JP2004500091A - 低酸素条件下での成長の改変及び適応 - Google Patents
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Abstract
本発明は、少酸素、すなわち低酸素条件に適応する能力を与える遺伝子についてのヌクレオチド配列及び対応するアミノ酸配列を提供する。これらの配列はSH2A及びSH2A様配列という。これらの配列を含む遺伝子構築物及びキメラ遺伝子も提供される。SH2A及びSH2A様タンパク質のレベル及び/又は活性を調整するために、ヌクレオチド及びアミノ酸配列は、細菌、酵母、真菌、動物及び植物種を形質転換するために用いられうる。SH2A及びSH2A様遺伝子を発現するトランスジェニック植物、植物細胞及び宿主細胞も提供される。低酸素条件下での培養細胞の成長又は生存を調整する方法及び生物の細胞、組織又は器官における成長応答を変化させるための方法も提供される。加えて、低酸素条件における成長に適応した植物を産生する方法、植物における湛水害耐性を改良する方法、植物細胞中でのジベレリン生合成を誘導するための方法及び植物細胞中での嫌気応答を調節する方法が、本発明によって提供される。本発明の組成物及び手法は、園芸、農業、医療、発酵、及び細胞培養産業における無数の用途がある。
Description
【0001】
本願は、2000年2月18日に米国仮出願第06/183,572号として最初に出願された。
【0002】
発明の背景
水稲(Deepwater rice)(オリザ・サティバ(Oryza sativa)L.)植物体は、長期にわたる部分的な浸水に耐えるよう特に適応している。少酸素(低酸素)条件への適応は、発酵経路を触媒するタンパク質をコードするものを含む、嫌気遺伝子の誘導を含む。いくつかの半水生植物において見出されたもう一つの適応は、上昇する水面よりも上にいくつかの葉を維持することにより、植物体の生存を可能にする、最も若い幼節間の急速な成長である。加速した節間の成長は、増加した細胞***活性及び増強された細胞伸長の結果であり、これらは文献においてよく特徴決定されている(Kende, 1987; Kende et al., 1993; Lorbiecke and Sauter, 1998; Kende et al., 1998)。成長応答は、環境シグナルにより誘導され、いくつかの植物ホルモンの相互作用により媒介される。
【0003】
植物体の浸水は、周囲の水による物理的な包囲及び増強された生合成による植物組織内エチレン濃度の増加、をもたらす(Stuenzi and Kende, 1989; Raskin and Kende, 1985)。エチレンは、イネ節間における、成長促進ホルモンジベレリン酸(GA)と、GA作用の強力なアンタゴニストであるシス−アブシジン酸(ABA)との比率を改変させる。ABAレベルの減少及びGAレベルの増加は、存在するGAに対する組織の増加した応答性をもたらす。
【0004】
GAは、節間における最終的な成長促進ホルモンである(Raskin and Kende, 1984)。エチレン適用及び浸水は、いずれも、節間における内因性ABAレベルを3時間以内に75%減少させる(Hoffmann−Benning and Kende, 1992; Azuma et al., 1995)。同時に、内因性GA1レベルが4倍に増加する。浸水による成長誘導の遅滞期は、3〜4時間である(Hoffmann−Benning and Kende, 1992)。
【0005】
イネにおいては単一の遺伝子座が浸水耐性を担当していることが、遺伝学的に示されている(Setter et al., 1997)。この遺伝子のクローニング及び同定は、従来成し遂げられていない。本発明は、異なる生物に由来するSH2遺伝子及び対応するSH2タンパク質を提供する。問題のSH2遺伝子は、嫌気生活により誘導されるSH2タンパク質の誘導を担当しており、従って、低酸素条件への適応における最も基本的なメカニズムのうちの一つを担当している。細胞内のSH2の発現及び/又は活性の調整は、少酸素条件における細胞の増殖を可能にする。
【0006】
発明の概要
本発明は、SH2A遺伝子又はSH2A様遺伝子のヌクレオチド配列〔該ヌクレオチド配列は、該トランスジェニック植物体又は植物細胞のゲノムと異種である〕を含むトランスジェニック植物体、植物部分、又は植物細胞を提供する。
【0007】
SH2A遺伝子又はSH2A様遺伝子のヌクレオチド配列〔該ヌクレオチド配列は、組換えDNA手段により植物体、植物部分、又は植物細胞へ導入されている〕を含むトランスジェニック植物体又は植物細胞も、提供される。そのような植物体は、内因性SH2A様遺伝子を有していてもよく、組換えDNA方法論を使用して、付加的な内因性SH2A様遺伝子が植物体、植物部分、又は植物細胞へ追加されてもよい。
【0008】
SH2Aタンパク質又はSH2A様タンパク質〔該SH2Aタンパク質又はSH2A様タンパク質は、植物体、植物部分、又は植物細胞と異種である〕を含むトランスジェニック植物体、植物部分、又は植物細胞も、提供される。
【0009】
SH2A遺伝子又はSH2A様遺伝子のヌクレオチド配列〔該ヌクレオチド配列は、該宿主細胞のゲノムと異種であるか、又は組換えDNA手段により該宿主細胞へと導入されている〕を含む宿主細胞。宿主細胞の例は、細菌、酵母、真菌、昆虫、植物、又は動物の細胞を含む。宿主細胞内で、SH2A遺伝子又はSH2A様遺伝子のヌクレオチド配列は、該ヌクレオチド配列の発現を指図する調節領域に対しセンス方向又はアンチセンス方向で存在しうる。
【0010】
該培養細胞におけるSH2Aタンパク質又はSH2A様タンパク質のレベル又は活性を調整することを含む、低酸素条件下での培養細胞の増殖又は生存を調整するための方法も、提供される。さらに本発明は、該培養細胞におけるSH2Aタンパク質又はSH2A様タンパク質のレベル又は活性を調整することにより、培養細胞の成長応答を改変するための方法を、提供する。培養細胞は、細菌、酵母、真菌、植物、哺乳動物、又は昆虫の細胞を含みうる。
【0011】
さらに本発明は、該生物の該細胞、組織、又は器官におけるSH2Aタンパク質又はSH2A様タンパク質のレベル又は活性を調整することを含む、生物の細胞、組織、又は器官の成長応答を改変するための方法を、提供する。該植物の該細胞、組織、又は器官におけるSH2Aタンパク質又はSH2A様タンパク質のレベル又は活性を調整することを含む、植物の細胞、組織、又は器官の成長応答を改変するための方法も、提供される。例えば、SH2Aタンパク質又はSH2A様タンパク質のレベルは、該SH2Aタンパク質又はSH2A様タンパク質のヌクレオチド配列の転写を増加させることにより調整されうる。植物において、転写の増加は、植物の細胞、組織、又は器官をエテフォン又はエチレンに曝すことにより誘導される。
【0012】
植物細胞、花粉、プロトプラスト、外植片、植物部分、又は植物器官のうちの少なくとも一つを、SH2A遺伝子又は類似遺伝子のコーディング配列で形質転換すること、及びそれらから植物体を再生させることを含む、低酸素条件における成長に適応した植物体を作製するための方法も、提供される。植物細胞、花粉、プロトプラスト、外植片、植物部分、又は植物器官のうちの少なくとも一つを、SH2A遺伝子又は類似遺伝子のコーディング配列で形質転換すること、及びそれらから植物体を再生させることを含む、少酸素条件における植物体の生存を改良するための方法も、提供される。
【0013】
植物細胞、花粉、プロトプラスト、外植片、植物部分、又は植物器官のうちの少なくとも一つを、SH2A遺伝子又は類似遺伝子のコーディング配列で形質転換すること、及びそれらから植物体を再生させることを含む、植物体の湛水害耐性(water logging tolerance)を改良するための方法も、提供される。
【0014】
本発明は、植物細胞、プロトプラスト、外植片、植物部分、又は植物器官におけるジベレリン生合成を誘導するための方法も提供する。その方法は、該植物細胞又はプロトプラストにおけるSH2Aタンパク質又はSH2A様タンパク質のレベル又は活性を調整することを含む。同様に、該植物の細胞におけるSH2Aタンパク質又はSH2A様タンパク質のレベル又は活性を調整することを含む、植物におけるジベレリン生合成を誘導するための方法が、本発明により提供される。
【0015】
内部のSH2Aタンパク質又はSH2A様タンパク質のレベル又は活性を調整することを含む、植物細胞、プロトプラスト、外植片、植物部分、又は植物器官における嫌気応答タンパク質を調節する方法も、提供される。例えば、嫌気応答タンパク質ピルビン酸デカルボキシラーゼ2が、このようにして調節されうる。
【0016】
本発明は、該ヌクレオチド配列の発現を指図するプロモーター配列と作動可能に連結されたSH2A遺伝子又はSH2A様遺伝子のヌクレオチド配列を含む遺伝子構築物も提供する。SH2A遺伝子又はSH2A様遺伝子は、例えば、cDNA又はゲノム配列でありうる。遺伝子構築物は、プロモーター配列に対してセンス方向又はアンチセンス方向で内部に含まれているSH2A遺伝子又はSH2A様遺伝子のヌクレオチド配列を有しうる。SH2A遺伝子又はSH2A様遺伝子の発現のサイレンシング(silencing)を目的とする遺伝子構築物は、プロモーター配列に対してセンス方向及び/又はアンチセンス方向で内部に含まれているSH2A遺伝子又はSH2A様遺伝子のヌクレオチド配列(又は1個以上のそれらの断片)を有しうる。
【0017】
異種コーディング配列と作動可能に連結されたSH2A遺伝子又はSH2A様遺伝子のプロモーターを含むキメラ遺伝子構築物も、提供される。
【0018】
配列番号5、7、9、11、13、15、及び17に示された核酸配列からなる群より選択されるSH2A様タンパク質をコードする単離された核酸も、本発明により提供される。
【0019】
さらに、本発明は、配列番号6、8、10、12、14、16、及び18に示されたアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、単離されたSH2A様タンパク質を提供する。
【0020】
本発明により、SH2Aと名付けられたイネ(オリザ・サティバ)由来の遺伝子が、植物の少酸素、即ち低酸素の条件への適応能に関与していることが発見された。さらに、SH2Aの遺伝子産物が、真核生物に遍在している高度に保存されたタンパク質のファミリーに属することも発見された。
【0021】
浸水と関連した低酸素条件は、水害(flooding)条件、境界層効果、及び植物組織代謝の結果であるため、定義するのが困難である。大部分の環境において、過多水(floodwater)中の酸素濃度は、通常、空気飽和未満(即ち、低酸素)である。しかしながら、特に夜間は、低酸素条件ではなく、酸素が完全に存在しない、即ち無酸素の条件になりうる。酸素が飽和した過多水ですら、浸水した植物組織中には無酸素のコアが生じる場合がある(Setter et al, 1997及びその中で引用された参照)。本明細書において使用されるように、「低酸素条件」とは、無酸素条件、及び酸素亜飽和、即ち空気飽和未満の条件を含む任意の条件を意味する。ほとんどの場合、無酸素又は亜飽和の条件は一時的である。
【0022】
本発明は、イネ由来のSH2A遺伝子及び対応するSH2Aタンパク質を提供する。本発明は、様々な生物に由来するSH2A様遺伝子及びSH2Aホモログも提供する。本明細書において使用されるように、「SH2A様遺伝子」及び「SH2A遺伝子又は類似遺伝子」とは、相同ヌクレオチド配列により示されるような、イネのSH2A遺伝子に相当する、イネ(オリザ・サティバ)以外の生物に由来する遺伝子をさす。「SH2A様タンパク質」及び「SH2Aホモログ」とは、相同アミノ酸配列、並びに低酸素条件下での適応及び/又は成長を授与する機能により示されるような、イネ以外の生物のSH2A相同タンパク質をさす。従って、本発明は、SH2A、並びにその誘導体、ホモログ、及び機能的アナログに関する。「SH2Aタンパク質又は類似タンパク質」という用語の本明細書における使用は、そのような相同又は非相同の誘導体、ホモログ、及び機能的アナログ全てを包含する。SH2A遺伝子配列及びSH2A様遺伝子配列、並びに対応するタンパク質は、特定の細胞と同種、即ちそのような細胞に天然に存在するものであってもよいし、又は細胞と異種であってもよく、即ち遺伝子配列又はタンパク質は、同一生物由来ではない起源からの細胞へと導入されうる。
【0023】
本発明のもう一つの面において、低酸素条件下での細胞の増殖又は生存を調整するための方法が提供される。その方法は、生物の細胞、組織、又は器官におけるSH2Aタンパク質又はSH2A様タンパク質のレベル及び/又は活性を調整することを含む。そのようなSH2Aタンパク質又は類似タンパク質のレベル及び/又は活性の調整は、それらの生物の細胞、組織、又は器官の低酸素条件への適応を可能にする。一つの実施態様において、生物は動物である。特に好ましいのは、哺乳動物種に属する生物の細胞、組織、又は器官である。SH2Aホモログ又はSH2Aアゴニストは、低酸素条件下での細胞の増殖及び生存を調整するため、培養中の動物細胞に投与されうる。SH2Aホモログ又はSH2Aアゴニストは、in vivoの低酸素部位の細胞へも投与されうる。従って、卒中又は心発作の患者は、低酸素の臨床的影響を減少させるために十分な量、有効量のSH2Aホモログ又はSH2Aアゴニストを投与されうる。ex vivo遺伝子治療法においては、SH2A様遺伝子を使用して、SH2Aホモログを過剰発現するようヒト細胞が形質転換され、形質転換された細胞が、患者へ、好ましくは低酸素部位へ移植される。動物、好ましくは哺乳動物の細胞、組織、又は器官におけるSH2Aタンパク質又はSH2A様タンパク質のレベル及び/又は活性の調整のための該方法は、他の低酸素関連病理の治癒又は緩解においても有用であるかもしれない。動物、好ましくは哺乳動物におけるそのような低酸素条件は、見られ、進行性繊維症を特徴とする末期腎疾患(Norman et al, 1999)、心筋虚血(Sinusas 1999)、肝硬変(Maruyama et al, 1994)、及び高高度性網膜症(high−altitude retinopathy)及びその他の高度関連疾病(Wiedman and Tabin 1999)を含む。窒息を起こした新生児は、低酸素症、特に低酸素性虚血性脳傷害に対して特に脆弱である(Gucuyener et al, 1999)。動物、好ましくは哺乳動物における低酸素条件は、腫瘍の浸潤、転移、及び致死性により作出された微小環境にも見られる。固形腫瘍は、新血管新生及び増加した解糖のみならず、低酸素により誘導可能な転写因子の過剰発現も特徴とする(Zhong et al, 1999)。
【0024】
もう一つの実施態様において、本発明は、腫瘍細胞におけるSH2Aタンパク質又はSH2a様タンパク質のレベル及び/又は活性の調整のための方法を含む。該方法は、低酸素条件下での細胞の増殖及び生存を減少させるための、動物、好ましくは哺乳動物の培養細胞への、例えばドミナントネガティブSH2Aホモログの投与、又は例えばSH2Aアゴニストの投与を含む。SH2Aホモログ又はSH2Aアゴニストは、in vivoの低酸素部位の細胞へも投与されうる。従って、癌患者は、癌性腫瘍細胞の増殖を減少させるために十分な量、有効量のSH2Aホモログ又はSH2Aアゴニストを投与されうる。ex vivo遺伝子治療法においては、例えばドミナントネガティブSH2A様タンパク質をコードするSH2A様遺伝子を使用して、SH2Aホモログを過剰発現するようヒト細胞が形質転換され、形質転換された細胞が癌患者、好ましくは腫瘍発生部位に移植される。好ましくは、哺乳動物はヒトであり、SH2A様遺伝子及び対応する遺伝子産物は、配列番号13に示されたヌクレオチド配列及び配列番号14に示されたアミノ酸配列を有する。ヒト細胞を形質転換する方法、及びヒト細胞において機能するプロモーター配列は、文献中に周知である。
【0025】
水害と関連した限定された気体拡散を克服するため、イネ植物は、品種によって、浸水耐性化、又は浸水から脱出するための伸長という2つの手段のうちの一方で応答する。水位が後退した後に比較的背の高い植物体が倒伏する傾向があるため、短期間の水害条件下での伸長は、不利である。しかしながら、イネが深水中で成長しているか、又は浮遊している範囲においては、伸長は望ましい。伸長応答を、ジベレリン生合成阻害剤パクロブトラゾール(paclobutrazol)の噴霧により阻害した場合、非浸水耐性品種の実生の生存は、大きく増強されうる。浸水耐性には、エネルギー生成メカニズムとしての効率的なアルコール発酵が伴う(Setter et al, 1997及びその中で引用された参照)。浸水条件は、低酸素をもたらすのみならず、エチレンの蓄積をも引き起こし、それが、植物ホルモンGAとABAとの比率を改変する。アラビドプシス・タリアナ(Arabidopsis thaliana)のSH2A様遺伝子のプロモーター領域の分析(図10/実施例7参照)は、浸水に起因する改変(低酸素、エチレン、GA、ABA)1個以上に応答性のプロモーター因子が存在することを示している。
【0026】
浸水耐性の発現又は伸長応答のいずれかを介した低酸素への適応及び低酸素の有害効果の克服は、明らかに収穫量に影響するであろう。さらに、増加した種子のサイズ、従って増加した炭水化物含量は、イネ実生の浸水耐性における重要な要因である(Setter et al, 1997)。
【0027】
本発明のもう一つの面において、SH2Aタンパク質又は類似タンパク質のレベル及び/又は活性を調整することを含む、植物の細胞、組織、又は器官の成長応答を改変する方法が提供される。SH2Aタンパク質又は類似タンパク質のレベル又は活性の調整は、植物体のサイズ及び/又は構造及び/又は収量に関する、細胞、組織、又は器官の成長の改変を可能にする。SH2A又はSH2Aホモログのレベル又は活性の調整は、遺伝子レベルで、即ちSH2A遺伝子もしくは類似遺伝子、又は該SH2A遺伝子もしくは類似遺伝子のRNAを標的とするリボザイムをコードする遺伝子で植物を形質転換することにより、実施されうる。SH2A遺伝子又はSH2A様遺伝子は、センス方向又はアンチセンス方向のいずれかで植物細胞を形質転換するために使用されうる。細胞増殖の変化、例えば植物茎の伸長の増加又は減少を起こさせるためには、センス方向のSH2A遺伝子又は類似遺伝子が、植物細胞、プロトプラスト、外植片、植物部分(例えば、胚、子房、花粉、根、茎の一部、胚軸、***組織等)、又は植物器官を形質転換するために使用される。SH2A遺伝子又はSH2A様遺伝子は、共抑制を引き起こすためセンス方向で使用されてもよいし、又は再生した植物体が、例えば植物の茎の伸長の増加もしくは減少を示すよう、植物細胞、プロトプラスト、外植片、植物部分、もしくは植物器官を形質転換するために、アンチセンス方向で使用されてもよい。SH2A遺伝子又はSH2A様遺伝子のRNAを標的とするリボザイムをコードする遺伝子で形質転換された植物細胞、プロトプラスト、外植片、植物部分、又は植物器官から再生した植物体においても、類似の効果が得られうる。SH2A又はSH2Aホモログのレベル又は活性の調整は、さらに、突然変異誘発、例えばT−DNAもしくはトランスポゾンの挿入、又は例えばWO98/36083、WO98/53083、WO99/15682、もしくはWO99/53050に記載されたような遺伝子サイレンシング戦略により、遺伝子レベルで実施されうる。SH2A遺伝子又はSH2A様遺伝子の発現のサイレンシングを目的とする遺伝子構築物は、プロモーター配列に対してセンス方向及び/又はアンチセンス方向で含まれたSH2A遺伝子又はSH2A様遺伝子のヌクレオチド配列(又は、それらの1個以上の断片)を有しうる。
【0028】
SH2Aタンパク質又はSH2A様タンパク質のレベル又は活性の調整は、SH2A、SH2Aホモログ、もしくはSH2Aアゴニストを細胞に投与するか、又はそれらに細胞を曝すことにより、タンパク質レベルでも実施されうる。そのような適用は、例えば動物の細胞及び組織の培養物、並びに植物細胞において特に有用である。SH2Aタンパク質又はSH2A様タンパク質のレベル又は活性の調整は、免疫調整、即ち宿主細胞におけるSH2Aタンパク質又はSH2A様タンパク質に特異的な抗体の発現によっても媒介されうる。そのような抗体は、「プランティボディ(plantibodies)」、単鎖抗体、IgG抗体、Fab断片、及び重鎖ラクダ抗体を含む。
【0029】
SH2Aタンパク質又はSH2A様タンパク質の配列のより精密な調査は、大部分(図2及び4参照)が、核移行配列(NLS:KRXR、イネSH2Aの残基64〜67)を含有しており、いくつかが破壊ボックスモチーフ(RX2LX2,3N、イネSH2Aの残基145〜152)を含有していることを明らかにした。NLSは、通常は細胞質に位置しており、マイトジェン又はストレスのような特異的シグナルの影響下で核へと移行し、核内で機能するタンパク質に特徴的なものである。そのようなタンパク質は、転写因子及び細胞周期タンパク質を含む。核に必要であるが、それ自体はNLSを含有していないタンパク質を核へと輸送するためのシャトル、即ち、いわゆるピギーバック(piggy−back)メカニズムとして作用しうるNLS含有タンパク質も存在する。(通常調節性の)タンパク質における破壊ボックスモチーフの存在は、該タンパク質の活性を時間的に制限するための効率的なメカニズムである、そのようなタンパク質の迅速な代謝回転の指標である。SH2Aタンパク質又はSH2A様タンパク質は、核において機能し、従って(1個以上の)核過程に関与していると予想される。そのような過程は、遺伝子転写の調節(例えば、直接的に転写因子として、又は間接的に転写因子のシャトルとして)及び細胞周期の調節を含む。動物において、低酸素は細胞周期を調整する、即ち、低酸素は、***促進サイクリンA及びBの合成を阻害することにより、マイトジェンにより活性化された細胞において増殖抑制状態を誘導する(Naldini and Carraro 1999)。低酸素は、サイクリン依存性キナーゼの阻害剤であるp21(waf1/cip1)のレベルも増加させる(Zaman et al, 1999)。動物細胞周期タンパク質の多くが植物における(1個以上の)対応物を有しているため(植物細胞周期に関する概説は、Mironov et al, 1999参照)、低酸素は、浸水耐性植物においては植物細胞周期を抑制するが、浸水した植物体の伸長応答においては植物細胞周期を増強するという可能性が高い。従って、SH2Aタンパク質又はSH2A様タンパク質が、遺伝子転写の調節因子及び/又は細胞周期の調節因子として機能する可能性は排除できない。細胞周期の調節因子としてのSH2Aタンパク質又はSH2A様タンパク質の可能性のある役割は、以下のように想像されうる。イネに関して上述したように、植物体は、耐性の顕示又は伸長の顕示(即ち、浸水感受性)という2つの手段のうちのいずれか一方で浸水誘導低酸素に応答することができる。
【0030】
第一のモデルにおいて、SH2Aタンパク質又はSH2A様タンパク質は、細胞周期制御遺伝子又は細胞周期制御タンパク質の負の調節因子として作用しうる。浸水耐性植物においては、低酸素により誘導されるシグナル伝達カスケードが、SH2A遺伝子又はSH2A様遺伝子の増強された発現をもたらすであろう。結果として、細胞周期が遮断され、伸長は起こらないであろう。伸長を示す浸水感受性植物においては、該低酸素により誘導されるシグナル伝達カスケードの中心的成分の欠如が、SH2Aタンパク質又はSH2A様タンパク質の蓄積を防止するであろう。結果として、細胞周期は、遮断されず、その後、例えば初期成長中のSH2A mRNAもしくはSH2A様mRNAの減少した安定性のため、又はSH2Aタンパク質もしくはSH2A様タンパク質の希釈のために増強され、それが迅速な伸長応答を引き起こしうる。
【0031】
第二のモデルにおいては、SH2Aタンパク質又はSH2A様タンパク質は、細胞周期制御遺伝子又は細胞周期制御タンパク質の正の調節因子として作用しうる。該細胞周期制御遺伝子又は細胞周期制御タンパク質は、この場合、例えば他の細胞周期制御遺伝子又は他の細胞周期制御タンパク質の阻害剤を含むであろう。異なる植物応答、浸水耐性又は伸長は、やはり低酸素により誘導されるシグナル伝達カスケードの中心的成分の存在又は欠如によりそれぞれ説明されうる。2つのモデルいずれにおいても、該低酸素により誘導されるシグナル伝達カスケードの中心的成分は、例えば浸水耐性のためのイネ主要遺伝子座の遺伝子によりコードされるのかもしれない(Xu and Mackill 1996)。
【0032】
「細胞周期」という用語は、細胞の増殖及び***、特にDNA複製及び有糸***の調節と関連した、周期的な生化学的及び構造的イベントを意味する。細胞周期は、G0期、Gap1(G1)期、DNA合成(S)期、Gap2(G2)期、及び有糸***(M)期と呼ばれる期を含む。通常、これらの4つの期は連続的に起こるが、細胞周期は、核内有糸***、細胞質***、倍数性、多糸性、及び核内倍加(endoreduplication)のような修飾された周期も含む。
【0033】
「細胞周期相互作用タンパク質」、「細胞周期タンパク質」、又は「細胞周期制御タンパク質」という用語は、本明細書において示されるように、細胞、組織、器官、もしくは生物全体の細胞周期もしくはその一部、並びに/又はDNA複製の制御を行うか、もしくは調節するか、もしくはそれらに必要なタンパク質を意味する。それは、サイクリン依存性キナーゼ又はそれらのサブユニットと結合する能力、それらを調節する能力、又はそれらによって調節される能力を有していてもよい。その用語は、それらのペプチド、ポリペプチド、断片、異型、ホモログ、対立遺伝子、又は前駆体(例えば、プレプロタンパク質)も含む。
【0034】
細胞周期制御タンパク質及び真核生物の細胞周期の調節におけるそれらの役割は、John(1981)及びその中に与えられた論文(Norbury and Nurse 1992; Nurse 1990; Ormrod and Francis 1993)及びその中に与えられた論文(Doerner et al, 1996; Elledge 1996; Francis and Halford 1995; Francis et al, 1998; Hirt et al, 1991; Mironov et al, 1999)により詳細に概説されており、これらは参照により組み込まれる。
【0035】
「細胞周期制御遺伝子」という用語は、染色体DNA合成、及び有糸***(前記前微小管束、核膜、紡錘体形成、染色体凝縮、染色体分離、新たな核の形成、隔膜形成体の形成等)、減数***、細胞質***、細胞増殖、及び核内倍加の制御を行うか、もしくはそれらに必要な任意の遺伝子、又はそれらの変異体をさす。CDK、サイクリン、E2F、Rv、CKI、Cksのホモログのような前記の制御を行う全ての遺伝子、例えばサイクリンD、cdc25、Weel、Niml、MAPキナーゼ等のような前記を妨害する任意の遺伝子も、細胞周期制御遺伝子である。
【0036】
より具体的には、S期への進入及び進行の制御に関与している全ての遺伝子が細胞周期制御遺伝子である。それらは、排他的にではないが、サイクリン依存性キナーゼ(CDK)、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤(CKI)、D、E、及びAサイクリン、E2F、及びDP転写因子、ポケットタンパク質(pocket proteins)、CDC7/DBF4キナーゼ、CDC6、MCM2−7、Oreタンパク質、cdc45、SCFユビキチンリガーゼの成分、PCNA、DNA−ポリメラーゼのような「細胞周期制御タンパク質」を発現する遺伝子を含む。
【0037】
「細胞周期制御タンパク質」という用語は、CYCA1;1、CYCAC2;1、CYCA3;1、CYCB1;1、CYCB1;2、CYCB2;2、CYCD1;1、CYCD2;1、CYCD3;1、及びCYCD4;1(Evans et al, 1983; Francis et al, 1998; Labbe et al, 1989; Murray and Kirschner 1989; Renaudin et al, 1996; Soni et al, 1995; Scrrell et al, 1999; Swenson et al, 1986)を含むサイクリンA、B、C、D、及びE、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤(CKI)タンパク質、例えばICK1(Wang et al, 1997)、FL39、FL66、FL67(PCT/EP98/05895)、Sic1、Far1、Rum1、p21、p27、p57、p16、p15、p18、p19(Elledge 1996; Pines 1995)、p14、及びp14ARF;p13suc1又はCKS1At(De Veylder et al, 1997; Hayles and Nurse 1986)及びnim−1(Russell and Nurse 1987a; Russell and Nurse 1987b; Fantes 1989; Russell and Nurse 1986; Russell and Nurse 1987a; Russell and Nurse 1987b)、Cdc2のホモログ、例えばCdc2MsB(Hirt et al, 1993)、CdcMsキナーゼ(Bogre et al, 1997)、cdc2T14Y15ホスファターゼ、例えばCdc25プロテインホスファターゼ又はp80cdc25(Bell et al, 1993; Ellegde 1996; Kumagai and Dunphy 1991; Russell and Nurse 1986)及びPyp3(Ellegde 1996)、cdc2プロテインキナーゼ又はp34cdc2(Colasanti et al, 1991; Feiler and Jacobs 1990; Hirt et al, 1991; John et al, 1989; Lee and Nurse 1987; Nurse and Bissett 1981; Ormrod and Francis 1993)、cdc2aプロテインキナーゼ(Hemerly et al, 1993)、cdc2T14Y15キナーゼ、例えばweel又はp107weel(Ellegde 1996; Russell and Nurse 1986; Russell and Nurse 1987a; Russell and Nurse 1987b; Sun et al, 1999)、mik1(Lundgren et al, 1991)及びmyt1(Ellegde 1996);cdc2T161キナーゼ、例えばCak及びCiv(Ellegde 1996);cdc2T161ホスファターゼ、例えばKap1(Ellegde 1996);cdc28プロテインキナーゼ又はp34cdc28(Nasmyth 1993; Reed et al,1985)、p40MO15(Fesquet et al,1993; Poon et al, 1993)、chk1キナーゼ(Zeng et al, 1998)、cds1キナーゼ(Zeng et al, 1998)、増殖関連H1キナーゼ(Labbe et al, 1989; Lake and Salzman 1972; Langan 1978; Zeng et al, 1998)、(Binarova et al, 1998; Boegre et al, 1999; Calderini et al, 1998; Wilson et al, 1999)により記載されたMAPキナーゼを含む。
【0038】
サイクリンDにより媒介される細胞のG0からG1への進入に関与している、その他の細胞周期制御タンパク質は、pRb(Xie et al, 1996; Huntley et al, 1998)、E2F、RIP、MCM7を含み、そしてpRb様タンパク質p107及びp130を含むかもしれない。
【0039】
これらに限定されないがORC、CDC6、CDC14、RPA、及びMCMタンパク質のような1個以上の複製開始点におけるプレ複製複合体の形成、これらに限定されないがCDC7、DBF4、及びMBFタンパク質のようなこのプレ複製複合体の形成の調節に関与している、さらなる細胞周期制御タンパク質。
【0040】
本明細書において使用されるように、「細胞周期タンパク質」及び「細胞周期制御タンパク質」という用語は、他の細胞周期制御タンパク質の代謝回転、又は他の細胞周期制御タンパク質の半減期の調節に関与しているタンパク質のうちの任意の1個以上を含む。「タンパク質代謝回転」という用語は、該タンパク質の物理的又は機能的な除去をもたらす全てのタンパク質の生化学的修飾を含むものとする。これらに限定されないが、そのような修飾の例は、リン酸化、ユビキチン化、及びタンパク質分解である。前記の他の細胞周期制御タンパク質のうちの任意の1個以上のタンパク質分解に関与している特に好ましいタンパク質は、酵母由来及び動物由来のタンパク質、Skp1、Skp2、Rub1、Cdc20、キュリン(cullins)、CDC23、CDC27、CDC16、及びそれらの植物由来ホモログである(Cohen−Fix and Koshland 1997; Hochstrasser 1998; Krek 1998; Lisztwan et al, 1998)、及び(Francis et al, 1998)中のPlesse et al)。
【0041】
本発明の目的のため、「細胞周期制御遺伝子」という用語は、転写因子及び上流シグナルタンパク質のような細胞周期制御遺伝子発現の転写調節に関与している遺伝子のうちの任意の1個以上を含む。さらなる細胞周期制御遺伝子も、排除されない。
【0042】
本明細書において使用されるように、「細胞周期制御遺伝子」という用語は、さらに、例えばストレス、栄養、病原体のような環境的シグナル、又は動物マイトジェンもしくは植物ホルモン(オーキシン、サイトカイニン、エチレン、ジベレリン酸、アブシジン酸、及びブラシノステロイド)のような内因性シグナルにより影響を受ける任意の細胞周期制御遺伝子又はそれらの変異体を含む。
【0043】
上述のような遺伝子転写及び/又は細胞周期及び/又は細胞代謝のSH2Aタンパク質又はSH2A様タンパク質による調節は、タンパク質−タンパク質相互作用、又はタンパク質−核酸相互作用の結果であり得る。従って、SH2Aタンパク質又はSH2A様タンパク質により作用を受ける可能性のある標的のレベル及び/又は活性の調整も、生物の細胞、組織、又は器官の成長の間接的な改変に寄与しうる。SH2Aタンパク質又はSH2A様タンパク質の標的のレベル及び/又は活性が調整される、この型の生物の細胞、組織、又は器官の成長の間接的な改変は、例えばSH2Aタンパク質又はSH2A様タンパク質のレベル及び/又は活性の調整と関連した不要な多面的な効果の発生が回避されるという利点を有しうる。
【0044】
潜在的なSH2Aタンパク質又はSH2A様タンパク質のタンパク質性標的の同定のための方法は、当業者に周知であり、SH2Aタンパク質又はSH2A様タンパク質をおとり(bait)として使用した酵母ツーハイブリッドスクリーニング、及びSH2Aタンパク質又はSH2A様タンパク質に対する抗体を使用した免疫沈降を含む。同定されたタンパク質性標的は、内因性調整因子、例えばSH2Aのレベル及び/もしくは活性、又はSH2A様タンパク質のレベル及び/もしくは活性の阻害剤又は活性化剤を含みうる。可能性のあるSH2Aタンパク質又はSH2A様タンパク質の核酸性標的の同定のための方法は、単純ではないが、可能であり、例えば遺伝子発見法(即ち、SH2Aタンパク質又はSH2A様タンパク質により発現が影響される遺伝子の同定)、それに続く例えば該発見された遺伝子に由来する重複するプロモーター断片のセットのゲルシフト分析を含みうる。同定された核酸標的は、SH2Aタンパク質もしくはSH2A様タンパク質をコードする遺伝子の発現、又はSH2Aタンパク質もしくはSH2A様タンパク質の活性の調整因子、例えば増強因子又は阻害剤をコードする内因性遺伝子を含みうる。
【0045】
従って、低酸素条件下での細胞の増殖又は生存は、SH2Aタンパク質又はSH2A様タンパク質と相互作用するタンパク質又は核酸のレベル及び/又は活性の調整によっても達成されうる。生物の細胞、組織、又は器官におけるそのようなタンパク質及び/又は核酸配列のレベル及び/又は活性の調整は、SH2Aタンパク質もしくはSH2A様タンパク質のレベル及び/もしくは活性の調整、並びに/又は低酸素条件に対する生物の細胞、組織、もしくは器官の適応の改変を可能にする。
【0046】
OMIGA2.0ソフトウェア(Oxford Molecular)と共に提供されるモチーフデータベースを使用したイネSH2Aアミノ酸配列のさらなる分析は、複数の推定リン酸化部位:5個の非重複カゼインキナーゼII(CK2)リン酸化部位、1個のプロテインキナーゼC(PKC)リン酸化部位、及び4個(そのうち3個は非重複)のチロシン(TYR)リン酸化部位の存在を明らかにした。これらの部位の位置は、表1に示されている。イネSH2Aタンパク質の推定リン酸化部位の多くは、他の起源由来のSH2A様タンパク質においても保存されている(図2参照)。従って、SH2Aタンパク質又はSH2A様タンパク質の生物学的活性及び/又はタンパク質代謝回転のターゲティングは、そのリン酸化状態の調節により調節されている可能性がある。そのような調節は、異なる発達及び/又は環境条件においてプロテインキナーゼ及び/又はプロテインホスファターゼの活性のバランスを変化させることにより得られる。(セリン、トレオニン、及びチロシンのような)リン酸化可能アミノ酸の、(それぞれアラニン、アラニン、及びフェニルアラニンのような)非リン酸化可能アミノ酸へのターゲティッド交換は、構成性の生物学的活性又は不活性を示し、かつ/又は増加もしくは減少したタンパク質分解代謝回転速度を示す変異型のSH2Aタンパク質又はSH2A様タンパク質を与えるかもしれない。従って、本発明のもう一つの面において、(1個以上の)中心的リン酸化可能アミノ酸が(1個以上の)非リン酸化可能アミノ酸へと交換されている変異型SH2Aタンパク質又はSH2A様タンパク質が同定される。該修飾されたSH2Aタンパク質又はSH2A様タンパク質の、生物の細胞、組織、又は器官における発現は、SH2Aタンパク質又はSH2A様タンパク質の調整されたレベル及び/又は活性を引き起こし、そして生物の細胞、組織、又は器官の低酸素条件への適応の改変を可能にする。好ましくは、細胞の低酸素条件に対する適応が、増強される。
【0047】
【表1】
【0048】
本発明によると、SH2A又はSH2Aホモログのレベル又は活性を調整することにより、植物細胞、プロトプラスト、外植片、植物部分、又は植物器官においてジベレリン生合成が誘導されうる。また、本発明によると、SH2A又はSH2Aホモログのレベル又は活性を調整することにより、植物細胞、プロトプラスト、外植片、植物部分、又は植物器官における嫌気応答タンパク質が調節されうる。
【0049】
SH2Aタンパク質又は類似タンパク質のレベル又は活性の調整は、1個以上のSH2A様遺伝子で、植物細胞、プロトプラスト、外植片、植物部分、又は植物器官を形質転換することを含みうる。同様に、SH2Aの発現レベル又は活性の調整は、1個以上のSH2A様遺伝子で、動物の細胞、器官、又は胚を形質転換することを含みうる。当然、細菌、酵母、真菌、及びその他の生物は、標準的な組換えDNA法を使用して形質転換されうる。現在では、SH2A様タンパク質は自然界に遍在していることが認識されているため、全てではないにしても大部分の生物の細胞が、SH2Aホモログをコードする天然遺伝子を有するであろう。従って、例えば、1個以上のSH2A遺伝子又は類似遺伝子が、そのような生物を形質転換し、その結果、天然のSH2Aタンパク質又は類似タンパク質の発現を増加又は減少させるため、センス方向又はアンチセンス方向で使用されうる。
【0050】
従って、SH2A様タンパク質をコードし、例えば動物又は植物材料を形質転換するために使用されるヌクレオチド配列は、特定の植物又は動物の細胞に対して異種(外来)であってもよいし、又はそのような細胞に天然に存在するものであってもよい。得られたトランスジェニック植物細胞及び動物細胞、又はその他の生物の細胞は、特定の細胞のゲノムに対して異種のSH2A様遺伝子を含んでいてもよいし、特定の生物に対して異種のSH2A様タンパク質を含んでいてもよい。得られたトランスジェニックな植物細胞及び動物細胞、又はその他の生物は、特定の生物のゲノムに天然にも存在するがゲノムに追加されたSH2A様遺伝子を含んでいてもよい。さらに、SH2A遺伝子又はSH2A様遺伝子のヌクレオチド配列は、該ヌクレオチド配列の発現を指図する調節領域に対してセンス方向又はアンチセンス方向の形態をとりうる。天然又は異種のSH2A様遺伝子は、標準的な組換えDNA法を使用して細胞へ添加される。
【0051】
SH2Aタンパク質又はSH2A様タンパク質の活性は、SH2Aタンパク質又はSH2A様タンパク質、即ちSH2Aアゴニストと相互作用する化合物に生物の細胞を曝すか、又はそれらを生物の細胞に適用することにより調整されうる。SH2Aタンパク質又はSH2A様タンパク質のレベルは、SH2Aタンパク質又はSH2Aタンパク質の発現を増加又は減少させることにより調整されうる。発現の増加は、例えば、センス方向のSH2Aコーディング配列の付加により達成されうる。発現の減少は、例えば、アンチセンス方向のコーディング配列の付加により、挿入突然変異誘発により、又はその他の遺伝子サイレンシング法により達成されうる。発現の増加は、さらに、SH2A又はSH2A遺伝子産物の発現を誘導する化合物に細胞を曝すか、又はそれらを細胞、もしくは植物体全体もしくは植物部分へ適用することにより、達成されうる。エチレン及びエテフォンは、SH2A遺伝子又はSH2A様遺伝子のmRNA転写物の蓄積を増加させ、従ってSH2A又はSH2Aホモログの発現を増加させるために使用されうる。
【0052】
本発明は、配列番号1に示されるようなヌクレオチド配列を含むイネ(オリザ・サティバ)由来のSH2A遺伝子を提供する。本発明のもう一つの実施態様において、配列番号3に示されるようなヌクレオチド配列を含む、SH2Bと名付けられたイネ由来SH2A様遺伝子が提供される。配列番号1に示された配列と比較した場合、1個以上のヌクレオチドの挿入、欠失、又は置換を有し、かつ低酸素条件への適応を授与するという特徴的な特性を維持しているSH2A遺伝子又はSH2A様遺伝子も、本発明により企図される。
【0053】
本発明のさらにもう一つの実施態様において、配列番号2に示されるようなアミノ酸配列を有するSH2Aをコードする単離された核酸が提供される。さらにもう一つの実施態様において、配列番号4に示されるようなアミノ酸配列を有するSH2Bをコードする単離された核酸が提供される。
【0054】
本発明は、トマト(リコパーシコン・エスクレンタム(Lycopersicon esculentum))、ダイズ(グリシン・マックス(Glycine max))、及びワタ(ゴシピウム・ヒルスタム(Gossypium hirsutum))のような植物に由来するSH2Aホモログをコードする単離された核酸、及び対応するアミノ酸も提供する。トマト由来の第一のSH2A様遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号5に示されている。対応するトマトSH2Aホモログのアミノ酸配列は、配列番号6に示されている。トマト由来の第二のSH2A様遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号7に示されている。配列番号8は、トマト由来の第二のSH2A様遺伝子の対応するアミノ酸配列を示している。
【0055】
ダイズ由来のSH2A様遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号9に示されている。対応するダイズSH2Aホモログのアミノ酸配列は、配列番号10に示されている。ワタSH2A様遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号11に示されており、対応するアミノ酸配列は、配列番号12に示されている。
【0056】
ヒト、マウス、及びゼブラフィッシュのSH2A様遺伝子のヌクレオチド配列、並びに対応するアミノ酸配列も、提供される。ヒトSH2A様遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号13に示されている。対応するアミノ酸配列は、配列番号14に示されている。マウスSH2A様遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号15に示されており、対応するアミノ酸配列は、配列番号16に示されている。
【0057】
ゼブラフィッシュSH2A様遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号17に示されている。対応するアミノ酸配列は、配列番号18に示されている。
【0058】
SH2Aタンパク質又はホモログは、周知の方法論を使用して生物の組織起源から単離されうる。例えば、Calderini et al, (1998) Journal of Cell Science 111: 3091−3100に記載されたような適切な抽出緩衝液を使用した標準的な手法に従いタンパク質抽出物が調製され、そして抗体を使用してSH2Aタンパク質又はSH2A様タンパク質が免疫沈降させられうる。例えば、SH2Aタンパク質又はSH2A様タンパク質の一部をコードする合成ペプチドに対するポリクローナル抗体が作製されうる。従って、SH2A様遺伝子の3′領域に対応する合成ペプチドが、SH2Aタンパク質又はSH2A様タンパク質に対する抗体を生成させるために使用されうる。例えば、SH2Aのヌクレオチド496〜867に対応するペプチドが、抗体を生成させるために使用されうる。SH2A又はSH2Aホモログのアミノ酸91〜118及び133〜161(図2参照)も、抗体を生成させるために使用されうる。次いで、抗体は、SH2Aホモログを同定するため、植物由来のタンパク質抽出物を用いた結合アッセイにおいて使用されうる。
【0059】
さらに、本発明は、SH2A分子もしくはSH2A様分子又はそれらの一部、即ちそのようなタンパク質の特異的断片又はエピトープを特異的に認識する抗体に関する。本発明の抗体は、異なる生物に由来するSH2Aホモログを同定し単離するために使用されうる。これらの抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、又は合成抗体であってもよいし、Fab、Fv、もしくはscFv断片のような抗体断片、又は重鎖ラクダ抗体等であってもよい。モノクローナル抗体は、例えば、マウス骨髄腫細胞の、免疫感作された哺乳動物に由来する脾細胞との融合を含む、Koehler and Milstein, Nature 256(1975), 495及びGalfre, Meth. Enzymol. 73(1981), 3に最初に記載されたような技術により調製されうる。さらに、前記ヘ゜プチドに対する抗体又はそれらの断片は、例えばHarlow and Lane“Antibodies, A Laboratory Manual”, CSH Press, Cold Spring Harbor, 1988に記載されている方法を使用することによっても得られる。これらの抗体は、例えば、本発明に係るSH2Aタンパク質又はSH2A様タンパク質の免疫沈降及び免疫学的局在部位決定、並びに例えば組換え宿主細胞及び生物におけるそのようなタンパク質の合成のモニタリングに使用されうる。前記タンパク質、それらのペプチドもしくは断片に対する抗体、又はそれらの断片は、例えば癌診断用のキットにも適用されうる。腫瘍又は腫瘍組織におけるSH2Aタンパク質又はSH2A様タンパク質のレベルの改変は、例えば、診断キット中に供給された該抗体又はそれらの標識誘導体を含むRIA又はELISAに基づく検出により測定されうる。本発明のもう一つの実施態様において、例えば癌診断用の、そのようなキットは、標的のSH2A mRNA種又はSH2A様mRNA種の特異的かつ定量的な増幅のため、例えばRT−PCRを介して使用されうるオリゴヌクレオチドプライマーを含有している。該mRNAのレベルの改変は、腫瘍又は腫瘍組織の発生の指標となりうる。
【0060】
好ましくは、SH2Aタンパク質又はSH2A様タンパク質は、本発明のSH2Aコーディング配列又はSH2A様コーティング配列の遺伝子産物を発現する組換え生物から単離される。SH2Aタンパク質又はSH2A様タンパク質は、Ausubel et al,(1987) Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates, New York、に記載されているもののような標準的な方法を使用して、そのような組換え生物から単離され精製されうる。
【0061】
また、本発明により、本発明の単離されたSH2Aヌクレオチド配列又はSH2A様ヌクレオチド配列を含むベクターが提供される。ヌクレオチド配列は、例えば、SH2A遺伝子又はSH2A様遺伝子の全体、即ちコーディング配列、並びにプロモーター及び終結配列のような関連した5′及び3′調節領域を含むSH2Aゲノミック配列を含んでいてもよい。そのような配列内には、イントロンが存在してもよいし、又は存在していなくてもよい。もう一つの実施態様において、ベクターは、SH2Aタンパク質又はSH2A様タンパク質の発現を起こさせるよう宿主細胞において機能するプロモーターと作動可能に連結されたcDNAのようなSH2Aヌクレオチド配列又はSH2A様ヌクレオチド配列を含む。そのようなベクターは、遺伝子構築物とも呼ばれる。本明細書において使用されるように、「遺伝子」とは、センス方向又はアンチセンス方向のいずれかの、SH2A又はSH2Aホモログをコードするゲノミック配列、cDNA配列、又は合成DNA配列をさすことができる。
【0062】
本発明のもう一つの面において、少酸素、即ち低酸素の条件における増殖に適応している宿主細胞を作製するための方法が提供される。その方法は、宿主細胞において機能するプロモーターの制御下にあるSH2A遺伝子又はSH2A様遺伝子で、宿主細胞を形質転換すること、及び調整されたSH2A遺伝子又はSH2A様遺伝子の発現レベルを有し、従って少酸素条件において増殖するよう適応している形質転換体を選択することを含む。SH2A遺伝子又は類似遺伝子は、宿主細胞において複製するか、又は宿主細胞のゲノムへ組み込まれるベクターにより保持されうる。その方法は、製パン又は発酵産業、及び組換えタンパク質の作製において使用されているもののような単細胞生物に特に有用である。従って、細菌、真菌、酵母、及び動物の細胞が、本発明のSH2A遺伝子又はSH2A様遺伝子での形質転換により、低酸素条件において増殖するよう適応させられうる。SH2A遺伝子又は類似遺伝子での形質転換により改変されうる酵母の例は、これらに限定されないが、E.コリ(coli)、バチルス(Bacillus)sp.、アキフェックス(Aquifex)sp.、及びシュードモナ(Pseudomona)sp.、ラクトバチルス(Lactobacilli)、ストレプトミセス(Streptomyces)sp.、アシネトバクター(Acinetobacter)sp.、シトロバクター(Citrobacter)sp.、及びクロストリジウム(Clostridium)sp.を含む。SH2A遺伝子又は類似遺伝子での形質転換により改変されうる細菌の例は、これらに限定されないが、サッカロミセス(Saccharomyces)及びシゾサッカロミセス(Schizosaccharomyces)、ピキア(Pichia)、及びクルイベロミセス(Kluyveromyces)、及びカンジダ(Candida)を含む。少酸素条件における増殖に適応させられ得る真菌の例は、アスペルギルス(Aspergillus)sp.、ペニシリウム(Penicillium)sp.及びトリコデルマ(Trichoderma)sp.を含む。
【0063】
SH2A遺伝子又は類似遺伝子での形質転換により改変されうる動物/哺乳動物細胞の例は、これらに限定されないが、例えばモノクローナル抗体を産生する、ハイブリドーマ細胞又は永久CHO細胞を含む。酸素供給量は、実際、培養動物/哺乳動物細胞による有用タンパク質の産生における主要な問題の一つである(Masuda et al, 2000)。従って、SH2A遺伝子又はSH2A様遺伝子の発現は、該培養細胞の生存を増強するであろう。さらに、SH2A遺伝子又はSH2A様遺伝子のプロモーターは、少酸素濃度下で培養された例えば動物細胞による該有用タンパク質の発現を推進するため使用されうる。他の低酸素応答エンハンサーを使用したそのような系は、記載されている(Masuda et al, 2000)。
【0064】
SH2A又はSH2Aホモログは、哺乳動物、酵母、又は昆虫の細胞を、本発明のSH2A遺伝子又はSH2A様遺伝子で形質転換することにより、哺乳動物、酵母、又は昆虫の細胞のような宿主細胞においても産生されうる。哺乳動物、酵母、又は昆虫の細胞を形質転換する方法は、当分野において周知である。哺乳動物、酵母、又は昆虫の細胞においてSH2Aタンパク質又は類似タンパク質を産生させるためには、哺乳動物、酵母、又は昆虫の細胞において機能するプロモーターの制御下にあるSH2A遺伝子又はSH2A様遺伝子を含むベクターで、そのような細胞が形質転換される。そのようなベクターは、遺伝子構築物とも呼ばれる。
【0065】
本発明のもう一つの面において、少酸素、即ち低酸素の条件において成長するよう適応した動物を作製するための方法が提供される。トランスジェニック動物を作製する方法は、当分野において周知であり、最も普及している方法は、所望のDNA、この場合SH2Aヌクレオチド配列又はSH2A様ヌクレオチド配列の受精胚の前核への注射を含む。胚は、代理母へと移植され、そこで出生まで発達する。組織特異的プロモーターは、広く利用可能であり、SH2Aヌクレオチド配列又はSH2A様ヌクレオチド配列の発現のため選択されうる。例は、乳腺発現に特異的なヒツジ主要乳清タンパク質β−ラクトグロブリン(BLG)遺伝子(Whitelaw et al, 1991 Transgenic Research 1:3−13)及び筋肉組織に特異的なマウスクレアチンキナーゼプロモーター(Frank et al, 1995 J. Clin. Inves. 96:976−986)を含む。多くの異なる細胞型における発現のためには、メタロチオネイン(MT)プロモーター、コラーゲンプロモーター、及び様々なウイルスプロモーターが使用されうる。トランスジェニック動物は、低酸素条件下での改善された成長を示す。
【0066】
本発明の方法は、植物組織培養、農業、及び園芸における使用に特に好適である。従って、本発明は、植物細胞、花粉、プロトプラスト、外植片、植物部分、又は植物器官を、SH2A遺伝子又はSH2A様遺伝子で形質転換すること、それらからトランスジェニック植物体を再生させること、及び低酸素条件下での成長に関して選択することを含む、少酸素条件下での成長に適応した植物体を作製する方法も提供する。トランスジェニック植物体は、排水性の悪い土壌、及び水分過多な成長条件のような少酸素条件の下での改善された成長を有する。
【0067】
本発明のさらにもう一つの面において、少酸素条件下での改善された生存を有する植物細胞又は植物プロトプラストを作製する方法が提供される。その方法は、トランスジェニック植物体を再生させる工程が実施されないことを除き、少酸素条件下での植物体の生存の改善に関するものと類似している。植物細胞は、SH2A遺伝子又はSH2A遺伝子で安定的に又は一過性に形質転換されうる。そのような形質転換された細胞は、組換え作製タンパク質を含む他のタンパク質産物のさらなる作製のため有用である。
【0068】
本発明のさらにもう一つの面は、少酸素条件下での改善された生存を有する植物体細胞性胚を作製するための方法を提供する。その方法は、トランスジェニックカルスが収集され、体細胞性胚形成の誘導のため使用されることを除き、少酸素条件における植物体の生存の改善に関するものと類似している。該方法は、例えばギネアアブラヤシからの、体細胞性胚の例えばバッチ作製の増加した効率、並びに封入された体細胞性胚の増加した生存率及び発芽率を含む利点を提供する。
【0069】
従って、植物細胞は、低酸素条件に対する耐性を授与する経路が誘導されるよう、少ない酸素供給量の条件におけるSH2A遺伝子又はSH2A様遺伝子の制御された発現のため操作されうる。SH2A又はSH2Aホモログの発現は、これらの組織における低酸素耐性を特異的に改善させるため、根及び水分過多傾向のある他の植物部分へとターゲティングされうる。SH2A遺伝子又はSH2A様遺伝子により授与される形質は、所望により任意の穀類植物及び園芸学上重要な植物へと移植されうる。
【0070】
本明細書において配列番号1〜18として提供されたヌクレオチド配列に加え、本発明の実施において有用な他のSH2A様遺伝子のヌクレオチド配列及び対応するアミノ酸配列が、EMBL及びGenBankのような遺伝子配列データベース上に提供されている。例えば、ダイズの第二のSH2A様遺伝子のヌクレオチド配列は、Genbankデータベースの登録番号AI441185により提供される。キャベツのSH2A様遺伝子のヌクレオチド配列は、Genbankデータベースの登録番号L38235により提供される。トウモロコシ(ジー・メイズ(Zea mays))のSH2A様遺伝子のヌクレオチド配列は、Genbankデータベースの登録番号AI649530により提供される。Genbankデータベースの登録番号AI054437は、メセンブリアンテマ(メセンブリアンテマム・クリスタリナム(Mesembryanthemum crystalllinum))SH2A様遺伝子のヌクレオチド配列を提供する。DDBJデータベースの登録番号AT000213は、リンゴ(マルス・ドメスチカ(Malus domestica))のSH2A様遺伝子のヌクレオチド配列を提供する。パイナップル(ピヌス・タエダ(Pinus taeda))のSH2A様遺伝子のヌクレオチド配列は、登録番号AI813053で、Genbankデータベース上に提供されている。Genbankデータベース上の登録番号AI727947は、ワタの第二のSH2A様遺伝子のヌクレオチド配列を提供する。アラビドプシス・タリアナの4つのSH2A様遺伝子に関する4つの登録番号も、Genbankデータベース上で登録番号N38691、N96935、T76549、及びAC002505として入手可能であり、それぞれ本明細書に記載されたようなATH1遺伝子、ATH2遺伝子、ATH4遺伝子、及びATH3遺伝子と相関している。
【0071】
本発明により、ATH3ノックアウトが生存不可であることにより証明されるように、ATH3は必須遺伝子であることが発見された(実施例16)。ATH3は、必須遺伝子であるため、除草剤スクリーニング法における標的として使用されうる。
【0072】
本発明の一つの面において、植物成長調節因子又は除草剤として使用されうるATH3遺伝子産物の相互作用因子が同定される。そのようなATH3遺伝子産物の相互作用因子を同定するための可能な方法は、BIACore装置(Pharmacia)を使用した、該化合物とATH3遺伝子産物との間の相互作用のリアルタイムの測定を含む。好ましくは、該相互作用因子は、例えば植物成長調節因子又は除草剤として有用であるかもしれない化学物質である。従って、本発明は、前記のような方法により植物成長調節因子又は除草剤として同定された分子の使用にも関する。もう一つの実施態様によると、本発明は、前記の方法の工程及び該工程から得られた化合物を、農業又は植物細胞もしくは組織の培養への適用にとって適当な形態に製剤化する工程を含む、植物成長調節因子又は除草剤の組成物の作製のための方法にも関する。
【0073】
Genbankデータベースの登録番号AI417749は、第二のヒトSH2A様遺伝子のヌクレオチド配列を提供する。ウサギSH2A様遺伝子配列は、DDBJデータベースの登録番号C82769により提供される。ドロソフィラ(Drosophila)由来のSH2A様遺伝子のヌクレオチド配列は、Genbankデータベースの登録番号AI517276により提供される。ケノラブジチス・エレガンス(Caenorhabditis elagens)の3つの異なるSH2A様遺伝子は、EMBLデータベースの登録番号Z68116、EMBLデータベースのU80455、及びEMBLデータベースのU23173により提供される。
【0074】
EMBLデータベースの登録番号Z48613は、サッカロミセス・セレビシエSH2A様遺伝子のヌクレオチド配列を提供する。EMBLデータベースの登録番号AA783142は、エメリセラ・ニヅランス(Emericella nidulans)由来のSH2A様遺伝子のヌクレオチド配列を提供する。EMBLデータベースの登録番号AL033388は、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)SH2A様遺伝子のヌクレオチド配列を提供する。EMBLデータベースの登録番号Z99111は、バチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)SH2A様遺伝子のヌクレオチド配列を提供する。Genbankデータベースの登録番号AE000766は、アキフェックス・エオリクス(Aquifex aeolicus)由来のSH2A様遺伝子のヌクレオチド配列を提供する。SWISS−PROTデータベースの登録番号P28809は、シュードモナス・アエロギノサ(Pseudomonas aeroginosa)由来のSH2A様遺伝子のヌクレオチド配列を提供する。
【0075】
SH2Aコーディング配列及びSH2A様コーディング配列並びにゲノミッククローンは、適切なプローブを用いたcDNAライブラリー又はゲノミックライブラリーのスクリーニングにより入手されうる。例えば、SH2Aゲノミッククローンは、本明細書に提供されたイネSH2A cDNA又はその断片を用いた、ゲノミックライブラリーのスクリーニングにより入手されうる。イネSH2A cDNAに由来する配列を含むオリゴヌクレオチドも、プローブとして使用されうる。例えば、SH2Aのヌクレオチド496〜867をカバーするcDNA断片が使用されうる。
【0076】
植物におけるSH2Aホモログは、約70〜95%の同一アミノ酸を共有している。従って、1個以上の植物SH2A様遺伝子のヌクレオチド配列に基づくオリゴヌクレオチドプローブが、本発明における使用のためのSH2A様遺伝子を単離するための、cDNAライブラリー又はゲノミックライブラリーのスクリーニングにおいて使用するため、設計され合成されうる。例えば、SH2Aタンパク質のアミノ酸99〜118及び133〜161の高度に保存された領域に相当する配列を含むオリゴヌクレオチドが、使用されうる。
【0077】
従って、SH2A遺伝子又は類似遺伝子のコーディング配列、プロモーター、又は3′終結配列に相当する核酸分子も、SH2A遺伝子もしくは類似遺伝子のコーディング配列全体を含む配列番号1〜18のいずれかに示されたような配列、又はSH2A様コーディング配列(断片及びオリゴヌクレオチドを含む)を有する遺伝子をプローブとして使用すること、並びに特定の生物に由来する核酸分子とハイブリダイズさせることにより入手されうる。「ハイブリダイズさせること」とは、そのような核酸分子が、例えば、Sambrook et al(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.に記載されたような、従来のハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることを意味する。
【0078】
オリザ・サティバSH2A cDNA(配列番号1)、又は配列番号1〜18に示されたヌクレオチド配列もしくはそれらの一部とハイブリダイズする核酸分子は、当分野において周知の技術により、例えばcDNAライブラリー又はゲノミックライブラリーから単離されうる。cDNAライブラリー又はゲノミックライブラリーのスクリーニングによる本発明のSH2A遺伝子又はSH2A様遺伝子に相当するゲノミックDNA配列の入手において有用であると考えられる方法は、例えばSambrook et al(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y.、又は広く入手可能な組換えDNA技術に関する多数の実験マニュアルに提供されている。
【0079】
本発明のSH2A遺伝子又は類似遺伝子は、単離されたSH2Aゲノミッククローン又はSH2A様ゲノミッククローンの制限エンドヌクレアーゼ消化より誘導されうる。従って、例えば、イネSH2A遺伝子(配列番号1)の既知のヌクレオチド配列又はアミノ酸配列が、単離された推定SH2A様ゲノミッククローンの核酸配列又は推測アミノ酸配列に対して整列化され、単離されたSH2Aゲノミッククローン又はSH2A様ゲノミッククローンの5′調節配列(即ち、コーディング領域の翻訳開始コドンから上流の配列)、コーディング配列、及び3′調節配列(即ち、コーディング領域の翻訳終止コドンから下流の配列)の位置が決定される。
【0080】
SH2A遺伝子又は類似遺伝子は、例えばin vitro突然変異誘発により、過剰の5′隣接配列、過剰のコーディング配列、及び/又は過剰の3′隣接配列を有するゲノミッククローンから生成させられうる。in vitro突然変異誘発は、便利な制限部位を導入するために役立つ。T7−Gen in vitro突然変異誘発キット(USB、Cleveland、OH)及びQuikChange Site Directed Mutagenesisキット(Stratagene、San Diego、CA)のようなこの適用に特に適した様々な商業的に入手可能なキットが存在する。又は、プロモーター、コーディング配列、及び3′終結配列を含むSH2A遺伝子又は類似遺伝子の直接的な増幅を可能にするためのPCRプライマーが画定されうる。
【0081】
本発明における使用のためのSH2A遺伝子又は類似遺伝子は、必ずしも、遺伝子ライブラリーから単離されなくてもよく、例えば化学合成、DNA複製、転写、及び逆転写を含む任意の様式で生成させられうる。従って、本発明において使用されるように、SH2A遺伝子及びSH2A様遺伝子とは、リボヌクレオチド及びデオキシリボヌクレオチドの両方からなる配列を包含する。
【0082】
本発明において、特にcDNAライブラリー又はゲノミックライブラリーの調製及び探索、単離されたクローンの配列決定、欠失分析の実施、発現ベクターの構築、細胞の形質転換、及び細胞の増殖等において使用される一般的な技術は、当分野において既知であり、そのような技術を説明している実験マニュアルは広く入手可能である。例えば、Sambrook et al,第2版(1989)Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New Yorkを参照のこと。
【0083】
真核生物全般におけるSH2A遺伝子産物又はSH2A様遺伝子産物の強い保存は、進化上保存された機能を示している。従って、任意のSH2A遺伝子又はSH2A様遺伝子が本発明の方法において使用されうる。好ましくは、細胞は、利用可能なもののうち系統学的に最も近いSH2A様遺伝子で形質転換される。例えば、植物細胞、プロトプラスト、外植片、植物部分、及び器官は、好ましくは、オリザ・サティバ由来のSH2A遺伝子(配列番号1)、アラビドプシス・タリアナ由来のATH1(登録番号N38691)、ATH2遺伝子(登録番号N96935)、ATH3遺伝子(登録番号AC002505)、もしくはATH4(登録番号T76549)、又はトマト1(配列番号5)、トマト2(配列番号7)、ダイズ1(配列番号9)、ダイズ2(登録番号AI441185)、ワタ1(配列番号11)、ワタ2(登録番号AI727947)、又はその他の植物より単離されたSH2A様配列及び/又は対応するゲノミック配列のような、植物のSH2A遺伝子又は類似遺伝子で形質転換される。
【0084】
本発明によると、SH2Aコーディング配列又はSH2A様コーディング配列は、cDNA又はゲノミック配列に相当しうる。ゲノミックSH2A遺伝子又はSH2A様遺伝子が使用される場合、遺伝子は所望により1個以上のイントロンを除去又は付加するため改変されうる。さらに、シグナル配列がゲノミック配列から除去及び/又は付加されうる。シグナル配列及び/又は(1個以上の)イントロンは、SH2A cDNA又はSH2A様cDNAにも付加されうる。1個以上のイントロンを含みうるSH2A遺伝子又は類似遺伝子のヌクレオチド配列は、同一のSH2A遺伝子もしくは類似遺伝子に由来するプロモーター、又は他のSH2A遺伝子由来のプロモーターと作動可能に連結されうる。又は、SH2Aヌクレオチド配列又は類似ヌクレオチド配列は、植物細胞において機能するがSH2A遺伝子又は類似遺伝子とは無関係であるプロモーターと作動可能に連結されうる。低酸素状態に応答性の他のプロモーターの例は、例えば、例えばメイズAdh1遺伝子のARE(ARE=嫌気応答因子)6個のリピートを含む合成プロモーターである(Olive et al, 1990)。
【0085】
植物細胞において構成性機能するプロモーターの例は、カリフラワーモザイクウイルス(CaMV)35Sプロモーター、ノパリンシンターゼ(nos)プロモーター、アルファルファモザイクウイルス(AMV)プロモーター、増強されたマンノピン(mannnopine)シンターゼプロモーター(MAC)プロモーターを含む。これらのプロモーターは、よく特徴決定されており、広く入手可能である。SH2遺伝子の発現を制御するために使用されうる誘導可能プロモーターの例は、熱ショックプロモーター、ホウレンソウ硝酸レダクターゼ遺伝子に由来する硝酸塩誘導可能プロモーター(Back et al, 1991 Plant Mol. Biol, 17:9)、ホルモン誘導可能配列(例えば、Yamagushi−Shinzaki, E. et al, 1990 Plant Mol. Biol. 15:905, Kares et al(1990) Plant Mol. Biol. 15:225)、並びにRuBPカルボキシラーゼの小サブユニット及びLHCP遺伝子ファミリーのような光誘導可能プロモーターを含む。誘導可能プロモーターの他の例は、テトラサイクリン誘導可能プロモーター(Gatz et al, 1992 Plant J 2:397)、糖質コルチコイド誘導可能プロモーター(WO9938988)、並びに例えばEP0332104及びWO9008826に記載されているような化学物質により誘導されるプロモーターを含む。
【0086】
組織特異的プロモーター、及び発生的に調節されるプロモーターも、SH2A遺伝子又は類似遺伝子の発現を制御し調節するために使用されうる。例は、花粉特異的プロモーター(Albani et al, 1991 Plant Mol. Biol. 16:501: Twell, et al., 1991 Genes Dev.5: 496; Hamilton D. et al., 1992 Plant Mol. Biol. 18:211)、花特異的プロモーター(van der Meer et al, 1990 Plant Mol. Biol. 15:95)、師部特異的プロモーター(DeWitt, N. D. et al,1991 J. Cell Biochem. Suppl. 15A:69, Yang, N. −S. Et al, 1990 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 87:4144)、根特異的プロモーター(Depater, B. S. et al., 1992 Plant Mol. Biol. 18:161: Vanderzaal, e. et al, 1991 Plant Mol.Biol. 16:983; Oppenheimer, D. G., et al., 1988 Gene 63:87)、及びWO993983に記載されているようなカッパヒドロキシラーゼプロモーターを含む種子特異的プロモーター(Bustos, M. M., et al.,1991 EMBO J. 10:1469; Stayton., M. et al., 1991 Aust. J. Plant Physiol. 18:507)を含む。特に好ましいプロモーターは、SH2A又はSH2Aホモログの発現が、植物の根にターゲティングされるような根特異的プロモーターを含む。SH2A遺伝子又は類似遺伝子の発現の根へのターゲティングは、適応度の低い植物種の浸水耐性の増加において特に有用である。そのような根特異的プロモーターは、トウモロコシ根優先的カチオニックペルオキシダーゼ遺伝子のプロモーター(WO9856921)、及び好気条件から嫌気条件への転換により転写活性が改変されないテンサイ貯蔵根特異的遺伝子のプロモーターを含む。(例えば、米国特許第5,898,096号に記載されているような)当分野において周知の***組織特異的プロモーターも、センス方向又はアンチセンス方向のいずれかのSH2A遺伝子又は類似遺伝子のmRNA転写物を、植物の***組織領域にターゲティングするために使用されうる。
【0087】
本発明は、SH2A遺伝子又はSH2A様遺伝子のプロモーター領域及びターミネーター領域を含む対応する5′及び3′の調節領域も企図する。従って、例えば、SH2Aのプロモーターは、SH2A遺伝子又は類似遺伝子の発現の促進、及び他の異種配列、即ちSH2A遺伝子又はSH2A様遺伝子と無関係なコーディング配列の発現の促進にとって有用である。5′調節領域は、少酸素供給量の条件下で誘導され、従ってそのような条件下での多数の異なるコーディング配列の発現の促進にとって有用である。さらに、SH2A遺伝子又はSH2A様遺伝子のプロモーターは、エチレン又はその前駆体エテフォンへの曝露によりさらに誘導されうる。
【0088】
SH2A遺伝子又はSH2A様遺伝子の調節された発現を提供するため、植物は、cDNA又はゲノミックSH2A配列もしくはSH2A様配列と作動可能に連結された、前記のように、SH2A遺伝子もしくはSH2A様遺伝子のプロモーター又はその他のプロモーターを含みうる植物において機能するプロモーターを含む核酸配列で形質転換される。通常、核酸配列はベクター内に置かれ、遺伝子構築物とも呼ばれる。好ましくは、SH2A遺伝子又はSH2A様遺伝子は、3′調節配列も含む。SH2Aコーディング配列又はSH2A様コーディング配列が、コーディング配列の5′上流に天然に存在するもの以外のプロモーターと作動可能に連結された場合、そのようなヌクレオチド配列はキメラ遺伝子又はキメラ遺伝子構築物とも呼ばれる。同様に、SH2A遺伝子又は類似遺伝子の5′又は3′の調節領域が、対応するSH2A遺伝子もしくは類似遺伝子のもの以外のコーディング配列、又は完全に無関係な遺伝子と作動可能に連結された場合、そのようなヌクレオチド配列も、キメラ遺伝子又はキメラ遺伝子構築物と呼ばれる。
【0089】
植物における遺伝子移入の方法は、当分野において周知である(Gelvin 1998 Current Opin Biotech 9:227)。キメラ遺伝子を含むSH2A遺伝子又は類似遺伝子は、Horsch et al,(1985) Science, 227:1229−1231により記載されたようなリーフディスク(leafdisk)形質転換−再生法により植物へ導入されうる。プロトプラスト培養(Horsch et al,(1984) Science,223:496; DeBlock et al,(1984) EMBO J., 2:2143; Barton et al,(1983) Cell. 32:1033)及び根形質転換(Valvekens et al,1988 Proc Natl Acad Sci USA 85:5536)のような他の形質転換法も、使用可能であり、本発明の範囲内に含まれる。好ましい実施態様において、植物は、Klett et al,(1987) Annu. Rev. Plant Physiol., 38:467に記載されたもののようなアグロバクテリウム由来ベクターで形質転換される。そのような形質転換ベクターは、アグロリスティック(agrolistic)形質転換において使用されるバイナリーベクター、スーパーバイナリー(super−binary)ベクター、コインテグレート(cointegrate)ベクター、及びRi由来ベクター、並びにT−DNA保持ベクターを含む。他の周知の方法も、本発明のキメラ遺伝子を植物細胞へ挿入するために利用可能である。そのような別法は、バイオリスティック(biolistic)法(Klein et al, (1987) Nature. 327:70)、電気穿孔、微量注入、化学的に誘導されたDNA取り込み、及びベクターとしてのウイルス又は花粉の使用を含む。
【0090】
形質転換法に必要である場合、SH2A遺伝子又は類似遺伝子又は本発明のキメラ遺伝子は、植物形質転換ベクター、例えばBevan(1984) Nucleic Acids Res., 12:8711−8721により記載されたバイナリーベクターへと挿入されうる。植物形質転換ベクターは、アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)の天然遺伝子移入系の修飾により誘導されうる。天然系は、形質転換植物へと移入されるT−DNAとして既知の大きいセグメントを含有するラージTi(腫瘍誘導)プラスミドを含む。Tiプラスミドのもう一つのセグメント、vir領域は、T−DNA移入を担当している。T−DNA領域は、末端反復配列に挟まれている。修飾型バイナリーベクターにおいては、腫瘍誘導遺伝子が欠失しており、vir領域の機能が、T−DNA境界配列に挟まれた外来DNAを移入するために利用される。T領域は、抗生物質耐性のための選択可能マーカー、及び移入のための配列を挿入するためのマルチプルクローニング部位も含有している。そのような操作された株は、「無毒化」A.ツメファシエンスとして既知であり、T領域に挟まれた配列の、植物の核ゲノムへの効率的な移入を可能にする。
【0091】
表面滅菌されたリーフディスク及びその他の感受性組織が、何日もの間培養された「無毒化」外来DNA含有A.ツメファシエンスを接種され、次いで抗生物質含有培地へと移される。次いで、適切な抗生物質を含有する培地中での発根の後、形質転換された苗条が選択され、土壌へと移される。トランスジェニック植物体が授粉させられ、これらの植物体から種子が収集され、抗生物質培地上で成長させられる。
【0092】
SH2A遺伝子、SH2A様遺伝子、又は本発明のキメラ遺伝子構築物の発生中の種子、幼実生、及び成熟植物における発現は、免疫学的、組織化学的なmRNA発現又は活性のアッセイによりモニタリングされうる。SH2A様遺伝子の発現をアッセイするには、実施例4に記載されたようなノーザン分析が実施されうる。キメラ遺伝子が、SH2A遺伝子又はSH2A様遺伝子以外の遺伝子と作動可能に連結されたSH2Aプロモーター又はSH2A様プロモーターを含む場合、キメラ遺伝子の発現のアッセイの選択は、異種コーディング配列の性質に依る。例えば、適切なヌクレオチドプローブが利用可能である場合には、ノーザン分析が転写を査定するために使用されうる。異種遺伝子によりコードされたポリペプチドに対する抗体が利用可能である場合には、ウェスタン分析、RIA分析、又はELISA分析、及び免疫組織化学的局在部位決定が、ポリペプチドの産生及び局在部位を査定するために使用されうる。
【0093】
本発明のもう一つの面は、本発明のSH2A遺伝子、SH2A様遺伝子、又はキメラ遺伝子構築物を含有するトランスジェニック植物体、これらの植物体の子孫又は本質的に誘導された変種を提供する。単子葉植物及び双子葉植物の両方が企図される。本明細書において使用されるように、(a)初期の変種から支配的に誘導されるものであり、(b)初期の変種とは区別され、かつ(c)導入されたトランスジーンの発現に関して初期の変種と本質的に一致する場合に、「本質的に誘導された変種」が存在するものとする。
【0094】
植物細胞は、前記の植物形質転換法のうちのいずれかにより、SH2A遺伝子もしくはSH2A様遺伝子、又はキメラ遺伝子構築物により形質転換される。通常、カルス培養物、リーフディスク、外植片、又は完全植物体の形態である形質転換された植物細胞は、(Bechtold et al. (1993) C. R. Acad. Sci. Paris. 316:1194−1199の真空浸潤(vacuum infiltration)法を介して)、当業者に周知の方法(例えば、Horsh et al., 1985)により、完全トランスジェニック植物体へと再生させられる。形質転換植物の子孫及び本質的に誘導された変種はキメラ遺伝子を受け継いでおり、形質転換植物又はそれらの本質的に誘導された変種に由来する花粉、卵、種子、塊茎、又は挿し木は、形質転換された系統又はそれらから本質的に誘導された変種においてトランスジェニック形質を維持するため使用されうる。
【0095】
本発明は、SH2Aタンパク質もしくはSH2A様タンパク質を発現するか、又はSH2Aキメラ遺伝子構築物もしくはSH2A様キメラ遺伝子構築物を含むトランスジェニック植物体に由来する花も包含する。
【0096】
以下の実施例は、本発明をさらに例示するものであり、決して本発明を制限するためのものではない。
【0097】
実施例1
植物材料及びインキュベーション条件
水稲(オリザ・サティバL.、Pin Gaew56)の種子を、International Rice Reserch Institute(Los Banos、The Philippines)より入手した。植物体を、記載されたようにして12〜14週間成長させた(Sauter, 1997)。全ての実験を、成長チャンバー内で、25℃で、連続光(200μE/m−2s−1)の下で実施した。浸水処理のため、記載されたようにして、完全植物体を、水道水が充填された600リットルのプラスチックバレル内に置いた(Lorbiecke and Sauter, 1999)。対照植物体は、同一成長チャンバー内で維持した。ホルモン及び阻害剤の効果の分析は、上方の最も高い成長応答性の節間を含有する切除された茎セグメントを使用して実施した(Raskin and Kende, 1984)。茎セグメントを、示された濃度のジベレリンA3(GA3)もしくはホルモン前駆体エテフォン(2−クロロエタンリン酸(chlorethanephosphoric acid)、E)を含有する水性溶液、又は対照としての水のみ25mlを含む150mlビーカー内でインキュベートした。対照セグメントは、水中で0.5又は3時間インキュベートした。エテフォン処理の場合には、茎セグメントを水中で0.5時間エテフォン添加前は2.5時間、プレインキュベートした。
【0098】
高い湿度を保証するため、ビーカーをプラスチックシリンダーの中に置いた。エチレン作用は、記載されたようにして(Lorbiecke and Sauter, 1999)、気相中50μl/lの濃度の2,5−ノルボルナジエン(ビシクロ〔2.2.1〕ヘプタ−2,5−ジエン、NBD)を使用して阻害した。
【0099】
タンパク質合成を阻害するため、示された濃度のシクロヘキシミドの水性溶液と共に3時間、茎セグメントをインキュベートした。エテフォンをシクロヘキシミドと共に使用する場合には、タンパク質合成の阻害を確実にするため、まずシクロヘキシミド溶液のみの中で茎片を30分間プレインキュベートした後、150μMの濃度になるまで、エテフォンを2.5時間で添加した。
【0100】
実施例2
イネの浸水誘導初期応答遺伝子の分子クローニング及び配列分析
部分的に浸水した水稲植物体の不定根に含まれる浸水誘導遺伝子の同定を目的とした、PCRに基づくサブトラクティブハイブリダイゼーションを使用して、イネから浸水誘導初期応答遺伝子(SH2)を単離した。PCRに基づくサブトラクティブハイブリダイゼーションは、浸水させていない水稲植物体由来の第3節の不定根のmRNAより合成されたcDNAをドライバー(driver)集団として使用し、2時間部分的に浸水させた植物体に由来するものを標的集団として使用し、Buchanan−Wollaston and Ainsworth(1997)により記載された方法に従い実施した。全長cDNAを入手するため、PCRに基づくサブトラクティブハイブリダイゼーションにおいて同定された、ジゴキシゲニンで標識された373bp cDNA断片を使用して、「DIG System User’s Guide」(Boehringer、Mannheim、Germany)に従い、水稲の_ambda−ZAPII−cDNAライブラリーのスクリーニング(Sauter,1995)を実施した。6個の強くハイブリダイズするプラークを、全部で2×105個の組換えファージから回収した。最も長い挿入配列を含有するクローンを、ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems、Weiterstadt、Germany)を用いて、Sangerら(1977)のジデオキシヌクレオチドチェーンターミネーション法により両側から配列決定した。SH2A(gb AF050200)と名付けられた最も長いクローンは、872bpの挿入配列を含有していた。SH2Aのヌクレオチド配列は配列番号1に示されている。ヌクレオチド496〜867の間の配列は、ライブラリースクリーニングに使用されたcDNA断片と同一であった。SH2Aは、597bpのオープンリーディングフレームをコードしている。予測ポリペプチドは199aa長、予測分子量は23.6kDaであった。SH2Aに対応するアミノ酸配列は、配列番号2に示されている。5′非翻訳領域のヌクレオチド30〜33のインフレームの終止コドンは、SH2Aが推定タンパク質の完全なコーディング領域を含んでいることを示した。
【0101】
実施例3
コンピュータ分析
イネESTクローンS2993及びS12166を、National Institute of Agrobiological ResourcesのRice Genome Research Program(日本つくば)より入手し、ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems、Weiterstadt、Germany)を用いて、Sangerら(1977)のジデオキシヌクレオチドチェーンターミネーション法により両側から配列決定した。DNA配列データを分析し、DNasis V5.11プログラム(Hitachi Software Engineering Co., Ltd. 1984, 1991)を使用して、仮想翻訳した。BLAST2.0.3プログラム(Altschul et al., 1997)を用いて、Swiss−Prot.TrEMBL(Bairoch and Apweiler, 1998)、EMBL(Stoesser et al., 1998)、GenBank(Benson et al., 1998)、DDBJ(Tateno et al., 1998)、及びPIR(Barker et al., 1998)のデータベースの実際の公開物においてホモログを検索した。同一遺伝子を表す同定されたESTをin silicoでクローニングし、推定オープンリーディングフレームの完全な配列情報を入手した。配列の整列化は、CLUSTAL X 1.64bプログラム(Thomson et al., 1997)を用いて計算し、GeneDoc2.1(Nicholas and Nicholas, 1997)を使用して手動で編集した。系統学的分析は、CLUSTAL X 1.64b及びTreeview1.31(Page, 1996)を使用して実施した。SH2Aの推定二次構造は、6つの異なる予測プログラム(Ito et al., 1997; White et al., 1994; Rost and Sander、1993, 1994; Gibrat et al.,1987; Chou and Fasman, 1978; Kneller et al., 1990)を使用した計算のコンセンサスより得た。6つの予測プログラムのうち4つが類似の結果を与えた領域のみを考慮の対象とした。
【0102】
データベース相同性検索は、SH2Aと同一の3つのイネEST、及び近縁のSH2A配列ホモログを表す4つのESTクローンの同定をもたらした。SH2Aホモログを表すESTのうち2つ、S2993及びS12166をRice Genome Research Programより入手し、完全に配列決定した。SH2B(gb AF068332)と名付けられたS2993は、980bpの挿入配列及び198アミノ酸をコードするオープンリーディングフレームを含有していた。インフレームの終止コドンが5′非翻訳領域に位置していた。S12166の配列は、SH2Bのオルタナティブなポリアデニル化を示唆するポリAテールに先行する64ヌクレオチド伸長を除き、SH2Bと同一であった。
【0103】
SH2A及びSH2Bのコーディング領域のヌクレオチド配列相同性は84%であった。2クローンの5′及び3′非翻訳領域には、有意な相同性が観察されなかった。さらなる分析は、SH2A及びSH2Bが、高度に保存されたタンパク質の新規クラスのメンバーであることを明らかにした。ヌクレオチドデータベース及びタンパク質データベースのコンピューター検索は、SH2Aの推定オープンリーディングフレームが、他の植物、動物、及び真菌の仮定タンパク質に相当する多数のESTの推定タンパク質及び推定オープンリーディングフレームとの有意な相同性を示すことを示した(図2)。EST及びゲノミック配列の分析は、アラビドプシス・タリアナの4つの転写されたSH2ホモログの同定をもたらした。さらに、他の双子葉植物由来の近縁SH2ホモログのESTが同定された。植物由来SH2ホモログの推定全長配列の比較は、57〜92%のアミノ酸同一性を明らかにした(図3)。ヒトホモログの推定アミノ酸配列は、SH2Aと50%同一、67%類似であった。サッカロミセス・セレビシエ及びシゾサッカロミセス・ポンベの推定タンパク質とSH2Aとのアミノ酸同一性は、それぞれ32%及び33%であった。真核生物配列の大部分が推定核移行シグナル(SH2Aのaa64〜67位のKRXR)を含有していた。SH2A及びSH2Bを含むいくつかの配列は、R(X)2L(X)2,3N破壊ボックスモチーフ(Glotzer et al., 1991)を含有していた。
【0104】
SH2Aを、バチルス・ズブチリス、アキフェックス・エオリクス、及びシュードモナス・アエルギノサ(Pseudomonas aeruginosa)に由来する3つの細菌タンパク質と比較した場合には、比較的弱い相同性が観察された(図2)。mmsR遺伝子によりコードされたシュードモナス・アエルギノサのタンパク質は、メチルマロン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼオペロンに対する正の調節因子であった(Steele et al., 1992)。mmsRは、正の細菌転写調節因子のXylS/AraCファミリーのメンバーとして同定されている。大部分のファミリーメンバーが、リンカーにより非保存領域と接続された、通常C末端に位置する、保存されたDNA結合ドメインを含有している(Gallegos et al., 1997)。SH2AとmmsRとの間の相同領域は、mmsRの非保存ドメインに位置している。さらに、その領域のハイドロパシー分析(Kyte and Doolittle, 1982)は、構造的な類似性を示唆した(図4)。
【0105】
整列化させたSH2関連配列の比較は、SH2Aタンパク質のaa91〜118及び133〜161の最も高度に保存された領域を決定した(図2)。aa133〜161の領域は、高い疎水性残基の含有率、及び推定α−ヘリックス、それに続く2つの推定β−シートにより特徴付けられた。プロリン残基(SH2AのP139)は全ての配列に保存されていた。植物、高等動物、及びヒトに由来するSH2ホモログのN末端領域は極めて類似していたが、ケノラブジチス・エレガンス、真菌、及び細菌の配列においては、この領域の保存度は比較的低かった。これは、利用可能な全長配列から計算された系統学的関係に反映された(図5)。
【0106】
実施例4
SH2A及びSH2Bの浸水応答性発現
浸水依存性遺伝子発現を決定するため、SH2A及びSH2BのmRNA量を、RNAゲルブロットハイブリダイゼーションにより分析した。空気中で成長させた、又は部分的に浸水させた水稲植物体の最幼節間の異なる帯域、及び第3節の不定根からRNAを単離した。従って、最高節間の組織片、介在***組織を含有する第2節の0〜5mm上、伸長域を含有する第2節の5〜15mm上、分化域を含有する第2節の15〜30mm上を使用した(Lorbiecke and Sauter, 1997)。第3節の不定根は、記載のようにして単離された(Lorbiecke and Sauter, 1999)。組織を液体窒素中で急速凍結させ、RNA抽出まで−70℃で保存した。TRIzol試薬(Gibco BRL)を用いて全RNAを単離し、記載されたようにして、4M LiClにより沈殿させた(Puissant and Houdebine, 1990, Lorbiecke and Sauter, 1999)。RNA分離及びノーザンブロットハイブリダイゼーションを、以前に記載されたようにして、実施した(Lorbiecke and Sauter, 1998)。RNAブロット分析のため、全RNA20μgを、6%ホルムアルデヒドを含有する1%(w/v)アガロースゲル上での電気泳動により分離した。Lorbiecke and Sauter (1998)に従い、RNAをナイロン膜(Hybond N+; Amersham、Braunschweig、Germany)へブロットした。ハイブリダイゼーションのため、SH2A(nt496〜867)及びSH2B(nt513〜980)の3′領域をカバーする遺伝子特異的cDNA断片を、「Rediprime Labelling Kit」(Amersham、Braunschweig、Germany)を使用して32Pでランダムプライム標識した。ハイブリダイゼーションを、1%SDS、1M NaCl、10%(w/v)デキストラン硫酸、及び熱変性サケ***DNAの中で68℃で一夜実施した。ブロットを68℃で1×SSC(0.15M NaCl、15mM Na−クエン酸、pH7.0)で1回、68℃で1×SSC、1%(w/v)SDSで1回、それぞれ10分間洗浄した(Sauter, 1997)。
【0107】
分析された組織において、SH2A発現を一過性誘導した。最も強い誘導は、最幼節間の介在***組織(IM)及び伸長域(EZ)に観察された(図6A)。分化域及び不定根には比較的少ない転写物が蓄積した。SH2AのmRNA量は、介在***組織においては0〜1時間の間、伸長域においては1〜2時間の間に増加した。最大mRNA量は、いずれの組織においても浸水後2時間で起こった(図6B)。浸水後2〜6時間の間に、SH2A mRNA転写物は対照レベルにまで低下した。対照的に、SH2Bの遺伝子特異的プローブを使用したノーザンブロットは、分析された時点において、いずれの組織においてもmRNA量の有意な改変を明らかにせず(図6A)、この遺伝子の構成性発現が示された。
【0108】
浸水誘導されたイネ植物体において、SH2A発現と、中心的嫌気応答タンパク質ピルビン酸デカルボキシラーゼ2の発現とは、密接に類似している(図6a及び6b)。節間におけるピルビン酸デカルボキシラーゼ2遺伝子発現は、SH2A遺伝子発現と同様にエチレンにより調節される。しかしながら、SH2Aとは異なり、ピルビン酸デカルボキシラーゼ2は、初期応答遺伝子ではない。ピルビン酸デカルボキシラーゼ2発現は、タンパク質合成に依存している(実施例6、図9)。前述の結果は、SH2A遺伝子産物が、ピルビン酸デカルボキシラーゼを含む嫌気応答タンパク質の調節に関与しており、従って、浸水又は冠水に対する耐性の制御のための要素であることを示している。
【0109】
実施例5
SH2A及びSH2Bのゲノム構造
記載されたようにして(Dellaporta et al., 1983)、11週齢の水稲植物体の最幼葉からゲノムDNAを単離し、BamHI、ClaI、HindIII、KpnI、又はPstIで5〜6時間消化し、1%(w/v)アガロースゲル上での電気泳動により分離した。DNAをナイロン膜(Hybond N+; Amersham、Braunschweig、Germany)へ毛細管ブロットし、ノーザン分析(実施例4)に関して記載されたような高ストリンジェンシー条件下で遺伝子特異的プローブとハイブリダイズさせた。SH2A関連配列を検出するため、SH2A cDNAをプローブとして使用して、比較的低ストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションを実施した。低ストリンジェンシー条件下でのサザン分析は、ハイブリダイゼーション工程及び洗浄工程を68℃ではなく55℃で実施したことを除き、ノーザン分析(実施例4)に関して記載されたようにして実施した。SH2関連配列を検出するため、SH2A−cDNAをプローブとして使用して、比較的低ストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションを実施した。SH2Aの遺伝子特異的プローブを用いたイネゲノミックDNAのサザンブロット分析は、高ストリンジェンシーでハイブリダイズさせ洗浄した場合、5つの異なる酵素で、単一のバンドを検出した(図1a)。SH2Bの遺伝子特異的プローブは、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズさせた場合、4つの異なる酵素で単一のバンド、PstI消化されたDNAで2つのバンドを検出した(図1b)。cDNA配列内にはPstI制限部位が存在せず、このことは、SH2B遺伝子内の少なくとも1個のイントロンの存在を示している。これらの結果は、SH2A及びSH2Bが、イネゲノム内の単一コピー遺伝子であることを示している。低ストリンジェンシー条件下で同一ブロットを用いた完全SH2A cDNAを使用したサザン分析においては、ほぼ全ての可視バンドがSH2A又はSH2B遺伝子特異的プローブにより検出されたシグナルに起因しており、イネにはさらなる近縁SH2ホモログは存在しないことが示された(図1)。
【0110】
実施例6
SH2A遺伝子発現の誘導
SH2A遺伝子のホルモン依存性発現を分析するため、最幼節間を含有する単離された茎セグメントを、異なるホルモン溶液又は阻害剤溶液で2.5時間処理した。介在***組織及び伸長域を含有する領域から全RNAを単離し、SH2A転写物量に関して分析した(図8a)。対照において、SH2A発現はわずかに誘導されていたが、それは植物体からの組織の切除によるものである可能性が高い。
【0111】
150μMエテフォン(2−クロロエタンリン酸)による茎セグメントの処理は、SH2A転写物レベルの強い増加をもたらした。(気相中50μl/lの濃度で適用された)エチレン作用の阻害剤ノルボルナジエンと組み合わせてエテフォンを使用した場合、SH2A転写物レベルは、対照レベルにまで減少した(図7)。これらの結果は、SH2A遺伝子がエチレンにより調節されることを示している。50μM GA3とのインキュベーションは、対照と比較した場合、2.5時間後に、増加したSH2A転写物レベルを引き起こさなかった。GA3とエテフォンとの組み合わせ、又はGAとノルボルナジエンとの組み合わせは、GA3が存在しない場合と同様の結果を与えた(図7)。
【0112】
エテフォン依存性SH2A発現のパターンを決定するため、150μMエテフォンと共にインキュベートされた茎セグメントの***組織及び伸長域から、1時間間隔で、全RNAを単離した。ノーザンブロット分析は、両組織において、0〜2時間の間のSH2A mRNAの増加を示した(図8A)。最大mRNA量は、2時間のインキュベーションの後に検出された。2〜6時間の間、mRNAレベルは対照レベルにまで低下した。エテフォンで処理された単離された茎セグメントと、部分的に浸水させた完全植物体(図6B)との比較は、介在***組織及び伸長域それぞれにおける類似の一過性SH2A発現パターンを明らかにした。
【0113】
用量依存的なSH2A遺伝子発現の応答を決定するため、単離された茎セグメントを異なるエテフォン濃度と共に2.5時間インキュベートした。使用されたエテフォン濃度は、0.015、0.15、1.5、15、及び150μMであった。介在***組織より単離されたRNAのノーザンブロット分析は、SH2A転写物蓄積が、わずか1.5uMのエテフォンにより誘導されることを示した(図8B)。SH2A遺伝子発現の誘導は、既知のタンパク質合成阻害剤シクロヘキシミド(CHX)の存在下で起こった。この観察は、SH2A遺伝子が事前のde novoタンパク質合成なしに誘導されることを示している。CHXのみによる茎セグメントの処理は、SH2A転写物の蓄積を引き起こした(図9A)。この現象は、初期応答遺伝子で高頻度に観察されており、スーパーインダクションと呼ばれている。用量応答試験は、20μg/ml以上というシクロヘキシミド濃度が遺伝子誘導に必要であることを明らかにした。そのような濃度は、タンパク質合成を効率的に遮断することが報告されており、それは、SH2A遺伝子発現が不安定なタンパク質により通常は抑制されていることを示している可能性がある(図9B)。
【0114】
(i)SH2A遺伝子発現の時間経過(図6A及び6B):(ii)ジベレリンではなくエチレンによる転写の調節(図7):(iii)幼組織における遺伝子誘導の位置:並びに(iv)初期応答調節因子としてのSH2Aの同定:という前述の所見は、SH2Aタンパク質が、ジベレリンホメオスタシスを調節し、イネ茎における改変されたジベレリンレベルをもたらすシグナル成分であることを示している。ジベレリンレベルに対する効果を通して、SH2Aは、イネの成長応答を改変する。
【0115】
実施例7
アラビドプシスSH2A様遺伝子のホルモン調節型遺伝子発現の証拠
アラビドプシス・タリアナ由来の3つのSH2A様遺伝子、EMBLデータベースからのATH1(登録番号Z97336)、ATH2遺伝子(登録番号Z97336)、及びGenBankデータベースからのATH3遺伝子(登録番号AC002505)のプロモーター領域の配列分析は、シグナル依存性遺伝子調節への関与が他の遺伝子において示されているいくつかのシス作用性因子を明らかにした(Dolferus et al, 1994, Gubler and Jacobsen 1992, Gubler et al, 1995, Manjunath and Sachs 1997, Ohme−Takagi and Shinshi 1995, Olive et al, 1990)。アラビドプシスにおいて同定された因子は、嫌気生活、エチレン,GA、又はABAに対する応答に関与している。アラビドプシス・タリアナ由来の3つのSH2A様遺伝子のプロモーター領域の推定シス因子の概略図を図10に図示する。
【0116】
実施例8
低酸素条件下での酵母(サッカロミセス・セレビシエ)及び動物細胞におけるSH2A様遺伝子発現の分析
酵母細胞を、酸素調節インキュベーターの中で、正常酸素条件(21%O2、5%CO2、75%N2)及び異なる酸素濃度の下で最小培地中で30℃で増殖させた。
【0117】
動物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞を、30℃の加湿インキュベーター内で、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド(Gibco、NY)及び10%ウシ胎仔血清が補足された最小必須アルファ培地中で維持した。異なる酸素濃度を、それと釣り合うN2と共に発生させる酸素調節インキュベーターを、低酸素(10%、5%、及び2%O2)条件下で細胞を培養するために使用した。
【0118】
正常酸素条件及び低酸素条件の下での48時間のインキュベーションの後、酵母細胞又はCHO細胞を収集し、全RNAを単離した。異なる酸素濃度における各SH2A様遺伝子の発現パターンを、各SH2A様mRNAに対する標識プローブを使用したノーザンブロッティング、又は定量的RT−PCRにより分析した。
【0119】
実施例9
遺伝子中断及び過剰発現による酵母(サッカロミセス・セレビシエ)SH2A様遺伝子発現の調整;低酸素耐性の分析
SH2A様遺伝子のノックアウトを有する変異型酵母を得るため、URA4のような栄養要求マーカーを、酵母SH2A様遺伝子の2つの断片の間にクローニングした。該断片は、2セットのプライマー(1セットはSH2A様遺伝子の5′部分を増幅するためのもの、1セットはSH2A様遺伝子の3′部分を増幅するためのもの)を使用したPCRにより得られた。得られたURA4により中断されたSH2A様遺伝子断片を使用して、ウラシル栄養要求性酵母株を形質転換した。安定なura+形質転換体、即ち中断されたSH2A様遺伝子断片が内因性遺伝子と相同組み換えされているものを選択し、酵母SH2A遺伝子ホモログの中断を確認するためPCRにより分析した。
【0120】
続いて、選択された酵母株を、実施例8に記載されたようなインキュベーション条件下での、対応する野生型酵母の増殖速度に対する相対増殖速度を決定することにより、低酸素耐性に関して分析した。ノックアウトされた酵母SH2A様遺伝子の相補を分析するためには、野生型酵母よりも低酸素耐性が低い変異体を、異なる起源のSH2A様遺伝子によりさらに形質転換することができる。
【0121】
酵母SH2A遺伝子ホモログの過剰発現のため、該遺伝子のコーディング領域を、PGKプロモーターのような構成性プロモーター、又はADH2プロモーターのような誘導可能プロモーターと作動可能に連結した。得られたキメラ遺伝子を2μ−プラスミドのような自律複製性プラスミドへと導入した。キメラSH2A遺伝子を保持するプラスミドを酵母へ形質転換し、適切な選択を施した。続いて、形質転換された酵母株を、必要であればキメラSH2A遺伝子の発現の誘導の後、実施例8に記載されたようなインキュベーション条件下で、対応する野生型酵母の増殖速度に対する相対増殖速度を決定することにより、増加した低酸素耐性に関して分析した。
【0122】
実施例10
アラビドプシス・タリアナSH2A相同遺伝子発現の調整:センス方向及びアンチセンス方向のA.タリアナSH2A遺伝子ホモログを(過剰)発現するトランスジェニック植物体
アグロバクテリウム・ツメファシエンスを使用して、花浸漬(floral dip)形質転換法(Clough and Bent 1998, Plant J. 16:735−743)又は別の適当な形質転換法により、A.タリアナを形質転換した。A.ツメファシエンスが含有していた植物形質転換ベクターは、
a)センスSH2A遺伝子ホモログの過剰発現の場合:カナマイシン耐性マーカーのような植物選択可能マーカー、及びSH2AのためのCaMV 35Sのような構成性プロモーター、又は***組織特異的発現を得るための組織特異的もしくは組織選択的プロモーターと作動可能に連結されたA.タリアナSH2A遺伝子ホモログ;又は
b)SH2A遺伝子ホモログのアンチセンス抑制の場合:カナマイシン耐性マーカーのような植物選択可能マーカー、及びSH2Aのための構成性、組織特異的、又は組織選択的プロモーター、好ましくは***組織特異的プロモーターとアンチセンス方向で連結されたA.タリアナSH2A遺伝子ホモログ又はその一部:のいずれかを保持しているT−DNAを保有していた。
【0123】
選択された形質転換されたA.タリアナ植物体を開花期に自家受粉させ、ホモ接合性子孫を同定し、実施例15に記載のようにしてさらに分析した。
【0124】
実施例11
トランスジェニックイネにおけるSH2A遺伝子及びSH2B遺伝子の過剰発現及び発現抑制
アグロバクテリウム・ツメファシエンスを使用して、O.サチバの未熟胚に由来する胚形成性カルスを形質転換した(Hiei et al, 1994, Plant J. 6:271−282)。A.ツメファシエンスが含有していた植物形質転換ベクターは、
a)センスのSH2A遺伝子又はSH2B遺伝子の過剰発現の場合:nptII遺伝子のような植物選択可能マーカー、並びにSH2Aのための構成性プロモーター、又は好ましくは***組織特異的プロモーターと作動可能に連結されたイネSH2A遺伝子及びSH2B遺伝子;又は
b)SH2A遺伝子及びSH2B遺伝子の発現抑制の場合:nptII遺伝子のような植物選択可能マーカー、及び構成性プロモーター、又はSH2A遺伝子の場合には好ましくは***組織選択的プロモーターとセンス方向及びアンチセンス方向で連結されたイネSH2A遺伝子及びSH2B遺伝子もしくはその一部:のいずれかを保持しているT−DNAを保有していた。
【0125】
構成プロモーターを使用して、全ての組織での遺伝子発現もしくは抑制を得ることもできるし、又は組織選択的もしくは組織特異的プロモーターを使用して、SH2Aの場合であれば***組織のような、ある組織のみにおける遺伝子発現もしくは抑制を得ることもできる。
【0126】
選択された形質転換されたO.サチバ植物体を自家受粉させ、表現型研究のための単一遺伝子座形質転換体を同定した(実施例15参照)。
【0127】
実施例12
調整されたSH2A様遺伝子発現を示すA.タリアナ植物体の低酸素耐性の分析
実施例10において得られた調整されたSH2A遺伝子ホモログ発現を有するホモ接合性A.タリアナ植物体を、水分過多耐性を査定することにより、低酸素耐性に関して分析した。水分過多耐性に関するパラメータは、
a)植物生存率、
b)生存植物体のサイズ、
c)生存植物体の開花時間
である。
【0128】
実施例13
動物細胞におけるSH2A様遺伝子の過剰発現及び低酸素耐性の分析
ヒト又はマウスのSH2A遺伝子ホモログのコーディング配列を、高レベル発現のためのサイトメガロウイルス(CMV)エンハンサー−プロモーターを含有し、かつトランスフェクトされた細胞の選択のためのneo遺伝子を含有するpcDNA3.1(InVitrogen、CA、USA)のような選択可能哺乳動物発現ベクターにクローニングした。得られたベクターを、製造業者のプロトコルに従い、Lipofectamine(Life Technologies、MD、USA)の使用によりCHO細胞(培養維持に関しては実施性8参照)へとトランスフェクトした。ネオマイシン耐性コロニーを選出し、24穴プレート(Nunc、Denmark)に5×104個の密度で播き、正常酸素条件(実施例8参照)の下で12時間培養し、その後、培地を新しいものに交換した。未形質転換細胞を、同一条件下で同時に接種しインキュベートした。
【0129】
培地を新しいものに交換した後、SH2A遺伝子ホモログを発現する形質転換細胞及び未形質転換細胞を含むプレートを、低酸素条件(2%酸素)下で異なる時間(48時間、72時間、及び96時間)インキュベートした。トリパンブルー排除法及び/又はニュートラルレッド取り込み法を使用した生死判別染色により、異なるインキュベーション時間の後、異なる細胞の生存率を査定した。死細胞を、トリパンブルー(PBS中400mg/L)との10minのインキュベーションにより染色し、顕微鏡により観察した。生存細胞は、ニュートラルレッド(PBS中56mg/L)との2時間のインキュベーションにより染色した。PBSによる洗浄の後、酸性EtOH(100mM クエン酸ナトリウムpH4、50%EtOH)中で細胞を溶解させ、生存細胞により取り込まれた色素の放出を540nmにおける吸光度測定により定量した。
【0130】
実施例14
SH2A様遺伝子発現の調整による嫌気応答遺伝子発現の調整
SH2A様遺伝子の調整された発現を示す、低酸素条件下でインキュベートされた酵母及び浸水したA.タリアナ植物体(実施例9〜10参照)を、嫌気応答タンパク質ピルビン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子の発現パターンに関して、低酸素条件下でインキュベートされた野生型酵母及び浸水した野生型A.タリアナ植物体とそれぞれ比較した。
【0131】
実施例15
調整されたSH2A遺伝子及びSH2B遺伝子又はホモログの遺伝子発現を示すO.サチバ及びA.タリアナトランスジェニック植物体の表現型分析
実施例10及び11において得られた、調整されたSH2A遺伝子もしくはSH2B遺伝子、又はホモログの発現を有するトランスジェニックO.サチバ及びA.タリアナ植物体を、水分過多耐性を査定することにより、低酸素耐性に関して分析した。水分過多耐性に関するパラメータは、
a)植物生存率、
b)生存植物体のサイズ、
c)生存植物体の開花時間
である。
【0132】
SH2A遺伝子もしくはSH2B遺伝子、又はホモログで形質転換された植物体においては、非トランスジェニック対照と比較して、増強された生存及び増加した生物量が観察された。
【0133】
さらに、一般的な収量関連パラメータも、正常増殖条件下で分析した。
【0134】
実施例16
A.タリアナのATH3遺伝子におけるトランスポゾン挿入変異体の同定
A.タリアナのEn−1トランスポゾン挿入変異体のコレクション(ZIGIA collection、Max−Planck−Institute fuer zuechtungsforschung、Cologne、Germany)を、PCRに基づく手法により、ATH3遺伝子への挿入に関してスクリーニングし、4つの独立した系統を同定した。これらの4つの系統からホモ接合性の挿入変異体を作製する試みは、失敗した。これらの結果は、ATH3ノックアウトが生存不可であり、従ってATH3がA.タリアナの必須遺伝子であることを示している。A.タリアナ遺伝子ATH1、ATH2、及びATH4についても、類似のスクリーニングを実施した。
【表2】
【図面の簡単な説明】
【図1A】
水稲におけるSH2Aのサザンブロット分析である。ゲノミックDNAを、HindIII(H)、BamHI(B)、ClaI(C)、PstI(P)、又はKpnI(K)で消化し、ブロットし、ストリンジェントな条件下でSH2Aの3′特異的プローブで探索した。分子長標準の位置が左に示されている。
【図1B】
水稲におけるSH2Bのサザンブロット分析である。図1Aのブロットを洗浄し、ストリンジェントな条件下でSH2Bの3′特異的プローブで探索した。
【図1C】
水稲におけるSH2関連配列のサザンブロット分析である。SH2関連配列のコピー数を決定するため、図1A及び1Bに示された同一のブロットを洗浄し、次いで低ストリンジェンシー条件下でSH2Aの全長cDNAで探索した。
【図2A】
植物、動物、真菌、及び細菌のSH2ホモログの推測アミノ酸配列のアラインメントである。50%以上の配列で保存されているアミノ酸には、影が付いている。ダッシュは、アラインメントを最適化するために挿入された間隙を示す。分析された配列全てにおいて保存されていたプロリン残基は、〔*〕により示されている。不完全な配列は、〔#〕により示されている。シュードモナス・アエルギノサのmmsRタンパク質については、aa1〜164のみが示されている。〔+〕により示された配列については、同定されたESTが、重複配列を含まないSH2ホモログの様々な領域を表している。
【図2B】
植物、動物、真菌、及び細菌のSH2ホモログの推測アミノ酸配列のアラインメントである。50%以上の配列で保存されているアミノ酸には、影が付いている。ダッシュは、アラインメントを最適化するために挿入された間隙を示す。分析された配列全てにおいて保存されていたプロリン残基は、〔*〕により示されている。不完全な配列は、〔#〕により示されている。シュードモナス・アエルギノサのmmsRタンパク質については、aa1〜164のみが示されている。〔+〕により示された配列については、同定されたESTが、重複配列を含まないSH2ホモログの様々な領域を表している。
【図3】
SH2ホモログアミノ酸配列の対間の関係を示す表である。各配列を、genedocプログラムを使用して、他の全ての配列と比較した。最初の数字は、2つの配列間の同一残基の割合(%)を記載している。括弧内の数字は、2つの配列間の類似置換及び保存的置換の割合(%)を示している。影付きの左上の4分の1は、50%以上の配列同一性を有する配列を示している。
【図4】
SH2Aとシュードモナス・アエルギノサのmmsRタンパク質との間の相同領域内のアミノ酸配列の位置、ハイドロパシー分析、及び整列化を図示している。推定核移行シグナル〔NLS〕及び推定破壊ボックスモチーフの位置が、SH2Aタンパク質の概略図中に示されている。
【図5】
アミノ酸配列の比較に基づき、推定全長SH2ホモログのアラインメントから、ClustalXプログラムにより作製された樹状図である。
【図6A】
部分的に浸水した水稲植物体の組織におけるSH2A、SH2B、及びピルビン酸デカルボキシラーゼ2のノーザンブロット分析である。水稲植物体を、最大18時間浸水させた。示された時点において、不定根、介在***組織、伸長域、及び分化域から全RNAを単離し、SH2A、SH2B、及びピルビン酸デカルボキシラーゼ2の発現に関して分析した。
【図6B】
部分的に浸水した水稲植物体の組織における水稲植物SH2A及びピルビン酸デカルボキシラーゼ2の遺伝子発現のノーザンブロット分析である。植物体を最大6時間浸水させ、介在***組織及び伸長域におけるSH2A及びピルビン酸デカルボキシラーゼ2の発現を分析した。
【図7】
エテフォン(E)、GA3(GA)、又はNBDとのインキュベーションの後の、最幼節間を含有する単離された茎セグメントの介在***組織及び伸長域におけるSH2A及びピルビン酸デカルボキシラーゼ2の遺伝子発現のノーザンブロット分析である。全RNAの単離の後、介在***組織及び伸長域におけるSH2A及びピルビン酸デカルボキシラーゼ2の発現を分析した。臭化エチジウムにより染色されたRNAゲルが、ローティング対照として示されている。
【図8A】
150μMエテフォンで最大6時間処理された単離された茎セグメントの成長域におけるSH2A及びピルビン酸デカルボキシラーゼ2の遺伝子発現のノーザンブロット分析である。インキュベートされていない茎(C0)又は水中で6時間インキュベートされた茎(C6)を、対照として使用した。示された時点で全RNAを単離し、SH2A及びピルビン酸デカルボキシラーゼ2の遺伝子発現を分析した。
【図8B】
異なる濃度のエテフォンで処理された単離された茎セグメントの介在***組織におけるSH2A及びピルビン酸デカルボキシラーゼ2の遺伝子発現のノーザンブロット分析である。茎セグメントを、エテフォンを含まないか(C)、又は示された濃度のエテフォンを含むビーカー内で、2.5時間インキュベートした。全RNAを単離し、SH2A及びピルビン酸デカルボキシラーゼ2の遺伝子発現を分析した。
【図9A】
タンパク質合成阻害剤シクロヘキシミド(CHX)の存在下で、150μMエテフォンで処理された、又は処理されていない単離された茎セグメントの介在***組織におけるSH2A及びピルビン酸デカルボキシラーゼ2の遺伝子発現のノーザンブロット分析である。茎セグメントを、示された濃度のCHX水性溶液と共に3時間インキュベートした。
【図9B】
異なる濃度のCHXで3時間処理された単離された茎セグメントの介在***組織におけるSH2A及びピルビン酸デカルボキシラーゼ2の遺伝子発現のノーザンブロット分析である。対照セグメント(C)は、水中で3時間インキュベートした。
【図10】
アラビドプシス・タリアナ由来の3つのSH2A様遺伝子のプロモーター領域内のシス因子の概略図である。
本願は、2000年2月18日に米国仮出願第06/183,572号として最初に出願された。
【0002】
発明の背景
水稲(Deepwater rice)(オリザ・サティバ(Oryza sativa)L.)植物体は、長期にわたる部分的な浸水に耐えるよう特に適応している。少酸素(低酸素)条件への適応は、発酵経路を触媒するタンパク質をコードするものを含む、嫌気遺伝子の誘導を含む。いくつかの半水生植物において見出されたもう一つの適応は、上昇する水面よりも上にいくつかの葉を維持することにより、植物体の生存を可能にする、最も若い幼節間の急速な成長である。加速した節間の成長は、増加した細胞***活性及び増強された細胞伸長の結果であり、これらは文献においてよく特徴決定されている(Kende, 1987; Kende et al., 1993; Lorbiecke and Sauter, 1998; Kende et al., 1998)。成長応答は、環境シグナルにより誘導され、いくつかの植物ホルモンの相互作用により媒介される。
【0003】
植物体の浸水は、周囲の水による物理的な包囲及び増強された生合成による植物組織内エチレン濃度の増加、をもたらす(Stuenzi and Kende, 1989; Raskin and Kende, 1985)。エチレンは、イネ節間における、成長促進ホルモンジベレリン酸(GA)と、GA作用の強力なアンタゴニストであるシス−アブシジン酸(ABA)との比率を改変させる。ABAレベルの減少及びGAレベルの増加は、存在するGAに対する組織の増加した応答性をもたらす。
【0004】
GAは、節間における最終的な成長促進ホルモンである(Raskin and Kende, 1984)。エチレン適用及び浸水は、いずれも、節間における内因性ABAレベルを3時間以内に75%減少させる(Hoffmann−Benning and Kende, 1992; Azuma et al., 1995)。同時に、内因性GA1レベルが4倍に増加する。浸水による成長誘導の遅滞期は、3〜4時間である(Hoffmann−Benning and Kende, 1992)。
【0005】
イネにおいては単一の遺伝子座が浸水耐性を担当していることが、遺伝学的に示されている(Setter et al., 1997)。この遺伝子のクローニング及び同定は、従来成し遂げられていない。本発明は、異なる生物に由来するSH2遺伝子及び対応するSH2タンパク質を提供する。問題のSH2遺伝子は、嫌気生活により誘導されるSH2タンパク質の誘導を担当しており、従って、低酸素条件への適応における最も基本的なメカニズムのうちの一つを担当している。細胞内のSH2の発現及び/又は活性の調整は、少酸素条件における細胞の増殖を可能にする。
【0006】
発明の概要
本発明は、SH2A遺伝子又はSH2A様遺伝子のヌクレオチド配列〔該ヌクレオチド配列は、該トランスジェニック植物体又は植物細胞のゲノムと異種である〕を含むトランスジェニック植物体、植物部分、又は植物細胞を提供する。
【0007】
SH2A遺伝子又はSH2A様遺伝子のヌクレオチド配列〔該ヌクレオチド配列は、組換えDNA手段により植物体、植物部分、又は植物細胞へ導入されている〕を含むトランスジェニック植物体又は植物細胞も、提供される。そのような植物体は、内因性SH2A様遺伝子を有していてもよく、組換えDNA方法論を使用して、付加的な内因性SH2A様遺伝子が植物体、植物部分、又は植物細胞へ追加されてもよい。
【0008】
SH2Aタンパク質又はSH2A様タンパク質〔該SH2Aタンパク質又はSH2A様タンパク質は、植物体、植物部分、又は植物細胞と異種である〕を含むトランスジェニック植物体、植物部分、又は植物細胞も、提供される。
【0009】
SH2A遺伝子又はSH2A様遺伝子のヌクレオチド配列〔該ヌクレオチド配列は、該宿主細胞のゲノムと異種であるか、又は組換えDNA手段により該宿主細胞へと導入されている〕を含む宿主細胞。宿主細胞の例は、細菌、酵母、真菌、昆虫、植物、又は動物の細胞を含む。宿主細胞内で、SH2A遺伝子又はSH2A様遺伝子のヌクレオチド配列は、該ヌクレオチド配列の発現を指図する調節領域に対しセンス方向又はアンチセンス方向で存在しうる。
【0010】
該培養細胞におけるSH2Aタンパク質又はSH2A様タンパク質のレベル又は活性を調整することを含む、低酸素条件下での培養細胞の増殖又は生存を調整するための方法も、提供される。さらに本発明は、該培養細胞におけるSH2Aタンパク質又はSH2A様タンパク質のレベル又は活性を調整することにより、培養細胞の成長応答を改変するための方法を、提供する。培養細胞は、細菌、酵母、真菌、植物、哺乳動物、又は昆虫の細胞を含みうる。
【0011】
さらに本発明は、該生物の該細胞、組織、又は器官におけるSH2Aタンパク質又はSH2A様タンパク質のレベル又は活性を調整することを含む、生物の細胞、組織、又は器官の成長応答を改変するための方法を、提供する。該植物の該細胞、組織、又は器官におけるSH2Aタンパク質又はSH2A様タンパク質のレベル又は活性を調整することを含む、植物の細胞、組織、又は器官の成長応答を改変するための方法も、提供される。例えば、SH2Aタンパク質又はSH2A様タンパク質のレベルは、該SH2Aタンパク質又はSH2A様タンパク質のヌクレオチド配列の転写を増加させることにより調整されうる。植物において、転写の増加は、植物の細胞、組織、又は器官をエテフォン又はエチレンに曝すことにより誘導される。
【0012】
植物細胞、花粉、プロトプラスト、外植片、植物部分、又は植物器官のうちの少なくとも一つを、SH2A遺伝子又は類似遺伝子のコーディング配列で形質転換すること、及びそれらから植物体を再生させることを含む、低酸素条件における成長に適応した植物体を作製するための方法も、提供される。植物細胞、花粉、プロトプラスト、外植片、植物部分、又は植物器官のうちの少なくとも一つを、SH2A遺伝子又は類似遺伝子のコーディング配列で形質転換すること、及びそれらから植物体を再生させることを含む、少酸素条件における植物体の生存を改良するための方法も、提供される。
【0013】
植物細胞、花粉、プロトプラスト、外植片、植物部分、又は植物器官のうちの少なくとも一つを、SH2A遺伝子又は類似遺伝子のコーディング配列で形質転換すること、及びそれらから植物体を再生させることを含む、植物体の湛水害耐性(water logging tolerance)を改良するための方法も、提供される。
【0014】
本発明は、植物細胞、プロトプラスト、外植片、植物部分、又は植物器官におけるジベレリン生合成を誘導するための方法も提供する。その方法は、該植物細胞又はプロトプラストにおけるSH2Aタンパク質又はSH2A様タンパク質のレベル又は活性を調整することを含む。同様に、該植物の細胞におけるSH2Aタンパク質又はSH2A様タンパク質のレベル又は活性を調整することを含む、植物におけるジベレリン生合成を誘導するための方法が、本発明により提供される。
【0015】
内部のSH2Aタンパク質又はSH2A様タンパク質のレベル又は活性を調整することを含む、植物細胞、プロトプラスト、外植片、植物部分、又は植物器官における嫌気応答タンパク質を調節する方法も、提供される。例えば、嫌気応答タンパク質ピルビン酸デカルボキシラーゼ2が、このようにして調節されうる。
【0016】
本発明は、該ヌクレオチド配列の発現を指図するプロモーター配列と作動可能に連結されたSH2A遺伝子又はSH2A様遺伝子のヌクレオチド配列を含む遺伝子構築物も提供する。SH2A遺伝子又はSH2A様遺伝子は、例えば、cDNA又はゲノム配列でありうる。遺伝子構築物は、プロモーター配列に対してセンス方向又はアンチセンス方向で内部に含まれているSH2A遺伝子又はSH2A様遺伝子のヌクレオチド配列を有しうる。SH2A遺伝子又はSH2A様遺伝子の発現のサイレンシング(silencing)を目的とする遺伝子構築物は、プロモーター配列に対してセンス方向及び/又はアンチセンス方向で内部に含まれているSH2A遺伝子又はSH2A様遺伝子のヌクレオチド配列(又は1個以上のそれらの断片)を有しうる。
【0017】
異種コーディング配列と作動可能に連結されたSH2A遺伝子又はSH2A様遺伝子のプロモーターを含むキメラ遺伝子構築物も、提供される。
【0018】
配列番号5、7、9、11、13、15、及び17に示された核酸配列からなる群より選択されるSH2A様タンパク質をコードする単離された核酸も、本発明により提供される。
【0019】
さらに、本発明は、配列番号6、8、10、12、14、16、及び18に示されたアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、単離されたSH2A様タンパク質を提供する。
【0020】
本発明により、SH2Aと名付けられたイネ(オリザ・サティバ)由来の遺伝子が、植物の少酸素、即ち低酸素の条件への適応能に関与していることが発見された。さらに、SH2Aの遺伝子産物が、真核生物に遍在している高度に保存されたタンパク質のファミリーに属することも発見された。
【0021】
浸水と関連した低酸素条件は、水害(flooding)条件、境界層効果、及び植物組織代謝の結果であるため、定義するのが困難である。大部分の環境において、過多水(floodwater)中の酸素濃度は、通常、空気飽和未満(即ち、低酸素)である。しかしながら、特に夜間は、低酸素条件ではなく、酸素が完全に存在しない、即ち無酸素の条件になりうる。酸素が飽和した過多水ですら、浸水した植物組織中には無酸素のコアが生じる場合がある(Setter et al, 1997及びその中で引用された参照)。本明細書において使用されるように、「低酸素条件」とは、無酸素条件、及び酸素亜飽和、即ち空気飽和未満の条件を含む任意の条件を意味する。ほとんどの場合、無酸素又は亜飽和の条件は一時的である。
【0022】
本発明は、イネ由来のSH2A遺伝子及び対応するSH2Aタンパク質を提供する。本発明は、様々な生物に由来するSH2A様遺伝子及びSH2Aホモログも提供する。本明細書において使用されるように、「SH2A様遺伝子」及び「SH2A遺伝子又は類似遺伝子」とは、相同ヌクレオチド配列により示されるような、イネのSH2A遺伝子に相当する、イネ(オリザ・サティバ)以外の生物に由来する遺伝子をさす。「SH2A様タンパク質」及び「SH2Aホモログ」とは、相同アミノ酸配列、並びに低酸素条件下での適応及び/又は成長を授与する機能により示されるような、イネ以外の生物のSH2A相同タンパク質をさす。従って、本発明は、SH2A、並びにその誘導体、ホモログ、及び機能的アナログに関する。「SH2Aタンパク質又は類似タンパク質」という用語の本明細書における使用は、そのような相同又は非相同の誘導体、ホモログ、及び機能的アナログ全てを包含する。SH2A遺伝子配列及びSH2A様遺伝子配列、並びに対応するタンパク質は、特定の細胞と同種、即ちそのような細胞に天然に存在するものであってもよいし、又は細胞と異種であってもよく、即ち遺伝子配列又はタンパク質は、同一生物由来ではない起源からの細胞へと導入されうる。
【0023】
本発明のもう一つの面において、低酸素条件下での細胞の増殖又は生存を調整するための方法が提供される。その方法は、生物の細胞、組織、又は器官におけるSH2Aタンパク質又はSH2A様タンパク質のレベル及び/又は活性を調整することを含む。そのようなSH2Aタンパク質又は類似タンパク質のレベル及び/又は活性の調整は、それらの生物の細胞、組織、又は器官の低酸素条件への適応を可能にする。一つの実施態様において、生物は動物である。特に好ましいのは、哺乳動物種に属する生物の細胞、組織、又は器官である。SH2Aホモログ又はSH2Aアゴニストは、低酸素条件下での細胞の増殖及び生存を調整するため、培養中の動物細胞に投与されうる。SH2Aホモログ又はSH2Aアゴニストは、in vivoの低酸素部位の細胞へも投与されうる。従って、卒中又は心発作の患者は、低酸素の臨床的影響を減少させるために十分な量、有効量のSH2Aホモログ又はSH2Aアゴニストを投与されうる。ex vivo遺伝子治療法においては、SH2A様遺伝子を使用して、SH2Aホモログを過剰発現するようヒト細胞が形質転換され、形質転換された細胞が、患者へ、好ましくは低酸素部位へ移植される。動物、好ましくは哺乳動物の細胞、組織、又は器官におけるSH2Aタンパク質又はSH2A様タンパク質のレベル及び/又は活性の調整のための該方法は、他の低酸素関連病理の治癒又は緩解においても有用であるかもしれない。動物、好ましくは哺乳動物におけるそのような低酸素条件は、見られ、進行性繊維症を特徴とする末期腎疾患(Norman et al, 1999)、心筋虚血(Sinusas 1999)、肝硬変(Maruyama et al, 1994)、及び高高度性網膜症(high−altitude retinopathy)及びその他の高度関連疾病(Wiedman and Tabin 1999)を含む。窒息を起こした新生児は、低酸素症、特に低酸素性虚血性脳傷害に対して特に脆弱である(Gucuyener et al, 1999)。動物、好ましくは哺乳動物における低酸素条件は、腫瘍の浸潤、転移、及び致死性により作出された微小環境にも見られる。固形腫瘍は、新血管新生及び増加した解糖のみならず、低酸素により誘導可能な転写因子の過剰発現も特徴とする(Zhong et al, 1999)。
【0024】
もう一つの実施態様において、本発明は、腫瘍細胞におけるSH2Aタンパク質又はSH2a様タンパク質のレベル及び/又は活性の調整のための方法を含む。該方法は、低酸素条件下での細胞の増殖及び生存を減少させるための、動物、好ましくは哺乳動物の培養細胞への、例えばドミナントネガティブSH2Aホモログの投与、又は例えばSH2Aアゴニストの投与を含む。SH2Aホモログ又はSH2Aアゴニストは、in vivoの低酸素部位の細胞へも投与されうる。従って、癌患者は、癌性腫瘍細胞の増殖を減少させるために十分な量、有効量のSH2Aホモログ又はSH2Aアゴニストを投与されうる。ex vivo遺伝子治療法においては、例えばドミナントネガティブSH2A様タンパク質をコードするSH2A様遺伝子を使用して、SH2Aホモログを過剰発現するようヒト細胞が形質転換され、形質転換された細胞が癌患者、好ましくは腫瘍発生部位に移植される。好ましくは、哺乳動物はヒトであり、SH2A様遺伝子及び対応する遺伝子産物は、配列番号13に示されたヌクレオチド配列及び配列番号14に示されたアミノ酸配列を有する。ヒト細胞を形質転換する方法、及びヒト細胞において機能するプロモーター配列は、文献中に周知である。
【0025】
水害と関連した限定された気体拡散を克服するため、イネ植物は、品種によって、浸水耐性化、又は浸水から脱出するための伸長という2つの手段のうちの一方で応答する。水位が後退した後に比較的背の高い植物体が倒伏する傾向があるため、短期間の水害条件下での伸長は、不利である。しかしながら、イネが深水中で成長しているか、又は浮遊している範囲においては、伸長は望ましい。伸長応答を、ジベレリン生合成阻害剤パクロブトラゾール(paclobutrazol)の噴霧により阻害した場合、非浸水耐性品種の実生の生存は、大きく増強されうる。浸水耐性には、エネルギー生成メカニズムとしての効率的なアルコール発酵が伴う(Setter et al, 1997及びその中で引用された参照)。浸水条件は、低酸素をもたらすのみならず、エチレンの蓄積をも引き起こし、それが、植物ホルモンGAとABAとの比率を改変する。アラビドプシス・タリアナ(Arabidopsis thaliana)のSH2A様遺伝子のプロモーター領域の分析(図10/実施例7参照)は、浸水に起因する改変(低酸素、エチレン、GA、ABA)1個以上に応答性のプロモーター因子が存在することを示している。
【0026】
浸水耐性の発現又は伸長応答のいずれかを介した低酸素への適応及び低酸素の有害効果の克服は、明らかに収穫量に影響するであろう。さらに、増加した種子のサイズ、従って増加した炭水化物含量は、イネ実生の浸水耐性における重要な要因である(Setter et al, 1997)。
【0027】
本発明のもう一つの面において、SH2Aタンパク質又は類似タンパク質のレベル及び/又は活性を調整することを含む、植物の細胞、組織、又は器官の成長応答を改変する方法が提供される。SH2Aタンパク質又は類似タンパク質のレベル又は活性の調整は、植物体のサイズ及び/又は構造及び/又は収量に関する、細胞、組織、又は器官の成長の改変を可能にする。SH2A又はSH2Aホモログのレベル又は活性の調整は、遺伝子レベルで、即ちSH2A遺伝子もしくは類似遺伝子、又は該SH2A遺伝子もしくは類似遺伝子のRNAを標的とするリボザイムをコードする遺伝子で植物を形質転換することにより、実施されうる。SH2A遺伝子又はSH2A様遺伝子は、センス方向又はアンチセンス方向のいずれかで植物細胞を形質転換するために使用されうる。細胞増殖の変化、例えば植物茎の伸長の増加又は減少を起こさせるためには、センス方向のSH2A遺伝子又は類似遺伝子が、植物細胞、プロトプラスト、外植片、植物部分(例えば、胚、子房、花粉、根、茎の一部、胚軸、***組織等)、又は植物器官を形質転換するために使用される。SH2A遺伝子又はSH2A様遺伝子は、共抑制を引き起こすためセンス方向で使用されてもよいし、又は再生した植物体が、例えば植物の茎の伸長の増加もしくは減少を示すよう、植物細胞、プロトプラスト、外植片、植物部分、もしくは植物器官を形質転換するために、アンチセンス方向で使用されてもよい。SH2A遺伝子又はSH2A様遺伝子のRNAを標的とするリボザイムをコードする遺伝子で形質転換された植物細胞、プロトプラスト、外植片、植物部分、又は植物器官から再生した植物体においても、類似の効果が得られうる。SH2A又はSH2Aホモログのレベル又は活性の調整は、さらに、突然変異誘発、例えばT−DNAもしくはトランスポゾンの挿入、又は例えばWO98/36083、WO98/53083、WO99/15682、もしくはWO99/53050に記載されたような遺伝子サイレンシング戦略により、遺伝子レベルで実施されうる。SH2A遺伝子又はSH2A様遺伝子の発現のサイレンシングを目的とする遺伝子構築物は、プロモーター配列に対してセンス方向及び/又はアンチセンス方向で含まれたSH2A遺伝子又はSH2A様遺伝子のヌクレオチド配列(又は、それらの1個以上の断片)を有しうる。
【0028】
SH2Aタンパク質又はSH2A様タンパク質のレベル又は活性の調整は、SH2A、SH2Aホモログ、もしくはSH2Aアゴニストを細胞に投与するか、又はそれらに細胞を曝すことにより、タンパク質レベルでも実施されうる。そのような適用は、例えば動物の細胞及び組織の培養物、並びに植物細胞において特に有用である。SH2Aタンパク質又はSH2A様タンパク質のレベル又は活性の調整は、免疫調整、即ち宿主細胞におけるSH2Aタンパク質又はSH2A様タンパク質に特異的な抗体の発現によっても媒介されうる。そのような抗体は、「プランティボディ(plantibodies)」、単鎖抗体、IgG抗体、Fab断片、及び重鎖ラクダ抗体を含む。
【0029】
SH2Aタンパク質又はSH2A様タンパク質の配列のより精密な調査は、大部分(図2及び4参照)が、核移行配列(NLS:KRXR、イネSH2Aの残基64〜67)を含有しており、いくつかが破壊ボックスモチーフ(RX2LX2,3N、イネSH2Aの残基145〜152)を含有していることを明らかにした。NLSは、通常は細胞質に位置しており、マイトジェン又はストレスのような特異的シグナルの影響下で核へと移行し、核内で機能するタンパク質に特徴的なものである。そのようなタンパク質は、転写因子及び細胞周期タンパク質を含む。核に必要であるが、それ自体はNLSを含有していないタンパク質を核へと輸送するためのシャトル、即ち、いわゆるピギーバック(piggy−back)メカニズムとして作用しうるNLS含有タンパク質も存在する。(通常調節性の)タンパク質における破壊ボックスモチーフの存在は、該タンパク質の活性を時間的に制限するための効率的なメカニズムである、そのようなタンパク質の迅速な代謝回転の指標である。SH2Aタンパク質又はSH2A様タンパク質は、核において機能し、従って(1個以上の)核過程に関与していると予想される。そのような過程は、遺伝子転写の調節(例えば、直接的に転写因子として、又は間接的に転写因子のシャトルとして)及び細胞周期の調節を含む。動物において、低酸素は細胞周期を調整する、即ち、低酸素は、***促進サイクリンA及びBの合成を阻害することにより、マイトジェンにより活性化された細胞において増殖抑制状態を誘導する(Naldini and Carraro 1999)。低酸素は、サイクリン依存性キナーゼの阻害剤であるp21(waf1/cip1)のレベルも増加させる(Zaman et al, 1999)。動物細胞周期タンパク質の多くが植物における(1個以上の)対応物を有しているため(植物細胞周期に関する概説は、Mironov et al, 1999参照)、低酸素は、浸水耐性植物においては植物細胞周期を抑制するが、浸水した植物体の伸長応答においては植物細胞周期を増強するという可能性が高い。従って、SH2Aタンパク質又はSH2A様タンパク質が、遺伝子転写の調節因子及び/又は細胞周期の調節因子として機能する可能性は排除できない。細胞周期の調節因子としてのSH2Aタンパク質又はSH2A様タンパク質の可能性のある役割は、以下のように想像されうる。イネに関して上述したように、植物体は、耐性の顕示又は伸長の顕示(即ち、浸水感受性)という2つの手段のうちのいずれか一方で浸水誘導低酸素に応答することができる。
【0030】
第一のモデルにおいて、SH2Aタンパク質又はSH2A様タンパク質は、細胞周期制御遺伝子又は細胞周期制御タンパク質の負の調節因子として作用しうる。浸水耐性植物においては、低酸素により誘導されるシグナル伝達カスケードが、SH2A遺伝子又はSH2A様遺伝子の増強された発現をもたらすであろう。結果として、細胞周期が遮断され、伸長は起こらないであろう。伸長を示す浸水感受性植物においては、該低酸素により誘導されるシグナル伝達カスケードの中心的成分の欠如が、SH2Aタンパク質又はSH2A様タンパク質の蓄積を防止するであろう。結果として、細胞周期は、遮断されず、その後、例えば初期成長中のSH2A mRNAもしくはSH2A様mRNAの減少した安定性のため、又はSH2Aタンパク質もしくはSH2A様タンパク質の希釈のために増強され、それが迅速な伸長応答を引き起こしうる。
【0031】
第二のモデルにおいては、SH2Aタンパク質又はSH2A様タンパク質は、細胞周期制御遺伝子又は細胞周期制御タンパク質の正の調節因子として作用しうる。該細胞周期制御遺伝子又は細胞周期制御タンパク質は、この場合、例えば他の細胞周期制御遺伝子又は他の細胞周期制御タンパク質の阻害剤を含むであろう。異なる植物応答、浸水耐性又は伸長は、やはり低酸素により誘導されるシグナル伝達カスケードの中心的成分の存在又は欠如によりそれぞれ説明されうる。2つのモデルいずれにおいても、該低酸素により誘導されるシグナル伝達カスケードの中心的成分は、例えば浸水耐性のためのイネ主要遺伝子座の遺伝子によりコードされるのかもしれない(Xu and Mackill 1996)。
【0032】
「細胞周期」という用語は、細胞の増殖及び***、特にDNA複製及び有糸***の調節と関連した、周期的な生化学的及び構造的イベントを意味する。細胞周期は、G0期、Gap1(G1)期、DNA合成(S)期、Gap2(G2)期、及び有糸***(M)期と呼ばれる期を含む。通常、これらの4つの期は連続的に起こるが、細胞周期は、核内有糸***、細胞質***、倍数性、多糸性、及び核内倍加(endoreduplication)のような修飾された周期も含む。
【0033】
「細胞周期相互作用タンパク質」、「細胞周期タンパク質」、又は「細胞周期制御タンパク質」という用語は、本明細書において示されるように、細胞、組織、器官、もしくは生物全体の細胞周期もしくはその一部、並びに/又はDNA複製の制御を行うか、もしくは調節するか、もしくはそれらに必要なタンパク質を意味する。それは、サイクリン依存性キナーゼ又はそれらのサブユニットと結合する能力、それらを調節する能力、又はそれらによって調節される能力を有していてもよい。その用語は、それらのペプチド、ポリペプチド、断片、異型、ホモログ、対立遺伝子、又は前駆体(例えば、プレプロタンパク質)も含む。
【0034】
細胞周期制御タンパク質及び真核生物の細胞周期の調節におけるそれらの役割は、John(1981)及びその中に与えられた論文(Norbury and Nurse 1992; Nurse 1990; Ormrod and Francis 1993)及びその中に与えられた論文(Doerner et al, 1996; Elledge 1996; Francis and Halford 1995; Francis et al, 1998; Hirt et al, 1991; Mironov et al, 1999)により詳細に概説されており、これらは参照により組み込まれる。
【0035】
「細胞周期制御遺伝子」という用語は、染色体DNA合成、及び有糸***(前記前微小管束、核膜、紡錘体形成、染色体凝縮、染色体分離、新たな核の形成、隔膜形成体の形成等)、減数***、細胞質***、細胞増殖、及び核内倍加の制御を行うか、もしくはそれらに必要な任意の遺伝子、又はそれらの変異体をさす。CDK、サイクリン、E2F、Rv、CKI、Cksのホモログのような前記の制御を行う全ての遺伝子、例えばサイクリンD、cdc25、Weel、Niml、MAPキナーゼ等のような前記を妨害する任意の遺伝子も、細胞周期制御遺伝子である。
【0036】
より具体的には、S期への進入及び進行の制御に関与している全ての遺伝子が細胞周期制御遺伝子である。それらは、排他的にではないが、サイクリン依存性キナーゼ(CDK)、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤(CKI)、D、E、及びAサイクリン、E2F、及びDP転写因子、ポケットタンパク質(pocket proteins)、CDC7/DBF4キナーゼ、CDC6、MCM2−7、Oreタンパク質、cdc45、SCFユビキチンリガーゼの成分、PCNA、DNA−ポリメラーゼのような「細胞周期制御タンパク質」を発現する遺伝子を含む。
【0037】
「細胞周期制御タンパク質」という用語は、CYCA1;1、CYCAC2;1、CYCA3;1、CYCB1;1、CYCB1;2、CYCB2;2、CYCD1;1、CYCD2;1、CYCD3;1、及びCYCD4;1(Evans et al, 1983; Francis et al, 1998; Labbe et al, 1989; Murray and Kirschner 1989; Renaudin et al, 1996; Soni et al, 1995; Scrrell et al, 1999; Swenson et al, 1986)を含むサイクリンA、B、C、D、及びE、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤(CKI)タンパク質、例えばICK1(Wang et al, 1997)、FL39、FL66、FL67(PCT/EP98/05895)、Sic1、Far1、Rum1、p21、p27、p57、p16、p15、p18、p19(Elledge 1996; Pines 1995)、p14、及びp14ARF;p13suc1又はCKS1At(De Veylder et al, 1997; Hayles and Nurse 1986)及びnim−1(Russell and Nurse 1987a; Russell and Nurse 1987b; Fantes 1989; Russell and Nurse 1986; Russell and Nurse 1987a; Russell and Nurse 1987b)、Cdc2のホモログ、例えばCdc2MsB(Hirt et al, 1993)、CdcMsキナーゼ(Bogre et al, 1997)、cdc2T14Y15ホスファターゼ、例えばCdc25プロテインホスファターゼ又はp80cdc25(Bell et al, 1993; Ellegde 1996; Kumagai and Dunphy 1991; Russell and Nurse 1986)及びPyp3(Ellegde 1996)、cdc2プロテインキナーゼ又はp34cdc2(Colasanti et al, 1991; Feiler and Jacobs 1990; Hirt et al, 1991; John et al, 1989; Lee and Nurse 1987; Nurse and Bissett 1981; Ormrod and Francis 1993)、cdc2aプロテインキナーゼ(Hemerly et al, 1993)、cdc2T14Y15キナーゼ、例えばweel又はp107weel(Ellegde 1996; Russell and Nurse 1986; Russell and Nurse 1987a; Russell and Nurse 1987b; Sun et al, 1999)、mik1(Lundgren et al, 1991)及びmyt1(Ellegde 1996);cdc2T161キナーゼ、例えばCak及びCiv(Ellegde 1996);cdc2T161ホスファターゼ、例えばKap1(Ellegde 1996);cdc28プロテインキナーゼ又はp34cdc28(Nasmyth 1993; Reed et al,1985)、p40MO15(Fesquet et al,1993; Poon et al, 1993)、chk1キナーゼ(Zeng et al, 1998)、cds1キナーゼ(Zeng et al, 1998)、増殖関連H1キナーゼ(Labbe et al, 1989; Lake and Salzman 1972; Langan 1978; Zeng et al, 1998)、(Binarova et al, 1998; Boegre et al, 1999; Calderini et al, 1998; Wilson et al, 1999)により記載されたMAPキナーゼを含む。
【0038】
サイクリンDにより媒介される細胞のG0からG1への進入に関与している、その他の細胞周期制御タンパク質は、pRb(Xie et al, 1996; Huntley et al, 1998)、E2F、RIP、MCM7を含み、そしてpRb様タンパク質p107及びp130を含むかもしれない。
【0039】
これらに限定されないがORC、CDC6、CDC14、RPA、及びMCMタンパク質のような1個以上の複製開始点におけるプレ複製複合体の形成、これらに限定されないがCDC7、DBF4、及びMBFタンパク質のようなこのプレ複製複合体の形成の調節に関与している、さらなる細胞周期制御タンパク質。
【0040】
本明細書において使用されるように、「細胞周期タンパク質」及び「細胞周期制御タンパク質」という用語は、他の細胞周期制御タンパク質の代謝回転、又は他の細胞周期制御タンパク質の半減期の調節に関与しているタンパク質のうちの任意の1個以上を含む。「タンパク質代謝回転」という用語は、該タンパク質の物理的又は機能的な除去をもたらす全てのタンパク質の生化学的修飾を含むものとする。これらに限定されないが、そのような修飾の例は、リン酸化、ユビキチン化、及びタンパク質分解である。前記の他の細胞周期制御タンパク質のうちの任意の1個以上のタンパク質分解に関与している特に好ましいタンパク質は、酵母由来及び動物由来のタンパク質、Skp1、Skp2、Rub1、Cdc20、キュリン(cullins)、CDC23、CDC27、CDC16、及びそれらの植物由来ホモログである(Cohen−Fix and Koshland 1997; Hochstrasser 1998; Krek 1998; Lisztwan et al, 1998)、及び(Francis et al, 1998)中のPlesse et al)。
【0041】
本発明の目的のため、「細胞周期制御遺伝子」という用語は、転写因子及び上流シグナルタンパク質のような細胞周期制御遺伝子発現の転写調節に関与している遺伝子のうちの任意の1個以上を含む。さらなる細胞周期制御遺伝子も、排除されない。
【0042】
本明細書において使用されるように、「細胞周期制御遺伝子」という用語は、さらに、例えばストレス、栄養、病原体のような環境的シグナル、又は動物マイトジェンもしくは植物ホルモン(オーキシン、サイトカイニン、エチレン、ジベレリン酸、アブシジン酸、及びブラシノステロイド)のような内因性シグナルにより影響を受ける任意の細胞周期制御遺伝子又はそれらの変異体を含む。
【0043】
上述のような遺伝子転写及び/又は細胞周期及び/又は細胞代謝のSH2Aタンパク質又はSH2A様タンパク質による調節は、タンパク質−タンパク質相互作用、又はタンパク質−核酸相互作用の結果であり得る。従って、SH2Aタンパク質又はSH2A様タンパク質により作用を受ける可能性のある標的のレベル及び/又は活性の調整も、生物の細胞、組織、又は器官の成長の間接的な改変に寄与しうる。SH2Aタンパク質又はSH2A様タンパク質の標的のレベル及び/又は活性が調整される、この型の生物の細胞、組織、又は器官の成長の間接的な改変は、例えばSH2Aタンパク質又はSH2A様タンパク質のレベル及び/又は活性の調整と関連した不要な多面的な効果の発生が回避されるという利点を有しうる。
【0044】
潜在的なSH2Aタンパク質又はSH2A様タンパク質のタンパク質性標的の同定のための方法は、当業者に周知であり、SH2Aタンパク質又はSH2A様タンパク質をおとり(bait)として使用した酵母ツーハイブリッドスクリーニング、及びSH2Aタンパク質又はSH2A様タンパク質に対する抗体を使用した免疫沈降を含む。同定されたタンパク質性標的は、内因性調整因子、例えばSH2Aのレベル及び/もしくは活性、又はSH2A様タンパク質のレベル及び/もしくは活性の阻害剤又は活性化剤を含みうる。可能性のあるSH2Aタンパク質又はSH2A様タンパク質の核酸性標的の同定のための方法は、単純ではないが、可能であり、例えば遺伝子発見法(即ち、SH2Aタンパク質又はSH2A様タンパク質により発現が影響される遺伝子の同定)、それに続く例えば該発見された遺伝子に由来する重複するプロモーター断片のセットのゲルシフト分析を含みうる。同定された核酸標的は、SH2Aタンパク質もしくはSH2A様タンパク質をコードする遺伝子の発現、又はSH2Aタンパク質もしくはSH2A様タンパク質の活性の調整因子、例えば増強因子又は阻害剤をコードする内因性遺伝子を含みうる。
【0045】
従って、低酸素条件下での細胞の増殖又は生存は、SH2Aタンパク質又はSH2A様タンパク質と相互作用するタンパク質又は核酸のレベル及び/又は活性の調整によっても達成されうる。生物の細胞、組織、又は器官におけるそのようなタンパク質及び/又は核酸配列のレベル及び/又は活性の調整は、SH2Aタンパク質もしくはSH2A様タンパク質のレベル及び/もしくは活性の調整、並びに/又は低酸素条件に対する生物の細胞、組織、もしくは器官の適応の改変を可能にする。
【0046】
OMIGA2.0ソフトウェア(Oxford Molecular)と共に提供されるモチーフデータベースを使用したイネSH2Aアミノ酸配列のさらなる分析は、複数の推定リン酸化部位:5個の非重複カゼインキナーゼII(CK2)リン酸化部位、1個のプロテインキナーゼC(PKC)リン酸化部位、及び4個(そのうち3個は非重複)のチロシン(TYR)リン酸化部位の存在を明らかにした。これらの部位の位置は、表1に示されている。イネSH2Aタンパク質の推定リン酸化部位の多くは、他の起源由来のSH2A様タンパク質においても保存されている(図2参照)。従って、SH2Aタンパク質又はSH2A様タンパク質の生物学的活性及び/又はタンパク質代謝回転のターゲティングは、そのリン酸化状態の調節により調節されている可能性がある。そのような調節は、異なる発達及び/又は環境条件においてプロテインキナーゼ及び/又はプロテインホスファターゼの活性のバランスを変化させることにより得られる。(セリン、トレオニン、及びチロシンのような)リン酸化可能アミノ酸の、(それぞれアラニン、アラニン、及びフェニルアラニンのような)非リン酸化可能アミノ酸へのターゲティッド交換は、構成性の生物学的活性又は不活性を示し、かつ/又は増加もしくは減少したタンパク質分解代謝回転速度を示す変異型のSH2Aタンパク質又はSH2A様タンパク質を与えるかもしれない。従って、本発明のもう一つの面において、(1個以上の)中心的リン酸化可能アミノ酸が(1個以上の)非リン酸化可能アミノ酸へと交換されている変異型SH2Aタンパク質又はSH2A様タンパク質が同定される。該修飾されたSH2Aタンパク質又はSH2A様タンパク質の、生物の細胞、組織、又は器官における発現は、SH2Aタンパク質又はSH2A様タンパク質の調整されたレベル及び/又は活性を引き起こし、そして生物の細胞、組織、又は器官の低酸素条件への適応の改変を可能にする。好ましくは、細胞の低酸素条件に対する適応が、増強される。
【0047】
【表1】
【0048】
本発明によると、SH2A又はSH2Aホモログのレベル又は活性を調整することにより、植物細胞、プロトプラスト、外植片、植物部分、又は植物器官においてジベレリン生合成が誘導されうる。また、本発明によると、SH2A又はSH2Aホモログのレベル又は活性を調整することにより、植物細胞、プロトプラスト、外植片、植物部分、又は植物器官における嫌気応答タンパク質が調節されうる。
【0049】
SH2Aタンパク質又は類似タンパク質のレベル又は活性の調整は、1個以上のSH2A様遺伝子で、植物細胞、プロトプラスト、外植片、植物部分、又は植物器官を形質転換することを含みうる。同様に、SH2Aの発現レベル又は活性の調整は、1個以上のSH2A様遺伝子で、動物の細胞、器官、又は胚を形質転換することを含みうる。当然、細菌、酵母、真菌、及びその他の生物は、標準的な組換えDNA法を使用して形質転換されうる。現在では、SH2A様タンパク質は自然界に遍在していることが認識されているため、全てではないにしても大部分の生物の細胞が、SH2Aホモログをコードする天然遺伝子を有するであろう。従って、例えば、1個以上のSH2A遺伝子又は類似遺伝子が、そのような生物を形質転換し、その結果、天然のSH2Aタンパク質又は類似タンパク質の発現を増加又は減少させるため、センス方向又はアンチセンス方向で使用されうる。
【0050】
従って、SH2A様タンパク質をコードし、例えば動物又は植物材料を形質転換するために使用されるヌクレオチド配列は、特定の植物又は動物の細胞に対して異種(外来)であってもよいし、又はそのような細胞に天然に存在するものであってもよい。得られたトランスジェニック植物細胞及び動物細胞、又はその他の生物の細胞は、特定の細胞のゲノムに対して異種のSH2A様遺伝子を含んでいてもよいし、特定の生物に対して異種のSH2A様タンパク質を含んでいてもよい。得られたトランスジェニックな植物細胞及び動物細胞、又はその他の生物は、特定の生物のゲノムに天然にも存在するがゲノムに追加されたSH2A様遺伝子を含んでいてもよい。さらに、SH2A遺伝子又はSH2A様遺伝子のヌクレオチド配列は、該ヌクレオチド配列の発現を指図する調節領域に対してセンス方向又はアンチセンス方向の形態をとりうる。天然又は異種のSH2A様遺伝子は、標準的な組換えDNA法を使用して細胞へ添加される。
【0051】
SH2Aタンパク質又はSH2A様タンパク質の活性は、SH2Aタンパク質又はSH2A様タンパク質、即ちSH2Aアゴニストと相互作用する化合物に生物の細胞を曝すか、又はそれらを生物の細胞に適用することにより調整されうる。SH2Aタンパク質又はSH2A様タンパク質のレベルは、SH2Aタンパク質又はSH2Aタンパク質の発現を増加又は減少させることにより調整されうる。発現の増加は、例えば、センス方向のSH2Aコーディング配列の付加により達成されうる。発現の減少は、例えば、アンチセンス方向のコーディング配列の付加により、挿入突然変異誘発により、又はその他の遺伝子サイレンシング法により達成されうる。発現の増加は、さらに、SH2A又はSH2A遺伝子産物の発現を誘導する化合物に細胞を曝すか、又はそれらを細胞、もしくは植物体全体もしくは植物部分へ適用することにより、達成されうる。エチレン及びエテフォンは、SH2A遺伝子又はSH2A様遺伝子のmRNA転写物の蓄積を増加させ、従ってSH2A又はSH2Aホモログの発現を増加させるために使用されうる。
【0052】
本発明は、配列番号1に示されるようなヌクレオチド配列を含むイネ(オリザ・サティバ)由来のSH2A遺伝子を提供する。本発明のもう一つの実施態様において、配列番号3に示されるようなヌクレオチド配列を含む、SH2Bと名付けられたイネ由来SH2A様遺伝子が提供される。配列番号1に示された配列と比較した場合、1個以上のヌクレオチドの挿入、欠失、又は置換を有し、かつ低酸素条件への適応を授与するという特徴的な特性を維持しているSH2A遺伝子又はSH2A様遺伝子も、本発明により企図される。
【0053】
本発明のさらにもう一つの実施態様において、配列番号2に示されるようなアミノ酸配列を有するSH2Aをコードする単離された核酸が提供される。さらにもう一つの実施態様において、配列番号4に示されるようなアミノ酸配列を有するSH2Bをコードする単離された核酸が提供される。
【0054】
本発明は、トマト(リコパーシコン・エスクレンタム(Lycopersicon esculentum))、ダイズ(グリシン・マックス(Glycine max))、及びワタ(ゴシピウム・ヒルスタム(Gossypium hirsutum))のような植物に由来するSH2Aホモログをコードする単離された核酸、及び対応するアミノ酸も提供する。トマト由来の第一のSH2A様遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号5に示されている。対応するトマトSH2Aホモログのアミノ酸配列は、配列番号6に示されている。トマト由来の第二のSH2A様遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号7に示されている。配列番号8は、トマト由来の第二のSH2A様遺伝子の対応するアミノ酸配列を示している。
【0055】
ダイズ由来のSH2A様遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号9に示されている。対応するダイズSH2Aホモログのアミノ酸配列は、配列番号10に示されている。ワタSH2A様遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号11に示されており、対応するアミノ酸配列は、配列番号12に示されている。
【0056】
ヒト、マウス、及びゼブラフィッシュのSH2A様遺伝子のヌクレオチド配列、並びに対応するアミノ酸配列も、提供される。ヒトSH2A様遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号13に示されている。対応するアミノ酸配列は、配列番号14に示されている。マウスSH2A様遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号15に示されており、対応するアミノ酸配列は、配列番号16に示されている。
【0057】
ゼブラフィッシュSH2A様遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号17に示されている。対応するアミノ酸配列は、配列番号18に示されている。
【0058】
SH2Aタンパク質又はホモログは、周知の方法論を使用して生物の組織起源から単離されうる。例えば、Calderini et al, (1998) Journal of Cell Science 111: 3091−3100に記載されたような適切な抽出緩衝液を使用した標準的な手法に従いタンパク質抽出物が調製され、そして抗体を使用してSH2Aタンパク質又はSH2A様タンパク質が免疫沈降させられうる。例えば、SH2Aタンパク質又はSH2A様タンパク質の一部をコードする合成ペプチドに対するポリクローナル抗体が作製されうる。従って、SH2A様遺伝子の3′領域に対応する合成ペプチドが、SH2Aタンパク質又はSH2A様タンパク質に対する抗体を生成させるために使用されうる。例えば、SH2Aのヌクレオチド496〜867に対応するペプチドが、抗体を生成させるために使用されうる。SH2A又はSH2Aホモログのアミノ酸91〜118及び133〜161(図2参照)も、抗体を生成させるために使用されうる。次いで、抗体は、SH2Aホモログを同定するため、植物由来のタンパク質抽出物を用いた結合アッセイにおいて使用されうる。
【0059】
さらに、本発明は、SH2A分子もしくはSH2A様分子又はそれらの一部、即ちそのようなタンパク質の特異的断片又はエピトープを特異的に認識する抗体に関する。本発明の抗体は、異なる生物に由来するSH2Aホモログを同定し単離するために使用されうる。これらの抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、又は合成抗体であってもよいし、Fab、Fv、もしくはscFv断片のような抗体断片、又は重鎖ラクダ抗体等であってもよい。モノクローナル抗体は、例えば、マウス骨髄腫細胞の、免疫感作された哺乳動物に由来する脾細胞との融合を含む、Koehler and Milstein, Nature 256(1975), 495及びGalfre, Meth. Enzymol. 73(1981), 3に最初に記載されたような技術により調製されうる。さらに、前記ヘ゜プチドに対する抗体又はそれらの断片は、例えばHarlow and Lane“Antibodies, A Laboratory Manual”, CSH Press, Cold Spring Harbor, 1988に記載されている方法を使用することによっても得られる。これらの抗体は、例えば、本発明に係るSH2Aタンパク質又はSH2A様タンパク質の免疫沈降及び免疫学的局在部位決定、並びに例えば組換え宿主細胞及び生物におけるそのようなタンパク質の合成のモニタリングに使用されうる。前記タンパク質、それらのペプチドもしくは断片に対する抗体、又はそれらの断片は、例えば癌診断用のキットにも適用されうる。腫瘍又は腫瘍組織におけるSH2Aタンパク質又はSH2A様タンパク質のレベルの改変は、例えば、診断キット中に供給された該抗体又はそれらの標識誘導体を含むRIA又はELISAに基づく検出により測定されうる。本発明のもう一つの実施態様において、例えば癌診断用の、そのようなキットは、標的のSH2A mRNA種又はSH2A様mRNA種の特異的かつ定量的な増幅のため、例えばRT−PCRを介して使用されうるオリゴヌクレオチドプライマーを含有している。該mRNAのレベルの改変は、腫瘍又は腫瘍組織の発生の指標となりうる。
【0060】
好ましくは、SH2Aタンパク質又はSH2A様タンパク質は、本発明のSH2Aコーディング配列又はSH2A様コーティング配列の遺伝子産物を発現する組換え生物から単離される。SH2Aタンパク質又はSH2A様タンパク質は、Ausubel et al,(1987) Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates, New York、に記載されているもののような標準的な方法を使用して、そのような組換え生物から単離され精製されうる。
【0061】
また、本発明により、本発明の単離されたSH2Aヌクレオチド配列又はSH2A様ヌクレオチド配列を含むベクターが提供される。ヌクレオチド配列は、例えば、SH2A遺伝子又はSH2A様遺伝子の全体、即ちコーディング配列、並びにプロモーター及び終結配列のような関連した5′及び3′調節領域を含むSH2Aゲノミック配列を含んでいてもよい。そのような配列内には、イントロンが存在してもよいし、又は存在していなくてもよい。もう一つの実施態様において、ベクターは、SH2Aタンパク質又はSH2A様タンパク質の発現を起こさせるよう宿主細胞において機能するプロモーターと作動可能に連結されたcDNAのようなSH2Aヌクレオチド配列又はSH2A様ヌクレオチド配列を含む。そのようなベクターは、遺伝子構築物とも呼ばれる。本明細書において使用されるように、「遺伝子」とは、センス方向又はアンチセンス方向のいずれかの、SH2A又はSH2Aホモログをコードするゲノミック配列、cDNA配列、又は合成DNA配列をさすことができる。
【0062】
本発明のもう一つの面において、少酸素、即ち低酸素の条件における増殖に適応している宿主細胞を作製するための方法が提供される。その方法は、宿主細胞において機能するプロモーターの制御下にあるSH2A遺伝子又はSH2A様遺伝子で、宿主細胞を形質転換すること、及び調整されたSH2A遺伝子又はSH2A様遺伝子の発現レベルを有し、従って少酸素条件において増殖するよう適応している形質転換体を選択することを含む。SH2A遺伝子又は類似遺伝子は、宿主細胞において複製するか、又は宿主細胞のゲノムへ組み込まれるベクターにより保持されうる。その方法は、製パン又は発酵産業、及び組換えタンパク質の作製において使用されているもののような単細胞生物に特に有用である。従って、細菌、真菌、酵母、及び動物の細胞が、本発明のSH2A遺伝子又はSH2A様遺伝子での形質転換により、低酸素条件において増殖するよう適応させられうる。SH2A遺伝子又は類似遺伝子での形質転換により改変されうる酵母の例は、これらに限定されないが、E.コリ(coli)、バチルス(Bacillus)sp.、アキフェックス(Aquifex)sp.、及びシュードモナ(Pseudomona)sp.、ラクトバチルス(Lactobacilli)、ストレプトミセス(Streptomyces)sp.、アシネトバクター(Acinetobacter)sp.、シトロバクター(Citrobacter)sp.、及びクロストリジウム(Clostridium)sp.を含む。SH2A遺伝子又は類似遺伝子での形質転換により改変されうる細菌の例は、これらに限定されないが、サッカロミセス(Saccharomyces)及びシゾサッカロミセス(Schizosaccharomyces)、ピキア(Pichia)、及びクルイベロミセス(Kluyveromyces)、及びカンジダ(Candida)を含む。少酸素条件における増殖に適応させられ得る真菌の例は、アスペルギルス(Aspergillus)sp.、ペニシリウム(Penicillium)sp.及びトリコデルマ(Trichoderma)sp.を含む。
【0063】
SH2A遺伝子又は類似遺伝子での形質転換により改変されうる動物/哺乳動物細胞の例は、これらに限定されないが、例えばモノクローナル抗体を産生する、ハイブリドーマ細胞又は永久CHO細胞を含む。酸素供給量は、実際、培養動物/哺乳動物細胞による有用タンパク質の産生における主要な問題の一つである(Masuda et al, 2000)。従って、SH2A遺伝子又はSH2A様遺伝子の発現は、該培養細胞の生存を増強するであろう。さらに、SH2A遺伝子又はSH2A様遺伝子のプロモーターは、少酸素濃度下で培養された例えば動物細胞による該有用タンパク質の発現を推進するため使用されうる。他の低酸素応答エンハンサーを使用したそのような系は、記載されている(Masuda et al, 2000)。
【0064】
SH2A又はSH2Aホモログは、哺乳動物、酵母、又は昆虫の細胞を、本発明のSH2A遺伝子又はSH2A様遺伝子で形質転換することにより、哺乳動物、酵母、又は昆虫の細胞のような宿主細胞においても産生されうる。哺乳動物、酵母、又は昆虫の細胞を形質転換する方法は、当分野において周知である。哺乳動物、酵母、又は昆虫の細胞においてSH2Aタンパク質又は類似タンパク質を産生させるためには、哺乳動物、酵母、又は昆虫の細胞において機能するプロモーターの制御下にあるSH2A遺伝子又はSH2A様遺伝子を含むベクターで、そのような細胞が形質転換される。そのようなベクターは、遺伝子構築物とも呼ばれる。
【0065】
本発明のもう一つの面において、少酸素、即ち低酸素の条件において成長するよう適応した動物を作製するための方法が提供される。トランスジェニック動物を作製する方法は、当分野において周知であり、最も普及している方法は、所望のDNA、この場合SH2Aヌクレオチド配列又はSH2A様ヌクレオチド配列の受精胚の前核への注射を含む。胚は、代理母へと移植され、そこで出生まで発達する。組織特異的プロモーターは、広く利用可能であり、SH2Aヌクレオチド配列又はSH2A様ヌクレオチド配列の発現のため選択されうる。例は、乳腺発現に特異的なヒツジ主要乳清タンパク質β−ラクトグロブリン(BLG)遺伝子(Whitelaw et al, 1991 Transgenic Research 1:3−13)及び筋肉組織に特異的なマウスクレアチンキナーゼプロモーター(Frank et al, 1995 J. Clin. Inves. 96:976−986)を含む。多くの異なる細胞型における発現のためには、メタロチオネイン(MT)プロモーター、コラーゲンプロモーター、及び様々なウイルスプロモーターが使用されうる。トランスジェニック動物は、低酸素条件下での改善された成長を示す。
【0066】
本発明の方法は、植物組織培養、農業、及び園芸における使用に特に好適である。従って、本発明は、植物細胞、花粉、プロトプラスト、外植片、植物部分、又は植物器官を、SH2A遺伝子又はSH2A様遺伝子で形質転換すること、それらからトランスジェニック植物体を再生させること、及び低酸素条件下での成長に関して選択することを含む、少酸素条件下での成長に適応した植物体を作製する方法も提供する。トランスジェニック植物体は、排水性の悪い土壌、及び水分過多な成長条件のような少酸素条件の下での改善された成長を有する。
【0067】
本発明のさらにもう一つの面において、少酸素条件下での改善された生存を有する植物細胞又は植物プロトプラストを作製する方法が提供される。その方法は、トランスジェニック植物体を再生させる工程が実施されないことを除き、少酸素条件下での植物体の生存の改善に関するものと類似している。植物細胞は、SH2A遺伝子又はSH2A遺伝子で安定的に又は一過性に形質転換されうる。そのような形質転換された細胞は、組換え作製タンパク質を含む他のタンパク質産物のさらなる作製のため有用である。
【0068】
本発明のさらにもう一つの面は、少酸素条件下での改善された生存を有する植物体細胞性胚を作製するための方法を提供する。その方法は、トランスジェニックカルスが収集され、体細胞性胚形成の誘導のため使用されることを除き、少酸素条件における植物体の生存の改善に関するものと類似している。該方法は、例えばギネアアブラヤシからの、体細胞性胚の例えばバッチ作製の増加した効率、並びに封入された体細胞性胚の増加した生存率及び発芽率を含む利点を提供する。
【0069】
従って、植物細胞は、低酸素条件に対する耐性を授与する経路が誘導されるよう、少ない酸素供給量の条件におけるSH2A遺伝子又はSH2A様遺伝子の制御された発現のため操作されうる。SH2A又はSH2Aホモログの発現は、これらの組織における低酸素耐性を特異的に改善させるため、根及び水分過多傾向のある他の植物部分へとターゲティングされうる。SH2A遺伝子又はSH2A様遺伝子により授与される形質は、所望により任意の穀類植物及び園芸学上重要な植物へと移植されうる。
【0070】
本明細書において配列番号1〜18として提供されたヌクレオチド配列に加え、本発明の実施において有用な他のSH2A様遺伝子のヌクレオチド配列及び対応するアミノ酸配列が、EMBL及びGenBankのような遺伝子配列データベース上に提供されている。例えば、ダイズの第二のSH2A様遺伝子のヌクレオチド配列は、Genbankデータベースの登録番号AI441185により提供される。キャベツのSH2A様遺伝子のヌクレオチド配列は、Genbankデータベースの登録番号L38235により提供される。トウモロコシ(ジー・メイズ(Zea mays))のSH2A様遺伝子のヌクレオチド配列は、Genbankデータベースの登録番号AI649530により提供される。Genbankデータベースの登録番号AI054437は、メセンブリアンテマ(メセンブリアンテマム・クリスタリナム(Mesembryanthemum crystalllinum))SH2A様遺伝子のヌクレオチド配列を提供する。DDBJデータベースの登録番号AT000213は、リンゴ(マルス・ドメスチカ(Malus domestica))のSH2A様遺伝子のヌクレオチド配列を提供する。パイナップル(ピヌス・タエダ(Pinus taeda))のSH2A様遺伝子のヌクレオチド配列は、登録番号AI813053で、Genbankデータベース上に提供されている。Genbankデータベース上の登録番号AI727947は、ワタの第二のSH2A様遺伝子のヌクレオチド配列を提供する。アラビドプシス・タリアナの4つのSH2A様遺伝子に関する4つの登録番号も、Genbankデータベース上で登録番号N38691、N96935、T76549、及びAC002505として入手可能であり、それぞれ本明細書に記載されたようなATH1遺伝子、ATH2遺伝子、ATH4遺伝子、及びATH3遺伝子と相関している。
【0071】
本発明により、ATH3ノックアウトが生存不可であることにより証明されるように、ATH3は必須遺伝子であることが発見された(実施例16)。ATH3は、必須遺伝子であるため、除草剤スクリーニング法における標的として使用されうる。
【0072】
本発明の一つの面において、植物成長調節因子又は除草剤として使用されうるATH3遺伝子産物の相互作用因子が同定される。そのようなATH3遺伝子産物の相互作用因子を同定するための可能な方法は、BIACore装置(Pharmacia)を使用した、該化合物とATH3遺伝子産物との間の相互作用のリアルタイムの測定を含む。好ましくは、該相互作用因子は、例えば植物成長調節因子又は除草剤として有用であるかもしれない化学物質である。従って、本発明は、前記のような方法により植物成長調節因子又は除草剤として同定された分子の使用にも関する。もう一つの実施態様によると、本発明は、前記の方法の工程及び該工程から得られた化合物を、農業又は植物細胞もしくは組織の培養への適用にとって適当な形態に製剤化する工程を含む、植物成長調節因子又は除草剤の組成物の作製のための方法にも関する。
【0073】
Genbankデータベースの登録番号AI417749は、第二のヒトSH2A様遺伝子のヌクレオチド配列を提供する。ウサギSH2A様遺伝子配列は、DDBJデータベースの登録番号C82769により提供される。ドロソフィラ(Drosophila)由来のSH2A様遺伝子のヌクレオチド配列は、Genbankデータベースの登録番号AI517276により提供される。ケノラブジチス・エレガンス(Caenorhabditis elagens)の3つの異なるSH2A様遺伝子は、EMBLデータベースの登録番号Z68116、EMBLデータベースのU80455、及びEMBLデータベースのU23173により提供される。
【0074】
EMBLデータベースの登録番号Z48613は、サッカロミセス・セレビシエSH2A様遺伝子のヌクレオチド配列を提供する。EMBLデータベースの登録番号AA783142は、エメリセラ・ニヅランス(Emericella nidulans)由来のSH2A様遺伝子のヌクレオチド配列を提供する。EMBLデータベースの登録番号AL033388は、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)SH2A様遺伝子のヌクレオチド配列を提供する。EMBLデータベースの登録番号Z99111は、バチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)SH2A様遺伝子のヌクレオチド配列を提供する。Genbankデータベースの登録番号AE000766は、アキフェックス・エオリクス(Aquifex aeolicus)由来のSH2A様遺伝子のヌクレオチド配列を提供する。SWISS−PROTデータベースの登録番号P28809は、シュードモナス・アエロギノサ(Pseudomonas aeroginosa)由来のSH2A様遺伝子のヌクレオチド配列を提供する。
【0075】
SH2Aコーディング配列及びSH2A様コーディング配列並びにゲノミッククローンは、適切なプローブを用いたcDNAライブラリー又はゲノミックライブラリーのスクリーニングにより入手されうる。例えば、SH2Aゲノミッククローンは、本明細書に提供されたイネSH2A cDNA又はその断片を用いた、ゲノミックライブラリーのスクリーニングにより入手されうる。イネSH2A cDNAに由来する配列を含むオリゴヌクレオチドも、プローブとして使用されうる。例えば、SH2Aのヌクレオチド496〜867をカバーするcDNA断片が使用されうる。
【0076】
植物におけるSH2Aホモログは、約70〜95%の同一アミノ酸を共有している。従って、1個以上の植物SH2A様遺伝子のヌクレオチド配列に基づくオリゴヌクレオチドプローブが、本発明における使用のためのSH2A様遺伝子を単離するための、cDNAライブラリー又はゲノミックライブラリーのスクリーニングにおいて使用するため、設計され合成されうる。例えば、SH2Aタンパク質のアミノ酸99〜118及び133〜161の高度に保存された領域に相当する配列を含むオリゴヌクレオチドが、使用されうる。
【0077】
従って、SH2A遺伝子又は類似遺伝子のコーディング配列、プロモーター、又は3′終結配列に相当する核酸分子も、SH2A遺伝子もしくは類似遺伝子のコーディング配列全体を含む配列番号1〜18のいずれかに示されたような配列、又はSH2A様コーディング配列(断片及びオリゴヌクレオチドを含む)を有する遺伝子をプローブとして使用すること、並びに特定の生物に由来する核酸分子とハイブリダイズさせることにより入手されうる。「ハイブリダイズさせること」とは、そのような核酸分子が、例えば、Sambrook et al(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.に記載されたような、従来のハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることを意味する。
【0078】
オリザ・サティバSH2A cDNA(配列番号1)、又は配列番号1〜18に示されたヌクレオチド配列もしくはそれらの一部とハイブリダイズする核酸分子は、当分野において周知の技術により、例えばcDNAライブラリー又はゲノミックライブラリーから単離されうる。cDNAライブラリー又はゲノミックライブラリーのスクリーニングによる本発明のSH2A遺伝子又はSH2A様遺伝子に相当するゲノミックDNA配列の入手において有用であると考えられる方法は、例えばSambrook et al(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y.、又は広く入手可能な組換えDNA技術に関する多数の実験マニュアルに提供されている。
【0079】
本発明のSH2A遺伝子又は類似遺伝子は、単離されたSH2Aゲノミッククローン又はSH2A様ゲノミッククローンの制限エンドヌクレアーゼ消化より誘導されうる。従って、例えば、イネSH2A遺伝子(配列番号1)の既知のヌクレオチド配列又はアミノ酸配列が、単離された推定SH2A様ゲノミッククローンの核酸配列又は推測アミノ酸配列に対して整列化され、単離されたSH2Aゲノミッククローン又はSH2A様ゲノミッククローンの5′調節配列(即ち、コーディング領域の翻訳開始コドンから上流の配列)、コーディング配列、及び3′調節配列(即ち、コーディング領域の翻訳終止コドンから下流の配列)の位置が決定される。
【0080】
SH2A遺伝子又は類似遺伝子は、例えばin vitro突然変異誘発により、過剰の5′隣接配列、過剰のコーディング配列、及び/又は過剰の3′隣接配列を有するゲノミッククローンから生成させられうる。in vitro突然変異誘発は、便利な制限部位を導入するために役立つ。T7−Gen in vitro突然変異誘発キット(USB、Cleveland、OH)及びQuikChange Site Directed Mutagenesisキット(Stratagene、San Diego、CA)のようなこの適用に特に適した様々な商業的に入手可能なキットが存在する。又は、プロモーター、コーディング配列、及び3′終結配列を含むSH2A遺伝子又は類似遺伝子の直接的な増幅を可能にするためのPCRプライマーが画定されうる。
【0081】
本発明における使用のためのSH2A遺伝子又は類似遺伝子は、必ずしも、遺伝子ライブラリーから単離されなくてもよく、例えば化学合成、DNA複製、転写、及び逆転写を含む任意の様式で生成させられうる。従って、本発明において使用されるように、SH2A遺伝子及びSH2A様遺伝子とは、リボヌクレオチド及びデオキシリボヌクレオチドの両方からなる配列を包含する。
【0082】
本発明において、特にcDNAライブラリー又はゲノミックライブラリーの調製及び探索、単離されたクローンの配列決定、欠失分析の実施、発現ベクターの構築、細胞の形質転換、及び細胞の増殖等において使用される一般的な技術は、当分野において既知であり、そのような技術を説明している実験マニュアルは広く入手可能である。例えば、Sambrook et al,第2版(1989)Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New Yorkを参照のこと。
【0083】
真核生物全般におけるSH2A遺伝子産物又はSH2A様遺伝子産物の強い保存は、進化上保存された機能を示している。従って、任意のSH2A遺伝子又はSH2A様遺伝子が本発明の方法において使用されうる。好ましくは、細胞は、利用可能なもののうち系統学的に最も近いSH2A様遺伝子で形質転換される。例えば、植物細胞、プロトプラスト、外植片、植物部分、及び器官は、好ましくは、オリザ・サティバ由来のSH2A遺伝子(配列番号1)、アラビドプシス・タリアナ由来のATH1(登録番号N38691)、ATH2遺伝子(登録番号N96935)、ATH3遺伝子(登録番号AC002505)、もしくはATH4(登録番号T76549)、又はトマト1(配列番号5)、トマト2(配列番号7)、ダイズ1(配列番号9)、ダイズ2(登録番号AI441185)、ワタ1(配列番号11)、ワタ2(登録番号AI727947)、又はその他の植物より単離されたSH2A様配列及び/又は対応するゲノミック配列のような、植物のSH2A遺伝子又は類似遺伝子で形質転換される。
【0084】
本発明によると、SH2Aコーディング配列又はSH2A様コーディング配列は、cDNA又はゲノミック配列に相当しうる。ゲノミックSH2A遺伝子又はSH2A様遺伝子が使用される場合、遺伝子は所望により1個以上のイントロンを除去又は付加するため改変されうる。さらに、シグナル配列がゲノミック配列から除去及び/又は付加されうる。シグナル配列及び/又は(1個以上の)イントロンは、SH2A cDNA又はSH2A様cDNAにも付加されうる。1個以上のイントロンを含みうるSH2A遺伝子又は類似遺伝子のヌクレオチド配列は、同一のSH2A遺伝子もしくは類似遺伝子に由来するプロモーター、又は他のSH2A遺伝子由来のプロモーターと作動可能に連結されうる。又は、SH2Aヌクレオチド配列又は類似ヌクレオチド配列は、植物細胞において機能するがSH2A遺伝子又は類似遺伝子とは無関係であるプロモーターと作動可能に連結されうる。低酸素状態に応答性の他のプロモーターの例は、例えば、例えばメイズAdh1遺伝子のARE(ARE=嫌気応答因子)6個のリピートを含む合成プロモーターである(Olive et al, 1990)。
【0085】
植物細胞において構成性機能するプロモーターの例は、カリフラワーモザイクウイルス(CaMV)35Sプロモーター、ノパリンシンターゼ(nos)プロモーター、アルファルファモザイクウイルス(AMV)プロモーター、増強されたマンノピン(mannnopine)シンターゼプロモーター(MAC)プロモーターを含む。これらのプロモーターは、よく特徴決定されており、広く入手可能である。SH2遺伝子の発現を制御するために使用されうる誘導可能プロモーターの例は、熱ショックプロモーター、ホウレンソウ硝酸レダクターゼ遺伝子に由来する硝酸塩誘導可能プロモーター(Back et al, 1991 Plant Mol. Biol, 17:9)、ホルモン誘導可能配列(例えば、Yamagushi−Shinzaki, E. et al, 1990 Plant Mol. Biol. 15:905, Kares et al(1990) Plant Mol. Biol. 15:225)、並びにRuBPカルボキシラーゼの小サブユニット及びLHCP遺伝子ファミリーのような光誘導可能プロモーターを含む。誘導可能プロモーターの他の例は、テトラサイクリン誘導可能プロモーター(Gatz et al, 1992 Plant J 2:397)、糖質コルチコイド誘導可能プロモーター(WO9938988)、並びに例えばEP0332104及びWO9008826に記載されているような化学物質により誘導されるプロモーターを含む。
【0086】
組織特異的プロモーター、及び発生的に調節されるプロモーターも、SH2A遺伝子又は類似遺伝子の発現を制御し調節するために使用されうる。例は、花粉特異的プロモーター(Albani et al, 1991 Plant Mol. Biol. 16:501: Twell, et al., 1991 Genes Dev.5: 496; Hamilton D. et al., 1992 Plant Mol. Biol. 18:211)、花特異的プロモーター(van der Meer et al, 1990 Plant Mol. Biol. 15:95)、師部特異的プロモーター(DeWitt, N. D. et al,1991 J. Cell Biochem. Suppl. 15A:69, Yang, N. −S. Et al, 1990 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 87:4144)、根特異的プロモーター(Depater, B. S. et al., 1992 Plant Mol. Biol. 18:161: Vanderzaal, e. et al, 1991 Plant Mol.Biol. 16:983; Oppenheimer, D. G., et al., 1988 Gene 63:87)、及びWO993983に記載されているようなカッパヒドロキシラーゼプロモーターを含む種子特異的プロモーター(Bustos, M. M., et al.,1991 EMBO J. 10:1469; Stayton., M. et al., 1991 Aust. J. Plant Physiol. 18:507)を含む。特に好ましいプロモーターは、SH2A又はSH2Aホモログの発現が、植物の根にターゲティングされるような根特異的プロモーターを含む。SH2A遺伝子又は類似遺伝子の発現の根へのターゲティングは、適応度の低い植物種の浸水耐性の増加において特に有用である。そのような根特異的プロモーターは、トウモロコシ根優先的カチオニックペルオキシダーゼ遺伝子のプロモーター(WO9856921)、及び好気条件から嫌気条件への転換により転写活性が改変されないテンサイ貯蔵根特異的遺伝子のプロモーターを含む。(例えば、米国特許第5,898,096号に記載されているような)当分野において周知の***組織特異的プロモーターも、センス方向又はアンチセンス方向のいずれかのSH2A遺伝子又は類似遺伝子のmRNA転写物を、植物の***組織領域にターゲティングするために使用されうる。
【0087】
本発明は、SH2A遺伝子又はSH2A様遺伝子のプロモーター領域及びターミネーター領域を含む対応する5′及び3′の調節領域も企図する。従って、例えば、SH2Aのプロモーターは、SH2A遺伝子又は類似遺伝子の発現の促進、及び他の異種配列、即ちSH2A遺伝子又はSH2A様遺伝子と無関係なコーディング配列の発現の促進にとって有用である。5′調節領域は、少酸素供給量の条件下で誘導され、従ってそのような条件下での多数の異なるコーディング配列の発現の促進にとって有用である。さらに、SH2A遺伝子又はSH2A様遺伝子のプロモーターは、エチレン又はその前駆体エテフォンへの曝露によりさらに誘導されうる。
【0088】
SH2A遺伝子又はSH2A様遺伝子の調節された発現を提供するため、植物は、cDNA又はゲノミックSH2A配列もしくはSH2A様配列と作動可能に連結された、前記のように、SH2A遺伝子もしくはSH2A様遺伝子のプロモーター又はその他のプロモーターを含みうる植物において機能するプロモーターを含む核酸配列で形質転換される。通常、核酸配列はベクター内に置かれ、遺伝子構築物とも呼ばれる。好ましくは、SH2A遺伝子又はSH2A様遺伝子は、3′調節配列も含む。SH2Aコーディング配列又はSH2A様コーディング配列が、コーディング配列の5′上流に天然に存在するもの以外のプロモーターと作動可能に連結された場合、そのようなヌクレオチド配列はキメラ遺伝子又はキメラ遺伝子構築物とも呼ばれる。同様に、SH2A遺伝子又は類似遺伝子の5′又は3′の調節領域が、対応するSH2A遺伝子もしくは類似遺伝子のもの以外のコーディング配列、又は完全に無関係な遺伝子と作動可能に連結された場合、そのようなヌクレオチド配列も、キメラ遺伝子又はキメラ遺伝子構築物と呼ばれる。
【0089】
植物における遺伝子移入の方法は、当分野において周知である(Gelvin 1998 Current Opin Biotech 9:227)。キメラ遺伝子を含むSH2A遺伝子又は類似遺伝子は、Horsch et al,(1985) Science, 227:1229−1231により記載されたようなリーフディスク(leafdisk)形質転換−再生法により植物へ導入されうる。プロトプラスト培養(Horsch et al,(1984) Science,223:496; DeBlock et al,(1984) EMBO J., 2:2143; Barton et al,(1983) Cell. 32:1033)及び根形質転換(Valvekens et al,1988 Proc Natl Acad Sci USA 85:5536)のような他の形質転換法も、使用可能であり、本発明の範囲内に含まれる。好ましい実施態様において、植物は、Klett et al,(1987) Annu. Rev. Plant Physiol., 38:467に記載されたもののようなアグロバクテリウム由来ベクターで形質転換される。そのような形質転換ベクターは、アグロリスティック(agrolistic)形質転換において使用されるバイナリーベクター、スーパーバイナリー(super−binary)ベクター、コインテグレート(cointegrate)ベクター、及びRi由来ベクター、並びにT−DNA保持ベクターを含む。他の周知の方法も、本発明のキメラ遺伝子を植物細胞へ挿入するために利用可能である。そのような別法は、バイオリスティック(biolistic)法(Klein et al, (1987) Nature. 327:70)、電気穿孔、微量注入、化学的に誘導されたDNA取り込み、及びベクターとしてのウイルス又は花粉の使用を含む。
【0090】
形質転換法に必要である場合、SH2A遺伝子又は類似遺伝子又は本発明のキメラ遺伝子は、植物形質転換ベクター、例えばBevan(1984) Nucleic Acids Res., 12:8711−8721により記載されたバイナリーベクターへと挿入されうる。植物形質転換ベクターは、アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)の天然遺伝子移入系の修飾により誘導されうる。天然系は、形質転換植物へと移入されるT−DNAとして既知の大きいセグメントを含有するラージTi(腫瘍誘導)プラスミドを含む。Tiプラスミドのもう一つのセグメント、vir領域は、T−DNA移入を担当している。T−DNA領域は、末端反復配列に挟まれている。修飾型バイナリーベクターにおいては、腫瘍誘導遺伝子が欠失しており、vir領域の機能が、T−DNA境界配列に挟まれた外来DNAを移入するために利用される。T領域は、抗生物質耐性のための選択可能マーカー、及び移入のための配列を挿入するためのマルチプルクローニング部位も含有している。そのような操作された株は、「無毒化」A.ツメファシエンスとして既知であり、T領域に挟まれた配列の、植物の核ゲノムへの効率的な移入を可能にする。
【0091】
表面滅菌されたリーフディスク及びその他の感受性組織が、何日もの間培養された「無毒化」外来DNA含有A.ツメファシエンスを接種され、次いで抗生物質含有培地へと移される。次いで、適切な抗生物質を含有する培地中での発根の後、形質転換された苗条が選択され、土壌へと移される。トランスジェニック植物体が授粉させられ、これらの植物体から種子が収集され、抗生物質培地上で成長させられる。
【0092】
SH2A遺伝子、SH2A様遺伝子、又は本発明のキメラ遺伝子構築物の発生中の種子、幼実生、及び成熟植物における発現は、免疫学的、組織化学的なmRNA発現又は活性のアッセイによりモニタリングされうる。SH2A様遺伝子の発現をアッセイするには、実施例4に記載されたようなノーザン分析が実施されうる。キメラ遺伝子が、SH2A遺伝子又はSH2A様遺伝子以外の遺伝子と作動可能に連結されたSH2Aプロモーター又はSH2A様プロモーターを含む場合、キメラ遺伝子の発現のアッセイの選択は、異種コーディング配列の性質に依る。例えば、適切なヌクレオチドプローブが利用可能である場合には、ノーザン分析が転写を査定するために使用されうる。異種遺伝子によりコードされたポリペプチドに対する抗体が利用可能である場合には、ウェスタン分析、RIA分析、又はELISA分析、及び免疫組織化学的局在部位決定が、ポリペプチドの産生及び局在部位を査定するために使用されうる。
【0093】
本発明のもう一つの面は、本発明のSH2A遺伝子、SH2A様遺伝子、又はキメラ遺伝子構築物を含有するトランスジェニック植物体、これらの植物体の子孫又は本質的に誘導された変種を提供する。単子葉植物及び双子葉植物の両方が企図される。本明細書において使用されるように、(a)初期の変種から支配的に誘導されるものであり、(b)初期の変種とは区別され、かつ(c)導入されたトランスジーンの発現に関して初期の変種と本質的に一致する場合に、「本質的に誘導された変種」が存在するものとする。
【0094】
植物細胞は、前記の植物形質転換法のうちのいずれかにより、SH2A遺伝子もしくはSH2A様遺伝子、又はキメラ遺伝子構築物により形質転換される。通常、カルス培養物、リーフディスク、外植片、又は完全植物体の形態である形質転換された植物細胞は、(Bechtold et al. (1993) C. R. Acad. Sci. Paris. 316:1194−1199の真空浸潤(vacuum infiltration)法を介して)、当業者に周知の方法(例えば、Horsh et al., 1985)により、完全トランスジェニック植物体へと再生させられる。形質転換植物の子孫及び本質的に誘導された変種はキメラ遺伝子を受け継いでおり、形質転換植物又はそれらの本質的に誘導された変種に由来する花粉、卵、種子、塊茎、又は挿し木は、形質転換された系統又はそれらから本質的に誘導された変種においてトランスジェニック形質を維持するため使用されうる。
【0095】
本発明は、SH2Aタンパク質もしくはSH2A様タンパク質を発現するか、又はSH2Aキメラ遺伝子構築物もしくはSH2A様キメラ遺伝子構築物を含むトランスジェニック植物体に由来する花も包含する。
【0096】
以下の実施例は、本発明をさらに例示するものであり、決して本発明を制限するためのものではない。
【0097】
実施例1
植物材料及びインキュベーション条件
水稲(オリザ・サティバL.、Pin Gaew56)の種子を、International Rice Reserch Institute(Los Banos、The Philippines)より入手した。植物体を、記載されたようにして12〜14週間成長させた(Sauter, 1997)。全ての実験を、成長チャンバー内で、25℃で、連続光(200μE/m−2s−1)の下で実施した。浸水処理のため、記載されたようにして、完全植物体を、水道水が充填された600リットルのプラスチックバレル内に置いた(Lorbiecke and Sauter, 1999)。対照植物体は、同一成長チャンバー内で維持した。ホルモン及び阻害剤の効果の分析は、上方の最も高い成長応答性の節間を含有する切除された茎セグメントを使用して実施した(Raskin and Kende, 1984)。茎セグメントを、示された濃度のジベレリンA3(GA3)もしくはホルモン前駆体エテフォン(2−クロロエタンリン酸(chlorethanephosphoric acid)、E)を含有する水性溶液、又は対照としての水のみ25mlを含む150mlビーカー内でインキュベートした。対照セグメントは、水中で0.5又は3時間インキュベートした。エテフォン処理の場合には、茎セグメントを水中で0.5時間エテフォン添加前は2.5時間、プレインキュベートした。
【0098】
高い湿度を保証するため、ビーカーをプラスチックシリンダーの中に置いた。エチレン作用は、記載されたようにして(Lorbiecke and Sauter, 1999)、気相中50μl/lの濃度の2,5−ノルボルナジエン(ビシクロ〔2.2.1〕ヘプタ−2,5−ジエン、NBD)を使用して阻害した。
【0099】
タンパク質合成を阻害するため、示された濃度のシクロヘキシミドの水性溶液と共に3時間、茎セグメントをインキュベートした。エテフォンをシクロヘキシミドと共に使用する場合には、タンパク質合成の阻害を確実にするため、まずシクロヘキシミド溶液のみの中で茎片を30分間プレインキュベートした後、150μMの濃度になるまで、エテフォンを2.5時間で添加した。
【0100】
実施例2
イネの浸水誘導初期応答遺伝子の分子クローニング及び配列分析
部分的に浸水した水稲植物体の不定根に含まれる浸水誘導遺伝子の同定を目的とした、PCRに基づくサブトラクティブハイブリダイゼーションを使用して、イネから浸水誘導初期応答遺伝子(SH2)を単離した。PCRに基づくサブトラクティブハイブリダイゼーションは、浸水させていない水稲植物体由来の第3節の不定根のmRNAより合成されたcDNAをドライバー(driver)集団として使用し、2時間部分的に浸水させた植物体に由来するものを標的集団として使用し、Buchanan−Wollaston and Ainsworth(1997)により記載された方法に従い実施した。全長cDNAを入手するため、PCRに基づくサブトラクティブハイブリダイゼーションにおいて同定された、ジゴキシゲニンで標識された373bp cDNA断片を使用して、「DIG System User’s Guide」(Boehringer、Mannheim、Germany)に従い、水稲の_ambda−ZAPII−cDNAライブラリーのスクリーニング(Sauter,1995)を実施した。6個の強くハイブリダイズするプラークを、全部で2×105個の組換えファージから回収した。最も長い挿入配列を含有するクローンを、ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems、Weiterstadt、Germany)を用いて、Sangerら(1977)のジデオキシヌクレオチドチェーンターミネーション法により両側から配列決定した。SH2A(gb AF050200)と名付けられた最も長いクローンは、872bpの挿入配列を含有していた。SH2Aのヌクレオチド配列は配列番号1に示されている。ヌクレオチド496〜867の間の配列は、ライブラリースクリーニングに使用されたcDNA断片と同一であった。SH2Aは、597bpのオープンリーディングフレームをコードしている。予測ポリペプチドは199aa長、予測分子量は23.6kDaであった。SH2Aに対応するアミノ酸配列は、配列番号2に示されている。5′非翻訳領域のヌクレオチド30〜33のインフレームの終止コドンは、SH2Aが推定タンパク質の完全なコーディング領域を含んでいることを示した。
【0101】
実施例3
コンピュータ分析
イネESTクローンS2993及びS12166を、National Institute of Agrobiological ResourcesのRice Genome Research Program(日本つくば)より入手し、ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems、Weiterstadt、Germany)を用いて、Sangerら(1977)のジデオキシヌクレオチドチェーンターミネーション法により両側から配列決定した。DNA配列データを分析し、DNasis V5.11プログラム(Hitachi Software Engineering Co., Ltd. 1984, 1991)を使用して、仮想翻訳した。BLAST2.0.3プログラム(Altschul et al., 1997)を用いて、Swiss−Prot.TrEMBL(Bairoch and Apweiler, 1998)、EMBL(Stoesser et al., 1998)、GenBank(Benson et al., 1998)、DDBJ(Tateno et al., 1998)、及びPIR(Barker et al., 1998)のデータベースの実際の公開物においてホモログを検索した。同一遺伝子を表す同定されたESTをin silicoでクローニングし、推定オープンリーディングフレームの完全な配列情報を入手した。配列の整列化は、CLUSTAL X 1.64bプログラム(Thomson et al., 1997)を用いて計算し、GeneDoc2.1(Nicholas and Nicholas, 1997)を使用して手動で編集した。系統学的分析は、CLUSTAL X 1.64b及びTreeview1.31(Page, 1996)を使用して実施した。SH2Aの推定二次構造は、6つの異なる予測プログラム(Ito et al., 1997; White et al., 1994; Rost and Sander、1993, 1994; Gibrat et al.,1987; Chou and Fasman, 1978; Kneller et al., 1990)を使用した計算のコンセンサスより得た。6つの予測プログラムのうち4つが類似の結果を与えた領域のみを考慮の対象とした。
【0102】
データベース相同性検索は、SH2Aと同一の3つのイネEST、及び近縁のSH2A配列ホモログを表す4つのESTクローンの同定をもたらした。SH2Aホモログを表すESTのうち2つ、S2993及びS12166をRice Genome Research Programより入手し、完全に配列決定した。SH2B(gb AF068332)と名付けられたS2993は、980bpの挿入配列及び198アミノ酸をコードするオープンリーディングフレームを含有していた。インフレームの終止コドンが5′非翻訳領域に位置していた。S12166の配列は、SH2Bのオルタナティブなポリアデニル化を示唆するポリAテールに先行する64ヌクレオチド伸長を除き、SH2Bと同一であった。
【0103】
SH2A及びSH2Bのコーディング領域のヌクレオチド配列相同性は84%であった。2クローンの5′及び3′非翻訳領域には、有意な相同性が観察されなかった。さらなる分析は、SH2A及びSH2Bが、高度に保存されたタンパク質の新規クラスのメンバーであることを明らかにした。ヌクレオチドデータベース及びタンパク質データベースのコンピューター検索は、SH2Aの推定オープンリーディングフレームが、他の植物、動物、及び真菌の仮定タンパク質に相当する多数のESTの推定タンパク質及び推定オープンリーディングフレームとの有意な相同性を示すことを示した(図2)。EST及びゲノミック配列の分析は、アラビドプシス・タリアナの4つの転写されたSH2ホモログの同定をもたらした。さらに、他の双子葉植物由来の近縁SH2ホモログのESTが同定された。植物由来SH2ホモログの推定全長配列の比較は、57〜92%のアミノ酸同一性を明らかにした(図3)。ヒトホモログの推定アミノ酸配列は、SH2Aと50%同一、67%類似であった。サッカロミセス・セレビシエ及びシゾサッカロミセス・ポンベの推定タンパク質とSH2Aとのアミノ酸同一性は、それぞれ32%及び33%であった。真核生物配列の大部分が推定核移行シグナル(SH2Aのaa64〜67位のKRXR)を含有していた。SH2A及びSH2Bを含むいくつかの配列は、R(X)2L(X)2,3N破壊ボックスモチーフ(Glotzer et al., 1991)を含有していた。
【0104】
SH2Aを、バチルス・ズブチリス、アキフェックス・エオリクス、及びシュードモナス・アエルギノサ(Pseudomonas aeruginosa)に由来する3つの細菌タンパク質と比較した場合には、比較的弱い相同性が観察された(図2)。mmsR遺伝子によりコードされたシュードモナス・アエルギノサのタンパク質は、メチルマロン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼオペロンに対する正の調節因子であった(Steele et al., 1992)。mmsRは、正の細菌転写調節因子のXylS/AraCファミリーのメンバーとして同定されている。大部分のファミリーメンバーが、リンカーにより非保存領域と接続された、通常C末端に位置する、保存されたDNA結合ドメインを含有している(Gallegos et al., 1997)。SH2AとmmsRとの間の相同領域は、mmsRの非保存ドメインに位置している。さらに、その領域のハイドロパシー分析(Kyte and Doolittle, 1982)は、構造的な類似性を示唆した(図4)。
【0105】
整列化させたSH2関連配列の比較は、SH2Aタンパク質のaa91〜118及び133〜161の最も高度に保存された領域を決定した(図2)。aa133〜161の領域は、高い疎水性残基の含有率、及び推定α−ヘリックス、それに続く2つの推定β−シートにより特徴付けられた。プロリン残基(SH2AのP139)は全ての配列に保存されていた。植物、高等動物、及びヒトに由来するSH2ホモログのN末端領域は極めて類似していたが、ケノラブジチス・エレガンス、真菌、及び細菌の配列においては、この領域の保存度は比較的低かった。これは、利用可能な全長配列から計算された系統学的関係に反映された(図5)。
【0106】
実施例4
SH2A及びSH2Bの浸水応答性発現
浸水依存性遺伝子発現を決定するため、SH2A及びSH2BのmRNA量を、RNAゲルブロットハイブリダイゼーションにより分析した。空気中で成長させた、又は部分的に浸水させた水稲植物体の最幼節間の異なる帯域、及び第3節の不定根からRNAを単離した。従って、最高節間の組織片、介在***組織を含有する第2節の0〜5mm上、伸長域を含有する第2節の5〜15mm上、分化域を含有する第2節の15〜30mm上を使用した(Lorbiecke and Sauter, 1997)。第3節の不定根は、記載のようにして単離された(Lorbiecke and Sauter, 1999)。組織を液体窒素中で急速凍結させ、RNA抽出まで−70℃で保存した。TRIzol試薬(Gibco BRL)を用いて全RNAを単離し、記載されたようにして、4M LiClにより沈殿させた(Puissant and Houdebine, 1990, Lorbiecke and Sauter, 1999)。RNA分離及びノーザンブロットハイブリダイゼーションを、以前に記載されたようにして、実施した(Lorbiecke and Sauter, 1998)。RNAブロット分析のため、全RNA20μgを、6%ホルムアルデヒドを含有する1%(w/v)アガロースゲル上での電気泳動により分離した。Lorbiecke and Sauter (1998)に従い、RNAをナイロン膜(Hybond N+; Amersham、Braunschweig、Germany)へブロットした。ハイブリダイゼーションのため、SH2A(nt496〜867)及びSH2B(nt513〜980)の3′領域をカバーする遺伝子特異的cDNA断片を、「Rediprime Labelling Kit」(Amersham、Braunschweig、Germany)を使用して32Pでランダムプライム標識した。ハイブリダイゼーションを、1%SDS、1M NaCl、10%(w/v)デキストラン硫酸、及び熱変性サケ***DNAの中で68℃で一夜実施した。ブロットを68℃で1×SSC(0.15M NaCl、15mM Na−クエン酸、pH7.0)で1回、68℃で1×SSC、1%(w/v)SDSで1回、それぞれ10分間洗浄した(Sauter, 1997)。
【0107】
分析された組織において、SH2A発現を一過性誘導した。最も強い誘導は、最幼節間の介在***組織(IM)及び伸長域(EZ)に観察された(図6A)。分化域及び不定根には比較的少ない転写物が蓄積した。SH2AのmRNA量は、介在***組織においては0〜1時間の間、伸長域においては1〜2時間の間に増加した。最大mRNA量は、いずれの組織においても浸水後2時間で起こった(図6B)。浸水後2〜6時間の間に、SH2A mRNA転写物は対照レベルにまで低下した。対照的に、SH2Bの遺伝子特異的プローブを使用したノーザンブロットは、分析された時点において、いずれの組織においてもmRNA量の有意な改変を明らかにせず(図6A)、この遺伝子の構成性発現が示された。
【0108】
浸水誘導されたイネ植物体において、SH2A発現と、中心的嫌気応答タンパク質ピルビン酸デカルボキシラーゼ2の発現とは、密接に類似している(図6a及び6b)。節間におけるピルビン酸デカルボキシラーゼ2遺伝子発現は、SH2A遺伝子発現と同様にエチレンにより調節される。しかしながら、SH2Aとは異なり、ピルビン酸デカルボキシラーゼ2は、初期応答遺伝子ではない。ピルビン酸デカルボキシラーゼ2発現は、タンパク質合成に依存している(実施例6、図9)。前述の結果は、SH2A遺伝子産物が、ピルビン酸デカルボキシラーゼを含む嫌気応答タンパク質の調節に関与しており、従って、浸水又は冠水に対する耐性の制御のための要素であることを示している。
【0109】
実施例5
SH2A及びSH2Bのゲノム構造
記載されたようにして(Dellaporta et al., 1983)、11週齢の水稲植物体の最幼葉からゲノムDNAを単離し、BamHI、ClaI、HindIII、KpnI、又はPstIで5〜6時間消化し、1%(w/v)アガロースゲル上での電気泳動により分離した。DNAをナイロン膜(Hybond N+; Amersham、Braunschweig、Germany)へ毛細管ブロットし、ノーザン分析(実施例4)に関して記載されたような高ストリンジェンシー条件下で遺伝子特異的プローブとハイブリダイズさせた。SH2A関連配列を検出するため、SH2A cDNAをプローブとして使用して、比較的低ストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションを実施した。低ストリンジェンシー条件下でのサザン分析は、ハイブリダイゼーション工程及び洗浄工程を68℃ではなく55℃で実施したことを除き、ノーザン分析(実施例4)に関して記載されたようにして実施した。SH2関連配列を検出するため、SH2A−cDNAをプローブとして使用して、比較的低ストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションを実施した。SH2Aの遺伝子特異的プローブを用いたイネゲノミックDNAのサザンブロット分析は、高ストリンジェンシーでハイブリダイズさせ洗浄した場合、5つの異なる酵素で、単一のバンドを検出した(図1a)。SH2Bの遺伝子特異的プローブは、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズさせた場合、4つの異なる酵素で単一のバンド、PstI消化されたDNAで2つのバンドを検出した(図1b)。cDNA配列内にはPstI制限部位が存在せず、このことは、SH2B遺伝子内の少なくとも1個のイントロンの存在を示している。これらの結果は、SH2A及びSH2Bが、イネゲノム内の単一コピー遺伝子であることを示している。低ストリンジェンシー条件下で同一ブロットを用いた完全SH2A cDNAを使用したサザン分析においては、ほぼ全ての可視バンドがSH2A又はSH2B遺伝子特異的プローブにより検出されたシグナルに起因しており、イネにはさらなる近縁SH2ホモログは存在しないことが示された(図1)。
【0110】
実施例6
SH2A遺伝子発現の誘導
SH2A遺伝子のホルモン依存性発現を分析するため、最幼節間を含有する単離された茎セグメントを、異なるホルモン溶液又は阻害剤溶液で2.5時間処理した。介在***組織及び伸長域を含有する領域から全RNAを単離し、SH2A転写物量に関して分析した(図8a)。対照において、SH2A発現はわずかに誘導されていたが、それは植物体からの組織の切除によるものである可能性が高い。
【0111】
150μMエテフォン(2−クロロエタンリン酸)による茎セグメントの処理は、SH2A転写物レベルの強い増加をもたらした。(気相中50μl/lの濃度で適用された)エチレン作用の阻害剤ノルボルナジエンと組み合わせてエテフォンを使用した場合、SH2A転写物レベルは、対照レベルにまで減少した(図7)。これらの結果は、SH2A遺伝子がエチレンにより調節されることを示している。50μM GA3とのインキュベーションは、対照と比較した場合、2.5時間後に、増加したSH2A転写物レベルを引き起こさなかった。GA3とエテフォンとの組み合わせ、又はGAとノルボルナジエンとの組み合わせは、GA3が存在しない場合と同様の結果を与えた(図7)。
【0112】
エテフォン依存性SH2A発現のパターンを決定するため、150μMエテフォンと共にインキュベートされた茎セグメントの***組織及び伸長域から、1時間間隔で、全RNAを単離した。ノーザンブロット分析は、両組織において、0〜2時間の間のSH2A mRNAの増加を示した(図8A)。最大mRNA量は、2時間のインキュベーションの後に検出された。2〜6時間の間、mRNAレベルは対照レベルにまで低下した。エテフォンで処理された単離された茎セグメントと、部分的に浸水させた完全植物体(図6B)との比較は、介在***組織及び伸長域それぞれにおける類似の一過性SH2A発現パターンを明らかにした。
【0113】
用量依存的なSH2A遺伝子発現の応答を決定するため、単離された茎セグメントを異なるエテフォン濃度と共に2.5時間インキュベートした。使用されたエテフォン濃度は、0.015、0.15、1.5、15、及び150μMであった。介在***組織より単離されたRNAのノーザンブロット分析は、SH2A転写物蓄積が、わずか1.5uMのエテフォンにより誘導されることを示した(図8B)。SH2A遺伝子発現の誘導は、既知のタンパク質合成阻害剤シクロヘキシミド(CHX)の存在下で起こった。この観察は、SH2A遺伝子が事前のde novoタンパク質合成なしに誘導されることを示している。CHXのみによる茎セグメントの処理は、SH2A転写物の蓄積を引き起こした(図9A)。この現象は、初期応答遺伝子で高頻度に観察されており、スーパーインダクションと呼ばれている。用量応答試験は、20μg/ml以上というシクロヘキシミド濃度が遺伝子誘導に必要であることを明らかにした。そのような濃度は、タンパク質合成を効率的に遮断することが報告されており、それは、SH2A遺伝子発現が不安定なタンパク質により通常は抑制されていることを示している可能性がある(図9B)。
【0114】
(i)SH2A遺伝子発現の時間経過(図6A及び6B):(ii)ジベレリンではなくエチレンによる転写の調節(図7):(iii)幼組織における遺伝子誘導の位置:並びに(iv)初期応答調節因子としてのSH2Aの同定:という前述の所見は、SH2Aタンパク質が、ジベレリンホメオスタシスを調節し、イネ茎における改変されたジベレリンレベルをもたらすシグナル成分であることを示している。ジベレリンレベルに対する効果を通して、SH2Aは、イネの成長応答を改変する。
【0115】
実施例7
アラビドプシスSH2A様遺伝子のホルモン調節型遺伝子発現の証拠
アラビドプシス・タリアナ由来の3つのSH2A様遺伝子、EMBLデータベースからのATH1(登録番号Z97336)、ATH2遺伝子(登録番号Z97336)、及びGenBankデータベースからのATH3遺伝子(登録番号AC002505)のプロモーター領域の配列分析は、シグナル依存性遺伝子調節への関与が他の遺伝子において示されているいくつかのシス作用性因子を明らかにした(Dolferus et al, 1994, Gubler and Jacobsen 1992, Gubler et al, 1995, Manjunath and Sachs 1997, Ohme−Takagi and Shinshi 1995, Olive et al, 1990)。アラビドプシスにおいて同定された因子は、嫌気生活、エチレン,GA、又はABAに対する応答に関与している。アラビドプシス・タリアナ由来の3つのSH2A様遺伝子のプロモーター領域の推定シス因子の概略図を図10に図示する。
【0116】
実施例8
低酸素条件下での酵母(サッカロミセス・セレビシエ)及び動物細胞におけるSH2A様遺伝子発現の分析
酵母細胞を、酸素調節インキュベーターの中で、正常酸素条件(21%O2、5%CO2、75%N2)及び異なる酸素濃度の下で最小培地中で30℃で増殖させた。
【0117】
動物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞を、30℃の加湿インキュベーター内で、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド(Gibco、NY)及び10%ウシ胎仔血清が補足された最小必須アルファ培地中で維持した。異なる酸素濃度を、それと釣り合うN2と共に発生させる酸素調節インキュベーターを、低酸素(10%、5%、及び2%O2)条件下で細胞を培養するために使用した。
【0118】
正常酸素条件及び低酸素条件の下での48時間のインキュベーションの後、酵母細胞又はCHO細胞を収集し、全RNAを単離した。異なる酸素濃度における各SH2A様遺伝子の発現パターンを、各SH2A様mRNAに対する標識プローブを使用したノーザンブロッティング、又は定量的RT−PCRにより分析した。
【0119】
実施例9
遺伝子中断及び過剰発現による酵母(サッカロミセス・セレビシエ)SH2A様遺伝子発現の調整;低酸素耐性の分析
SH2A様遺伝子のノックアウトを有する変異型酵母を得るため、URA4のような栄養要求マーカーを、酵母SH2A様遺伝子の2つの断片の間にクローニングした。該断片は、2セットのプライマー(1セットはSH2A様遺伝子の5′部分を増幅するためのもの、1セットはSH2A様遺伝子の3′部分を増幅するためのもの)を使用したPCRにより得られた。得られたURA4により中断されたSH2A様遺伝子断片を使用して、ウラシル栄養要求性酵母株を形質転換した。安定なura+形質転換体、即ち中断されたSH2A様遺伝子断片が内因性遺伝子と相同組み換えされているものを選択し、酵母SH2A遺伝子ホモログの中断を確認するためPCRにより分析した。
【0120】
続いて、選択された酵母株を、実施例8に記載されたようなインキュベーション条件下での、対応する野生型酵母の増殖速度に対する相対増殖速度を決定することにより、低酸素耐性に関して分析した。ノックアウトされた酵母SH2A様遺伝子の相補を分析するためには、野生型酵母よりも低酸素耐性が低い変異体を、異なる起源のSH2A様遺伝子によりさらに形質転換することができる。
【0121】
酵母SH2A遺伝子ホモログの過剰発現のため、該遺伝子のコーディング領域を、PGKプロモーターのような構成性プロモーター、又はADH2プロモーターのような誘導可能プロモーターと作動可能に連結した。得られたキメラ遺伝子を2μ−プラスミドのような自律複製性プラスミドへと導入した。キメラSH2A遺伝子を保持するプラスミドを酵母へ形質転換し、適切な選択を施した。続いて、形質転換された酵母株を、必要であればキメラSH2A遺伝子の発現の誘導の後、実施例8に記載されたようなインキュベーション条件下で、対応する野生型酵母の増殖速度に対する相対増殖速度を決定することにより、増加した低酸素耐性に関して分析した。
【0122】
実施例10
アラビドプシス・タリアナSH2A相同遺伝子発現の調整:センス方向及びアンチセンス方向のA.タリアナSH2A遺伝子ホモログを(過剰)発現するトランスジェニック植物体
アグロバクテリウム・ツメファシエンスを使用して、花浸漬(floral dip)形質転換法(Clough and Bent 1998, Plant J. 16:735−743)又は別の適当な形質転換法により、A.タリアナを形質転換した。A.ツメファシエンスが含有していた植物形質転換ベクターは、
a)センスSH2A遺伝子ホモログの過剰発現の場合:カナマイシン耐性マーカーのような植物選択可能マーカー、及びSH2AのためのCaMV 35Sのような構成性プロモーター、又は***組織特異的発現を得るための組織特異的もしくは組織選択的プロモーターと作動可能に連結されたA.タリアナSH2A遺伝子ホモログ;又は
b)SH2A遺伝子ホモログのアンチセンス抑制の場合:カナマイシン耐性マーカーのような植物選択可能マーカー、及びSH2Aのための構成性、組織特異的、又は組織選択的プロモーター、好ましくは***組織特異的プロモーターとアンチセンス方向で連結されたA.タリアナSH2A遺伝子ホモログ又はその一部:のいずれかを保持しているT−DNAを保有していた。
【0123】
選択された形質転換されたA.タリアナ植物体を開花期に自家受粉させ、ホモ接合性子孫を同定し、実施例15に記載のようにしてさらに分析した。
【0124】
実施例11
トランスジェニックイネにおけるSH2A遺伝子及びSH2B遺伝子の過剰発現及び発現抑制
アグロバクテリウム・ツメファシエンスを使用して、O.サチバの未熟胚に由来する胚形成性カルスを形質転換した(Hiei et al, 1994, Plant J. 6:271−282)。A.ツメファシエンスが含有していた植物形質転換ベクターは、
a)センスのSH2A遺伝子又はSH2B遺伝子の過剰発現の場合:nptII遺伝子のような植物選択可能マーカー、並びにSH2Aのための構成性プロモーター、又は好ましくは***組織特異的プロモーターと作動可能に連結されたイネSH2A遺伝子及びSH2B遺伝子;又は
b)SH2A遺伝子及びSH2B遺伝子の発現抑制の場合:nptII遺伝子のような植物選択可能マーカー、及び構成性プロモーター、又はSH2A遺伝子の場合には好ましくは***組織選択的プロモーターとセンス方向及びアンチセンス方向で連結されたイネSH2A遺伝子及びSH2B遺伝子もしくはその一部:のいずれかを保持しているT−DNAを保有していた。
【0125】
構成プロモーターを使用して、全ての組織での遺伝子発現もしくは抑制を得ることもできるし、又は組織選択的もしくは組織特異的プロモーターを使用して、SH2Aの場合であれば***組織のような、ある組織のみにおける遺伝子発現もしくは抑制を得ることもできる。
【0126】
選択された形質転換されたO.サチバ植物体を自家受粉させ、表現型研究のための単一遺伝子座形質転換体を同定した(実施例15参照)。
【0127】
実施例12
調整されたSH2A様遺伝子発現を示すA.タリアナ植物体の低酸素耐性の分析
実施例10において得られた調整されたSH2A遺伝子ホモログ発現を有するホモ接合性A.タリアナ植物体を、水分過多耐性を査定することにより、低酸素耐性に関して分析した。水分過多耐性に関するパラメータは、
a)植物生存率、
b)生存植物体のサイズ、
c)生存植物体の開花時間
である。
【0128】
実施例13
動物細胞におけるSH2A様遺伝子の過剰発現及び低酸素耐性の分析
ヒト又はマウスのSH2A遺伝子ホモログのコーディング配列を、高レベル発現のためのサイトメガロウイルス(CMV)エンハンサー−プロモーターを含有し、かつトランスフェクトされた細胞の選択のためのneo遺伝子を含有するpcDNA3.1(InVitrogen、CA、USA)のような選択可能哺乳動物発現ベクターにクローニングした。得られたベクターを、製造業者のプロトコルに従い、Lipofectamine(Life Technologies、MD、USA)の使用によりCHO細胞(培養維持に関しては実施性8参照)へとトランスフェクトした。ネオマイシン耐性コロニーを選出し、24穴プレート(Nunc、Denmark)に5×104個の密度で播き、正常酸素条件(実施例8参照)の下で12時間培養し、その後、培地を新しいものに交換した。未形質転換細胞を、同一条件下で同時に接種しインキュベートした。
【0129】
培地を新しいものに交換した後、SH2A遺伝子ホモログを発現する形質転換細胞及び未形質転換細胞を含むプレートを、低酸素条件(2%酸素)下で異なる時間(48時間、72時間、及び96時間)インキュベートした。トリパンブルー排除法及び/又はニュートラルレッド取り込み法を使用した生死判別染色により、異なるインキュベーション時間の後、異なる細胞の生存率を査定した。死細胞を、トリパンブルー(PBS中400mg/L)との10minのインキュベーションにより染色し、顕微鏡により観察した。生存細胞は、ニュートラルレッド(PBS中56mg/L)との2時間のインキュベーションにより染色した。PBSによる洗浄の後、酸性EtOH(100mM クエン酸ナトリウムpH4、50%EtOH)中で細胞を溶解させ、生存細胞により取り込まれた色素の放出を540nmにおける吸光度測定により定量した。
【0130】
実施例14
SH2A様遺伝子発現の調整による嫌気応答遺伝子発現の調整
SH2A様遺伝子の調整された発現を示す、低酸素条件下でインキュベートされた酵母及び浸水したA.タリアナ植物体(実施例9〜10参照)を、嫌気応答タンパク質ピルビン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子の発現パターンに関して、低酸素条件下でインキュベートされた野生型酵母及び浸水した野生型A.タリアナ植物体とそれぞれ比較した。
【0131】
実施例15
調整されたSH2A遺伝子及びSH2B遺伝子又はホモログの遺伝子発現を示すO.サチバ及びA.タリアナトランスジェニック植物体の表現型分析
実施例10及び11において得られた、調整されたSH2A遺伝子もしくはSH2B遺伝子、又はホモログの発現を有するトランスジェニックO.サチバ及びA.タリアナ植物体を、水分過多耐性を査定することにより、低酸素耐性に関して分析した。水分過多耐性に関するパラメータは、
a)植物生存率、
b)生存植物体のサイズ、
c)生存植物体の開花時間
である。
【0132】
SH2A遺伝子もしくはSH2B遺伝子、又はホモログで形質転換された植物体においては、非トランスジェニック対照と比較して、増強された生存及び増加した生物量が観察された。
【0133】
さらに、一般的な収量関連パラメータも、正常増殖条件下で分析した。
【0134】
実施例16
A.タリアナのATH3遺伝子におけるトランスポゾン挿入変異体の同定
A.タリアナのEn−1トランスポゾン挿入変異体のコレクション(ZIGIA collection、Max−Planck−Institute fuer zuechtungsforschung、Cologne、Germany)を、PCRに基づく手法により、ATH3遺伝子への挿入に関してスクリーニングし、4つの独立した系統を同定した。これらの4つの系統からホモ接合性の挿入変異体を作製する試みは、失敗した。これらの結果は、ATH3ノックアウトが生存不可であり、従ってATH3がA.タリアナの必須遺伝子であることを示している。A.タリアナ遺伝子ATH1、ATH2、及びATH4についても、類似のスクリーニングを実施した。
【表2】
【図面の簡単な説明】
【図1A】
水稲におけるSH2Aのサザンブロット分析である。ゲノミックDNAを、HindIII(H)、BamHI(B)、ClaI(C)、PstI(P)、又はKpnI(K)で消化し、ブロットし、ストリンジェントな条件下でSH2Aの3′特異的プローブで探索した。分子長標準の位置が左に示されている。
【図1B】
水稲におけるSH2Bのサザンブロット分析である。図1Aのブロットを洗浄し、ストリンジェントな条件下でSH2Bの3′特異的プローブで探索した。
【図1C】
水稲におけるSH2関連配列のサザンブロット分析である。SH2関連配列のコピー数を決定するため、図1A及び1Bに示された同一のブロットを洗浄し、次いで低ストリンジェンシー条件下でSH2Aの全長cDNAで探索した。
【図2A】
植物、動物、真菌、及び細菌のSH2ホモログの推測アミノ酸配列のアラインメントである。50%以上の配列で保存されているアミノ酸には、影が付いている。ダッシュは、アラインメントを最適化するために挿入された間隙を示す。分析された配列全てにおいて保存されていたプロリン残基は、〔*〕により示されている。不完全な配列は、〔#〕により示されている。シュードモナス・アエルギノサのmmsRタンパク質については、aa1〜164のみが示されている。〔+〕により示された配列については、同定されたESTが、重複配列を含まないSH2ホモログの様々な領域を表している。
【図2B】
植物、動物、真菌、及び細菌のSH2ホモログの推測アミノ酸配列のアラインメントである。50%以上の配列で保存されているアミノ酸には、影が付いている。ダッシュは、アラインメントを最適化するために挿入された間隙を示す。分析された配列全てにおいて保存されていたプロリン残基は、〔*〕により示されている。不完全な配列は、〔#〕により示されている。シュードモナス・アエルギノサのmmsRタンパク質については、aa1〜164のみが示されている。〔+〕により示された配列については、同定されたESTが、重複配列を含まないSH2ホモログの様々な領域を表している。
【図3】
SH2ホモログアミノ酸配列の対間の関係を示す表である。各配列を、genedocプログラムを使用して、他の全ての配列と比較した。最初の数字は、2つの配列間の同一残基の割合(%)を記載している。括弧内の数字は、2つの配列間の類似置換及び保存的置換の割合(%)を示している。影付きの左上の4分の1は、50%以上の配列同一性を有する配列を示している。
【図4】
SH2Aとシュードモナス・アエルギノサのmmsRタンパク質との間の相同領域内のアミノ酸配列の位置、ハイドロパシー分析、及び整列化を図示している。推定核移行シグナル〔NLS〕及び推定破壊ボックスモチーフの位置が、SH2Aタンパク質の概略図中に示されている。
【図5】
アミノ酸配列の比較に基づき、推定全長SH2ホモログのアラインメントから、ClustalXプログラムにより作製された樹状図である。
【図6A】
部分的に浸水した水稲植物体の組織におけるSH2A、SH2B、及びピルビン酸デカルボキシラーゼ2のノーザンブロット分析である。水稲植物体を、最大18時間浸水させた。示された時点において、不定根、介在***組織、伸長域、及び分化域から全RNAを単離し、SH2A、SH2B、及びピルビン酸デカルボキシラーゼ2の発現に関して分析した。
【図6B】
部分的に浸水した水稲植物体の組織における水稲植物SH2A及びピルビン酸デカルボキシラーゼ2の遺伝子発現のノーザンブロット分析である。植物体を最大6時間浸水させ、介在***組織及び伸長域におけるSH2A及びピルビン酸デカルボキシラーゼ2の発現を分析した。
【図7】
エテフォン(E)、GA3(GA)、又はNBDとのインキュベーションの後の、最幼節間を含有する単離された茎セグメントの介在***組織及び伸長域におけるSH2A及びピルビン酸デカルボキシラーゼ2の遺伝子発現のノーザンブロット分析である。全RNAの単離の後、介在***組織及び伸長域におけるSH2A及びピルビン酸デカルボキシラーゼ2の発現を分析した。臭化エチジウムにより染色されたRNAゲルが、ローティング対照として示されている。
【図8A】
150μMエテフォンで最大6時間処理された単離された茎セグメントの成長域におけるSH2A及びピルビン酸デカルボキシラーゼ2の遺伝子発現のノーザンブロット分析である。インキュベートされていない茎(C0)又は水中で6時間インキュベートされた茎(C6)を、対照として使用した。示された時点で全RNAを単離し、SH2A及びピルビン酸デカルボキシラーゼ2の遺伝子発現を分析した。
【図8B】
異なる濃度のエテフォンで処理された単離された茎セグメントの介在***組織におけるSH2A及びピルビン酸デカルボキシラーゼ2の遺伝子発現のノーザンブロット分析である。茎セグメントを、エテフォンを含まないか(C)、又は示された濃度のエテフォンを含むビーカー内で、2.5時間インキュベートした。全RNAを単離し、SH2A及びピルビン酸デカルボキシラーゼ2の遺伝子発現を分析した。
【図9A】
タンパク質合成阻害剤シクロヘキシミド(CHX)の存在下で、150μMエテフォンで処理された、又は処理されていない単離された茎セグメントの介在***組織におけるSH2A及びピルビン酸デカルボキシラーゼ2の遺伝子発現のノーザンブロット分析である。茎セグメントを、示された濃度のCHX水性溶液と共に3時間インキュベートした。
【図9B】
異なる濃度のCHXで3時間処理された単離された茎セグメントの介在***組織におけるSH2A及びピルビン酸デカルボキシラーゼ2の遺伝子発現のノーザンブロット分析である。対照セグメント(C)は、水中で3時間インキュベートした。
【図10】
アラビドプシス・タリアナ由来の3つのSH2A様遺伝子のプロモーター領域内のシス因子の概略図である。
Claims (36)
- SH2A又はSH2A様遺伝子についてのヌクレオチド配列を含む、トランスジェニック植物、その本質的に由来する変種、植物の部分又は植物細胞、ここで、該ヌクレオチド配列は、該トランスジェニック植物、その本質的に由来する変種、植物の部分又は植物細胞のゲノムに対して異種である。
- SH2A又はSH2A様遺伝子についてのヌクレオチド配列を含む、トランスジェニック植物、その本質的に由来する変種、植物の部分又は植物細胞、ここで、該ヌクレオチド配列は、組換えDNA手段によって、トランスジェニック植物、植物の部分又は植物細胞中に導入されている。
- SH2A又はSH2A様タンパク質を含む、トランスジェニック植物、その本質的に由来する変種、植物の部分又は植物細胞、ここで、該SH2A又はSH2A様タンパク質は、該トランスジェニック植物、その本質的に由来する変種、植物の部分又は植物細胞に対して異種である。
- SH2A又はSH2A様遺伝子についてのヌクレオチド配列で形質転換された植物細胞又はプロトプラスト、ここで、該ヌクレオチド配列は植物細胞又は植物プロトプラストのゲノムに対して異種である。
- 植物細胞が、安定に又は一過的に形質転換される、請求項4に記載の植物細胞又はプロトプラスト。
- SH2A又はSH2A様遺伝子についてのヌクレオチド配列を含む宿主細胞、ここで、該ヌクレオチド配列は、該宿主細胞のゲノムに対して異種であるか、又は該ヌクレオチド配列が、組換えDNA手段によって、該宿主細胞中に導入されている。
- 該宿主細胞が、細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞、昆虫細胞、植物細胞、動物細胞又はヒト細胞である、請求項6に記載の宿主細胞。
- SH2A又はSH2A様遺伝子についてのヌクレオチド配列が、該ヌクレオチド配列の発現を指示する調節領域に関してセンス又はアンチセンス方向であるか、又は、該ヌクレオチド配列が、調節領域によって駆動される遺伝子サイレンシング構築物中に含まれる、請求項6に記載の宿主細胞。
- 低酸素条件下で培養細胞の成長又は生存を調整するための方法であって、該培養細胞におけるSH2A又はSH2A様タンパク質のレベル及び/又は活性を調整することを含む、方法。
- 培養細胞における成長応答を変化させる方法であって、該培養細胞におけるSH2A又はSH2A様タンパク質のレベル及び/又は活性を調整することを含む、方法。
- 培養細胞が、細菌細胞、酵母細胞又は真菌細胞である、請求項9又は10に記載の方法。
- 培養細胞が、動物細胞、ヒト細胞又は昆虫細胞である、請求項9又は10に記載の方法。
- 培養細胞が、植物細胞である、請求項9又は10に記載の方法。
- 生物の細胞、組織又は器官における成長応答を変化させる方法であって、該生物の該細胞、組織又は器官において、SH2A又はSH2A様タンパク質のレベル及び/又は活性を調整することを含む、方法。
- 植物の細胞、組織又は器官における成長応答を変化させる方法であって、該植物の該細胞、組織又は器官において、SH2A又はSH2A様タンパク質のレベル及び/又は活性を調整することを含む、方法。
- SH2A又はSH2A様タンパク質のレベル及び/又は活性が、該SH2A又はSH2A様タンパク質についてのヌクレオチド配列の転写を増加させることによって調整される、請求項15に記載の方法。
- 転写の増加が、植物の細胞、組織又は器官をエテフォン又はエチレンに暴露することによって誘導される、請求項16に記載の方法。
- 低酸素条件での成長に適応した植物を産生する方法であって、少なくとも1つの植物細胞、花粉、プロトプラスト、外植片、植物の部分又は植物の器官を、SH2A又は同様の遺伝子をコードする配列で形質転換し、それらから植物を再生することを含む、方法。
- 低酸素の条件における植物の生存を改良する方法であって、少なくとも1つの植物細胞、花粉、プロトプラスト、外植片、植物の部分又は植物の器官を、SH2A又はSH2A様遺伝子をコードする配列で形質転換し、それらから植物を再生することを含む、方法。
- 植物における湛水害耐性を改良する方法であって、少なくとも1つの植物細胞、花粉、プロトプラスト、外植片、植物の部分又は植物の器官を、SH2A又はSH2A様遺伝子をコードする配列で形質転換し、それらから植物を再生することを含む、方法。
- 植物細胞、プロトプラスト、外植片又は植物器官におけるジベレリン生合成を誘導する方法であって、その中のSH2A又はSH2A様タンパク質のレベル及び/又は活性を調整することを含む、方法。
- 植物におけるジベレリン生合成を誘導する方法であって、該植物の細胞又は細胞群中のSH2A又はSH2A様タンパク質のレベル及び/又は活性を調整することを含む、方法。
- 植物細胞、プロトプラスト、外植片又は植物器官における嫌気応答タンパク質を調節する方法であって、その中のSH2A又はSH2A様タンパク質のレベル及び/又は活性を調整することを含む、方法。
- 嫌気応答タンパク質が、ピルビン酸デカルボキシラーゼ2である、請求項23に記載の方法。
- SH2A又はSH2A様遺伝子についてのヌクレオチド配列の発現を指示するプロモーター配列に作動可能に連結された該ヌクレオチド配列を含む、遺伝子構築物。
- 該SH2A又はSH2A様遺伝子が、cDNAであるか又はゲノム配列である、請求項25に記載の遺伝子構築物。
- 該SH2A又はSH2A様遺伝子が、合成配列である、請求項25に記載の遺伝子構築物。
- SH2A又はSH2A様遺伝子についてのヌクレオチド配列が、プロモーター配列に関してセンス又はアンチセンス方向であるか、又は遺伝子サイレンシング構築物中に含まれる、請求項25〜27のいずれか1項記載の遺伝子構築物。
- SH2A又はSH2A様タンパク質をコードする遺伝子を含むキメラ遺伝子構築物であって、該遺伝子が、植物中で機能するプロモーターの制御下にある、キメラ遺伝子構築物。
- 異種コーディング配列に作動可能に連結されたSH2A又はSH2A様遺伝子プロモーターを含む、キメラ遺伝子構築物。
- 配列番号5、7、9、11、13、15又は17に記載された核酸配列からなる群より選択された、SH2A様遺伝子をコードする単離された核酸。
- 配列番号6、8、10、12、14、16又は18に記載されたアミノ酸配列からなる群より選択されたアミノ酸配列を有する、単離されたSH2A様タンパク質。
- 請求項1〜3のいずれか1項に記載されたトランスジェニック植物又はその本質的に由来する変種の花粉。
- 請求項1〜3のいずれか1項に記載されたトランスジェニック植物又はその本質的に由来する変種の種子。
- 請求項1〜3のいずれか1項に記載されたトランスジェニック植物又はその本質的に由来する変種の切断物。
- 請求項1〜3のいずれか1項に記載されたトランスジェニック植物又はその本質的に由来する変種の花。
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