JP4021615B2 - 植物成長及び発達の遺伝子制御 - Google Patents
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Description
本発明は、植物の成長及び/又は発達の遺伝子制御並びにその中の関連する遺伝子のクローニング及び発現に関する。より詳しくは、本発明は、トリチクム・アエスチブム(Triticum Aestivum)のRht遺伝子、及び他の種からの相同体のクローニング及び発現、並びに該遺伝子の植物中での使用に関する。
【0002】
開花を含む植物の成長及び発達に影響を与える遺伝子メカニズムの理解は、標的植物の特徴を変化させるための手段を供する。成長及び/又は発達特性の操作が有利であり得る種には、全ての作物があり、重要な例は穀類、おそらく温暖な気候帯において最も農業経済的に重要である、コメ及びトウモロコシ、並びにより温帯性の気候における、コムギ、オオムギ、オート及びライ麦である。種子製品のための重要な作物は、脂肪種子なたね及びカノーラ、トウモロコシ、ひまわり、ダイズ及びモロコシ類である。それらの根のために収集される多くの作物は、もちろん種子から毎年、成長され、いずれの種の種子の生産も、植物が開花し、授粉し、そして種子をつける能力に極めて依存する。園芸において、開花を含む成長及び発達の時期の制御は重要である。開花を制御できる園芸植物には、レタス、エンダイブ及びアブラナ属植物、例えばキャベツ、ブロッコリー及びカリフラワー、並びにカーネーション及びゼラニウムがある。一方で矮性植物及び他方で過剰に大きく丈の高い植物が、樹木、プランテーション作物及び稲科植物を更に含めて、種々の園芸及び農業関係において有利であり得、及び/又は要求さ得る。
【0003】
ここ数10年で、半矮性Rhtホメオアレルの育種プログラムへの組込みのよりコムギ収率が非常に増加している。これらの増加は、コムギ生産性を世界人口の上昇の要求と歩調をそろえることを可能にしている。以前、我々は、アラビドプシス・ガイ(Arabidopsis gai)対立遺伝子のクローニングを記述した(1997年2月12日に出願され、1998年8月14日にWO97/29123として公開されたPCT/GB97/00390、John Innes Centre Innovations Limited、この全ての内容は引用により本明細書に組み込まれる)。それは、コムギ(単子葉植物)におけるRht変異体対立遺伝子と同様、アラビドプシス(双子葉植物)における半優性矮性表現型及び植物成長ホルモンジベレリン(GA)に対する応答性の減少を与える。gaiは、野生型(GAI)タンパク質のN末端近くに見い出される17アミノ酸残基を欠如する変異体タンパク質(gai)をコードする。このセグメントの配列はコメcDNA配列(EST)中で高度に保存されている。ここで、我々はこのcDNAがRht座を含むことが知られている重複する穀類のゲノムマップの短いセクションにマッピングされること、及び我々がそのcDNAを用いてコムギのRht遺伝子を単離したことを示す。アラビドプシス(Arabidopsis)及びトリチクム(Triticum)のものとして広範囲に分岐したこのゲノムは、変異させた時にGA応答性に作用し、植物界を通して保存されているGAシグナル伝達において配列のための役割を示す保存された配列を有するはずである。更に、Rhtのクローニングは、以前にコムギで得られたものと同様に大きい収率増強の目的で、多くの異なる作物種への転移を許容する。
【0004】
半矮性Rhtホメオアレル(日本の品種Norin10から得られるNorin10遺伝子として元来、知られている)の、純血コムギ育種系への導入はいわゆる“グリーン・レボルーション”への最も大きな寄与の1つであった(Galeら、1985, Dwarfing genes in wheat : Progress in Plant Breeding, G.E. Russell (ed) Butterworths, London pp 1-35) 。これらのホメオアレルを含むコムギは、一貫してそれらを欠如するコムギをより多く生産し、現在、世界のコムギ作物の約80%を含む。この収率増強の生物学的基礎は2重であるようである。第1に、Rht対立遺伝子により供される半矮性表現型は倒伏(風/両による植物の平担化、結果として収率を減少させる)に対する耐性を増加させる。第2に、これらの対立遺伝子は、光吸収の再配分を引きおこし、これは穀粒に対して多く、幹に対して少くなる(Galeら、1985)。これらの特性は、コムギ収率に大きな効果を有し、これは、Rht含有系が農業者により収穫される年の間、20%超、UKコムギ収率が増加したという事実により証明される。
【0005】
rht変異体は、ジベレリン(GA、内因性植物成長レギュレーター)に対するそれらの応答を害する遺伝的に優性の変異体rht対立遺伝子を含むので、矮小になっている(Galeら、1976, Heredity 37 ; 283-289)。これにより、rht変異体の子葉鞘は、野生型コムギ植物のものと異なり、GA適用に対して応答しない。更に、rht変異体は野生型対照において見い出されるより高いレベルまで、生物学的に活性なGAを蓄積する(Lentonら、1987)、Gibberellin insensitivity and depletion in wheat - consequences for development : Hormone action in Plant Development - a critical appraisal. GV Haod, JR Lenton, MB Jackson and RK Atkin (eds) Butterworths, London pp 145-160)。これらの特性(遺伝子優性、GA応答性の減少、及び高い内因性GAレベル)は他の種における変異により与えられる表現型に共通しており(トウモロコシのD8/D9;アラビドプシスのgai)、このことは、これらの変異体対立遺伝子はこれらの異なる種においてオルソロガス遺伝子を規定していることを示し、これは、D8/D9及びRhtがトウモロコシ及びコムギのゲノム内でシンテニーの座であるという観察結果により更に支持される。
【0006】
本発明の第1の態様によれば、Rht機能を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を供する。用語“Rht機能”は、トリチクムのRht遺伝子と同様に植物の表現型に作用する能力を示す。“Rht機能”は、植物成長の阻害、サプレッション、リプレッション又は削減として植物内で表現型として観察することができ、ここでその阻害、サプレッション、リプレッション又は削減はGAにより拮抗される。Rht発現はGAにより拮抗される植物上の矮性表現型を与える傾向がある。
【0007】
Rht機能を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からの植物の過剰発現は、GAでの処置により癒され得る植物に矮性表現型を与えるのに用いることができる。
また、本発明の一態様によれば、発現に基づいてrht変異体表現型を与える能力を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を供する。rht変異体植物は野生型と比べて矮小しており、ここでその矮小はGA不感受性である。
【0008】
ここで“Rht”(大文字で始まる)は、野生型機能をいうのに用いるが、“rht”(大文字で始まらない)は変異体機能をいうのに用いる。
多くの植物成長及び発達課程はジベレリン(GA)として知られる四環式ジテルペノイド成長因子のファミリーの特定のメンバーにより制御される。(Hooley, Plart. Mol. Riol. 26, 1529-1555 (1994))。ジベレリン又はGAは、図5に示す基本的な炭素環構造を有するジテルペノイド分子を意味し、生物活性を有する場合、我々は、生物学的に活性なジベレリンという。
【0009】
生物活性は、穀類アリューロンα−アミラーゼ応答の細胞伸長、葉の老化又は顕在化の1又は複数の刺激により定義することができる。当該技術で利用できる多くの標準的アッセイが存在し、それらのいずれかの1又は複数における陽性結果はテストジベレリンを生物的に活性であるとして示す(Hoadら、Phytochemistry 20, 703-713 (1981) ; Serebryakov ら、Phytochemistry 23, 1843-1854 (1984) ; Smith ら、Phytochemistry 33, 17-20 (1993))。
【0010】
当該技術で利用できるアッセイには、レタス胚軸アッセイ、キュウリ胚軸アッセイ、及びオート第1葉アッセイがあり、それら全てが、適用されるジベレリンが各々の組織の伸長を引きおこす能力に基づいて生物活性を決定する。好ましいアッセイは、テスト組成物がジベレリン欠損植物に適用されるものである。このような好ましいアッセイには、成長を決定するための矮性GA欠損アラビドプシスの処理、節間伸長が決定される矮性エンドウアッセイ、葉鞘の伸長が決定されるTan−ginbozu矮性ライスアッセイ、及び葉鞘の伸長が決定されるd5−トウモロコシアッセイがある。エロンゲーションバイオアッセイは、各々の器官中の全般的な細胞伸長の効果を測定し、特定の細胞型に制限されない。
【0011】
更に利用できるアッセイには、ドック(Rumex)葉老化アッセイ及び穀類アリューロンα−アミラーゼアッセイがある。穀粒内の内乳の周囲にあるアリューロン細胞は、デンプンを消化して後に成長中の植物により用いられる糖を作り出すα−アミラーゼを発芽により分泌する。その酵素生産はGAにより制御される。生物学的に活性なGAをキシコ単離されたアリューロン細胞はα−アミラーゼを分泌し、その活性は、例えばデンプンの分解の測定によりアッセイすることができる。
【0012】
(GA,GA3 ,GA4 及びGAn により示される)高い生物活性のために重要な構造的特徴はB−環のC−6上のカルボキシル基;C−19,C−10ラクトン;及びC−3におけるβ−水酸化である。C−2におけるβ−水酸化は(GA8 ,GA29,GA34及びGA51により示される)不活性を引きおこす。rht変異体はGA処理、例えばGA1 ,GA3 又はGA4 での処理に応答しない。
【0013】
GAでの処理は、好ましくは、水溶液を噴霧することにより、例えば水溶液中10-4MのGA3 又はGA4 を、週ごとに又はより頻繁に、噴霧することにより行われ、また噴霧でなく植物上に液滴をたらすことにより行ってもよい。GAは、有機溶媒、例えばエタノール又はアセトンに溶かして適用することができる。なぜならそれは水よりこれらにより可溶性であるからであるが、これは、これらの溶媒は植物を傷つける傾向があるので好ましくない。有機溶媒を用いるなら、適切な製剤は、80%エタノールに溶かした24ηlの0.6,4.0又は300mM GA3 又はGA4 を含む。植物、例えばアラビドプシスは、GAを含む培地、例えば寒天で固体化し、補給GAを含む組織培養培地(GM)上で成長させることができる。
【0014】
本発明による核酸は、トリチクムの野生型Rht遺伝子の配列を有しても、供される配列の突然変異体、誘導体、変異体又は対立遺伝子であってもよい。好ましい突然変異体、誘導体、変異体及び対立遺伝子は、野生型遺伝子によりコードされるタンパク質の機能的特徴、特にGAにより拮抗される植物成長阻害の能力、又は植物のGA処理に応答する1もしくは複数の他の特徴を植物に与える能力を保持するタンパク質をコードするものである。他の好ましい突然変異体、誘導体、変異体及び対立遺伝子はrht変異体表現型、即ち植物成長の減少であってその減少がGAに対して不感受性、即ちGA処理によって克服されないものを与えるタンパク質をコードする。突然変異体、変異体又は誘導体を生産するための配列の変化は、コードされるポリペプチド内の1又は複数のアミノ酸の付加、挿入、欠失又は置換を導く、核酸内の1又は複数のヌクレオチドの1又は複数の付加、挿入、欠失又は置換により行うことができる。もちろん、コードされるアミノ酸配列に差を生じない核酸の変化も含まれる。
【0015】
Rht遺伝子のための好ましいヌクレオチド配列は、配列番号1に示すRHTアミノ酸配列をコードするもの、特に配列番号2に示すRhtコーディング配列である。好ましいrht変異体は、配列番号1に下線で示される17アミノ酸のうちの一部もしくは全部、及び/又は配列番号1に下線で示される17アミノ酸配列の直後にある一部もしくは配列:
【0016】
【化1】
【0017】
を欠如する。
更に好ましいヌクレオチド配列は、添付のいずれかの他の図に示されるアミノ酸をコードし、特に図に示すコーディング配列である。更に、本発明の更なる実施形態は、全ての態様において、配列番号5,6,7,8,9,10又は11に示すアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を用いる。このようなコーディング配列は、配列番号12,13,14,15,16,17又は18に示されるものである。
【0018】
本発明は、その供される配列のいずれか1つの核酸を含む核酸構成物又はベクター、好ましくはその核酸配列によりコードされるポリペプチドがそれから発現され得る構成物又はベクターも供する。その構成物又はベクターは、好ましくは植物細胞への形質転換のために適している。本発明は、このような構成物又はベクターで形質転換された宿主細胞、特に植物細胞を更に含む。これにより、本発明による核酸を含む宿主細胞、例えば植物細胞が供される。その細胞内で、核酸は、染色体内に組み込むことができる。半数体ゲノム当りに1超の異種ヌクレオチド配列が存在し得る。これは、例えば、以下に議論するように、内因的なレベルと比べて、遺伝子産物の発現の増加を可能にする。
【0019】
本発明による核酸を含む構成物又はベクターは、特にそのベクターをゲノムへの組換えのために細胞内に核酸を導入するために用いる場合、プロモーター又は他の調節配列を含む必要はない。しかしながら、一態様において、本発明は、発現の調節のための調節配列に連結された(トリチクム以外からの相同体を含む)Rht又はrhtコーディング配列を含む核酸構成物を供する。ここでその調節配列は、そのコーディング配列に天然で融合しているもの以外のものであり、好ましくは別の遺伝子のもの又はそれから得られるものである。
【0020】
本発明による核酸分子及びベクターは、それらの天然の環境から単離されるなら、実質的に純粋もしくは均一な形態、又は開花を含み得る、成長及び/又は発達に作用し得るポリペプチドをコードする配列以外の関心の種もしくは起源の核酸もしくは遺伝子、例えばRhtコーディング配列以外のトリチクム・アエスチブム核酸を含まない、もしくは実質的に含まない単離物であり得る。用語“核酸単離物”には、全体的に又は部分的に合成された核酸を包含する。
【0021】
もちろん、核酸は、適切なら、二本鎖又は一本鎖、cDNA又はゲノムDNA、RNA、全体的又は部分的に合成したものであり得る。もちろん、本発明による核酸はRNAを含み、ここで示される配列の引用は、TのかわりにUでおきかえて、RNA等価物を包含するとして解釈すべきである。
本発明は、開示される核酸配列のいずれかの発現産物、及び適切な宿主細胞内で適切な条件下で、コーディング核酸からの発現により発現産物を生産する方法も包含する。当業者は、組換え遺伝子発現の産物の発現及び回収のためのベクター及びデザインプロトコルを十分に作製することができる。適切なら、プロモーター配列、ターミネーターフラグメント、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子及び他の配列を含む、適切な調節配列を含む、適切なベクターを選択し又は作製することができる。更なる詳細については、例えば、Molecular Cloning : a Laboratory Manual : 2nd edition, Sambrook ら、1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press を参照のこと。形質転換手順は用いる宿主に依存することが、十分知られている。核酸の操作のための多くの周知の技術及びプロトコル、例えば核酸構成物の調製、変異誘発、配列決定、DNAの細胞への導入及び遺伝子発現、並びにタンパク質の分析におけるものは、Protocols in Molecular Biology, Second Edition, Ausubel ら、eds, John Wiley & Sons, 1992に詳細に記載される。植物で広範囲に成功して以前に用いられている特定の手順及びベクターは、Bevan, Nucl. Acids Res. (1984) 12, 8711-8721、並びにGuerinean 及びMullineaux (1993) Plant transformation and expression vectors : Plant Molecular Biology Labfax (Croy RRD ed) Oxford, Bios ScientiPic Publisher, pp 121-148に記載される。Sambrookら及びAusubel ら並びに全ての他の本明細書に言及される文献の開示は引用により本明細書に組み込まれる。
【0022】
ポリヒスチジンタグとの融合物としての発現により、QIAGEN Inc.(USA)及びDIAGEN GmbH(Germamy)から利用できるNi−NTAを用いて行われるRht又はrhtの精製を行うことができる。Jarknecht ら(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 8972-8976 (1991) 並びにEP−A−0253303及びEP−A−0282042を参照のこと。Ni−NTA樹脂はタンパク質のN−又はC−末端近くに連続的ヒスチジンを有するタンパク質について高いアフィニティーを有するので、植物、植物の一部もしくは抽出物から、又はそのタンパク質を発現する組換え生物、例えばイーストもしくは細菌からヒスチジン標識化Rht又はrhtタンパク質を精製するのに用いることができる。
【0023】
精製されたRhtタンパク質、例えばコーディング核酸からの発現により組換え生産されたものを、当該技術分野で標準的である技術を用いて抗体を生じさせるために用いることができる。抗体及び抗体の抗原結合フラグメントを含むポリペプチドを、更に後述するように、他の種からの相同体を同定するのに用いることができる。
【0024】
抗体を生産する方法には、哺乳動物(例えばヒト、マウス、ラット、ウサギ、ウマ、ヤギ、ヒツジ又はサル)を、タンパク質又はそのフラグメントで免疫化することを含む。抗体は、当該技術で周知である種々の技術のいずれかを用いて免疫化動物から得ることができ、好ましくは関心の抗原への抗体の結合を用いて、スクリーニングすることができよう。例えば、ウエスタンブロット技術又は免疫沈降法を用いることができる(Armitageら、1992, Nature 357 : 80-82) 。抗体はポリクローナルでもモノクローナルでもよい。
【0025】
哺乳動物を免疫化するかわりとして又は補助として、適切な結合特異性を有する抗体は、例えば表面上に、機能的なイムノグロブリン結合ドメインを提示するラムダバクテリオファージ又は繊維状バクテリオファージを用いて、発現されるイムノグロブリン可変ドメインの組換え生産されたライブラリーから得ることができる。例えばWO92/01047を参照のこと。
【0026】
Rht又はrhtポリペプチドに対して生じた抗体は、相同なポリペプチド、及び後にそのコーディング遺伝子の同定及び/又は単離に用いることができる。これにより、本発明は、Rht機能又はrht変異体表現型を与える能力を有するポリペプチドを同定し又は単離する方法であって、トリチクム・アエスチブムRhtもしくはrhtポリペプチドに結合することができ、又は好ましくはこのようなポリペプチド、例えば配列番号1に示すアミノ酸配列を有するものについての結合特異性を有する抗体の抗原結合ドメインを含むポリペプチド(例えば完全な抗体又はそのフラグメント)で候補のポリペプチドをスクリーニングすることを含む方法を供する。
【0027】
スクリーニングのための候補ポリペプチドは、例えば、関心の植物から得られる核酸を用いて作られた発現ライブラリーの産物であっても、天然のソースからの精製過程の産物であってもよい。
抗体に結合することが見い出されたポリペプチドは単離することができ、次にアミノ酸配列決定にかけることができる。全体的に又は部分的にポリペプチドを配列決定するためにいずれかの適切な技術を用いることができる(例えばポリペプチドのフラグメントを配列決定することができる)。例えば更に後述されるように、候補核酸へのハイブリダイゼーションにおいてプローブ又はプライマーとして用いるための1又は複数のオリゴヌクレオチド(例えばオリゴヌクレオチドの縮重プール)をデザインすることにより、ポリペプチドをコードする核酸を得ることにおいて、アミノ酸配列情報を用いることができる。
【0028】
本発明の更なる態様は、トリチクム以外の植物種からのRht相同体を同定シ、クローン化する方法であって、配列番号57〜77もしくは配列番号3、又は本明細書の他の図に示すいずれか由来のヌクレオチド配列を用いる方法を供する。これら由来の配列は、それら自体、他の配列を同定し、クローン化することに用いることができる。本明細書に供されるヌクレオチド配列情報又はそのいずれか一部は、相同な配列を見い出すためにデータベースサーチに用いることができ、その発現産物はRht機能についてテストすることができる。あるいは、核酸ライブラリーは、当業者に公知の技術を用いてスクリーニングすることができ、それにより、相同な配列を同定し、次にテストすることができる。
【0029】
例えば、本発明は、Rht又はrht相同遺伝子を同定し及び/又は単離する方法であって、Rht機能を有するポリペプチドをコードする核酸又はそのフラグメント、変異体、誘導体もしくは対立遺伝子で候補(又は“標的”)核酸をプロービングすることを含む方法も供する。(例えばcDNA又はゲノムDNAであり得る)候補核酸は、このような相同体をコードする核酸を含み得る又は含むと予想されるいずれかの細胞又は生物から得ることができる。
【0030】
本発明のこの態様の好ましい実施形態において、候補核酸のプロービングのために用いる核酸は、コーディング配列に相補的である配列番号1に示すアミノ酸配列、又はこれらのいずれかのフラグメントをコードし、最も好ましくは配列番号3に示すヌクレオチド配列を含む。
あるいは、上述の通り、プローブは、配列番号1に示すRhtアミノ酸配列を有するもののようなRht又はrhtポリペプチドに結合することができる抗体の抗原結合ドメインに結合することができるものとして同定されるポリペプチドを配列決定することにより得られるアミノ酸配列情報を用いてデザインすることができる。
【0031】
プロービングのための好ましい条件は、更に研究することができる、陽性として同定される少数のハイブリダイゼーションで単純なパターンであるために十分にストリンジェントであるものである。少しだけの陽性クローンが残るまで、次第にハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを増加させることが当該技術分野で公知である。
【0032】
プロービングのかわりに、なお核酸ハイブリダイゼーションを用いるが、Rht遺伝子からDNA配列を増幅するようデザインしたオリゴヌクレオチドを、慣用的な手順を用いて、PCR又は他の核酸の増幅に関連する方法に用いることができる。例えば“PCRプロトコル;A Guide to Method and Applications”, Eds, Innisら、1990, Academic Press, New Yorkを参照のこと。
【0033】
プローブ又はPCRプライマーのデザインに用いるために適した好ましいアミノ酸配列は、Rht遺伝子間で(完全に、実質的に又は部分的に)保存された配列である。
アミノ酸配列情報に基づいて、遺伝コードの縮重、及び適切なら、候補核酸が得られる生物のコドン用法を考慮して、オリゴヌクレオチドプローブ又はプライマーをデザインすることができる。特に、プライマー及びプローブは、例えば配列番号1,3及び/又は配列番号1,7から明らかな保存された配列に基づく情報を用いてデザインすることができる。
【0034】
全長のコーディング核酸分子が得られていない場合、完全な分子の一部を表すより小さな分子を、全長のクローンを得るために用いることができる。挿入物は、例えば部分的なcDNAクローンから調製することができ、cDNAライブラリーをスクリーニングするために用いることができる。単離された全長のクローンは、ベクター、例えば発現ベクター又は植物への形質転換のために適したベクターにサブクローン化することができる。全長の配列を供するために重複したクローンを用いることができる。
【0035】
本発明は、Rhtをコードする核酸、又は配列番号57〜77又は配列番号3から得られるヌクレオチド配列を用いて得ることができる相同体、並びに表1に示す配列を含む1又は複数の、例えば一対のプライマーを用いて得ることができる核酸にも広げられる。
本発明の範囲内に、トリチクムのRhtによりコードされるポリペプチドの相同体であるアミノ酸配列をコードする核酸配列も含まれる。相同体は、トリチクム以外の種からのものであり得る。
【0036】
相同性はヌクレオチド配列及び/又はアミノ酸配列レベルであり得る。好ましくは、その核酸及び/又はアミノ酸配列は配列番号3のヌクレオチド配列によりコードされる配列と、好ましくは少くとも約50%、又は60%、又は70%、又は80%又は85%の相同性、最も好ましくは少くとも90%、92%、95%又は97%の相同性を有する。このようなポリペプチドをコードする核酸は、好ましくは、トリチクムRht遺伝子と、植物中での発現により特定の表現型、好ましくはGA応答性である表現型(即ちGAでの処理により植物の特徴に変化がおこる)を与える能力、例えば阻害がGAにより拮抗される植物成長を阻害する能力を共有し得る。注意すべきは、植物中でのRht発現は植物の1又は複数の他の特徴に作用し得る。トリチクムRht遺伝子と共有し得る好ましい特徴は、トリチクムのような植物においてRht又は変異体表現型を補給する能力である。ここで、このような表現型はパクロブトラゾールの矮性効果に対する耐性である。オオムギのslender変異体はコムギゲノム内のRhtのものと等価なオオムギゲノム内の位置に存在する。このような変異体植物は強力にパクロブトラゾール耐性である。本発明者らはslenderオオムギ変異体は、オオムギ変異体のコムギ遺伝子での補給を許容する、コムギRhtに対するオルソロガス遺伝子の又は変異体対立遺伝子である。オオムギにslender変異体を補給する能力は、本発明の実施形態の特徴であり得る。
【0037】
(本発明による核酸の実施形態によりコードされる)本発明によるポリペプチドの特定の好ましい実施形態には、配列番号1に下線で示される17アミノ酸配列、又は配列番号1に下線で示される17アミノ酸中の(位置に関して)各々の対応する残基と類似性もしくは同一性を有する少くとも約10残基、より好ましくは11,12,13,14,15,16もしくは17残基を有するアミノ酸の隣接配列、及び/又は配列:
【0038】
【化2】
【0039】
又は配列:
【0040】
【化3】
【0041】
内の(位置に関して)各々の対応する残基と類似性もしくは同一性を有する少くとも約5残基、より好ましくは6,7,8もしくは9残基を有するアミノ酸の隣接配列がある。更なる実施形態には、27アミノ酸配列:
【0042】
【化4】
【0043】
又はこの配列中の(位置に関して)各々の対応する残基と類似性もしくは同一性を有する少くとも約15残基、好ましくは16,17,18,19,20,21,22,23,24,25もしくは26残基を有するアミノ酸の隣接配列がある。
十分に理解されるように、アミノ酸レベルでの相同性は一般に、アミノ酸類似性又は同一性に関する。類似性は、“保存性変異”、即ち1つの疎水性残基、例えばイソロイシン、バリン、ロイシン又はメチオニンの他のものへの置換、又は1つの極性残基の他のものへの、例えばリシンのアルギニンへの、アスパラギン酸のグルタミン酸への、アスパラギンのグルタミンへの置換を許容する。類似性は、当該技術に標準的に用いられるAltschulら(1990) J. Mol. Biol. 215 : 403-10のTBLASTNプログラム、より好ましくは配列をアラインするためのNeedleman 及びWunschのアルゴリズムを用いるGAP(Program Manual for the Wisconsin Package, Version 8, September 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, USA)により規定され、決定される通りであり得る。GAPのための適切なパラメーターには、デフォルトパラメータ、ギャップ・クリエーション・ペナルティー=12及びギャップ・エクステンション・ペナルティー=4、又はギャップ・クリエーション・ペナルティー=3.00及びギャップエクステンション・ペナルティー=0.1がある。相同性は、配列番号1のRht配列の全長にわたってもよく、又は好ましくは配列:
【0044】
【化5】
【0045】
と比べて10アミノ酸の隣接配列、及び/又は配列番号1に下線で示される17アミノ酸と比べて17アミノ酸の隣接配列、及び/又は配列:
【0046】
【化6】
【0047】
と比べて27アミノ酸の連続配列、又は配列番号1のアミノ酸配列、好ましくは下線の17アミノ酸及び/又は配列:
【0048】
【化7】
【0049】
を含む配列と比べてより長い配列、例えば約30,40,50又はより多くのアミノ酸にわたってもよい。
核酸レベルにおいて、相同性は、全長にわたっても、又は好ましくは配列番号3の配列内の30ヌクレオチドコーディング配列及び配列:
【0050】
【化8】
【0051】
をコードする配列及び/又は配列番号3の配列内の51ヌクレオチドコーディング配列及び配列番号1に下線で示す17アミノ酸配列をコードする配列、又はより長い配列、例えば約60,70,80,90,100,120,150又はより多くのヌクレオチド、好ましくは配列番号1の下線の17アミノ酸をコードする配列番号3の51ヌクレオチドを含む配列によってもよい。
【0052】
注意すべきは、類似性は、当該技術で標準的に用いられるAltschulら(1990) J. Mol. Biol. 215 : 403-10のTBLASTNプログラム、又はWisconsin Package, Version 8, September 1994, (Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA, Wisconsin 53711)の一部である標準的プログラムBestFitにより規定され、決定される。BestFitは、2つの配列間の類似性の最も優れたセグメントの最適なアラインメントを作り出す。最適なアラインメントは、Smith 及びWaterman(Adv. Appl. Math. (1981) 2 : 482-489)の局所的相同性アルゴリズムを用いて対の数を最大にするようにギャップを挿入することにより見い出される。他のアルゴリズムには、対の数を最大にし、かつギャップの数を最小にするよう2つの完全な配列をアラインするためにNeedleman 及びWunschアルゴリズムを用いるGAPがある。いずれのアルゴリズムであっても、一般に、GAPギャップ・クリエーション・ペナルティー=12及びギャップエクステンション・ペナルティー=4であるデフォルトパラメータが用いられる。(Pearson及びLipman(1988) PNAS USA 85 : 2444-2448 の方法を用いる)アルゴリズムFASTAが更にかわりとして用いられる。
【0053】
本明細書の用語“相同性”及び“相同な”のいずれの使用も、例えば2つのヌクレオチド配列が適切な条件下で組換えるために十分に類似していることを単に要求する“相同時組換え”のような用語の標準的使用において、比較される配列間のいずれの必要な進化的な関係も包含しない。本発明による核酸によりコードされ得る本発明によるポリペプチドの更なる議論は以下に記す。
【0054】
本発明は、ストリンジェント条件下で本明細書に開示されて特定の配列のいずれか一又は複数のものとハイブリダイズする核酸も包含する。
ハイブリダイゼーションは、核酸でプロービングし、そして(周知の技術に従って)適切なストリンジェント条件下でポジティブなハイブリダイゼーションを同定することにより決定することができる。プロービングのために、好ましい条件は、更に研究することができる陽性として同定される少数のハイブリダイゼーションで単純なパターンであるのに十分にストリンジェントであるものである。少い陽性クローンだけが残るまで次第にハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを増加させるために当該技術で公知である。
【0055】
プローブの標的核酸(例えばDNA)への結合は、当業者の自由に種々の技術のいずれかを用いて測定することができる。例えば、プローブは、放射能で、蛍光で、又は酵素により標識することができる。プローブの標識化を用いない他の方法には、制限フラグメント長多形性の検査、PCRを用いる増幅、RNAse開裂及び対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプロービングがある。
【0056】
プロービングは、標準的なサザン・ブロット技術を用いることができる。例えば、DNAは細胞から抽出し、異なる制限酵素で消化することができる。次に、制限フラグメントは、変性前に、アガロースゲルでの電気泳動により分離し、そしてニトロセルロースフィルターに移すことができる。標識化プローブは、フィルター上でDNAフラグメントにハイブリダイズさせ、結合を決定することができる。プロービングのためのDNAは、逆転写酵素−PRCのような技術により細胞からのRNA調製物から調製することができる。
【0057】
制限酵素で消化したDNAのサザンブロットに低ストリンジェンシー条件下で種々のプローブをハイブリダイズさせることにより予備実験を行うことができる。プロービングのために、好ましい条件は、更に研究することができる陽性として同定される少数のハイブリダイゼーションで単純なパターンであるのに十分にストリンジェントである条件である。少しの陽性クローンだけが残るまで、次第にハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを増加させることが当該技術で公知である。適切な条件は、バックグラウンドハイブリダイゼーションが低い時に多数のハイブリダイズするフラグメントが得られる時に達成されるであろう。これらの条件を用いて、核酸ライブラリー、例えば発現される配列の代表的なcDNAライブラリーを調査することができる。当業者は、オリゴヌクレオチド長並びに塩基組成、温度等のような因子を考慮して、選択的ハイブリダイゼーションのための要求されるストリンジェンシーの適切な条件を十分に用いることができる。
【0058】
例えば、スクリーニングは、約37℃又はそれ超の温度、約50%未満のホルムアミド濃度、及び中〜低の塩(例えばStandard Saline Citrate(‘SSC’)=0.15M塩化ナトリウム;0.15Mクエン酸ナトリウム;pH7)濃度を含む条件下で最初に行うことができる。
あるいは、約50℃又はそれ超の温度及び高い塩(例えば‘SSPE’=0.186mM塩化ナトリウム;9mMリン酸水素二ナトリウム;9mMリン酸二水素ナトリウム;1mM EDTAナトリウム;pH7.4)で行うことができる。好ましくは、スクリーニングは約37℃、約20%のホルムアミド濃度、及び約5×SSCの塩濃度、又は約50℃の温度及び約2×SSPEの塩濃度で行われる。これらの条件により、安定なハイブリッドの同定のための完全な相同性を要求することなく、プローブ配列との実質的な相同性(類似性、同一性)を有する配列を同定することができよう。
【0059】
適切な条件には、例えば約80〜90%の同一性である配列の検出のために、42℃で一晩の、0.25MのNa2 HPO4 ,pH7.2,6.5%のSDS,10%のデキストランスルフェートでのハイブリダイゼーション及び0.1×SSC,0.1% SDS中で55℃での最後の洗浄がある。約90%の同一性により大きい配列の検出のために、適切な条件には、65℃で一晩の、0.25M Na2 HPO4 ,pH7.2,6.5%のSDS,10%のデキストランスルフェート中でのハイブリダイゼーション及び0.1×SSC,0.1% SDS中で60℃での最後の洗浄がある。
【0060】
Rht遺伝子と他のものからの相同体とを区別するために用いることができる条件は、以下の手順を含み得る。
第1及び第2のDNA分子をアガロースゲル上に走らせ、メンブランフィルターにブロットする(Sambrookら、1989)。そのフィルターを、一定に振とうしながら、5時間、65℃で、プレハイブリダイゼーション溶液(6×SSC,5×Denhart’s溶液、20mM Tris−HCl,0.1% SDS,2mM EDTA,20μg/mlサケ***DNA)中でインキュベートする。次に、その溶液を放射能標識化第2DNAを含む30mlの溶液に置換し(標準的技術に従って調製したもの;Sambrookら、1999を参照のこと)、一定に振とうしながら65℃で一晩、インキュベートする。次の朝に、フィルターをそそぎ(3×SSC−0.1% SDS溶液で1回、そそぐ)、次に洗う:65℃で25分、3×SSC−0.1% SDS溶液での第1の洗浄;及び同じ時間、同じ温度で0.1×SSC−0.1% SDSでの第2の洗浄。次に、そのフィルター上の放射線パターンを標準的な技術を用いて記録する(Sambrookら、1989を参照のこと)。
【0061】
必要なら、ストリンジェンシーは、洗浄の温度を増加させ、及び/又はSSCini洗浄液を減少させ又は全く省略することにより増加させることができる。 (SSCは、150mM NaCl,15mMクエン酸ナトリウムである。50×Denhart’s溶液は1%(w/v)ficoll,1%ポリビニルピロリドン、1%(w/v)ウシ血清アルブミンである)。
【0062】
rht変異体に対する相同性も本発明によって供される。これらは、野生型が、配列番号1に下線で示す17アミノ酸、又は配列番号1に下線で示す17アミノ酸中の対応する残基と類似性又は同一性を有する少くとも約10(より好ましくは11,12,13,14,15,16又は17)アミノ酸を有する17アミノ酸の隣接アミノ酸を含むが、変異体はそうでない場合、変異体であり得る。同様に、野生型が、配列:
【0063】
【化9】
【0064】
又は配列:
【0065】
【化10】
【0066】
中の対応する残基と類似性もしくは同一性を有する少くとも約5(より好ましくは6,7,8又は9)アミノ酸を有する10アミノ酸の隣接配列を含むが変異体はそうでない場合であり得る。このような変異体ポリペプチドをコードする核酸は、植物内での発現に基づいて、(GAの供給又は涸渇に基づき植物中でいくらかの応答があり得るが)GAでの植物の処理に基づき克服されない又は野生型表現型にもどらない変異体表現型である、GAでの植物の処理に不感受性又は非応答性である表現型を与える。
【0067】
本発明の更なる態様は、配列番号1に示す種トリチクム・アエスチブムのRhtアミノ酸配列の突然変異体、対立遺伝子、誘導体もしくは変異体配列であり、又は他の種の相同体もしくはその突然変異体、対立遺伝子、誘導体、もしくは変異体であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する核酸単離物を供する。ここでその突然変異体、対立遺伝子、誘導体、変異体又は相同体は1又は複数のアミノ酸の挿入、欠失、付加及び/又は置換により配列番号1に示すアミノ酸と異なる。それらは、パクロブトラゾールの矮小効果に対して耐性であるRht又は変異体表現型を有する植物をテスト核酸で形質転換することによりトランスジェニック植物を生産し、そのトランスジェニック植物内でテスト核酸から発現を引きおこし又は許容し、そのトランスジェニック植物をRht又は変異体表現型の補給を示すものについてスクリーニングしてRht又は変異体を補給することができるテスト核酸を同定し、そのRht又は変異体を補給することができるとして同定された核酸から、配列番号1に下線で示す17アミノ酸又は配列番号1に下線で示す17アミノ酸中の対応する位置内の各々のアミノ酸と類似性又は同一性を有する少くとも10残基、より好ましくは11,12,13,14,15,16又は17残基を有する隣接17アミノ酸をコードするヌクレオチド配列、及び/又は配列:
【0068】
【化11】
【0069】
をコードするヌクレオチド配列又は配列:
【0070】
【化12】
【0071】
中の対応する残基と類似性又は同一性を有する少くとも約5(より好ましくは6,7,8又は9)残基を有する10アミノ酸の隣接配列を削除することにより得ることができる。
本発明の核酸を含む細胞、特に植物細胞又は細菌細胞は本発明の更なる態様を形成する。
【0072】
その細胞は、核酸の細胞又はその祖先への導入により、例えば当業者に利用できるいずれかの適切な技術を用いる形質転換により、タンパク質をコードする核酸を含み得る。
本発明によれば、ゲノム内に組み込まれた開示される核酸を有する植物細胞も供する。
【0073】
完全な天然の配列を用いる場合、その植物細胞はその配列の天然の宿主以外の植物のものであり得る。
本発明は、このような植物細胞を含む植物も供する。
本発明によれば、発現の制御のための調節配列の作用的制御下で、本発明により供されるヌクレオチドの配列をそのゲノム内に組み込んだ植物細胞も供する。
【0074】
本発明の更なる態様は、このような植物細胞を生産する方法であって、ヌクレオチドの配列を含むベクターを植物細胞に導入し、そしてそのベクターと植物細胞との間の組換えを引きおこし又は許容してヌクレオチドの配列をゲノム内に導入することに関する方法も供する。
本発明による植物は、1又は複数の特性において本気に受粉しないものであり得る。植物品種、特に植物育種者の権利による登録可能な植物品種は排除される。植物は“植物品種”であると考える必要はないことに注意のこと。なぜならそれは、植物又はその祖先の細胞内に導入されたトランスジーンをゲノム内に安定に含むだけだからである。
【0075】
植物に加えて、本発明は、このような植物のいずれかのクローン、種子、自家又はハイブリッド子孫及び後継、並びにこれらのいずれかのいずれか一部、例えば挿穂(cutting)、種子を供する。本発明は挿穂、種子等を含む、有性又は無性的な再生又は繁殖に用いることができるいずれか一部であるいずれかの植物零余子を供する。このような植物の有性的又は無性的に繁殖された子孫、クローンもしくは後継、又はその植物、子孫、クローンもしくは後継のいずれか一部もしくは零余子も本発明に含まれる。
【0076】
本発明は更に、植物の細胞内での異種Rht又はrht遺伝子配列(又は議論されるようなその突然変異体、対立遺伝子、誘導体もしくは相同性)の発現を含む、植物の特徴に影響を与える方法を供する。用語“異種”は、問題のヌクレオチドの遺伝子/配列が、遺伝子工学を用いて、即ち形質転換を含み得るヒトの介入により、前記植物の細胞又はその祖先に導入されていることを示す。その遺伝子は、ゲノム外ベクター上にあっても、ゲノム内に好ましくは安定に組み込まれてもよい。異種遺伝子は、内因性の等価な遺伝子、即ち成長及び/又は発達の制御下で同じ又は類似する機能を通常、行うものであってもよく、又はその挿入された配列は、内因性遺伝子に加えてもよい。異種遺伝子の導入の利点は、遺伝発現、並びにそれにより優性に従った植物の成長及び/又は発達に影響を与えることができるために、選択されたプロモーターの制御下に遺伝子の発現をおく能力である。更に、野生型遺伝子の突然変異体及び誘導体は、内因性遺伝子のかわりに用いることができる。挿入された遺伝子は宿主細胞に対して外のもの又は外来性、例えば別の植物種のものであってもよい。
【0077】
本発明を用いて変化させることができる原則的特徴は成長である。
成長レプレッサーとしてのRht遺伝子のモデルによれば、遺伝子の下降制御は、少くとも(例えば補うであろう内因性相同体を有するアラビドプシス(Arabidopsis)でない)Rht機能を与える唯一の内因性遺伝子を有する植物において、成長を促進するために用いることができる。これは、アンチセンス又はセンス制御の使用に関連し得る。丈の高い植物は、関心の植物中のRht又は関連する相同体をバックアウトすることにより作ることができる。例えば雑草を矮小に維持するためのGA生合成インヒビターの使用を許容するが作物を高く成長させるため、パクロブトラゾールのようなGA生合成を阻害する化合物に対して耐性である植物を作ることができる。
【0078】
Rht遺伝子の過剰発現は、Rht抑制モデルにより予想されるように、GAでの処理により補うことができる矮性植物を導き得る。
rht変異体遺伝子は表現型において優先であるので、それらは、GA不感受性矮性植物を作るために用いることができる。これは、例えばいずれかの形質転換可能な作物、樹木又は果樹種に適用することができる。それは、Rhtコムギのようなより高収率/少い倒伏を供し得る。コメにおいて、これは、日本及び他所で問題となっているBakane病に対するGA不感受性のコメを供することができる。矮性装飾植物は、園芸及び切り花市場のために価値あるものであり得る。配列操作は、種々の程度の激しさの矮小、GA不感受性表現型を供し得、各々の作物の必要性又は操作者の希望に対して激しさの程度を調節を許容する。rht変異体配列の過剰発現は潜在的に最も有用である。
【0079】
変化させることができる第2の特徴は植物発達、例えば開花である。特定の植物において、及び特定の環境条件において、GAシグナルは開花誘導のために必要とされる。例えば、短日条件下で成長させたGA欠損変異体アラビドプシス植物はGAで処理しなければ開花しないであろう:これらの植物は、長日条件下で成長する時に正常に開花する。アラビドプシス・ガイ(Arabidopsis gai)変異体植物は、短日条件下で開花の遅れを示す:激しい変異体は全く開花することができない。これにより、例えばRht又はrht遺伝子発現又は過剰発現により、開花を誘導するための所定のGA処理まで生長を保持する植物を生産することができる。これは、園芸の分野において又は抽苔の抑制が要求されるホウレンソウ、レタス及び他の作物のために役立つ。
【0080】
本発明による核酸は、使用者の制御下にRht又はrhtコーディング配列をおくために外から誘導できる遺伝子プロモーターの制御下におくことができる。 プロモーターに適用される用語“誘導可能(誘導性)”は、当業者に十分に理解される。本質において、誘導性プロモーターの制御下の発現は、“スイッチ・オン”され、又は適用された刺激に応答して増加する。それら刺激の性質はプロモーター間で多様である。特定の誘導性プロモーターは適切な刺激の欠如下で極めて少い又は検出できないレベルの発現を引きおこす(又は発現しない)。他の誘導性プロモーターは、刺激の欠如下で検出可能な構成物発現を引きおこす。発現のレベルが刺激の欠如下にあっても、正常な刺激の存在下でいずれの誘導性プロモーターからの発現も増加する。好ましい刺激は発現のレベルが表現型の特徴を変えるために有効な量による関連する刺激の適用に基づいて増加する場合である。これにより、レベルが低すぎて要求される表現型をもたらさない(実質的にゼロであり得る)刺激の欠如下で発現の基底レベルを引きおこす誘導性(又は“スイッチ可能な”)プロモーターを用いることができる。刺激の適用に基づいて、要求される表現型をもたらすレベルに発現は増加される(又はスイッチ・オンにされる)。
【0081】
適切なプロモーターには、本質的に全ての植物組織において高レベルで発現されるカリフラワーモザイクウィルス35S(CaMV 35S)遺伝子プロモーター(Benfeyら、1990a及び1990b);外来性のセーフナーの適用に応答して活性化されるトウモロコシグルタチオン−S−トランスフェラーゼ異型II(GST−II−27)遺伝子プロモーター(WO93/01294,ICI Ltd);植物の頂端***組織及び植物体内のいくつかの十分に局在化した位置、例えば内生師部、花の原基、根及び苗条内の分岐点で発現されるカリフラワーmeri5プロモーター(Medford, 1992 ; Medford ら、1991) 並びに花の発達において極めて初期に発現されるアラビドプシス・タリアナ(Arabidopsis thaliana)LEAFYプロモーター(Weigelら、1992)がある。
【0082】
GST−II−27遺伝子プロモーターは、成長中の植物に適用することができる特定の化学的化合物により誘導されることが示されている。プロモーターは、単子葉及び双子葉植物の両方で機能的である。それゆえ、それは、畑の作物、例えばカノーラ、ひまわり、タバコ、シュガービート、綿;穀類、例えばコムギ、オオムギ、コメ、トウモロコシ、モロコシ類;果樹、例えばタバコ、マンゴー、モモ、リンゴ、西洋ナシ、イチゴ、バナナ、及びメロン;及び野菜、例えばニンジン、レタス、キャベツ及びオニオンを含む。遺伝的に改変された種々の植物内で遺伝子発現を制御するために用いることができる。GST−II−27プロモーターは、根、葉、幹及び再生した組織を含む、種々の組織に用いるためにも適している。
【0083】
従って、本発明は、更なる態様において、本発明により供されるヌクレオチド配列、例えばトリチクムのRht遺伝子、他の植物種からの相同体又はそのいずれかの変異体、誘導体もしくは対立遺伝子に作用可能に連結された誘導性プロモーターを含む遺伝子構成物を供する。これは、遺伝子の発現の制御を可能にする。本発明は、前記遺伝子構成物で形質転換された植物、並びにこのような構成物の植物細胞への導入及び/又は適切な刺激、有効な外来インデューサーの適用による植物細胞内での構成物の発現の誘導を含む方法も供する。プロモーターは、GST−II−27遺伝子プロモーター又はいずれかの他の誘導性植物プロモーターであり得る。
【0084】
選択された遺伝子構成物を細胞に導入する場合、特定の考慮がされなければならず、これは当業者に公知である。挿入すべき核酸は、転写を駆動するであろう有効な調節因子を含む構成物内でアセンブルされるべきである。その構成物を細胞に輸送する方法が利用できなければならない。構成物が細胞膜内にあるなら、内因性染色体材料への組込みは行っても行わなくてもよい。最後に、植物を考慮する限り、標的細胞型は、細胞が完全な植物に再生され得るようでなければならない。
【0085】
抗生物質、例えばカナマイシン、ヒグロマイシン、ホスフィノトリシン、クロルスルフロン、メトトレキセート、ゼンタマイシン、スペクチノマイシン、イミダゾリノン及びグリホセートに対する耐性のような選択的表現型を与えるキメラ遺伝子からなる選択遺伝子マーカーを用いることができる。
本発明の一態様は、トランスジェニック植物の生産における本発明による核酸の使用である。
【0086】
更なる態様は、核酸を植物細胞に導入し、そしてその核酸の細胞のゲノム内への組込みを引きおこし又は許容することを含む方法を供する。
植物形質転換のいずれかの適切な方法を用いて本発明に従って、核酸を含む植物細胞を作り出すことができる。形質転換の後、植物は形質転換された植物細胞及び組織から再生することができる。
【0087】
上手く形質転換された細胞及び/又は植物、即ちそれらのゲノム内に組み込まれた構成物で形質転換されたものは、核酸の植物細胞への導入の後、任意に植物への再生の後、例えば1又は複数のマーカー遺伝子、例えば抗生物質耐性を用いて(上述)、選択することができる。
その配列を含むDNAセグメントで形質転換された植物は、植物の遺伝子操作のために既に知られている標準的な技術によって作り出すことができる。DNAは、いずれかの適切な技術、例えばその天然の遺伝子転移能力を利用するアグロバクテリウムにより行われるジスアームドTi−プラスミド・ベクター(EP−A−270355,EP−A−0116718,NAR12(22)8711−87215 1984)、パーティクル又はマイクロプロジェクティルボンバードメント(US5100792,EP−A−444882,EP−A−434616)、マイクロインジェクション(WO92/09696,WO94/00583,EP331083,EP175966,Green ら(1987) Plant Tissue and Cell Culture, Academic Press)、エレクトロポレーション(EP290395,WO87066/4 Gelvin Debeyser−添付を参照のこと)、他の形態の直接的DNA取込み(DE4005152,WO9012096,US4684611)。リポソーム媒介DNA取込み(例えばFreeman ら、Plant Cell Physiol. 29 : 1353 (1984)) 、又はボルテキシング法(例えば Kindle, PNAS U.S.A. 87 : 1228 (1990d))を用いて植物細胞に形質転換することができる。植物細胞の形質転換のための物理的方法はDard, 1991, Biotech. Adv. 9 : 1-11を参照のこと。
【0088】
アグロバクテリウム形質転換は、双子葉種を形質転換するために当業者により広く用いられている。現在、ほとんど全ての経済的に関連のある単子葉植物中での安定な繁殖力のあるトランスジェニック植物のルーチン的な生産に対する実質的な進行がある(Toriyama, et al. (1988) Bio/Technology 6, 1072-1074 ; Zhang, et al. (1988) Plant Cell Rep. 7, 379-384 ; Zhang, et al. (1988) Theor Appl Genet 76, 835-840 ; Shimamoto, et al. (1989) Nature 338, 274-276 ; Datta, et al. (1990) Bio/Technology 8, 736-740 ; Christou, et al. (1991) Bio/Technology 9, 957-962 ; Peng, et al. (1991) International Rice Research Institute, Manila, Philippines 563-574 ; Cao, et al. (1992) Plant Cell Rep. 11, 585-591 ; Li, et al. (1993) Plant Cell Rep. 12, 250-255 ; Rathore, et al. (1993) Plant Molecular Biology 21, 871-884 ; Fromm, et al. (1990) Bio/Technology 8, 833-839 ; Gordon-Kamm, et al. (1990) Plant Cell 2, 603-618 ; D'Halluin, et al. (1992) Plant Cell 4, 1495-1505 ; Walters, et al. (1992) Plant Molecular Biology 18, 189-200 ; Koziel, et al. (1993) Biotechnology 11, 194-200 ; Vasil, I.K. (1994) Plant Molecular Biology 25, 925-937 ; Weeks, et al. (1993) Plant Physiology 102, 1077-1084 ; Somers, et al. (1992) Bio/Technology 10, 1589-1594 ; WO92/14828) 。特に、アグロバクテリウム媒介性形質転換は、単子葉植物における極めて有効な形質転換法としても、現在、出現している(Hieiら(1994) The Plant Journal 6, 271-282) 。
【0089】
繁殖できるトランスジェニック植物の生産は、穀類コメ、トウモロコシ、コムギ、オート、及びオオムギにおいて達成されている(Shimamoto, K. (1994) Current Opinion in Biotechnology 5, 158-162. ; Vasil, et al. (1992) Bio/Technology 10, 667-674 ; Vain et al., 1995, Biotechnology Advances 13 (4) : 653-671 ; Vasil, 1996, Nature Biotechnology 14 page 702に報告される)。
【0090】
マイクロプロジェクティルボンバードメント、エレクトロポレーション及び直接的取込みは、アグロバクテリウムが無能又は無効である場合に好ましい。あるいは、異なる技術の組合せ、例えばアグロバクテリウムコート化マイクロパーティクルでのボンバードメント(EP−A−486234)又は傷を誘導するためのマイクロプロジェクティルボンバードメントの後のアグロバクテリウムとの同時培養を形質転換過程の効率を増強するために用いることができる。
【0091】
ブラシカ・ナプス形質転換はMoloney ら(1989) Plant Cell Reports 8 : 238-242に記載される。
形質転換の後、植物は、例えば単細胞、カルス組織又は葉ディスクから、当該技術分野で標準であるように再生することができる。ほぼいずれの植物でも、植物の細胞、組織及び器官から完全に再生することができる。利用できる技術は、Vasil ら(Cell Culture and Somatic Cel Genetics of Plants, Vol I, II及びIII, Laboratory Procedure and Ther Applications, Academic Press, 1984)及びWeissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, 1989に報告される。
【0092】
形質転換技術の特定の選択は、特定の植物種を形質転換する効率並びに選択された特定の方法で本発明を実施するヒトの経験及び好みにより決定されよう。植物細胞に核酸を導入するための形質転換システムの特定の選択は本発明に本質的でなく、又は本発明を限定するものでもなく、また植物再生のための技術の選択でもないことは当業者に明らかであろう。
【0093】
本発明において、過剰発現は、センス方向にヌクレオチド配列を導入することにより達成することができる。これにより、本発明は、植物の特徴に影響を与える方法であって、植物の細胞内で核酸から本発明による核酸の発現を引きおこし又は許容することを含む方法を供する。
遺伝子産物ポリペプチドの下降発現は、アンチセンス技術又は“センス制御”を用いて達成することができる。アンチセンス遺伝子又は部分的遺伝子配列の遺伝子発現を下降制御するための使用は現在、十分に確立されている。DNAは、そのDNAの“アンチセンス”鎖の転写が標的遺伝子の“センス”鎖から転写される通常のmRNAに相補的であるRNAを作り出すように、プロモーターの制御下におかれる。二本鎖DNAのために、これは、コーディング配列又はそのフラグメントをプロモーターの制御下に“逆方向”におくことにより達成される。相補的アンチセンスRNA配列は、次に、mRNAと結合して二本鎖を形成し、標的遺伝子からの内因性mRNAのタンパク質への翻訳を阻害すると考えられる。これが、実際の作用の態様であるか否かはまだ不確かである。しかしながら、技術は確立されている。例えば、Rothstein et al, 1987 ; Smith et al, (1988) Nature 334, 724-726 ; Zhang et al, (1992) The Plant Cell 4, 1575-1588, English et al., (1996) The Plant Cell 8, 179-188 。Antisense technology is also reviewed in reviewed in Bourque, (1995), Plant Science 105, 125-149, and Flavell, (1994) PNAS USA 91, 3490-3496を参照のこと。
【0094】
逆方向にあるコーディング配列に対応する完全な配列は用いる必要はない。例えば、十分な長さのフラグメントを用いることができる。アンチセンス阻害のレベルを最適にするためにコーディング配列の種々の部分から種々の大きさのフラグメントをスクリーニングすることは当業者にとって慣用的な事項である。開始メチオニンATGコドン、及びおそらくその開始コドンの上流に1又は複数のヌクレオチドを含めることが有利であり得る。更なる可能性は、遺伝子の調節配列、例えば耐性が要求される1又は複数の病原体中に1又は複数の遺伝子の特徴的な配列を標的にすることである。適切なフラグメントは、少くとも約14〜23ヌクレオチド、例えば約15,16もしくは17又はそれ超、少くとも約25、少くとも約30、少くとも約40、少くとも約50、又はそれ超のヌクレオチドを有し得る。他のフラグメントは、少くとも約300ヌクレオチド、少くとも約400ヌクレオチド、少くとも約560ヌクレオチド、少くとも約600ヌクレオチド、少くとも約700ヌクレオチド又はそれ超であり得る。このようなセンス方向のフラグメントは、同時抑制に用いることができる(以下を参照のこと)。
【0095】
配列の全体の相補性は本質的ではないが、好ましい。1又は複数のヌクレオチドは標的遺伝子からアンチセンス構成物において異なり得る。特に植物細胞中に存在する条件下で、各々のアンチセンス及びセンスRNA分子がハイブリダイズするために十分な相同性があることが好ましい。
これにより、本発明は、植物の特徴に影響を与える方法であって、植物の細胞内で本発明による核酸からのアンチセンス転写を引きおこし又は許容することを含む方法も供する。
【0096】
標的遺伝子の更なるコピーが標的遺伝子と同じ方向であるセンス方向で挿入される場合、標的遺伝子からのタンパク質の過剰発現がおこる個体及び下降発現がおこるいくらかの個体を含む所定範囲の表現型が作られる。その挿入された遺伝子が内因性遺伝子の一部だけである場合、トランスジェニック集団中の下降発現する個体の数は増加する。センス制御、特に下降制御がおこるメカニズムは十分に理解されていない。しかしながら、この技術は、科学及び特許文献にも十分に報告され、遺伝子制御のために慣用的に用いられる。例えば、van der Krol et al., (1990) The Plant Cell 2, 291-299 ; Napoli et al., (1990) The Plant Cell 2, 279-289 ; Zhang et al., (1992) The Plant Cell 4, 1575-1588, and US-A-5,231,020も参照のこと。
【0097】
これにより、本発明は、植物の特徴に影響を与える方法であって、植物の細胞内で本発明による核酸からの発現を引きおこし又は許容することを含む方法も供する。これは、成長に影響を与えるために用いることができる。
本発明の態様及び実施形態は、添付の図面を引用して例により詳述されよう。更なる態様及び実施形態は当業者に明らかであろう。本明細書に言及される全ての文献は引用により本明細書に組み込まれる。
【0098】
以前に、我々は、アラビドプシスのGAI遺伝子をクローン化した(PCT/GB97/00390−WO97/29193,1997年8月14日公開)。野生型(GAI)のDNA配列と変異体(gai)対立遺伝子との比較は、gaiが、タンパク質のN末端近くからの17アミノ酸のセグメントを欠如する変異体の予想されるタンパク質産物(gai)をコードすることを示した。DNA配列データベースのGAI配列でのスクリーニングは、gaiタンパク質中のGAIから削除されたセグメントのものに極めて密接に関連した配列の領域を含むコメEST(D39460)の存在を示した。領域DELLA(配列番号107)からEQLE(配列番号108)への予想されるアミノ酸配列の比較は両方の配列で同じである。2つの差(V/A;E/D)は保存性置換であり、ここで、1つのアミノ酸残基は極めて類似した化学特性を有する別のものに置換されている。更に、同一性の領域はgaiタンパク質内の欠失領域の境界を超えて広がっている。配列:
【0099】
【化13】
【0100】
はgai中の欠失により影響を受けないが、GAI(配列番号78)とD39460配列(配列番号79)との間で完全に保存されている。
D39460の約760bpのSalI−NotIサブフラグメントを、コムギcDNA及び(種々のChinese SpringからのDNAから作った)ゲノムライブラリーから並び(系統B73Nから作った)トウモロコシゲノムライブラリーからハイブリダイズするクローンを単離するために低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション実験に用いた。C15−1及びC15−10(cDNA)、並びに5al及び14al(ゲノムクローン)を含むいくつかのコムギクローンを単離した。クローンC15−1は遺伝子マッピング実験に用いられている。零染色体−4染色体分析は、クローンC15−1がコムギ染色体4A,4B及び4D由来のゲノムDNAフラグメントとハイブリダイズすることを示した。これは、Rht座がグループ4染色体にマッピングされるので、Rht配列を含むクローンC15−1と一致する。更に、Rht−Dlb(以前はRht2)対立遺伝子について分離する集団を用いる組換え体分析は、変異体対立遺伝子との完全な同時分離を示すハイブリダイズするフラグメントを同定した。これは、グループ4染色体の(Rhtを含むことが既に知られていた)2cMセグメント内のcDNA C15−1中のmRNA配列をコードする遺伝子のゲノム位置に位置し、cDNA及びゲノムクローンが実際Rht遺伝子を含むという強力な証拠を供した。ここで開示されるトウモロコシD8 DNA配列は1alからのサブクローン化した隣接1.8kb及び3.0kb SalIフラグメント(BluescriptTM SK+ にクローン化したもの)からのものである。ここで開示されるコムギRht配列はクローン5alから(BluescriptTM SK+ にクローン化した)5.7kb DraIサブフラグメントである。
【0101】
配列番号57は、cDNA C15−1の完全な(シングルパス)DNA配列を供する。我々は、C15−10のためのDNA配列も得て;それはC15−1のものと同一であり、それゆえ示さない。配列番号58〜70及び配列番号71〜77はクローン14al及び5alからの個々の配列決定のランからのオリジナルのデータを示す。配列番号57〜77に示す配列は、配列番号3に示す複合DNA配列を作るために重複させることができる。この配列は、配列番号2に示すGAIのもの(GAI)との、コムギ配列の予想される翻訳産物(Rht)のアミノ酸配列(配列番号1)の比較により示される通り、アラビドプシスGAIのものとの強力な相同性を示す。特に、仮定上のRhtの予想されるアミノ酸配列は、gai内で失った領域中にわたってGAIとの近同一性の領域を示す。図4(配列番号1,2,20)は、コメEST内のgai削除領域を超えて広がる相同性がRht(
【0102】
【化14】
【0103】
)内でも保存されていることを示し、これにより、この領域は、gai欠失において見い出されるものに加えて、GAシグナル伝達に関連することを示す。この領域は、GAIに配列において関連するがGAシグナル伝達には関連しない他のタンパク質であるSCRにおいて見い出されない。上述の配列決定実験に用いたプライマーを表1に示す(配列番号21〜55)。
【0104】
これらの配列が実際にコムギRht及びトウモロコシD8座であることの更なる確認は、以下の通り、種々の変異体対立遺伝子からの遺伝子配列の分析により得られている。
本発明者らは、そのクローンを得て配列決定し、コメEST D39460としてデータベースに基づいて同定した。この研究から生じた予想されるアミノ酸配列を各々配列番号12及び配列番号5に示す。
【0105】
アラビドプシスのGAI遺伝子に基づく以前の研究は、GAIタンパク質が2つのセクション、周知の機能のいずれかのタンパク質とも相同性を示さないN末端半分、及びアラビドプシスSCR候補転写因子(Pengら、(1997) Genes and Development 11 : 3194-3205 : PCT/GB97/00390) と広範囲の相同性を示すC末端半分からなることを示した。上述の通り、タンパク質のN末端半分の一部分の欠如はgai変異体対立遺伝子のGA応答特性を減少させる(Pengら、1997 ; PCT/GB97/00390)。それゆえ、本発明者らは、D8及びRhtが各々アラビドプシスGAIのトウモロコシ及びコムギ機能的相同体(オルソロガス)であるなら、D8及びRhtの優性変異体対立遺伝子は、それらがコードするタンパク質のN末端セクションに作用する変異も引きおこすはずである。
【0106】
先の報告は、いくつかのD8において及びRhtにおいて優性な変異体対立遺伝子、特にD8−1,D8−2023及びRht−Dlc(以前はRht10)を記述する(Boerner ら、(1996) Euphytica 89 : 69-75 ; Harberd and Freeling (1989) Genetics 121 : 827-838 ; Winkler及びFreeling (1994) Planta 193 : 341-348) 。それゆえ、本発明者らは、これらの変異体から候補D8/Rht遺伝子をクローン化し、そのタンパク質のN末端半分をコードする遺伝子の部分をDNA配列決定することにより検査した。
【0107】
D8/Rhtタンパク質のN末端半分の一部をコードする候補D8又はRht遺伝子のフラグメントを、D8−1,D8−2023及びRht−Dlcを含む植物のゲノムDNAからのPCRにより、増幅のための次のプライマーを用いて増幅した:D8−1のためにプライマーZM−15及びZM−24;D8−2023のためにプライマーZM−9及びZM−11;Rht−Dlcのために、ネスティドPCRを、Rht−15及びRht−26、次にRht−16及びRht−2を用いて行った。PCR反応を、Perkin Elmer gencAmp XL PCRキットを用いて、以下の条件を用いて行った:反応を94℃で1分、インキュベートし、次に94℃,15秒−X℃,15秒−69℃,5分の13サイクル(ここで、Xは64℃で始めてサイクル当り1℃減少させ52℃で終える)、次に94℃,15秒−53℃,15秒−65℃,5分の25サイクル、次に70℃で10分でインキュベートした。これらのフラグメントを、次にpGEMR −T Easyベクター(Promega, Technical Manual を参照のこと)にクローン化し、それらのDNA配列を決定した。
【0108】
上述の変異体の各々において候補D8及びRht遺伝子中で変異を見い出した。D8−1変異はアミノ酸VAQK(55−59)(配列番号101)を除去し、Gを加える枠内欠失である(配列番号16及び配列番号9の配列を参照のこと)。この欠失は上述の保存された
【0109】
【化15】
【0110】
相同性ブロックと重複する。D8−2023はD8タンパク質のN末端からアミノ酸
【0111】
【化16】
【0112】
を除去する別の枠内欠失変異である(配列番号17及び配列番号10を参照のこと)。この欠失は、gai又はD8−1内の欠失と重複しないが、GAI,D8及びRht間で高度に保存された別の領域をカバーする(配列番号2,5,7を参照のこと)。最後に、Rht−Dlcは、それがコードする変異体Rhtタンパク質のN末端領域内のアミノ酸
【0113】
【化17】
【0114】
を除去する別の小さな枠内欠失を含む(配列番号18及び配列番号11を参照のこと)(LN−PはGAI,D8及びRht間で保存されている。配列番号2,5,7を参照のこと)。
これにより、上述の変異体対立遺伝子の全ては優性であり、GA応答性の減少に関連した矮性を与える。全部で3つのこれらの対立遺伝子は、それらがコードするタンパク質のN末端半分の一部分を除去する欠失変異を含む。これらの観察結果は、トウモロコシ及びコムギのD8及びRht遺伝子がクローン化されていることを示す。
【0115】
【表1】
【0116】
【表2】
【図面の簡単な説明】
【図1】 Figure1:白抜きで示す相同性の領域を伴う、コメEST D39460(O830)(配列番号79)とのN末端の予想されるGAIアミノ酸配列(Gai)(配列番号78)のアラインメント。
【図2】 Figure2:C15−1,14al及び5alからのDNA配列。
Figure2aは、保存性DNA配列cDNA C15−1(シングル・パス配列決定により得たもの)(配列番号57)を示す。
Figure2bは、14alからのもとのDNA配列決定ランからのデータを示す(シングルパス)(配列番号58〜70)。
Figure2cは、5alからのもとのDNA配列決定ランからのデータを示す(シングルパス)(配列番号71〜77)。
【図3】 Figure3:Rht配列。
Figure3aは、コーディング配列を含む、図2におけるデータ由来のコムギRht遺伝子の複合DNA配列を示す(配列番号3)。
Figure3bは、アラビドプシスの全体の予想されるGAIタンパク質配列(Gai)(配列番号2)との、図2のコーディング配列によりコードされる全体の予想されるRhtタンパク質配列(rht)(配列番号1)のアラインメントを示す。配列同一性の領域を白抜きで示す。
【図4】 Figure4:D39460配列。
Figure4aは、コメcDNA D39460のDNA配列(シングルパス)(配列番号19)を示す。このcDNAは、それが得られるmRNAの3′末端を失っている不完全な部分的クローンである。
Figure4bは、全体の予想されるRhtタンパク質(コムギ−図2のコーディング配列によりコードされる)(配列番号1)の、GAIのもの(Gai)(配列番号2)及び図4aのDNA配列から予想されるコメタンパク質配列(配列番号20)とのアラインメントを示す。アミノ酸同一性の領域を白抜きで示し;いくつかの保存性置換を陰で示す。
【図5】 Figure5:ジベレリンの基本的炭素環構造。
【図6】 Figure6:コメEST配列。
Figure6aは、本発明により決定した。コメEST D39460のヌクレオチド配列(配列番号12)を示す。
Figure6bは、Figure6aのコメEST配列によりコードされる予想されるアミノ酸配列(配列番号5)を示す。
【図7】 Figure7:コムギC15−1cDNA。
Figure7aは、コムギC15−1cDNAのヌクレオチド配列(配列番号13)を示す。 Figure7bは、Figure7aのコムギC15−1cDNAの予想されるアミノ酸配列(配列番号6)を示す。
【図8】 Figure8:コムギ5alゲノムクローン。
Figure8aは、5alコムギゲノムクローンのヌクレオチド配列(配列番号14)を示す。
Figure8bは、Figure8aの5alコムギゲノムクローンの予想されるアミノ酸配列(配列番号7)を示す。
【図9】 Figure9:トウモロコシゲノムクローン。
Figure9aは、1alトウモロコシゲノムクローン、即ちD8のヌクレオチド配列(配列番号15)を示す。
Figure9bは、Figure9aのトウモロコシ1alゲルクローンのアミノ酸配列(配列番号8)を示す。
【図10】 Figure10は、トウモロコシD8ポリペプチドのアミノ酸配列(配列番号8)の、コムギRhtポリペプチド(配列番号7)、本発明者らにより決定されたコメEST配列及びアラビドプシス・タリアナGaiポリペプチド(配列番号2)とのPRETTYBOXアラインメントを示す。
【図11】 Figure11:トウモロコシD8対立遺伝子の配列。
Figure11aは、トウモロコシD8−1対立遺伝子の部分的ヌクレオチド配列(配列番号16)を示す。
Figure11bは、トウモロコシ対立遺伝子の部分的アミノ酸配列(配列番号9)を示す。
Figure11cは、トウモロコシD8−2023対立遺伝子の部分的ヌクレオチド配列(配列番号17)を示す。
Figure11dは、トウモロコシD8−2023対立遺伝子の部分的アミノ酸配列(配列番号10)を示す。
【図12】 Figure12:コムギrht−10対立遺伝子。
Figure12aは、コムギrht−10対立遺伝子の部分的ヌクレオチド配列(配列番号18)を示す。
Figure12bは、コムギrht−10対立遺伝子の部分的アミノ酸配列(配列番号11)を示す。
Claims (41)
- トリチクム・アエスチブム(Triticum Aestivum)植物中での発現に基づいて該植物の成長を阻害するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドであって、該阻害がジベレリンにより拮抗され、ここで該ポリペプチドが、以下の:
(a)配列番号3のヌクレオチド配列によりコードされるトリチクム・アエスチブムのRhtポリペプチド;又は
(b)1又は数個のアミノ酸の置換、欠失又は付加によりポリペプチド(a)から生じるポリペプチド、
であることを特徴とする、前記ポリヌクレオチド。 - 前記ポリペプチドが、(b)であり、且つ配列番号104に示すアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項1に記載の単離されたポリヌクレオチド。
- 前記ポリペプチドが、(b)であり、且つ17個のアミノ酸の隣接配列を含み、ここで該配列中の少くとも10の残基が、配列番号104に示すアミノ酸配列中の対応する位置の残基に対してアミノ酸の保存性変異を有するか又は同一性を示すことを特徴とする請求項1に記載の単離されたポリヌクレオチド。
- 前記ポリペプチドが(b)であり、且つ17個のアミノ酸の隣接配列を含み、ここで該配列中の16残基が配列番号104に示すアミノ酸配列中の対応する位置の残基とアミノ酸同一性を示すことを特徴とする請求項3に記載の単離されたポリヌクレオチド。
- 配列番号7に示すアミノ酸配列から成るポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
- 配列番号14に示すコーディングヌクレオチド配列から成る請求項5に記載の単離されたポリヌクレオチド。
- トウモロコシD8ポリペプチドについての配列番号8に示すアミノ酸配列から成るポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
- 配列番号15に示すコーディングヌクレオチド配列から成る請求項7に記載の単離されたポリヌクレオチド。
- 配列番号5に示すアミノ酸配列から成るポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
- 配列番号12に示すコーディングヌクレオチド配列から成る請求項9に記載の単離されたポリヌクレオチド。
- 植物中での発現に基づいてジベレリン非応答性矮性である表現型を該植物に与え、又はパクロブトラゾールの矮性効果に耐性であるrhtヌル変異体表現型植物中での発現に基づいて該rhtヌル変異体表現型を補足するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドであって、該ポリペプチドが、配列番号3のヌクレオチド配列によりコードされるトリチクム・アエスチブムのRhtポリペプチドのアミノ酸配列から配列番号104に示すアミノ酸配列が削除されたアミノ酸配列から成ることを特徴とする、前記ポリヌクレオチド。
- 植物中での発現に基づいてジベレリン非応答性矮性である表現型を該植物に与え、又はパクロブトラゾールの矮性効果に耐性であるrhtヌル変異体表現型植物中での発現に基づいて該rhtヌル変異体表現型を補足するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドであって、該ポリペプチドが、配列番号3のヌクレオチド配列によりコードされるトリチクム・アエスチブムのRhtポリペプチドのアミノ酸配列から配列番号103に示すアミノ酸配列が削除されたアミノ酸配列から成ることを特徴とする、前記ポリヌクレオチド。
- 植物中での発現に基づいてジベレリン非応答性矮性である表現型を該植物に与え、又はパクロブトラゾールの矮性効果に耐性であるrhtヌル変異体表現型 植物中での発現に基づいて該rhtヌル変異体表現型を補足するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドであって、該ポリペプチドが、配列番号8のアミノ酸配列から配列番号106に示すアミノ酸配列が削除されたアミノ酸配列から成ることを特徴とする、前記ポリヌクレオチド。
- 植物中での発現に基づいてジベレリン非応答性矮性である表現型を該植物に与え、又はパクロブトラゾールの矮性効果に耐性であるrhtヌル変異体表現型植物中での発現に基づいて該rhtヌル変異体表現型を補足するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドが、配列番号15に示すコーディングヌクレオチド配列から配列番号106に示すアミノ酸配列をコードするヌクレオチドが削除されたヌクレオチド配列から成ることを特徴とする、前記ポリヌクレオチド。
- 植物中での発現に基づいてジベレリン非応答性矮性である表現型を該植物に与え、又はパクロブトラゾールの矮性効果に耐性であるrhtヌル変異体表現型植物中での発現に基づいて該rhtヌル変異体表現型を補足するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドであって、該ポリペプチドが、配列番号8のアミノ酸配列から配列番号101に示すアミノ酸配列が削除されたアミノ酸配列から成ることを特徴とする、前記ポリヌクレオチド。
- 植物中での発現に基づいてジベレリン非応答性矮性である表現型を該植物に与え、又はパクロブトラゾールの矮性効果に耐性であるrhtヌル変異体表現型植物中での発現に基づいて該rhtヌル変異体表現型を補足するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドであって、該ポリペプチドが、配列番号8のアミノ酸配列から配列番号102に示すアミノ酸配列が削除されたアミノ酸配列から成ることを特徴とする、前記ポリペプチド。
- 配列番号104に示すアミノ酸配列が削除されている、配列番号7に示すアミノ酸配列から成るポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
- 配列番号14に示すコーディングヌクレオチド配列から成る請求項17に記載の単離されたポリヌクレオチドであって、配列番号104に示すアミノ酸配列をコードするヌクレオチドが削除されていることを特徴とする請求項17に記載の単離されたポリヌクレオチド。
- 請求項1〜18のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドが発現のための調節配列に作用可能に連結していることを特徴とする単離されたポリヌクレオチド。
- 前記調節配列が、誘導性プロモーターを含むことを特徴とする請求項19に記載の単離されたポリヌクレオチド。
- 請求項1〜20のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドを含み、植物細胞の形質転換のために適した核酸ベクター。
- 請求項1〜21のいずれか1項に記載の異種ポリヌクレオチド又は核酸ベクターを含む宿主細胞。
- 微生物である請求項22に記載の宿主細胞。
- 植物細胞である請求項22に記載の宿主細胞。
- 染色体内に異種の前記ポリヌクレオチドを有する請求項24に記載の植物細胞。
- 半数体ゲノム当り1超の前記ポリヌクレオチドを有する請求項25に記載の植物細胞。
- 植物、植物の一部もしくは植物の零余子、又は植物の抽出物もしくは誘導体内に含まれる請求項24〜26のいずれか1項に記載の植物細胞。
- 請求項22〜26のいずれか1項に記載の細胞を生産する方法であって、前記ポリヌクレオチド又は核酸ベクターを形質転換により前記細胞に組み込むことを含む、前記方法。
- 前記ポリヌクレオチドを、細胞ゲノム核酸で、安定に中に組み込まれるように組換えることを含む請求項28に記載の方法。
- 1又は複数の形質転換された細胞から植物を再生することを含む請求項28又は29に記載の方法。
- 請求項24〜26のいずれか1項に記載の植物細胞を含む植物。
- 請求項24〜26のいずれか1項に記載の植物細胞を含む植物の一部又は零余子。
- 植物を生産する方法であって、請求項1〜21のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド又は核酸ベクターを植物細胞に組み込み、そして該植物細胞から植物を再生することを含む、前記方法。
- 前記植物細胞から再生された前記植物の子孫又は派生物を有性又は無性生殖により繁殖させ又は増殖させることを含む請求項33に記載の方法。
- 植物の特徴に影響を与える方法であって、該植物の細胞内で、請求項1〜20のいずれか1項に記載の異種ポリヌクレオチドからの発現を引きおこし又は許容することを含む、前記方法。
- トランスジェニック植物の生産における請求項1〜20のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド又は請求項21に記載のベクターの使用。
- 請求項1に記載のポリヌクレオチドを同定し又は得る方法であって、請求項1〜10のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドに由来するヌクレオチド配列から成る核酸分子を用いて候補核酸をスクリーニングすることを含む、前記方法。
- PCRにおいてオリゴヌクレオチドプライマーを用いることを特徴とする請求項37に記載の方法。
- 前記プライマーが、配列番号21〜55及び80〜100に示すプライマーから選択されることを特徴とする請求項38に記載の方法。
- 請求項1〜18のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドによりコードされる単離されたポリペプチド。
- 請求項40に記載のポリペプチドについての特定の結合アフィニティーを有する抗原結合部位を含む抗体。
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