JP2004275194A5 - - Google Patents
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また、本発明の好ましい態様によれば、核酸部が、タンパク質をコードする遺伝子を含み、タンパク質部が該核酸部の遺伝子の翻訳産物である上記の対応付け分子が提供される。核酸部は、好ましくは、RNAからなる遺伝子と、前記遺伝子にスペーサーを介して連結したサプレッサーtRNAとを含む。サプレッサーtRNAは、好ましくは、前記遺伝子の終止コドンに対応するアンチコドンを含む。あるいは、核酸部は、RNAからなる遺伝子と、DNAとRNAまたはDNAとポリエチレングリコールからなるスペーサー部分とを含む。また、核酸部は、DNAからなる遺伝子とDNAとRNAからなるスペーサー部分とを含んでもよい。 Further, according to a preferred embodiment of the present invention, there is provided the aforementioned matching molecule in which the nucleic acid part contains a gene encoding a protein and the protein part is a translation product of the gene of the nucleic acid part. The nucleic acid portion preferably comprises a gene consisting of RNA and a suppressor tRNA linked to the gene via a spacer. The suppressor tRNA preferably comprises an anticodon corresponding to the stop codon of the gene. Alternatively, the nucleic acid part comprises a gene consisting of RNA, and a spacer part consisting of DNA and RNA or DNA and polyethylene glycol. The nucleic acid part may also contain a gene consisting of DNA and a spacer part consisting of DNA and RNA.
さらに具体的には、以下のものが提供される。
（１） （a）遺伝子を含むDNAを作製し、（b）作製したDNAを転写してRNAにし、（c）得られたRNAの3'末端側にスペーサーを介してアミノ酸またはアミノ酸に類似した化学構造骨格を有する物質と共有結合し得る、ヌクレオシドまたはヌクレオシドに類似した化学構造骨格を有する物質を連結し、（d）得られた連結体をmRNAとして無細胞タンパク質合成系でタンパク質合成を行い、遺伝子を含む核酸部と前記遺伝子の翻訳産物とを連結することを特徴とする対応付け分子の構築工程と、構築工程で得られた対応付け分子を淘汰する淘汰工程とを含むことを特徴とする所望のタンパク質の選択方法。
（２） （a）遺伝子を含むDNAを作製し、（b）作製したDNAを転写してRNAにし、（c）得られたRNAの3'末端側にスペーサーを介してアミノ酸またはアミノ酸に類似した化学構造骨格を有する物質と共有結合し得る、ヌクレオシドまたはヌクレオシドに類似した化学構造骨格を有する物質を連結し、（d）得られた連結体をmRNAとして無細胞タンパク質合成系でタンパク質合成を行い、遺伝子を含む核酸部と前記遺伝子の翻訳産物とを連結する
ことを特徴とする対応付け分子の構築工程と、構築工程で得られた対応付け分子を淘汰する淘汰工程と、淘汰工程により選択された対応付け分子の遺伝子部分を増幅する増幅工程とを含み、増幅工程で得られたDNAを構築工程に供することにより、構築工程、淘汰工程及び増幅工程を繰り返し行うことを特徴とする所望のタンパク質の選択方法。
（３） （a）遺伝子を含むDNAを作製し、（b）作製したDNAを転写してRNAにし、（c）得られたRNAの3'末端側にスペーサーを介してアミノ酸またはアミノ酸に類似した化学構造骨格を有する物質と共有結合し得る、ヌクレオシドまたはヌクレオシドに類似した化学構造骨格を有する物質を連結し、（d）得られた連結体をmRNAとして無細胞タンパク質合成系でタンパク質合成を行い、遺伝子を含む核酸部と前記遺伝子の翻訳産物とを連結することを特徴とする対応付け分子の構築工程と、構築工程で得られた対応付け分子を淘汰する淘汰工程と、淘汰工程により選択された対応付け分子の遺伝子部分を増幅する増幅工程とを含むことを特徴とする所望のタンパク質をコードするDNAの取得方法。
（４） 増幅工程で得られたDNAを構築工程に供することにより、構築工程、淘汰工程及び増幅工程を繰り返し行うことを特徴とする３記載のDNAの取得方法。
（５） （a）遺伝子を含むDNAを作製し、（b）作製したDNAを転写してRNAにし、（c）得られたRNAの3'末端側にスペーサーを介してアミノ酸またはアミノ酸に類似した化学構造骨格を有する物質と共有結合し得る、ヌクレオシドまたはヌクレオシドに類似した化学構造骨格を有する物質を連結し、（d）得られた連結体をmRNAとして無細胞タンパク質合成系でタンパク質合成を行い、遺伝子を含む核酸部と前記遺伝子の翻訳産物とを連結することを特徴とする対応付け分子の構築工程と、構築工程で得られた対応付け分子を淘汰する淘汰工程とを含むことを特徴とする所望のタンパク質をコードするRNAの選択方法。
（６） （a）遺伝子を含むDNAを作製し、（b）作製したDNAを転写してRNAにし、（c）得られたRNAの3'末端側にスペーサーを介してアミノ酸またはアミノ酸に類似した化学構造骨格を有する物質と共有結合し得る、ヌクレオシドまたはヌクレオシドに類似した化学構造骨格を有する物質を連結し、（d）得られた連結体をmRNAとして無細胞タンパク質合成系でタンパク質合成を行い、遺伝子を含む核酸部と前記遺伝子の翻訳産物とを連結することを特徴とする対応付け分子の構築工程と、構築工程で得られた対応付け分子を淘汰する淘汰工程と、淘汰工程により選択された対応付け分子の遺伝子部分を増幅する増幅工程とを含み、増幅工程で得られたDNAを構築工程に供することにより、構築工程、淘汰工程及び増幅工程を繰り返し行うことを特徴とする所望のタンパク質をコードするRNAの選択方法。
（７） 遺伝子を含むDNAが、さらに転写・翻訳開始配列、及び開始コドンを含む１〜６のいずれかに記載の方法。
（８） スペーサーが高分子物質からなる１〜７のいずれかに記載の方法。
（９） スペーサーの長さが、１００〜１０００Åの範囲である１〜８のいずれかに記載の方法。
（１０） スペーサーが核酸を含む１〜９のいずれかに記載の方法。
（１１） 核酸が、RNAもしくはDNAの一本鎖、RNAもしくはDNAとDNAとの二本鎖、RNAと短鎖のPNAもしくはDNAとの二本鎖、RNAとDNAとからなる一本鎖、または、RNAとDNAとからなる一本鎖と短鎖のDNAとの二本鎖である１０に記載の方法。
（１２） スペーサーがポリエチレングリコールを含む１〜１１のいずれかに記載の方法。
（１３） ポリエチレングリコールの分子量が３０００〜３００００である１２に記載の方法。
（１４） スペーサーが、ポリエチレングリコールとDNAとからなる９または１３記載の方法。
（１５） ヌクレオシドまたはヌクレオシドに類似した化学構造骨格を有する物質が、ピューロマイシン、3'-N-アミノアシルピューロマイシンアミノヌクレオシドまたは3'-N-アミノアシルアデノシンアミノヌクレオシドである１〜１４のいずれかに記載の方法。
（１６） 遺伝子を含む核酸部と前記遺伝子の翻訳産物との連結が、共有結合によって
なる１〜１５のいずれかに記載の方法。
（１７） 共有結合がアミド結合である１６に記載の方法。
（１８） 淘汰工程において選択される対応付け分子が、物質との相互作用を指標として選択されるものである１〜１７のいずれかに記載の方法。
（１９） 淘汰工程が、固相に結合した物質と構築工程で得られた対応付け分子との相互作用による複合体を分離する工程を含む１８に記載の方法。
（２０） 遺伝子が、抗体またはその部分の遺伝子である１〜１９のいずれかに記載の方法。
（２１） 遺伝子が、酵素またはその部分の遺伝子である１〜１９のいずれかに記載の方法。
（２２） 遺伝子を含むDNAが、ランダム塩基配列からなる１〜１９のいずれかに記載の方法。
（２３） 遺伝子を含むDNAが、異なる遺伝子を有する複数のDNAからなるライブラリーである１〜２２のいずれかに記載の方法。
More specifically, the following are provided.
(1) (a) DNA containing a gene was prepared, (b) the prepared DNA was transcribed to be RNA, and (c) an amino acid or amino acid similar to the amino acid via a spacer on the 3 'end side of the obtained RNA A substance having a chemical structure skeleton that can be covalently linked to a substance having a chemical structure skeleton is linked, and a substance having a chemical structure skeleton similar to a nucleoside or nucleoside is linked, and (d) the obtained conjugate is subjected to protein synthesis in a cell-free protein synthesis system, The method includes a step of constructing a corresponding molecule characterized by linking a nucleic acid portion containing a gene and a translation product of the gene, and a step of picking up the corresponding molecule obtained in the step of construction. How to select the desired protein.
(2) (a) DNA containing a gene was prepared, (b) the prepared DNA was transcribed into RNA, and (c) an amino acid or an amino acid similar to the amino acid via a spacer on the 3 'end side of the obtained RNA A substance having a chemical structure skeleton that can be covalently linked to a substance having a chemical structure skeleton is linked, and a substance having a chemical structure skeleton similar to a nucleoside or nucleoside is linked, and (d) the obtained conjugate is subjected to protein synthesis in a cell-free protein synthesis system, A step of constructing a corresponding molecule characterized by linking a nucleic acid portion containing a gene and a translation product of the gene, a step of selecting the corresponding molecule obtained in the step of selecting, and a step of selecting And a step of amplifying the gene portion of the corresponding molecule, wherein the DNA obtained in the step of amplification is subjected to the step of construction to repeatedly perform the step of construction, the step of chewing and the step of amplification. Selection method of the desired protein.
(3) (a) DNA containing a gene was prepared, (b) the prepared DNA was transcribed to be RNA, and (c) an amino acid or an amino acid similar to the amino acid via a spacer on the 3 'end side of the obtained RNA A substance having a chemical structure skeleton that can be covalently linked to a substance having a chemical structure skeleton is linked, and a substance having a chemical structure skeleton similar to a nucleoside or nucleoside is linked, and (d) the obtained conjugate is subjected to protein synthesis in a cell-free protein synthesis system, A step of constructing a corresponding molecule characterized by linking a nucleic acid portion containing a gene and a translation product of the gene, a step of selecting the corresponding molecule obtained in the step of selecting, and a step of selecting And D. an amplification step of amplifying a gene portion of the correspondence molecule.
(4) The method for obtaining DNA according to 3 above, wherein the construction step, the chewing step and the amplification step are repeated by applying the DNA obtained in the amplification step to the construction step.
(5) (a) DNA containing a gene was prepared, (b) the prepared DNA was transcribed to be RNA, and (c) an amino acid or an amino acid similar to the amino acid via a spacer on the 3 'end side of the obtained RNA A substance having a chemical structure skeleton that can be covalently linked to a substance having a chemical structure skeleton is linked, and a substance having a chemical structure skeleton similar to a nucleoside or nucleoside is linked, and (d) the obtained conjugate is subjected to protein synthesis in a cell-free protein synthesis system, The method includes a step of constructing a corresponding molecule characterized by linking a nucleic acid portion containing a gene and a translation product of the gene, and a step of picking up the corresponding molecule obtained in the step of construction. A method of selecting RNA encoding a desired protein.
(6) (a) DNA containing a gene was prepared, (b) the prepared DNA was transcribed to be RNA, and (c) an amino acid or an amino acid similar to the amino acid via a spacer on the 3 'end side of the obtained RNA A substance having a chemical structure skeleton that can be covalently linked to a substance having a chemical structure skeleton is linked, and a substance having a chemical structure skeleton similar to a nucleoside or nucleoside is linked, and (d) the obtained conjugate is subjected to protein synthesis in a cell-free protein synthesis system, A step of constructing a corresponding molecule characterized by linking a nucleic acid portion containing a gene and a translation product of the gene, a step of selecting the corresponding molecule obtained in the step of selecting, and a step of selecting And a step of amplifying the gene portion of the corresponding molecule, wherein the DNA obtained in the step of amplification is subjected to the step of construction to repeatedly perform the step of construction, the step of chewing and the step of amplification. RNA selection method of encoding the desired protein.
(7) The method according to any one of 1 to 6 , wherein the DNA containing the gene further comprises a transcription / translation initiation sequence and an initiation codon .
(8) The method according to any one of 1 to 7, wherein the spacer comprises a polymer substance.
(9) The method according to any one of 1 to 8, wherein the length of the spacer is in the range of 100 to 1000 Å.
(10) The method according to any one of 1 to 9, wherein the spacer comprises a nucleic acid.
(11) The nucleic acid is a single strand of RNA or DNA, a double strand of RNA or DNA and DNA, a double strand of RNA and short PNA or DNA, a single strand of RNA and DNA, or 10. The method according to 10, which is a double strand of a single strand consisting of RNA and DNA and a short strand DNA.
(12) The method according to any one of 1 to 11, wherein the spacer comprises polyethylene glycol.
(13) The method according to 12, wherein the molecular weight of polyethylene glycol is 3,000 to 30,000.
(14) The method according to 9 or 13, wherein the spacer comprises polyethylene glycol and DNA.
(15) The substance described in any one of 1 to 14 wherein the substance having a chemical structure skeleton similar to the nucleoside or nucleoside is puromycin , 3'-N-aminoacyl puromycin aminonucleoside or 3'-N-aminoacyl adenosine aminonucleoside the method of.
(16) The method according to any one of 1 to 15, wherein the linkage between the nucleic acid part containing the gene and the translation product of the gene is by covalent bond.
(17) The method according to 16, wherein the covalent bond is an amide bond.
(18) The method according to any one of 1 to 17, wherein the mapping molecule selected in the chewing step is selected using an interaction with a substance as an index.
(19) The method according to 18, wherein the step of 淘汰 includes the step of separating the complex resulting from the interaction between the substance bound to the solid phase and the corresponding molecule obtained in the step of construction.
(20) The method according to any one of 1 to 19, wherein the gene is a gene of an antibody or a part thereof.
(21) The method according to any one of 1 to 19, wherein the gene is a gene of an enzyme or a part thereof.
( 22 ) The method according to any one of 1 to 19 , wherein the DNA containing a gene comprises a random base sequence.
( 23 ) The method according to any one of 1 to 22 , wherein the DNA containing a gene is a library consisting of a plurality of DNAs having different genes.
（２４） 遺伝子を有するRNAの3'末端に、高分子物質からなるスペーサーが結合した分子。
（２５） ２４に記載の分子の3'末端側に、アミノ酸またはアミノ酸に類似した化学構造骨格を有する物質と共有結合し得る、ヌクレオシドまたはヌクレオシドに類似した化学構造骨格を有する物質が結合した分子。
（２６） ヌクレオシドまたはヌクレオシドに類似した化学構造骨格を有する物質が、ピューロマイシン、3'-N-アミノアシルピューロマイシンアミノヌクレオシドまたは3'-N-アミノアシルアデノシンアミノヌクレオシドである２５に記載の分子。
（２７） RNAが、さらに転写・翻訳開始配列、及び開始コドンを含む２４〜２６のいずれかに記載の分子。
（２８） スペーサーの長さが、１００〜１０００Åの範囲である２４〜２７のいずれかに記載の分子。
（２９） スペーサーが、核酸を含む２４〜２８のいずれかに記載の分子。
（３０） 核酸が、RNAもしくはDNAの一本鎖、RNAもしくはDNAとDNAとの二本鎖、RNAと短鎖のPNAもしくはDNAとの二本鎖、RNAとDNAとからなる一本鎖、または、RNAとDNAとからなる一本鎖と短鎖のDNAとの二本鎖である２９に記載の分子。
（３１） スペーサーが、ポリエチレングリコールを含む２４〜３０のいずれかに記載の分子。
（３２） スペーサーが、ポリエチレングリコールとDNAとからなる３１に記載の分子。
（３３） ポリエチレングリコールの分子量が、３０００〜３００００である３１または３２に記載の方法。
（３４） 遺伝子が、抗体またはその部分の遺伝子である２４〜３３のいずれかに記載の分子。
（３５） 遺伝子が、酵素またはその部分の遺伝子である２４〜３３のいずれかに記載の分子。
（３６） 遺伝子が、ランダム塩基配列からなる２４〜３３のいずれかに記載の分子。
（３７） ２４〜３６のいずれかに記載の分子であって、異なる遺伝子を有する複数の分子からなるライブラリー。
(24) A molecule in which a spacer made of a high molecular substance is bound to the 3 'end of RNA having a gene.
(25) A molecule in which a substance having a chemical structure skeleton similar to a nucleoside or nucleoside that can be covalently linked to an amino acid or a substance having a chemical structure skeleton similar to an amino acid is linked to the 3 ′ end of the molecule described in 24.
( 26 ) The molecule according to 25, wherein the substance having a chemical structure skeleton similar to a nucleoside or nucleoside is puromycin , 3'-N-aminoacyl puromycin aminonucleoside or 3'-N-aminoacyl adenosine aminonucleoside .
( 27 ) The molecule according to any one of 24 to 26 , wherein the RNA further comprises a transcription / translation initiation sequence, and an initiation codon .
( 28 ) The molecule according to any of 24 to 27 , wherein the length of the spacer is in the range of 100 to 1000 Å.
( 29 ) The molecule according to any one of 24 to 28 , wherein the spacer comprises a nucleic acid.
( 30 ) The nucleic acid is a single strand of RNA or DNA, a double strand of RNA or DNA and DNA, a double strand of RNA and short PNA or DNA, a single strand of RNA and DNA, or 29. The molecule according to 29 , which is a double strand of a single strand consisting of RNA and DNA and a short strand DNA.
(31) spacer, molecule according to any one of 24 to 30, including polyethylene glycol.
( 32 ) The molecule according to 31 , wherein the spacer comprises polyethylene glycol and DNA.
( 33 ) The method according to 31 or 32 , wherein the molecular weight of polyethylene glycol is 3,000 to 30,000.
(34) The molecule according to any one of 24 to 33, wherein the gene is a gene of an antibody or a part thereof.
(35) The molecule according to any one of 24 to 33, wherein the gene is a gene of an enzyme or a part thereof.
(36) The molecule | numerator in any one of 24-33 whose gene consists of a random base sequence.
(37) The library according to any one of 24 to 36, wherein the library comprises a plurality of molecules having different genes.
（３８） 遺伝子型を反映する塩基配列を有する核酸部と、前記遺伝子型を反映する塩基配列がコードするタンパク質を含むタンパク質部とが直接共有結合している分子であって、核酸部がDNAを含む分子。
（３９） 核酸部が、さらに転写・翻訳開始配列、及び開始コドンを含む３８に記載の分子。
（４０） 核酸部に含まれるDNAが、DNAとRNAとの二本鎖である３８または３９に記載の分子。
（４１） 核酸部に含まれるDNAが、DNAの一本鎖である３８または３９に記載の分子。
（４２） 核酸部に含まれるDNAが、DNAの二本鎖である３８または３９に記載の分子。
（４３） 核酸部に含まれるDNAが、RNAの逆転写反応によって生成されたものである３８〜４２のいずれかに記載の分子。
（４４） 核酸部が、遺伝子型を反映する塩基配列の3'末端側に、スペーサーを介して、アミノ酸またはアミノ酸に類似した化学構造骨格を有する物質と共有結合し得る、ヌクレオシドまたはヌクレオシドに類似した化学構造骨格を有する物質が結合した分子である３８〜４３のいずれかに記載の分子。
（４５） ヌクレオシドまたはヌクレオシドに類似した化学構造骨格を有する物質が、ピューロマイシン、3'-N-アミノアシルピューロマイシンアミノヌクレオシドまたは3'-N-アミノアシルアデノシンアミノヌクレオシドである４４に記載の分子。
（４６） スペーサーが、高分子物質からなる４４または４５に記載の分子。
（４７） スペーサーが、１００〜１０００Åの長さを有する４４〜４６のいずれかに記載の分子。
（４８） スペーサーが核酸を含む４４〜４７のいずれかに記載の分子。
（４９） 核酸が、RNAもしくはDNAの一本鎖、RNAもしくはDNAとDNAとの二本鎖、RNAと短鎖のPNAもしくはDNAとの二本鎖、RNAとDNAとからなる一本鎖、または、RNAとDNAとからなる一本鎖と短鎖のDNAとの二本鎖である４８に記載の分子。
（５０） スペーサーが、ポリエチレングリコールを含む４４〜４９のいずれかに記載の分子。
（５１） スペーサーが、ポリエチレングリコールとDNAとからなる５０に記載の分子。
（５２） ポリエチレングリコールが、３０００〜３００００の分子量を有する５０または５１に記載の方法。
（５３） 遺伝子が、抗体またはその部分の遺伝子である３８〜５２のいずれかに記載の分子。
（５４） 遺伝子が、酵素またはその部分の遺伝子である３８〜５２のいずれかに記載の分子。
（５５） 遺伝子が、ランダム塩基配列からなる３８〜５２のいずれかに記載の分子。
（５６） ３８〜５５のいずれかに記載の分子であって、異なる遺伝子を有する複数の分子からなるライブラリー。
(38) A molecule in which a nucleic acid part having a nucleotide sequence reflecting a genotype and a protein part containing a protein encoded by the base sequence reflecting the genotype are directly and covalently bonded, and the nucleic acid part is a DNA Containing molecules.
(39) The molecule according to 38 , wherein the nucleic acid portion further comprises a transcription / translation initiation sequence, and an initiation codon .
(40) The molecule according to 38 or 39, wherein the DNA contained in the nucleic acid part is a double strand of DNA and RNA.
(41) The molecule according to 38 or 39, wherein the DNA contained in the nucleic acid part is a single strand of DNA.
(42) The molecule according to 38 or 39, wherein the DNA contained in the nucleic acid part is a double strand of DNA.
(43) The molecule according to any one of 38 to 42, wherein the DNA contained in the nucleic acid part is produced by reverse transcription of RNA.
(44) Nucleoside or nucleoside similar to nucleic acid, which can be covalently linked to an amino acid or a substance having a chemical structure skeleton similar to an amino acid via a spacer on the 3 'end side of the nucleotide sequence reflecting the genotype A molecule according to any one of 38 to 43, which is a molecule bound to a substance having a chemical structure skeleton.
(45) The molecule according to 44, wherein the substance having a chemical structure skeleton similar to a nucleoside or nucleoside is puromycin , 3'-N-aminoacyl puromycin aminonucleoside or 3'-N-aminoacyl adenosine aminonucleoside .
(46) The molecule according to 44 or 45, wherein the spacer comprises a polymer substance.
(47) The molecule according to any of 44-46, wherein the spacer has a length of 100 to 1000 Å.
(48) The molecule according to any one of 44 to 47, wherein the spacer comprises a nucleic acid.
(49) The nucleic acid is a single strand of RNA or DNA, a double strand of RNA or DNA and DNA, a double strand of RNA and short PNA or DNA, a single strand of RNA and DNA, or 46. The molecule according to 48, which is a double strand of a single strand consisting of RNA and DNA and a short strand DNA.
(50) The molecule | numerator in any one of 44-49 whose spacer contains polyethyleneglycol.
(51) The molecule according to 50, wherein the spacer comprises polyethylene glycol and DNA.
(52) The method according to 50 or 51, wherein the polyethylene glycol has a molecular weight of 3,000 to 30,000.
(53) The molecule according to any one of 38 to 52, wherein the gene is a gene of an antibody or a part thereof.
(54) The molecule according to any one of 38 to 52, wherein the gene is a gene of an enzyme or a part thereof.
(55) The molecule | numerator in any one of 38-52 whose gene consists of a random base sequence.
(56) The molecule according to any one of 38 to 55, wherein the library comprises a plurality of molecules having different genes.
そこで、mRNA-sup tRNA（mRNAの3'側にスペーサーを介してsup tRNAを連結したもの）
の3'末端にタンパク質を結合させる実験の前に、mRNAと切り離したsup tRNAでもリボソームのＡサイトに入り、タンパク質と結合するかどうかを調べてみた。実際に、sup tRNAの3'末端にピューロマイシンを結合させたsup tRNAを調製し、これを無細胞タンパク質合成系に投入し、sup tRNA部分がリボゾームのＡサイトの終止コドンに対応して入り、タンパク質と結合するかどうか調べた。mRNAはタウ・タンパク質の４リピート領域（127残基）を用いた（Goedert, M. (1989) EMBO J. 8, 392-399）。その結果、無細胞タンパク合成系で翻訳させところ、3'末端にピューロマイシンをもつsup tRNAはリボゾームのＡサイトの終止コドンに対応して入り、タンパク質と結合することが確認できた（第２図）。
Therefore, mRNA-sup-tRNA (a product in which sup-tRNA is linked to the 3 'side of mRNA via a spacer)
Before the experiment of binding the protein to the 3 'end of, it was examined whether the suptRNA separated from the mRNA also enters the A site of the ribosome and binds to the protein. In fact, a suptRNA having puromycin bound to the 3 'end of the suptRNA is prepared, and this is put into a cell-free protein synthesis system, and the suptRNA portion enters corresponding to the stop codon of the A site of ribosome, It was examined whether it binds to a protein. For mRNA, 4 repeat region (127 residues) of tau protein was used (Goedert, M. (1989) EMBO J. 8, 392-399). As a result, when translated by the cell-free protein synthesis system, it was confirmed that suptRNA having puromycin at the 3 'end enters in correspondence with the stop codon of the A site of ribosome and binds to the protein (FIG. 2) ).
この核酸部の連結体の構築においては、先ず、T7プロモーター領域から４リピート翻訳領域の終りまでの連結体の構築は、前記（1）部位指定的な方法の核酸部の連結体の構築のところで述べた方法に準ずるが、違うところは前記で構築した連結体を鋳型にしてPCRで増幅する際に、backwardのプライマーに４リピートのＣ末端の二つの終止コドン、オーカー（CTG）とアンバー（TAA）をそれぞれCAG（グルタミン）とAAA（リジン）に変え、終止コドンをなくするように設計したプライマーを用いることである。 In the construction of the ligation product of the nucleic acid part, first, the construction of the ligation product from the T7 promoter region to the end of the 4-repeat translation region is the construction of the ligation product of the nucleic acid part of the (1) site-directed method. According to the method described above, the difference is that when using the ligation constructed above as a template and amplifying by PCR, two stop codons, C-terminus of a C-terminus of 4 repeats, aker (CTG) and an amber (TAA) are used as primers of backward. ) To CAG (glutamine) and AAA (lysine), respectively, and using primers designed to eliminate the stop codon.
2) このゲノムからT7プロモーター領域及びシャインダルガノ配列を含んだ4リピート部分をPCRによって増幅した。この際、プライマーとして、5'側は、Left+（配列番号１）と3'側はRight-（配列番号2）を使った。また、Right-の配列はオーカー終止コドンの前のロイシンをアンバー終止コドンに変異させるようになっている。PCR条件は、変性92℃/30秒、アニーリング65℃/30秒、伸長反応73℃/1分で30回繰り返した。 2) From this genome, a 4-repeat portion containing a T7 promoter region and Shine-Dalgarno sequence was amplified by PCR. At this time, as the primer, Left + (SEQ ID NO: 1) on the 5 'side and Right- (SEQ ID NO: 2) on the 3' side were used. Also, the sequence of Right- is designed to mutate leucine before the Oker stop codon to the amber stop codon. The PCR conditions were repeated 30 times with denaturation at 92 ° C./30 seconds, annealing at 65 ° C./30 seconds, and extension reaction at 73 ° C./minute.
（２）部位非指定的に結合させるためのゲノムの作成
Ａ. 変異4リピート部分のDNA及びRNAの作成
変異4リピート部分のDNAは、基本的に上記（１）のAと同一の方法で作成した。ただし、2つの終止コドンすなわちアンバーをグルタミン、オーカーをリジンに替えて終止コドンをなくし、また、3'末端をプリンリッチ(rich)にするために、新しいプライマーNew/Right-（配列番号10）を合成し、Left+とともに変性92℃/30秒、アニーリング65℃/30秒、伸長反応73℃/1分で30回の条件でPCRによって増幅した。このDNAを鋳型として、T7ポリメラーゼを使い37℃、2時間反応させることによりRNAゲノムを得た。
(2) Preparation of genome for non-specific site binding A. Preparation of DNA and RNA of mutation 4 repeat part DNA of mutation 4 repeat part is basically prepared by the same method as A of the above (1) did. However, in order to replace two stop codons, ie, glutamine for amber and lysine for ochre to eliminate the stop codon, and to make the 3 'end purine rich (New), a new primer New / Right- (SEQ ID NO: 10) They were synthesized and amplified by PCR under conditions of denaturation 92 ° C./30 sec, annealing 65 ° C./30 sec, extension reaction 73 ° C./1 min with Left +. Using this DNA as a template, an RNA genome was obtained by reacting with T7 polymerase for 2 hours at 37 ° C.
Claims (56)
汰する淘汰工程とを含むことを特徴とする所望のタンパク質をコードするRNAの選択方法。 (A) DNA containing a gene is prepared, (b) the prepared DNA is transcribed into RNA, and (c) a chemical structure skeleton similar to the amino acid or amino acid via a spacer on the 3 'end side of the obtained RNA And a substance having a chemical structure skeleton similar to a nucleoside or nucleoside, which can be covalently linked, and (d) carrying out protein synthesis in a cell-free protein synthesis system using the obtained conjugate as mRNA, and containing a gene A desired protein comprising a step of constructing a corresponding molecule characterized by linking a nucleic acid portion and a translation product of the gene, and a step of chewing the corresponding molecule obtained in the step of construction. A method of selecting RNA encoding
似した化学構造骨格を有する物質が結合した分子。 A molecule in which a substance having a chemical structure skeleton similar to a nucleoside or nucleoside that can be covalently linked to an amino acid or a substance having a chemical structure skeleton similar to an amino acid is linked to the 3 'terminal side of the molecule according to claim 24.
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