JP2004505248A - ポリペプチドの配列決定のための新しい方法及びキット - Google Patents
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Abstract
本開示は、ポリペプチドの配列決定を行うのに有用である方法及びキットを提供する。前記方法は、ポリペプチド又はそのペプチドのN末端の誘導体化を含む。前記方法はまた、リジンを含有するポリペプチド又はそのペプチドの側鎖のイプシロンアミノ基を誘導体化することも含む。1つ以上の誘導体化された検体の質量スペクトル分析によって、当業者に周知の技術を介して容易に解釈されるスペクトルが提供される。本開示はまた、前記方法の便利な性能を強化するキットも記載する。
Description
【0001】
(相互参照)
本出願は、2000年7月25日出願の米国仮出願第60/220,564号の利益を請求するものである。
(発明の分野)
本発明は、質量分析技術を用いてポリペプチドの配列決定を可能にする方法及びキットに関する。前記方法及び前記キットは、例えば、生物学分野、製薬分野、身体洗浄分野、及び布地洗浄分野において使用するための高分子量のポリペプチドを同定するのに特に有用である。
【0002】
(発明の背景)
高感度のペプチド及びポリペプチドの配列決定に適用するために、最近、マトリクス支援レーザー脱離イオン化(MALDI)質量分析法及びエレクトロスプレーイオン化が開発された。例えば、スペングラー(Spengler)らの、「マトリクス支援レーザー脱離質量分析法によるペプチド配列決定」ラピッドコミュニケーションズインマススペクトロメトリー(Rapid Communications in Mass Spectrometry)、第6巻の105〜108ページ(1992年);スペングラー(Spengler)らの「マトリクス支援レーザー脱離質量分析法におけるポストソース崩壊の基本的性状」ジャーナルオブフィジカルケミストリ(Journal of Physical Chemistry)、第96巻の9678〜9684ページ(1992年);コッフマン(Kaufmann)らの「マトリクス支援レーザー脱離イオン化を用いた反射飛行時間質量分析計におけるプロダクトイオン分析による線状ペプチドの質量分析配列決定」、ラピッドコミュニケーションズインマススペクトロメトリー、第7巻902〜910ページ(1993年);コッフマン(Kaufmann)らの「飛行時間質量分析計におけるペプチドの配列決定:マトリクス支援レーザー脱離イオン化(MALDI)後のポストソース崩壊の評価」、インターナショナルジャーナルオブマスススペクトロメトリー、アンドイオンプロセス(International Journal of Mass Spectrometry and Ion Processes)、第131巻355〜385ページ(1994年);コッフマン(Kaufmann)らの「マトリクス支援レーザー脱離/イオン化反射飛行時間質量分析法におけるポストソース崩壊及び遅延抽出」、ラピッドコミュニケーションズインマススペクトロメトリー第10巻1199〜1208ページ(1996年);及びスペングラー(Spengler)の「生体分子のマトリクス支援レーザー脱離/イオン化質量分析法におけるポストソース崩壊の分析」ジャーナルオブマススペクトロメトリー第32巻1019〜1036ページ(1997年);カール(Carr)らの「分析バイオテクノロジーにおける質量分析法の統合」、アナリティカルケミストリ(Analytical Chemistry)第63巻2802〜2824ページ(1991年);イエーツ(Yates)3世らの「MSによるゲノムの採掘」、アナリティカルケミストリ第68巻534A〜540Aページ(1996年);モリス(Morris)らの「新規の四重極/直交加速飛行時間質量分析計における高感度衝突活性化タンデム質量分析法」、ラピッドコミュニケーションズインマススペクトロメトリー第10巻889〜896ページ(1996年)を参照のこと。
【0003】
MALDIは、質量分析法の分野に幾つかの利点を提供している。例えば、MALDIは、従来のエレクトロスプレー三連四重極型装置よりも高い感度を提供する。飛行時間質量分析計と組み合わせて用いると、MALDIは、三連四重極型装置で分析することができるペプチドよりも大きな質量のペプチドに適用可能である。MALDIは、最低限の試料精製を行った複雑な混合物を分析するのにも有用である。一方、エレクトロスプレーイオン化は、液体クロマトグラフィー(LC)及び種々の型のキャピラリー電気泳動(CE)を含む強力な分離技法に容易に接続される。LC及びCEを試料の精製及び装置への導入に用いる場合、高度に自動化された分析が可能である。
【0004】
しかしながら、現在のMALDI及び、より少ない程度でエレクトロスプレーイオン化質量分析法は、予測可能なタンデム質量分析法のフラグメンテーションパターンを適切に提供することができない。例えば、複数のイオンシリーズ(a−イオン、b−イオン、及びy−イオンを含む)が通常観測され、その結果、MALDIのポストソース崩壊スペクトルが生じ、それは、効率的に解釈し、配列決定するには複雑すぎる。エレクトロスプレーイオン化により生じる多様に荷電した前駆体イオンから、複数のイオンシリーズ(b−及びy−イオン)に加えて内部フラグメント及び単一に荷電した及び多様に荷電したイオンの両方が形成され、その結果生じるタンデム質量スペクトルは新規で解釈するのは難しいことが多い。従って、フラグメンテーションに関連する問題は、質量分析法を用いてポリペプチドを迅速に配列決定する能力を制限している。その結果、質量分析法、及び特に、MALDI質量分析法はこの領域での価値が限定されている。
【0005】
幾つかの研究グループが、化学的な誘導体化技法を介してポリペプチドの配列決定の分野における質量分析法の有用性を改善しようと試みている。かかる技法は、感度を高め、生じるスペクトルの複雑さを減らすことを目指して、ペプチドのMSMSスペクトルにおいてフラグメンテーションを促進し、それを方向付けるのに利用されてきた。このような既知の技法のほとんどは、陽イオン系誘導体を提供している。例えば、キッドウエル(Kidwell)らの「二次イオン質量分析法によるペプチドの配列決定」、ジャーナルオブアメリカンケミカルソサエティ(Journal of the American Chemical Society)、第106巻2219〜2220ページ(1984年)(四級アンモニウム基による誘導体化、静電気SIMSイオン化法を用いた分析(MALDI及びエレクトロスプレーイオン化の双方が開発される前))を参照のこと。低エネルギー衝突活性化によるMALDI及びエレクトロスプレーイオン化を用いたかかる技法の適用は、一般に有効であるとは証明されていない。
【0006】
さらに最近、質量分析法を用いたペプチド/ポリペプチドの配列決定を強化するために、研究者はその他の誘導体化技法を利用している。例えば、トリプシンペプチド(トリプシンによる消化を介して作製したペプチド)に存在するシステイン残基の酸化が、エレクトロスプレータンデム質量分析法を用いたフラグメンテーションを改善する可能性があることが明らかにされている。例えば、ガスケル(Gaskell)らの「気相ペプチドイオンの低エネルギー分解におけるプロトン化の部位の役割」、ジャーナルオブザアメリカンソサエティオブマススペクトロメトリー(Journal of the American Society of Mass Spectrometry)第7巻522〜531ページ(1996年)及びガスケル(Gaskell)らの「プロトン化したペプチドの衝突活性化分解におけるシステイン酸酸化に対するシステインの影響:イオン内相互作用の証拠」、ジャーナルオブザアメリカンソサエティオブマススペクトロメトリー第3巻337〜344ページ(1992年)を参照のこと。
【0007】
具体的には、y−イオンのフラグメンテーションが促進された。しかしながら、この技法は幾つかの制限を有する。例えば、この技法は、MALDI法に拡張されなかった。その技法はまた、解析されるべき配列の中に存在するシステイン残基を有するポリペプチドの解析に制限される。実際、天然に生じるポリペプチドにはシステインはむしろ希にしか存在せず、この技法の有用性に重大な制限を与えている。
従って、簡便で、効率的で、そして野生型及び変異型のポリペプチドに広く適用可能である、ポリペプチドの配列決定を行う質量分析法を提供するというニーズがある。本発明者らは本明細書にて質量分析技術を用いた高感度のポリペプチドの配列決定法を提供する。本発明者らは相対的に強い酸基で誘導体化されたポリペプチド及びそのペプチドはほぼ独占的にy−イオンのフラグメンテーションを提供し、その結果、新規に解釈し易いスペクトルを生じることを発見した。本発明はまた、本方法を都合よく実行可能にするために用いられるキットにも関する。
【0008】
(発明の概要)
本発明は、ポリペプチドの配列決定を行うのに特に有用である質量分析方法及びキットに関する。前記方法には、ポリペプチドのアミノ酸配列を決定することが含まれ、その工程は:
(a)ポリペプチド又はペプチドとカップリングするとき、約2未満のpKaを有する1つ以上の酸性部分でポリペプチドのN末端又はポリペプチドの1つ以上のペプチドのN末端を誘導体化し、1つ以上の誘導体化された検体を提供すること;
(b)質量分析技術を用いて1つ以上の誘導体化された検体を分析し、フラグメンテーションパターンを提供すること;及び
(c)フラグメンテーションパターンを解釈することを含む。
【0009】
ポリペプチドの1つ以上のペプチドがリジン残基を有する、本発明のもう1つの実施形態では、リジン側鎖のイプシロンアミノ基が、ホモアルギニンのような極めて強い塩基性の基への変換又は固定された陽イオン基の付加によって修飾される。ポリペプチドの1つ以上の適宜修飾ペプチドが、次いで上記で概略された(a)〜(c)の工程に従って配列決定される。
【0010】
本発明のさらなる実施形態では、同位体で標識されたリジンを修飾する試薬が質量分析法とともに用いられ、複雑な混合物におけるタンパク質のレベルを定量する。例えば、ガイギ(Gygi)らの「同位体をコード化した親和性タグを用いた複雑なタンパク質の混合物の定量的分析」、ネイチャーバイオテクノロジー(Nature Biotechnology)第17巻994〜999ページ(1999年)を参照のこと。例えば、2つのタンパク質混合物(対照及び実験試料)を別々に修飾する。一方のタンパク質混合物を天然に豊富な同位体の比を有するリジン修飾試薬で標識する。もう一方のタンパク質混合物を同じリジン修飾試薬の重い同位体を濃縮した形態(1つ以上の2H、13C15N)で標識する。2つのタンパク質試料を合わせ、分離する(例えば、ゲル電気泳動又はHPLCを用いて)。続いて、当該タンパク質を適当な手段で消化し、質量分析法により解析する。軽いリジン修飾ペプチドに対する重いリジン修飾ペプチドの実験的に観測される比を用いて、2つの試料のタンパク質の相対的なレベルを正確に定量する。
【0011】
本発明のキットは、ポリペプチドとカップリングするとき約2未満のpKaを有する酸性部分を提供する1つ以上の酸性部分の試薬;及びポリペプチドのN末端又はポリペプチドの1つ以上のペプチドのN末端を1つ以上の酸性部分試薬で誘導体化するための手段を含む。キットはまた、リジン側鎖のイプシロンアミノ基を誘導体化するための1つ以上の試薬も包含する。本キットは方法の性能と合わせて特に有用である。
【0012】
(発明の詳細な説明)
本発明の方法及びキットは、例えば、野生型、変異型、及び/又は合成のポリペプチドを含む配列決定を行うのに有用である。前記方法及び前記キットは、例えば、生物学分野、製薬分野、身体洗浄分野、及び布地洗浄分野において使用するための高分子量のポリペプチドを同定するのに特に有用である。
本方法及びキットは幅広い有用性を有する。適用には:例えば、市販の洗濯及び洗浄製品;遺伝子クローニングのためのオリゴヌクレオチドプローブの設計を助けること;方向性を持った進化研究において形成される生成物の迅速な性状分析;コンビナトリアル化学及びペプチドライブラリの同定;及びプロテオミクスにおいて用いられるもののような、ペプチド又はポリペプチドの配列の迅速な決定を必要とする生物学研究の促進;タンパク質における翻訳後修飾の同定及び変異型タンパク質におけるアミノ酸修飾の同定が挙げられるが、これに限定されない。
【0013】
本方法には質量スペクトル分析の前に、1つ以上の相対的に強い酸基をポリペプチド又はポリペプチドの開裂を介して形成される1つ以上のペプチドのN末端に付加することが含まれる。理論によって制限されることを意図せず、結果的に生じる負に荷電した誘導体は、低エネルギーの荷電部位で開始するフラグメンテーションを促進すると考えられている。このことは、ポリペプチド又はそのペプチドのC末端が塩基性又は疎水性、好ましくは塩基性残基である場合、特に有効である。C末端にリジンを含有するペプチドについては、リジン側鎖の適当な修飾によってこの方法の有効性をさらに改善することができる。適当な修飾には、リジンをホモアルギニンに変換すること、又は固定陽イオン基をリジン側鎖のイプシロンアミンに付加することが挙げられるが、これに限定されない。再び、理論による限定なしに、質量スペクトル分析の間に塩基性残基がプロトン化される場合、相対的に強い酸基が脱プロトン化され、塩基性残基における正の電荷の対抗平衡をとると考えられている。四級化されたリジン側鎖の場合、固定された正の電荷もまた、脱プロトン化された強酸によって提供される負の電荷について対抗平衡をとる。それぞれの場合で、誘導体をイオン化するのに追加のプロトンが必要とされ、ほとんどの塩基性残基はすでにプロトン化されるか、又は四級化されているので、それは実質的に「遊離」ポリペプチド/ペプチドの主鎖アミド基を無作為にイオン化する。さらに、理論による限定なしに、2番目に相対的に強い酸基がポリペプチド/ペプチドに組み入れられ、2つの酸基が脱プロトン化される場合、2つの実質的に「遊離」のプロトンが提供されてポリペプチド/ペプチドの主鎖アミド基を無作為にイオン化すると考えられている。
【0014】
本方法の利用はフラグメンテーション効率の有意な上昇を提供する。さらに、同一配列を有する誘導体化されていないペプチドに比べて、誘導体化されたペプチドでは、フラグメントイオンのノイズに対するシグナルの比の上昇が観測される。得られた単純なPSD MALDI及びエレクトロスプレータンデム質量スペクトルは、日常的に新規で解釈することができる。
本開示全般にわたり、出版物及び特許を参照する。本明細書中で引用された全ての参考文献は、参考として本明細書に組み入れられる。
本明細書において用いられる全ての比率は、特に明記しない限り重量に基づく。
本明細書で使用されるとき、略語はアミノ酸を記載するのに用いられる。かかる略語を以下の表Iに記載する。さらに、表Iで記載されているのは、本発明の実践に有用であるアミノ酸残基の平均質量である。修飾リジンのリジン残基の質量は、天然に豊富な又は重い同位体を濃縮したリジン修飾試薬で誘導体化した後、適当に調整しなければならない。
【0015】
【表1】
【0016】
(定義)
本明細書で使用されるとき、用語「脱離イオン化」は固相から気相へのイオンとしての検体の転移をいう。
本明細書で使用されるとき、用語「脱離」は表面からの検体の離脱及び/又は検体の気相への流入をいう。
本明細書で使用されるとき、「イオン化」は、正又は負の1以上の電子単位に等しい電荷を検体に創製する又は保持する過程をいう。
本明細書で使用されるとき、用語「MALDI」はマトリクス支援レーザー脱離イオン化をいう。
【0017】
「MALDI」に関連して本明細書で使用されるとき、用語「マトリクス」は、当該ポリペプチド、又はかかる様式で当該ペプチドと溶液中で混合してもよいので、試料段階で乾燥するとき、結晶性のマトリクスに埋め込まれた検体が、レーザー照射の後、固相から気相又は蒸気相に上手く脱離し、イオン化することができる小型の酸性の光を吸収する化学物質をいう。別の方法としては、ポリペプチド又はそのペプチドの溶液を、試料段階で予備乾燥される適当なマトリクスに装填してもよい。好適なマトリクスの非限定例には、ニコチン酸、シナピン酸、フェルラ酸、コーヒー酸、a−シアノ−4−ヒドロキシ桂皮酸、及びニトロセルロースと混合したa−シアノ−4−ヒドロキシ桂皮酸が挙げられる。
【0018】
本明細書で使用されるとき、用語「エレクトロスプレーイオン化」は、接地した対抗電極に関して高い電圧にてキャピラリー電極から溶液を静電気的にスプレーすることによって溶液からイオンを製造する工程をいう。その定義は、エレクトロスプレーイオン化及びイオンスプレーともいわれる空気圧支援のエレクトロスプレーイオン化の双方を包含することを意図する。本明細書で使用されるとき、用語「エレクトロスプレーイオン化」は、あらゆる液体の流速に適用され、ミクロスプレー実験及びナノスプレー実験を包含することを意図する。さらに、その定義は、分離せず直接イオン源に注がれるペプチドの分析、及びエレクトロスプレーイオン化に先立って分離されるペプチド又はペプチド混合物の分析に適用することを意図する。好適な直結式分離法にはHPLC、キャピラリーHPLC及びキャピラリー電気泳動が挙げられるが、これに限定されない。エレクトロスプレーイオン化実験は、三連四重極型、イオントラップ型、直交式加速飛行時間分析計及びフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴装置を含むが、これに限定されない種々の質量分析計で行うことができる。
【0019】
本明細書で使用されるとき、用語「ポリペプチド」は2つ又はそれ以上のアミノ酸残基を有する分子をいう。本発明の方法は、大きい質量のポリペプチドの配列同定に好適である。
本明細書で使用されるとき、用語「野生型」は、突然変異していない生物によって産生されるポリペプチドをいう。
本明細書で使用されるとき、用語「変異型」は、野生型のポリペプチドとは異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドをいう。
本明細書で使用されるとき、用語「強い塩基性の基」は、グアニジニウム基のような基を含むが、これに限定されない9.5より大きいpKaを持つ官能基をいう。
本明細書で使用されるとき、用語「固定された陽イオンに荷電した基」は、四級アミン、スルホニウム又はピリジニウムのような官能基を含むが、これに限定されない永続的に正の電荷を含む基をいう。
【0020】
本明細書で使用されるとき、用語「同位体で標識された基」は、15Nを含有するグアニジニウム基、13Cを含有する四級アミン類及び18Oを含有するベタイン類のような基を含むが、これに限定されない、原子の最も一般に天然で豊富な同位体よりも分子量において大きい又は小さい同位体について濃縮されている少なくとも1種の原子を含む基をいう。2H又は37Cl又は81Brのようなハロゲンを含有する基も用いることができる。
【0021】
本発明の方法
本方法は、複雑なタンパク質混合物における相対的なタンパク質のレベルを定量するのに、及びポリペプチドのアミノ酸配列を決定するのに有用である。語句「アミノ酸配列を決定すること」によって、本発明者らは、所与のポリペプチドの配列全体を決定することに限定することを意図しない。むしろ、この語句によって、本明細書では、部分(単数)、部分(複数)、及び/又は全体の配列が決定されることを意味する。
本方法には、質量スペクトル分析のために、1つ以上の相対的に強い酸基をポリペプチド又はその1つ以上のペプチドのN末端に付加して1つ以上の誘導体化された検体を製造することが関与する。次いで、質量分析技術を用いてポリペプチド/ペプチドを分析し、フラグメンテーションパターンを提供する。得られたフラグメンテーションパターンを解釈し、それによってポリペプチドの配列が与えられる。
【0022】
本発明者らは、誘導体化する基の酸性度(酸性部分)が結果として生じる質量スペクトルに深遠な影響を有することを発見した。驚くべきことに、ポリペプチド又はそのペプチドとカップリングするとき、約2未満のpKaを有するような酸性部分は、所望の配列情報を提供するのに解釈し易いフラグメンテーションパターンを生じる。当業者は、当該技術分野において既知の常法を用いて本明細書に記載されるpKa値を測定するのに適任である。かかる方法の非限定例には、例えば、滴定法及び電気化学的方法が挙げられる。pKa値を測定する好ましい方法は滴定を介するものである。
【0023】
本発明者らは、ペプチドの遊離のN末端をスルホン化する前に、リジン側鎖のイプシロンアミノ基を修飾してその塩基性度を高めることによって、又は、そのような側鎖に固定された陽イオン基を付加することによって、リジン含有ペプチドについて、質量分析法による配列決定の結果の質を改善することができることを発見した。遊離のN末端アミンにおける明らかな競合反応がなく、加水分解のような明らかな望ましくない副反応もなく、ペプチドのリジン側鎖におけるイプシロンアミノ基を効率的に塩基性度の高いグアニジニウム基に変換することができる(例えば、キメル(Kimmel)の「タンパク質のグアニジン化」、メソッドインエンザイモロジー(Methods in Enzymology)第11巻584〜589ページ(1967年)及びボネット(Bonetto)らの「Lys及びCys残基の誘導体化後、カルボキシペプチダーゼ及び質量分析法を用いたペプチド及びタンパク質のC末端配列の解析」、アナリティカルケミストリ(Analytical Chemistry)第69巻1315〜1319ページ(1997年)を参照のこと)。次いで、リジン修飾ペプチドの遊離のN末端アミンをスルホネート基で誘導体化し、次いで、我々の以前の出願(P&G特許7379P2)に記載されている質量分析法を用いてペプチドの配列を新規に決定する。別の方法としては、N末端のスルホン化反応とC末端のリジンの修飾反応の順を逆にすることができる。
【0024】
原則として、グアニジン化反応とスルホン化反応は、反応条件の適切な制御によっていずれの順でも行うことができる。しかしながら、非水性条件下で極めて反応性の高いスルホン化化合物(例えば、実施例2及び8)を用いる場合、先ず、リジン側鎖をグアニジン化することが好ましい。リジンのホモアルギニンへの選択的変換は、極めて強い塩基性の基によってリジン側鎖を効率的に保護する。次いで、リジンイプシロンアミノ基が望ましくなくスルホン化されることなく、リジンが保護されたペプチドをN末端で選択的にスルホン化することができる。この戦略によって質量分析法によるリジン終結ペプチドの新規のペプチド配列決定が円滑になる。
【0025】
ジイソプロピルエチルアミン(DIEA)のような有機塩基の存在下でグアニジン化反応を行うことは、高いpH(>13)でNaOHの存在下でグアニジン化を行うときに観測されることが多い望ましくないペプチドの加水分解を最小限に抑える。揮発性の有機塩基(NaOHの代わりに)の存在下で調製される低レベルの試料も質量分析法による配列決定に先立ってさらにクリーンアップし易い。
別の方法としては、緩衝化した水性媒体中(例えば、pHが6.5である実施例1を参照のこと)でスルホン化反応を行うことにより、先ず、リジン終結ペプチドのN末端をスルホン化することができる。次いで、過剰のスルホン化試薬を取り除き、リジン側鎖のイプシロンアミノ基を、O−メチルイソ尿素又はその塩でグアニジン化するか、又はそれを四級アンモニウム基に変換する。イプシロンアミンを四級化する方法の1つは、無水イソ酢酸との反応、その後トリメチルアミンとの反応による。この工程はアミンをベタインに変換する。例えば、スタルツ(Stults)らの「アミノ末端誘導体化によるペプチドの高エネルギー衝突スペクトルの簡略化」、アナリティカルケミストリ(Anal.Chem.)第65号1703〜1708ページ(1993年)を参照のこと。
【0026】
本発明の方法は以下のように行ってもよい:
ポリペプチド及び/又はポリペプチドのペプチドの誘導体化:
N末端の誘導体化:
本発明の重要な特徴は、1つ以上の相対的に強い酸、すなわち、ポリペプチド又は前記ポリペプチドのペプチドとカップリングするとき約2未満、好ましくは約0未満、及びさらに好ましくは約−2未満のpKaを有する酸性部分による関心のあるポリペプチド又はポリペプチドのペプチドの誘導体化である。「ポリペプチドのペプチド」によって、本明細書では、ポリペプチドが2つ又はそれ以上のペプチドに消化される、さもなければ切断される(本明細書では、まとめて「消化」などと呼ぶ)ことを意味する。本方法に従って得られたペプチドを誘導体化する。「カップリングするとき」によって本明細書では、本明細書のポリペプチド又はペプチドと共有結合した後、測定されるとき酸性部分のpKaが定義されることを意味する。
【0027】
ポリペプチド又はそのペプチドはいかなる手段で製造してもよい。例えば、必要であれば関心のあるポリペプチドは分析のために単離される。例えば、一次元及び二次元のゲル電気泳動を含む幾つかの方法が単離に利用されてもよい。もう1つの実施例として、ポリペプチドは、当該技術分野において周知のコンビナトリアル化学の方法を介して合成されてもよい。
【0028】
消化は、ゲル中又は膜上、好ましくはゲル中を含む、多数の方法を介して生じてもよい。例えば、シェブチェンコ(Shevchenko)らの「銀染色ポリアクリルアミドゲルからのタンパク質の質量分光分析による配列決定」。アナリティカルケミストリ(Analytical Chemistry)第68巻850〜858ページ(1996年)を参照のこと。しかしながら、酵素的に又は化学的に、好ましくは酵素的にポリペプチドを消化することが可能である。塩基性の残基又は疎水性の残基、最も好ましくは塩基性の残基を得られるペプチドのC末端にて又はその近傍で生じる消化方法を利用することが最も好ましい。「にて」によって本明細書では、塩基性の残基又は疎水性の残基がペプチドのC末端残基であることを意味する。「近傍で」によって本明細書では、塩基性の残基又は疎水性の残基が、好ましくはペプチドのC末端から約40アミノ酸残基の範囲内、さらに好ましくは約30残基の範囲内、一層さらに好ましくは約20残基の範囲内、及び最も好ましくはペプチドのC末端から約10アミノ酸残基の範囲内にあることを意味する。
【0029】
この手順には多くの方法を利用してもよいが、例えば、トリプシン、エンドプロテイナーゼLys C、エンドプロテイナーゼArg C、又はキモトリプシン、好ましくは、トリプシン、エンドプロテイナーゼLys C、又はエンドプロテイナーゼArg C、及び最も好ましくはトリプシンを用いてポリペプチドを酵素的に消化することが好ましい。当然、ポリペプチドの元来のC末端の例外は伴うが、得られるポリペプチドのペプチドが通常、C末端にてアルギニン残基又はリジン残基(塩基性残基)で終結するので、トリプシン、エンドプロテイナーゼLys C、及びエンドプロテイナーゼArg Cが好ましい。特に、得られるペプチドのC末端にて又はその近傍で塩基性残基が生じるのであれば、その他の酵素も好適である。通常、疎水性のアミノ酸残基を切断するキモトリプシンも消化には好ましい。化学的消化も有用である。例えば、臭化シアンによる消化が有用である。
【0030】
本発明の方法は、特にその中に記載された消化技法に関して1998年10月13日に発行され、パーセプティブバイオシステムズ社(PerSeptive Biosystems、Inc.)に譲渡されたパターソン(Patterson)らの米国特許第5,821,063号に基づいて適用される。例えば、本発明に基づいて、ポリペプチドに対する作用剤の異なった比を有する複数の試料を利用してもよく、誘導体化してもよい。
しかしながら、特に、小型のポリペプチドを配列決定する場合(確実に限定されるわけではないが)、消化がいつも必要なわけではない。本明細書で使用されるとき、「小型の」ポリペプチドは、好ましくは約50未満のアミノ酸残基、さらに好ましくは約40未満の残基、一層さらに好ましくは約30未満の残基、尚さらに好ましくは約20未満の残基、及び最も好ましくは約10未満のアミノ酸残基を有するものを包含する。
【0031】
例えば、コンビナトリアル化学法を含む周知の手段によって合成されるポリペプチドが特徴付けられてもよい(「合成ポリペプチド」)。この例では、得られるポリペプチドのC末端にて又はその近傍で塩基性の残基又は疎水性の残基、好ましくは塩基性の残基(最も好ましくはアルギニン、ホモアルギニン又はリジン)を有するポリペプチドを合成することが最も好ましい。
【0032】
ポリペプチド(前記ポリペプチドが本明細書の上記で定義されるように十分に「小型」であれば)又は前記ポリペプチドのペプチドが、約2未満、好ましくは約0未満、及び最も好ましくは約−2未満のpKa(ポリペプチド又はペプチドとカップリングするとき)を有する1つ以上の酸性部分によって誘導体化され、誘導体化された検体を提供する。誘導体化された検体の酸性部分は酸性部分試薬とのカップリンングによって調製される。ポリペプチド又はそのペプチド上の酸性部分が結果として本明細書に記載されるpKaを有するという条件で、酸性部分試薬は限定されない。カップリングに利用してもよい酸性部分試薬の非限定例には、例えば、ジチオビス(スルホスクシンイミジルプロピオネート)、S−アセチルメルカプトコハク酸無水物、2−イミノチオレート(トラウトの試薬とも呼ばれる)、ジチオジグリコール酸無水物、テトラフルオロコハク酸無水物、ヘキサフルオログルタール酸無水物、スルホコハク酸無水物、環状2−スルホ安息香酸無水物、シクロスルホニルアセチルクロリド、及び1,3−プロパンスルトンが挙げられる。S−アセチルメルカプトコハク酸無水物、2−イミノチオラン、及びジチオジグリコール酸無水物のような試薬の使用は、酸性部分を生じるにはペプチドによる誘導体化した後、酸化を必要とする。酸化工程を必要としない酸性部分試薬には、例えば、テトラフルオロコハク酸無水物、ヘキサフルオログルタール酸無水物、スルホコハク酸無水物、環状2−スルホ安息香酸無水物及びクロロスルホニルアセチルクロリドが挙げられる。さらに効率的な合成及び/又はポリペプチド又はそのペプチドにおける不安定な残基の複雑な酸化の欠如のために、このような試薬が好まれることが多い。システインスルフヒドリル側基のシステイン酸への酸化がその後に続く、システイン含有ペプチドのN末端への酸性部分試薬のカップリングは、2つの酸性部分(スルホン酸)を含有するペプチドを作製する1つの手段である。
【0033】
酸性部分は最も好ましくはスルホン酸である。この中で、さらに好ましい酸性部分には、2−スルホアセチル部分、3−スルホプロピオニル部分、及び2−スルホベンゾイル部分が挙げられる。
ジスルホン酸誘導体の使用も好ましい。ジスルホン酸誘導体の使用は好ましくは、ペプチドのN末端の近傍で両方のスルホン酸基を生じる。例えば、システインスルフヒドリル側基のシステイン酸への酸化がその後に続く、システイン含有ペプチドのN末端への酸性部分試薬のカップリングは、2つの酸性部分(スルホン酸)を含有するペプチドを作製する1つの手段である。
【0034】
リジン側鎖のイプシロンアミノ基の修飾:
前の項で記載されるように作製されたリジン含有ペプチドについては、リジン側鎖のイプシロンアミノ基をさらに塩基性の基に選択的に変換することによって、又は固定的な陽イオン基をリジン側鎖に付加することによって、この配列決定法の有効性が強化されることが多い。このような後者のペプチド修飾は、前の項で議論したN末端スルホン化反応に加えて行われる。
リジン修飾試薬の非限定例は、O−メチルイソウレア水素サルフェート、O−メチルイソウレアサルフェート及びO−メチルイソウレア塩酸塩、並びにメシレート、アセテート、ブロミド、ピクレート、p−トルエンスルホネート及びベンゾエートの塩を含むO−メチルイソウレアのその他の塩である。
当業者は、本発明によって必要とされる相対的に単純なカップリング手順を実行する能力を有する。しかしながら便宜上、関心のあるポリペプチド、又は前記ポリペプチドのペプチドの誘導体化の非限定例を以下に説明する:
【0035】
(実地例)
実施例1
【0036】
【化1】
【0037】
環状2−スルホ安息香酸無水物(ウィスコンシン州ミルウォーキーのアルドリッチケミカル社(Aldrich Chemical Co)から市販されている)を使用前に無水テトラヒドロフランで0.1Mの濃度に調製する。ポリペプチドASHLGLAR(1nM、ミズーリ州セントルイスのシグマケミカル社(Sigma Chemical Co.)から市販)(SEQ ID NO:1)を20μLの0.05Mトリメチルアミンで希釈する。環状2−スルホ安息香酸無水物溶液(2μL)を加え、反応混合物を30秒間攪拌する。室温にて反応を約2分間進め、その後、生じた誘導体化された検体を希釈し、質量スペクトルを解析する。酸性部分試薬の濃度は、さらに少ない量を誘導体化する場合、100という因数で減らす。
【0038】
実施例2
【0039】
【化2】
【0040】
ASHLGLAR(1nM、ミズーリ州セントルイスのシグマケミカル社(Sigma Chemical Co.)から市販)(SEQ ID NO:1)を、2μLの原液クロロスルホニルアセチルクロリド(ウィスコンシン州ミルウォーキーのアルドリッチケミカル社(Aldrich Chemical Co)から市販されている)を500μLの水と混合することにより形成される2μLの0.02Mスルホ酢酸と混合する。混合物を乾燥し、次いで20μLのテトラヒドロフラン:ジイソプロピルエチルアミン(4:1v:v)で再構築する。無水テトラヒドロフラン中の0.1Mのクロロスルホニルアセチルクロリド(2μL、ウィスコンシン州ミルウォーキーのアルドリッチケミカル社(Aldrich Chemical Co)から市販)を加え、混合物を30秒間攪拌するする。室温にて、誘導体化反応をおよそ2分間進める。誘導体化された検体を乾燥し、20μLの水で再構築し、さらに希釈して、質量スペクトル分析にかける。クロロスルホニルアセチルクロリドは、2Dゲル単離の誘導体化の有用な試薬でもあるが、改変した合成手順は、さらに一貫した生成物収量を提供する。改変した手順は実施例14で議論する。
【0041】
実施例3
【0042】
【化3】
【0043】
S−アセチルメルカプトコハク酸無水物(ウィスコンシン州ミルウォーキーのアルドリッチケミカル社(Aldrich Chemical Co)から市販)を使用前に無水テトラヒドロフランで0.1Mの濃度に調製する。ASHLGLAR(1nM、ミズーリ州セントルイスのシグマケミカル社(Sigma Chemical Co.)から市販)(SEQ ID NO:1)を20μLの0.05Mトリメチルアミンで希釈する。S−アセチルメルカプトコハク酸無水物溶液(5μL)を加え、反応混合物を30秒間攪拌する。室温にて反応を約2分間進め、次いで、19:1(v:v)の比に調製した10μLのギ酸(88%):H2O2(30%)により酸化する。室温にて16時間酸化を進め、試料を乾燥した後、希釈して、質量スペクトル分析を行う。酸性部分試薬の濃度は、さらに少ない量を誘導体化する場合、100という因数で減らす。
【0044】
実施例4
【0045】
【化4】
【0046】
0.1Mのトリメチルアミン(20μL)中のASHLGLAR(1nM、ミズーリ州セントルイスのシグマケミカル社(Sigma Chemical Co.)から市販)(SEQ ID NO:1)に2−イミノチオラン(トラウト試薬、ウィスコンシン州ミルウォーキーのアルドリッチケミカル社(Aldrich Chemical Co)から市販)(脱イオン水中で3μL、0.1M)を加える。室温にて反応を5分間進める。19:1(v:v)の比に調製した3μLのギ酸(88%):H2O2(30%)により生成物を酸化する。室温にて酸化を5分間進め、質量スペクトル分析に先立って誘導体化された検体を乾燥する。
【0047】
実施例5
【0048】
【化5】
【0049】
ポリペプチドCDPGYIGSR(ミズーリ州セントルイスのシグマケミカル社(Sigma Chemical Co.)から市販)(SEQ Id NO:2)を、1〜5nMのポリペプチド(5〜20μLの水中で)を19:1(v:v)の比に調製した10μLのギ酸(88%):H2O2(30%)と混合することにより酸化する。室温にて酸化を30分間進め、質量スペクトル分析に先立って誘導体化された検体を乾燥する。
【0050】
実施例6
【0051】
【化6】
【0052】
ジチオビス(スルホスクシンイミジルプロピオネート)(DTSSP)(イリノイ州、ロックフォードのピアースケミカル社(Pierce Chemical Co.)から市販)をホスフェート緩衝生理食塩水に50nM/20μLで溶解し、1NのNaOHでpHを7.7に調整する。その溶液(20μL)を1μLのペプチドHLGLAR(1nM/μL)(SEQ ID NO:3)に加え、30分間反応させる。トリス−ヒドロキシメチル−アミノメタン(0.1M、20μL)で反応を止める。試料を脱塩し、19:1(v:v)の比に調製した10μLのギ酸(88%):H2O2(30%)で酸化する。室温にて酸化を30分間進め、質量スペクトル分析に先立って誘導体化された検体を乾燥する。
【0053】
実施例7
【0054】
【化7】
【0055】
ジチオジグリコール酸(0.93g、5.1ミリモル、ミズーリ州セントルイスのシグマケミカル社(Sigma Chemical Co.)から市販)(別の方法としては、その無水物のそのポリマー(環式又は非環式)を用いてもよい)をジクロロメタン(20mL)に溶解し、不活性の雰囲気下に置く。ジシクロヘキシルカルボジイミド(1.05g、5.1ミリモル)を一気に加える。約96時間後、沈殿物をろ過によって除き、ろ液を減圧下で濃縮する。得られた物質をジエチルエーテルに溶解し、ろ過する。再び、ろ液を減圧下で濃縮してジチオジグリコール酸無水物を提供する。ジチオジグリコール酸無水物(この実施例では環状形態を示す)を、使用に先立って、無水テトラヒドロフラン中で0.1Mの濃度に調製する。ASHLGLAR(1nM)(SEQ ID NO:1)を20μLの0.05Mトリメチルアミンで希釈する。ジチオジグリコール酸無水物溶液(5μL)を加え、反応混合物を30秒間攪拌する。室温にて、反応をおよそ2分間進める。得られた生成物を19:1(v:v)の比に調製した2μLのギ酸(88%):H2O2(30%)で酸化する。室温にて酸化を30分間進め、質量スペクトル分析に先立って誘導体化された検体を乾燥する。酸性部分試薬の濃度は、さらに少ない量を誘導体化する場合、100という因数で減らす。
【0056】
実施例8
【0057】
【化8】
【0058】
使用に先立って、3−スルホプロピオン酸無水物を無水テトラヒドロフランで0.1Mの濃度に調製する。ASHLGLAR(1nM)(SEQ ID NO:1)を20μLのテトラヒドロフラン:ジイソプロピルエチルアミン4:1(v:v)で希釈する。3−スルホプロピオン酸無水物溶液(2μL)を加え、反応混合物を30秒間攪拌する。室温にて反応を約2分進めた後、希釈して質量スペクトル分析を行う。酸性部分試薬の濃度は、さらに少ない量を誘導体化する場合、100という因数で減らす。
【0059】
実施例9
【0060】
【化9】
【0061】
使用に先立って、テトラフルオロコハク酸無水物を無水テトラヒドロフランで0.1Mの濃度に調製する。ASHLGLAR(1nM)(SEQ ID NO:1)を20μLの0.05Mトリメチルアミンで希釈する。テトラフルオロコハク酸無水物溶液(2μL)を加え、反応混合物を30秒間攪拌する。室温にて反応を約2分進めた後、希釈して質量スペクトル分析を行う。カップリング試薬の濃度は、さらに少ない量を誘導体化する場合、およそ100という因数で減らす。
【0062】
実施例10
【0063】
【化10】
【0064】
ペプチドCDPGYIGSR(ミズーリ州セントルイスのシグマケミカルカンパニー(Sigma Chemical)から市販)(SEQ ID NO:2)を、2μLの原液クロロスルホニルアセチルクロリド(ウィスコンシン州ミルウォーキーのアルドリッチケミカル社(Aldrich Chemical Co)から市販されている)を500μLの水と混合することにより形成される2μLの0.02Mスルホ酢酸と混合する。混合物を乾燥し、次いで20μLのテトラヒドロフラン:ジイソプロピルエチルアミン(4:1v:v)で再構築する。無水テトラヒドロフラン中の0.1Mのクロロスルホニルアセチルクロリド(2μL)を加え、混合物を30秒間攪拌する。室温にて、誘導体化反応をおよそ2分間進める。誘導体化された検体を乾燥し、10μLの水にて再構築する。その溶液に19:1(v:v)の比に調製した10μLのギ酸(88%):H2O2(30%)を加える。室温にて酸化を5分間進め、N末端近傍で2つのスルホン酸基を有する誘導体化されたペプチドを製造する。
【0065】
(質量分析技術を用いた解析)
誘導体化して、ポリペプチド又はポリペプチドの1つ以上のペプチドが質量分析技術を用いて解析される。利用される技術は限定されないが、好ましい技術は、ポストソース崩壊(PSD)マトリクス支援レーザー脱離イオン化(MALDI)及びエレクトロスプレーイオン化タンデム質量分析法である。例えば、スペングラー(Spengler)らの、「マトリクス支援レーザー脱離質量分析法によるペプチド配列決定」ラピッドコミュニケーションズインマススペクトロメトリー(Rapid Communications in Mass Spectrometry)、第6巻の105〜108ページ(1992年);スペングラー(Spengler)らの「マトリクス支援レーザー脱離質量分析法におけるポストソース崩壊の基本的性状」ジャーナルオブフィジカルケミストリ(Journal of Physical Chemistry)、第96巻の9678〜9684ページ(1992年);コッフマン(Kaufmann)らの「マトリクス支援レーザー脱離イオン化を用いた反射飛行時間質量分析計におけるプロダクトイオン分析による線状ペプチドの質量分析配列決定」、ラピッドコミュニケーションズインマススペクトロメトリー、第7巻902〜910ページ(1993年);コッフマン(Kaufmann)らの「飛行時間質量分析計におけるペプチドの配列決定:マトリクス支援レーザー脱離イオン化(MALDI)後のポストソース崩壊の評価」、インターナショナルジャーナルオブマスススペクトロメトリー、アンドイオンプロセス(International Journal of Mass Spectrometry and Ion Processes)、第131巻355〜385ページ(1994年);カウフマン(Kaufmann)らの「マトリクス支援レーザー脱離/イオン化反射飛行時間質量分析法におけるポストソース崩壊及び遅延抽出」、ラピッドコミュニケーションズインマススペクトロメトリー第10巻1199〜1208ページ(1996年);及びスペングラー(Spengler)の「生体分子のマトリクス支援レーザー脱離/イオン化質量分析法におけるポストソース崩壊の分析」ジャーナルオブマススペクトロメトリー第32巻1019〜1036ページ(1997年);カール(Carr)らの「分析バイオテクノロジーにおける質量分析法の統合」、アナリティカルケミストリ(Analytical Chemistry)第63巻2802〜2824ページ(1991年);イエーツ(Yates)3世らの「MSによるゲノムの採掘」、アナリティカルケミストリ第68巻534A〜540Aページ(1996年);モリス(Morris)らの「新規のQuadrupole/Orthogonal加速飛行時間質量分析計における高感度衝突活性化タンデム質量分析法」、ラピッドコミュニケーションズインマススペクトロメトリー第10巻889〜896ページ(1996年)を参照のこと。最も好ましくは、利用される技法は、正イオンモードのPSD MALDI及びエレクトロスプレーイオン化タンデム質量分析法である。便宜上、以下の実施例11及び12が、ポリペプチド及びそのペプチドを解析するために利用されてもよい質量分析技術を説明する。
【0066】
驚くべきことに本発明者が発見したように、適宜誘導体化されたペプチド又はポリペプチドのペプチドは、主としてy−イオンを特徴とするMSMSスペクトルを提供する。当該技術分野において周知であるように、y−イオンは、ポリペプチド又はペプチドの元来のC末端を含有するイオン化されたフラグメントを示す。本明細書で使用されるとき、用語「y−イオン」はまた、(y−NH3)イオンも包含し;例えば、第2の塩基性(例えば)残基を含有する不完全な消化生成物は、豊富な(y−NH3)イオンを生じることが多い。好ましくは、この方法で生じるスペクトルは実質的にa−イオン及びb−イオンを含まない。a−イオン及びb−イオンは主鎖のカルボニル基のいずれかの側の開裂によって形成される。重要なことに、電荷は、a−イオン及びb−イオンによってN末端フラグメントで保持される。本明細書で使用されるとき、a−イオン及び/又はb−イオンに関する用語「実質的に含まない」は、優勢なy−イオンシリーズに比べて、a−イオン及びb−イオンは合わせて、約20%未満、好ましくは約10%未満、及び最も好ましくは約5%未満の相対存在量を有することを意味する。
【0067】
本発明の方法に従って、特にポリペプチドの配列が配列データベースにあれば、そのポリペプチドを同定するためにあらゆる消化生成物を分析し、及び/又は同定する必要はない。
【0068】
実施例11−PSD MALDI配列決定技法
この実施例では、質量分析技術は、N2レーザー(337nm、3ナノ秒パルス幅、20Hzの反復率)を装備したボイジャー(Voyager)DE−RP又はボイジャーDE−STR(マサチューセッツ州フレーミングハムのパーセプティブバイオシステムズ社(PerSeptive Biosystems Inc))(又は好適な同等物)で行う。遅延抽出による反射モードにて質量スペクトルを得る。外部質量較正は、質量の少ないペプチド標準物で行い、質量測定の精度は、通常、±0.3Daである。誘導体化されたポリペプチド又はペプチドを0.1%トリフルオロ酢酸(TFA)で約10pM/μLまで希釈する。10mgを0.1%のTFAを含有する1mLの水性50%アセトニトリルに溶解することによって調製されるa−シアノ−4−ヒドロキシ桂皮酸(αCN)で試料をさらに5倍〜10倍に希釈する。例えば、ベアビス(Beavis)らの「マトリクス支援レーザー脱離質量分析法のためのマトリクスとしてのa−シアノ−4−ヒドロキシ桂皮酸」オーガニックマススペクトロメトリー(Organic Mass Spectrometry)第27巻156〜158ページ(1992年)を参照のこと。迅速蒸発法により調製されるa−シアノ−4−ヒドロキシ桂皮酸/ニトロセルロース(αCN/NC)の薄膜表面からゲル単離物を解析する。例えば、アーノット(Arnott)らの「プロテオーム解析への統合的アプローチ:心臓肥大症に関連するタンパク質の同定」、アナリティカルバイオケミストリ(Analytical Biochemistry)第258巻1〜18ページ(1998年)を参照のこと。
【0069】
時間指定イオン選抜を用いて適当な前駆体イオンを単離した後、誘導体化された検体についてPSD MALDIタンデム質量スペクトルが得られる。αCN、αCN/NC及び2,5−ジヒドロ安息香酸(DHB)を含むが、これに限定されない多数のMALDI物質を用いて誘導体化された検体を分析することができる。反射に適用される電圧をステッピングすることによってフラグメントイオンは最終検出器に前もって焦点が合わせられる。用いてもよい典型的な電圧比は以下のとおりである:1.0000(前駆体イオン断片)、0.9126、0.6049、0.4125、0.2738、0.1975、及び0.1213(フラグメント断片)。マサチューセッツ州フレーミングハムのパーセプティブバイオシステムズ(PerSeptive Biosystems)から入手可能なソフトウエアを用いて、個々の断片を組み合わせる(当該技術分野において一般に用いられているように「一緒に縫い合わせる」)(解析ウインドウから「PSD」を選択する)。前駆体イオン断片はすべて、低いレーザー出力で(変数減衰器=1450)<256のレーザーパルスについて獲得し、検出器を飽和するのを回避する。PSD MALDI獲得の残りの断片すべてに対してレーザーの出力を上げる(変数減衰器=1650)。通常、各フラグメントイオンの断片について256のレーザーパルスが得られる。20MHzのデジタル変換速度にてデータを獲得する。
【0070】
実施例12−エレクトロスプレーイオン化タンデム質量分析法による配列決定法
この実施例では、自家製マイクロエレクトロスプレー源(uES)を装備したLCQイオントラップ質量分析計(カリフォルニア州サンノゼのサーモクエスト(ThermoQuest))にカップリングしたキャピラリーLCシステム(カリフォルニア州フォスターシティのパーキンエルマーバイオシステムズ(Perkin Elmer Biosystems))を用いて質量スペクトルを獲得する。0.5×150mmのC18LCカラム(カリフォルニア州フォスターシティのパーキンエルマーバイオシステムズ(Perkin Elmer Biosystems))は、5μl/分の流速にて用いる。LC移動相は、それぞれ0.02%のTFAを含有する水及びアセトニトリルである。典型的な勾配は、15%のアセトニトリルで5分間、次いで15〜60%のアセトニトリルで40分かける。uES源への0.5μl/分及びUV検出器への4.5μl/分の流速は、LCカラムの後に割れたティー(1/16”、0.25mm内径、テキサス州ヒューストンのバルコ(Valco))を置くことによって達成する。オートサンプラー(ジョージア州ノルクロスのアルコット(ALCOTT)、モデル719)によって、誘導体化したペプチド又はポリペプチドの試料をLCカラムに注入する。uES源は装置の前端に載せられたX、Y、Zマイクロメートル(カリフォルニア州サンタクララのニューフォーカス社(New Focus))に格納される。マイクロエレクトロスプレーの針は、ニューオブジェクティブ(New Objective)(マサチューセッツ州ケンブリッジ)のピコチップ(PicoTip)(FS360−50−15−D)である。
【0071】
エレクトロスプレータンデム質量スペクトルは、以下の装置条件を用いて獲得する:スプレー針の電圧1.5kV、加熱したキャピラリーの温度200℃、及び衝突エネルギー35eV。各完全なMS走査では300〜2000m/zの質量範囲を用いる。エレクトロスプレータンデム質量スペクトルは、3つの連続した走査:1)完全なMS走査、2)電荷状態を測定するための選択されたイオンにおけるズーム、及び3)ズーム走査から選択された適当なイオンにおけるMS/MS走査から成る「三連操作」モードにおけるデータ依存性の走査を用いて獲得される。このような3つの事象はLC作動の間中、反復される。
【0072】
フラグメンテーションパターンの解釈
質量分光分析により生じたフラグメンテーションパターンはポリペプチドの配列に解釈される。質量分析の分野における当業者は、市販のソフトウエア又は配列データベースの助けを借りずに新規の小型ポリペプチドのフラグメンテーションパターンを手動で解釈することができる。同様に、熟練者は、新規のポリペプチドのペプチド(消化生成物)を配列決定することもできる。別の方法としては、熟練者は、例えば、配列データベースの市販のソフトウエアを含む解釈のための既知の助けを借りてもよい。
【0073】
例えば、ポリペプチド又はそのペプチドの配列は、本発明を介して作製されるy−イオンのフラグメンテーションパターンによって効率的に及び正確に決定される。個々のアミノ酸残基の同定は、y−イオンシリーズの隣接するメンバー間の質量の差異を測定することによって新規に達成することができる。次いで、測定された質量の差異を既知のアミノ酸残基の質量(本明細書では上記表Iを参照のこと)と比較することによって同定は達成される。例えば、71.1Daの測定された質量差はアラニンに相当する。読み取り方向も質量スペクトルから直接明らかにされる。小さな質量から大きな質量へと測定するのであれば、方向はC末端からN末端である。大きい質量から小さい質量へと測定するのであれは、読み取り方向は、N末端からC末端である。
【0074】
配列データベース検索に対する入力として、フラグメンテーションデータ、解釈されていないy−イオンシリーズの質量又はy−イオンシリーズに由来する配列タグのいずれかを許容するソフトウエアを用いて、ポリペプチド、及びそのペプチドの配列を効率的に及び正確に決定してもよい。当事者により一般に利用されているそのようなソフトウエアには、「プロテインプロスペクター(Protein Prospector)」(カリフォルニア大学サンフランシスコ校又はウエブ(http://prospector.ucsf.edu)から市販されている)及び「ペプチドサーチ」(ドイツ、ヘイデルベルグの欧州分子生物学研究所又はウエブ(http://www.mann.embl−heidelberg.de)から市販)が挙げられるが、これらに限定されない。
【0075】
本発明で作製されるフラグメンテーションパターンは、NCBI非冗長データベース(ncbi.nlm.nih.gov/blast/db.nr.z)、SWISPROT(ncbi.nlm.gov/repository/SWISS−PROT/sprot33.dat.z)、EMBL(FTP://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/peptidesearch/)、OWL(ncbi.nlm.nih.gov/repository/owl/FASTA.z)、dbEST(ncbi.nlm.nih.gov/repository/dbEST/dbEST.weekly.fasta.mmddyy.z)及びジェンバンク(ncbi.nlm.nih.gov/genebank/genpept.fsa.z)を含むが、これらに限定されない多数の配列データベースで検索することができる。本発明の方法を用いて形成される1つ以上の関連あるペプチド誘導体から作製されるフラグメンテーションデータを検索することによって配列データベースから、関心のあるポリペプチドの配列全体を取り出すことができることが多い。
【0076】
当然、データベース検索技術を用いる場合、y−イオン及び(y−NH3)イオンが、本方法が利用されるフラグメンテーションパターンで観測される最も顕著な種なので、y−イオン又は(y−NH3)イオンだけがフラグメントになるように指定することによって検索を限定することが最も効率的である。本発明の方法を用いて誘導体化されたペプチドのスペクトルにおいて顕著ではないので、a−、b−、(b+H2O)、(b−H2O)、(b−NH3)及び内部開裂イオンのようなその他のフラグメントイオンを否認することができる。本発明によって形成される誘導体は、誘導体化していない同一ペプチドのスペクトルから得られるよりも多くのデータベース検索の特異性を生じることが多い単純なフラグメンテーションパターンを提供する。
以下の非限定例において本発明の方法をさらに説明する。このような実施例では、当業者は、新しいタンパク質が頻繁にデータベースに加えられるので、多数の「候補タンパク質」が本明細書で開示されたものとは異なる可能性があることを認識するであろう。
【0077】
実施例13
酸化されたインスリンB鎖FVNQHLC(SO3H)GSHLVEALYLVC(SO3H)GERGFFYTPKA(SEQ ID NO:4)(MM計算値=3495.9Da)(ミズーリ州セントルイスのシグマケミカルカンパニー(Sigma Chemical)から市販)によって高質量のポリペプチドのPSD MALDIタンデム質量分析法を実証する。このポリペプチドの質量は、従来のほとんどの三連四重極型装置の上限をはるかに超えている。元のままのポリペプチドのタンデム質量スペクトルは、実質的にy−イオンから成る相対的に強いイオンシリーズを示す。y9からy24の間のy−イオンはすべて観測し易い。分子のN末端を規定する配列特異的なフラグメント、y25〜y29はスペクトルに存在しない。
【0078】
酸性部分試薬、スルホ安息香酸環状無水物(ミズーリ州セントルイスのアルドリッチケミカル社(Aldrich Chemical Co)から市販)を用いる誘導体化によってこのポリペプチドのスペクトルを改善する。誘導体化されたポリペプチドは、分子のN末端領域に由来するy−イオン(y25、y26、y27、y28、及びy29)の有意な増強を示す。誘導体化の後、y8〜y29のy−イオンの完全なシリーズが観測される。顕著なb−イオンは検知されない。
【0079】
実施例14
二次元ゲル電気泳動により分離されたポリペプチドをトリプシンによりゲル内消化して前記ポリペプチドのペプチドを生じる。ペプチドは、1060.8、1090.8、1271.0、1299.0、1312.0、1344.0、1399.1、1450.1、1460.1、及び1794.4m/zにおけるイオンを含むMALDIによる強いMH+シグナルを幾つか示す。NCBIタンパク質配列ライブラリのすべてに対するプロテインプロスペクターソフトウエアを用いたデータベース検索により、5以上の入力したトリプシン切断した質量と一致する41の候補タンパク質のリストを作製する(検索パラメータ:MW範囲1,000〜150,000、3.0〜10.0の等電点、副反応として認められる酸化Met及び+/−0.6Daの控え目な質量許容範囲)。
【0080】
前出の実施例で議論した数種の試薬のいかなる1つによってもポリペプチドのペプチドを誘導体化することができる。それらには、2−スルホ安息香酸環状無水物、3−スルホプロピオン酸無水物又はクロロスルホニルアセチルクロリドが挙げられるが、これらに限定されない。本実施例では、クロロスルホニルアセチルクロリドを酸性部分試薬として用いる。2Dゲル電気泳動から単離された低い濃度のペプチドを誘導体化する方法を改変して再現性及び誘導体収率を改善する。通常、2Dゲルのペプチド抽出物は、スピードバック上でほぼ乾燥するまで濃縮する(5〜10μL)。15μLの0.1%TFAによって濃縮物を酸性化し、市販のC18ミニカラム(マサチューセッツ州ベッドフォードのミリポアコーポレーションのジップチップ(ZipTip)(商標))を用いてクリーンアップする。
【0081】
クリーンアップした試料をスピードバックで乾燥し、10μLの塩基(THF:DIEA19:1v/v)で再構築する。本実施例では、2μLのクロロスルホニルアセチルクロリド溶液(1mLのTHFに2μLの原液)を加え、室温にて、反応を1〜2分進める。誘導体化された試料を再びスピードバックにて乾燥し、解析前に10μLの0.1%TFAで再構築する。この段階で、MALDIマトリクス及び解析のために試料ステージに負荷されている部分と試料を混合することができ、又は、市販のC18ミニカラム(ジップチック(商標)、ミリポアコーポレーション)を用いて再びクリーンアップしてもよい。10mg/mLのMALDIマトリクスを含有する1〜2μL容量のアセトニトリル:0.1%TFA(1:1v/v)にてMALDI試料ステージ上に、ジップチップから直接、クリーンアップされた試料を溶出することができる。後者の手順によって回収された誘導体のすべてをMALDI試料ステージに負荷することができ、それによって方法全体の感度を改善することができる。約1572Daの重量がある誘導体化されたペプチドについてPSD MALDIタンデム質量分析を行う。574.5、661.7、875.9、1003.8、1103.9、1204.6、1304.1m/zにてy−イオンを、及び1451.0m/zにて(MH+−誘導体)イオンを有する配列タグが得られる。タンパク質配列データベースに対してスペクトルを検索し、6つの候補タンパク質(すべてミトコンドリア性のアスパルテートアミノトランスフェラーゼ類)が戻ってくる(検索パラメータ:MW範囲1,000〜150,000、親イオンの質量許容範囲+/−0.6Da、フラグメントイオンの質量許容範囲+/−2.5Da、Par(mi)Frag(av)、許容される不足イオンの数=1)。データベース検索がy−イオンを唯一の許容されるフラグメントとみなすように制約されているので、このレベルの特異性が得られる。このような誘導体のタンデム質量スペクトルではN末端及び内部開裂のイオンは顕著ではないので、この検索の制約が可能である(本発明に基づいた誘導体化による)。完全なライブラリに対してこの同じタンデム質量スペクトルを検索するとはるかに低い特異性が得られ(239の候補タンパク質が帰ってくる)、すべてのフラグメントイオン型(a、b、(b+H2O)、(b−NH3)、(b−H2O)、内部及びy)が許容される。前記ペプチドは、FVTVQTISGTGALR(SEQ ID NO:5)として同定された。
【0082】
タンパク質の同定の確認は、約1916Daの重量がある誘導体のPSD MALDIによって求める。スペクトルは、プロトン化した前駆体イオンに加えて724.6、1154.2、1299.3、1439.0、1551.9、1665.5、及び1779.2m/zにおける7つのフラグメントのイオンを含有する。フラグメントをy−イオンであると想定してデータベースに対してこのスペクトルを検索する。検索によってミトコンドリア性のアスパルテートアミノトランスフェラーゼ又はその他のいかなる候補タンパク質も戻ってこない。yイオン及び(y−NH3)イオンの両方を許容するデータベース検索によって16の候補タンパク質ガ得られ、そのうち10がミトコンドリア性のアスパルテートアミノトランスフェラーゼである。この後者の検索によってタンパク質の同定が裏付けられる。可能性のあるフラグメントとして(y−NH3)イオンを含めることは、ペプチドが第2のアルギニン残基を含有する不完全なトリプシン処理生成物(ILIRPLYSNPPLNGAR)(SEQ ID NO:6)なので、この特定の検索には必要である。本明細書の上記で述べたように、PSDタンデム質量スペクトルでは、不完全な消化生成物は、(y−NH3)フラグメントイオンを呈することが多い。
【0083】
実施例15
2Dゲル電気泳動で単離されたタンパク質のゲル内トリプシン消化物を、本明細書の実施例14に基づいて誘導体化した後、LCQイオントラップにてLCエレクトロスプレータンデム質量分析法により解析する。マイクロスキャンの「三連操作」配列を用いる自動データ依存モードにてあらゆるスペクトルは無人で獲得する。誘導体化されたトリプシン処理ペプチド(MH+=971.5)のタンデム質量スペクトルは、401.1、538.3、651.3、750.4m/zを含めて幾つかのy型生成物イオンを示す。誘導体化されていないトリプシン処理ペプチド(971.5−122=849.5)のMH+質量とともに測定されたy−イオンをデータベース検索に用いる。NCBIタンパク質配列ライブラリに対するプロテインプロスペクターソフトウエアを用いたデータベース検索によって3つの候補タンパク質が得られる(検索パラメータ:MW範囲すべて、親イオンの質量許容範囲+/−0.6Da、フラグメントイオンの質量許容範囲+/−1.0Da、単同位体親イオン及びフラグメントイオンは認められ、不足イオンは認められない)。データベース検索から得られる3つの候補タンパク質はすべてハプトグロビンである。ペプチドは、VVLHPER(SEQ ID NO:7)として同定された。
【0084】
第2の誘導体化されたペプチド(誘導体のMH+=771.4Da)から生じるタンデム質量スペクトルを用いてデータベース検索からタンパク質同定の裏付けを求める。スペクトルは、322.1、436.2及び535.3m/zにおけるy−型イオンを含めて幾つかのイオンを示した。上記と同じ検索パラメータを用いて、3つのペプチド配列がエレクトロスプレータンデム質量スペクトルからの入力データに一致する。3つのペプチド配列の1つがハプトグロビンに相当する。当前記ペプチドの同定はNVNFR(SEQ ID NO:8)として確証された。この結果はタンパク質の同一性を裏付けている。
【0085】
実施例16
本発明の方法は、変異型ポリペプチドを同定するのに利用し易い。酵素単離物のトリプシン消化物のMALDIスペクトルは、市販のプロテアーゼ、サビナーゼ(登録商標)(デンマーク、コペンハーゲンのノボノルディスク(Novo Nordisk)から市販)のそれと同一の多数のトリプシン処理質量を示す。予想されるトリプシン処理ペプチドの1つ、GVLVVAASGNSGAGSISYPAR(MH+=1933Da)(SEQ ID NO:9)がスペクトルからなくなり、未知のイオンが1963m/zで観測される。このことは、単離物がサビナーゼ(登録商標)の変異型であることを示唆している。11の異なった単一アミノ酸の変更によって観測された+30Daの質量のシフト(4G→S、4A→T、及び3V→E)を説明することができる。本明細書の実施例2で説明されているような誘導体化に続いてPSD MALDIタンデム質量スペクトルが得られる。21アミノ酸のペプチドについてy−イオンの完全なシリーズが観測される。スペクトルは残基14におけるグリシンがセリンに変換されていることを立証している。このスペクトルであらゆるy−イオンの質量が測定される。スペクトルは、パーセプティブバイオシステムズのMALDIデータシステムに包含されるペプチドラダー配列決定プログラムを用いて自動的に解釈される。
【0086】
実施例17
本明細書の実施例5に従い、実施例10に従って誘導体化されたCDPGYIGSR(SEQ ID NO:2)から生じるMALDIPSDスペクトルの比較によって、ペプチドのN末端近傍で両方のスルホン酸基を伴ったジスルホン酸誘導体の使用を実証する。システイン残基(実施例5)のスルフヒドリル側基の過ギ酸酸化によって形成される誘導体を、アルファ−シアノ−4−ヒドロキシ桂皮酸のマトリクスからPSD MALDIを用いて解析する。得られるPSDスペクトルは、不安定なAsp−Proアミド結合の開裂によって形成されるy7フラグメントイオンが優勢である。低い質量のy型イオンは相対的に低い量を示す。例えば、y7イオンに比べたy3イオン及びy4イオンの量は、それぞれ8%及び5%でしかない(ピークの高さの比)。理論によって制限されることを意図せず、Pro酸アミド窒素は他の主鎖アミド基よりも塩基性が強いので、「移動可能な」イオン化プロトンは塩基性Asp−Proアミド窒素原子に優先的に局在すると考えられている。この電荷局在は、Aspとプロトン化されたProとの間のアミド結合の優先的なフラグメンテーションを生じると考えられている。
【0087】
実施例10に従ってペプチドのN末端近傍に第2のスルホン酸基を付加することによってこの問題は、最小限に抑えられる。第2のスルホン酸基の付加は、MALDIPSD解析で使用され正に荷電したイオンを生じるために、第2の「移動可能な」プロトンを必要とする。再び、理論によって制限されることを意図せず、相対的に塩基性の強いProはすでにイオン化されているので、この第2のプロトンはその他の主鎖アミド基を自由にイオン化すると考えられている。
その他の主鎖アミド基のプロトン化は、結果としてそのような基のフラグメンテーションを高め、MALDIPSDスペクトルにおいて相当するy−イオンの相対存在量を高める。実施例10に従って形成された誘導体のPSDスペクトルにおいて、y7イオンに比べたy3イオン及びy4イオンの量は、それぞれ41%及び57%に上昇する(ピークの高さの比)。
【0088】
実施例18
C末端にて又はその近傍でリジンを有するペプチドから作製される質量分析のフラグメンテーションパターンは、本明細書に記載されるように、リジンをホモアルギニンに変換し、酸性基で誘導体化することにより改善できることが多い。N末端アミンでの感知できるほどの反応なしで及び加水分解のような感知できるような副反応なしで、リジン側鎖のイプシロンアミノ基をさらに塩基性の強いグアニジニウム基に効率よく変換することができる。この変換を達成するアプローチの1つはグアニジン化試薬としてO−メチルイソウレア又はその塩を用いる。例えば、ボネット(Bonetto)らの「Lys及びCys残基の誘導体化の後、カルボキシペプチダーゼ及び質量分析法を用いたペプチド及びタンパク質のC末端配列分析」アナリティカルケミストリ(Analytical Chemistry)第69巻1315〜1319ページ、(1997年)を参照のこと。本実施例では、グアニジン化したペプチドを次いでN末端にて誘導体化し、質量分析法による配列決定に先立ってスルホニル基を提供する。当業者は、リジンをホモアルギニン誘導体に変換する反応とN末端を誘導体化して酸性基を導入する反応の順序は、反応条件の適当な制御によって入れ換えて同じ誘導体を得ることができることを理解することができる。
【0089】
【化11】
【0090】
使用の前に、O−メチルイソウレア水素サルフェート(ウィスコンシン州ミルウォーキーのアルドリッチケミカル社(Aldrich Chemical)から市販)をH2Oで0.5Mに調製する。ポリペプチドVGGYGYGAK(1〜10nM、ミズーリ州セントルイスのシグマケミカル社から市販)(SEQ ID NO:10)を20μLのH2O:DIEA19:1v:vに溶解する。2μLの0.5MのO−メチルイソウレア水素サルフェートを加え、ペプチド溶液を攪拌する。溶液のpHをチェックし、(必要に応じて調整し)、それが塩基性であることを確認する。室温にて反応を一晩進める。次いで、少量の原液トリフルオロ酢酸(TFA)を加えることにより反応を止める。次いで、市販のC18カラム(ジップチップ(ZipTip)(商標)、マサチューセッツ州ベッドフォードのミリポアコーポレーション)を用いて酸性溶液をクリーンアップし、0.1%のTFAを含有する10μLのアセトニトリル:水1:1v:vで溶出する。次いで、溶液をスピードバックで乾燥し、試料を20μLのTHF:DIEA19:1v/vで再構築する。この溶液のpHをチェックして塩基性であることを確認する。2μLのクロロスルホニルアセチルクロリド溶液を、1mLの無水THF(実施例2を参照のこと)における2μLの試薬原液で希釈することにより調製し、加えて、試料を攪拌する。室温にて1〜2分間、スルホン化反応を進める。次いで、試料をスピードバックにて乾燥し、20μLの0.1%TFAで再構築する。次いで試料をジップチップ(商標)C18カラムでクリーンアップし、0.1%のTFAを含有する少量のアセトニトリル:水1:1で溶出する。当量の試料を2,5−ジヒドロ安息香酸で希釈し、MALDIポストソース崩壊質量分析法により解析する。スペクトルは、C末端におけるホモアルギニンから無処理のグアニジン化ペプチド分子のイオンに伸びるy−イオンの完全なシリーズを示す。
【0091】
実施例19
1つ以上の13C又は15Nを含有するO−メチルイソウレア又はその塩の同位体で標識した形態を用いてタンパク質の複雑な混合物におけるタンパク質の相対レベルを正確に定量することができる。この能力は、以前開発された同位体コード化親和性タグ法に類似している。例えば、ガイギ(Gygi)らの「同位体をコード化した親和性タグを用いた複雑なタンパク質の混合物の定量的分析」、ネイチャーバイオテクノロジー(Nature Biotechnology)第17巻994〜999ページを参照のこと。この能力は定量的プロテオーム分析で特に有用である。細胞又は組織(対照試料)において1つの状態を示している1つのタンパク質混合物におけるリジン側鎖を天然に豊富な同位体を有するO−メチルイソウレア又はその塩のような試薬を用いてグアニジン化する(同位体として軽い形態の試薬)。
【0092】
細胞又は組織(実験試料)で第2の状態を示している等量のタンパク質のリジン側鎖を1つ以上の13C又は15Nの元素を濃縮したレベルで含有するO−メチルイソウレア又はその塩のような試薬を用いてグアニジン化する(同位体として重い形態の試薬)。2つの誘導体化されたタンパク質混合物を次いで合わせる。例えば1D又は2Dゲル電気泳動のような技術を用いて次いで、合わせられた試料を分離する。付加されたグアニジニウム基を含有するペプチドを生じる分離の後、関心のあるペプチドを消化する。消化は、例えば、トリプシンを介して達成してもよい。例えば、セイドル(Seidl)らの「ボウマン−バーク(Bowman−Birk)大豆阻害剤のグアニジン化:ホモアルギニンを含むペプチド結合のトリプシン加水分解の証拠」、バイオケミカル及びバイオフィジカルリサーチコミュニケーションズ(Biochemical and Biophysical Research Communications)第42巻1101〜1107ページ、(1971年)を参照のこと。例えば、MALDI質量分析法を用いた質量分析によって又はエレクトロスプレーイオン化を用いたオンラインLC(又はCE)MSによって、得られるペプチドの混合物を直接分析する。別の方法としては、合わせたグアニジン化タンパク質試料を消化し、種々のオンラインHPLC又はCE質量分析法で解析する。グアニジン化試薬の同位体として軽い形態及び重い形態を含有する同一のペプチドイオン(同一のペプチド配列)の対のシグナル相対強度を測定することにより2つの試料(対照及び実験試料)におけるタンパク質の比を定量する。次いで、試料の対照状態と実験状態の間で相対濃度が変化しない代表的なタンパク質に対して較正することによって、2つの試料における相対的なタンパク質濃度の正確な定量が可能である。
【0093】
観測されるペプチドの多くは1つ以上の付加されたグアニジニウム基を含有するので、1回の消化から各タンパク質について数種の定量的測定が得られる。1つのタンパク質目的物について複数の定量的測定を行う能力によって方法の定量的精度が高められる。別々にグアニジン化されたタンパク質の混合物の消化から、又はグアニジン化されたタンパク質混合物の消化から得られるペプチド混合物は、例えば、クロロスルホニルアセチルクロリド(実施例2、18を参照のこと)のような種々のスルホン化試薬を用いてN末端にて、本明細書に記載されるように酸性基で誘導体化することができる。次いで、質量分析法(例えば、MALDIポストソース崩壊又はエレクトロスプレータンデム質量分析法)を用いてスルホン化されたペプチドの新規配列決定を行う。得られる質量分析のフラグメンテーションパターンは主としてy−イオンを呈する。所望の形態を明瞭に選択するのに十分な解像度を有する質量分析計を用いて、グアニジン化されたペプチドのいずれかの同位体形態でタンデム質量分析法による配列決定実験を行う。別の方法としては、タンデム質量スペクトルに寄与するグアニジン化ペプチドイオンの両方の同位体形態でペプチド配列決定実験を行う。この後者の方法も主としてy−イオンから成るスペクトルを生じる。しかしながら、各y−イオンは、付加されたグアニジニウム基の同位体として重い形態と軽い形態の間の既知の質量差によって分離される「二重」成分として観測される。ペプチドの配列は、上述のように隣接するy−イオンの質量差を測定することによって配置される。対照試料及び実験試料におけるタンパク質の相対量は、グアニジン化されたペプチドにおけるy−イオン二重成分のそれぞれについて観測される各同位体の量比を測定することにより独立して決定される。この技術によって、同一の実験から定量的タンパク質解析及び新規のペプチド配列決定の双方が提供される。定量的プロテオミクスの適用に特に有用であるはずである。
【0094】
本発明のキット
本発明のさらなる実施形態は、ポリペプチドのアミノ酸配列を決定するのに利用されてもよいキットである。キットは以下を含む:
(a)ポリペプチド又はポリペプチドの1つ以上のペプチドとカップリングするときに約2未満のpKaを有する酸性部分を提供する1つ以上の酸性部分試薬;及び
(b)1つ以上の酸性部分試薬でポリペプチドのN末端又はポリペプチドの1つ以上のペプチドのN末端を誘導体化するための手段
(c)リジン側鎖をさらに強い塩基性の基、固定的に荷電した誘導体又は同位体で標識した基に変換する1つ以上の試薬;及び
(d)ポリペプチドのリジン側鎖又はポリペプチドの1つ以上のペプチドのリジン側鎖におけるイプシロンアミノ基をリジン修飾試薬で誘導体化する手段。
本発明のキットは、例えば1998年10月27日に発行され、パーセプティブバイオシステムズ社(PerSeptive Biosystems、 Inc.)に譲渡されたパターソン(Patterson)らの米国特許第5,827,659号に記載されるサンプルホルダーとして同様の形式にて質量分析計に適合してもよい。
【0095】
任意で、キットはさらに、例えば、質量分析技術の精度を調べるための1つ以上の検定用ペプチドを含んでもよい。参照の質量スペクトルデータも任意で包含されてもよい。
キットに包含されてもよい酸性部分試薬及びリジン修飾試薬の一部は上述されている。
誘導体化するための特に好ましい手段には、誘導体化されたポリペプチド又はペプチドを入手することに関心のある分析者又はその他の人に都合の良い誘導体化ができるようなものが挙げられる。誘導体化するのに特に好ましい手段は、例えば酸性部分試薬及び/又はリジン修飾試薬及び最終的に関心のあるポリペプチド/ペプチドを含有する1つ以上の格納装置を含む。
【0096】
好適な格納装置には、例えば、バイアル瓶、チューブ、ピペットチップ、プレート、サンプルホルダー、及び多穴プレートが挙げられる。誘導体化試薬が格納装置の中に入っているので分析者によって添加される必要がない任意の好都合が提供される。例えば、酸性部分試薬は、ピペットチップの内部に存在し、ポリペプチド、ペプチド又はリジン修飾ポリペプチド又はペプチドが好適な緩衝液とともにチップの中に吸い込まれたとき活性化されてもよい。格納装置は最も好ましくは使い捨てであるが、そうである必要はない。
誘導体化試薬は固体支持体に結合されてもよい。例えば、試薬はピペットチップの内部で支持体に結合してもよいし、多穴プレートの穴にコーティングされてもよい。関心のあるポリペプチド又はペプチドを適当な緩衝系に溶解し、結合された試薬の上に繰り返しかけてもよいし、又は試薬がコーティングされた多穴プレートの中で反応させてもよい。反応後、適当量の誘導体化したポリペプチド又はペプチドを直接MALDI質量分析法試料ステージに負荷してもよいし、又はエレクトロスプレーイオン化質量分析装置に注入してもよい。
【0097】
誘導体化を促進する1つ以上の緩衝系も本発明のキットに包含されてもよい。包含されるのに適当な緩衝系は包含される誘導体化試薬に依存する。好ましい緩衝系の例は、上記誘導体化の実施例で開示されている。特に好ましい緩衝系には、第3級アミン溶液(水性及び非水性の両方(例えば、テトラヒドロフランの溶液))及び原液の第3級アミンが挙げられるが、これに限定されない。特に好ましい第3級アミン類には、トリメチルアミン、トリエチルアミン、及びジイソプロピルエチルアミンが挙げられる。
本発明のキットはまた、本明細書で上記したもののようなさらなる消化助剤の1つを含んでもよい。消化助剤は化学的であっても、酵素的であってもよい。例えば、トリプシン、エンドプロテイナーゼLys C、エンドプロテイナーゼArg C、及び/又はキモトリプシン、好ましくは、トリプシン、エンドプロテイナーゼLys C、及び/又はエンドプロテイナーゼArg C、及び最も好ましくはトリプシンが消化助剤として挙げられ得る。臭化シアンのような化学的消化助剤も本明細書に包含され得る。
(相互参照)
本出願は、2000年7月25日出願の米国仮出願第60/220,564号の利益を請求するものである。
(発明の分野)
本発明は、質量分析技術を用いてポリペプチドの配列決定を可能にする方法及びキットに関する。前記方法及び前記キットは、例えば、生物学分野、製薬分野、身体洗浄分野、及び布地洗浄分野において使用するための高分子量のポリペプチドを同定するのに特に有用である。
【0002】
(発明の背景)
高感度のペプチド及びポリペプチドの配列決定に適用するために、最近、マトリクス支援レーザー脱離イオン化(MALDI)質量分析法及びエレクトロスプレーイオン化が開発された。例えば、スペングラー(Spengler)らの、「マトリクス支援レーザー脱離質量分析法によるペプチド配列決定」ラピッドコミュニケーションズインマススペクトロメトリー(Rapid Communications in Mass Spectrometry)、第6巻の105〜108ページ(1992年);スペングラー(Spengler)らの「マトリクス支援レーザー脱離質量分析法におけるポストソース崩壊の基本的性状」ジャーナルオブフィジカルケミストリ(Journal of Physical Chemistry)、第96巻の9678〜9684ページ(1992年);コッフマン(Kaufmann)らの「マトリクス支援レーザー脱離イオン化を用いた反射飛行時間質量分析計におけるプロダクトイオン分析による線状ペプチドの質量分析配列決定」、ラピッドコミュニケーションズインマススペクトロメトリー、第7巻902〜910ページ(1993年);コッフマン(Kaufmann)らの「飛行時間質量分析計におけるペプチドの配列決定:マトリクス支援レーザー脱離イオン化(MALDI)後のポストソース崩壊の評価」、インターナショナルジャーナルオブマスススペクトロメトリー、アンドイオンプロセス(International Journal of Mass Spectrometry and Ion Processes)、第131巻355〜385ページ(1994年);コッフマン(Kaufmann)らの「マトリクス支援レーザー脱離/イオン化反射飛行時間質量分析法におけるポストソース崩壊及び遅延抽出」、ラピッドコミュニケーションズインマススペクトロメトリー第10巻1199〜1208ページ(1996年);及びスペングラー(Spengler)の「生体分子のマトリクス支援レーザー脱離/イオン化質量分析法におけるポストソース崩壊の分析」ジャーナルオブマススペクトロメトリー第32巻1019〜1036ページ(1997年);カール(Carr)らの「分析バイオテクノロジーにおける質量分析法の統合」、アナリティカルケミストリ(Analytical Chemistry)第63巻2802〜2824ページ(1991年);イエーツ(Yates)3世らの「MSによるゲノムの採掘」、アナリティカルケミストリ第68巻534A〜540Aページ(1996年);モリス(Morris)らの「新規の四重極/直交加速飛行時間質量分析計における高感度衝突活性化タンデム質量分析法」、ラピッドコミュニケーションズインマススペクトロメトリー第10巻889〜896ページ(1996年)を参照のこと。
【0003】
MALDIは、質量分析法の分野に幾つかの利点を提供している。例えば、MALDIは、従来のエレクトロスプレー三連四重極型装置よりも高い感度を提供する。飛行時間質量分析計と組み合わせて用いると、MALDIは、三連四重極型装置で分析することができるペプチドよりも大きな質量のペプチドに適用可能である。MALDIは、最低限の試料精製を行った複雑な混合物を分析するのにも有用である。一方、エレクトロスプレーイオン化は、液体クロマトグラフィー(LC)及び種々の型のキャピラリー電気泳動(CE)を含む強力な分離技法に容易に接続される。LC及びCEを試料の精製及び装置への導入に用いる場合、高度に自動化された分析が可能である。
【0004】
しかしながら、現在のMALDI及び、より少ない程度でエレクトロスプレーイオン化質量分析法は、予測可能なタンデム質量分析法のフラグメンテーションパターンを適切に提供することができない。例えば、複数のイオンシリーズ(a−イオン、b−イオン、及びy−イオンを含む)が通常観測され、その結果、MALDIのポストソース崩壊スペクトルが生じ、それは、効率的に解釈し、配列決定するには複雑すぎる。エレクトロスプレーイオン化により生じる多様に荷電した前駆体イオンから、複数のイオンシリーズ(b−及びy−イオン)に加えて内部フラグメント及び単一に荷電した及び多様に荷電したイオンの両方が形成され、その結果生じるタンデム質量スペクトルは新規で解釈するのは難しいことが多い。従って、フラグメンテーションに関連する問題は、質量分析法を用いてポリペプチドを迅速に配列決定する能力を制限している。その結果、質量分析法、及び特に、MALDI質量分析法はこの領域での価値が限定されている。
【0005】
幾つかの研究グループが、化学的な誘導体化技法を介してポリペプチドの配列決定の分野における質量分析法の有用性を改善しようと試みている。かかる技法は、感度を高め、生じるスペクトルの複雑さを減らすことを目指して、ペプチドのMSMSスペクトルにおいてフラグメンテーションを促進し、それを方向付けるのに利用されてきた。このような既知の技法のほとんどは、陽イオン系誘導体を提供している。例えば、キッドウエル(Kidwell)らの「二次イオン質量分析法によるペプチドの配列決定」、ジャーナルオブアメリカンケミカルソサエティ(Journal of the American Chemical Society)、第106巻2219〜2220ページ(1984年)(四級アンモニウム基による誘導体化、静電気SIMSイオン化法を用いた分析(MALDI及びエレクトロスプレーイオン化の双方が開発される前))を参照のこと。低エネルギー衝突活性化によるMALDI及びエレクトロスプレーイオン化を用いたかかる技法の適用は、一般に有効であるとは証明されていない。
【0006】
さらに最近、質量分析法を用いたペプチド/ポリペプチドの配列決定を強化するために、研究者はその他の誘導体化技法を利用している。例えば、トリプシンペプチド(トリプシンによる消化を介して作製したペプチド)に存在するシステイン残基の酸化が、エレクトロスプレータンデム質量分析法を用いたフラグメンテーションを改善する可能性があることが明らかにされている。例えば、ガスケル(Gaskell)らの「気相ペプチドイオンの低エネルギー分解におけるプロトン化の部位の役割」、ジャーナルオブザアメリカンソサエティオブマススペクトロメトリー(Journal of the American Society of Mass Spectrometry)第7巻522〜531ページ(1996年)及びガスケル(Gaskell)らの「プロトン化したペプチドの衝突活性化分解におけるシステイン酸酸化に対するシステインの影響:イオン内相互作用の証拠」、ジャーナルオブザアメリカンソサエティオブマススペクトロメトリー第3巻337〜344ページ(1992年)を参照のこと。
【0007】
具体的には、y−イオンのフラグメンテーションが促進された。しかしながら、この技法は幾つかの制限を有する。例えば、この技法は、MALDI法に拡張されなかった。その技法はまた、解析されるべき配列の中に存在するシステイン残基を有するポリペプチドの解析に制限される。実際、天然に生じるポリペプチドにはシステインはむしろ希にしか存在せず、この技法の有用性に重大な制限を与えている。
従って、簡便で、効率的で、そして野生型及び変異型のポリペプチドに広く適用可能である、ポリペプチドの配列決定を行う質量分析法を提供するというニーズがある。本発明者らは本明細書にて質量分析技術を用いた高感度のポリペプチドの配列決定法を提供する。本発明者らは相対的に強い酸基で誘導体化されたポリペプチド及びそのペプチドはほぼ独占的にy−イオンのフラグメンテーションを提供し、その結果、新規に解釈し易いスペクトルを生じることを発見した。本発明はまた、本方法を都合よく実行可能にするために用いられるキットにも関する。
【0008】
(発明の概要)
本発明は、ポリペプチドの配列決定を行うのに特に有用である質量分析方法及びキットに関する。前記方法には、ポリペプチドのアミノ酸配列を決定することが含まれ、その工程は:
(a)ポリペプチド又はペプチドとカップリングするとき、約2未満のpKaを有する1つ以上の酸性部分でポリペプチドのN末端又はポリペプチドの1つ以上のペプチドのN末端を誘導体化し、1つ以上の誘導体化された検体を提供すること;
(b)質量分析技術を用いて1つ以上の誘導体化された検体を分析し、フラグメンテーションパターンを提供すること;及び
(c)フラグメンテーションパターンを解釈することを含む。
【0009】
ポリペプチドの1つ以上のペプチドがリジン残基を有する、本発明のもう1つの実施形態では、リジン側鎖のイプシロンアミノ基が、ホモアルギニンのような極めて強い塩基性の基への変換又は固定された陽イオン基の付加によって修飾される。ポリペプチドの1つ以上の適宜修飾ペプチドが、次いで上記で概略された(a)〜(c)の工程に従って配列決定される。
【0010】
本発明のさらなる実施形態では、同位体で標識されたリジンを修飾する試薬が質量分析法とともに用いられ、複雑な混合物におけるタンパク質のレベルを定量する。例えば、ガイギ(Gygi)らの「同位体をコード化した親和性タグを用いた複雑なタンパク質の混合物の定量的分析」、ネイチャーバイオテクノロジー(Nature Biotechnology)第17巻994〜999ページ(1999年)を参照のこと。例えば、2つのタンパク質混合物(対照及び実験試料)を別々に修飾する。一方のタンパク質混合物を天然に豊富な同位体の比を有するリジン修飾試薬で標識する。もう一方のタンパク質混合物を同じリジン修飾試薬の重い同位体を濃縮した形態(1つ以上の2H、13C15N)で標識する。2つのタンパク質試料を合わせ、分離する(例えば、ゲル電気泳動又はHPLCを用いて)。続いて、当該タンパク質を適当な手段で消化し、質量分析法により解析する。軽いリジン修飾ペプチドに対する重いリジン修飾ペプチドの実験的に観測される比を用いて、2つの試料のタンパク質の相対的なレベルを正確に定量する。
【0011】
本発明のキットは、ポリペプチドとカップリングするとき約2未満のpKaを有する酸性部分を提供する1つ以上の酸性部分の試薬;及びポリペプチドのN末端又はポリペプチドの1つ以上のペプチドのN末端を1つ以上の酸性部分試薬で誘導体化するための手段を含む。キットはまた、リジン側鎖のイプシロンアミノ基を誘導体化するための1つ以上の試薬も包含する。本キットは方法の性能と合わせて特に有用である。
【0012】
(発明の詳細な説明)
本発明の方法及びキットは、例えば、野生型、変異型、及び/又は合成のポリペプチドを含む配列決定を行うのに有用である。前記方法及び前記キットは、例えば、生物学分野、製薬分野、身体洗浄分野、及び布地洗浄分野において使用するための高分子量のポリペプチドを同定するのに特に有用である。
本方法及びキットは幅広い有用性を有する。適用には:例えば、市販の洗濯及び洗浄製品;遺伝子クローニングのためのオリゴヌクレオチドプローブの設計を助けること;方向性を持った進化研究において形成される生成物の迅速な性状分析;コンビナトリアル化学及びペプチドライブラリの同定;及びプロテオミクスにおいて用いられるもののような、ペプチド又はポリペプチドの配列の迅速な決定を必要とする生物学研究の促進;タンパク質における翻訳後修飾の同定及び変異型タンパク質におけるアミノ酸修飾の同定が挙げられるが、これに限定されない。
【0013】
本方法には質量スペクトル分析の前に、1つ以上の相対的に強い酸基をポリペプチド又はポリペプチドの開裂を介して形成される1つ以上のペプチドのN末端に付加することが含まれる。理論によって制限されることを意図せず、結果的に生じる負に荷電した誘導体は、低エネルギーの荷電部位で開始するフラグメンテーションを促進すると考えられている。このことは、ポリペプチド又はそのペプチドのC末端が塩基性又は疎水性、好ましくは塩基性残基である場合、特に有効である。C末端にリジンを含有するペプチドについては、リジン側鎖の適当な修飾によってこの方法の有効性をさらに改善することができる。適当な修飾には、リジンをホモアルギニンに変換すること、又は固定陽イオン基をリジン側鎖のイプシロンアミンに付加することが挙げられるが、これに限定されない。再び、理論による限定なしに、質量スペクトル分析の間に塩基性残基がプロトン化される場合、相対的に強い酸基が脱プロトン化され、塩基性残基における正の電荷の対抗平衡をとると考えられている。四級化されたリジン側鎖の場合、固定された正の電荷もまた、脱プロトン化された強酸によって提供される負の電荷について対抗平衡をとる。それぞれの場合で、誘導体をイオン化するのに追加のプロトンが必要とされ、ほとんどの塩基性残基はすでにプロトン化されるか、又は四級化されているので、それは実質的に「遊離」ポリペプチド/ペプチドの主鎖アミド基を無作為にイオン化する。さらに、理論による限定なしに、2番目に相対的に強い酸基がポリペプチド/ペプチドに組み入れられ、2つの酸基が脱プロトン化される場合、2つの実質的に「遊離」のプロトンが提供されてポリペプチド/ペプチドの主鎖アミド基を無作為にイオン化すると考えられている。
【0014】
本方法の利用はフラグメンテーション効率の有意な上昇を提供する。さらに、同一配列を有する誘導体化されていないペプチドに比べて、誘導体化されたペプチドでは、フラグメントイオンのノイズに対するシグナルの比の上昇が観測される。得られた単純なPSD MALDI及びエレクトロスプレータンデム質量スペクトルは、日常的に新規で解釈することができる。
本開示全般にわたり、出版物及び特許を参照する。本明細書中で引用された全ての参考文献は、参考として本明細書に組み入れられる。
本明細書において用いられる全ての比率は、特に明記しない限り重量に基づく。
本明細書で使用されるとき、略語はアミノ酸を記載するのに用いられる。かかる略語を以下の表Iに記載する。さらに、表Iで記載されているのは、本発明の実践に有用であるアミノ酸残基の平均質量である。修飾リジンのリジン残基の質量は、天然に豊富な又は重い同位体を濃縮したリジン修飾試薬で誘導体化した後、適当に調整しなければならない。
【0015】
【表1】
【0016】
(定義)
本明細書で使用されるとき、用語「脱離イオン化」は固相から気相へのイオンとしての検体の転移をいう。
本明細書で使用されるとき、用語「脱離」は表面からの検体の離脱及び/又は検体の気相への流入をいう。
本明細書で使用されるとき、「イオン化」は、正又は負の1以上の電子単位に等しい電荷を検体に創製する又は保持する過程をいう。
本明細書で使用されるとき、用語「MALDI」はマトリクス支援レーザー脱離イオン化をいう。
【0017】
「MALDI」に関連して本明細書で使用されるとき、用語「マトリクス」は、当該ポリペプチド、又はかかる様式で当該ペプチドと溶液中で混合してもよいので、試料段階で乾燥するとき、結晶性のマトリクスに埋め込まれた検体が、レーザー照射の後、固相から気相又は蒸気相に上手く脱離し、イオン化することができる小型の酸性の光を吸収する化学物質をいう。別の方法としては、ポリペプチド又はそのペプチドの溶液を、試料段階で予備乾燥される適当なマトリクスに装填してもよい。好適なマトリクスの非限定例には、ニコチン酸、シナピン酸、フェルラ酸、コーヒー酸、a−シアノ−4−ヒドロキシ桂皮酸、及びニトロセルロースと混合したa−シアノ−4−ヒドロキシ桂皮酸が挙げられる。
【0018】
本明細書で使用されるとき、用語「エレクトロスプレーイオン化」は、接地した対抗電極に関して高い電圧にてキャピラリー電極から溶液を静電気的にスプレーすることによって溶液からイオンを製造する工程をいう。その定義は、エレクトロスプレーイオン化及びイオンスプレーともいわれる空気圧支援のエレクトロスプレーイオン化の双方を包含することを意図する。本明細書で使用されるとき、用語「エレクトロスプレーイオン化」は、あらゆる液体の流速に適用され、ミクロスプレー実験及びナノスプレー実験を包含することを意図する。さらに、その定義は、分離せず直接イオン源に注がれるペプチドの分析、及びエレクトロスプレーイオン化に先立って分離されるペプチド又はペプチド混合物の分析に適用することを意図する。好適な直結式分離法にはHPLC、キャピラリーHPLC及びキャピラリー電気泳動が挙げられるが、これに限定されない。エレクトロスプレーイオン化実験は、三連四重極型、イオントラップ型、直交式加速飛行時間分析計及びフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴装置を含むが、これに限定されない種々の質量分析計で行うことができる。
【0019】
本明細書で使用されるとき、用語「ポリペプチド」は2つ又はそれ以上のアミノ酸残基を有する分子をいう。本発明の方法は、大きい質量のポリペプチドの配列同定に好適である。
本明細書で使用されるとき、用語「野生型」は、突然変異していない生物によって産生されるポリペプチドをいう。
本明細書で使用されるとき、用語「変異型」は、野生型のポリペプチドとは異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドをいう。
本明細書で使用されるとき、用語「強い塩基性の基」は、グアニジニウム基のような基を含むが、これに限定されない9.5より大きいpKaを持つ官能基をいう。
本明細書で使用されるとき、用語「固定された陽イオンに荷電した基」は、四級アミン、スルホニウム又はピリジニウムのような官能基を含むが、これに限定されない永続的に正の電荷を含む基をいう。
【0020】
本明細書で使用されるとき、用語「同位体で標識された基」は、15Nを含有するグアニジニウム基、13Cを含有する四級アミン類及び18Oを含有するベタイン類のような基を含むが、これに限定されない、原子の最も一般に天然で豊富な同位体よりも分子量において大きい又は小さい同位体について濃縮されている少なくとも1種の原子を含む基をいう。2H又は37Cl又は81Brのようなハロゲンを含有する基も用いることができる。
【0021】
本発明の方法
本方法は、複雑なタンパク質混合物における相対的なタンパク質のレベルを定量するのに、及びポリペプチドのアミノ酸配列を決定するのに有用である。語句「アミノ酸配列を決定すること」によって、本発明者らは、所与のポリペプチドの配列全体を決定することに限定することを意図しない。むしろ、この語句によって、本明細書では、部分(単数)、部分(複数)、及び/又は全体の配列が決定されることを意味する。
本方法には、質量スペクトル分析のために、1つ以上の相対的に強い酸基をポリペプチド又はその1つ以上のペプチドのN末端に付加して1つ以上の誘導体化された検体を製造することが関与する。次いで、質量分析技術を用いてポリペプチド/ペプチドを分析し、フラグメンテーションパターンを提供する。得られたフラグメンテーションパターンを解釈し、それによってポリペプチドの配列が与えられる。
【0022】
本発明者らは、誘導体化する基の酸性度(酸性部分)が結果として生じる質量スペクトルに深遠な影響を有することを発見した。驚くべきことに、ポリペプチド又はそのペプチドとカップリングするとき、約2未満のpKaを有するような酸性部分は、所望の配列情報を提供するのに解釈し易いフラグメンテーションパターンを生じる。当業者は、当該技術分野において既知の常法を用いて本明細書に記載されるpKa値を測定するのに適任である。かかる方法の非限定例には、例えば、滴定法及び電気化学的方法が挙げられる。pKa値を測定する好ましい方法は滴定を介するものである。
【0023】
本発明者らは、ペプチドの遊離のN末端をスルホン化する前に、リジン側鎖のイプシロンアミノ基を修飾してその塩基性度を高めることによって、又は、そのような側鎖に固定された陽イオン基を付加することによって、リジン含有ペプチドについて、質量分析法による配列決定の結果の質を改善することができることを発見した。遊離のN末端アミンにおける明らかな競合反応がなく、加水分解のような明らかな望ましくない副反応もなく、ペプチドのリジン側鎖におけるイプシロンアミノ基を効率的に塩基性度の高いグアニジニウム基に変換することができる(例えば、キメル(Kimmel)の「タンパク質のグアニジン化」、メソッドインエンザイモロジー(Methods in Enzymology)第11巻584〜589ページ(1967年)及びボネット(Bonetto)らの「Lys及びCys残基の誘導体化後、カルボキシペプチダーゼ及び質量分析法を用いたペプチド及びタンパク質のC末端配列の解析」、アナリティカルケミストリ(Analytical Chemistry)第69巻1315〜1319ページ(1997年)を参照のこと)。次いで、リジン修飾ペプチドの遊離のN末端アミンをスルホネート基で誘導体化し、次いで、我々の以前の出願(P&G特許7379P2)に記載されている質量分析法を用いてペプチドの配列を新規に決定する。別の方法としては、N末端のスルホン化反応とC末端のリジンの修飾反応の順を逆にすることができる。
【0024】
原則として、グアニジン化反応とスルホン化反応は、反応条件の適切な制御によっていずれの順でも行うことができる。しかしながら、非水性条件下で極めて反応性の高いスルホン化化合物(例えば、実施例2及び8)を用いる場合、先ず、リジン側鎖をグアニジン化することが好ましい。リジンのホモアルギニンへの選択的変換は、極めて強い塩基性の基によってリジン側鎖を効率的に保護する。次いで、リジンイプシロンアミノ基が望ましくなくスルホン化されることなく、リジンが保護されたペプチドをN末端で選択的にスルホン化することができる。この戦略によって質量分析法によるリジン終結ペプチドの新規のペプチド配列決定が円滑になる。
【0025】
ジイソプロピルエチルアミン(DIEA)のような有機塩基の存在下でグアニジン化反応を行うことは、高いpH(>13)でNaOHの存在下でグアニジン化を行うときに観測されることが多い望ましくないペプチドの加水分解を最小限に抑える。揮発性の有機塩基(NaOHの代わりに)の存在下で調製される低レベルの試料も質量分析法による配列決定に先立ってさらにクリーンアップし易い。
別の方法としては、緩衝化した水性媒体中(例えば、pHが6.5である実施例1を参照のこと)でスルホン化反応を行うことにより、先ず、リジン終結ペプチドのN末端をスルホン化することができる。次いで、過剰のスルホン化試薬を取り除き、リジン側鎖のイプシロンアミノ基を、O−メチルイソ尿素又はその塩でグアニジン化するか、又はそれを四級アンモニウム基に変換する。イプシロンアミンを四級化する方法の1つは、無水イソ酢酸との反応、その後トリメチルアミンとの反応による。この工程はアミンをベタインに変換する。例えば、スタルツ(Stults)らの「アミノ末端誘導体化によるペプチドの高エネルギー衝突スペクトルの簡略化」、アナリティカルケミストリ(Anal.Chem.)第65号1703〜1708ページ(1993年)を参照のこと。
【0026】
本発明の方法は以下のように行ってもよい:
ポリペプチド及び/又はポリペプチドのペプチドの誘導体化:
N末端の誘導体化:
本発明の重要な特徴は、1つ以上の相対的に強い酸、すなわち、ポリペプチド又は前記ポリペプチドのペプチドとカップリングするとき約2未満、好ましくは約0未満、及びさらに好ましくは約−2未満のpKaを有する酸性部分による関心のあるポリペプチド又はポリペプチドのペプチドの誘導体化である。「ポリペプチドのペプチド」によって、本明細書では、ポリペプチドが2つ又はそれ以上のペプチドに消化される、さもなければ切断される(本明細書では、まとめて「消化」などと呼ぶ)ことを意味する。本方法に従って得られたペプチドを誘導体化する。「カップリングするとき」によって本明細書では、本明細書のポリペプチド又はペプチドと共有結合した後、測定されるとき酸性部分のpKaが定義されることを意味する。
【0027】
ポリペプチド又はそのペプチドはいかなる手段で製造してもよい。例えば、必要であれば関心のあるポリペプチドは分析のために単離される。例えば、一次元及び二次元のゲル電気泳動を含む幾つかの方法が単離に利用されてもよい。もう1つの実施例として、ポリペプチドは、当該技術分野において周知のコンビナトリアル化学の方法を介して合成されてもよい。
【0028】
消化は、ゲル中又は膜上、好ましくはゲル中を含む、多数の方法を介して生じてもよい。例えば、シェブチェンコ(Shevchenko)らの「銀染色ポリアクリルアミドゲルからのタンパク質の質量分光分析による配列決定」。アナリティカルケミストリ(Analytical Chemistry)第68巻850〜858ページ(1996年)を参照のこと。しかしながら、酵素的に又は化学的に、好ましくは酵素的にポリペプチドを消化することが可能である。塩基性の残基又は疎水性の残基、最も好ましくは塩基性の残基を得られるペプチドのC末端にて又はその近傍で生じる消化方法を利用することが最も好ましい。「にて」によって本明細書では、塩基性の残基又は疎水性の残基がペプチドのC末端残基であることを意味する。「近傍で」によって本明細書では、塩基性の残基又は疎水性の残基が、好ましくはペプチドのC末端から約40アミノ酸残基の範囲内、さらに好ましくは約30残基の範囲内、一層さらに好ましくは約20残基の範囲内、及び最も好ましくはペプチドのC末端から約10アミノ酸残基の範囲内にあることを意味する。
【0029】
この手順には多くの方法を利用してもよいが、例えば、トリプシン、エンドプロテイナーゼLys C、エンドプロテイナーゼArg C、又はキモトリプシン、好ましくは、トリプシン、エンドプロテイナーゼLys C、又はエンドプロテイナーゼArg C、及び最も好ましくはトリプシンを用いてポリペプチドを酵素的に消化することが好ましい。当然、ポリペプチドの元来のC末端の例外は伴うが、得られるポリペプチドのペプチドが通常、C末端にてアルギニン残基又はリジン残基(塩基性残基)で終結するので、トリプシン、エンドプロテイナーゼLys C、及びエンドプロテイナーゼArg Cが好ましい。特に、得られるペプチドのC末端にて又はその近傍で塩基性残基が生じるのであれば、その他の酵素も好適である。通常、疎水性のアミノ酸残基を切断するキモトリプシンも消化には好ましい。化学的消化も有用である。例えば、臭化シアンによる消化が有用である。
【0030】
本発明の方法は、特にその中に記載された消化技法に関して1998年10月13日に発行され、パーセプティブバイオシステムズ社(PerSeptive Biosystems、Inc.)に譲渡されたパターソン(Patterson)らの米国特許第5,821,063号に基づいて適用される。例えば、本発明に基づいて、ポリペプチドに対する作用剤の異なった比を有する複数の試料を利用してもよく、誘導体化してもよい。
しかしながら、特に、小型のポリペプチドを配列決定する場合(確実に限定されるわけではないが)、消化がいつも必要なわけではない。本明細書で使用されるとき、「小型の」ポリペプチドは、好ましくは約50未満のアミノ酸残基、さらに好ましくは約40未満の残基、一層さらに好ましくは約30未満の残基、尚さらに好ましくは約20未満の残基、及び最も好ましくは約10未満のアミノ酸残基を有するものを包含する。
【0031】
例えば、コンビナトリアル化学法を含む周知の手段によって合成されるポリペプチドが特徴付けられてもよい(「合成ポリペプチド」)。この例では、得られるポリペプチドのC末端にて又はその近傍で塩基性の残基又は疎水性の残基、好ましくは塩基性の残基(最も好ましくはアルギニン、ホモアルギニン又はリジン)を有するポリペプチドを合成することが最も好ましい。
【0032】
ポリペプチド(前記ポリペプチドが本明細書の上記で定義されるように十分に「小型」であれば)又は前記ポリペプチドのペプチドが、約2未満、好ましくは約0未満、及び最も好ましくは約−2未満のpKa(ポリペプチド又はペプチドとカップリングするとき)を有する1つ以上の酸性部分によって誘導体化され、誘導体化された検体を提供する。誘導体化された検体の酸性部分は酸性部分試薬とのカップリンングによって調製される。ポリペプチド又はそのペプチド上の酸性部分が結果として本明細書に記載されるpKaを有するという条件で、酸性部分試薬は限定されない。カップリングに利用してもよい酸性部分試薬の非限定例には、例えば、ジチオビス(スルホスクシンイミジルプロピオネート)、S−アセチルメルカプトコハク酸無水物、2−イミノチオレート(トラウトの試薬とも呼ばれる)、ジチオジグリコール酸無水物、テトラフルオロコハク酸無水物、ヘキサフルオログルタール酸無水物、スルホコハク酸無水物、環状2−スルホ安息香酸無水物、シクロスルホニルアセチルクロリド、及び1,3−プロパンスルトンが挙げられる。S−アセチルメルカプトコハク酸無水物、2−イミノチオラン、及びジチオジグリコール酸無水物のような試薬の使用は、酸性部分を生じるにはペプチドによる誘導体化した後、酸化を必要とする。酸化工程を必要としない酸性部分試薬には、例えば、テトラフルオロコハク酸無水物、ヘキサフルオログルタール酸無水物、スルホコハク酸無水物、環状2−スルホ安息香酸無水物及びクロロスルホニルアセチルクロリドが挙げられる。さらに効率的な合成及び/又はポリペプチド又はそのペプチドにおける不安定な残基の複雑な酸化の欠如のために、このような試薬が好まれることが多い。システインスルフヒドリル側基のシステイン酸への酸化がその後に続く、システイン含有ペプチドのN末端への酸性部分試薬のカップリングは、2つの酸性部分(スルホン酸)を含有するペプチドを作製する1つの手段である。
【0033】
酸性部分は最も好ましくはスルホン酸である。この中で、さらに好ましい酸性部分には、2−スルホアセチル部分、3−スルホプロピオニル部分、及び2−スルホベンゾイル部分が挙げられる。
ジスルホン酸誘導体の使用も好ましい。ジスルホン酸誘導体の使用は好ましくは、ペプチドのN末端の近傍で両方のスルホン酸基を生じる。例えば、システインスルフヒドリル側基のシステイン酸への酸化がその後に続く、システイン含有ペプチドのN末端への酸性部分試薬のカップリングは、2つの酸性部分(スルホン酸)を含有するペプチドを作製する1つの手段である。
【0034】
リジン側鎖のイプシロンアミノ基の修飾:
前の項で記載されるように作製されたリジン含有ペプチドについては、リジン側鎖のイプシロンアミノ基をさらに塩基性の基に選択的に変換することによって、又は固定的な陽イオン基をリジン側鎖に付加することによって、この配列決定法の有効性が強化されることが多い。このような後者のペプチド修飾は、前の項で議論したN末端スルホン化反応に加えて行われる。
リジン修飾試薬の非限定例は、O−メチルイソウレア水素サルフェート、O−メチルイソウレアサルフェート及びO−メチルイソウレア塩酸塩、並びにメシレート、アセテート、ブロミド、ピクレート、p−トルエンスルホネート及びベンゾエートの塩を含むO−メチルイソウレアのその他の塩である。
当業者は、本発明によって必要とされる相対的に単純なカップリング手順を実行する能力を有する。しかしながら便宜上、関心のあるポリペプチド、又は前記ポリペプチドのペプチドの誘導体化の非限定例を以下に説明する:
【0035】
(実地例)
実施例1
【0036】
【化1】
【0037】
環状2−スルホ安息香酸無水物(ウィスコンシン州ミルウォーキーのアルドリッチケミカル社(Aldrich Chemical Co)から市販されている)を使用前に無水テトラヒドロフランで0.1Mの濃度に調製する。ポリペプチドASHLGLAR(1nM、ミズーリ州セントルイスのシグマケミカル社(Sigma Chemical Co.)から市販)(SEQ ID NO:1)を20μLの0.05Mトリメチルアミンで希釈する。環状2−スルホ安息香酸無水物溶液(2μL)を加え、反応混合物を30秒間攪拌する。室温にて反応を約2分間進め、その後、生じた誘導体化された検体を希釈し、質量スペクトルを解析する。酸性部分試薬の濃度は、さらに少ない量を誘導体化する場合、100という因数で減らす。
【0038】
実施例2
【0039】
【化2】
【0040】
ASHLGLAR(1nM、ミズーリ州セントルイスのシグマケミカル社(Sigma Chemical Co.)から市販)(SEQ ID NO:1)を、2μLの原液クロロスルホニルアセチルクロリド(ウィスコンシン州ミルウォーキーのアルドリッチケミカル社(Aldrich Chemical Co)から市販されている)を500μLの水と混合することにより形成される2μLの0.02Mスルホ酢酸と混合する。混合物を乾燥し、次いで20μLのテトラヒドロフラン:ジイソプロピルエチルアミン(4:1v:v)で再構築する。無水テトラヒドロフラン中の0.1Mのクロロスルホニルアセチルクロリド(2μL、ウィスコンシン州ミルウォーキーのアルドリッチケミカル社(Aldrich Chemical Co)から市販)を加え、混合物を30秒間攪拌するする。室温にて、誘導体化反応をおよそ2分間進める。誘導体化された検体を乾燥し、20μLの水で再構築し、さらに希釈して、質量スペクトル分析にかける。クロロスルホニルアセチルクロリドは、2Dゲル単離の誘導体化の有用な試薬でもあるが、改変した合成手順は、さらに一貫した生成物収量を提供する。改変した手順は実施例14で議論する。
【0041】
実施例3
【0042】
【化3】
【0043】
S−アセチルメルカプトコハク酸無水物(ウィスコンシン州ミルウォーキーのアルドリッチケミカル社(Aldrich Chemical Co)から市販)を使用前に無水テトラヒドロフランで0.1Mの濃度に調製する。ASHLGLAR(1nM、ミズーリ州セントルイスのシグマケミカル社(Sigma Chemical Co.)から市販)(SEQ ID NO:1)を20μLの0.05Mトリメチルアミンで希釈する。S−アセチルメルカプトコハク酸無水物溶液(5μL)を加え、反応混合物を30秒間攪拌する。室温にて反応を約2分間進め、次いで、19:1(v:v)の比に調製した10μLのギ酸(88%):H2O2(30%)により酸化する。室温にて16時間酸化を進め、試料を乾燥した後、希釈して、質量スペクトル分析を行う。酸性部分試薬の濃度は、さらに少ない量を誘導体化する場合、100という因数で減らす。
【0044】
実施例4
【0045】
【化4】
【0046】
0.1Mのトリメチルアミン(20μL)中のASHLGLAR(1nM、ミズーリ州セントルイスのシグマケミカル社(Sigma Chemical Co.)から市販)(SEQ ID NO:1)に2−イミノチオラン(トラウト試薬、ウィスコンシン州ミルウォーキーのアルドリッチケミカル社(Aldrich Chemical Co)から市販)(脱イオン水中で3μL、0.1M)を加える。室温にて反応を5分間進める。19:1(v:v)の比に調製した3μLのギ酸(88%):H2O2(30%)により生成物を酸化する。室温にて酸化を5分間進め、質量スペクトル分析に先立って誘導体化された検体を乾燥する。
【0047】
実施例5
【0048】
【化5】
【0049】
ポリペプチドCDPGYIGSR(ミズーリ州セントルイスのシグマケミカル社(Sigma Chemical Co.)から市販)(SEQ Id NO:2)を、1〜5nMのポリペプチド(5〜20μLの水中で)を19:1(v:v)の比に調製した10μLのギ酸(88%):H2O2(30%)と混合することにより酸化する。室温にて酸化を30分間進め、質量スペクトル分析に先立って誘導体化された検体を乾燥する。
【0050】
実施例6
【0051】
【化6】
【0052】
ジチオビス(スルホスクシンイミジルプロピオネート)(DTSSP)(イリノイ州、ロックフォードのピアースケミカル社(Pierce Chemical Co.)から市販)をホスフェート緩衝生理食塩水に50nM/20μLで溶解し、1NのNaOHでpHを7.7に調整する。その溶液(20μL)を1μLのペプチドHLGLAR(1nM/μL)(SEQ ID NO:3)に加え、30分間反応させる。トリス−ヒドロキシメチル−アミノメタン(0.1M、20μL)で反応を止める。試料を脱塩し、19:1(v:v)の比に調製した10μLのギ酸(88%):H2O2(30%)で酸化する。室温にて酸化を30分間進め、質量スペクトル分析に先立って誘導体化された検体を乾燥する。
【0053】
実施例7
【0054】
【化7】
【0055】
ジチオジグリコール酸(0.93g、5.1ミリモル、ミズーリ州セントルイスのシグマケミカル社(Sigma Chemical Co.)から市販)(別の方法としては、その無水物のそのポリマー(環式又は非環式)を用いてもよい)をジクロロメタン(20mL)に溶解し、不活性の雰囲気下に置く。ジシクロヘキシルカルボジイミド(1.05g、5.1ミリモル)を一気に加える。約96時間後、沈殿物をろ過によって除き、ろ液を減圧下で濃縮する。得られた物質をジエチルエーテルに溶解し、ろ過する。再び、ろ液を減圧下で濃縮してジチオジグリコール酸無水物を提供する。ジチオジグリコール酸無水物(この実施例では環状形態を示す)を、使用に先立って、無水テトラヒドロフラン中で0.1Mの濃度に調製する。ASHLGLAR(1nM)(SEQ ID NO:1)を20μLの0.05Mトリメチルアミンで希釈する。ジチオジグリコール酸無水物溶液(5μL)を加え、反応混合物を30秒間攪拌する。室温にて、反応をおよそ2分間進める。得られた生成物を19:1(v:v)の比に調製した2μLのギ酸(88%):H2O2(30%)で酸化する。室温にて酸化を30分間進め、質量スペクトル分析に先立って誘導体化された検体を乾燥する。酸性部分試薬の濃度は、さらに少ない量を誘導体化する場合、100という因数で減らす。
【0056】
実施例8
【0057】
【化8】
【0058】
使用に先立って、3−スルホプロピオン酸無水物を無水テトラヒドロフランで0.1Mの濃度に調製する。ASHLGLAR(1nM)(SEQ ID NO:1)を20μLのテトラヒドロフラン:ジイソプロピルエチルアミン4:1(v:v)で希釈する。3−スルホプロピオン酸無水物溶液(2μL)を加え、反応混合物を30秒間攪拌する。室温にて反応を約2分進めた後、希釈して質量スペクトル分析を行う。酸性部分試薬の濃度は、さらに少ない量を誘導体化する場合、100という因数で減らす。
【0059】
実施例9
【0060】
【化9】
【0061】
使用に先立って、テトラフルオロコハク酸無水物を無水テトラヒドロフランで0.1Mの濃度に調製する。ASHLGLAR(1nM)(SEQ ID NO:1)を20μLの0.05Mトリメチルアミンで希釈する。テトラフルオロコハク酸無水物溶液(2μL)を加え、反応混合物を30秒間攪拌する。室温にて反応を約2分進めた後、希釈して質量スペクトル分析を行う。カップリング試薬の濃度は、さらに少ない量を誘導体化する場合、およそ100という因数で減らす。
【0062】
実施例10
【0063】
【化10】
【0064】
ペプチドCDPGYIGSR(ミズーリ州セントルイスのシグマケミカルカンパニー(Sigma Chemical)から市販)(SEQ ID NO:2)を、2μLの原液クロロスルホニルアセチルクロリド(ウィスコンシン州ミルウォーキーのアルドリッチケミカル社(Aldrich Chemical Co)から市販されている)を500μLの水と混合することにより形成される2μLの0.02Mスルホ酢酸と混合する。混合物を乾燥し、次いで20μLのテトラヒドロフラン:ジイソプロピルエチルアミン(4:1v:v)で再構築する。無水テトラヒドロフラン中の0.1Mのクロロスルホニルアセチルクロリド(2μL)を加え、混合物を30秒間攪拌する。室温にて、誘導体化反応をおよそ2分間進める。誘導体化された検体を乾燥し、10μLの水にて再構築する。その溶液に19:1(v:v)の比に調製した10μLのギ酸(88%):H2O2(30%)を加える。室温にて酸化を5分間進め、N末端近傍で2つのスルホン酸基を有する誘導体化されたペプチドを製造する。
【0065】
(質量分析技術を用いた解析)
誘導体化して、ポリペプチド又はポリペプチドの1つ以上のペプチドが質量分析技術を用いて解析される。利用される技術は限定されないが、好ましい技術は、ポストソース崩壊(PSD)マトリクス支援レーザー脱離イオン化(MALDI)及びエレクトロスプレーイオン化タンデム質量分析法である。例えば、スペングラー(Spengler)らの、「マトリクス支援レーザー脱離質量分析法によるペプチド配列決定」ラピッドコミュニケーションズインマススペクトロメトリー(Rapid Communications in Mass Spectrometry)、第6巻の105〜108ページ(1992年);スペングラー(Spengler)らの「マトリクス支援レーザー脱離質量分析法におけるポストソース崩壊の基本的性状」ジャーナルオブフィジカルケミストリ(Journal of Physical Chemistry)、第96巻の9678〜9684ページ(1992年);コッフマン(Kaufmann)らの「マトリクス支援レーザー脱離イオン化を用いた反射飛行時間質量分析計におけるプロダクトイオン分析による線状ペプチドの質量分析配列決定」、ラピッドコミュニケーションズインマススペクトロメトリー、第7巻902〜910ページ(1993年);コッフマン(Kaufmann)らの「飛行時間質量分析計におけるペプチドの配列決定:マトリクス支援レーザー脱離イオン化(MALDI)後のポストソース崩壊の評価」、インターナショナルジャーナルオブマスススペクトロメトリー、アンドイオンプロセス(International Journal of Mass Spectrometry and Ion Processes)、第131巻355〜385ページ(1994年);カウフマン(Kaufmann)らの「マトリクス支援レーザー脱離/イオン化反射飛行時間質量分析法におけるポストソース崩壊及び遅延抽出」、ラピッドコミュニケーションズインマススペクトロメトリー第10巻1199〜1208ページ(1996年);及びスペングラー(Spengler)の「生体分子のマトリクス支援レーザー脱離/イオン化質量分析法におけるポストソース崩壊の分析」ジャーナルオブマススペクトロメトリー第32巻1019〜1036ページ(1997年);カール(Carr)らの「分析バイオテクノロジーにおける質量分析法の統合」、アナリティカルケミストリ(Analytical Chemistry)第63巻2802〜2824ページ(1991年);イエーツ(Yates)3世らの「MSによるゲノムの採掘」、アナリティカルケミストリ第68巻534A〜540Aページ(1996年);モリス(Morris)らの「新規のQuadrupole/Orthogonal加速飛行時間質量分析計における高感度衝突活性化タンデム質量分析法」、ラピッドコミュニケーションズインマススペクトロメトリー第10巻889〜896ページ(1996年)を参照のこと。最も好ましくは、利用される技法は、正イオンモードのPSD MALDI及びエレクトロスプレーイオン化タンデム質量分析法である。便宜上、以下の実施例11及び12が、ポリペプチド及びそのペプチドを解析するために利用されてもよい質量分析技術を説明する。
【0066】
驚くべきことに本発明者が発見したように、適宜誘導体化されたペプチド又はポリペプチドのペプチドは、主としてy−イオンを特徴とするMSMSスペクトルを提供する。当該技術分野において周知であるように、y−イオンは、ポリペプチド又はペプチドの元来のC末端を含有するイオン化されたフラグメントを示す。本明細書で使用されるとき、用語「y−イオン」はまた、(y−NH3)イオンも包含し;例えば、第2の塩基性(例えば)残基を含有する不完全な消化生成物は、豊富な(y−NH3)イオンを生じることが多い。好ましくは、この方法で生じるスペクトルは実質的にa−イオン及びb−イオンを含まない。a−イオン及びb−イオンは主鎖のカルボニル基のいずれかの側の開裂によって形成される。重要なことに、電荷は、a−イオン及びb−イオンによってN末端フラグメントで保持される。本明細書で使用されるとき、a−イオン及び/又はb−イオンに関する用語「実質的に含まない」は、優勢なy−イオンシリーズに比べて、a−イオン及びb−イオンは合わせて、約20%未満、好ましくは約10%未満、及び最も好ましくは約5%未満の相対存在量を有することを意味する。
【0067】
本発明の方法に従って、特にポリペプチドの配列が配列データベースにあれば、そのポリペプチドを同定するためにあらゆる消化生成物を分析し、及び/又は同定する必要はない。
【0068】
実施例11−PSD MALDI配列決定技法
この実施例では、質量分析技術は、N2レーザー(337nm、3ナノ秒パルス幅、20Hzの反復率)を装備したボイジャー(Voyager)DE−RP又はボイジャーDE−STR(マサチューセッツ州フレーミングハムのパーセプティブバイオシステムズ社(PerSeptive Biosystems Inc))(又は好適な同等物)で行う。遅延抽出による反射モードにて質量スペクトルを得る。外部質量較正は、質量の少ないペプチド標準物で行い、質量測定の精度は、通常、±0.3Daである。誘導体化されたポリペプチド又はペプチドを0.1%トリフルオロ酢酸(TFA)で約10pM/μLまで希釈する。10mgを0.1%のTFAを含有する1mLの水性50%アセトニトリルに溶解することによって調製されるa−シアノ−4−ヒドロキシ桂皮酸(αCN)で試料をさらに5倍〜10倍に希釈する。例えば、ベアビス(Beavis)らの「マトリクス支援レーザー脱離質量分析法のためのマトリクスとしてのa−シアノ−4−ヒドロキシ桂皮酸」オーガニックマススペクトロメトリー(Organic Mass Spectrometry)第27巻156〜158ページ(1992年)を参照のこと。迅速蒸発法により調製されるa−シアノ−4−ヒドロキシ桂皮酸/ニトロセルロース(αCN/NC)の薄膜表面からゲル単離物を解析する。例えば、アーノット(Arnott)らの「プロテオーム解析への統合的アプローチ:心臓肥大症に関連するタンパク質の同定」、アナリティカルバイオケミストリ(Analytical Biochemistry)第258巻1〜18ページ(1998年)を参照のこと。
【0069】
時間指定イオン選抜を用いて適当な前駆体イオンを単離した後、誘導体化された検体についてPSD MALDIタンデム質量スペクトルが得られる。αCN、αCN/NC及び2,5−ジヒドロ安息香酸(DHB)を含むが、これに限定されない多数のMALDI物質を用いて誘導体化された検体を分析することができる。反射に適用される電圧をステッピングすることによってフラグメントイオンは最終検出器に前もって焦点が合わせられる。用いてもよい典型的な電圧比は以下のとおりである:1.0000(前駆体イオン断片)、0.9126、0.6049、0.4125、0.2738、0.1975、及び0.1213(フラグメント断片)。マサチューセッツ州フレーミングハムのパーセプティブバイオシステムズ(PerSeptive Biosystems)から入手可能なソフトウエアを用いて、個々の断片を組み合わせる(当該技術分野において一般に用いられているように「一緒に縫い合わせる」)(解析ウインドウから「PSD」を選択する)。前駆体イオン断片はすべて、低いレーザー出力で(変数減衰器=1450)<256のレーザーパルスについて獲得し、検出器を飽和するのを回避する。PSD MALDI獲得の残りの断片すべてに対してレーザーの出力を上げる(変数減衰器=1650)。通常、各フラグメントイオンの断片について256のレーザーパルスが得られる。20MHzのデジタル変換速度にてデータを獲得する。
【0070】
実施例12−エレクトロスプレーイオン化タンデム質量分析法による配列決定法
この実施例では、自家製マイクロエレクトロスプレー源(uES)を装備したLCQイオントラップ質量分析計(カリフォルニア州サンノゼのサーモクエスト(ThermoQuest))にカップリングしたキャピラリーLCシステム(カリフォルニア州フォスターシティのパーキンエルマーバイオシステムズ(Perkin Elmer Biosystems))を用いて質量スペクトルを獲得する。0.5×150mmのC18LCカラム(カリフォルニア州フォスターシティのパーキンエルマーバイオシステムズ(Perkin Elmer Biosystems))は、5μl/分の流速にて用いる。LC移動相は、それぞれ0.02%のTFAを含有する水及びアセトニトリルである。典型的な勾配は、15%のアセトニトリルで5分間、次いで15〜60%のアセトニトリルで40分かける。uES源への0.5μl/分及びUV検出器への4.5μl/分の流速は、LCカラムの後に割れたティー(1/16”、0.25mm内径、テキサス州ヒューストンのバルコ(Valco))を置くことによって達成する。オートサンプラー(ジョージア州ノルクロスのアルコット(ALCOTT)、モデル719)によって、誘導体化したペプチド又はポリペプチドの試料をLCカラムに注入する。uES源は装置の前端に載せられたX、Y、Zマイクロメートル(カリフォルニア州サンタクララのニューフォーカス社(New Focus))に格納される。マイクロエレクトロスプレーの針は、ニューオブジェクティブ(New Objective)(マサチューセッツ州ケンブリッジ)のピコチップ(PicoTip)(FS360−50−15−D)である。
【0071】
エレクトロスプレータンデム質量スペクトルは、以下の装置条件を用いて獲得する:スプレー針の電圧1.5kV、加熱したキャピラリーの温度200℃、及び衝突エネルギー35eV。各完全なMS走査では300〜2000m/zの質量範囲を用いる。エレクトロスプレータンデム質量スペクトルは、3つの連続した走査:1)完全なMS走査、2)電荷状態を測定するための選択されたイオンにおけるズーム、及び3)ズーム走査から選択された適当なイオンにおけるMS/MS走査から成る「三連操作」モードにおけるデータ依存性の走査を用いて獲得される。このような3つの事象はLC作動の間中、反復される。
【0072】
フラグメンテーションパターンの解釈
質量分光分析により生じたフラグメンテーションパターンはポリペプチドの配列に解釈される。質量分析の分野における当業者は、市販のソフトウエア又は配列データベースの助けを借りずに新規の小型ポリペプチドのフラグメンテーションパターンを手動で解釈することができる。同様に、熟練者は、新規のポリペプチドのペプチド(消化生成物)を配列決定することもできる。別の方法としては、熟練者は、例えば、配列データベースの市販のソフトウエアを含む解釈のための既知の助けを借りてもよい。
【0073】
例えば、ポリペプチド又はそのペプチドの配列は、本発明を介して作製されるy−イオンのフラグメンテーションパターンによって効率的に及び正確に決定される。個々のアミノ酸残基の同定は、y−イオンシリーズの隣接するメンバー間の質量の差異を測定することによって新規に達成することができる。次いで、測定された質量の差異を既知のアミノ酸残基の質量(本明細書では上記表Iを参照のこと)と比較することによって同定は達成される。例えば、71.1Daの測定された質量差はアラニンに相当する。読み取り方向も質量スペクトルから直接明らかにされる。小さな質量から大きな質量へと測定するのであれば、方向はC末端からN末端である。大きい質量から小さい質量へと測定するのであれは、読み取り方向は、N末端からC末端である。
【0074】
配列データベース検索に対する入力として、フラグメンテーションデータ、解釈されていないy−イオンシリーズの質量又はy−イオンシリーズに由来する配列タグのいずれかを許容するソフトウエアを用いて、ポリペプチド、及びそのペプチドの配列を効率的に及び正確に決定してもよい。当事者により一般に利用されているそのようなソフトウエアには、「プロテインプロスペクター(Protein Prospector)」(カリフォルニア大学サンフランシスコ校又はウエブ(http://prospector.ucsf.edu)から市販されている)及び「ペプチドサーチ」(ドイツ、ヘイデルベルグの欧州分子生物学研究所又はウエブ(http://www.mann.embl−heidelberg.de)から市販)が挙げられるが、これらに限定されない。
【0075】
本発明で作製されるフラグメンテーションパターンは、NCBI非冗長データベース(ncbi.nlm.nih.gov/blast/db.nr.z)、SWISPROT(ncbi.nlm.gov/repository/SWISS−PROT/sprot33.dat.z)、EMBL(FTP://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/peptidesearch/)、OWL(ncbi.nlm.nih.gov/repository/owl/FASTA.z)、dbEST(ncbi.nlm.nih.gov/repository/dbEST/dbEST.weekly.fasta.mmddyy.z)及びジェンバンク(ncbi.nlm.nih.gov/genebank/genpept.fsa.z)を含むが、これらに限定されない多数の配列データベースで検索することができる。本発明の方法を用いて形成される1つ以上の関連あるペプチド誘導体から作製されるフラグメンテーションデータを検索することによって配列データベースから、関心のあるポリペプチドの配列全体を取り出すことができることが多い。
【0076】
当然、データベース検索技術を用いる場合、y−イオン及び(y−NH3)イオンが、本方法が利用されるフラグメンテーションパターンで観測される最も顕著な種なので、y−イオン又は(y−NH3)イオンだけがフラグメントになるように指定することによって検索を限定することが最も効率的である。本発明の方法を用いて誘導体化されたペプチドのスペクトルにおいて顕著ではないので、a−、b−、(b+H2O)、(b−H2O)、(b−NH3)及び内部開裂イオンのようなその他のフラグメントイオンを否認することができる。本発明によって形成される誘導体は、誘導体化していない同一ペプチドのスペクトルから得られるよりも多くのデータベース検索の特異性を生じることが多い単純なフラグメンテーションパターンを提供する。
以下の非限定例において本発明の方法をさらに説明する。このような実施例では、当業者は、新しいタンパク質が頻繁にデータベースに加えられるので、多数の「候補タンパク質」が本明細書で開示されたものとは異なる可能性があることを認識するであろう。
【0077】
実施例13
酸化されたインスリンB鎖FVNQHLC(SO3H)GSHLVEALYLVC(SO3H)GERGFFYTPKA(SEQ ID NO:4)(MM計算値=3495.9Da)(ミズーリ州セントルイスのシグマケミカルカンパニー(Sigma Chemical)から市販)によって高質量のポリペプチドのPSD MALDIタンデム質量分析法を実証する。このポリペプチドの質量は、従来のほとんどの三連四重極型装置の上限をはるかに超えている。元のままのポリペプチドのタンデム質量スペクトルは、実質的にy−イオンから成る相対的に強いイオンシリーズを示す。y9からy24の間のy−イオンはすべて観測し易い。分子のN末端を規定する配列特異的なフラグメント、y25〜y29はスペクトルに存在しない。
【0078】
酸性部分試薬、スルホ安息香酸環状無水物(ミズーリ州セントルイスのアルドリッチケミカル社(Aldrich Chemical Co)から市販)を用いる誘導体化によってこのポリペプチドのスペクトルを改善する。誘導体化されたポリペプチドは、分子のN末端領域に由来するy−イオン(y25、y26、y27、y28、及びy29)の有意な増強を示す。誘導体化の後、y8〜y29のy−イオンの完全なシリーズが観測される。顕著なb−イオンは検知されない。
【0079】
実施例14
二次元ゲル電気泳動により分離されたポリペプチドをトリプシンによりゲル内消化して前記ポリペプチドのペプチドを生じる。ペプチドは、1060.8、1090.8、1271.0、1299.0、1312.0、1344.0、1399.1、1450.1、1460.1、及び1794.4m/zにおけるイオンを含むMALDIによる強いMH+シグナルを幾つか示す。NCBIタンパク質配列ライブラリのすべてに対するプロテインプロスペクターソフトウエアを用いたデータベース検索により、5以上の入力したトリプシン切断した質量と一致する41の候補タンパク質のリストを作製する(検索パラメータ:MW範囲1,000〜150,000、3.0〜10.0の等電点、副反応として認められる酸化Met及び+/−0.6Daの控え目な質量許容範囲)。
【0080】
前出の実施例で議論した数種の試薬のいかなる1つによってもポリペプチドのペプチドを誘導体化することができる。それらには、2−スルホ安息香酸環状無水物、3−スルホプロピオン酸無水物又はクロロスルホニルアセチルクロリドが挙げられるが、これらに限定されない。本実施例では、クロロスルホニルアセチルクロリドを酸性部分試薬として用いる。2Dゲル電気泳動から単離された低い濃度のペプチドを誘導体化する方法を改変して再現性及び誘導体収率を改善する。通常、2Dゲルのペプチド抽出物は、スピードバック上でほぼ乾燥するまで濃縮する(5〜10μL)。15μLの0.1%TFAによって濃縮物を酸性化し、市販のC18ミニカラム(マサチューセッツ州ベッドフォードのミリポアコーポレーションのジップチップ(ZipTip)(商標))を用いてクリーンアップする。
【0081】
クリーンアップした試料をスピードバックで乾燥し、10μLの塩基(THF:DIEA19:1v/v)で再構築する。本実施例では、2μLのクロロスルホニルアセチルクロリド溶液(1mLのTHFに2μLの原液)を加え、室温にて、反応を1〜2分進める。誘導体化された試料を再びスピードバックにて乾燥し、解析前に10μLの0.1%TFAで再構築する。この段階で、MALDIマトリクス及び解析のために試料ステージに負荷されている部分と試料を混合することができ、又は、市販のC18ミニカラム(ジップチック(商標)、ミリポアコーポレーション)を用いて再びクリーンアップしてもよい。10mg/mLのMALDIマトリクスを含有する1〜2μL容量のアセトニトリル:0.1%TFA(1:1v/v)にてMALDI試料ステージ上に、ジップチップから直接、クリーンアップされた試料を溶出することができる。後者の手順によって回収された誘導体のすべてをMALDI試料ステージに負荷することができ、それによって方法全体の感度を改善することができる。約1572Daの重量がある誘導体化されたペプチドについてPSD MALDIタンデム質量分析を行う。574.5、661.7、875.9、1003.8、1103.9、1204.6、1304.1m/zにてy−イオンを、及び1451.0m/zにて(MH+−誘導体)イオンを有する配列タグが得られる。タンパク質配列データベースに対してスペクトルを検索し、6つの候補タンパク質(すべてミトコンドリア性のアスパルテートアミノトランスフェラーゼ類)が戻ってくる(検索パラメータ:MW範囲1,000〜150,000、親イオンの質量許容範囲+/−0.6Da、フラグメントイオンの質量許容範囲+/−2.5Da、Par(mi)Frag(av)、許容される不足イオンの数=1)。データベース検索がy−イオンを唯一の許容されるフラグメントとみなすように制約されているので、このレベルの特異性が得られる。このような誘導体のタンデム質量スペクトルではN末端及び内部開裂のイオンは顕著ではないので、この検索の制約が可能である(本発明に基づいた誘導体化による)。完全なライブラリに対してこの同じタンデム質量スペクトルを検索するとはるかに低い特異性が得られ(239の候補タンパク質が帰ってくる)、すべてのフラグメントイオン型(a、b、(b+H2O)、(b−NH3)、(b−H2O)、内部及びy)が許容される。前記ペプチドは、FVTVQTISGTGALR(SEQ ID NO:5)として同定された。
【0082】
タンパク質の同定の確認は、約1916Daの重量がある誘導体のPSD MALDIによって求める。スペクトルは、プロトン化した前駆体イオンに加えて724.6、1154.2、1299.3、1439.0、1551.9、1665.5、及び1779.2m/zにおける7つのフラグメントのイオンを含有する。フラグメントをy−イオンであると想定してデータベースに対してこのスペクトルを検索する。検索によってミトコンドリア性のアスパルテートアミノトランスフェラーゼ又はその他のいかなる候補タンパク質も戻ってこない。yイオン及び(y−NH3)イオンの両方を許容するデータベース検索によって16の候補タンパク質ガ得られ、そのうち10がミトコンドリア性のアスパルテートアミノトランスフェラーゼである。この後者の検索によってタンパク質の同定が裏付けられる。可能性のあるフラグメントとして(y−NH3)イオンを含めることは、ペプチドが第2のアルギニン残基を含有する不完全なトリプシン処理生成物(ILIRPLYSNPPLNGAR)(SEQ ID NO:6)なので、この特定の検索には必要である。本明細書の上記で述べたように、PSDタンデム質量スペクトルでは、不完全な消化生成物は、(y−NH3)フラグメントイオンを呈することが多い。
【0083】
実施例15
2Dゲル電気泳動で単離されたタンパク質のゲル内トリプシン消化物を、本明細書の実施例14に基づいて誘導体化した後、LCQイオントラップにてLCエレクトロスプレータンデム質量分析法により解析する。マイクロスキャンの「三連操作」配列を用いる自動データ依存モードにてあらゆるスペクトルは無人で獲得する。誘導体化されたトリプシン処理ペプチド(MH+=971.5)のタンデム質量スペクトルは、401.1、538.3、651.3、750.4m/zを含めて幾つかのy型生成物イオンを示す。誘導体化されていないトリプシン処理ペプチド(971.5−122=849.5)のMH+質量とともに測定されたy−イオンをデータベース検索に用いる。NCBIタンパク質配列ライブラリに対するプロテインプロスペクターソフトウエアを用いたデータベース検索によって3つの候補タンパク質が得られる(検索パラメータ:MW範囲すべて、親イオンの質量許容範囲+/−0.6Da、フラグメントイオンの質量許容範囲+/−1.0Da、単同位体親イオン及びフラグメントイオンは認められ、不足イオンは認められない)。データベース検索から得られる3つの候補タンパク質はすべてハプトグロビンである。ペプチドは、VVLHPER(SEQ ID NO:7)として同定された。
【0084】
第2の誘導体化されたペプチド(誘導体のMH+=771.4Da)から生じるタンデム質量スペクトルを用いてデータベース検索からタンパク質同定の裏付けを求める。スペクトルは、322.1、436.2及び535.3m/zにおけるy−型イオンを含めて幾つかのイオンを示した。上記と同じ検索パラメータを用いて、3つのペプチド配列がエレクトロスプレータンデム質量スペクトルからの入力データに一致する。3つのペプチド配列の1つがハプトグロビンに相当する。当前記ペプチドの同定はNVNFR(SEQ ID NO:8)として確証された。この結果はタンパク質の同一性を裏付けている。
【0085】
実施例16
本発明の方法は、変異型ポリペプチドを同定するのに利用し易い。酵素単離物のトリプシン消化物のMALDIスペクトルは、市販のプロテアーゼ、サビナーゼ(登録商標)(デンマーク、コペンハーゲンのノボノルディスク(Novo Nordisk)から市販)のそれと同一の多数のトリプシン処理質量を示す。予想されるトリプシン処理ペプチドの1つ、GVLVVAASGNSGAGSISYPAR(MH+=1933Da)(SEQ ID NO:9)がスペクトルからなくなり、未知のイオンが1963m/zで観測される。このことは、単離物がサビナーゼ(登録商標)の変異型であることを示唆している。11の異なった単一アミノ酸の変更によって観測された+30Daの質量のシフト(4G→S、4A→T、及び3V→E)を説明することができる。本明細書の実施例2で説明されているような誘導体化に続いてPSD MALDIタンデム質量スペクトルが得られる。21アミノ酸のペプチドについてy−イオンの完全なシリーズが観測される。スペクトルは残基14におけるグリシンがセリンに変換されていることを立証している。このスペクトルであらゆるy−イオンの質量が測定される。スペクトルは、パーセプティブバイオシステムズのMALDIデータシステムに包含されるペプチドラダー配列決定プログラムを用いて自動的に解釈される。
【0086】
実施例17
本明細書の実施例5に従い、実施例10に従って誘導体化されたCDPGYIGSR(SEQ ID NO:2)から生じるMALDIPSDスペクトルの比較によって、ペプチドのN末端近傍で両方のスルホン酸基を伴ったジスルホン酸誘導体の使用を実証する。システイン残基(実施例5)のスルフヒドリル側基の過ギ酸酸化によって形成される誘導体を、アルファ−シアノ−4−ヒドロキシ桂皮酸のマトリクスからPSD MALDIを用いて解析する。得られるPSDスペクトルは、不安定なAsp−Proアミド結合の開裂によって形成されるy7フラグメントイオンが優勢である。低い質量のy型イオンは相対的に低い量を示す。例えば、y7イオンに比べたy3イオン及びy4イオンの量は、それぞれ8%及び5%でしかない(ピークの高さの比)。理論によって制限されることを意図せず、Pro酸アミド窒素は他の主鎖アミド基よりも塩基性が強いので、「移動可能な」イオン化プロトンは塩基性Asp−Proアミド窒素原子に優先的に局在すると考えられている。この電荷局在は、Aspとプロトン化されたProとの間のアミド結合の優先的なフラグメンテーションを生じると考えられている。
【0087】
実施例10に従ってペプチドのN末端近傍に第2のスルホン酸基を付加することによってこの問題は、最小限に抑えられる。第2のスルホン酸基の付加は、MALDIPSD解析で使用され正に荷電したイオンを生じるために、第2の「移動可能な」プロトンを必要とする。再び、理論によって制限されることを意図せず、相対的に塩基性の強いProはすでにイオン化されているので、この第2のプロトンはその他の主鎖アミド基を自由にイオン化すると考えられている。
その他の主鎖アミド基のプロトン化は、結果としてそのような基のフラグメンテーションを高め、MALDIPSDスペクトルにおいて相当するy−イオンの相対存在量を高める。実施例10に従って形成された誘導体のPSDスペクトルにおいて、y7イオンに比べたy3イオン及びy4イオンの量は、それぞれ41%及び57%に上昇する(ピークの高さの比)。
【0088】
実施例18
C末端にて又はその近傍でリジンを有するペプチドから作製される質量分析のフラグメンテーションパターンは、本明細書に記載されるように、リジンをホモアルギニンに変換し、酸性基で誘導体化することにより改善できることが多い。N末端アミンでの感知できるほどの反応なしで及び加水分解のような感知できるような副反応なしで、リジン側鎖のイプシロンアミノ基をさらに塩基性の強いグアニジニウム基に効率よく変換することができる。この変換を達成するアプローチの1つはグアニジン化試薬としてO−メチルイソウレア又はその塩を用いる。例えば、ボネット(Bonetto)らの「Lys及びCys残基の誘導体化の後、カルボキシペプチダーゼ及び質量分析法を用いたペプチド及びタンパク質のC末端配列分析」アナリティカルケミストリ(Analytical Chemistry)第69巻1315〜1319ページ、(1997年)を参照のこと。本実施例では、グアニジン化したペプチドを次いでN末端にて誘導体化し、質量分析法による配列決定に先立ってスルホニル基を提供する。当業者は、リジンをホモアルギニン誘導体に変換する反応とN末端を誘導体化して酸性基を導入する反応の順序は、反応条件の適当な制御によって入れ換えて同じ誘導体を得ることができることを理解することができる。
【0089】
【化11】
【0090】
使用の前に、O−メチルイソウレア水素サルフェート(ウィスコンシン州ミルウォーキーのアルドリッチケミカル社(Aldrich Chemical)から市販)をH2Oで0.5Mに調製する。ポリペプチドVGGYGYGAK(1〜10nM、ミズーリ州セントルイスのシグマケミカル社から市販)(SEQ ID NO:10)を20μLのH2O:DIEA19:1v:vに溶解する。2μLの0.5MのO−メチルイソウレア水素サルフェートを加え、ペプチド溶液を攪拌する。溶液のpHをチェックし、(必要に応じて調整し)、それが塩基性であることを確認する。室温にて反応を一晩進める。次いで、少量の原液トリフルオロ酢酸(TFA)を加えることにより反応を止める。次いで、市販のC18カラム(ジップチップ(ZipTip)(商標)、マサチューセッツ州ベッドフォードのミリポアコーポレーション)を用いて酸性溶液をクリーンアップし、0.1%のTFAを含有する10μLのアセトニトリル:水1:1v:vで溶出する。次いで、溶液をスピードバックで乾燥し、試料を20μLのTHF:DIEA19:1v/vで再構築する。この溶液のpHをチェックして塩基性であることを確認する。2μLのクロロスルホニルアセチルクロリド溶液を、1mLの無水THF(実施例2を参照のこと)における2μLの試薬原液で希釈することにより調製し、加えて、試料を攪拌する。室温にて1〜2分間、スルホン化反応を進める。次いで、試料をスピードバックにて乾燥し、20μLの0.1%TFAで再構築する。次いで試料をジップチップ(商標)C18カラムでクリーンアップし、0.1%のTFAを含有する少量のアセトニトリル:水1:1で溶出する。当量の試料を2,5−ジヒドロ安息香酸で希釈し、MALDIポストソース崩壊質量分析法により解析する。スペクトルは、C末端におけるホモアルギニンから無処理のグアニジン化ペプチド分子のイオンに伸びるy−イオンの完全なシリーズを示す。
【0091】
実施例19
1つ以上の13C又は15Nを含有するO−メチルイソウレア又はその塩の同位体で標識した形態を用いてタンパク質の複雑な混合物におけるタンパク質の相対レベルを正確に定量することができる。この能力は、以前開発された同位体コード化親和性タグ法に類似している。例えば、ガイギ(Gygi)らの「同位体をコード化した親和性タグを用いた複雑なタンパク質の混合物の定量的分析」、ネイチャーバイオテクノロジー(Nature Biotechnology)第17巻994〜999ページを参照のこと。この能力は定量的プロテオーム分析で特に有用である。細胞又は組織(対照試料)において1つの状態を示している1つのタンパク質混合物におけるリジン側鎖を天然に豊富な同位体を有するO−メチルイソウレア又はその塩のような試薬を用いてグアニジン化する(同位体として軽い形態の試薬)。
【0092】
細胞又は組織(実験試料)で第2の状態を示している等量のタンパク質のリジン側鎖を1つ以上の13C又は15Nの元素を濃縮したレベルで含有するO−メチルイソウレア又はその塩のような試薬を用いてグアニジン化する(同位体として重い形態の試薬)。2つの誘導体化されたタンパク質混合物を次いで合わせる。例えば1D又は2Dゲル電気泳動のような技術を用いて次いで、合わせられた試料を分離する。付加されたグアニジニウム基を含有するペプチドを生じる分離の後、関心のあるペプチドを消化する。消化は、例えば、トリプシンを介して達成してもよい。例えば、セイドル(Seidl)らの「ボウマン−バーク(Bowman−Birk)大豆阻害剤のグアニジン化:ホモアルギニンを含むペプチド結合のトリプシン加水分解の証拠」、バイオケミカル及びバイオフィジカルリサーチコミュニケーションズ(Biochemical and Biophysical Research Communications)第42巻1101〜1107ページ、(1971年)を参照のこと。例えば、MALDI質量分析法を用いた質量分析によって又はエレクトロスプレーイオン化を用いたオンラインLC(又はCE)MSによって、得られるペプチドの混合物を直接分析する。別の方法としては、合わせたグアニジン化タンパク質試料を消化し、種々のオンラインHPLC又はCE質量分析法で解析する。グアニジン化試薬の同位体として軽い形態及び重い形態を含有する同一のペプチドイオン(同一のペプチド配列)の対のシグナル相対強度を測定することにより2つの試料(対照及び実験試料)におけるタンパク質の比を定量する。次いで、試料の対照状態と実験状態の間で相対濃度が変化しない代表的なタンパク質に対して較正することによって、2つの試料における相対的なタンパク質濃度の正確な定量が可能である。
【0093】
観測されるペプチドの多くは1つ以上の付加されたグアニジニウム基を含有するので、1回の消化から各タンパク質について数種の定量的測定が得られる。1つのタンパク質目的物について複数の定量的測定を行う能力によって方法の定量的精度が高められる。別々にグアニジン化されたタンパク質の混合物の消化から、又はグアニジン化されたタンパク質混合物の消化から得られるペプチド混合物は、例えば、クロロスルホニルアセチルクロリド(実施例2、18を参照のこと)のような種々のスルホン化試薬を用いてN末端にて、本明細書に記載されるように酸性基で誘導体化することができる。次いで、質量分析法(例えば、MALDIポストソース崩壊又はエレクトロスプレータンデム質量分析法)を用いてスルホン化されたペプチドの新規配列決定を行う。得られる質量分析のフラグメンテーションパターンは主としてy−イオンを呈する。所望の形態を明瞭に選択するのに十分な解像度を有する質量分析計を用いて、グアニジン化されたペプチドのいずれかの同位体形態でタンデム質量分析法による配列決定実験を行う。別の方法としては、タンデム質量スペクトルに寄与するグアニジン化ペプチドイオンの両方の同位体形態でペプチド配列決定実験を行う。この後者の方法も主としてy−イオンから成るスペクトルを生じる。しかしながら、各y−イオンは、付加されたグアニジニウム基の同位体として重い形態と軽い形態の間の既知の質量差によって分離される「二重」成分として観測される。ペプチドの配列は、上述のように隣接するy−イオンの質量差を測定することによって配置される。対照試料及び実験試料におけるタンパク質の相対量は、グアニジン化されたペプチドにおけるy−イオン二重成分のそれぞれについて観測される各同位体の量比を測定することにより独立して決定される。この技術によって、同一の実験から定量的タンパク質解析及び新規のペプチド配列決定の双方が提供される。定量的プロテオミクスの適用に特に有用であるはずである。
【0094】
本発明のキット
本発明のさらなる実施形態は、ポリペプチドのアミノ酸配列を決定するのに利用されてもよいキットである。キットは以下を含む:
(a)ポリペプチド又はポリペプチドの1つ以上のペプチドとカップリングするときに約2未満のpKaを有する酸性部分を提供する1つ以上の酸性部分試薬;及び
(b)1つ以上の酸性部分試薬でポリペプチドのN末端又はポリペプチドの1つ以上のペプチドのN末端を誘導体化するための手段
(c)リジン側鎖をさらに強い塩基性の基、固定的に荷電した誘導体又は同位体で標識した基に変換する1つ以上の試薬;及び
(d)ポリペプチドのリジン側鎖又はポリペプチドの1つ以上のペプチドのリジン側鎖におけるイプシロンアミノ基をリジン修飾試薬で誘導体化する手段。
本発明のキットは、例えば1998年10月27日に発行され、パーセプティブバイオシステムズ社(PerSeptive Biosystems、 Inc.)に譲渡されたパターソン(Patterson)らの米国特許第5,827,659号に記載されるサンプルホルダーとして同様の形式にて質量分析計に適合してもよい。
【0095】
任意で、キットはさらに、例えば、質量分析技術の精度を調べるための1つ以上の検定用ペプチドを含んでもよい。参照の質量スペクトルデータも任意で包含されてもよい。
キットに包含されてもよい酸性部分試薬及びリジン修飾試薬の一部は上述されている。
誘導体化するための特に好ましい手段には、誘導体化されたポリペプチド又はペプチドを入手することに関心のある分析者又はその他の人に都合の良い誘導体化ができるようなものが挙げられる。誘導体化するのに特に好ましい手段は、例えば酸性部分試薬及び/又はリジン修飾試薬及び最終的に関心のあるポリペプチド/ペプチドを含有する1つ以上の格納装置を含む。
【0096】
好適な格納装置には、例えば、バイアル瓶、チューブ、ピペットチップ、プレート、サンプルホルダー、及び多穴プレートが挙げられる。誘導体化試薬が格納装置の中に入っているので分析者によって添加される必要がない任意の好都合が提供される。例えば、酸性部分試薬は、ピペットチップの内部に存在し、ポリペプチド、ペプチド又はリジン修飾ポリペプチド又はペプチドが好適な緩衝液とともにチップの中に吸い込まれたとき活性化されてもよい。格納装置は最も好ましくは使い捨てであるが、そうである必要はない。
誘導体化試薬は固体支持体に結合されてもよい。例えば、試薬はピペットチップの内部で支持体に結合してもよいし、多穴プレートの穴にコーティングされてもよい。関心のあるポリペプチド又はペプチドを適当な緩衝系に溶解し、結合された試薬の上に繰り返しかけてもよいし、又は試薬がコーティングされた多穴プレートの中で反応させてもよい。反応後、適当量の誘導体化したポリペプチド又はペプチドを直接MALDI質量分析法試料ステージに負荷してもよいし、又はエレクトロスプレーイオン化質量分析装置に注入してもよい。
【0097】
誘導体化を促進する1つ以上の緩衝系も本発明のキットに包含されてもよい。包含されるのに適当な緩衝系は包含される誘導体化試薬に依存する。好ましい緩衝系の例は、上記誘導体化の実施例で開示されている。特に好ましい緩衝系には、第3級アミン溶液(水性及び非水性の両方(例えば、テトラヒドロフランの溶液))及び原液の第3級アミンが挙げられるが、これに限定されない。特に好ましい第3級アミン類には、トリメチルアミン、トリエチルアミン、及びジイソプロピルエチルアミンが挙げられる。
本発明のキットはまた、本明細書で上記したもののようなさらなる消化助剤の1つを含んでもよい。消化助剤は化学的であっても、酵素的であってもよい。例えば、トリプシン、エンドプロテイナーゼLys C、エンドプロテイナーゼArg C、及び/又はキモトリプシン、好ましくは、トリプシン、エンドプロテイナーゼLys C、及び/又はエンドプロテイナーゼArg C、及び最も好ましくはトリプシンが消化助剤として挙げられ得る。臭化シアンのような化学的消化助剤も本明細書に包含され得る。
Claims (38)
- ポリペプチドのアミノ酸配列を決定する方法であって、前記ポリペプチドの1つ以上のペプチドはリジンを含有し、
(a)前記リジン含有ペプチド上のリジンのイプシロンアミノ基をグアニン又はその他の強塩基性基、固定された陽イオン荷電の基、又は同位体で標識された基に変換すること、
(b)前記ポリペプチド又はペプチドとカップリングするとき、約2未満のpKaを有する1つ以上の酸性部分で前記ポリペプチドのN末端又は前記ポリペプチドの1つ以上のペプチドのN末端を誘導体化し、1つ以上の誘導体化された検体を提供すること、
(c)質量分析技術を用いて1つ以上の誘導体化された検体を分析し、フラグメンテーションパターンを提供すること、及び
(d)フラグメンテーションパターンを解明すること、
を含むことを特徴とする方法。 - 前記フラグメンテーションパターンが実質的にa−イオン及びb−イオンを含まないことを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記質量分析技術が、インソースフラグメンテーション後のMALDI PSD質量分析法、エレクトロスプレーイオン化タンデム質量分析法、又はエレクトロスプレーイオン化単一段階質量分析法であることを特徴とする、請求項2に記載の方法。
- 前記質量分析技術が、インソースフラグメンテーション後の陽イオンモードPSD MALDI、タンデムエレクトロスプレーイオン化質量分析法、又はエレクトロスプレーイオン化単一段階質量分析法であることを特徴とする、請求項3に記載の方法。
- 前記ポリペプチド又はペプチドとカップリングするとき前記酸性部分が約0未満のpKaを有することを特徴とする、請求項4に記載の方法。
- 前記ポリペプチド又はペプチドと結合するとき前記酸性部分が約−2未満のpKaを有することを特徴とする、請求項5に記載の方法。
- 前記フラグメンテーションパターンの解明が、市販のソフトウエアプログラム又はデータベースを使用することを含むことを特徴とする、請求項4に記載の方法。
- 前記ポリペプチドが合成ポリペプチドであることを特徴とする、請求項4に記載の方法。
- 前記ポリペプチドの1つ以上のペプチドのN末端が誘導体化される、請求項4に記載の方法。
- 前記ポリペプチドのペプチドが消化によって生じることを特徴とする、請求項9に記載の方法。
- 前記消化が化学的消化であることを特徴とする、請求項10に記載の方法。
- 前記化学的消化が臭化シアン消化であることを特徴とする、請求項11に記載の方法。
- 前記消化が酵素消化であることを特徴とする、請求項10に記載の方法。
- 前記酵素消化が、エンドプロテイナーゼLysC消化、エンドプロテイナーゼArgC消化、トリプシン消化、及びキモトリプシン消化からなる群より選択されることを特徴とする、請求項13に記載の方法。
- 前記酵素消化が、エンドプロテイナーゼLysC消化及びエンドプロテイナーゼArgC消化からなる群より選択されることを特徴とする、請求項14に記載の方法。
- 前記消化がトリプシン消化であることを特徴とする、請求項14に記載の方法。
- 前記酸性部分が1つ以上のスルホン酸であることを特徴とする、請求項16に記載の方法。
- 前記酸性部分が2−スルホアセチル部分であることを特徴とする、請求項17に記載の方法。
- 前記酸性部分が3−スルホプロピオノイル部分であることを特徴とする、請求項17に記載の方法。
- 前記酸性部分が2−スルホベンゾイル部分であることを特徴とする、請求項17に記載の方法。
- 前記酸性部分がジスルホン酸誘導体であることを特徴とする、請求項16に記載の方法。
- 前記リジン含有ペプチド上のリジンのイプシロンアミノ基が(a)においてグアニンに変換され、(a)におけるグアニジン化反応が、前記リジン含有ペプチド上のリジンのイプシロンアミノ基とO−メチルイソ尿素又はその塩との反応を含むことを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 有機塩基の存在下で、前記リジン含有ペプチド上のリジンのイプシロンアミノ基がO−メチルイソ尿素又はその塩と反応することを特徴とする、請求項22に記載の方法。
- 前記有機塩基がジイソプロピルエチルアミンであることを特徴とする、請求項23に記載の方法。
- 各混合物が等量のタンパク質を有する少なくとも2つの異なるタンパク質混合物の前記リジンのイプシロンアミノ基が
(a)同位体で標識された異なる形態の同一の試薬によって誘導体化され、
(b)前記タンパク質混合物を合わせ、次いで個々のタンパク質を単離及び消化し、
(c)前記2つの混合物における前記リジン含有ペプチドの相対存在量が、同一のペプチド配列を有するが、異なった同位体形態のリジン修飾試薬を有するイオン対の質量分析法から得られる相対存在量から決定され、
(d)任意選択により、前記2つのタンパク質混合物の間で相対濃度が変化しない他のタンパク質由来の修飾ペプチドについて観測された比に対し観測された比を修正することによって、これらの測定の量的精度を改善することを特徴とする、請求項1に記載の方法。 - ポリペプチドのアミノ酸配列を決定するのに用いるキットであって、前記ポリペプチドの1つ以上のペプチドはリジンを含有し、
(a)前記リジン含有ペプチド上のリジンのイプシロンアミノ基をグアニン又はその他の塩基性基、又は固定された陽イオンに荷電した基、又は同位体で標識された基に変換するための1つ以上の化学試薬、
(b)前記リジン含有ペプチド上のリジンのイプシロンアミノ基を前記化学試薬によってグアニン又はその他の塩基性基、又は固定された陽イオンに荷電した基、又は同位体で標識された基に変換するための手段、
(c)前記ポリペプチド又は前記ポリペプチドの1つ以上のペプチドとカップリングするとき、約2未満のpKaを有する1つ以上の酸性部分を提供する1つ以上の酸性部分試薬、及び
(d)1つ以上の酸性部分試薬によって、又はポリペプチドのN末端又はポリペプチドの1つ以上のペプチドのN末端を誘導体化するための手段、
を含むことを特徴とするキット。 - 前記誘導体化するための手段が1つ以上の格納装置を含むことを特徴とする、請求項26に記載のキット。
- 前記誘導体化するための手段が少なくとも1つの緩衝系をさらに含む、請求項27に記載のキット。
- 前記1つ以上の消化助剤をさらに含むことを特徴とする、請求項28に記載のキット。
- 前記1つ以上の検定用ペプチドをさらに含むことを特徴とする、請求項28に記載のキット。
- 参照の質量スペクトルデータをさらに含むことを特徴とする、請求項30に記載のキット。
- 前記酸性部分試薬又は前記リジン修飾試薬が前記格納装置内に存在することを特徴とする、請求項27に記載のキット。
- 前記酸性部分試薬及び前記リジン修飾試薬の両方が前記格納装置内に存在することを特徴とする、請求項32に記載のキット。
- 前記酸性部分試薬又は前記リジン修飾試薬が固形の支持体に結合することを特徴とする、請求項32に記載のキット。
- 前記酸性部分試薬及び前記リジン修飾試薬の両方が固形の支持体に結合することを特徴とする、請求項33に記載のキット。
- (a)における前記化学試薬がO−メチルイソ尿素又はその塩を含むことを特徴とする、請求項26に記載のキット。
- (a)における前記化学試薬が有機塩基をさらに含むことを特徴とする、請求項36に記載のキット。
- 前記有機塩基がジイソプロピルエチルアミンを含むことを特徴とする、請求項37に記載のキット。
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Cited By (6)
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JP2016029068A (ja) * | 2002-02-14 | 2016-03-03 | 味の素株式会社 | アミノ官能性化合物の分析方法及び分析試薬 |
JP2005528609A (ja) * | 2002-05-30 | 2005-09-22 | シマズ リサーチ ラボラトリー (ヨーロッパ) リミテッド | 質量分析 |
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