JP5155530B2 - Adult stem cell separation and culture system - Google Patents
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Description
本発明は、複数の細胞種からなる細胞懸濁液から成体幹細胞を選択的に分離し、分離した細胞を同一装置内で培養することにより、種々の目的のために必要な質及び量を満たす成体幹細胞を得ることを可能とする細胞分離・培養システムの提供に関する。 In the present invention, adult stem cells are selectively separated from a cell suspension composed of a plurality of cell types, and the separated cells are cultured in the same apparatus, thereby satisfying the quality and quantity necessary for various purposes. The present invention relates to the provision of a cell separation / culture system that makes it possible to obtain adult stem cells.
胚性幹細胞に代表されるように、発生初期の受精卵には様々な臓器や組織に分化する能力を有する幹細胞が豊富に存在することは周知のことであるが、発生を終了した成体にも幹細胞が存在する。近年、この成体中に存在する幹細胞、所謂成体幹細胞を生体内に移植することにより、臓器や組織の機能を代償、あるいは回復させて疾患を治療することが現実的な治療法となりつつある。しかし、成体幹細胞は、胚性幹細胞等の発生初期の組織に由来する幹細胞とは異なり、組織中での存在率が極めて低く、治療に必要な数の幹細胞を調製するためには、幹細胞が含まれる組織を大量に確保する必要があった。 As represented by embryonic stem cells, it is well known that fertilized eggs in the early stages of development have abundant stem cells that have the ability to differentiate into various organs and tissues, but even adults that have completed development. There are stem cells. In recent years, it has become a realistic treatment method to treat diseases by compensating or recovering the functions of organs and tissues by transplanting stem cells present in the adult, so-called adult stem cells, into the living body. However, unlike stem cells derived from early developmental tissues such as embryonic stem cells, adult stem cells have a very low presence rate in tissues and include stem cells to prepare the number of stem cells necessary for treatment. It was necessary to secure a large number of organizations.
例えば、閉塞性動脈硬化症やＢｕｒｇｅｒ病等の下肢虚血疾患に対して、骨髄から血液成分分離装置（例えばバクスター社製ＣＳ３０００−Ｐｌｕｓ）を用いて血管内皮前駆細胞が含まれるとされる骨髄由来単核球画分を分離し、移植する治療が試みられている。この場合、前記装置は骨髄液から単核球画分を分離するだけであり、目的とする血管内皮前駆細胞以外の細胞も多く含まれているだけでなく、治療に有効な血管内皮前駆細胞の数を増幅させる機能は有しない。したがって、通常５００ｍＬ以上もの骨髄液が治療のために必要とされ、患者は骨髄液採取のため全身麻酔を余儀なくされる。 For example, for lower limb ischemic diseases such as obstructive arteriosclerosis and Burger's disease, derived from bone marrow, which contains vascular endothelial progenitor cells using a blood component separation device (eg, Baxter CS3000-Plus) from bone marrow Attempts have been made to isolate and transplant the mononuclear cell fraction. In this case, the device only separates the mononuclear cell fraction from the bone marrow fluid, and not only contains many cells other than the target vascular endothelial progenitor cells, but also effective therapeutic vascular endothelial progenitor cells. It does not have the function of amplifying the number. Therefore, usually more than 500 mL of bone marrow fluid is required for treatment, and the patient is forced to undergo general anesthesia for bone marrow fluid collection.
また、患者から採取した成体幹細胞を培養することによりその細胞数を増幅して、治療に適用することが試みられている。具体的には、人工関節の表面を、成体幹細胞の１つである（患者骨髄由来の）間葉系幹細胞で被覆することにより人工関節の生体適合性を高めた人工関節置換術が試みられているが、ここでは間葉系幹細胞を培養することによりその細胞数を増幅し、局部麻酔で採取が可能な量の骨髄液でも治療のために十分な細胞数の確保が可能となるようにしている。しかし、この場合、骨髄液をそのまま培養フラスコに播種して培養するため、骨髄液中の白血球等の有核細胞や赤血球等幹細胞以外の細胞が大量に培養系に混入することになる。成体幹細胞以外の細胞は、幹細胞が本来消費すべき培地成分や培養スペースを奪うことになるので、培地や培養フラスコ等の使用量が通常の培養よりも格段に増大する。また、このときの成体幹細胞の培養は通常の培養フラスコを用いて開放系の環境下で手作業によって行うため、培養の過程で雑菌、ウィルス等の混入や他の細胞のクロスコンタミネーション等の不具合が起こる危険性がある。このため、治療用の細胞を調製するためには、培養環境の管理を厳重に行い、上記のような不具合が起こらないことを保証する必要がある。 In addition, an attempt has been made to amplify the number of cells by culturing adult stem cells collected from a patient and apply them to treatment. Specifically, artificial joint replacement has been attempted in which the biocompatibility of the artificial joint is improved by coating the surface of the artificial joint with a mesenchymal stem cell (derived from a patient's bone marrow), which is one of the adult stem cells. However, in this case, the number of cells is amplified by culturing mesenchymal stem cells so that a sufficient number of cells for treatment can be secured even with an amount of bone marrow fluid that can be collected by local anesthesia. Yes. However, in this case, since the bone marrow fluid is seeded in the culture flask as it is and cultured, nucleated cells such as leukocytes and cells other than stem cells such as erythrocytes in the bone marrow fluid are mixed in a large amount in the culture system. Since cells other than adult stem cells deprive the stem cells of the medium components and culture space that the stem cells should originally consume, the amount of media and culture flasks used is significantly increased compared to normal culture. In addition, since adult stem cells are cultured manually in an open environment using normal culture flasks at this time, problems such as contamination with germs and viruses and cross-contamination of other cells during the culture process There is a risk that will occur. For this reason, in order to prepare cells for treatment, it is necessary to strictly manage the culture environment and to ensure that the above problems do not occur.
以上のように、治療に適用できる成体幹細胞を調製する方法及び装置については、現在、さらに改良の余地があり、少量の組織からでも治療に必要な数の成体幹細胞を調製することが可能であり、かつ、簡便に調製できる成体幹細胞分離・培養装置が望まれている。 As described above, the method and apparatus for preparing adult stem cells that can be applied to treatment have room for further improvement, and it is possible to prepare as many adult stem cells as necessary for treatment even from a small amount of tissue. In addition, an adult stem cell separation / culture apparatus that can be easily prepared is desired.
特許文献１および２では、細胞分離フィルターを用いて組織再生用細胞（すなわち本特許でいう成体幹細胞）を分離濃縮する方法を開示している。この方法においては、回収した組織再生細胞を培養用ディッシュ等で培養するため、コンタミなどの危険性が避けられず、また回収された成体幹細胞の純度という点でも不十分なため、分離された組織再生用細胞を培養する場合、夾雑細胞による負の影響（例えば、顆粒球混入による顆粒球エラスターゼ濃度の上昇、赤血球の溶血にともなうＫ（カリウム）濃度の上昇などにともなう増殖抑制作用など）が大きいことが懸念される。
また特許文献３は、培養原料細胞と除去対象細胞を含む細胞含有液を多孔質体からなる細胞捕捉材が充填されている容器に導入し、細胞捕捉材に培養原料細胞を捕捉させ、除去対象細胞を容器外に導出した後に容器ごと培養することにより、安価でかつ簡便・短時間操作が可能な細胞分離・培養装置を提案している。しかし、該分離・培養方法はもともとは単球を分離し、樹状細胞へ分化させることを目的としていることから、該装置では、培養原料細胞を細胞捕捉材に捕捉させた状態で容器ごと培養しており、これを成体幹細胞の分離・培養に応用した場合、細胞が増殖できるスペースの関係から、得られる細胞数がある程度制限されるものと考えられる。
Further, Patent Document 3 introduces a cell-containing liquid containing culture raw material cells and cells to be removed into a container filled with a cell capturing material made of a porous material, and causes the cell capturing material to capture the culture raw material cells to be removed. We have proposed a cell separation and culture apparatus that is inexpensive, simple and can be operated in a short time by culturing the entire container after the cells are led out of the container. However, since the separation / cultivation method is originally intended to separate monocytes and differentiate them into dendritic cells, the apparatus cultures the whole vessel in a state in which the culture raw material cells are captured by the cell capture material. When this is applied to the isolation and culture of adult stem cells, the number of cells obtained is considered to be limited to some extent due to the space in which the cells can grow.
本発明の課題は、成体の限られた原料組織から、疾患の治療に必要な数の成体幹細胞を簡便かつ効率的に調製することを可能とする成体幹細胞分離・培養システムを提供することである。 An object of the present invention is to provide an adult stem cell separation / culture system that makes it possible to easily and efficiently prepare the number of adult stem cells necessary for treatment of a disease from a raw material tissue with limited adults. .
本発明者らは上記に挙げられた課題を解決するために鋭意検討を行った。その結果、細胞懸濁液から成体幹細胞を選択的に分離し、分離した細胞を同一装置内で培養することにより成体幹細胞を簡便かつ効率的に調製することを可能とする成体幹細胞分離・培養システムを発明した。すなわち、本発明は以下のとおりである。
・ 少なくとも、
成体幹細胞を含む被処理液から成体幹細胞を選択的に捕捉する手段１と、
手段１の入口側に接続され、成体幹細胞を含む被処理液を手段１に導入する回路２と、
手段１の出口側に接続され、手段１から導出された液体を排液する回路３と、
手段１に回収液を導入する手段４と、
手段１から回収された細胞を培養する手段５と、
から構成される成体幹細胞分離・培養システム。
（２） 手段１が、被処理液導入部と被処理液導出部を有する容器に、被処理液中の白血球及び赤血球を実質的に通過させることが可能である細胞分離材を収納してなる細胞分離器であることを特徴とする（１）の成体幹細胞分離・培養システム。
（３） 細胞分離材が、被処理液中の白血球の６０％以上を通過させ、かつ、被処理液中の赤血球の９０％以上を通過させることが可能である細胞分離材であることを特徴とする（２）の成体幹細胞分離・培養システム。
（４） 手段４において使用される回収液が、成体幹細胞の培養液であることを特徴とする（１）の成体幹細胞分離・培養システム。
（５） 手段５として、細胞培養バッグまたは細胞培養カセットを用いることを特徴とする（１）の成体幹細胞分離・培養システム。
（６） 手段５として、自動培養装置を用いることを特徴とする（１）の成体幹細胞分離・培養システム。
（７） （１）〜（６）いずれかの成体幹細胞分離・培養システムを用いて、成体幹細胞を含む被処理液から成体幹細胞を分離し増幅する方法。
（８） （７）の方法を用いて調製された細胞組成物。
The present inventors have intensively studied to solve the above-mentioned problems. As a result, an adult stem cell separation / cultivation system capable of easily and efficiently preparing adult stem cells by selectively separating adult stem cells from a cell suspension and culturing the separated cells in the same apparatus. Was invented. That is, the present invention is as follows.
· at least,
Means 1 for selectively capturing adult stem cells from a solution containing adult stem cells;
A circuit 2 connected to the inlet side of the means 1 and introducing a treatment liquid containing adult stem cells into the means 1;
A circuit 3 connected to the outlet side of the means 1 for draining the liquid derived from the means 1;
Means 4 for introducing the recovered liquid into means 1;
Means 5 for culturing the cells recovered from means 1;
Adult stem cell isolation and culture system composed of
(2) The means 1 contains a cell separation material capable of substantially passing white blood cells and red blood cells in the liquid to be processed in a container having the liquid to be processed introducing section and the liquid extracting section to be processed. The adult stem cell separation / culture system according to (1), which is a cell separator.
(3) The cell separation material is a cell separation material capable of passing 60% or more of white blood cells in the liquid to be treated and allowing 90% or more of red blood cells in the liquid to be treated to pass through. (2) adult stem cell separation and culture system.
(4) The adult stem cell separation / culture system according to (1), wherein the recovery solution used in the means 4 is an adult stem cell culture solution.
(5) The adult stem cell separation / culture system according to (1), wherein a cell culture bag or a cell culture cassette is used as the means 5.
(6) The adult stem cell separation / culture system according to (1), wherein an automatic culture apparatus is used as the means 5.
(7) A method for isolating and amplifying adult stem cells from a liquid to be treated containing adult stem cells, using the adult stem cell separation / culture system according to any one of (1) to (6).
(8) A cell composition prepared using the method of (7).
本発明により、複数の細胞種からなる細胞懸濁液から成体幹細胞を選択的に分離し、分離した細胞を培養することにより、再生医療・細胞医療に使用できる成体幹細胞を質、及び量ともに満たした状態で調製することが可能となった。 According to the present invention, adult stem cells are selectively separated from a cell suspension composed of a plurality of cell types, and the separated cells are cultured to satisfy adult stem cells that can be used for regenerative medicine / cell medicine in both quality and quantity. It was possible to prepare in a fresh state.
以下、本発明を詳細に説明する。 Hereinafter, the present invention will be described in detail.
本発明の成体幹細胞分離・培養システムは、少なくとも、
１）成体幹細胞を含む被処理液から成体幹細胞を選択的に捕捉する手段１と、
２）手段１の入口側に接続され、成体幹細胞を含む被処理液を手段１に導入する回路２と、
３）手段１の出口側に接続され、手段１から導出された液体を排液する回路３と、
４）手段１に回収液を導入する手段４と、
５）手段１から回収された細胞を培養する手段５と、
から構成される成体幹細胞分離・培養システムである。
The adult stem cell separation / culture system of the present invention includes at least:
1) Means 1 for selectively capturing adult stem cells from a liquid to be treated containing adult stem cells;
2) a circuit 2 connected to the inlet side of the means 1 and introducing a treatment liquid containing adult stem cells into the means 1;
3) a circuit 3 connected to the outlet side of the means 1 and draining the liquid derived from the means 1;
4) means 4 for introducing the recovered liquid into means 1;
5) means 5 for culturing the cells recovered from means 1;
An adult stem cell separation and culture system composed of
本発明でいう成体幹細胞とは、発生を終了した成体（子供や胎児等の幼弱な個体も含む）の組織中に存在する未分化の細胞で、組織または臓器等を形成する特定の機能を有する細胞に分化する能力を有する細胞を指す。具体的な例としては、骨髄液、脂肪組織、胎盤、羊膜等に存在する間葉系幹細胞、骨髄液や臍帯血等に存在することが報告されている成人多能性幹細胞等の多分化能を有する幹細胞の他、骨髄液や末梢血中に存在する造血幹細胞、血管内皮前駆細胞、また、筋組織中に存在する筋芽細胞、小腸クリプトに存在する基底細胞、さらに肝臓、腎臓、膵臓、網膜、皮膚等の臓器や組織中に存在する所謂組織幹細胞等が挙げられるが、機能を有する細胞への分化能を保持する細胞であれば特に限定されない。また、発生を終了した成体とは、たとえばヒトの場合、成人の個体だけでなく出生直後の乳児も本発明の対象に含める。 An adult stem cell as used in the present invention is an undifferentiated cell existing in the tissue of an adult (including a young individual such as a child or a fetus) that has completed development, and has a specific function of forming a tissue or an organ. It refers to a cell having the ability to differentiate into a cell having it. Specific examples include pluripotency such as mesenchymal stem cells existing in bone marrow fluid, adipose tissue, placenta, amniotic membrane, and adult pluripotent stem cells reported to exist in bone marrow fluid and umbilical cord blood. In addition to stem cells, hematopoietic stem cells present in bone marrow and peripheral blood, vascular endothelial progenitor cells, myoblasts present in muscle tissue, basal cells present in small intestine crypts, liver, kidney, pancreas, Examples include so-called tissue stem cells that exist in organs and tissues such as the retina and skin, but are not particularly limited as long as they retain the ability to differentiate into functional cells. In addition, for example, in the case of human beings, adults that have completed development include not only adult individuals but also infants immediately after birth.
本発明でいう成体幹細胞を含む被処理液とは、成体幹細胞を含む液体であればその物理的、化学的性状について限定されないが、本発明の手段１において成体幹細胞が効率よく捕捉されるために、成体幹細胞が液体中に分散された細胞懸濁液の状態であることが望ましい。具体的には、骨髄液、末梢血、リンパ液、臍帯血、***等の体液；臓器または組織等からコラゲナーゼ等の分解酵素処理により生化学的に、あるいは、超音波処理、ホモジナイザー、鋭利な刃物等で物理的に、細胞を分離した処理液；等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、上記の体液や処理液は、手段１で処理される前に、生理食塩水、リン酸緩衝液等の適当な液体で希釈されてもよく、また、遠心分離等の適当な方法で濃縮されてもよい。濃縮する方法の具体例としては、フィコール、パーコール、リンフォプレップ、ヒドロキシエチルスターチ（ＨＥＳ）、バクティナーチューブ等を使用する比重密度遠心分離法等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。 The treatment liquid containing adult stem cells in the present invention is not limited in terms of physical and chemical properties as long as it is a liquid containing adult stem cells. However, because the adult stem cells are efficiently captured in the means 1 of the present invention. Desirably, adult stem cells are in a cell suspension state dispersed in a liquid. Specifically, body fluids such as bone marrow fluid, peripheral blood, lymph fluid, umbilical cord blood, semen; biochemically by degrading enzyme treatment such as collagenase from organs or tissues, or ultrasonic treatment, homogenizer, sharp blade, etc. However, it is not limited to these. In addition, the above body fluid and treatment solution may be diluted with an appropriate liquid such as physiological saline or phosphate buffer before being treated with the means 1, and concentrated by an appropriate method such as centrifugation. May be. Specific examples of the method for concentration include, but are not limited to, specific gravity density centrifugation using Ficoll, Percoll, Lymphoprep, hydroxyethyl starch (HES), Bactiner tube, and the like. .
本発明の分離・培養システムにおける、手段１としては、成体幹細胞を含む被処理液から成体幹細胞を選択的に捕捉する機能を有し、その入口側に成体幹細胞を含む被処理液を導入する回路２と、その出口側に導出された液体を排液する回路３とが、それぞれ接続されたものであるなら、いかなる器具、装置を用いることができるが、多大なエネルギーを必要とせず、操作も簡便であることから、被処理液流入部と被処理液流出部を有する容器に、成体幹細胞を含む被処理液中の白血球及び赤血球を実質的に通過させることが可能である細胞分離材を収納してなる細胞分離器であることが好ましい。その場合、該細胞分離器の被処理液導入部は、上記回路２に相当し、また、被処理液導出部は回路３に相当する。これら被処理液導入部と被処理液導出部は、細胞分離器と無菌的に接続される。 Means 1 in the separation / culture system of the present invention is a circuit that has a function of selectively capturing adult stem cells from a treatment solution containing adult stem cells, and introduces a treatment solution containing adult stem cells to the inlet side thereof. 2 and the circuit 3 for draining the liquid led out to the outlet side can be connected to each other, but any instrument or device can be used. Because it is simple, a cell separation material that can substantially pass white blood cells and red blood cells in the liquid to be treated including adult stem cells is stored in a container having a liquid to be treated inflow part and a liquid outflow part to be treated. It is preferable that it is a cell separator. In that case, the treatment liquid introduction part of the cell separator corresponds to the circuit 2 and the treatment liquid lead-out part corresponds to the circuit 3. The treated liquid introduction part and the treated liquid lead-out part are aseptically connected to the cell separator.
上記細胞分離器に収納されている細胞分離材は、成体幹細胞を含む被処理液中の白血球及び赤血球を実質的に通過させることが可能であることを特徴とするものである。ここでいう「成体幹細胞を含む被処理液中の白血球及び赤血球を実質的に通過させる」とは、成体幹細胞を含む被処理液を細胞分離材に通液した時、被処理液中の白血球の３０％以上、かつ、赤血球の８０％以上が細胞分離材に捕捉されることなく通過することを意味する。成体幹細胞の分離能の点から、より好ましい細胞分離材は、被処理液中の白血球の４５％以上、かつ、赤血球の８５％以上を通過させるものであり、さらに好ましくは、被処理液中の白血球の６０％以上、かつ、赤血球の９０％以上を通過させるものであり、もっとも好ましくは被処理液中の白血球の７０％以上、かつ、赤血球の９５％以上を通過させるものである。 The cell separation material accommodated in the cell separator is characterized in that it can substantially pass white blood cells and red blood cells in a liquid to be treated containing adult stem cells. As used herein, “substantially passing leukocytes and erythrocytes in the treatment liquid containing adult stem cells” means that when the treatment liquid containing adult stem cells is passed through the cell separation material, leukocytes in the treatment liquid It means that 30% or more and 80% or more of red blood cells pass through without being captured by the cell separation material. From the viewpoint of the ability to separate adult stem cells, a more preferable cell separation material is one that allows passage of 45% or more of leukocytes in the liquid to be treated and 85% or more of red blood cells, and more preferably, in the liquid to be treated. 60% or more of white blood cells and 90% or more of red blood cells are allowed to pass through. Most preferably, 70% or more of white blood cells in the liquid to be treated and 95% or more of red blood cells are allowed to pass through.
上記のような白血球及び赤血球の通過率を達成し、さらに成体幹細胞を選択的に捕捉できるものであれば、細胞分離材の物理的、化学的、生化学的性状等は特に限定されるものではないが、その形態、目開き、密度、材質に関しては、具体的には、次のようなものが挙げられる。 The physical, chemical, and biochemical properties of the cell separation material are not particularly limited as long as the above-described white blood cell and red blood cell passage rates can be achieved and adult stem cells can be selectively captured. Although there are no specific examples of the shape, aperture, density, and material, the following can be cited.
細胞分離材の形態は、特に限定されるものではないが、細胞懸濁液を接触させやすいこと、接触する面積が大きいことから、連通孔構造の多孔質体、繊維の集合体、織物等であることが好ましい。より好ましくは繊維で構成されるものであり、さらに好ましくは繊維の集合体として不織布である。 The form of the cell separation material is not particularly limited, but it is easy to contact the cell suspension and has a large contact area. Preferably there is. More preferably, it is comprised with a fiber, More preferably, it is a nonwoven fabric as a fiber assembly.
細胞分離材が繊維または繊維の集合体で構成される場合、その繊維径は、目的細胞である成体幹細胞の捕捉・回収率の観点から、３μｍ〜４０μｍの範囲が好ましい。細胞分離材を構成する繊維の繊維径が３μｍより細いと白血球等の夾雑有核細胞や赤血球、血小板等の通過率が低くなり、それらの除去効率が低くなる。また繊維径が４０μｍより太いと有効接触面積の低下やショートパスが起こりやすくなり、目的細胞の捕捉・回収率の低下につながる。目的細胞と細胞分離材との相互作用を上げ、収率を上げるためには、繊維径は５μｍ〜３５μｍの範囲がより好ましい。さらに好ましくは５μｍ〜３０μｍの範囲である。 When the cell separation material is composed of a fiber or an aggregate of fibers, the fiber diameter is preferably in the range of 3 μm to 40 μm from the viewpoint of capture / recovery rate of adult stem cells that are target cells. If the fiber diameter of the fibers constituting the cell separation material is smaller than 3 μm, the passing rate of contaminated nucleated cells such as leukocytes, red blood cells, and platelets is lowered, and the removal efficiency thereof is lowered. On the other hand, if the fiber diameter is larger than 40 μm, the effective contact area is likely to be reduced and a short pass is likely to occur, leading to a decrease in the capture / recovery rate of target cells. In order to increase the interaction between the target cell and the cell separation material and increase the yield, the fiber diameter is more preferably in the range of 5 μm to 35 μm. More preferably, it is the range of 5 micrometers-30 micrometers.
細胞分離材の目開きは、目的細胞の捕捉・回収率の観点から、その短径が３μｍ以上で、その長径は１２０μｍ以下が好ましい。細胞分離材の目開きの短径が３μｍより小さいと、白血球等の夾雑有核細胞や赤血球、血小板の除去効率が著しく低下する。また目開きの長径が１２０μｍより大きいと目的細胞である成体幹細胞の捕捉が困難となる。白血球等の夾雑有核細胞や赤血球、血小板の除去効率などの観点より、好ましくは、目開きの短径が５μｍ以上、長径が８０μｍ以下であり、白血球等の夾雑有核細胞や赤血球、血小板の除去効率、及び成体幹細胞の捕捉・回収率などの観点から、さらに好ましくは、目開きの短径が５μｍ以上、長径が７０μｍ以下である。ここでいう目開きとは、細胞分離材を走査型電子顕微鏡にて写真撮影し、異なる２本以上の繊維が交差することにより形成される実質的な孔の長径、および短径を画像解析装置にて５０ポイント以上測定した値の平均値である。 The mesh size of the cell separation material is preferably 3 μm or more in the minor axis and 120 μm or less in the major axis from the viewpoint of capturing / recovering target cells. If the minor axis of the cell separation material is smaller than 3 μm, the removal efficiency of contaminating nucleated cells such as leukocytes, erythrocytes, and platelets is significantly reduced. If the major axis of the mesh is larger than 120 μm, it becomes difficult to capture adult stem cells as target cells. From the viewpoint of removal efficiency of contaminated nucleated cells such as leukocytes, erythrocytes and platelets, preferably, the minor axis of the aperture is 5 μm or more and the major axis is 80 μm or less. From the viewpoints of removal efficiency, adult stem cell capture / recovery rate, etc., more preferably, the minor axis of the mesh is 5 μm or more and the major axis is 70 μm or less. The term “aperture” as used herein refers to an image analysis device in which a cell separation material is photographed with a scanning electron microscope, and the major and minor diameters of a substantial hole formed by the intersection of two or more different fibers. It is the average value of the values measured at 50 points or more.
細胞分離材の密度は、白血球等の夾雑有核細胞や赤血球、血小板の除去効率、及び目的細胞の捕捉・回収率の観点から、１．０×１０４ｇ／ｍ３〜１．０×１０６ｇ／ｍ３の範囲であることが好ましい。さらに白血球等の夾雑有核細胞や赤血球、血小板の除去効率の観点から、より好ましくは２．５×１０４ｇ／ｍ３〜７．５×１０５ｇ／ｍ３、さらに好ましくは５．０×１０４ｇ／ｍ３〜５．０×１０５ｇ／ｍ３の範囲である。ここでいう密度とは、細胞分離材の重量（ｇ）をその体積（ｍ３）で除した値である。 The density of the cell separation material is 1.0 × 10 4 g / m 3 to 1.0 × 10 from the viewpoint of removal efficiency of contaminated nucleated cells such as leukocytes, red blood cells and platelets, and capture / recovery rate of target cells. A range of 6 g / m 3 is preferred. Further, from the viewpoint of removal efficiency of contaminated nucleated cells such as leukocytes, red blood cells, and platelets, more preferably 2.5 × 10 4 g / m 3 to 7.5 × 10 5 g / m 3 , still more preferably 5.0. in the range of × 10 4 g / m 3 ~5.0 × 10 5 g / m 3. The density referred to here is a value obtained by dividing the weight (g) of the cell separation material by its volume (m 3 ).
細胞分離材の材質は、ポリプロピレン、ポリエチレン、高密度ポリエチレン、低密度ポリエチレン等のポリオレフィン、ポリエステル、ポリ塩化ビニル、ポリビニルアルコール、ポリ塩化ビニリデン、レーヨン、ビニロン、ポリスチレン、アクリル重合体（ポリメチルメタクリレート、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリアクリロニトリル、ポリアクリル酸、ポリアクリル酸エステル等）、ナイロン、ポリウレタン、ポリイミド、アラミド、ポリアミド、キュプラ、ケブラー、カーボン、ポリアクリレート、フェノール、テトロン、パルプ、麻、セルロース、ケナフ、キチン、キトサン、ガラス、綿等の少なくとも１種より選択される材質が好ましい。より好ましくは、ポリエステル、ポリプロピレン、ポリスチレン、アクリル重合体、レーヨン、ポリオレフィン、ビニロン、ポリエチレン、ナイロン、ポリウレタン等の少なくとも１種より選択される合成又は半合成の高分子である。 Cell separation material is made of polyolefin such as polypropylene, polyethylene, high density polyethylene, low density polyethylene, polyester, polyvinyl chloride, polyvinyl alcohol, polyvinylidene chloride, rayon, vinylon, polystyrene, acrylic polymer (polymethyl methacrylate, poly Hydroxyethyl methacrylate, polyacrylonitrile, polyacrylic acid, polyacrylic acid ester, etc.), nylon, polyurethane, polyimide, aramid, polyamide, cupra, kevlar, carbon, polyacrylate, phenol, tetron, pulp, hemp, cellulose, kenaf, chitin A material selected from at least one of chitosan, glass, cotton and the like is preferable. More preferably, it is a synthetic or semi-synthetic polymer selected from at least one of polyester, polypropylene, polystyrene, acrylic polymer, rayon, polyolefin, vinylon, polyethylene, nylon, polyurethane and the like.
細胞分離材として２種以上の高分子を組み合わせる場合は、その組み合わせに特に限定はないが、ポリエステル及びポリオレフィン、またはレーヨン及びポリオレフィン、またはポリエステル、レーヨン及びビニロン等からなる組み合わせが挙げられる。２種類以上の高分子を組み合わせる場合の繊維の形態としては、１本の繊維が異成分同士の高分子よりなる繊維、あるいは異成分同士が剥離分割した分割繊維でもよい。また成分の異なる高分子単独よりなる繊維をそれぞれ複合化した形態でもよい。ここでいう複合化とは、特に限定はないが２種類以上の繊維が混在した状態より構成される形態、あるいは高分子単独よりなる形態をそれぞれ張り合わせたもの等挙げられるが、本発明はこれに限定されるものではない。 When two or more kinds of polymers are combined as the cell separation material, the combination is not particularly limited, and examples thereof include polyester and polyolefin, or rayon and polyolefin, or a combination of polyester, rayon, and vinylon. When the two or more kinds of polymers are combined, the form of the fiber may be a fiber in which one fiber is composed of polymers of different components, or a split fiber in which different components are separated from each other. Moreover, the form which each compounded the polymer which consists of polymer | macromolecule independent from which a component differs may be sufficient. The term “composite” as used herein is not particularly limited, and examples thereof include a form constituted by a state in which two or more kinds of fibers are mixed, or a form in which a form made of a polymer alone is bonded to each other. It is not limited.
細胞分離材の性能をより向上させるために、材料の親水化処理を行ってもよい。親水化処理することにより、必要細胞以外の細胞の非特異的な捕捉の抑制、体液を偏りなく細胞分離材中に通過させる等の性能の向上、必要細胞の回収効率の向上等を付与することができる。親水化処理方法としては、水溶性多価アルコール、または水酸基やカチオン基、アニオン基を有したポリマー、あるいはその共重合体（例えば、ヒドロキシエチルメタクリレート、ジメチルアミノエチルメタクリレート、あるいはその共重合体等）を吸着させる方法、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール等の水溶性高分子物質を吸着させる方法、疎水性膜に親水性高分子を固定化する方法（例えば、表面に親水性モノマーを化学的に結合させる方法等）、細胞分離材に電子線照射する方法、含水状態で細胞分離材に放射線を照射することで親水性高分子を架橋不溶化する方法、細胞分離材を乾燥状態で熱処理することにより、親水性高分子を不溶化し固定化する方法、親水性高分子と水不溶性複合体を形成する成分で細胞分離材を処理する方法、疎水性膜の表面をスルホン化する方法、ポリエチレングリコールやポリビニルピロリドン等の親水性高分子物質と、疎水性ポリマードープとの混合物から膜をつくる方法、アルカリ水溶液（ＮａＯＨ，ＫＯＨ等）処理により膜表面に親水基を付与する方法、疎水性多孔質膜をアルコールに浸漬した後、水溶性ポリマー水溶液で処理、乾燥後、熱処理や放射線等で不溶化処理する方法、界面活性作用を有する物質を吸着させる方法等が挙げられる。 In order to further improve the performance of the cell separation material, the material may be hydrophilized. By imparting hydrophilic treatment, non-specific capture of cells other than necessary cells can be suppressed, body fluid can be passed through the cell separation material without unevenness, and recovery efficiency of necessary cells can be improved. Can do. Hydrophilic treatment methods include water-soluble polyhydric alcohols, polymers having hydroxyl groups, cationic groups, and anionic groups, or copolymers thereof (eg, hydroxyethyl methacrylate, dimethylaminoethyl methacrylate, or copolymers thereof). A method of adsorbing a water-soluble polymer such as polyethylene glycol, polyvinyl pyrrolidone, polyvinyl alcohol, a method of immobilizing a hydrophilic polymer on a hydrophobic film (for example, chemically immobilizing a hydrophilic monomer on the surface) A method of binding, etc.), a method of irradiating the cell separation material with an electron beam, a method of crosslinking and insolubilizing the hydrophilic polymer by irradiating the cell separation material with water, and a heat treatment of the cell separation material in a dry state. , Method of insolubilizing and immobilizing hydrophilic polymer, Forming hydrophilic polymer and water-insoluble complex A method of treating a cell separation material with a component to be treated, a method of sulfonating the surface of a hydrophobic membrane, a method of forming a membrane from a mixture of a hydrophilic polymer substance such as polyethylene glycol or polyvinylpyrrolidone and a hydrophobic polymer dope, an alkali A method of imparting hydrophilic groups to the membrane surface by treatment with aqueous solution (NaOH, KOH, etc.), A method of immersing a hydrophobic porous membrane in alcohol, treating with a water-soluble polymer aqueous solution, drying, and insolubilizing treatment with heat treatment or radiation And a method of adsorbing a substance having a surface active action.
界面活性作用を有する物質として、非イオン性の界面活性剤、レシチン、ポリオキシエチレン硬化ひまし油、エデト酸ナトリウム、セスキオレイン酸ソルビタン、Ｄ−ソルビトール、デヒドロコール酸、グリセリン、Ｄ−マンニトール、酒石酸、プロピレングリコール、マクロゴール、ラノリンアルコール、メチルセルロース等が挙げられる。非イオン性の界面活性剤としては、多価アルコール脂肪酸エステル系とポリオキシエチレン系とに大別される。多価アルコール脂肪酸エステル系の界面活性剤としては、ステアリン酸グリセリンエステル系、ソルビタン脂肪酸エステル、ソルビタンアシルエステル等が挙げられる。またポリオキシエチレン系の界面活性剤としては、ポリオキシエチレンアルコールエーテル、ポリオキシエチレンアシルエステル、ポリオキシエチレンソルビタンアシルエステル、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレンソルビタントリステアレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート等が挙げられる。これらは各々単独、または組み合わせで用いることができる。また成体幹細胞の細胞分離材への付着性を向上させるために、細胞付着性のタンパク質や目的細胞上の発現されている抗原に対する抗体を細胞分離材上に固定化してもよい。 Nonionic surfactant, lecithin, polyoxyethylene hydrogenated castor oil, sodium edetate, sorbitan sesquioleate, D-sorbitol, dehydrocholic acid, glycerin, D-mannitol, tartaric acid, propylene Examples include glycol, macrogol, lanolin alcohol, and methylcellulose. Nonionic surfactants are broadly classified into polyhydric alcohol fatty acid esters and polyoxyethylenes. Examples of the polyhydric alcohol fatty acid ester surfactant include glyceryl stearate ester, sorbitan fatty acid ester, sorbitan acyl ester and the like. Polyoxyethylene surfactants include polyoxyethylene alcohol ether, polyoxyethylene acyl ester, polyoxyethylene sorbitan acyl ester, polyoxyethylene sorbitan monolaurate, polyoxyethylene sorbitan monopalmitate, polyoxyethylene Examples include sorbitan monostearate, polyoxyethylene sorbitan tristearate, polyoxyethylene sorbitan monooleate and the like. These can be used alone or in combination. In addition, in order to improve the adherence of adult stem cells to a cell separation material, a cell adhesion protein or an antibody against an antigen expressed on a target cell may be immobilized on the cell separation material.
細胞付着性のタンパク質としては、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、コラーゲン等が挙げられる。抗体としては、目的細胞が間葉系幹細胞の場合、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５等に対する抗体が、造血幹細胞の場合は、ＣＤ３４、ｃ−Ｋｉｔ、Ｓｃａ−１等に対する抗体、筋芽細胞の場合は、Ｍｙｆ５等に対する抗体等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。 Examples of cell adhesion proteins include fibronectin, laminin, vitronectin, collagen and the like. As an antibody, when the target cell is a mesenchymal stem cell, an antibody against CD73, CD90, CD105, etc., an hematopoietic stem cell, an antibody against CD34, c-Kit, Sca-1, etc., and a myoblast, Examples include, but are not limited to, antibodies to Myf5 and the like.
本発明において、手段１として使用される場合の細胞分離器は、上記で説明した細胞分離材を収納して成るが、その形態、大きさ、構造材料等に関して特に限定はない。 In the present invention, the cell separator when used as the means 1 contains the cell separating material described above, but there is no particular limitation on the form, size, structural material, and the like.
該細胞分離器の形態は、球、コンテナ、カセット、バッグ、チューブ、カラム等、任意の形態をとりうるが、好ましい具体例としては、例えば、容量約０．５〜１０００ｍｌ程度、直径約０．１〜１０ｃｍ程度の透明または半透明の円柱状容器、あるいは一片の長さ１ｃｍ〜２０ｃｍ程度の正方形あるいは長方形で、厚みが０．１ｃｍ〜５ｃｍ程度の四角柱状の形態等が挙げられるが、本発明はこれに限定されるものではない。該細胞分離器は、任意の構造材料を使用して作製することができる。具体的には、非反応性ポリマー、生物親和性金属、合金、ガラス等が挙げられる。非反応性ポリマーとしては、アクリロニトリルブタジエンスチレンターポリマー等のアクリロニトリルポリマー；ポリテトラフルオロエチレン、ポリクロロトリフルオロエチレン、テトラフルオロエチレンとヘキサフルオロプロピレンのコポリマー、ポリ塩化ビニル等のハロゲン化ポリマー；ポリアミド、ポリスルホン、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリビニルクロリドアクリルコポリマー、ポリカーボネートアクリロニトリルブタジエンスチレン、ポリスチレン、ポリメチルペンテン等が挙げられる。容器の材料として有用な金属材料は、ステンレス鋼、チタン、白金、タンタル、金、およびそれらの合金、並びに金メッキ合金鉄、白金メッキ合金鉄、コバルトクロミウム合金、窒化チタン被覆ステンレス鋼等が挙げられる。
特に好ましくは耐滅菌性を有する素材であるが、具体的には、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、ポリイミド、ポリカーボネート、ポリスルホン、ポリメチルペンテン等が挙げられる。
The cell separator may take any form such as a sphere, a container, a cassette, a bag, a tube, a column, and the like. Preferred specific examples include, for example, a capacity of about 0.5 to 1000 ml, and a diameter of about 0. Examples thereof include a transparent or translucent cylindrical container of about 1 to 10 cm, or a square or rectangular shape having a length of about 1 cm to 20 cm and a thickness of about 0.1 cm to 5 cm. Is not limited to this. The cell separator can be made using any structural material. Specific examples include non-reactive polymers, biocompatible metals, alloys, and glass. Non-reactive polymers include acrylonitrile polymers such as acrylonitrile butadiene styrene terpolymers; halogenated polymers such as polytetrafluoroethylene, polychlorotrifluoroethylene, copolymers of tetrafluoroethylene and hexafluoropropylene, and polyvinyl chloride; polyamides, polysulfones Polycarbonate, polyethylene, polypropylene, polyvinyl chloride acrylic copolymer, polycarbonate acrylonitrile butadiene styrene, polystyrene, polymethylpentene, and the like. Examples of the metal material useful as the container material include stainless steel, titanium, platinum, tantalum, gold, and alloys thereof, as well as gold-plated alloy iron, platinum-plated alloy iron, cobalt chromium alloy, titanium nitride-coated stainless steel, and the like.
Particularly preferred are materials having sterilization resistance, and specific examples include polypropylene, polyvinyl chloride, polyethylene, polyimide, polycarbonate, polysulfone, and polymethylpentene.
本発明の成体幹細胞分離・培養システムにおける、手段１に回収液を導入する手段４としては、その目的を達成しうるものならいかなる器具、装置を用いることもできるが、手段１が、細胞分離材を収納した細胞分離器である場合、細胞分離材に捕捉された細胞に、高い流水圧を加えて効率的に回収することができるものであることが好ましい。その具体的な例としては、プランジャーポンプ、ピストンポンプ、ギアーポンプ等の液体を押し出すことができるポンプ、注射器に代表される、シリンダー内に収納された液体をピストンを押すことによって押し出すことができる器具等が挙げられるがこれらに限定されることはない。 In the adult stem cell separation / culture system of the present invention, as the means 4 for introducing the recovered solution into the means 1, any instrument or device can be used as long as the object can be achieved. In the case of the cell separator containing the cell, it is preferable that the cell trapped by the cell separation material can be efficiently recovered by applying a high flowing water pressure. Specific examples thereof include pumps that can push out liquids such as plunger pumps, piston pumps, and gear pumps, and devices that can push out liquids contained in cylinders, such as syringes, by pushing the pistons. However, it is not limited to these.
手段４を利用して手段１に導入される回収液は、捕捉された細胞に負の影響を与えないものであればいかなる液体を使用してもよい。具体的には、生理食塩水、リンゲル液等の医療用途に使用される実績のあるもの、細胞培養に使用される培地や、リン酸緩衝液、ハンクス塩溶液等の緩衝液、あるいは、血清、血漿等が挙げられる。そのなかでも、手段４によって手段１から回収された成体幹細胞は、引き続き、手段５において培養されることから、該回収液として、成体幹細胞を増殖させる機能を有する液体、すなわち成体幹細胞の培養液であることが好ましい。この場合の成体幹細胞の培養液の具体例としては、Ｄ−ＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）、ＩＭＤＭ（イスコフ改変イーグル培地）、ＲＰＭＩ１６４０培地、ＭＣＤＢ１３３培地、ＡＳＦ培地等の細胞培養培地が挙げられるが、これらに限定されることはない。また、回収された幹細胞の増殖能や分化能を高めるために、上記の培養液に血清、血漿等の生体成分、ｂＦＧＦ（塩基性繊維芽細胞増殖因子）、ＴＧＦ−β（トランスフォーミング増殖因子−β）、インスリン、トランスフェリン、ラミニン、ファイブロネクチン等の蛋白性因子、レチノイン酸、アスコルビン酸、各種アミノ酸、各種糖類、５−アザシチジン、２−メルカプトエタノール、亜セレン酸ナトリウム、ハイドロコルチゾン、デキサメサゾン等の低分子物質を加えてもよい。さらに、幹細胞の培養過程における雑菌汚染を避けるために、上記の液体にカナマイシン、ゲンタマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン、ポリミキシンB、バンコマイシン、アンホテリシンB等の抗生物質、抗真菌剤を加えてもよい。 As the recovery liquid introduced into the means 1 using the means 4, any liquid may be used as long as it does not negatively affect the captured cells. Specifically, those that have been used for medical purposes such as physiological saline and Ringer's solution, media used for cell culture, buffer solutions such as phosphate buffer solution and Hank's salt solution, or serum, plasma Etc. Among them, since the adult stem cells recovered from the means 1 by the means 4 are subsequently cultured in the means 5, a liquid having a function of proliferating adult stem cells, that is, a culture solution of adult stem cells is used as the recovered liquid. Preferably there is. Specific examples of the culture solution of adult stem cells in this case include cell culture media such as D-MEM (Dulbecco modified Eagle medium), IMDM (Iskov modified Eagle medium), RPMI1640 medium, MCDB133 medium, ASF medium, and the like. It is not limited to these. In addition, in order to enhance the proliferation ability and differentiation ability of the recovered stem cells, the above culture medium is added to biological components such as serum and plasma, bFGF (basic fibroblast growth factor), TGF-β (transforming growth factor − β), protein factors such as insulin, transferrin, laminin, fibronectin, retinoic acid, ascorbic acid, various amino acids, various sugars, 5-azacytidine, 2-mercaptoethanol, sodium selenite, hydrocortisone, dexamethasone Molecular substances may be added. Furthermore, in order to avoid contamination of germs in the stem cell culture process, antibiotics and antifungal agents such as kanamycin, gentamicin, penicillin, streptomycin, polymyxin B, vancomycin, amphotericin B may be added to the above liquid.
手段４において、細胞分離材に捕捉された成体幹細胞の回収率を向上するために、使用する回収液の粘稠度を上げてもよい。そのために添加される物質としては、特に限定されないが、アルブミン、フィブリノーゲン、グロブリン、デキストラン、ヒドロキシエチルスターチ、ヒドロキシエチルセルロース等が挙げられる。 In the means 4, in order to improve the recovery rate of the adult stem cells trapped by the cell separation material, the consistency of the recovery solution used may be increased. The substance added for that purpose is not particularly limited, and examples thereof include albumin, fibrinogen, globulin, dextran, hydroxyethyl starch, and hydroxyethylcellulose.
本発明の成体幹細胞分離・培養システムにおける、回収された細胞を培養する手段５としては、回収された細胞に含まれる成体幹細胞を培養し、その細胞数を増幅することができるものであれば、いかなる器具、装置を用いることができるが、操作が簡便であること、雑菌汚染やクロスコンタミネーション等の危険性が低いことから、細胞培養バッグ、細胞培養カセット、あるいは自動細胞培養装置を用いることが好ましい。 In the adult stem cell separation / culture system of the present invention, as means 5 for culturing the recovered cells, as long as adult stem cells contained in the recovered cells can be cultured and the number of the cells can be amplified, Any instrument or device can be used, but since the operation is simple and the risk of contamination and cross-contamination is low, a cell culture bag, a cell culture cassette, or an automatic cell culture device can be used. preferable.
上記細胞培養バッグとは、細胞をその内部に収納して培養できる、柔軟な（可撓性のある）構造材料で構成される、袋状の容器のことを指す。細胞培養バッグの使用形態は、インキュベーター内に設置されているトレイのような平台の上に置く、適当な架台に吊るす、あるいはシェーカーを用いて振盪する等が挙げられるが、これらに限定されることはない。細胞培養バッグの構造材料としては、気体の透過性や生体適合性等の点から、ポリプロピレン、ポリエチレン、及びエチレンプロピレン共重合体等のポリオレフィン系樹脂、スチレンブタジエン熱可塑性樹脂等のエラストマー、テフロン(登録商標)、シリコーンゴム等が好ましいが、特に限定されることはない。好ましい具体例としては、ニプロカルチャーバッグ（ニプロ製）、Ｏｐｔｉｃｙｔｅ、Ｘ−ＦＯＬＤ、ＬｉｆｅＣｅｌｌ（Ｂａｘｔｅｒ製）等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。 The cell culture bag refers to a bag-like container composed of a flexible (flexible) structural material in which cells can be stored and cultured. The cell culture bag can be used on a flat table such as a tray installed in the incubator, hung on a suitable frame, or shaken using a shaker. There is no. Cell culture bag structural materials include polyolefin resins such as polypropylene, polyethylene, and ethylene propylene copolymers, elastomers such as styrene butadiene thermoplastic resins, and Teflon (registered) in terms of gas permeability and biocompatibility. Trademark), silicone rubber and the like are preferable, but are not particularly limited. Preferred specific examples include Nipro culture bags (made by Nipro), Optitice, X-FOLD, LifeCell (made by Baxter) and the like, but are not limited thereto.
上記細胞培養カセットとは、細胞をその内部に収納して培養できる、非可撓性の構造材料で構成される容器のことを指す。細胞培養カセットの形状は、円形、矩形、円柱状、角柱状、球形等特に限定されないが、限られた空間に多くの細胞培養カセットを設置できることから扁平な矩形であることが好ましい。細胞培養カセットの構造材料はとしては、特に限定されないが、非可撓性を保証できること、透明であるため培養中の細胞や培地の視認性が高いことからガス透過性のポリスチレン、ポリカーボネート等が好ましい。細胞培養カセットの使用形態は、インキュベーター内に設置されているトレイのような平台の上に置く、適当なラックに積層して収納する、あるいはシェーカーを用いて振盪する等が挙げられるが、これらに限定されることはない。好ましい具体例としては、ＯｐｔｉＣｅｌｌ（ＢｉｏＣｒｙｓｔａｌ製）、ＣＬＩＮＩｃｅｌｌ（ＭＡＢＩＯ製）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。 The cell culture cassette refers to a container made of an inflexible structural material in which cells can be stored and cultured. The shape of the cell culture cassette is not particularly limited, such as circular, rectangular, cylindrical, prismatic, spherical, etc., but is preferably a flat rectangle because many cell culture cassettes can be installed in a limited space. The structural material of the cell culture cassette is not particularly limited, but gas permeable polystyrene, polycarbonate, and the like are preferable because inflexibility can be ensured and the cell and medium in culture are highly visible because it is transparent. . The cell culture cassette can be used on a flat table such as a tray installed in the incubator, stacked in an appropriate rack, or shaken using a shaker. There is no limit. Preferable specific examples include OptiCell (manufactured by BioCrystal) and CLINIcell (manufactured by MABIO), but are not limited thereto.
上記自動培養装置とは、通常は用手法によっておこなう細胞培養に要する操作の全部または一部を、機械または器具で代替することにより自動または半自動的に行うことを可能とした装置のことを指す。好ましい具体例としては、ＡａｓｔｒｏｍＲｅｐｌｉｃｅｌｌ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａａｓｔｒｏｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）、また、特開２００４−３４４１２８、特開２００４−８９０９５、特開２００１−２７５６５９により開示されている培養装置等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。 The automatic culture apparatus refers to an apparatus that can automatically or semi-automatically replace all or part of the operation required for cell culture usually performed by a method with a machine or an instrument. Preferable specific examples include Aastrom Replicacell System (manufactured by Aastrom Bioscience), and culture apparatuses disclosed in JP-A-2004-344128, JP-A-2004-89095, JP-A-2001-275659, and the like. Is not to be done.
本発明の成体幹細胞分離・培養システムにおいて、成体幹細胞の分離・回収操作までは、手段５は手段１に無菌的に接続されているが、その後の培養工程においては、手段５を手段１と切り離した上で培養を行うことも可能である。 In the adult stem cell separation / culture system of the present invention, the means 5 is aseptically connected to the means 1 until the adult stem cell separation / recovery operation. In the subsequent culturing step, the means 5 is separated from the means 1. It is also possible to carry out the cultivation.
次に本発明の成体幹細胞分離・培養システムを用いて行う、成体幹細胞を含む被処理液から成体幹細胞を分離し、培養する、好ましい方法について図１を用いて説明する。
図１は本発明の実施態様の一例を示すものであるが、本発明はこれに限定されるものではない。
Next, a preferred method for separating and culturing adult stem cells from a treatment solution containing adult stem cells, which is performed using the adult stem cell separation / culture system of the present invention, will be described with reference to FIG.
FIG. 1 shows an example of an embodiment of the present invention, but the present invention is not limited to this.
任意の方法によって調製された成体幹細胞を含む被処理液は、液槽２−１に一旦収納される。この場合、調製された被処理液が閉鎖系の環境下で移送されるために、液槽２−１には被処理液の調製手段と被処理液槽を無菌的に連結できる注入口が設けられていることが好ましい。被処理液槽に収納された成体幹細胞を含む被処理液は、回路２に相当するライン２−２を通って、手段１に相当する細胞分離器１−１に通液される。細胞分離器１−１への被処理液の通液手段は、特に限定されず、ポンプ等の機器を用いてもよいし、重力による自然落下によって通液されてもよい。細胞分離器１−１への被処理液の通液速度は、特に限定されないが、細胞分離材の厚さに対する被処理液の通過速度（線速）で表した時、０．１ｍｍ／分〜１，０００ｍｍ／分の範囲にあることが好ましい。線速が０．１ｍｍ／分より低いと処理時間が長期化し、１，０００ｍｍ／分より高いと被処理液の流水圧により成体幹細胞が分離材に捕捉されにくくなる。より好ましい線速は、０．５ｍｍ／分〜５００ｍｍ／分であり、さらにより好ましくは１ｍｍ／分〜２５０ｍｍ／分である。 The liquid to be treated containing adult stem cells prepared by any method is temporarily stored in the liquid tank 2-1. In this case, since the prepared liquid to be processed is transferred in a closed system environment, the liquid tank 2-1 is provided with an inlet capable of aseptically connecting the means for preparing the liquid to be processed and the liquid tank to be processed. It is preferable that A liquid to be treated containing adult stem cells stored in the liquid tank to be treated is passed through a line 2-2 corresponding to the circuit 2 and a cell separator 1-1 corresponding to the means 1. The means for passing the liquid to be processed to the cell separator 1-1 is not particularly limited, and a device such as a pump may be used, or the liquid may be passed by natural fall due to gravity. The flow rate of the liquid to be processed to the cell separator 1-1 is not particularly limited, but when expressed by the passing speed (linear speed) of the liquid to be processed with respect to the thickness of the cell separating material, 0.1 mm / min. It is preferably in the range of 1,000 mm / min. When the linear velocity is lower than 0.1 mm / min, the treatment time is prolonged, and when it is higher than 1,000 mm / min, adult stem cells are hardly captured by the separation material due to the flowing water pressure of the liquid to be treated. A more preferable linear velocity is 0.5 mm / min to 500 mm / min, and even more preferably 1 mm / min to 250 mm / min.
成体幹細胞を含む被処理液が、細胞分離器１−１に通液されることによって、被処理液中の成体幹細胞は細胞分離材に捕捉され、捕捉されなかった赤血球、成体幹細胞以外の有核細胞、血漿成分、酵素、希釈に用いた緩衝液等の不要成分は、回路３に相当するライン３−２を通って液槽３−１に移送される。
成体幹細胞を含む被処理液を細胞分離器１−１に通液することにより、成体幹細胞が細胞分離材に捕捉されるが、同時に一部の赤血球や有核細胞が細胞分離材中に留まっている可能性がある。これらの不要な細胞を除去するために、洗浄液を細胞分離器１−１に通液してもよい。この場合の洗浄液流入口は、細胞分離器１−１に通液した被処理液流入口より上流にあることが好ましい。ここで用いられる洗浄液は、成体幹細胞に対して負の影響を与えない液体であれば特に限定されないが、具体例としては、生理食塩水、リンゲル液、血清、血漿、細胞培養に用いられる培地、リン酸緩衝液等の一般的な緩衝液等が挙げられる。成体幹細胞への負の影響が小さいこと、医療用途に用いられている実績があることから、生理食塩水を用いることが好ましい。洗浄液は、成体幹細胞を含む被処理液と同様、回路２を用いて細胞分離器１−１に通液されてもよいし、回路２とは別の回路を設けて細胞分離器１−１に通液されてもよい。いずれの場合にも、洗浄液の通液条件は、被処理液を細胞分離器１−１に通液した場合に準じるものを用いることが好ましい。
When the treatment liquid containing the adult stem cells is passed through the cell separator 1-1, the adult stem cells in the treatment liquid are captured by the cell separation material, and the erythrocytes other than the captured erythrocytes and adult stem cells are nucleated. Unnecessary components such as cells, plasma components, enzymes, and buffers used for dilution are transferred to the liquid tank 3-1 through the line 3-2 corresponding to the circuit 3.
By passing the liquid to be treated containing adult stem cells through the cell separator 1-1, the adult stem cells are captured by the cell separator, but at the same time, some red blood cells and nucleated cells remain in the cell separator. There is a possibility. In order to remove these unnecessary cells, the washing solution may be passed through the cell separator 1-1. In this case, it is preferable that the cleaning liquid inlet is upstream of the liquid inlet to be processed which has passed through the cell separator 1-1. The washing solution used here is not particularly limited as long as it does not negatively affect adult stem cells. Specific examples thereof include physiological saline, Ringer's solution, serum, plasma, medium used for cell culture, phosphorus Examples include general buffer solutions such as acid buffers. It is preferable to use physiological saline because it has a small negative effect on adult stem cells and has a track record of being used for medical purposes. The washing liquid may be passed through the cell separator 1-1 using the circuit 2 in the same manner as the liquid to be treated containing adult stem cells, or a circuit different from the circuit 2 may be provided to the cell separator 1-1. It may be passed through. In any case, it is preferable to use conditions for passing the cleaning liquid in accordance with the case where the liquid to be treated is passed through the cell separator 1-1.
洗浄液が細胞分離器に通液されることによって、細胞分離材に残存している、成体幹細胞以外の不要細胞は細胞分離材を離れ、ライン３−２を通って洗浄液とともに液槽３−１に移送される。
細胞分離材に捕捉された成体幹細胞は、手段４に相当する細胞回収液注入装置４−１を用いて、回収液を、ライン４−２を介して細胞分離器１−１に通液することによって、ライン５−２を介して細胞培養器５−１に移送されて回収される。ライン４−２は三方活栓を介して細胞分離器１−１の上流側に位置するライン２−２に連結されてもよいし、下流側に位置するライン３−２に、三方活栓４−３を介して連結されてもよいが、細胞分離器１−１中において成体幹細胞は上流側に偏在する可能性が高いため、下流側に位置するライン３−２に連結されていることが好ましい。
When the washing solution is passed through the cell separator, unnecessary cells other than the adult stem cells remaining in the cell separation material leave the cell separation material and pass through the line 3-2 to the liquid tank 3-1 together with the washing solution. Be transported.
The adult stem cells captured by the cell separation material are passed through the cell separator 1-1 through the line 4-2 using the cell recovery liquid injector 4-1 corresponding to the means 4. Is transferred to the cell culture device 5-1 through the line 5-2 and collected. The line 4-2 may be connected to a line 2-2 located on the upstream side of the cell separator 1-1 via a three-way cock, or the line 3-2 located on the downstream side may be connected to the three-way cock 4-3. However, since it is highly possible that adult stem cells are unevenly distributed upstream in the cell separator 1-1, it is preferably connected to the line 3-2 located on the downstream side.
細胞回収液を細胞分離器１−１に通液することによって、細胞培養器５−１に回収された成体幹細胞は、そのまま細胞分離器５−１中で培養される。この時、細胞回収液として、幹細胞培養用の培地等の、幹細胞を増殖させる機能を有する液体を用いると、移送後そのまま培養することができるので好ましい。細胞回収液が３−２を介して細胞分離器１−１に通液される場合、ライン５−２は三方活栓５−３を介してライン２−２に連結されており、逆に、細胞回収液がライン２−２を介して細胞分離器１−１に通液される場合、細胞回収液はライン２−２に連結され、細胞培養器はライン３−２に連結され、細胞培養器に移送された後に培養される。この場合、成体幹細胞の回収率の点から前者が好ましい。 By passing the cell recovery solution through the cell separator 1-1, the adult stem cells recovered in the cell culture device 5-1 are directly cultured in the cell separator 5-1. At this time, it is preferable to use a liquid having a function of proliferating stem cells, such as a medium for stem cell culture, as the cell recovery solution, since it can be cultured as it is after transfer. When the cell recovery solution is passed through the cell separator 1-1 via 3-2, the line 5-2 is connected to the line 2-2 via the three-way stopcock 5-3. When the recovered solution is passed through the cell separator 1-1 via the line 2-2, the cell recovered solution is connected to the line 2-2, the cell culture device is connected to the line 3-2, and the cell culture device And then cultured. In this case, the former is preferable from the viewpoint of the recovery rate of adult stem cells.
回収された成体幹細胞は、細胞培養器５−１を用いて培養され、必要な細胞数まで増幅されるが、この時、成体幹細胞としての性質を保ったまま増幅されてもよいし、適当な特定の細胞や組織に分化誘導されてもよい。成体幹細胞としての性質を保ったまま増幅された細胞組成物も、特定の細胞や組織に分化誘導された細胞組成物も本発明の範疇に含まれる。また、細胞培養器５−１中で、必要な細胞数まで増幅された成体幹細胞は、その後更に続けて細胞培養器５−１外で培養を続けてもよいし、細胞培養器５−１外で分化誘導を行うこともできる。
The recovered adult stem cells are cultured using the cell incubator 5-1, and are amplified to the required number of cells. At this time, they may be amplified while maintaining the properties as adult stem cells, or appropriate. Differentiation may be induced in specific cells or tissues. The cell composition amplified while maintaining the properties as an adult stem cell and the cell composition induced to differentiate into a specific cell or tissue are also included in the scope of the present invention. The adult stem cells amplified to the required number of cells in the cell culture device 5-1 may be further cultured outside the cell culture device 5-1, or outside the cell culture device 5-1. Differentiation induction can also be performed with.
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention in detail, this invention is not limited to these.
（実施例１）
本発明の成体幹細胞分離・培養システムに相当する成体幹細胞分離・培養装置を作製し、骨髄液から成体幹細胞の一種である間葉系幹細胞を分離し、増幅させた例を以下に示す。本実施例で用いた装置は、図１に示されるもので、液槽２−１に成体幹細胞を含む被処理液が用意され、細胞分離器１−１とライン２−１の間に細胞培養器５−１が、また細胞分離器１−１の下流に不要細胞回収容器３−１が、細胞分離器１−１と不要細胞回収容器３−１の間に細胞回収液注入装置４−１があるシステムである。細胞分離器１−１としては、出入口を供えた内径１ｃｍの円筒状の筒に、レーヨンとポリプロピレンからなる分割繊維不織布（密度＝１．３×１０５ｇ／ｍ３、繊維径＝３〜１２μｍ、目開き＝５〜５０μｍ（短径〜長径）、厚み５．５×１０−５ｍ）を１２枚積層し、不織布の上下を外形１ｃｍ、内径７ｍｍ、高さ５ｍｍのストッパーにて挟み込むことにより、不織布を固定化した細胞分離器を用いた。
Example 1
An example of producing an adult stem cell separation / culture apparatus corresponding to the adult stem cell separation / culture system of the present invention, separating mesenchymal stem cells, which are a kind of adult stem cells, from bone marrow fluid, and amplifying them is shown below. The apparatus used in the present example is the one shown in FIG. 1, and a liquid to be treated containing adult stem cells is prepared in a liquid tank 2-1, and cell culture is performed between the cell separator 1-1 and the line 2-1. And the unnecessary cell collection container 3-1 downstream of the cell separator 1-1, and the cell collection liquid injection device 4-1 between the cell separator 1-1 and the unnecessary cell collection container 3-1. There is a system. As the cell separator 1-1, a split fiber nonwoven fabric (density = 1.3 × 10 5 g / m 3 , fiber diameter = 3 to 12 μm) formed in a cylindrical tube having an inner diameter of 1 cm provided with an entrance and exit. By laminating 12 sheets of openings = 5 to 50 μm (minor axis to major axis) and thickness 5.5 × 10 −5 m), and sandwiching the upper and lower sides of the nonwoven fabric with a stopper having an outer diameter of 1 cm, an inner diameter of 7 mm and a height of 5 mm A cell separator with a non-woven fabric immobilized thereon was used.
成体幹細胞を含む被処理液として用いた骨髄は、以下に記した方法にて調製した。体重約３０Ｋｇの家畜ブタに、筋肉注射にてケタラール、セラクタールを注入し、その後ネンブタールを静脈注射にて追加することにより麻酔を行った。１０ｍｌのシリンジに約２０ＩＵ／ｍｌになるように予めヘパリンを入れておき、腸骨より１５Ｇの穿刺針を用いて骨髄液を採取した。次に採取した骨髄プールにヘパリンを最終濃度で５０ＩＵ／ｍｌになるように添加して、十分に転倒混和を行うことにより骨髄液を得た。 Bone marrow used as a treatment solution containing adult stem cells was prepared by the method described below. Anesthesia was performed by injecting ketalal and seractal by intramuscular injection into domestic pigs weighing approximately 30 kg, and then adding nembutal by intravenous injection. Heparin was put in advance in a 10 ml syringe so as to be about 20 IU / ml, and bone marrow fluid was collected from the iliac using a 15 G puncture needle. Next, heparin was added to the collected bone marrow pool to a final concentration of 50 IU / ml, and the mixture was thoroughly mixed by inversion to obtain bone marrow fluid.
まず、細胞分離材をその体積の約６倍量の生理食塩液にて洗浄した。上記調製した骨髄液５ｍｌを液槽２−１に入れ、回路付属のローラークレンメにて骨髄の注入速度を０．５ｍｌ／ｍｉｎ（線速１３ｍｍ／ｍｉｎ）に設定して、ライン２−２を通じて細胞分離器１−１に導入し、細胞分離器より導出された被処理液は、ライン３−２よりサンプリングを行い血球数の測定を自動血球計測装置（シスメックスＫ−４５００）にて実施した。次に同方向からライン２−２を介して生理食塩液１０ｍｌを同流速にて流すことにより、赤血球や白血球、血小板の洗浄除去を行った。次に牛胎児血清１５％を含む細胞培養液（α−ＭＥＭ培地）５ｍｌを、細胞回収液注入装置４−１に入れ、骨髄液を流した方向と逆方向から、ライン４−２及びライン３−２を介してシリンジで細胞培養液を通液することにより、目的とする細胞画分を細胞培養器５−２（ＣＬＩＮＩｃｅｌｌ（ＭＡＢＩＯ製）を使用）に回収し、回収溶液中の血球数を自動血球計測装置にて求めた。血球の通過率は、細胞分離器１−１通過前の血球数で、細胞分離器１−１通過後の各種細胞数を割ることにより求めた。また細胞の回収率は、回収溶液中の細胞数を、細胞分離器１−１通過前の血球数で割ることにより求めた。その結果、赤血球、血小板の通過率は、９５％以上を示し、白血球の通過率は約７５％であった。また回収率は、赤血球が０．８％、血小板が４％であり、白血球は約１８％であった。このことから、本細胞分離フィルターにより、赤血球、血小板はほとんど除去されることが示された。次に、細胞培養器５−２を無菌的に切り離し、３７℃、ＣＯ２インキュベーター内で培養を行った。２〜３日ごとに培地交換し、培養開始１０日後にクリスタルバイオレットでコロニーを染色して出現したコロニー数を測定した。その結果、出現コロニー数は、８５個／カセットであった。 First, the cell separation material was washed with a physiological saline solution of about 6 times its volume. Place 5 ml of the prepared bone marrow fluid in the liquid tank 2-1, set the bone marrow injection speed to 0.5 ml / min (linear speed 13 mm / min) with the roller clamp attached to the circuit, and then connect the cells through the line 2-2. The liquid to be treated introduced into the separator 1-1 and derived from the cell separator was sampled from the line 3-2, and the blood cell count was measured with an automatic blood cell counter (Sysmex K-4500). Next, 10 ml of physiological saline was flowed at the same flow rate through the line 2-2 from the same direction, thereby washing and removing red blood cells, white blood cells, and platelets. Next, 5 ml of a cell culture solution (α-MEM medium) containing 15% of fetal bovine serum is placed in the cell recovery solution injection device 4-1, and the line 4-2 and the line 3 from the direction opposite to the direction in which the bone marrow fluid has flowed. -2 is used to collect the target cell fraction in a cell culture device 5-2 (using CLINIcell (manufactured by MABIO)), and the number of blood cells in the collected solution is determined. It was determined with an automatic blood cell counter. The passing rate of blood cells was determined by dividing the number of various cells after passing through the cell separator 1-1 by the number of blood cells before passing through the cell separator 1-1. The cell recovery rate was determined by dividing the number of cells in the recovery solution by the number of blood cells before passing through the cell separator 1-1. As a result, the passing rate of red blood cells and platelets was 95% or more, and the passing rate of white blood cells was about 75%. The recovery rates were 0.8% for red blood cells, 4% for platelets, and about 18% for white blood cells. From this, it was shown that erythrocytes and platelets were almost removed by this cell separation filter. Next, the cell culture device 5-2 was aseptically disconnected and cultured in a CO 2 incubator at 37 ° C. The medium was changed every 2-3 days, and the number of colonies that appeared by staining the colonies with crystal violet 10 days after the start of the culture was measured. As a result, the number of appearing colonies was 85 / cassette.
次に上記細胞培養器５−２で培養した１０日目の細胞を用いて軟骨形成評価を行った。上記方法にて培養して増幅させた細胞を、ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製ＤＭＥＭ−ハイグルコース培地２０ｍｌで１回洗浄し、遠心分離操作（１０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎ，４℃）で集めた。再度ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製ＤＭＥＭ−ハイグルコース培地に軟骨分化誘導を促す添加物（ＴＧＦβ３ヒトリコンビナント 最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ：フナコシ，デキサメサゾン 最終濃度１００ｎＭ：Ｓｉｇｍａ，アスコルビン酸リン酸エステル 最終濃度５０μｇ／ｍｌ：ＷＡＫＯ，ピルビン酸ナトリウム 最終濃度１００μｇ／ｍｌ，Ｌ−プロリン 最終濃度４０μｇ／ｍｌ：コスモバイオ）を所定量添加した培地に、さらにＩＴＳ（インスリン、トランスフェリン、セレン、牛血清アルブミン）を市販原液の１／１００量添加した培地で間葉系細胞濃度が４×１０５個／ｍｌになるように懸濁した。この細胞懸濁液を０．５ｍｌ取り、１５ｍｌファルコンチューブに入れた。その後遠心分離操作（１０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎ，４℃）を行うと細胞がペレット状になるが、そのままチューブの蓋を緩めて、３７℃，５％ＣＯ２インキュベーター中で３週間培養した。尚この間に培地交換は週２回実施した。培養終了後は球形となった細胞塊を回収し、組織固定用ホルマリンで固定し、軟骨基質染色剤であるトルイジンブルー染色を行った。組織切片を顕微鏡観察した結果、軟骨基質が紫色に染まる異染色性（メタクロマジー）が観察された（図２）。 Next, cartilage formation evaluation was performed using the cells on the 10th day cultured in the cell culture device 5-2. Cells cultured and amplified by the above method were washed once with 20 ml of DMEM-high glucose medium manufactured by GIBCO BRL, and collected by centrifugation (1000 rpm, 10 min, 4 ° C.). GIBCO BRL manufactured DMEM-high glucose medium to promote the induction of cartilage differentiation (TGFβ3 human recombinant final concentration 10 ng / ml: Funakoshi, dexamethasone final concentration 100 nM: Sigma, ascorbic acid phosphate final concentration 50 μg / ml: WAKO, Sodium pyruvate final concentration of 100 μg / ml, L-proline final concentration of 40 μg / ml: Cosmo Bio) plus ITS (insulin, transferrin, selenium, bovine serum albumin) 1/100 volume of commercial stock solution The added medium was suspended in a mesenchymal cell concentration of 4 × 10 5 cells / ml. 0.5 ml of this cell suspension was taken and placed in a 15 ml falcon tube. Thereafter, centrifugation (1000 rpm, 10 min, 4 ° C.) resulted in pelleting of the cells, but the lid of the tube was loosened and cultured in a 37 ° C., 5% CO 2 incubator for 3 weeks. During this period, the medium was changed twice a week. After completion of the culture, the spherical cell mass was collected, fixed with formalin for tissue fixation, and stained with toluidine blue, which is a cartilage matrix stain. As a result of observing the tissue section under a microscope, a metachromatism in which the cartilage matrix was stained purple was observed (FIG. 2).
（参考例１）
培地に軟骨分化誘導因子（上記）を添加しない以外は実施例１と同様の方法にて、軟骨基質形成能を評価した。その結果、軟骨基質が紫色に染まる異染色性（メタクロマジー）は観察されなかった（図２）。
(Reference Example 1)
The cartilage matrix forming ability was evaluated in the same manner as in Example 1 except that the cartilage differentiation inducing factor (above) was not added to the medium. As a result, no metachromatism (metachromosis) in which the cartilage matrix was stained purple was observed (FIG. 2).
（比較例１）
実施例１と同様の方法で採取した骨髄液２ｍｌを、リン酸緩衝液PBS（−）２ｍｌと混合（２倍希釈）した。次に１５ｍｌ遠沈管にＦｉｃｏｌｌ ｐａｑｕｅ ｐｌｕｓ（アマシャム）を３ｍｌ添加し、該溶液の上層に先に調整した希釈骨髄液４ｍｌを積層した。１４００ｒｐｍ、３０ｍｉｎ室温にて遠心分離することにより、成体幹細胞を含む単核球画分層を回収した。PBS（−）を約１０ｍｌ入れ、１３００ｒｐｍ、５ｍｉｎで細胞の洗浄を行った。次に同様にPBS（−）を約１０ｍｌ入れ、１２００ｒｐｍ、５ｍｉｎで細胞の再洗浄を行った。再洗浄液を２ｍｌのＰＢＳ（−）に懸濁し、血球数の測定を行い、細胞回収率を求めた。また実施例１と同様の方法でコロニー出現率、異染色性の観察を行った。その結果、赤血球の回収率は１％、血小板の回収率は８％、白血球の回収率は８３％であった。また出現したコロニー数は、７９個／カセットであった。
(Comparative Example 1)
2 ml of bone marrow fluid collected in the same manner as in Example 1 was mixed (2 times diluted) with 2 ml of phosphate buffer PBS (−). Next, 3 ml of Ficoll paque plus (Amersham) was added to a 15 ml centrifuge tube, and 4 ml of the diluted bone marrow fluid prepared previously was layered on the upper layer of the solution. The mononuclear cell fraction containing adult stem cells was recovered by centrifugation at 1400 rpm for 30 min at room temperature. About 10 ml of PBS (-) was added and the cells were washed at 1300 rpm for 5 minutes. Next, about 10 ml of PBS (−) was similarly added, and the cells were washed again at 1200 rpm for 5 minutes. The rewash solution was suspended in 2 ml of PBS (−), the blood cell count was measured, and the cell recovery rate was determined. In addition, colony appearance rate and heterochromatability were observed in the same manner as in Example 1. As a result, the recovery rate of red blood cells was 1%, the recovery rate of platelets was 8%, and the recovery rate of white blood cells was 83%. The number of colonies that appeared was 79 / cassette.
以上、成体幹細胞回収性能に関する結果を表１に、また異染色性の観察結果を図２に示す。以上の結果から本発明の成体幹細胞分離・培養システムを使用することにより、現在成体幹細胞を分離する方法として使用されているフィコール分離法より優れた間葉系幹細胞分離性能を有し、本培養システムにて増殖した細胞は軟骨への分化能を有していることがわかった。
１ 手段１に相当する部分
１−１ 細胞分離器（デバイス本体）
２ デバイス入口側ユニット
２−１ 液槽
２−２ ライン
３ デバイス出口側ユニット
３−１ 液槽
３−２ ライン
４−１ 細胞回収液注入装置
４−２ ライン
４−３ 三方活栓
５−１ 細胞培養器
５−２ ライン
５−３ 三方活栓
1 Portion corresponding to means 1 1-1 Cell separator (device main body)
2 Device inlet side unit 2-1 Liquid tank 2-2 Line 3 Device outlet side unit 3-1 Liquid tank 3-2 Line 4-1 Cell recovery liquid injection device 4-2 Line 4-3 Three-way stopcock 5-1 Cell culture 5-2 Line 5-3 Three-way stopcock
Claims (7)
成体幹細胞を含む被処理液から成体幹細胞を選択的に捕捉する手段１と、
手段１の入口側に接続され、成体幹細胞を含む被処理液を手段１に導入する回路２と、
手段１の出口側に接続され、手段１から導出された液体を排液する回路３と、
手段１の出口側に配置され、手段１に回収液を導入する手段４と、
手段１の入口側に配置され、手段１から回収された細胞を培養する手段５と、
から構成される成体幹細胞分離・培養システム。 at least,
Means 1 for selectively capturing adult stem cells from a solution containing adult stem cells;
A circuit 2 connected to the inlet side of the means 1 and introducing a treatment liquid containing adult stem cells into the means 1;
A circuit 3 connected to the outlet side of the means 1 for draining the liquid derived from the means 1;
Means 4 arranged on the outlet side of means 1 for introducing the recovered liquid into means 1;
Means 5 for culturing cells recovered from means 1 disposed on the inlet side of means 1;
Adult stem cell isolation and culture system composed of
A method for separating and amplifying an adult stem cell from a treatment liquid containing the adult stem cell using the adult stem cell separation / culture system according to any one of claims 1 to 6.
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