JP2004505094A - 免疫調節化合物 - Google Patents
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Abstract
ｐ５６ｌｃｋのチロシンキナーゼ活性及びこの酵素が関与する信号伝達経路を調節する化合物が記述されている。本発明はまた、免疫調節活性、例えば、免疫抑制又は免疫賦活活性を有する、及び／又は抗腫瘍効果を有する化合物に関する。本発明は更に、これらの化合物を含んでなる組成物、及びそれらを用いる方法にも関する。
Description
【０００１】
本出願は、米国仮出願第６０／２２１，６８７の出願日の利益を主張しており、参照によりその開示が全体的に導入されている。
【０００２】
〔発明の分野〕
本発明は、例えば、ｐ５６ｌｃｋのチロシンキナーゼ活性及びこの酵素が関与する信号伝達経路を調節する化合物に関する。本発明はまた、例えば、免疫抑制性の又は免疫賦活性の活性を有する等の、免疫調節活性を有する、及び／又は抗腫瘍効果を有する化合物にも関する。本発明は更に、これらの化合物を含んでなる組成物及びそれらの使用方法に関する。
【０００３】
〔発明の記述〕
一具体例においては、本発明は、免疫調節効果を、これを必要とする患者において達成する方法であって、式、
【０００４】
【化３１】
【０００５】
〔式中、Ｘは、イオウ、ＳＯ２、ＳＯ、メチレン、酸素、カルボニル、エチレン、アミド、エステル又はチオエステルであり、
Ｒ１は、負電荷官能基であり、
Ｒ２は、電気陰性の基であって、アミン、アミド、ウレア、カルバミド、カーボネート、アンハイドライド、チオアミド、チオウレア、チオカルバミド、チオカーボネート、チオアンハイドライド、ヒドロキシル、又はエステル例えばアルキルエステル、アシルエステル、アリールエステル、アルキルチオエステル、アシルチオエステル又はアリールチオエステルであることができ、
Ｙ１、Ｙ２、Ｙ３、Ｙ４、Ｙ５、Ｙ６、Ｙ７、Ｙ８、Ｙ９及びＹ１０は、独立して、水素、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル又はハロゲンであり、そして
所望により、これらフェニル芳香族環の１個又は２個以上は、縮合芳香環によって、又は、例えば、これら１個又は２個以上の芳香環の１〜３個の炭素原子が窒素原子で置き換えられることによって、ヘテロ芳香環、又は縮合ヘテロ芳香環によって置き換えられている。（例には、ナフチル、ピリジニル、キノリニル及びイソキノリニル環が含まれる）〕、
又は式、
【０００６】
【化３２】
【０００７】
〔式中、Ｘ及びＹ１ないしＹ７は、上記定義に同じであり、
Ｒ１及びＲ４は、同一又は異なっており、且つＲ１についての上記定義と同じであり、
Ｒ３は、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、アミン、メチル、エチル、プロピル又はイソプロピルであり、そして
所望により、これらフェニル芳香族環の１個又は２個以上は、縮合芳香環によって、又は、例えば、これら１個又は２個以上の芳香環の１〜３個の炭素原子が窒素原子で置き換えられることによって、ヘテロ芳香環、又は縮合ヘテロ芳香環によって置き換えられている。（例には、ナフチル、ピリジニル、キノリニル及びイソキノリニル環が含まれる）〕、
【０００８】
又は式、
【０００９】
【化３３】
〔式中、Ｘ及びＲ１は、上記定義に同じであり、そしてＹ１ないしＹ１２は、Ｙ１ないしＹ１０についての上記定義に同じであり、
Ｘ１は、イオウ、ＳＯ２、ＳＯ、メチレン、酸素、カルボニル、エステル、チオエステル又はアミドであり、
Ｒ３及びＲ５は、同一又は異なっており、且つＲ３についての上記定義に同じであり、そして
所望により、これらフェニル芳香族環の１個又は２個以上は、縮合芳香環によって、又は、例えば、これら１個又は２個以上の芳香環の１〜３個の炭素原子が窒素原子で置き換えられることによって、ヘテロ芳香環、又は縮合ヘテロ芳香環によって置き換えられている。（例には、ナフチル、ピリジニル、キノリニル及びイソキノリニル環が含まれる）〕
の化合物又はその薬剤学的に許容し得る塩の有効量を投与することを含むものである方法に関する。
【００１０】
好ましくは、上記化合物の負電荷官能基は、−ＣＯＯＨ、アミド、エステル、ニトロ、ホスフェート又はサルフェート基であり（ホスフェートは、リンに基づく酸例えばリン又はリン酸等のエステルを意味し、サルフェートは、イオウに基づく酸例えばスルホン酸又はスルフィン酸等のエステルを意味する）；該水素結合受容体は、好ましくはカルボン酸又はカルボン酸エステル、例えばアルキルエステル、アシルエステル、アリールエステル、アルキルチオエステル、アシルチオエステル又はアリールチオエステルである。
【００１１】
特に好ましい具体例の一つにおいては、該化合物は、
【００１２】
【化３４】
【００１３】
【化３５】
【００１４】
又は
【００１５】
【化３６】
【００１６】
である。
【００１７】
模範的な具体例においては、Ｘ１及びＸは、独立して、Ｏ、Ｓ、チオエステル又はカルボニルであり、
Ｒ１（及び独立してＲ４）は、ＣＯＯＨ又はニトロであり、
Ｒ２は、アルキルエステル、アミノ又はＯＨであり、
Ｒ３（及び独立してＲ５）は、Ｈ、Ｃｌ、Ｆ、ＯＨ又はメチルであり、
各Ｙは、独立して、Ｈ、メチル、Ｆ又はＣｌであり、そして「フェニル」環は、フェニル環のままであるか又はナフチル若しくはピリジニルである。
【００１８】
別の一具体例においては、本発明は、抗腫瘍効果を、これを必要とする患者において達成する方法であって、上記の式Ｉ、ＩＩ又はＩＩＩの化合物の有効量を投与することを含むものである方法に関する。
【００１９】
別の一具体例においては、本発明は、ｐ５６ｌｃｋ分子の、そのＳＨ２ドメインを介した対応する細胞の結合性タンパク質への結合を調節する、及び／又は、ｐ５６ｌｃｋ分子の、そのＳＨ２ドメインを介した活性を調節する方法であって、ｐ５６ｌｃｋ分子のＳＨ２ドメインに、式Ｉ、ＩＩ又はＩＩＩの化合物を、より好ましくは上記のように式Ｉ’、ＩＩ’又はＩＩＩ’の化合物を結合させることを含む方法に関する。
【００２０】
別の一具体例においては、本発明は、抗腫瘍効果を、これを必要とする患者において達成するための方法であって、式Ｉ’、ＩＩ’又はＩＩＩ’の化合物の有効量を投与することを含むものである方法に関する。
【００２１】
別の一具体例においては、本発明は、過増殖性の細胞増殖を阻害を、これを必要とする患者において行う方法であって、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、Ｉ’、ＩＩ’又はＩＩＩ’の化合物の有効量を投与することを含むものである方法に関する。
【００２２】
別の一具体例においては、本発明は、免疫調節効果を、これを必要とする患者において達成する方法であって、式Ｉ’、ＩＩ’又はＩＩＩ’の化合物の有効量を投与することを含むものである方法に関する。
【００２３】
上記式Ｉ’の化合物（化合物Ｉ’）は、約３５２の分子量及びＣ２０Ｈ１６Ｏ４Ｓの化学式を有する。それは、ｐ５６ｌｃｋキナーゼ活性を活性化し、Ｔ細胞の刺激及び活性化をもたらす。化合物Ｉ’は、例えば、免疫賦活薬として使用することができる。
【００２４】
上記式ＩＩ’の化合物（化合物ＩＩ’）は、約３０５の分子量及びＣ１４Ｈ８Ｏ５ＣｌＮの化学式を有する。それは、低い濃度（投与量）でｐ５６ｌｃｋキナーゼ活性を活性化し、高濃度（投与量）で活性を阻害する。化合物ＩＩ’は、その濃度（投与量）に応じて、例えば、免疫賦活薬若しくは免疫抑制薬として、又は抗腫瘍薬として使用することができる。
【００２５】
上記式ＩＩＩ’の化合物（化合物ＩＩＩ’）は、約４２１の分子量及びＣ１８Ｈ１０Ｃ１２Ｎ２Ｏ４Ｓの化学式を有する。それは、ｐ５６ｌｃｋキナーゼ活性を阻害し、例えば、免疫抑制薬又は抗腫瘍薬として使用することができる。
【００２６】
好ましい一具体例においては、本発明の化合物は、ホスホチロシン又は関連の部分を含まない。
【００２７】
全ての化合物が、既知の反応化学を用いて、既知の材料又は通常の方法で製造できる材料から出発して、完全に通常の方法で製造できる〔例えば、Ｈｏｕｂｅｎ−Ｗｅｙｌ， Ｍｅｔｈｏｄｅｎ ｄｅｒ Ｏｒｇａｎｉｓｃｈｅｎ Ｃｈｅｍｉｅ〔Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ〕， Ｇｅｏｒｇ−Ｔｈｉｅｍｅ−Ｖｅｒｌａｇ， Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ．を参照〕。例えば、本発明の一化合物は、化学種、
【００２８】
【化３７】
【００２９】
のＳＮＡＲ反応を介して合成することができる。
【００３０】
本発明の多くの化合物は、化学品供給業者等のような標準の供給源から直ちに入手可能であり、又は商業的に入手できる化合物から、上述のような通常の変更によって作り出すことができる。例えば、上述の化合物Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩは、Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ， ＬＴＤ（Ｍａｙｂｒｉｅｇｅ ＰＬＣ； Ｔｒｅｖｉｌｌｅｔ， Ｔｉｎｔａｇｅｌ； Ｃｏｒｎｗａｌｌ， ＰＬ３４ ＯＨＷ； イングランド）から入手することができる。化合物Ｉ’は、Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ ＃ＢＴＢ１１４７８；化合物ＩＩ’は、Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ ＃ＳＢ００５２９；そして化合物ＩＩＩ’は、Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ ＃ＳＰＢ０１８９０である。
【００３１】
本発明の化合物の利点のうちに、分子が（タンパク質チロシンキナーゼ活性の、ペプチド及びタンパク質調節剤では受けるような）酵素的加水分解を受けないこと、及び、それらが良好な細胞透過性を有することがある。
【００３２】
如何なる特定のメカニズムにも拘束されることは望まないが、本発明は、例えば、タンパク質、例えば、タンパク質チロシンキナーゼ（これは、細胞間信号伝達経路に関与する）と特異的に相互作用する化合物に、特に、そのようなチロシンキナーゼのＳＨ２ドメインと相互作用する化合物に、更に取り分け、ｐ５６ｌｃｋｓｒｃファミリーチロシンキナーゼのＳＨ２ドメインと相互作用する化合物に関する。他の諸機能のうち、ｐ５６ｌｃｋタンパク質は、活性の免疫応答を行うために必要であるＴ細胞抗原受容体活性化信号発生に関与する信号伝達経路に、及び細胞増殖の面に、例えば、腫瘍細胞の増殖に関与する。本発明の化合物は、ｐ５６ｌｃｋと、特に、そのＳＨ２ドメインと相互作用することにより、該タンパク質のキナーゼ活性を調節し及び／又はそれが対応する細胞の結合性タンパク質と相互作用する能力を調節し、それによって、免疫応答を、直接的又は間接的に調節し且つ腫瘍細胞増殖を調節する。本発明の化合物は、信号伝達経路の下流信号伝達プロセスを含む信号伝達経路を、増強するか又は阻害し、すなわちそれらは、条件に応じて促進的又は阻害的という、二相性であり得る。与えられた如何なる化合物の効果も、ここに記載したアッセイ又は他の全く慣用のアッセイの１つ又は２つ以上において日常的仕方で決定できる。
【００３３】
ｐ５６ｌｃｋキナーゼの非触媒性ドメイン、例えばＳＨ２ドメインは、ｐ５６ｌｃｋ機能の制御に重要な特定の分子内及び分子間相互作用を媒介する。すなわちそれらは、キナーゼ活性に対しマイナス効果にもプラス効果のどちらをも及ぼす。一般に、分子内相互作用は、ｐ５６ｌｃｋを不活性な状態に維持し、分子間相互作用は、ｐ５６ｌｃｋキナーゼ活性を促進する。例えば、ＳＨ２ドメインは、基質リン酸化が必要な場合は、ｐ５６ｌｃｋを特異的な細胞部位〔ＩＴＡＭ（ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｂａｓｅｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｍｏｔｉｆ：免疫受容体チロシン系活性化モチーフ）ホスホチロシン〕へとｐ５６ｌｃｋを向かわせることにより、ｐ５６ｌｃｋ酵素活性をプラスに制御することができ、そして、ＳＨ２ドメインを介してホスホチロシン部位に結合したｐ５６ｌｃｋは、より高酵素活性を示すことができ、それにより、基質の更なるリン酸化を促進する。これが如何にして達成されるかの如何なる特定のメカニズムに拘束されることも希望しないが、ＳＨ２ドメインに結合する本化合物は、キナーゼ活性又は随伴の細胞リン酸化事象（例えば、細胞内信号発生に関与するプロセス）を、増加（活性化、増強、刺激）させ、減少（抑制、阻害、低下）させることができるか、又は効果を有しない。、
【００３４】
Ｐｐ５６ｌｃｋは、免疫応答の調節において重要な役割を果している。ｐ５６ｌｃｋは、Ｔ細胞特異的なキナーゼであり、Ｔ細胞の大半はＣＤ４（ＴＨ細胞で）及びＣＤ８（細胞障害性Ｔ細胞で）に関連している。ｐ５６ｌｃｋキナーゼは、例えばＴ細胞活性化の初期のステップ、すなわちＣＤ３鎖中のＩＴＡＭのリン酸化を担っており、これは次いで、例えばアクチンの重合、遺伝子転写の促進、細胞増殖及び分化等をもたらす複数の生化学的事象の細胞内カスケードを開始させるものである。ｐ５６ｌｃｋはまた、Ｔ細胞の活性化における第２の重要なステップ、すなわち免疫学的シナプスの形成において重要な役割を果たしている。本発明の化合物は、例えば、Ｔ細胞活性化を調節することによって、又は信号伝達経路の下流プロセスを間接的に調節することによって、免疫応答を調節することができる。本願で用いるとき、語「調節」は、変化させる、例えば、反応又は活性を増加（活性化、増強、刺激）させ、又は減少（抑制、阻害、低下）させることを意味する。本発明の化合物は、「対応する細胞の結合性タンパク質」（この語は、ここにおいて用いるとき、ｐ５６ｌｃｋへのその結合がＳＨ２ドメインによって媒介されているものである如何なる細胞の結合性タンパク質をもいう。）へのｐ５６ｌｃｋのＳＨドメインの結合を調節するということができる。そのような対応する細胞の結合性タンパク質には、例えば、ＣＤ３鎖、ＺＡＰ−７０、ｐ６２、Ｌａｄ、ＣＤ４５、Ｓａｍ６８又はその他が含まれる。
【００３５】
多くのタンパク質チロシンキナーゼは、遺伝子の活性化及び／又は調節、従って細胞の増殖を含む、細胞事象の制御においてある役割を演じている。ｐ５６ｌｃｋは、癌原性遺伝子（ｐｒｏｔｏ−ｏｎｃｏｇｅｎｅ）であり、これは、望ましくない細胞増殖が関与する多くの病理学的状態との関連がいわれてきた。例えば、構成的に活性なｐ５６ｌｃｋの過剰発現が、マウス及びヒトのリンパ腫において観察されており、細胞タンパク質のｐ５６ｌｃｋ媒介性リン酸化がリンパ球増殖を刺激していることを示唆している。加えて、ｐ５６ｌｃｋの過剰発現及び活性化は、エプスタイン・バーウイルス及びＨｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ Ｓａｉｍｉｒｉによって誘導されるヒトのリンパ球形質転換において重要な役割を果たしているように見える。更には、野生型ｐ５６ｌｃｋ及び胸腺細胞におけるｐ５６ｌｃｋの構成的活性型を過剰発現するトランスジェニックマウスは、胸腺腫を発生し、このことは、野生型ｐ５６ｌｃｋの過剰発現でさえも、これらの条件下においては細胞を形質転換し得ることを示唆している。本発明の化合物、例えば、ｐ５６ｌｃｋ活性を阻害する化合物は、過増殖性細胞増殖を伴なう状態を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ（例えば、形質転換細胞）であれｉｎ ｖｉｖｏであれ、治療するために有用である。本発明の化合物によって治療できる又は予防できる状態としては、例えば、良性及び悪性の腫瘍を含む種々の腫瘍、種々の過形成その他が挙げられる。本発明の化合物は、そのような状態に伴なう望ましくない過増殖性の細胞増殖の阻害及び／又は逆転を達成することができる。
【００３６】
ここに使用するときは、語「過増殖性の細胞増殖」は、過剰な細胞増殖をいう。過剰な細胞増殖は、一般的な集団における同じタイプの細胞で起こるもの、及び／又は、初期に患者から得られた同じタイプの細胞に対比したものである。「過増殖性の細胞疾患」は、多細胞生物における１つ又はより多くの細胞の部分集団の過剰な細胞増殖が起こって、その多細胞生物に害（例えば、不快、又は推定寿命の短縮）を及ぼす場合の疾患をいう。過剰の細胞増殖は、一般の集団を参照することにより及び／又は特定の患者（例えば、該患者の生涯のより早期の時点）を参照することにより、決定することができる。過増殖性の細胞疾患は、種々のタイプの動物及びヒトに起こり得、冒された細胞に依存して種々の物理的徴候を呈する。過増殖性の細胞疾患としては、例えば、癌、血管増殖性疾患、線維症性の疾患、及び自己免疫疾患が挙げられる。
【００３７】
本発明の化合物の活性及びその他の性質（及び、当該分野で認められている比較化合物の活性に対するそれらの比較）は、如何なる種々の慣用手順によっても測定することができる。
【００３８】
それらの化合物の生物学的及び／又は化学的性質を測定するために、種々のｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイが使用でき、当該分野において慣用のものである。例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合研究は、それらの化合物の、例えばｐ５６ｌｃｋＳＨ２ドメインへの結合の親和性及び特異性を決定することができる。実施例４は、トリチウム化した化合物及び精製した組換えｐ５６ｌｃｋＳＨ２ドメインを用いてＫＤ値及びＩＣ５０値を決定する方法を説明している。類似のアッセイが、ｉｎ ｖｉｔｒｏで特定の部位、例えばｐ５６ｌｃｋＳＨ２ドメインに選択的に化合物が結合するが、しかし他の部位例えば、Ｈｃｋ、Ｆｙｎ、Ｓｒｃ、Ｓｈｃ又はＺＡＰ−７０のＳＨ２ドメインにはそうでないことを示すことができる。実施例５は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ免疫共沈（ＩＰ）キナーゼアッセイを説明している。やはり、類似のアッセイが、それらの化合物の結合の特異性を示すことができる。実施例６は、該結合の特異性を決定するためのアッセイを説明している。
【００３９】
他の慣用のｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイが、チロシンタンパク質キナーゼ例えばｐ５６ｌｃｋに関連した生物学的活性に対するそれらの化合物の効果（例えば、阻害又は増強）を測定することができる。免疫応答に関与するｐ５６ｌｃｋ活性としては、例えば、ある種の分子、例えばＣＤ３鎖等に存するＩＴＡＭコンセンサス配列における例えばチロシンのリン酸化；例えば対応する細胞の結合性タンパク質との免疫学的シナプス形成；その他が挙げられる。実施例１は、Ｔ細胞活性化に相関する活性である、ジャーカット細胞活性化依存性リン酸化のためのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを説明している。化合物Ｉ’は、リン酸化を刺激すること、並びに化合物ＩＩ’及びＩＩＩ’は阻害的であることが示されている。それらの効果は、投与量依存性であることが示されている。実施例２は、化合物が細胞毒性又は細胞***抑制性を有するか否かを示すものである、細胞生存性のためのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを説明している。化合物ＩＩＩ’は、ジャーカット細胞の増殖の可逆的阻害を見せることが示されている。実施例３は、Ｔ細胞活性化と相関する活性である、ＩＬ−２産生のためのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを説明している。化合物ＩＩＩ’は、ＯＫＴ−３処理ジャーカット細胞におけるＩＬ−２産生を阻害することが示されている。実施例７は、混合リンパ球培養アッセイを説明している。
【００４０】
これらの化合物の免疫調節特性を実証するために種々のｉｎ ｖｉｖｏアッセイが、使用できる。そのようなｉｎ ｖｉｖｏアッセイ及び、これらの化合物で治療することのできる疾患状態の動物モデルは、当業者に周知である。例えば、慢性間接リウマチの動物モデルが、実施例８に説明されている。
【００４１】
細胞の増殖及び細胞の形質転換に対する化合物（例えば、ホスホチロシンキナーゼ阻害剤）の効果を測定するためのアッセイは、慣用のものである。種々の典型的なアッセイが、例えば、以下に記載されている。Ｋｅｌｌｏｆｆ， Ｇ．Ｊ．， ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ Ｐｒｅｖ．， １９９６． ５（８）， ｐ． ６５７−６６； Ｗａｋｅｌｉｎｇ， Ａ．Ｅ．， ｅｔ ａｌ．， Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ Ｔｒｅａｔ， １９９６， ３８（１）， ６７−７３； Ｙａｎｏ， Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ， ２０００， ６（３）， ｐ． ９５７−６５； Ｒｅｅｄｙ， Ｋ．Ｂ．， ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ， １９９２， ５２（１３）， ｐ． ３６３６−４１； Ｐｅｔｅｒｓｏｎ， Ｇ． ａｎｄ Ｓ． Ｂａｒｎｅｓ， Ｐｒｏｓｔａｔｅ， １９９３； ２２（４）， ｐ． ３３５−４５； Ｓｃｈｏｌａｒ， Ｅ．Ｍ． ａｎｄ Ｍ．Ｌ． Ｔｏｅｗｓ， Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ， １９９４， ８７（２）； １５９−６２； Ｓｐｉｎｏｚｚｉ， Ｆ．， ｅｔ ａｌ．， Ｌｅｕｋ Ｒｅｓ， １９９４， １８（６）， ｐ． ４３１−９； Ｋｏｎｄａｐａｋａ， Ｂ．Ｓ． ａｎｄ Ｋ．Ｂ． Ｒｅｄｄｙ， Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ， １９９６， １１７（１）， ｐ． ５３−８； Ｍｏａｓｓｅｒ， Ｍ．Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ， １９９９， ５９（２４）， ｐ． ６１４５−５２； Ｌｉ， Ｙ．， Ｍ． Ｂｈｕｉｖａｎ ＆ Ｆ．Ｈ． Ｓａｒｋａｒ， Ｉｎｔ Ｊ Ｏｎｃｏｌ， １９９９， １５（３）， ｐ． ５２５−３３； Ｂａｇｕｌｅｙ， Ｂ．Ｃ．， ｅｔ ａｌ． Ｅｕｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ， １９９８， ３４（７）， ｐ． １０８６−９０； 及び Ｂｈａｔｉａ， Ｒ．， Ｈ．Ａ． Ｍｕｎｔｈｅ， ａｎｄ Ｃ．Ｍ． Ｖｅｒｆａｉｌｌｉｅ， Ｌｅｕｋｅｍｉａ， １９９８， １２（１１）， ｐ． １７０８−１７．
【００４２】
ここに記述されたアッセイの変法並びに他の慣用のアッセイが、当業者に周知である。そのようなアッセイは、勿論、慣用の手順を用いたハイスループット形式に適合している。
【００４３】
更には、コンピュータ利用の合理的薬物設計の慣用的方法が、例えばＨｃｋ、Ｆｙｎ、Ｓｒｃ、ＳｈｃやＺＡＰ−７０のＳＨ２ドメインではなく例えばｐ５６ｌｃｋのＳＨドメインへの結合特異性に重要なタンパク質領域に、本発明の化合物が適切に「フィット」するか、そしてこれに相補的であるか否か、に関して指標を提供することができる。特に、そのような方法は、ある化合物がｐ５６ｌｃｋのｐＹ＋３結合部位に相補的であるか否かを示すことができる。ここに用いるものとしての「特異的結合」又は「結合の特異性」の語は、例えば、他のタンパク質部分（例えば、他のタンパク質キナーゼのＳＨ２ドメイン）より高い親和性例えばより高い選択性で、本発明の化合物が、特定のＳＨ２ドメイン（例えば、ｐ５６ｌｃｋのＳＨ２ドメイン）と相互作用する、又はこれとの物理的な連携を形成することを意味する。更には、化合物の性質、例えば、溶解性、化学的安定性、及び毒性を付与することの知られた化学的基の不存在等を、特定の化学的置換基の既知の性質に基づいて分析することができ、これらのことは、当業者に周知である。Ｏｐｅｒａ， Ｊ． Ｃｏｍｐｕｔ．−Ａｉｄｅｄ Ｍｏｌ． Ｄｅｓ．， ２０００． １４：ｐ．２５１−２６４を参照のこと。
【００４４】
本発明の化合物は、動物、例えば、マウス、ラット、家兎等のような哺乳類、ペット（例えば、哺乳類、鳥類、爬虫類、魚類、両生類）、家（例えば、農場）畜、及び霊長類、特にヒトにおいて、例えばｐ５６ｌｃｋのＳＨ２ドメインへの結合に、及び例えばｐ５６ｌｃｋの活性を調節するのに効果的である。本発明の化合物は、免疫調節活性及び／又は抗腫瘍活性を示し、チロシンキナーゼ（例えば、ｐ５６ｌｃｋ）の異常な調節又は活性及び／又は細胞内信号応答が関与する疾患の治療に有効である。例えば、免疫応答を賦活する化合物（免疫賦活薬）は、自然に生じた免疫抑制又は種々の状態及び疾患に由来する免疫抑制を治療し又は予防するのに有用である。免疫応答を抑制する化合物（免疫抑制薬）は、例えば、免疫系による身体自体に対する抗体の産生によって引き起こされる炎症性の現象及び組織破壊によって特徴付けられる自己免疫疾患を治療若しくは予防するのに、又は組織若しくは臓器の移植に際して拒絶を抑制するのに、有用である。細胞増殖を阻害する化合物は、細胞の過増殖によって特徴付けられる状態を治療するために、例えば、抗腫瘍薬として有用である。本発明の化合物はまた、例えば細胞の信号発生を研究するための道具としても有用である。
【００４５】
好ましい一具体例によれば、本発明は、例えば、化学療法、放射線治療、放射能宿酔、又はＨＩＶ／ＡＩＤｓ；原発性のＢ細胞減少（例えば、Ｂｒｕｔｏｎ先天性ａ−γ−グロブリン血症又は一般の種々の免疫不全）又は原発性のＴ細胞減少（例えば、ディジョージ（ＤｉＧｅｏｒｇｅ）症候群及びネゼロフ（Ｎｅｚｅｌｏｆ）症候群、毛細管拡張性失調症、ウィスコット・アルドリック（Ｗｉｓｋｏｔｔ−Ａｌｄｒｉｃｈ）症候群；重症複合型免疫不全症（ＳＣＩＤ）等の結果もたらされた免疫系の抑制に苦しむ患者を、本発明の免疫賦活薬で治療する方法を含む。これらの免疫賦活薬はまた、特に免疫不全状態を有する患者のためのワクチン（例えば、抗細菌、抗真菌、抗ウイルス又は抗原虫感染症）；又は抗腫瘍ワクチンのためにも使用することができる。
【００４６】
好ましい別の一具体例においては、本発明は、慢性間接リウマチ、糸球体腎炎、橋本甲状腺炎、多発性硬化症、Ｔ細胞白血病、全身性エリテマトーデス、重症筋無力症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少性紫斑病、１型糖尿病、クローン病、グレーヴス病、セリアック病その他等のような、自己免疫疾患に罹っている患者を、本発明の免疫抑制薬で治療する方法を含む。本発明の免疫抑制薬はまた、組織又は臓器の移植拒絶反応、例えば、超急性又は慢性の移植片対宿主疾患、同種移植又は異種移植拒絶反応等を治療するためにも有用である。
【００４７】
既に述べたように、本発明の化合物はまた、細胞の過剰増殖を阻害する。例えば、それらは抗腫瘍活性を示すことができる。その結果、本発明の化合物は、例えば、Ｔ細胞及びＢ細胞の関与する癌等の種々の状態の治療に有用である。本発明の化合物で治療することのできる癌のタイプのうちには、例えば、白血病、リンパ腫、卵巣癌及び乳癌がある。
【００４８】
本発明の化合物は、例えば、腫瘍特異的抗原に特異的な抗体等のような、特定の腫瘍を標的とする薬剤に取り付けることができる。この仕方により、本発明の化合物は、標的細胞へと輸送されてその中で作用することができる。これらの化合物は、更には、慣用の細胞毒物（例えば、毒素又は放射能）に取り付けることができる。本発明の化合物がその標的、例えばｐ５６ｌｃｋに結合したとき、それはその酵素活性を阻害するのみならず、毒素という手段によって、該標的を及び／又は該標的の存する細胞を破壊する。
【００４９】
これら好ましい面は、本発明の化合物及び薬剤学的に許容し得る担体及び所望により他の、以下に論じる活性な薬剤を含んでなる薬剤組成物を含む。ｉｎ ｖｉｔｒｏであれｉｎ ｖｉｖｏ（動物例えば、動物モデル又は哺乳類又はヒトにおいて）であれ慣用のアッセイ又はここに記載のアッセイによって測定されるものとしてのｐ５６ｌｃｋキナーゼを阻害する又は賦活する方法；免疫応答を調節、例えば免疫反応を増強又は阻害する方法；例えば自己免疫疾患、腫瘍等の疾患状態を治療する方法；動物、例えば、ヒトにおいてｐ５６ｌｃｋキナーゼ活性によって調節される、ここに述べた疾患状態を含む疾患状態を治療する方法、を含む。
【００５０】
本発明はまた、本発明の全ての化合物の薬剤学的に許容し得る塩及びプロドラッグ等のような、これらの化合物のここに開示される有用な形態にも関する。薬剤学的に許容し得る塩としては、主化合物を、塩基として機能させて、無機又は有機酸と反応させて塩、例えば、塩酸、硫酸、リン酸、メタン硫酸、カンファースルホン酸、シュウ酸、マレイン酸、コハク酸及びクエン酸の塩を形成させることによって得られるものが挙げられる。薬剤学的に許容し得る塩としてはまた、主化合物が酸として機能して、適当な塩基と反応して塩、例えば、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アンモニウム及び塩素塩を形成したものが挙げられる。当業者は、請求された化合物の酸付加塩が、既知の多くの方法の如何なるものによっても、それらの化合物を適当な無機又は有機の酸と反応させることによって製造できるということを、更に認識するであろう。代わりに、アルカリ金属塩又はアルカリ土類金属塩が、既知の種々の方法によって、それらの化合物を適当な塩基と反応させることにより製造される。
【００５１】
以下は、無機酸又は有機酸との反応によって得ることのできる酸塩の更なる例である：酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、クエン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、硫酸水素塩、ブタン酸塩、カンファー酸、ジグルコン酸、シクロペンタンプロピオン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、グルコヘプタン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミサルフェート、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、フマル酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、エタンスルホン酸、ニコチン酸、２−ナフタレンスルホン酸、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、ペクチニン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、チオ桂皮酸塩、トシル酸塩、メシル酸塩及びウンデカン酸塩。
【００５２】
好ましくは、形成される塩は、哺乳類に投与するのに薬剤学的に許容し得るものである。しかしながら、それらの化合物の薬剤学的に許容し得ない塩は、例えば、それらの化合物を塩として単離し次いで該塩をアルカリ性試薬で処理して化合物の遊離塩基へと戻するための中間体として適している。遊離塩基は、次いで、望ましい場合には、薬剤学的に許容し得る酸付加塩へと変換することができる。
【００５３】
本発明の化合物は、単独でもまたは調合物の活性成分としても投与することができる。従って、本発明はまた、式Ｉ、ＩＩ’、ＩＩＩ’の化合物の、例えば１腫又は２種以上の薬剤学的に許容し得る担体を含んだ、薬剤学的組成物をも含む。
【００５４】
本発明の化合物を投与するための種々の処方物を調製するための手順を記載した非常に多数の標準の参考文献が入手可能である。可能性ある処方物及び調合物の例には、例えば、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ， Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ （現版）； Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ： Ｔａｂｌｅｔｓ （Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｌａｃｈｍａｎ ａｎｄ Ｓｃｈｗａｒｚ編）現版、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．発行、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ （Ａｒｔｈｕｒ Ｉｓｏｌ編）、１５５３−１５９３ （現班）が挙げられる。
【００５５】
ｐ５６ｌｃｋキナーゼの阻害又は賦活に対するそれらの高い選択性に照らして、本発明の化合物は、ｐ５６ｌｃｋキナーゼの阻害又は賦活を必要とする誰にでも投与することができる。投与は、例えば、経口、経鼻、非経口（皮下、静脈内、筋肉内、胸骨内、及び注入による）、吸入、経直腸、経膣、局所、及び眼投与等、患者の必要に応じて行うことができる。注射は、例えば、筋肉内、腹腔内、静脈内その他であってよい。
【００５６】
本発明の化合物の投与には、錠剤、ゲルカプセル、カプセル、カプレット、顆粒、トローチ剤及び原粉末等の、固体の形態を含む種々の固形の経口投与形態を用いることができる。本発明の化合物は、単独でもまた種々の薬剤学的に許容し得る担体、希釈剤（例えば、ショ糖、マンニトール、乳糖、デンプン）及び当該分野にて知られている補助剤、例えば分散剤、可溶化剤、緩衝剤、結合剤、崩壊剤、保存剤、着色剤、矯味剤、滑沢剤その他との組み合わせで投与することができる。徐放性のカプセル、錠剤及びゲルもまた、本発明の化合物の投与には有利である。
【００５７】
水性及び非水性の溶液、乳濁液、懸濁液、シロップ及びエリキシル剤等のような、種々の液体の経口投与形態もまた、本発明の化合物を投与するために使用できる。そのような投与形態はまた、水等のような当該分野でおいて知られている適当な不活性の希釈剤、及び保存剤、界面活性剤、甘味剤、矯味剤等のような当該分野で知られている適当な補助剤、並びに、本発明の化合物を乳化及び／又は懸濁するための薬剤を含むことができる。本発明の化合物は、等張滅菌溶液の形で、例えば静脈内に、注射してよい。その他の調製物もまた可能である。
【００５８】
本発明の化合物の直腸投与坐剤は、該化合物を、カカオ脂、サリチレート及びポリエチレングリコール等のような適当な賦形剤と共に混合することによって調製することができる。膣投与のための坐剤の形成は、活性成分に加えて当該分野で知られている適当な担体を含む、ペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、泡、又はスプレー処方の形をとることができる。
【００５９】
局所投与のためには、薬剤組成物は、皮膚、眼、耳又は鼻への投与に適した、クリーム、軟膏、リニメント、ローション、乳濁液、懸濁液、ゲル、溶液、ペースト、パウダー、スプレー及びドロップの形をとることができる。局所投与は、経皮パッチのような手段による経皮投与をも含んでよい。
【００６０】
吸入により投与するのに適したエアロゾル処方もまた作ることができる。例えば、気道の疾患の治療のために、本発明の化合物を、粉末の形（例えば、微紛とした）又は噴霧溶液若しくは懸濁液の形で吸入により投与することができる。エアロゾル処方は、加圧された許容し得る噴射剤中に入れておくことができる。
【００６１】
これらの化合物は、単独の活性薬として、又は、チロシンキナーゼ、信号伝達プロセス、細胞増殖及び／又は免疫応答を阻害し又は刺激する他の薬物等のような、他の薬物と組み合わせて投与することができる。阻害薬としては、例えば、サイクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、レフルノミド、ブテナミド、コルチコステロイド、アトメリックアシッド（ａｔｏｍｅｒｉｃ ａｃｉｄ）、ジペプチド誘導体、チルホスチン（ｔｙｒｐｈｏｓｔｉｎ）、ドキソルビシンその他が挙げられる。そのような組み合わせにおいては、各活性成分は、その通常の投与量範囲に従って、又はその通常の投与量範囲を下回る投与量で、投与することができる。
【００６２】
本発明の化合物の投与量は、その他の考慮事項のなかでも、治療すべき特定の症候群、症状の重篤度、患者の年齢、性及び身体状態、投与経路、投与間隔の頻度、用いる特定の化合物、効果、毒性学的プロフィール、該化合物の薬物動力学的プロフィール、及び、何らかの有害な副作用の存在を含む、種々の要因に依存する。
【００６３】
「有効投与量」又は「治療的に有効な投与量」は、ここでは、癌の治療に関連して、以下のうち１つ又は２つ以上の結果をもたらすに十分な量を意味する：癌の寸法の減少；癌の転移の阻害；癌の増殖の阻害、好ましくは癌増殖の停止；癌による不快感の軽減；及び癌に冒された患者の寿命の延長。
【００６４】
「治療的に有効な量」は、癌以外の過増殖性の細胞疾患に関連して、以下のうち１つ又は２つ以上の結果をもたらすに十分な量を意味する：疾患を引き起こしている細胞の増殖の阻害、好ましくは細胞増殖の停止；疾患による不快感の軽減、及び該疾患に冒されている患者の寿命の延長。
【００６５】
「治療的に有効な量」は、自己免疫疾患の治療に関連して、以下のうち１つ又は２つ以上の結果をもたらすに十分な量を意味する：該疾患の症状の阻害又は軽減；該疾患に関与する細胞の進行する変質の阻害；該疾患による不快感の軽減；及び該疾患に冒されている患者の寿命の延長。
【００６６】
「治療的に有効な量」は、組織又は臓器の移植を受ける患者の治療に関連して、以下のうち１つ又は２つ以上の結果をもたらすに十分な量を意味する：移植された材料の拒絶の阻害又は防止；移植片の拒絶に起因する不快感の軽減；及び移植片を受けた患者の寿命の延長。
【００６７】
「治療的に有効な量」は、免疫抑制患者の治療に関連して、以下のうち１つ又は２つ以上の結果をもたらすに十分な量を意味する：Ｔ細胞の数又は活性化されたＴ細胞の数の増加；患者の免疫抑制された状態の減少；該疾患による不快感の軽減、及び該疾患に冒されている患者の寿命の延長。
【００６８】
本発明の化合物は、ｐ５６ｌｃｋキナーゼ阻害薬又は賦活薬、又は上述したもののような他の類似の薬物について一般的である投与量のレベル及び仕方で、投与することができる。例えば、サイクロスポリンは、（移植には）約７．９５±２．８１ｍｇ／ｋｇ／日（ＰＤＲ（Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）を参照）；ＦＫ５０６は、（移植には）約０．１５〜０．３０ｍｇ／ｋｇ／日（ＰＤＲを参照）で投与され；ラパマイシンは、（移植には）約２〜６ｍｇ／日、例えば、８１ｋｇの成人については約０．０２４ｍｇ／ｋｇ／日で投与される（Ｔｈｏｍａｓ Ａ． Ｓｔａｒｇｙ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ウェブサイトを参照）。米国特許第５，６８８，８２４、５，９１４，３４３、５，２１７，９９９、６，１３３，３０１及びここに引用した刊行物をも参照のこと。
【００６９】
例えば、本発明の化合物Ｉ及びＩＩＩは、１回又は複数回投与量で、例えば、患者体重あたり１日１μｇ／ｋｇないし５００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約１００μｇ／ｋｇ／日ないし２５ｍｇ／ｋｇ／日の投与量レベルで投与することができる。化合物ＩＩについては、所望の免疫賦活効果又は免疫抑制効果を生ずるよう、投与量は調節される。低い方の投与量（免疫調節）は、約１μｇ／ｋｇ／日と７５０μｇ／ｋｇ／日の間、好ましくは約１０μｇ／ｋｇ／日と５００ｍｇ／ｋｇ／日の間であることができる。高い方の投与量（免疫抑制）は、約１ｍｇ／ｋｇ／日と７５０ｍｇ／ｋｇ／日の間、好ましくは約１０ｍｇ／ｋｇ／日と４５０ｍｇ／ｋｇ／日の間であることができる。
【００７０】
本発明の手順を実施するに際して、特定の緩衝液、培地、試薬、細胞、培養条件その他への言及は、勿論、限定的であることを意図したものでなく、当該議論が提示された特定の文脈において利益がある又は価値があると当業者が認識する全ての関連する材料を含むように読まれなければならない、ということを理解しなければならない。例えば、１つの緩衝系又は培養培地を他のものに代えても、もしも同一でないにせよ類似の結果をしばしば達成できる。当業者は、ここに開示された方法及び手順を用いて、過度な実験を行うことなしに、彼等の目的に最も役立つようにそのような置き換えを行うことができるような、そのような系及び方法論についての十分な知識を有するであろう。
【００７１】
上記の及び以下の実施例において、全ての温度は摂氏の度で補正せずに示しており、特記しない限り、全ての部及びパーセントは重量による。
【００７２】
〔実施例〕
実施例１ − ジャーカット細胞活性化−依存性のリン酸化
モノクローナル抗体、ＯＫＴ−３によって活性化されたジャーカット細胞におけるリン酸化は、Ｔ細胞活性化と相関する。
【００７３】
Ａ．ＯＫＴ−３で活性化されたジャーカット細胞に対する効果につき、化合物を試験する。ＯＫＴ−３は、ＣＤ３−ε鎖に対するモノクローナル抗体である。ＯＫＴ−３抗体による３７℃５分間のジャーカット細胞の処理は、ジャーカット細胞を活性化させて、数種の細胞タンパク質のチロシンリン酸化を誘導する。キナーゼ活性を欠いたｐ５６ｌｃｋを発現しているＪＣａＭ１．６ジャーカット細胞においては、細胞タンパク質のＯＫＴ−３媒介性のリン酸化は起こらず、このことは、ｐ５６ｌｃｋがこの過程に必須の役割を演じていることを示している。本発明の化合物又は標準として役立つことのできる既知の化合物が、ジャーカット細胞においてＯＫＴ−３によって刺激された細胞チロシンリン酸化に影響を与えるか否か、を決定するために、試験を実施する。例えば、化合物ＩＩ’、及びＩＩＩ’は、１００μＭで阻害活性を、そして化合物Ｉ’は刺激活性を現すことが示されている。
【００７４】
アッセイは次のようにして行う：１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を補充したＲＰＭＩ１６４０中のジャーカット細胞（１×１０６個）を、ＯＫＴ−３抗体（０．２μｇ）及び各化合物（１００μＭ）で５分間３７℃で処理する。この培養時間の後、直ちに培養物を氷上に置き、冷ＰＢＳで３回洗浄し、そして２０μｌのＳＤＳサンプル緩衝液で溶解する。サンプルを手短に超音波処理し、５分間煮沸しそしてＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）（１２％ゲル）に適用する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ウエスタンブロット分析のために、タンパク質をイモビロン（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ）Ｐ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上にブロットする。５％粉ミルク／ＴＢＳＴ（トリス緩衝生理食塩水、１％ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）で膜をブロックする。洗浄後、ブロットをモノクローナル抗ホスホチロシン抗体で、ＴＢＳＴ中１時間インキュベートし、続いて、西洋ワサビパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）−接合ヤギ抗マウスＩｇＧと共に１時間インキュベートする。増強された化学ルミネッセンス（ＥＣＬ，Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてブロットを現像する。
【００７５】
Ｂ．投与量応答実験を行う。例えば、化合物Ｉ’は、投与量依存的にジャーカット細胞タンパク質のチロシンリン酸化を有意に刺激することが示されている。化合物ＩＩ’は、低い投与量（０．１及び１μＭ）で細胞タンパク質のチロシンリン酸化を刺激するが、高い投与量（１００μＭ）ではリン酸化を阻害する。化合物ＩＩＩ’は、細胞タンパク質のチロシンリン酸化を完全に阻害する。
【００７６】
このアッセイは、次のようにして行う：抗ホスホチロシン抗体を用いたウエスタンブロット分析を実施する。化合物（例えば、本発明の化合物Ｉ’、ＩＩ’及びＩＩＩ’）を、０．１、１、１０及び１００μＭの濃度で加える。細胞を上記のようにして培養する。化合物Ｉ’は、チロシンリン酸化を投与量依存的に誘導することが示され、一方、化合物ＩＩＩ’は、試験した最低濃度（０．１μＭ）でもチロシンリン酸化を阻害する。化合物ＩＩ’は、２相性の応答を与え、低投与量（０．１及び１μＭ）ではチロシンリン酸化を刺激する一方、高投与量（１００μＭ）ではリン酸化を阻害する。
【００７７】
実施例２ − ジャーカット細胞の生存性に対する影響
細胞毒性又は細胞***抑制性があるか否かを決定するために、化合物を試験することができる。チロシンリン酸化に対するＯＫＴ−３媒介性の刺激を阻害する化合物がジャーカット細胞に対して細胞毒性を有するか否かを試験するために、ジャーカット細胞の増殖に対するその影響を試験する。例えば、化合物ＩＩＩ’は、１０μＭでジャーカット細胞の増殖を抑制して幾らかの細胞***抑制効果を現すことが示されているが、細胞毒性は観察されない。ジャーカット細胞は、化合物ＩＩＩ’の」添加の２４時間後には、正常な増殖率に戻っており、このことは、増殖に対する化合物ＩＩＩ’の効果は、可逆的であることを示している。
【００７８】
実施例３ − ジャーカット細胞におけるＩＬ−２産生の阻害
インターロイキン２（ＩＬ−２）は、Ｔ細胞の自己分泌増殖因子であり、正常なＴ細胞において、その産生にはＴ細胞抗原受容体及びコ・レセプター（ｃｏ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ）により発生される活性化信号が必要である。ＩＬ−２の産生は、Ｔ細胞活性化信号発生の証しの一つであり、抗原特異的Ｔ細胞クローンのクローン拡張をもたらす。ジャーカット細胞においては、ＯＫＴ−３による細胞の処理は、ＩＬ−２の産生をもたらす。細胞タンパク質のＯＫＴ−３誘導性チロシンリン酸化を阻害する化合物が、ＩＬ−２産生をも阻害するか否かを試験するために、ジャーカット細胞を、該化合物の存在下又は不存在下に、ＯＫＴ−３で処理する。例えば、ＯＫＴ−３処理の時に、細胞を１０μＭの化合物ＩＩＩ’で処理したときは約５０％のＩＬ−２阻害が観察される。低い濃度では、化合物ＩＩＩ’は観察し得る効果を有しない。ＯＫＴ−３誘導性のチロシンリン酸化の完全な阻害とは異なって、化合物ＩＩＩ’によるＩＬ−２産生阻害は、部分的である。
【００７９】
アッセイを次のようにして行う： ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳ中で、化合物（例えば、化合物ＩＩＩ’）（０．１、１及び１０μＭ）の存在下又は不存在下に、ジャーカット細胞（１×１０６個）をＯＫＴ−３抗体（０．２μｇ）で２４時間処理する。インキュベーション期間の終りに、培養培地を回収し、ヒトＩＬ−２についてＲＩＡでアッセイする。ＯＫＴ−３のみ及びＰＭＡ＋イオノマイシンで処理した細胞を陽性対象とする。無処理の細胞を陰性対照とする。ＩＬ−２産生は、無処理の細胞では検出されない。１０μＭの化合物ＩＩＩ’で処理した細胞は、ＩＬ−２産生を４４％阻害することが示されている。標準偏差は０．２３ｐｇ／ｍｌである。
【００８０】
実施例４ − ［ ３ Ｈ］化合物を用いたＳＨ２ドメインへの結合
細菌中でＧＳＴ−融合タンパク質として発現させた、精製した組換えｐ５６ｌｃｋ−ＳＨ２ドメインを、抗ＧＳＴアガロースビーズ又はグルタチオン・アガロースビーズの何れにも結合させる。これらのビーズは、ＧＳＴ−ｐ５６ｌｃｋ−ＳＨ２タンパク質に結合し、ＳＨ２ドメインに結合した［３Ｈ］試験化合物の、未結合の化合物からの分離を容易にする。代わりとして、デキストラン−被覆活性炭溶液が、結合した化合物を未結合の化合物から分離するのに使用される。
【００８１】
・ＫＤの決定： 化合物の結合親和性は、標準のスキャッチャード（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ）解析によって決定され、そこでは、結合アッセイは、固定した量の［３Ｈ］化合物と増大する量の非放射性化合物との存在下に行われる。化合物のＫＤは、リガンドプログラム（Ｌｉｇａｎｄ Ｐｒｏｇｒａｍ）（Ｍｕｎｓｏｎ ＆ Ｒｏｄｂａｒｄ １９８０）， Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １０７， ２２０−２３９を用いて計算する。ｃｏ−Ｐは、例えばＳｕｎ ｅｔ ａｌ．， １９８７， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍ． １４８， ６０３−６０８から明らかである。
【００８２】
・ＩＣ５０の決定： ＫＤの決定に加えて、ＣＤ３のζＩＴＡＭ２のＮ末端ｐＹへのｐ５６ｌｃｋ−ＳＨ２ドメインの結合を阻害する化合物のＩＣ５０値を測定する。ＣＤ３ζ鎖の２番目のＩＴＡＭのＮ末端ｐＹに対し、ｐ５６ｌｃｋのＳＨ２ドメインは、最も高い結合親和性を有している（０．１μＭ）。この領域に対応する合成ペプチドが作られ、アガロースビーズに接合される（ζ−ＮｐＹ−ＩＴＡＭ２−アガロース）。ｐ５６ｌｃｋは、ＳＨ２ドメインを介してζ−ＮｐＹ−ＩＴＡＭ２−アガロースに結合し、沈殿させることができる。組換えｐ５６ｌｃｋＧＳＴ−ＳＨ２タンパク質を用いて、ＲＩＰＡ緩衝液中で種々の濃度（０．０１〜１００μＭ）のこれら化合物の存在下又は不存在下に、ζ−ＮｐＹ−ＩＴＡＭ２−アガロース使用の結合アッセイを行う。室温にて２時間の結合反応の後、ビーズを回収してＲＩＰＡ緩衝液で３回洗浄する。抗ＧＳＴ抗体及びＨＲＰ−接合二次抗体及びＨＲＰ酵素基質と共にビーズをインキュベートした後、ζ−ＮｐＹ−ＩＴＡＭ２−アガロースに結合したＧＳＴ−ＳＨ２の相対量を、比色アッセイで測定する。化合物の不存在下におけるζ−ＮｐＹ−ＩＴＡＭ２−アガロースへのＧＳＴ−ＳＨ２の結合から読み取られたＯＤは、陽性対照として働き、１００％結合レベルを表す。バックグラウンド（ＧＳＴ−ＳＨ２無しでのζ−ＮｐＹ−ＩＴＡＭ２−アガロース）が、各値から減ぜられる。アッセイは３本行い、３つの独立したアッセイからの平均を、各化合物についてのＩＣ５０値の計算に用いる。
【００８３】
実施例５− 共免疫沈降実験
ｐ５６ｌｃｋＳＨ２ドメインｐＹ＋３ポケットへの化合物の結合は、細胞の標的タンパク質のホスホチロシン残基との、ＳＨ２媒介性のｐ５６ｌｃｋの相互作用に影響を及ぼす。例えば、阻害化合物による細胞処理は、ＣＤ３ζ及びＺＡＰ−７０とのｐ５６ｌｃｋの連携を阻害するのに対し、刺激化合物による処理の後は、連携の増加が起こる。これらの分子的相互作用の存在は、化合物の存在下又は不存在下における活性化したジャーカット細胞中の共免疫沈降（ｃｏ−ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）アッセイによって評価する。このアッセイを（本明細書の他の箇所に記載したｐ５６ｌｃｋキナーゼアッセイと組み合わせて）用いることで、分子的相互作用の遮断に関して化合物のＩＣ５０を、そしてキナーゼ活性に関して化合物のＥＤ５０を、評価することができる。これらの値は、一般に、化合物の効果がｐ５６ｌｃｋのＳＨ２ドメインへの結合によって媒介されているのならば、ＳＨ２ドメインに結合する化合物のＫＤの近くにある。
【００８４】
試験すべき化合物（０．０１〜１００μｍ）の存在下又は不存在下に、ＯＫＴ−３抗体（１μｇ／５×１０６細胞）を用いてジャーカット細胞（５×１０６ないし１×１０７／ｍｌ；１ｍｌ／条件）を活性化させる。３７℃での１０分の活性化に続いて、細胞を回収し、ＲＩＰＡ又はＮＰ−４０溶解緩衝液を用いて溶解させる。不溶性の物質を除去した後、ＣＤ３ζ又はＺＡＰ−７０に対する抗体１ないし２μｇで上清を処理する。プロテインＡ又はＧ接合アガロースビーズ（５０％スラリーの１０μｌ）を用いて、４℃で免疫複合体を沈殿させる。ビーズを回収し、溶解緩衝液で３回洗浄し、２分間煮沸し、ＳＤＳ ＰＡＧＥ（例えば、１２．５％）上で分離し、抗ｐ５６ｌｃｋ抗体を用いたウエスタンブロット分析のために、イモビロンＰ膜上にブロットする。化合物の存在下に活性化無しの又は活性化した細胞からのサンプルは、陰性及び陽性対照として働く。各サンプルから等しい量のタンパク質（ＣＤ３ζ又はＺＡＰ−７０）が沈殿していることを確認するために、沈殿抗体によるブロットの再プローブも行う。共免疫沈降するｐ５６ｌｃｋの存在が試験される。アッセイ中の化合物濃度を変更して、共免疫沈降するｐ５６ｌｃｋの相対量を測定することによって、半定量分析もまた行うことができる。定量は、ＥＩＡ（ＨＲＰ接合二次抗体＋色原体基質に続いて分光光度法によるアッセイを使用）、化学ルミネッセンス（ＨＲＰ接合二次抗体＋ＥＣＬに続いてイメージアナライザーを使用）又はリン画像解析（［１２５Ｉ］二次抗体を使用）を実施することによって、行われる。各化合物についてのＩＣ５０値が決定される。
【００８５】
実施例６ − 結合の特異性の実証
特異性の試験のために、配列の相同性その他の考慮事項に基づいて、２個のｐＹ結合部位を含むものであるＺＡＰ−７０を含む、５種の追加のＳＨ２ドメイン含有キナーゼを、コンピュータ的及び実験的に、選択する。これらのタンパク質は表１に掲げられている。
【００８６】
【表１】
【００８７】
ａ）ＺＡＰ−７０は、Ｎ及びＣ末端領域に、それぞれＺＡＰ−７０，Ｎ、ＺＡＰ−７０，Ｃと呼ばれる２個のホスホチロシン結合部位を含む。
ｂ）ＮＡ： ＰＤＢからは得られないが、その構造は著者によって得られた。
【００８８】
特異性は、表２に掲げたホスホペプチドとの表１のＳＨ２ドメインの差別的結合によって決定される。それらのＳＨ２ドメインは、ｐ５６ｌｃｋとの相同性、並びに３次元（３Ｄ）構造データが入手できることに基づいて選択する。ホスホペプチドは、それらのＳＨ２ドメイン特異性に基づいて選択する。ζ−ＩＴＡＭ−２−Ｃペプチド及びζ−ＩＴＡＭ−１ペプチドは、それぞれ、ｐ５６ｌｃｋ及びＺＡＰ−７０に特異的である。ｐ５６ｌｃｋ及びＳｈｃを含む全てのＳｒｃキナーゼは、ｐＹＥＥＩ配列を含むハムスターポリオーマミドルＴ抗原ペプチドに対して、類似の親和性を以って結合することが知られている。
【００８９】
【表２】
【００９０】
本化合物とホスホペプチドとの間の固相結合競合アッセイを用いる。ＳＨ２ドメインをＰＣＲ増幅し、ＧＳＴ融合タンパク質としてＥ． ｃｏｌｉ中に発現させる。ＧＳＴ融合タンパク質を、グルタチオンカラムにかけて精製する。トロンビンを用いてＳＨ２ドメインを切り離し、ゲルろ過カラムにかけて精製する。表２に掲げたペプチドを含んだ合成のホスホチロシンを、慣用の方法を用いて合成する。これらのペプチドを、Ｎ末端において、ＳＨ２ドッキング部位から離れたところで、Ｐｉｅｒｃｅ （Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， ＩＬ） から入手できるキットを用いてビオチン化する。９６ウェルのＥＩＡプレートを、精製ＳＨ２ドメイン（１μｇ／ウェル；約１００ ｎｍｏｌ）でコートする。種々の濃度（ｐｍｏｌ ないし μｍｏｌ）の化合物の存在下又は不存在下に、ビオチン化したペプチド（約２００ ｎｍｏｌ）を加える。次いで、ＳＨ２ドメインに結合したビオチン化ペプチドを、種々の方法、例えば、ＨＲＰ−ストレプトアビジン＋基質を用いた比色分析アッセイにより、ＦＩＴＣ標識ストレプトアビジンを用いた蛍光により、又は、［１２５Ｉ］標識ストレプトアビジンを用いてシンチレーションカウンターによって、測定する。化合物無しでのζ−ＩＴＡＭ２−ＣペプチドのＯＤ（又はｃｐｍ）の読みは、１００％結合に相当する。ＳＨ２のみのＯＤ（又はｃｐｍ）の読みは、ブランクに相当する。各化合物のＩＣ５０が決定される。代わりとしは、アッセイを、インキュベーション時間の後にＳＨ２ドメインを分離するためにグルタチオン−アガロースビーズを使用するのに適合させる。結合競合アッセイを用いることにより、各化合物のＫＤが、決定される。
【００９１】
実施例７ − 混合リンパ球培養アッセイ
生物学的応答を測定するのに用いられるもう一つの読み出しアッセイは、混合リンパ球培養アッセイであり、これにおいては、異なった組織適合抗原を有する異なった系統のマウスからのリンパ球が混合される。組織適合性抗原の相違のために、両系統のマウスからの休止Ｔ細胞が、芽球化を起こして増殖する。如何なるＴ細胞活性化プロセスでもそうであるように、ｐ５６ｌｃｋの活性化が必須である。従って、ｐ５６ｌｃｋ活性化の調節は、ＤＮＡへの［３Ｈ］−ＴｄＲ取り込みのレベルにおける下流調節として定量することができる。
【００９２】
異なった２つの異質遺伝子型系統のマウスのリンパ節又は脾臓のリンパ球を収穫する。各系統からの細胞（１×１０６個）を、２００μｌの培養培地を含んだ９６ウェルの培養プレート中で、化合物（０．１〜１００μＭ）の存在下又は不存在下に混合し、そして７２時間培養する。回収の６時間前に、０．５μＣｉの［３Ｈ］−ＴｄＲを各ウェルに加える。培養時間の最後に、セル・ハーベスター（ｃｅｌｌ ｈａｒｖｅｓｔｅｒ）を用いて細胞をガラス線維フィルター上に回収する。ＰＢＳで、次いでエタノールでフィルターを洗浄し、ＤＮＡ中に取り込まれた［３Ｈ］−ＴｄＲをシンチレーションカウンターを用いて測定する。実験は３本行う。化合物の不存在下に培養された細胞は、陽性対照として使われる。異質遺伝子型リンパ球の不存在下に培養されたマウスの各系統からの細胞は、陰性対照として使われる。化合物は、１２時間毎に添加される。タンパク質リン酸化とＩＬ−２産生とを抑制する化合物は、［３Ｈ］−ＴｄＲ取り込みに対して同様の効果を有している。
【００９３】
実施例８ − マウスにおける遅延型過敏症（ＤＴＨ）の免疫応答及び抗２型コラーゲン誘導慢性間接リウマチの ｉｎ ｖｉｖｏ での阻害
一つの実験モデルは、ＰＰＤに対するＤＴＨである。ＤＴＨ反応は、Ｔ細胞免疫応答に典型的なものの一つであり、従って、本化合物のｉｎ ｖｉｖｏでの効果を評価するために使用するのによく適している。完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）に入れたＢＣＧを用いてマウスを免疫感作する。最初の免疫感作の後、ツベルクリン皮膚試験を行う。ＢＣＧ免疫感作したマウスの両側の皮膚領域を、脱毛クリームで処理する。２箇所の脱毛部位にツベルクリンの皮内注射を行う。ＤＭＳＯに溶解させた化合物を、これらの部位の片方に１２時間毎に塗布する。他方の部位は、ＤＭＳＯのみで処理し、内部陽性対照として使用される。１週間後、ＤＴＨ反応の直径を、対照部位及び治療部位の双方につき測定する。１群に５匹のマウスが用いられる。ＤＴＨ皮膚試験において対照に対し５０％の減少に必要な有効投与量を決定するために、統計分析を行う。治療は、（気化させた２％イソフルランを使用して）麻酔した動物で行う。動物は、ＤＭＳＯが皮膚に完全に吸収されるまで麻酔下に維持する。各部位に塗布ＤＭＳＯの量は、最小限（約１０μｌ）に維持する。
【００９４】
ＤＴＨ反応に加えて、マウスにおけるコラーゲン誘発関節炎（ＣＩＡ）を用いて実験を行う。ＣＩＡは、ヒトにおける慢性間接リウマチ（ＲＡ）の実験モデルである。短期間のうちにマウスにＣＩＡを確実に誘発するのには市販のキットが入手できる。ＩＩ型コラーゲンに対するモノクローナル抗体カクテルを、マウスに、静脈注射し、抗体カクテルの注射２４ないし４８時間内にリウマチ性関節炎が発症し、２本の後肢の増悪する腫脹が、６日目には顕著となる。各動物のこれらの肢の一つを、ＤＭＳＯで溶解させた化合物で治療する。他の肢は、他方の肢はＤＳＭＯのみで治療し、内部陽性対照として使われる。肢の腫脹を測定する。生理食塩水注射しＤＭＳＯ治療した肢の厚みは、陰性対照として用いる。後肢をＤＭＳＯ溶液に（試験化合物の存在下又は不存在下に）、１２時間間隔で毎日２回１０秒間浸漬させる。ＤＭＳＯが完全に吸収されるまで動物を麻酔下におく。１群に５匹の動物を用いる。抑制性化合物については、対照に比して後肢の腫脹の５０％減少に必要な有効投与量を決定するために、統計解析を行う。治療は、麻酔下のマウスを用いて行う。
【００９５】
以上の記述から、当業者は、本発明の本質的特徴を容易に確認することができ、そしてその精神及び範囲から逸脱することなしに、種々の用途及び条件に適合させるよう本発明の変更及び修正を行うことができる。
【００９６】
当業者は、以上の記述を用い、更なる苦労なしに、本発明をその完全な範囲まで利用することができると信じられる。従って、以上の好ましい特定の具体例は、単に説明的なものであって、如何なる意味においても開示の残り部分を限定するものでないと解釈しなければならない。
【００９７】
以上に及び図面において引用した全ての出願、特許及び刊行物は、参照によってそれらの全体がここに導入される。
本出願は、米国仮出願第６０／２２１，６８７の出願日の利益を主張しており、参照によりその開示が全体的に導入されている。
【０００２】
〔発明の分野〕
本発明は、例えば、ｐ５６ｌｃｋのチロシンキナーゼ活性及びこの酵素が関与する信号伝達経路を調節する化合物に関する。本発明はまた、例えば、免疫抑制性の又は免疫賦活性の活性を有する等の、免疫調節活性を有する、及び／又は抗腫瘍効果を有する化合物にも関する。本発明は更に、これらの化合物を含んでなる組成物及びそれらの使用方法に関する。
【０００３】
〔発明の記述〕
一具体例においては、本発明は、免疫調節効果を、これを必要とする患者において達成する方法であって、式、
【０００４】
【化３１】
〔式中、Ｘは、イオウ、ＳＯ２、ＳＯ、メチレン、酸素、カルボニル、エチレン、アミド、エステル又はチオエステルであり、
Ｒ１は、負電荷官能基であり、
Ｒ２は、電気陰性の基であって、アミン、アミド、ウレア、カルバミド、カーボネート、アンハイドライド、チオアミド、チオウレア、チオカルバミド、チオカーボネート、チオアンハイドライド、ヒドロキシル、又はエステル例えばアルキルエステル、アシルエステル、アリールエステル、アルキルチオエステル、アシルチオエステル又はアリールチオエステルであることができ、
Ｙ１、Ｙ２、Ｙ３、Ｙ４、Ｙ５、Ｙ６、Ｙ７、Ｙ８、Ｙ９及びＹ１０は、独立して、水素、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル又はハロゲンであり、そして
所望により、これらフェニル芳香族環の１個又は２個以上は、縮合芳香環によって、又は、例えば、これら１個又は２個以上の芳香環の１〜３個の炭素原子が窒素原子で置き換えられることによって、ヘテロ芳香環、又は縮合ヘテロ芳香環によって置き換えられている。（例には、ナフチル、ピリジニル、キノリニル及びイソキノリニル環が含まれる）〕、
又は式、
【０００６】
【化３２】
〔式中、Ｘ及びＹ１ないしＹ７は、上記定義に同じであり、
Ｒ１及びＲ４は、同一又は異なっており、且つＲ１についての上記定義と同じであり、
Ｒ３は、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、アミン、メチル、エチル、プロピル又はイソプロピルであり、そして
所望により、これらフェニル芳香族環の１個又は２個以上は、縮合芳香環によって、又は、例えば、これら１個又は２個以上の芳香環の１〜３個の炭素原子が窒素原子で置き換えられることによって、ヘテロ芳香環、又は縮合ヘテロ芳香環によって置き換えられている。（例には、ナフチル、ピリジニル、キノリニル及びイソキノリニル環が含まれる）〕、
【０００８】
又は式、
【０００９】
【化３３】
Ｘ１は、イオウ、ＳＯ２、ＳＯ、メチレン、酸素、カルボニル、エステル、チオエステル又はアミドであり、
Ｒ３及びＲ５は、同一又は異なっており、且つＲ３についての上記定義に同じであり、そして
所望により、これらフェニル芳香族環の１個又は２個以上は、縮合芳香環によって、又は、例えば、これら１個又は２個以上の芳香環の１〜３個の炭素原子が窒素原子で置き換えられることによって、ヘテロ芳香環、又は縮合ヘテロ芳香環によって置き換えられている。（例には、ナフチル、ピリジニル、キノリニル及びイソキノリニル環が含まれる）〕
の化合物又はその薬剤学的に許容し得る塩の有効量を投与することを含むものである方法に関する。
【００１０】
好ましくは、上記化合物の負電荷官能基は、−ＣＯＯＨ、アミド、エステル、ニトロ、ホスフェート又はサルフェート基であり（ホスフェートは、リンに基づく酸例えばリン又はリン酸等のエステルを意味し、サルフェートは、イオウに基づく酸例えばスルホン酸又はスルフィン酸等のエステルを意味する）；該水素結合受容体は、好ましくはカルボン酸又はカルボン酸エステル、例えばアルキルエステル、アシルエステル、アリールエステル、アルキルチオエステル、アシルチオエステル又はアリールチオエステルである。
【００１１】
特に好ましい具体例の一つにおいては、該化合物は、
【００１２】
【化３４】
【化３５】
又は
【００１５】
【化３６】
である。
【００１７】
模範的な具体例においては、Ｘ１及びＸは、独立して、Ｏ、Ｓ、チオエステル又はカルボニルであり、
Ｒ１（及び独立してＲ４）は、ＣＯＯＨ又はニトロであり、
Ｒ２は、アルキルエステル、アミノ又はＯＨであり、
Ｒ３（及び独立してＲ５）は、Ｈ、Ｃｌ、Ｆ、ＯＨ又はメチルであり、
各Ｙは、独立して、Ｈ、メチル、Ｆ又はＣｌであり、そして「フェニル」環は、フェニル環のままであるか又はナフチル若しくはピリジニルである。
【００１８】
別の一具体例においては、本発明は、抗腫瘍効果を、これを必要とする患者において達成する方法であって、上記の式Ｉ、ＩＩ又はＩＩＩの化合物の有効量を投与することを含むものである方法に関する。
【００１９】
別の一具体例においては、本発明は、ｐ５６ｌｃｋ分子の、そのＳＨ２ドメインを介した対応する細胞の結合性タンパク質への結合を調節する、及び／又は、ｐ５６ｌｃｋ分子の、そのＳＨ２ドメインを介した活性を調節する方法であって、ｐ５６ｌｃｋ分子のＳＨ２ドメインに、式Ｉ、ＩＩ又はＩＩＩの化合物を、より好ましくは上記のように式Ｉ’、ＩＩ’又はＩＩＩ’の化合物を結合させることを含む方法に関する。
【００２０】
別の一具体例においては、本発明は、抗腫瘍効果を、これを必要とする患者において達成するための方法であって、式Ｉ’、ＩＩ’又はＩＩＩ’の化合物の有効量を投与することを含むものである方法に関する。
【００２１】
別の一具体例においては、本発明は、過増殖性の細胞増殖を阻害を、これを必要とする患者において行う方法であって、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、Ｉ’、ＩＩ’又はＩＩＩ’の化合物の有効量を投与することを含むものである方法に関する。
【００２２】
別の一具体例においては、本発明は、免疫調節効果を、これを必要とする患者において達成する方法であって、式Ｉ’、ＩＩ’又はＩＩＩ’の化合物の有効量を投与することを含むものである方法に関する。
【００２３】
上記式Ｉ’の化合物（化合物Ｉ’）は、約３５２の分子量及びＣ２０Ｈ１６Ｏ４Ｓの化学式を有する。それは、ｐ５６ｌｃｋキナーゼ活性を活性化し、Ｔ細胞の刺激及び活性化をもたらす。化合物Ｉ’は、例えば、免疫賦活薬として使用することができる。
【００２４】
上記式ＩＩ’の化合物（化合物ＩＩ’）は、約３０５の分子量及びＣ１４Ｈ８Ｏ５ＣｌＮの化学式を有する。それは、低い濃度（投与量）でｐ５６ｌｃｋキナーゼ活性を活性化し、高濃度（投与量）で活性を阻害する。化合物ＩＩ’は、その濃度（投与量）に応じて、例えば、免疫賦活薬若しくは免疫抑制薬として、又は抗腫瘍薬として使用することができる。
【００２５】
上記式ＩＩＩ’の化合物（化合物ＩＩＩ’）は、約４２１の分子量及びＣ１８Ｈ１０Ｃ１２Ｎ２Ｏ４Ｓの化学式を有する。それは、ｐ５６ｌｃｋキナーゼ活性を阻害し、例えば、免疫抑制薬又は抗腫瘍薬として使用することができる。
【００２６】
好ましい一具体例においては、本発明の化合物は、ホスホチロシン又は関連の部分を含まない。
【００２７】
全ての化合物が、既知の反応化学を用いて、既知の材料又は通常の方法で製造できる材料から出発して、完全に通常の方法で製造できる〔例えば、Ｈｏｕｂｅｎ−Ｗｅｙｌ， Ｍｅｔｈｏｄｅｎ ｄｅｒ Ｏｒｇａｎｉｓｃｈｅｎ Ｃｈｅｍｉｅ〔Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ〕， Ｇｅｏｒｇ−Ｔｈｉｅｍｅ−Ｖｅｒｌａｇ， Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ．を参照〕。例えば、本発明の一化合物は、化学種、
【００２８】
【化３７】
のＳＮＡＲ反応を介して合成することができる。
【００３０】
本発明の多くの化合物は、化学品供給業者等のような標準の供給源から直ちに入手可能であり、又は商業的に入手できる化合物から、上述のような通常の変更によって作り出すことができる。例えば、上述の化合物Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩは、Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ， ＬＴＤ（Ｍａｙｂｒｉｅｇｅ ＰＬＣ； Ｔｒｅｖｉｌｌｅｔ， Ｔｉｎｔａｇｅｌ； Ｃｏｒｎｗａｌｌ， ＰＬ３４ ＯＨＷ； イングランド）から入手することができる。化合物Ｉ’は、Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ ＃ＢＴＢ１１４７８；化合物ＩＩ’は、Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ ＃ＳＢ００５２９；そして化合物ＩＩＩ’は、Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ ＃ＳＰＢ０１８９０である。
【００３１】
本発明の化合物の利点のうちに、分子が（タンパク質チロシンキナーゼ活性の、ペプチド及びタンパク質調節剤では受けるような）酵素的加水分解を受けないこと、及び、それらが良好な細胞透過性を有することがある。
【００３２】
如何なる特定のメカニズムにも拘束されることは望まないが、本発明は、例えば、タンパク質、例えば、タンパク質チロシンキナーゼ（これは、細胞間信号伝達経路に関与する）と特異的に相互作用する化合物に、特に、そのようなチロシンキナーゼのＳＨ２ドメインと相互作用する化合物に、更に取り分け、ｐ５６ｌｃｋｓｒｃファミリーチロシンキナーゼのＳＨ２ドメインと相互作用する化合物に関する。他の諸機能のうち、ｐ５６ｌｃｋタンパク質は、活性の免疫応答を行うために必要であるＴ細胞抗原受容体活性化信号発生に関与する信号伝達経路に、及び細胞増殖の面に、例えば、腫瘍細胞の増殖に関与する。本発明の化合物は、ｐ５６ｌｃｋと、特に、そのＳＨ２ドメインと相互作用することにより、該タンパク質のキナーゼ活性を調節し及び／又はそれが対応する細胞の結合性タンパク質と相互作用する能力を調節し、それによって、免疫応答を、直接的又は間接的に調節し且つ腫瘍細胞増殖を調節する。本発明の化合物は、信号伝達経路の下流信号伝達プロセスを含む信号伝達経路を、増強するか又は阻害し、すなわちそれらは、条件に応じて促進的又は阻害的という、二相性であり得る。与えられた如何なる化合物の効果も、ここに記載したアッセイ又は他の全く慣用のアッセイの１つ又は２つ以上において日常的仕方で決定できる。
【００３３】
ｐ５６ｌｃｋキナーゼの非触媒性ドメイン、例えばＳＨ２ドメインは、ｐ５６ｌｃｋ機能の制御に重要な特定の分子内及び分子間相互作用を媒介する。すなわちそれらは、キナーゼ活性に対しマイナス効果にもプラス効果のどちらをも及ぼす。一般に、分子内相互作用は、ｐ５６ｌｃｋを不活性な状態に維持し、分子間相互作用は、ｐ５６ｌｃｋキナーゼ活性を促進する。例えば、ＳＨ２ドメインは、基質リン酸化が必要な場合は、ｐ５６ｌｃｋを特異的な細胞部位〔ＩＴＡＭ（ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｂａｓｅｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｍｏｔｉｆ：免疫受容体チロシン系活性化モチーフ）ホスホチロシン〕へとｐ５６ｌｃｋを向かわせることにより、ｐ５６ｌｃｋ酵素活性をプラスに制御することができ、そして、ＳＨ２ドメインを介してホスホチロシン部位に結合したｐ５６ｌｃｋは、より高酵素活性を示すことができ、それにより、基質の更なるリン酸化を促進する。これが如何にして達成されるかの如何なる特定のメカニズムに拘束されることも希望しないが、ＳＨ２ドメインに結合する本化合物は、キナーゼ活性又は随伴の細胞リン酸化事象（例えば、細胞内信号発生に関与するプロセス）を、増加（活性化、増強、刺激）させ、減少（抑制、阻害、低下）させることができるか、又は効果を有しない。、
【００３４】
Ｐｐ５６ｌｃｋは、免疫応答の調節において重要な役割を果している。ｐ５６ｌｃｋは、Ｔ細胞特異的なキナーゼであり、Ｔ細胞の大半はＣＤ４（ＴＨ細胞で）及びＣＤ８（細胞障害性Ｔ細胞で）に関連している。ｐ５６ｌｃｋキナーゼは、例えばＴ細胞活性化の初期のステップ、すなわちＣＤ３鎖中のＩＴＡＭのリン酸化を担っており、これは次いで、例えばアクチンの重合、遺伝子転写の促進、細胞増殖及び分化等をもたらす複数の生化学的事象の細胞内カスケードを開始させるものである。ｐ５６ｌｃｋはまた、Ｔ細胞の活性化における第２の重要なステップ、すなわち免疫学的シナプスの形成において重要な役割を果たしている。本発明の化合物は、例えば、Ｔ細胞活性化を調節することによって、又は信号伝達経路の下流プロセスを間接的に調節することによって、免疫応答を調節することができる。本願で用いるとき、語「調節」は、変化させる、例えば、反応又は活性を増加（活性化、増強、刺激）させ、又は減少（抑制、阻害、低下）させることを意味する。本発明の化合物は、「対応する細胞の結合性タンパク質」（この語は、ここにおいて用いるとき、ｐ５６ｌｃｋへのその結合がＳＨ２ドメインによって媒介されているものである如何なる細胞の結合性タンパク質をもいう。）へのｐ５６ｌｃｋのＳＨドメインの結合を調節するということができる。そのような対応する細胞の結合性タンパク質には、例えば、ＣＤ３鎖、ＺＡＰ−７０、ｐ６２、Ｌａｄ、ＣＤ４５、Ｓａｍ６８又はその他が含まれる。
【００３５】
多くのタンパク質チロシンキナーゼは、遺伝子の活性化及び／又は調節、従って細胞の増殖を含む、細胞事象の制御においてある役割を演じている。ｐ５６ｌｃｋは、癌原性遺伝子（ｐｒｏｔｏ−ｏｎｃｏｇｅｎｅ）であり、これは、望ましくない細胞増殖が関与する多くの病理学的状態との関連がいわれてきた。例えば、構成的に活性なｐ５６ｌｃｋの過剰発現が、マウス及びヒトのリンパ腫において観察されており、細胞タンパク質のｐ５６ｌｃｋ媒介性リン酸化がリンパ球増殖を刺激していることを示唆している。加えて、ｐ５６ｌｃｋの過剰発現及び活性化は、エプスタイン・バーウイルス及びＨｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ Ｓａｉｍｉｒｉによって誘導されるヒトのリンパ球形質転換において重要な役割を果たしているように見える。更には、野生型ｐ５６ｌｃｋ及び胸腺細胞におけるｐ５６ｌｃｋの構成的活性型を過剰発現するトランスジェニックマウスは、胸腺腫を発生し、このことは、野生型ｐ５６ｌｃｋの過剰発現でさえも、これらの条件下においては細胞を形質転換し得ることを示唆している。本発明の化合物、例えば、ｐ５６ｌｃｋ活性を阻害する化合物は、過増殖性細胞増殖を伴なう状態を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ（例えば、形質転換細胞）であれｉｎ ｖｉｖｏであれ、治療するために有用である。本発明の化合物によって治療できる又は予防できる状態としては、例えば、良性及び悪性の腫瘍を含む種々の腫瘍、種々の過形成その他が挙げられる。本発明の化合物は、そのような状態に伴なう望ましくない過増殖性の細胞増殖の阻害及び／又は逆転を達成することができる。
【００３６】
ここに使用するときは、語「過増殖性の細胞増殖」は、過剰な細胞増殖をいう。過剰な細胞増殖は、一般的な集団における同じタイプの細胞で起こるもの、及び／又は、初期に患者から得られた同じタイプの細胞に対比したものである。「過増殖性の細胞疾患」は、多細胞生物における１つ又はより多くの細胞の部分集団の過剰な細胞増殖が起こって、その多細胞生物に害（例えば、不快、又は推定寿命の短縮）を及ぼす場合の疾患をいう。過剰の細胞増殖は、一般の集団を参照することにより及び／又は特定の患者（例えば、該患者の生涯のより早期の時点）を参照することにより、決定することができる。過増殖性の細胞疾患は、種々のタイプの動物及びヒトに起こり得、冒された細胞に依存して種々の物理的徴候を呈する。過増殖性の細胞疾患としては、例えば、癌、血管増殖性疾患、線維症性の疾患、及び自己免疫疾患が挙げられる。
【００３７】
本発明の化合物の活性及びその他の性質（及び、当該分野で認められている比較化合物の活性に対するそれらの比較）は、如何なる種々の慣用手順によっても測定することができる。
【００３８】
それらの化合物の生物学的及び／又は化学的性質を測定するために、種々のｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイが使用でき、当該分野において慣用のものである。例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合研究は、それらの化合物の、例えばｐ５６ｌｃｋＳＨ２ドメインへの結合の親和性及び特異性を決定することができる。実施例４は、トリチウム化した化合物及び精製した組換えｐ５６ｌｃｋＳＨ２ドメインを用いてＫＤ値及びＩＣ５０値を決定する方法を説明している。類似のアッセイが、ｉｎ ｖｉｔｒｏで特定の部位、例えばｐ５６ｌｃｋＳＨ２ドメインに選択的に化合物が結合するが、しかし他の部位例えば、Ｈｃｋ、Ｆｙｎ、Ｓｒｃ、Ｓｈｃ又はＺＡＰ−７０のＳＨ２ドメインにはそうでないことを示すことができる。実施例５は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ免疫共沈（ＩＰ）キナーゼアッセイを説明している。やはり、類似のアッセイが、それらの化合物の結合の特異性を示すことができる。実施例６は、該結合の特異性を決定するためのアッセイを説明している。
【００３９】
他の慣用のｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイが、チロシンタンパク質キナーゼ例えばｐ５６ｌｃｋに関連した生物学的活性に対するそれらの化合物の効果（例えば、阻害又は増強）を測定することができる。免疫応答に関与するｐ５６ｌｃｋ活性としては、例えば、ある種の分子、例えばＣＤ３鎖等に存するＩＴＡＭコンセンサス配列における例えばチロシンのリン酸化；例えば対応する細胞の結合性タンパク質との免疫学的シナプス形成；その他が挙げられる。実施例１は、Ｔ細胞活性化に相関する活性である、ジャーカット細胞活性化依存性リン酸化のためのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを説明している。化合物Ｉ’は、リン酸化を刺激すること、並びに化合物ＩＩ’及びＩＩＩ’は阻害的であることが示されている。それらの効果は、投与量依存性であることが示されている。実施例２は、化合物が細胞毒性又は細胞***抑制性を有するか否かを示すものである、細胞生存性のためのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを説明している。化合物ＩＩＩ’は、ジャーカット細胞の増殖の可逆的阻害を見せることが示されている。実施例３は、Ｔ細胞活性化と相関する活性である、ＩＬ−２産生のためのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを説明している。化合物ＩＩＩ’は、ＯＫＴ−３処理ジャーカット細胞におけるＩＬ−２産生を阻害することが示されている。実施例７は、混合リンパ球培養アッセイを説明している。
【００４０】
これらの化合物の免疫調節特性を実証するために種々のｉｎ ｖｉｖｏアッセイが、使用できる。そのようなｉｎ ｖｉｖｏアッセイ及び、これらの化合物で治療することのできる疾患状態の動物モデルは、当業者に周知である。例えば、慢性間接リウマチの動物モデルが、実施例８に説明されている。
【００４１】
細胞の増殖及び細胞の形質転換に対する化合物（例えば、ホスホチロシンキナーゼ阻害剤）の効果を測定するためのアッセイは、慣用のものである。種々の典型的なアッセイが、例えば、以下に記載されている。Ｋｅｌｌｏｆｆ， Ｇ．Ｊ．， ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ Ｐｒｅｖ．， １９９６． ５（８）， ｐ． ６５７−６６； Ｗａｋｅｌｉｎｇ， Ａ．Ｅ．， ｅｔ ａｌ．， Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ Ｔｒｅａｔ， １９９６， ３８（１）， ６７−７３； Ｙａｎｏ， Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ， ２０００， ６（３）， ｐ． ９５７−６５； Ｒｅｅｄｙ， Ｋ．Ｂ．， ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ， １９９２， ５２（１３）， ｐ． ３６３６−４１； Ｐｅｔｅｒｓｏｎ， Ｇ． ａｎｄ Ｓ． Ｂａｒｎｅｓ， Ｐｒｏｓｔａｔｅ， １９９３； ２２（４）， ｐ． ３３５−４５； Ｓｃｈｏｌａｒ， Ｅ．Ｍ． ａｎｄ Ｍ．Ｌ． Ｔｏｅｗｓ， Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ， １９９４， ８７（２）； １５９−６２； Ｓｐｉｎｏｚｚｉ， Ｆ．， ｅｔ ａｌ．， Ｌｅｕｋ Ｒｅｓ， １９９４， １８（６）， ｐ． ４３１−９； Ｋｏｎｄａｐａｋａ， Ｂ．Ｓ． ａｎｄ Ｋ．Ｂ． Ｒｅｄｄｙ， Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ， １９９６， １１７（１）， ｐ． ５３−８； Ｍｏａｓｓｅｒ， Ｍ．Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ， １９９９， ５９（２４）， ｐ． ６１４５−５２； Ｌｉ， Ｙ．， Ｍ． Ｂｈｕｉｖａｎ ＆ Ｆ．Ｈ． Ｓａｒｋａｒ， Ｉｎｔ Ｊ Ｏｎｃｏｌ， １９９９， １５（３）， ｐ． ５２５−３３； Ｂａｇｕｌｅｙ， Ｂ．Ｃ．， ｅｔ ａｌ． Ｅｕｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ， １９９８， ３４（７）， ｐ． １０８６−９０； 及び Ｂｈａｔｉａ， Ｒ．， Ｈ．Ａ． Ｍｕｎｔｈｅ， ａｎｄ Ｃ．Ｍ． Ｖｅｒｆａｉｌｌｉｅ， Ｌｅｕｋｅｍｉａ， １９９８， １２（１１）， ｐ． １７０８−１７．
【００４２】
ここに記述されたアッセイの変法並びに他の慣用のアッセイが、当業者に周知である。そのようなアッセイは、勿論、慣用の手順を用いたハイスループット形式に適合している。
【００４３】
更には、コンピュータ利用の合理的薬物設計の慣用的方法が、例えばＨｃｋ、Ｆｙｎ、Ｓｒｃ、ＳｈｃやＺＡＰ−７０のＳＨ２ドメインではなく例えばｐ５６ｌｃｋのＳＨドメインへの結合特異性に重要なタンパク質領域に、本発明の化合物が適切に「フィット」するか、そしてこれに相補的であるか否か、に関して指標を提供することができる。特に、そのような方法は、ある化合物がｐ５６ｌｃｋのｐＹ＋３結合部位に相補的であるか否かを示すことができる。ここに用いるものとしての「特異的結合」又は「結合の特異性」の語は、例えば、他のタンパク質部分（例えば、他のタンパク質キナーゼのＳＨ２ドメイン）より高い親和性例えばより高い選択性で、本発明の化合物が、特定のＳＨ２ドメイン（例えば、ｐ５６ｌｃｋのＳＨ２ドメイン）と相互作用する、又はこれとの物理的な連携を形成することを意味する。更には、化合物の性質、例えば、溶解性、化学的安定性、及び毒性を付与することの知られた化学的基の不存在等を、特定の化学的置換基の既知の性質に基づいて分析することができ、これらのことは、当業者に周知である。Ｏｐｅｒａ， Ｊ． Ｃｏｍｐｕｔ．−Ａｉｄｅｄ Ｍｏｌ． Ｄｅｓ．， ２０００． １４：ｐ．２５１−２６４を参照のこと。
【００４４】
本発明の化合物は、動物、例えば、マウス、ラット、家兎等のような哺乳類、ペット（例えば、哺乳類、鳥類、爬虫類、魚類、両生類）、家（例えば、農場）畜、及び霊長類、特にヒトにおいて、例えばｐ５６ｌｃｋのＳＨ２ドメインへの結合に、及び例えばｐ５６ｌｃｋの活性を調節するのに効果的である。本発明の化合物は、免疫調節活性及び／又は抗腫瘍活性を示し、チロシンキナーゼ（例えば、ｐ５６ｌｃｋ）の異常な調節又は活性及び／又は細胞内信号応答が関与する疾患の治療に有効である。例えば、免疫応答を賦活する化合物（免疫賦活薬）は、自然に生じた免疫抑制又は種々の状態及び疾患に由来する免疫抑制を治療し又は予防するのに有用である。免疫応答を抑制する化合物（免疫抑制薬）は、例えば、免疫系による身体自体に対する抗体の産生によって引き起こされる炎症性の現象及び組織破壊によって特徴付けられる自己免疫疾患を治療若しくは予防するのに、又は組織若しくは臓器の移植に際して拒絶を抑制するのに、有用である。細胞増殖を阻害する化合物は、細胞の過増殖によって特徴付けられる状態を治療するために、例えば、抗腫瘍薬として有用である。本発明の化合物はまた、例えば細胞の信号発生を研究するための道具としても有用である。
【００４５】
好ましい一具体例によれば、本発明は、例えば、化学療法、放射線治療、放射能宿酔、又はＨＩＶ／ＡＩＤｓ；原発性のＢ細胞減少（例えば、Ｂｒｕｔｏｎ先天性ａ−γ−グロブリン血症又は一般の種々の免疫不全）又は原発性のＴ細胞減少（例えば、ディジョージ（ＤｉＧｅｏｒｇｅ）症候群及びネゼロフ（Ｎｅｚｅｌｏｆ）症候群、毛細管拡張性失調症、ウィスコット・アルドリック（Ｗｉｓｋｏｔｔ−Ａｌｄｒｉｃｈ）症候群；重症複合型免疫不全症（ＳＣＩＤ）等の結果もたらされた免疫系の抑制に苦しむ患者を、本発明の免疫賦活薬で治療する方法を含む。これらの免疫賦活薬はまた、特に免疫不全状態を有する患者のためのワクチン（例えば、抗細菌、抗真菌、抗ウイルス又は抗原虫感染症）；又は抗腫瘍ワクチンのためにも使用することができる。
【００４６】
好ましい別の一具体例においては、本発明は、慢性間接リウマチ、糸球体腎炎、橋本甲状腺炎、多発性硬化症、Ｔ細胞白血病、全身性エリテマトーデス、重症筋無力症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少性紫斑病、１型糖尿病、クローン病、グレーヴス病、セリアック病その他等のような、自己免疫疾患に罹っている患者を、本発明の免疫抑制薬で治療する方法を含む。本発明の免疫抑制薬はまた、組織又は臓器の移植拒絶反応、例えば、超急性又は慢性の移植片対宿主疾患、同種移植又は異種移植拒絶反応等を治療するためにも有用である。
【００４７】
既に述べたように、本発明の化合物はまた、細胞の過剰増殖を阻害する。例えば、それらは抗腫瘍活性を示すことができる。その結果、本発明の化合物は、例えば、Ｔ細胞及びＢ細胞の関与する癌等の種々の状態の治療に有用である。本発明の化合物で治療することのできる癌のタイプのうちには、例えば、白血病、リンパ腫、卵巣癌及び乳癌がある。
【００４８】
本発明の化合物は、例えば、腫瘍特異的抗原に特異的な抗体等のような、特定の腫瘍を標的とする薬剤に取り付けることができる。この仕方により、本発明の化合物は、標的細胞へと輸送されてその中で作用することができる。これらの化合物は、更には、慣用の細胞毒物（例えば、毒素又は放射能）に取り付けることができる。本発明の化合物がその標的、例えばｐ５６ｌｃｋに結合したとき、それはその酵素活性を阻害するのみならず、毒素という手段によって、該標的を及び／又は該標的の存する細胞を破壊する。
【００４９】
これら好ましい面は、本発明の化合物及び薬剤学的に許容し得る担体及び所望により他の、以下に論じる活性な薬剤を含んでなる薬剤組成物を含む。ｉｎ ｖｉｔｒｏであれｉｎ ｖｉｖｏ（動物例えば、動物モデル又は哺乳類又はヒトにおいて）であれ慣用のアッセイ又はここに記載のアッセイによって測定されるものとしてのｐ５６ｌｃｋキナーゼを阻害する又は賦活する方法；免疫応答を調節、例えば免疫反応を増強又は阻害する方法；例えば自己免疫疾患、腫瘍等の疾患状態を治療する方法；動物、例えば、ヒトにおいてｐ５６ｌｃｋキナーゼ活性によって調節される、ここに述べた疾患状態を含む疾患状態を治療する方法、を含む。
【００５０】
本発明はまた、本発明の全ての化合物の薬剤学的に許容し得る塩及びプロドラッグ等のような、これらの化合物のここに開示される有用な形態にも関する。薬剤学的に許容し得る塩としては、主化合物を、塩基として機能させて、無機又は有機酸と反応させて塩、例えば、塩酸、硫酸、リン酸、メタン硫酸、カンファースルホン酸、シュウ酸、マレイン酸、コハク酸及びクエン酸の塩を形成させることによって得られるものが挙げられる。薬剤学的に許容し得る塩としてはまた、主化合物が酸として機能して、適当な塩基と反応して塩、例えば、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アンモニウム及び塩素塩を形成したものが挙げられる。当業者は、請求された化合物の酸付加塩が、既知の多くの方法の如何なるものによっても、それらの化合物を適当な無機又は有機の酸と反応させることによって製造できるということを、更に認識するであろう。代わりに、アルカリ金属塩又はアルカリ土類金属塩が、既知の種々の方法によって、それらの化合物を適当な塩基と反応させることにより製造される。
【００５１】
以下は、無機酸又は有機酸との反応によって得ることのできる酸塩の更なる例である：酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、クエン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、硫酸水素塩、ブタン酸塩、カンファー酸、ジグルコン酸、シクロペンタンプロピオン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、グルコヘプタン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミサルフェート、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、フマル酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、エタンスルホン酸、ニコチン酸、２−ナフタレンスルホン酸、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、ペクチニン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、チオ桂皮酸塩、トシル酸塩、メシル酸塩及びウンデカン酸塩。
【００５２】
好ましくは、形成される塩は、哺乳類に投与するのに薬剤学的に許容し得るものである。しかしながら、それらの化合物の薬剤学的に許容し得ない塩は、例えば、それらの化合物を塩として単離し次いで該塩をアルカリ性試薬で処理して化合物の遊離塩基へと戻するための中間体として適している。遊離塩基は、次いで、望ましい場合には、薬剤学的に許容し得る酸付加塩へと変換することができる。
【００５３】
本発明の化合物は、単独でもまたは調合物の活性成分としても投与することができる。従って、本発明はまた、式Ｉ、ＩＩ’、ＩＩＩ’の化合物の、例えば１腫又は２種以上の薬剤学的に許容し得る担体を含んだ、薬剤学的組成物をも含む。
【００５４】
本発明の化合物を投与するための種々の処方物を調製するための手順を記載した非常に多数の標準の参考文献が入手可能である。可能性ある処方物及び調合物の例には、例えば、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ， Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ （現版）； Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ： Ｔａｂｌｅｔｓ （Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｌａｃｈｍａｎ ａｎｄ Ｓｃｈｗａｒｚ編）現版、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．発行、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ （Ａｒｔｈｕｒ Ｉｓｏｌ編）、１５５３−１５９３ （現班）が挙げられる。
【００５５】
ｐ５６ｌｃｋキナーゼの阻害又は賦活に対するそれらの高い選択性に照らして、本発明の化合物は、ｐ５６ｌｃｋキナーゼの阻害又は賦活を必要とする誰にでも投与することができる。投与は、例えば、経口、経鼻、非経口（皮下、静脈内、筋肉内、胸骨内、及び注入による）、吸入、経直腸、経膣、局所、及び眼投与等、患者の必要に応じて行うことができる。注射は、例えば、筋肉内、腹腔内、静脈内その他であってよい。
【００５６】
本発明の化合物の投与には、錠剤、ゲルカプセル、カプセル、カプレット、顆粒、トローチ剤及び原粉末等の、固体の形態を含む種々の固形の経口投与形態を用いることができる。本発明の化合物は、単独でもまた種々の薬剤学的に許容し得る担体、希釈剤（例えば、ショ糖、マンニトール、乳糖、デンプン）及び当該分野にて知られている補助剤、例えば分散剤、可溶化剤、緩衝剤、結合剤、崩壊剤、保存剤、着色剤、矯味剤、滑沢剤その他との組み合わせで投与することができる。徐放性のカプセル、錠剤及びゲルもまた、本発明の化合物の投与には有利である。
【００５７】
水性及び非水性の溶液、乳濁液、懸濁液、シロップ及びエリキシル剤等のような、種々の液体の経口投与形態もまた、本発明の化合物を投与するために使用できる。そのような投与形態はまた、水等のような当該分野でおいて知られている適当な不活性の希釈剤、及び保存剤、界面活性剤、甘味剤、矯味剤等のような当該分野で知られている適当な補助剤、並びに、本発明の化合物を乳化及び／又は懸濁するための薬剤を含むことができる。本発明の化合物は、等張滅菌溶液の形で、例えば静脈内に、注射してよい。その他の調製物もまた可能である。
【００５８】
本発明の化合物の直腸投与坐剤は、該化合物を、カカオ脂、サリチレート及びポリエチレングリコール等のような適当な賦形剤と共に混合することによって調製することができる。膣投与のための坐剤の形成は、活性成分に加えて当該分野で知られている適当な担体を含む、ペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、泡、又はスプレー処方の形をとることができる。
【００５９】
局所投与のためには、薬剤組成物は、皮膚、眼、耳又は鼻への投与に適した、クリーム、軟膏、リニメント、ローション、乳濁液、懸濁液、ゲル、溶液、ペースト、パウダー、スプレー及びドロップの形をとることができる。局所投与は、経皮パッチのような手段による経皮投与をも含んでよい。
【００６０】
吸入により投与するのに適したエアロゾル処方もまた作ることができる。例えば、気道の疾患の治療のために、本発明の化合物を、粉末の形（例えば、微紛とした）又は噴霧溶液若しくは懸濁液の形で吸入により投与することができる。エアロゾル処方は、加圧された許容し得る噴射剤中に入れておくことができる。
【００６１】
これらの化合物は、単独の活性薬として、又は、チロシンキナーゼ、信号伝達プロセス、細胞増殖及び／又は免疫応答を阻害し又は刺激する他の薬物等のような、他の薬物と組み合わせて投与することができる。阻害薬としては、例えば、サイクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、レフルノミド、ブテナミド、コルチコステロイド、アトメリックアシッド（ａｔｏｍｅｒｉｃ ａｃｉｄ）、ジペプチド誘導体、チルホスチン（ｔｙｒｐｈｏｓｔｉｎ）、ドキソルビシンその他が挙げられる。そのような組み合わせにおいては、各活性成分は、その通常の投与量範囲に従って、又はその通常の投与量範囲を下回る投与量で、投与することができる。
【００６２】
本発明の化合物の投与量は、その他の考慮事項のなかでも、治療すべき特定の症候群、症状の重篤度、患者の年齢、性及び身体状態、投与経路、投与間隔の頻度、用いる特定の化合物、効果、毒性学的プロフィール、該化合物の薬物動力学的プロフィール、及び、何らかの有害な副作用の存在を含む、種々の要因に依存する。
【００６３】
「有効投与量」又は「治療的に有効な投与量」は、ここでは、癌の治療に関連して、以下のうち１つ又は２つ以上の結果をもたらすに十分な量を意味する：癌の寸法の減少；癌の転移の阻害；癌の増殖の阻害、好ましくは癌増殖の停止；癌による不快感の軽減；及び癌に冒された患者の寿命の延長。
【００６４】
「治療的に有効な量」は、癌以外の過増殖性の細胞疾患に関連して、以下のうち１つ又は２つ以上の結果をもたらすに十分な量を意味する：疾患を引き起こしている細胞の増殖の阻害、好ましくは細胞増殖の停止；疾患による不快感の軽減、及び該疾患に冒されている患者の寿命の延長。
【００６５】
「治療的に有効な量」は、自己免疫疾患の治療に関連して、以下のうち１つ又は２つ以上の結果をもたらすに十分な量を意味する：該疾患の症状の阻害又は軽減；該疾患に関与する細胞の進行する変質の阻害；該疾患による不快感の軽減；及び該疾患に冒されている患者の寿命の延長。
【００６６】
「治療的に有効な量」は、組織又は臓器の移植を受ける患者の治療に関連して、以下のうち１つ又は２つ以上の結果をもたらすに十分な量を意味する：移植された材料の拒絶の阻害又は防止；移植片の拒絶に起因する不快感の軽減；及び移植片を受けた患者の寿命の延長。
【００６７】
「治療的に有効な量」は、免疫抑制患者の治療に関連して、以下のうち１つ又は２つ以上の結果をもたらすに十分な量を意味する：Ｔ細胞の数又は活性化されたＴ細胞の数の増加；患者の免疫抑制された状態の減少；該疾患による不快感の軽減、及び該疾患に冒されている患者の寿命の延長。
【００６８】
本発明の化合物は、ｐ５６ｌｃｋキナーゼ阻害薬又は賦活薬、又は上述したもののような他の類似の薬物について一般的である投与量のレベル及び仕方で、投与することができる。例えば、サイクロスポリンは、（移植には）約７．９５±２．８１ｍｇ／ｋｇ／日（ＰＤＲ（Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）を参照）；ＦＫ５０６は、（移植には）約０．１５〜０．３０ｍｇ／ｋｇ／日（ＰＤＲを参照）で投与され；ラパマイシンは、（移植には）約２〜６ｍｇ／日、例えば、８１ｋｇの成人については約０．０２４ｍｇ／ｋｇ／日で投与される（Ｔｈｏｍａｓ Ａ． Ｓｔａｒｇｙ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ウェブサイトを参照）。米国特許第５，６８８，８２４、５，９１４，３４３、５，２１７，９９９、６，１３３，３０１及びここに引用した刊行物をも参照のこと。
【００６９】
例えば、本発明の化合物Ｉ及びＩＩＩは、１回又は複数回投与量で、例えば、患者体重あたり１日１μｇ／ｋｇないし５００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約１００μｇ／ｋｇ／日ないし２５ｍｇ／ｋｇ／日の投与量レベルで投与することができる。化合物ＩＩについては、所望の免疫賦活効果又は免疫抑制効果を生ずるよう、投与量は調節される。低い方の投与量（免疫調節）は、約１μｇ／ｋｇ／日と７５０μｇ／ｋｇ／日の間、好ましくは約１０μｇ／ｋｇ／日と５００ｍｇ／ｋｇ／日の間であることができる。高い方の投与量（免疫抑制）は、約１ｍｇ／ｋｇ／日と７５０ｍｇ／ｋｇ／日の間、好ましくは約１０ｍｇ／ｋｇ／日と４５０ｍｇ／ｋｇ／日の間であることができる。
【００７０】
本発明の手順を実施するに際して、特定の緩衝液、培地、試薬、細胞、培養条件その他への言及は、勿論、限定的であることを意図したものでなく、当該議論が提示された特定の文脈において利益がある又は価値があると当業者が認識する全ての関連する材料を含むように読まれなければならない、ということを理解しなければならない。例えば、１つの緩衝系又は培養培地を他のものに代えても、もしも同一でないにせよ類似の結果をしばしば達成できる。当業者は、ここに開示された方法及び手順を用いて、過度な実験を行うことなしに、彼等の目的に最も役立つようにそのような置き換えを行うことができるような、そのような系及び方法論についての十分な知識を有するであろう。
【００７１】
上記の及び以下の実施例において、全ての温度は摂氏の度で補正せずに示しており、特記しない限り、全ての部及びパーセントは重量による。
【００７２】
〔実施例〕
実施例１ − ジャーカット細胞活性化−依存性のリン酸化
モノクローナル抗体、ＯＫＴ−３によって活性化されたジャーカット細胞におけるリン酸化は、Ｔ細胞活性化と相関する。
【００７３】
Ａ．ＯＫＴ−３で活性化されたジャーカット細胞に対する効果につき、化合物を試験する。ＯＫＴ−３は、ＣＤ３−ε鎖に対するモノクローナル抗体である。ＯＫＴ−３抗体による３７℃５分間のジャーカット細胞の処理は、ジャーカット細胞を活性化させて、数種の細胞タンパク質のチロシンリン酸化を誘導する。キナーゼ活性を欠いたｐ５６ｌｃｋを発現しているＪＣａＭ１．６ジャーカット細胞においては、細胞タンパク質のＯＫＴ−３媒介性のリン酸化は起こらず、このことは、ｐ５６ｌｃｋがこの過程に必須の役割を演じていることを示している。本発明の化合物又は標準として役立つことのできる既知の化合物が、ジャーカット細胞においてＯＫＴ−３によって刺激された細胞チロシンリン酸化に影響を与えるか否か、を決定するために、試験を実施する。例えば、化合物ＩＩ’、及びＩＩＩ’は、１００μＭで阻害活性を、そして化合物Ｉ’は刺激活性を現すことが示されている。
【００７４】
アッセイは次のようにして行う：１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を補充したＲＰＭＩ１６４０中のジャーカット細胞（１×１０６個）を、ＯＫＴ−３抗体（０．２μｇ）及び各化合物（１００μＭ）で５分間３７℃で処理する。この培養時間の後、直ちに培養物を氷上に置き、冷ＰＢＳで３回洗浄し、そして２０μｌのＳＤＳサンプル緩衝液で溶解する。サンプルを手短に超音波処理し、５分間煮沸しそしてＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）（１２％ゲル）に適用する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ウエスタンブロット分析のために、タンパク質をイモビロン（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ）Ｐ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上にブロットする。５％粉ミルク／ＴＢＳＴ（トリス緩衝生理食塩水、１％ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）で膜をブロックする。洗浄後、ブロットをモノクローナル抗ホスホチロシン抗体で、ＴＢＳＴ中１時間インキュベートし、続いて、西洋ワサビパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）−接合ヤギ抗マウスＩｇＧと共に１時間インキュベートする。増強された化学ルミネッセンス（ＥＣＬ，Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてブロットを現像する。
【００７５】
Ｂ．投与量応答実験を行う。例えば、化合物Ｉ’は、投与量依存的にジャーカット細胞タンパク質のチロシンリン酸化を有意に刺激することが示されている。化合物ＩＩ’は、低い投与量（０．１及び１μＭ）で細胞タンパク質のチロシンリン酸化を刺激するが、高い投与量（１００μＭ）ではリン酸化を阻害する。化合物ＩＩＩ’は、細胞タンパク質のチロシンリン酸化を完全に阻害する。
【００７６】
このアッセイは、次のようにして行う：抗ホスホチロシン抗体を用いたウエスタンブロット分析を実施する。化合物（例えば、本発明の化合物Ｉ’、ＩＩ’及びＩＩＩ’）を、０．１、１、１０及び１００μＭの濃度で加える。細胞を上記のようにして培養する。化合物Ｉ’は、チロシンリン酸化を投与量依存的に誘導することが示され、一方、化合物ＩＩＩ’は、試験した最低濃度（０．１μＭ）でもチロシンリン酸化を阻害する。化合物ＩＩ’は、２相性の応答を与え、低投与量（０．１及び１μＭ）ではチロシンリン酸化を刺激する一方、高投与量（１００μＭ）ではリン酸化を阻害する。
【００７７】
実施例２ − ジャーカット細胞の生存性に対する影響
細胞毒性又は細胞***抑制性があるか否かを決定するために、化合物を試験することができる。チロシンリン酸化に対するＯＫＴ−３媒介性の刺激を阻害する化合物がジャーカット細胞に対して細胞毒性を有するか否かを試験するために、ジャーカット細胞の増殖に対するその影響を試験する。例えば、化合物ＩＩＩ’は、１０μＭでジャーカット細胞の増殖を抑制して幾らかの細胞***抑制効果を現すことが示されているが、細胞毒性は観察されない。ジャーカット細胞は、化合物ＩＩＩ’の」添加の２４時間後には、正常な増殖率に戻っており、このことは、増殖に対する化合物ＩＩＩ’の効果は、可逆的であることを示している。
【００７８】
実施例３ − ジャーカット細胞におけるＩＬ−２産生の阻害
インターロイキン２（ＩＬ−２）は、Ｔ細胞の自己分泌増殖因子であり、正常なＴ細胞において、その産生にはＴ細胞抗原受容体及びコ・レセプター（ｃｏ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ）により発生される活性化信号が必要である。ＩＬ−２の産生は、Ｔ細胞活性化信号発生の証しの一つであり、抗原特異的Ｔ細胞クローンのクローン拡張をもたらす。ジャーカット細胞においては、ＯＫＴ−３による細胞の処理は、ＩＬ−２の産生をもたらす。細胞タンパク質のＯＫＴ−３誘導性チロシンリン酸化を阻害する化合物が、ＩＬ−２産生をも阻害するか否かを試験するために、ジャーカット細胞を、該化合物の存在下又は不存在下に、ＯＫＴ−３で処理する。例えば、ＯＫＴ−３処理の時に、細胞を１０μＭの化合物ＩＩＩ’で処理したときは約５０％のＩＬ−２阻害が観察される。低い濃度では、化合物ＩＩＩ’は観察し得る効果を有しない。ＯＫＴ−３誘導性のチロシンリン酸化の完全な阻害とは異なって、化合物ＩＩＩ’によるＩＬ−２産生阻害は、部分的である。
【００７９】
アッセイを次のようにして行う： ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳ中で、化合物（例えば、化合物ＩＩＩ’）（０．１、１及び１０μＭ）の存在下又は不存在下に、ジャーカット細胞（１×１０６個）をＯＫＴ−３抗体（０．２μｇ）で２４時間処理する。インキュベーション期間の終りに、培養培地を回収し、ヒトＩＬ−２についてＲＩＡでアッセイする。ＯＫＴ−３のみ及びＰＭＡ＋イオノマイシンで処理した細胞を陽性対象とする。無処理の細胞を陰性対照とする。ＩＬ−２産生は、無処理の細胞では検出されない。１０μＭの化合物ＩＩＩ’で処理した細胞は、ＩＬ−２産生を４４％阻害することが示されている。標準偏差は０．２３ｐｇ／ｍｌである。
【００８０】
実施例４ − ［ ３ Ｈ］化合物を用いたＳＨ２ドメインへの結合
細菌中でＧＳＴ−融合タンパク質として発現させた、精製した組換えｐ５６ｌｃｋ−ＳＨ２ドメインを、抗ＧＳＴアガロースビーズ又はグルタチオン・アガロースビーズの何れにも結合させる。これらのビーズは、ＧＳＴ−ｐ５６ｌｃｋ−ＳＨ２タンパク質に結合し、ＳＨ２ドメインに結合した［３Ｈ］試験化合物の、未結合の化合物からの分離を容易にする。代わりとして、デキストラン−被覆活性炭溶液が、結合した化合物を未結合の化合物から分離するのに使用される。
【００８１】
・ＫＤの決定： 化合物の結合親和性は、標準のスキャッチャード（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ）解析によって決定され、そこでは、結合アッセイは、固定した量の［３Ｈ］化合物と増大する量の非放射性化合物との存在下に行われる。化合物のＫＤは、リガンドプログラム（Ｌｉｇａｎｄ Ｐｒｏｇｒａｍ）（Ｍｕｎｓｏｎ ＆ Ｒｏｄｂａｒｄ １９８０）， Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １０７， ２２０−２３９を用いて計算する。ｃｏ−Ｐは、例えばＳｕｎ ｅｔ ａｌ．， １９８７， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍ． １４８， ６０３−６０８から明らかである。
【００８２】
・ＩＣ５０の決定： ＫＤの決定に加えて、ＣＤ３のζＩＴＡＭ２のＮ末端ｐＹへのｐ５６ｌｃｋ−ＳＨ２ドメインの結合を阻害する化合物のＩＣ５０値を測定する。ＣＤ３ζ鎖の２番目のＩＴＡＭのＮ末端ｐＹに対し、ｐ５６ｌｃｋのＳＨ２ドメインは、最も高い結合親和性を有している（０．１μＭ）。この領域に対応する合成ペプチドが作られ、アガロースビーズに接合される（ζ−ＮｐＹ−ＩＴＡＭ２−アガロース）。ｐ５６ｌｃｋは、ＳＨ２ドメインを介してζ−ＮｐＹ−ＩＴＡＭ２−アガロースに結合し、沈殿させることができる。組換えｐ５６ｌｃｋＧＳＴ−ＳＨ２タンパク質を用いて、ＲＩＰＡ緩衝液中で種々の濃度（０．０１〜１００μＭ）のこれら化合物の存在下又は不存在下に、ζ−ＮｐＹ−ＩＴＡＭ２−アガロース使用の結合アッセイを行う。室温にて２時間の結合反応の後、ビーズを回収してＲＩＰＡ緩衝液で３回洗浄する。抗ＧＳＴ抗体及びＨＲＰ−接合二次抗体及びＨＲＰ酵素基質と共にビーズをインキュベートした後、ζ−ＮｐＹ−ＩＴＡＭ２−アガロースに結合したＧＳＴ−ＳＨ２の相対量を、比色アッセイで測定する。化合物の不存在下におけるζ−ＮｐＹ−ＩＴＡＭ２−アガロースへのＧＳＴ−ＳＨ２の結合から読み取られたＯＤは、陽性対照として働き、１００％結合レベルを表す。バックグラウンド（ＧＳＴ−ＳＨ２無しでのζ−ＮｐＹ−ＩＴＡＭ２−アガロース）が、各値から減ぜられる。アッセイは３本行い、３つの独立したアッセイからの平均を、各化合物についてのＩＣ５０値の計算に用いる。
【００８３】
実施例５− 共免疫沈降実験
ｐ５６ｌｃｋＳＨ２ドメインｐＹ＋３ポケットへの化合物の結合は、細胞の標的タンパク質のホスホチロシン残基との、ＳＨ２媒介性のｐ５６ｌｃｋの相互作用に影響を及ぼす。例えば、阻害化合物による細胞処理は、ＣＤ３ζ及びＺＡＰ−７０とのｐ５６ｌｃｋの連携を阻害するのに対し、刺激化合物による処理の後は、連携の増加が起こる。これらの分子的相互作用の存在は、化合物の存在下又は不存在下における活性化したジャーカット細胞中の共免疫沈降（ｃｏ−ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）アッセイによって評価する。このアッセイを（本明細書の他の箇所に記載したｐ５６ｌｃｋキナーゼアッセイと組み合わせて）用いることで、分子的相互作用の遮断に関して化合物のＩＣ５０を、そしてキナーゼ活性に関して化合物のＥＤ５０を、評価することができる。これらの値は、一般に、化合物の効果がｐ５６ｌｃｋのＳＨ２ドメインへの結合によって媒介されているのならば、ＳＨ２ドメインに結合する化合物のＫＤの近くにある。
【００８４】
試験すべき化合物（０．０１〜１００μｍ）の存在下又は不存在下に、ＯＫＴ−３抗体（１μｇ／５×１０６細胞）を用いてジャーカット細胞（５×１０６ないし１×１０７／ｍｌ；１ｍｌ／条件）を活性化させる。３７℃での１０分の活性化に続いて、細胞を回収し、ＲＩＰＡ又はＮＰ−４０溶解緩衝液を用いて溶解させる。不溶性の物質を除去した後、ＣＤ３ζ又はＺＡＰ−７０に対する抗体１ないし２μｇで上清を処理する。プロテインＡ又はＧ接合アガロースビーズ（５０％スラリーの１０μｌ）を用いて、４℃で免疫複合体を沈殿させる。ビーズを回収し、溶解緩衝液で３回洗浄し、２分間煮沸し、ＳＤＳ ＰＡＧＥ（例えば、１２．５％）上で分離し、抗ｐ５６ｌｃｋ抗体を用いたウエスタンブロット分析のために、イモビロンＰ膜上にブロットする。化合物の存在下に活性化無しの又は活性化した細胞からのサンプルは、陰性及び陽性対照として働く。各サンプルから等しい量のタンパク質（ＣＤ３ζ又はＺＡＰ−７０）が沈殿していることを確認するために、沈殿抗体によるブロットの再プローブも行う。共免疫沈降するｐ５６ｌｃｋの存在が試験される。アッセイ中の化合物濃度を変更して、共免疫沈降するｐ５６ｌｃｋの相対量を測定することによって、半定量分析もまた行うことができる。定量は、ＥＩＡ（ＨＲＰ接合二次抗体＋色原体基質に続いて分光光度法によるアッセイを使用）、化学ルミネッセンス（ＨＲＰ接合二次抗体＋ＥＣＬに続いてイメージアナライザーを使用）又はリン画像解析（［１２５Ｉ］二次抗体を使用）を実施することによって、行われる。各化合物についてのＩＣ５０値が決定される。
【００８５】
実施例６ − 結合の特異性の実証
特異性の試験のために、配列の相同性その他の考慮事項に基づいて、２個のｐＹ結合部位を含むものであるＺＡＰ−７０を含む、５種の追加のＳＨ２ドメイン含有キナーゼを、コンピュータ的及び実験的に、選択する。これらのタンパク質は表１に掲げられている。
【００８６】
【表１】
ａ）ＺＡＰ−７０は、Ｎ及びＣ末端領域に、それぞれＺＡＰ−７０，Ｎ、ＺＡＰ−７０，Ｃと呼ばれる２個のホスホチロシン結合部位を含む。
ｂ）ＮＡ： ＰＤＢからは得られないが、その構造は著者によって得られた。
【００８８】
特異性は、表２に掲げたホスホペプチドとの表１のＳＨ２ドメインの差別的結合によって決定される。それらのＳＨ２ドメインは、ｐ５６ｌｃｋとの相同性、並びに３次元（３Ｄ）構造データが入手できることに基づいて選択する。ホスホペプチドは、それらのＳＨ２ドメイン特異性に基づいて選択する。ζ−ＩＴＡＭ−２−Ｃペプチド及びζ−ＩＴＡＭ−１ペプチドは、それぞれ、ｐ５６ｌｃｋ及びＺＡＰ−７０に特異的である。ｐ５６ｌｃｋ及びＳｈｃを含む全てのＳｒｃキナーゼは、ｐＹＥＥＩ配列を含むハムスターポリオーマミドルＴ抗原ペプチドに対して、類似の親和性を以って結合することが知られている。
【００８９】
【表２】
本化合物とホスホペプチドとの間の固相結合競合アッセイを用いる。ＳＨ２ドメインをＰＣＲ増幅し、ＧＳＴ融合タンパク質としてＥ． ｃｏｌｉ中に発現させる。ＧＳＴ融合タンパク質を、グルタチオンカラムにかけて精製する。トロンビンを用いてＳＨ２ドメインを切り離し、ゲルろ過カラムにかけて精製する。表２に掲げたペプチドを含んだ合成のホスホチロシンを、慣用の方法を用いて合成する。これらのペプチドを、Ｎ末端において、ＳＨ２ドッキング部位から離れたところで、Ｐｉｅｒｃｅ （Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， ＩＬ） から入手できるキットを用いてビオチン化する。９６ウェルのＥＩＡプレートを、精製ＳＨ２ドメイン（１μｇ／ウェル；約１００ ｎｍｏｌ）でコートする。種々の濃度（ｐｍｏｌ ないし μｍｏｌ）の化合物の存在下又は不存在下に、ビオチン化したペプチド（約２００ ｎｍｏｌ）を加える。次いで、ＳＨ２ドメインに結合したビオチン化ペプチドを、種々の方法、例えば、ＨＲＰ−ストレプトアビジン＋基質を用いた比色分析アッセイにより、ＦＩＴＣ標識ストレプトアビジンを用いた蛍光により、又は、［１２５Ｉ］標識ストレプトアビジンを用いてシンチレーションカウンターによって、測定する。化合物無しでのζ−ＩＴＡＭ２−ＣペプチドのＯＤ（又はｃｐｍ）の読みは、１００％結合に相当する。ＳＨ２のみのＯＤ（又はｃｐｍ）の読みは、ブランクに相当する。各化合物のＩＣ５０が決定される。代わりとしは、アッセイを、インキュベーション時間の後にＳＨ２ドメインを分離するためにグルタチオン−アガロースビーズを使用するのに適合させる。結合競合アッセイを用いることにより、各化合物のＫＤが、決定される。
【００９１】
実施例７ − 混合リンパ球培養アッセイ
生物学的応答を測定するのに用いられるもう一つの読み出しアッセイは、混合リンパ球培養アッセイであり、これにおいては、異なった組織適合抗原を有する異なった系統のマウスからのリンパ球が混合される。組織適合性抗原の相違のために、両系統のマウスからの休止Ｔ細胞が、芽球化を起こして増殖する。如何なるＴ細胞活性化プロセスでもそうであるように、ｐ５６ｌｃｋの活性化が必須である。従って、ｐ５６ｌｃｋ活性化の調節は、ＤＮＡへの［３Ｈ］−ＴｄＲ取り込みのレベルにおける下流調節として定量することができる。
【００９２】
異なった２つの異質遺伝子型系統のマウスのリンパ節又は脾臓のリンパ球を収穫する。各系統からの細胞（１×１０６個）を、２００μｌの培養培地を含んだ９６ウェルの培養プレート中で、化合物（０．１〜１００μＭ）の存在下又は不存在下に混合し、そして７２時間培養する。回収の６時間前に、０．５μＣｉの［３Ｈ］−ＴｄＲを各ウェルに加える。培養時間の最後に、セル・ハーベスター（ｃｅｌｌ ｈａｒｖｅｓｔｅｒ）を用いて細胞をガラス線維フィルター上に回収する。ＰＢＳで、次いでエタノールでフィルターを洗浄し、ＤＮＡ中に取り込まれた［３Ｈ］−ＴｄＲをシンチレーションカウンターを用いて測定する。実験は３本行う。化合物の不存在下に培養された細胞は、陽性対照として使われる。異質遺伝子型リンパ球の不存在下に培養されたマウスの各系統からの細胞は、陰性対照として使われる。化合物は、１２時間毎に添加される。タンパク質リン酸化とＩＬ−２産生とを抑制する化合物は、［３Ｈ］−ＴｄＲ取り込みに対して同様の効果を有している。
【００９３】
実施例８ − マウスにおける遅延型過敏症（ＤＴＨ）の免疫応答及び抗２型コラーゲン誘導慢性間接リウマチの ｉｎ ｖｉｖｏ での阻害
一つの実験モデルは、ＰＰＤに対するＤＴＨである。ＤＴＨ反応は、Ｔ細胞免疫応答に典型的なものの一つであり、従って、本化合物のｉｎ ｖｉｖｏでの効果を評価するために使用するのによく適している。完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）に入れたＢＣＧを用いてマウスを免疫感作する。最初の免疫感作の後、ツベルクリン皮膚試験を行う。ＢＣＧ免疫感作したマウスの両側の皮膚領域を、脱毛クリームで処理する。２箇所の脱毛部位にツベルクリンの皮内注射を行う。ＤＭＳＯに溶解させた化合物を、これらの部位の片方に１２時間毎に塗布する。他方の部位は、ＤＭＳＯのみで処理し、内部陽性対照として使用される。１週間後、ＤＴＨ反応の直径を、対照部位及び治療部位の双方につき測定する。１群に５匹のマウスが用いられる。ＤＴＨ皮膚試験において対照に対し５０％の減少に必要な有効投与量を決定するために、統計分析を行う。治療は、（気化させた２％イソフルランを使用して）麻酔した動物で行う。動物は、ＤＭＳＯが皮膚に完全に吸収されるまで麻酔下に維持する。各部位に塗布ＤＭＳＯの量は、最小限（約１０μｌ）に維持する。
【００９４】
ＤＴＨ反応に加えて、マウスにおけるコラーゲン誘発関節炎（ＣＩＡ）を用いて実験を行う。ＣＩＡは、ヒトにおける慢性間接リウマチ（ＲＡ）の実験モデルである。短期間のうちにマウスにＣＩＡを確実に誘発するのには市販のキットが入手できる。ＩＩ型コラーゲンに対するモノクローナル抗体カクテルを、マウスに、静脈注射し、抗体カクテルの注射２４ないし４８時間内にリウマチ性関節炎が発症し、２本の後肢の増悪する腫脹が、６日目には顕著となる。各動物のこれらの肢の一つを、ＤＭＳＯで溶解させた化合物で治療する。他の肢は、他方の肢はＤＳＭＯのみで治療し、内部陽性対照として使われる。肢の腫脹を測定する。生理食塩水注射しＤＭＳＯ治療した肢の厚みは、陰性対照として用いる。後肢をＤＭＳＯ溶液に（試験化合物の存在下又は不存在下に）、１２時間間隔で毎日２回１０秒間浸漬させる。ＤＭＳＯが完全に吸収されるまで動物を麻酔下におく。１群に５匹の動物を用いる。抑制性化合物については、対照に比して後肢の腫脹の５０％減少に必要な有効投与量を決定するために、統計解析を行う。治療は、麻酔下のマウスを用いて行う。
【００９５】
以上の記述から、当業者は、本発明の本質的特徴を容易に確認することができ、そしてその精神及び範囲から逸脱することなしに、種々の用途及び条件に適合させるよう本発明の変更及び修正を行うことができる。
【００９６】
当業者は、以上の記述を用い、更なる苦労なしに、本発明をその完全な範囲まで利用することができると信じられる。従って、以上の好ましい特定の具体例は、単に説明的なものであって、如何なる意味においても開示の残り部分を限定するものでないと解釈しなければならない。
【００９７】
以上に及び図面において引用した全ての出願、特許及び刊行物は、参照によってそれらの全体がここに導入される。
Claims (26)
- 免疫調節効果を、これを必要とする患者において達成するための方法であって、該患者に、式
Ｒ１は、−ＣＯＯＨ、アミド、カルボン酸エステル、ニトロ、ホスフェート又はサルフェート基であり、
Ｒ２は、アミド、アミン、ヒドロキシル、ウレア、カルバミド、カーボネート、アンハイドライド、チオアミド、チオウレア、チオカルバミド、チオカーボネート、チオアンハイドライド、アルキルエステル、アシルエステル、アリールエステル、アルキルチオエステル、アシルチオエステル、又はアリールチオエステルであり、
Ｙ１ないしＹ１０は、独立して、水素、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル又はハロゲンであり、そして
所望により、これらフェニル芳香族環の１個又は２個以上は、縮合芳香環、ヘテロ芳香環、又は縮合ヘテロ芳香環によって置き換えられており、及び／又は、これら１個又は２個以上の芳香環の１〜３個の炭素原子が窒素原子で置き換えられている。〕、
又は式、
Ｒ１及びＲ４は、同一又は異なっており、且つＲ１についての上記定義と同じであり、
Ｒ３は、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、アミン、メチル、エチル、プロピル又はイソプロピルであり、そして
所望により、これらフェニル芳香族環の１個又は２個以上は、縮合芳香環、ヘテロ芳香環、又は縮合ヘテロ芳香環によって置き換えられており、及び／又は、これら１個又は２個以上の芳香環の１〜３個の炭素原子が窒素原子で置き換えられている。〕、
又は式、
Ｘ１は、イオウ、ＳＯ２、ＳＯ、メチレン、酸素、カルボニル、エチレン、エステル、チオエステル又はアミドであり、
Ｒ３及びＲ５は、同一又は異なっており、且つＲ３についての上記定義に同じであり、そして
所望により、これらフェニル芳香族環の１個又は２個以上は、縮合芳香環によって、又は、例えば、これら１個又は２個以上の芳香環の１〜３個の炭素原子が窒素原子で置き換えられることによって、ヘテロ芳香環、又は縮合ヘテロ芳香環によって置き換えられている。〕
の化合物、又はその薬剤学的に許容し得る塩の有効量を投与することを含むものである方法。 - Ｒ２の該エステルが、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、フェニル、又はピリジルエステルであり、
該ハロゲンが、Ｃｌ、Ｆ、Ｂｒ又はＩであり、そして
所望により且つ独立して、該６員芳香環がピリジンであり、該１０員芳香環がキノリンである、
請求項１の方法。 - 式Ｉの化合物が、
- 式Ｉ、ＩＩ又はＩＩＩの化合物を投与することを含む、免疫系を賦活するための請求項１の方法。
- 式Ｉ、ＩＩ又はＩＩＩの化合物を投与することを含む、免疫系を抑制するための請求項１の方法。
- 式Ｉの化合物が投与されるものである請求項１の方法。
- 式ＩＩの化合物が投与されるものである請求項１の方法。
- 式ＩＩＩの化合物が投与されるものである請求項１の方法。
- 該患者が免疫不全状態を患っているものである請求項３の方法。
- 該患者が自己免疫疾患又は移植変拒絶を患っているものである請求項３の方法。
- 該患者がヒトである請求項１の方法。
- 抗腫瘍効果を、これを必要とする患者において達成するための方法であって、該患者に、式
Ｒ１は、−ＣＯＯＨ、アミド、カルボン酸エステル、ニトロ、ホスフェート又はサルフェート基であり、
Ｒ２は、アミド、アミン、ヒドロキシル、ウレア、カルバミド、カーボネート、アンハイドライド、チオアミド、チオウレア、チオカルバミド、チオカーボネート、チオアンハイドライド、アルキルエステル、アシルエステル、アリールエステル、アルキルチオエステル、アシルチオエステル、又はアリールチオエステルであり、
Ｙ１ないしＹ１０は、独立して、水素、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル又はハロゲンであり、そして
所望により、これらフェニル芳香族環の１個又は２個以上は、縮合芳香環、ヘテロ芳香環、又は縮合ヘテロ芳香環によって置き換えられており、及び／又は、これら１個又は２個以上の芳香環の１〜３個の炭素原子が窒素原子で置き換えられている。〕、
又は式、
Ｒ１及びＲ４は、同一又は異なっており、且つＲ１についての上記定義と同じであり、
Ｒ３は、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、アミン、メチル、エチル、プロピル又はイソプロピルであり、そして
所望により、これらフェニル芳香族環の１個又は２個以上は、縮合芳香環、ヘテロ芳香環、又は縮合ヘテロ芳香環によって置き換えられており、及び／又は、これら１個又は２個以上の芳香環の１〜３個の炭素原子が窒素原子で置き換えられている。〕、
又は式、
Ｘ１は、イオウ、ＳＯ２、ＳＯ、メチレン、酸素、カルボニル、エチレン、エステル、チオエステル又はアミドであり、
Ｒ３及びＲ５は、同一又は異なっており、且つＲ３についての上記定義に同じであり、そして
所望により、これらフェニル芳香族環の１個又は２個以上は、縮合芳香環、ヘテロ芳香環、又は縮合ヘテロ芳香環によって置き換えられており、及び／又は、これら１個又は２個以上の芳香環の１〜３個の炭素原子が窒素原子で置き換えられている。〕、
の化合物、又はその薬剤学的に許容し得る塩の有効量を投与することを含むものである方法。 - 式Ｉの化合物が投与されるものである請求項１２の方法。
- 式ＩＩの化合物が投与されるものである請求項１２の方法。
- 式ＩＩＩの化合物が投与されるものである請求項１２の方法。
- 該患者がヒトである請求項１２の方法。
- ｐ５６ｌｃｋ分子の、そのＳＨ２ドメインを介した対応する細胞の結合性タンパク質への結合を調節する、又は、ｐ５６ｌｃｋ分子の、そのＳＨ２ドメインを介した活性を調節する方法であって、該ｐ５６ｌｃｋ分子のＳＨ２ドメインに、式、
Ｒ１は、−ＣＯＯＨ、アミド、カルボン酸エステル、ニトロ、ホスフェート又はサルフェート基であり、
Ｒ２は、アミド、アミン、ヒドロキシル、ウレア、カルバミド、カーボネート、アンハイドライド、チオアミド、チオウレア、チオカルバミド、チオカーボネート、チオアンハイドライド、アルキルエステル、アシルエステル、アリールエステル、アルキルチオエステル、アシルチオエステル、又はアリールチオエステルであり、
Ｙ１ないしＹ１０は、独立して、水素、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル又はハロゲンであり、そして
所望により、これらフェニル芳香族環の１個又は２個以上は、縮合芳香環、ヘテロ芳香環、又は縮合ヘテロ芳香環によって置き換えられており、及び／又は、これら１個又は２個以上の芳香環の１〜３個の炭素原子が窒素原子で置き換えられている。〕、
又は式、
Ｒ１及びＲ４は、同一又は異なっており、且つＲ１についての上記定義と同じであり、
Ｒ３は、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、アミン、メチル、エチル、プロピル又はイソプロピルであり、そして
所望により、これらフェニル芳香族環の１個又は２個以上は、縮合芳香環、ヘテロ芳香環、又は縮合ヘテロ芳香環によって置き換えられており、及び／又は、これら１個又は２個以上の芳香環の１〜３個の炭素原子が窒素原子で置き換えられている。〕、
又は式、
Ｘ１は、イオウ、ＳＯ２、ＳＯ、メチレン、酸素、カルボニル、エステル、チオエステル又はアミドであり、
Ｒ３及びＲ５は、同一又は異なっており、且つＲ３についての上記定義に同じであり、そして
所望により、これらフェニル芳香族環の１個又は２個以上は、縮合芳香環、ヘテロ芳香環、又は縮合ヘテロ芳香環によって置き換えられており、及び／又は、これら１個又は２個以上の芳香環の１〜３個の炭素原子が窒素原子で置き換えられている。〕、
の化合物又はその薬剤学的に許容し得る塩を結合させることを含むものである方法。 - 式、
Ｒ１は、−ＣＯＯＨ、アミド、カルボン酸エステル、ニトロ、ホスフェート又はサルフェート基であり、
Ｒ２は、アミド、アミン、ヒドロキシル、ウレア、カルバミド、カーボネート、アンハイドライド、チオアミド、チオウレア、チオカルバミド、チオカーボネート、チオアンハイドライド、アルキルエステル、アシルエステル、アリールエステル、アルキルチオエステル、アシルチオエステル、又はアリールチオエステルであり、
Ｙ１ないしＹ１０は、独立して、水素、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル又はハロゲンであり、そして
所望により、これらフェニル芳香族環の１個又は２個以上は、縮合芳香環、ヘテロ芳香環、又は縮合ヘテロ芳香環によって置き換えられており、及び／又は、これら１個又は２個以上の芳香環の１〜３個の炭素原子が窒素原子で置き換えられている。〕、
又は式、
Ｒ１及びＲ４は、同一又は異なっており、且つＲ１についての上記定義と同じであり、
Ｒ３は、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、アミン、メチル、エチル、プロピル又はイソプロピルであり、そして
所望により、これらフェニル芳香族環の１個又は２個以上は、縮合芳香環、ヘテロ芳香環、又は縮合ヘテロ芳香環によって置き換えられており、及び／又は、これら１個又は２個以上の芳香環の１〜３個の炭素原子が窒素原子で置き換えられている。〕、
又は式、
Ｘ１は、イオウ、ＳＯ２、ＳＯ、メチレン、酸素、カルボニル、エステル、チオエステル又はアミドであり、
Ｒ３及びＲ５は、同一又は異なっており、且つＲ３についての上記定義に同じであり、そして
所望により、これらフェニル芳香族環の１個又は２個以上は、縮合芳香環、ヘテロ芳香環、又は縮合ヘテロ芳香環によって置き換えられており、及び／又は、これら１個又は２個以上の芳香環の１〜３個の炭素原子が窒素原子で置き換えられている。〕、
の化合物、
又はその薬剤学的に許容し得る塩、
及び薬剤学的に許容し得る担体
を含んでなるものである、薬剤組成物。 - 該化合物が式Ｉのものである、請求項１８の薬剤組成物。
- 該化合物が式ＩＩのものである、請求項１８の薬剤組成物。
- 該化合物が式ＩＩＩのものである、請求項１８の薬剤組成物。
- 式Ｉの化合物が、
- 過増殖性の細胞増殖を阻害を、これを必要とする患者において行う方法であって、式
Ｒ１は、−ＣＯＯＨ、アミド、カルボン酸エステル、ニトロ、ホスフェート又はサルフェート基であり、
Ｒ２は、アミド、アミン、ヒドロキシル、ウレア、カルバミド、カーボネート、アンハイドライド、チオアミド、チオウレア、チオカルバミド、チオカーボネート、チオアンハイドライド、アルキルエステル、アシルエステル、アリールエステル、アルキルチオエステル、アシルチオエステル、又はアリールチオエステルであり、
Ｙ１ないしＹ１０は、独立して、水素、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル又はハロゲンであり、そして
所望により、これらフェニル芳香族環の１個又は２個以上は、縮合芳香環、ヘテロ芳香環、又は縮合ヘテロ芳香環によって置き換えられており、及び／又は、これら１個又は２個以上の芳香環の１〜３個の炭素原子が窒素原子で置き換えられている。〕、
又は式、
Ｒ１及びＲ４は、同一又は異なっており、且つＲ１についての上記定義と同じであり、
Ｒ３は、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、アミン、メチル、エチル、プロピル又はイソプロピルであり、そして
所望により、これらフェニル芳香族環の１個又は２個以上は、縮合芳香環、ヘテロ芳香環、又は縮合ヘテロ芳香環によって置き換えられており、及び／又は、これら１個又は２個以上の芳香環の１〜３個の炭素原子が窒素原子で置き換えられている。〕、
又は式、
Ｘ１は、イオウ、ＳＯ２、ＳＯ、メチレン、酸素、カルボニル、エチレン、エステル、チオエステル又はアミドであり、
Ｒ３及びＲ５は、同一又は異なっており、且つＲ３についての上記定義に同じであり、そして
所望により、これらフェニル芳香族環の１個又は２個以上は、縮合芳香環によって、又は、例えば、これら１個又は２個以上の芳香環の１〜３個の炭素原子が窒素原子で置き換えられることによって、ヘテロ芳香環、又は縮合ヘテロ芳香環によって置き換えられている。〕
の化合物を該患者に投与することを含むものである方法。 - 式Ｉの化合物が、
- 式Ｉの化合物が、
- 式Ｉの化合物が、
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