JP2004208646A - Cadaverine-dicarboxylic acid salt and method for producing the same - Google Patents

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To produce a cadaverine-dicarboxylic acid salt in high reaction yield, production rate and purity by a simplified production process. <P>SOLUTION: The cadaverine-dicarboxylic acid salt is produced by contacting an aqueous solution of an L-lysine dicarboxylic acid salt with Escherichia coli containing L-lysine decarboxylase gene introduced into the cell or Escherichia coli having L-lysine decarboxylase localized on the surface of the cell. The aqueous solution of the L-lysine dicarboxylic acid salt is produced by using L-lysine fermentation liquid fermented while controlling the pH with a dicarboxylic acid and the L-lysine decarboxylase is prepared by using the fermentation liquid. The cadaverine-dicarboxylic acid salt is produced from the aqueous solution of the cadaverine-dicarboxylic acid salt by concentration, addition of an organic solvent, filtration and crystallization. <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO&NCIPI

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、カダベリン・ジカルボン酸塩の製造法に関するものである。カダベリン・ジカルボン酸塩はポリアミドの原料として期待され、需要が高まりつつある。
【０００２】
【従来の技術】
従来、Ｌ−リジンを微量のテトラリン過酸化物を含むシクロヘキサノール中で煮沸することによりカダベリンが得られることが知られている（非特許文献１参照。）。しかしながら高温反応であるために大量のエネルギーおよび有機溶媒が必要であるうえに、反応収率が非常に低い（３６％）。
【０００３】
また、２−シクロヘキセン−１−オンなどのビニルケトン類を触媒としてリジンから合成する方法が知られている（非特許文献２参照。）。
【０００４】
さらにＬ−リジンを、３−メチル−シクロヘキセノンを触媒にナトリウムメトキシド含むシクロヘキサノール中で１５５℃３時間加熱攪拌することによりカダベリンが得られることが知られている（特許文献１参照。）。
【０００５】
また、この方法によって得られるカダベリンには不純物として、トリ−ｎ−ブチルアミンや２，３，４，５−テトラヒドロピリジンといった塩基性化合物が含有されている。
【０００６】
また、カダベリンは生体内に普遍的に存在する生体アミンであり、その生合成系が解明されつつある（非特許文献３参照。）。また、エシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）由来のＬ−リジン脱炭酸酵素遺伝子が知られている（非特許文献４参照。）。
【０００７】
また、カダベリンの組み換え大腸菌での発酵による製造方法（特許文献２参照）および組み換え大腸菌での酵素法による製造方法（特許文献３参照）が知られている。
【０００８】
一方、細胞表面にタンパク質を局在化させる研究は、多くの細菌において行われている。大腸菌について細胞表面にタンパク質を局在化させる研究が活発に行われている（非特許文献５参照。）。
【０００９】
また、ポリアミドは、原料であるフリーのジアミンおよびフリーのジカルボン酸を、各々を精製した後、等モル混合し重合反応を行い製造していた。従来のジアミンおよびジカルボン酸は石油由来の原料を用いるため、溶媒を特に用いることなくフリーのジアミンおよびジカルボン酸が得られた（非特許文献６参照。）。そのため水溶液からのジアミン・ジカルボン酸の晶析を検討する必要はなかった。
【００１０】
しかし、化学合成法とは異なる発酵または酵素法によりポリアミド原料を製造するためには、溶媒として水を使うことが一般的であり、また発酵または酵素法を行うためには溶液のｐＨの調整が一般的に必要である。これら中和剤としてはアルカリ金属水酸化物または無機酸が一般的に用いられ、それらの塩としてジアミンまたはジカルボン酸が晶析されている。例えば、ジカルボン酸であるコハク酸の発酵による製法などでは、コハク酸カルシウムとして晶析し精製している（特許文献４参照。）。
【００１１】
しかしながら、カダベリン・ジカルボン酸塩の製造について実際的な製造技術は確立されておらず、副生廃棄物の少ない、高純度のカダベリン・ジカルボン酸塩を製造する方法の開発が望まれている。
【００１２】
【特許文献１】
特開昭６０−２３３２８号公報第１１〜１２頁
【特許文献２】
特開２００２−２２３７７０号公報第５頁
【特許文献３】
特開２００２−２２３７７１号公報第４〜５頁
【特許文献４】
特開昭６２−２９４０９０号公報第６頁
【非特許文献１】
須山正，金尾清造，「アミノ酸の脱炭酸（第４報）」，薬学雑誌，１９６５年，第８５巻，第６号，ｐ．５３１−５３３
【非特許文献２】
ミツノリハシモト、外４名，「ケミストリーレターズ（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｌｅｔｔｅｒｓ）」，１９８６年，ｐ．８９３−８９６
【非特許文献３】
セリアホワイトテーバー、ハーバートテーバー（Ｃｅｌｉａ ｗｈｉｔｅ ｔａｂｏｒ ａｎｄ Ｈｅｒｂｅｒｔ ｔａｂｏｒ），「マイクロバイオロジカルレビューズ（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ）」，１９８５年，第４９巻，ｐ．８１−９９
【非特許文献４】
シユアンメング（Ｓｈｉ−ｙｕａｎｍｅｎｇ）、外１名，「ジャーナルオブバクテリオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）」，１９９２年，第１７４巻，ｐ．２６５９−２６６９
【非特許文献５】
ジョージジョージオウ（Ｇｅｏｒｇｅ Ｇｅｏｒｇｉｏｕ））、外５名，「プロテインエンジニアリング（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）」，１９９６年，第９巻，第２号，ｐ．２３９−２４７
【非特許文献６】
向山光昭著，「工業有機化学」，第４版，東京化学同人，ｐ．２７０−２７３，２７５−２８１
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
トリ−ｎ−ブチルアミンおよび２，３，４，５−テトラヒドロピリジンが多く含有されているカダベリン・ジカルボン酸塩をポリマーの原料とする場合、たとえば、カダベリン・ジカルボン酸塩を含む原料からポリアミドを加熱重縮合で合成する際には、反応温度が高温であるため、カダベリン・ジカルボン酸塩に含まれるトリ−ｎ−ブチルアミンや２，３，４，５−テトラヒドロピリジンなどの塩基性化合物がポリアミドの分解反応を起こし得られたポリアミドに耐熱性が不足するといった問題点がある。
【００１４】
さらに、トリ−ｎ−ブチルアミンは、水性生物に有毒で、魚類に対する致死量は２０−４０ｍｇ／ｌであるといった問題点もある。
【００１５】
Ｌ−リジンを発酵法により製造する際に中和剤として塩酸を使用し、その発酵液から酵素法によりカダベリンを製造する際に中和剤として塩酸を使用すると、カダベリンを二塩酸塩として晶析することになる。そうするとカダベリン二塩酸塩をイオン交換法や抽出法などによりフリー化する必要があり、工程が複雑になり、溶媒が必要となったり副生成物などの廃棄処理が必要になったりする。
【００１６】
また、発酵装置および酵素調整装置は別々の反応器で行われることが一般的であり、装置のメンテナンスおよび管理が複雑になる。
【００１７】
また発酵液中にはアミノ酸が含まれているが、アミノ酸の水への溶解度は高く、また、カダベリン・ジカルボン酸塩の水への溶解度も高い。そのため水溶液から直接カダベリン・ジカルボン酸塩のみを晶析する事ができない。
【００１８】
またポリアミドに重合する際にカダベリン・ジカルボン酸塩中にアミノ酸が含まれていると、アミノ酸が重合されポリマーの分岐を起こしたり、ポリマーの結晶化度を低下させたりする。
【００１９】
本発明の課題は、このような不純物の少ないカダベリン・ジカルボン酸塩を、より簡単な製造プロセスで、発酵および酵素反応の際にアルカリ金属水酸化物または無機酸を中和剤に使用することなく、水溶液からカダベリン・ジカルボン酸塩を製造する方法を提供することである。
【００２０】
【課題を解決するための手段】
上記問題点を解決するために、本発明者らは、カダベリン・ジカルボン酸塩の製造方法について鋭意研究を行った結果、Ｌ−リジン・ジカルボン酸塩水溶液にＬ−リジン脱炭酸酵素を作用させることによりカダベリン・ジカルボン酸塩を効率的に得られることを見出した。
【００２１】
すなわち、本発明は、
「（１）Ｌ−リジン・ジカルボン酸塩水溶液に、Ｌ−リジン脱炭酸酵素を作用させ、反応液からカダベリン・ジカルボン酸塩を単離することを特徴とするカダベリン・ジカルボン酸塩の製造方法。
（２）２，３，４，５−テトラヒドロピリジンの含有量が１．４ｗｔ％以下のカダベリン・ジカルボン酸塩。
（３）トリ−ｎ−ブチルアミンの含有量が０．００６ｗｔ％以下のカダベリン・ジカルボン酸塩。
（４）上記（１）の方法で得られたカダベリン・ジカルボン酸塩または上記（２）あるいは（３）記載のカダベリン・ジカルボン酸塩を原料として含有するポリアミド。」である。
【００２２】
【発明の実施の形態】
カダベリンとは１，５−ペンタンジアミンのことであり、ポリマー原料として有用な化合物である。
【００２３】
本発明において、Ｌ−リジン脱炭酸酵素とは、少なくともＬ−リジンをカダベリンに転換させる酵素でありさえすれば、何等限定されるものではなく、Ｌ−リジン脱炭酸能以外の酵素作用も併せ持っていても良い。但し、その場合、本発明において、カダベリン・ジカルボン酸塩の製造に大きく支障をきたすような副反応等を引き起こすものは好ましくない。前記Ｌ−リジン脱炭酸酵素は、エシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２）株をはじめとするエシェリシア属微生物のみならず、多くの生物に存在することが知られている。
【００２４】
本発明において使用されるＬ−リジン脱炭酸酵素に特に制限はないが、例えば、バシラス・ハロドゥランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）、バシラス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、エシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、セレノモナス・ルミナンチウム（Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ）、ビブリオ・コレラ（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、ビブリオ・パラヘモリティカス（Ｖｉｂｒｉｏｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、ストレプトマイセス・コエリカーラ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ストレプトマイセス・ピロサス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｉｌｏｓｕｓ）、エイケネラ・コロデンス（Ｅｉｋｅｎｅｌｌａ ｃｏｒｒｏｄｅｎｓ）、イユバクテリウム・アシダミノフィルム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｉｄａｍｉｎｏｐｈｉｌｕｍ）、サルモネラ・ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、ハフニア・アルベイ（Ｈａｆｎｉａ ａｌｖｅｉ）、ナイセリア・メニンギチデス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、テルモプラズマ・アシドフィルム（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）、またはピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ）由来のものが好ましく用いられる。さらに好ましくは安全性の認められているエシェリシア・コリ由来のものである。
【００２５】
本発明における生成物は、アルカリ性の化合物であるカダベリンであるために、反応が進行するにつれ、反応液のｐＨはアルカリ側に変化していく。しかし、Ｌ−リジン・ジカルボン酸塩水溶液に、Ｌ−リジン脱炭酸酵素を作用させれば、反応液のｐＨを制御する必要がなく効率よくカダベリンを生産できる。
【００２６】
リジン発酵において培養ｐＨ調整にはアンモニアおよびジカルボン酸を使用することが好ましく、これら中和剤を用い培養ｐＨを５〜８に、特に好ましくはｐＨ７に制御するのがよい。なお中和剤の状態に制限はなく、気体、液体、固体または水溶液で使用される。特に好ましくは水溶液である。
【００２７】
本発明においては、Ｌ−リジン・ジカルボン酸塩水溶液は、好ましくは、Ｌ−リジン発酵微生物を培養した発酵液、より好ましくは、Ｌ−リジン発酵微生物を培養する際に、ジカルボン酸により培養液のｐＨを調整しながら行った発酵液である。その際に、Ｌ−リジン脱炭酸酵素活性を有する細胞として使用する微生物も特に制限はなく、好ましくはコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属またはブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する微生物であり、更に好ましくはコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）である。
【００２８】
使用する培地は、炭素源、窒素源、無機イオンおよび必要に応じその他有機成分を含有する培地が用いられる。例えば、炭素源としては、グルコース、ラクトース、ガラクトース、フラクトース、アラビノース、マルトース、キシロース、トレハロース、リボースや澱粉の加水分解物などの糖類、グリセロール、マンニトールやソルビトールなどのアルコール類、グルコン酸、フマル酸、クエン酸やコハク酸等の有機酸類を用いることができる。窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、尿素、アンモニアガス、アンモニア水等を用いることができる。有機微量栄養素としては、各種アミノ酸、ビタミンＢ１等のビタミン類、ＲＮＡ等の核酸類などの要求物質または酵母エキス等を適量含有させることが望ましい。それらの他に、必要に応じて、無機イオンとして、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添加される。なお、前記に列記した、炭素源、窒素源、有機微量栄養素、無機イオンの例示は、以下、典型培地成分群という。
【００２９】
更に好ましくは、コリネバクテリウム・グルタミカムの場合硫酸マグネシウム、クエン酸、硫酸鉄、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、リン酸カリウム、リン酸水素カリウム、尿素、Ｌ−スレオニン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−ロイシン、ビオチンおよびチアミンが含まれる培地である。
【００３０】
培養条件にも特に制限はなく、例えばコリネバクテリウム・グルタミカムの場合、好気条件下で１６〜１５０時間程度実施するのが良く、培養温度は２５℃〜４２℃に、特に好ましくは３０℃である。
【００３１】
中和剤として用いるジカルボン酸に特に制限はなく、好ましくは、官能基としては２つのカルボキシル基のみを有する脂肪族および／または芳香族のジカルボン酸である。官能基としては２つのカルボキシル基のみを有する脂肪族または芳香族のジカルボン酸とは、前記２つのカルボキシル基以外には、実質上、官能基が存在しないものである。ここでいう官能基とは、ポリアミド重合反応（反応条件としては、例えば、反応温度２５０〜２７０℃、圧力１０〜２０ｋｇ／ｃｍ^２で反応時間１から５時間）の際にアミノ基やカルボキシル基等と反応して、ポリマーの分岐を引き起こしたり、ポリマーの結晶化度を低下（結晶化度８０％以下）させるような基を指す。例えばアミノ基やカルボキシル基がこれに該当するが、それ以外には、酸性基（スルホン酸基、リン酸基、フェノール性水酸基等）や塩基性基（ヒドラジノ基等）やプロトニックな極性基（水酸基等）や開裂性を有する基（エポシキ基、過酸化基等）やその他反応性の高い基（イソシアナート基等）が該当することが多い。一方、ハロゲン置換基や芳香族性置換基は比較的安定であり、エーテル、エステル、アミド等も安定であり、官能性が低い場合が多い。
【００３２】
ジカルボン酸として、より好ましくは、以下の一般式（１）、（２）または（３）で示されるジカルボン酸である。
ＨＯＯＣ−（ＣＨ_２）_ｍ−ＣＯＯＨ （１）
（但し、一般式（１）において、ｍ＝０〜１６）
【００３３】
【化３】

【００３４】
【化４】

【００３５】
（但し、一般式（２）、（３）において、ｎ，ｏ，ｐ，ｑ＝０〜５）
更に好ましくは
一般式（１）において、
ｍ＝０〜１０
、および／または、該一般式（２）および／または（３）において、
ｎ，ｏ，ｐ，ｑ＝０〜１
である。
【００３６】
より更に好ましくは、アジピン酸、セバシン酸、１，１２−ドデカンジカルボン酸、コハク酸、イソフタル酸、テレフタル酸である。
【００３７】
水溶液中のＬ−リジンおよびジカルボン酸のモル比に制限はない。Ｌ−リジンは塩酸との塩を形成する際１：１のモル比でＬ−リジン・塩酸塩を形成する。そのためＬ−リジン・ジカルボン酸塩の状態では水溶液中にはＬ−リジンとジカルボン酸のモル比は１：０．５であるはずである。しかし、用いるＬ−リジン脱炭酸酵素の至適ｐＨ付近になるように調整するために、ジカルボン酸をさらに添加（Ｌ−リジン：ジカルボン酸＝１：０．５５〜０．７５［モル比］）することが好ましい。またはアルカリを添加する必要がある場合はアンモニアで調整することが好ましい。
【００３８】
Ｌ−リジン脱炭酸酵素は本来ビタミンＢ６と結合し存在するが、Ｌ−リジン・ジカルボン酸塩水溶液にビタミンＢ６を添加することにより、生産速度および反応収率を向上させることができる。ビタミンＢ６を添加する方法には特に制限はない。反応中に適宜添加しても良い。好ましくはＬ−リジン脱炭酸酵素が溶液状態であれば、酵素溶液中に添加することが好ましい。反応液中でのビタミンＢ６の濃度については特に制限はなく。好ましくは反応液に０．０５ｍＭのビタミンＢ６濃度となるように加えればよい。用いるビタミンＢ６に特に制限はない。好ましくは、ピリドキシン、ピリドキサミン、ピリドキサルおよびピリドキサルリン酸から選ばれる少なくとも１種である。さらに好ましくはピリドキサルリン酸である。
【００３９】
本発明において使用されるＬ−リジン脱炭酸酵素または、Ｌ−リジン脱炭酸酵素活性を有する細胞としては、特に制限はないが、例えば、Ｌ−リジン脱炭酸酵素が細胞内で高発現した組換え細胞（細胞内発現組み換え細胞）などを適当な培地で培養し、増殖した細胞を遠心分離、または、更に酵素の分離などの通常の方法により回収したものなどが挙げられる。
【００４０】
また、これとは別に、Ｌ−リジン脱炭酸酵素が細胞表面で局在化した組み換え細胞（細胞表面発現組み換え細胞）などを適当な培地で培養し、増殖した細胞を回収したものでも良い。
【００４１】
Ｌ−リジン脱炭酸酵素が細胞表面で局在化した組み換え細胞とは、少なくともＬ−リジン脱炭酸酵素が細胞表面に局在化している状態であり、細胞内に同時にＬ−リジン脱炭酸酵素が存在していても良い。
【００４２】
一方、細胞表面にＬ−リジン脱炭酸酵素を局在化させる具体的な方法としては、例えば、分泌シグナル配列の一部、細胞表面局在タンパク質の一部をコードする遺伝子配列、Ｌ−リジン脱炭酸酵素の構造遺伝子配列をこの順で有するＤＮＡを大腸菌に導入すればよい。
【００４３】
分泌シグナル配列の一部に制限はない。宿主においてタンパク質を分泌するために必要な配列であればよい。大腸菌においては、例えばリポプロテインの配列の一部であり、具体的には、アミノ酸配列としてＭＫＡＴＫＬＶＬＧＡＶＩＬＧＳＴＬＬＡＧＣＳＳＮＡＫＩＤＱ（アミノ酸の一文字表記）と翻訳される遺伝子配列であることが好ましい。
【００４４】
細胞表面局在タンパク質の一部をコードする遺伝子配列に特に制限はない。大腸菌においては、例えば外膜結合タンパク質の配列の一部であり、具体的にはＯｍｐＡ（外膜結合タンパク質）の４６番目のアミノ酸から１５９番目のアミノ酸までの配列の一部であることが好ましい。
【００４５】
Ｌ−リジン脱炭酸酵素遺伝子、リポプロテイン遺伝子およびＯｍｐＡ遺伝子をクローニングする方法に特に制限はない。既知の遺伝子情報に基づき、ＰＣＲ （ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）法を用いて必要な遺伝領域を増幅取得する方法、既知の遺伝子情報に基づきゲノムライブラリーやｃＤＮＡライブラリーより相同性や酵素活性を指標としてクローニングする方法などが挙げられる。例えばエシェリシア・コリ Ｋ１２株の染色体ＤＮＡよりＰＣＲ法を用いてＬ−リジン脱炭酸酵素をコードする遺伝子であるｃａｄＡ遺伝子またはｌｄｃ遺伝子をクローニングする。この際使用する染色体ＤＮＡはエシェリシア・コリ由来であればどの菌株由来でもよい。なお、本発明においては、これらの遺伝子は、遺伝的多形性などによる変異型も含む。遺伝的多形性とは、遺伝子上の自然突然変異により遺伝子の塩基配列が一部変化しているものをいう。
【００４６】
Ｌ−リジン脱炭酸酵素が細胞表面に局在化していることの確認は、例えばＬ−リジン脱炭酸酵素を抗原として作製した抗体により、細胞表面発現組み換え細胞を免疫反応後、包埋、薄切りし、電子顕微鏡（免疫電顕法）により観察することで確認できる。
【００４７】
本発明では、Ｌ−リジン脱炭酸酵素は、Ｌ−リジン脱炭酸酵素の細胞内もしくは細胞表面での活性が上昇した組換え細胞から調製されたものが好ましく使用できる。細胞内もしくは細胞表面でＬ−リジン脱炭酸酵素の活性を上昇させる方法に特に制限はない。具体的には、例えば、Ｌ−リジン脱炭酸酵素の酵素量を増加させる方法、もしくは酵素の構造遺伝子自体に変異を導入して、酵素そのものの比活性を上昇させることなどが挙げられる。
【００４８】
細胞内もしくは細胞表面の酵素量を増加させる手段としては、遺伝子の転写調節領域の改良、遺伝子のコピー数の増加、蛋白への翻訳の効率化などが挙げられる。
【００４９】
転写調節領域の改良とは、遺伝子の転写量を増加させる改変を加えることをいう。例えば、プロモーターに変異を導入することによってプロモーター強化を行い、下流にある遺伝子の転写量を増加させることができる。プロモーターに変異を導入する以外にも、宿主内で強力に発現するプロモーターを導入しても良い。例えば大腸菌においては、ｌａｃ、ｔａｃ、ｔｒｐなどのプロモーターが挙げられる。また、エンハンサーを新たに導入することによって遺伝子の転写量を増加させることができる。染色体ＤＮＡのプロモーター等の遺伝子導入については、例えば特開平１−２１５２８０号公報に記載されている。
【００５０】
遺伝子のコピー数の上昇は、具体的には、遺伝子を多コピー型のベクターに接続して組換えＤＮＡを作製し、該組換えＤＮＡを宿主細胞に保持させることにより達成することができる。ここでベクターとは、プラスミドやファージ等広く用いられているものを含むが、これら以外にも、トランソポゾン（バーグ，Ｄ．Ｅ．（Ｂｅｒｇ，Ｄ．Ｅ）、外１名，「バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」，１９８３年，第１巻，ｐ．４１７）やＭｕファージ（特開平２−１０９９８５号公報）も含む。遺伝子を相同組換え用プラスミド等を用いた方法で染色体に組み込んでコピー数を上昇させることも可能である。
【００５１】
蛋白の翻訳効率を上昇させる方法としては、例えば原核生物においてはＳＤ配列、真核生物ではＫｏｚａｋのコンセンサス配列を導入、改変することや、使用コドンの最適化（特開昭５９−１２５８９５号公報）などが挙げられる。
【００５２】
Ｌ−リジン脱炭酸酵素の細胞内もしくは細胞表面での活性を上昇させる手段としては、Ｌ−リジン脱炭酸酵素の構造遺伝子自体に変異を導入して、Ｌ−リジン脱炭酸酵素そのものの活性を上昇させることも挙げられる。
【００５３】
遺伝子に変異を生じさせるには、部位特異的変異法（クラマー，Ｗ．（Ｋｒａｍｅｒ，Ｗ．）、外１名，「メゾットインエンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）」，１９８７年，第１５４巻，ｐ．３５０）、リコンビナントＰＣＲ法、特定の部分のＤＮＡを化学合成する方法、または当該遺伝子をヒドロキシアミン処理する方法や当該遺伝子を保有する菌株を紫外線照射処理、もしくはニトロソグアニジンや亜硝酸などの化学薬剤で処理する方法がある。
【００５４】
組換え細胞としては、微生物、動物、植物、または昆虫由来のものが好ましく使用できる。例えば動物を用いる場合、マウス、ラットやそれらの培養細胞などが用いられる。植物を用いる場合、例えばシロイヌナズナ、タバコやそれらの培養細胞が用いられる。また、昆虫を用いる場合、例えばカイコやその培養細胞などが用いられる。また、微生物を用いる場合、例えば、大腸菌などが用いられる。
【００５５】
また、Ｌ−リジン脱炭酸酵素を複数種組み合わせて使用しても良い。
【００５６】
Ｌ−リジン脱炭酸酵素を得るために、組換え細胞を培養する方法に特に制限はないが、例えば微生物を培養する場合、使用する培地は、炭素源、窒素源、無機イオンおよび必要に応じその他有機成分を含有する培地が用いられる。例えば、大腸菌の場合しばしばＬＢ培地が用いられる。好ましい成分として、前記典型培地成分群があげられる。
【００５７】
更に好ましい培地は、Ｌ−リジン発酵を行った後の発酵液である。この発酵液にＬ−リジン脱炭酸酵素を得るために必要な栄養素を更に添加しても良い。
【００５８】
培養条件にも特に制限はなく、例えば大腸菌の場合、好気条件下で１６〜７２時間程度実施するのが良く、培養温度は３０℃〜４５℃に、特に好ましくは３７℃に、培養ｐＨは５〜８に、特に好ましくはｐＨ７に制御するのがよい。なおｐＨ調整には無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、さらにアンモニアガス等を使用することができる。
【００５９】
Ｌ−リジン脱炭酸酵素を高発現させた宿主がＬ−リジンまたはカダベリンまたはジカルボン酸を資化してしまう場合、Ｌ−リジン脱炭酸酵素を精製して用いる方が好ましい。
【００６０】
例えば、回収した細胞内発現組み換え細胞から細胞破砕液を調整するには、通常の方法が用いられる。すなわち、細胞内発現組み換え細胞を超音波処理、ダイノミル、フレンチプレス等の方法にて破砕し、遠心分離により細胞残渣を除去することにより細胞破砕液が得られる。
【００６１】
細胞破砕液からＬ−リジン脱炭酸酵素を精製するには、硫安分画、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、等電点沈殿、熱処理、ｐＨ処理など酵素の精製に通常用いられる手法が適宜組み合わされて用いられる。
【００６２】
工業的には精製方法は簡便な方がよく、部分的に精製したＬ−リジン脱炭酸酵素を作用させることが好ましい。部分的な精製とは、工業的に容易な処理のみ行うことであり例えば熱処理、ｐＨ処理等が挙げられる。好ましくは熱処理である。さらに好ましくは単離精製したＬ−リジン脱炭酸酵素を作用させることである。Ｌ−リジン脱炭酸酵素を部分的に精製、または単離精製することで、Ｌ−リジンの分解やカダベリンの分解またはジカルボン酸の分解を引き起こす酵素を取り除くことができる。
【００６３】
本発明で使用する精製されたＬ−リジン脱炭酸酵素は、固定化することで繰り返しカダベリン合成反応に使用することができ、酵素の調製に必要なコストを低減させることができる。固定化方法としては、アクリルアミドなどの合成高分子に包括する方法、セファロースやスチレン樹脂を骨格とするイオン交換性担体や疎水性担体に吸着させる方法、または、ガラス担体に共有結合で結合させる方法などが挙げられる。
【００６４】
さらに、Ｌ−リジン脱炭酸酵素が細胞表面に局在化している細胞を作用させれば、Ｌ−リジンの分解およびカダベリンの分解を抑制することができ、より高生産速度でカダベリンが得られる。さらにはその細胞を回収することで繰り返し酵素反応に利用することができる。しかも酵素の調整が非常に簡便である。
【００６５】
これらＬ−リジン脱炭酸酵素活性を有する細胞をゲル状担体により包括固定化すると、細胞および酵素が安定化し、酵素の繰り返し利用が簡便にできるようになる。
【００６６】
ゲル状担体としては、特に制限はない。高分子多糖類でも合成高分子でもよく、好ましくは高分子多糖類である。より好ましくは、アルギン酸、カッパーカラギーナンまたはポリアクリルアミドのいずれかであり、更に好ましくはカッパーカラギーナンである。
【００６７】
包括固定する方法に特に制限はない。Ｌ−リジン脱炭酸酵素活性が低下しない程度の穏和な条件で行うことが好ましい。
【００６８】
包括固定するゲル状担体の量に特に制限はない。調整したＬ−リジン脱炭酸酵素活性を有する細胞のすべてを包括固定できればよい。
【００６９】
一般的に酵素というものは本来あるべきアミノ酸配列で自然界に存在するため、人工的にアミノ酸配列を付与もしくは欠如させると酵素の活性を失うことが多い。しかし本発明において細胞内にＬ−リジン脱炭酸酵素を発現させる場合、Ｌ−リジン脱炭酸酵素のＮ末端アミノ酸配列に１から３０個のアミノ酸配列を付与したＬ−リジン脱炭酸酵素が好ましく使用できる。ここで、Ｎ末端に付与するものは６から１０個のヒスチジン残基が好ましい。このように、Ｎ末端アミノ酸配列にアミノ酸を付与することで、Ｌ−リジン脱炭酸酵素の精製を簡便にできるようにすることができる。Ｎ末端アミノ酸配列に１から３０個のアミノ酸を付与する方法に特に制限はない。例えばＬ−リジン脱炭酸酵素遺伝子に付与したいアミノ酸配列に相当する塩基配列を遺伝子工学的手法を用い、組み換えればよい。用いる遺伝子工学的手法に特に制限はないが。好ましくはＰＣＲ法やＤＮＡ断片同士の連結による方法がある。
【００７０】
Ｌ−リジン脱炭酸酵素によるＬ−リジン・ジカルボン酸塩水溶液からカダベリンへの変換は、上記のようにして得られるＬ−リジン脱炭酸酵素を、Ｌ−リジン・ジカルボン酸塩水溶液に接触させることによって行うことができる。
【００７１】
用いるＬ−リジン脱炭酸酵素の量に特に制限はない。Ｌ−リジン・ジカルボン酸塩水溶液をカダベリン・ジカルボン酸塩水溶液に変換する反応を触媒するのに十分な量であればよい。好ましくは反応液中の酵素濃度が２５から７０ｍｇ／ｌである。好ましくは５０ｍｇ／ｌである。一方、休止細胞を使用する際は、反応液中の細胞濃度が５から１５ｇ／ｌである。好ましくは１０ｇ／ｌである。
【００７２】
なお、本発明においてＬ−リジン脱炭酸酵素活性を有する細胞又はＬ−リジン脱炭酸酵素の活性は、後述の実施例６又は参考例１（２）の条件で，ＪＭ１０９／ｐＴＶ１１８Ｎ株又はその細胞破砕液の活性の、好ましくは１０（より好ましくは５０）倍以上である。
【００７３】
反応温度は、通常、２８〜５５℃、好ましくは３５〜４８℃である。
【００７４】
反応液の状態に特に制限はない。好ましくは静置または攪拌状態である。攪拌状態にする方法には特に制限はない。好ましくは攪拌翼により攪拌する方法である。
【００７５】
反応時間は、使用する酵素活性、Ｌ−リジン・ジカルボン酸塩濃度などの条件によって異なるが、通常、１〜７２時間である。また、反応は、Ｌ−リジン・ジカルボン酸塩を供給しながら連続的に行ってもよい。
【００７６】
このように生成したカダベリン・ジカルボン酸塩を反応終了後、反応液から採取する方法としては、通常の単離または晶析を用いれば良く、例えば、好ましくは反応液を濃縮し、有機溶媒を添加した晶析操作により採取できる。
【００７７】
晶析操作前に水溶液中のカダベリンとジカルボン酸を等モルに調整することが好ましい。更に好ましくはジカルボン酸を過剰に加える方がよい。
【００７８】
本発明で、反応液に添加する有機溶媒は、アルコール類、ケトン類またはニトリル類が好ましい。更に好ましくは、炭素数６以下の脂肪族アルコール類、炭素数６以下の脂肪族ケトン類または炭素数６以下の脂肪族ニトリル類である。
【００７９】
例えば有機溶媒の具体的例として、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、ヘキサノール、イソプロパノール、アセトニトリルまたはアセトン等が挙げられる。
【００８０】
その他、有機溶媒は単独である必要はなく、混合溶媒で有っても良い。例えば、エタノール・アセトン混合液等が挙げられる。
【００８１】
本発明で用いる有機溶媒量は特に限定されないが、カダベリン・ジカルボン酸塩を含む水溶液の重量に対して通常０．１〜５倍、本発明を特に効果的に実施するためには０．３〜２倍が使用される。あるいは、カダベリン・ジカルボン酸塩重量に対して、好ましくは１〜１０（より好ましくは３〜７）倍である。
【００８２】
カダベリン・ジカルボン酸塩を含む水溶液と有機溶媒との接触方法は任意であり、バッチ法であっても連続法であってもよい。
【００８３】
晶析を効率的に行うために、および釜効率を良くするためにカダベリン・ジカルボン酸塩を含む水溶液は濃縮するのが好ましい。濃縮の程度は、無機塩およびカダベリン・ジカルボン酸塩が結晶として析出しない程度が好ましい。水溶液中のカダベリン・ジカルボン酸塩濃度、その他の塩濃度によって濃縮の程度は変わるが、重量基準で１／４〜１／３０まで濃縮するのが好ましく、１／１０〜１／２０まで濃縮するのがより好ましい。
【００８４】
濃縮方法は常圧濃縮、減圧濃縮のいずれでもよいが、濃縮時の液温は通常、水の沸点以下で行われる。かかる液温とするとカダベリン・ジカルボン酸塩が分解する恐れがない。
【００８５】
このようにして、製造されたカダベリン・ジカルボン酸塩は、カダベリン１分子とジカルボン酸１分子よりなる塩であると考えて良いが、何等他の形態を排除するものでもなく、例えばカダベリン２分子とカルボン酸２分子より形成された塩等が含まれていても良い。
【００８６】
本発明の精製方法は、カダベリン・ジカルボン酸塩を含む水溶液に、不純物としてアミノ酸が含まれている場合の精製に特に有効である。含まれているアミノ酸に特に制限はない。好ましくは、非電荷・極性アミノ酸（グリシン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−システイン、Ｌ−チロシン、Ｌ−アスパラギンおよびＬ−グルタミン）、酸性アミノ酸（Ｌ−アスパラギン酸およびＬ−グルタミン酸）および塩基性アミノ酸（Ｌ−リジン、Ｌ−アルギニンおよびＬ−ヒスチジン）のいずれかが含まれている場合の精製に特に有効である。更に好ましくは、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸およびＬ−リジンのいずれかが含まれている場合である。本発明において、水溶液中に含まれるアミノ酸濃度は、好適には０．０１〜１重量％である。前記数値範囲の下限とを下回るとカダベリンの生成が困難となる可能性があり、一方、上限値を上回ると単離・晶析が困難となる恐れがあり、いずれも好ましくない。
【００８７】
次いで、濃縮工程で濃縮されたカダベリン・ジカルボン酸塩水溶液に有機溶媒を添加し、析出した結晶を遠心分離などの通常の固液分離の方法によって取り除き、この有機溶媒からカダベリン・ジカルボン酸塩を通常の晶析分離操作によりカダベリン・ジカルボン酸塩を単離する。例えば、有機溶媒を添加した濃縮液をそのまま冷却してカダベリン・ジカルボン酸塩を晶析した後、結晶を遠心分離などの通常の固液分離の方法によって単離すると高純度のカダベリン・ジカルボン酸塩を得ることができる。
【００８８】
晶析行程でカダベリン・ジカルボン酸塩から分離された有機溶媒は晶析操作にリサイクルすることが好ましい。
【００８９】
かくして単離したカダベリン・ジカルボン酸塩は再度既知の晶析精製方法で、つまり、有機溶媒で均一溶液とした後、その均一液を冷却したり、熱時ろ過したろ液を冷却したりしてカダベリン・ジカルボン酸塩を結晶化させ、高純度品にできる。
【００９０】
このようにして得られたカダベリン・ジカルボン酸塩は、トリ−ｎ−ブチルアミンおよび２，３，４，５−テトラヒドロピリジンなどの不純物が少ない。本発明の方法で製造することで、以下の方法で分析した場合に、トリ−ｎ−ブチルアミンの含有量が、０．００６ｗｔ％以下のカタベリン・ジカルボン酸塩が得られる。さらに、以下の方法で分析した場合に、２，３，４，５−テトラヒドロピリジンの含有量が１．４ｗｔ％以下のものが得られる。さらに、トリ−ｎ−ブチルアミンの含有量が、０．００６ｗｔ％以下であり、かつ、２，３，４，５−テトラヒドロピリジンの含有量が１．４ｗｔ％以下のものが得られる。
【００９１】
トリ−ｎ−ブチルアミンおよび２，３，４，５−テトラヒドロピリジンの分析は、ＧＣ−ＭＳ法によって以下の条件で行う。
【００９２】
ＧＣ−ＭＳ：ＨＰ６９８０／ＨＰ５９７３Ａ
カラム：ＮＵＫＯＬ ３０ｍ×０．２４ｍｍＩ．Ｄ． ０．２μｍ Ｆｉｌｍ
オーブン：１２０℃（一定）
インジェクト：２００℃（Ｓｐｌｉｔ １０：１）
流速：Ｈｅ ２．４ｍｌ／ｍｉｎ（一定）
ＭＳ：２３０℃（ＳＣＡＮ ｍ／ｚ＝３０から４００）
このようにして得られたカダベリン・ジカルボン酸塩は、ポリアミドの原料として有用である。
【００９３】
ポリアミドの製造方法としては、こうして得られたカダベリン・ジカルボン酸塩および水の混合物を、加熱して脱水反応を進行させる加熱重縮合法が用いられる。また、加熱重縮合後、固相重合することによって、分子量を上昇させることも可能である。固相重合は、１００℃から融点の温度範囲で、真空中、あるいは不活性ガス中で加熱することにより進行し、加熱重縮合では分子量が不十分なポリアミドを高分子量化することができる。
【００９４】
本発明で得られるカダベリン・ジカルボン酸塩をポリアミドの原料とすることで、耐熱性の高いポリアミドが得られる。
【００９５】
【実施例】
以下に実施例を示し、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例の記載に限定されるものではない。
【００９６】
［Ｌ−リジン濃度およびカダベリン濃度のＨＰＬＣによる分析方法］
使用カラム：ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８（資生堂）
移動相：０．１％（ｗ／ｗ）リン酸水溶液：アセトニトリル＝４．５：５．５
検出：ＵＶ３６０ｎｍ
サンプル前処理：分析サンプル２５μｌに内標として１，４−ジアミノブタン（０．０３Ｍ）を２５μｌ、炭酸水素ナトリウム（０．０７５Ｍ）を１５０μｌおよび２，４−ジニトロフルオロベンゼン（０．２Ｍ）のエタノール溶液を添加混合し３７℃で１時間保温する。上記反応溶液５０μｌを１ｍｌアセトニトリルに溶解後、１０，０００ｒｐｍで５分間遠心した後の上清１０μｌをＨＰＬＣ分析した。
【００９７】
［アジピン酸、コハク酸濃度のＨＰＬＣによる分析方法］
使用カラム：ＳＣＲ−１０１Ｈ（島津製作所）
移動相：０．０２５％（ｖ／ｖ）硫酸水溶液
検出：ＵＶ２１４ｎｍ
サンプル前処理：分析サンプルを、検量線が直線性を有することができる範囲内の濃度となるように、水で希釈し、１０μｌをＨＰＬＣ分析した。
【００９８】
参考例１（Ｌ−リジン脱炭酸酵素の調整）
（１）Ｌ−リジン脱炭酸酵素遺伝子のクローニングおよび細胞内発現ベクターの作製
Ｌ−リジン脱炭酸酵素を用いてＬ−リジン・ジカルボン酸塩からカダベリン・ジカルボン酸塩に変換させるために、エシェリシア・コリのＬ−リジン脱炭酸酵素遺伝子（ｃａｄＡ）のクローニングを行った。
【００９９】
データベース（ＧｅｎＢａｎｋ）に登録されているＬ−リジン脱炭酸酵素遺伝子（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｍ７６４１１）の塩基配列を参考にオリゴヌクレオチドプライマー５’−ａｔｇａａｃｇｔｔａｔｔｇｃａａｔａｔｔｇ−３’（配列番号：１）、５’−ｇｃｔｇａｔｇｇｇｔｇａｇａｔａｇａａｔｇ −３’（配列番号：２）を合成した。エシェリシア・コリＫ１２株（ＡＴＣＣ１０７９８）から常法に従い調整したゲノムＤＮＡの溶液を増幅鋳型として０．２ｍｌのミクロ遠心チューブに０．２μｌづつ取り、各プライマーを２０ｐｍｏｌ、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、２．５ｍＭ塩化カリウム、１００μｇ／ｍｌゼラチン、５０μＭ各ｄＮＴＰ、２単位 ＬＡＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造製）となるように各試薬を加え、全量を５０μｌとした。ＤＮＡの変性条件を９４℃、３０秒、プライマーのアニーリング条件を５５℃、３０秒、ＤＮＡプライマーの伸長反応条件を７２℃、３分の各条件でＢｉｏＲａｄ社のサーマルサイクラーを用い、３０サイクル反応させた（ポリメラーゼ連鎖反応：以後、ＰＣＲ法と記す）。尚、本実施例におけるＰＣＲ法は特に断らない限り、本条件にて行った。このＰＣＲ法により得られた産物を１％アガロースにて電気泳動し、ｃａｄＡ遺伝子を含む約２．１ｋｂのＤＮＡ断片を常法に従い調整した。この断片を、プラスミドベクターｐＴ７ｂｌｕｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＥｃｏＲＶ部位の３’−末端にＴ塩基が付加された間隙に、常法に従ったライゲーション反応により挿入し、得られたプラスミドをｐＴ７−ｃａｄＡと命名した。
【０１００】
このｐＴ７−ｃａｄＡを増幅鋳型として、オリゴヌクレオチド５’−ｃｇｃｃａｔｇｇｇｃｃａｔｃａｔｃａｔｃａｔｃａｔｃａｔｃａｔｃａｔａｔｇａａｃｇｔｔａｔｔｇｃａａｔａｔｔｇ−３’（配列番号：３）、５’−ｃｇｃｇｇａｔｃｃｇｃｔｇａｔｇｇｇｔｇａｇａｔａｇａａｔｇ−３’（配列番号：４）をプライマーセットとしたＰＣＲ法を行った。ここで得られる産物は、オリゴヌクレオチド（配列番号：３）由来の塩基配列と、オリゴヌクレオチド（配列番号：４）由来の塩基配列が、それぞれｃａｄＡ遺伝子を含むＤＮＡ断片の５’末端、および３’末端に付加されている。この産物を１％アガロースにて電気泳動し、約２．１ｋｂのＤＮＡ断片を常法に従い調整した。この断片を、プラスミドベクターｐＴ７ｂｌｕｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＥｃｏＲＶ部位の３’−末端にＴ塩基が付加された間隙に、常法に従ったライゲーション反応により挿入し、得られたプラスミドをｐＴ７−ｃａｄＡ１と命名した。
【０１０１】
このｐＴ７−ｃａｄＡ１をＮｃｏＩ、及びＢａｍＨＩで消化し、得られた２．１ｋｂのＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩ断片を、予めＮｃｏＩ、及びＢａｍＨＩで消化しておいたｐＴＶ１１８Ｎ（宝酒造製）のＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩ間隙に常法に従ったライゲーション反応により挿入し、得られたプラスミドをｐＬＤＣ１と命名した（図１）。このプラスミドを導入した大腸菌を培養することで、Ｌ−リジン脱炭酸酵素のＮ末端アミノ酸配列に６個のヒスジチン残基が付加された分子量約８０ｋＤａの組み換えＬ−リジン脱炭酸酵素を生産することができる。
【０１０２】
（２）組み換えＬ−リジン脱炭酸酵素の産生
ｐＬＤＣ１でエシェリシア・コリＪＭ１０９株をアンピシリン耐性に形質転換し、得られた形質転換体をＪＭ１０９／ｐＬＤＣ１株と命名した。
【０１０３】
次にＪＭ１０９／ｐＬＤＣ１株で組み換えＬ−リジン脱炭酸酵素を産生させた。まず、ＪＭ１０９／ｐＬＤＣ１株をそれぞれ５０μｇ／ｍｌのアンピシリンナトリウムを含んだ滅菌したＬＢ培地（ナカライテスク社製）（ＬＢ−ａｍｐ培地）５ｍｌに１白金耳植菌し、３７℃で２４時間振とうして前培養を行い、前培養液を得た。
【０１０４】
この前培養液をＬＢ−ａｍｐ培地５０ｍｌに全量植菌し、３７℃、振幅３０ｃｍで、１８０ｒｐｍの条件下で３時間培養した後にＩＰＴＧ（イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド）（１ｍＭ）添加し、更に４時間培養した。対照実験として、ＪＭ１０９株をｐＴＶ１１８Ｎで形質転換した形質転換体（以後、ＪＭ１０９／ｐＴＶ１１８Ｎ株とする）を用い同様の培養を行った。こうして得られた菌体を集め、５ｍｌのＴＢＳ緩衝液（宝酒造製）に再懸濁後、超音波破砕および遠心分離により細胞破砕液を調製した。これらのＬ−リジン脱炭酸酵素活性の測定を単位時間当たりに生成するカダベリンの濃度を測定することにより行った。その結果、対照実験であるＪＭ１０９／ｐＴＶ１１８Ｎ株由来の細胞破砕液に対して、ＪＭ１０９／ｐＬＤＣ１株においてはＬ−リジン脱炭酸酵素活性は約１００倍に上昇していた。また、この細胞破砕液をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分画し、Ｐｅｎｔａ−Ｈｉｓ Ａｎｔｉｂｏｄｙ抗体（ＱＩＡＧＥＮ社製）でウエスタンブロッティングを行った結果、ＪＭ１０９／ｐＬＤＣ１株由来の細胞破砕液のみから、分子量約８０ｋＤａの組み換えＬ−リジン脱炭酸酵素を検出した。
【０１０５】
（３）組み換えＬ−リジン脱炭酸酵素の精製
この組み換えＬ−リジン脱炭酸酵素は、Ｎ末端アミノ酸配列に６個のヒスチジン残基があることこから、ニッケルイオンとの相互作用を利用した精製を行った。
まず１０ｍｌのキレーティング セファロース ファースト フロー（Ｃｈｉｌａｔｉｎｇ ＳｅｐＨａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ）担体（アマシャム バイオサイエンス社製）を充填したカラムシステムを構築した。このカラムに５０ｍｌの５０ｍＭ硫酸ニッケル水溶液、５０ｍｌのＴＢＳ緩衝液の順で流した後、（２）と同様の方法で得られたＪＭ１０９／ｐＬＤＣ１株の５００ｍｌ培養液由来の５０ｍｌ細胞破砕液を流した。その後、１００ｍｌのイミダゾール（５ｍＭ）を含むＴＢＳ緩衝液、１００ｍｌのイミダゾール（５０ｍＭ）を含むＴＢＳ緩衝液をこの順序で流した。更に５０ｍｌのイミダゾール（６００ｍＭ）を含むＴＢＳ緩衝液を流した。カラムに流した各々の緩衝液のＬ−リジン脱炭酸酵素活性を（２）と同様の方法で測定したところ、イミダゾール（６００ｍＭ）を含むＴＢＳ緩衝液のみに活性があった。また、カラムに流した各々の緩衝液をＳＤＳ−ＰＡＧＥし、クマシーブリリアントブルーで染色たところ、イミダゾール（６００ｍＭ）を含むＴＢＳ緩衝液から、約８０ｋＤａの単一バンドを検出した。また、カラムに流した各々の緩衝液を（２）と同様の方法でウエスタンブロッティングを行ったところ、イミダゾール（６００ｍＭ）を含むＴＢＳ緩衝液のみに約８０ｋＤａタンパク質を検出し、この精製タンパク質はＬ−リジン脱炭酸酵素活性を有する組み換えＬ−リジン脱炭酸酵素であることを確認した。
【０１０６】
（４）Ｌ−リジン脱炭酸酵素の細胞表面発現ベクターの作製
まず、リポプロテインの配列の一部および外膜結合タンパク質（ＯｍｐＡ）の４６番目のアミノ酸から１５９番目のアミノ酸までの配列を一つのカセットとしてクローニングした。
【０１０７】
即ち、データベース（ＧｅｎＢａｎｋ）に登録されている外膜結合タンパク質（ｏｍｐＡ）（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＣ＿０００９１３）の塩基配列を参考にオリゴヌクレオチドプライマー５’−ａｔａａａｇｃｔｔａｔｇａａａｇｃｔａｃｔａａａｃｔｇｇ−３’（配列番号：５）５’−ａｔａｇｔｃｇａｃｇｔｔｇｔｃｃｇｇａｃｇａｇｔｇｃｃｇ−３’（配列番号：６）、５’−ａｔａａａｇｃｔｔａｔｇａａａｇｃｔａｃｔａａａｃｔｇｇｔａｃｔｇｇｇｃｇｃｇｇｔａａｔｃｃｔｇｇｇｔｔｃｔａｃｔｃｔｇｃｔｇｇｃａｇｇｔｔｇｃｔｃｃａｇｃａａｃｇｃｔａａａａｔｃｇａｔｃａｇａａｃｃｃｇｔａ−３’（配列番号：７）を合成した。エシェリシア・コリＫ１２株から常法に従い調整したゲノムＤＮＡの溶液を増幅鋳型として（配列番号：５）（配列番号：６）（配列番号：７）をプライマーセットとしたＰＣＲ法を行った。このＰＣＲ法により得られた産物を２％アガロースにて電気泳動し、ｏｍｐＡ遺伝子を含む約０．４ｋｂのＤＮＡ断片を常法に従い調整した。この断片を、プラスミドベクターｐＴ７ｂｌｕｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＥｃｏＲＶ部位の３’−末端にＴ塩基が付加された間隙に、常法に従ったライゲーション反応により挿入し、得られたプラスミドをｐＴＭ７と命名した。
【０１０８】
このｐＴＭ７をＨｉｎｄＩＩＩ、及びＳａｌＩで消化し、得られた約０．４ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ、ＳａｌＩ断片を、予めＨｉｎｄＩＩＩ、及びＳａｌＩで消化しておいたｐＵＣ１９（宝酒造製）のＨｉｎｄＩＩＩ／ＳａｌＩ間隙に常法に従ったライゲーション反応により挿入し、得られたプラスミドをｐＴＭ１４と命名した。
【０１０９】
次に、エシェリシア・コリＫ１２株のＬ−リジン脱炭酸酵素遺伝子（ｃａｄＡ）のクローニングを行った。
【０１１０】
データベース（ＧｅｎＢａｎｋ）に登録されているＬ−リジン脱炭酸酵素遺伝子の塩基配列を参考にオリゴヌクレオチドプライマー５’−ｔａｔｇｔｃｇａｃａｔｇａａｃｇｔｔａｔｔｇｃａａｔａｔ−３’（配列番号：８）、５’−ｇｇａｇａｇｃｔｃｔｔａｔｔｔｔｔｔｇｃｔｔｔｃｔｔｃｔｔｔ−３’（配列番号：９）を合成した。エシェリシア・コリＫ１２株から常法に従い調整したゲノムＤＮＡの溶液を増幅鋳型として（配列番号：８）（配列番号：９）をプライマーセットとしたＰＣＲ法を行った。
【０１１１】
このＰＣＲ法により得られた産物を１％アガロースにて電気泳動し、ｃａｄＡ遺伝子を含む約２．１ｋｂのＤＮＡ断片を常法に従い調整した。この断片を、プラスミドベクターｐＴ７ｂｌｕｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＥｃｏＲＶ部位の３’−末端にＴ塩基が付加された間隙に、常法に従ったライゲーション反応により挿入し、得られたプラスミドをｐＴＭ１５と命名した。
【０１１２】
これら調整したｐＴＭ１５をＳａｌＩ、及びＳａｃＩで消化し、得られた約２．１ｋｂのＳａｌＩ、ＳａｃＩ断片を、予めＳａｌＩ、及びＳａｃＩで消化しておいたｐＴＭ１４のＳａｌＩ／ＳａｃＩ間隙に常法に従ったライゲーション反応により挿入し、得られたプラスミドをｐＴＭ１６（図２）と命名した。
【０１１３】
このプラスミドを導入した大腸菌を培養することで、Ｌ−リジン脱炭酸酵素が細胞表面に局在化され、その大腸菌を回収するだけでＬ−リジン脱炭酸酵素を調整することができるようになる。
【０１１４】
（５）Ｌ−リジン脱炭酸酵素が細胞表面に局在化した細胞の調整
ｐＴＭ１６でエシェリシア・コリＪＭ１０９株をアンピシリン耐性に形質転換し、得られた形質転換体をＪＭ１０９／ｐＴＭ１６株と命名した。
【０１１５】
次にＪＭ１０９／ｐＴＭ１６株で組み換えＬ−リジン脱炭酸酵素を産生させた。まずＪＭ１０９／ｐＴＭ１６株をそれぞれ５０μｇ／ｍｌのアンピシリンナトリウムを含んだ滅菌ＬＢ培地（ＬＢ−ａｍｐ培地）５ｍｌに１白金耳植菌し、３７℃で２４時間振とうして前培養を行った。
【０１１６】
この前培養液をＬＢ−ａｍｐ培地５０ｍｌに全量植菌し、３７℃、振幅３０ｃｍで、１８０ｒｐｍの条件下で３時間培養した後にＩＰＴＧ（１ｍＭ）を添加し、更に４時間培養した。こうして得られた菌体を遠心回収し、１０ｍｌのＴＢＳ緩衝液（宝酒造製）で３回洗浄後、遠心し菌体を回収した。
【０１１７】
実施例１，２、比較例１（Ｌ−リジン・ジカルボン酸水溶液を用いることの効果）
１，０００ｍｌのフラスコに、表１に示すようにＬ−リジンまたはＬ−リジンおよびジカルボン酸を水溶液５００ｍｌに加えた。その後、終濃度５０ｍｇ／ｌになるように参考例１（３）で得た精製した組み換えＬ−リジン脱炭酸酵素および終濃度０．０５ｍＭになるようにピリドキサルリン酸を加え作用させた。４５℃で４８時間反応した後の反応液中に含まれるカダベリンの濃度を測定した。その結果を表１に示す。
【０１１８】
【表１】

【０１１９】
この結果、原料としてＬ−リジン・ジカルボン酸塩水溶液を用いると、ｐＨの調整をしなくてもカダベリン・ジカルボン酸塩が得られた。
【０１２０】
実施例３、比較例２（Ｌ−リジン発酵をジカルボン酸で中和することの効果）コリネバクテリウム・グルタミカ ＡＴＣＣ１３２８６株を滅菌ＬＢ培地５ｍｌに１白金耳植菌し、３０℃で２４時間振とうして前々培養を行って、前々培養液を得た。
【０１２１】
この前々培養液を滅菌ＬＢ培地５０ｍｌに全量植菌し、３０℃、振幅３０ｃｍで、１８０ｒｐｍの条件下で２４時間培養して前培養を行って、前培養液を得た。
【０１２２】
次に表２に示す発酵培地９５０ｍｌに前培養液全量を植菌し、滅菌した空気を１ｖｖｍ（１分間に培養液体積と同等の体積の空気を通気する）で通気しながら、３０℃、攪拌翼回転数８００ｒｐｍ、ｐＨを７に調整しながら７５時間培養を行った。中和剤として、滅菌したアジピン酸水溶液（１０ｇ／ｌ）およびアンモニア水（３Ｍ）（実施例３の場合）、もしくは、塩酸水溶液（３Ｍ）およびアンモニア水（３Ｍ）（比較例２の場合）で行った。 培養終了後、４℃、８，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離することで菌体を除去し、培養上清を回収した。この培養上清中に、実施例３および比較例２共に総量として１０ｇのＬ−リジンを生成した。
【０１２３】
【表２】

【０１２４】
次にそれぞれの培養上清に終濃度５０ｍｇ／ｌになるように参考例１（３）で得た精製した組み換えＬ−リジン脱炭酸酵素および終濃度０．０５ｍＭになるようにピリドキサルリン酸を加え、４５℃で４８時間作用させた。この反応液中に、実施例３および比較例２共に総量として６．６ｇのカダベリンを生成した。
【０１２５】
次にそれぞれの反応液を２Ｌ３つ口フラスコ内で減圧下で水を留去した。スラリーの粘度が上昇し攪拌操作性が悪化し始めたところで濃縮を終了した。素早く８０ｇのエタノールを加え、６５℃まで加熱し溶解させた。溶解せずに析出した結晶をろ過により固液分離した。その後均一に溶解したエタノールを徐々に冷却し、晶析、固液分離、乾燥した。実施例３では、カダベリン・アジピン酸の等モル塩である結晶１２．２ｇを得た。対して比較例２では、カダベリン二塩酸塩の結晶６．８ｇを得た。
【０１２６】
比較例２ではこの後さらに、得られたカダベリン二塩酸塩の結晶を水に溶解し、水酸化ナトリウムを添加し、この水溶液のｐＨを１３以上にした。次にクロロホルムを水溶液と等量加え、クロロホルム相にカダベリンを抽出した。最後にこのクロロホルム相を、減圧蒸留（３０ｍｍＨｇ、８０℃）することによりフリーのカダベリン３．６ｇを単離した。 この単離したカダベリンと等モルのアジピン酸５．１ｇを水に一旦溶解させ減圧下で水を留去し、乾燥することでカダベリン・アジピン酸の等モル塩である結晶８．７ｇを得た。
【０１２７】
この結果、Ｌ−リジン発酵を塩酸で中和せずに、アジピン酸で中和することでカダベリン・アジピン酸塩を得る工程が簡略化される。そのため当然ながら対原料収率が向上する。
【０１２８】
実施例４〜６（Ｌ−リジン脱炭酸酵素の状態の効果）
実施例３の方法と同様にＬ−リジン発酵を行い、総量として１０ｇのＬ−リジンを含む培養上清を得た。
【０１２９】
この培養上清に終濃度０．０５ｍＭになるようにピリドキサルリン酸を加え、最後に参考例１（２）および（５）に記載の方法により調整したＪＭ１０９／ｐＴＶ１１８Ｎ菌体（実施例６）、ＪＭ１０９／ｐＬＤＣ１菌体（実施例４）およびＪＭ１０９／ｐＴＭ１６菌体（実施例５）を加え、４５℃で２４時間作用させた。経時的にカダベリンの濃度を測定した結果を図３に示す。
【０１３０】
この結果、Ｌ−リジン脱炭酸酵素を細胞表面に局在化させることで高生産速度でカダベリンが得られた。
【０１３１】
実施例７（Ｌ−リジン発酵培地でＬ−リジン脱炭酸酵素を調整する効果）
実施例３の方法と同様にＬ−リジン発酵を行い、総量として１０ｇのＬ−リジンを含む培養上清を得た。
【０１３２】
この培養上清に終濃度１０ｇ／ｌになるように滅菌したグルコースを添加し、ＪＭ１０９／ｐＴＭ１６菌体を１白金耳植菌し、滅菌した空気を１ｖｖｍで通気しながら、３７℃、攪拌翼回転数４００ｒｐｍ、ｐＨを７に調整しながら２４時間培養を行った。中和剤として滅菌したアジピン酸水溶液（１０ｇ／ｌ）およびアンモニア水（３Ｍ）を使用した。培養終了後、４℃、８，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離することで菌体を除去し、培養上清を回収した。この培養上清中に、全量として６．８ｇのカダベリンを生成した。
【０１３３】
この培養上清を実施例３に記載の方法でカダベリン・アジピン酸塩を精製し、カダベリン・アジピン酸の等モル塩である結晶１２．５ｇを得た。
【０１３４】
この結果一つの発酵装置を用いるだけでカダベリン・アジピン酸を得ることができた。
【０１３５】
比較例３（既存の化学合成法によるカダベリンの調製）
Ｌ−リジン一塩酸塩２０ｇ（フルカ社製）シクロヘキサノール１００ｍｌ（シグマアルドリッチジャパン製）に懸濁し、次いで２８％ナトリウムメトキシド／メタノール溶液（シグマアルドリッチジャパン製）２１．２ｍｌ、３−メチル−シクロヘキセノン１ｍｌ（シグマアルドリッチジャパン製）を加え、１５５℃で３時間加熱撹拌した。反応終了後、反応混合物に塩化水素４ｇ（シグマアルドリッチジャパン製）を含むイソプロパノール溶液２０ｍｌ（シグマアルドリッチジャパン製）を加え、析出した生成物を回収し、乾燥することによりカダベリン二塩酸塩を得た（特開昭６０−２３３２８号公報の実施例３記載の方法）。
【０１３６】
得られたカダベリン二塩酸塩を水に溶解させ、この水溶液に、水酸化ナトリウム水溶液を添加することによってカダベリン二塩酸塩をカダベリンに変換し、クロロホルムで抽出して、減圧蒸留（３０ｍｍＨｇ、８０℃）することにより、カダベリンを得た。この単離したカダベリンと等モルのアジピン酸を水に一旦溶解させ減圧下で乾燥することでカダベリン・アジピン酸の等モル塩である結晶を得た。
【０１３７】
実施例３、６比較例３の不純物の同定
実施例３および６で得られたカダベリン・アジピン酸塩の不純物の分析を、下記に示す条件でＧＣ−ＭＳ法により行い、比較例３で調製したカダベリン・アジピン酸塩の不純物分析と比較した結果を表３に示す。
【０１３８】
ＧＣ−ＭＳ：ＨＰ６９８０／ＨＰ５９７３Ａ
カラム：ＮＵＫＯＬ ３０ｍ×０．２４ｍｍＩ．Ｄ． ０．２μｍ Ｆｉｌｍ
オーブン：１２０℃（一定）
インジェクト：２００℃（Ｓｐｌｉｔ １０：１）
流速：Ｈｅ ２．４ｍｌ／ｍｉｎ（一定）
ＭＳ：２３０℃（ＳＣＡＮ ｍ／ｚ＝３０から４００）
【０１３９】
【表３】

【０１４０】
この結果、Ｌ−リジン脱炭酸酵素を用い生成したカダベリンをカダベリン・アジピン酸塩に精製することにより、水性生物に有毒で、また酸と接触すると反応してしまうトリ−ｎ−ブチルアミンの含有量が０．００６ｗｔ％以下かつ２，３，４，５−テトラヒドロピリジンの含有量が１．４ｗｔ％以下の高純度カダベリン・アジピン酸塩が得られた。
【０１４１】
実施例７（ポリアミドの合成）
実施例３の方法で得られたカダベリン・アジピン酸の等モル塩を水に溶解させの５０ｗｔ％水溶液５０．０ｇを調整した。この溶液を試験管に仕込み、オートクレーブに入れて、密閉し、窒素置換した。ジャケット温度を２６５℃に設定し、加熱を開始した。缶内圧力が１７．５ｋｇ／ｃｍ^２に到達した後、缶内圧力を１７．５ｋｇ／ｃｍ^２で３時間保持した。その後、ジャケット温度を２７５℃に設定し、２時間かけて缶内圧力を常圧に放圧した。その後、缶内温度が２４５℃に到達した時点で、加熱を停止した。室温に放冷後、試験管をオートクレーブから取り出し、ポリアミドを得た。
【０１４２】
比較例４
比較例３の方法で得られたカダベリン・アジピン酸の等モル塩を水に溶解させ５０ｗｔ％水溶液５０．０ｇを調整し用いる以外は、実施例７と全く同様の方法でポリアミドを得た。
【０１４３】
実施例７，比較例４のポリアミドの評価
実施例７で得られたポリアミドおよび比較例４で得られたポリアミドを下記に示す方法で比較評価した。その結果を表４に示す。
［ポリアミド中の２，３，４，５−テトラヒドロピリジン、およびトリ−ｎ−ブチルアミンの定量（ＧＣ−ＭＳ）］
ポリアミド約１５ｇを精秤して、メタノールでソックスレー抽出し、その抽出液を、下記条件でＧＣ−ＭＳ分析して、ポリアミド中に含まれる２，３，４，５−テトラヒドロピリジン、およびトリ−ｎ−ブチルアミンを定量した。
装置：ヒューレットパッカード製 ＨＰ５８９０質量検出器
カラム：５％−ジフェニル−９５％−ジメチルポリシロキサン
カラム温度：Ｉｎｉｔｉａｌ １００℃
Ｆｉｎａｌ ２５０℃
昇温速度：１０℃／ｍｉｎ
注入口温度：２３０℃
検出器温度：２８０℃
キャリアガス：ヘリウム
注入口圧力：５０ｋｇ／ｃｍ^２
試料注入量：１μｌ。
【０１４４】
［ＤＳＣ（示差走査熱量測定）］
セイコー電子工業製 ロボットＤＳＣ ＲＤＣ２２０を用い、窒素雰囲気下、ポリアミドを約５ｍｇを採取し、次の条件で測定した。
融点＋２５℃に昇温して３分間保持し、ポリアミドを完全に融解させた後、２０℃／分の降温速度で、３０℃まで降温し、３分間保持した後、３０℃から融点＋２５℃まで２０℃／分の昇温速度で昇温したときに観測される吸熱ピークの温度、および熱量を求めた。
【０１４５】
［相対粘度（ηｒ）］
９８％硫酸中、０．０１ｇ／ｍｌ濃度、２５℃でオストワルド式粘度計を用いて測定を行った。
［溶融滞留試験］
試験管にポリアミド約５ｇを仕込み、窒素雰囲気下、融点＋２０℃の温度のシリコンバスに浸漬し、ポリアミドが完全に溶融してから３０分間放置した後、ポリアミドを回収して相対粘度測定を行った。
【０１４６】
【表４】

【０１４７】
その結果、本発明の方法によって得られた高純度カダベリン・ジカルボン酸塩を使用することにより、相対粘度（ηｒ）の保持率の高い（耐熱性の高い）ポリアミドが得られた。
【０１４８】
【発明の効果】
本発明によれば、一つの発酵装置で高反応収率、高生産速度および高純度でのカダベリン・ジカルボン酸塩の工業的製造方法およびカダベリン・ジカルボン酸塩の単離方法が提供される。
【０１４９】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】Ｌ−リジン脱炭酸酵素細胞内発現ベクターｐＬＤＣ１のフィジカルマップを示す図である。
【図２】Ｌ−リジン脱炭酸酵素細胞表面発現ベクターｐＴＭ１６のフィジカルマップを示す図である。
【図３】 実施例４〜６における時間とカダベリン生産量の関係を示す図である。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for producing cadaverine dicarboxylate. Cadaverine dicarboxylate is expected as a raw material for polyamide, and its demand is increasing.
[0002]
[Prior art]
Conventionally, it is known that cadaverine can be obtained by boiling L-lysine in cyclohexanol containing a small amount of tetralin peroxide (see Non-Patent Document 1). However, the high temperature reaction requires large amounts of energy and organic solvents, and the reaction yield is very low (36%).
[0003]
In addition, a method of synthesizing lysine using vinyl ketones such as 2-cyclohexen-1-one as a catalyst is known (see Non-Patent Document 2).
[0004]
Further, it is known that cadaverine can be obtained by heating and stirring L-lysine in cyclohexanol containing sodium methoxide with 3-methyl-cyclohexenone as a catalyst at 155 ° C. for 3 hours (see Patent Document 1).
[0005]
Moreover, cadaverine obtained by this method contains a basic compound such as tri-n-butylamine or 2,3,4,5-tetrahydropyridine as an impurity.
[0006]
In addition, cadaverine is a biogenic amine that is ubiquitous in living organisms, and its biosynthetic system is being elucidated (see Non-Patent Document 3). In addition, an L-lysine decarboxylase gene derived from Escherichia coli is known (see Non-Patent Document 4).
[0007]
Also, a method for producing cadaverine by fermentation with recombinant Escherichia coli (see Patent Document 2) and a method for producing cadaverine by enzymatic method using recombinant Escherichia coli (see Patent Document 3) are known.
[0008]
On the other hand, research on localizing proteins on the cell surface has been performed in many bacteria. Research on localizing proteins on the cell surface of Escherichia coli has been actively conducted (see Non-Patent Document 5).
[0009]
Further, a polyamide has been produced by purifying a free diamine and a free dicarboxylic acid as raw materials and then mixing them in equimolar amounts to carry out a polymerization reaction. Since conventional diamines and dicarboxylic acids use petroleum-derived raw materials, free diamines and dicarboxylic acids were obtained without particularly using a solvent (see Non-Patent Document 6). Therefore, there was no need to study the crystallization of diamine / dicarboxylic acid from the aqueous solution.
[0010]
However, in order to produce a polyamide raw material by a fermentation or enzyme method different from the chemical synthesis method, it is common to use water as a solvent, and to perform a fermentation or enzyme method, it is necessary to adjust the pH of the solution. Generally required. As these neutralizing agents, alkali metal hydroxides or inorganic acids are generally used, and diamines or dicarboxylic acids are crystallized as salts thereof. For example, in a production method by fermentation of succinic acid, which is a dicarboxylic acid, crystallization and purification are performed as calcium succinate (see Patent Document 4).
[0011]
However, no practical production technique has been established for the production of cadaverine dicarboxylate, and development of a method for producing high-purity cadaverine dicarboxylate with little by-product waste has been desired.
[0012]
[Patent Document 1]
JP-A-60-23328, pp. 11-12
[Patent Document 2]
JP-A-2002-223770, page 5
[Patent Document 3]
JP-A-2002-223771, pages 4 to 5
[Patent Document 4]
JP-A-62-294090, page 6
[Non-patent document 1]
Tadashi Suyama and Kiyozo Kanao, "Decarboxylation of Amino Acids (Report 4)", Pharmaceutical Magazine, 1965, Vol. 85, No. 6, p. 531-533
[Non-patent document 2]
Mitsunori Hashimoto, et al., “Chemistry Letters”, 1986, p. 893-896
[Non-Patent Document 3]
Ceria White Taber and Herbert Tabor, "Microbiological Reviews", 1985, Vol. 49, p. 81-99
[Non-patent document 4]
Shi-yuanengeng, et al., “Journal of Bacteriology”, 1992, Vol. 174, p. 2659-2669
[Non-Patent Document 5]
George Georgiou), five others, "Protein Engineering", 1996, Vol. 9, No. 2, p. 239-247
[Non-Patent Document 6]
Mitsuaki Mukoyama, "Industrial Organic Chemistry", 4th edition, Tokyo Chemical Doujin, p. 270-273, 275-281
[0013]
[Problems to be solved by the invention]
When cadaverine dicarboxylate containing a large amount of tri-n-butylamine and 2,3,4,5-tetrahydropyridine is used as a raw material of the polymer, for example, polyamide is heated from a raw material containing cadaverine dicarboxylate. When synthesizing by condensation, the reaction temperature is high, so that basic compounds such as tri-n-butylamine and 2,3,4,5-tetrahydropyridine contained in cadaverine dicarboxylate are decomposed by polyamide. There is a problem that the heat resistance of the resulting polyamide is insufficient.
[0014]
Furthermore, tri-n-butylamine is toxic to aquatic organisms and has a problem that the lethal dose to fish is 20 to 40 mg / l.
[0015]
When hydrochloric acid is used as a neutralizing agent when producing L-lysine by fermentation, and when hydrochloric acid is used as a neutralizing agent when producing cadaverine from the fermented liquor, cadaverine crystallizes as a dihydrochloride. Will do. In this case, cadaverine dihydrochloride needs to be made free by an ion exchange method, an extraction method, or the like, which complicates the process, requires a solvent, and requires disposal treatment of by-products and the like.
[0016]
In addition, the fermentation apparatus and the enzyme adjustment apparatus are generally performed in separate reactors, which makes maintenance and management of the apparatus complicated.
[0017]
Amino acids are contained in the fermentation broth, but the solubility of amino acids in water is high, and the solubility of cadaverine dicarboxylate in water is also high. Therefore, it is impossible to crystallize only cadaverine dicarboxylate directly from the aqueous solution.
[0018]
In addition, when an amino acid is contained in cadaverine dicarboxylate when polymerized into polyamide, the amino acid is polymerized to cause polymer branching or decrease the crystallinity of the polymer.
[0019]
An object of the present invention is to provide a cadaverine dicarboxylate having a small amount of such impurities in a simpler production process without using an alkali metal hydroxide or an inorganic acid as a neutralizing agent during fermentation and enzymatic reaction. And a method for producing cadaverine dicarboxylate from an aqueous solution.
[0020]
[Means for Solving the Problems]
In order to solve the above problems, the present inventors have conducted intensive studies on a method for producing cadaverine dicarboxylate, and found that L-lysine decarboxylase is allowed to act on an aqueous solution of L-lysine dicarboxylate. Found that cadaverine dicarboxylate can be obtained efficiently.
[0021]
That is, the present invention
"(1) A method for producing cadaverine dicarboxylate, comprising reacting L-lysine decarboxylate with an aqueous solution of L-lysine dicarboxylate to isolate cadaverine dicarboxylate from the reaction solution.
(2) A cadaverine dicarboxylate having a content of 2,3,4,5-tetrahydropyridine of 1.4% by weight or less.
(3) A cadaverine dicarboxylate having a tri-n-butylamine content of 0.006 wt% or less.
(4) A polyamide containing, as a raw material, the cadaverine dicarboxylate obtained by the method (1) or the cadaverine dicarboxylate according to the above (2) or (3). ".
[0022]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Cadaverine is 1,5-pentanediamine and is a useful compound as a polymer raw material.
[0023]
In the present invention, L-lysine decarboxylase is not particularly limited as long as it is an enzyme that converts at least L-lysine to cadaverine, and also has an enzymatic action other than L-lysine decarboxylability. May be. However, in that case, in the present invention, it is not preferable to cause a side reaction or the like that greatly hinders the production of cadaverine dicarboxylate. It is known that the L-lysine decarboxylase is present not only in Escherichia coli K12 strains and other microorganisms of the genus Escherichia, but also in many other organisms.
[0024]
There is no particular limitation on the L-lysine decarboxylase used in the present invention. For example, Bacillus halodurans, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Selenomonas luminantium (Bacillus subtilis). Selenomonas ruminantium, Vibrio cholera (Vibrio cholerae), Vibrio parahemolyticus (Vibrio parahaemolyticus), Streptomyces coelicar (Estr. rrodens), Eubacterium acididaminophilum, Salmonella typhimurium, Hafnia alvi (Hafnia alevimia, Neisseria meningitides amis), and Neisseria meningitis amides. Those derived from Pyrococcus abyssi are preferably used. More preferably, it is derived from Escherichia coli whose safety is recognized.
[0025]
Since the product in the present invention is cadaverine, which is an alkaline compound, the pH of the reaction solution changes toward the alkali side as the reaction proceeds. However, if L-lysine decarboxylate is allowed to act on the aqueous solution of L-lysine dicarboxylate, cadaverine can be produced efficiently without the need to control the pH of the reaction solution.
[0026]
In the lysine fermentation, it is preferable to use ammonia and dicarboxylic acid for adjusting the culture pH, and it is preferable to control the culture pH to 5 to 8, particularly preferably pH 7, using these neutralizing agents. The state of the neutralizing agent is not limited, and it is used as a gas, liquid, solid or aqueous solution. Particularly preferred is an aqueous solution.
[0027]
In the present invention, the aqueous solution of L-lysine dicarboxylate is preferably a fermented liquid obtained by culturing L-lysine fermenting microorganisms, and more preferably, when culturing L-lysine fermenting microorganisms, the culture liquid is diluted with dicarboxylic acid. It is a fermentation solution performed while adjusting the pH. At this time, the microorganism used as a cell having L-lysine decarboxylase activity is not particularly limited, and is preferably a microorganism belonging to the genus Corynebacterium or the genus Brevibacterium, and more preferably. Corynebacterium glutamicum (Corynebacterium glutamicum).
[0028]
As a medium to be used, a medium containing a carbon source, a nitrogen source, inorganic ions, and other organic components as necessary is used. For example, as a carbon source, glucose, lactose, galactose, fructose, arabinose, maltose, xylose, trehalose, sugars such as hydrolysates of ribose and starch, glycerol, alcohols such as mannitol and sorbitol, gluconic acid, fumaric acid, Organic acids such as citric acid and succinic acid can be used. As the nitrogen source, inorganic ammonium salts such as ammonium sulfate, ammonium chloride and ammonium phosphate, organic nitrogen such as soybean hydrolysate, urea, ammonia gas, aqueous ammonia and the like can be used. As organic trace nutrients, it is desirable to contain required amounts of various amino acids, vitamins such as vitamin B1, nucleic acids such as RNA, and yeast extract in an appropriate amount. In addition to these, calcium phosphate, calcium sulfate, iron ions, manganese ions, etc. are added in small amounts as necessary. The carbon sources, nitrogen sources, organic trace nutrients, and inorganic ions listed above are hereinafter referred to as typical medium components.
[0029]
More preferably, in the case of Corynebacterium glutamicum, magnesium sulfate, citric acid, iron sulfate, sodium chloride, calcium chloride, potassium phosphate, potassium hydrogen phosphate, urea, L-threonine, L-methionine, L-leucine, biotin And a thiamine-containing medium.
[0030]
The culturing conditions are not particularly limited. For example, in the case of Corynebacterium glutamicum, the culturing is preferably performed under aerobic conditions for about 16 to 150 hours, and the culturing temperature is preferably 25 ° C to 42 ° C, particularly preferably 30 ° C. is there.
[0031]
The dicarboxylic acid used as the neutralizing agent is not particularly limited, and is preferably an aliphatic and / or aromatic dicarboxylic acid having only two carboxyl groups as a functional group. An aliphatic or aromatic dicarboxylic acid having only two carboxyl groups as a functional group is one having substantially no functional group other than the two carboxyl groups. The functional group herein means a polyamide polymerization reaction (reaction conditions include, for example, a reaction temperature of 250 to 270 ° C. and a pressure of 10 to 20 kg / cm.²Reacts with an amino group or a carboxyl group during a reaction time of 1 to 5 hours to cause a branch of the polymer or reduce the crystallinity of the polymer (crystallinity of 80% or less). . For example, an amino group or a carboxyl group corresponds to this, but other than that, an acidic group (such as a sulfonic acid group, a phosphoric acid group, or a phenolic hydroxyl group), a basic group (such as a hydrazino group), or a protonic polar group ( A hydroxyl group, a cleavable group (epoxy group, peroxide group, etc.) and other highly reactive groups (isocyanate group, etc.) are often applicable. On the other hand, halogen substituents and aromatic substituents are relatively stable, and ethers, esters, amides and the like are also stable and often have low functionality.
[0032]
The dicarboxylic acid is more preferably a dicarboxylic acid represented by the following general formula (1), (2) or (3).
HOOC- (CH₂)_m-COOH (1)
(However, in the general formula (1), m = 0 to 16)
[0033]
Embedded image

[0034]
Embedded image

[0035]
(However, in the general formulas (2) and (3), n, o, p, and q = 0 to 5)
More preferably
In the general formula (1),
m = 0 to 10
And / or in the general formulas (2) and / or (3),
n, o, p, q = 0 to 1
It is.
[0036]
Still more preferred are adipic acid, sebacic acid, 1,12-dodecanedicarboxylic acid, succinic acid, isophthalic acid and terephthalic acid.
[0037]
There is no limitation on the molar ratio of L-lysine and dicarboxylic acid in the aqueous solution. L-lysine forms L-lysine hydrochloride in a molar ratio of 1: 1 when forming a salt with hydrochloric acid. Therefore, in the state of L-lysine dicarboxylate, the molar ratio of L-lysine to dicarboxylic acid in the aqueous solution should be 1: 0.5. However, dicarboxylic acid is further added (L-lysine: dicarboxylic acid = 1: 0.55 to 0.75 [molar ratio]) to adjust the pH of the L-lysine decarboxylase to be used so as to be around the optimum pH. Is preferred. Alternatively, when it is necessary to add an alkali, it is preferable to adjust with ammonia.
[0038]
L-Lysine decarboxylase naturally exists by binding to vitamin B6, but by adding vitamin B6 to an aqueous solution of L-lysine dicarboxylate, the production rate and reaction yield can be improved. There is no particular limitation on the method of adding vitamin B6. It may be appropriately added during the reaction. Preferably, when L-lysine decarboxylase is in a solution state, it is preferably added to the enzyme solution. There is no particular limitation on the concentration of vitamin B6 in the reaction solution. Preferably, it is added to the reaction solution so that the concentration of vitamin B6 becomes 0.05 mM. There is no particular limitation on the vitamin B6 used. Preferably, it is at least one selected from pyridoxine, pyridoxamine, pyridoxal and pyridoxal phosphate. More preferred is pyridoxal phosphate.
[0039]
The cell having L-lysine decarboxylase or L-lysine decarboxylase activity used in the present invention is not particularly limited. For example, recombinant cells in which L-lysine decarboxylase is highly expressed in cells are used. Cells (intracellularly expressed recombinant cells) or the like are cultured in an appropriate medium, and the grown cells are collected by a conventional method such as centrifugation or further separation of an enzyme.
[0040]
Alternatively, a recombinant cell in which L-lysine decarboxylase is localized on the cell surface (recombinant cell expressing the cell surface) or the like may be cultured in an appropriate medium, and the cells that have grown may be collected.
[0041]
A recombinant cell in which L-lysine decarboxylase is localized on the cell surface is a state in which at least L-lysine decarboxylase is localized on the cell surface, and L-lysine decarboxylase is simultaneously present in the cell. May be present.
[0042]
On the other hand, specific methods for localizing L-lysine decarboxylase on the cell surface include, for example, a part of a secretory signal sequence, a gene sequence encoding a part of a cell surface-localized protein, and L-lysine decarboxylase. The DNA having the structural gene sequence of carbonic enzyme in this order may be introduced into E. coli.
[0043]
There is no restriction on the part of the secretory signal sequence. Any sequence that is necessary for secreting the protein in the host may be used. In Escherichia coli, for example, it is a part of the lipoprotein sequence, and specifically, it is preferably a gene sequence translated as an amino acid sequence of MKATKLVLGAVILGSTLLAGCSSNAKIDQ (one letter code of amino acid).
[0044]
There is no particular limitation on the gene sequence encoding a part of the cell surface localized protein. In Escherichia coli, for example, it is a part of the sequence of the outer membrane binding protein, and specifically, it is preferably a part of the sequence from the 46th amino acid to the 159th amino acid of OmpA (outer membrane binding protein).
[0045]
The method for cloning the L-lysine decarboxylase gene, lipoprotein gene and OmpA gene is not particularly limited. A method of amplifying and obtaining a necessary genetic region by using a PCR (polymerase chain reaction) method based on known gene information, and cloning using a homology or enzyme activity as an index from a genomic library or a cDNA library based on known gene information. And the like. For example, the cadA gene or ldc gene, which is a gene encoding L-lysine decarboxylase, is cloned from the chromosomal DNA of Escherichia coli K12 strain by PCR. The chromosomal DNA used at this time may be derived from any strain as long as it is derived from Escherichia coli. In the present invention, these genes include mutants due to genetic polymorphism and the like. Genetic polymorphism refers to a gene in which the nucleotide sequence of a gene is partially changed due to a spontaneous mutation in the gene.
[0046]
To confirm that L-lysine decarboxylase is localized on the cell surface, for example, after performing an immunoreaction on the cell surface-expressing recombinant cells with an antibody prepared using L-lysine decarboxylase as an antigen, embed and slice. Can be confirmed by observation with an electron microscope (immunoelectron microscopy).
[0047]
In the present invention, as the L-lysine decarboxylase, those prepared from recombinant cells having an increased intracellular or cell surface activity of L-lysine decarboxylase can be preferably used. There is no particular limitation on the method for increasing the activity of L-lysine decarboxylase in the cell or on the cell surface. Specifically, for example, a method of increasing the amount of L-lysine decarboxylase enzyme, or introducing a mutation into the structural gene of the enzyme itself to increase the specific activity of the enzyme itself can be mentioned.
[0048]
Means for increasing the amount of the enzyme in the cell or on the cell surface include improving the transcriptional regulatory region of the gene, increasing the copy number of the gene, and increasing the efficiency of translation into a protein.
[0049]
Improving the transcription regulatory region means adding a modification that increases the amount of gene transcription. For example, the promoter can be strengthened by introducing a mutation into the promoter to increase the transcription amount of the downstream gene. In addition to introducing a mutation into a promoter, a promoter that is strongly expressed in a host may be introduced. For example, in Escherichia coli, promoters such as lac, tac, and trp are exemplified. Moreover, the transcription amount of a gene can be increased by newly introducing an enhancer. The introduction of a gene such as a promoter of chromosomal DNA is described in, for example, JP-A-1-215280.
[0050]
Specifically, the increase in the copy number of the gene can be achieved by connecting the gene to a multi-copy type vector to prepare a recombinant DNA, and retaining the recombinant DNA in a host cell. Here, the vector includes those widely used such as plasmids and phages, but in addition to these, transoposon (Berg, DE (Berg, DE)) and one other, “Bio / technology ( Bio / Technology), 1983, Vol. 1, p. 417) and Mu phage (JP-A-2-109985). It is also possible to increase the copy number by integrating the gene into the chromosome by a method using a homologous recombination plasmid or the like.
[0051]
Methods for increasing the translation efficiency of a protein include, for example, introduction and modification of an SD sequence in prokaryotes and a Kozak consensus sequence in eukaryotes, and optimization of codons to be used (JP-A-59-125895). And the like.
[0052]
Means for increasing the activity of L-lysine decarboxylase in cells or on the cell surface include introducing a mutation into the structural gene itself of L-lysine decarboxylase to increase the activity of L-lysine decarboxylase itself. There is also a thing to do.
[0053]
In order to generate a mutation in a gene, a site-directed mutagenesis method (Kramer, W.), et al., “Methods in Enzymology”, 1987, Vol. p.350), a recombinant PCR method, a method of chemically synthesizing a specific portion of DNA, a method of treating the gene with hydroxyamine, a method of irradiating a strain having the gene with ultraviolet light, or a chemical method such as nitrosoguanidine or nitrite. There is a method of treating with drugs.
[0054]
As the recombinant cells, those derived from microorganisms, animals, plants, or insects can be preferably used. For example, when using an animal, a mouse, a rat, or a cultured cell thereof is used. When a plant is used, for example, Arabidopsis thaliana, tobacco and their cultured cells are used. When insects are used, for example, silkworms and cultured cells thereof are used. When a microorganism is used, for example, Escherichia coli or the like is used.
[0055]
Further, a plurality of L-lysine decarboxylases may be used in combination.
[0056]
In order to obtain L-lysine decarboxylase, the method of culturing the recombinant cells is not particularly limited. For example, when culturing a microorganism, the medium used is a carbon source, a nitrogen source, inorganic ions, and other A medium containing an organic component is used. For example, in the case of E. coli, an LB medium is often used. Preferred components include the aforementioned typical medium components.
[0057]
A more preferred medium is a fermentation broth after performing L-lysine fermentation. Nutrients necessary for obtaining L-lysine decarboxylase may be further added to the fermented liquid.
[0058]
The culturing conditions are not particularly limited. For example, in the case of Escherichia coli, the culturing is preferably performed under aerobic conditions for about 16 to 72 hours, the culturing temperature is 30 to 45 ° C, particularly preferably 37 ° C, and the culturing pH is It is better to control the pH to 5 to 8, particularly preferably to pH 7. For pH adjustment, an inorganic or organic acidic or alkaline substance, furthermore, ammonia gas or the like can be used.
[0059]
When the host in which L-lysine decarboxylase is highly expressed assimilates L-lysine, cadaverine or dicarboxylic acid, it is preferable to purify and use L-lysine decarboxylase.
[0060]
For example, an ordinary method is used to prepare a cell lysate from the collected intracellularly expressed recombinant cells. That is, the cell-expressed recombinant cells are disrupted by sonication, dynomill, French press, or the like, and cell debris is obtained by removing cell residues by centrifugation.
[0061]
To purify L-lysine decarboxylase from cell lysate, ammonium sulfate fractionation, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, affinity chromatography, gel filtration chromatography, isoelectric point precipitation, heat treatment, pH treatment, etc. Techniques usually used for purification are used in appropriate combination.
[0062]
Industrially, a simpler purification method is preferred, and it is preferable to use a partially purified L-lysine decarboxylase. The partial purification means that only industrially easy treatment is performed, and examples thereof include heat treatment and pH treatment. Preferably, it is a heat treatment. More preferably, L-lysine decarboxylase isolated and purified is allowed to act. By partially purifying or isolating and purifying L-lysine decarboxylase, an enzyme that causes L-lysine degradation, cadaverine degradation, or dicarboxylic acid degradation can be removed.
[0063]
The purified L-lysine decarboxylase used in the present invention can be repeatedly used for cadaverine synthesis reaction by immobilization, and the cost required for enzyme preparation can be reduced. Examples of the immobilization method include a method involving inclusion in a synthetic polymer such as acrylamide, a method involving adsorption onto an ion-exchange carrier or a hydrophobic carrier having a sepharose or styrene resin skeleton, or a method involving covalent bonding to a glass carrier. Is mentioned.
[0064]
Furthermore, when a cell in which L-lysine decarboxylase is localized on the cell surface is allowed to act, the degradation of L-lysine and the degradation of cadaverine can be suppressed, and cadaverine can be obtained at a higher production rate. Further, by collecting the cells, the cells can be repeatedly used for an enzymatic reaction. Moreover, the adjustment of the enzyme is very simple.
[0065]
When these cells having L-lysine decarboxylase activity are entrapped and immobilized with a gel carrier, the cells and the enzyme are stabilized, and the enzyme can be easily reused.
[0066]
The gel carrier is not particularly limited. It may be a high molecular polysaccharide or a synthetic polymer, preferably a high molecular polysaccharide. More preferably, it is any of alginic acid, kappa carrageenan or polyacrylamide, and even more preferably kappa carrageenan.
[0067]
There is no particular limitation on the method of comprehensively fixing. It is preferable to perform the reaction under mild conditions such that the activity of L-lysine decarboxylase does not decrease.
[0068]
There is no particular limitation on the amount of the gel carrier to be entrapped and fixed. It suffices if all the cells having the adjusted L-lysine decarboxylase activity can be comprehensively fixed.
[0069]
In general, enzymes are naturally present in the natural amino acid sequence that should be present. Therefore, when an amino acid sequence is artificially added or deleted, the activity of the enzyme is often lost. However, when L-lysine decarboxylase is expressed in cells in the present invention, L-lysine decarboxylase in which 1 to 30 amino acid sequences are added to the N-terminal amino acid sequence of L-lysine decarboxylase can be preferably used. . Here, what is given to the N-terminal is preferably 6 to 10 histidine residues. As described above, by adding amino acids to the N-terminal amino acid sequence, L-lysine decarboxylase can be easily purified. There is no particular limitation on the method for providing 1 to 30 amino acids to the N-terminal amino acid sequence. For example, the base sequence corresponding to the amino acid sequence to be added to the L-lysine decarboxylase gene may be recombined using genetic engineering techniques. There are no particular restrictions on the genetic engineering technique used. Preferably, there is a PCR method or a method by ligation of DNA fragments.
[0070]
The conversion of the L-lysine dicarboxylate aqueous solution into the cadaverine by the L-lysine decarboxylase is carried out by bringing the L-lysine decarboxylase obtained as described above into contact with the L-lysine dicarboxylate aqueous solution. It can be carried out.
[0071]
There is no particular limitation on the amount of L-lysine decarboxylase used. Any amount is sufficient as long as it catalyzes the reaction for converting the aqueous solution of L-lysine dicarboxylate into the aqueous solution of cadaverine dicarboxylate. Preferably, the enzyme concentration in the reaction solution is 25 to 70 mg / l. Preferably it is 50 mg / l. On the other hand, when using resting cells, the cell concentration in the reaction solution is 5 to 15 g / l. Preferably it is 10 g / l.
[0072]
In the present invention, the activity of cells having L-lysine decarboxylase activity or L-lysine decarboxylase activity was determined by the JM109 / pTV118N strain or cell disruption thereof under the conditions of Example 6 or Reference Example 1 (2) described later. It is preferably at least 10 (more preferably 50) times the activity of the liquid.
[0073]
The reaction temperature is generally 28 to 55C, preferably 35 to 48C.
[0074]
The state of the reaction solution is not particularly limited. It is preferably in a standing or stirring state. There is no particular limitation on the method of stirring. Preferably, stirring is performed by a stirring blade.
[0075]
The reaction time varies depending on conditions such as the enzyme activity and L-lysine dicarboxylate concentration used, but is usually 1 to 72 hours. Further, the reaction may be continuously performed while supplying L-lysine dicarboxylate.
[0076]
After completion of the reaction, the cadaverine dicarboxylate thus formed may be collected from the reaction solution by a conventional isolation or crystallization method.For example, preferably, the reaction solution is concentrated, and an organic solvent is added. It can be collected by the following crystallization operation.
[0077]
It is preferable to adjust cadaverine and dicarboxylic acid in the aqueous solution to be equimolar before the crystallization operation. It is more preferable to add a dicarboxylic acid in excess.
[0078]
In the present invention, the organic solvent to be added to the reaction solution is preferably an alcohol, a ketone or a nitrile. More preferred are aliphatic alcohols having 6 or less carbon atoms, aliphatic ketones having 6 or less carbon atoms, and aliphatic nitriles having 6 or less carbon atoms.
[0079]
For example, specific examples of the organic solvent include methanol, ethanol, propanol, butanol, hexanol, isopropanol, acetonitrile, and acetone.
[0080]
In addition, the organic solvent does not need to be used alone, and may be a mixed solvent. For example, a mixed solution of ethanol and acetone may be used.
[0081]
The amount of the organic solvent used in the present invention is not particularly limited, but is usually 0.1 to 5 times the weight of the aqueous solution containing cadaverine dicarboxylate, and 0.3 to 5 times in order to particularly effectively carry out the present invention. Twice is used. Alternatively, it is preferably 1 to 10 (more preferably 3 to 7) times the weight of cadaverine dicarboxylate.
[0082]
The method of contacting the aqueous solution containing cadaverine dicarboxylate with the organic solvent is arbitrary, and may be a batch method or a continuous method.
[0083]
The aqueous solution containing cadaverine dicarboxylate is preferably concentrated for efficient crystallization and for improving the pot efficiency. The concentration is preferably such that the inorganic salt and cadaverine dicarboxylate do not precipitate as crystals. Although the degree of concentration varies depending on the concentration of cadaverine dicarboxylate and other salts in the aqueous solution, the concentration is preferably 1/4 to 1/30 by weight, more preferably 1/10 to 1/20. Is more preferred.
[0084]
The concentration method may be either normal pressure concentration or reduced pressure concentration, but the liquid temperature during concentration is usually lower than the boiling point of water. At such a liquid temperature, there is no fear that the cadaverine dicarboxylate is decomposed.
[0085]
The cadaverine dicarboxylate thus produced may be considered to be a salt composed of one molecule of cadaverine and one molecule of dicarboxylic acid, but it does not exclude any other form, for example, two molecules of cadaverine. A salt formed from two molecules of carboxylic acid may be contained.
[0086]
The purification method of the present invention is particularly effective for purification when an aqueous solution containing cadaverine dicarboxylate contains an amino acid as an impurity. There is no particular limitation on the amino acids contained. Preferably, uncharged and polar amino acids (glycine, L-serine, L-threonine, L-cysteine, L-tyrosine, L-asparagine and L-glutamine), acidic amino acids (L-aspartic acid and L-glutamic acid) and bases It is particularly effective for purification when any of the amino acids (L-lysine, L-arginine and L-histidine) is contained. More preferably, it contains any of L-aspartic acid, L-glutamic acid and L-lysine. In the present invention, the concentration of the amino acid contained in the aqueous solution is preferably 0.01 to 1% by weight. If it is below the lower limit of the above numerical range, it may be difficult to produce cadaverine, while if it exceeds the upper limit, isolation and crystallization may be difficult, and both are not preferred.
[0087]
Next, an organic solvent is added to the aqueous solution of cadaverine dicarboxylate concentrated in the concentration step, and the precipitated crystals are removed by a usual solid-liquid separation method such as centrifugation, and the cadaverine dicarboxylate is usually removed from the organic solvent. The cadaverine dicarboxylate is isolated by a crystallization separation operation. For example, after cooling the concentrated solution to which the organic solvent is added as it is to crystallize cadaverine dicarboxylate, the crystals are isolated by a usual solid-liquid separation method such as centrifugation to obtain high-purity cadaverine dicarboxylate. Can be obtained.
[0088]
The organic solvent separated from cadaverine dicarboxylate in the crystallization step is preferably recycled to the crystallization operation.
[0089]
The cadaverine dicarboxylate thus isolated is again purified by a known crystallization purification method, that is, after forming a homogeneous solution with an organic solvent, cooling the homogeneous solution, or cooling the filtrate filtered while hot. Cadaverine dicarboxylate can be crystallized to produce high purity products.
[0090]
The cadaverine dicarboxylate obtained in this way is low in impurities such as tri-n-butylamine and 2,3,4,5-tetrahydropyridine. By producing by the method of the present invention, a cataverine dicarboxylate having a tri-n-butylamine content of 0.006 wt% or less can be obtained when analyzed by the following method. Furthermore, when analyzed by the following method, a product having a content of 2,3,4,5-tetrahydropyridine of 1.4 wt% or less is obtained. Further, a product having a tri-n-butylamine content of 0.006 wt% or less and a 2,3,4,5-tetrahydropyridine content of 1.4 wt% or less is obtained.
[0091]
Analysis of tri-n-butylamine and 2,3,4,5-tetrahydropyridine is performed by GC-MS under the following conditions.
[0092]
GC-MS: HP6980 / HP5973A
Column: NUKOL 30m × 0.24mmI. D. 0.2μm Film
Oven: 120 ° C (constant)
Injection: 200 ° C (Split 10: 1)
Flow rate: He 2.4 ml / min (constant)
MS: 230 ° C (SCAN m / z = 30 to 400)
The cadaverine dicarboxylate thus obtained is useful as a raw material for polyamide.
[0093]
As a method for producing a polyamide, a heating polycondensation method in which a mixture of cadaverine dicarboxylate and water thus obtained is heated to progress a dehydration reaction is used. Further, it is also possible to increase the molecular weight by performing solid phase polymerization after the heat polycondensation. Solid-state polymerization proceeds by heating in a vacuum or an inert gas at a temperature in the range of 100 ° C. to a melting point, and heating polycondensation can increase the molecular weight of a polyamide having an insufficient molecular weight.
[0094]
By using cadaverine dicarboxylate obtained in the present invention as a raw material for polyamide, a polyamide having high heat resistance can be obtained.
[0095]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples, but the present invention is not limited to these Examples.
[0096]
[Method for analyzing L-lysine concentration and cadaverine concentration by HPLC]
Column used: CAPCELL PAK C18 (Shiseido)
Mobile phase: 0.1% (w / w) phosphoric acid aqueous solution: acetonitrile = 4.5: 5.5
Detection: UV 360 nm
Sample pretreatment: 25 μl of 1,4-diaminobutane (0.03 M), 150 μl of sodium bicarbonate (0.075 M) and ethanol of 2,4-dinitrofluorobenzene (0.2 M) as an internal standard in 25 μl of an analysis sample The solution is added and mixed and incubated at 37 ° C. for 1 hour. After dissolving 50 µl of the above reaction solution in 1 ml of acetonitrile, 10 µl of the supernatant after centrifugation at 10,000 rpm for 5 minutes was analyzed by HPLC.
[0097]
[Analysis method of adipic acid and succinic acid concentration by HPLC]
Column used: SCR-101H (Shimadzu Corporation)
Mobile phase: 0.025% (v / v) sulfuric acid aqueous solution
Detection: UV 214 nm
Sample pretreatment: The analytical sample was diluted with water so that the calibration curve had a concentration within a range capable of having linearity, and 10 μl was analyzed by HPLC.
[0098]
Reference Example 1 (Preparation of L-lysine decarboxylase)
(1) Cloning of L-lysine decarboxylase gene and preparation of intracellular expression vector
In order to convert L-lysine dicarboxylate into cadaverine dicarboxylate using L-lysine decarboxylase, the L-lysine decarboxylase gene (cadA) of Escherichia coli was cloned.
[0099]
Oligonucleotide primers 5'-atgaacgttatttgcaatttg-3 '(SEQ ID NO: 1) and 5'-gctgatggggtaggatagatag- 3 ′ (SEQ ID NO: 2) was synthesized. A genomic DNA solution prepared according to a conventional method from Escherichia coli K12 strain (ATCC10798) was used as an amplification template in a 0.2 ml microcentrifuge tube in an amount of 0.2 μl, and each primer was 20 pmol in 20 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0). ), 2.5 mM potassium chloride, 100 μg / ml gelatin, 50 μM each dNTP, 2 units LATaq DNA polymerase (manufactured by Takara Shuzo), and added each reagent to make a total volume of 50 μl. DNA denaturation conditions were 94 ° C for 30 seconds, primer annealing conditions were 55 ° C for 30 seconds, DNA primer extension reaction conditions were 72 ° C for 3 minutes, and a reaction was performed for 30 cycles using a BioRad thermal cycler. (Polymerase chain reaction: hereinafter referred to as PCR method). The PCR method in this example was performed under the same conditions unless otherwise specified. The product obtained by this PCR method was electrophoresed on 1% agarose, and a DNA fragment of about 2.1 kb containing the cadA gene was prepared according to a conventional method. This fragment was inserted into a gap where a T base was added to the 3′-end of the EcoRV site of a plasmid vector pT7blue (manufactured by Novagen) by a ligation reaction according to a conventional method, and the resulting plasmid was designated as pT7-cadA. Named.
[0100]
This pT7-cadA was used as an amplification template, and the oligonucleotide 5'-cgccatggggccatcatcatcatcatcatcatcatatgaacgttattgcaatattg-3 '(SEQ ID NO: 3), and a primer set using the primer sequence of a primer set using primers with the 5'-cgcggatccgctgggggccgctggggggtggatagatagataga-3). The product obtained here has the nucleotide sequence derived from the oligonucleotide (SEQ ID NO: 3) and the nucleotide sequence derived from the oligonucleotide (SEQ ID NO: 4) at the 5 ′ end and 3 ′ of the DNA fragment containing the cadA gene, respectively. At the end. This product was electrophoresed on 1% agarose, and a DNA fragment of about 2.1 kb was prepared according to a conventional method. This fragment was inserted into a gap where a T base was added to the 3′-end of the EcoRV site of a plasmid vector pT7blue (manufactured by Novagen) by a ligation reaction according to a conventional method, and the resulting plasmid was inserted into pT7-cadA1. Named.
[0101]
This pT7-cadA1 was digested with NcoI and BamHI, and the obtained 2.1 kb NcoI-BamHI fragment was inserted into the NcoI / BamHI gap of pTV118N (Takara Shuzo) previously digested with NcoI and BamHI. And the resulting plasmid was named pLDC1 (FIG. 1). By culturing Escherichia coli into which this plasmid was introduced, it was possible to produce a recombinant L-lysine decarboxylase having a molecular weight of about 80 kDa in which six histidine residues were added to the N-terminal amino acid sequence of L-lysine decarboxylase. it can.
[0102]
(2) Production of recombinant L-lysine decarboxylase
Escherichia coli JM109 strain was transformed with pLDC1 to ampicillin resistance, and the obtained transformant was designated as JM109 / pLDC1 strain.
[0103]
Next, recombinant L-lysine decarboxylase was produced in the JM109 / pLDC1 strain. First, one loop of JM109 / pLDC1 was inoculated into 5 ml of a sterilized LB medium (manufactured by Nacalai Tesque, Inc.) (LB-amp medium) containing 50 μg / ml of sodium ampicillin, and shaken at 37 ° C. for 24 hours. Preculture was performed to obtain a preculture solution.
[0104]
This preculture solution was inoculated in its entirety into 50 ml of LB-amp medium, cultured at 37 ° C., 30 cm in amplitude and 180 rpm for 3 hours, and then IPTG (isopropyl-1-thio-β-D-galactoside) (1 mM). Was added and the cells were further cultured for 4 hours. As a control experiment, a similar culture was carried out using a transformant obtained by transforming the JM109 strain with pTV118N (hereinafter referred to as the JM109 / pTV118N strain). The cells thus obtained were collected, resuspended in 5 ml of TBS buffer (Takara Shuzo), and then a cell lysate was prepared by sonication and centrifugation. These L-lysine decarboxylase activities were measured by measuring the concentration of cadaverine produced per unit time. As a result, the L-lysine decarboxylase activity was increased about 100-fold in the JM109 / pLDC1 strain compared to the cell lysate derived from the JM109 / pTV118N strain as a control experiment. The cell lysate was fractionated by SDS-PAGE and subjected to Western blotting with a Penta-His Antibody antibody (manufactured by QIAGEN). L-Lysine decarboxylase was detected.
[0105]
(3) Purification of recombinant L-lysine decarboxylase
Since this recombinant L-lysine decarboxylase has six histidine residues in the N-terminal amino acid sequence, it was purified using the interaction with nickel ions.
First, a column system packed with 10 ml of a chelating Sepharose Fast Flow carrier (manufactured by Amersham Bioscience) was constructed. After flowing 50 ml of a 50 mM nickel sulfate aqueous solution and 50 ml of a TBS buffer solution in this order, a 50 ml cell lysate derived from a 500 ml culture of the JM109 / pLDC1 strain obtained in the same manner as in (2) was flowed. . Thereafter, a TBS buffer containing 100 ml of imidazole (5 mM) and a TBS buffer containing 100 ml of imidazole (50 mM) were flowed in this order. An additional 50 ml of TBS buffer containing imidazole (600 mM) was flushed. When the L-lysine decarboxylase activity of each buffer solution passed through the column was measured in the same manner as in (2), only the TBS buffer solution containing imidazole (600 mM) had activity. In addition, when each buffer solution passed through the column was subjected to SDS-PAGE and stained with Coomassie brilliant blue, a single band of about 80 kDa was detected from the TBS buffer solution containing imidazole (600 mM). When each buffer solution passed through the column was subjected to Western blotting in the same manner as in (2), about 80 kDa protein was detected only in the TBS buffer solution containing imidazole (600 mM). It was confirmed to be a recombinant L-lysine decarboxylase having lysine decarboxylase activity.
[0106]
(4) Preparation of L-lysine decarboxylase cell surface expression vector
First, a part of the lipoprotein sequence and the sequence from the 46th amino acid to the 159th amino acid of the outer membrane binding protein (OmpA) were cloned as one cassette.
[0107]
That is, referring to the nucleotide sequence of the outer membrane-associated protein (ompA) (Accession No. NC_000913) registered in the database (GenBank), the oligonucleotide primer 5′-ataaagctttattagaagctactataaactgg-3 ′ (sequence number: 5) 5′-ataggtcgtggtggccgccggtggcc -3 '(SEQ ID NO: 6), 5'-ataaaactctgaaagctactaaaactggtactggggcgcggtaatcctgggttctactactctgctggcaggttggtcctgcaacgctacgac sequence. A PCR method was performed using a solution of genomic DNA prepared from Escherichia coli K12 according to a conventional method as an amplification template and using (SEQ ID NO: 5) (SEQ ID NO: 6) (SEQ ID NO: 7) as a primer set. The product obtained by this PCR method was electrophoresed on 2% agarose, and a DNA fragment of about 0.4 kb containing the ompA gene was prepared according to a conventional method. This fragment was inserted into a gap where a T base was added to the 3′-end of the EcoRV site of a plasmid vector pT7blue (manufactured by Novagen) by a conventional ligation reaction, and the resulting plasmid was named pTM7. .
[0108]
This pTM7 was digested with HindIII and SalI, and the obtained approximately 0.4 kb HindIII and SalI fragment was inserted into the HindIII / SalI space of pUC19 (Takara Shuzo) previously digested with HindIII and SalI in the usual manner. The resulting plasmid was inserted by a ligation reaction, and the resulting plasmid was named pTM14.
[0109]
Next, the L-lysine decarboxylase gene (cadA) of the Escherichia coli K12 strain was cloned.
[0110]
Oligonucleotide primers 5'-tatgtcgcatatgaacgttattgcaatat-3 '(SEQ ID NO: 8) and 5'-ggagagctctttttttttgctttttcttttt-3' (sequence number) with reference to the base sequence of the L-lysine decarboxylase gene registered in the database (GenBank). 9) was synthesized. A PCR method was performed using a solution of genomic DNA prepared from Escherichia coli K12 according to a conventional method as an amplification template and (SEQ ID NO: 8) (SEQ ID NO: 9) as a primer set.
[0111]
The product obtained by this PCR method was electrophoresed on 1% agarose, and a DNA fragment of about 2.1 kb containing the cadA gene was prepared according to a conventional method. This fragment was inserted into a gap where a T base was added to the 3′-end of the EcoRV site of a plasmid vector pT7blue (manufactured by Novagen) by a conventional ligation reaction, and the resulting plasmid was named pTM15. .
[0112]
The thus prepared pTM15 was digested with SalI and SacI, and the obtained 2.1 kb SalI and SacI fragment was inserted into the SalI / SacI gap of pTM14 which had been digested with SalI and SacI in a conventional manner. The plasmid was inserted by the ligation reaction and the resulting plasmid was named pTM16 (FIG. 2).
[0113]
By culturing Escherichia coli into which this plasmid has been introduced, L-lysine decarboxylase is localized on the cell surface, and L-lysine decarboxylase can be adjusted only by collecting the E. coli.
[0114]
(5) Preparation of cells in which L-lysine decarboxylase is localized on the cell surface
Escherichia coli JM109 strain was transformed into ampicillin resistance using pTM16, and the obtained transformant was designated as JM109 / pTM16 strain.
[0115]
Next, recombinant L-lysine decarboxylase was produced in JM109 / pTM16 strain. First, one loopful of the JM109 / pTM16 strain was inoculated into 5 ml of a sterilized LB medium (LB-amp medium) containing 50 μg / ml of sodium ampicillin, and precultured by shaking at 37 ° C. for 24 hours.
[0116]
This preculture was inoculated in its entirety into 50 ml of LB-amp medium, cultured at 37 ° C., at an amplitude of 30 cm, and at 180 rpm for 3 hours, and then added with IPTG (1 mM) and further cultured for 4 hours. The cells thus obtained were collected by centrifugation, washed three times with 10 ml of TBS buffer (Takara Shuzo), and then centrifuged to collect the cells.
[0117]
Examples 1 and 2, Comparative Example 1 (Effects of Using L-Lysine / Dicarboxylic Acid Aqueous Solution)
In a 1,000 ml flask, L-lysine or L-lysine and dicarboxylic acid were added to 500 ml of the aqueous solution as shown in Table 1. Thereafter, the purified recombinant L-lysine decarboxylase obtained in Reference Example 1 (3) was added to a final concentration of 50 mg / l, and pyridoxal phosphate was added to a final concentration of 0.05 mM to act. After reacting at 45 ° C. for 48 hours, the concentration of cadaverine contained in the reaction solution was measured. Table 1 shows the results.
[0118]
[Table 1]

[0119]
As a result, when an aqueous solution of L-lysine dicarboxylate was used as a raw material, cadaverine dicarboxylate was obtained without adjusting the pH.
[0120]
Example 3, Comparative Example 2 (Effect of neutralizing L-lysine fermentation with dicarboxylic acid) One loopful of Corynebacterium glutamica ATCC13286 was inoculated into 5 ml of sterilized LB medium and shaken at 30 ° C for 24 hours. Then, pre-pre-culture was performed to obtain a pre-pre-culture solution.
[0121]
The pre-pre-culture solution was inoculated into 50 ml of a sterilized LB medium in its entirety, and cultured for 24 hours at 30 ° C., an amplitude of 30 cm and 180 rpm to obtain a pre-culture solution.
[0122]
Next, 950 ml of the fermentation medium shown in Table 2 was inoculated with the entire amount of the pre-culture solution, and stirred at 30 ° C. while passing sterilized air at 1 vvm (aeration of the same volume as the culture solution volume per minute). The culture was performed for 75 hours while adjusting the blade rotation speed to 800 rpm and the pH to 7. As a neutralizing agent, a sterilized adipic acid aqueous solution (10 g / l) and aqueous ammonia (3 M) (in the case of Example 3), or a hydrochloric acid aqueous solution (3 M) and aqueous ammonia (3 M) (in the case of Comparative Example 2) went. After completion of the culture, the cells were removed by centrifugation at 8,000 rpm for 10 minutes at 4 ° C., and the culture supernatant was recovered. In this culture supernatant, 10 g of L-lysine was produced in total in both Example 3 and Comparative Example 2.
[0123]
[Table 2]

[0124]
Next, the purified recombinant L-lysine decarboxylase obtained in Reference Example 1 (3) was added to each culture supernatant to a final concentration of 50 mg / l, and pyridoxalphosphate was added to a final concentration of 0.05 mM. Acted for 48 hours at 45 ° C. In this reaction solution, 6.6 g of cadaverine was produced in both Example 3 and Comparative Example 2 in total.
[0125]
Next, water was distilled off from each reaction solution under reduced pressure in a 2 L three-necked flask. The concentration was terminated when the viscosity of the slurry increased and the stirring operability began to deteriorate. 80 g of ethanol was quickly added and heated to 65 ° C. to dissolve. Crystals precipitated without dissolution were separated into solid and liquid by filtration. Thereafter, the uniformly dissolved ethanol was gradually cooled, crystallized, solid-liquid separated, and dried. In Example 3, 12.2 g of a crystal which was an equimolar salt of cadaverine / adipic acid was obtained. On the other hand, in Comparative Example 2, 6.8 g of cadaverine dihydrochloride crystals were obtained.
[0126]
In Comparative Example 2, the obtained crystals of cadaverine dihydrochloride were further dissolved in water, and sodium hydroxide was added to adjust the pH of the aqueous solution to 13 or more. Next, chloroform was added in the same amount as the aqueous solution, and cadaverine was extracted into the chloroform phase. Finally, 3.6 g of free cadaverine was isolated by vacuum distillation (30 mmHg, 80 ° C.) of the chloroform phase. 5.1 g of adipic acid equimolar to the isolated cadaverine was once dissolved in water, the water was distilled off under reduced pressure, and the residue was dried to obtain 8.7 g of crystals as equimolar salts of cadaverine-adipic acid. .
[0127]
As a result, the step of obtaining cadaverine adipate by neutralizing L-lysine fermentation with adipic acid without neutralizing with hydrochloric acid is simplified. Therefore, the yield to raw materials is naturally improved.
[0128]
Examples 4 to 6 (Effect of state of L-lysine decarboxylase)
L-Lysine fermentation was carried out in the same manner as in Example 3 to obtain a culture supernatant containing 10 g of L-lysine in total.
[0129]
To this culture supernatant, pyridoxal phosphate was added to a final concentration of 0.05 mM, and finally JM109 / pTV118N cells (Example 6) and JM109 prepared by the methods described in Reference Examples 1 (2) and (5). / PLDC1 cells (Example 4) and JM109 / pTM16 cells (Example 5) were added and allowed to act at 45 ° C. for 24 hours. FIG. 3 shows the results of measuring the concentration of cadaverine over time.
[0130]
As a result, cadaverine was obtained at a high production rate by localizing L-lysine decarboxylase on the cell surface.
[0131]
Example 7 (Effect of adjusting L-lysine decarboxylase in L-lysine fermentation medium)
L-Lysine fermentation was carried out in the same manner as in Example 3 to obtain a culture supernatant containing 10 g of L-lysine in total.
[0132]
Glucose sterilized to a final concentration of 10 g / l was added to the culture supernatant, one platinum loop of JM109 / pTM16 cells was inoculated, and the sterilized air was supplied at 1 vvm while rotating at 37 ° C. with stirring blades. Culturing was performed for 24 hours while adjusting the pH to 7 at several 400 rpm. A sterilized aqueous solution of adipic acid (10 g / l) and aqueous ammonia (3 M) were used as neutralizing agents. After completion of the culture, the cells were removed by centrifugation at 8,000 rpm for 10 minutes at 4 ° C., and the culture supernatant was recovered. In this culture supernatant, 6.8 g of cadaverine was produced in a total amount.
[0133]
The cadaverine adipate was purified from the culture supernatant by the method described in Example 3 to obtain 12.5 g of crystals, which are equimolar salts of cadaverine adipate.
[0134]
As a result, cadaverine-adipic acid could be obtained using only one fermentation apparatus.
[0135]
Comparative Example 3 (Preparation of cadaverine by existing chemical synthesis method)
20 g of L-lysine monohydrochloride (manufactured by Fluka) and 100 ml of cyclohexanol (manufactured by Sigma-Aldrich Japan) are suspended in the suspension, followed by 21.2 ml of a 28% sodium methoxide / methanol solution (manufactured by Sigma-Aldrich Japan), 3-methyl-cyclohexenone 1 ml (manufactured by Sigma-Aldrich Japan) was added, and the mixture was heated and stirred at 155 ° C. for 3 hours. After completion of the reaction, 20 ml of an isopropanol solution (manufactured by Sigma-Aldrich Japan) containing 4 g of hydrogen chloride (manufactured by Sigma-Aldrich Japan) was added to the reaction mixture, and the precipitated product was collected and dried to obtain cadaverine dihydrochloride ( Method described in Example 3 of JP-A-60-23328).
[0136]
The obtained cadaverine dihydrochloride is dissolved in water, and cadaverine dihydrochloride is converted to cadaverine by adding an aqueous sodium hydroxide solution to the aqueous solution, extracted with chloroform, and distilled under reduced pressure (30 mmHg, 80 ° C.). As a result, cadaverine was obtained. The isolated cadaverine and an equimolar amount of adipic acid were once dissolved in water and dried under reduced pressure to obtain a crystal as an equimolar salt of cadaverine-adipic acid.
[0137]
Examples 3 and 6 Identification of impurities in Comparative Example 3
Analysis of impurities of cadaverine adipate obtained in Examples 3 and 6 was performed by GC-MS under the following conditions, and the results were compared with those of cadaverine adipate prepared in Comparative Example 3. Are shown in Table 3.
[0138]
GC-MS: HP6980 / HP5973A
Column: NUKOL 30m × 0.24mmI. D. 0.2μm Film
Oven: 120 ° C (constant)
Injection: 200 ° C (Split 10: 1)
Flow rate: He 2.4 ml / min (constant)
MS: 230 ° C (SCAN m / z = 30 to 400)
[0139]
[Table 3]

[0140]
As a result, by purifying cadaverine produced using L-lysine decarboxylase to cadaverine adipate, the content of tri-n-butylamine that is toxic to aqueous organisms and reacts when contacted with acid is reduced. A high-purity cadaverine adipate having a content of 0.006 wt% or less and a content of 2,3,4,5-tetrahydropyridine of 1.4 wt% or less was obtained.
[0141]
Example 7 (Synthesis of polyamide)
An equimolar salt of cadaverine / adipic acid obtained by the method of Example 3 was dissolved in water to prepare 50.0 g of a 50 wt% aqueous solution. This solution was charged into a test tube, placed in an autoclave, sealed, and replaced with nitrogen. The jacket temperature was set at 265 ° C. and heating was started. The pressure inside the can is 17.5kg / cm², The pressure in the can is increased to 17.5 kg / cm²For 3 hours. Thereafter, the jacket temperature was set to 275 ° C., and the pressure in the can was released to normal pressure over 2 hours. Thereafter, when the temperature in the can reached 245 ° C., the heating was stopped. After cooling to room temperature, the test tube was taken out of the autoclave to obtain a polyamide.
[0142]
Comparative Example 4
A polyamide was obtained in exactly the same manner as in Example 7, except that the equimolar salt of cadaverine-adipic acid obtained by the method of Comparative Example 3 was dissolved in water to prepare and use 50.0 g of a 50 wt% aqueous solution.
[0143]
Evaluation of the polyamides of Example 7 and Comparative Example 4
The polyamide obtained in Example 7 and the polyamide obtained in Comparative Example 4 were comparatively evaluated by the following method. Table 4 shows the results.
[Quantification of 2,3,4,5-tetrahydropyridine and tri-n-butylamine in polyamide (GC-MS)]
About 15 g of polyamide was precisely weighed and subjected to Soxhlet extraction with methanol. The extract was subjected to GC-MS analysis under the following conditions, and the 2,3,4,5-tetrahydropyridine and tri-n contained in the polyamide were analyzed. -Butylamine was quantified.
Equipment: Hewlett-Packard HP5890 mass detector
Column: 5% -diphenyl-95% -dimethylpolysiloxane
Column temperature: Initial 100 ° C
Final 250 ° C
Heating rate: 10 ° C / min
Inlet temperature: 230 ° C
Detector temperature: 280 ° C
Carrier gas: helium
Inlet pressure: 50 kg / cm²
Sample injection volume: 1 μl.
[0144]
[DSC (Differential Scanning Calorimetry)]
Using a robot DSC RDC220 manufactured by Seiko Denshi Kogyo, about 5 mg of polyamide was sampled under a nitrogen atmosphere and measured under the following conditions.
After the temperature was raised to the melting point + 25 ° C. and held for 3 minutes to completely melt the polyamide, the temperature was lowered to 30 ° C. at a rate of 20 ° C./min. The temperature of the endothermic peak and the calorific value observed when the temperature was raised at a rate of 20 ° C./min were determined.
[0145]
[Relative viscosity (ηr)]
The measurement was carried out in 98% sulfuric acid at 0.01 g / ml at 25 ° C. using an Ostwald viscometer.
[Melting retention test]
About 5 g of polyamide was charged into a test tube, immersed in a silicon bath having a temperature of melting point + 20 ° C. in a nitrogen atmosphere, and allowed to stand for 30 minutes after the polyamide was completely melted. Then, the polyamide was recovered and the relative viscosity was measured. .
[0146]
[Table 4]

[0147]
As a result, by using the high-purity cadaverine dicarboxylate obtained by the method of the present invention, a polyamide having a high relative viscosity (ηr) retention rate (high heat resistance) was obtained.
[0148]
【The invention's effect】
According to the present invention, there is provided an industrial production method of cadaverine dicarboxylate and a method of isolating cadaverine dicarboxylate with high reaction yield, high production rate and high purity in one fermentation apparatus.
[0149]
[Sequence list]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows a physical map of L-lysine decarboxylase intracellular expression vector pLDC1.
FIG. 2 shows a physical map of L-lysine decarboxylase cell surface expression vector pTM16.
FIG. 3 is a graph showing the relationship between time and cadaverine production in Examples 4 to 6.

Claims (19)

Ｌ−リジン・ジカルボン酸塩水溶液に、Ｌ−リジン脱炭酸酵素を作用させ、反応液からカダベリン・ジカルボン酸塩を単離することを特徴とするカダベリン・ジカルボン酸塩の製造方法。A method for producing cadaverine dicarboxylate, comprising reacting L-lysine decarboxylate with an aqueous solution of L-lysine dicarboxylate to isolate cadaverine dicarboxylate from the reaction solution. Ｌ−リジン・ジカルボン酸塩水溶液に、Ｌ−リジン脱炭酸酵素を作用させ、反応液から晶析工程によりカダベリン・ジカルボン酸塩を回収することを特徴とするカダベリン・ジカルボン酸塩の製造方法。A method for producing cadaverine dicarboxylate, comprising reacting L-lysine decarboxylate with an aqueous solution of L-lysine dicarboxylate and recovering cadaverine dicarboxylate from the reaction solution by a crystallization step. 該Ｌ−リジン・ジカルボン酸塩水溶液が、Ｌ−リジン発酵微生物を培養する際に、ジカルボン酸により培養液のｐＨを調整しながら行った発酵液であることを特徴とする請求項１または２に記載のカダベリン・ジカルボン酸塩の製造方法。3. The method according to claim 1, wherein the L-lysine dicarboxylate aqueous solution is a fermentation solution obtained by adjusting the pH of the culture solution with dicarboxylic acid when culturing the L-lysine fermentation microorganism. A method for producing the cadaverine dicarboxylate according to the above. 該Ｌ−リジン発酵微生物が、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属および／またはブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属であることを特徴とする請求項３記載のカダベリン・ジカルボン酸塩の製造方法。4. The method for producing cadaverine dicarboxylate according to claim 3, wherein the L-lysine fermenting microorganism belongs to the genus Corynebacterium and / or the genus Brevibacterium. 該ジカルボン酸が、官能基としては２つのカルボキシル基のみを有する脂肪族および／または芳香族のジカルボン酸であることを特徴とする請求項１から４のいずれかに記載のカダベリン・ジカルボン酸塩の製造方法。The cadaverine dicarboxylate according to any one of claims 1 to 4, wherein the dicarboxylic acid is an aliphatic and / or aromatic dicarboxylic acid having only two carboxyl groups as a functional group. Production method. ジカルボン酸が、以下の一般式（１）、（２）または（３）で示されるジカルボン酸のいずれかであることを特徴とする請求項５に記載のカダベリン・ジカルボン酸塩の製造方法。
ＨＯＯＣ−（ＣＨ_２）_ｍ−ＣＯＯＨ （１）
（但し、一般式（１）において、ｍ＝０〜１６）

（但し、一般式（２）、（３）において、ｎ，ｏ，ｐ，ｑ＝０〜５）The method for producing cadaverine dicarboxylate according to claim 5, wherein the dicarboxylic acid is any of dicarboxylic acids represented by the following general formulas (1), (2) or (3).
_{HOOC- (CH 2) m -COOH (} 1)
(However, in the general formula (1), m = 0 to 16)

(However, in general formulas (2) and (3), n, o, p, and q = 0 to 5) 該一般式（１）において、
ｍ＝０〜１０
、および／または、該一般式（２）および／または（３）において、
ｎ，ｏ，ｐ，ｑ＝０〜１
のいずれかであることを特徴とする請求項５に記載のカダベリン・ジカルボン酸塩の製造方法。In the general formula (1),
m = 0 to 10
And / or in the general formulas (2) and / or (3),
n, o, p, q = 0 to 1
The method for producing cadaverine dicarboxylate according to claim 5, wherein: 該ジカルボン酸が、アジピン酸、セバシン酸、１，１２−ドデカンジカルボン酸、コハク酸、イソフタル酸またはテレフタル酸のいずれかであることを特徴とする請求項５に記載のカダベリン・ジカルボン酸塩の製造方法。6. The cadaverine dicarboxylate according to claim 5, wherein the dicarboxylic acid is any of adipic acid, sebacic acid, 1,12-dodecanedicarboxylic acid, succinic acid, isophthalic acid and terephthalic acid. Method. 請求項３から８のいずれかに記載の発酵液を用い、Ｌ−リジン脱炭酸酵素を調製することを特徴とする請求項１から８のいずれかに記載のカダベリン・ジカルボン酸塩の製造方法。The method for producing cadaverine dicarboxylate according to any one of claims 1 to 8, wherein L-lysine decarboxylase is prepared using the fermentation solution according to any one of claims 3 to 8. 該Ｌ−リジン脱炭酸酵素が、Ｌ−リジン脱炭酸酵素活性を有する細胞のＬ−リジン脱炭酸酵素であることを特徴とする請求項１から９のいずれかに記載のカダベリン・ジカルボン酸塩の製造方法。The cadaverine dicarboxylate according to any one of claims 1 to 9, wherein the L-lysine decarboxylase is L-lysine decarboxylase of a cell having L-lysine decarboxylase activity. Production method. 該Ｌ−リジン脱炭酸酵素が、細胞表面に局在化しているＬ−リジン脱炭酸酵素であることを特徴とする請求項１から１０のいずれかに記載のカダベリン・ジカルボン酸塩の製造方法。The method for producing cadaverine dicarboxylate according to any one of claims 1 to 10, wherein the L-lysine decarboxylase is L-lysine decarboxylase localized on a cell surface. 反応後の該反応液から、カダベリン・ジカルボン酸塩を単離または晶析する際に、有機溶媒を添加することを特徴とする請求項１から１１のいずれかに記載のカダベリン・ジカルボン酸塩の製造方法。The cadaverine dicarboxylate according to any one of claims 1 to 11, wherein an organic solvent is added when the cadaverine dicarboxylate is isolated or crystallized from the reaction solution after the reaction. Production method. 該有機溶媒が、アルコール類、ケトン類またはニトリル類のいずれかであることを特徴とする請求項１２に記載のカダベリン・ジカルボン酸塩の製造方法。The method for producing cadaverine dicarboxylate according to claim 12, wherein the organic solvent is any one of alcohols, ketones, and nitriles. 該有機溶媒が、炭素数６以下の脂肪族アルコール類、炭素数６以下の脂肪族ケトン類または炭素数６以下の脂肪族ニトリル類のいずれかであることを特徴とする請求項１２に記載のカダベリン・ジカルボン酸塩の製造方法。The organic solvent is any of aliphatic alcohols having 6 or less carbon atoms, aliphatic ketones having 6 or less carbon atoms, or aliphatic nitriles having 6 or less carbon atoms, according to claim 12, characterized in that: A method for producing cadaverine dicarboxylate. 該有機溶媒が、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、ヘキサノール、イソプロパノール、アセトニトリルまたはアセトンのいずれかであることを特徴とする請求項１２に記載のカダベリン・ジカルボン酸塩の製造方法。The method for producing cadaverine dicarboxylate according to claim 12, wherein the organic solvent is any one of methanol, ethanol, propanol, butanol, hexanol, isopropanol, acetonitrile and acetone. ２，３，４，５−テトラヒドロピリジンの含有量が１．４ｗｔ％以下のカダベリン・ジカルボン酸塩。A cadaverine dicarboxylate having a content of 2,3,4,5-tetrahydropyridine of 1.4% by weight or less. トリ−ｎ−ブチルアミンの含有量が０．００６ｗｔ％以下のカダベリン・ジカルボン酸塩。A cadaverine dicarboxylate having a tri-n-butylamine content of 0.006 wt% or less. ２，３，４，５−テトラヒドロピリジンの含有量が１．４ｗｔ％以下かつトリ−ｎ−ブチルアミンの含有量が０．００６％以下のカダベリン・ジカルボン酸塩。A cadaverine dicarboxylate having a content of 2,3,4,5-tetrahydropyridine of 1.4% by weight or less and a content of tri-n-butylamine of 0.006% or less. 請求項１から１５のいずれか１項記載の方法で得られるカダベリン・ジカルボン酸塩もしくは請求項１６から１８のいずれか１項記載のカダベリン・ジカルボン酸塩を原料として得られたポリアミド。A cadaverine dicarboxylate obtained by the method according to any one of claims 1 to 15 or a polyamide obtained from the cadaverine dicarboxylate according to any one of claims 16 to 18.

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