JP4196620B2 - Method for producing cadaverine for polyamide raw material - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ポリアミド原料用カダベリンの製造方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来、L-リジンを微量のテトラリン過酸化物を含むシクロヘキサノール中で煮沸することによりカダベリンが得られることが知られている（非特許文献１参照。）。しかしながら高温反応であるために大量のエネルギーおよび有機溶媒が必要であるうえに、反応収率が非常に低い（36%）。
【０００３】
また、2-シクロヘキセン-1-オンなどのビニルケトン類を触媒としてリジンから合成する方法（非特許文献２、特許文献１参照。）等が知られている。
【０００４】
また、この方法によって得られるカダベリンには不純物として、トリ-n-ブチルアミンや２，３，４，５−テトラヒドロピリジンといった塩基性化合物が含有されている。
【０００５】
また一般的に、酵素反応進行時にpHが変化する際には、pHを制御するために酸もしくはアルカリが適宜加えられ生成物の濃度が低下し、精製工程において濃縮操作が必要となり効率が悪くなるといった問題点がある。さらには、加えられた酸、アルカリにより酵素が変性失活してしまう。
また、カダベリンは生体内に普遍的に存在する生体アミンであり、その生合成系が解明されつつある（非特許文献３参照。）。また、エシェリシア・コリ(Escherichia coli)由来のL-リジン脱炭酸酵素遺伝子が知られている（非特許文献４参照。）。
【０００６】
一方、細胞表面にタンパク質を局在化させる研究は、多くの細菌において行われている。大腸菌について細胞表面にタンパク質を局在化させる研究が活発に行われている（非特許文献５参照）。
【０００７】
しかしながら、カダベリンの製造について実際的な製造技術は確立されておらず、効率よく、より温和な条件下で高濃度かつ高純度のカダベリンを製造する方法の開発が望まれている。
【０００８】
【特許文献１】
特公平４−１０４５２号公報
【非特許文献１】
須山正,金尾清造;アミノ酸の脱炭酸（第４報）薬学雑誌,vol.85(6),P.531-533(1965)）
【非特許文献２】
Chemistry letters,893(1986)
【非特許文献３】
Celia white tabor and Herbert tabor;Microbiological Reviews,vol.49,P.81-99(1985)
【非特許文献４】
Shi-yuanmeng and George N. Bennett;Journal of Bacteriology,vol.174,P.2659-2669(1992)
【非特許文献５】
George Georgiou,Heather L.Poetschke,Chrisstos Stathopoulos and Joseph A. Francisco;TIBTECH,vol.11,P.6-10(1993)
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
トリ-n-ブチルアミンおよび２，３，４，５−テトラヒドロピリジンが多く含有されているカダベリンをポリマーの原料とする場合、たとえば、カダベリンを含む原料からポリアミドを加熱重縮合で合成する際には、反応温度が高温であるため、カダベリンに含まれるトリ-n-ブチルアミンや２，３，４，５−テトラヒドロピリジンなどの塩基性化合物がポリアミドの分解反応を起こし得られたポリアミドに耐熱性が不足するといった問題点がある。
【００１０】
さらに、トリ-ｎ-ブチルアミンは、水性生物に有毒で、魚類に対する致死量は２０−４０mg/Lであるといった問題点もある。
【００１１】
本発明の課題は、このような不純物の少ないポリアミド原料用カダベリンの高反応収率、高精製収率、高生産速度、高濃度および高純度での工業的製造方法およびポリアミド原料用カダベリンの単離方法を提供することである。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
上記問題点を解決するために、本発明者らは、効率がよく、より温和な条件下で高濃度かつ高純度のポリアミド原料用カダベリンの製造方法について鋭意研究を行った結果、Ｌ−リジン塩水溶液にＬ−リジン脱炭酸酵素を作用させることによりポリアミド原料用カダベリンを高反応収率かつ高濃度で得られることを見出した。
【００１３】
すなわち、本発明は、Ｌ−リジン塩水溶液に、Ｌ−リジン脱炭酸酵素を作用させ、反応液からカダベリンを単離するカダベリンの製造方法であって、単離精製されたＬ−リジン脱炭酸酵素を作用させ２，３，４，５−テトラヒドロピリジンの含有量を低減させることを特徴とするポリアミド原料用カダベリンの製造方法である。
本発明のポリアミド原料用カダベリンの製造方法の好ましい態様によれば、単離精製されたＬ−リジン脱炭酸酵素を作用させた後、Ｌ−リジン塩の濃度が仕込み濃度の２０％以下になった反応液からカダベリンを単離するものである。
本発明のポリアミド原料用カダベリンの製造方法の好ましい態様によれば、前記の反応液から２，３，４，５−テトラヒドロピリジンの含有量が０．２０５ｗｔ％以下のカダベリンを単離するものである。
【００１４】
【発明の実施の形態】
カダベリンとは1,5-ペンタンジアミンのことであり、ポリマー原料、医薬中間体の合成原料などとして有用な化合物である。
【００１５】
L-リジン脱炭酸酵素は、L-リジンをカダベリンに転換させる酵素であり、Escherichia coli K12株をはじめとするエシェリシア属微生物のみならず、多くの生物に存在することが知られている。
【００１６】
本発明において使用されるＬ−リジン脱炭酸酵素としては、例えば、バシラス・ハロドゥランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）、バシラス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、エシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、セレノモナス・ルミナンチウム（Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ）、ビブリオ・コレラ（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、ビブリオ・パラヘモリティカス（Ｖｉｂｒｉｏ ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、ストレプトマイセス・コエリカーラ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ストレプトマイセス・ピロサス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｉｌｏｓｕｓ）、エイケネラ・コロデンス（Ｅｉｋｅｎｅｌｌａ ｃｏｒｒｏｄｅｎｓ）、イユバクテリウム・アシダミノフィルム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｉｄａｍｉｎｏｐｈｉｌｕｍ）、サルモネラ・ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、ハフニア・アルベイ（Ｈａｆｎｉａ ａｌｖｅｉ）、ナイセリア・メニンギチデス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、テルモプラズマ・アシドフィルム（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）、ピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ）またはコリネバクテリウム・グルタミカス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）由来のものが好ましく用いられる。さらに好ましくは安全性の認められているエシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）由来のものである。
【００１７】
本発明における生成物は、アルカリ性の化合物であるカダベリンであるために、反応が進行するにつれ、反応液のｐＨはアルカリ側に変化していく。しかし、L-リジン塩水溶液に、L-リジン脱炭酸酵素を作用させれば、反応液のpHを制御する必要がなく効率よくカダベリンを生産できる。用いるL-リジン塩については特に制限はない。好ましくは塩酸塩、硫酸塩、酢酸塩、硝酸塩、炭酸塩である。さらに好ましくはL-リジン一塩酸塩である。
【００１８】
L-リジン脱炭酸酵素は本来ビタミンＢ６と結合し存在するが、L-リジン塩水溶液にビタミンＢ６を添加することにより、生産速度および反応収率を向上させることができる。ビタミンＢ６を添加する方法には特に制限はない。反応中に適宜添加しても良い。好ましくはL-リジン脱炭酸酵素が溶液状態であれば、酵素溶液中に添加することが好ましい。反応液中でのビタミンＢ６の濃度については特に制限はなく。好ましくは反応液に０．０５ｍＭのビタミンＢ６濃度となるように加えればよい。用いるビタミンＢ６に特に制限はない。好ましくは、ピリドキシン、ピリドキサミン、ピリドキサルおよびピリドキサルリン酸から選ばれる少なくとも１種である。さらに好ましくはピリドキサルリン酸である。
【００１９】
また、L-リジン脱炭酸酵素を作用させた後、L-リジン塩が仕込み濃度の２０％以下にまでになった反応液からカダベリンを単離することにより、高精製収率でカダベリンが単離できる。２０％以下にまでになったことを確認する手段には特に制限はない。好ましくはＨＰＬＣ法によって確認することができる。さらに好ましくはｐＨの変化を経時的に測定し、L-リジン塩の濃度と関連づけて反応の終点を確認する方法が採用できる。
【００２０】
本発明において使用されるL-リジン脱炭酸酵素を得る方法に特に制限はないが、例えば、L-リジン脱炭酸酵素が細胞内で高発現した組換え細胞（細胞内発現組み換え細胞）などを適当な培地で培養し、増殖した細胞を回収し、当該細胞を破砕すればよい。
【００２１】
また、別の方法として、L-リジン脱炭酸酵素が細胞表面で局在化した組み換え細胞（細胞表面発現組み換え細胞）などを適当な培地で培養し、増殖した細胞を回収すればよい。
【００２２】
L-リジン脱炭酸酵素が細胞表面で局在化した組み換え細胞とは、少なくともL-リジン脱炭酸酵素が細胞表面に局在化している状態であり、細胞内に同時にL-リジン脱炭酸酵素が存在していても良い。
【００２３】
一方、細胞表面にL-リジン脱炭酸酵素を局在化させる具体的な方法としては、例えば、分泌シグナル配列の一部、細胞表面局在タンパク質の一部をコードする遺伝子配列、L-リジン脱炭酸酵素の構造遺伝子配列をこの順で有するＤＮＡを大腸菌菌に導入すればよい。
【００２４】
分泌シグナル配列の一部に制限はない。宿主においてタンパク質を分泌するために必要な配列であればよい。大腸菌においては、例えばリポプロテインの配列の一部であり、具体的には、アミノ酸配列としてＭＫＡＴＫＬＶＬＧＡＶＩＬＧＳＴＬＬＡＧＣＳＳＮＡＫＩＤＱ（アミノ酸の一文字表記）と翻訳される遺伝子配列であることが好ましい。
細胞表面局在タンパク質の一部をコードする遺伝子配列に特に制限はない。大腸菌においては、例えば外膜結合タンパク質の配列の一部であり、具体的にはOmpA（外膜結合タンパク質）の４６番目のアミノ酸から１５９番目のアミノ酸までの配列の一部であることが好ましい。
【００２５】
L-リジン脱炭酸酵素遺伝子、リポプロテイン遺伝子およびOmpA遺伝子をクローニングする方法に特に制限はない。既知の遺伝子情報に基づき、PCR (polymerase chain reaction)法を用いて必要な遺伝領域を増幅取得する方法、既知の遺伝子情報に基づきゲノムライブラリーやcDNAライブラリーより相同性や酵素活性を指標としてクローニングする方法などが挙げられる。本発明においては、これらの遺伝子は、遺伝的多形性などによる変異型も含む。なお、遺伝的多形性とは、遺伝子上の自然突然変異により遺伝子の塩基配列が一部変化しているものをいう。例えばE.coli K12株の染色体DNAよりPCR法を用いてL-リジン脱炭酸酵素をコードする遺伝子であるcadA遺伝子またはldc遺伝子をクローニングする。この際使用する染色体DNAはE.coli由来であればどの菌株由来でもよい。
【００２６】
L-リジン脱炭酸酵素が細胞表面に局在化していることの確認は、例えばL-リジン脱炭酸酵素を抗原として作製した抗体により、細胞表面発現組み換え細胞を免疫反応後、包埋、薄切りし、電子顕微鏡（免疫電顕法）により観察することで確認できる。
【００２７】
本発明では、L-リジン脱炭酸酵素は、L-リジン脱炭酸酵素の細胞内もしくは細胞表面での活性が上昇した組換え細胞から調製されたものが好ましく使用できる。細胞内もしくは細胞表面でL-リジン脱炭酸酵素の活性を上昇させる方法に特に制限はない。具体的には、例えば、L-リジン脱炭酸酵素の酵素量を増加させる方法、もしくは酵素の構造遺伝子自体に変異を導入して、酵素そのものの比活性を上昇させることなどが挙げられる。
【００２８】
細胞内もしくは細胞表面の酵素量を増加させる手段としては、遺伝子の転写調節領域の改良、遺伝子のコピー数の増加、蛋白への翻訳の効率化などが挙げられる。
【００２９】
転写調節領域の改良とは、遺伝子の転写量を増加させる改変を加えることをいう。例えば、プロモーターに変異を導入することによってプロモーター強化を行い、下流にある遺伝子の転写量を増加させることができる。プロモーターに変異を導入する以外にも、宿主内で強力に発現するプロモーターを導入しても良い。例えば大腸菌においては、lac、tac、trpなどのプロモーターが挙げられる。また、エンハンサーを新たに導入することによって遺伝子の転写量を増加させることができる。染色体DNAのプロモーター等の遺伝子導入については、例えば特開平1-215280号公報に記載されている。
【００３０】
遺伝子のコピー数の上昇は、具体的には、遺伝子を多コピー型のベクターに接続して組換えDNAを作製し、該組換えDNAを宿主細胞に保持させることにより達成することができる。ここでベクターとは、プラスミドやファージ等広く用いられているものを含むが、これら以外にも、トランソポゾン（Berg,D.E and Berg.C.M., Bio/Technol.,vol.1,P.417(1983)）やMuファージ（特開平2-109985号公報）も含む。遺伝子を相同組換え用プラスミド等を用いた方法で染色体に組み込んでコピー数を上昇させることも可能である。
蛋白の翻訳効率を上昇させる方法としては、例えば原核生物においてはSD配列（Shine, J. and Dalgarno, L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 71, 1342-1346 (1974)）、真核生物では Kozak のコンセンサス配列（Kozak, M., Nuc. Acids Res., Vol.15，p.8125-8148(1987)）を導入、改変することや、使用コドンの最適化（特開昭59-125895）などが挙げられる。
【００３１】
L-リシン脱炭酸酵素の細胞内もしくは細胞表面での活性を上昇させる手段としては、L-リジン脱炭酸酵素の構造遺伝子自体に変異を導入して、L-リジン脱炭酸酵素そのものの活性を上昇させることも挙げられる。
【００３２】
遺伝子に変異を生じさせるには、部位特異的変異法（Kramer,W. and frita,H.J., Methods in Enzymology,vol.154,P.350(1987)）リコンビナントPCR法（PCR Technology,Stockton Press(1989）、特定の部分のDNAを化学合成する方法、または当該遺伝子をヒドロキシアミン処理する方法や当該遺伝子を保有する菌株を紫外線照射処理、もしくはニトロソグアニジンや亜硝酸などの化学薬剤で処理する方法がある。
【００３３】
組換え細胞としては、微生物、動物、植物、または昆虫由来のものが好ましく使用できる。例えば動物を用いる場合、マウス、ラットやそれらの培養細胞などが用いられる。植物を用いる場合、例えばシロイヌナズナ、タバコやそれらの培養細胞が用いられる。また、昆虫を用いる場合、例えばカイコやその培養細胞などが用いられる。また、微生物を用いる場合、例えば、大腸菌などが用いられる。
【００３４】
また、L-リジン脱炭酸酵素を複数種組み合わせて使用しても良い。
【００３５】
L-リジン脱炭酸酵素を得るために、組換え細胞を培養する方法に特に制限はないが、例えば微生物を培養する場合、使用する培地は、炭素源、窒素源、無機イオンおよび必要に応じその他有機成分を含有する培地が用いられる。例えば、大腸菌の場合しばしばLB培地が用いられる。炭素源としては、グルコース、ラクトース、ガラクトース、フラクトース、アラビノース、マルトース、キシロース、トレハロース、リボースや澱粉の加水分解物などの糖類、グリセロール、マンニトールやソルビトールなどのアルコール類、グルコン酸、フマール酸、クエン酸やコハク酸等の有機酸類を用いることができる。窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水等を用いることができる。有機微量栄養素としては、各種アミノ酸、ビタミンB1等のビタミン類、RNA等の核酸類などの要求物質または酵母エキス等を適量含有させることが望ましい。それらの他に、必要に応じて、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添加される。
【００３６】
培養条件にも特に制限はなく、例えば大腸菌の場合、好気条件下で１６〜７２時間程度実施するのが良く、培養温度は３０℃〜４５℃に、特に好ましくは３７℃に、培養pHは５〜８に、特に好ましくはpH７に制御するのがよい。なおpH調整には無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、さらにアンモニアガス等を使用することができる。
【００３７】
増殖した細胞内発現組み換え細胞は、遠心分離等により培養液から回収することができる。回収した細胞内発現組み換え細胞から細胞破砕液を調整するには、通常の方法が用いられる。すなわち、細胞内発現組み換え細胞を超音波処理、ダイノミル、フレンチプレス等の方法にて破砕し、遠心分離により細胞残渣を除去することにより細胞破砕液が得られる。
【００３８】
細胞破砕液からL-リジン脱炭酸酵素を精製するには、硫安分画、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、等電点沈殿、熱処理、pH処理など酵素の精製に通常用いられる手法が適宜組み合わされて用いられる。
【００４０】
本発明においては、単離精製したＬ−リジン脱炭酸酵素を作用させることが重要である。Ｌ−リジン脱炭酸酵素を単離精製することで、Ｌ−リジンの分解やカダベリンの分解を引き起こす酵素を取り除くことができ、高収率かつ高純度のカダベリンが得られる。
【００４１】
さらに、L-リジン脱炭酸酵素が細胞表面に局在化している細胞を作用させれば、L-リジンの分解およびカダベリンの分解を抑制することができ、より高収率かつ高純度、高生産速度でカダベリンが得れらる。さらにはその細胞を回収することで繰り返し酵素反応に利用することができる。しかも酵素の調整が非常に簡便である。
【００４２】
一般的に酵素というものは本来あるべきアミノ酸配列で自然界に存在するため、人工的にアミノ酸配列を付与もしくは欠如させると酵素の活性を失うことが多い。しかし本発明において細胞内にL-リジン脱炭酸酵素を発現させる場合、L-リジン脱炭酸酵素のＮ末端アミノ酸配列に１から３０個のアミノ酸配列を付与したL-リジン脱炭酸酵素が好ましく使用できる。ここで、Ｎ末端に付与するものは６から１０個のヒスチジン残基が好ましい。このように、Ｎ末端アミノ酸配列にアミノ酸を付与することで、L-リジン脱炭酸酵素の精製を簡便にできるようにすることができる。Ｎ末端アミノ酸配列に１から３０個のアミノ酸を付与する方法に特に制限はない。例えばL-リジン脱炭酸酵素遺伝子に付与したいアミノ酸配列に相当する塩基配列を遺伝子工学的手法を用い、組み換えればよい。用いる遺伝子工学的手法に特に制限はないが。好ましくはPCR法やＤＮＡ断片同士の連結による方法がある。
【００４３】
L-リジン脱炭酸酵素によるL-リジン塩水溶液からカダベリンへの変換は、上記のようにして得られるL-リジン脱炭酸酵素を、L-リジン塩水溶液に接触させることによって行うことができる。
【００４４】
用いるL-リジン脱炭酸酵素の量に特に制限はない。、L-リジン塩水溶液をカダベリンに変換する反応を触媒するのに十分な量であればよい。好ましくは反応液中の酵素濃度が２５から７０mg/Lである。好ましくは５０mg/Lである。一方、休止細胞を使用する際は、反応液中の細胞濃度が５から１５g/Lである。好ましくは１０g/Lである。
【００４５】
反応温度は、通常、２８〜５５℃、好ましくは４５℃前後である。
【００４６】
反応液の状態に特に制限はない。好ましくは静置または攪拌状態である。攪拌状態にする方法には特に制限はない。好ましくは攪拌翼により攪拌する方法である。
【００４７】
本発明で使用するL-リジン脱炭酸酵素は、固定化することで繰り返しカダベリン合成反応に使用することができ、酵素の調製に必要なコストを低減させることができる。固定化方法としては、アクリルアミドなどの合成高分子に包括する方法、セファロースやスチレン樹脂を骨格とするイオン交換性担体や疎水性担体に吸着させる方法、または、ガラス担体に共有結合で結合させる方法などが挙げられる。
【００４８】
反応時間は、使用する酵素活性、L-リジン塩濃度などの条件によって異なるが、通常、１〜７２時間である。また、反応は、L-リジン塩を供給しながら連続的に行ってもよい。
【００４９】
このように生成したカダベリンを反応終了後、反応液から採取する方法としては、反応終了液をアルカリでpH１２から１４にし、極性有機溶媒で抽出すれば良い。
【００５０】
用いるアルカリに特に制限はない。好ましくは水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウムを用いることができる。
【００５１】
用いる極性有機溶媒に特に制限はない。好ましくはアニリン、シクロヘキサノン、１−オクタノール、イソブチルアルコール、シクロヘキサノール、クロロホルムを用いることができる。
【００５２】
このようにして得られたカダベリンは、トリ-n-ブチルアミンおよび２，３，４，５−テトラヒドロピリジンなどの不純物が少ない。本発明の方法で製造することで、以下の方法で分析した場合に、トリ-n-ブチルアミンの含有量が、０．００６ｗｔ％以下のカタベリンが得られる。さらに、以下の方法で分析した場合に、２，３，４，５−テトラヒドロピリジンの含有量が１．４ｗｔ％以下のものが得られる。さらに、トリ-n-ブチルアミンの含有量が、０．００６ｗｔ％以下であり、かつ、２，３，４，５−テトラヒドロピリジンの含有量が１．４ｗｔ％以下のものが得られる。
【００５３】
トリ-n-ブチルアミンおよび２，３，４，５−テトラヒドロピリジンの分析は、GC-MS法によって以下の条件で行う。
【００５４】
GC/MS：HP6980/HP5973A
Column：NUKOL 30m ×0.24mmI.D. 0.2μm Film
Oven：１２０℃（一定）
InJ：２００℃（Split 10:1）
Flow：He 2.4ml/min (const.Flow)
MS：２３０℃（SCAN m/z=30〜400）
このようにして得られたカダベリンは、ポリアミドの原料として有用である。
【００５５】
ポリアミドの製造方法としては、カダベリンとジカルボン酸の塩、および水の混合物を、加熱して脱水反応を進行させる加熱重縮合法が用いられる。また、加熱重縮合後、固相重合することによって、分子量を上昇させることも可能である。固相重合は、１００℃〜融点の温度範囲で、真空中、あるいは不活性ガス中で加熱することにより進行し、加熱重縮合では分子量が不十分なポリアミドを高分子量化することができる。
【００５６】
用いるジカルボン酸に特に制限はなく。例えばアジピン酸が好ましい。
【００５７】
本発明で得られるカダベリンをポリアミドの原料とすることで、耐熱性の高いポリアミドが得られる。
【００５８】
【実施例】
以下に実施例を示し、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例の記載に限定されるものではない。
【００５９】
[L-リジン濃度およびカダベリン濃度のＨＰＬＣによる分析方法]
使用カラム：CAPCELL PAK C18（資生堂）
移動相：０．１％（ｗ／ｗ）Ｈ３ＰＯ４：アセトニトリル＝４．５：５．５
検出：UV 360nm
サンプル前処理：分析サンプル２５μｌに内標として０．０３Ｍ 1,4-ジアミノブタンを２５μｌ、０．０７５Ｍ 炭酸水素ナトリウムを１５０μｌおよび０．２Ｍ ２，４−ジニトロフルオロベンゼンのエタノール溶液を添加混合し３７℃で１時間保温する。上記反応溶液５０μｌを１ｍｌアセトニトリルに溶解後、10,000rpmで５分間遠心した後の１０μｌをＨＰＬＣ分析した。
【００６０】
参考例１（L-リジン脱炭酸酵素の調整）
（１）L-リジン脱炭酸酵素遺伝子のクローニングおよび細胞内発現ベクターの作製
L-リジン脱炭酸酵素を用いてL-リジン塩からカダベリンに変換させるために、E.coliのL-リジン脱炭酸酵素遺伝子（cadA）のクローニングを行った。
【００６１】
データベース(GenBank)に登録されているL-リジン脱炭酸酵素遺伝子（cadA）（Accession No.M76411）の塩基配列を参考にオリゴヌクレオチドプライマー5-atgaacgttattgcaatattg -3'（配列番号：１）、5'- gctgatgggtgagatagaatg-3'（配列番号：２）を合成した。E.coli K12株（ATCC10798）から常法に従い調整したゲノムDNAの溶液を増幅鋳型として0.2ｍｌのミクロ遠心チューブに0.2μｌづつ取り、各プライマーを20ｐｍｏｌ、20ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ8.0）、2.5ｍＭ ＫＣｌ、100μｇ／ｍｌゼラチン、50μＭ各ｄＮＴＰ、2単位 ＬＡＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造製）となるように各試薬を加え、全量を50μｌとした。ＤＮＡの変性条件を94℃、30秒、プライマーのアニーリング条件を55℃、30秒、ＤＮＡプライマーの伸長反応条件を72℃、3分の各条件でＢｉｏＲａｄ社のサーマルサイクラーを用い、30サイクル反応させた（ポリメラーゼ連鎖反応：以後、ＰＣＲ法と記す）。尚、本実施例におけるＰＣＲ法は特に断らない限り、本条件にて行った。このＰＣＲ法により得られた産物を１％アガロースにて電気泳動し、ｃａｄＡ遺伝子を含む約2.1ｋｂのＤＮＡ断片を常法に従い調整した。この断片を、プラスミドベクターｐＴ７ｂｌｕｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＥｃｏＲＶ部位の3'-末端にＴ塩基が付加された間隙に、常法に従ったライゲーション反応により挿入し、得られたプラスミドをｐＴ７−ｃａｄＡと命名した。
【００６２】
このｐＴ７−ｃａｄＡを増幅鋳型として、オリゴヌクレオチド5'- cgccatgggccatcatcatcatcatcatcatcatatgaacgttattgcaatattg -3'（配列番号：３）、5'- cgcggatccgctgatgggtgagatagaatg -3'（配列番号：４）をプライマーセットとしたＰＣＲ法を行った。ここで得られる産物は、オリゴヌクレオチド（配列番号：３）由来の塩基配列と、（配列番号：４）由来の塩基配列が、それぞれｃａｄＡ遺伝子を含むＤＮＡ断片の5'末端、および3'末端に付加されている。この産物を１％アガロースにて電気泳動し、約2.1ｋｂのＤＮＡ断片を常法に従い調整した。この断片を、プラスミドベクターｐＴ７ｂｌｕｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＥｃｏＲＶ部位の3'-末端にＴ塩基が付加された間隙に、常法に従ったライゲーション反応により挿入し、得られたプラスミドをｐＴ７−ｃａｄＡ１と命名した。
【００６３】
このｐＴ７−ｃａｄＡ１をＮｃｏＩ、及びＢａｍＨＩで消化し、得られた2.1ｋｂのNcoI−BamHI断片を、予めＮｃｏＩ、及びＢａｍＨＩで消化しておいたｐＴＶ１１８Ｎ（宝酒造製）のＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩ間隙に常法に従ったライゲーション反応により挿入し、得られたプラスミドをｐＬＤＣ１と命名した（図１）。このプラスミドを導入した大腸菌を培養することで、L-リジン脱炭酸酵素のＮ末端アミノ酸配列に6個のヒスジチン残基が付加された分子量約80ｋＤａの組み換えL-リジン脱炭酸酵素を生産することができる。
【００６４】
（２）組み換えL-リジン脱炭酸酵素の産生
ｐＬＤＣ１でE.coli JM109株をアンピシリン耐性に形質転換し、得られた形質転換体をJM109/pLDC1株と命名した。
【００６５】
次にJM109/pLDC1株で組み換えL-リジン脱炭酸酵素を産生させた。まず、JM109/pLDC1株をそれぞれ５０μｇ／ｍｌのアンピシリンナトリウムを含んだ滅菌ＬＢ培地（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ． ｅｔ. ａｌ、２００１、 Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ３ｒｄ． ｅｄｉｔｉｏｎ、 Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ． Ｐｒｅｓｓ）（ＬＢ−ａｍｐ培地）５ｍｌに１白金耳植菌し、３７℃で２４時間振とうして前培養を行った。
【００６６】
この前培養液をＬＢ−ａｍｐ培地５０ｍｌに全量植菌し、３７℃、振幅３０cmで、１８０rpmの条件下で３時間培養した後に1mM IPTG(isopropyl-1-thio-β-D-galactoside)添加し、更に４時間培養した。対照実験として、JM109株をｐＴＶ１１８Ｎで形質転換した形質転換体（以後、JM109/pTV118N株とする）を用い同様の培養を行った。こうして得られた菌体を集め、５ｍｌのＴＢＳ緩衝液（宝酒造製）に再懸濁後、超音波破砕および遠心分離により細胞破砕液を調製した。これらのL-リジン脱炭酸酵素活性の測定を単位時間当たりに生成するカダベリンの濃度を測定することにより行った。その結果、対照実験であるJM109/pTV118N株由来の細胞破砕液に対して、JM109/pLDC1株においてはL-リジン脱炭酸酵素活性は約100倍に上昇していた。また、この細胞破砕液をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分画し、Ｐｅｎｔａ−Ｈｉｓ Ａｎｔｉｂｏｄｙ抗体（ＱＩＡＧＥＮ社製）でウエスタンブロッティングを行った結果、JM109/pLDC1株由来の細胞破砕液のみから、分子量約80ｋＤａの組み換えL-リジン脱炭酸酵素を検出した。
【００６７】
（３）組み換えL-リジン脱炭酸酵素の精製
この組み換えL-リジン脱炭酸酵素は、Ｎ末端アミノ酸配列に6個のヒスチジン残基があることこから、ニッケルイオンとの相互作用を利用した精製を行った。まず、10ｍｌのキレーティング セファロース ファースト フロー（Ｃｈｉｌａｔｉｎｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ）担体（アマシャム バイオサイエンス社製）を充填したカラムシステムを構築した。このカラムに50ｍｌの50ｍＭ 硫酸ニッケル水溶液、50ｍｌのＴＢＳ緩衝液の順で流した後、（２）と同様の方法で得られたJM109/pLDC1株の500ｍＬ培養液由来の50ｍｌ細胞破砕液を流した。その後、100ｍｌの5ｍＭ イミダゾールを含むＴＢＳ緩衝液、100ｍｌの50ｍＭ イミダゾールを含むＴＢＳ緩衝液をこの順序で流した。更に50ｍｌの600ｍＭ イミダゾールを含むＴＢＳ緩衝液を流した。カラムに流した各々の緩衝液のL-リジン脱炭酸酵素活性を（２）と同様の方法で測定したところ、600ｍＭ イミダゾールを含むＴＢＳ緩衝液のみに活性があった。また、カラムに流した各々の緩衝液をＳＤＳ−ＰＡＧＥし、クマシーブリリアントブルーで染色たところ、600ｍＭ イミダゾールを含むＴＢＳ緩衝液から、約80ｋＤａの単一バンドを検出した。また、カラムに流した各々の緩衝液を（２）と同様の方法でウエスタンブロッティングを行ったところ、600ｍＭ イミダゾールを含むＴＢＳ緩衝液のみに約80ｋＤａタンパク質を検出し、この精製タンパク質はL-リジン脱炭酸酵素活性を有する組み換えL-リジン脱炭酸酵素であることを確認した。
【００６８】
（４）L-リジン脱炭酸酵素の細胞表面発現ベクターの作製
まず、リポプロテインの配列の一部および外膜結合タンパク質（ＯｍｐＡ）の４６番目のアミノ酸から１５９番目のアミノ酸までの配列を一つのカセットとしてクローニングした。
【００６９】
データベース(GenBank)に登録されている外膜結合タンパク質（ompA）（Accession No. NC_000913）の塩基配列を参考にオリゴヌクレオチドプライマー5-ataaagcttatgaaagctactaaactgg-3'（配列番号：５）、5'-atagtcgacgttgtccggacgagtgccg-3'（配列番号：６）、5'-ataaagcttatgaaagctactaaactggtactgggcgcggtaatcctgggttctactctgctggcaggttgctccagcaacgctaaaatcgatcagaacccgta-3'（配列番号：７）を合成した。E.coli K12株（ATCC10798）から常法に従い調整したゲノムDNAの溶液を増幅鋳型として（配列番号：５）（配列番号：６）（配列番号：７）をプライマーセットとしたＰＣＲ法を行った。このＰＣＲ法により得られた産物を２％アガロースにて電気泳動し、ompA遺伝子を含む約0.4ｋｂのＤＮＡ断片を常法に従い調整した。この断片を、プラスミドベクターｐＴ７ｂｌｕｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＥｃｏＲＶ部位の3'-末端にＴ塩基が付加された間隙に、常法に従ったライゲーション反応により挿入し、得られたプラスミドをｐＴＭ７と命名した。
【００７０】
このｐＴＭ７をHind III、及びSal Iで消化し、得られた約0.4ｋｂのHind III Sal I断片を、予めHind III、及びSal Iで消化しておいたpUC19（宝酒造製）のHind III/Sal I間隙に常法に従ったライゲーション反応により挿入し、得られたプラスミドをｐＴＭ１４と命名した。
【００７１】
次に、E.coli K12株（ATCC10798）のL-リジン脱炭酸酵素遺伝子（cadA）のクローニングを行った。
【００７２】
データベース(GenBank)に登録されているL-リジン脱炭酸酵素遺伝子（cadA）（Accession No.M76411）の塩基配列を参考にオリゴヌクレオチドプライマー5-tatgtcgacatgaacgttattgcaatat -3'（配列番号：８）、5'-ggagagctcttattttttgctttcttcttt-3'（配列番号：９）を合成した。E.coli K12株（ATCC10798）から常法に従い調整したゲノムDNAの溶液を増幅鋳型として（配列番号：８）（配列番号：９）をプライマーセットとしたＰＣＲ法を行った。
【００７３】
このＰＣＲ法により得られた産物を１％アガロースにて電気泳動し、ｃａｄＡ遺伝子を含む約2.1ｋｂのＤＮＡ断片を常法に従い調整した。この断片を、プラスミドベクターｐＴ７ｂｌｕｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＥｃｏＲＶ部位の3'-末端にＴ塩基が付加された間隙に、常法に従ったライゲーション反応により挿入し、得られたプラスミドをｐＴＭ１５と命名した。
【００７４】
これら調整したpTM15をSal I、及びSac Iで消化し、得られた約2.1ｋｂのSal I Sac I断片を、予めSal I、及びSac Iで消化しておいたpTM14のSal I/Sac I間隙に常法に従ったライゲーション反応により挿入し、得られたプラスミドをｐＴＭ１６（図２）と命名した。
【００７５】
このプラスミドを導入した大腸菌を培養することで、L-リジン脱炭酸酵素が細胞表面に局在化され、その大腸菌を回収するだけでL-リジン脱炭酸酵素を調整することができるようになる。
（５）L-リジン脱炭酸酵素が細胞表面に局在化した細胞の調整
ｐＴＭ１６でE.coli JM109株をアンピシリン耐性に形質転換し、得られた形質転換体をJM109／ｐＴＭ１６株と命名した。
【００７６】
次にJM109／ｐＴＭ１６株で組み換えL-リジン脱炭酸酵素を産生させた。まず、JM109／ｐＴＭ１６株をそれぞれ５０μｇ／ｍｌのアンピシリンナトリウムを含んだ滅菌ＬＢ培地（ＬＢ−ａｍｐ培地）５ｍｌに１白金耳植菌し、３７℃で２４時間振とうして前培養を行った。
【００７７】
この前培養液をＬＢ−ａｍｐ培地５０ｍｌに全量植菌し、３７℃、振幅３０cmで、１８０rpmの条件下で３時間培養した後に1mM IPTGを添加し、更に４時間培養した。こうして得られた菌体を遠心回収し、１０ｍｌのＴＢＳ緩衝液（宝酒造製）で３回洗浄後、遠心し菌体を回収した。
【００７８】
実施例１，２ 比較例１（L-リジンの種類の効果）
１０００ｍｌのフラスコに、表１に示すL-リジンまたはL-リジン塩を終濃度１．３５Ｍになるように各種L-リジンを加え調整した水溶液５００ｍｌを加えた。その後、終濃度50mg/Lになるように参考例１（３）で得た精製した組み換えL-リジン脱炭酸酵素を加え作用させた。４５℃で４８時間反応した後の反応液中に含まれるカダベリンの濃度を測定した。その結果を表１に示す。
【００７９】
【表１】

【００８０】
原料として、L-リジン塩水溶液を用いると、より高濃度かつ高反応収率でカダベリンが得られた。
【００８１】
実施例３〜７（ビタミンＢ６の添加の効果）
１０００ｍｌのフラスコに、L-リジン一塩酸塩を終濃度１．３５Ｍになるように調整した水溶液５００ｍｌを加えた。次に表２に示す各種ビタミンＢ６を終濃度０．０５ｍＭになるように添加した。最後に終濃度50mg/Lになるように参考例１（３）で得た精製した組み換えL-リジン脱炭酸酵素を加え作用させた。４５℃で４８時間反応した後の反応液中に含まれるカダベリンの濃度を測定した。その結果を表２に示す。
【００８２】
【表２】

【００８３】
この結果、ビタミンＢ６をL-リジン塩水溶液に添加することにより、より高収率でカダベリンを得られた。
【００８４】
実施例８〜１１（反応停止の条件の効果）
１０００ｍｌのフラスコに、終濃度１．３５ＭになるようにL-リジン一塩酸塩を加え調整した水溶液５００ｍｌを加えた。次にピリドキサルリン酸一水和物を終濃度０．０５ｍＭになるように添加した。最後に、終濃度50mg/Lになるように参考例１（３）で得た精製した組み換えL-リジン脱炭酸酵素を加え、４５℃において作用させた。残存L-リジン濃度をＨＰＬＣにより常に測定し、表３に示す残存L-リジン濃度に達した際に反応溶液を８０℃に加熱し反応を停止した。これら反応液に水酸化ナトリウムを添加し、反応液のpHを１３以上にした。次にクロロホルムを反応液と等量加え、クロロホルム相にカダベリンを抽出した。最後にこのクロロホルム相を、減圧蒸留（３０ｍｍＨｇ、８０℃）することによりカダベリンを単離した。この単離操作における精製収率を表３にまとめる。
【００８５】
【表３】

【００８６】
この結果、反応停止条件としてL-リジン塩濃度が仕込み濃度の２０％以下になった反応液からカダベリンを単離することにより、高精製収率でカダベリンが得られた。
【００８７】
実施例１２ 参照例１〜４ 比較例２（得られたＬ−リジン脱炭酸酵素の精製状態の効果）
参考例１に示す方法により得られたＪＭ１０９／ｐＬＤＣ１株を培養し表４に示すような精製処理をおこなった。また、Ｌ−リジン脱炭酸酵素が細胞表面に局在化したＪＭ１０９／ｐＴＭ１６株の培養も行った。比較例２として参考例１に示す方法により得られたＪＭ１０９／ｐＴＶ１１８Ｎ株の培養も行った。
【００８８】
１０００ｍｌのフラスコに、終濃度１．３５ＭになるようにＬ−リジン一塩酸塩を加え調整した水溶液５００ｍｌを加えた。次にピリドキサルリン酸一水和物を終濃度０．０５ｍＭになるように添加した。最後に、ＪＭ１０９／ｐＴＶ１１８Ｎ菌体（比較例２）、ＪＭ１０９／ｐＬＤＣ１菌体（参照例１）およびＪＭ１０９／ｐＴＭ１６菌体（実施参照例４）は２７０ｍｌの培養液から得られた菌体（Ｌ−リジン脱炭酸酵素濃度を終濃度５０ｍｇ／Ｌ添加することに相当する菌体量）を、また表４に示す各精製状態の組み換えＬ−リジン脱炭酸酵素（参照例２，３、実施例１２）は終濃度５０ｍｇ／Ｌになるように加え、４５℃において作用させた。経時的にカダベリンの濃度を測定した結果を図３に示す。また、反応が進行しなくなった時間におけるカダベリン収率およびカダベリンの生産速度を求め、表５および図３に示す。
【００８９】
【表４】

【００９０】
【表５】

【００９１】
この結果、組み換えＬ−リジン脱炭酸酵素を単離精製することで、高生産速度、高収率でカダベリンが得られた。また、Ｌ−リジン脱炭酸酵素を細胞表面に局在化させることで高生産速度、高収率でカダベリンが得られた。
【００９２】
参考例２（既存の化学合成法によるカダベリンの調製）
L-リジン一塩酸塩２０ｇ（Fluka社製）シクロヘキサノール１００ｍｌ（シグマアルドリッチジャパン製）に懸濁し、次いで２８％ナトリウムメトキシド／メタノール溶液（シグマアルドリッチジャパン製）２１．２ｍｌ、２−シクロヘキセン−１−オン１ｍｌ（シグマアルドリッチジャパン製）を加え、１５５℃で３時間加熱撹拌した。反応終了後、反応混合物に塩化水素４ｇ（シグマアルドリッチジャパン製）を含むイソプロパノール溶液２０ｍｌ（シグマアルドリッチジャパン製）を加え、析出した生成物を回収し、乾燥することによりカダベリン二塩酸塩を得た（特公平４−１０４５２の実施例３記載の方法）。この水溶液に、水酸化ナトリウム水溶液を添加することによってカダベリン二塩酸塩をカダベリンに変換し、クロロホルムで抽出して、減圧蒸留（３０ｍｍＨｇ、８０℃）することにより、カダベリンを得た。
【００９３】
実施例１３ 参照例５〜８ 比較例３（不純物の同定）
上記の参照例１〜３、実施例１２および参照例４で得られた各反応液を実施例８〜１１に示した精製方法によりカダベリンを単離した。不純物の分析を、下記に示す条件でＧＣ−ＭＳ法により行い、参考例２で調製したカダベリン（比較例３）の不純物分析と比較した結果を表６に示す。（参照例５と参照例１、参照例６と参照例２、参照例７と参照例３、参照例８と参照例４、実施例１３と実施例１２がそれぞれ対応している。）
ＧＣ／ＭＳ：ＨＰ６９８０／ＨＰ５９７３Ａ
Ｃｏｌｕｍｎ：ＮＵＫＯＬ ３０ｍ×０．２４ｍｍＩ．Ｄ． ０．２μｍ Ｆｉｌｍ
Ｏｖｅｎ：１２０℃（一定）
ＩｎＪ：２００℃（Ｓｐｌｉｔ １０：１）
Ｆｌｏｗ：Ｈｅ ２．４ｍｌ／ｍｉｎ （ｃｏｎｓｔ．Ｆｌｏｗ）
ＭＳ：２３０℃（ＳＣＡＮ ｍ／ｚ＝３０〜４００）
【００９４】
【表６】

【００９５】
この結果、L-リジン脱炭酸酵素を用い生成したカダベリンを精製することにより、水性生物に有毒で、また酸と接触すると反応してしまうトリ-n-ブチルアミンの含有量が０．００６ｗｔ％以下かつ２，３，４，５−テトラヒドロピリジンの含有量が１．４ｗｔ％以下の高純度カダベリンが得られた。
【００９６】
参考例３（カダベリンとアジピン酸の塩の調製）
実施例１２のカダベリン１０．３ｇを、水２５ｇ中に溶解した水溶液を、４０℃のウォーターバスに浸して撹拌しているところに、アジピン酸（カーク製）を約１ｇずつ、中和点付近では約０．２ｇずつ添加していき、アジピン酸添加量に対する水溶液のｐＨ変化を調べ、中和点を求めると、ｐＨ８．６６であった。ｐＨが８．６６になるように、カダベリンとアジピン酸の等モル塩の５０ｗｔ％水溶液を調製した。
【００９７】
参考例４（カダベリンとアジピン酸の塩の調整）
参考例２のカダベリン１０．３ｇを、水２５ｇ中に溶解した水溶液を、４０℃のウォーターバスに浸して撹拌しているところに、アジピン酸（カーク製）を約１ｇずつ、中和点付近では約０．２ｇずつ添加していき、アジピン酸添加量に対する水溶液のｐＨ変化を調べ、中和点を求めると、ｐＨ８．７２であった。ｐＨが８．７２になるようにカダベリンとアジピン酸の等モル塩の５０ｗｔ％水溶液を調製した。
【００９８】
実施例１４（ポリアミドの合成）
参考例３で調製したカダベリンとアジピン酸の等モル塩の５０ｗｔ％水溶液５０．０ｇを試験管に仕込み、オートクレーブに入れて、密閉し、窒素置換した。ジャケット温度を２６５℃に設定し、加熱を開始した。缶内圧力が１７．５ｋｇ／ｃｍ^２に到達した後、缶内圧力を１７．５ｋｇ／ｃｍ^２で３時間保持した。その後、ジャケット温度を２７５℃に設定し、２時間かけて缶内圧力を常圧に放圧した。その後、缶内温度が２４５℃に到達した時点で、加熱を停止した。室温に放冷後、試験管をオートクレーブから取り出し、ポリアミドを得た。
【００９９】
比較例４
参考例４で調製したカダベリンとアジピン酸の等モル塩の５０ｗｔ％水溶液５０．０ｇを用いる以外は、実施例２２と全く同様の方法でポリアミドを得た。
【０１００】
実施例１５（ポリアミドの評価）
実施例１４で得られたポリアミドおよび比較例４で得られたポリアミドを下記に示す方法で比較評価した。その結果を表７に示す。
【０１０１】
［ポリアミド中の２，３，４，５−テトラヒドロピリジン、およびトリ-n-ブチルアミンの定量（ＧＣ−ＭＳ）］
ポリアミド約１５ｇを精秤して、メタノールでソックスレー抽出し、その抽出液を、下記条件でＧＣ−ＭＳ分析して、ポリアミド中に含まれる２，３，４，５−テトラヒドロピリジン、およびトリ-n-ブチルアミンを定量した。
装置：ヒューレットパッカード製 ＨＰ５８９０質量検出器
カラム：５％−ジフェニル−９５％−ジメチルポリシロキサン
カラム温度：Ｉｎｉｔｉａｌ １００℃
Ｆｉｎａｌ ２５０℃
昇温速度：１０℃／ｍｉｎ
注入口温度：２３０℃
検出器温度：２８０℃
キャリアガス：ヘリウム
注入口圧力：５０ｋｇ／ｃｍ２
試料注入量：１μｌ。
【０１０２】
［ＤＳＣ（示差走査熱量測定）］
セイコー電子工業製 ロボットＤＳＣ ＲＤＣ２２０を用い、窒素雰囲気下、ポリアミドを約５ｍｇを採取し、次の条件で測定した。
融点＋２５℃に昇温して３分間保持し、ポリアミドを完全に融解させた後、２０℃／分の降温速度で、３０℃まで降温し、３分間保持した後、３０℃から融点＋２５℃まで２０℃／分の昇温速度で昇温したときに観測される吸熱ピークの温度、および熱量を求めた。
【０１０３】
［相対粘度（ηｒ）］
９８％硫酸中、０．０１ｇ／ｍｌ濃度、２５℃でオストワルド式粘度計を用いて測定を行った。
【０１０４】
［溶融滞留試験］
試験管にポリアミド約５ｇを仕込み、窒素雰囲気下、融点＋２０℃の温度のシリコンバスに浸漬し、ポリアミドが完全に溶融してから３０分間放置した後、ポリアミドを回収して相対粘度測定を行った。
【０１０５】
【表７】

【０１０６】
その結果、本発明の方法によって得られた高純度カダベリンを使用することにより、相対粘度（ηｒ）の保持率の高い（耐熱性の高い）ポリアミドが得られた。
【０１０７】
【発明の効果】
本発明によれば、高反応収率、高精製収率、高生産速度、高濃度および高純度でのポリアミド原料用カダベリンの工業的製造方法およびポリアミド原料用カダベリンの単離方法が提供される。
【０１０８】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】 L-リジン脱炭酸酵素細胞内発現ベクターpLDC1のフィジカルマップを示す図である。
【図２】 L-リジン脱炭酸酵素細胞表面発現ベクターpTM16のフィジカルマップを示す図である。
【図３】 実施例１２〜１６および比較例２における時間とカダベリン生産量の関係を示す図である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
  The present inventionFor polyamide raw materialsManufacture of cadaverineDirectionAbout the lawThe
[0002]
[Prior art]
Conventionally, it is known that cadaverine can be obtained by boiling L-lysine in cyclohexanol containing a trace amount of tetralin peroxide (see Non-Patent Document 1). However, the high temperature reaction requires a large amount of energy and organic solvent, and the reaction yield is very low (36%).
[0003]
Further, a method of synthesizing from lysine using vinyl ketones such as 2-cyclohexen-1-one as a catalyst is known (see Non-Patent Document 2 and Patent Document 1).
[0004]
Further, cadaverine obtained by this method contains basic compounds such as tri-n-butylamine and 2,3,4,5-tetrahydropyridine as impurities.
[0005]
In general, when the pH changes during the progress of the enzymatic reaction, acid or alkali is appropriately added to control the pH, the concentration of the product decreases, and a concentration operation is required in the purification process, resulting in poor efficiency. There is a problem. Furthermore, the enzyme is denatured and deactivated by the added acid or alkali.
Cadaverine is a biogenic amine that exists universally in the living body, and its biosynthetic system is being elucidated (see Non-Patent Document 3). In addition, an L-lysine decarboxylase gene derived from Escherichia coli is known (see Non-Patent Document 4).
[0006]
On the other hand, studies for localizing proteins on the cell surface have been conducted in many bacteria. Studies on the localization of proteins on the cell surface are actively conducted for E. coli (see Non-Patent Document 5).
[0007]
However, no practical production technique has been established for the production of cadaverine, and there is a demand for the development of a method for producing cadaverine with high concentration and high purity efficiently under milder conditions.
[0008]
[Patent Document 1]
Japanese Examined Patent Publication No. 4-10452
[Non-Patent Document 1]
Masaru Suyama, Kiyozo Kaneo; Decarboxylation of Amino Acids (Part 4) Pharmaceutical Journal, vol.85 (6), P.531-533 (1965))
[Non-Patent Document 2]
Chemistry letters, 893 (1986)
[Non-Patent Document 3]
Celia white tabor and Herbert tabor; Microbiological Reviews, vol. 49, P. 81-99 (1985)
[Non-Patent Document 4]
Shi-yuanmeng and George N. Bennett; Journal of Bacteriology, vol. 174, P. 2659-2669 (1992)
[Non-Patent Document 5]
George Georgiou, Heather L. Poetschke, Chrisstos Stathopoulos and Joseph A. Francisco; TIBTECH, vol. 11, P. 6-10 (1993)
[0009]
[Problems to be solved by the invention]
When cadaverine containing a large amount of tri-n-butylamine and 2,3,4,5-tetrahydropyridine is used as the raw material of the polymer, for example, when synthesizing polyamide by heat polycondensation from the raw material containing cadaverine, Since the reaction temperature is high, the heat resistance of the polyamide obtained by causing a basic compound such as tri-n-butylamine or 2,3,4,5-tetrahydropyridine contained in cadaverine to undergo a polyamide decomposition reaction is insufficient. There is a problem.
[0010]
Further, tri-n-butylamine is toxic to aquatic organisms, and there is a problem that the lethal dose to fish is 20-40 mg / L.
[0011]
  The object of the present invention is to reduce such impuritiesFor polyamide raw materialsIndustrial production method of cadaverine with high reaction yield, high purification yield, high production rate, high concentration and high purity andFor polyamide raw materialsIt is to provide a method for isolating cadaverine.
[0012]
[Means for Solving the Problems]
  In order to solve the above problems, the present inventors have a high concentration and high purity under efficient and milder conditions.For polyamide raw materialsAs a result of diligent research on the production method of cadaverine, L-lysine decarboxylase was allowed to act on an L-lysine salt aqueous solution.For polyamide raw materialsIt has been found that cadaverine can be obtained with high reaction yield and high concentration.
[0013]
  That is, the present inventionLA method for producing cadaverine, wherein L-lysine decarboxylase is allowed to act on a lysine salt aqueous solution, and cadaverine is isolated from the reaction solution,Isolated and purifiedL-lysine decarboxylaseTo reduce the content of 2,3,4,5-tetrahydropyridineIt is characterized byFor polyamide raw materialsMethod for producing cadaverineIs.
  According to a preferred embodiment of the method for producing cadaverine for polyamide raw material of the present invention, after the isolated and purified L-lysine decarboxylase was allowed to act, the concentration of the L-lysine salt became 20% or less of the charged concentration. Cadaverine is isolated from the reaction solution.
  According to a preferred embodiment of the method for producing cadaverine for polyamide raw material of the present invention, cadaverine having a 2,3,4,5-tetrahydropyridine content of 0.205 wt% or less is isolated from the reaction solution. .
[0014]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Cadaverine is 1,5-pentanediamine and is a useful compound as a raw material for polymers and as a raw material for synthesizing pharmaceutical intermediates.
[0015]
L-lysine decarboxylase is an enzyme that converts L-lysine into cadaverine, and is known to exist not only in Escherichia microorganisms such as Escherichia coli K12 but also in many organisms.
[0016]
  L-lysine decarboxylase used in the present inventionasE.g., Bacillus halodurans, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Selenomonas luminiole, Bolinus olei (Vibrio parahaemolyticus), Streptomyces coelicolor, Streptomyces pilosus, Eikenella coridonum, Eikenella coridonum E acerium aciduminophilum, Salmonella typhimurium, Hafnia albei, Neisseria meningitidis, aceticum acidum Those derived from Corynebacterium glutamicum are preferably used. More preferably, it is derived from Escherichia coli, which has been confirmed to be safe.
[0017]
Since the product in the present invention is cadaverine, which is an alkaline compound, the pH of the reaction solution changes to the alkali side as the reaction proceeds. However, if L-lysine decarboxylase is allowed to act on an aqueous L-lysine salt solution, cadaverine can be produced efficiently without the need to control the pH of the reaction solution. There is no restriction | limiting in particular about the L-lysine salt to be used. Preferred are hydrochloride, sulfate, acetate, nitrate and carbonate. More preferred is L-lysine monohydrochloride.
[0018]
L-lysine decarboxylase is inherently bound to vitamin B6, but the production rate and reaction yield can be improved by adding vitamin B6 to the aqueous L-lysine salt solution. There is no restriction | limiting in particular in the method of adding vitamin B6. You may add suitably during reaction. Preferably, if L-lysine decarboxylase is in solution, it is preferably added to the enzyme solution. There is no restriction | limiting in particular about the density | concentration of vitamin B6 in a reaction liquid. Preferably, the vitamin B6 concentration of 0.05 mM may be added to the reaction solution. There is no restriction | limiting in particular in the vitamin B6 to be used. Preferably, it is at least one selected from pyridoxine, pyridoxamine, pyridoxal and pyridoxal phosphate. More preferred is pyridoxal phosphate.
[0019]
In addition, cadaverine is isolated in a highly purified yield by isolating cadaverine from the reaction solution in which L-lysine decarboxylase is allowed to act and then the L-lysine salt is charged to a concentration of 20% or less. it can. There is no particular limitation on the means for confirming that the amount has reached 20% or less. Preferably it can confirm by HPLC method. More preferably, a method of measuring the change in pH over time and confirming the end point of the reaction in relation to the concentration of the L-lysine salt can be employed.
[0020]
The method for obtaining L-lysine decarboxylase used in the present invention is not particularly limited. For example, a recombinant cell in which L-lysine decarboxylase is highly expressed in the cell (intracellularly expressed recombinant cell) is suitable. It is only necessary to culture in a suitable medium, collect the proliferated cells, and disrupt the cells.
[0021]
As another method, recombinant cells in which L-lysine decarboxylase is localized on the cell surface (cell surface-expressed recombinant cells) and the like are cultured in an appropriate medium, and the proliferated cells may be recovered.
[0022]
A recombinant cell in which L-lysine decarboxylase is localized on the cell surface is a state in which at least L-lysine decarboxylase is localized on the cell surface. May exist.
[0023]
On the other hand, specific methods for localizing L-lysine decarboxylase on the cell surface include, for example, a part of a secretory signal sequence, a gene sequence encoding a part of a cell surface localized protein, and L-lysine decarboxylation. What is necessary is just to introduce | transduce the DNA which has the structural gene sequence of a carbonic acid enzyme in this order into colon_bacillus | E._coli.
[0024]
There is no restriction on part of the secretory signal sequence. Any sequence may be used as long as it is necessary for secreting the protein in the host. In Escherichia coli, for example, it is a part of a lipoprotein sequence. Specifically, it is preferably a gene sequence translated as MKATKLVLGAVIGLSTLLAGCSSSNAKIDQ (amino acid one-letter code) as an amino acid sequence.
There is no particular limitation on the gene sequence encoding a part of the cell surface localized protein. In E. coli, for example, it is a part of the sequence of the outer membrane binding protein, and specifically, it is preferably a part of the sequence from the 46th amino acid to the 159th amino acid of OmpA (outer membrane binding protein).
[0025]
There is no particular limitation on the method for cloning the L-lysine decarboxylase gene, lipoprotein gene and OmpA gene. Based on known gene information, PCR (polymerase chain reaction) method is used to amplify and acquire the necessary genetic region, cloning based on known gene information using homology and enzyme activity as an index from genomic library and cDNA library The method of doing is mentioned. In the present invention, these genes include mutants due to genetic polymorphism and the like. Genetic polymorphism means that the base sequence of a gene is partially changed due to a natural mutation on the gene. For example, the cadA gene or ldc gene, which is a gene encoding L-lysine decarboxylase, is cloned from the chromosomal DNA of E. coli K12 strain using PCR. The chromosomal DNA used here may be derived from any strain as long as it is derived from E. coli.
[0026]
Confirmation that L-lysine decarboxylase is localized on the cell surface is achieved by, for example, embedding and slicing cell surface-expressed recombinant cells with an antibody prepared using L-lysine decarboxylase as an antigen. This can be confirmed by observation with an electron microscope (immunoelectron microscopy).
[0027]
In the present invention, as L-lysine decarboxylase, those prepared from recombinant cells in which the activity of L-lysine decarboxylase in the cell or on the cell surface is increased can be preferably used. There is no particular limitation on the method for increasing the activity of L-lysine decarboxylase in the cell or on the cell surface. Specifically, for example, a method of increasing the enzyme amount of L-lysine decarboxylase, or introducing a mutation into the structural gene of the enzyme itself to increase the specific activity of the enzyme itself can be mentioned.
[0028]
Examples of means for increasing the amount of enzyme in the cell or on the cell surface include improving the transcriptional regulatory region of the gene, increasing the copy number of the gene, and increasing the efficiency of translation into a protein.
[0029]
Improving the transcriptional regulatory region means adding a modification that increases the amount of gene transcription. For example, the promoter can be strengthened by introducing a mutation into the promoter, and the transcription amount of the downstream gene can be increased. In addition to introducing mutations into the promoter, a promoter that is strongly expressed in the host may be introduced. For example, in E. coli, promoters such as lac, tac, and trp can be mentioned. In addition, the amount of gene transcription can be increased by newly introducing an enhancer. The introduction of a gene such as a chromosomal DNA promoter is described in, for example, JP-A-1-215280.
[0030]
Specifically, the increase in the copy number of a gene can be achieved by connecting the gene to a multi-copy vector to produce a recombinant DNA and allowing the host cell to hold the recombinant DNA. Here, vectors include those widely used such as plasmids and phages, but besides these, transposon (Berg, DE and Berg. CM, Bio / Technol., Vol. 1, P. 417 (1983) ) And Mu phage (Japanese Patent Laid-Open No. 2-109985). It is also possible to increase the copy number by incorporating a gene into a chromosome by a method using a plasmid for homologous recombination.
As a method for increasing the translation efficiency of proteins, for example, in prokaryotes, SD sequences (Shine, J. and Dalgarno, L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 71, 1342-1346 (1974)), true In nuclear organisms, Kozak consensus sequences (Kozak, M., Nuc. Acids Res., Vol.15, p.8125-8148 (1987)) were introduced and modified, and codons used were optimized (JP-A-59 -125895).
[0031]
As a means to increase the intracellular or cell surface activity of L-lysine decarboxylase, mutations are introduced into the structural gene itself of L-lysine decarboxylase to increase the activity of L-lysine decarboxylase itself. Can also be mentioned.
[0032]
In order to induce mutations in genes, site-specific mutagenesis (Kramer, W. and frita, HJ, Methods in Enzymology, vol. 154, P. 350 (1987)) Recombinant PCR (PCR Technology, Stockton Press (1989) ), A method of chemically synthesizing a specific portion of DNA, a method of treating the gene with hydroxyamine, a method of treating a strain having the gene with ultraviolet irradiation, or a method of treating with a chemical agent such as nitrosoguanidine or nitrous acid. .
[0033]
As the recombinant cell, those derived from microorganisms, animals, plants, or insects can be preferably used. For example, when animals are used, mice, rats and cultured cells thereof are used. When plants are used, for example, Arabidopsis thaliana, tobacco and cultured cells thereof are used. In addition, when insects are used, for example, silkworms and cultured cells thereof are used. In addition, when microorganisms are used, for example, E. coli is used.
[0034]
Further, a plurality of L-lysine decarboxylases may be used in combination.
[0035]
In order to obtain L-lysine decarboxylase, there are no particular restrictions on the method of culturing the recombinant cells. For example, when culturing microorganisms, the medium to be used may be a carbon source, nitrogen source, inorganic ions, and other as required. A medium containing organic components is used. For example, in the case of E. coli, LB medium is often used. Carbon sources include glucose, lactose, galactose, fructose, arabinose, maltose, xylose, trehalose, sugars such as ribose and starch hydrolysates, alcohols such as glycerol, mannitol and sorbitol, gluconic acid, fumaric acid, citric acid And organic acids such as succinic acid can be used. As the nitrogen source, inorganic ammonium salts such as ammonium sulfate, ammonium chloride and ammonium phosphate, organic nitrogen such as soybean hydrolysate, ammonia gas, aqueous ammonia and the like can be used. As organic micronutrients, it is desirable to contain appropriate amounts of various substances, required substances such as vitamins such as vitamin B1, nucleic acids such as RNA, or yeast extract. In addition to these, a small amount of calcium phosphate, calcium sulfate, iron ion, manganese ion or the like is added as necessary.
[0036]
The culture conditions are not particularly limited. For example, in the case of Escherichia coli, the culture is preferably performed for about 16 to 72 hours under aerobic conditions, the culture temperature is 30 ° C. to 45 ° C., particularly preferably 37 ° C., and the culture pH is It is good to control to 5-8, Most preferably, pH7. For adjusting the pH, inorganic or organic acidic or alkaline substances, ammonia gas and the like can be used.
[0037]
Proliferated intracellularly expressed recombinant cells can be recovered from the culture medium by centrifugation or the like. In order to prepare a cell disruption solution from the collected intracellular-expressed recombinant cells, a normal method is used. That is, a cell disruption solution is obtained by disrupting intracellularly expressed recombinant cells by a method such as ultrasonic treatment, dynomill, French press, etc., and removing cell residues by centrifugation.
[0038]
To purify L-lysine decarboxylase from the cell lysate, enzyme sulfates, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, affinity chromatography, gel filtration chromatography, isoelectric precipitation, heat treatment, pH treatment, etc. Techniques usually used for purification are used in appropriate combination.
[0040]
  In the present invention,Working with isolated and purified L-lysine decarboxylaseImportantIt is. L-lysine decarboxylaseSimplySeparation and purification can remove enzymes that cause degradation of L-lysine and cadaverine., High yield and high purity cadaverineThe
[0041]
In addition, if cells that have L-lysine decarboxylase localized on the cell surface are allowed to act, degradation of L-lysine and cadaverine can be suppressed, resulting in higher yield, higher purity, and higher production. Cadaverine can be obtained at speed. Furthermore, the cells can be collected and used repeatedly for enzyme reactions. Moreover, the enzyme preparation is very simple.
[0042]
In general, an enzyme is an amino acid sequence that should originally exist and exists in nature. Therefore, when an amino acid sequence is artificially added or lost, the activity of the enzyme is often lost. However, in the present invention, when L-lysine decarboxylase is expressed in cells, L-lysine decarboxylase in which 1 to 30 amino acid sequences are added to the N-terminal amino acid sequence of L-lysine decarboxylase can be preferably used. . Here, 6 to 10 histidine residues are preferable for the N-terminal. Thus, L-lysine decarboxylase can be easily purified by adding an amino acid to the N-terminal amino acid sequence. There is no particular limitation on the method of adding 1 to 30 amino acids to the N-terminal amino acid sequence. For example, the base sequence corresponding to the amino acid sequence to be added to the L-lysine decarboxylase gene may be recombined using genetic engineering techniques. There are no particular restrictions on the genetic engineering technique used. Preferably, there are a PCR method and a method by linking DNA fragments.
[0043]
Conversion from an L-lysine salt aqueous solution to cadaverine by L-lysine decarboxylase can be performed by contacting the L-lysine decarboxylase obtained as described above with an L-lysine salt aqueous solution.
[0044]
There is no particular limitation on the amount of L-lysine decarboxylase used. An amount sufficient to catalyze the reaction of converting the aqueous L-lysine salt solution into cadaverine is sufficient. The enzyme concentration in the reaction solution is preferably 25 to 70 mg / L. Preferably it is 50 mg / L. On the other hand, when resting cells are used, the cell concentration in the reaction solution is 5 to 15 g / L. Preferably it is 10 g / L.
[0045]
The reaction temperature is usually 28 to 55 ° C, preferably around 45 ° C.
[0046]
There is no restriction | limiting in particular in the state of a reaction liquid. Preferably, it is left standing or stirred. There is no particular limitation on the method of stirring. A method of stirring with a stirring blade is preferred.
[0047]
The L-lysine decarboxylase used in the present invention can be repeatedly used for cadaverine synthesis reaction by immobilization, and the cost required for enzyme preparation can be reduced. Examples of the immobilization method include a method encompassing synthetic polymers such as acrylamide, a method of adsorbing to an ion-exchange carrier or a hydrophobic carrier having a skeleton of Sepharose or styrene resin, or a method of covalently binding to a glass carrier. Is mentioned.
[0048]
The reaction time varies depending on conditions such as enzyme activity and L-lysine salt concentration used, but is usually 1 to 72 hours. The reaction may be continuously performed while supplying the L-lysine salt.
[0049]
As a method for collecting the cadaverine thus produced from the reaction solution after completion of the reaction, the reaction end solution may be adjusted to pH 12 to 14 with an alkali and extracted with a polar organic solvent.
[0050]
There is no restriction | limiting in particular in the alkali to be used. Preferably, sodium hydroxide, potassium hydroxide, or calcium hydroxide can be used.
[0051]
There is no restriction | limiting in particular in the polar organic solvent to be used. Preferably, aniline, cyclohexanone, 1-octanol, isobutyl alcohol, cyclohexanol, and chloroform can be used.
[0052]
The cadaverine thus obtained is low in impurities such as tri-n-butylamine and 2,3,4,5-tetrahydropyridine. When produced by the method of the present invention, when analyzed by the following method, a cataverine having a tri-n-butylamine content of 0.006 wt% or less is obtained. Furthermore, when the following method is used for analysis, a 2,3,4,5-tetrahydropyridine content of 1.4 wt% or less is obtained. Furthermore, the tri-n-butylamine content is 0.006 wt% or less and the 2,3,4,5-tetrahydropyridine content is 1.4 wt% or less.
[0053]
Analysis of tri-n-butylamine and 2,3,4,5-tetrahydropyridine is carried out by the GC-MS method under the following conditions.
[0054]
GC / MS: HP6980 / HP5973A
Column: NUKOL 30m x 0.24mm I.D. 0.2μm Film
Oven: 120 ° C (constant)
InJ: 200 ° C (Split 10: 1)
Flow: He 2.4ml / min (const.Flow)
MS: 230 ° C. (SCAN m / z = 30 to 400)
The cadaverine thus obtained is useful as a raw material for polyamide.
[0055]
As a method for producing polyamide, a heating polycondensation method is used in which a mixture of a salt of cadaverine and a dicarboxylic acid and water is heated to advance a dehydration reaction. It is also possible to increase the molecular weight by solid phase polymerization after heat polycondensation. Solid phase polymerization proceeds by heating in a temperature range of 100 ° C. to a melting point in a vacuum or in an inert gas, and a polyamide having an insufficient molecular weight by heating polycondensation can have a high molecular weight.
[0056]
There is no restriction | limiting in particular in the dicarboxylic acid to be used. For example, adipic acid is preferable.
[0057]
By using cadaverine obtained in the present invention as a raw material for polyamide, a polyamide having high heat resistance can be obtained.
[0058]
【Example】
Examples Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the present invention is not limited to the description of these examples.
[0059]
[Analysis method of L-lysine concentration and cadaverine concentration by HPLC]
Column used: CAPCELL PAK C18 (Shiseido)
Mobile phase: 0.1% (w / w) H3PO4: acetonitrile = 4.5: 5.5
Detection: UV 360nm
Sample pretreatment: 25 μl of an analytical sample, 25 μl of 0.03M 1,4-diaminobutane, 150 μl of 0.075 M sodium bicarbonate, and an ethanol solution of 0.2 M 2,4-dinitrofluorobenzene were added and mixed as an internal standard. Incubate for 1 hour at ° C. 50 μl of the above reaction solution was dissolved in 1 ml of acetonitrile, and 10 μl after centrifugation at 10,000 rpm for 5 minutes was analyzed by HPLC.
[0060]
Reference example 1 (adjustment of L-lysine decarboxylase)
(1) Cloning of L-lysine decarboxylase gene and preparation of intracellular expression vector
In order to convert L-lysine salt into cadaverine using L-lysine decarboxylase, the E. coli L-lysine decarboxylase gene (cadA) was cloned.
[0061]
Oligonucleotide primer 5-atgaacgttattgcaatattg-3 '(SEQ ID NO: 1), 5'- with reference to the base sequence of L-lysine decarboxylase gene (cadA) (Accession No. M76411) registered in the database (GenBank) gctgatgggtgagatagaatg-3 ′ (SEQ ID NO: 2) was synthesized. Take 0.2 μl each of a genomic DNA solution prepared from E. coli K12 strain (ATCC10798) according to a conventional method as an amplification template in a 0.2 ml microcentrifuge tube, 20 pmol of each primer, 20 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0), Reagents were added to give 2.5 mM KCl, 100 μg / ml gelatin, 50 μM each dNTP, 2 units LATaq DNA polymerase (Takara Shuzo), and the total volume was 50 μl. The DNA denaturation conditions were 94 ° C for 30 seconds, the primer annealing conditions were 55 ° C for 30 seconds, and the DNA primer extension reaction conditions were 72 ° C for 3 minutes using a BioRad thermal cycler for 30 cycles. (Polymerase chain reaction: hereinafter referred to as PCR method). The PCR method in this example was performed under these conditions unless otherwise specified. The product obtained by this PCR method was electrophoresed with 1% agarose, and a DNA fragment of about 2.1 kb containing the cadA gene was prepared according to a conventional method. This fragment was inserted into a gap in which T base was added to the 3′-end of the EcoRV site of plasmid vector pT7blue (manufactured by Novagen) by a ligation reaction according to a conventional method, and the resulting plasmid was called pT7-cadA. Named.
[0062]
Using this pT7-cadA as an amplification template, PCR was performed using oligonucleotides 5'-cgccatgggccatcatcatcatcatcatcatcatatgaacgttattgcaatattg-3 '(SEQ ID NO: 3) and 5'-cgcggatccgctgatgggtgagatagaatg-3' (SEQ ID NO: 4) as a primer set. The product obtained here has the nucleotide sequence derived from the oligonucleotide (SEQ ID NO: 3) and the nucleotide sequence derived from (SEQ ID NO: 4) at the 5 ′ end and 3 ′ end of the DNA fragment containing the cadA gene, respectively. It has been added. This product was electrophoresed with 1% agarose, and a DNA fragment of about 2.1 kb was prepared according to a conventional method. This fragment was inserted into a gap in which T base was added to the 3′-end of the EcoRV site of plasmid vector pT7blue (manufactured by Novagen) by a ligation reaction according to a conventional method, and the resulting plasmid was designated as pT7-cadA1. Named.
[0063]
This pT7-cadA1 was digested with NcoI and BamHI, and the resulting 2.1 kb NcoI-BamHI fragment was routinely inserted into the NcoI / BamHI gap of pTV118N (Takara Shuzo) previously digested with NcoI and BamHI. The resulting plasmid was inserted by a ligation reaction, and the resulting plasmid was named pLDC1 (FIG. 1). By culturing Escherichia coli into which this plasmid has been introduced, recombinant L-lysine decarboxylase having a molecular weight of about 80 kDa in which 6 histidine residues are added to the N-terminal amino acid sequence of L-lysine decarboxylase can be produced. it can.
[0064]
(2) Production of recombinant L-lysine decarboxylase
The E. coli JM109 strain was transformed to ampicillin resistance with pLDC1, and the resulting transformant was named JM109 / pLDC1 strain.
[0065]
Next, recombinant L-lysine decarboxylase was produced in the JM109 / pLDC1 strain. First, JM109 / pLDC1 strain was sterilized LB medium (Sambrook, J. et. Al, 2001, Molecular Cloning 3rd. Edition, Cold Spring Harbor Lab. Press) (LB-amp medium) containing 50 μg / ml ampicillin sodium. One platinum ear inoculated into 5 ml and precultured by shaking at 37 ° C. for 24 hours.
[0066]
This preculture is inoculated in a total volume of 50 ml of LB-amp medium and cultured for 3 hours at 37 ° C. with an amplitude of 30 cm and 180 rpm, and then 1 mM IPTG (isopropyl-1-thio-β-D-galactoside) is added. The culture was further continued for 4 hours. As a control experiment, the same culture was performed using a transformant obtained by transforming the JM109 strain with pTV118N (hereinafter referred to as JM109 / pTV118N strain). The bacterial cells thus obtained were collected, resuspended in 5 ml of TBS buffer (Takara Shuzo), and a cell disruption solution was prepared by ultrasonic disruption and centrifugation. These L-lysine decarboxylase activities were measured by measuring the concentration of cadaverine produced per unit time. As a result, the L-lysine decarboxylase activity increased about 100 times in the JM109 / pLDC1 strain compared to the cell disruption solution derived from the control experiment JM109 / pTV118N strain. In addition, this cell lysate was fractionated by SDS-PAGE and subjected to Western blotting with a Penta-His Antibody antibody (QIAGEN). L-lysine decarboxylase was detected.
[0067]
(3) Purification of recombinant L-lysine decarboxylase
This recombinant L-lysine decarboxylase was purified using interaction with nickel ions because of the 6 histidine residues in the N-terminal amino acid sequence. First, a column system packed with 10 ml of chelating Sepharose Fast Flow carrier (manufactured by Amersham Bioscience) was constructed. After flowing 50 ml of 50 mM nickel sulfate aqueous solution and 50 ml of TBS buffer in this order, 50 ml cell lysate derived from a 500 ml culture of JM109 / pLDC1 obtained in the same manner as in (2) was poured. . Thereafter, 100 ml of TBS buffer containing 5 mM imidazole and 100 ml of TBS buffer containing 50 mM imidazole were run in this order. Further, 50 ml of TBS buffer containing 600 mM imidazole was flowed. When the L-lysine decarboxylase activity of each buffer passed through the column was measured by the same method as in (2), only the TBS buffer containing 600 mM imidazole was active. In addition, each buffer solution passed through the column was subjected to SDS-PAGE and stained with Coomassie Brilliant Blue, and a single band of about 80 kDa was detected from the TBS buffer containing 600 mM imidazole. In addition, Western blotting was performed on each buffer solution passed through the column in the same manner as in (2). As a result, an approximately 80 kDa protein was detected only in the TBS buffer solution containing 600 mM imidazole. It was confirmed that it was a recombinant L-lysine decarboxylase having carbonic acid activity.
[0068]
(4) Preparation of cell surface expression vector of L-lysine decarboxylase
First, a part of the lipoprotein sequence and the sequence from the 46th amino acid to the 159th amino acid of the outer membrane associated protein (OmpA) were cloned as one cassette.
[0069]
Oligonucleotide primer 5-ataaagcttatgaaagctactaaactgg-3 '(SEQ ID NO: 5), 5'-atagtcgacgttgtccggacgagtgccg-3 with reference to the base sequence of outer membrane binding protein (ompA) (Accession No. NC_000913) registered in the database (GenBank) '(SEQ ID NO: 6), 5'-ataaagcttatgaaagctactaaactggtactgggcgcggtaatcctgggttctactctgctggcaggttgctccagcaacgctaaaatcgatcagaacccgta-3' (SEQ ID NO: 7) was synthesized. PCR was carried out using a genomic DNA solution prepared from E. coli K12 strain (ATCC10798) according to a conventional method as an amplification template and using (SEQ ID NO: 5) (SEQ ID NO: 6) (SEQ ID NO: 7) as a primer set. . The product obtained by this PCR method was electrophoresed with 2% agarose, and a DNA fragment of about 0.4 kb containing the ompA gene was prepared according to a conventional method. This fragment was inserted into a gap in which T base was added to the 3′-end of the EcoRV site of plasmid vector pT7blue (manufactured by Novagen) by a ligation reaction according to a conventional method, and the resulting plasmid was named pTM7. .
[0070]
This pTM7 was digested with Hind III and Sal I, and the obtained approximately 0.4 kb Hind III Sal I fragment was digested with Hind III and Sal I in advance to Hind III / Sal of pUC19 (Takara Shuzo). It was inserted into the I gap by a ligation reaction according to a conventional method, and the resulting plasmid was designated as pTM14.
[0071]
Next, the L-lysine decarboxylase gene (cadA) of E. coli K12 strain (ATCC10798) was cloned.
[0072]
Oligonucleotide primer 5-tatgtcgacatgaacgttattgcaatat-3 '(SEQ ID NO: 8), 5'- with reference to the base sequence of L-lysine decarboxylase gene (cadA) (Accession No. M76411) registered in the database (GenBank) ggagagctcttattttttgctttcttcttt-3 ′ (SEQ ID NO: 9) was synthesized. PCR was performed using a genomic DNA solution prepared from E. coli K12 strain (ATCC10798) according to a conventional method as an amplification template and (SEQ ID NO: 8) (SEQ ID NO: 9) as a primer set.
[0073]
The product obtained by this PCR method was electrophoresed with 1% agarose, and a DNA fragment of about 2.1 kb containing the cadA gene was prepared according to a conventional method. This fragment was inserted into a gap in which T base was added to the 3′-end of the EcoRV site of plasmid vector pT7blue (manufactured by Novagen) by a ligation reaction according to a conventional method, and the resulting plasmid was named pTM15. .
[0074]
These adjusted pTM15 were digested with Sal I and Sac I, and the resulting 2.1 kb Sal I Sac I fragment was previously digested with Sal I and Sac I in the Sal I / Sac I gap of pTM14. Was inserted by a ligation reaction according to a conventional method, and the resulting plasmid was designated as pTM16 (FIG. 2).
[0075]
By culturing E. coli into which this plasmid has been introduced, L-lysine decarboxylase is localized on the cell surface, and L-lysine decarboxylase can be adjusted by simply recovering the E. coli.
(5) Preparation of cells with L-lysine decarboxylase localized on the cell surface
The E. coli JM109 strain was transformed to ampicillin resistance with pTM16, and the resulting transformant was designated as JM109 / pTM16 strain.
[0076]
Next, recombinant L-lysine decarboxylase was produced in the JM109 / pTM16 strain. First, 1 platinum ear of the JM109 / pTM16 strain was inoculated into 5 ml of sterilized LB medium (LB-amp medium) containing 50 μg / ml ampicillin sodium, and precultured by shaking at 37 ° C. for 24 hours.
[0077]
A total amount of this preculture was inoculated into 50 ml of LB-amp medium, cultured at 37 ° C. and amplitude of 30 cm for 3 hours under the condition of 180 rpm, added with 1 mM IPTG, and further cultured for 4 hours. The bacterial cells thus obtained were collected by centrifugation, washed 3 times with 10 ml of TBS buffer (Takara Shuzo), and then centrifuged to collect the bacterial cells.
[0078]
Examples 1 and 2 Comparative Example 1 (effect of the type of L-lysine)
To a 1000 ml flask was added 500 ml of an aqueous solution prepared by adding various L-lysines or L-lysine salts shown in Table 1 to a final concentration of 1.35 M. Thereafter, the purified recombinant L-lysine decarboxylase obtained in Reference Example 1 (3) was added to act at a final concentration of 50 mg / L. The concentration of cadaverine contained in the reaction solution after 48 hours of reaction at 45 ° C. was measured. The results are shown in Table 1.
[0079]
[Table 1]

[0080]
When an aqueous L-lysine salt solution was used as a raw material, cadaverine was obtained with a higher concentration and a higher reaction yield.
[0081]
Examples 3 to 7 (effect of addition of vitamin B6)
To a 1000 ml flask, 500 ml of an aqueous solution prepared by adjusting L-lysine monohydrochloride to a final concentration of 1.35 M was added. Next, various vitamin B6 shown in Table 2 was added to a final concentration of 0.05 mM. Finally, the purified recombinant L-lysine decarboxylase obtained in Reference Example 1 (3) was added to the final concentration of 50 mg / L. The concentration of cadaverine contained in the reaction solution after 48 hours of reaction at 45 ° C. was measured. The results are shown in Table 2.
[0082]
[Table 2]

[0083]
As a result, cadaverine was obtained in a higher yield by adding vitamin B6 to the L-lysine salt aqueous solution.
[0084]
Examples 8 to 11 (Effects of reaction stop conditions)
To a 1000 ml flask, 500 ml of an aqueous solution prepared by adding L-lysine monohydrochloride to a final concentration of 1.35 M was added. Next, pyridoxal phosphate monohydrate was added to a final concentration of 0.05 mM. Finally, the purified recombinant L-lysine decarboxylase obtained in Reference Example 1 (3) was added to a final concentration of 50 mg / L and allowed to act at 45 ° C. The residual L-lysine concentration was always measured by HPLC, and when the residual L-lysine concentration shown in Table 3 was reached, the reaction solution was heated to 80 ° C. to stop the reaction. Sodium hydroxide was added to these reaction solutions so that the pH of the reaction solution was 13 or higher. Next, chloroform was added in an amount equivalent to the reaction solution, and cadaverine was extracted from the chloroform phase. Finally, cadaverine was isolated by subjecting this chloroform phase to distillation under reduced pressure (30 mmHg, 80 ° C.). The purification yield in this isolation operation is summarized in Table 3.
[0085]
[Table 3]

[0086]
As a result, cadaverine was obtained in a high purification yield by isolating cadaverine from the reaction solution in which the L-lysine salt concentration was 20% or less of the charged concentration as the reaction termination condition.
[0087]
  Example 12  Reference examples 1-4  Comparative Example 2(Effect of the purified state of the obtained L-lysine decarboxylase)
The JM109 / pLDC1 strain obtained by the method shown in Reference Example 1 was cultured and purified as shown in Table 4. In addition, the JM109 / pTM16 strain in which L-lysine decarboxylase was localized on the cell surface was also cultured. Comparative example2The JM109 / pTV118N strain obtained by the method shown in Reference Example 1 was also cultured.
[0088]
  To a 1000 ml flask, 500 ml of an aqueous solution prepared by adding L-lysine monohydrochloride to a final concentration of 1.35 M was added. Next, pyridoxal phosphate monohydrate was added to a final concentration of 0.05 mM. Finally, JM109 / pTV118N cells (Comparative Example 2), JM109 / pLDC1 cells (referenceExample1) And JM109 / pTM16 cells (implemented)referenceExample4) Shows the microbial cells obtained from 270 ml of the culture solution (the amount of microbial cells corresponding to the addition of L-lysine decarboxylase concentration to 50 mg / L final concentration), and recombinant L- in each purified state shown in Table 4. Lysine decarboxylase (Reference examples 2, 3,Example12) Was added to a final concentration of 50 mg / L and allowed to act at 45 ° C. The results of measuring the concentration of cadaverine over time are shown in FIG. Further, the cadaverine yield and the cadaverine production rate at the time when the reaction did not proceed were determined and are shown in Table 5 and FIG.
[0089]
[Table 4]

[0090]
[Table 5]

[0091]
  As a result, recombinant L-lysine decarboxylaseIsolationBy purification, cadaverine was obtained at a high production rate and high yield. Cadaverine was obtained at a high production rate and high yield by localizing L-lysine decarboxylase on the cell surface.
[0092]
Reference Example 2 (Preparation of cadaverine by existing chemical synthesis method)
It is suspended in 20 g of L-lysine monohydrochloride (manufactured by Fluka) in 100 ml of cyclohexanol (manufactured by Sigma-Aldrich Japan), and then 21.2 ml of 28% sodium methoxide / methanol solution (manufactured by Sigma-Aldrich Japan), 2-cyclohexene-1- 1 ml of ON (manufactured by Sigma Aldrich Japan) was added, and the mixture was heated and stirred at 155 ° C. for 3 hours. After completion of the reaction, 20 ml of isopropanol solution (manufactured by Sigma-Aldrich Japan) containing 4 g of hydrogen chloride (manufactured by Sigma-Aldrich Japan) was added to the reaction mixture, and the precipitated product was recovered and dried to obtain cadaverine dihydrochloride ( The method described in Example 3 of JP-B-4-10452). Cadaverine dihydrochloride was converted to cadaverine by adding an aqueous sodium hydroxide solution to this aqueous solution, extracted with chloroform, and distilled under reduced pressure (30 mmHg, 80 ° C.) to obtain cadaverine.
[0093]
  Example13  Reference examples 5-8  Comparative example 3 (identification of impurities)
  Reference examples 1 to 3 aboveExample 12And Reference Example 4Cadaverine was isolated by the purification method shown in Examples 8 to 11 from the reaction solutions obtained in (1). Table 6 shows the results of impurity analysis performed by the GC-MS method under the conditions shown below and compared with the impurity analysis of cadaverine prepared in Reference Example 2 (Comparative Example 3).(Reference Example 5 and Reference Example 1, Reference Example 6 and Reference Example 2, Reference Example 7 and Reference Example 3, Reference Example 8 and Reference Example 4, Example 13 and Example 12 respectively correspond.)
GC / MS: HP6980 / HP5973A
Column: NUKOL 30m x 0.24mmI. D. 0.2μm Film
Oven: 120 ° C (constant)
InJ: 200 ° C. (Split 10: 1)
Flow: He 2.4 ml / min (const. Flow)
MS: 230 ° C. (SCAN m / z = 30 to 400)
[0094]
[Table 6]

[0095]
As a result, by purifying cadaverine produced using L-lysine decarboxylase, the content of tri-n-butylamine which is toxic to aquatic organisms and reacts when contacted with acid is 0.006 wt% or less and A high-purity cadaverine having a 2,3,4,5-tetrahydropyridine content of 1.4 wt% or less was obtained.
[0096]
  Reference Example 3 (Preparation of cadaverine and adipic acid salt)
  Example12An aqueous solution obtained by dissolving 10.3 g of cadaverine in 25 g of water is immersed in a water bath at 40 ° C. and stirred, and about 1 g of adipic acid (manufactured by Kirk) is about 0.1 g near the neutralization point. It was pH 8.66 when 2g was added, the pH change of the aqueous solution with respect to the added amount of adipic acid was examined, and the neutralization point was determined. A 50 wt% aqueous solution of equimolar salts of cadaverine and adipic acid was prepared so that the pH was 8.66.
[0097]
Reference Example 4 (adjustment of cadaverine and adipic acid salt)
A solution of 10.3 g of cadaverine of Reference Example 2 dissolved in 25 g of water is immersed in a 40 ° C. water bath and stirred, and about 1 g of adipic acid (made by Kirk) About 0.2 g was added, the change in pH of the aqueous solution with respect to the amount of adipic acid added was examined, and the neutralization point was determined to be pH 8.72. A 50 wt% aqueous solution of equimolar salts of cadaverine and adipic acid was prepared so that the pH was 8.72.
[0098]
  Example14(Polyamide synthesis)
  50.0 g of a 50 wt% aqueous solution of cadaverine and an adipic acid equimolar salt prepared in Reference Example 3 was placed in a test tube, placed in an autoclave, sealed, and purged with nitrogen. The jacket temperature was set to 265 ° C. and heating was started. The pressure inside the can is 17.5 kg / cm²The pressure inside the can is 17.5 kg / cm²For 3 hours. Thereafter, the jacket temperature was set to 275 ° C., and the internal pressure of the can was released to normal pressure over 2 hours. Thereafter, heating was stopped when the internal temperature reached 245 ° C. After cooling to room temperature, the test tube was removed from the autoclave to obtain polyamide.
[0099]
Comparative Example 4
A polyamide was obtained in the same manner as in Example 22 except that 50.0 g of a 50 wt% aqueous solution of equimolar salts of cadaverine and adipic acid prepared in Reference Example 4 was used.
[0100]
  Example15(Evaluation of polyamide)
  Example14The polyamide obtained in the above and the polyamide obtained in Comparative Example 4 were comparatively evaluated by the methods shown below. The results are shown in Table 7.
[0101]
[Quantification of 2,3,4,5-tetrahydropyridine and tri-n-butylamine in polyamide (GC-MS)]
About 15 g of polyamide is precisely weighed and subjected to Soxhlet extraction with methanol. The extract is subjected to GC-MS analysis under the following conditions to obtain 2,3,4,5-tetrahydropyridine contained in polyamide and tri-n. -Butylamine was quantified.
Apparatus: HP5890 mass detector manufactured by Hewlett-Packard
Column: 5% -diphenyl-95% -dimethylpolysiloxane
Column temperature: Initial 100 ° C
Final 250 ° C
Temperature increase rate: 10 ° C / min
Inlet temperature: 230 ° C
Detector temperature: 280 ° C
Carrier gas: helium
Inlet pressure: 50 kg / cm2
Sample injection volume: 1 μl.
[0102]
[DSC (Differential Scanning Calorimetry)]
Using a DSC RDC220 robot manufactured by Seiko Denshi Kogyo, about 5 mg of polyamide was collected under a nitrogen atmosphere and measured under the following conditions.
The temperature was raised to the melting point + 25 ° C. and held for 3 minutes to completely melt the polyamide. Then, the temperature was lowered to 30 ° C. at a rate of 20 ° C./min. The temperature of the endothermic peak and the amount of heat observed when the temperature was raised at a rate of temperature increase of 20 ° C./min were determined.
[0103]
[Relative viscosity (ηr)]
Measurement was performed using an Ostwald viscometer at a concentration of 0.01 g / ml in 25% sulfuric acid in 98% sulfuric acid.
[0104]
[Melt retention test]
About 5 g of polyamide was placed in a test tube and immersed in a silicon bath having a melting point of + 20 ° C. in a nitrogen atmosphere. After the polyamide was completely melted, it was allowed to stand for 30 minutes, and then the polyamide was recovered and the relative viscosity was measured. .
[0105]
[Table 7]

[0106]
As a result, by using the high purity cadaverine obtained by the method of the present invention, a polyamide having a high relative viscosity (ηr) retention (high heat resistance) was obtained.
[0107]
【The invention's effect】
  According to the present invention, high reaction yield, high purification yield, high production rate, high concentration and high purityFor polyamide raw materialsIndustrial production method of cadaverine andFor polyamide raw materialsMethods for isolating cadaverine are provided.
[0108]
[Sequence Listing]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows a physical map of L-lysine decarboxylase intracellular expression vector pLDC1.
FIG. 2 is a diagram showing a physical map of L-lysine decarboxylase cell surface expression vector pTM16.
3 is a graph showing the relationship between time and cadaverine production in Examples 12 to 16 and Comparative Example 2. FIG.

Claims (3)

Ｌ−リジン塩水溶液に、Ｌ−リジン脱炭酸酵素を作用させ、反応液からカダベリンを単離するカダベリンの製造方法であって、単離精製されたＬ−リジン脱炭酸酵素を作用させ２，３，４，５−テトラヒドロピリジンの含有量を低減させることを特徴とするポリアミド原料用カダベリンの製造方法。A method for producing cadaverine, wherein L-lysine decarboxylase is allowed to act on an L-lysine salt aqueous solution to isolate cadaverine from the reaction solution, wherein the isolated and purified L-lysine decarboxylase is allowed to act on the method of manufacturing polyamide material for cadaverine, wherein Rukoto reduce the content of 4,5-tetrahydropyridine. 単離精製されたＬ−リジン脱炭酸酵素を作用させた後、Ｌ−リジン塩の濃度が仕込み濃度の２０％以下になった反応液からカダベリンを単離することを特徴とする請求項１記載のポリアミド原料用カダベリンの製造方法。The cadaverine is isolated from the reaction solution in which the concentration of the L-lysine salt is 20% or less of the charged concentration after allowing the isolated and purified L-lysine decarboxylase to act. Of producing cadaverine for polyamide raw materials. 反応液から２，３，４，５−テトラヒドロピリジンの含有量が０．２０５ｗｔ％以下のカダベリンを単離することを特徴とする請求項１または２記載のポリアミド原料用カダベリンの製造方法。The method for producing cadaverine for a polyamide raw material according to claim 1 or 2, wherein cadaverine having a 2,3,4,5-tetrahydropyridine content of 0.205 wt% or less is isolated from the reaction solution.

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