JP2004219346A - 犬下痢症ウイルス抗原検出用キット - Google Patents
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Abstract
【課題】臨床の場面での簡便かつ迅速な診断に使用可能な犬下痢症ウィルス抗原検出用キットであるＣＣＶ感染症の診断キットを提供する。
【解決手段】（１）多孔質キャリアに検体滴下部位、標識抗体含有部位、抗原検出部位及び反応終了判定部位とを順次形成し、（２）標識抗体含有部位には多孔質キャリア上を抗原検出部位から反応終了判定部位へと順次移動し得るイヌコロナウイルス抗原特異的標識抗体を含有し、抗原検出部位にはイヌコロナウイルス抗原特異的抗体を固相化し、反応終了判定部位には標識抗体として使用した動物種の免疫グロブリンタンパク質特異的抗体を固相化し、（３）検体を検体滴下部位に滴下することにより、検体中の該イヌコロナウイルス抗原を検出する。
【選択図】 なし
【解決手段】（１）多孔質キャリアに検体滴下部位、標識抗体含有部位、抗原検出部位及び反応終了判定部位とを順次形成し、（２）標識抗体含有部位には多孔質キャリア上を抗原検出部位から反応終了判定部位へと順次移動し得るイヌコロナウイルス抗原特異的標識抗体を含有し、抗原検出部位にはイヌコロナウイルス抗原特異的抗体を固相化し、反応終了判定部位には標識抗体として使用した動物種の免疫グロブリンタンパク質特異的抗体を固相化し、（３）検体を検体滴下部位に滴下することにより、検体中の該イヌコロナウイルス抗原を検出する。
【選択図】 なし
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は犬のウイルス性下痢症の診断に関するものであり、犬の下痢症の原因ウイルスであるイヌコロナウイルス（以下、「ＣＣＶ」と記載することがある）、又はＣＣＶ並びにイヌパルボウイルス（以下、「ＣＰＶ」と記載することがある）の両者を高感度かつ特異的に、しかも簡便かつ迅速に検出することの出来る犬下痢症ウイルス抗原検出用キットおよび該キットを用いた犬ウイルス性下痢症の診断法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
【非特許文献１】Ｔｕｃｈｉｙａら（１９９１） Ｖｅｔ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２６： ４１−５１
【非特許文献２】Ｒｉｍｍｅｌｚｗａａｎら（１９９１） Ｖｅｔ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２６： ２５−４０
【非特許文献３】Ｐｒａｔｅｌｌｉら （１９９９） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ８０： １１−５
【非特許文献４】Ｐｒａｔｅｌｌｉら （２０００）Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ８４： ９１−４
【非特許文献５】Ｎａｙｌｏｒら （２００１） Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ３９： １０３６−４１
【０００３】
従来、ＣＣＶの検出法には、エライザ法を応用した方法（非特許文献１、非特許文献２）とＰＣＲ法（非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５）を応用した方法が知られているのみである。しかし、これらの方法は、特殊な機器を必要とし、手技が繁雑で結果の判定に熟練を要するなどの問題があり、犬の下痢症の迅速診断を必要とする臨床の場面には適当なものではない。また、ＣＰＶのみを迅速に検出する方法はすでに知られているが、該方法により陰性の結果を得た場合に、臨床症状が酷似するＣＣＶ感染症であるか否かの検査結果は依然として得られず、原因が不明のまま治療にあたらなければならない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
犬の下痢症の診断においては、臨床症状が酷似しており、治療が遅れた場合に致死となる可能性のある２大ウイルス性下痢症である、ＣＣＶ感染症とＣＰＶ感染症の治療方針を立て、かつ予防措置を講じるために迅速かつ簡便な診断キットが必要とされている。本発明は、特殊な機器及び熟練した技術を必要とせず臨床の場面での簡便かつ迅速な診断に使用可能な犬下痢症ウイルス抗原検出用キットである、ＣＣＶ感染症の診断キット及びＣＣＶ感染症とＣＰＶ感染症の鑑別診断キットの提供を目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上記目的を達成するためになされたものであって、各方面から検討の結果、免疫学的手法であるサンドイッチ法を多孔質キャリア上で実施することによって上述した技術課題を解決するのにはじめて成功したものである。
【０００６】
すなわち、本発明による課題解決の第一の手段は、ＣＣＶ抗原を検出するキットの提供である。
【０００７】
すなわち、
（１）多孔質キャリアに、検体滴下部位、標識抗体含有部位、抗原検出部位及び反応終了判定部位とを順次形成してなり、（２）標識抗体含有部位には湿潤状態において多孔質キャリア上を抗原検出部位から反応終了判定部位へと順次移動し得るＣＣＶ抗原特異的標識抗体（以下、「標識抗体Ｉ」と記載することがある）を含有せしめ、抗原検出部位にはＣＣＶ抗原特異的抗体（以下、「抗体ＩＩ」と記載することがある）を固相化し、反応終了判定部位には標識抗体として使用した動物種の免疫グロブリンタンパク質特異的抗体（以下、「抗体ＩＩＩ」と記載することがある）を固相化し、（３）もって、検体を検体滴下部位に滴下することにより、検体を多孔質キャリア内で移動せしめて、標識抗体Ｉを溶出させ、抗体ＩＩを固相化した抗原検出部位及び抗体ＩＩＩを固相化した反応終了判定部位を通過せしめることにより、検体中の該ＣＣＶ抗原を検出すること、を特徴とする犬下痢症ウイルス抗原検出用キットを提供することにより、ＣＣＶ抗原の簡便かつ迅速な検出を可能にすることである。以下、該検出用キットの要件を詳述する。
【０００８】
該検出用キットは、ＣＣＶ抗原に対するサンドイッチアッセイを多孔質キャリア上で行う方法（イムノクロマト法）を測定原理として利用するものである。該キットでは、ＣＣＶの全てのタンパク質が検出抗原となり得るが、好ましくは該ウイルスのヌクレオカプシドタンパク質（以下、ＣＣＶ−Ｎと記載することがある）を検出抗原として本キットを作製した場合に、該キットの検出感度を最大限に発揮させることができる。しかし、本発明の該検出用キットの検出抗原は、ＣＣＶ−Ｎに限られるものではなく、該ウイルスのＳタンパク質、Ｍタンパク質など該ウイルスにコードされるタンパク質であれば、本キットの検出抗原となりうる。
【０００９】
該キットにおける標識抗体Ｉを作製する抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれでもＣＣＶ抗原に特異的であれば使用できる。該抗体として該ウイルスヌクレオカプシドタンパク質に特異的な抗体を使用することにより、該キットの感度を最大限に発揮させることができる。また、該標識抗体Ｉがモノクローナル抗体を標識して作製されることにより、該キットの特異性を高めることができる。すなわち、標識抗体Ｉの最も好ましい実施態様は、ＣＣＶ−Ｎに特異的なモノクローナル抗体を使用することであるが、本発明は、これに限定されるものではない。該標識抗体は、例えば、着色ラテックス粒子、磁気ビーズ等の合成高分子、ゼラチン等の天然高分子、又は金コロイド等の金属高分子等で標識し、イムノクロマト法に使用することが可能である。反応を直接、可視的に検出する場合には金コロイドによる標識をその最も好適な例としてあげることができるが、これに限定されるものではない。
【００１０】
また、ＣＣＶ抗原を検出する該キットにおいて、抗原検出部位に固相化する抗体（抗体ＩＩ）においてもポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれでもＣＣＶ抗原に特異的であれば使用できる。該ウイルスヌクレオカプシドタンパク質を被検出抗原として該タンパク質に特異的な標識抗体Ｉを使用したキットを作製する場合、抗体ＩＩも該タンパク質に対して特異的な抗体分画を含むポリクローナル抗体を固相化することにより、該キットの検出感度を最大限に発揮させることができ、該抗体の使用をその最も好適な例としてあげることができるが、本発明は、これに限られるものではない。
【００１１】
反応終了判定部位には標識抗体Ｉとして使用した動物種の免疫グロブリンタンパク質に特異的な抗体（抗体ＩＩＩ）を固相化するが、該抗体はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれでも使用できる。
【００１２】
これらの抗体を多孔質キャリアに順次含有せしめて、犬下痢症ウイルス抗原検出用キットを構成する。多孔質キャリアの材質としては、市販の濾紙、ナイロン、ニトロセルロース、ポリビニリデンジフルオライドやガラスファイバー濾紙などを使用できる。上記のほか、ポリプロピレン、ポリエチレン、フッ化ポリビニリデン、エチレン酢酸ビニル、アクリルニトリル、ポリテトラフルオロエチレンのような合成高分子を多孔質化した多孔質プラスチックも使用することができる。
【００１３】
本キットの使用により、特殊な技術、装置及び施設を必要とせず、簡便かつ迅速にＣＣＶ感染症を診断することが可能となる。
【００１４】
さらに本発明による課題解決の第二の手段は、ＣＣＶ及びＣＰＶ抗原を同時に検出するキットの提供である。本キットの使用により、犬の主要なウイルス性下痢症の原因であるであるＣＣＶ及びＣＰＶの抗原検出を、一回の操作で行うことが出来、両感染症の鑑別診断が可能となり、より容易に、検査結果を得ることができる。本キットは、本発明の第一の手段で詳述した犬下痢症ウイルス抗原検出用キットを発展させたキットであり、同一検出用キット上で両ウイルス抗原を検出することが可能であることを見出し、本発明の第二の検出用キットを完成させるに至った。
【００１５】
すなわち、（１）多孔質キャリアに、検体滴下部位、標識抗体含有部位、抗原検出部位及び反応終了判定部位とを順次形成してなり、（２）標識抗体含有部位には湿潤状態において多孔質キャリア上を抗原検出部位から反応終了判定部位へと順次移動し得る、ＣＣＶ抗原特異的標識抗体（標識抗体Ｉ）及びＣＰＶ抗原特異的標識抗体（以下、「標識抗体ＩＶ」と記載することがある）を含有せしめ、抗原検出部位にはＣＣＶ抗原特異的抗体（抗体ＩＩ）及びＣＰＶ抗原特異的抗体（以下、「抗体Ｖ」と記載することがある）を固相化し、反応終了判定部位には、標識抗体として使用した動物種の免疫グロブリンタンパク質特異的抗体（抗体ＩＩＩ）を固相化し、（３）もって、検体を検体滴下部位に滴下することにより、検体を多孔質キャリア内で移動せしめて、標識抗体Ｉ及びＩＶを溶出させ、抗体ＩＩ及びＶを固相化した抗原検出部位及び抗体ＩＩＩを固相化した反応終了判定部位を通過せしめることにより、検体中の該ＣＣＶ抗原及び該ＣＰＶ抗原を検出すること、を特徴とする犬下痢症ウイルス抗原検出用キットを提供することにより、同一検体から両抗原を、迅速、簡便、かつ同時に検出することを可能にするものである。以下、該検出用キットの要件を詳述する。
【００１６】
該キットのＣＣＶ抗原検出のための要件については、イヌコロナウイルス抗原のみを検出するキットの項で詳述した事項が本キットにも当てはまる。
【００１７】
該キットのＣＰＶ抗原検出のための要件において、用いる標識抗体ＩＶは、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれでもＣＰＶ抗原に特異的であれば使用できる。該ウイルス粒子表面タンパク質に特異的なモノクローナル抗体を標識して使用することにより、該キットの特異性を最大限に発揮させることができ、該モノクローナル抗体の使用をその最も好適な例としてあげることができるが、これに限定されるものではない。該標識抗体ＩＶは、例えば、着色ラテックス粒子、磁気ビーズ等の合成高分子、ゼラチン等の天然高分子、又は金コロイドなどの金属高分子で標識し、イムノクロマト法に使用することが可能である。反応を直接、可視的に検出する場合には金コロイドによる標識をその最も好適な例としてあげることができるが、これに限定されるものではない。
【００１８】
また、抗原検出部位に固相化する抗体（抗体Ｖ）はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれでもＣＰＶ抗原に特異的であれば使用できる。該ウイルス粒子表面タンパク質を検出抗原とし、該抗原に対して特異的な抗体分画を含むポリクローナル抗体を固相化することにより、該キットの検出感度を最大限に発揮させることができ、該抗体の使用をその最も好適な例としてあげることができるが、これに限定されるものではない。
【００１９】
反応終了判定部位には標識抗体として使用した動物種の免疫グロブリンタンパク質に特異的な抗体（抗体ＩＩＩ）を固相化するが、該抗体はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれでも使用できる。
【００２０】
これらの抗体を多孔質キャリアに順次含有せしめて、犬下痢症ウイルス抗原検出用キットを構成する。該キットの多孔質キャリアの要件については、犬コロナウイルス抗原のみを検出するキットの項で詳述した事項が本キットにも当てはまる。
【００２１】
本キットの使用により、一回の操作でＣＣＶ感染症とＣＰＶ感染症を迅速に診断することが可能となる。なお、当業者にとって、同様の構成により検出用キットに新たに、イヌロタウイルス等の検出部位を加えていくことは容易なことである。
【００２２】
【発明の実施の形態】
請求項１に係る本発明は、「犬下痢症ウイルス抗原を検出するキットであり、（１）多孔質キャリアに、検体滴下部位、標識抗体含有部位、抗原検出部位及び反応終了判定部位とを順次形成してなり、（２）標識抗体含有部位には湿潤状態において多孔質キャリア上を抗原検出部位から反応終了判定部位へと順次移動し得る該ＣＣＶ抗原特異的標識抗体（標識抗体Ｉ）を含有せしめ、抗原検出部位には該ＣＣＶ抗原特異的抗体（抗体ＩＩ）を固相化し、反応終了判定部位には標識抗体として使用した動物種の免疫グロブリンタンパク質特異的抗体（抗体ＩＩＩ）を固相化し、（３）もって、検体を検体滴下部位に滴下することにより、検体を多孔質キャリア内で移動せしめて、標識抗体Ｉを溶出させ、抗体ＩＩを固相化した抗原検出部位及び抗体ＩＩＩを固相化した反応終了判定部位を通過せしめることにより、検体中の該ＣＣＶ抗原を検出すること、を特徴とする犬下痢症ウイルス抗原検出用キット」としたものであり、本キットの使用によりＣＣＶ感染症を、特殊な技術、装置及び施設を必要とせずしかも、簡便かつ迅速に診断できるという作用を有する。
【００２３】
本キットを作製するにあたって必要とされるＣＣＶポリクローナル抗体はＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ （１９８８， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ編）に記載される方法に従って精製ＣＣＶをウサギ、ヤギなどの各種動物に免疫することにより得ることができる。精製ＣＣＶはＭａｋｉｎｏらの方法（Ｍａｋｉｎｏら（１９８３）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２７：４４５−４５４、Ｍａｋｉｎｏら（１９８４）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １３３：９−１７）により、例えばＣＣＶ１−７１株感染ＣＲＦＫ細胞の培養上清からショ糖密度勾配遠心法を用いて調製することができる。あるいは、ヌクレオカプシドタンパク質に対する抗体のみを得る目的で、同タンパク質をバキュロウイルスあるいは大腸菌などを用いた発現系で大量に発現させ、これを抗原としてポリクローナル抗体を得ることも可能である。
【００２４】
また、同ウイルスに対するモノクローナル抗体についても、精製ＣＣＶをマウスに免疫した後、同じくＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ （１９８８， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ編）に記載される方法に従い、ＣＣＶ抗原タンパク質に対する抗体を産生するハイブリドーマをクローニングすることにより得ることができる。得られたモノクローナル抗体の特異性については、エライザ法、ウェスタンブロッティング法や、ウイルスゲノムにコードされた各タンパク質の発現産物に対する反応性を調べることにより決定することができる。
【００２５】
得られた抗体の標識に使用する担体粒子は着色ラテックス粒子、磁気ビーズ等の合成高分子、ゼラチン等の天然高分子、又は金コロイド等の金属高分子を好適なものとして例示することができる。担体粒子は、肉眼での判定を行う場合には着色されていることが望ましく、この点で、金属高分子のコロイド粒子や着色ラテックス粒子は、色調を有するため有利である。抗体の標識法については、標識物である担体粒子を製造するメーカーがおのおの提供するマニュアルに沿って標識することができ、当業者にとっては自明の技術である。担体粒子により標識された抗体は、コロイド化学的安定性の向上、又は膜及び検体との非特異的な結合を防止する目的で、０．０５％から５％程度のＢＳＡ等を含有した緩衝液中に懸濁して保管することが望ましい。
【００２６】
これら抗体を、多孔質キャリア上に例えば図１に示すごとく配置して、本キットを作製する。すなわち、多孔質キャリアの標識抗体含有部位にはＣＣＶ抗原特異的標識抗体Ｉを含有せしめ、抗原検出部位にはＣＣＶ抗原特異的抗体（抗体ＩＩ）を固相化し、反応終了判定部位には標識抗体として使用した動物種の免疫グロブリンタンパク質特異的抗体（抗体ＩＩＩ）を固相化し、膜を短冊状（例えば、幅５〜２０ｍｍ、長さ約５０ｍｍ程度）に裁断し、裁断した膜を同一の大きさの支持体（例えば、プラスチック等）に固定する。裁断した短冊の反応終了判定部位側の片端に適当な大きさの吸収材を配置すると、検体の展開を容易にする機能を有しており、有利である。さらに検体滴下部位を配置して本キットを構成する。なお、本キットにおいては標識抗体含有部位と検体滴下部位は、同一であってもかまわない。支持体への各部材の固定には、接着剤、粘着テープ等を用いることができる。
【００２７】
多孔質キャリアの材質としては、市販の濾紙、ナイロン、ニトロセルロース、ポリビニリデンジフルオライドやガラスファイバー濾紙などの天然又は合成高分子のいずれも使用できる。また、ＣＣＶ抗原特異的抗体（抗体ＩＩ）の膜への固定方法としては、物理吸着法、化学結合（共有結合）法、その他いずれの方法も使用することができる。即ち、ＣＣＶ抗体が膜より脱離しなければどのような材質を用いることも可能である。抗体ＩＩ固定膜は、検体又は標識抗体Ｉとの非特異的な吸着を防止するために、０．０５から５％程度のＢＳＡ等でブロッキング処理を行い、乾燥条件下で保存することが望ましい。
【００２８】
使用にあたっては、被検動物である犬から採取した糞便を緩衝液に懸濁し、この適当量を、本キットの検体滴下部位に滴下する。滴下された検体は標識抗体Ｉを含有する部位に到達し、検体中にＣＣＶ抗原が存在する場合、これと標識抗体Ｉとの免疫複合体が形成される。該免疫複合体は毛細管現象により緩衝液とともに濾紙等の多孔質キャリア上に展開され、抗体ＩＩが固相化された抗原検出部位に到達し、該免疫複合体の大部分は該部位で抗体ＩＩに捕捉される。もし、検体中にＣＣＶ抗原が存在しない場合は、フリーの標識抗体Ｉとしてこの部位に捕捉されず通過する。一部の免疫複合体あるいはフリーの標識抗体Ｉは抗原検出部位を通り抜け、反応終了判定部位に到達し、免疫複合体の形成の有無にかかわらず、標識抗体Ｉが捕捉されて蓄積し、試験終了の反応が現れる。本キットにおいては検体滴下後、１０〜１５分間室温に静置することによりこの反応が現れる。この反応は、金コロイド標識抗体を用いた場合は、赤紫色の発色として出現する。反応終了判定部位に反応が現れた時点で、抗原検出部位に発色反応が現れた場合はＣＣＶ抗原陽性、現れない場合は陰性と判定し、ＣＣＶ抗原陽性の場合、被検動物（犬）はＣＣＶ感染症と診断される。
【００２９】
更に、該抗原検出用キットにおいて、図１に示したＣＣＶ抗原特異的標識抗体Ｉを含有せしめた標識抗体含有部位は、これを除いて本キットを構築することも可能である。このような形態のキットにおいては、標識抗体Ｉと緩衝液に懸濁した検体とをあらかじめ試験管内で混合した後に検体滴下部位に該混合液を滴下し、上記と同様に反応を待ち、抗原の有無を判定することができる。
【００３０】
本発明の請求項２に記載の発明は、「犬下痢症ウイルス抗原を検出するキットであり、（１）多孔質キャリアに、検体滴下部位、標識抗体含有部位、抗原検出部位及び反応終了判定部位とを順次形成してなり、（２）標識抗体含有部位には湿潤状態において多孔質キャリア上を抗原検出部位から反応終了判定部位へと順次移動し得る、ＣＣＶ抗原特異的標識抗体（標識抗体Ｉ）及びＣＰＶ抗原特異的標識抗体（標識抗体ＩＶ）を含有せしめ、抗原検出部位にはＣＣＶ抗原特異的抗体（抗体ＩＩ）及びＣＰＶ抗原特異的抗体（抗体Ｖ）を固相化し、反応終了判定部位には、標識抗体として使用した動物種の免疫グロブリンタンパク質特異的抗体（抗体ＩＩＩ）を固相化し、（３）もって、検体を検体滴下部位に滴下することにより、検体を多孔質キャリア内で移動せしめて、標識抗体Ｉ及びＩＶを溶出させ、抗体ＩＩ及びＶを固相化した抗原検出部位及び抗体ＩＩＩを固相化した反応終了判定部位を通過せしめることにより、検体中の該ＣＣＶ抗原及び該ＣＰＶ抗原を検出すること、を特徴とする犬下痢症ウイルス抗原検出用キット」としたものであり、本キットの使用によりＣＣＶ感染症及びＣＰＶ感染症を、特殊な機器及び熟練した技術を必要とせず、しかも簡便かつ迅速に診断できるという作用を有する。
【００３１】
本キットにおいて必要とされるＣＣＶ抗原検出のための抗体は、イヌコロナウイルス抗原のみを検出するキットを組み立てるために作製される抗体を使用することができる。
【００３２】
本キットを作製するにあたって、さらに必要とされるＣＰＶポリクローナル抗体はＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ （１９８８， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ編）に記載される方法に従って精製ＣＰＶをウサギ、ヤギなどの各種動物に免疫することにより得ることができる。精製ＣＰＶは例えば、ＣＰＶＣｐ−４９株感染ＣＲＦＫ細胞の培養上清から塩化セシウム密度勾配遠心法を用いて調製することができる。
【００３３】
また、同ウイルスに対するモノクローナル抗体についても、精製ＣＰＶをマウスに免疫した後、同じくＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ （１９８８， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ編）に記載される方法に従い、ＣＰＶ抗原タンパク質に対する抗体を産生するハイブリドーマをクローニングすることにより得ることができる。得られたモノクローナル抗体の特異性については、エライザ法やウェスタンブロッティング法、ウイルスゲノムにコードされた各タンパク質の発現産物に対する反応性、あるいはウイルス中和活性や赤血球凝集抑制活性により決定することができる。
【００３４】
抗体の標識については、ＣＣＶ抗原のみを検出するキットの作製法の項で詳述した方法を準用することができる。
【００３５】
これら抗体を、多孔質キャリア上に例えば図２に示すごとく配置して、本キットを作製する。すなわち、多孔質キャリアの標識抗体含有部位にはＣＣＶ抗原特異的標識抗体Ｉ及びＣＰＶ抗原特異的標識抗体ＩＶの両者を含有せしめ、抗原検出部位には、ＣＣＶ抗原特異的抗体（抗体ＩＩ）及びＣＰＶ抗原特異的抗体（抗体Ｖ）を固相化し、反応終了判定部位には標識抗体として使用した動物種の免疫グロブリンタンパク質特異的抗体（抗体ＩＩＩ）を固相化し、膜を短冊状（例えば、幅５〜２０ｍｍ、長さ約５０ｍｍ程度）に裁断し、裁断した膜を同一の大きさの支持体（例えば、プラスチック等）に固定する。裁断した短冊の反応終了判定部位側の片端に適当な大きさの吸収材を配置すると、検体の展開を容易にする機能を有しており、有利である。さらに検体滴下部位を配置して本キットを構成する。なお、本キットにおいては標識抗体含有部位と検体滴下部位は、同一であってもかまわない。支持体への各部材の固定には、接着剤、粘着テープ等を用いることができる。
【００３６】
本キットにおけるそれぞれの標識抗体は同一の物質、例えば金コロイドあるいは着色ラテックス粒子などで標識してもよく、両者を異なった標識物質、例えば一方を金コロイド、他方を着色ラテックス粒子で標識してもよい。抗原検出部位の２つの抗体（抗体ＩＩ及び抗体Ｖ）は、これらを該部位内で位置をずらして、あるいはさらに固相化の形状に違い（例えば、線状と点状）を持たせてそれぞれ固相化することにより、ＣＣＶ抗原検出部位とＣＰＶ抗原検出部位を区別させ抗原検出部位における発色等の反応の位置あるいは形状の違いから検体にはどちらの抗原を含んでいるか、あるいは両方の抗原を含んでいるか否かを容易に判定でき、有利である。ＣＣＶ抗原特異的標識抗体ＩとＣＰＶ抗原特異的標識抗体ＩＶとして使用した免疫グロブリンタンパク質の動物種が異なる場合は、いずれか一方の動物種の免疫グロブリンタンパク質特異的抗体（抗体ＩＩＩ）を反応終了判定部位に固相化することにより、該部位を形成することができるが、両動物種の免疫グロブリンタンパク質特異的抗体（抗体ＩＩＩ）を該部位に固相化してもよい。
【００３７】
多孔質キャリアの材質としては、市販の濾紙、ナイロン、ニトロセルロース、ポリビニリデンジフルオライドやガラスファイバー濾紙などの天然又は合成高分子のいずれも使用できる。また、ＣＣＶ抗体ＩＩの膜への固定方法としては、物理吸着法、化学結合（共有結合）法、その他いずれの方法も使用することができる。即ち、ＣＣＶ抗体が膜より脱離しなければどのような材質を用いることも可能である。ＣＣＶ抗体固定膜は、検体又は標識抗体Ｉとの非特異的な吸着を防止するために、０．０５から５％程度のＢＳＡ等でブロッキング処理を行い、乾燥条件下で保存することが望ましい。
【００３８】
抗原検出法は、ＣＣＶ抗原検出用キットの方法と同様であり、本キットの特徴はＣＣＶ抗原とＣＰＶ抗原検出を同一のキット上で行うところにある。本発明のキットを使用することにより、一回の操作で両抗原の存在の有無を判定することが可能となる。
【００３９】
使用にあたっては、検体を緩衝液に懸濁して本キットの検体滴下部位に滴下し、１０〜１５分間室温に静置することにより反応終了判定部位に反応が現れるのを待つ。この反応は、金コロイド標識抗体を用いた場合は、赤紫色の発色として出現する。反応終了判定部位に反応が現れた時点で、抗原検出部位のＣＣＶ抗原検出部位に同様の反応が現れた場合はＣＣＶ抗原陽性、ＣＰＶ抗原検出部位に同様の反応が現れた場合はＣＰＶ抗原陽性、両検出部位に同様の反応が現れた場合はＣＣＶ抗原およびＣＰＶ抗原陽性、両検出部位に反応が現れない場合はＣＣＶ抗原およびＣＰＶ抗原陰性と判定する。診断にあたっては、被検動物は抗原陽性であったウイルスの感染症と判定される。
【００４０】
更に、該抗原検出用キットにおいて、図２に示したＣＣＶ抗原特異的標識抗体Ｉ及びＣＰＶ抗原特異的標識抗体ＩＶを含有せしめた標識抗体含有部位は、これを除いて本キットを構築することも可能である。このような形態のキットにおいては、標識抗体Ｉ及びＩＶと緩衝液に懸濁した検体とをあらかじめ試験管内で混合した後に検体滴下部位に該混合液を滴下し、上記と同様に反応を待ち、抗原の有無を判定することができる。
【００４１】
【実施例】
以下、本発明の犬下痢症ウイルス抗原検出用キットが実際に非常に有用であることを下記の調製例及び実施例に沿ってさらに詳細に説明するが、本発明は、以下の調製例及び実施例によりなんら限定されるものではない。調製例では、本発明の抗原検出用キットを作製するために必要な各抗体の作製例を、そして実施例では、これら抗体を用いた抗原検出用キットの作製例ならびにその応用例を示す。
【００４２】
調製例１：抗ＣＣＶポリクローナル抗体の調製
免疫原であるＣＣＶは以下のように調製した。すなわち、ＣＣＶ １−７１株感染ＣＲＦＫ細胞の培養上清に２．２％の塩化ナトリウム及び６．５％のポリエチレングリコール＃６０００を添加した後遠心分離により析出物を回収することにより粗精製ＣＣＶを得、更にこれから不連続ショ糖密度勾配遠心法により３０％（Ｗ／Ｗ）ショ糖と６０％（Ｗ／Ｗ）ショ糖との間に集積する精製ＣＣＶ分画を調製した。ウサギ１羽あたり、１００μｇの精製ＣＣＶをＦｒｅｕｎｄの完全アジュバントとともに皮下に接種し、更に３週間隔で２回、Ｆｒｅｕｎｄの不完全アジュバントとともに皮下に追加接種した。その後３週間以上の間隔をあけてウサギ静脈内に精製ＣＣＶを接種し、接種後１０日以内にウサギ血清を抗ＣＣＶポリクローナル抗体として得た。得られた血清からプロテインＧカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィー（アマシャムファルマシア社製）により抗ＣＣＶ抗体含有分画を精製した。
【００４３】
調製例２：抗ＣＣＶ−Ｎモノクローナル抗体の調製
マウス１匹あたり、調製例１において調製した１００μｇの精製ＣＣＶをＦｒｅｕｎｄの完全アジュバントとともに皮下に接種し、更に３週間隔で２回、Ｆｒｅｕｎｄの不完全アジュバントとともに皮下に追加接種した。その後３週間以上の間隔をあけてマウス腹腔内に精製ＣＣＶを接種し、３日後に脾臓を摘出した。その脾細胞をマウスミエローマ細胞と融合させ、スクリーニング及びクローニングにより抗ＣＣＶ−Ｎ抗体産生ハイブリドーマを得た。この抗ＣＣＶ−Ｎ抗体産生ハイブリドーマを、プリスタン（シグマ社製）投与後１０日目のＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内に移入し、約１０日後に腹水を採取した。得られた腹水からプロテインＧカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィー（アマシャムファルマシア社製）により抗ＣＣＶ−Ｎモノクローナル抗体を精製した。
【００４４】
調製例３：抗マウスイムノグロブリンポリクローナル抗体の調製
ウサギ１羽あたり、１００μｇの市販のマウスイムノグロブリンＧ（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社）をＦｒｅｕｎｄの完全アジュバントとともに皮下に接種し、更に３週間隔で２回、Ｆｒｅｕｎｄの不完全アジュバントとともに皮下に追加接種した。その後３週間以上の間隔をあけてウサギ静脈内にマウスイムノグロブリンＧを接種し、接種後１０日以内にウサギ血清を抗マウスイムノグロブリンポリクローナル抗体として得た。得られた血清からプロテインＧを用いたアフィニティークロマトグラフィー（アマシャムファルマシア社製）により抗マウスイムノグロブリン抗体含有分画を精製した。
【００４５】
調製例４：抗ＣＰＶポリクローナル抗体の調製
免疫原であるＣＰＶは以下のように調製した。すなわち、ＣＰＶ Ｃｐ−４９株感染ＣＲＦＫ細胞の培養上清に２．２％の塩化ナトリウム及び６．５％のポリエチレングリコール＃６０００を添加した後遠心分離により析出物を回収することにより粗精製ＣＰＶを得、更にこれから塩化セシウム密度勾配遠心法により精製ＣＰＶ分画を調製した。ウサギ１羽あたり、１００μｇの精製ＣＰＶをＦｒｅｕｎｄの完全アジュバントとともに皮下に接種し、更に３週間隔で２回、Ｆｒｅｕｎｄの不完全アジュバントとともに皮下に追加接種した。その後３週間以上の間隔をあけてウサギ静脈内に精製ＣＰＶを接種し、接種後１０日以内にウサギ血清を抗ＣＰＶポリクローナル抗体として得た。得られた血清からプロテインＧカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィー（アマシャムファルマシア社製）により抗ＣＰＶ抗体含有分画を精製した。
【００４６】
調製例５：抗ＣＰＶモノクローナル抗体の調製
マウス１匹あたり、調製例４において調製した１００μｇの精製ＣＰＶをＦｒｅｕｎｄの完全アジュバントとともに皮下に接種し、更に３週間隔で２回、Ｆｒｅｕｎｄの不完全アジュバントとともに皮下に追加接種した。その後３週間以上の間隔をあけてマウス腹腔内に精製ＣＰＶを接種し、３日後に脾臓を摘出した。その脾細胞をマウスミエローマ細胞と融合させ、スクリーニング及びクローニングにより抗ＣＰＶ抗体産生ハイブリドーマを得た。この抗ＣＰＶ抗体産生ハイブリドーマを、プリスタン（シグマ社製）投与後１０日目のＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内に移入し、約１０日後に腹水を採取した。得られた腹水からプロテインＧカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィー（アマシャムファルマシア社製）により抗ＣＰＶマウスモノクローナル抗体を精製した。
【００４７】
（実施例１）
本実施例はＣＣＶ抗原を検出するキットの作製及び該キットを用いたＣＣＶ抗原の検出を示す。
【００４８】
１）ＣＣＶ抗原検出用キットの作製
図１に示す抗原検出用キットを以下のように作製した。すなわち、図１の抗体ＩＩとして調製例１で調製した抗ＣＣＶ−Ｎウサギポリクローナル抗体を、抗体ＩＩＩとして調製例３で調製した抗マウスイムノグロブリンポリクローナル抗体を使用した。該抗体をＰＢＳ緩衝液により希釈し、抗体塗布キット（バイオドット社製）を用いて市販のニトロセルロースメンブレン（ミリポア社製）に図１に示すごとく線状に塗布した。十分に乾燥した後、非特異的な吸着を防止するため、１％のＢＳＡを添加したＰＢＳ緩衝液によりブロッキング処理を行い、十分に乾燥させて抗体固定膜を作製した。図１の標識抗体Ｉとして調製例２で調製した抗ＣＣＶ−Ｎモノクローナル抗体を以下のように標識し、使用した。すなわち、ｐＨ９．０に調製した精製ＣＣＶ−Ｎマウスモノクローナル抗体（０．１ｍｇ／ｍＬ）５０μｌを、粒子径４０ｎｍの金コロイド（ブリティッシュ・バイオセル社製）１ｍＬに添加し、常温で５分間撹拌し、次いでｐＨ９．０に調整した１０％ＢＳＡ及び１％ＰＥＧを含む水溶液を１００μｌ添加し、さらに常温で１０分間撹拌した。次いで、遠心分離（４℃、１０，０００ｇ、１５分間）により抗ＣＣＶ−Ｎマウスモノクローナル抗体蛋白質固定金コロイド粒子を集め、１００μｌの１％ＢＳＡ及び０．１％アジ化ナトリウムを含むトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．２）に再懸濁し、ＣＣＶ−Ｎに特異的に結合する金コロイド粒子標識抗体懸濁液を得、ガラス繊維製の吸収膜（ミリポア社製）に固定した。前記抗体固定膜と金コロイド標識抗体Ｉを含むガラス繊維性吸収膜を、図１のごとく幅約５ｍｍ、長さ約５０ｍｍの短冊状に成型した。反応終了判定部位側の片端に、滴下した検体を容易に展開させる目的で、グラスファイバー製吸収材（ミリポア社製）を接着し、抗原検出用キットを完成させた。
【００４９】
２）被検試料
（１）試料番号１〜７：ＣＣＶ実験感染個体から経時的に採取した糞便
（２）試料番号８〜１１：下痢症を呈した個体から採取した糞便
（３）試料番号１２：検体希釈液
【００５０】
３）被検試料からのＲＴ−ＰＣＲ法によるＣＣＶゲノムＲＮＡの検出
被検糞便を１０（Ｗ／Ｖ）％になるようにＰＢＳ緩衝液に溶解し、遠心して得た上清からゲノムＲＮＡを抽出する。ＣＣＶゲノムＲＮＡは、糞便溶解液上清をプロテイナーゼＫ及びソジウムドデシル硫酸存在下で加温処理し、これをフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール溶液（２５：２４：１）により抽出し、取得することができる。
【００５１】
回収されたゲノムＲＮＡを鋳型とし、また、現在までに公知となっている塩基配列［ジャーナル・オブ・ジェネラル・ヴィロロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、第７３巻、第２８４９ページ、１９９２年］を参考にして、２本の合成ＤＮＡプライマー５’−ＧＡＡＣＴＧＧＡＣＣＴＣＡＴＧＣＴＧＡＴ−３’（配列番号１）及び５’−ＣＡＴＴＣＴＴＡＧＧＴＧＴＡＧＴＡＴＣＴＣＴ−３’（配列番号２）を作製し、ＲＴ−ＰＣＲ法によりＣＣＶゲノムＲＮＡの検出を行った。
【００５２】
４）試験結果
この試験の結果は表１に示す通りである。表１から明らかな通り、ＣＣＶ実験感染個体から採取した糞便においては、接種後２日目から６日目までＲＴ−ＰＣＲ法によりＣＣＶゲノムが検出された。これら試料においては、本発明のＣＣＶ抗原を検出する犬下痢症ウイルス抗原検出用キットにより該抗原が検出された。下痢症を呈した個体から採取した糞便においては、ＲＴ−ＰＣＲ法によりＣＣＶゲノムＲＮＡが検出された試料番号８、９で本発明の抗原検出用キットにより該抗原が検出され、ＣＣＶゲノムが検出されない試料番号１０、１１ではＣＣＶ抗原も検出されなかった。
【００５３】
ＲＴ−ＰＣＲ法は感度の高いウイルス検出法とされているが、該方法によるＣＣＶゲノムの検出には検体の調製から結果がでるまでにほぼ１日を要するとともに、ＰＣＲ反応キットを必要とし、かつ熟練した技術が必要であることに比較し、本発明の犬下痢症ウイルス抗原検出用キットを用いた場合は、特殊な装置や熟練した技術を必要とせずに全工程をわずか２０分以内に完了した。以上の試験結果から、本発明のキットは、ＣＣＶ抗原を高感度に検出し、これによりＣＣＶ感染症を的確に診断することが可能となり、しかも簡便かつ迅速に結果を得ることが出来たことから、本発明の抗原検出用キットは、従来にない優れたＣＣＶ抗原検出用キットであることが判明した。
【００５４】
【表１】
【００５５】
（実施例２）
本実施例はＣＣＶ抗原及びＣＰＶ抗原を検出するキットの作製及び該キットを用いたＣＣＶ抗原並びにＣＰＶ抗原の検出を示す。
【００５６】
１）ＣＣＶ抗原及びＣＰＶ抗原検出用キットの作製
図２に示す抗原検出用キットを以下のように作製した。図２の標識抗体Ｉ、抗体ＩＩ、及び抗体ＩＩＩは実施例１で使用した標識抗体あるいは抗体を準用した。標識抗体ＩＶとしては調製例５で調製した抗ＣＰＶモノクローナル抗体を、抗体Ｖとしては調製例４で調製した抗ＣＰＶポリクローナル抗体を使用した。抗体ＩＩ、抗体ＩＩＩ、及び抗体Ｖを図２に示すごとく実施例１と同様の方法でニトロセルロースメンブレンに線状に塗布し、抗体固定膜を作製した。標識抗体ＩＶは、標識抗体Ｉと同様に作製し、同一ガラス繊維製の吸収膜に固定した。前記抗体固定膜と金コロイド標識抗体Ｉを含むガラス繊維性吸収膜を、図２のごとく幅約５ｍｍ、長さ約５０ｍｍの短冊状に成型した。反応終了判定部位側の片端に、滴下した検体を容易に展開させる目的で、グラスファイバー製吸収材（ミリポア社製）を接着し、抗原検出用キットを完成させた。
【００５７】
２）被検試料
（１）試料番号１〜７：ＣＣＶ実験感染個体から経時的に採取した糞便
（２）試料番号８〜１４：ＣＰＶ実験感染個体から経時的に採取した糞便
（３）試料番号１５〜１８：下痢症を呈した個体から採取した糞便
（４）試料番号１９： 検体希釈液
【００５８】
３）被検試料からのＲＴ−ＰＣＲ法によるＣＣＶゲノムＲＮＡの検出
実施例１と同様に行った。
【００５９】
４）被検試料からのＰＣＲ法によるＣＰＶゲノムＤＮＡの検出
被検糞便を１０（Ｗ／Ｖ）％になるようにＰＢＳ緩衝液に溶解し、遠心して得た上清からゲノムＤＮＡを抽出する。ＣＰＶゲノムＤＮＡは、糞便溶解液上清をプロテイナーゼＫ及びソジウムドデシル硫酸存在下で加温処理し、これをフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール溶液（２５：２４：１）により抽出し、取得することができる。
【００６０】
回収されたゲノムＤＮＡを鋳型とし、また、現在までに公知となっている塩基配列［ヴィロロジー・（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、第１４８巻、第１２１ページ、１９８６年］を参考にして、２本の合成ＤＮＡプライマー５’− ＴＧＣＣＡＴＴＴＡＣＴＣＣＡＧＣＡＧＣ−３’（配列番号３）及び５’− ＣＡＴＴＴＧＡＧＴＴＡＣＡＣＣＡＣＧＴＣＴ −３’（配列番号４）を作製し、ＰＣＲ法によりＣＰＶゲノムＲＮＡの検出を行った。
【００６１】
５）試験結果
この試験の結果は表２に示す通りである。表２から明らかな通り、ＣＣＶ実験感染個体から採取した糞便においては、接種後２日目から６日目までＲＴ−ＰＣＲ法によりＣＣＶゲノムが検出された。これら試料においては、本発明のＣＣＶ及びＣＰＶ抗原を検出する犬下痢症ウイルス抗原検出用キットによりＣＣＶ抗原が検出され、ＣＰＶ抗原は陰性であった。下痢症を呈した個体から採取した糞便においては、ＲＴ−ＰＣＲ法によりＣＣＶゲノムＲＮＡが検出された試料番号１５、１６で本発明の抗原検出用キットによりＣＣＶ抗原が検出され、ＣＣＶゲノムが検出されない試料番号１７、１８ではＣＣＶ抗原も検出されなかった。また、ＣＰＶ実験感染個体から採取した糞便においては、接種後２日目から６日目までＰＣＲ法によりＣＰＶゲノムが検出された。これら試料においては、本発明のＣＣＶ及びＣＰＶ抗原検出用キットによりＣＰＶ抗原が検出され、ＣＣＶ抗原は陰性であった。下痢症を呈した個体から採取した糞便においては、ＰＣＲ法によりＣＰＶゲノムＤＮＡが検出された試料番号１７で本発明の抗原検出用キットによりＣＰＶ抗原が検出され、ＣＰＶゲノムが検出されない試料番号１５、１６、１８ではＣＰＶ抗原も検出されなかった。
【００６２】
ＲＴ−ＰＣＲ法及びＰＣＲ法は、感度の高いウイルス検出法とされているが、該方法によるウイルスゲノムの検出には検体の調製から結果がでるまでにほぼ１日を要するとともに、ＰＣＲ反応装置を必要とし、かつ熟練した技術が必要であることに比較し、本発明の抗原検出用キットを用いた場合は、特殊な装置や熟練した技術を必要とせずに全工程をわずか２０分以内に完了した。さらに、該キットの使用により、ＣＣＶとＣＰＶの鑑別も可能であった。以上の試験結果から、本発明のキットは、ＣＣＶ抗原及びＣＰＶ抗原を高感度に検出し、これによりＣＣＶ感染症及びＣＰＶ感染症を的確に診断することが可能となり、しかも簡便かつ迅速に結果を得ることが出来たことから、本発明の抗原検出用キットは、従来にない優れたＣＣＶ及びＣＰＶ検出用キットであることが判明した。
【００６３】
【表２】
【００６４】
【発明の効果】
以上詳記した通り、本発明は、新規な犬のウイルス性下痢症の診断キットに関するものであり、本発明によれば、次のような効果が奏される。
１）特殊な機器及び熟練した技術を必要とすることなく、検体（糞便）の採取現場において簡便かつ迅速にイヌコロナウイルス感染症を診断することが可能となる。
２）特殊な機器及び熟練した技術を必要とすることなく、検体（糞便）の採取現場において簡便、迅速、かつ同時にイヌコロナウイルス感染症とイヌパルボウイルス感染症を鑑別診断することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の一実施の形態によるイヌコロナウイルス抗原を検出する犬下痢症ウイルス抗原検出用キットを示す平面図。
【図２】本発明の一実施の形態によるイヌコロナウイルス抗原及びイヌパルボウイルス抗原を検出する犬下痢症ウイルス抗原検出用キットを示す平面図。
【配列表】
【発明の属する技術分野】
本発明は犬のウイルス性下痢症の診断に関するものであり、犬の下痢症の原因ウイルスであるイヌコロナウイルス（以下、「ＣＣＶ」と記載することがある）、又はＣＣＶ並びにイヌパルボウイルス（以下、「ＣＰＶ」と記載することがある）の両者を高感度かつ特異的に、しかも簡便かつ迅速に検出することの出来る犬下痢症ウイルス抗原検出用キットおよび該キットを用いた犬ウイルス性下痢症の診断法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
【非特許文献１】Ｔｕｃｈｉｙａら（１９９１） Ｖｅｔ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２６： ４１−５１
【非特許文献２】Ｒｉｍｍｅｌｚｗａａｎら（１９９１） Ｖｅｔ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２６： ２５−４０
【非特許文献３】Ｐｒａｔｅｌｌｉら （１９９９） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ８０： １１−５
【非特許文献４】Ｐｒａｔｅｌｌｉら （２０００）Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ８４： ９１−４
【非特許文献５】Ｎａｙｌｏｒら （２００１） Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ３９： １０３６−４１
【０００３】
従来、ＣＣＶの検出法には、エライザ法を応用した方法（非特許文献１、非特許文献２）とＰＣＲ法（非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５）を応用した方法が知られているのみである。しかし、これらの方法は、特殊な機器を必要とし、手技が繁雑で結果の判定に熟練を要するなどの問題があり、犬の下痢症の迅速診断を必要とする臨床の場面には適当なものではない。また、ＣＰＶのみを迅速に検出する方法はすでに知られているが、該方法により陰性の結果を得た場合に、臨床症状が酷似するＣＣＶ感染症であるか否かの検査結果は依然として得られず、原因が不明のまま治療にあたらなければならない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
犬の下痢症の診断においては、臨床症状が酷似しており、治療が遅れた場合に致死となる可能性のある２大ウイルス性下痢症である、ＣＣＶ感染症とＣＰＶ感染症の治療方針を立て、かつ予防措置を講じるために迅速かつ簡便な診断キットが必要とされている。本発明は、特殊な機器及び熟練した技術を必要とせず臨床の場面での簡便かつ迅速な診断に使用可能な犬下痢症ウイルス抗原検出用キットである、ＣＣＶ感染症の診断キット及びＣＣＶ感染症とＣＰＶ感染症の鑑別診断キットの提供を目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上記目的を達成するためになされたものであって、各方面から検討の結果、免疫学的手法であるサンドイッチ法を多孔質キャリア上で実施することによって上述した技術課題を解決するのにはじめて成功したものである。
【０００６】
すなわち、本発明による課題解決の第一の手段は、ＣＣＶ抗原を検出するキットの提供である。
【０００７】
すなわち、
（１）多孔質キャリアに、検体滴下部位、標識抗体含有部位、抗原検出部位及び反応終了判定部位とを順次形成してなり、（２）標識抗体含有部位には湿潤状態において多孔質キャリア上を抗原検出部位から反応終了判定部位へと順次移動し得るＣＣＶ抗原特異的標識抗体（以下、「標識抗体Ｉ」と記載することがある）を含有せしめ、抗原検出部位にはＣＣＶ抗原特異的抗体（以下、「抗体ＩＩ」と記載することがある）を固相化し、反応終了判定部位には標識抗体として使用した動物種の免疫グロブリンタンパク質特異的抗体（以下、「抗体ＩＩＩ」と記載することがある）を固相化し、（３）もって、検体を検体滴下部位に滴下することにより、検体を多孔質キャリア内で移動せしめて、標識抗体Ｉを溶出させ、抗体ＩＩを固相化した抗原検出部位及び抗体ＩＩＩを固相化した反応終了判定部位を通過せしめることにより、検体中の該ＣＣＶ抗原を検出すること、を特徴とする犬下痢症ウイルス抗原検出用キットを提供することにより、ＣＣＶ抗原の簡便かつ迅速な検出を可能にすることである。以下、該検出用キットの要件を詳述する。
【０００８】
該検出用キットは、ＣＣＶ抗原に対するサンドイッチアッセイを多孔質キャリア上で行う方法（イムノクロマト法）を測定原理として利用するものである。該キットでは、ＣＣＶの全てのタンパク質が検出抗原となり得るが、好ましくは該ウイルスのヌクレオカプシドタンパク質（以下、ＣＣＶ−Ｎと記載することがある）を検出抗原として本キットを作製した場合に、該キットの検出感度を最大限に発揮させることができる。しかし、本発明の該検出用キットの検出抗原は、ＣＣＶ−Ｎに限られるものではなく、該ウイルスのＳタンパク質、Ｍタンパク質など該ウイルスにコードされるタンパク質であれば、本キットの検出抗原となりうる。
【０００９】
該キットにおける標識抗体Ｉを作製する抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれでもＣＣＶ抗原に特異的であれば使用できる。該抗体として該ウイルスヌクレオカプシドタンパク質に特異的な抗体を使用することにより、該キットの感度を最大限に発揮させることができる。また、該標識抗体Ｉがモノクローナル抗体を標識して作製されることにより、該キットの特異性を高めることができる。すなわち、標識抗体Ｉの最も好ましい実施態様は、ＣＣＶ−Ｎに特異的なモノクローナル抗体を使用することであるが、本発明は、これに限定されるものではない。該標識抗体は、例えば、着色ラテックス粒子、磁気ビーズ等の合成高分子、ゼラチン等の天然高分子、又は金コロイド等の金属高分子等で標識し、イムノクロマト法に使用することが可能である。反応を直接、可視的に検出する場合には金コロイドによる標識をその最も好適な例としてあげることができるが、これに限定されるものではない。
【００１０】
また、ＣＣＶ抗原を検出する該キットにおいて、抗原検出部位に固相化する抗体（抗体ＩＩ）においてもポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれでもＣＣＶ抗原に特異的であれば使用できる。該ウイルスヌクレオカプシドタンパク質を被検出抗原として該タンパク質に特異的な標識抗体Ｉを使用したキットを作製する場合、抗体ＩＩも該タンパク質に対して特異的な抗体分画を含むポリクローナル抗体を固相化することにより、該キットの検出感度を最大限に発揮させることができ、該抗体の使用をその最も好適な例としてあげることができるが、本発明は、これに限られるものではない。
【００１１】
反応終了判定部位には標識抗体Ｉとして使用した動物種の免疫グロブリンタンパク質に特異的な抗体（抗体ＩＩＩ）を固相化するが、該抗体はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれでも使用できる。
【００１２】
これらの抗体を多孔質キャリアに順次含有せしめて、犬下痢症ウイルス抗原検出用キットを構成する。多孔質キャリアの材質としては、市販の濾紙、ナイロン、ニトロセルロース、ポリビニリデンジフルオライドやガラスファイバー濾紙などを使用できる。上記のほか、ポリプロピレン、ポリエチレン、フッ化ポリビニリデン、エチレン酢酸ビニル、アクリルニトリル、ポリテトラフルオロエチレンのような合成高分子を多孔質化した多孔質プラスチックも使用することができる。
【００１３】
本キットの使用により、特殊な技術、装置及び施設を必要とせず、簡便かつ迅速にＣＣＶ感染症を診断することが可能となる。
【００１４】
さらに本発明による課題解決の第二の手段は、ＣＣＶ及びＣＰＶ抗原を同時に検出するキットの提供である。本キットの使用により、犬の主要なウイルス性下痢症の原因であるであるＣＣＶ及びＣＰＶの抗原検出を、一回の操作で行うことが出来、両感染症の鑑別診断が可能となり、より容易に、検査結果を得ることができる。本キットは、本発明の第一の手段で詳述した犬下痢症ウイルス抗原検出用キットを発展させたキットであり、同一検出用キット上で両ウイルス抗原を検出することが可能であることを見出し、本発明の第二の検出用キットを完成させるに至った。
【００１５】
すなわち、（１）多孔質キャリアに、検体滴下部位、標識抗体含有部位、抗原検出部位及び反応終了判定部位とを順次形成してなり、（２）標識抗体含有部位には湿潤状態において多孔質キャリア上を抗原検出部位から反応終了判定部位へと順次移動し得る、ＣＣＶ抗原特異的標識抗体（標識抗体Ｉ）及びＣＰＶ抗原特異的標識抗体（以下、「標識抗体ＩＶ」と記載することがある）を含有せしめ、抗原検出部位にはＣＣＶ抗原特異的抗体（抗体ＩＩ）及びＣＰＶ抗原特異的抗体（以下、「抗体Ｖ」と記載することがある）を固相化し、反応終了判定部位には、標識抗体として使用した動物種の免疫グロブリンタンパク質特異的抗体（抗体ＩＩＩ）を固相化し、（３）もって、検体を検体滴下部位に滴下することにより、検体を多孔質キャリア内で移動せしめて、標識抗体Ｉ及びＩＶを溶出させ、抗体ＩＩ及びＶを固相化した抗原検出部位及び抗体ＩＩＩを固相化した反応終了判定部位を通過せしめることにより、検体中の該ＣＣＶ抗原及び該ＣＰＶ抗原を検出すること、を特徴とする犬下痢症ウイルス抗原検出用キットを提供することにより、同一検体から両抗原を、迅速、簡便、かつ同時に検出することを可能にするものである。以下、該検出用キットの要件を詳述する。
【００１６】
該キットのＣＣＶ抗原検出のための要件については、イヌコロナウイルス抗原のみを検出するキットの項で詳述した事項が本キットにも当てはまる。
【００１７】
該キットのＣＰＶ抗原検出のための要件において、用いる標識抗体ＩＶは、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれでもＣＰＶ抗原に特異的であれば使用できる。該ウイルス粒子表面タンパク質に特異的なモノクローナル抗体を標識して使用することにより、該キットの特異性を最大限に発揮させることができ、該モノクローナル抗体の使用をその最も好適な例としてあげることができるが、これに限定されるものではない。該標識抗体ＩＶは、例えば、着色ラテックス粒子、磁気ビーズ等の合成高分子、ゼラチン等の天然高分子、又は金コロイドなどの金属高分子で標識し、イムノクロマト法に使用することが可能である。反応を直接、可視的に検出する場合には金コロイドによる標識をその最も好適な例としてあげることができるが、これに限定されるものではない。
【００１８】
また、抗原検出部位に固相化する抗体（抗体Ｖ）はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれでもＣＰＶ抗原に特異的であれば使用できる。該ウイルス粒子表面タンパク質を検出抗原とし、該抗原に対して特異的な抗体分画を含むポリクローナル抗体を固相化することにより、該キットの検出感度を最大限に発揮させることができ、該抗体の使用をその最も好適な例としてあげることができるが、これに限定されるものではない。
【００１９】
反応終了判定部位には標識抗体として使用した動物種の免疫グロブリンタンパク質に特異的な抗体（抗体ＩＩＩ）を固相化するが、該抗体はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれでも使用できる。
【００２０】
これらの抗体を多孔質キャリアに順次含有せしめて、犬下痢症ウイルス抗原検出用キットを構成する。該キットの多孔質キャリアの要件については、犬コロナウイルス抗原のみを検出するキットの項で詳述した事項が本キットにも当てはまる。
【００２１】
本キットの使用により、一回の操作でＣＣＶ感染症とＣＰＶ感染症を迅速に診断することが可能となる。なお、当業者にとって、同様の構成により検出用キットに新たに、イヌロタウイルス等の検出部位を加えていくことは容易なことである。
【００２２】
【発明の実施の形態】
請求項１に係る本発明は、「犬下痢症ウイルス抗原を検出するキットであり、（１）多孔質キャリアに、検体滴下部位、標識抗体含有部位、抗原検出部位及び反応終了判定部位とを順次形成してなり、（２）標識抗体含有部位には湿潤状態において多孔質キャリア上を抗原検出部位から反応終了判定部位へと順次移動し得る該ＣＣＶ抗原特異的標識抗体（標識抗体Ｉ）を含有せしめ、抗原検出部位には該ＣＣＶ抗原特異的抗体（抗体ＩＩ）を固相化し、反応終了判定部位には標識抗体として使用した動物種の免疫グロブリンタンパク質特異的抗体（抗体ＩＩＩ）を固相化し、（３）もって、検体を検体滴下部位に滴下することにより、検体を多孔質キャリア内で移動せしめて、標識抗体Ｉを溶出させ、抗体ＩＩを固相化した抗原検出部位及び抗体ＩＩＩを固相化した反応終了判定部位を通過せしめることにより、検体中の該ＣＣＶ抗原を検出すること、を特徴とする犬下痢症ウイルス抗原検出用キット」としたものであり、本キットの使用によりＣＣＶ感染症を、特殊な技術、装置及び施設を必要とせずしかも、簡便かつ迅速に診断できるという作用を有する。
【００２３】
本キットを作製するにあたって必要とされるＣＣＶポリクローナル抗体はＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ （１９８８， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ編）に記載される方法に従って精製ＣＣＶをウサギ、ヤギなどの各種動物に免疫することにより得ることができる。精製ＣＣＶはＭａｋｉｎｏらの方法（Ｍａｋｉｎｏら（１９８３）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２７：４４５−４５４、Ｍａｋｉｎｏら（１９８４）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １３３：９−１７）により、例えばＣＣＶ１−７１株感染ＣＲＦＫ細胞の培養上清からショ糖密度勾配遠心法を用いて調製することができる。あるいは、ヌクレオカプシドタンパク質に対する抗体のみを得る目的で、同タンパク質をバキュロウイルスあるいは大腸菌などを用いた発現系で大量に発現させ、これを抗原としてポリクローナル抗体を得ることも可能である。
【００２４】
また、同ウイルスに対するモノクローナル抗体についても、精製ＣＣＶをマウスに免疫した後、同じくＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ （１９８８， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ編）に記載される方法に従い、ＣＣＶ抗原タンパク質に対する抗体を産生するハイブリドーマをクローニングすることにより得ることができる。得られたモノクローナル抗体の特異性については、エライザ法、ウェスタンブロッティング法や、ウイルスゲノムにコードされた各タンパク質の発現産物に対する反応性を調べることにより決定することができる。
【００２５】
得られた抗体の標識に使用する担体粒子は着色ラテックス粒子、磁気ビーズ等の合成高分子、ゼラチン等の天然高分子、又は金コロイド等の金属高分子を好適なものとして例示することができる。担体粒子は、肉眼での判定を行う場合には着色されていることが望ましく、この点で、金属高分子のコロイド粒子や着色ラテックス粒子は、色調を有するため有利である。抗体の標識法については、標識物である担体粒子を製造するメーカーがおのおの提供するマニュアルに沿って標識することができ、当業者にとっては自明の技術である。担体粒子により標識された抗体は、コロイド化学的安定性の向上、又は膜及び検体との非特異的な結合を防止する目的で、０．０５％から５％程度のＢＳＡ等を含有した緩衝液中に懸濁して保管することが望ましい。
【００２６】
これら抗体を、多孔質キャリア上に例えば図１に示すごとく配置して、本キットを作製する。すなわち、多孔質キャリアの標識抗体含有部位にはＣＣＶ抗原特異的標識抗体Ｉを含有せしめ、抗原検出部位にはＣＣＶ抗原特異的抗体（抗体ＩＩ）を固相化し、反応終了判定部位には標識抗体として使用した動物種の免疫グロブリンタンパク質特異的抗体（抗体ＩＩＩ）を固相化し、膜を短冊状（例えば、幅５〜２０ｍｍ、長さ約５０ｍｍ程度）に裁断し、裁断した膜を同一の大きさの支持体（例えば、プラスチック等）に固定する。裁断した短冊の反応終了判定部位側の片端に適当な大きさの吸収材を配置すると、検体の展開を容易にする機能を有しており、有利である。さらに検体滴下部位を配置して本キットを構成する。なお、本キットにおいては標識抗体含有部位と検体滴下部位は、同一であってもかまわない。支持体への各部材の固定には、接着剤、粘着テープ等を用いることができる。
【００２７】
多孔質キャリアの材質としては、市販の濾紙、ナイロン、ニトロセルロース、ポリビニリデンジフルオライドやガラスファイバー濾紙などの天然又は合成高分子のいずれも使用できる。また、ＣＣＶ抗原特異的抗体（抗体ＩＩ）の膜への固定方法としては、物理吸着法、化学結合（共有結合）法、その他いずれの方法も使用することができる。即ち、ＣＣＶ抗体が膜より脱離しなければどのような材質を用いることも可能である。抗体ＩＩ固定膜は、検体又は標識抗体Ｉとの非特異的な吸着を防止するために、０．０５から５％程度のＢＳＡ等でブロッキング処理を行い、乾燥条件下で保存することが望ましい。
【００２８】
使用にあたっては、被検動物である犬から採取した糞便を緩衝液に懸濁し、この適当量を、本キットの検体滴下部位に滴下する。滴下された検体は標識抗体Ｉを含有する部位に到達し、検体中にＣＣＶ抗原が存在する場合、これと標識抗体Ｉとの免疫複合体が形成される。該免疫複合体は毛細管現象により緩衝液とともに濾紙等の多孔質キャリア上に展開され、抗体ＩＩが固相化された抗原検出部位に到達し、該免疫複合体の大部分は該部位で抗体ＩＩに捕捉される。もし、検体中にＣＣＶ抗原が存在しない場合は、フリーの標識抗体Ｉとしてこの部位に捕捉されず通過する。一部の免疫複合体あるいはフリーの標識抗体Ｉは抗原検出部位を通り抜け、反応終了判定部位に到達し、免疫複合体の形成の有無にかかわらず、標識抗体Ｉが捕捉されて蓄積し、試験終了の反応が現れる。本キットにおいては検体滴下後、１０〜１５分間室温に静置することによりこの反応が現れる。この反応は、金コロイド標識抗体を用いた場合は、赤紫色の発色として出現する。反応終了判定部位に反応が現れた時点で、抗原検出部位に発色反応が現れた場合はＣＣＶ抗原陽性、現れない場合は陰性と判定し、ＣＣＶ抗原陽性の場合、被検動物（犬）はＣＣＶ感染症と診断される。
【００２９】
更に、該抗原検出用キットにおいて、図１に示したＣＣＶ抗原特異的標識抗体Ｉを含有せしめた標識抗体含有部位は、これを除いて本キットを構築することも可能である。このような形態のキットにおいては、標識抗体Ｉと緩衝液に懸濁した検体とをあらかじめ試験管内で混合した後に検体滴下部位に該混合液を滴下し、上記と同様に反応を待ち、抗原の有無を判定することができる。
【００３０】
本発明の請求項２に記載の発明は、「犬下痢症ウイルス抗原を検出するキットであり、（１）多孔質キャリアに、検体滴下部位、標識抗体含有部位、抗原検出部位及び反応終了判定部位とを順次形成してなり、（２）標識抗体含有部位には湿潤状態において多孔質キャリア上を抗原検出部位から反応終了判定部位へと順次移動し得る、ＣＣＶ抗原特異的標識抗体（標識抗体Ｉ）及びＣＰＶ抗原特異的標識抗体（標識抗体ＩＶ）を含有せしめ、抗原検出部位にはＣＣＶ抗原特異的抗体（抗体ＩＩ）及びＣＰＶ抗原特異的抗体（抗体Ｖ）を固相化し、反応終了判定部位には、標識抗体として使用した動物種の免疫グロブリンタンパク質特異的抗体（抗体ＩＩＩ）を固相化し、（３）もって、検体を検体滴下部位に滴下することにより、検体を多孔質キャリア内で移動せしめて、標識抗体Ｉ及びＩＶを溶出させ、抗体ＩＩ及びＶを固相化した抗原検出部位及び抗体ＩＩＩを固相化した反応終了判定部位を通過せしめることにより、検体中の該ＣＣＶ抗原及び該ＣＰＶ抗原を検出すること、を特徴とする犬下痢症ウイルス抗原検出用キット」としたものであり、本キットの使用によりＣＣＶ感染症及びＣＰＶ感染症を、特殊な機器及び熟練した技術を必要とせず、しかも簡便かつ迅速に診断できるという作用を有する。
【００３１】
本キットにおいて必要とされるＣＣＶ抗原検出のための抗体は、イヌコロナウイルス抗原のみを検出するキットを組み立てるために作製される抗体を使用することができる。
【００３２】
本キットを作製するにあたって、さらに必要とされるＣＰＶポリクローナル抗体はＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ （１９８８， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ編）に記載される方法に従って精製ＣＰＶをウサギ、ヤギなどの各種動物に免疫することにより得ることができる。精製ＣＰＶは例えば、ＣＰＶＣｐ−４９株感染ＣＲＦＫ細胞の培養上清から塩化セシウム密度勾配遠心法を用いて調製することができる。
【００３３】
また、同ウイルスに対するモノクローナル抗体についても、精製ＣＰＶをマウスに免疫した後、同じくＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ （１９８８， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ編）に記載される方法に従い、ＣＰＶ抗原タンパク質に対する抗体を産生するハイブリドーマをクローニングすることにより得ることができる。得られたモノクローナル抗体の特異性については、エライザ法やウェスタンブロッティング法、ウイルスゲノムにコードされた各タンパク質の発現産物に対する反応性、あるいはウイルス中和活性や赤血球凝集抑制活性により決定することができる。
【００３４】
抗体の標識については、ＣＣＶ抗原のみを検出するキットの作製法の項で詳述した方法を準用することができる。
【００３５】
これら抗体を、多孔質キャリア上に例えば図２に示すごとく配置して、本キットを作製する。すなわち、多孔質キャリアの標識抗体含有部位にはＣＣＶ抗原特異的標識抗体Ｉ及びＣＰＶ抗原特異的標識抗体ＩＶの両者を含有せしめ、抗原検出部位には、ＣＣＶ抗原特異的抗体（抗体ＩＩ）及びＣＰＶ抗原特異的抗体（抗体Ｖ）を固相化し、反応終了判定部位には標識抗体として使用した動物種の免疫グロブリンタンパク質特異的抗体（抗体ＩＩＩ）を固相化し、膜を短冊状（例えば、幅５〜２０ｍｍ、長さ約５０ｍｍ程度）に裁断し、裁断した膜を同一の大きさの支持体（例えば、プラスチック等）に固定する。裁断した短冊の反応終了判定部位側の片端に適当な大きさの吸収材を配置すると、検体の展開を容易にする機能を有しており、有利である。さらに検体滴下部位を配置して本キットを構成する。なお、本キットにおいては標識抗体含有部位と検体滴下部位は、同一であってもかまわない。支持体への各部材の固定には、接着剤、粘着テープ等を用いることができる。
【００３６】
本キットにおけるそれぞれの標識抗体は同一の物質、例えば金コロイドあるいは着色ラテックス粒子などで標識してもよく、両者を異なった標識物質、例えば一方を金コロイド、他方を着色ラテックス粒子で標識してもよい。抗原検出部位の２つの抗体（抗体ＩＩ及び抗体Ｖ）は、これらを該部位内で位置をずらして、あるいはさらに固相化の形状に違い（例えば、線状と点状）を持たせてそれぞれ固相化することにより、ＣＣＶ抗原検出部位とＣＰＶ抗原検出部位を区別させ抗原検出部位における発色等の反応の位置あるいは形状の違いから検体にはどちらの抗原を含んでいるか、あるいは両方の抗原を含んでいるか否かを容易に判定でき、有利である。ＣＣＶ抗原特異的標識抗体ＩとＣＰＶ抗原特異的標識抗体ＩＶとして使用した免疫グロブリンタンパク質の動物種が異なる場合は、いずれか一方の動物種の免疫グロブリンタンパク質特異的抗体（抗体ＩＩＩ）を反応終了判定部位に固相化することにより、該部位を形成することができるが、両動物種の免疫グロブリンタンパク質特異的抗体（抗体ＩＩＩ）を該部位に固相化してもよい。
【００３７】
多孔質キャリアの材質としては、市販の濾紙、ナイロン、ニトロセルロース、ポリビニリデンジフルオライドやガラスファイバー濾紙などの天然又は合成高分子のいずれも使用できる。また、ＣＣＶ抗体ＩＩの膜への固定方法としては、物理吸着法、化学結合（共有結合）法、その他いずれの方法も使用することができる。即ち、ＣＣＶ抗体が膜より脱離しなければどのような材質を用いることも可能である。ＣＣＶ抗体固定膜は、検体又は標識抗体Ｉとの非特異的な吸着を防止するために、０．０５から５％程度のＢＳＡ等でブロッキング処理を行い、乾燥条件下で保存することが望ましい。
【００３８】
抗原検出法は、ＣＣＶ抗原検出用キットの方法と同様であり、本キットの特徴はＣＣＶ抗原とＣＰＶ抗原検出を同一のキット上で行うところにある。本発明のキットを使用することにより、一回の操作で両抗原の存在の有無を判定することが可能となる。
【００３９】
使用にあたっては、検体を緩衝液に懸濁して本キットの検体滴下部位に滴下し、１０〜１５分間室温に静置することにより反応終了判定部位に反応が現れるのを待つ。この反応は、金コロイド標識抗体を用いた場合は、赤紫色の発色として出現する。反応終了判定部位に反応が現れた時点で、抗原検出部位のＣＣＶ抗原検出部位に同様の反応が現れた場合はＣＣＶ抗原陽性、ＣＰＶ抗原検出部位に同様の反応が現れた場合はＣＰＶ抗原陽性、両検出部位に同様の反応が現れた場合はＣＣＶ抗原およびＣＰＶ抗原陽性、両検出部位に反応が現れない場合はＣＣＶ抗原およびＣＰＶ抗原陰性と判定する。診断にあたっては、被検動物は抗原陽性であったウイルスの感染症と判定される。
【００４０】
更に、該抗原検出用キットにおいて、図２に示したＣＣＶ抗原特異的標識抗体Ｉ及びＣＰＶ抗原特異的標識抗体ＩＶを含有せしめた標識抗体含有部位は、これを除いて本キットを構築することも可能である。このような形態のキットにおいては、標識抗体Ｉ及びＩＶと緩衝液に懸濁した検体とをあらかじめ試験管内で混合した後に検体滴下部位に該混合液を滴下し、上記と同様に反応を待ち、抗原の有無を判定することができる。
【００４１】
【実施例】
以下、本発明の犬下痢症ウイルス抗原検出用キットが実際に非常に有用であることを下記の調製例及び実施例に沿ってさらに詳細に説明するが、本発明は、以下の調製例及び実施例によりなんら限定されるものではない。調製例では、本発明の抗原検出用キットを作製するために必要な各抗体の作製例を、そして実施例では、これら抗体を用いた抗原検出用キットの作製例ならびにその応用例を示す。
【００４２】
調製例１：抗ＣＣＶポリクローナル抗体の調製
免疫原であるＣＣＶは以下のように調製した。すなわち、ＣＣＶ １−７１株感染ＣＲＦＫ細胞の培養上清に２．２％の塩化ナトリウム及び６．５％のポリエチレングリコール＃６０００を添加した後遠心分離により析出物を回収することにより粗精製ＣＣＶを得、更にこれから不連続ショ糖密度勾配遠心法により３０％（Ｗ／Ｗ）ショ糖と６０％（Ｗ／Ｗ）ショ糖との間に集積する精製ＣＣＶ分画を調製した。ウサギ１羽あたり、１００μｇの精製ＣＣＶをＦｒｅｕｎｄの完全アジュバントとともに皮下に接種し、更に３週間隔で２回、Ｆｒｅｕｎｄの不完全アジュバントとともに皮下に追加接種した。その後３週間以上の間隔をあけてウサギ静脈内に精製ＣＣＶを接種し、接種後１０日以内にウサギ血清を抗ＣＣＶポリクローナル抗体として得た。得られた血清からプロテインＧカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィー（アマシャムファルマシア社製）により抗ＣＣＶ抗体含有分画を精製した。
【００４３】
調製例２：抗ＣＣＶ−Ｎモノクローナル抗体の調製
マウス１匹あたり、調製例１において調製した１００μｇの精製ＣＣＶをＦｒｅｕｎｄの完全アジュバントとともに皮下に接種し、更に３週間隔で２回、Ｆｒｅｕｎｄの不完全アジュバントとともに皮下に追加接種した。その後３週間以上の間隔をあけてマウス腹腔内に精製ＣＣＶを接種し、３日後に脾臓を摘出した。その脾細胞をマウスミエローマ細胞と融合させ、スクリーニング及びクローニングにより抗ＣＣＶ−Ｎ抗体産生ハイブリドーマを得た。この抗ＣＣＶ−Ｎ抗体産生ハイブリドーマを、プリスタン（シグマ社製）投与後１０日目のＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内に移入し、約１０日後に腹水を採取した。得られた腹水からプロテインＧカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィー（アマシャムファルマシア社製）により抗ＣＣＶ−Ｎモノクローナル抗体を精製した。
【００４４】
調製例３：抗マウスイムノグロブリンポリクローナル抗体の調製
ウサギ１羽あたり、１００μｇの市販のマウスイムノグロブリンＧ（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社）をＦｒｅｕｎｄの完全アジュバントとともに皮下に接種し、更に３週間隔で２回、Ｆｒｅｕｎｄの不完全アジュバントとともに皮下に追加接種した。その後３週間以上の間隔をあけてウサギ静脈内にマウスイムノグロブリンＧを接種し、接種後１０日以内にウサギ血清を抗マウスイムノグロブリンポリクローナル抗体として得た。得られた血清からプロテインＧを用いたアフィニティークロマトグラフィー（アマシャムファルマシア社製）により抗マウスイムノグロブリン抗体含有分画を精製した。
【００４５】
調製例４：抗ＣＰＶポリクローナル抗体の調製
免疫原であるＣＰＶは以下のように調製した。すなわち、ＣＰＶ Ｃｐ−４９株感染ＣＲＦＫ細胞の培養上清に２．２％の塩化ナトリウム及び６．５％のポリエチレングリコール＃６０００を添加した後遠心分離により析出物を回収することにより粗精製ＣＰＶを得、更にこれから塩化セシウム密度勾配遠心法により精製ＣＰＶ分画を調製した。ウサギ１羽あたり、１００μｇの精製ＣＰＶをＦｒｅｕｎｄの完全アジュバントとともに皮下に接種し、更に３週間隔で２回、Ｆｒｅｕｎｄの不完全アジュバントとともに皮下に追加接種した。その後３週間以上の間隔をあけてウサギ静脈内に精製ＣＰＶを接種し、接種後１０日以内にウサギ血清を抗ＣＰＶポリクローナル抗体として得た。得られた血清からプロテインＧカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィー（アマシャムファルマシア社製）により抗ＣＰＶ抗体含有分画を精製した。
【００４６】
調製例５：抗ＣＰＶモノクローナル抗体の調製
マウス１匹あたり、調製例４において調製した１００μｇの精製ＣＰＶをＦｒｅｕｎｄの完全アジュバントとともに皮下に接種し、更に３週間隔で２回、Ｆｒｅｕｎｄの不完全アジュバントとともに皮下に追加接種した。その後３週間以上の間隔をあけてマウス腹腔内に精製ＣＰＶを接種し、３日後に脾臓を摘出した。その脾細胞をマウスミエローマ細胞と融合させ、スクリーニング及びクローニングにより抗ＣＰＶ抗体産生ハイブリドーマを得た。この抗ＣＰＶ抗体産生ハイブリドーマを、プリスタン（シグマ社製）投与後１０日目のＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内に移入し、約１０日後に腹水を採取した。得られた腹水からプロテインＧカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィー（アマシャムファルマシア社製）により抗ＣＰＶマウスモノクローナル抗体を精製した。
【００４７】
（実施例１）
本実施例はＣＣＶ抗原を検出するキットの作製及び該キットを用いたＣＣＶ抗原の検出を示す。
【００４８】
１）ＣＣＶ抗原検出用キットの作製
図１に示す抗原検出用キットを以下のように作製した。すなわち、図１の抗体ＩＩとして調製例１で調製した抗ＣＣＶ−Ｎウサギポリクローナル抗体を、抗体ＩＩＩとして調製例３で調製した抗マウスイムノグロブリンポリクローナル抗体を使用した。該抗体をＰＢＳ緩衝液により希釈し、抗体塗布キット（バイオドット社製）を用いて市販のニトロセルロースメンブレン（ミリポア社製）に図１に示すごとく線状に塗布した。十分に乾燥した後、非特異的な吸着を防止するため、１％のＢＳＡを添加したＰＢＳ緩衝液によりブロッキング処理を行い、十分に乾燥させて抗体固定膜を作製した。図１の標識抗体Ｉとして調製例２で調製した抗ＣＣＶ−Ｎモノクローナル抗体を以下のように標識し、使用した。すなわち、ｐＨ９．０に調製した精製ＣＣＶ−Ｎマウスモノクローナル抗体（０．１ｍｇ／ｍＬ）５０μｌを、粒子径４０ｎｍの金コロイド（ブリティッシュ・バイオセル社製）１ｍＬに添加し、常温で５分間撹拌し、次いでｐＨ９．０に調整した１０％ＢＳＡ及び１％ＰＥＧを含む水溶液を１００μｌ添加し、さらに常温で１０分間撹拌した。次いで、遠心分離（４℃、１０，０００ｇ、１５分間）により抗ＣＣＶ−Ｎマウスモノクローナル抗体蛋白質固定金コロイド粒子を集め、１００μｌの１％ＢＳＡ及び０．１％アジ化ナトリウムを含むトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．２）に再懸濁し、ＣＣＶ−Ｎに特異的に結合する金コロイド粒子標識抗体懸濁液を得、ガラス繊維製の吸収膜（ミリポア社製）に固定した。前記抗体固定膜と金コロイド標識抗体Ｉを含むガラス繊維性吸収膜を、図１のごとく幅約５ｍｍ、長さ約５０ｍｍの短冊状に成型した。反応終了判定部位側の片端に、滴下した検体を容易に展開させる目的で、グラスファイバー製吸収材（ミリポア社製）を接着し、抗原検出用キットを完成させた。
【００４９】
２）被検試料
（１）試料番号１〜７：ＣＣＶ実験感染個体から経時的に採取した糞便
（２）試料番号８〜１１：下痢症を呈した個体から採取した糞便
（３）試料番号１２：検体希釈液
【００５０】
３）被検試料からのＲＴ−ＰＣＲ法によるＣＣＶゲノムＲＮＡの検出
被検糞便を１０（Ｗ／Ｖ）％になるようにＰＢＳ緩衝液に溶解し、遠心して得た上清からゲノムＲＮＡを抽出する。ＣＣＶゲノムＲＮＡは、糞便溶解液上清をプロテイナーゼＫ及びソジウムドデシル硫酸存在下で加温処理し、これをフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール溶液（２５：２４：１）により抽出し、取得することができる。
【００５１】
回収されたゲノムＲＮＡを鋳型とし、また、現在までに公知となっている塩基配列［ジャーナル・オブ・ジェネラル・ヴィロロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、第７３巻、第２８４９ページ、１９９２年］を参考にして、２本の合成ＤＮＡプライマー５’−ＧＡＡＣＴＧＧＡＣＣＴＣＡＴＧＣＴＧＡＴ−３’（配列番号１）及び５’−ＣＡＴＴＣＴＴＡＧＧＴＧＴＡＧＴＡＴＣＴＣＴ−３’（配列番号２）を作製し、ＲＴ−ＰＣＲ法によりＣＣＶゲノムＲＮＡの検出を行った。
【００５２】
４）試験結果
この試験の結果は表１に示す通りである。表１から明らかな通り、ＣＣＶ実験感染個体から採取した糞便においては、接種後２日目から６日目までＲＴ−ＰＣＲ法によりＣＣＶゲノムが検出された。これら試料においては、本発明のＣＣＶ抗原を検出する犬下痢症ウイルス抗原検出用キットにより該抗原が検出された。下痢症を呈した個体から採取した糞便においては、ＲＴ−ＰＣＲ法によりＣＣＶゲノムＲＮＡが検出された試料番号８、９で本発明の抗原検出用キットにより該抗原が検出され、ＣＣＶゲノムが検出されない試料番号１０、１１ではＣＣＶ抗原も検出されなかった。
【００５３】
ＲＴ−ＰＣＲ法は感度の高いウイルス検出法とされているが、該方法によるＣＣＶゲノムの検出には検体の調製から結果がでるまでにほぼ１日を要するとともに、ＰＣＲ反応キットを必要とし、かつ熟練した技術が必要であることに比較し、本発明の犬下痢症ウイルス抗原検出用キットを用いた場合は、特殊な装置や熟練した技術を必要とせずに全工程をわずか２０分以内に完了した。以上の試験結果から、本発明のキットは、ＣＣＶ抗原を高感度に検出し、これによりＣＣＶ感染症を的確に診断することが可能となり、しかも簡便かつ迅速に結果を得ることが出来たことから、本発明の抗原検出用キットは、従来にない優れたＣＣＶ抗原検出用キットであることが判明した。
【００５４】
【表１】
（実施例２）
本実施例はＣＣＶ抗原及びＣＰＶ抗原を検出するキットの作製及び該キットを用いたＣＣＶ抗原並びにＣＰＶ抗原の検出を示す。
【００５６】
１）ＣＣＶ抗原及びＣＰＶ抗原検出用キットの作製
図２に示す抗原検出用キットを以下のように作製した。図２の標識抗体Ｉ、抗体ＩＩ、及び抗体ＩＩＩは実施例１で使用した標識抗体あるいは抗体を準用した。標識抗体ＩＶとしては調製例５で調製した抗ＣＰＶモノクローナル抗体を、抗体Ｖとしては調製例４で調製した抗ＣＰＶポリクローナル抗体を使用した。抗体ＩＩ、抗体ＩＩＩ、及び抗体Ｖを図２に示すごとく実施例１と同様の方法でニトロセルロースメンブレンに線状に塗布し、抗体固定膜を作製した。標識抗体ＩＶは、標識抗体Ｉと同様に作製し、同一ガラス繊維製の吸収膜に固定した。前記抗体固定膜と金コロイド標識抗体Ｉを含むガラス繊維性吸収膜を、図２のごとく幅約５ｍｍ、長さ約５０ｍｍの短冊状に成型した。反応終了判定部位側の片端に、滴下した検体を容易に展開させる目的で、グラスファイバー製吸収材（ミリポア社製）を接着し、抗原検出用キットを完成させた。
【００５７】
２）被検試料
（１）試料番号１〜７：ＣＣＶ実験感染個体から経時的に採取した糞便
（２）試料番号８〜１４：ＣＰＶ実験感染個体から経時的に採取した糞便
（３）試料番号１５〜１８：下痢症を呈した個体から採取した糞便
（４）試料番号１９： 検体希釈液
【００５８】
３）被検試料からのＲＴ−ＰＣＲ法によるＣＣＶゲノムＲＮＡの検出
実施例１と同様に行った。
【００５９】
４）被検試料からのＰＣＲ法によるＣＰＶゲノムＤＮＡの検出
被検糞便を１０（Ｗ／Ｖ）％になるようにＰＢＳ緩衝液に溶解し、遠心して得た上清からゲノムＤＮＡを抽出する。ＣＰＶゲノムＤＮＡは、糞便溶解液上清をプロテイナーゼＫ及びソジウムドデシル硫酸存在下で加温処理し、これをフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール溶液（２５：２４：１）により抽出し、取得することができる。
【００６０】
回収されたゲノムＤＮＡを鋳型とし、また、現在までに公知となっている塩基配列［ヴィロロジー・（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、第１４８巻、第１２１ページ、１９８６年］を参考にして、２本の合成ＤＮＡプライマー５’− ＴＧＣＣＡＴＴＴＡＣＴＣＣＡＧＣＡＧＣ−３’（配列番号３）及び５’− ＣＡＴＴＴＧＡＧＴＴＡＣＡＣＣＡＣＧＴＣＴ −３’（配列番号４）を作製し、ＰＣＲ法によりＣＰＶゲノムＲＮＡの検出を行った。
【００６１】
５）試験結果
この試験の結果は表２に示す通りである。表２から明らかな通り、ＣＣＶ実験感染個体から採取した糞便においては、接種後２日目から６日目までＲＴ−ＰＣＲ法によりＣＣＶゲノムが検出された。これら試料においては、本発明のＣＣＶ及びＣＰＶ抗原を検出する犬下痢症ウイルス抗原検出用キットによりＣＣＶ抗原が検出され、ＣＰＶ抗原は陰性であった。下痢症を呈した個体から採取した糞便においては、ＲＴ−ＰＣＲ法によりＣＣＶゲノムＲＮＡが検出された試料番号１５、１６で本発明の抗原検出用キットによりＣＣＶ抗原が検出され、ＣＣＶゲノムが検出されない試料番号１７、１８ではＣＣＶ抗原も検出されなかった。また、ＣＰＶ実験感染個体から採取した糞便においては、接種後２日目から６日目までＰＣＲ法によりＣＰＶゲノムが検出された。これら試料においては、本発明のＣＣＶ及びＣＰＶ抗原検出用キットによりＣＰＶ抗原が検出され、ＣＣＶ抗原は陰性であった。下痢症を呈した個体から採取した糞便においては、ＰＣＲ法によりＣＰＶゲノムＤＮＡが検出された試料番号１７で本発明の抗原検出用キットによりＣＰＶ抗原が検出され、ＣＰＶゲノムが検出されない試料番号１５、１６、１８ではＣＰＶ抗原も検出されなかった。
【００６２】
ＲＴ−ＰＣＲ法及びＰＣＲ法は、感度の高いウイルス検出法とされているが、該方法によるウイルスゲノムの検出には検体の調製から結果がでるまでにほぼ１日を要するとともに、ＰＣＲ反応装置を必要とし、かつ熟練した技術が必要であることに比較し、本発明の抗原検出用キットを用いた場合は、特殊な装置や熟練した技術を必要とせずに全工程をわずか２０分以内に完了した。さらに、該キットの使用により、ＣＣＶとＣＰＶの鑑別も可能であった。以上の試験結果から、本発明のキットは、ＣＣＶ抗原及びＣＰＶ抗原を高感度に検出し、これによりＣＣＶ感染症及びＣＰＶ感染症を的確に診断することが可能となり、しかも簡便かつ迅速に結果を得ることが出来たことから、本発明の抗原検出用キットは、従来にない優れたＣＣＶ及びＣＰＶ検出用キットであることが判明した。
【００６３】
【表２】
【発明の効果】
以上詳記した通り、本発明は、新規な犬のウイルス性下痢症の診断キットに関するものであり、本発明によれば、次のような効果が奏される。
１）特殊な機器及び熟練した技術を必要とすることなく、検体（糞便）の採取現場において簡便かつ迅速にイヌコロナウイルス感染症を診断することが可能となる。
２）特殊な機器及び熟練した技術を必要とすることなく、検体（糞便）の採取現場において簡便、迅速、かつ同時にイヌコロナウイルス感染症とイヌパルボウイルス感染症を鑑別診断することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の一実施の形態によるイヌコロナウイルス抗原を検出する犬下痢症ウイルス抗原検出用キットを示す平面図。
【図２】本発明の一実施の形態によるイヌコロナウイルス抗原及びイヌパルボウイルス抗原を検出する犬下痢症ウイルス抗原検出用キットを示す平面図。
【配列表】
Claims (6)
- イヌコロナウイルス抗原を検出する犬下痢症ウイルス抗原検出用キットであり、
（１）多孔質キャリアに、検体滴下部位、標識抗体含有部位、抗原検出部位及び反応終了判定部位とを順次形成してなり、
（２）標識抗体含有部位には湿潤状態において多孔質キャリア上を抗原検出部位から反応終了判定部位へと順次移動し得るイヌコロナウイルス抗原特異的標識抗体を含有せしめ、抗原検出部位にはイヌコロナウイルス抗原特異的抗体を固相化し、反応終了判定部位には標識抗体として使用した動物種の免疫グロブリンタンパク質特異的抗体を固相化し、
（３）もって、検体を検体滴下部位に滴下することにより、検体を多孔質キャリア内で移動せしめて、イヌコロナウイルス抗原特異的標識抗体を溶出させ、イヌコロナウイルス抗原特異的抗体を固相化した抗原検出部位及び免疫グロブリンタンパク質特異的抗体を固相化した反応終了判定部位を通過せしめることにより、検体中の該イヌコロナウイルス抗原を検出すること、
を特徴とする犬下痢症ウイルス抗原検出用キット。 - イヌコロナウイルス抗原及びイヌパルボウイルス抗原を検出する犬下痢症ウイルス抗原検出用キットであり、
（１）多孔質キャリアに、検体滴下部位、標識抗体含有部位、抗原検出部位及び反応終了判定部位とを順次形成してなり、
（２）標識抗体含有部位には湿潤状態において多孔質キャリア上を抗原検出部位から反応終了判定部位へと順次移動し得る、イヌコロナウイルス抗原特異的標識抗体及びイヌパルボウイルス抗原特異的標識抗体を含有せしめ、抗原検出部位にはイヌコロナウイルス抗原特異的抗体及びイヌパルボウイルス抗原特異的抗体を固相化し、反応終了判定部位には、標識抗体として使用した動物種の免疫グロブリンタンパク質特異的抗体を固相化し、
（３）もって、検体を検体滴下部位に滴下することにより、検体を多孔質キャリア内で移動せしめて、イヌコロナウイルス抗原特異的標識抗体及びイヌパルボウイルス抗原特異的標識抗体を溶出させ、イヌコロナウイルス抗原特異的抗体及びイヌパルボウイルス抗原特異的抗体を固相化した抗原検出部位及び免疫グロブリンタンパク質特異的抗体を固相化した反応終了判定部位を通過せしめることにより、検体中の該イヌコロナウイルス抗原及び該イヌパルボウイルス抗原を検出すること、
を特徴とする犬下痢症ウイルス抗原検出用キット。 - 前記イヌコロナウイルス抗原が、イヌコロナウイルスのヌクレオカプシドタンパク質の抗原性を有するタンパク質であることを特徴とする請求項１又は２に記載の犬下痢症ウイルス抗原検出用キット。
- 前記イヌコロナウイルス抗原特異的標識抗体がイヌコロナウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を標識した該抗体であり、前記イヌコロナウイルス抗原特異的抗体がイヌコロナウイルス抗原に対するポリクローナル抗体であることを特徴とする請求項１ないし３のいずれか１項に記載の犬下痢症ウイルス抗原検出用キット。
- 前記イヌコロナウイルス抗原特異的標識抗体がイヌコロナウイルス抗原に対する抗体を金コロイド粒子により標識した該抗体であることを特徴とする請求項１ないし４のいずれか１項に記載の犬下痢症ウイルス抗原検出用キット。
- 犬ウイルス性下痢症の診断法であって、請求項１ないし５のいずれか１項に記載の犬下痢症ウイルス抗原検出用キットを用いることにより生体由来材料中のイヌコロナウイルス抗原及び／又はイヌパルボウイルス抗原を検出することを特徴とする犬ウイルス性下痢症の診断法。
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|---|---|---|---|---|
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| JP7036979B1 (ja) * | 2021-04-02 | 2022-03-15 | ライオン株式会社 | 検査方法 |
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-
2003
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