JP2004298158A

JP2004298158A - Method for detecting organism-derived particle

Info

Publication number: JP2004298158A
Application number: JP2003098240A
Authority: JP
Inventors: Yukiaki Saeki; 享昭佐伯; Yoshihiro Hatanaka; 美博畑中
Original assignee: Asahi Kasei Corp
Current assignee: Asahi Kasei Corp
Priority date: 2003-04-01
Filing date: 2003-04-01
Publication date: 2004-10-28

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for simply concentrating and detecting a definite specific type group of organism-derived particles in a short time, especially capable of simply concentrating and detecting mast cells or precursor cells differenitiating to Langerhans islands or insulin-expressing cells from the pancreas in a short time. <P>SOLUTION: This method for detecting the specific type group of organism-derived particles is provided by adding suspension containing the organism-derived particles in a substrate for catching the particles and added with a dyeing reagent for dyeing the organism-derived particles in advance to catch and dye the particles, and detecting the dyed organism-derived particles qualitatively or quantitatively. <P>COPYRIGHT: (C)2005,JPO&NCIPI

Description

【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、生物由来粒子浮遊液から必要な生物由来粒子を短時間に、かつ、簡便に検出する方法およびそれに用いる装置に関する。特に、本発明は、酵素等によって膵臓器等を消化した後、遊離させた組織または生物由来粒子浮遊液をフィルターに通過させ、ランゲルハンス島等の特定の生物由来粒子型群を検出する方法およびそれに用いる装置に関する。
本発明により検出される細胞型群は、ランゲルハンス島に限らず、癌細胞を捕捉、検出することによる癌の診断等にも適用が可能である。
【０００２】
【従来の技術】
糖尿病は、日本のみならず世界的に広がっている深刻な疾病である。１９９７年に旧厚生省が行った調査では、「糖尿病が強く疑われる人」が約６９０万人存在し、この値に「糖尿病の可能性を否定できない人」６８０万人を加えると、約１３７０万人がリスク群と推定されている。ＷＨＯの推定する全世界の糖尿病人口は、２０００年で１億５千万人あまりであり、２０２５年には約３億人に達するものと予測されている。
【０００３】
近年、糖尿病の根治的治療法として、膵島移植が注目を浴びるようになってきている。膵島移植は、生理的な血糖コントロールを可能とし、手技も簡単で、ハイリスク例にも応用できる、優れた糖尿病治療法として期待されている。
膵島移植は、糖代謝の改善による糖尿病性二次病変の進行阻止または改善を目的としているが、強化インスリン療法やインスリン持続皮下注入療法でも血糖コントロールの難しいインスリン依存型糖尿病（ＩＤＤＭ）は、まさに膵島移植のよい適応であると考えられている。
【０００４】
膵島移植は局所麻酔で可能なほどで、手術侵襲が極めて小さいため、糖尿病患者にとってより安全であり、血管吻合の必要がないため血管病変の進行により膵（臓器）移植の適応外になった患者でも実施可能である。また、門脈循環にインスリンが放出されるため生理学的にも有利である。さらに、分離膵島の凍結保存によるいわゆるｂａｎｋｉｎｇも可能である等、膵（臓器）移植と比較して多くの利点を有している。
【０００５】
インスリン非依存型糖尿病（ＮＩＤＤＭ）臨床の実際では、積極的にインスリン療法が用いられている。これは、インスリンを投与することにより患者自身の膵島β細胞を休息させ、それによりβ細胞の機能が回復してくるのを待つという考え方からであり、近年、積極的に導入され、好結果が報告されている。
このことは、ＮＩＤＤＭにおいても、膵島移植によって治療可能であることを示しており、ＮＩＤＤＭ例のβ細胞機能が低下してきている時期に膵島を移植すれば、再びβ細胞機能が回復し、ＮＩＤＤＭの悪化を防止できる可能性も考えられている。
【０００６】
実験的医療の段階から始まった膵島移植は、当初、成績が芳しくなかったが、１９９９年３月よりカナダＥｄｍｏｎｔｏｎにあるＡｌｂｅｒｔａ大学において、新しい画期的なＥｄｍｏｎｔｏｎＰｒｏｔｏｃｏｌが実施され、膵島移植施行７例全例がｉｎｓｕｌｉｎｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔとなったということが報告され（非特許文献１参照。）、このｐｒｏｔｏｃｏｌによる多施設共同トライアルも準備されている。
【０００７】
このように、膵島移植の臨床研究までに発展した理由としては、大動物膵よりの大量膵島分離法の研究がなされ、１９８４年、Ｒｉｃｏｒｄｉらは独自の自動膵島分離装置を考案し、ブタ、ヒト膵よりの大量膵島分離に成功したことが大きい。
膵島移植に利用される膵島の分離、調製は、一般的に次のような大量膵島分離に関する技術がある。すなわち、特許文献１および非特許文献２に代表される文献に記載されている技術である。
【０００８】
具体的な膵島の一般的な単離操作は、以下の工程で行われる。
まず、ヒトまたはブタの膵臓の膵管に、コラゲナーゼ含有媒体の注入または灌流によって膵臓を低温で消化し、その後、コラゲナーゼ含有媒体を注入した膵臓を専用の消化チャンバー内に入れる。
第２に、プロテアーゼの有効な作用を可能にすべく、チャンバー中の媒体の温度を上げて、膵臓を含有する消化チャンバー中にプロテアーゼ含有媒体を加え、適切な撹拌を行いながら；
第３に、消化チャンバー内の膵臓からのランゲルハンス島の流出をジチゾン染色により顕微鏡等で直接検出した後；
第４に、新たな低温媒体を消化チャンバー内に導入して、消化チャンバーから流出してきた細胞を回収器中に流出させ回収する。
【０００９】
最後に、回収フラスコからの細胞懸濁液にフィコール等の比重液による勾配を与え、遠心分離してランゲルハンス島細胞を含有する精製画分を回収する。
上記のように、消化チャンバーからのランゲルハンス島流出の検出は、実施者の目視による検鏡作業であることから操作が煩雑であり、実施者に負担を強いる、検出に時間を要するといった問題点があった。また、流出するランゲルハンス島の濃度が低い状態では、正確な計数のためにより多くのサンプルを検鏡する必要があり、したがって、より広い範囲を検鏡することとなるため、実施者にさらなる負担を課す。そのため、流出したランゲルハンス島を濃縮し、簡便に検出する方法の確立が望まれていた。
【００１０】
非特許文献３には、孔径１００μｍのナイロンメッシュである、セルストレイナー（商標、ＢＤバイオサイエンス社製）に膵臓消化液を注ぎ、５０ｍｌのＨＢＳＳですすいだ後、ペトリ皿に本セルストレイナーを逆さに置き、２０ｍｌのＨＢＳＳで洗い流してペトリ皿に回収するという細胞の分離、回収方法が記載されている。しかし、これは細胞の回収を目的としたものであり、フィルターを用いた細胞検出についての記載は一切無い。
特許文献２には、微生物をフィルター上に保持し、死細胞を染色後、生細胞のＤＮＡを解離させ、インターカレータで染色することにより生細胞の検出を行っているが、複数回の染色が必要であることから操作が煩雑であり、それに伴い、検出に要する時間も増大するという問題点を有する。
【００１１】
特許文献３には、次の方法が記載されている。一定量の血液をシリンジ内にセットされたｇｌａｓｓｍｉｃｒｏｆｉｂｅｒｆｉｌｔｅｒ上に乗せ、顆粒球計測を阻害する成分を予め除去するために、血液中の顆粒球は破壊しないように水を加え、赤血球を溶血させた後、サンプル内の溶解成分を吸引洗浄（ｐｒｅｓｓｕｒｅｗａｓｈ）する。その後、溶解されなかった顆粒球を含むｇｌａｓｓｆｉｂｅｒｆｉｌｔｅｒは乾燥され、そのｆｉｌｔｅｒに対して０．００５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、３０ｍＭ３−ａｍｉｎｏ−１，２，４ｔｒｉａｚｏｌｅ、０．０００５％Ｈ_２Ｏ_２、０．５ｍｇ／ｍｌｏ−ｔｏｌｉｄｉｎｅを含む５０ｍＭリン酸バッファーを滴下する。次いで、顆粒球から溶出されたミエロペルオキシダーゼの作用により青色に染色されたスポットを顆粒球として計測する。この方法は、操作が非常に煩雑であり、また細胞を破壊するため、フィルターに捕捉した細胞の形状や状態を観察することができないという問題点がある。
【００１２】
フィルター上で生物由来粒子を検出する方法として、特許文献４には、次の方法が記載されている。試料中の細菌の染色の前後いずれかの時期に疎水性フィルターで細菌を捕集し、過剰の細菌染色用色素を洗浄により除去した後、フィルター上の細菌の着色度から試料中の全細菌数を測定する。次いで、疎水性フィルターに捕集された細菌を、グラム陽性細菌染色用色素で染色し、媒染剤を用いて媒染し、過剰のグラム陽性細菌染色用試薬および媒染剤を洗浄により除去する。その後、フィルター上のグラム陽性細菌の着色度から試料中のグラム陽性細菌数を測定する。この方法によると、フィルターに細菌を捕集する前または捕集した後に染色試薬を用いて染色を行う必要があり、操作が煩雑となる問題点がある。
特許文献５には、フィルターを用いてレジオネラ菌を検出する方法が記載されているが、フィルターを培地に重ね培養し、コロニーを形成後にフィルターを分離、菌体を破壊し、抗体を用いてコロニーを検出するという極めて操作が煩雑であり、かつ著しく操作のための時間を要する等の問題点が挙げられる。
【００１３】
特許文献６には、フィルター上に捕集した細菌に色素液を吸引条件下に添加して染色し、検出する方法が記載されているが、色素液を別途用意する必要があり手間がかかる他、吸引を行うためポンプ等の手段が必要であり、簡便な検出には向かない。
特許文献７には、フィルター上に捕捉した微生物のＤＮＡに標識抗ＤＮＡ抗体を結合させることにより検出を行う方法が記載されているが、検出結果が得られるまでに数十分から数日を要し、速やかな検出が求められる場においては適用不可能である。
【００１４】
特許文献８には、次の方法が記載されている。細菌検出用疎水性フィルターを内部に有し、前記フィルターから見て細菌試料を採取する側に色素液組成物を予め配し、前記フィルターから見てその反対側に前記フィルターの支持体を予め配したチューブ状の濾過容器に、細菌試料を採取する側から細菌試料を入れ染色する。次いで、前記支持体側から吸引濾過し、前記フィルターへの染色された細菌の捕集と過剰色素の除去と同時に行い、前記フィルターの着色度から試料中の細菌数を測定する。この方法は、チューブ状の濾過容器を用いるため、顕微鏡等によって捕集された細菌を観察することは難しく、また、吸引のためのピストン等の機構を要するため測定具はかさ高くなる、液状の染色試薬を扱うため操作に注意を要するといった問題点がある。
【００１５】
特許文献９には、フィルターによって濃縮し、蛍光ラベル化することにより生存細菌および白血球を計数する方法が記載されているが、計数をフローサイトメーターもしくはレーザースキャン血球計算器で行うために、その装置を持たない施設での検出は不可能であり、また、検出に前処理だけでも数十分を要することから、迅速な検出には不向きである。
特許文献１０には、色素を含む液体と試料とを接触させることによりフィルター上に染色された細菌を捕集し、その着色度より細菌数を測定する方法が記載されているが、色素は液体の状態で使用されるために操作に注意を要する上、フィルターとは別に色素を含む液体を用意する必要があり、簡便さを欠く。
【００１６】
特許文献１１には、孔径３０〜７０μｍの第一フィルターと、疎水性材料からなる孔径０．４５〜４μｍの第二フィルターを有する細菌捕集、検出用ろ過具に、第一フィルターから先に接触するように着色された試料を導入して細菌の捕集を行い、第二フィルターの着色度から資料中の細菌数を検出することからなる細菌数の測定方法が記載されている。この方法では、事前に着色試薬を試料に加えておく必要がある。すなわち、フィルターでろ過を行う前に着色の操作を要するため煩雑となり、かつ、着色試薬の準備が必要であり、手間を要する。
【００１７】
特許文献１２には、ポリマー膜フィルター上に保持した細胞に対して、標識核酸プローブをＤＮＡに結合させ、検出する方法が記載されているが、核酸プローブとのインキュベーションに一晩を要する等、迅速な検出には程遠い。
特許文献１３には、フィルター上に保持した細胞を緩衝界面活性溶液により破砕し、ハイブリダイゼーションにより検出する方法が記載されているが、処理に時間を要し、迅速な検出は不可能である。
【００１８】
特許文献１４には、フィルター上に保持した微生物を蛍光によって検出する方法が記載されているが、染色試薬を事前に試料に加える、またはフィルター濾過後に染色を行うため、操作が煩雑であるという問題点を有している。
予め試薬を添加した基材を利用し、検出を行う方法としては、特許文献１５に、酵素活性を指標とし、抗原抗体反応を利用して抗原（または抗体）の量を測定する酵素免疫測定法において、予め酵素または基質と結合した抗原（または抗体）を含む検体溶液を抗体（または抗原）を固定した通水性シート状に滴下し、該シート上で抗原抗体反応を行わせ、フリーの酵素または基質と結合した抗原（または抗体）のみを該シートの下方に設けられた透明フィルムに移行させ、該透明フィルム上で基質と酵素を反応させて蛍光または発光物質を生成せしめ、蛍光または発光の量により抗原（または抗体）量を測定することを特徴とする酵素免疫測定法についての記載がある。この方法は、抗原抗体反応に限定されたものであり、本発明におけるところの生物由来粒子についての記載は無く、かつ、検出を蛍光または発光の量を測定することにより行うため、励起光源や受光素子等を必要とし、簡便な検出には不向きである。
【００１９】
特許文献１６には、血球成分と血漿成分とを含む全血から血球成分を分離して血漿成分に含まれるグルコース等の被検物質を検出することができる血球成分分離能を有する試験片であって、ビーズ、無機ゲルおよび前記被検物質と検出しうる反応を起こす試薬とを含む多孔質構造の試薬層と、この試薬層を支持する支持体とを含み、前記ビーズ同士は前記無機ゲルによって接着され、ビーズ間には前記固体成分を捕集する粒子間隙が形成されていることを特徴とする試験片についての記載がある。この発明によると、ビーズを無機ゲルで接着して試験片を作成する手順を必要とし、作成が煩雑である上、無機ゲルにより接着するため、事前に試薬を添加した試験片を作成しておかねばならず、使用直前の試薬の変更は不可能であり、汎用性に乏しい。
すなわち、これまで膵臓器から分離したランゲルハンス島を、複雑な検出手段を用いずに効率的に濃縮と同時に染色し、検出する方法は知られていなかった。
【００２０】
【非特許文献１】
ＳｈａｐｉｒｏＡＭ，ＬａｋｅｙＪＲＴ，ＲｙａｎＥＡ，ＫｏｒｂｕｔｔＧＳ，ＴｏｔｈＥ，ＷａｒｎｏｃｋＧＬ，ＫｎｅｔｅｍａｎＮＭ，ＲａｊｏｔｔｅＲＶ：ＮＥｎｇＪＭｅｄ，３４３，２３０−２３８（２０００）
【非特許文献２】
ＲｉｃｏｒｄｉＣ，ＬａｃｙＰＥ，ＦｉｎｋｅＥＨ，ＯｌａｃｋＢＪ，ＳｃｈａｒｐＤＷ：Ｄａｉｂｅｔｅｓ，３７，４１３−４２０（１９８８）
【非特許文献３】
ＰａｏｌｏＲ．Ｏ．Ｓａｌｖａｌａｇｇｉｏ，ｅｔａｌ：Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，７４，８７７−９００，２００２
【特許文献１】
特表平２−５０４２２２２号公報（米国特許第５０７９１６０号明細書に対応）
【特許文献２】
国際公開第９０／０３４４０号パンフレット
【特許文献３】
国際公開第９３／０１３０６号パンフレット
【特許文献４】
特開平５−３０８９９７号公報
【特許文献５】
特開平６−２１３８９４号公報
【特許文献６】
特開平８−２３９５９号公報
【特許文献７】
特開平８−２８９７８０号公報
【特許文献８】
特開平８−３２２５９４号公報
【特許文献９】
特開平９−１１９９２６号公報
【特許文献１０】
特開平１０−１３６９９６号公報
【特許文献１１】
特開平１０−２１５８５９号公報
【特許文献１２】
特表平１０−５０１４１９号公報（国際公開第９５／３４６８５号パンフレットに対応）
【特許文献１３】
特表平１１−５０９１０４号公報（国際公開第９７／４２３４９号パンフレットに対応）
【特許文献１４】
特開平２００２−２９１４９９号公報
【特許文献１５】
特開昭５８−１５０８６１号公報
【特許文献１６】
特開２００１−２６４３１５号公報
【００２１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、生物由来粒子の一定の特定型群を、短時間に、かつ、簡便に濃縮し、検出する方法を提供することを目的とする。とりわけ、本発明は、膵臓器からのランゲルハンス島やインスリン産生細胞へと分化する幹細胞や前駆細胞を、短時間に、かつ、簡便に濃縮し、検出することができる方法を提供することにある。
【００２２】
【課題を解決するための手段】
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
（１）特定型群の生物由来粒子を検出する方法であって、該生物由来粒子を染色する染色試薬が予め添加されている、生物由来粒子を捕捉する基材に、該生物由来粒子を含む懸濁液を添加することによって該生物由来粒子を捕捉すると共にこれを染色し、染色された該生物由来粒子を定性的または定量的に検出することを特徴とする生物由来粒子検出方法。
【００２３】
（２）特定型群の生物由来粒子を捕捉する基材が吸水性であることを特徴とする（１）に記載の生物由来粒子検出方法。
（３）特定型群の生物由来粒子を捕捉する基材が不織布で構成されていることを特徴とする（１）に記載の生物由来粒子検出方法。
（４）特定型群の生物由来粒子が生物由来材料由来のものであることを特徴とする（１）に記載の生物由来粒子検出方法。
（５）特定型群の生物由来粒子が、幹細胞、前駆細胞、ランゲルハンス島および白血球から選ばれる少なくとも一種であることを特徴とする（４）に記載の生物由来粒子検出方法。
【００２４】
（６）染色試薬がジチゾン（ジフェニルチオカルバゾン）またはギムザ（Ｇｉｅｍｓａ）染色試薬であることを特徴とする（１）に記載の生物由来粒子検出方法。
（７）染色された生物由来粒子の画像を取り込み、取り込んだ画像の色信号を計測することにより生物由来粒子数を求めることを特徴とする（１）に記載の生物由来粒子検出方法。
（８）染色された生物由来粒子の有無または数を肉眼により確認することを特徴とする（１）に記載の生物由来粒子検出方法。
【００２５】
（９）特定型群の生物由来粒子を検出する装置であって、
（Ａ）該生物由来粒子を染色する染色試薬を予め添加した、該生物由来粒子を捕捉する基材と、
（Ｂ）該基材を上下から挟み込むことにより支持する支持基板であって、染色試薬で染色された該基材中の該生物由来粒子の吸水性材料の色と、それとは異なる色とを識別可能な透明な部分を有し、該生物由来粒子を含む生物由来粒子浮遊液を基材上に添加するための導入口を有する支持基板、
を備えることを特徴とする生物由来粒子検出装置。
（１０）特定型群の生物由来粒子を捕捉する基材が吸水性であることを特徴とする（９）に記載の生物由来粒子検出装置。
（１１）特定型群の生物由来粒子を捕捉する基材が不織布で構成されていることを特徴とする（９）に記載の生物由来粒子検出装置。
【００２６】
本発明により、特定型群の生物由来粒子を生物由来粒子懸濁液より短時間に、かつ簡便に濃縮し、検出することができる。
以下、本発明を詳細に説明する。
図１は、本発明の生物由来粒子検出装置の一例である。特定型群生物由来粒子を染色する染色試薬が予め添加された、該生物由来粒子を捕捉する基材２は、透明なポリメチルメタクリレート製の基板１，２により、上下から挟み込まれている。上部の基板１に設けた開口部５から、基材２に生物由来粒子を含む懸濁液を添加する。染色された生物由来粒子は、透明な基板１を介して検出手段４により、定性的または定量的に検出される。
【００２７】
本明細書に記載されている、特定型群の生物由来粒子とは、円口類、棘魚類、板皮類、軟骨魚類、硬骨魚類、両性類、爬虫類、鳥類、哺乳類に属する動物由来の、個体、器官、臓器、組織、体液、し尿に含まれる、特徴的なある種の性質を有する粒子または粒子のクラスターのことをいう。特徴的な性質とは、生物由来粒子または生物由来粒子クラスターのサイズ、比重、内容物、表面マーカー、表面電荷、分泌タンパク、化学物質による染色性等を指し、それらのうち、同一の性質を有する生物由来粒子または生物由来粒子クラスターの集団が、特定型群の生物由来粒子である。
【００２８】
特定型群の生物由来粒子の例として、膵臓に含まれるランゲルハンス島、体液または尿中の血球、上皮細胞、細菌、真菌、原虫、寄生虫、タンパク質やアミノ酸等の有機物、結晶、塩類等の無機物等が挙げられる。例えば、ランゲルハンス島や膵臓由来のインスリン産生細胞へ分化する幹細胞または前駆細胞は、密度勾配遠心分離によって同一の比重をもった細胞の特定型群として分離される。なかでも、ランゲルハンス島は量的にも多く採取することができる。
本発明に記載の、幹細胞とは、種々の細胞に分化する能力を有する細胞のことを指し、通常、組織や臓器中に存在する成人幹細胞または前駆細胞等も含まれる。例えば、インスリンを産生するβ細胞へ分化する幹細胞（または前駆細胞）は、膵臓の場合、膵管に存在するという報告や肝臓細胞にも存在するということが知られている。
【００２９】
本発明に記載の、特定型群の生物由来粒子を捕捉する基材とは、多孔質体からなる構造物で、一方の面から他方の面に連通する多数の微細な孔を有し、特定型群の生物由来粒子を選択的に分離除去できる平均孔径を有する通気性の基材を意味する。迅速に生物由来粒子懸濁液より特定型群の生物由来粒子を検出するためには、基材が吸水性であることが、滴下された生物由来粒子懸濁液より基材が速やかに水分を吸収し、生物由来粒子の濃縮が達成されることから望ましい。また、顕微鏡による検鏡での検出を行う場合には、基材は十分な光透過性を持つことが望ましい。肉眼による着色の確認、取り込んだ画像の色信号の計測等、他の検出方法を用いる場合には、光透過性を考慮する必要はない。
多孔質体とは、微細な孔を多数有する構造体のことをいい、その材質、厚さ、形状、寸法等は限定されない。多孔質体の材質は、有機材料、無機材料、または有機材料と無機材料からなる複合材料であってもよい。
【００３０】
その中でも有機材料、とりわけ、有機高分子は、切断等の加工性に優れるため好ましい素材である。有機高分子としては、例えば、ポリカーボネート、ポリウレタン、ポリアクリロニトリル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、ポリエステル、ポリアミド、ポリスチレン、ポリスルホン、セルロース、セルロースアセテート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリフッ化ビニル、ポリフッ化ビニリデン、ポリトリフルオロクロロビニル、フッ化ビニリデン−テトラフルオロエチレン共重合体、ポリエーテルスルホン、ポリ（メタ）アクリレート、ブタジエン−アクリロニトリルコポリマー、ポリエーテル−ポリアミドブロツクコポリマー、エチレン−ビニルアルコールコポリマー等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３１】
多孔質体の形状は、生物由来粒子を捕捉できる細孔を有するものであれば限定はなく、平板状、球状、棒状、繊維状、中空状のいずれの形態であってもよい。この例として、メッシュ、フィルム、シート、膜、板、不織布、濾紙、スポンジ、織物、編物、塊、糸、中空糸、粒子等が挙げられる。生物由来粒子を捕捉するにあたって、操作を行いやすいように生物由来粒子を捕捉する孔の大きさを簡単に制御できること、基材作製の容易さ、コスト等を考慮すると、メッシュ、フィルム、シート、濾紙、膜、板、不織布、スポンジ、中空糸、粒子が好ましく、より好ましくは、フィルム、シート、濾紙、膜、不織布およびスポンジである。
【００３２】
多孔質体の孔の大きさは限定されないが、生物由来粒子を選択的に捕捉できることを考慮すると、平均孔径は０．１μｍ以上５００μｍ以下であることが好ましく、１μｍ以上４００μｍ以下がより好ましく、最も好ましくは５μｍ以上２００μｍ以下である。生物由来粒子の選択的捕捉を容易にするためには、上記多孔質体を複数重ね合わせて使用することが好ましい。
本発明における多孔質体の平均孔径とは、水銀ポロシメーターで測定される値である。水銀ポロシメーターで測定する場合は、細孔径分布曲線における最大のピークを示す細孔径（直径）が本発明でいう平均孔径である。したがって、多孔質体の平均孔径よりも大きい直径を有する粒子は入り難いという径を表わすものであって、これ以上の直径の粒子は絶対に入らないというものではない。
【００３３】
不織布とは、編織によらずに繊維または糸の集合体が、化学的、熱的または機械的に結合された布状のものである。繊維と繊維とが互いに接触して摩擦により、または互いにもつれあうこと等により一定の形状を保っている場合、これも、機械的に結合された、ということができる。織布とは、縦糸と横糸とが交錯してできた布地を意味する。
上記の多孔質体は、生物由来粒子の接着性または吸水性を向上させるために、多孔質体の孔を塞がない程度に、高分子物質により表面コーティング処理を施されていてもよい。
【００３４】
高分子物質は、天然高分子物質、半合成高分子物質および合成高分子物質の３つに大きく分類することができ、本発明においていずれの高分子物質も使用することができる。例えば、天然高分子物質としては、マイカ（雲母）、アスベスト（石綿）、グラファイト（石墨）、ダイアモンド、でんぷん、セルロース、アルギン酸等に代表される糖類およびゼラチン、コラーゲン、ラミニン、ビトロネクチン、フィブロネクチン、フィブリノーゲン等に代表されるタンパク質やペプチド等が挙げられる。半合成高分子物質としては、ガラス、硝酸セルロース、酢酸セルロース、塩酸ゴム、カルボキシメチルセルロース等が挙げられる。合成高分子物質としては、ポリカーボネート、ポリホスホニトリルクロライド、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリアミド、ポリエチレンテレフタレート、ポリスルホン、ポリアクリロニトリル、ポリビニルアルコール、ポリメチルメタクリレート、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリジメチルアミノエチルメタクリレートおよびヒドロキシエチルメタクリレートとジメチルアミノエチルメタクリレートの共重合体に代表されるような２種類以上の合成単量体からなる共重合体等が挙げられる。
【００３５】
コーティング処理のし易さを考慮すると、有機高分子物質が好ましく、タンパク質、ペプチドおよび有機合成高分子物質がよりに好ましい。
多孔質体に、抗体等の生理活性物質、ジチゾン等の染色試薬の固定化、グラフト、電子線、放射線照射等による何らかの表面処理が施されていてもよい。
基材上に捕捉された特定型群の生物由来粒子は、染色試薬で染色することにより検出を容易に行うことができる。染色試薬として、例えば、ランゲルハンス島を特異的に染色するジチゾン（ジフェニルチオカルバゾン）や白血球を選択的に染色するギムザ（Ｇｉｍｓａ）染色試薬を用いることによりランゲルハンス島または白血球の簡便な検出が可能である。
【００３６】
基材に前以て染色試薬を添加しておくことにより、検出の際に試薬添加の工程を省くことができる。添加する方法としては、染色試薬を含む溶液に基材を浸した後、乾燥させて染色試薬を基材上に吸着させる方法、染色試薬を基材に化学的に結合させる方法等が挙げられる。化学的結合の例として、共有結合、イオン結合、水素結合、疎水結合等がある。添加された染色試薬は必ずしも基材に完全に結合している必要はない。生物由来粒子懸濁液を基材に添加することにより、基材上の染色試薬が流され、その濃度が低下したとしても、特定型群の生物由来粒子の染色に十分な染色試薬が残存していればよい。
【００３７】
基材上に捕捉された特定型群の生物由来粒子を検出する手段としては、顕微鏡による検鏡、肉眼による目視での確認、基材上に捕捉された細胞の画像を取り込むことによる色信号の計測等が挙げられる。定性的な検出の他、必要に応じて定量的に計数してもよい。染色した目的細胞の画像を取り込み、解析し、色信号を計測することにより計数を行うことは、検出の自動化を可能にすることから好ましい。
【００３８】
基材は、支持基板により支持されていることが取り扱いの容易さの点から好ましく、基材を挟み込んで支持することにより、特定型群の生物由来粒子を含む懸濁液添加後に基材をより詳細に観察する場合に取り出しが容易であるので好ましい。
基材へ特定型群の生物由来粒子を含む懸濁液を添加するための導入部を支持基板上に設けることにより、検出操作が簡便になるので好ましい。この導入部は、支持基板上に特定型群の生物由来粒子を含む懸濁液を添加した際に、懸濁液が展開するのに十分な面積の開口部であることが好ましいが、基材が吸水性である場合は、開口部の面積は必ずしも懸濁液が展開する面積よりも大きい必要はなく、展開する面積を限定する場合には開口部の面積を小さくすることが好ましい。
【００３９】
基材を支持する材料としては、有機材料、無機材料および有機材料と無機材料からなる複合材料であってもよい。その中でも有機材料、とりわけ、有機高分子は、切断等の加工性に優れるため好ましい素材である。有機高分子としては、例えば、ポリカーボネート、ポリウレタン、ポリアクリロニトリル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、ポリエステル、ポリアミド、ポリスチレン、ポリスルホン、セルロース、セルロースアセテート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリフッ化ビニル、ポリフッ化ビニリデン、ポリトリフルオロクロロビニル、フッ化ビニリデン−テトラフルオロエチレン共重合体、ポリエーテルスルホン、ポリ（メタ）アクリレート、ブタジエン−アクリロニトリルコポリマー、ポリエーテル−ポリアミドブロツクコポリマー、エチレン−ビニルアルコールコポリマー等が挙げられ、無機材料としてはガラス、シリコン、金属、石英、セラミック等が挙げられるが、上記に限定されるものではない。
【００４０】
透明性に優れた支持材料を用いることにより、染色された特定型群の生物由来粒子を透過型顕微鏡等の検出手段により検出することができるので好ましい。透明性に優れた支持材料としては、プラスチック、ガラス、石英等が挙げられるが、繰り返し使用せずに、臨床の際や実験毎に使い捨てにするためには、安価、かつ、加工性に優れたプラスチックで作製された支持材料が必要である。具体的には、ポリメチルメタクリレート、塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエチレン、アクリロニトリルースチレン共重合体、アクリロニトリルーブタジエン共重合体、ポリクロルフルオロエチレン、ポリカーボネート、ポリアセタール、ポリフェニレンオキシド、グリプタル樹脂等の素材が挙げられる。好ましくは、ポリメチルメタクリレート、塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリカーボネート等が挙げられる。
【００４１】
以上に述べたように、本発明の方法によって、特定型群の生物由来粒子を、該粒子を含む懸濁液より迅速に、かつ、簡便に濃縮し、検出することができる。
ヒトの膵臓から得られるランゲルハンス島は、当然のことながら、適当な免疫抑制剤を用いることによって、そのまま膵島移植に使用できる。また、後ほどの使用のため、適当な材料中に封入することによって保存できる。このようなカプセル化により免疫応答が抑制され、その結果、異種移植への使用も可能となる。例えば、ブタ等のランゲルハンス島をヒトに移植することができる。また、ランゲルハンス島のみならずインスリン細胞へ分化することができる幹細胞や前駆細胞も調製することができるので、調製したそれらの細胞を適当な条件下で培養することによって、インスリン産生細胞へ分化、増殖させ、得られたインスリン産生細胞も移植療法に用いることができる。
【００４２】
【発明の実施の形態】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明は何らこれに限定されるものではない。
【００４３】
【実施例１】
ブタ膵臓の消化とジチゾン添加不織布を用いたランゲルハンス島の濃縮、検出および計数
屠殺場にてブタ膵臓摘出後、直ちに氷冷し、細切した。ＨＢＳＳ（Ｈａｎｋ緩衝液）に、コラゲナーゼ（商標、新田ゼラチン社製、ｔｙｐｅＳ−１）を１ｍｇ／ｍｌの濃度になるように溶解した液１０ｍｌに、細切したブタ膵臓１０ｇを入れ、３７℃に加熱した恒温槽にて数分おきに撹拌しながら２０分間加温した。未消化の膵臓片を除き、残った消化液を、ジチゾン溶液によって染色した後、スライドガラス上に１μｌずつ滴下し、ランゲルハンス島を計数した。
【００４４】
次に、スライドグラス上に滴下された消化液１μｌ分の直径に相当する、直径６ｍｍの穴を有するアクリル板とスライドガラスで挟んだ、ジチゾン溶液を含浸した平均孔径１２μｍの不織布に未染色の消化液５μｌを滴下し、分離されたランゲルハンス島の状態を顕微鏡で観察した。
図２は、不織布６に捕捉されたランゲルハンス島７を撮像した写真である。これよりランゲルハンス島を、その色および形状により容易に検出・計数することができることが確認された。図３は、ランゲルハンス島をスライドグラスに滴下する方法と本発明の方法で計数した結果を比較した図である。不織布を用いた本発明の方法により標準偏差が小さくなり、本発明の方法を用いることにより、同一検鏡面積において、より正確にランゲルハンス島数を計測できることが確認された。
【００４５】
【実施例２】
ギムザ（Ｇｉｅｍｓａ）液添加不織布上での白血球の検出
図４で示すように、直径６ｍｍの穴８を有するアクリル板９、Ｇｉｅｍｓａ液を含浸した平均孔径１２μｍの不織布１０、Ｇｉｅｍｓａ液を含浸した濾紙１１、スライドグラス１２の順に重ねて固定し、アクリル板の穴から健常人より提供された全血１００μｌをＧｉｅｍｓａ液含浸不織布上に滴下した。１５分間室温で放置した後、濾紙を新しいものに交換し、１／１５Ｍリン酸緩衝液１００μｌを滴下した。濾紙を外し、顕微鏡で不織布を観察したところ、図５で示されるように、不織布１４に捕捉、染色された白血球１３が青い点として観察され、本発明の方法により白血球の検出が可能であることが確認された。
【００４６】
【発明の効果】
本発明によれば、ランゲルハンス島やインスリン分泌細胞に分化する幹細胞や前駆細胞を迅速に、かつ、簡便に濃縮、検出できるので、膵島移植のためのランゲルハンス島検出工程の時間が短縮され、その作業も容易になる。
本発明によってランゲルハンス島を濃縮、検出することによりランゲルハンス島分離精製の際の条件決定を行うことができ、分離精製されたランゲルハンス島は、次いで、糖尿病患者内にインシュリンを生成させるため、糖尿病患者に移植することができる。また、生物由来材料から幹細胞や前駆細胞を濃縮、検出した場合は、それを分離精製後、培養してインスリン産生細胞に分化、増殖させて糖尿病患者に移植することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明における生物由来粒子検出装置の一例を示す概略図。
【図２】実施例１における不織布に捕捉、染色されたランゲルハンス島の顕微鏡写真。
【図３】実施例１におけるランゲルハンス島を計数した結果の比較を示したグラフ。
【図４】実施例２において用いられた検出装置を示す概略図。
【図５】実施例２における不織布に捕捉、染色された白血球の顕微鏡写真。[0001]
[Industrial applications]
The present invention relates to a method for easily and easily detecting necessary biological particles from a biological particle suspension, and an apparatus used for the method. In particular, the present invention provides a method for detecting a specific biological particle type group such as islets of Langerhans and the like, after digesting a pancreatic organ or the like with an enzyme or the like, passing the released tissue or biological particle suspension through a filter. The equipment used.
The cell type group detected by the present invention is not limited to the islets of Langerhans, but can be applied to cancer diagnosis and the like by capturing and detecting cancer cells.
[0002]
[Prior art]
Diabetes is a serious disease that is spreading not only in Japan but also worldwide. According to a survey conducted by the former Ministry of Health and Welfare in 1997, there were approximately 6.90 million "people who are strongly suspected of having diabetes," and when adding 6.8 million "people who cannot deny the possibility of diabetes," about 13.7 million People are estimated to be at risk. The WHO estimates that the worldwide diabetic population will be more than 150 million in 2000 and will reach about 300 million by 2025.
[0003]
In recent years, islet transplantation has been receiving attention as a curative treatment for diabetes. Pancreatic islet transplantation is expected as an excellent treatment for diabetes, which enables physiological control of blood sugar, is easy to perform, and can be applied to high-risk patients.
Islet transplantation is aimed at preventing or improving the progression of diabetic secondary lesions by improving glucose metabolism. It is considered a good indication for transplantation.
[0004]
Pancreatic islet transplantation is possible with local anesthesia and is minimally invasive, making it safer for diabetics. Patients who are not eligible for pancreatic (organ) transplantation due to progression of vascular lesions because vascular anastomosis is not required But it is possible. Also, insulin is released into the portal circulation, which is physiologically advantageous. Furthermore, it has many advantages as compared with pancreatic (organ) transplantation, such as so-called banking by cryopreservation of isolated islets.
[0005]
In the practice of non-insulin dependent diabetes mellitus (NIDDM) clinical practice, insulin therapy is actively used. This is based on the idea that insulin is administered to rest the patient's own pancreatic islet β-cells, thereby waiting for the β-cells to recover their functions. It has been reported.
This indicates that NIDDM can also be treated by pancreatic islet transplantation. If pancreatic islets are transplanted during the period when β-cell function in NIDDM patients is decreasing, β-cell function is restored again, and NIDDM There is also a possibility that deterioration can be prevented.
[0006]
The results of the islet transplantation, which began at the experimental medical stage, were initially poor, but a new breakthrough Edmonton Protocol was implemented at the University of Alberta in Edmonton, Canada in March 1999, and seven cases of islet transplantation were performed. It has been reported that all cases became insulin independent (see Non-Patent Document 1), and a multicenter trial using this protocol is also being prepared.
[0007]
As described above, the reason for the development of clinical studies on islet transplantation was that a large-scale islet separation method from large animal pancreas was studied. In 1984, Ricordi et al. Devised a unique automatic islet separation apparatus, The major success in separating large-scale islets from the pancreas was significant.
Isolation and preparation of pancreatic islets used for pancreatic islet transplantation generally include the following techniques relating to isolation of large-scale islets. That is, it is a technique described in documents represented by Patent Document 1 and Non-Patent Document 2.
[0008]
A typical general operation for isolating pancreatic islets is performed in the following steps.
First, the pancreas of the human or porcine pancreas is digested at a low temperature by injecting or perfusing a collagenase-containing medium into the pancreatic duct, and then the pancreas injected with the collagenase-containing medium is placed in a dedicated digestion chamber.
Second, to allow for the effective action of the protease, increase the temperature of the medium in the chamber and add the protease-containing medium into the digestion chamber containing the pancreas, with appropriate agitation;
Thirdly, after the outflow of islets of Langerhans from the pancreas in the digestion chamber is directly detected by dithizone staining, for example, by a microscope;
Fourth, a new low-temperature medium is introduced into the digestion chamber, and the cells that have flowed out of the digestion chamber are drained into the collector and collected.
[0009]
Finally, a gradient with a specific gravity solution such as Ficoll is applied to the cell suspension from the recovery flask, and centrifuged to collect a purified fraction containing Langerhans islet cells.
As described above, the detection of Langerhans islet outflow from the digestion chamber is a complicated operation because it is a microscopic work performed visually by the practitioner, and the burden is placed on the practitioner and the detection takes time. there were. In addition, when the concentration of the outflowing islets of Langerhans is low, more samples need to be examined for accurate counting, and therefore, a larger area is examined, which places an additional burden on the practitioner. impose. Therefore, it has been desired to establish a method for concentrating the outflowing islets of Langerhans and detecting it easily.
[0010]
In Non-Patent Document 3, a pancreatic digestive juice is poured into a cell strainer (trademark, manufactured by BD Biosciences), which is a nylon mesh having a pore diameter of 100 μm, rinsed with 50 ml of HBSS, and then inverted in a Petri dish. A method for separating and collecting cells is described in which the cells are placed, washed with 20 ml of HBSS, and collected in a Petri dish. However, this is for the purpose of collecting cells, and there is no description about cell detection using a filter.
In Patent Document 2, living cells are detected by holding microorganisms on a filter, staining dead cells, dissociating the DNA of living cells, and staining with an intercalator. Since it is necessary, the operation is complicated, and accordingly, there is a problem that the time required for detection also increases.
[0011]
Patent Document 3 discloses the following method. A certain amount of blood is placed on a glass microfiber filter set in a syringe, and water is added so as not to destroy granulocytes in the blood, and erythrocytes are lysed in order to remove components that inhibit the measurement of granulocytes in advance. After that, the dissolved components in the sample are suction-washed. Thereafter, the glass fiber filter containing the undissolved granulocytes was dried, and 0.005% Triton X-100, 30 mM 3-amino-1,2,4 triazole, 0.0005% H were added to the filter. ₂ O ₂ 50 mM phosphate buffer containing 0.5 mg / ml o-tolidine is added dropwise. Next, spots stained blue by the action of myeloperoxidase eluted from granulocytes are counted as granulocytes. This method has a problem that the operation is very complicated and the cells are destroyed, so that the shape and state of the cells captured by the filter cannot be observed.
[0012]
As a method for detecting biological particles on a filter, Patent Document 4 describes the following method. At any time before or after the staining of the bacteria in the sample, the bacteria are collected with a hydrophobic filter, and excess bacterial dye is removed by washing.The total number of bacteria in the sample is determined based on the degree of bacterial coloring on the filter. Is measured. Next, the bacteria collected by the hydrophobic filter are stained with a dye for staining Gram-positive bacteria, mordant using a mordant, and excess Gram-positive bacterial staining reagent and mordant are removed by washing. Thereafter, the number of Gram-positive bacteria in the sample is determined from the degree of coloring of the Gram-positive bacteria on the filter. According to this method, it is necessary to perform staining using a staining reagent before or after collecting the bacteria on the filter, and there is a problem that the operation is complicated.
Patent Document 5 describes a method for detecting Legionella using a filter. The filter is overlaid on a medium, the filter is separated after colonies are formed, the cells are disrupted, and the cells are destroyed. Is very complicated and the time required for the operation is extremely long.
[0013]
Patent Document 6 describes a method of adding a dye solution to bacteria collected on a filter under suction conditions to stain and detect the dye solution. However, it is necessary to separately prepare a dye solution, which is troublesome. In addition, a means such as a pump is required for performing suction, and this is not suitable for simple detection.
Patent Document 7 describes a method of performing detection by binding a labeled anti-DNA antibody to DNA of a microorganism captured on a filter, but it takes tens of minutes to several days to obtain a detection result. However, it is not applicable in a case where prompt detection is required.
[0014]
Patent Document 8 describes the following method. It has a hydrophobic filter for detecting bacteria inside, in which a dye solution composition is previously disposed on the side where a bacterial sample is collected as viewed from the filter, and a support for the filter is disposed in advance on the opposite side as viewed from the filter. The bacterial sample is put into the tubular filter container from the side where the bacterial sample is collected and stained. Next, suction filtration is performed from the side of the support, collection of stained bacteria in the filter and removal of excess dye are performed at the same time, and the number of bacteria in the sample is measured from the degree of coloration of the filter. Since this method uses a tubular filtration container, it is difficult to observe the collected bacteria with a microscope or the like.In addition, since a mechanism such as a piston for suction is required, the measuring tool becomes bulky. There is a problem that the operation requires attention to handle the staining reagent.
[0015]
Patent Document 9 describes a method for counting viable bacteria and leukocytes by concentrating with a filter and performing fluorescent labeling. However, in order to perform the counting with a flow cytometer or a laser scanning hemocytometer, the apparatus is used. However, it is not possible to perform detection at a facility that does not have this, and it is not suitable for rapid detection because pre-processing alone requires several tens of minutes.
Patent Document 10 describes a method of collecting bacteria stained on a filter by bringing a liquid containing a dye into contact with a sample, and measuring the number of bacteria based on the degree of coloration. In addition, it is necessary to prepare a liquid containing a dye separately from the filter, which is not easy to use.
[0016]
Patent Document 11 discloses that a filter for bacteria collection and detection having a first filter having a pore size of 30 to 70 μm and a second filter having a pore size of 0.45 to 4 μm made of a hydrophobic material is contacted with the first filter first. A method for measuring the number of bacteria, which comprises introducing a sample colored in such a manner as described above, collecting bacteria, and detecting the number of bacteria in the sample from the degree of coloring of the second filter, is described. In this method, it is necessary to add a coloring reagent to the sample in advance. That is, the coloring operation is required before the filtration with the filter, which is complicated, and the preparation of the coloring reagent is required, which is troublesome.
[0017]
Patent Literature 12 describes a method of binding a labeled nucleic acid probe to DNA and detecting the cells held on a polymer membrane filter. However, such a method requires one night of incubation with a nucleic acid probe. It is far from detecting.
Patent Literature 13 describes a method in which cells held on a filter are crushed with a buffered surfactant solution and detected by hybridization, but the processing requires time and rapid detection is impossible.
[0018]
Patent Document 14 describes a method for detecting microorganisms retained on a filter by fluorescence, but the operation is complicated because a staining reagent is added to a sample in advance, or staining is performed after filter filtration. Have a point.
Patent Literature 15 discloses an enzyme immunoassay in which the amount of an antigen (or an antibody) is measured using an antigen-antibody reaction by using an enzyme-antibody reaction as an index. In, a sample solution containing an antigen (or an antibody) previously bound to an enzyme or a substrate is dropped on a water-permeable sheet on which an antibody (or an antigen) is fixed, and an antigen-antibody reaction is performed on the sheet, and free enzyme or Only the antigen (or antibody) bound to the substrate is transferred to a transparent film provided below the sheet, and the substrate and the enzyme are reacted on the transparent film to generate a fluorescent or luminescent substance. There is a description of an enzyme immunoassay characterized by measuring the amount of an antigen (or an antibody) by the method described above. This method is limited to the antigen-antibody reaction, and there is no description of the biologically-derived particles in the present invention, and the detection is performed by measuring the amount of fluorescence or luminescence. It requires an element or the like and is not suitable for simple detection.
[0019]
Patent Document 16 discloses a test piece having a blood cell component separating ability capable of separating a blood cell component from whole blood containing a blood cell component and a plasma component and detecting a test substance such as glucose contained in the plasma component. A bead, an inorganic gel, and a reagent layer having a porous structure containing a reagent that causes a detectable reaction with the test substance, and a support for supporting the reagent layer, and the beads are separated by the inorganic gel. There is a description of a test piece which is adhered and has a particle gap for collecting the solid component between beads. According to the present invention, a procedure for preparing a test piece by bonding the beads with an inorganic gel is required, and the preparation is complicated.In addition, a test piece to which a reagent is added in advance is required for bonding with the inorganic gel. Therefore, it is impossible to change the reagent immediately before use, and the versatility is poor.
That is, a method for efficiently concentrating and staining Langerhans islets separated from pancreatic organs without using complicated detection means and detecting the islets has not been known.
[0020]
[Non-patent document 1]
Shapiro AM, Lakey JRT, Ryan EA, Korbutt GS, Toth E, Warnock GL, Kneteman NM, Rajotte RV: N Eng J Med, 343, 230-238 (2000)
[Non-patent document 2]
Ricordi C, Lacy PE, Finke EH, Olac BJ, Sharp DW: Daibetes, 37, 413-420 (1988).
[Non-Patent Document 3]
Paolo R. O. Salvalaggio, et al: Transplantation, 74, 877-900, 2002.
[Patent Document 1]
Japanese Patent Publication No. 2-50442222 (corresponding to U.S. Pat. No. 5,079,160)
[Patent Document 2]
International Publication No. 90/03440 pamphlet
[Patent Document 3]
WO 93/01306 pamphlet
[Patent Document 4]
JP-A-5-308997
[Patent Document 5]
JP-A-6-213894
[Patent Document 6]
JP-A-8-23959
[Patent Document 7]
JP-A-8-289780
[Patent Document 8]
JP-A-8-322594
[Patent Document 9]
JP-A-9-119926
[Patent Document 10]
JP-A-10-136996
[Patent Document 11]
JP-A-10-215859
[Patent Document 12]
Japanese Patent Publication No. 10-501419 (corresponding to International Publication No. 95/34685 pamphlet)
[Patent Document 13]
Japanese Patent Publication No. 11-509104 (corresponding to International Publication No. 97/42349)
[Patent Document 14]
JP-A-2002-291499
[Patent Document 15]
JP-A-58-150861
[Patent Document 16]
JP 2001-264315 A
[0021]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a method for concentrating and detecting a specific group of particles of a biological origin in a short time and easily. In particular, an object of the present invention is to provide a method capable of easily and simply enriching and detecting stem cells and progenitor cells that differentiate from pancreatic organs into Langerhans islets and insulin-producing cells.
[0022]
[Means for Solving the Problems]
That is, the present invention is as follows.
(1) A method for detecting a biological particle of a specific type, wherein the substrate for capturing the biological particle to which a staining reagent for staining the biological particle is added in advance includes the biological particle. A method for detecting biological particles, the method comprising capturing and dyeing the biological particles by adding a suspension, and qualitatively or quantitatively detecting the stained biological particles.
[0023]
(2) The method for detecting biological particles according to (1), wherein the substrate that captures the specific type of biological particles is water-absorbing.
(3) The method for detecting biological particles according to (1), wherein the substrate that captures the specific type group of biological particles is made of a nonwoven fabric.
(4) The method for detecting biological particles according to (1), wherein the biological particles of a specific type are derived from biological materials.
(5) The method for detecting biological particles according to (4), wherein the biological particles of the specific type group are at least one selected from stem cells, progenitor cells, islets of Langerhans, and leukocytes.
[0024]
(6) The method for detecting biological particles according to (1), wherein the staining reagent is dithizone (diphenylthiocarbazone) or Giemsa staining reagent.
(7) The method for detecting biologically-derived particles according to (1), wherein an image of stained biologically-derived particles is captured, and the number of biologically-derived particles is determined by measuring a color signal of the captured image.
(8) The method for detecting biological particles according to (1), wherein the presence or absence or the number of the stained biological particles is visually confirmed.
[0025]
(9) An apparatus for detecting biological particles of a specific type,
(A) a substrate that captures the biological particles, to which a staining reagent for staining the biological particles is added in advance;
(B) a supporting substrate that supports the substrate by sandwiching the substrate from above and below, and distinguishes between the color of the water-absorbing material of the biological particles in the substrate stained with the staining reagent and a color different from the color Support substrate having an inlet for adding a biologically-derived particle suspension containing the biologically-derived particles to a substrate, having a transparent portion that is possible,
A biological particle detection device, comprising:
(10) The biological particle detecting device according to (9), wherein the substrate that captures the biological particles of the specific type group is water-absorbing.
(11) The biological particle detecting device according to (9), wherein the substrate that captures the specific type group of biological particles is formed of a nonwoven fabric.
[0026]
ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the biological-derived particle of a specific type group can be concentrated and detected more easily and in a shorter time than the biological-derived particle suspension.
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
FIG. 1 is an example of the biological particle detecting device of the present invention. The base material 2 for capturing the biologically-derived particles, to which a staining reagent for staining the specific-type biologically-derived particles is added in advance, is sandwiched from above and below by the transparent polymethyl methacrylate substrates 1 and 2. From the opening 5 provided in the upper substrate 1, a suspension containing biological particles is added to the substrate 2. The stained biological particles are qualitatively or quantitatively detected by the detection means 4 via the transparent substrate 1.
[0027]
As described herein, a particular type of biologically-derived particles refers to oraminifera, spines, plateworms, cartilaginous fish, teleosts, amphibians, reptiles, birds, animals derived from mammals, A particle or a cluster of particles having a certain characteristic characteristic contained in an individual, an organ, an organ, a tissue, a body fluid, and human waste. Characteristic properties refer to the size, specific gravity, contents, surface markers, surface charges, secretory proteins, stainability with chemical substances, etc. of biological particles or biological particle clusters, and have the same properties among them. The population of biological particles or biological particle clusters is a particular type of biological particles.
[0028]
Examples of particles of a specific type of organisms include the islets of Langerhans contained in the pancreas, blood cells and epithelial cells in body fluids or urine, bacteria, fungi, protozoa, parasites, and organic substances such as proteins and amino acids, and inorganic substances such as salts. And the like. For example, stem cells or progenitor cells that differentiate into insulin-producing cells derived from islets of Langerhans or pancreas are separated by density gradient centrifugation as a specific group of cells having the same specific gravity. Above all, Langerhans Island can be collected in large quantities.
The stem cells described in the present invention refer to cells capable of differentiating into various cells, and usually include adult stem cells or progenitor cells present in tissues and organs. For example, in the case of pancreas, stem cells (or progenitor cells) that differentiate into insulin-producing β cells are reported to be present in the pancreatic duct and are also known to be present in liver cells.
[0029]
The substrate according to the present invention that captures the biological particles of a specific type is a structure made of a porous material, and has a large number of fine holes communicating from one surface to the other surface. It means a gas-permeable base material having an average pore size capable of selectively separating and removing biological particles of a type group. In order to quickly detect a specific type of biological particles from the biological particle suspension, the substrate must be water-absorbing. It is desirable because it absorbs and achieves enrichment of biological particles. Further, in the case of performing detection with a microscope using a microscope, it is desirable that the substrate has sufficient light transmittance. When other detection methods are used, such as confirmation of coloring by the naked eye, measurement of a color signal of a captured image, and the like, there is no need to consider light transmittance.
The porous body refers to a structure having a large number of fine holes, and its material, thickness, shape, dimensions, and the like are not limited. The material of the porous body may be an organic material, an inorganic material, or a composite material including an organic material and an inorganic material.
[0030]
Among them, organic materials, particularly organic polymers, are preferable materials because of their excellent workability such as cutting. Examples of the organic polymer include polycarbonate, polyurethane, polyacrylonitrile, polyvinyl alcohol, polyvinyl acetal, polyester, polyamide, polystyrene, polysulfone, cellulose, cellulose acetate, polyethylene, polypropylene, polyvinyl fluoride, polyvinylidene fluoride, and polytrifluoroethylene. Examples include, but are not limited to, chlorovinyl, vinylidene fluoride-tetrafluoroethylene copolymer, polyether sulfone, poly (meth) acrylate, butadiene-acrylonitrile copolymer, polyether-polyamide block copolymer, ethylene-vinyl alcohol copolymer, and the like. It is not done.
[0031]
The shape of the porous body is not limited as long as it has pores capable of capturing biological particles, and may be any of a flat plate shape, a spherical shape, a rod shape, a fiber shape, and a hollow shape. Examples of this include meshes, films, sheets, membranes, plates, nonwoven fabrics, filter papers, sponges, woven fabrics, knits, lumps, threads, hollow fibers, particles, and the like. When capturing biological particles, mesh, film, sheet, filter paper, etc. are considered considering that the size of pores for capturing biological particles can be easily controlled so that operation can be easily performed, ease of substrate fabrication, cost, etc. , A membrane, a plate, a nonwoven fabric, a sponge, a hollow fiber, and particles are preferable, and a film, a sheet, a filter paper, a membrane, a nonwoven fabric, and a sponge are more preferable.
[0032]
The size of the pores of the porous body is not limited, but in consideration of the ability to selectively capture biological particles, the average pore size is preferably 0.1 μm or more and 500 μm or less, more preferably 1 μm or more and 400 μm or less, most preferably Preferably it is 5 μm or more and 200 μm or less. In order to facilitate the selective capture of biological particles, it is preferable to use a plurality of the above-mentioned porous bodies in a stacked manner.
The average pore diameter of the porous body in the present invention is a value measured by a mercury porosimeter. When measured with a mercury porosimeter, the pore diameter (diameter) showing the maximum peak in the pore diameter distribution curve is the average pore diameter in the present invention. Therefore, particles having a diameter larger than the average pore diameter of the porous body represent a diameter that is difficult to enter, and particles having a diameter larger than this do not mean that particles will never enter.
[0033]
A nonwoven fabric is a cloth in which an aggregate of fibers or yarns is chemically, thermally, or mechanically connected regardless of knitting or weaving. If the fibers and the fibers are in contact with each other and maintain a certain shape due to friction or entanglement with each other, it can be said that these are also mechanically connected. The woven fabric means a fabric formed by interlacing warp yarns and weft yarns.
The above-mentioned porous body may be subjected to a surface coating treatment with a polymer substance to such an extent that pores of the porous body are not closed in order to improve the adhesiveness or water absorption of the biological particles.
[0034]
Polymer substances can be broadly classified into three groups: natural polymer substances, semi-synthetic polymer substances, and synthetic polymer substances, and any of the polymer substances can be used in the present invention. For example, natural polymer substances include mica (mica), asbestos (asbestos), graphite (graphite), diamond, starch, cellulose, sugars and gelatins represented by alginic acid, collagen, laminin, vitronectin, fibronectin, fibrinogen, etc. And proteins, peptides, and the like. Examples of the semi-synthetic polymer include glass, cellulose nitrate, cellulose acetate, rubber hydrochloride, carboxymethyl cellulose, and the like. Synthetic high-molecular substances include polycarbonate, polyphosphonitrile chloride, polyethylene, polyvinyl chloride, polyamide, polyethylene terephthalate, polysulfone, polyacrylonitrile, polyvinyl alcohol, polymethyl methacrylate, polyhydroxyethyl methacrylate, polydimethylaminoethyl methacrylate and hydroxyethyl. Copolymers composed of two or more kinds of synthetic monomers typified by a copolymer of methacrylate and dimethylaminoethyl methacrylate are exemplified.
[0035]
Considering the ease of the coating treatment, organic polymer substances are preferable, and proteins, peptides and organic synthetic polymer substances are more preferable.
The porous body may have been subjected to some surface treatment such as immobilization of a physiologically active substance such as an antibody or a staining reagent such as dithizone, grafting, electron beam irradiation, or irradiation.
The specific type group of biologically-derived particles captured on the substrate can be easily detected by staining with a staining reagent. By using, for example, dithizone (diphenylthiocarbazone) that specifically stains islets of Langerhans or Gimsa staining reagent that selectively stains leukocytes, it is possible to easily detect islets of Langerhans or leukocytes. is there.
[0036]
By adding the staining reagent to the substrate in advance, the step of adding the reagent at the time of detection can be omitted. Examples of the method of adding include a method of dipping the substrate in a solution containing the staining reagent and then drying the solution to adsorb the staining reagent on the substrate, a method of chemically binding the staining reagent to the substrate, and the like. Examples of chemical bonds include covalent, ionic, hydrogen, and hydrophobic bonds. The added staining reagent does not necessarily need to be completely bound to the substrate. By adding the biological particle suspension to the substrate, the staining reagent on the substrate is washed away, and even if the concentration decreases, sufficient staining reagent remains for staining the specific type of biological particles. It should just be.
[0037]
Means for detecting biological particles of a specific type captured on the substrate include microscopy, visual confirmation with the naked eye, and color signal capture by capturing the image of the cells captured on the substrate. Measurement and the like. In addition to qualitative detection, counting may be performed quantitatively as necessary. It is preferable to take in the image of the stained target cell, analyze it, and perform counting by measuring the color signal, since it enables automation of detection.
[0038]
The substrate is preferably supported by a supporting substrate from the viewpoint of ease of handling.By supporting the substrate by sandwiching the substrate, the substrate is more likely to be added after adding a suspension containing biological particles of a specific type. It is preferable for easy observation when taking a detailed observation.
It is preferable to provide an introduction portion for adding a suspension containing biological particles of a specific type to the base material on the support substrate, because the detection operation is simplified. The introduction portion is preferably an opening having a sufficient area for the suspension to expand when the suspension containing the biological particles of a specific type is added to the support substrate. When the suspension is water-absorbing, the area of the opening does not necessarily need to be larger than the area where the suspension spreads. When the area where the suspension spreads is limited, it is preferable to reduce the area of the opening.
[0039]
The material for supporting the substrate may be an organic material, an inorganic material, or a composite material including an organic material and an inorganic material. Among them, organic materials, particularly organic polymers, are preferable materials because of their excellent workability such as cutting. Examples of the organic polymer include polycarbonate, polyurethane, polyacrylonitrile, polyvinyl alcohol, polyvinyl acetal, polyester, polyamide, polystyrene, polysulfone, cellulose, cellulose acetate, polyethylene, polypropylene, polyvinyl fluoride, polyvinylidene fluoride, and polytrifluorochloro. Vinyl, vinylidene fluoride-tetrafluoroethylene copolymer, polyether sulfone, poly (meth) acrylate, butadiene-acrylonitrile copolymer, polyether-polyamide block copolymer, ethylene-vinyl alcohol copolymer, etc., and inorganic materials such as glass , Silicon, metal, quartz, ceramic and the like, but are not limited to the above.
[0040]
The use of a support material having excellent transparency is preferable because the stained biologically-derived particles of a specific type can be detected by a detection means such as a transmission microscope. Examples of the support material having excellent transparency include plastics, glass, and quartz.However, in order to disposable at the time of clinical use or each experiment without using repeatedly, it is inexpensive and has excellent workability. A support material made of plastic is required. Specifically, materials such as polymethyl methacrylate, vinyl chloride, polypropylene, polystyrene, polyethylene, acrylonitrile styrene copolymer, acrylonitrile butadiene copolymer, polychlorofluoroethylene, polycarbonate, polyacetal, polyphenylene oxide, and glyptal resin are used. No. Preferably, polymethyl methacrylate, vinyl chloride, polypropylene, polystyrene, polyethylene, polycarbonate and the like are mentioned.
[0041]
As described above, the method of the present invention makes it possible to rapidly and simply concentrate and detect a specific type of biological particles from a suspension containing the particles.
The islets of Langerhans obtained from the human pancreas can, of course, be directly used for islet transplantation by using a suitable immunosuppressant. It can also be preserved by encapsulating it in a suitable material for later use. Such an encapsulation suppresses the immune response, thereby allowing its use in xenografts. For example, islets of Langerhans such as pigs can be transplanted into humans. In addition, since stem cells and progenitor cells capable of differentiating into insulin cells as well as the islets of Langerhans can be prepared, by culturing the prepared cells under appropriate conditions, differentiation and proliferation into insulin-producing cells can be performed. The resulting insulin-producing cells can also be used for transplantation therapy.
[0042]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described specifically with reference to Examples, but the present invention is not limited thereto.
[0043]
Embodiment 1
Digestion of porcine pancreas and enrichment, detection and counting of islets of Langerhans using nonwoven fabric with dithizone
Immediately after excision of the pig pancreas at the slaughterhouse, it was ice-cooled and minced. 10 g of minced porcine pancreas was added to 10 ml of a solution in which collagenase (trademark, type S-1 manufactured by Nitta Gelatin Co., Ltd.) was dissolved at a concentration of 1 mg / ml in HBSS (Hank's buffer solution). The mixture was heated for 20 minutes while being stirred in a constant temperature bath heated at a temperature of several minutes. Undigested pancreatic fragments were removed, and the remaining digestive juice was stained with a dithizone solution, and then dropped on a slide glass in an amount of 1 μl each to count the islets of Langerhans.
[0044]
Next, an unstained digestion was performed on a non-woven fabric having an average pore diameter of 12 μm impregnated with a dithizone solution and sandwiched between an acrylic plate having a hole of 6 mm in diameter and a slide glass corresponding to the diameter of 1 μl of digestive juice dropped on the slide glass. 5 μl of the liquid was dropped, and the state of the separated islets of Langerhans was observed with a microscope.
FIG. 2 is a photograph of the Langerhans island 7 captured by the nonwoven fabric 6. From this, it was confirmed that the islets of Langerhans can be easily detected and counted based on their colors and shapes. FIG. 3 is a diagram comparing the results of counting by the method of the present invention with the method of dropping the islets of Langerhans onto a slide glass. The standard deviation was reduced by the method of the present invention using a nonwoven fabric, and it was confirmed that the use of the method of the present invention enabled more accurate measurement of the number of Langerhans islands in the same microscopic area.
[0045]
Embodiment 2
Detection of leukocytes on nonwoven fabric with Giemsa liquid
As shown in FIG. 4, an acrylic plate 9 having a hole 8 having a diameter of 6 mm, a nonwoven fabric 10 having an average pore diameter of 12 μm impregnated with Giemsa liquid, a filter paper 11 impregnated with Giemsa liquid, and a slide glass 12 are stacked and fixed in this order. 100 μl of whole blood provided from a healthy person was dropped from the hole of No. on the Giemsa liquid-impregnated nonwoven fabric. After standing at room temperature for 15 minutes, the filter paper was replaced with a new one and 100 μl of 1 / 15M phosphate buffer was added dropwise. After removing the filter paper and observing the non-woven fabric with a microscope, as shown in FIG. 5, the leukocytes 13 captured and stained by the non-woven fabric 14 are observed as blue dots, and the leukocytes can be detected by the method of the present invention. Was confirmed.
[0046]
【The invention's effect】
According to the present invention, stem cells and progenitor cells that differentiate into islets of Langerhans and insulin-secreting cells can be rapidly and easily concentrated and detected, so that the time for the islet of Langerhans detection step for islet transplantation is reduced, Will also be easier.
By enriching and detecting the islets of Langerhans according to the present invention, it is possible to determine the conditions for the separation and purification of islets of Langerhans, and the separated and purified islets of Langerhans are then used to produce insulin in diabetic patients, so that diabetic patients are given Can be transplanted. When stem cells or progenitor cells are concentrated and detected from a biological material, they can be separated and purified, cultured, differentiated and proliferated into insulin-producing cells, and transplanted to a diabetic patient.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a schematic diagram showing an example of a biological particle detection device according to the present invention.
FIG. 2 is a micrograph of a Langerhans island captured and stained by a nonwoven fabric in Example 1.
FIG. 3 is a graph showing a comparison of the results of counting Langerhans islands in Example 1.
FIG. 4 is a schematic diagram showing a detection device used in Example 2.
FIG. 5 is a photomicrograph of leukocytes captured and stained by a nonwoven fabric in Example 2.

Claims

特定型群の生物由来粒子を検出する方法であって、該生物由来粒子を染色する染色試薬が予め添加されている、生物由来粒子を捕捉する基材に、該生物由来粒子を含む懸濁液を添加することによって該生物由来粒子を捕捉すると共にこれを染色し、染色された該生物由来粒子を定性的または定量的に検出することを特徴とする生物由来粒子検出方法。A method for detecting biological particles of a specific type, wherein a staining reagent for staining the biological particles is added in advance, and a suspension containing the biological particles on a substrate that captures the biological particles. A method for detecting biologically-derived particles, which comprises capturing and dyeing the biologically-derived particles by adding a dye, and qualitatively or quantitatively detecting the stained biologically-derived particles.

特定型群の生物由来粒子を捕捉する基材が吸水性であることを特徴とする請求項１記載の生物由来粒子検出方法。2. The method for detecting biological particles according to claim 1, wherein the substrate capturing the specific type of biological particles is water-absorbing.

特定型群の生物由来粒子を捕捉する基材が不織布で構成されていることを特徴とする請求項１記載の生物由来粒子検出方法。2. The method for detecting biological particles according to claim 1, wherein the substrate for capturing the specific type of biological particles is made of a nonwoven fabric.

特定型群の生物由来粒子が生物由来材料由来のものであることを特徴とする請求項１記載の生物由来粒子検出方法。2. The method for detecting biological particles according to claim 1, wherein the biological particles of the specific type group are derived from biological materials.

特定型群の生物由来粒子が、幹細胞、前駆細胞、ランゲルハンス島および白血球から選ばれる少なくとも一種であることを特徴とする請求項４記載の生物由来粒子検出方法。The method for detecting biological particles according to claim 4, wherein the specific type of biological particles is at least one selected from stem cells, progenitor cells, islets of Langerhans, and leukocytes.

染色試薬がジチゾン（ジフェニルチオカルバゾン）またはギムザ（Ｇｉｅｍｓａ）染色試薬であることを特徴とする請求項１記載の生物由来粒子検出方法。The method for detecting biological particles according to claim 1, wherein the staining reagent is dithizone (diphenylthiocarbazone) or Giemsa staining reagent.

染色された生物由来粒子の画像を取り込み、取り込んだ画像の色信号を計測することにより生物由来粒子数を求めることを特徴とする請求項１記載の生物由来粒子検出方法。The biological particle detecting method according to claim 1, wherein an image of the stained biological particle is captured, and a color signal of the captured image is measured to determine the number of the biological particle.

染色された生物由来粒子の有無または数を肉眼により確認することを特徴とする請求項１記載の生物由来粒子検出方法。2. The method according to claim 1, wherein the presence or absence or the number of the stained biological particles is visually confirmed.

特定型群の生物由来粒子を検出する装置であって、
（Ａ）該生物由来粒子を染色する染色試薬を予め添加した、該生物由来粒子を捕捉する基材と、
（Ｂ）該基材を上下から挟み込むことにより支持する支持基板であって、染色試薬で染色された該基材中の該生物由来粒子の吸水性材料の色と、それとは異なる色とを識別可能な透明な部分を有し、該生物由来粒子を含む生物由来粒子浮遊液を基材上に添加するための導入口を有する支持基板、
を備えることを特徴とする生物由来粒子検出装置。An apparatus for detecting a biological particle of a specific type group,
(A) a substrate that captures the biological particles, to which a staining reagent for staining the biological particles is added in advance;
(B) a supporting substrate that supports the substrate by sandwiching the substrate from above and below, and distinguishes between the color of the water-absorbing material of the biological particles in the substrate stained with the staining reagent and a color different from the color Support substrate having an inlet for adding a biologically-derived particle suspension containing the biologically-derived particles to a substrate, having a transparent portion that is possible,
A biological particle detection device, comprising:

特定型群の生物由来粒子を捕捉する基材が吸水性であることを特徴とする請求項９記載の生物由来粒子検出装置。10. The biological particle detecting device according to claim 9, wherein the substrate that captures a specific type of biological particles is water-absorbing.

特定型群の生物由来粒子を捕捉する基材が不織布で構成されていることを特徴とする請求項９記載の生物由来粒子検出装置。The biological particle detecting device according to claim 9, wherein the substrate that captures the specific type of biological particles is made of a nonwoven fabric.