JP2005013173A5 - - Google Patents

Description

【特許請求の範囲】
【請求項１】 特定の塩基を有したヌクレオチド配列が３´側に存在するヌクレオチド鎖に、前記特定の塩基を有したヌクレオチドに特異的な分解酵素を作用させることにより、ヌクレオチド鎖の３´末端に修飾物質に対して反応性を有する官能基を形成し、このヌクレオチド鎖の３´末端に直接に前記修飾物質を結合させるヌクレオチド鎖修飾方法。
【請求項２】 特定の塩基を有したヌクレオチド配列が、主鎖となすヌクレオチド鎖の３´側に位置し、前記特定の塩基が前記主鎖に存在しない塩基である請求項１記載のヌクレオチド鎖修飾方法。
【請求項３】 反応性を有する官能基がアルデヒド基である請求項１または請求項２のいずれかに記載のヌクレオチド鎖修飾方法。
【請求項４】 特定の塩基がヒポキサンチンであり、分解酵素が３−メチルアデニンＤＮＡグリコシラーゼである請求項１〜請求項３のいずれかに記載のヌクレオチド鎖修飾方法。
【請求項５】 特定の塩基を有したヌクレオチド配列は、テーリング法により付加する請求項１記載のヌクレオチド鎖修飾方法。
【請求項６】 特定の塩基を有したヌクレオチド配列が存在するヌクレオチド鎖として、化学合成されたヌクレオチド鎖を使用する請求項１記載のヌクレオチド鎖修飾方法。
【請求項７】 分解酵素を作用させるに先だって、特定の塩基と相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを添加する請求項１記載のヌクレオチド鎖修飾方法。
【請求項８】 修飾物質が、ヌクレオチド鎖をラベル化、標識化する物質である請求項１記載のヌクレオチド鎖修飾方法。
【請求項９】 修飾物質が、遺伝子解析のための基板への結合能を有した物質である請求項１記載のヌクレオチド鎖修飾方法。
【請求項１０】 ヌクレオチド鎖の３´末端の官能基に反応する修飾物質がアミノ基を有する請求項１または請求項３のいずれかに記載のヌクレオチド鎖修飾方法。
【請求項１１】 修飾物質が、アミノ酸、オリゴペプチド、またはタンパク質である請求項１０記載のヌクレオチド鎖修飾方法。
【請求項１２】 修飾物質が、アミノアルカンチオールまたはアミノシランカップリング化合物である請求項１０記載のヌクレオチド鎖修飾方法。 [Claims]
1. A 3 ′ end of a nucleotide chain by allowing a degrading enzyme specific to the nucleotide having a specific base to act on a nucleotide chain having a nucleotide sequence having a specific base on the 3 ′ side. A method for modifying a nucleotide chain, wherein a functional group having reactivity with a modifying substance is formed on the base and the modifying substance is directly bonded to the 3 'end of the nucleotide chain.
2. The nucleotide chain according to claim 1, wherein the nucleotide sequence having a specific base is located on the 3 ′ side of the nucleotide chain constituting the main chain, and the specific base is a base not present in the main chain. Modification method.
3. The nucleotide chain modification method according to claim 1, wherein the reactive functional group is an aldehyde group.
4. A particular base is hypoxanthine, a nucleotide chain modification method according to any one of claims 1 to 3 decomposing enzyme is 3-methyl adenine DNA glycosyl La over zero.
5. The nucleotide chain modification method according to claim 1, wherein the nucleotide sequence having a specific base is added by the tailing method.
6. The method for modifying a nucleotide chain according to claim 1, wherein a chemically synthesized nucleotide chain is used as a nucleotide chain in which a nucleotide sequence having a specific base is present.
7. The method for modifying a nucleotide chain according to claim 1, wherein an oligonucleotide having a base sequence complementary to a specific base is added prior to the action of the decomposing enzyme.
8. The method of modifying a nucleotide chain according to claim 1, wherein the modifying substance is a substance that labels and labels the nucleotide chain.
9. The method for modifying a nucleotide chain according to claim 1, wherein the modifying substance is a substance capable of binding to a substrate for gene analysis.
10. The method for modifying a nucleotide chain according to claim 1, wherein the modifying substance that reacts with the functional group at the 3 ′ end of the nucleotide chain has an amino group.
11. The method for modifying a nucleotide chain according to claim 10, wherein the modifying substance is an amino acid, an oligopeptide, or a protein.
12. The method for modifying a nucleotide chain according to claim 10, wherein the modifying substance is an aminoalkanethiol or an aminosilane coupling compound.

上述したヌクレオチド鎖のラベル化、標識化、固定化の課題を解決するものとして、ヌクレオチド鎖の３´末端部を直接的に修飾物質で修飾する方法が提案されている（特許文献１０参照）。この方法は、ヌクレオチド鎖の３´側に２つ以上のウラシル塩基を付加させ、付加したウラシルのグリコシド結合をウラシルＤＮＡグリコシラーゼで分解して、３´末端にアルデヒド基を形成させ、このアルデヒド基とアミノ基を有する修飾物質とを共有結合させることにより、ヌクレオチド鎖の３´末端を修飾する。 In order to solve the above-mentioned problems of labeling, labeling, and immobilizing a nucleotide chain, a method of directly modifying the 3 ′ end of the nucleotide chain with a modifying substance has been proposed (see Patent Document 10). This method, by adding two or more uracil bases 3 'side of the nucleotide chain, the glycosidic bond of the added uracil was decomposed with uracil DNA glycoside la chromatography peptidase, to form aldehyde groups on the 3' end, the The 3 ′ end of the nucleotide chain is modified by covalently bonding an aldehyde group and a modifying substance having an amino group.

特開２００３−２４６７９４公報JP 2003-246794 A

ベック（Beck.S.）、「メソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods Enzymol.）」、２１６巻、１４３頁、１９９２年Beck. S., “Methods in Enzymology”, 216, 143, 1992

ブロンシュタイン（Bronstein.I.）ら、「メソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods Enzymol.）」、２１７巻、３９８頁、１９９３年Bronstein.I. Et al., “Methods Enzymol.”, 217, 398, 1993

ミュリス（Mullis.K.B.）ら、「メソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods Enzymol.）」、１５５巻、３３５頁、１９８７年Mullis. K.B., et al., “Methods in Enzymol.”, 155, 335, 1987

この問題を解決するものとして特許文献１０記載の方法が提案されており、ヌクレオチド鎖の鎖長に関係なく、ヌクレオチド鎖の３´側を直接的に簡便に任意の修飾物質で修飾して、安定に保持可能な方法であるが、その一方で、付加したウラシルのグリコシド結合をウラシルＤＮＡグリコシラーゼにより分解する原理から理解されるように、ヌクレオチド鎖中にウラシル塩基の配列が存在しない時しか実施できないという制約を有している。 As a method for solving this problem, a method described in Patent Document 10 has been proposed, and the 3 ′ side of the nucleotide chain is directly and simply modified with an arbitrary modifying substance, regardless of the chain length of the nucleotide chain. is a method that can be held in, on the other hand, the added glycosidic bonds uracil as is understood from the principles decomposed by uracil DNA glycoside la chromatography peptidase only when the sequence of the uracil bases are not present in the nucleotide chain There is a restriction that it cannot be implemented.

反応性を有する官能基として、アルデヒド基を形成することができる。
特定の塩基がヒポキサンチンであり、分解酵素が３−メチルアデニンＤＮＡグリコラーゼであるのが好ましい。特定の塩基および分解酵素は種々の組合せが可能であるが、たとえばウラシル塩基のヌクレオチド鎖への組み込みは、遺伝子解析の様々な手法の中で汎用されているため、これを特定の塩基として利用することは望ましくない場合がある。汎用頻度の低いヒポキサンチン塩基とその分解酵素を利用することで、ヌクレオチド鎖の３´末端修飾を実施する際の利用者の利便性を大幅に向上することが可能となる。また、ヌクレオチド鎖の塩基の構成や鎖長に関わらず、ヌクレオチド鎖の３´末端側を直接的に簡便に、任意の修飾物質で、定量的、安定的に修飾することが可能となる。ヌクレオチド鎖内への不必要な塩基配列、修飾された塩基の取り込みを排除し、ヌクレオチド鎖の３´末端に限定して修飾物質で修飾できる方法である。 An aldehyde group can be formed as a functional group having reactivity.
Particular base is hypoxanthine, decomposing enzyme is preferably a 3-methyl adenine DNA glycolate La over zero. Although various combinations of specific bases and degrading enzymes are possible, for example, incorporation of a uracil base into a nucleotide chain is widely used in various methods of gene analysis, and this is used as a specific base. That may not be desirable. By using a hypoxanthine base and its degrading enzyme, which are less commonly used, it is possible to greatly improve the convenience of the user when modifying the 3 ′ end of the nucleotide chain. In addition, regardless of the base configuration or chain length of the nucleotide chain, the 3 ′ end side of the nucleotide chain can be directly and simply modified quantitatively and stably with an arbitrary modifying substance. In this method, unnecessary nucleotide sequences and modified bases are not incorporated into the nucleotide chain, and the modification can be performed with a modifying substance limited to the 3 ′ end of the nucleotide chain.

なお、この実施の形態１では、ヒポキサンチン塩基を有するヌクレオチド（Ａ）をテーリングさせ、３−メチルアデニンＤＮＡグリコシラーゼII型を作用させる例を示したが、これに限らず、以下の表１に例示するＤＮＡグリコシラーゼあるいはＤＮＡ修復酵素と各塩基を有するヌクレオチドのテーリングとを組み合せても、同様にしてヌクレオチド鎖の３´末端を修飾物質で直接的に修飾できる。 In accordance with this embodiment 1, by tailing the nucleotide (A) having hypoxanthine base, an example of the action of 3-methyl-adenine DNA glycosyl La over peptidase II, not limited thereto, the following table be combined DNA glycosyl La over peptidase or DNA repair enzymes exemplified in 1 and the tailing of nucleotides with the nucleotide can be directly modifying the 3'-end of the nucleotide chain with a modifier material in the same manner.

目的とするヌクレオチド鎖が化学合成可能な数十ヌクレオチド鎖長のものであれば、予め特定の塩基の配列を有するヌクレオチド鎖を合成しておくことで、第１段階の反応を省略することも可能である。
（実施の形態２）
本発明の実施の形態２を図２に基づいて説明する。図中、ｍは、０または任意の自然数を表わし、Ｂａｓｅは、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル等の任意の塩基を示す。

If the target nucleotide chain has a length of several tens of nucleotides that can be chemically synthesized, the first step reaction can be omitted by synthesizing a nucleotide chain having a specific base sequence in advance. It is.
(Embodiment 2)
A second embodiment of the present invention will be described with reference to FIG. In the figure, m represents 0 or an arbitrary natural number, and Base represents an arbitrary base such as adenine, guanine, cytosine, thymine, uracil.

フルオレセインのほかに、アミノ基を有するテキサスレッド、ローダミン、Ｃｙ３・Ｃｙ５に代表されるシアニン系化合物、ジゴギシゲニン、ビオチン等を用いて同様に、ラベル化、標識化することが可能である。 In addition to fluorescein, labeling and labeling can be carried out in the same manner using amino acids-containing Texas red, rhodamine, cyanine compounds represented by Cy3 / Cy5, digigosigenin, biotin and the like.

これは、テーリングしたヒポキサンチンのヌクレオチド鎖部分にオリゴデオキシシトシンがランダムにアニールするため、部分的に２本鎖が形成されず、３−メチルアデニンＤＮＡグリコシラーゼII型が作用しない箇所が存在してしまうためである。 This is because the nucleotide chain portion of hypoxanthine were tailing oligodeoxynucleotides cytosine anneal randomly partially without 2 strand is formed, 3-methyl adenine DNA glycosyl La chromatography locations peptidase II type does not act exists It is because it will do.