JP2004173599A - Agent for repairing damage of dna, and screening method - Google Patents

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a new medicament for preventing or ameliorating various kinds of human diseases caused by G/T (guanine/thymine) mismatch of a genome DNA. <P>SOLUTION: The agent for repairing the damage of a DNA contains a polypeptide having an amino acid sequence of a specific polypeptide derived from a gene associated with human xeroderma pigmentosum (XP) or a mutant sequence thereof, or a polynucleotide encoding the polypeptide which has a form introducible into cells. <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
この出願の発明は、ＤＮＡ損傷修復剤とスクリーニング方法に関するものである。さらに詳しくは、この出願の発明は、チミンＤＮＡグリコシラーゼ（ＴＤＧ）が関与する塩基除去修復反応を促進することによってＤＮＡ損傷を修復する薬剤と、そのような薬剤の新規成分を特定するためのスクリーニング方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
生物には様々なＤＮＡ損傷を除去する複数のＤＮＡ修復経路があり、これによってゲノムの安定性と細胞機能が維持されている（非特許文献１、２）。このようなＤＮＡ修復経路の一つである塩基除去修復（ＢＥＲ）は、自然発生的、または環境誘導性の様々な塩基損傷を修正する（非特許文献３、４、５）。ＢＥＲの開始はＤＮＡグリコシラーゼという酵素により行われるが、この酵素はＮ−グリコシド結合を加水分解することにより、ＤＮＡのリン酸−糖骨格から異常塩基、または不適切な塩基を切り離す。脊椎動物では、結果的に生じた脱プリン／脱ピリミジン部位（ＡＰ部位）が次にＡＰエンドヌクレアーゼ（ＡＰＥ、あるいはＨＡＰ１、ＡＰＥＸ、Ｒｅｆ−１とも呼ばれる）により切断され、５’−デオキシリボース−５−リン酸と３’−ヒドロキシル末端が残される（非特許文献６）。さらに、一部のＤＮＡグリコシラーゼは内因性のＡＰリアーゼ活性を持っており、この場合にはＡＰ部位の３’側が切断される（非特許文献７）。ＡＰＥはＡＰ部位の５’側を切断する活性に加えて、ＤＮＡ ３’−ホスホジエステラーゼや３’−ホスファターゼなどの酵素活性を併せ持っており、後者のＡＰリアーゼ活性が働いた結果残された中間体の処理にも関係している。すなわちＡＰＥの後者の活性は、ＡＰリアーゼにより残された３’−末端をヒドロキシル基に変換し、それに続くＤＮＡ修復合成においてＤＮＡポリメラーゼがプライマーとして利用できるようにするのに寄与している（非特許文献６）。ＢＥＲ反応の最終段階であるＤＮＡ修復合成とＤＮＡ鎖再結合には、ＤＮＡポリメラーゼβが関与するショートパッチ修復経路と、ＰＣＮＡ依存性のロングパッチ修復経路の少なくとも２種類のメカニズムが存在することが示されている（非特許文献８）。
【０００３】
加水分解による脱アミノ化は、ＤＮＡ塩基に対して最も頻繁に生じる自然発生的な損傷の一つである。脊椎動物のゲノムでは、ＣｐＧジヌクレオチド部位のシトシンがＣ５部位でメチル化されることが多く、その結果生じた５−メチルシトシンの脱アミノ化の結果、チミンがグアニンに対して誤った塩基対を形成することになる（非特許文献１）。このようなＧ／Ｔミスマッチが修正される前にＤＮＡが複製されてしまうと、本来のＧ：Ｃ塩基対がＡ：Ｔに変化することになる。このためＣｐＧ部位は変異に対して非常に感受性が高い。これらの変異は、チミンＤＮＡグリコシラーゼ（ＴＤＧ；概説は非特許文献９を参照）によって開始されるＢＥＲ経路を介したＧ／Ｔミスマッチ修正により抑制される。
【０００４】
ＤＮＡ修復のもう一つの重要な経路はヌクレオチド除去修復（ＮＥＲ）である。ＮＥＲによって除去可能なＤＮＡ損傷は、二重らせん構造に歪みを与えるような各種の塩基損傷（例えば、紫外線（ＵＶ）によって誘導されたシクロブタン型ピリミジン二量体（ＣＰＤ）や（６−４）光産物など、あるいは種々の化学物質により誘導されたＤＮＡ鎖内架橋、およびかさの大きな塩基付加物など）である（非特許文献１０）。ＮＥＲ活性の欠損は、色素性乾皮症（ＸＰ）を含む幾つかのヒト遺伝性疾患に関係している。ＸＰの臨床症状はＵＶ曝露に対する皮膚の様々な過敏症状、および皮膚癌発症率の亢進により特徴づけられる。ＮＥＲに欠損を示すＸＰの遺伝的相補性群が現在まで７種類同定されており（ＸＰ−Ａ群からＧ群）、それぞれの群の原因となる遺伝子がクローニングされている。ＸＰ−Ｃ群の患者はそれ以外の大多数のＸＰ群とは異なり、２種類のＮＥＲ副経路のうちゲノム全体で働くグローバルゲノムＮＥＲだけに欠損が見られる。もう一方の経路である転写と共役したＮＥＲ（活性遺伝子の転写鎖上にある損傷を特異的に除去する）はＸＰ−Ｃ群患者では正常に機能している。ＸＰ−Ｃ群の責任遺伝子産物であるＸＰＣタンパク質は、細胞内においてセントリン２、および出芽酵母Ｒａｄ２３ｐに相同な２種類の哺乳類ホモローグのうちの一つであるＨＲ２３Ｂと結合し、ヘテロ３量体として存在している（非特許文献１１、１２、１３）。複合体中でのセントリン２の役割は未解決であるが、ＸＰＣ−ＨＲ２３Ｂ複合体の形成が無細胞ＮＥＲ反応の再構成に必要であることが示されている（非特許文献１４、１５、１６、１７）。生化学的な研究から、ＸＰＣ−ＨＲ２３Ｂがある種のＤＮＡ損傷に特異的に結合し、ＮＥＲ反応を開始させることが明らかになっている（非特許文献１５、１８、１９）。このため、ＸＰＣ−ＨＲ２３Ｂはゲノム全体で働くＮＥＲ機構において損傷認識因子として機能していると考えられている。そしてこの出願の発明者らは、ＸＰＣ−ＨＲ２３Ｂが、損傷そのものの構造特性を認識するのではなく、むしろ損傷により二重鎖ＤＮＡに誘起された構造異常を認識すること、さらには二重鎖および一本鎖ＤＮＡの境界を含む特異的なＤＮＡ構造が選択的に認識される可能性がある点を示している（非特許文献２０、２１）。
【０００５】
ただし、このＸＰＣタンパク質が、ＮＥＲ経路ではなく、ＢＥＲ経路（特にＴＤＧが関与するＧ／Ｔミスマッチの修復経路）に関与することは、従来、全く知られていない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
前記のとおり、ゲノムＤＮＡにおけるＧ／Ｔミスマッチは生理的条件下で高頻度に発生するものであり、このＤＮＡ損傷によって誘起される突然変異は細胞の機能低下やがん化、老化、遺伝病等の様々なヒト疾患に関係していると考えられる。そこで、このＧ／Ｔミスマッチを認識して解消するためのＤＮＡ修復反応を開始する酵素ＴＤＧを人為的に賦活化することができれば、Ｇ／Ｔミスマッチに起因する様々なヒト疾患を予防もしくは改善することが可能になるものと期待される。
【０００７】
ＴＤＧ活性を促進する因子の候補としてはＡＰＥを挙げることができる。ＡＰＥがＴＤＧの酵素学的な代謝回転を促進することが知られているからである（非特許文献２２）。しかしながら、ＡＰＥがＤＮＡ上でＴＤＧと相互作用してＴＤＧの活性そのものを促進しているという証拠は存在しない。また、ＡＰＥはそれ自身が塩基除去修復に必須な因子であることに加え、もともと細胞内での発現レベルが高いため、外来性ＡＰＥの細胞内導入や外来性ＡＰＥ遺伝子の細胞内発現による顕著な効果は期待できない。さらに、ＡＰＥは動物個体の生存に必須であり、塩基除去修復以外にも転写因子の活性調節等にも関与することが知られているので、外来性ＡＰＥの人為的導入や外来性ＡＰＥ遺伝子の強制発現は動物個体や細胞の正常な遺伝子発現調節に影響を及ぼすなどの弊害をもたらす危険性が高い。
【０００８】
この出願の発明者らは、ＴＤＧ活性を促進する因子を探索した結果、従来はヌクレオチド除去修復機構（ＮＥＲ）に関与する因子として知られていたＸＰＣタンパク質が、ＴＤＧと相互作用してその活性を促進させ、Ｇ／Ｔミスマッチを極めて効果的に修復することを見出した。
【０００９】
この出願の発明は、発明者らによるこの新規な知見に基づき、Ｇ／ＴミスマッチによるＤＮＡ損傷を効果的に修復する新しい薬剤を提供することを課題としている。
【００１０】
またこの出願の発明は、ＴＤＧとＸＰＣタンパク質との相互作用を指標として、ＴＤＧ酵素の活性をＸＰＣタンパク質と同等またはそれ以上に促進する新規物質、またはＴＤＧ酵素とＸＰＣタンパク質との相互作用をさらに増強することのできる新規物質をスクリーニングする方法を提供することを課題としている。
【００１１】
【非特許文献１】
Ｆｒｉｅｄｂｅｒｇ， Ｅ． Ｃ． ｅｔ ａｌ． （１９９５） ＤＮＡ Ｒｅｐａｉｒ ａｎｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ， ＡＳＭ ｐｅｒｓｓ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ． Ｄ． Ｃ．
【非特許文献２】
Ｈｏｅｉｊｍａｋｅｒｓ， Ｊ． Ｈ． Ｊ． （２００１） Ｎａｔｕｒｅ， ４１１， ３６６−３７４．
【非特許文献３】
Ｋｒｏｋａｎ， Ｈ． Ｅ． ｅｔ ａｌ． （２０００） ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．， ４７６， ７３−７７．
【非特許文献４】
ＭｃＣｕｌｌｏｕｇｈ， Ａ． Ｋ． ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ６８， ２５５−２８５．
【非特許文献５】
Ｎｉｌｓｅｎ， Ｈ． ａｎｄ Ｋｒｏｋａｎ， Ｈ． Ｅ． （２００１） Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ， ２２， ９８７−９９８．
【非特許文献６】
Ｗｉｌｓｏｎ ＩＩＩ， Ｄ． Ｍ． ａｎｄ Ｂａｒｓｋｙ， Ｄ． （２００１） Ｍｕｔａｔ． Ｒｅｓ．， ４８５， ２８３−３０７．
【非特許文献７】
ＭｃＣｕｌｌｏｕｇｈ， Ａ． Ｋ． ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ６８， ２５５−２８５．
【非特許文献８】
Ｎｉｌｓｅｎ， Ｈ． ａｎｄ Ｋｒｏｋａｎ， Ｈ． Ｅ． （２００１） Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ， ２２， ９８７−９９８．
【非特許文献９】
Ｈａｒｄｅｌａｎｄ， Ｕ． ｅｔ ａｌ． （２００２） ＥＭＢＯ Ｊ．， ２１， １４５６−１４６４．
【非特許文献１０】
ｄｅ Ｌａａｔ． ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．， １３， ７６８−７８５．
【非特許文献１１】
Ａｒａｋｉ， Ｍ． ｅｔ ａｌ． （２００１） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７６， １８６６５−１８６７２．
【非特許文献１２】
Ｍａｓｕｔａｎｉ， Ｃ． ｅｔ ａｌ． （１９９４） ＥＭＢＯ Ｊ．， １３， １８３１−１８４３．
【非特許文献１３】
Ｓｈｉｖｊｉ， Ｍ． Ｋ． Ｋ． ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６９， ２２７４９−２２７５７．
【非特許文献１４】
Ａｒａｕｊｏ， Ｓ． Ｊ． ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．， １４． ３４９−３５９．
【非特許文献１５】
Ｂａｔｔｙ， Ｄ． ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ３００， ２７５−２９０．
【非特許文献１６】
Ｍｕ， Ｄ． ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７０， ２４１５−２４１８．
【非特許文献１７】
Ｓｕｇａｓａｗａ， Ｋ． ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．， １７， ６９２４−６９３１．
【非特許文献１８】
Ｋｕｓｕｍｏｔｏ， Ｒ． ｅｔ ａｌ． （２００１） Ｍｕｔａｔ． Ｒｅｓ．， ４８５， ２１９−２２７．
【非特許文献１９】
Ｓｕｇａｓａｗａ， Ｋ． ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ， ２， ２２３−２３２．
【非特許文献２０】
Ｓｕｇａｓａｗａ， Ｋ． ｅｔ ａｌ． （２００１） Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．， １５， ５０７−５２１．
【非特許文献２１】
Ｓｕｇａｓａｗａ， Ｋ． ｅｔ ａｌ． （２００２） ＤＮＡ Ｒｅｐａｉｒ， １， ９５−１０７．
【非特許文献２２】
Ｗａｔｅｒｓ， Ｔ． Ｒ． ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７４， ６７−７４．
【００１２】
【課題を解決するための手段】
この出願は、前記の課題を解決するための第１の発明として、配列番号２のアミノ酸配列またはその変異配列からなるポリペプチドＸＰＣをコードするポリヌクレオチドが細胞内に導入可能な形態を有するＤＮＡ損傷修復剤を提供する。
【００１３】
この出願はまた、第２の発明として、配列番号２のアミノ酸配列またはその変異配列からなるポリペプチドＸＰＣが細胞内に導入可能な形態を有するＤＮＡ損傷修復剤を提供する。
【００１４】
さらにこの出願は、第３の発明として、配列番号２のアミノ酸配列またはその変異配列からなるポリペプチドＸＰＣと同等またはそれ以上のＤＮＡ損傷修復活性を有する物質を特定する方法であって、
（１）Ｇ／Ｔミスマッチ塩基対を含む２本鎖オリゴヌクレオチド集団に、チミンＤＮＡグリコシラーゼおよびポリペプチドＸＰＣを反応させた場合のミスマッチＴ塩基除去オリゴヌクレオチド量；および
（２）前記（１）と同一のオリゴヌクレオチド集団に、チミンＤＮＡグリコシラーゼおよび候補物質を反応させた場合のミスマッチＴ塩基除去オリゴヌクレオチド量、
をそれぞれ測定し、（１）量と（２）量が等量、または（１）量より（２）量が多くなる候補物質を目的物質とすることを特徴とするスクリーニング方法を提供する。
【００１５】
またさらにこの出願は、第４の発明として、配列番号２のアミノ酸配列またはその変異配列からなるポリペプチドＸＰＣのＤＮＡ損傷修復活性を増強する物質を特定する方法であって、
（１）Ｇ／Ｔミスマッチ塩基対を含む２本鎖オリゴヌクレオチド集団に、チミンＤＮＡグリコシラーゼおよびポリペプチドＸＰＣを反応させた場合のミスマッチＴ塩基除去オリゴヌクレオチド量；および
（２）前記（１）と同一のオリゴヌクレオチド集団に、チミンＤＮＡグリコシラーゼ、ポリペプチドＸＰＣおよび候補物質を反応させた場合のミスマッチＴ塩基除去オリゴヌクレオチド量、
をそれぞれ測定し、（１）量より（２）量が多くなる候補物質を目的物質とすることを特徴とするスクリーニング方法を提供する。
【００１６】
この出願の前記発明において、「ＤＮＡ損傷修復」とは、ゲノムＤＮＡ中の５−メチルシトシンの脱アミノ化によって生じるＧ／Ｔミスマッチの修復を意味する。さらに詳しくは、チミンＤＮＡグリコシダーゼ（ＴＤＧ）が関与するミスマッチ塩基除去修復を意味する。
【００１７】
「ポリペプチド」とは、アミド結合（ペプチド結合）によって直線的配列で互いに結合した２１個以上のアミノ酸残基の直線的配列から構成された分子を意味する。
【００１８】
「ポリヌクレオチド」とは、プリンまたはピリミジンが糖にβ−Ｎ−グリコシド結合したヌクレオシドのリン酸エステル（ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ；またはｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）が１０１個以上結合した分子を言い、「オリゴヌクレオチド」とは２−９９個連結した分子を言う。
【００１９】
この発明における「ポリペプチドＸＰＣ」とは、公知のヒトＸＰＣタンパク質（Ｍａｓｕｔａｎｉ Ｃ． ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ． １３（８）： １８３１−１８４３， １９９４； ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＮＭ＿００４６２８）と同一のアミノ酸配列からなるポリペプチドであある。また、このポリペプチドＸＰＣの「変異体」とは、ポリペプチドＸＰＣをコードするポリヌクレオチドにおける一塩基多型（ＳＮＰｓ）の結果として生じたアミノ酸置換を含むタンパク質である。ポリペプチドＸＰＣの配列情報（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＮＭ＿００４６２８）には複数のＳＮＰｓが開示されており、これらのうち、表１に示すタンパク質変異が公知である（例えば、表１の第１段は、配列番号１の第６１番目ｃがｇに置換した結果、配列番号２に示したアミノ酸配列における第１６番目Ｌｅｕ残基がＶａｌ残基に置換することを示す。また塩基置換によってもアミノ酸置換を伴わないもの［サイレント変異］は括弧内に示した）。また「変異体をコードするポリヌクレオチド」とは、表１に示したＳＮＰｓを含むポリヌクレオチドを意味する。
【００２０】
【表１】

【００２１】
第３発明および第４発明において、「同等」および「等量」とは、比較測定された数値が±５％以内であることを意味し、「同等以上」および「多い」とは比較測定された数値が６％以上であることを意味する。
【００２２】
この発明におけるその他の用語については、発明の実施形態および実施例において適宜に説明する。
【００２３】
なお、この発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。例えば、薬剤の調製はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， ｅｄ． Ａ． Ｇｅｎｎａｒｏ， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， ＰＡ， １９９０、遺伝子工学および分子生物学的技術はＳａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ， ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８９； Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ． Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ， １９９５）等に記載されている。
【００２４】
以下、各発明の実施形態を詳しく説明する。
【００２５】
【発明の実施の形態】
第１発明のＤＮＡ損傷修復剤は、ゲノムＤＮＡ上で塩基除去修復酵素ＴＤＧと相互作用することによってＴＤＧ活性を促進させ、Ｇ／Ｔミスマッチを効率よく修復することのできるポリペプチドＸＰＣをコードするポリヌクレオチドを含有する薬剤である。具体的には、この薬剤は、配列番号２のアミノ酸配列またはその変異配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが細胞内に導入可能な形態を有することを特徴としている。
【００２６】
このポリヌクレオチドは、好ましくはＸＰＣタンパク質をコードするｃＤＮＡであり、その配列は配列番号１のとおりである。ｃＤＮＡは例えば、配列番号１の塩基配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドプローブを用いて既存のヒトｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって得ることができる。またオリゴヌクレオチドプライマーとヒト細胞から抽出したＲＮＡ分子を用いたＲＴ−ＰＣＲ法によっても目的とするｃＤＮＡ断片を得ることができる。
【００２７】
ポリヌクレオチドは、発現ベクターに組み込むようにすることができる。発現ベクターは、プロモーター、スプライシング領域、ポリ（Ａ）付加部位等を有する公知の真核細胞用発現ベクターを使用することができ、この発現ベクターのクローニングサイトに、ポリペプチドＸＰＣをコードするポリヌクレオチドを挿入することによってポリペプチドＸＰＣ発現ベクターを構築することができる。またｃＤＮＡを使用する場合、配列番号１のタンパク質コード領域を構成する塩基配列（１６−２８３８番塩基）からなるＤＮＡ断片を使用することもできる。
【００２８】
薬剤形態としては、ポリペプチド発現ベクターを、例えば生体認識分子を提示した中空ナノ粒子、または公知のウイルスベクター（レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス等）に組み込むようにすればよい。このような薬剤を遺伝子治療の手法により生体内に導入することによって、細胞内でポリペプチドＸＰＣを発現させることができる。発現したＸＰＣは細胞内でＨＲ２３Ｂタンパク質と複合体を形成し、ＴＤＧによるＧ／Ｔミスマッチ修復活性を促進する。なお、ポリペプチドＸＰＣは核移行シグナル（核局在性ドメイン）を有するため、細胞内で発現したＸＰＣは核内に移行し、ゲノムＤＮＡ上で酵素ＴＤＧと相互作用する。
【００２９】
第２発明のＤＮＡ損傷修復剤は、ポリペプチドＸＰＣそれ自体が細胞内に導入可能な形態を有することを特徴とする。例えば、このポリペプチドの構造や機能を変更することなく、かつ薬理学的に許容される担体溶液にこのポリペプチドを混合して製剤化することができる。そしてこのような薬剤は、例えばマイクロインジェクション法により細胞内に導入することができる。あるいは脂質による細胞内導入法（ＢｉｏＰＯＲＴＥＲ（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、米国）、Ｃｈａｒｉｏｔ（Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆ社、米国）等）を採用することもできる。
【００３０】
ポリペプチドＸＰＣは、配列番号２のアミノ酸配列に基づいてペプチドを化学合成する方法や、前記の発現ベクターからのインビトロ転写翻訳系や、発現ベクターによる形質転換細胞の発現産物としてポリペプチドを単離精製する方法等によって取得することができる。例えば、ポリペプチドＸＰＣをインビトロ翻訳で発現させる場合には、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを有する発現ベクターを、プロモーターに対応するＲＮＡポリメラーゼを含むウサギ網状赤血球溶解物や小麦胚芽抽出物などのインビトロ翻訳系に添加すれば、ポリペプチドをインビトロで生産することができる。ＲＮＡポリメラーゼプロモーターとしては、Ｔ７、Ｔ３、ＳＰ６などが例示できる。これらのＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むベクターとしては、ｐＫＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＴ３／Ｔ７ １８、ｐＴ７／３ １９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩなどが例示できる。また、ポリペプチドＸＰＣを、大腸菌などの微生物で発現させる場合には、微生物中で複製可能なオリジン、プロモーター、リボソーム結合部位、ＤＮＡクローニング部位、ターミネーター等を有する発現ベクターに前記のＤＮＡ断片を組込んで発現ベクターを作成する。この発現ベクターで宿主細胞を形質転換すれば、ポリペプチドＸＰＣを発現する形質転換体細胞を得ることができ、この形質転換体を培養すれば、その培養物から目的のポリペプチドＸＰＣを大量生産することができる。大腸菌用発現ベクターとしては、ｐＥＴ発現システム、ｐＧＥＸ発現システムなどが例示できる。さらに、ポリペプチドＸＰＣを真核細胞で発現させる場合には、前記のＤＮＡ断片を、プロモーター、スプライシング領域、ポリ（Ａ）付加部位等を有する真核細胞用発現ベクターに挿入して組換えベクターを作製する。このベクターを真核細胞内に導入すれば、目的のポリペプチドＸＰＣを発現する形質転換真核細胞を得ることができる。発現ベクターとしては、ｐＫＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＳＶＫ３、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ＥＢＶベクター、ｐＲＳ、ｐＹＥＳ２などが例示できる。真核細胞としては、ヒト胎児腎臓細胞ＨＥＫ２９３、サル腎臓細胞ＣＯＳ７、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯなどの哺乳動物培養細胞、あるいはヒト臓器から単離した初代培養細胞などが使用できる。出芽酵母、***酵母、カイコ細胞、アフリカツメガエル卵細胞なども使用できる。発現ベクターを細胞に導入するには、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法など公知の方法を用いることができる。形質転換細胞で発現させたポリペプチドを単離精製するためには、公知の分離操作を組み合わせて行うことができる。例えば、界面活性剤による処理、超音波処理、酵素消化、塩析や溶媒沈殿法、透析、遠心分離、限外濾過、ゲル濾過、等電点電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーなどが挙げられる。
【００３１】
第２発明の薬剤の別の態様として、ポリペプチドＸＰＣのＮ末端側に細胞膜通過ペプチドを連結させた融合ポリペプチドを使用することもできる。この細胞膜通過ペプチドを備えることによって、生体内に注入されたポリペプチドＸＰＣは細胞膜を通過して細胞内に取り込まれ、核内に移行し、酵素ＴＤＧと相互作用してＧ／Ｔミスマッチを効率的に修復する。細胞膜通過ペプチドとしては、ＨＩＶ−１・ＴＡＴのＰＴＤ（ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ）（Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２８５：１５６９−１５７２， １９９９； ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＮＯ． Ｕ３９３６２ Ｍ９６１５５）、またはショウジョウバエのホメオボックスタンパク質アンテナペディアのＰＴＤ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＡＥ００１５７３）を採用することができる。融合ポリペプチドは、ＰＴＤをコードするＤＮＡ断片とポリペプチドＸＰＣ ｃＤＮＡを連結して融合ＤＮＡ断片を作成し、この融合ＤＮＡ断片を大腸菌等の宿主細胞で発現させることによって作成することができる。また、２価の架橋剤（例えば、ＥＤＣやβ−アラニン等）を介して、ポリペプチドＸＰＣとＰＴＤペプチドを結合させる方法によって細胞膜通過ペプチドを連結した融合ポリペプチドを作成することもできる。
【００３２】
第３発明は、ポリペプチドＸＰＣと同等またはそれ以上のＤＮＡ損傷修復活性を有する物質を特定するスクリーニング方法である。この方法では、
（１）Ｇ／Ｔミスマッチ塩基対を含む２本鎖オリゴヌクレオチド集団に、ＴＤＧおよびポリペプチドＸＰＣを反応させた場合のミスマッチＴ塩基除去オリゴヌクレオチド量；および
（２）前記（１）と同一のオリゴヌクレオチド集団に、ＴＤＧおよび候補物質を反応させた場合のミスマッチＴ塩基除去オリゴヌクレオチド量、
をそれぞれ測定し、（１）量と（２）量が等量、または（１）量より（２）量が多くなる候補物質を目的のＤＮＡ損傷修復物質として特定する。
【００３３】
「Ｇ／Ｔミスマッチ塩基対を含む２本鎖オリゴヌクレオチド」は、２−９９塩基からなる相補的な合成オリゴヌクレオチドがアニールしており、その配列中の中央付近に１箇所のＧ／Ｔミスマッチ塩基対を有する分子（以下「ＤＮＡ基質」と記載することがある）であり、例えば図２（ｂ）に示した６０塩基対の２本鎖オリゴヌクレオチドを例示することができる（図２（ｂ）の上段は配列番号３、下段は配列番号４に示す）。この図２（ｂ）の２本鎖オリゴヌクレオチドは、上段５’側から２７番目のＧに対して下段３’側から２７番目がＴである（Ｇ／Ｔミスマッチ）。
【００３４】
このようなＧ／Ｔミスマッチを含むＤＮＡ基質は、ＴＤＧによってミスマッチＴ塩基が除去されて「Ｔ塩基除去オリゴヌクレオチド」となるが、後記の実施例に示したように、ＴＤＧとＸＰＣとが作用することによって、Ｔ塩基除去オリゴヌクレオチドの量は増加する。従って、［ＴＤＧ＋ＸＰＣ］によって得られるＴ塩基除去オリゴヌクレオチドの量（１）と、［ＴＤＧ＋候補物質］の作用によって得られるＴ塩基除去オリゴヌクレオチドの量（２）を比較し、（１）量と（２）量が等量、または（１）量より（２）量が多くなる候補物質は、ＸＰＣと同等またはそれ以上のＤＮＡ損傷修復活性を有する物質と判定することができる。
【００３５】
また第４の発明では、［ＴＤＧ＋ＸＰＣ］によって得られるＴ塩基除去オリゴヌクレオチドの量（１）と、［ＴＤＧ＋ＸＰＣ＋候補物質］の作用によって得られるＴ塩基除去オリゴヌクレオチドの量（２）を比較し、（１）量より（２）量が多くなる候補物質は、ＸＰＣの活性を増強する物質であると判定することができる。
【００３６】
第３発明および第４発明の方法において使用する「候補物質」は、例えば有機または無機の化合物（特に低分子量の化合物）、タンパク質、ペプチド等が含まれる。またポリペプチドＸＰＣの一部連続配列からなるオリゴペプチドも第３発明の候補物質に含まれる。
【００３７】
なお、この第３発明および第４発明で使用するポリペプチドＸＰＣは、ＨＲ２３Ｂタンパク質との複合体として使用することが好ましい。細胞内において、ＸＰＣはＨＲ２３Ｂタンパク質との複合体として機能するからである。ＸＰＣ−ＨＲ２３Ｂ複合体は、それぞれのタンパク質をコードするＤＮＡ断片からなる融合ＤＮＡを用いた遺伝子工学的方法によって取得することができる。
【００３８】
また、Ｔ塩基除去オリゴヌクレオチド量は、例えば後記の実施例と同様にして測定することができる（ニッキングアッセイ）。すなわち、ＤＮＡ基質のうち、ミスマッチＴ塩基を含むオリゴヌクレオチドの一端を放射標識した状態で［ＴＤＧ＋ＸＰＣ］および［ＴＤＧ＋候補物質］または［ＴＤＧ＋ＸＰＣ＋候補物質］を作用させる。次いでミスマッチＴ塩基が除去されたオリゴヌクレオチドを熱アルカリ処理により切断し、電気泳動によって切断されたＤＮＡ基質を確認する。
【００３９】
以下、実施例として、ポリペプチドＸＰＣの機能を確認するために行った実験例を示すが、この発明は以下の例によって限定されるものではない。
【００４０】
【実施例】
１．方法
１−１．酵母２−ハイブリッドスクリーニング
ＸＰＣと相互作用するタンパク質の同定のため、Ｍａｔｃｈｍａｋｅｒ ＬｅｘＡ ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ ｓｙｓｔｅｍ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて酵母２−ハイブリッドスクリーニングを行った。ヒトＸＰＣの全長をコードするｃＤＮＡを、バイトベクターｐＬｅｘＡ中のＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメインにインフレームで融合させた。その結果得られたプラスミドｐＬｅｘＡ−ＸＰＣおよびレポータープラスミドｐ８ｏｐ−ｌａｃＺを用いて酵母株ＥＧＹ４８を同時形質転換し、ヒスチジンおよびウラシルを欠いたＳＤ培地上で形質転換体を選別した。
【００４１】
次にマウス胚線維芽細胞ＬｅｘＡマッチメーカーライブラリ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて形質転換したＥＧＹ４８酵母をさらに形質転換することによりスクリーニングを行った。このライブラリ中でのＧＡＬ４活性化ドメインに融合されたｃＤＮＡの発現はＧＡＬ１プロモーターにより調節されている。ガラクトースおよびラフィノースを含み、ヒスチジン、ロイシン、トリプトファン、およびウラシルを欠いた培地上で、およそ７×１０^６個の形質転換体が選別された。２週間にわたる３０℃でのインキュベーション後に現れたコロニーを、β−ガラクトシダーゼ活性の有無でさらに選別した。ポジティブクローンをトリプトファンを欠いたＳＤ培地中で生育させ、ｐｒｅｙ ｐｌａｓｍｉｄを回収し、大腸菌ＫＣ８株にエレクトロポーレションし、回収したＤＮＡの配列分析を行い、ＸＰＣと相互作用するタンパク質の候補を同定した。
１−２．組換えタンパク質の精製
組換えヒトＸＰＣおよびＨｉｓタグを融合したＨＲ２３Ｂ（ＨＲ２３Ｂ−Ｈｉｓ）タンパク質の精製は文献（Ｍａｓｕｔａｎｉ， Ｃ． ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．， １７， ６９１５−６９２３； Ｓｕｇａｓａｗａ， Ｋ． ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．， １６， ４８５２−４８６１）の記載に従って行った。すなわち、ＸＰＣ−ＨＲ２３Ｂ−Ｈｉｓヘテロダイマーを試験管内で再構成し、文献（Ｓｕｇａｓａｗａ， Ｋ． ｅｔ ａｌ． （２００１） Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．， １５， ５０７−５２１）の記載に従って精製した。Ｈｉｓ−ＴＤＧは、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株中でｐＥＴ２８ａベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）を用いて発現させ、これを文献（Ｈａｒｄｅｌａｎｄ， Ｕ． ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７５， ３３４４９−３３４５６）の記載に従って精製した。但しニッケル−ＮＴＡアガロースの代わりにＴａｌｏｎ樹脂（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用した。ＧＳＴ−ＴＤＧおよびＧＳＴは、大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）株中でｐＧＥＸ４Ｔ−３ベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて発現させた。発現誘導は、ＧＳＴ−ＴＤＧに対しては１６℃で１９時間にわたり０．２ｍＭ ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ＩＰＴＧ）を用いて、またＧＳＴに対しては３７℃で３時間にわたり１ｍＭ ＩＰＴＧを用いて行った。バクテリア細胞の沈殿は緩衝液Ａ［２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ７．５）， １ｍＭ ＥＤＴＡ， ２５ｍＭ ＮａＣｌ， ０．０１％ Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０， １ｍＭ ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ （ＤＴＴ）， ０．２５ｍＭｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ ｆｌｕｏｒｉｄｅ （ＰＭＳＦ）， およびプロテアーゼ阻害剤カクテル（１ｘＣｏｍｐｌｅｔｅ； Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）］中で超音波処理し、３０分間にわたり１００，０００ｘｇで遠心分離した。この上清を、０．１Ｍ ＮａＣｌを含む緩衝液Ｂ［２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ７．５）， １ｍＭ ＥＤＴＡ， ０．０１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００， １０％グリセロール， １ｍＭ ＤＴＴ， ０．２５ｍＭ ＰＭＳＦ］で平衡化したＧＳＴｒａｐカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に供した。続いてカラムを０．５および１Ｍ ＮａＣｌを含む緩衝液Ｂで洗浄した後、結合したタンパク質の溶出を０．１Ｍ ＮａＣｌと１０ｍＭグルタチオンを含む緩衝液Ｂを用いて行った。さらにＧＳＴ−ＴＤＧを含む分画を、０．１Ｍ ＮａＣｌを含む緩衝液Ｃ［２５ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）， １ｍＭ ＥＤＴＡ， ０．０１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００， １０％グリセロール， １ｍＭ ＤＴＴ， ０．２５ｍＭ ＰＭＳＦ］で平衡化したＭｏｎｏ Ｓ ＰＣ １．６／５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に供し、結合タンパク質の溶出を緩衝液Ｃ中の０．１−０．８Ｍ ＮａＣｌの線形勾配を用いて行った。ＧＳＴ−ＴＤＧは０．４Ｍ ＮａＣｌ周辺の溶出分画に現れた。最後にＧＳＴ−ＴＤＧとＧＳＴの両方を、０．２Ｍ ＮａＣｌを含む緩衝液Ｂで平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５ ＰＣ ３．２／３０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いたゲル濾過クロマトグラフィーに供した。Ｈｉｓ−ＡＰＥは、ｐＥＴ２８ａベクターを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株中で行い、バクテリア細胞の溶解物を文献（Ｃｈｏｕ， Ｋ． Ｍ． ａｎｄ Ｃｈｅｎｇ， Ｙ． Ｃ． （２００２） Ｎａｔｕｒｅ， ４１５， ６５５−６５９）の記載にに従って調製した。試料を０．１Ｍ ＮａＣｌを含む緩衝液Ｄ［２０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．８）， １０％グリセロール， ０．０１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００， および０．２５ｍＭ ＰＭＳＦ］で平衡化したホスホセルロース（Ｗｈａｔｍａｎ Ｐ１１）カラムに供し、結合タンパク質の溶出を０．２、０．６および１Ｍ ＮａＣｌを含む緩衝液Ｄを用いて段階的に行った。１Ｍ ＮａＣｌを用いて溶出したタンパク質を、０．１Ｍ ＮａＣｌと５ｍＭ イミダゾールを含む緩衝液Ｄを用いて平衡化してあるＴａｌｏｎ樹脂（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を詰めたカラム上に供した。同じ緩衝液で十分に洗浄を行った後、イミダゾール濃度を２０、１００、および２５０ｍＭに増加させることにより結合タンパク質の溶出を行った。次にＨｉｓ−ＡＰＥを含む１００ｍＭイミダゾール溶出画分を、０．１Ｍ ＮａＣｌを含む緩衝液Ｅ［５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−ＮａＯＨ （ｐＨ７．６）， １ｍＭ ＥＤＴＡ， ０．０１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００， １０％グリセロール， １ｍＭ ＤＴＴ， ０．２５ｍＭ ＰＭＳＦ］で平衡化したＭｏｎｏ Ｓ ＰＣ １．６／５カラム上に供した。このカラムの展開を緩衝液Ｅ中の０．１〜０．７Ｍ ＮａＣｌの線形勾配を用いて行い、Ｈｉｓ−ＡＰＥは０．２５Ｍ ＮａＣｌ周辺で溶出された。
１−３．ＧＳＴプルダウンアッセイ
Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ ｆａｓｔ ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ： ２０μｌ）を、０．１Ｍ ＮａＣｌを含む緩衝液Ｆ［２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）， １０％グリセロール， ０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００， １ｍＭ ＤＴＴ］中の組換えＸＰＣ−ＨＲ２３Ｂ（１ｐｍｏｌ）、およびＧＳＴまたはＧＳＴ−ＴＤＧのいずれか（それぞれ１ｐｍｏｌ）と混合した。指定箇所では、Ｈｉｓ−ＴＤＧも競合剤として含めた。時々撹拌しつつ氷上で１時間インキュベーションした後、ビーズの洗浄を０．３Ｍ ＮａＣｌを含む緩衝液Ｆ ５００μｌを用いて７回行い、ビーズ上に保持されたタンパク質の溶出を０．３Ｍ ＮａＣｌと１０ｍＭグルタチオンを含む緩衝液Ｆ ２０μｌを用いて行った。精製ＸＰＣはＳＤＳ存在下で煮沸すると凝集する傾向があるため、それぞれの溶出物を変性させる前に、内因性ＸＰＣを発現していないＸＰ４ＰＡＳＶ細胞の全細胞抽出物（０．４μｇタンパク質）と混合した。この処理によって、ＸＰＣの凝集が妨げられ、タンパク質のより定量的な評価が可能になる。それぞれの溶出物をＸＰ４ＰＡＳＶ細胞の抽出物と混合したものを８％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ポリクローナル抗ＸＰＣ抗体を用いた免疫ブロッティングにより分析した。
１−４．ゲルシフトアッセイ
図２Ａに示した共有結合閉環状ＤＮＡと、^３２Ｐ標識された平滑末端ＤＮＡ断片は、文献（Ｓｕｇａｓａｗａ， Ｋ． ｅｔ ａｌ． （２００１） Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．， １５， ５０７−５２１）の記載に正確に従って調製した。ゲルシフトアッセイは基本的に文献（Ｓｕｇａｓａｗａ， Ｋ． ｅｔ ａｌ． （２００１）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．， １５， ５０７−５２１）に従って行ったが、結合反応からＭｇＣｌ_２を除外し、また非特異的な結合を吸収するために添加する二本鎖閉環状ＤＮＡの量を８ｎｇに増やした。スーパーシフトアッセイは、標準的な結合反応を行った後で、アフィニティー精製したポリクローナル抗体を添加し、氷上で１５分間インキュベートしてからグルタルアルデヒド固定を行った。
１−５．ニッキングアッセイ
組換えＨｉｓ−ＴＤＧとＨｉｓ−ＡＰＥタンパク質の酵素活性のモニタリングは、「ニッキングアッセイ」を用いて、文献（Ｎｅｄｄｅｒｍａｎｎ， Ｐ． ａｎｄ Ｊｉｒｉｃｎｙ， Ｊ． （１９９３） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６８， ２１２１８−２１２２４）記載の方法にいくつかの修正を加えて行った。
【００４２】
単一のＧ／Ｔミスマッチを含むＤＮＡ基質は、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼと［γ−^３２Ｐ］ＡＴＰ処理により、Ｔ鎖オリゴヌクレオチド（図２Ｂの下段配列）の５’−末端を標識した。６５℃で１時間にわたり酵素を熱で不活性化した後、等モル量のＧ鎖オリゴヌクレオチドを添加し、６５℃で１時間加熱した後、徐々に室温まで冷やすことによってアニーリングした。アニーリングした６０ｂｐの２本鎖ＤＮＡは未変性ＰＡＧＥにより精製した。ニッキング反応は、２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ７．８）、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．５ｍＭ ＤＴＴ、ウシ血清アルブミン（９μｇ）および基質ＤＮＡ（４０ｆｍｏｌ）を含む混合液（２５μｌ）中で行った。３０℃で１時間にわたりインキュベートした後、精製Ｈｉｓ−ＴＤＧを添加し、３０℃でさらにインキュベートした。またＸＰＣ−ＨＲ２３Ｂ−ＨｉｓおよびＨｉｓ−ＡＰＥを個別、あるいは同時に様々な時点で添加した。反応の停止は等量の停止緩衝液［５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ７．５）， ２５ｍＭ ＥＤＴＡ， ０．３ｍｇ／ｍｌ酵母ｔＲＮＡ、２％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．８ｍｇ／ｍｌプロテインキナーゼＫ］を添加して行い、さらに３０℃で１時間以上にわたりインキュベートした。結果として生じたＡＰ部位を単鎖切断に変換するため、ＮａＯＨを添加して最終濃度９０ｍＭとし、１０分間にわたり１００℃で加熱した。ＤＮＡの精製はフェノール／クロロフォルム抽出とエタノール沈殿により行い、１６％変性ＰＡＧＥに供した後、オートラジオグラフィーを行った。またＡＰＥによる切断も同様の方法で測定したが、反応停止は１μｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡの添加により行った。次に９０％ホルムアミド、０．０４％ブロモフェノールブルー、および０．０４％キシレンシアノールＦＦを含む等量の溶液を反応液に混合し、６５℃で３分間加熱し、１６％変性ＰＡＧＥによる分析後、オートラジオグラフィーにより分析した。どちらの分析でも、切断および非切断オリゴヌクレオチドの放射活性の定量は、ＢＡＳ２５００ ｂｉｏｉｍａｇｉｎｇ ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ）を用いて行った。
１−６．抗体
ＸＰＣに対するポリクローナル抗体は、文献（Ｓｕｇａｓａｗａ， Ｋ． ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．， １６， ４８５２−４８６１）の記載のとおり作製した。抗ＴＤＧ抗体は、アミノ末端にＦＬＡＧ−タグを融合させた組換えＴＤＧ（ＦＬＡＧ−ＴＤＧ）を大腸菌中で発現させ、これを免疫化したウサギより得た抗血清を硫酸アンモニウム沈殿（５０％飽和）に供し、続いてＮＨＳ−活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ ｆａｓｔ ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に対して共有結合によりカップリングしたＧＳＴ−ＴＤＧを用いて、アフィニティ精製を行った。
２．結果
２−１．ＴＤＧとＸＰＣとの相互作用
ＸＰＣと相互作用する因子を検索するため、全長ヒトＸＰＣをバイト（ｂａｉｔ）として、マウス胚線維芽細胞ｃＤＮＡライブラリーに対する酵母２−ハイブリッドスクリーニングを行った。７×１０^６個の形質転換体から単離したポジティブクローンの一つがマウスＴＤＧをコードしていることが判明した。また、ヒトＴＤＧ ｃＤＮＡを用いた酵母２−ハイブリッドアッセイを行い、ヒトＴＤＧもヒトＸＰＣと相互作用しうることを確認した。
【００４３】
ＸＰＣとＴＤＧが物理的に相互作用していることを確認するため、ＧＳＴタグを融合させた組換えヒトＴＤＧタンパク質（ＧＳＴ−ＴＤＧ）を大腸菌内で発現させて、ＸＰＣ−ＨＲ２３Ｂ複合体を用いたプルダウンアッセイに供するため精製した。ＸＰＣ−ＨＲ２３Ｂ、およびＧＳＴまたはＧＳＴ−ＴＤＧのいずれかを含むアッセイにグルタチオン−セファロースビーズを添加した後、ビーズを遠心分離して十分に洗浄した。次に結合したタンパク質を１０ｍＭグルタチオンを含む緩衝液を用いて溶出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供してから、抗−ＸＰＣ抗体を用いたイムノブロッティングを行った（図１）。対照のＧＳＴへの結合はほとんど検出されなかったが（レーン３）、ＧＳＴ−ＴＤＧを用いた場合には有意な量のＸＰＣ−ＨＲ２３Ｂが同時に沈殿した（レーン４）。アミノ末端にヒスチジンタグを融合したＴＤＧ（Ｈｉｓ−ＴＤＧ）を過剰量添加すると、容量依存的に結合が失われた（レーン５および６）。これらの条件下でＸＰＣ−ＨＲ２３Ｂの代わりに組換えＸＰＣタンパク質を用いた場合にも同様な結果が得られたことから、ＸＰＣとＴＤＧの間の直接的な相互作用が確認された。
２−２．ＸＰＣ−ＨＲ２３ＢとＴＤＧのＤＮＡ上での複合体形成
ＴＤＧがＧ／Ｔミスマッチを修正するＢＥＲ反応の開始に関与していることから、ＸＰＣ−ＨＲ２３ＢがＮＥＲ以外に、ＴＤＧに依存したＢＥＲに関与しているかどうかを確認するため、部位特異的Ｇ／Ｔミスマッチを含む、^３２Ｐ標識された二本鎖ＤＮＡ断片を用いてゲルシフトアッセイを行った（図２Ａ）。ＸＰＣ−ＨＲ２３Ｂは二重鎖ＤＮＡ中の様々な構造異常を認識するが（Ｓｕｇａｓａｗａ， Ｋ． ｅｔ ａｌ． （２００１） Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．， １５， ５０７−５２１；Ｓｕｇａｓａｗａ， Ｋ． ｅｔ ａｌ． （２００２） ＤＮＡ Ｒｅｐａｉｒ， １， ９５−１０７）、ここで用いた条件下ではＧ／Ｔミスマッチ基質への特異的に結合はほとんど検出できなかった（図３Ａ、レーン１−８）。対照的に、ＴＤＧはＧ／ＴミスマッチＤＮＡと共にインキュベートした場合にバンドシフトを示す一方、対応する位置に正常なＧ／Ｃペアを含む対照ＤＮＡを用いた場合には有意な結合性を示さなかった（図３Ａ、レーン９−１６；Ｎｅｄｄｅｒｍａｎｎ， Ｐ． ａｎｄ Ｊｉｒｉｃｎｙ， Ｊ． （１９９３） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６８， ２１２１８−２１２２４も参照）。特記すべき点として、ＴＤＧがグリコシラーゼ活性を発揮しうるような条件下でこの結合反応が行われている事実を挙げることができる。このため、観察されたＴＤＧ／ＤＮＡ複合体の少なくとも一部はＧ／Ｔミスマッチではなく、グアニンを反対側に持つＡＰ部位を含んでいる可能性が高い。
【００４４】
前述のようにＸＰＣ−ＨＲ２３Ｂ複合体そのものはＧ／ＴミスマッチＤＮＡに結合できないが、ＸＰＣ−ＨＲ２３ＢはＴＤＧが結合したＤＮＡに結合する。ＴＤＧをＧ／ＴミスマッチＤＮＡと共にインキュベートした後でＸＰＣ−ＨＲ２３Ｂを添加した場合、ＴＤＧ／ＤＮＡ複合体の総量が用量依存的に減少し、代わってＴＤＧ／ＤＮＡ複合体より移動度が低い新しいシフトバンドが現れた（図３Ｂの星印により示す）。この新しいバンドのタンパク質成分を決定するため、ＸＰＣとＴＤＧに対して作成したポリクローナル抗体を用いてスーパーシフトアッセイを行った（図３Ｃ）。予想通り、抗ＸＰＣ抗体はＴＤＧ／ＤＮＡ複合体をスーパーシフトさせず、抗ＴＤＧ抗体によりＸＰＣ−ＨＲ２３Ｂ／ＤＮＡ複合体はスーパーシフトしなかった。しかしながら抗ＴＤＧ抗体を添加すると、ＴＤＧ／ＤＮＡ複合体と新しいバンドの両方がスーパーシフトした（レーン１−４）。さらに、この新規バンドは抗ＸＰＣ抗体によってもスーパーシフトした（レーン５−８）。このため、ｉｎ ｖｉｔｒｏで基質ＤＮＡに結合したＴＤＧは、ＸＰＣ−ＨＲ２３Ｂとの三成分複合体を形成していることが判明した。
２−３．ＴＤＧ活性に対するＸＰＣの作用
ＸＰＣ−ＨＲ２３ＢがＴＤＧ活性に影響を及ぼすかどうかを調べるため、単一のＧ／Ｔミスマッチを含み、Ｔ鎖の５’−末端を^３２Ｐ標識した６０塩基対ＤＮＡ断片を用いて「ニッキングアッセイ」を行った（図２Ｂ）。このアッセイでは、ＴＤＧ処理したＤＮＡを熱アルカリ処理し、次に変性ＰＡＧＥを用いて切断Ｔ鎖と非切断Ｔ鎖を分離することによりＴＤＧによって生成されたＡＰ部位数の測定を行った。
【００４５】
このアッセイにおいて、精製ＸＰＣ−ＨＲ２３Ｂそれ自体は、Ｇ／Ｔミスマッチに対する検出可能なＤＮＡグリコシラーゼ活性を示さなかった。一方、ＴＤＧを同じＤＮＡ基質と共にインキュベートすると、反応開始後１５分間である程度のミスマッチＴ残基が切除されたが、その後反応は著しく減速した（図４ＡおよびＢ）。これはおそらく、ＴＤＧがいったんＧ／Ｔミスマッチに結合してＴ残基を切除した後、結果的に生じたＡＰ部位に結合し続けるため（Ｗａｔｅｒｓ， Ｔ． Ｒ． ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７４， ６７−７４：Ｗａｔｅｒｓ， Ｔ． Ｒ． ａｎｄ Ｓｗａｎｎ， Ｐ． Ｆ． （１９９８） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７３， ２０００７−２００１４）、最終的に１サイクルのＴＤＧ酵素反応の終了後には、ほとんどのＴＤＧ分子がＡＰ部位によってトラップされるためと思われる。しかしながら、ＸＰＣ−ＨＲ２３ＢをＴＤＧと同時にＤＮＡに添加した場合には、ＴＤＧ活性はＸＰＣ−ＨＲ２３Ｂの用量に依存して増加した。１０７ｆｍｏｌのＸＰＣ−ＨＲ２３Ｂと共にインキュベートした結果、１２０分のインキュベーション後に３倍のＴＤＧ活性が得られた（図４ＡおよびＢ）。ＸＰＣかＨＲ２３Ｂのいずれのサブユニットがこの促進の原因になっているのか調べるため、反応混合液中へサブユニットを個別に添加した。図４Ｃに示すように、ＸＰＣ単独（レーン３−６）の場合には、ＸＰＣ−ＨＲ２３Ｂ複合体（レーン２）と同レベルの促進が得られたが、ＨＲ２３Ｂ単独（レーン７−１０）の場合は同様な条件下でもＴＤＧ活性に対する影響は全く見られなかった。
【００４６】
ＸＰＣがＴＤＧ活性を促進する際のメカニズムについて調べるため、さまざまな時点でＸＰＣ−ＨＲ２３ＢをＧ／ＴミスマッチＤＮＡに添加した。ＴＤＧ添加前にＧ／ＴミスマッチＤＮＡをＸＰＣ−ＨＲ２３Ｂと共にインキュベートしても、全ての成分を同時に混合した場合と比較して、ＴＤＧ反応のタイムコースは変化しなかった。ＸＰＣ−ＨＲ２３Ｂ自体はＧ／Ｔミスマッチに結合できないため、これは予想通りの結果である（図３Ｂ）。ＤＮＡ基質への添加前に、ＴＤＧとＸＰＣ−ＨＲ２３Ｂをインキュベートした場合にも、初期反応速度の増加は生じなかったが、これはＴＤＧ／ＸＰＣ複合体を予め構築してもＧ／Ｔミスマッチの認識が促進されないことを示唆している。しかしながら、ＴＤＧをＧ／ＴミスマッチＤＮＡと予めインキュベートして反応が頭打ちになった後でＸＰＣ−ＨＲ２３Ｂを添加したところ、その時点から反応産物の劇的な再増加が見られた（図５）。ＴＤＧがミスマッチＴ塩基を除去した後に結果的に生じたＡＰ部位に結合し続けることを考えると、これらの観察結果から、ＸＰＣ−ＨＲ２３ＢがＡＰ部位からのＴＤＧの解離を促進し、これによって自由になったＴＤＧの新たなＧ／Ｔミスマッチ基質との反応を可能にしていることが強く示唆される。
２−４． ＡＰＥ存在下でのＴＤＧ活性に対するＸＰＣ−ＨＲ２３Ｂの作用
ＡＰＥはＢＥＲ経路中でＤＮＡグリコシラーゼの直後に働くと考えられるが、一方でＴＤＧをＡＰ部位から排除することによりＴＤＧの酵素学的な代謝回転を促進する作用を示すことが報告されている（Ｗａｔｅｒｓ， Ｔ． Ｒ． ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７４，６７−７４）。このため、ＡＰＥとＸＰＣ−ＨＲ２３ＢがＴＤＧの代謝回転の促進に関して機能的に相互作用する可能性について調べた。様々な量のＸＰＣ−ＨＲ２３Ｂの存在下、あるいは非存在下で、ＴＤＧを含むニッキングアッセイ反応にＡＰＥ（５３ｆｍｏｌ）を添加した。文献（Ｗａｔｅｒｓ， Ｔ． Ｒ． ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７４， ６７−７４）の記述どおりＡＰＥの添加によってＴＤＧ活性の有意な促進が生じ、ＡＰＥ存在下で１２０分インキュベートした後には２倍以上の数のＡＰ部位が生じた（図４Ａ、レーン２−５を図６Ａ、レーン２−５と比較せよ）。次にＸＰＣ−ＨＲ２３Ｂを添加するとＴＤＧ活性がさらに促進されたが、これはＸＰＣ−ＨＲ２３Ｂ用量に依存的であった（図６ＡおよびＢ）。このため、５３ｆｍｏｌのＡＰＥと１０７ｆｍｏｌのＸＰＣ−ＨＲ２３Ｂを同時に添加した結果、１２０分後に生成したＡＰ部位の総量が６倍増加することになり、この事実から２種類の因子がＴＤＧ活性に対して相加的な促進効果を有することが示される。しかしながら添加したＸＰＣ−ＨＲ２３Ｂが、例えばＴＤＧによる処理後に生成したＡＰ部位に結合することによって、後に続くＡＰＥの酵素反応に影響を与える可能性は除外できない。実際に、特定の部位に３−ｈｙｄｒｏｘｙ−２−（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｕｒａｎ（合成ＡＰ部位アナログ；Ｆｕｊｉｗａｒａ， Ｙ． ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７４， ２００２７−２００３３）を含むＤＮＡ基質を用いたゲルシフトアッセイにより、ＸＰＣ−ＨＲ２３ＢがＡＰ部位に結合しうることが判明した。図７Ａに示すように、結合親和性はＡＰ部位の反対にある塩基によって変化し、その順はＡＰ／Ｃ＞ＡＰ／Ｔ＞ＡＰ／Ｇ＞ＡＰ／Ａである。グアニンがＡＰ部位の反対にある場合にはこの結合は比較的弱いものの、これらの知見からＸＰＣ−ＨＲ２３ＢがＡＰ部位からＴＤＧを押し出し、酵素学的な代謝回転を促進している可能性が示唆される。ＸＰＣ−ＨＲ２３Ｂの存在がＡＰＥのエンドヌクレアーゼ活性に影響するかどうかを調べるため、ニッキングアッセイを図６で行ったものと同様に行った。ただしここではＡＰＥにより切断された標識化オリゴヌクレオチド量を測定するため、変性ＰＡＧＥの前のアルカリ処理を除外することにより行った。ＡＰＥによる切断はＸＰＣ−ＨＲ２３Ｂの添加により増加したが、ＡＰＥにより処理されたのは、ＴＤＧにより生成したＡＰ部位のごく一部（５０％未満）のみであった（図６Ｂと図７Ｃを比較せよ）。さらに、反応からＡＰＥを除外した場合には、切断したオリゴヌクレオチドはほとんど検出されず、このことから検出された切断の大部分がＡＰ部位の自発的なβ脱離ではなくＡＰＥ活性に起因することが示された。特記すべきなのは、ＸＰＣ−ＨＲ２３Ｂの有無に関わらず、ＴＤＧによって生成したＡＰ部位の一部しかＡＰＥで処理されない点である。この事実から、ここで用いた条件下においてはＸＰＣ−ＨＲ２３ＢがＡＰＥ活性を促進も阻害もしていないことが示唆される。
【００４７】
以上の結果から、ＸＰＣ−ＨＲ２３ＢはＴＤＧの活性を促進することにより、ＡＰＥに影響を及ぼさずにＴＤＧ依存性ＢＥＲ反応を促進することが確認された。
【００４８】
【発明の効果】
以上詳しく説明したとおり、この出願の発明によって、ゲノムＤＮＡのＧ／Ｔミスマッチに起因する様々なヒト疾患を予防もしくは改善するための新規薬剤が提供される。また、この発明によって、さらに新しいＤＮＡ損傷修復剤を開発するための有効物質スクリーニング方法が提供される。
【００４９】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】ＸＰＣ−ＨＲ２３ＢとＴＤＧの物理的相互作用を調べた結果である。グルタチオン−セファロースビーズを１ｐｍｏｌのＧＳＴ（レーン３）またはＧＳＴ−ＴＤＧ（レーン４から６）のいずれかと共に、ＸＰＣ−ＨＲ２３Ｂ（１ｐｍｏｌ）の存在下でインキュベートした。またレーン５と６では、表示された量のＨｉｓ−ＴＤＧを競合剤として含めた。十分に洗浄を行った後、結合タンパク質を１０ｍＭグルタチオンを含む緩衝液で溶出した。それぞれの溶出液の１／４量を、ＸＰＣを発現していないＸＰ４ＰＡＳＶ細胞の全細胞抽出物と共に混合し、８％のＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した後、抗ＸＰＣ抗体を用いたイムノブロッティングを行った。レーン１：入力ＸＰＣの０．４％、レーン２：ＸＰ４ＰＡＳＶ細胞の細胞抽出物のみ。
【図２】
ゲルシフトアッセイ（Ａ）およびニッキングアッセイ（Ｂ）に使用したＤＮＡ基質を示す。ＸはＡ、Ｃ、Ｇ、またはＴ。
【図３】ＸＰＣ−ＨＲ２３ＢがＴＤＧ結合ＤＮＡと相互作用し、三成分複合体を形成することを確認した結果である。（Ａ）表示された量のＸＰＣ−ＨＲ２３ＢまたはＴＤＧを、単一のＧ／Ｔミスマッチを含む^３２Ｐ標識された３．５ｆｍｏｌのＤＮＡ断片、あるいは対照として完全に対になった二重鎖ＤＮＡ（Ｇ／Ｃ）と混合し、３０°Ｃで３０分間にわたりインキュベーションした。結果として得られたＤＮＡ−タンパク質複合体はグルタルアルデヒドを用いて固定し、未変性ＰＡＧＥにより分離した。（Ｂ）単一のＧ／Ｔミスマッチ（３．５ｆｍｏｌ）を含むＤＮＡ基質のインキュベーションを、３０℃で１５分間にわたり、Ｈｉｓ−ＴＤＧ（１６４ｆｍｏｌ）の存在下または非存在下で行った。続いて表示された量のＸＰＣ−ＨＲ２３Ｂを添加し、さらに３０℃で１５分間インキュベートし、グルタルアルデヒド固定後に未変性ＰＡＧＥに供した。星印（＊）が示すのは、ＴＤＧとＸＰＣ−ＨＲ２３Ｂの両方が存在する場合に新しく現れたバンドである。（Ｃ）ＴＤＧ、ＸＰＣ−ＨＲ２３ＢおよびＤＮＡを含む三成分複合体を同定するためのスーパーシフトアッセイ。１６４ｆｍｏｌのＴＤＧ、６７ｆｍｏｌのＸＰＣ−ＨＲ２３Ｂ、および単一のＧ／Ｔミスマッチを含む３．５ｆｍｏｌのＤＮＡ基質を使用して（Ｂ）と同様に結合反応を行った後、様々な量の抗ＴＤＧまたは抗ＸＰＣ抗体を添加して、さらに氷上で１５分間インキュベートし、ＤＮＡ−タンパク質複合体をグルタルアルデヒドで架橋させた。
【図４】ＸＰＣ−ＨＲ２３ＢがＴＤＧ活性を促進することを確認した結果である。（Ａ）ＸＰＣ−ＨＲ２３Ｂの存在下におけるＴＤＧ活性を測定するためのニッキングアッセイ。単一のＧ／Ｔミスマッチを含む６０塩基対のＤＮＡ基質でＴ鎖の５’−末端が標識されたものを、１０ｆｍｏｌのＨｉｓ−ＴＤＧと共に、様々な量のＸＰＣ−ＨＲ２３Ｂの存在下または非存在下で、指定時間にわたり３０℃でインキュベートした。このＤＮＡ試料を精製し、アルカリ処理によってＡＰ部位を化学的に切断した後、変性ＰＡＧＥに供した。（Ｂ）^３２Ｐ標識されたＤＮＡ基質中の切断されたオリゴヌクレオチドの比率を（Ａ）の各レーン毎に計算し、グラフにプロットした。平均値と標準誤差の計算は、少なくとも２回の独立した実験を基におこなった。（Ｃ）表示した様々な量のＸＰＣ−ＨＲ２３Ｂ（レーン２）、ＸＰＣ単独（レーン３と６）、あるいはＨＲ２３Ｂ単独（レーン７から１０）の存在下において、１０ｆｍｏｌのＨｉｓ−ＴＤＧを用いて行ったニッキングアッセイ。全ての反応は３０℃で１２０分間にわたりインキュベートし、精製したＤＮＡ試料はアルカリ処理および変性ＰＡＧＥに供した。
【図５】ＸＰＣ−ＨＲ２３ＢがＴＤＧの酵素学的な代謝回転を促進することを確認した結果である。（Ａ）単一のＧ／Ｔミスマッチを含む^３２Ｐ標識されたＤＮＡ基質を、３０℃で１０ｆｍｏｌのＨｉｓ−ＴＤＧと共に、表示にある様々な時間にわたりインキュベートした（レーン１−５）。１２０分後に表示量のＸＰＣ−ＨＲ２３Ｂを添加し、さらに３０℃で１５、３０、または６０分間にわたりインキュベートした（総インキュベーション時間を各レーン上に表示した）。精製ＤＮＡ試料は、アルカリ処理と変性ＰＡＧＥに供した。（Ｂ）^３２Ｐ標識されたＤＮＡ基質中の切断されたオリゴヌクレオチドの比率を、（Ａ）の各レーン毎に計算した。平均値と標準誤差の計算は、少なくとも２回の独立した実験を基におこなった。
【図６】ＸＰＣ−ＨＲ２３ＢがＡＰＥの存在下でＴＤＧの活性を促進することを確認した結果である。（Ａ）単一のＧ／Ｔミスマッチを含む^３２Ｐ標識されたＤＮＡ基質を、１０ｆｍｏｌのＨｉｓ−ＴＤＧ、５３ｆｍｏｌのＨｉｓ−ＡＰＥ、および表示量のＸＰＣ−ＨＲ２３Ｂの存在下、３０℃で指定時間にわたりインキュベートした。精製ＤＮＡ試料は、アルカリ処理と変性ＰＡＧＥに供した。ＡＰＥの３’（５’エクソヌクレアーゼ活性のため、開裂したオリゴヌクレオチドのバンドは梯子状に現れる。（Ｂ）^３２Ｐ標識されたＤＮＡ基質中の切断されたオリゴヌクレオチドの比率を、（Ａ）の各レーン毎に計算した。平均値と標準誤差の計算は、少なくとも２回の独立した実験を基におこなった。
【図７】ＸＰＣ−ＨＲ２３ＢはＡＰＥの酵素反応を阻害しないことを確認した結果である。（Ａ）４種類の異なる塩基を反対に持つ、あるいは対応位置に正常なＧ／Ｃペアを持つ合成ＡＰ部位アナログを含む^３２Ｐ標識されたＤＮＡ基質（それぞれ３．５ｆｍｏｌ）を、表示量のＸＰＣ−ＨＲ２３Ｂの存在下、３０℃で３０分間インキュベートした。結果として得られたＤＮＡ−タンパク質複合体はグルタルアルデヒドで固定し、未変性ＰＡＧＥで分離した。（Ｂ）単一のＧ／Ｔミスマッチを含む^３２Ｐ標識されたＤＮＡ基質を、１０ｆｍｏｌのＨｉｓ−ＴＤＧ、５３ｆｍｏｌのＨｉｓ−ＡＰＥ、および表示量のＸＰＣ−ＨＲ２３Ｂの存在下、３０℃で指定時間にわたりインキュベートした。反応停止はＥＤＴＡ添加により行い、アルカリ処理を行わずに変性ＰＡＧＥに供した。（Ｃ）^３２Ｐ標識されたＤＮＡ基質中の切断されたオリゴヌクレオチドの比率を、（Ｂ）の各レーン毎に計算した。平均値と標準誤差の計算は、少なくとも２回の独立した実験を基におこなった。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The invention of this application relates to a DNA damage repair agent and a screening method. More specifically, the invention of this application relates to an agent that repairs DNA damage by promoting a base excision repair reaction involving thymine DNA glycosylase (TDG), and a screening method for identifying a novel component of such an agent. It is about.
[0002]
[Prior art]
Organisms have multiple DNA repair pathways that remove various DNA damages, thereby maintaining genomic stability and cell function (Non-Patent Documents 1 and 2). Base excision repair (BER), one of such DNA repair pathways, corrects various spontaneous or environment-induced base damages (Non-Patent Documents 3, 4, and 5). Initiation of BER is carried out by an enzyme called DNA glycosylase, which hydrolyzes N-glycosidic bonds to separate abnormal or inappropriate bases from the phosphate-sugar backbone of DNA. In vertebrates, the resulting apurinic / apyrimidine site (AP site) is then cleaved by AP endonuclease (APE, also referred to as HAP1, APEX, Ref-1) and 5'-deoxyribose-5. -Phosphoric acid and 3'-hydroxyl end are left (Non-Patent Document 6). Furthermore, some DNA glycosylase has endogenous AP lyase activity, in which case the 3 ′ side of the AP site is cleaved (Non-Patent Document 7). APE has not only the activity of cleaving the 5 'side of the AP site but also enzymatic activities such as DNA 3'-phosphodiesterase and 3'-phosphatase, and the latter is the intermediate remaining as a result of the action of the AP lyase activity. It is also related to processing. That is, the latter activity of APE contributes to the conversion of the 3'-end left by the AP lyase to a hydroxyl group, making DNA polymerase available as a primer in the subsequent DNA repair synthesis (non-patented). Reference 6). DNA repair synthesis and DNA strand reassembly, which are the final stages of the BER reaction, show that there are at least two types of mechanisms, a short patch repair pathway involving DNA polymerase β and a PCNA-dependent long patch repair pathway. (Non-Patent Document 8).
[0003]
Hydrolytic deamination is one of the most frequently occurring spontaneous damages to DNA bases. In the vertebrate genome, cytosine at the CpG dinucleotide site is often methylated at the C5 site, and the resulting deamination of 5-methylcytosine results in thymine having the wrong base pair for guanine. (Non-Patent Document 1). If the DNA is duplicated before such a G / T mismatch is corrected, the original G: C base pair changes to A: T. For this reason, CpG sites are very sensitive to mutations. These mutations are suppressed by G / T mismatch correction via the BER pathway initiated by thymine DNA glycosylase (TDG; see Non-Patent Document 9 for a review).
[0004]
Another important pathway of DNA repair is nucleotide excision repair (NER). DNA damage that can be removed by NER can be caused by various types of base damage that may distort the double helix structure (eg, cyclobutane-type pyrimidine dimer (CPD) or (6-4) light induced by ultraviolet (UV) light). Products, or intra-DNA cross-links induced by various chemical substances, and bulky base adducts (Non-Patent Document 10). Deficiency in NER activity has been linked to several human hereditary diseases, including xeroderma pigmentosum (XP). The clinical manifestations of XP are characterized by various hypersensitivity symptoms of the skin to UV exposure and an increased incidence of skin cancer. Seven types of XP genetic complementation groups showing NER deficiency have been identified so far (from the XP-A group to the G group), and the genes responsible for each group have been cloned. Unlike the majority of the other XP groups, the XP-C group patients are deficient in only the global genome NER that works on the whole genome of the two NER alternative pathways. The other pathway, transcription coupled NER (specifically removes damage on the transcribed strand of the active gene), is functioning normally in XP-C group patients. XPC protein, which is a responsible gene product of the XP-C group, binds to Centrin 2 and HR23B, one of two mammalian homologues homologous to budding yeast Rad23p, in the cell, and exists as a heterotrimer. (Non-Patent Documents 11, 12, and 13). Although the role of centrin 2 in the complex is unresolved, it has been shown that the formation of the XPC-HR23B complex is required for reconstitution of the cell-free NER response (14, 15, 16). , 17). Biochemical studies have shown that XPC-HR23B specifically binds to certain types of DNA damage and initiates the NER reaction (Non-Patent Documents 15, 18, and 19). For this reason, XPC-HR23B is considered to function as a damage recognition factor in the NER mechanism that works throughout the genome. The inventors of the present application have found that XPC-HR23B does not recognize the structural properties of the damage itself, but rather recognizes structural abnormalities induced in the double-stranded DNA by the damage. It shows that a specific DNA structure including the boundary of single-stranded DNA may be selectively recognized (Non-Patent Documents 20, 21).
[0005]
However, it has never been known that this XPC protein is involved not in the NER pathway but in the BER pathway (particularly, the repair pathway for G / T mismatch involving TDG).
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
As described above, G / T mismatches in genomic DNA frequently occur under physiological conditions, and mutations induced by this DNA damage can lead to decreased cell function, canceration, aging, genetic diseases, etc. It is thought to be related to various human diseases. Therefore, if an enzyme TDG that initiates a DNA repair reaction for recognizing and eliminating this G / T mismatch can be artificially activated, various human diseases caused by the G / T mismatch can be prevented or improved. It is expected that it will be possible.
[0007]
APE can be mentioned as a candidate of the factor which promotes TDG activity. This is because APE is known to promote enzymatic turnover of TDG (Non-Patent Document 22). However, there is no evidence that APE interacts with TDG on DNA to promote the activity of TDG itself. In addition, since APE itself is an essential factor for base excision repair, and because of its high expression level in the cells, it is notable that APE is introduced by introducing foreign APE into cells or expressing foreign APE genes in cells. No effect can be expected. Furthermore, since APE is essential for the survival of individual animals and is known to be involved in the regulation of transcription factor activity in addition to base excision repair, artificial introduction of exogenous APE and exogenous APE gene Forced expression has a high risk of causing adverse effects such as affecting normal gene expression regulation of animal individuals and cells.
[0008]
The inventors of the present application have searched for factors that promote TDG activity, and as a result, XPC protein, which was conventionally known as a factor involved in the nucleotide excision repair mechanism (NER), interacts with TDG to reduce its activity. And found to repair G / T mismatches very effectively.
[0009]
An object of the invention of this application is to provide a new drug that effectively repairs DNA damage due to a G / T mismatch based on this novel finding by the inventors.
[0010]
In addition, the invention of this application uses the interaction between TDG and XPC protein as an index to further enhance the interaction between TDG enzyme and XPC protein, or a novel substance that promotes the activity of TDG enzyme to be equal to or higher than that of XPC protein. An object of the present invention is to provide a method for screening a novel substance that can be used.
[0011]
[Non-patent document 1]
Friedberg, E .; C. et al. (1995) DNA Replacement and Mutagenesis, ASM perss, Washington. D. C.
[Non-patent document 2]
Hoeijmakers, J .; H. J. (2001) Nature, 411, 366-374.
[Non-Patent Document 3]
Krokan, H .; E. FIG. et al. (2000) FEBS Lett. , 476, 73-77.
[Non-patent document 4]
McCullough, A .; K. et al. (1999) Annu. Rev .. Biochem. , 68, 255-285.
[Non-Patent Document 5]
Nilsen, H .; and Krokan, H .; E. FIG. (2001) Carcinogenesis, 22, 987-998.
[Non-Patent Document 6]
Wilson III, D.S. M. and Barsky, D.C. (2001) Mutat. Res. , 485, 283-307.
[Non-Patent Document 7]
McCullough, A .; K. et al. (1999) Annu. Rev .. Biochem. , 68, 255-285.
[Non-Patent Document 8]
Nilsen, H .; and Krokan, H .; E. FIG. (2001) Carcinogenesis, 22, 987-998.
[Non-Patent Document 9]
Hardeland, U.S.A. et al. (2002) EMBO J.C. , 21, 1456-1464.
[Non-Patent Document 10]
de Laat. et al. (1999) Genes Dev. , 13, 768-785.
[Non-Patent Document 11]
Araki, M .; et al. (2001) Biol. Chem. , 276, 18665-18672.
[Non-Patent Document 12]
Masutani, C.I. et al. (1994) EMBO J .; , 13, 1831-1843.
[Non-patent document 13]
Shivji, M .; K. K. et al. (1994) J. Am. Biol. Chem. , 269, 22749-22775.
[Non-patent document 14]
Araujo, S .; J. et al. (2000) Genes Dev. , 14. 349-359.
[Non-Patent Document 15]
Batty, D.M. et al. (2000) Mol. Biol. , 300, 275-290.
[Non-Patent Document 16]
Mu, D.M. et al. (1995) Biol. Chem. , 270, 2415-2418.
[Non-Patent Document 17]
Sugasawa, K .; et al. (1997) Mol. Cell. Biol. , 17, 6924-6931.
[Non-Patent Document 18]
Kusumoto, R .; et al. (2001) Mutat. Res. , 485, 219-227.
[Non-Patent Document 19]
Sugasawa, K .; et al. (1998) Mol. Cell, 2, 223-232.
[Non-Patent Document 20]
Sugasawa, K .; et al. (2001) Genes Dev. , 15, 507-521.
[Non-Patent Document 21]
Sugasawa, K .; et al. (2002) DNA Repair, 1, 95-107.
[Non-Patent Document 22]
Waters, T.W. R. et al. (1999) Biol. Chem. , 274, 67-74.
[0012]
[Means for Solving the Problems]
This application is directed to a first invention for solving the above-mentioned problems, in which a DNA encoding a polypeptide encoding the polypeptide XPC consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or a mutant sequence thereof can be introduced into cells. Provide a repair agent.
[0013]
This application also provides, as a second invention, a DNA damage repair agent having a form in which a polypeptide XPC comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or a mutant sequence thereof can be introduced into cells.
[0014]
Further, the present invention provides, as a third invention, a method for specifying a substance having a DNA damage repair activity equal to or higher than that of a polypeptide XPC consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or a mutant sequence thereof,
(1) the amount of mismatched T base-removed oligonucleotide when a thymine DNA glycosylase and a polypeptide XPC are reacted with a double-stranded oligonucleotide population containing G / T mismatched base pairs; and
(2) the amount of mismatched T base-removed oligonucleotide when thymine DNA glycosylase and a candidate substance are reacted with the same oligonucleotide population as in (1),
And a screening method characterized in that a candidate substance having an equal amount of (1) and (2) or an amount of (2) larger than (1) is set as a target substance.
[0015]
The present invention further provides, as a fourth invention, a method for identifying a substance that enhances the DNA damage repair activity of a polypeptide XPC comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or a mutant sequence thereof,
(1) the amount of mismatched T base-removed oligonucleotide when a thymine DNA glycosylase and a polypeptide XPC are reacted with a double-stranded oligonucleotide population containing G / T mismatched base pairs; and
(2) the amount of mismatched T base-removed oligonucleotide when the same oligonucleotide population as in (1) is reacted with thymine DNA glycosylase, polypeptide XPC and a candidate substance;
And a screening method characterized in that a candidate substance having an amount (2) larger than (1) is determined as a target substance.
[0016]
In the invention of this application, “DNA damage repair” means repair of a G / T mismatch caused by deamination of 5-methylcytosine in genomic DNA. More specifically, it refers to mismatch base excision repair involving thymine DNA glycosidase (TDG).
[0017]
"Polypeptide" refers to a molecule composed of a linear sequence of 21 or more amino acid residues linked together in a linear sequence by amide bonds (peptide bonds).
[0018]
The “polynucleotide” is a molecule in which 101 or more nucleoside phosphates (ATP, GTP, CTP, UTP; or dATP, dGTP, dCTP, dTTP) in which a purine or pyrimidine is β-N-glycoside-linked to a sugar are bound And "oligonucleotide" refers to a molecule in which 2-99 are linked.
[0019]
The “polypeptide XPC” in the present invention is defined by the same amino acid sequence as a known human XPC protein (Masutani C. et al., EMBO J. 13 (8): 1831-1843, 1994; GenBank Accession No. NM_004628). Polypeptide. A “variant” of the polypeptide XPC is a protein containing an amino acid substitution resulting from a single nucleotide polymorphism (SNPs) in a polynucleotide encoding the polypeptide XPC. A plurality of SNPs are disclosed in the sequence information (GenBank Accession No. NM_004628) of the polypeptide XPC, and among them, the protein mutations shown in Table 1 are known (for example, the first column in Table 1 shows the sequence Substitution of g for the 61st c of No. 1 indicates that the 16th Leu residue in the amino acid sequence shown in SEQ ID No. 2 is replaced with a Val residue, and no amino acid substitution is caused by the base substitution. (Silent mutations) are shown in parentheses). Further, “polynucleotide encoding a mutant” means a polynucleotide containing SNPs shown in Table 1.
[0020]
[Table 1]

[0021]
In the third invention and the fourth invention, “equivalent” and “equivalent” mean that the comparatively measured numerical value is within ± 5%, and “equal to or more” and “many” are comparatively measured. Means that the calculated value is 6% or more.
[0022]
Other terms in the present invention will be appropriately described in embodiments and examples of the present invention.
[0023]
Various techniques used to carry out the present invention can be easily and reliably implemented by those skilled in the art based on known documents and the like, except for the technique whose source is clearly indicated. For example, drug preparation is described in Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, ed. A. Gennaro, Mack Publishing Co. , Easton, PA, 1990; Genetic engineering and molecular biology techniques are described in Sambrook and Maniatis, in Molecular Cloning- A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, New York; M. et al. , Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.W. Y, 1995).
[0024]
Hereinafter, embodiments of each invention will be described in detail.
[0025]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
The DNA damage repair agent of the first invention promotes TDG activity by interacting with a base excision repair enzyme TDG on genomic DNA, and encodes a polypeptide encoding a polypeptide XPC capable of efficiently repairing a G / T mismatch. It is a drug containing nucleotides. Specifically, this drug is characterized in that a polynucleotide encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or a mutant sequence thereof can be introduced into cells.
[0026]
This polynucleotide is preferably a cDNA encoding an XPC protein, the sequence of which is as SEQ ID NO: 1. The cDNA can be obtained, for example, by screening an existing human cDNA library using an oligonucleotide probe synthesized based on the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1. The target cDNA fragment can also be obtained by RT-PCR using oligonucleotide primers and RNA molecules extracted from human cells.
[0027]
The polynucleotide can be incorporated into an expression vector. As the expression vector, a known eukaryotic cell expression vector having a promoter, a splicing region, a poly (A) addition site, and the like can be used. A polynucleotide encoding the polypeptide XPC is inserted into the cloning site of the expression vector. By insertion, a polypeptide XPC expression vector can be constructed. When cDNA is used, a DNA fragment consisting of a base sequence (bases 16 to 2838) constituting the protein coding region of SEQ ID NO: 1 can also be used.
[0028]
As a drug form, the polypeptide expression vector may be incorporated into, for example, a hollow nanoparticle presenting a biorecognition molecule or a known viral vector (retrovirus, adenovirus, adeno-associated virus, etc.). By introducing such a drug into a living body by a gene therapy technique, the polypeptide XPC can be expressed in cells. The expressed XPC forms a complex with the HR23B protein in the cells and promotes the G / T mismatch repair activity by TDG. Since the polypeptide XPC has a nuclear transport signal (nuclear localization domain), the XPC expressed in the cell translocates into the nucleus and interacts with the enzyme TDG on the genomic DNA.
[0029]
The DNA damage repair agent of the second invention is characterized in that the polypeptide XPC itself has a form that can be introduced into cells. For example, the polypeptide can be formulated by mixing the polypeptide with a pharmacologically acceptable carrier solution without changing the structure or function of the polypeptide. Such an agent can be introduced into cells by, for example, a microinjection method. Alternatively, an intracellular transfection method using a lipid (BioPORTER (Gene Therapy Systems, USA), Chariot (Active Motif, USA), etc.) can also be employed.
[0030]
The polypeptide XPC is a method for chemically synthesizing a peptide based on the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, an in vitro transcription / translation system from the above-mentioned expression vector, and isolation and purification of a polypeptide as an expression product of a transformed cell by the expression vector. It can be obtained by a method or the like. For example, when expressing the polypeptide XPC by in vitro translation, an expression vector having an RNA polymerase promoter is added to an in vitro translation system such as a rabbit reticulocyte lysate or a wheat germ extract containing an RNA polymerase corresponding to the promoter. For example, a polypeptide can be produced in vitro. Examples of the RNA polymerase promoter include T7, T3, SP6 and the like. Examples of vectors containing these RNA polymerase promoters include pKA1, pCDM8, pT3 / T718, pT7 / 319, and pBluescript II. When the polypeptide XPC is expressed in a microorganism such as Escherichia coli, the DNA fragment is incorporated into an expression vector having an origin, a promoter, a ribosome binding site, a DNA cloning site, a terminator, and the like that can be replicated in the microorganism. Create an expression vector with. By transforming a host cell with this expression vector, a transformant cell expressing the polypeptide XPC can be obtained, and by culturing this transformant, the target polypeptide XPC can be produced in large quantities from the culture. be able to. Examples of the expression vector for Escherichia coli include a pET expression system and a pGEX expression system. When the polypeptide XPC is expressed in eukaryotic cells, the DNA fragment is inserted into an expression vector for eukaryotic cells having a promoter, a splicing region, a poly (A) addition site, and the like, to prepare a recombinant vector. Make it. When this vector is introduced into eukaryotic cells, transformed eukaryotic cells that express the desired polypeptide XPC can be obtained. Examples of expression vectors include pKA1, pCDM8, pSVK3, pMSG, pSVL, pBK-CMV, pBK-RSV, EBV vector, pRS, pYES2 and the like. As eukaryotic cells, cultured mammalian cells such as human embryonic kidney cells HEK293, monkey kidney cells COS7, Chinese hamster ovary cells CHO, and primary cultured cells isolated from human organs can be used. Budding yeast, fission yeast, silkworm cells, Xenopus egg cells and the like can also be used. To introduce the expression vector into cells, known methods such as an electroporation method, a calcium phosphate method, a liposome method, and a DEAE dextran method can be used. In order to isolate and purify the polypeptide expressed in the transformed cells, known separation operations can be combined. For example, treatment with a surfactant, ultrasonic treatment, enzyme digestion, salting out or solvent precipitation, dialysis, centrifugation, ultrafiltration, gel filtration, isoelectric focusing, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, Affinity chromatography, reverse phase chromatography and the like can be mentioned.
[0031]
As another embodiment of the drug of the second invention, a fusion polypeptide in which a peptide that crosses the cell membrane is linked to the N-terminal side of the polypeptide XPC can be used. By providing the peptide that passes through the cell membrane, the polypeptide XPC injected into the living body passes through the cell membrane, is taken into the cell, translocates into the nucleus, and interacts with the enzyme TDG to efficiently reduce the G / T mismatch. To repair. Examples of the peptide that passes through the cell membrane include a protein transduction domain (PTD) of HIV-1 • TAT (Science, 285: 1569-1572, 1999; GenBank Accession No. U39362 M96155), and a pomegranate protein of Drosophila eg. GenBank Accession No. AE001573) can be employed. The fusion polypeptide can be prepared by ligating a DNA fragment encoding PTD and polypeptide XPC cDNA to prepare a fusion DNA fragment, and expressing the fusion DNA fragment in a host cell such as Escherichia coli. In addition, a fusion polypeptide in which a cell membrane transit peptide is linked by a method of binding a polypeptide XPC to a PTD peptide via a divalent crosslinking agent (for example, EDC, β-alanine, or the like) can also be prepared.
[0032]
The third invention is a screening method for identifying a substance having a DNA damage repair activity equal to or higher than that of the polypeptide XPC. in this way,
(1) the amount of mismatched T base-removed oligonucleotide when TDG and polypeptide XPC are reacted with a double-stranded oligonucleotide population containing G / T mismatched base pairs; and
(2) the amount of mismatched T base-removed oligonucleotide when TDG and a candidate substance are reacted with the same oligonucleotide population as in (1),
Is measured, and a candidate substance in which the amount of (1) and the amount of (2) are equal or the amount of (2) is larger than the amount of (1) is specified as a target DNA damage repair substance.
[0033]
The “double-stranded oligonucleotide containing a G / T mismatched base pair” is an annealed synthetic oligonucleotide consisting of 2-99 bases, and one G / T mismatched base near the center of the sequence. It is a molecule having a pair (hereinafter may be referred to as “DNA substrate”), and examples thereof include a double-stranded oligonucleotide of 60 base pairs shown in FIG. 2 (b) (FIG. 2 (b)). Are shown in SEQ ID NO: 3 in the upper row and SEQ ID NO: 4 in the lower row). In the double-stranded oligonucleotide of FIG. 2B, the 27th G from the lower 3 ′ side is T with respect to the 27th G from the upper 5 ′ side (G / T mismatch).
[0034]
The DNA substrate containing such a G / T mismatch has a mismatched T base removed by TDG to become a “T base removed oligonucleotide”. However, as shown in Examples below, TDG and XPC act. This increases the amount of T base removal oligonucleotide. Therefore, the amount (1) of the T base-removed oligonucleotide obtained by [TDG + XPC] and the amount (2) of the T base-removed oligonucleotide obtained by the action of [TDG + candidate substance] were compared, and (1) and ( 2) A candidate substance having an equal amount or a larger amount of (2) than the amount of (1) can be determined as a substance having a DNA damage repair activity equal to or greater than that of XPC.
[0035]
In the fourth invention, the amount (1) of the T base-removed oligonucleotide obtained by [TDG + XPC] is compared with the amount (2) of the T base-removed oligonucleotide obtained by the action of [TDG + XPC + candidate substance]. Candidate substances whose (2) amount is larger than 1) amount can be determined to be substances that enhance the activity of XPC.
[0036]
The “candidate substance” used in the methods of the third and fourth inventions includes, for example, organic or inorganic compounds (especially low molecular weight compounds), proteins, peptides and the like. Oligopeptides consisting of a partial sequence of the polypeptide XPC are also included in the candidate substance of the third invention.
[0037]
The polypeptide XPC used in the third and fourth inventions is preferably used as a complex with the HR23B protein. This is because XPC functions as a complex with the HR23B protein in cells. The XPC-HR23B complex can be obtained by a genetic engineering method using a fusion DNA consisting of a DNA fragment encoding each protein.
[0038]
Further, the amount of the T base-removed oligonucleotide can be measured, for example, in the same manner as in Examples described later (nicking assay). That is, among the DNA substrates, [TDG + XPC] and [TDG + candidate substance] or [TDG + XPC + candidate substance] are allowed to act while one end of the oligonucleotide containing the mismatched T base is radiolabeled. Next, the oligonucleotide from which the mismatched T base has been removed is cleaved by hot alkali treatment, and the cleaved DNA substrate is confirmed by electrophoresis.
[0039]
Hereinafter, as examples, experimental examples performed to confirm the function of the polypeptide XPC will be described, but the present invention is not limited to the following examples.
[0040]
【Example】
1. Method
1-1. Yeast 2-hybrid screening
Yeast two-hybrid screening was performed using Matchmaker LexA two-hybrid system (Clontech) to identify proteins that interact with XPC. The cDNA encoding the full length human XPC was fused in frame to the GAL4 DNA binding domain in the byte vector pLexA. The yeast strain EGY48 was co-transformed using the resulting plasmid pLexA-XPC and the reporter plasmid p8op-lacZ, and the transformants were selected on SD medium lacking histidine and uracil.
[0041]
Next, screening was performed by further transforming the transformed EGY48 yeast using a mouse embryo fibroblast LexA matchmaker library (Clontech). Expression of the cDNA fused to the GAL4 activation domain in this library is regulated by the GAL1 promoter. On a medium containing galactose and raffinose and lacking histidine, leucine, tryptophan, and uracil, approximately 7 × 10 ⁶ Transformants were selected. Colonies that appeared after incubation at 30 ° C. for 2 weeks were further selected for the presence or absence of β-galactosidase activity. Positive clones were grown in SD medium lacking tryptophan, prey plasmid was recovered, electroporated into Escherichia coli KC8 strain, and the recovered DNA was subjected to sequence analysis to identify candidate proteins that interact with XPC.
1-2. Purification of recombinant proteins
Purification of HR23B (HR23B-His) protein fused with recombinant human XPC and His tag has been described in the literature (Masutani, C. et al. (1997) Mol. Cell. Biol., 17, 6915-6923; Sugasawa, K. et al. al. (1996) Mol. Cell. Biol., 16, 4852-4861). That is, the XPC-HR23B-His heterodimer was reconstituted in a test tube and purified according to the description in the literature (Sugasawa, K. et al. (2001) Genes Dev., 15, 507-521). His-TDG was expressed using the pET28a vector (Novagen) in Escherichia coli BL21 (DE3), and this was expressed in the literature (Hardelland, U. et al. (2000) J. Biol. Chem. 275, 33449-33456). Purified as described in However, Talon resin (Clontech) was used instead of nickel-NTA agarose. GST-TDG and GST were expressed in E. coli strain JM109 (DE3) using the pGEX4T-3 vector (Amersham Biosciences). Expression induction was performed using 0.2 mM isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) for 16 hours at 16 ° C. for GST-TDG, and 1 mM IPTG for 3 hours at 37 ° C. for GST. I went. Precipitation of bacterial cells was performed using buffer A [25 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM EDTA, 25 mM NaCl, 0.01% Nonidet P-40, 1 mM dithiothreitol (DTT), 0.25 mM phenylmethylsulfonyl, and protease (PM). Inhibitor cocktail (1 × Complete; Roche Diagnostics)] and centrifuged at 100,000 × g for 30 minutes. This supernatant was washed with buffer B containing 0.1 M NaCl [25 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM EDTA, 0.01% Triton X-100, 10% glycerol, 1 mM DTT, 0.25 mM PMSF]. It was applied to an equilibrated GSTrap column (Amersham Biosciences). After washing the column with buffer B containing 0.5 and 1 M NaCl, the bound proteins were eluted with buffer B containing 0.1 M NaCl and 10 mM glutathione. Further, the fraction containing GST-TDG was added to buffer C containing 0.1 M NaCl [25 mM sodium phosphate (pH 7.0), 1 mM EDTA, 0.01% Triton X-100, 10% glycerol, 1 mM DTT, 0 mM .25 mM PMSF] and equilibrated with a Mono S PC 1.6 / 5 column (Amersham Biosciences), and the bound protein was eluted using a linear gradient of 0.1-0.8 M NaCl in buffer C. . GST-TDG appeared in the eluted fraction around 0.4 M NaCl. Finally, both GST-TDG and GST were subjected to gel filtration chromatography using a Superdex 75 PC 3.2 / 30 column (Amersham Biosciences) equilibrated with buffer B containing 0.2 M NaCl. His-APE was performed in E. coli BL21 (DE3) strain using the pET28a vector, and lysates of bacterial cells were collected from the literature (Chou, KM and Cheng, YC (2002) Nature, 415, 655-). 659). The samples were phosphocellulose (Whatman P11) equilibrated with buffer D containing 0.1 M NaCl [20 mM sodium phosphate (pH 7.8), 10% glycerol, 0.01% Triton X-100, and 0.25 mM PMSF]. 2.) The column was applied and the elution of the bound protein was performed stepwise with buffer D containing 0.2, 0.6 and 1 M NaCl. The protein eluted with 1 M NaCl was applied to a column packed with Talon resin (Clontech) equilibrated with buffer D containing 0.1 M NaCl and 5 mM imidazole. After extensive washing with the same buffer, the bound proteins were eluted by increasing the imidazole concentration to 20, 100, and 250 mM. Next, the 100 mM imidazole-eluting fraction containing His-APE was added to a buffer E containing 0.1 M NaCl [50 mM Hepes-NaOH (pH 7.6), 1 mM EDTA, 0.01% Triton X-100, 10% glycerol, 1 mM DTT, 0.25 mM PMSF] and loaded on a Mono SPC 1.6 / 5 column. The column was developed using a linear gradient of 0.1-0.7 M NaCl in buffer E, and His-APE eluted around 0.25 M NaCl.
1-3. GST pull-down assay
Glutathione-Sepharose 4 fast flow (Amersham Biosciences: 20 μl) was added to a buffer F containing 0.1 M NaCl [20 mM sodium phosphate (pH 7.5), 10% glycerol, 0.1% Triton X-100, 1 mM DT]. The mixture was mixed with the recombinant XPC-HR23B (1 pmol), and either GST or GST-TDG (1 pmol each). Where indicated, His-TDG was also included as a competitor. After incubation for 1 hour on ice with occasional stirring, the beads were washed seven times with 500 μl of buffer F containing 0.3 M NaCl, and the proteins retained on the beads were eluted with 0.3 M NaCl and 10 mM glutathione. Was performed using 20 μl of Buffer F containing Because purified XPCs tend to aggregate when boiled in the presence of SDS, they were mixed with a whole cell extract of XP4PASV cells that did not express endogenous XPC (0.4 μg protein) before denaturing each eluate. . This treatment prevents aggregation of the XPC and allows for more quantitative evaluation of the protein. Each eluate was mixed with an extract of XP4PASV cells, subjected to 8% SDS-PAGE, and analyzed by immunoblotting using a polyclonal anti-XPC antibody.
1-4. Gel shift assay
The covalently closed circular DNA shown in FIG. 2A; ³² The P-labeled blunt-ended DNA fragment was prepared exactly as described in the literature (Sugasawa, K. et al. (2001) Genes Dev., 15, 507-521). The gel shift assay was basically performed according to the literature (Sugasawa, K. et al. (2001) Genes Dev., 15, 507-521). ₂ And the amount of double-stranded closed circular DNA added to absorb non-specific binding was increased to 8 ng. In the supershift assay, after a standard binding reaction was performed, an affinity-purified polyclonal antibody was added, and the mixture was incubated on ice for 15 minutes, followed by glutaraldehyde fixation.
1-5. Nicking assay
Monitoring of the enzymatic activities of the recombinant His-TDG and His-APE proteins was performed using a “nicking assay” in the literature (Nedermann, P. and Jirnicy, J. (1993) J. Biol. Chem., 268, 21218-). 21224), with some modifications.
[0042]
DNA substrates containing a single G / T mismatch were identified as T4 polynucleotide kinase and [γ- ³² The 5'-end of the T-chain oligonucleotide (the lower sequence in FIG. 2B) was labeled by [P] ATP treatment. After heat inactivation of the enzyme at 65 ° C. for 1 hour, an equimolar amount of G-chain oligonucleotide was added, heated at 65 ° C. for 1 hour, and then gradually cooled to room temperature for annealing. The annealed 60 bp double-stranded DNA was purified by native PAGE. The nicking reaction was performed using 25 mM Hepes-KOH (pH 7.8), 0.5 mM EDTA, 50 mM NaCl, 2 mM MgCl. ₂ , 0.5 mM DTT, bovine serum albumin (9 μg) and substrate DNA (40 fmol) in a mixture (25 μl). After incubation at 30 ° C. for 1 hour, purified His-TDG was added and further incubated at 30 ° C. XPC-HR23B-His and His-APE were added individually or simultaneously at various times. The reaction was stopped with an equal volume of stop buffer [50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 25 mM EDTA, 0.3 mg / ml yeast tRNA, 2% sodium dodecyl sulfate (SDS), 0.8 mg / ml protein kinase K] And further incubated at 30 ° C. for 1 hour or more. To convert the resulting AP sites to single-strand breaks, NaOH was added to a final concentration of 90 mM and heated at 100 ° C. for 10 minutes. DNA was purified by phenol / chloroform extraction and ethanol precipitation, subjected to 16% denaturing PAGE, and then subjected to autoradiography. The cleavage by APE was also measured in the same manner, but the reaction was stopped by adding 1 μl of 0.5 M EDTA. Next, an equal volume of a solution containing 90% formamide, 0.04% bromophenol blue, and 0.04% xylene cyanol FF was mixed with the reaction solution, heated at 65 ° C. for 3 minutes, and analyzed by 16% denaturing PAGE. Later, it was analyzed by autoradiography. In both analyses, quantification of the radioactivity of the cleaved and uncleaved oligonucleotides was performed using a BAS2500 bioimaging analyzer (Fujifilm).
1-6. antibody
A polyclonal antibody against XPC was prepared as described in the literature (Sugasawa, K. et al. (1996) Mol. Cell. Biol., 16, 4852-4861). The anti-TDG antibody is expressed in Escherichia coli by recombinant TDG (FLAG-TDG) having a FLAG-tag fused to the amino terminus, and the antiserum obtained from a rabbit immunized with the antibody is subjected to ammonium sulfate precipitation (50% saturation). This was followed by affinity purification using GST-TDG which was covalently coupled to NHS-activated Sepharose 4 fast flow (Amersham Biosciences).
2. result
2-1. Interaction between TDG and XPC
In order to search for a factor that interacts with XPC, a yeast 2-hybrid screening was performed on a mouse embryo fibroblast cDNA library using full-length human XPC as a bait. 7 × 10 ⁶ One of the positive clones isolated from the transformants was found to encode mouse TDG. In addition, a yeast two-hybrid assay using human TDG cDNA was performed, and it was confirmed that human TDG could also interact with human XPC.
[0043]
To confirm that XPC and TDG physically interact, a recombinant human TDG protein fused with a GST tag (GST-TDG) was expressed in Escherichia coli, and an XPC-HR23B complex was used. Purified for use in pull-down assays. After adding glutathione-Sepharose beads to assays containing XPC-HR23B and either GST or GST-TDG, the beads were centrifuged and washed thoroughly. Next, the bound protein was eluted using a buffer containing 10 mM glutathione, subjected to SDS-PAGE, and then subjected to immunoblotting using an anti-XPC antibody (FIG. 1). Although little binding to control GST was detected (lane 3), a significant amount of XPC-HR23B co-precipitated with GST-TDG (lane 4). When TDG (His-TDG) fused with a histidine tag at the amino terminus was added in an excessive amount, binding was lost in a dose-dependent manner (lanes 5 and 6). Similar results were obtained when recombinant XPC protein was used instead of XPC-HR23B under these conditions, confirming a direct interaction between XPC and TDG.
2-2. Complex formation of XPC-HR23B and TDG on DNA
Since TDG is involved in the initiation of the BER reaction that corrects the G / T mismatch, to confirm whether XPC-HR23B is involved in TDG-dependent BER other than NER, site-specific G / T Including T mismatch, ³² A gel shift assay was performed using the P-labeled double-stranded DNA fragment (FIG. 2A). Although XPC-HR23B recognizes various structural abnormalities in double-stranded DNA (Sugasawa, K. et al. (2001) Genes Dev., 15, 507-521; Sugasawa, K. et al. (2002) DNA Repair, 1, 95-107). Under the conditions used here, almost no specific binding to the G / T mismatch substrate was detected (FIG. 3A, lanes 1-8). In contrast, TDG showed a band shift when incubated with G / T mismatched DNA, but showed no significant binding when using control DNA containing a normal G / C pair at the corresponding position. (See also FIG. 3A, lanes 9-16; Nedermann, P. and Jirnicy, J. (1993) J. Biol. Chem., 268, 21218-21224). It should be noted that the coupling reaction is carried out under such conditions that TDG can exert glycosylase activity. Therefore, it is highly likely that at least a part of the observed TDG / DNA complex is not a G / T mismatch but contains an AP site having guanine on the opposite side.
[0044]
As described above, the XPC-HR23B complex itself cannot bind to G / T mismatch DNA, but XPC-HR23B binds to TDG-bound DNA. When TPC was incubated with the G / T mismatch DNA and then XPC-HR23B was added, the total amount of the TDG / DNA complex decreased in a dose-dependent manner and instead a new shift band with lower mobility than the TDG / DNA complex Appeared (indicated by the star in FIG. 3B). To determine the protein component of this new band, a supershift assay was performed using polyclonal antibodies raised against XPC and TDG (FIG. 3C). As expected, the anti-XPC antibody did not supershift the TDG / DNA complex, and the anti-TDG antibody did not supershift the XPC-HR23B / DNA complex. However, when the anti-TDG antibody was added, both the TDG / DNA complex and the new band were supershifted (lanes 1-4). Furthermore, this new band was also supershifted by the anti-XPC antibody (lanes 5-8). Therefore, it was found that TDG bound to the substrate DNA in vitro formed a ternary complex with XPC-HR23B.
2-3. Effect of XPC on TDG activity
To determine whether XPC-HR23B affects TDG activity, we included a single G / T mismatch and added the 5'-end of the T chain. ³² A “nicking assay” was performed using a P-labeled 60 base pair DNA fragment (FIG. 2B). In this assay, the number of AP sites generated by TDG was determined by subjecting TDG-treated DNA to hot alkali treatment and then separating denatured and uncleaved T chains using denaturing PAGE.
[0045]
In this assay, purified XPC-HR23B itself showed no detectable DNA glycosylase activity against G / T mismatch. On the other hand, when TDG was incubated with the same DNA substrate, some mismatched T residues were excised 15 minutes after the start of the reaction, but the reaction was significantly slowed down thereafter (FIGS. 4A and B). This is probably because TDG once binds to the G / T mismatch and removes the T residue, and continues to bind to the resulting AP site (Waters, TR et al. (1999) J. Am. Biol. Chem., 274, 67-74: Waters, TR and SWann, PF (1998) J. Biol. Chem., 273, 200007-20014), and finally one cycle of the TDG enzyme reaction. It is likely that most of the TDG molecules will be trapped by the AP site after the end of. However, when XPC-HR23B was added to DNA at the same time as TDG, TDG activity increased in a dose-dependent manner of XPC-HR23B. Incubation with 107 fmol of XPC-HR23B resulted in a 3-fold increase in TDG activity after 120 minutes of incubation (FIGS. 4A and B). Subunits were individually added to the reaction mixture to determine which subunit, XPC or HR23B, was responsible for this enhancement. As shown in FIG. 4C, in the case of XPC alone (lanes 3-6), the same level of promotion was obtained as in the case of the XPC-HR23B complex (lane 2), but in the case of HR23B alone (lanes 7-10). Showed no effect on TDG activity even under similar conditions.
[0046]
To examine the mechanism by which XPC promotes TDG activity, XPC-HR23B was added to G / T mismatched DNA at various time points. Incubating the G / T mismatch DNA with XPC-HR23B before adding TDG did not change the time course of the TDG reaction as compared to mixing all components simultaneously. This is expected as XPC-HR23B itself cannot bind to the G / T mismatch (FIG. 3B). Incubation of TDG with XPC-HR23B prior to addition to the DNA substrate did not result in an increase in the initial reaction rate, which was due to the recognition of the G / T mismatch even if the TDG / XPC complex had been previously constructed. Is not promoted. However, when TDG was pre-incubated with the G / T mismatch DNA and the reaction reached a plateau, XPC-HR23B was added, from which point a dramatic re-increase of the reaction product was observed (FIG. 5). Given that TDG continues to bind to the resulting AP site after removing the mismatched T base, these observations indicate that XPC-HR23B promotes the dissociation of TDG from the AP site, thereby allowing free access. It is strongly suggested that the resulting TDG is capable of reacting with a new G / T mismatch substrate.
2-4. Effect of XPC-HR23B on TDG activity in the presence of APE
Although APE is thought to act immediately after DNA glycosylase in the BER pathway, it has been reported that APE promotes enzymatic turnover of TDG by eliminating TDG from the AP site (Waters). , TR et al. (1999) J. Biol. Chem., 274, 67-74). For this reason, the possibility that APE and XPC-HR23B functionally interact with respect to the promotion of TDG turnover was examined. APE (53 fmol) was added to nicking assay reactions containing TDG in the presence or absence of varying amounts of XPC-HR23B. Addition of APE resulted in significant enhancement of TDG activity as described in the literature (Waters, TR et al. (1999) J. Biol. Chem., 274, 67-74), and incubated for 120 minutes in the presence of APE. After that, more than twice as many AP sites occurred (compare FIG. 4A, lane 2-5 with FIG. 6A, lane 2-5). Subsequent addition of XPC-HR23B further enhanced TDG activity, which was dependent on XPC-HR23B dose (FIGS. 6A and B). Therefore, the simultaneous addition of 53 fmol of APE and 107 fmol of XPC-HR23B resulted in a 6-fold increase in the total amount of AP sites generated after 120 minutes. From this fact, two factors have an effect on TDG activity. It is shown to have an additional promoting effect. However, it cannot be ruled out that the added XPC-HR23B may affect the enzymatic reaction of the subsequent APE, for example by binding to the AP site generated after treatment with TDG. In fact, a DNA substrate containing 3-hydroxy-2- (hydroxymethyl) tetrahydrofuran (synthetic AP site analog; Fujiwara, Y. et al. (1999) J. Biol. Chem., 274, 20027-20033) at a specific site. A gel shift assay using revealed that XPC-HR23B could bind to the AP site. As shown in FIG. 7A, the binding affinity varies with the base opposite the AP site, in the order AP / C> AP / T> AP / G> AP / A. This binding is relatively weak when guanine is opposite the AP site, but these findings suggest that XPC-HR23B may be pushing TDG out of the AP site and promoting enzymatic turnover. You. To determine whether the presence of XPC-HR23B affected the endonuclease activity of APE, a nicking assay was performed similar to that performed in FIG. However, in this case, in order to measure the amount of the labeled oligonucleotide cleaved by APE, the measurement was performed by excluding the alkali treatment before denaturing PAGE. APE cleavage increased with the addition of XPC-HR23B, but only a small portion (less than 50%) of the TDG-generated AP sites were treated with APE (compare FIGS. 6B and 7C). ). Furthermore, when APE was omitted from the reaction, almost no cleaved oligonucleotide was detected, indicating that most of the detected cleavage was due to APE activity rather than spontaneous β-elimination of the AP site. It has been shown. It should be noted that regardless of the presence or absence of XPC-HR23B, only a part of the AP site generated by TDG is processed by APE. This fact suggests that XPC-HR23B does not promote or inhibit APE activity under the conditions used here.
[0047]
From the above results, it was confirmed that XPC-HR23B promotes the activity of TDG, thereby promoting the TDG-dependent BER reaction without affecting APE.
[0048]
【The invention's effect】
As described above in detail, the present invention provides a novel drug for preventing or improving various human diseases caused by G / T mismatch of genomic DNA. The present invention also provides an effective substance screening method for developing a new DNA damage repair agent.
[0049]
[Sequence list]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows the results of examining the physical interaction between XPC-HR23B and TDG. Glutathione-Sepharose beads were incubated with either 1 pmol of GST (lane 3) or GST-TDG (lanes 4 to 6) in the presence of XPC-HR23B (1 pmol). In lanes 5 and 6, the indicated amount of His-TDG was included as a competitor. After extensive washing, the bound protein was eluted with a buffer containing 10 mM glutathione. One-fourth of each eluate was mixed with a whole cell extract of XP4PASV cells not expressing XPC, subjected to 8% SDS-PAGE, and then subjected to immunoblotting using an anti-XPC antibody. . Lane 1: 0.4% of input XPC, Lane 2: cell extract of XP4PASV cells only.
FIG. 2
The DNA substrates used in the gel shift assay (A) and the nicking assay (B) are shown. X is A, C, G, or T.
FIG. 3 shows the results of confirming that XPC-HR23B interacts with TDG-binding DNA to form a ternary complex. (A) The indicated amount of XPC-HR23B or TDG containing a single G / T mismatch ³² It was mixed with 3.5 fmol of the P-labeled DNA fragment or a completely paired double-stranded DNA (G / C) as a control and incubated at 30 ° C. for 30 minutes. The resulting DNA-protein complex was fixed using glutaraldehyde and separated by native PAGE. (B) Incubation of a DNA substrate containing a single G / T mismatch (3.5 fmol) was performed at 30 ° C. for 15 minutes in the presence or absence of His-TDG (164 fmol). Subsequently, the indicated amount of XPC-HR23B was added, the mixture was further incubated at 30 ° C. for 15 minutes, and then subjected to native PAGE after glutaraldehyde fixation. The asterisk (*) indicates a band that newly appeared when both TDG and XPC-HR23B were present. (C) Supershift assay to identify ternary complexes containing TDG, XPC-HR23B and DNA. After performing a binding reaction as in (B) using 164 fmol TDG, 67 fmol XPC-HR23B, and 3.5 fmol DNA substrate containing a single G / T mismatch, various amounts of anti-TDG or Anti-XPC antibody was added and incubated on ice for another 15 minutes to crosslink the DNA-protein complex with glutaraldehyde.
FIG. 4 shows the results obtained by confirming that XPC-HR23B promotes TDG activity. (A) Nicking assay for measuring TDG activity in the presence of XPC-HR23B. A 60 bp DNA substrate containing a single G / T mismatch, labeled at the 5'-end of the T-strand, with 10 fmol of His-TDG, in the presence or absence of varying amounts of XPC-HR23B Incubate at 30 ° C. below for the specified time. This DNA sample was purified, and the AP site was chemically cleaved by alkali treatment, and then subjected to denaturing PAGE. (B) ³² The percentage of cleaved oligonucleotide in the P-labeled DNA substrate was calculated for each lane in (A) and plotted on a graph. Calculation of the mean and standard error was based on at least two independent experiments. (C) In the presence of various indicated amounts of XPC-HR23B (lane 2), XPC alone (lanes 3 and 6), or HR23B alone (lanes 7 to 10), using 10 fmol of His-TDG. Nicking assay. All reactions were incubated at 30 ° C. for 120 minutes, and purified DNA samples were subjected to alkaline treatment and denaturing PAGE.
FIG. 5 shows the results confirming that XPC-HR23B promotes enzymatic turnover of TDG. (A) contains a single G / T mismatch ³² P-labeled DNA substrate was incubated with 10 fmol His-TDG at 30 ° C. for various times as indicated (lanes 1-5). After 120 minutes, the indicated amount of XPC-HR23B was added and further incubated at 30 ° C. for 15, 30, or 60 minutes (total incubation times are indicated on each lane). Purified DNA samples were subjected to alkaline treatment and denaturing PAGE. (B) ³² The percentage of cleaved oligonucleotide in the P-labeled DNA substrate was calculated for each lane in (A). Calculation of the mean and standard error was based on at least two independent experiments.
FIG. 6 shows the results of confirming that XPC-HR23B promotes TDG activity in the presence of APE. (A) contains a single G / T mismatch ³² The P-labeled DNA substrate was incubated at 30 ° C. for the indicated time in the presence of 10 fmol His-TDG, 53 fmol His-APE, and the indicated amount of XPC-HR23B. Purified DNA samples were subjected to alkaline treatment and denaturing PAGE. Due to the 3 ′ (5 ′ exonuclease activity of APE, the band of the cleaved oligonucleotide appears as a ladder (B). ³² The percentage of cleaved oligonucleotide in the P-labeled DNA substrate was calculated for each lane in (A). Calculation of the mean and standard error was based on at least two independent experiments.
FIG. 7 shows the results confirming that XPC-HR23B does not inhibit the enzyme reaction of APE. (A) Synthetic AP site analogs with four different bases reversed or with normal G / C pairs at corresponding positions ³² P-labeled DNA substrates (3.5 fmol each) were incubated at 30 ° C. for 30 minutes in the presence of the indicated amount of XPC-HR23B. The resulting DNA-protein complex was fixed with glutaraldehyde and separated by native PAGE. (B) contains a single G / T mismatch ³² The P-labeled DNA substrate was incubated at 30 ° C. for the indicated time in the presence of 10 fmol His-TDG, 53 fmol His-APE, and the indicated amount of XPC-HR23B. The reaction was stopped by adding EDTA and subjected to denaturing PAGE without alkali treatment. (C) ³² The percentage of cleaved oligonucleotide in the P-labeled DNA substrate was calculated for each lane in (B). Calculation of the mean and standard error was based on at least two independent experiments.

Claims (4)

配列番号２のアミノ酸配列またはその変異配列からなるポリペプチドＸＰＣをコードするポリヌクレオチドが細胞内に導入可能な形態を有するＤＮＡ損傷修復剤。A DNA damage repair agent having a form in which a polynucleotide encoding the polypeptide XPC consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or a mutant sequence thereof can be introduced into cells. 配列番号２のアミノ酸配列またはその変異配列からなるポリペプチドＸＰＣが細胞内に導入可能な形態を有するＤＮＡ損傷修復剤。A DNA damage repair agent having a form in which a polypeptide XPC comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or a mutant sequence thereof can be introduced into cells. 配列番号２のアミノ酸配列またはその変異配列からなるポリペプチドＸＰＣと同等またはそれ以上のＤＮＡ損傷修復活性を有する物質を特定する方法であって、
（１）Ｇ／Ｔミスマッチ塩基対を含む２本鎖オリゴヌクレオチド集団に、チミンＤＮＡグリコシラーゼおよびポリペプチドＸＰＣを反応させた場合のミスマッチＴ塩基除去オリゴヌクレオチド量；および
（２）前記（１）と同一のオリゴヌクレオチド集団に、チミンＤＮＡグリコシラーゼおよび候補物質を反応させた場合のミスマッチＴ塩基除去オリゴヌクレオチド量、
をそれぞれ測定し、（１）量と（２）量が等量、または（１）量より（２）量が多くなる候補物質を目的物質とすることを特徴とするスクリーニング方法。A method for specifying a substance having a DNA damage repair activity equal to or higher than that of a polypeptide XPC consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or a mutant sequence thereof,
(1) the amount of mismatched T base-removed oligonucleotide when a thymine DNA glycosylase and a polypeptide XPC are reacted with a double-stranded oligonucleotide population containing a G / T mismatched base pair; and (2) the same as (1) above The amount of mismatched T base-removed oligonucleotide when thymine DNA glycosylase and a candidate substance were reacted with the oligonucleotide population of
Respectively, and using a candidate substance in which (1) amount and (2) amount are equal or (2) amount is larger than (1) amount as a target substance. 配列番号２のアミノ酸配列またはその変異配列からなるポリペプチドＸＰＣのＤＮＡ損傷修復活性を増強する物質を特定する方法であって、
（１）Ｇ／Ｔミスマッチ塩基対を含む２本鎖オリゴヌクレオチド集団に、チミンＤＮＡグリコシラーゼおよびポリペプチドＸＰＣを反応させた場合のミスマッチＴ塩基除去オリゴヌクレオチド量；および
（２）前記（１）と同一のオリゴヌクレオチド集団に、チミンＤＮＡグリコシラーゼ、ポリペプチドＸＰＣおよび候補物質を反応させた場合のミスマッチＴ塩基除去オリゴヌクレオチド量、
をそれぞれ測定し、（１）量より（２）量が多くなる候補物質を目的物質とすることを特徴とするスクリーニング方法。A method for specifying a substance that enhances the DNA damage repair activity of a polypeptide XPC consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or a mutant sequence thereof,
(1) the amount of mismatched T base-removed oligonucleotide when a thymine DNA glycosylase and a polypeptide XPC are reacted with a double-stranded oligonucleotide population containing a G / T mismatched base pair; and (2) the same as (1) above The amount of mismatched T base-removed oligonucleotide when thymine DNA glycosylase, polypeptide XPC and a candidate substance were reacted with the oligonucleotide population of
Respectively, and using a candidate substance having an amount larger than (1) the amount of (2) as a target substance, as a target substance.

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