方法。
- ベクターが、非液体親水性核並びに疎水性相互作用及び/又はイオン結合により核に結びつけられ両親媒性化合物で少なくとも部分的に構成されている外部層を含むタイプのものであることを特徴とする請求項16に記載の方法。
- 非液体親水性核が、イオンリガンドが上にグラフト化された自然に又は化学的に網状化したオリゴ糖又は多糖類マトリクスで構成されていることを特徴とする請求項16又は17のいずれか1項に記載の方法。
- イオンリガンドが正の電荷をもつことを特徴とする請求項18に記載の方法。
- 正の電荷をもつイオンリガンドが第4アンモニウムであることを特徴とする請求項19に記載の方法。
- 外部層が、ジパルミトイルホスファチジルコリン(DDPC)及びコレステロールで形成されていることを特徴とする請求項17〜20のいずれか1項に記載の方法。
- DPPCとコレステロールの質量比が70/30であることを特徴とする請求項21に記載の方法。
- 物質とベクターの重量比が約1%〜20%、好ましくは約5%〜10%の間に含まれていることを特徴とする請求項16〜22のいずれか1項に記載の方法。
- 免疫応答を調節する能力をもつ、抗原以外の物質が、免疫系の機能において1つの役割を果たす治療上有利なタンパク質であることを特徴とする請求項16〜23のいずれか1項に記載の方法。
- 治療上有利なタンパク質が、好ましくはインタロイキン、インタフェロン、TNF、TGF、G−CSF、GM−CSF、MIF、RANTES又はこれらの混合物を含むグループの中から選択されるサイトカイン又はケモカインであることを特徴とする請求項24に記載の方法。
- 免疫応答を調節する能力をもつ、抗原以外の物質がアジュバントであることを特徴とする請求項16〜23のいずれか1項に記載の方法。
- アジュバントが、細菌腸毒素、リポ糖類誘導体、オリゴヌクレオチド、サポニン、アンモニウム塩及びその誘導体、DT又はTTタイプのタンパク質又はそれらの混合物を含むグループの中から選択されることを特徴とする請求項26に記載の方法。
- 免疫応答を調節する能力をもつ、抗原以外の物質が、Th1/Th2バランスを修飾する能力をもつ物質であることを特徴とする請求項16〜23のいずれか1項に記載の方法。
- 免疫応答を調節する能力をもつ、抗原以外の物質が、免疫抑制剤であることを特徴とする請求項16〜23のいずれか1項に記載の方法。
- − イオンリガンドが上にグラフト化された自然に又は化学的に網状化したオリゴ糖又は多糖類マトリクスで構成された非液体親水性核そして場合によっては、疎水性相互作用及び/又はイオン結合により核に結びつけられ両親媒性化合物で少なくとも部分的に構成されている外部層を含むタイプのベクター、及び
− 少なくとも1つの治療上の有利なタンパク質、及び/又はアジュバント及び/又はTh1/Th2バランスを修飾する能力をもつ物質、
を含むことを特徴とする薬学組成物。 - 外部層が、ジパルミトイルホスファチジルコリン(DDPC)及びコレステロールで形成されていることを特徴とする請求項30に記載の薬学組成物。
- 物質とベクターの重量比が約1%〜20%、好ましくは約5%〜10%の間に含まれていることを特徴とする請求項30又は31のいずれか1項に記載の薬学組成物。
- 治療上有利なタンパク質が、好ましくはインタロイキン、インタフェロン、TNF、TGF、G−CSF、GM−CSF、MIF、RANTES又はこれらの混合物を含むグループの中から選択されるサイトカイン又はケモカインであることを特徴とする請求項30〜32のいずれか1項に記載の薬学組成物。
- 治療上有利なタンパク質がインタロイキン2であることを特徴とする請求項33に記載の薬学組成物。
- アジュバントが、細菌腸毒素、リポ糖類誘導体、オリゴヌクレオチド、サポニン誘導体、アンモニウム塩及びその誘導体、DT又はTTタイプのタンパク質又はそれらの混合物を含むグループの中から選択されることを特徴とする請求項30〜32のいずれか1項に記載の薬学組成物。
- ワクチン組成物の調製を目的とした、液体でない親水性核を有するタイプのベクターの利用において、前記ベクターが該組成物の中で、少なくとも1つの抗原及び該抗原に対する免疫学的応答を調節する能力をもつ少なくとも1つの物質と混合されている、利用。
- ベクターが、非液体親水性核並びに疎水性相互作用及び/又はイオン結合により核に結びつけられ両親媒性化合物で少なくとも部分的に構成されている外部層を含むタイプのものであることを特徴とする請求項36に記載の利用。
- 非液体親水性核が、イオンリガンドが上にグラフト化された自然に又は化学的に網状化したオリゴ糖又は多糖類マトリクスで構成されていることを特徴とする請求項36又は37のいずれか1項に記載の利用。
- イオンリガンドが正の電荷をもつことを特徴とする請求項38に記載の利用。
- 正の電荷をもつイオンリガンドが第4アンモニウムであることを特徴とする請求項39に記載の利用。
- 外部層が、ジパルミトイルホスファチジルコリン(DDPC)及びコレステロールで形成されていることを特徴とする請求項37〜40のいずれか1項に記載の利用。
- 物質とベクターの重量比が約1%〜20%、好ましくは約5%〜10%の間に含まれていることを特徴とする請求項36〜41のいずれか1項に記載の利用。
- 抗原の免疫学的応答を調節する能力をもつ物質が、アジュバント及び/又は、治療上有利なタンパク質及び/又は、Th1/Th2バランスを修飾する能力をもつ物質であることを特徴とする請求項36〜42のいずれか1項に記載の利用。
- アジュバントが、細菌腸毒素、サポニン誘導体、アンモニウム塩及びその誘導体、DT又はTTタイプのタンパク質サイトカイン、オリゴヌクレオチド又はそれらの混合物の中から選択されることを特徴とする請求項43に記載の利用。
- 治療上有利なタンパク質が、好ましくはインタロイキン、インタフェロン、TNF、TGF、G−CSF、GM−CSF、MIF、RANTES又はこれらの混合物を含むグループの中から選択されるサイトカイン又はケモカインであることを特徴とする請求項43に記載の利用。
- ウイルス疾患特にエイズ及び慢性肝炎又は癌の治療及び/又は予防のためのワクチン組成物の調製を目的とする、請求項36〜45のいずれか1項に記載の利用。
- − 抗原又は抗原混合物、
− イオンリガンドが上にグラフト化された自然に又は化学的に網状化したオリゴ糖又は多糖類マトリクスで構成された非液体親水性核そして場合によっては、疎水性相互作用及び/又はイオン結合により核に結びつけられ両親媒性化合物で少なくとも部分的に構成されている外部層を含むタイプのベクター、及び
− 前記抗原に対する免疫学的応答を調節する能力をもつ少なくとも1つの物質、
を含むことを特徴とするワクチン組成物。 - 外部層が、ジパルミトイルホスファチジルコリン(DDPC)及びコレステロールで形成されていることを特徴とする請求項47のいずれか1項に記載の薬学組成物。
- 抗原の免疫学的応答を調節する能力をもつ物質が、アジュバントおよび/又は、治療上有利なタンパク質及び/又は、Th1/Th2バランスを修飾する能力をもつ物質、又はこれらの混合物であることを特徴とする請求項47又は48のいずれか1項に記載のワクチン組成物。
- アジュバントが、細菌腸毒素、サポニン誘導体、アンモニウム塩及びその誘導体、DT又はTTタイプのタンパク質サイトカイン、オリゴヌクレオチド又はそれらの混合物の中から選択されることを特徴とする請求項49に記載のワクチン組成物。
- 治療上有利なタンパク質が、好ましくはインタロイキン、インタフェロン、TNF、TGF、G−CSF、GM−CSF、MIF、RANTES又はこれらの混合物を含むグループの中から選択されるサイトカイン又はケモカインであることを特徴とする請求項49に記載のワクチン組成物。
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