JP2004135657A - Transgenic non-human mammalian animal expressing human a3 adenosine receptor - Google Patents
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Abstract
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヒトＡ３アデノシン受容体を発現するトランスジェニック非ヒト哺乳動物に関する。本発明はまた、上記トランスジェニック非ヒト哺乳動物の作製方法、該トランスジェニック非ヒト哺乳動物を利用した試験物質の薬理評価方法、ならびに該トランスジェニック非ヒト哺乳動物の作製に使用するターゲットベクターに関する。
【０００２】
【従来の技術】
Ａ３アデノシン受容体は、アデノシン受容体のサブタイプとして発見された受容体である（非特許文献１、２および３参照）。Ａ３アデノシン受容体のアゴニスト又は拮抗薬のアッセイ系が構築され（特許文献１参照）、多くの化合物が探索されてきた。その結果、多くのＡ３アデノシン受容体アンタゴニストが既に取得されている（特許文献１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６および１７参照）。
【０００３】
しかし、マウスやラットなど薬理評価に用いられるモデル動物のＡ３アデノシン受容体に対してもヒトＡ３アデノシン受容体と同等に強い拮抗作用を有する化合物が見出されていないため、Ａ３アデノシン受容体の種差による薬物反応性の違いを克服し、ヒト疾患モデルでその有効性を適切に評価することができていない。すなわち、取得された医薬開発候補化合物の疾患に対する薬効および副作用の実質的な評価ができないことがＡ３アデノシン受容体拮抗剤の開発を行う上で大きな障害となっている。
【０００４】
このような種差の問題を解決する一つの手段として、ヒトの遺伝子を動物で発現させる等の、モデル動物のヒト化が注目されている。ヒトの遺伝子を動物に発現させることは、トランスジェニックの技術を用いて行うことが可能である。例えば、ヒトアドレナリンβ２受容体を発現するトランスジェニックマウス（非特許文献４参照）やヒトブラジキニンＢ２受容体を発現するトランスジェニックマウス（非特許文献５参照）等が報告されている。これらの動物では、ヒトの遺伝子とともに、元からあるトランスジェニック動物の対応する遺伝子（オーソログ遺伝子）も発現している。これに対し、ポジティブ選択とネガティブ選択を組み合わせた方法を用いて、ヒト遺伝子をそれに対応する非ヒト哺乳動物のオーソログ遺伝子の位置に導入するノックインと呼ばれる遺伝子改変により、自己のオーソログ遺伝子の代わりに導入したヒト遺伝子を発現する動物を作製することができる（特許文献１８ならびに特許文献６、７および８参照）。しかしながら、ヒトＡ３アデノシン受容体遺伝子を発現するトランスジェニック非ヒト動物は、報告されていない。
【０００５】
【特許文献１】
英国特許出願公開第２２６４９４８号明細書
【０００６】
【特許文献２】
国際公開第９８／１５５５５号パンフレット
【０００７】
【特許文献３】
国際公開第００／６４８９４号パンフレット
【０００８】
【特許文献４】
国際公開第００／０２８６１号パンフレット
【０００９】
【特許文献５】
国際公開第００／１０３９１号パンフレット
【００１０】
【特許文献６】
国際公開第００／１５２３１号パンフレット
【００１１】
【特許文献７】
国際公開第９９／６５９１２号パンフレット
【００１２】
【特許文献８】
国際公開第９９／６４４１８号パンフレット
【００１３】
【特許文献９】
国際公開第９９／５１６０６号パンフレット
【００１４】
【特許文献１０】
国際公開第９７／３３８７９号パンフレット
【００１５】
【特許文献１１】
国際公開第９７／２７１７７号パンフレット
【００１６】
【特許文献１２】
特開平１１−１９３２８１号公報
【００１７】
【特許文献１３】
特開平９−２９１０８９号公報
【００１８】
【特許文献１４】
米国特許第５４４１８８３号明細書
【００１９】
【特許文献１５】
米国特許第５６４６１５６号明細書
【００２０】
【特許文献１６】
米国特許第５５７３７７２
【００２１】
【特許文献１７】
英国特許出願公開第２３２０４３０号明細書
【００２２】
【特許文献１８】
国際公開第９９／１８１９１号パンフレット
【００２３】
【非特許文献１】
フェブス・レターズ（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ），（オランダ），１９９１年，第２８４巻、第２号，ｐ．１５５−１６０
【００２４】
【非特許文献２】
プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ），（米国），１９９２年，第８９巻，第１６号，ｐ．７４３２−７４３６
【００２５】
【非特許文献３】
プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ），（米国），１９９３年，第９０巻，第２１号，ｐ．１０３６５−１０３６９
【００２６】
【非特許文献４】
ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），（ドイツ），１９９６年，第２４１巻，第２号，ｐ．４１７−４２４
【００２７】
【非特許文献５】
ハイパーテンション（Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ），（米国），１９９７年，第２９巻，第１号，ｐ．４８８−４９３
【００２８】
【非特許文献６】
ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），（米国），１９９７年，第２７２巻，第２９号，ｐ．１７９７２−１７９８０
【００２９】
【非特許文献７】
ヒューマン・モレキュラー・ジェネティクス（Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），（イギリス），１９９７年，第６巻，第７号，ｐ．１１５３−１１６２
【００３０】
【非特許文献８】
セル（Ｃｅｌｌ），（米国），１９９６年，第８７巻，第４号，ｐ．６８７−６９６
【００３１】
【発明が解決しようとする課題】
ヒトＡ３アデノシン受容体に特異的に作用する物質の薬理評価を行なうことのできる非ヒト哺乳動物が求められている。
【００３２】
【課題を解決するための手段】
本発明は、以下の（１）〜（２８）を提供する。
（１）ヒトＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡをゲノム中に有し、該受容体を発現するトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
（２）両方の相同染色体において、ヒトＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡが、自己のＡ３アデノシン受容体をコードする領域と置換して挿入されている、（１）に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
（３）非ヒト哺乳動物が、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシおよびサルからなる群から選ばれる非ヒト哺乳動物である、（１）または（２）に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
（４）以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む（１）に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の作製方法。
（ａ）ヒトＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡを含む発現ベクターを構築する工程
（ｂ）該発現ベクターを非ヒト哺乳動物の受精卵に導入する工程
（ｃ）該受精卵を偽妊娠雌性非ヒト哺乳動物の卵管あるいは子宮に移植する工程
（ｄ）該非ヒト哺乳動物を飼育し、産まれた仔から、ヒトＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡをゲノム中に有する個体を選択する工程
（５）以下の（ａ）〜（ｅ）の工程を含む（１）に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の作製方法。
（ａ）ヒトＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡを含む発現ベクターを構築する工程
（ｂ）該発現ベクターを非ヒト哺乳動物の胚性幹細胞に導入する工程
（ｃ）該胚性幹細胞を非ヒト哺乳動物の受精卵に導入する工程
（ｄ）該受精卵を偽妊娠雌性非ヒト哺乳動物の卵管あるいは子宮に移植する工程
（ｅ）該非ヒト哺乳動物を飼育し、産まれた仔から、ヒトＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡを有するゲノム中に個体を選択する工程
【００３３】
（６）以下の（ａ）〜（ｅ）の工程を含む（１）に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の作製方法。
（ａ）ヒトＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡを含む発現ベクターを構築する工程
（ｂ）該発現ベクターを***に取り込ませる工程
（ｃ）該***により非ヒト哺乳動物の未受精卵を受精させる工程
（ｄ）該受精卵を偽妊娠雌性非ヒト哺乳動物の卵管あるいは子宮に移植する工程
（ｅ）該非ヒト哺乳動物を飼育し、産まれた仔から、ヒトＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡをゲノム中に有する個体を選択する工程
（７）以下の（ａ）〜（ｆ）の工程を含む（１）に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の作製方法。
（ａ）ヒトＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡを含むレトロウイルスベクターを構築する工程
（ｂ）該レトロウイルスベクターを用いて組換えレトロウイルスを作製する工程
（ｃ）該組換えレトロウイルスを非ヒト哺乳動物の未受精卵に感染させる工程
（ｄ）該未受精卵を体外受精させる工程
（ｅ）該受精卵を偽妊娠雌性非ヒト哺乳動物の卵管あるいは子宮に移植する工程
（ｆ）該非ヒト哺乳動物を飼育し、産まれた仔から、ヒトＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡをゲノム中に有する個体を選択する工程
（８）以下の（ａ）〜（ｈ）の工程を含む（２）に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の作製方法。
（ａ）ヒトＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡを含むターゲットベクターを構築する工程
（ｂ）該ターゲットベクターを非ヒト哺乳動物の胚性幹細胞に導入する工程
（ｃ）ヒトＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡが、自己のＡ３アデノシン受容体をコードする領域と置換して挿入された染色体を有する胚性幹細胞を選択する工程
（ｄ）選択した胚性幹細胞を受精卵に導入する工程
（ｅ）該受精卵を偽妊娠雌性非ヒト哺乳動物の卵管あるいは子宮に移植する工程（ｆ）該非ヒト哺乳動物を飼育し、産まれた仔から、生殖系列キメラを選択する工程
（ｇ）該生殖系列キメラを交配させ、産まれた仔から、ヒトＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡが、自己のＡ３アデノシン受容体をコードする領域と置換して挿入された染色体を有する個体を選択する工程
（ｈ）（ｇ）で得られた個体同士を交配させ、産まれた仔から、両方の相同染色体において、ヒトＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡが、自己のＡ３アデノシン受容体をコードする領域と置換して挿入されたホモ接合体を選択する工程
（９）以下の（ａ）〜（ｅ）の工程を含む（１）に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の作製方法。
（ａ）ヒトＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡを含む発現ベクターを構築する工程
（ｂ）構築した発現ベクターを非ヒト哺乳動物の細胞に導入する工程
（ｃ）（ｂ）で得られた細胞の核を脱核した非ヒト哺乳動物の未受精卵に導入し、発生を開始させる工程
（ｄ）発生を開始した該未受精卵を偽妊娠雌性非ヒト哺乳動物の卵管あるいは子宮に移植する工程
（ｅ）該非ヒト哺乳動物を飼育し、産まれた仔から、ヒトＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡをゲノム中に有する個体を選択する工程
（１０）以下の（ａ）〜（ｇ）の工程を含む（２）に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の作製方法。
（ａ）ヒトＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡを含むターゲットベクターを構築する工程
（ｂ）構築したターゲットベクターを非ヒト哺乳動物の細胞に導入する工程
（ｃ）ヒトＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡが、自己のＡ３アデノシン受容体をコードする領域と置換して挿入された染色体を有する細胞を選択する工程
（ｄ）選択した細胞の核を脱核した非ヒト哺乳動物の未受精卵に導入し、発生を開始させる工程
（ｅ）発生を開始した該未受精卵を偽妊娠雌性非ヒト哺乳動物の卵管あるいは子宮に移植する工程
（ｆ）該非ヒト哺乳動物を飼育し、産まれた仔から、ヒトＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡが、自己のＡ３アデノシン受容体をコードする領域と置換して挿入された染色体を有する個体を選択する工程
（ｇ）（ｆ）で得られた個体同士を交配させ、産まれた仔から、両方の相同染色体において、ヒトＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡが、自己のＡ３アデノシン受容体をコードする領域と置換して挿入されているホモ接合体を選択する工程
【００３４】
（１１）（１）または（２）に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物に由来する細胞。
（１２）細胞が、卵、***または胚性幹細胞である（１１）に記載の細胞。
（１３）（１１）または（１２）に記載の細胞に、さらに外来の遺伝子を導入することを特徴とする、トランスジェニック非ヒト哺乳動物の作製方法。
（１４）（１３）に記載の方法で作製されるトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
（１５）（１１）または（１２）に記載の細胞に、さらに外来の遺伝子を導入して特定の遺伝子を欠損させることを特徴とする、ノックアウト非ヒト哺乳動物の作製方法。
（１６）（１５）に記載の方法で作製されるノックアウト非ヒト哺乳動物。
（１７）（１）または（２）に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物と同種他系統の病態モデル動物とを交配させることを特徴とする、ヒトＡ３アデノシン受容体を発現する病態モデル非ヒト哺乳動物の作製方法。
（１８）（１７）に記載の方法により作製される、ヒトＡ３アデノシン受容体を発現する病態モデル非ヒト哺乳動物。
（１９）（１）または（２）に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物に、疾患を誘発させることを特徴とする、ヒトＡ３アデノシン受容体を発現する病態モデル非ヒト哺乳動物の作製方法。
（２０）（１９）に記載の方法により作製される、ヒトＡ３アデノシン受容体を発現する病態モデル非ヒト哺乳動物。
【００３５】
（２１）以下の（ａ）および（ｂ）の工程を含む、ヒトＡ３アデノシン受容体に対する試験物質の薬理評価方法。
（ａ）（１）、（２）、（１４）、（１６）、（１８）または（２０）のいずれか１項に記載の非ヒト哺乳動物に試験物質を投与して薬理効果を調べる工程
（ｂ）該非ヒト哺乳動物に試験物質を投与しなかった場合の薬理効果と比較し、試験物質が該非ヒト哺乳動物に与えた薬理効果を調べる工程
（２２）以下（ａ）および（ｂ）の工程を含む、ヒトＡ３アデノシン受容体に対する試験物質の薬理評価方法。
（ａ）（１１）に記載の細胞に試験物質を投与して薬理効果を調べる工程
（ｂ）該細胞に試験物質を投与しなかった場合の薬理効果と比較し、試験物質が該細胞に与えた薬理効果を調べる工程
（２３）以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、ヒトＡ３アデノシン受容体に対する試験物質の薬理評価方法。
（ａ）（１２）に記載の胚性幹細胞を分化誘導し、分化した細胞を取得する工程（ｂ）（ａ）で得られた分化した細胞に試験物質を投与して薬理効果を調べる工程
（ｃ）（ａ）で得られた分化した細胞に試験物質を投与しなかった場合の薬理効果と比較し、試験物質が該細胞に与えた薬理効果を調べる工程
（２４）試験物質が、ヒトＡ３アデノシン受容体に対するアゴニストまたはアンタゴニストである、（２１）〜（２３）のいずれか１項に記載の薬理評価方法。
（２５）ヒトＡ３アデノシン受容体に対するアゴニストが、ヒトＡ３アデノシン受容体に対するアゴニスト活性が非ヒト哺乳動物のＡ３アデノシン受容体に対するアゴニスト活性の１０倍以上であるヒト選択的なアゴニストである（２４）に記載の薬理評価方法。
（２６）ヒトＡ３アデノシン受容体に対するアンタゴニストが、ヒトＡ３アデノシン受容体に対するアンタゴニスト活性が非ヒト哺乳動物のＡ３アデノシン受容体に対するアンタゴニスト活性の１０倍以上であるヒト選択的なアンタゴニストである（２４）に記載の薬理評価方法。
（２７）ヒトＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡを含むターゲットベクター。
（２８）配列番号１１に示される塩基配列の１〜６３７番目の配列の連続する５００塩基以上の配列からなるＤＮＡおよび配列番号１１に示される塩基配列の３７３５〜５２７０番目の配列の連続する５００塩基以上の配列からなるＤＮＡを含む（２７）に記載のターゲットベクター。
【００３６】
【発明の実施の形態】
本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、ヒトＡ３アデノシン受容体を発現しており、ヒトＡ３アデノシン受容体に選択的に作用する薬物を評価するために用いることができる。
非ヒト哺乳動物としては、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシまたはサルなどがあげられ、好ましくはマウス、ラット、ウサギ、サルなどがあげられる。
【００３７】
以下、本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の作出方法と利用方法について詳細に説明する。
本発明の、ヒトＡ３アデノシン受容体を発現するトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、１）目的とする遺伝子を動物個体に導入するトランスジェニック動物の作製方法、２）標的遺伝子と目的とする導入遺伝子とを入れ換えた遺伝子置換動物の作製方法、３）目的とした遺伝子改変を施した細胞の核を用いたクローン個体の作製方法等を用いることにより、作製することができる。以下にそれぞれ具体的に説明する。
【００３８】
１．目的とする遺伝子を動物個体に導入するトランスジェニック動物の作製方法を用いた、本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の作製
（１）ヒトＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡの取得
ヒトＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡとしては、ヒトＡ３アデノシン受容体をコードするｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡをあげることができる。ゲノムＤＮＡはイントロンを含んでいてもよい。また、コード領域のコドンは、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡにおけるコドンに限られるものでなく、ヒトＡ３アデノシン受容体のアミノ酸配列をコードするコドンであれば、いかなるコドンの組み合わせでもよい。ヒトＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡの例としては、配列番号１４に示す塩基配列からなるヒトＡ３アデノシン受容体のｃＤＮＡをあげることができる。
【００３９】
塩基配列データベースより、ヒトＡ３アデノシン受容体ｃＤＮＡの配列、またはヒトＡ３アデノシン受容体遺伝子のゲノム配列を検索し、その塩基配列情報を取得する。塩基配列データベースから取得できるヒトＡ３アデノシン受容体遺伝子のゲノム配列としては、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｌ７７７２９、Ｌ７７７３０およびＡＨ００３５９７で登録されている塩基配列、ヒトＡ３アデノシン受容体ｃＤＮＡの配列としては、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｌ２０４６３、Ｌ２２６０７およびＮＭ＿０００６７７で登録されている塩基配列をあげることができる。
【００４０】
得られたヒトＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡの塩基配列情報に基づいて、ヒトＡ３アデノシン受容体をコードする領域を含むｃＤＮＡの配列またはゲノム配列の領域を適当に選択し、この領域の５’端２０〜４０ｂｐの配列を３’端に含むＤＮＡおよび、この領域の３’端２０〜４０ｂｐの配列と相補的な配列を３’端に含むＤＮＡを作製する。これらのＤＮＡをプライマーとして用い、ヒトｃＤＮＡを鋳型としたＰＣＲにより、ヒトＡ３アデノシン受容体をコードするｃＤＮＡを、ヒトゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲにより、ヒトＡ３アデノシン受容体をコードするゲノムＤＮＡを単離することができる。
【００４１】
ヒトｃＤＮＡは、ヒトの組織または細胞から調製したＲＮＡから作製できる。組織または細胞から全ＲＮＡを調製する方法としては、チオシアン酸グアニジン−トリフルオロ酢酸セシウム法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５４， ３， １９８７）、酸性チオシアン酸グアニジン・フェノール・クロロホルム法（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １６２， １５６， １９８７； 実験医学， ９， １９３７， １９９１）などがあげられる。また、アブソリュートリーＲＮＡ ＲＴ−ＰＣＲミニプレップ・キット（Ａｂｓｏｌｕｔｅｌｙ ＲＮＡ ＲＴ−ＰＣＲ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ、ストラタジーン社製）、ＲＮイージー・ミニ・キット（ＲＮｅａｓｙ ＭＩｎｉ Ｋｉｔ、キアゲン社製）等のキットを用いることによっても調製することができる。全ＲＮＡからポリ（Ａ）＋ ＲＮＡとしてｍＲＮＡを調製する方法としては、オリゴ（ｄＴ）固定化セルロースカラム法〔Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ２００１（以下、モレキュラー・クローニング第３版と略す）〕等があげられる。さらに、ファーストトラック２．０ｍＲＮＡ分離キット（ＦａｓｔＴｒａｃｋ ２．０ ｍＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ、インビトロジェン社製）、クィックプレップｍＲＮＡ精製キット（ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ、アマシャム・バイオサイエンス社製）等のキットを用いることによりヒト組織や細胞からｍＲＮＡを調製することができる。全ＲＮＡまたはｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成する方法としてはモレキュラー・クローニング第３版、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， １９８７−２００１（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）等に記載された方法、あるいは市販のキット、例えばＲＴ−ＰＣＲ用スーパースクリプト第一鎖合成システム（ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ Ｆｉｒｓｔ−ＳｔｒａｎｄＳｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＲＴ−ＰＣＲ、インビトロジェン社製）、プロスター第一鎖ＲＴ−ＰＣＲキット（ＰｒｏＳＴＡＲ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ＲＴ−ＰＣＲ Ｋｉｔ、ストラタジーン社製）、ＰＣＲ−セレクトｃＤＮＡサブトラクション・キット（ＰＣＲ−Ｓｅｌｅｃｔ ｃＤＮＡ Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ、クロンテック社製）を用いる方法などがあげられる。クロンテック社等から市販されているヒトの各種組織のｃＤＮＡを用いることもできる。このようにして得られたヒトＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡの例として、配列番号１４に示す塩基配列を有するＤＮＡをあげることができる。
【００４２】
ヒトゲノムＤＮＡは、ヒトの組織または細胞から、モレキュラー・クローニング第３版に記載の方法により調製することができる。または、イージーＤＮＡキット（Ｅａｓｙ−ＤＮＡ Ｋｉｔ、インビトロジェン社製）、ＤＮＡ抽出キット（ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ、ストラタジーン社製）等のキットを用いることにより、調製できる。クロンテック社等から市販されているヒトのゲノムＤＮＡを用いることもできる。
【００４３】
（２）ヒトＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡを含む導入遺伝子の作製
（１）で得られたヒトＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡを非ヒト哺乳動物に導入する際には、適当なプロモーターの下流に該ＤＮＡを連結した発現ベクターを導入遺伝子として用いるのが好ましい。
【００４４】
発現ベクターに用いられるプロモーターとしては、ヒトＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡを導入する非ヒト哺乳動物の細胞内で転写を開始できるプロモーターであればいずれも用いることができる。たとえばウイルス（サイトメガロウイルス、モロニー白血病ウイルス、ＪＣウイルス、乳癌ウイルス、シミアンウイルス、レトロウイルスなど）由来遺伝子のプロモーター、各種哺乳動物（ヒト、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）および鳥類（ニワトリなど）由来遺伝子〔例えば、アルブミン、インスリンＩＩ、エリスロポエチン、エンドセリン、オステオカルシン、筋クレアチンキナーゼ、血小板由来成長因子β、ケラチンＫ１、Ｋ１０およびＫ１４、コラーゲンＩ型およびＩＩ型、心房ナトリウム利尿性因子、ドーパミンβ−水酸化酵素、内皮レセプターチロシンキナーゼ（Ｔｉｅ２）、ナトリウムカリウムアデノシン３リン酸化酵素（Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅ）、ニューロフィラメント軽鎖、メタロチオネインＩおよびＩＩＡ、メタロプロテイナーゼ１組織インヒビター（ＴＩＭＰ１）、ＭＨＣクラスＩ抗原（Ｈ−２Ｌ）、平滑筋αアクチン、ポリペプチド鎖延長因子１α（ＥＦ−１α）、βアクチン、αおよびβミオシン重鎖、ミオシン軽鎖１および２、ミエリン塩基性タンパク、血清アミロイドＰコンポーネント、ミオグロビン、レニン、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）等の解糖系酵素、ヒートショック蛋白質などの遺伝子〕のプロモーター、上記遺伝子のエンハンサー配列やプロモーター配列を融合させたプロモーター〔例えば、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）の初期遺伝子のプロモーターとヒトＴ細胞白血病ウイルス１のロング・ターミナル・リピートの一部の配列からなるＳＲαプロモーター、サイトメガロウイルスの前初期（ＩＥ）遺伝子エンハンサーとニワトリβ−アクチンプロモーターからなるＣＡＧプロモーターなど〕などがあげられるが、Ａ３アデノシン受容体遺伝子のプロモーターを用いることが好ましく、特にヒトＡ３アデノシン受容体遺伝子のプロモーターを用いることが好ましい。組織特異的な発現を示す遺伝子のプロモーターを使用することにより、該受容体をコードするＤＮＡを導入したトランスジェニック非ヒト哺乳動物の特定の組織に発現させることも可能である。また、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ系との組合せにより、以下のようにして導入した外来遺伝子の発現時期や発現量等を制御することも可能である。
【００４５】
発現ベクター中のヒトＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡを２つのｌｏｘＰ配列の間に挿入し、該発現ベクターを用いて（３）に後述する方法でトランスジェニック非ヒト哺乳動物を作製する。該トランスジェニック非ヒト哺乳動物に、アデノウイルスベクターを利用してＣｒｅリコンビナーゼを発現させれば、Ｃｒｅリコンビナーゼ発現用のアデノウイルスを感染させた部位または時期に特異的にヒトＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡが欠失し、ヒトＡ３アデノシン受容体の発現を抑制することができる。また、（３）に後述する方法でヒトＡ３アデノシン受容体の発現ベクターに加えて、例えば組織特異的な発現を示すプロモーターを利用したＣｒｅリコンビナーゼ発現ベクターを導入してトランスジェニック非ヒト哺乳動物を作製することにより、Ｃｒｅリコンビナーゼが発現する組織でのみ、ヒトＡ３アデノシン受容体の発現が抑制されたトランスジェニック非ヒト哺乳動物を作製することができる。
【００４６】
発現ベクターは、ヒトＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡの下流に、ｍＲＮＡの３’末端のポリアデニル化に必要なポリアデニル化シグナルを有していることが好ましい。ポリアデニル化シグナルとしては、上記のウィルス由来、各種哺乳動物および鳥類由来の各遺伝子に含まれるポリアデニル化シグナル、例えば、ＳＶ４０の後期遺伝子または初期遺伝子、ウサギβグロビン遺伝子、ウシ成長ホルモン遺伝子、ヒトＡ３アデノシン受容体遺伝子等のポリアデニル化シグナルをあげることができる。その他ヒトＡ３アデノシン受容体をさらに高発現させるために、各遺伝子のスプライシングシグナル、エンハンサー領域、イントロンの一部をプロモーター領域の５’上流、プロモーター領域と翻訳領域間あるいは翻訳領域の３’下流に連結してもよい。以下、プロモーター、ヒトＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡおよびポリアデニル化シグナルからなるＤＮＡ構築物をヒトＡ３アデノシン受容体発現ユニットと呼ぶ。
【００４７】
さらに発現ベクターには、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、以下Ｅ． ｃｏｌｉと略す）を用いてベクターを調製するため、Ｅ． ｃｏｌｉで複製可能な複製開始点およびＥ． ｃｏｌｉの形質転換体の選択マーカーとなる内因性プロモーターを含む薬剤耐性遺伝子が必要である。薬剤耐性遺伝子としては、Ｅ． ｃｏｌｉ由来のアンピシリン耐性遺伝子（β−ラクタマーゼ遺伝子）、テトラサイクリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子等があげられる。Ｅ． ｃｏｌｉでの複製可能な複製開始点としては、ｐＢＲ３２２の複製開始点、ｃｏｌＥ１の複製開始点等があげられる。
【００４８】
レトロウイルスを遺伝子の導入に用いる場合は、レトロウイルスベクターにヒトＡ３アデノシン受容体発現ユニットを挿入した組換えレトロウイルスベクターを作製する。該組換えレトロウイルスベクターを、適切なパッケージング細胞に導入することにより、組換えレトロウイルスを生産させることができる。得られた組換えレトロウイルスを受精卵等に感染させることにより、組換えレトロウイルスベクターを導入することができる。パッケージング細胞への組換えレトロウイルスベクターの導入には、公知の遺伝子導入の手法（例えば、リン酸カルシウム法、電気パルス法、リポフェクション法、凝集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、ＤＥＡＥ−デキストラン法等）を用いることができる。
【００４９】
（３）受精卵等への発現ベクターの導入とトランスジェニック非ヒト動物の選択本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、（２）で作製したヒトＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡを含む遺伝子を対象となる非ヒト哺乳動物に導入することによって作製できる。具体的には、該遺伝子を対象となる非ヒト哺乳動物の受精卵、胚性幹細胞（以下、ＥＳ細胞と略す）、***または未受精卵へ導入し、これらの細胞を用いて発生させた個体から、ヒトＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡを含む遺伝子が胚芽細胞を含むすべての細胞の染色体上に組み込まれた個体を選択することにより、本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物を作出できる。作出したトランスジェニック非ヒト哺乳動物の胚芽細胞において該導入遺伝子が存在することは、作出動物の子孫がその胚芽細胞および体細胞の全てに該導入遺伝子を有することで確認することができる。個体の選択は、個体を構成する組織、例えば、血液組織、上皮組織、結合組織、軟骨組織、骨組織、筋組織、口腔内組織または骨格系組織の一部から調製したゲノムＤＮＡ上に該導入遺伝子が存在することをＤＮＡレベルで確認することによって行われる。このようにして選択された個体は通常、相同染色体の片方に導入遺伝子を有するヘテロ接合体なので、ヘテロ接合体の個体同士を交配することにより、子孫の中から導入遺伝子を相同染色体の両方に持つホモ接合体動物を取得することができる。このホモ接合体の雌雄の動物を交配することにより、すべての子孫が該遺伝子を安定に保持するホモ接合体となるので、通常の飼育環境で、本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物を繁殖継代することができる。
【００５０】
（ｉ）受精卵への遺伝子導入によるトランスジェニック非ヒト哺乳動物の作製
受精卵への遺伝子導入によるトランスジェニック非ヒト哺乳動物の作製は、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ （１９９４）（以下、マニピュレーティング・マウス・エンブリオ第２版と略す）、Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ， Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ （１９９３）、バイオマニュアルシリーズ８ ジーンターゲッティング， ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製，羊土社 （１９９５）、発生工学実験マニュアル， トランスジェニック・マウスの作り方， 講談社 （１９８７）等に記載された方法により行うことができる。
【００５１】
ヒトＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡを含む遺伝子を導入する受精卵は、同種の雄非ヒト哺乳動物と雌非ヒト哺乳動物を交配させることによって得られる。例えば、雄マウスと雌マウス、好ましくは近交系の雄マウスと雌マウスを交配することによりマウスの受精卵が得られ、雄ラットと雌ラット、好ましくはＷｉｓｔａｒ系統の雄ラットとＷｉｓｔａｒ系統の雌ラットを交配することによりラットの受精卵が得られる。受精卵は自然交配によっても得られるが、雌非ヒト哺乳動物の性周期を人工的に調節した後、雄非ヒト哺乳動物と交配させる方法が好ましい。雌非ヒト哺乳動物の性周期を人工的に調節する方法としては、例えば初めに卵胞刺激ホルモン、次いで黄体形成ホルモンを例えば腹腔注射などにより投与する方法が好ましいが、好ましいホルモンの投与量、投与間隔は非ヒト哺乳動物の種類によりそれぞれ異なる。非ヒト哺乳動物がマウスの場合は、雌マウスに卵胞刺激ホルモン投与後、約４８時間後に黄体形成ホルモンを投与し、雄マウスと交配させることにより受精卵を得る方法が好ましく、卵胞刺激ホルモンの投与量は２〜２０ ＩＵ／個体、好ましくは約５ＩＵ／個体、黄体形成ホルモンの投与量は０〜１０ ＩＵ／個体、好ましくは約５ＩＵ／個体である。非ヒト哺乳動物がラットの場合は、雌ラットに卵胞刺激ホルモン投与後、約４８時間後に黄体形成ホルモンを投与し、雄ラットと交配させることにより受精卵を得る方法が好ましく、卵胞刺激ホルモンの投与量は２０〜５０ ＩＵ／個体、好ましくは約３０ＩＵ／個体、黄体形成ホルモンの投与量は０〜１０ ＩＵ／個体、好ましくは約５ＩＵ／個体である。また、近交系のマウスやＷｉｓｔｅｒ系統のラットを用いる場合は、約１２時間明期条件（例えば７：００−１９：００）で約１週間飼育した８週齢以上のものを用いるのが好ましい。
【００５２】
得られた受精卵にマイクロインジェクション法（Ｗ． Ｊ． Ｇｏｒｄｏｎら； Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７７， ７３８０， １９８０、Ｊ． Ｊ． Ｍｕｌｌｉｎｓら； Ｎａｔｕｒｅ， ３４４， ５４１， １９９０、Ｒ． Ｅ． Ｈａｍｍｅｒら； Ｎａｔｕｒｅ， ３１５， ６８０， １９８５、Ｖ． Ｇ． Ｐｕｒｓｅｌら； Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．， １７， ３０３， １９８７）やレトロウイルスを用いた方法（マニピュレーティング・マウス・エンブリオ第２版）等によりヒトＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡを含む遺伝子を導入した後、該受精卵を雌非ヒト哺乳動物に人工的に移植および着床させることによって、導入したヒトＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡを含む遺伝子を組み込んだ染色体ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物が得られる。
【００５３】
マイクロインジェクション法により遺伝子を導入する場合には、受精後約１２〜約２４時間の雄性前核が出現している受精卵を用いることが好ましい。マイクロインジェクション法で導入されるヒトＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡを含む遺伝子は、環状化状態、直線化状態いずれでも用いることができるが、ヒトＡ３アデノシン受容体をコードする領域およびプロモーター等の発現調節領域を破壊しない形で直線化し導入することが好ましい。レトロウイルスを用いた方法により遺伝子を導入する場合には、桑実胚以前（一般には、８細胞期以前）の発生段階の受精卵を用いることが好ましい。
【００５４】
雌非ヒト哺乳動物へ受精卵を移植する場合には、精管結紮雄非ヒト哺乳動物と交配させることにより、受精能を誘起された偽妊娠雌非ヒト哺乳動物に得られた受精卵を人工的に移植および着床させる方法が好ましい。偽妊娠雌非ヒト哺乳動物は自然交配によっても得られるが、黄体形成ホルモン放出ホルモン（以下、ＬＨＲＨと略する）あるいはその類縁体を投与後、雄非ヒト哺乳動物と交配させることにより、受精能を誘起された偽妊娠雌非ヒト哺乳動物を得ることもできる。ＬＨＲＨの類縁体としては、例えば［３，５−ジヨード−Ｔｙｒ５］−ＬＨＲＨ、［Ｇｌｎ８］−ＬＨＲＨ、［Ｄ−Ａｌａ６］−ＬＨＲＨ、ｄｅｓ−Ｇｌｙ１０−［Ｄ−Ｈｉｓ（Ｂｚｌ）６］−ＬＨＲＨエチルアミド等があげられる。ＬＨＲＨあるいはその類縁体の投与量ならびにその投与後に雄非ヒト哺乳動物と交配させる時期は非ヒト哺乳動物の種類によりそれぞれ異なる。非ヒト哺乳動物が雌ラットの場合は、通常、ＬＨＲＨあるいはその類縁体を投与後、約４日目に雄ラットと交配させることが好ましく、ＬＨＲＨあるいはその類縁体の投与量は、通常、１０〜６０μｇ／個体、好ましくは約４０μｇ／個体である。
【００５５】
（ｉｉ）ＥＳ細胞への遺伝子導入によるトランスジェニック非ヒト哺乳動物の作製
ＥＳ細胞への遺伝子導入によるトランスジェニック非ヒト哺乳動物の作製は、マニピュレーティング・マウス・エンブリオ第２版 、Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ， Ａ ＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ （１９９３）、バイオマニュアルシリーズ８ ジーンターゲッティング， ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製，羊土社 （１９９５）、発生工学実験マニュアル， トランスジェニック・マウスの作り方， 講談社 （１９８７）等に記載された方法により行うことができる。
【００５６】
非ヒト哺乳動物のＥＳ細胞にヒトＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡを含む遺伝子を導入後、得られたＥＳ細胞を集合キメラ法または注入キメラ法を用いて、非ヒト哺乳動物の受精卵に取り込ませ、該受精卵を雌非ヒト哺乳動物に人工的に移植および着床させることによって導入したヒトＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡを含む遺伝子を組み込んだ染色体ＤＮＡを有する細胞を部分的に有する非ヒト哺乳キメラ動物が得られる。
【００５７】
非ヒト哺乳動物のＥＳ細胞は、マウスのＥＳ細胞（Ｍ． Ｊ． Ｅｖａｎｓら； Ｎａｔｕｒｅ， ２９２， １５４， １９８１ ； Ｇ． Ｒ． Ｍａｒｔｉｎ； Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７８， ７６３４， １９８１）、ラットのＥＳ細胞（Ｐ． Ｍ． Ｉａｎｎａｃｃｏｎｅら； Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ．， １６３， ２８８， １９９４）ブタのＥＳ細胞（Ｍ． Ｂ． Ｗｈｅｅｌｅｒ； Ｒｅｐｒｏｄ． Ｆｅｒｔｉｌ． Ｄｅｖ．， ６， ５６３， １９９４）、サルのＥＳ細胞（Ｊ． Ａ． Ｔｈｏｍｓｏｎら； Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９２， ７８４４， １９９６）の各樹立方法、ＵＳ５４５３３５７またはＵＳ５６７０３７２に記載のＥＳ細胞の樹立方法に準じて、樹立することができる。マウスのＥＳ細胞として、ＡＢ２．２〔レキシコン・ジェネティックス（Ｌｅｘｉｃｏｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）社製〕等を用いることができる。
【００５８】
ＥＳ細胞への外来性遺伝子の導入には、公知の遺伝子導入の手法（例えば、リン酸カルシウム法、電気パルス法、リポフェクション法、凝集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、ウイルスベクター法等）を用いることができる。導入されるヒトＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡを含む遺伝子は、環状化状態、直線化状態いずれでも用いることができるが、ヒトＡ３アデノシン受容体をコードする領域およびプロモーター等の発現調節領域を破壊しない形で直線化し導入することが好ましい。
【００５９】
受精卵は（ｉ）に記載した方法により取得できる。
ＥＳ細胞を集合キメラ法を用いて非ヒト哺乳動物の受精卵に取り込ませる場合には、一般に８細胞期以前の発生段階の受精卵を用いることが好ましい。ＥＳ細胞を注入キメラ法を用いて非ヒト哺乳動物の受精卵に取り込ませる場合には、一般に８細胞期から胚盤胞の発生段階の受精卵を用いることが好ましい。
【００６０】
雌非ヒト哺乳動物へ受精卵を移植する場合には、精管結紮雄非ヒト哺乳動物と交配させることにより、受精能を誘起された偽妊娠雌非ヒト哺乳動物に得られた受精卵を人工的に移植および着床させる方法が好ましく、偽妊娠雌非ヒト哺乳動物は、（ｉ）に記載した方法を用いることで得られる。
ＥＳ細胞の非ヒト哺乳動物と受精卵の非ヒト哺乳動物を、同じ種であるが体毛の色等の外見的な表現型が異なる系統にしておけば、非ヒト哺乳キメラ動物である個体、およびキメラ率（ＥＳ細胞に由来する細胞、すなわち導入した外来性遺伝子組み込んだ染色体ＤＮＡを有する細胞の割合）の高い個体を容易に選択することができる。
【００６１】
ヒトＡ３アデノシンをコードするＤＮＡを含む遺伝子を組み込んだ染色体ＤＮＡを有する細胞を部分的に有する非ヒト哺乳キメラ動物のうちキメラ率の高い個体（好ましくは、雄）と非ヒト哺乳動物の個体（好ましくは、雌）を交配する。生まれた仔の組織、例えば、血液組織、上皮組織、結合組織、軟骨組織、骨組織、筋組織、口腔内組織または骨格系組織の一部から調製したゲノムＤＮＡ上に導入したヒトＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡを含む遺伝子が存在するかどうかをサザンハイブリダイゼーション、ＰＣＲ等により調べ、生まれた全ての仔のゲノムＤＮＡ上に導入したヒトＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡを含む遺伝子が存在する場合、親の非ヒト哺乳キメラ動物を生殖系列キメラとして選択する。生殖系列キメラと非ヒト哺乳動物の個体を交配することによって、全身の細胞の染色体上に導入したヒトＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡを含む遺伝子を有する個体を仔として得ることができる。この個体は通常、相同染色体の片方にのみ、導入したヒトＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡを含む遺伝子を有するヘテロ接合体である。さらにその個体の雄雌どうしを交配することにより相同染色体の双方に導入したヒトＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡを含む遺伝子が入ったホモ接合体のトランスジェニック非ヒト哺乳動物を得ることができる。
【００６２】
（ｉｉｉ）***への遺伝子導入によるトランスジェニック非ヒト哺乳動物の作製
***への遺伝子導入によるトランスジェニック非ヒト哺乳動物の作製は、Ｐｅｒｒｙら（Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２８４， １１８０， １９９９） やＷａｋａｙａｍａら（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １６， ６３９， １９９８）によって報告された方法を用いて行なうことができる。
【００６３】
非ヒト哺乳動物の***に（４）で作製したヒトＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡを含む遺伝子を取り込ませた後、得られた***を顕微受精の方法を用いて未受精卵に受精させ、発生を開始した卵を雌非ヒト哺乳動物に人工的に移植および着床させることによって、***に取り込ませたヒトＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡを含む遺伝子を染色体上に組み込んだ非ヒト哺乳動物が得られる。
【００６４】
***に外来性遺伝子を取り込ませる場合には、細胞膜を破壊した***を、約０．５〜約１００ｎｇ／ｍＬ（好ましくは、５〜１０ｎｇ／ｍＬ）の濃度の外来性遺伝子を含む培地（例えば、ＣＺＢ培地やＮＩＭ培地など）中で数分間（好ましくは、１分間程度）インキュベーションする方法を用いることが好ましい。***の細胞膜を破壊する方法としては、低濃度（例えば、０．０５％）の界面活性剤（例えば、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００など）で処理する方法、１０％の仔ウシ胎児血清（以下、ＦＣＳと略す）を含みＥＤＴＡを含まない培地（例えば、ＣＺＢ培地など）中に懸濁した***を凍結乾燥する方法 、該***懸濁液を凍結融解する方法のいずれかが好ましい。このような処理をして細胞膜を破壊した***は、もはや自発的に受精する能力を失っているが、マイクロマニュピレーター等を用いた顕微受精の方法を用いて受精させることで胚の発生を促すことができる。顕微受精を行う場合には、外来性遺伝子を取り込ませた***の頭部を減数第二***中期にある同種の雌非ヒト哺乳動物未受精卵の細胞質に注入する方法が好ましい。
【００６５】
（ｉｖ）未受精卵への遺伝子導入と体外受精によるトランスジェニック非ヒト哺乳動物の作製
未受精卵への遺伝子導入と体外受精によるトランスジェニック非ヒト哺乳動物の作製は、Ｃｈａｎらによって報告された方法（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９５， １４０２８， １９９８）を用いて行なうことができる。
【００６６】
非ヒト哺乳動物（好ましくは、マウス、ラット、ウシなど）の未受精卵に、ヒトＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡを含む遺伝子を組み込んだレトロウイルスを感染させることで該遺伝子を導入し、得られた卵を体外受精の方法を用いて発生を開始させ、発生を開始した受精卵を雌非ヒト哺乳動物に人工的に移植および着床させることによって、導入したヒトＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡを含む遺伝子を染色体上に組み込んだ非ヒト哺乳動物が得られる。
【００６７】
ヒトＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡを含む遺伝子を組み込んだレトロウイルスは、マニピュレーティング・マウス・エンブリオ第２版等に記載の方法により調製できる。組換えレトロウイルスを未受精卵に感染させる場合には、透明帯を除いた未受精卵を用いることが好ましい。未受精卵の透明帯を除去する方法としては、マイクロマニュピレーター等を用いて物理的に膜を除く方法、化学物質（例えば、酸性タイロードなど）を用いて化学的に膜を溶解して除く方法のいずれかが好ましい。
【００６８】
２．標的遺伝子と目的とする導入遺伝子とを入れ換えた遺伝子置換動物の作製方法を用いた、本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の作製
（１）ヒトＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡの取得
１．（１）に記載の方法で、ヒトＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡの取得する。後述するように、ヒトＡ３アデノシン受容体をコードする領域の５’および３’に非ヒト哺乳動物のＡ３アデノシン受容体遺伝子の非コード領域を付加するために、開始コドンおよび終止コドンの近傍のコード領域中に適当な制限酵素サイトが必要であるため、このような制限酵素サイトがない場合は、ＰＣＲのプライマーの配列を、コードするアミノ酸配列は変えずに制限酵素サイトができるようにコドンを選択して設計し、ヒトＡ３アデノシン受容体のコード領域中の開始コドンおよび終止コドンの近傍に適当な制限酵素サイトができるようにする。
【００６９】
（２）非ヒト哺乳動物のＡ３アデノシン受容体遺伝子を含むゲノムＤＮＡの取得
非ヒト哺乳動物のＡ３アデノシン受容体遺伝子を含むゲノムＤＮＡを取得する。該ゲノムＤＮＡには、Ａ３アデノシン受容体をコードする領域およびイントロンの他に、Ａ３アデノシン受容体をコードする領域よりも５’側および３’側の領域も含む必要がある。Ａ３アデノシン受容体をコードする領域よりも５’側および３’側の領域は、５００ｂｐ以上であり、１ｋｂｐ以上が好ましく、３ｋｂｐ以上がより好ましい。
【００７０】
Ａ３アデノシン受容体遺伝子を含むゲノムＤＮＡを調製する方法としては、該非ヒト哺乳動物のゲノムＤＮＡライブラリーを作製し、プラークハイブリダイゼーションあるいはコロニーハイブリダイゼーションにより、該遺伝子を含むゲノムＤＮＡクローンを単離する方法があげられる。
ゲノムＤＮＡライブラリーは、該非ヒト哺乳動物の細胞や組織からゲノムＤＮＡを抽出し、制限酵素で部分的に切断した後、適当なベクターに挿入し、ベクターに応じたＥ． ｃｏｌｉ等の適当な宿主に導入することにより作製することができる。ゲノムＤＮＡの調製およびゲノムＤＮＡライブラリーは、モレキュラー・クローニング第３版やカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された方法により作製することができる。ベクターとしては、λ ＥＭＢＬ３（ストラタジーン社製）、λ ＤＡＳＨ ＩＩ（ストラタジーン社製）、λ ＦＩＸ ＩＩ（ストラタジーン社製）等のλファージベクター、ＢｅｌｏＢＡＣＩＩ等の細菌人工染色体（ＢＡＣ）ベクター、ｐＡｄ１０ｓａｃＢＩＩ等のバクテリオファージＰ１ベクター、ｐＣＹＰＡＣ１等のＰ１人工染色体（ＰＡＣ）ベクター、ＳｕｐｅｒＣｏｓ Ｉ（ストラタジーン社製）等のコスミドベクター等があげられる。
【００７１】
プラークハイブリダイゼーションあるいはコロニーハイブリダイゼーションに用いるプローブとしては、該非ヒト哺乳動物のＡ３アデノシン受容体のゲノム遺伝子の部分断片、Ａ３アデノシン受容体のｃＤＮＡの部分断片を標識したものを用いることができる。これらの部分断片は、該非ヒト哺乳動物のＡ３アデノシン受容体遺伝子のゲノム配列またはｃＤＮＡの配列を塩基配列データベースから検索し、この塩基配列に基づいて作製したプライマーを用いたＰＣＲにより取得することができる。
【００７２】
プラークハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーションおよびプローブの標識と調製は、モレキュラー・クローニング第３版やカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された方法により行なうことができる。
また、該非ヒト哺乳動物のＡ３アデノシン受容体遺伝子のゲノム配列が塩基配列データベースの検索により得られる場合は、増幅するゲノム配列の領域を適当に選択し、この領域の５’端２０〜４０ｂｐの配列を３’端に含むＤＮＡおよび、この領域の３’端２０〜４０ｂｐの配列と相補的な配列を３’端に含むＤＮＡを作製し、このＤＮＡをプライマーとし、該非ヒト哺乳動物のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲにより、該非ヒト哺乳動物の該受容体遺伝子を含むゲノムＤＮＡを単離することができる。
【００７３】
また、ゲノムＤＮＡライブラリースクリーニングシステム（Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）やユニバーサル・ゲノムウォーカー・キット（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒＴＭ Ｋｉｔ、クロンテック社製）などのキットを用いることによって、該非ヒト哺乳動物のＡ３アデノシン受容体遺伝子を含むゲノムＤＮＡを単離することもできる。
上記の方法で得られる非ヒト哺乳動物のＡ３アデノシン受容体遺伝子を含むゲノムＤＮＡとして、配列番号１０で示される塩基配列を含む、マウスＡ３アデノシン受容体遺伝子を含むマウスゲノムＤＮＡをあげることができる。
【００７４】
（３）ヒトＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡの両末端に、非ヒト哺乳動物のＡ３アデノシン受容体遺伝子のゲノム配列の５’非コード領域および３’非コード領域を付加したＤＮＡの作製
相同組換えに必要な、（１）で調製したヒトＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡの該受容体をコードする領域（開始コドン〜終止コドンの領域）の５’端に、非ヒト哺乳動物のＡ３アデノシン受容体遺伝子のゲノム配列の開始コドンより５’側の適当な長さの非コード領域を付加し、３’端に該ゲノム配列の終止コドンより３’側の適当な長さの非コード領域を付加したＤＮＡは、以下のようにして取得できる。付加する非コード領域の長さは、３’側、５’側とも５００ｂｐ以上、より好ましくは１ｋｂｐ以上、さらに好ましくは３ｋｂｐ以上が好ましい
【００７５】
（ａ）非ヒト哺乳動物のＡ３アデノシン受容体遺伝子のゲノム配列の、開始コドンより５’側にある適当な制限酵素サイトＸよりもさらに５’側の非コード領域２０〜４０ｂｐの配列を有するＤＮＡ、（ｂ）ヒトＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡの開始コドンから開始コドン近傍の制限酵素サイトＡまでの配列と相補的な配列の３’端に、非ヒト哺乳動物のＡ３アデノシン受容体遺伝子のゲノム配列の開始コドン直前までの非コード領域２０〜４０ｂｐの配列と相補的な配列を付加したＤＮＡ、（ｃ）ヒトＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡの終止コドン近傍の制限酵素サイトＢから終止コドンまでの配列の３’端に、非ヒト哺乳動物のＡ３アデノシン受容体遺伝子のゲノム配列の終止コドン直後の非コード領域２０〜４０ｂｐの配列を付加したＤＮＡ、（ｄ）非ヒト哺乳動物のＡ３アデノシン受容体遺伝子のゲノム配列の、終止コドンより３’側にある適当な制限酵素サイトＹよりもさらに３’側の非コード領域２０〜４０ｂｐの配列と相補的な配列を有するＤＮＡを作製する。（ａ）と（ｂ）を１組のプライマー、（ｃ）と（ｄ）を１組のプライマーとして、それぞれ（２）で取得した非ヒト哺乳動物のＡ３アデノシン受容体遺伝子を含むゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行なう。（ａ）と（ｂ）のプライマーを用いたＰＣＲにより得られたＤＮＡを、ヒトＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡの開始コドンの近傍にある制限酵素サイトＡおよび５’側非コード領域中の制限酵素サイトＸで切断し、（ｃ）と（ｄ）のプライマーを用いたＰＣＲにより得られたＤＮＡを、ヒトＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡの終止コドンの近傍にある制限酵素サイトＢおよび３’側非コード領域中の制限酵素サイトＹで切断する。これらの断片と、（１）で得られたヒトＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡを開始コドンおよび終止コドンの近傍にある制限酵素サイトＡおよびＢで切断した断片、（２）で得られた非ヒト哺乳動物のＡ３アデノシン受容体遺伝子のゲノム配列を５’側非コード領域中の制限酵素サイトＸおよびＸよりさらに５’側にある適当な制限酵素サイトＷで切断した断片、および非ヒト哺乳動物のＡ３アデノシン受容体遺伝子のゲノム配列を３’側非コード領域中の制限酵素サイトＹおよびＹよりさらに３’側にある適当な制限酵素サイトＺで切断した断片とを連結する。
【００７６】
（４）ターゲットベクターの作製とＥＳ細胞への導入
非ヒト哺乳動物オーソログ遺伝子を相同組換えするためのターゲットベクターは、Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ， Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ （１９９３）、バイオマニュアルシリーズ８ ジーンターゲッティング， ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製（羊土社）（１９９５）等に記載の方法にしたがって作製することができる。ターゲットベクターは、リプレースメント型、インサーション型いずれでも用いることができる。ターゲットベクターは、（３）で作製した、ヒトＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡの両末端に、非ヒト哺乳動物のＡ３アデノシン受容体遺伝子を含むゲノム配列の５’非コード領域および３’非コード領域を付加したＤＮＡ（以下、相同組換え用ＤＮＡとも称する）、相同組換え体の選別に必要な遺伝子、およびＥ． ｃｏｌｉを用いたベクターの調製に必要なＥ． ｃｏｌｉで自律複製可能な複製開始点および薬剤耐性遺伝子を有する。相同組換え体の選別に必要な遺伝子としては、ポジティブ選択（選別に用いた遺伝子を含む組換え体を選別する方法）に用いる、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｈｐｒｔ）遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子、ネガティブ選択（選別に用いた遺伝子を含まない組換え体を選別する方法）に用いるジフテリアトキシン（ＤＴ）遺伝子等をあげることができる。ポジティブ選択に用いる遺伝子は相同組換え用ＤＮＡの非コード領域内に挿入し、ネガティブ選択に用いる遺伝子は相同組換え用ＤＮＡとは別の位置に挿入する。ポジティブ選択に用いる遺伝子は、該遺伝子の発現に必要なプロモーターに連結してもよいし、プロモーターに連結せず、相同組換えが起きた場合に、ＥＳ細胞の染色体上のＡ３アデノシン受容体遺伝子のプロモーターにより発現させるようにしてもよい。ポジティブ選択に用いる遺伝子の両端に２つのｌｏｘＰ配列を付加して挿入すると、相同組換え体の選別を行なった後に、相同組換え体にＣｒｅリコンビナーゼ発現ベクターを導入することにより、相同組換え体の染色体からポジティブ選択に用いる遺伝子を除去することができる。
【００７７】
具体的なターゲットベクターとしては、ｐｌｏｘｐＨＰＲＴ２（ＷＯ ０１／３３９５７）に、相同組換え用ＤＮＡおよびＤＴ遺伝子の発現ユニットを挿入したベクター、例えば、ｐｌｏｘｐＨＰＲＴ２にマウスＡ３アデノシン受容体遺伝子を含むゲノムＤＮＡの非コード領域とヒトＡ３アデノシン受容体ｃＤＮＡからなる相同組換え用ＤＮＡおよびＤＴ遺伝子の発現ユニットを挿入したｐｌｏｘＰ−ＤＴ−ａｒｍ１−ＨＰＲＴ−ｈＡ３Ｒ−ａｒｍ２をあげることができる。
【００７８】
ＥＳ細胞へのターゲットベクターの導入には、公知の遺伝子導入の手法、例えば、リン酸カルシウム法、電気パルス法、リポフェクション法、凝集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、ウイルスベクター法等を用いることができる。導入されるターゲットベクターは、環状、直鎖状いずれの形状でも用いることができるが、相同組換え用ＤＮＡおよび相同組換え体の選別に必要な遺伝子を破壊しない形で直線化し導入することが好ましい。
【００７９】
相同組換え体を効率的に選別する方法として、例えば、Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ， Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ （１９９３）、バイオマニュアルシリーズ８ ジーンターゲッティング， ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製（羊土社）（１９９５）等に記載のポジティブ選択、プロモーター選択、ネガティブ選択、ポリＡ選択などの方法を用いることができる。例えば、ｈｐｒｔ遺伝子を含むターゲットベクターの場合は、ｈｐｒｔ遺伝子を欠損したＥＳ細胞に導入後、ＥＳ細胞をアミノプテリン、ヒポキサンチンおよびチミジンを含む培地で培養し、アミノプテリン耐性の株を選別することにより、ｈｐｒｔ遺伝子を含む相同組換え体を選別するポジティブ選択を行なうことができる。ネオマイシン耐性遺伝子を含むターゲットベクターの場合は、ベクターを導入したＥＳ細胞をＧ４１８を含む培地で培養し、Ｇ４１８耐性の株を選別することにより、ネオマイシン耐性遺伝子を含む相同組換え体を選別するポジティブ選択を行なうことができる。ＤＴ遺伝子を含むターゲットベクターの場合は、ベクターを導入したＥＳ細胞を培養し、生育してきた株を選別する（相同組換え以外のランダムに染色体に挿入された組換え体は、ＤＴ遺伝子が染色体に組み込まれて発現するため、ＤＴの毒性により生育できない）ことにより、ＤＴ遺伝子を含まない相同組換え体を選別するネガティブ選択を行なうことができる。選別した細胞株の中から目的とする相同組換え体を選択する方法としては、ゲノムＤＮＡに対するサザンハイブリダイゼーション法（モレキュラー・クローニング第３版）やＰＣＲ等があげられる。
【００８０】
（５）受精卵へのＥＳ細胞の取り込みと非ヒトトランスジェニック動物の作製
受精卵へのＥＳ細胞の取り込みと、受精卵の非ヒト哺乳動物への移植は、１．（３）（ｉｉ）に記載の方法により行なうことができる。
【００８１】
得られた仔から１．（３）（ｉｉ）に記載の方法により、全身の細胞の相同染色体の片方に相同組換えによる遺伝子置換を有するヘテロ接合体を得ることができる。さらにその個体の雄雌どうしを交配することにより相同染色体の双方に相同組換えによる遺伝子置換を有するホモ接合体のトランスジェニック非ヒト哺乳動物を得ることができる。
【００８２】
このようにして得られたホモ接合体のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、導入した遺伝子がコードするヒトＡ３アデノシン受容体を発現し、自己が持っていたＡ３アデノシン受容体は発現しないトランスジェニック非ヒト哺乳動物である。このホモ接合体のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、１．の方法で得られるトランスジェニック非ヒト哺乳動物よりも、４．および５．に後述する試験物質の薬理評価に用いる非ヒト哺乳動物として、（ａ）非ヒト哺乳動物が本来発現しているＡ３アデノシン受容体を発現していないので、薬理評価に用いる場合に該Ａ３アデノシン受容体を介した薬理効果を考慮する必要がない、（ｂ）導入遺伝子の導入部位に存在する遺伝子の破壊あるいは導入遺伝子による導入部位周辺の遺伝子の活性化等の副次的な表現形の変化がおきる可能性がほとんどない、等の点で好ましい。
【００８３】
３．目的とした遺伝子改変を施した細胞の核を用いたクローン個体の作製方法を用いた、本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の作製
本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、文献に記載されたクローンヒツジ（Ｉ． Ｗｉｌｍｕｔら； Ｎａｔｕｒｅ， ３８５， ８１０， １９９７）、クローンウシ（Ｊ． Ｂ． Ｃｉｂｅｌｌｉら； Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２８０， １２５６， １９９８、入谷明； 蛋白核酸酵素， ４４， ８９２， １９９９）、クローンヤギ（Ａ． Ｂａｇｕｉｓｉら； Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １７， ４５６， １９９９）、クローンマウス（Ｔ． Ｗａｋａｙａｍａら； Ｎａｔｕｒｅ， ３９４， ３６９， １９９８、Ｔ． Ｗａｋａｙａｍａら； Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， ２２， １２７， １９９９）の作製方法を用い、例えば以下のように作製することができる。
【００８４】
上記１．あるいは２．に記載した方法を用い、非ヒト哺乳動物（好ましくは、マウス、ヒツジ、ヤギ、ウシなど）の任意の細胞の染色体上に、ヒトＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡを含む遺伝子を導入する。得られた細胞の核を初期化（核を再び発生を繰り返すことができるような状態に戻す操作）する。
初期化した細胞の核を除核した非ヒト哺乳動物の未受精卵に注入することによって発生を開始させる。
【００８５】
発生を開始した卵を雌非ヒト哺乳動物に人工的に移植および着床させることによって導入した遺伝子を発現する、本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物が得られる。また、２．に記載の方法で、遺伝子置換を行なった細胞の核を用いて得られたトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、通常相同染色体の片方にヒトＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡを含む遺伝子が導入されたヘテロ接合体なので、得られたヘテロ接合体同士を交配することにより、自己のもつＡ３アデノシン受容体は発現せず、ヒトＡ３アデノシン受容体を発現するトランスジェニック非ヒト哺乳動物を得ることができる。このホモ接合体のトランスジェニック非ヒト哺乳動物も、２．に記載の方法で得られるホモ接合体のトランスジェニック非ヒト哺乳動物と同様の点で、薬理評価に用いる非ヒト哺乳動物として、１．に記載した方法で得られるトランスジェニック非ヒト哺乳動物よりも好ましい。
【００８６】
細胞の核を初期化する方法は、非ヒト哺乳動物の種類によりそれぞれ異なる。非ヒト哺乳動物がヒツジ、ヤギ、ウシなどの場合は、外来性遺伝子を導入した細胞を５〜３０％、好ましくは１０％のＦＣＳを含む培地（例えば、Ｍ２培地）から３〜１０日、好ましくは５日間、０〜１％、好ましくは０．５％のＦＣＳを含む貧栄養培地で培養することで細胞周期を休止期状態（Ｇ０期もしくはＧ１期）に誘導し初期化することが好ましい。非ヒト哺乳動物がマウスなどの場合は、同種の非ヒト哺乳動物の除核した未受精卵に、外来性遺伝子を導入した細胞の核を注入し数時間、好ましくは約１〜６時間培養することで初期化することが好ましい。
【００８７】
初期化された核を除核された未受精卵中で発生を開始させる方法は、非ヒト哺乳動物の種類によりそれぞれ異なる。非ヒト哺乳動物がヒツジ、ヤギ、ウシなどの場合は、細胞周期を休止期状態（Ｇ０期もしくはＧ１期）に誘導し初期化した核を、電気融合法などによって同種の非ヒト哺乳動物の除核した未受精卵に移植することで卵子を活性化し発生を開始させることが好ましい。非ヒト哺乳動物がマウスなどの場合は、外来性遺伝子を導入した細胞の核を注入した未受精卵を、卵子活性化物質（例えば、ストロンチウムなど）で刺激し細胞***の阻害物質（例えば、サイトカラシンＢなど）で処理し第二極体の放出を抑制することで発生を開始させることが好ましい。
【００８８】
４．本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物を用いた試験物質の薬理評価方法
本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物に試験物質、例えば、ヒトＡ３アデノシン受容体に選択的に作用するアゴニストまたはアンタゴニスト等を投与し、試験物質を投与しない該動物と比較して、該動物の血圧、呼吸数、体重等の種々の身体的パラメーターの測定、外見や行動の観察、病理組織学的検討等の薬理作用を調べることにより、該試験物質の薬理評価を行なうことができる。
【００８９】
また、本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物に各種の疾患を誘発させた病態モデル動物を作製し、該病態モデル動物に試験物質、例えば、ヒトＡ３アデノシン受容体に選択的に作用するアゴニストまたはアンタゴニスト等を投与し、該病態モデル動物の血圧、呼吸数、体重等の種々の身体的パラメーターの測定、病態や、外見、行動の観察、病理組織学的検討等を、試験物質を投与しない該病態モデル動物と比較して行なうことにより、該試験物質の該疾患に対する有効性および副作用等の薬理評価を行なうことができる。また、この評価に基づき、該疾患の治療薬として好ましい物質を選択することができる。特に、ヒトＡ３アデノシン受容体に対する結合量やアゴニストまたはアンタゴニストとしての活性が、非ヒト哺乳動物のＡ３アデノシン受容体と比較して高いヒト受容体に特異的な薬物では、通常の病態モデル動物を用いた薬理評価は困難であったが、本発明のトランスジェニック動物を用いることにより、薬理評価を行なうことが可能となる。本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物に誘発させる疾患としては、心疾患（例えば、急性心不全、慢性心不全、心筋炎など）、呼吸器系疾患、関節疾患（例えば、関節リュウマチ、変形性関節症など）、腎疾患（例えば、腎不全、糸球体腎炎、ＩｇＡ腎症など）、動脈硬化症、乾癬症、高脂血症、アレルギー疾患（例えば、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎など）、骨疾患（例えば、骨粗鬆症、くる病、骨軟化症、低カルシュウム血症など）、血液疾患、脳血管性傷害、外傷性脳障害、感染症、痴呆症、癌、糖尿病、肝疾患、皮膚疾患、神経変性疾患および慢性炎症性疾患などがあげられる。病態モデル動物の作製は、「マニュアル疾患モデルマウス」〔Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， ３１ 臨時増刊号， 中山書店 （１９９４）〕、「図説・薬理学のための病態動物モデル」〔西村書店 （１９８４）〕、「関節炎モデル動物」〔医歯薬出版 （１９８５）〕、「神経・筋疾患モデル動物」〔医歯薬出版 （１９８２）〕、「活性酸素と病態 疾患モデルからベッドサイドへ」〔学会出版センター （１９９２）〕等に記載の方法を用いることができる。
【００９０】
本薬理評価方法および５．および８．に後述する薬理評価方法に供する試験物質としては、Ａ３アデノシン受容体に対するアンタゴニスト（ＷＯ９８／１５５５５； ＷＯ００／６４８９４； ＷＯ００／０２８６１； ＷＯ００／１０３９１； ＷＯ００／１５２３１； ＷＯ９９／６５９１２； ＷＯ９９／６４４１８； ＷＯ９９／５１６０６； ＷＯ９７／３３８７９； ＷＯ９７／２７１７７； 特開平１１−１９３２８１； 特開平９−２９１０８９； ＵＳ５４４１８８３； ＵＳ５６４６１５６； ＵＳ５５７３７７２； ＧＢ２３２０４３０）等をあげることができる。
【００９１】
５．本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物から得られる細胞を用いた試験物質の薬理評価方法
本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物から得られる種々の細胞と、試験物質とを接触させ、試験物質非存在下での細胞と比較して、細胞内のＣａ２＋濃度の上昇等の種々の細胞の応答や細胞の形態の変化等の薬理作用を調べることにより、試験物質の該細胞に対する試験物質の薬理評価を行なうことができる。
【００９２】
本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物から得られるＥＳ細胞を分化誘導することにより、さまざまな種類の細胞を得ることができる。分化の誘導方法としては、ＥＳ細胞を同種同系統の動物の皮下に移植することにより、様々な組織が混じりあった奇形腫瘍（テラトーマ）を誘導する方法（マニピュレーティング・マウス・エンブリオ第２版）、適当な条件でインビトロ培養することにより、内胚葉細胞、外胚葉細胞、中胚葉細胞、血液細胞、内皮細胞、軟骨細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、神経細胞、グリア細胞、上皮細胞、メラノサイト、ケラチノサイトに分化誘導する方法（Ｒｅｐｒｏｄ． Ｆｅｒｔｉｌ． Ｄｅｖ．， １０， ３１， １９９８）をあげることができる。この分化後の細胞と、試験物質とを接触させ、試験物質非存在下での細胞と比較して、細胞内のＣａ２＋濃度の上昇等の種々の細胞の応答や細胞の形態の変化等の薬理作用を調べることにより、試験物質の該細胞に対する薬理評価を行なうことができる。これらの方法によって、ヒトの生体から摘出しにくい細胞や少数しか存在しない細胞などに対する薬理評価を行うことができる。
【００９３】
６．本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物のＥＳ細胞、卵、***または核を用いた遺伝子改変動物の作製
本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物から得られるＥＳ細胞、卵、***または核を用いて、１．〜３．に記載の方法によりヒトＡ３アデノシン受容体を発現し、かつさらなる染色体上の遺伝子の改変を行った遺伝子改変非ヒト哺乳動物を得ることができる。特に、その遺伝子の機能を破壊することである病態が惹起されることが公知になっている遺伝子を２．に記載した相同組換えの手法を利用して欠損させたノックアウト動物や、該遺伝子の機能を阻害するドミナントネガティブ体の遺伝子を１．または３．に記載の方法で導入し発現させたトランスジェニック動物は、病態モデル動物として有用である。
【００９４】
７．本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物と同種他系統の動物との交配による遺伝子改変動物の作製と作製された該遺伝子改変動物の利用
本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物と同種他系統の動物（例えば、ヒト疾患モデル動物）とを交配させることにより、ヒトＡ３アデノシン受容体を発現し、かつある表現系（例えば、ヒト病態と類似の症状）を示す遺伝子改変哺乳動物を得ることができる。交配する動物が、ヒト疾患モデル動物であれば、ヒトＡ３アデノシン受容体を発現し、かつヒト病態と類似の症状を表現系として示す病態モデル動物が得られる。交配の方法としては、自然交配以外に体外受精の方法があげられる。疾患モデル動物としては、先天性および後天性を疾患を問わずいかなる疾患モデル動物も用いることができる。例えば後天性の病態モデル動物は、「マニュアル疾患モデルマウス」〔Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， ３１ 臨時増刊号， 中山書店 （１９９４）〕、「図説・薬理学のための病態動物モデル」〔西村書店 （１９８４）〕、「関節炎モデル動物」〔医歯薬出版 （１９８５）〕、「神経・筋疾患モデル動物」〔医歯薬出版 （１９８２）〕、「活性酸素と病態 疾患モデルからベッドサイドへ」〔学会出版センター （１９９２）〕等に記載の方法により作製することができる。
【００９５】
８．遺伝子改変動物を用いた試験物質の薬理評価方法
６および７に記載の方法で得られた遺伝子改変病態モデル動物に試験物質、例えば、Ａ３アデノシン受容体に作用するアゴニストまたはアンタゴニスト等を投与し、該病態モデル動物の血圧、呼吸数、体重等の種々の身体的パラメーターの測定、病態や、外見、行動の観察、病理組織学的検討等を、試験物質を投与しない該病態モデル動物と比較して行なうことにより、該試験物質の該疾患に対する有効性および副作用等の薬理評価を行なうことができる。また、この評価に基づき、該病態の治療薬として好ましい物質を選択することができる。特に、ヒトＡ３アデノシン受容体に対するアゴニストまたはアンタゴニストとしての活性が、非ヒト哺乳動物のＡ３アデノシン受容体と比較して高い、ヒト受容体に選択的な薬物では、通常の病態モデル動物を用いた薬理評価は困難であったが、上記の遺伝子改変病態モデル動物を用いることにより、薬理評価を行なうことが可能となる。
以下に、本発明の実施例を示す。
【００９６】
【実施例】
実施例１ ヒトＡ３アデノシン受容体のｃＤＮＡの単離
（１）ヒト肝臓由来ｃＤＮＡの合成
クロンテック社より購入したヒト肝臓ポリＡ＋ ＲＮＡ４μｇを鋳型とし、第一鎖ｃＤＮＡ合成用スーパースクリプト・プレアンプリフィケーション・システム（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｆｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、インビトロジェン社製）を用い、添付マニュアルに従ってｃＤＮＡを取得した。
【００９７】
（２）ＰＣＲによるヒトＡ３アデノシン受容体ｃＤＮＡの単離
続いて、取得したヒト肝臓由来ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行なった。すなわち、Ｍ． Ｒ． Ａｔｋｉｎｓｏｎらの報告（Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． Ｒｅｓ．， ２９， １， １９９７）に記載されているヒトＡ３アデノシン受容体遺伝子を含むヒトゲノムＤＮＡの塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｌ７７７２９およびＬ７７７３０）に基いて、配列番号１で示される塩基配列を有する２４ｍｅｒのプライマー、および配列番号２で示される塩基配列を有する２５ｍｅｒのプライマーを作製した。これらのプライマーを用い、ヒト肝臓由来ｃＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲの反応液を調製し、９４℃で５分間反応させ、続いて９４℃で１分間、６８℃で２分間のサイクルを３０サイクル反復した。このＰＣＲ反応液を２μＬ用いて、上記と同方法で再度ＰＣＲを行なった後、このＰＣＲ反応液をアガロースゲル電気泳動し、ヒトＡ３アデノシン受容体ｃＤＮＡを含む約１ｋｂｐのＤＮＡ断片を、ジーンクリーンＩＩキット（ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ ＩＩ Ｋｉｔ、ＢＩＯ１０１社製）を用い、添付マニュアルに従って回収した。
【００９８】
（３）ヒトＡ３アデノシン受容体ｃＤＮＡを有するプラスミドｐＢＳ−ｈＡ３Ｒの構築
次に、回収したヒトＡ３アデノシン受容体ｃＤＮＡを含むＤＮＡ断片（約１ｋｂｐ）２５０ｎｇとプラスミドｐＴ７Ｂｌｕｅ Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒ（ノバジェン社製）５０ｎｇを１０μＬの蒸留水に溶解し、ＤＮＡライゲーション・キットＶｅｒ．２（宝酒造社製）のＩ液１０μＬを加え、１６℃で２時間結合反応を行なった。
【００９９】
該反応液を用いてＥ． ｃｏｌｉ ＤＨ５αをコーエンらの方法によって形質転換し、アンピシリン耐性（Ａｍｐｒ）株を得た。この形質転換株からバーンボイム（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ）らの方法（Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ７， １５１３， １９７９）に従ってプラスミドＤＮＡを単離した。得られたプラスミドの構造は制限酵素消化により確認した。また、ＤＮＡシークエンサー３７７（アプライド・バイオシステムズ社製）を用い、塩基配列を決定し、該プラスミドに含まれるヒトＡ３アデノシン受容体ｃＤＮＡの配列を確認した結果、公知のヒトＡ３アデノシン受容体ｃＤＮＡの配列と同じであった。配列番号３に得られたヒトＡ３アデノシン受容体のｃＤＮＡの塩基配列を、配列番号４に該ｃＤＮＡがコードするヒトＡ３アデノシン受容体のアミノ酸配列を示した。以下、このプラスミドをｐＢＳ−ｈＡ３Ｒと称す。ｐＢＳ−ｈＡ３Ｒの構築工程を図１に示した。
【０１００】
実施例２ マウスＡ３アデノシン受容体遺伝子を含むマウスゲノムＤＮＡの単離および解析
（１）マウスＡ３アデノシン受容体遺伝子を含むマウスゲノムＤＮＡのスクリーニング
マウスＡ３アデノシン受容体遺伝子の配列を有するクローンをＰＣＲで判定するためのＰＣＲプライマーを作製した。すなわち、Ｚ． Ｚｈａｏらの報告（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， ５７， １，１９９９）に記載されているマウスＡ３アデノシン受容体遺伝子の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号： ＡＦ０６９７７８）より、エクソン１の一部を含む領域を増幅する、配列番号５で示される塩基配列を有する２３ｍｅｒのプライマーと配列番号６で示される塩基配列を有する２３ｍｅｒのプライマーの組み合わせ（マウスゲノムＤＮＡを鋳型とした場合、配列番号１１の配列の６３５〜９９３番目に相当する約３６０ｂｐの増幅バンドが検出される）、および配列番号７で示される塩基配列を有する２０ｍｅｒのプライマーと配列番号８で示される塩基配列を有する２０ｍｅｒのプライマーの組み合わせ（マウスゲノムＤＮＡを鋳型とした場合、配列番号１１の配列の５２７〜１０８８番目に相当する約５６０ｂｐの増幅バンドが検出される）を選択して作製した。各プライマーを倉敷紡績社のゲノムＤＮＡライブラリーＰＣＲスクリーニングサービスへ送付し、これらのプライマーを用いたＰＣＲによるマウスゲノムＤＮＡライブラリー（ベクターｐＢｅｌｏＢＡＣＩＩ）からのマウスＡ３アデノシン受容体遺伝子のスクリーニングを依頼した。その結果、Ａ３アデノシン受容体遺伝子の配列を含むマウスゲノムＤＮＡが導入されているｐＢｅｌｏＢＡＣＩＩプラスミドを含むＥ． ｃｏｌｉ ＤＨ１０Ｂ株の形質転換体のクローンを得ることができた。
【０１０１】
（２）マウスＡ３アデノシン受容体遺伝子を含むマウスゲノムＤＮＡの単離
上記のＥ． ｃｏｌｉ ＤＨ１０Ｂ株クローンより、バーンボイムらの方法に従ってプラスミドを単離した。該プラスミドをｐｍＡ３Ｒ／ＢｅｌｏＢａｃＩＩと名づけた。次に以下のようにして、得られたプラスミドを各制限酵素で処理し、マウスＡ３アデノシン受容体遺伝子配列を含むラジオアイソトープ標識ＤＮＡプローブを用いてサザンハイブリダイゼーションを行なった。
【０１０２】
まず、上記で単離したｐｍＡ３Ｒ／ＢｅｌｏＢａｃＩＩプラスミド１００ｎｇをＳａｃＩ、ＳａｃＩＩ、ＮｏｔＩ、ＸｂａＩ、ＳｐｅＩ、ＢａｍＨＩ、ＳｍａＩ、ＰｓｔＩ、ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＶ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＣｌａＩ、ＨｉｎｃＩＩ、ＡｃｃＩ、ＳａｌＩ、ＸｈｏＩ、ＡｐａＩ、ＫｐｎＩの各制限酵素（宝酒造社製）を１２単位ずつ用い、添付マニュアルに従って３７℃で６時間消化反応を行なうことにより完全に切断したのち、パルスフィールド装置〔バイオ・ラッド（ＢＩＯ−ＲＡＤ）社製〕を用いたアガロースゲル電気泳動を行ない（分離断片サイズ：５−１５０ｋｂｐ用プログラムを使用）、さらにＳｏｕｔｈｅｒｎの方法（Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ９８， ５０３， １９７５）でナイロンフィルター〔ハイボンド（ＨｙｂｏｎｄＴＭ）−Ｎ＋；アマシャム・バイオサイエンス社製〕へ移した。次に、サザンハイブリダイゼーションに用いるプローブを作製するため、マウスゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行なった。すなわち、エクソン１中のマウスＡ３アデノシン受容体をコードする領域を含むＤＮＡを増幅する配列番号７で示される塩基配列を有する２０ｍｅｒのプライマーと配列番号８で示される塩基配列を有する２０ｍｅｒのプライマー、エクソン２中のマウスＡ３アデノシン受容体をコードする領域を含むＤＮＡを増幅する配列番号９で示される塩基配列を有する２３ｍｅｒのプライマーと配列番号１０で示される塩基配列を有する２３ｍｅｒのプライマーを作製した。これらのプライマーを用い、上記のｐｍＡ３Ｒ／ＢｅｌｏＢａｃＩＩプラスミドを鋳型として、ＰＣＲの反応液を調製し、９４℃で５分間反応させ、続いて９４℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で１分間のサイクルを１０サイクル反復した後、さらに９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で１分間のサイクルを２０サイクル反復し、４℃で一晩保存する条件でＰＣＲを行なった。このＰＣＲ反応液をアガロースゲル電気泳動し、エクソン１中のマウスＡ３アデノシン受容体をコードする領域を含む約５６０ｂｐのＤＮＡ断片、およびエクソン２中のマウスＡ３アデノシン受容体をコードする領域を含む約６００ｂｐのＤＮＡ断片を、ジーンクリーンＩＩキットを用い、添付マニュアルに従って回収した。これらＤＮＡ断片は、市販のＴ７クイックプライム・キット（Ｔ７ ＱｕｉｃｋＰｒｉｍｅ Ｋｉｔ、アマシャム・バイオサイエンス社製）を用いて［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰ（ＮＥＮ社製）で標識した。
【０１０３】
この標識した各プローブと上記で作製したフィルターを一晩ハイブリダイズさせ、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含有する２×ＳＳＰＥ（３００ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、２０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＨ２ＰＯ４、２ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）を用いて６５℃で１５分間の洗浄を３回、０．１％ＳＤＳを含有する０．２×ＳＳＰＥ（３０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、２ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＨ２ＰＯ４、０．２ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）を用いて６５℃で１５分間の洗浄を２回行ない、Ｘ線フィルム〔コダック・サイエンティフィック・イメージング・フィルム（Ｋｏｄａｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｆｉｌｍ）Ｘ−ＯＭＡＴＴＭ ＡＲ、コダック社製〕と重ね合わせて−８０℃で一晩感光させ、翌日現像した。
【０１０４】
このハイブリダイゼーションの結果、ｐｍＡ３Ｒ／ＢｅｌｏＢａｃＩＩプラスミドをＥｃｏＲＩで切断処理することにより、エクソン１を含む約９ｋｂｐのＤＮＡ断片とエクソン２を含む約６．５ｋｂｐのＤＮＡ断片が生じることが示された。
続いて、上記のｐｍＡ３Ｒ／ＢｅｌｏＢａｃＩＩプラスミド５μｇを１００μＬのユニバーサルバッファーＨ（宝酒造社製）に溶解し、６０単位のＥｃｏＲＩを加えて３７℃で１６時間消化反応を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動した後、エクソン１を含む約９ｋｂｐのＤＮＡ断片と、エクソン２を含む約６．５ｋｂｐのＤＮＡ断片を切り出し、ジーンクリーンＩＩキットを用いて、添付マニュアルに従ってＤＮＡ断片を回収した。
【０１０５】
プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ（−）（ストラタジーン社製）１μｇを５０μＬのユニバーサルバッファーＨに溶解し１２単位のＥｃｏＲＩを加えて３７℃で１６時間消化反応を行なった。該反応液をフェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法により約３ｋｂｐのＤＮＡ断片を回収した。回収したＤＮＡを５０μＬのアルカリホスファターゼ用バッファーに溶解し、４０単位のウシ小腸由来のアルカリホスファターゼを加えて５０℃で３時間反応を行なった。フェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法により脱リン酸化された約３ｋｂｐのＤＮＡ断片を回収した。
【０１０６】
ｐｍＡ３Ｒ／ＢｅｌｏＢａｃＩＩプラスミド由来のＥｃｏＲＩ断片であるマウスＡ３アデノシン受容体遺伝子のエクソン１を含むマウスゲノムＤＮＡ断片（約９ｋｂｐ）１０ｎｇおよびマウスＡ３アデノシン受容体のエクソン２を含むマウスゲノムＤＮＡ断片（約６．５ｋｂｐ）１０ｎｇを、各々ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ（−）由来のＥｃｏＲＩ断片（約３ｋｂｐ）４０ｎｇと一緒に１０μＬの蒸留水に溶解し、ライゲーション・キットＶｅｒ．２ Ｉ液１０μＬを加え、１６℃で３時間結合反応を行なった。
【０１０７】
該反応液を用いてＥ． ｃｏｌｉ ＤＨ５αをコーエンらの方法によって形質転換し、Ａｍｐｒ株を得た。この形質転換株からバーンボイムらの方法に従ってプラスミドＤＮＡを単離した。得られたプラスミドの構造は制限酵素消化により確認した。以下、このプラスミドをｐＢＳ−ｅｘ１及びｐＢＳ−ｅｘ２と称す。
【０１０８】
（３）マウスＡ３アデノシン受容体遺伝子を含むマウスゲノムＤＮＡの解析
ｐＢＳ−ｅｘ１およびｐＢＳ−ｅｘ２各１μｇをＳａｃＩ、ＳａｃＩＩ、ＮｏｔＩ、ＸｂａＩ、ＳｐｅＩ、ＢａｍＨＩ、ＳｍａＩ、ＰｓｔＩ、ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＶ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＣｌａＩ、ＨｉｎｃＩＩ、ＡｃｃＩ、ＳａｌＩ、ＸｈｏＩ、ＡｐａＩ、ＫｐｎＩの各制限酵素（宝酒造社製）を１２単位ずつ用い、添付マニュアルに従って３７℃で１６時間消化反応を行なうことにより完全に切断したのち、アガロースゲル電気泳動を行なった。その結果から、Ａ３アデノシン受容体遺伝子のエクソン１およびエクソン２を含む約１５．５ｋｂｐのマウスゲノムＤＮＡに存在する、各制限酵素に対する認識配列の位置を決定した。図２にエクソン１、図３にエクソン２の各制限酵素マップを示した。
次に、ＤＮＡシークエンサー３７７を用い、エクソン１より上流約３００ｂｐの領域から、エクソン２より下流約１．１ｋｂｐの領域までの塩基配列を決定した（図４、配列番号１１）。
【０１０９】
実施例３ マウスＡ３アデノシン受容体遺伝子をヒトＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡに置換するためのターゲットベクターの構築
マウスＡ３アデノシン受容体遺伝子のエクソン１より約５ｋｂｐ上流のＳｍａＩサイトからエクソン２より下流のＨｉｎｃＩＩサイトまでの領域において、マウスＡ３アデノシン受容体をコードする領域およびイントロンを、ヒトＡ３アデノシン受容体ｃＤＮＡのヒトＡ３アデノシン受容体をコードする領域に置換したＤＮＡ、およびマウスＡ３アデノシン受容体遺伝子のエクソン２のＢａｍＨＩサイトからエクソン２より下流のＡｐａＩサイトまでの領域のＤＮＡを含むターゲットベクターｐｌｏｘＰ−ＤＴ−ａｒｍ１−ＨＰＲＴ−ｈＡ３Ｒ−ａｒｍ２を以下に示す（１）〜（１５）の工程で構築した。
【０１１０】
（１）プラスミドｐｌｏｘＰ−ＨＰＲＴ−ｈＡ３Ｒ−ａｒｍ２の構築
２つのｌｏｘＰ配列の間に、ＰＧＫプロモーターの下流につながったｈｐｒｔ遺伝子が存在するプラスミドｐｌｏｘｐＨＰＲＴ２のＳｍａＩ／ＢａｍＨＩサイト間に、マウスＡ３アデノシン受容体遺伝子のエキソン２の非翻訳領域中のＢａｍＨＩサイトからエキソン２の下流のＡｐａＩサイトまでの約２．８ｋｂｐのマウスゲノムＤＮＡを挿入したプラスミドｐｌｏｘＰ−ＨＰＲＴ−ｈＡ３Ｒ−ａｒｍ２を、以下のようにして構築した（図５参照）。
【０１１１】
３μｇの実施例２（２）で作製したプラスミドｐＢＳ−ｅｘ２を、０．０１％ウシ血清アルブミン（以下、ＢＳＡと略す）を含む１００μＬのユニバーサルバッファーＭ（宝酒造社製）に溶解し、７５単位のＸｂａＩを加えて３７℃で１２時間消化反応を行なった。この反応液をフェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収した。ＤＮＡ断片を１００μＬのユニバーサルバッファーＬ（宝酒造社製）に溶解し、７５単位のＡｐａＩを加えて３７℃で１２時間消化反応を行なった。この反応液をフェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収した。ＤＮＡ断片を１０μＬの蒸留水に溶解し、アガロースゲル電気泳動後、約４ｋｂｐのＤＮＡ断片を、ジーンクリーンＩＩキットを用い、添付マニュアルに従って回収した。続いて、ＤＮＡ平滑化キット（宝酒造社製）を用いて、回収したＤＮＡ断片の両末端を添付マニュアルに従って平滑化処理した。該反応液をフェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収した。このＤＮＡ断片を１５μＬのユニバーサルバッファーＫ（宝酒造社製）に溶解し、７．５単位のＢａｍＨＩを加えて３７℃で１０時間消化反応を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動後、約２．８ｋｂｐのＤＮＡ断片を、ジーンクリーンＩＩキットを用い、添付マニュアルに従って回収した。この断片は、マウスＡ３アデノシン受容体遺伝子のエクソン２の非翻訳領域中のＢａｍＨＩサイトから下流のＡｐａＩサイトまで約２．８ｋｂｐに相当するゲノムＤＮＡであり、エクソン２の非翻訳領域中のポリアデニル化シグナルを含む。
【０１１２】
プラスミドｐｌｏｘｐＨＰＲＴ２（ＷＯ ０１／３３９５７）２．８μｇを０．０１％ＢＳＡを含む１００μＬのユニバーサルバッファーＴ（宝酒造社製）に溶解し、７５単位のＳｍａＩを加えて３７℃で１６時間消化反応を行なった。該反応液をフェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収した。ＤＮＡ断片を１００μＬのユニバーサルバッファーＫに溶解し、７５単位のＢａｍＨＩを加えて３７℃で１２時間消化反応を行なった。該反応液をフェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収し、２０μＬの蒸留水に溶解した。
【０１１３】
上記で得た、Ａ３アデノシン受容体のエクソン２を含むマウスゲノムＤＮＡ断片（約２．８ｋｂｐ）９０ｎｇとプラスミドｐｌｏｘｐＨＰＲＴ２由来のＳｍａＩ−ＢａｍＨＩ断片（約５．７ｋｂｐ）５０ｎｇを１０μＬの蒸留水に溶解し、ライゲーション・キットＶｅｒ．２ Ｉ液１０μＬを加え、１６℃で１６時間結合反応を行なった。
該反応液を用いてＥ． ｃｏｌｉ ＤＨ５αをコーエンらの方法によって形質転換し、Ａｍｐｒ株を得た。この形質転換株からバーンボイムらの方法に従ってプラスミドＤＮＡを単離した。得られたプラスミドの構造は制限酵素消化により確認した。また、ＤＮＡシークエンサー３７７を用い、塩基配列を決定し、該プラスミドに含まれる配列を確認した。以下、このプラスミドをｐｌｏｘＰ−ＨＰＲＴ−ｈＡ３Ｒ−ａｒｍ２と称す。
【０１１４】
（２）プラスミドｐｌｏｘＰ−ＲＥ−ＨＰＲＴ−ｈＡ３Ｒ−ａｒｍ２の構築
（１）で構築したｐｌｏｘＰ−ＨＰＲＴ−ｈＡ３Ｒ−ａｒｍ２にＥｃｏＲＩとＳａｃＩＩの認識配列を付加したプラスミドｐｌｏｘＰ−ＲＥ−ＨＰＲＴ−ｈＡ３Ｒ−ａｒｍ２を以下のようにして構築した（図６参照）。
【０１１５】
２μｇのプラスミドｐｌｏｘＰ−ＨＰＲＴ−ｈＡ３Ｒ−ａｒｍ２を１００μＬのユニバーサルバッファーＫに溶解し、４０単位のＨｐａＩを加えて３７℃で１６時間消化反応を行なった。該反応液をフェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収した。このＤＮＡ断片を１００μＬのユニバーサルバッファーＬに溶解し、５０単位のＫｐｎＩを加えて３７℃で１６時間消化反応を行なった。該反応液をフェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収した。ＤＮＡ断片を蒸留水１５μＬに溶解した後、アガロースゲル電気泳動し、約９ｋｂｐのＤＮＡ断片を、ジーンクリーンＩＩキットを用い、添付マニュアルに従って回収した。
【０１１６】
続いて、配列番号１２で示される３８ｍｅｒの合成オリゴＤＮＡ、および配列番号１３で示される３４ｍｅｒの合成オリゴＤＮＡを作製し、各１０ｐｍｏｌずつを蒸留水１００μＬに加え、９０℃で１０分間熱したのち室温に戻すことによりアニーリングさせた。
上記で得た、プラスミドｐｌｏｘＰ−ＨＰＲＴ−ｈＡ３Ｒ−ａｒｍ２由来のＨｐａＩ−ＫｐｎＩ断片（約９ｋｂｐ）３０ｎｇとアニーリング済み合成オリゴＤＮＡ ０．２ｐｍｏｌを１０μＬの蒸留水に溶解し、ライゲーション・キットＶｅｒ．２ Ｉ液１０μＬを加え、１６℃で１時間結合反応を行なった。
【０１１７】
該反応液を用いてＥ． ｃｏｌｉ ＤＨ５αをコーエンらの方法によって形質転換し、Ａｍｐｒ株を得た。この形質転換株からバーンボイムらの方法に従ってプラスミドＤＮＡを単離した。得られたプラスミドの構造は制限酵素消化により確認した。また、ＤＮＡシークエンサー３７７を用い、塩基配列を決定し、該プラスミドに含まれる配列を確認した。以下、このプラスミドをｐｌｏｘＰ−ＲＥ−ＨＰＲＴ−ｈＡ３Ｒ−ａｒｍ２と称す。
【０１１８】
（３）プラスミドＡ３Ｒ−Ｃ１の構築
マウスＡ３アデノシン受容体遺伝子のエクソン２に存在するポリアデニル化シグナルを含む約１．８ｋｂｐのマウスゲノムＤＮＡを有するプラスミドＡ３Ｒ−Ｃ１を以下のようにして構築した（図７参照）。
【０１１９】
５μｇのプラスミドｐＢＳ−ｅｘ２を１００μＬのユニバーサルバッファーＫに溶解し、３０単位のＰｓｔＩと３０単位のＢａｍＨＩを加えて３７℃で１６時間消化反応を行なったのち、該反応液をフェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収した。ＤＮＡ断片を蒸留水２０μＬに溶解し、アガロースゲル電気泳動後、約１．８ｋｂｐのＤＮＡ断片を、ジーンクリーンＩＩキットを用い、添付マニュアルに従って回収した。
【０１２０】
２．８μｇのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ（−）を１００μＬのユニバーサルバッファーＫに溶解し、３０単位のＰｓｔＩと３０単位のＢａｍＨＩを加えて３７℃で２４時間消化反応を行なった。該反応液をフェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収した。
上記で得た、Ａ３アデノシン受容体遺伝子のエクソン２に存在するポリアデニル化シグナルを含むマウスゲノムＤＮＡ断片（約１．８ｋｂｐ）１００ｎｇとｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ（−）由来のＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩ断片（約３ｋｂｐ）３０ｎｇを１０μＬの蒸留水に溶解し、ライゲーション・キットＶｅｒ．２ Ｉ液１０μＬを加え、１６℃で２時間結合反応を行なった。
【０１２１】
該反応液を用いてＥ． ｃｏｌｉ ＤＨ５αをコーエンらの方法によって形質転換し、Ａｍｐｒ株を得た。この形質転換株からバーンボイムらの方法に従ってプラスミドＤＮＡを単離した。得られたプラスミドの構造は制限酵素消化により確認した。また、ＤＮＡシークエンサー３７７を用い、塩基配列を決定し、該プラスミドに含まれる配列を確認した。以下、このプラスミドをＡ３Ｒ−Ｃ１と称す。
【０１２２】
（４）プラスミドＡ３Ｒ−Ｃ２の構築
プラスミドＡ３Ｒ−Ｃ１からポリアデニル化シグナルより下流の配列を約１．６ｋｂｐ除き、かつその下流にＳａｃＩＩ認識配列を付加したプラスミドＡ３Ｒ−Ｃ２を以下のようにして構築した（図８参照）。
【０１２３】
２μｇのプラスミドＡ３Ｒ−Ｃ１を１００μＬのユニバーサルバッファーＭに溶解し、５０単位のＨｉｎｃＩＩを加えて３７℃で１６時間消化反応を行なったのち、該反応液をフェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収した。ＤＮＡ断片を１００μＬのユニバーサルバッファーＬに溶解し、５０単位のＫｐｎＩを加えて３７℃で１６時間消化反応を行なった。該反応液をフェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収した。ＤＮＡ断片を蒸留水２０μＬに溶解したのちアガロースゲル電気泳動を行ない、約３．２ｋｂｐのＤＮＡ断片を、ジーンクリーンＩＩキットを用い、添付マニュアルに従って回収した。
【０１２４】
続いて、配列番号１４で示される１７ｍｅｒの合成オリゴＤＮＡ、および配列番号１５で示される１３ｍｅｒの合成オリゴＤＮＡを作製し、各１０ｐｍｏｌずつを蒸留水１００μＬに加え、９０℃で１０分間熱したのち室温に戻すことにより各合成オリゴＤＮＡをアニーリングさせた。
上記で得た、マウスゲノムＤＮＡの配列約１．６ｋｂｐを取り除いたプラスミドＡ３Ｒ−Ｃ１由来のＨｉｎｃＩＩ−ＫｐｎＩ断片（約３．２ｋｂｐ）３０ｎｇとアニーリング済み合成オリゴＤＮＡ ０．２ｐｍｏｌを１０μＬの蒸留水に溶解し、ライゲーション・キットＶｅｒ．２ Ｉ液１０μＬを加え、１６℃で１時間結合反応を行なった。
【０１２５】
該反応液を用いてＥ． ｃｏｌｉ ＤＨ５αをコーエンらの方法によって形質転換し、Ａｍｐｒ株を得た。この形質転換株からバーンボイムらの方法に従ってプラスミドＤＮＡを単離した。得られたプラスミドの構造は制限酵素消化により確認した。以下、このプラスミドをＡ３Ｒ−Ｃ２と称す。
【０１２６】
（５）プラスミドＡ３Ｒ−Ｃ３の構築
ヒトＡ３アデノシン受容体ｃＤＮＡのＡ３アデノシン受容体をコードする領域（停止コドンを含む）の３’端１３ｂｐの下流に、マウスＡ３アデノシン受容体遺伝子エクソン２の停止コドンより下流３８０ｂｐを付加した配列を有するプラスミドＡ３Ｒ−Ｃ３を、以下のようにして構築した（図９参照）。
【０１２７】
ヒトＡ３アデノシン受容体ｃＤＮＡのＡ３アデノシン受容体をコードする領域（停止コドンを含む）の３’端１３ｂｐをマウスＡ３アデノシン受容体遺伝子エクソン２の停止コドンより下流３８０ｂｐの５’側に付加するため、マウスゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行なった。すなわち、ヒトＡ３アデノシン受容体ｃＤＮＡのＡ３アデノシン受容体をコードする領域（停止コドンを含む）の３’端１３ｂｐの配列を含む配列番号１６で示される塩基配列を有する２７ｍｅｒのプライマー、およびマウスＡ３アデノシン受容体遺伝子エクソン２の配列に基いた配列番号１７で示される塩基配列を有する２４ｍｅｒのプライマーを作製した。これらのプライマーを用い、ｐＢＳ−ｅｘ２を鋳型として、ＰＣＲの反応液を調製し、９４℃で５分間反応させ、続いて９４℃で１分間、５８℃で３０秒間、７２℃で１分間のサイクルを８サイクル反復した後、さらに９４℃で１分間、６８℃で２分間のサイクルを２２サイクル反復し、４℃で一晩保存する条件でＰＣＲを行なった。このＰＣＲ反応液をフェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法により約３８０ｂｐのＤＮＡ断片を回収した。５０μＬのユニバーサルバッファーＫに溶解し、３７．５単位のＢａｍＨＩを加えて３７℃で２０時間消化反応を行なった。続いて該反応液をフェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収した。ＤＮＡ断片を２０μＬのユニバーサルバッファーＨに溶解し、１２単位のＥｃｏＲＩを加えて３７℃で１６時間消化反応を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動して、約３８０ｂｐのＤＮＡ断片を、ジーンクリーンＩＩキットを用い、添付マニュアルに従って回収した。
【０１２８】
２．８μｇのプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ（−）を５０μＬのユニバーサルバッファーＫに溶解し、３０単位のＢａｍＨＩを加えて３７℃で１６時間消化反応を行なった。該反応液をエタノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収した。続いて、このＤＮＡ断片を２０μＬのユニバーサルバッファーＨに溶解し、１２単位のＥｃｏＲＩを加えて３７℃で１６時間消化反応を行なった。該反応液をエタノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法により約３ｋｂｐのＤＮＡ断片を回収した。
【０１２９】
上記で得た、ヒトＡ３アデノシン受容体ｃＤＮＡのＡ３アデノシン受容体をコードする領域（停止コドンを含む）の３’端１３ｂｐの下流に、マウスＡ３アデノシン受容体遺伝子エクソン２の停止コドンより下流３８０ｂｐを付加した配列を有するＤＮＡ断片（約３８０ｂｐ）２５ｎｇと、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ（−）由来のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片（約３ｋｂｐ）５０ｎｇを１０μＬの蒸留水に溶解し、ライゲーション・キットＶｅｒ．２ Ｉ液１０μＬを加え、１６℃で１時間結合反応を行なった。
【０１３０】
該反応液を用いてＥ． ｃｏｌｉ ＤＨ５αをコーエンらの方法によって形質転換し、Ａｍｐｒ株を得た。この形質転換株からバーンボイムらの方法に従ってプラスミドＤＮＡを単離した。得られたプラスミドの構造は制限酵素消化により確認した。また、ＤＮＡシークエンサー３７７を用い、塩基配列を決定し、該プラスミドに含まれる配列を確認した。以下、このプラスミドをＡ３Ｒ−Ｃ３と称す。
【０１３１】
（６）プラスミドＡ３Ｒ−Ｃ４の構築
プラスミドＡ３Ｒ−Ｃ３のマウスＡ３アデノシン受容体遺伝子エクソン２に由来する配列の下流に、ポリアデニル化シグナルを含むマウスゲノムＤＮＡ配列を付加したプラスミドＡ３Ｒ−Ｃ４を以下のようにして構築した（図１０参照）。
【０１３２】
１μｇのプラスミドＡ３Ｒ−Ｃ２を、０．０１％ＢＳＡを含む１００μＬのユニバーサルバッファーＴに溶解し、２０単位のＳａｃＩＩを加えて３７℃で２０時間消化反応を行なった。該反応液をフェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収した。このＤＮＡ断片を２０μＬのユニバーサルバッファーＫに溶解し、１５単位のＢａｍＨＩを加えて３７℃で１６時間消化反応を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動し、約１５０ｂｐのＤＮＡ断片を、ジーンクリーンＩＩキットを用い、添付マニュアルに従って回収した。
【０１３３】
２μｇのプラスミドＡ３Ｒ−Ｃ３を、０．０１％ＢＳＡを含む１００μＬのユニバーサルバッファーＴに溶解し、２０単位のＳａｃＩＩを加えて３７℃で２０時間消化反応を行なった。該反応液をフェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収した。このＤＮＡ断片を２０μＬのユニバーサルバッファーＫに溶解し、１５単位のＢａｍＨＩを加えて３７℃で１６時間消化反応を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動し、約３．４ｋｂｐのＤＮＡ断片を、ジーンクリーンＩＩキットを用い、添付マニュアルに従って回収した。
【０１３４】
上記で得た、プラスミドＡ３Ｒ−Ｃ２由来の、Ａ３アデノシン受容体遺伝子のエクソン２に存在するポリアデニル化シグナルを含むマウスゲノムＤＮＡ断片（約１５０ｂｐ）１０ｎｇとプラスミドＡ３Ｒ−Ｃ３由来のＳａｃＩＩ−ＢａｍＨＩ断片（約３．４ｋｂｐ）５０ｎｇを１０μＬの蒸留水に溶解し、ライゲーション・キットＶｅｒ．２ Ｉ液１０μＬを加え、１６℃で２時間結合反応を行なった。
【０１３５】
該反応液を用いてＥ． ｃｏｌｉ ＤＨ５αをコーエンらの方法によって形質転換し、Ａｍｐｒ株を得た。この形質転換株からバーンボイムらの方法に従ってプラスミドＤＮＡを単離した。得られたプラスミドの構造は制限酵素消化により確認した。また、ＤＮＡシークエンサー３７７を用い、塩基配列を決定し、該プラスミドに含まれる配列を確認した。以下、このプラスミドをＡ３Ｒ−Ｃ４と称す。
【０１３６】
（７）プラスミドｐｌｏｘＰ−ＲＥ−Ｃ−ＨＰＲＴ−ｈＡ３Ｒ−ａｒｍ２の構築
プラスミドｐｌｏｘＰ−ＲＥ−ＨＰＲＴ−ｈＡ３Ｒ−ａｒｍ２のｈｐｒｔ遺伝子の上流に、プラスミドＡ３Ｒ−Ｃ４由来のＤＮＡ断片（ヒトＡ３アデノシン受容体ｃＤＮＡのＡ３アデノシン受容体をコードする領域の３’端１３ｂｐの下流に、ポリアデニル化シグナルを含む、マウスゲノムＤＮＡのＡ３アデノシン受容体遺伝子の停止コドンより下流のＨｉｎｃＩＩサイトまでの領域を付加したＤＮＡ）を導入した、プラスミドｐｌｏｘＰ−ＲＥ−Ｃ−ＨＰＲＴ−ｈＡ３Ｒ−ａｒｍ２を以下のようにして構築した（図１１参照）。
【０１３７】
３μｇのプラスミドＡ３Ｒ−Ｃ４を、０．０１％のＢＳＡを含む１００μＬのユニバーサルバッファーＴに溶解し、５０単位のＳａｃＩＩを加えて３７℃で１６時間消化反応を行なった。該反応液をフェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収した。このＤＮＡ断片を２０μＬのユニバーサルバッファーＨに溶解し、１２単位のＥｃｏＲＩを加えて３７℃で６時間消化反応を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動し、約５００ｂｐのＤＮＡ断片を、ジーンクリーンＩＩキットを用い、添付マニュアルに従って回収した。
【０１３８】
３．２μｇのプラスミドｐｌｏｘＰ−ＲＥ−ＨＰＲＴ−ｈＡ３Ｒ−ａｒｍ２を、０．０１％のＢＳＡを含む１００μＬのユニバーサルバッファーＴに溶解し、５０単位のＳａｃＩＩを加えて３７℃で１６時間消化反応を行なった。該反応液をフェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収した。このＤＮＡ断片を２０μＬのユニバーサルバッファーＨに溶解し、１２単位のＥｃｏＲＩを加えて３７℃で６時間消化反応を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動し、約８．５ｋｂｐのＤＮＡ断片を、ジーンクリーンＩＩキットを用い、添付マニュアルに従って回収した。
【０１３９】
上記で得たプラスミドＡ３Ｒ−Ｃ４由来のＳａｃＩＩ−ＥｃｏＲＩ断片（約５００ｂｐ）５０ｎｇとプラスミドｐｌｏｘＰ−ＲＥ−ＨＰＲＴ−ｈＡ３Ｒ−ａｒｍ２由来のＳａｃＩＩ−ＥｃｏＲＩ断片（約８．５ｋｂｐ）２００ｎｇを１０μＬの蒸留水に溶解し、ライゲーション・キットＶｅｒ．２ Ｉ液１０μＬを加え、１６℃で２時間結合反応を行なった。
該反応液を用いてＥ． ｃｏｌｉ ＤＨ５αをコーエンらの方法によって形質転換し、Ａｍｐｒ株を得た。この形質転換株からバーンボイムらの方法に従ってプラスミドＤＮＡを単離した。得られたプラスミドの構造は制限酵素消化により確認した。また、ＤＮＡシークエンサー３７７を用い、塩基配列を決定し、該プラスミドに含まれる配列を確認した。以下、このプラスミドをｐｌｏｘＰ−ＲＥ−Ｃ−ＨＰＲＴ−ｈＡ３Ｒ−ａｒｍ２と称す。
【０１４０】
（８）プラスミドＡ３Ｒ−Ｎ１の構築
マウスＡ３アデノシン受容体遺伝子の開始コドンより上流約３５０ｂｐのマウスゲノムＤＮＡ配列を有するプラスミドＡ３Ｒ−Ｎ１を以下のようにして構築した（図１２参照）。
【０１４１】
マウスＡ３アデノシン受容体遺伝子の開始コドンより上流３５０ｂｐのマウスゲノムＤＮＡ断片を得るため、プラスミドｐＢＳ−ｅｘ１を鋳型としてＰＣＲを行なった。すなわち、マウスＡ３アデノシン受容体遺伝子の塩基配列に基いて配列番号１８で示される塩基配列を有する２７ｍｅｒのプライマー、および配列番号１９で示される塩基配列を有する２８ｍｅｒのプライマーを作製した。これらのプライマーを用い、ｐＢＳ−ｅｘ１を鋳型として、ＰＣＲの反応液を調製し、９４℃で５分間反応させ、続いて９４℃で１分間、５２℃で３０秒間、７２℃で１分間のサイクルを８サイクル反復した後、さらに９４℃で１分間、６８℃で２分間のサイクルを２２サイクル反復し、４℃で一晩保存する条件でＰＣＲを行なった。このＰＣＲ反応液をフェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法により約３５０ｂｐのＤＮＡ断片を回収した。ＤＮＡ断片を１００μＬのユニバーサルバッファーＫに溶解し、７５単位のＢａｍＨＩを加えて３７℃で２０時間消化反応を行なった。続いて該反応液をフェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収した。ＤＮＡ断片を１００μＬのユニバーサルバッファーＨに溶解し、６０単位のＥｃｏＲＩを加えて３７℃で１６時間消化反応を行なった。該反応液をフェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収した。ＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動して、約３５０ｂｐのＤＮＡ断片を、ジーンクリーンＩＩキットを用い、添付マニュアルに従って回収した。
【０１４２】
２．８μｇのプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ（−）を５０μＬのユニバーサルバッファーＫに溶解し３０単位のＢａｍＨＩを加えて３７℃で１６時間消化反応を行なった。該反応液をエタノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収した。続いて、このＤＮＡ断片を２０μＬのユニバーサルバッファーＨに溶解し、１２単位のＥｃｏＲＩを加えて３７℃で１６時間消化反応を行なった。該反応液をエタノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法により約３ｋｂｐのＤＮＡ断片を回収した。
【０１４３】
上記で得た、マウスＡ３アデノシン受容体遺伝子の開始コドンより上流約３５０ｂｐのＤＮＡ断片５０ｎｇとプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ（−）由来のＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片（約３ｋｂｐ）５０ｎｇを１０μＬの蒸留水に溶解し、ライゲーション・キットＶｅｒ．２ Ｉ液１０μＬを加え、１６℃で２時間結合反応を行なった。
該反応液を用いてＥ． ｃｏｌｉ ＤＨ５αをコーエンらの方法によって形質転換し、Ａｍｐｒ株を得た。この形質転換株からバーンボイムらの方法に従ってプラスミドＤＮＡを単離した。得られたプラスミドの構造は制限酵素消化により確認した。また、ＤＮＡシークエンサー３７７を用い、塩基配列を決定し、該プラスミドに含まれる配列を確認した。以下、このプラスミドをＡ３Ｒ−Ｎ１と称す。
【０１４４】
（９）プラスミドＡ３Ｒ−Ｎ２の構築
ヒトＡ３アデノシン受容体ｃＤＮＡの開始コドンより下流約２００ｂｐの塩基配列を有するプラスミドＡ３Ｒ−Ｎ２を以下のようにして構築した（図１３参照）。
【０１４５】
ヒトＡ３アデノシン受容体ｃＤＮＡ配列の開始コドンより下流約２００ｂｐのＤＮＡ断片を得るため、プラスミドｐＢＳ−ｈＡ３Ｒを鋳型としてＰＣＲを行なった。すなわち、ヒトＡ３アデノシン受容体ｃＤＮＡの配列に基いて配列番号２０で示される塩基配列を有する２８ｍｅｒのプライマー、および配列番号２１で示される塩基配列を有する２６ｍｅｒのプライマーを作製した。これらのプライマーを用い、ｐＢＳ−ｈＡ３Ｒを鋳型として、ＰＣＲの反応液を調製し、９４℃で５分間反応させ、続いて９４℃で１分間、５２℃で３０秒間、７２℃で１分間のサイクルを８サイクル反復した後、さらに９４℃で１分間、６８℃で２分間のサイクルを２２サイクル反復し、４℃で一晩保存する条件でＰＣＲを行なった。
【０１４６】
このＰＣＲ反応液をフェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法により約３５０ｂｐのＤＮＡ断片を回収した。ＤＮＡ断片を１００μＬのユニバーサルバッファーＫに溶解し、７５単位のＢａｍＨＩを加えて３７℃で２０時間消化反応を行なった。続いて該反応液をフェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収した。ＤＮＡ断片を１００μＬのユニバーサルバッファーＨに溶解し、６０単位のＥｃｏＲＩを加えて３７℃で１６時間消化反応を行なった。該反応液をフェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収した。ＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動して、約２００ｂｐのＤＮＡ断片を、ジーンクリーンＩＩキットを用い、添付マニュアルに従って回収した。
【０１４７】
２．８μｇのプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ（−）を５０μＬのユニバーサルバッファーＫに溶解し３０単位のＢａｍＨＩを加えて３７℃で１６時間消化反応を行なった。該反応液をエタノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収した。続いて、このＤＮＡ断片を２０μＬのユニバーサルバッファーＨに溶解し、１２単位のＥｃｏＲＩを加えて３７℃で１６時間消化反応を行なった。該反応液をエタノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法により約３ｋｂｐのＤＮＡ断片を回収した。
【０１４８】
上記で得た、ヒトＡ３アデノシン受容体ｃＤＮＡの開始コドンより下流約２００ｂｐのＤＮＡ断片５０ｎｇとプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ（−）由来のＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片（約３ｋｂｐ）５０ｎｇを１０μＬの蒸留水に溶解し、ライゲーション・キットＶｅｒ．２ Ｉ液１０μＬを加え、１６℃で２時間結合反応を行なった。
該反応液を用いてＥ． ｃｏｌｉ ＤＨ５αをコーエンらの方法によって形質転換し、Ａｍｐｒ株を得た。この形質転換株からバーンボイムらの方法に従ってプラスミドＤＮＡを単離した。得られたプラスミドの構造は制限酵素消化により確認した。また、ＤＮＡシークエンサー３７７を用い、塩基配列を決定し、該プラスミドに含まれる配列を確認した。以下、このプラスミドをＡ３Ｒ−Ｎ２と称す。
【０１４９】
（１０）プラスミドＡ３Ｒ−Ｎ３の構築
プラスミドＡ３Ｒ−Ｎ１のマウスＡ３アデノシン受容体遺伝子の開始コドンより５’側の配列の下流に、プラスミドＡ３Ｒ−Ｎ２由来のＤＮＡ断片（ヒトＡ３アデノシン受容体ｃＤＮＡの開始コドンより下流約２００ｂｐのＤＮＡ断片）を導入した、プラスミドＡ３Ｒ−Ｎ３を以下のようにして構築した（図１４参照）。
【０１５０】
２．３μｇのプラスミドＡ３Ｒ−Ｎ２を、４０μＬのユニバーサルバッファーＨに溶解し、１２単位のＥｃｏＲＩと１０単位のＳｐｈＩを加えて３７℃で２０時間消化反応を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動し、約２００ｂｐのＤＮＡ断片を、ジーンクリーンＩＩキットを用い、添付マニュアルに従って回収した。
１．６μｇのプラスミドＡ３Ｒ−Ｎ１を、４０μＬのユニバーサルバッファーＨに溶解し、１２単位のＥｃｏＲＩと１０単位のＳｐｈＩを加えて３７℃で２０時間消化反応を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動し、約３．３５ｋｂｐのＤＮＡ断片を、ジーンクリーンＩＩキットを用い、添付マニュアルに従って回収した。
【０１５１】
上記で得た、プラスミドＡ３Ｒ−Ｎ２由来のＥｃｏＲＩ−ＳｐｈＩ断片（約２００ｂｐ）１０ｎｇとプラスミドＡ３Ｒ−Ｎ１由来のＥｃｏＲＩ−ＳｐｈＩ断片（約３．３５ｋｂｐ）５０ｎｇを１０μＬの蒸留水に溶解し、ライゲーション・キットＶｅｒ．２ Ｉ液１０μＬを加え、１６℃で２時間結合反応を行なった。
該反応液を用いてＥ． ｃｏｌｉ ＤＨ５αをコーエンらの方法によって形質転換し、Ａｍｐｒ株を得た。この形質転換株からバーンボイムらの方法に従ってプラスミドＤＮＡを単離した。得られたプラスミドの構造は制限酵素消化により確認した。また、ＤＮＡシークエンサー３７７を用い、塩基配列を決定し、該プラスミドに含まれる配列を確認した。以下、このプラスミドをＡ３Ｒ−Ｎ３と称す。
【０１５２】
（１１）プラスミドＡ３Ｒ−Ｎ４の構築
マウスＡ３アデノシン受容体遺伝子の開始コドンより上流約３５０ｂｐの塩基配列の下流にヒトＡ３アデノシン受容体ｃＤＮＡ（開始コドン以降の領域）をつなげた配列を有するプラスミドＡ３Ｒ−Ｎ４を以下のようにして構築した。（図１５参照）。
【０１５３】
０．７μｇのプラスミドＡ３Ｒ−Ｎ３を、０．０１％のＢＳＡを含む１００μＬのユニバーサルバッファーＫに溶解し、５０単位のＮｃｏＩを加えて３７℃で２０時間消化反応を行なった。該反応液をエタノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収した。続いて、このＤＮＡ断片を２０μＬのユニバーサルバッファーＬに溶解し、１０単位のＳａｃＩを加えて３７℃で１６時間消化反応を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動して、約４００ｂｐのＤＮＡ断片を、ジーンクリーンＩＩキットを用い、添付マニュアルに従って回収した。
【０１５４】
さらに、２．２μｇのプラスミドｐＢＳ−ｈＡ３Ｒを、０．０１％のＢＳＡを含む１００μＬのユニバーサルバッファーＫに溶解し、５０単位のＮｃｏＩを加えて３７℃で２０時間消化反応を行なった。該反応液をエタノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収した。続いてＤＮＡ断片を１００μＬのユニバーサルバッファーＬに溶解し、５０単位のＳａｃＩを加えて３７℃で１６時間消化反応を行なった。該反応液をエタノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収した。このＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動し、約４ｋｂｐのＤＮＡ断片を、ジーンクリーンＩＩキットを用い、添付マニュアルに従って回収した。
【０１５５】
上記で得た、プラスミドＡ３Ｒ−Ｎ４由来のＮｃｏＩ−ＳａｃＩ断片（約４００ｂｐ）２０ｎｇとプラスミドｐＢＳ−ｈＡ３Ｒ由来のＮｃｏＩ−ＳａｃＩ断片（約４ｋｂｐ）５０ｎｇを１０μＬの蒸留水に溶解し、ライゲーション・キットＶｅｒ．２ Ｉ液１０μＬを加え、１６℃で２時間結合反応を行なった。
該反応液を用いてＥ． ｃｏｌｉ ＤＨ５αをコーエンらの方法によって形質転換し、Ａｍｐｒ株を得た。この形質転換株からバーンボイムらの方法に従ってプラスミドＤＮＡを単離した。得られたプラスミドの構造は制限酵素消化により確認した。また、ＤＮＡシークエンサー３７７を用い、塩基配列を決定し、該プラスミドに含まれる配列を確認した。以下、このプラスミドをＡ３Ｒ−Ｎ４と称す。
【０１５６】
（１２）プラスミドＡ３Ｒ−Ｎ５の構築
マウスＡ３アデノシン受容体遺伝子のエクソン１よりも上流５ｋｂｐのマウスゲノムＤＮＡの配列を有するプラスミドＡ３Ｒ−Ｎ５を以下のようにして構築した（図１６参照）。
【０１５７】
３．３μｇのプラスミドｐＢＳ−ｅｘ１を、０．０１％のＢＳＡを含む２０μＬのユニバーサルバッファーＴに溶解し、４単位のＳｍａＩと５単位のＳａｃＩを加えて３７℃で２０時間消化反応を行なったのち、該反応液をアガロースゲル電気泳動し、約５ｋｂｐのＤＮＡ断片を、ジーンクリーンＩＩキットを用い、添付マニュアルに従って回収した。
１．１μｇのプラスミドｐＢＳ−ｈＡ３Ｒを、５０μＬのユニバーサルバッファーＨに溶解し、２０単位のＮｄｅＩを加えて３７℃で１６時間消化反応を行なった。該反応液をエタノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収した。続いてＤＮＡ平滑化キット（宝酒造社製）を用い、回収したＤＮＡ断片の両末端を添付マニュアルに従って平滑化処理した。該反応液をフェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収した。このＤＮＡ断片を４０μＬのユニバーサルバッファーＨに溶解し、２０単位のＳａｃＩを加えて３７℃で１６時間消化反応を行なったのち、該反応液をアガロースゲル電気泳動し、約３ｋｂｐのＤＮＡ断片を、ジーンクリーンＩＩキットを用い、添付マニュアルに従って回収した。
【０１５８】
上記で得た、プラスミドｐＢＳ−ｅｘ１由来のＤＮＡ断片（約５ｋｂｐ）１μｇとプラスミドｐＢＳ−ｈＡ３Ｒ由来のＮｄｅＩ（平滑末端処理済み）−ＳａｃＩ断片（約３ｋｂｐ）５０ｎｇを１０μＬの蒸留水に溶解し、ライゲーション・キットＶｅｒ．２ Ｉ液１０μＬを加え、１６℃で１６時間結合反応を行なった。
該反応液を用いてＥ． ｃｏｌｉ ＤＨ５αをコーエンらの方法によって形質転換し、Ａｍｐｒ株を得た。この形質転換株からバーンボイムらの方法に従ってプラスミドＤＮＡを単離した。得られたプラスミドの構造は制限酵素消化により確認した。また、ＤＮＡシークエンサー３７７を用い、塩基配列を決定し、該プラスミドに含まれる配列を確認した。以下、このプラスミドをＡ３Ｒ−Ｎ５と称す。
【０１５９】
（１３）プラスミドＡ３Ｒ−Ｎ６の構築
マウスＡ３アデノシン受容体遺伝子の開始コドンよりも上流約５．４ｋｂｐのマウスゲノムＤＮＡの配列の下流にヒトＡ３アデノシン受容体ｃＤＮＡ（開始コドン以降）をつないだ配列を有するプラスミドＡ３Ｒ−Ｎ６を以下のようにして構築した（図１７参照）。
【０１６０】
３μｇのプラスミドＡ３Ｒ−Ｎ４を、５０μＬのユニバーサルバッファーＬに溶解し、２０単位のＳａｃＩを加えて３７℃で２０時間消化反応を行なった。該反応液をエタノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収した。続いてＤＮＡ断片を２０μＬのユニバーサルバッファーＨに溶解し、１２単位のＥｃｏＲＩを加えて３７℃で１６時間消化反応を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動し、約１．２ｋｂｐのＤＮＡ断片を、ジーンクリーンＩＩキットを用い、添付マニュアルに従って回収した。
【０１６１】
３．４μｇのプラスミドＡ３Ｒ−Ｎ５を、５０μＬのユニバーサルバッファーＬに溶解し、２０単位のＳａｃＩを加えて３７℃で２０時間消化反応を行なった。該反応液をエタノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収した。続いてＤＮＡ断片を２０μＬのユニバーサルバッファーＨに溶解し、１２単位のＥｃｏＲＩを加えて３７℃で１６時間消化反応を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動し、約９ｋｂｐのＤＮＡ断片を、ジーンクリーンＩＩキットを用い、添付マニュアルに従って回収した。
【０１６２】
上記で得た、プラスミドＡ３Ｒ−Ｎ４由来のＳａｃＩ−ＥｃｏＲＩ断片（約１．２ｋｂｐ）６０ｎｇとプラスミドＡ３Ｒ−Ｎ５由来のＳａｃＩ−ＥｃｏＲＩ断片（約９ｋｂｐ）５０ｎｇを１０μＬの蒸留水に溶解し、ライゲーション・キットＶｅｒ．２ Ｉ液１０μＬを加え、１６℃で１６時間結合反応を行なった。
該反応液を用いてＥ． ｃｏｌｉ ＤＨ５αをコーエンらの方法によって形質転換し、Ａｍｐｒ株を得た。この形質転換株からバーンボイムらの方法に従ってプラスミドＤＮＡを単離した。得られたプラスミドの構造は制限酵素消化により確認した。以下、このプラスミドをＡ３Ｒ−Ｎ６と称す。
【０１６３】
（１４）ｐｌｏｘＰ−ａｒｍ１−ＨＰＲＴ−ｈＡ３Ｒ−ａｒｍ２の構築
マウスＡ３アデノシン受容体遺伝子の開始コドンよりも５’側約５．４ｋｂｐのマウスゲノムＤＮＡの配列の下流にヒトＡ３アデノシン受容体ｃＤＮＡ（コード領域）およびマウスＡ３アデノシン受容体遺伝子の停止コドンより３’側にあるＨｉｎｃＩＩサイトまでのマウスゲノムＤＮＡの配列をつなげた配列を、プラスミドｐｌｏｘＰ−ＲＥ−ＨＰＲＴ−ｈＡ３Ｒ−ａｒｍ２のｈｐｒｔ遺伝子の上流に挿入したプラスミドｐｌｏｘＰ−ａｒｍ１−ＨＰＲＴ−ｈＡ３Ｒ−ａｒｍ２を以下のようにして構築した（図１８参照）。
【０１６４】
１．５μｇの（１３）で作製したプラスミドＡ３Ｒ−Ｎ６を、５０μＬのユニバーサルバッファーＭに溶解し、５０単位のＳｐｅＩを加えて３７℃で２０時間消化反応を行なった。該反応液をエタノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収した。続いてＤＮＡ断片を２０μＬのユニバーサルバッファーＨに溶解し、１２単位のＥｃｏＲＩを加えて３７℃で１６時間消化反応を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動し、約７ｋｂｐのＤＮＡ断片を、ジーンクリーンＩＩキットを用い、添付マニュアルに従って回収した。
【０１６５】
２μｇの（７）で作製したプラスミドｐｌｏｘＰ−ＲＥ−Ｃ−ＨＰＲＴ−ｈＡ３Ｒ−ａｒｍ２を、１００μＬのユニバーサルバッファーＭに溶解し、５０単位のＮｈｅＩを加えて３７℃で２０時間消化反応を行なった。該反応液をエタノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収した。続いてＤＮＡ断片を２０μＬのユニバーサルバッファーＨに溶解し、１２単位のＥｃｏＲＩを加えて３７℃で１６時間消化反応を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動し、約９ｋｂｐのＤＮＡ断片を、ジーンクリーンＩＩキットを用い、添付マニュアルに従って回収した。
【０１６６】
上記で得た、プラスミドＡ３Ｒ−Ｎ６由来のＳｐｅＩ−ＥｃｏＲＩＤＮＡ断片（約７ｋｂｐ）１０ｎｇとプラスミドｐｌｏｘＰ−ＲＥ−Ｃ−ＨＰＲＴ−ｈＡ３Ｒ−ａｒｍ２由来のＮｈｅＩ−ＥｃｏＲＩ断片（約９ｋｂｐ）５０ｎｇを１０μＬの蒸留水に溶解し、ライゲーション・キットＶｅｒ．２ Ｉ液１０μＬを加え、１６℃で２０時間結合反応を行なった。
該反応液を用いてＥ． ｃｏｌｉ ＤＨ５αをコーエンらの方法によって形質転換し、Ａｍｐｒ株を得た。この形質転換株からバーンボイムらの方法に従ってプラスミドＤＮＡを単離した。得られたプラスミドの構造は制限酵素消化により確認した。また、ＤＮＡシークエンサー３７７を用い、塩基配列を決定し、該プラスミドに含まれる配列を確認した。以下、このプラスミドをｐｌｏｘＰ−ａｒｍ１−ＨＰＲＴ−ｈＡ３Ｒ−ａｒｍ２と称す。
【０１６７】
（１５）プラスミドｐｌｏｘＰ−ＤＴ−ａｒｍ１−ＨＰＲＴ−ｈＡ３Ｒ−ａｒｍ２の構築
プラスミドｐｌｏｘＰ−ａｒｍ１−ＨＰＲＴ−ｈＡ３Ｒ−ａｒｍ２のマウスＡ３アデノシン受容体遺伝子の開始コドンよりも上流約５．４ｋｂｐの配列の上流にジフテリア毒素（ＤＴ）発現ユニット（ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅＩＩプロモーターの下流にＤＴ遺伝子とＳＶ４０由来のポリアデニル化シグナルをつなげた配列）を挿入した、プラスミドｐｌｏｘＰ−ＤＴ−ａｒｍ１−ＨＰＲＴ−ｈＡ３Ｒ−ａｒｍ２を以下のようにして構築した（図１９参照）。
【０１６８】
３．５５μｇのプラスミドｐＫＯ ＳｅｌｅｃｔＤＴ（レキシコン・ジェネティックス社製）を、４０μＬのＮＥバッファー４〔ニュー・イングランド・バイオラブズ（Ｎｅｗ ＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）社製〕に溶解し、２単位のＲｓｒＩＩ（ニュー・イングランド・バイオラブズ社製）を加えて３７℃で２４時間消化反応を行なった。該反応液をフェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収した。続いて、ＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動し、約１．３ｋｂｐのＤＮＡ断片を、ジーンクリーンＩＩキットを用い、添付マニュアルに従って回収した。
【０１６９】
３μｇの（１４）で構築したプラスミドｐｌｏｘＰ−ａｒｍ１−ＨＰＲＴ−ｈＡ３Ｒ−ａｒｍ２を、１００μＬのＮＥバッファー４に溶解し、５単位のＲｓｒＩＩを加えて３７℃で２４時間消化反応を行なった。該反応液をフェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収した。続いて、ＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動し、約１６ｋｂｐのＤＮＡ断片を、ジーンクリーンＩＩキットを用い、添付マニュアルに従って回収した。
【０１７０】
上記で得た、プラスミドｐＫＯ ＳｅｌｅｃｔＤＴ由来のＲｓｒＩＩ断片（約１．３ｋｂｐ）５０ｎｇとプラスミドｐｌｏｘＰ−ａｒｍ１−ＨＰＲＴ−ｈＡ３Ｒ−ａｒｍ２由来のＲｓｒＩＩ断片（約１６ｋｂｐ）１００ｎｇを１０μＬの蒸留水に溶解し、ライゲーション・キットＶｅｒ．２ Ｉ液１０μＬを加え、１６℃で１６時間結合反応を行なった。
該反応液を用いてＥ． ｃｏｌｉ ＤＨ５αをコーエンらの方法によって形質転換し、Ａｍｐｒ株を得た。この形質転換株からバーンボイムらの方法に従ってプラスミドＤＮＡを単離した。得られたプラスミドの構造は制限酵素消化により確認した。また、ＤＮＡシークエンサー３７７を用い、塩基配列を決定し、該プラスミドに含まれる配列を確認した。以下、このプラスミドをｐｌｏｘＰ−ＤＴ−ａｒｍ１−ＨＰＲＴ−ｈＡ３Ｒ−ａｒｍ２と称す。
【０１７１】
実施例４ ヒトＡ３アデノシン受容体の発現ベクターの構築
（１）プラスミドｐｏｌｙＡ ｉｎ ｐＢＳの構築
ＳＶ４０のポリアデニル化シグナルを含むプラスミドｐｏｌｙＡ ｉｎ ｐＢＳを以下のようにして構築した（図２０参照）。
【０１７２】
プラスミドｐＣＡＧ−ＧＦＰ−ｐＨＰＲＴｐ（ＷＯ ０１／３３９５７）のＳＶ４０のポリアデニル化シグナルを含む配列番号２２で示される塩基配列を有する２６ｍｅｒのプライマー、および配列番号２３で示される塩基配列を有する３５ｍｅｒのプライマーを作製した。これらのプライマーを用い、プラスミドｐＣＡＧ−ＧＦＰ−ｐＨＰＲＴｐを鋳型として、ＰＣＲの反応液を調製し、９４℃で５分間反応させ、続いて９４℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で１分間のサイクルを３０サイクル反復し、４℃で一晩保存する条件でＰＣＲを行なった。このＰＣＲ反応液をフェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収した。ＤＮＡ断片を０．０１％ＢＳＡを含む４０μＬのユニバーサルバッファーＴに溶解し、１５単位のＸｂａＩおよび１０単位のＳａｃＩＩを加えて３７℃で１６時間消化反応を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動後、ＳＶ４０のポリアデニル化シグナルを含む約３００ｂｐのＤＮＡ断片を、ジーンクリーンＩＩキットを用い、添付マニュアルに従って回収した。
【０１７３】
３μｇのプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ（−）を０．０１％ＢＳＡを含む４０μＬのユニバーサルバッファーＴに溶解し、１５単位のＸｂａＩおよび１０単位のＳａｃＩＩを加えて３７℃で１６時間消化反応を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動し、約３ｋｂｐのＤＮＡ断片を、ジーンクリーンＩＩキットを用い、添付マニュアルに従って回収した。
上記で得た、ＳＶ４０のポリアデニル化シグナルを含むＤＮＡ断片（約３００ｂｐ）１００ｎｇとプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ（−）由来のＸｂａＩ−ＳａｃＩＩ断片（約３ｋｂｐ）１００ｎｇを１０μＬの蒸留水に溶解し、ライゲーション・キットＶｅｒ．２のＩ液１０μＬを加え、１６℃で２時間結合反応を行なった。
【０１７４】
該反応液を用いてＥ． ｃｏｌｉ ＤＨ５αをコーエンらの方法によって形質転換し、Ａｍｐｒ株を得た。この形質転換株からバーンボイムらの方法に従ってプラスミドＤＮＡを単離した。得られたプラスミドの構造は制限酵素消化により確認した。また、ＤＮＡシークエンサー３７７を用い、塩基配列を決定し、該プラスミドに含まれるＳＶ４０のポリアデニル化シグナルを確認した。以下、このプラスミドをｐｏｌｙＡ ｉｎ ｐＢＳと称す。
【０１７５】
（２）ｈＡ３Ｒ ｉｎ ｐＢＳの構築
Ｎ末端にＦＬＡＧタグが付加されたヒトＡ３アデノシン受容体をコードする配列を有するプラスミドｈＡ３Ｒ ｉｎ ｐＢＳを以下のようにして構築した（図２１参照）。
【０１７６】
ヒトＡ３アデノシン受容体ｃＤＮＡの配列に基づいて、ＦＬＡＧタグをコードする配列を含む配列番号２４で示される塩基配列を有する５５ｍｅｒのプライマー、および配列番号２５で示される塩基配列を有する３０ｍｅｒのプライマーを作製した。これらのプライマーを用い、プラスミドｐＢＳ−ｈＡ３Ｒを鋳型として、ＰＣＲの反応液を調製し、９４℃で５分間反応させ、続いて９４℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で１分間のサイクルを３０サイクル反復し、４℃で一晩保存する条件でＰＣＲを行なった。このＰＣＲ反応液をフェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収した。ＤＮＡ断片を０．０１％ＢＳＡを含む５０μＬのユニバーサルバッファーＭに溶解し、３７．５単位のＸｂａＩを加えて３７℃で１６時間消化反応を行なった。該反応液をフェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収した。ＤＮＡ断片を４０μＬのユニバーサルバッファーＨに溶解し、２４単位のＥｃｏＲＩを加えて３７℃で１６時間消化反応を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動後、Ｎ末端にＦＬＡＧタグが付加されたヒトＡ３アデノシン受容体をコードする配列を含む約１ｋｂｐのＤＮＡ断片を、ジーンクリーンＩＩキットを用い、添付マニュアルに従って回収した。
【０１７７】
３μｇのプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ（−）を０．０１％ＢＳＡを含む４０μＬのユニバーサルバッファーＭに溶解し、３０単位のＸｂａＩを加えて３７℃で１６時間消化反応を行なった。該反応液をフェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収した。このＤＮＡ断片４０μＬのユニバーサルバッファーＨに溶解し、２４単位のＥｃｏＲＩを加えて３７℃で１６時間消化反応を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動し、約３ｋｂｐのＤＮＡ断片を、ジーンクリーンＩＩキットを用い、添付マニュアルに従って回収した。
【０１７８】
上記で得た、Ｎ末端にＦＬＡＧタグが付加されたヒトＡ３アデノシン受容体をコードする配列を含むＤＮＡ断片（約１ｋｂｐ）１００ｎｇとプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ（−）由来のＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩ断片（約３ｋｂｐ）５０ｎｇを１０μＬの蒸留水に溶解し、ライゲーション・キットＶｅｒ．２ Ｉ液１０μＬを加え、１６℃で２時間結合反応を行なった。
該反応液を用いてＥ． ｃｏｌｉ ＤＨ５αをコーエンらの方法によって形質転換し、Ａｍｐｒ株を得た。この形質転換株からバーンボイムらの方法に従ってプラスミドＤＮＡを単離した。得られたプラスミドの構造は制限酵素消化により確認した。また、ＤＮＡシークエンサー３７７を用い、塩基配列を決定し、該プラスミドに含まれるＮ末端にＦＬＡＧタグが付加されたヒトＡ３アデノシン受容体をコードする配列を確認した。以下、このプラスミドをｈＡ３Ｒ ｉｎ ｐＢＳと称す。
【０１７９】
（３）プラスミドｈＡ３Ｒ−ｐｏｌｙＡ ｉｎ ｐＢＳの構築
Ｎ末端にＦＬＡＧタグが付加されたヒトＡ３アデノシン受容体をコードする配列の下流にＳＶ４０のポリアデニル化シグナルを付加したプラスミドｈＡ３Ｒ−ｐｏｌｙＡ ｉｎ ｐＢＳを以下のようにして構築した（図２２参照）。
【０１８０】
１．２５μｇの上記（２）で作製したプラスミドｈＡ３Ｒ ｉｎ ｐＢＳを０．０１％ＢＳＡを含む４０μＬのユニバーサルバッファーＭに溶解し、３０単位のＸｂａＩを加えて３７℃で１６時間消化反応を行なった。この反応液をフェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収した。ＤＮＡ断片を２０μＬのユニバーサルバッファーＨに溶解し、１２単位のＥｃｏＲＩを加えて３７℃で６時間消化反応を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動後、Ｎ末端にＦＬＡＧタグが付加されたヒトＡ３アデノシン受容体をコードする配列を含む約１ｋｂｐのＤＮＡ断片を、ジーンクリーンＩＩキットを用い、添付マニュアルに従って回収した。
【０１８１】
２．５μｇの上記（１）で作製したプラスミドｐｏｌｙＡ ｉｎ ｐＢＳを０．０１％ＢＳＡを含む５０μＬのユニバーサルバッファーＭに溶解し、３０単位のＸｂａＩを加えて３７℃で１６時間消化反応を行なった。この反応液をフェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収した。回収したＤＮＡ断片を４０μＬのユニバーサルバッファーＨに溶解し、２４単位のＥｃｏＲＩを加えて３７℃で１６時間消化反応を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動後、約３．３ｋｂｐのＤＮＡ断片を、ジーンクリーンＩＩキットを用い、添付マニュアルに従って回収した。
【０１８２】
上記で得た、Ｎ末端にＦＬＡＧタグが付加されたヒトＡ３アデノシン受容体をコードする配列を含むＤＮＡ断片（約１ｋｂｐ）４０ｎｇとプラスミドｐｏｌｙＡ ｉｎ ｐＢＳ由来のＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩ断片（約３．３ｋｂｐ）５０ｎｇを１０μＬの蒸留水に溶解し、ライゲーション・キットＶｅｒ．２ Ｉ液１０μＬを加え、１６℃で３時間結合反応を行なった。
該反応液を用いてＥ． ｃｏｌｉ ＤＨ５αをコーエンらの方法によって形質転換し、Ａｍｐｒ株を得た。この形質転換株からバーンボイムらの方法に従ってプラスミドＤＮＡを単離した。得られたプラスミドの構造は制限酵素消化により確認した。また、ＤＮＡシークエンサー３７７を用い、塩基配列を決定し、該プラスミドに含まれる配列を確認した。以下、このプラスミドをｈＡ３Ｒ−ｐｏｌｙＡ ｉｎ ｐＢＳと称す。
【０１８３】
（４）ヒトＡ３アデノシン受容体の発現ベクターｈＡ３Ｒ ｉｎ ｐＣＡＧの構築
ＣＡＧプロモーターを含む、Ｎ末端にＦＬＡＧタグが付加されたヒトＡ３アデノシン受容体の発現ベクターｈＡ３Ｒ ｉｎ ｐＣＡＧを、以下のようにして構築した（図２３参照）。
【０１８４】
３μｇの上記（３）で作製したプラスミドｈＡ３Ｒ−ｐｏｌｙＡ ｉｎ ｐＢＳを４０μＬのユニバーサルバッファーＨに溶解し、１２単位のＥｃｏＲＩと１５単位のＥｃｏＲＶを加えて３７℃で１６時間消化反応を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動し、約１．５ｋｂｐのＤＮＡ断片（Ｎ末端にＦＬＡＧタグが付加されたヒトＡ３アデノシン受容体をコードする配列の下流にＳＶ４０のポリアデニル化シグナルを含むＤＮＡ断片）を、ジーンクリーンＩＩキットを用い、添付マニュアルに従って回収した。
【０１８５】
４μｇのプラスミドｐＣＡＧ−ＧＦＰ−ｐＨＰＲＴｐを、５０μＬのユニバーサルバッファーＫに溶解し、２０単位のＨｐａＩを加えて３７℃で１６時間消化反応を行なった。この反応液をフェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収した。４０μＬのユニバーサルバッファーＨに溶解し、２４単位のＥｃｏＲＩを加えて３７℃で１６時間消化反応を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動後、約８ｋｂｐのＤＮＡ断片を、ジーンクリーンＩＩキットを用い、添付マニュアルに従って回収した。
【０１８６】
上記で得た、プラスミドｈＡ３Ｒ−ｐｏｌｙＡ ｉｎ ｐＢＳ由来のＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＶ断片（約１．５ｋｂｐ）１００ｎｇとｐＣＡＧ−ＧＦＰ−ｐＨＰＲＴｐ由来のＥｃｏＲＩ−ＨｐａＩ断片（約８ｋｂｐ）５０ｎｇを１０μＬの蒸留水に溶解し、ライゲーション・キットＶｅｒ．２のＩ液１０μＬを加え、１６℃で３時間結合反応を行なった。
該反応液を用いてＥ． ｃｏｌｉ ＤＨ５αをコーエンらの方法によって形質転換し、Ａｍｐｒ株を得た。この形質転換株からバーンボイムらの方法に従ってプラスミドＤＮＡを単離した。得られたプラスミドの構造は制限酵素消化により確認した。また、ＤＮＡシークエンサー３７７を用い、塩基配列を決定し、該プラスミドに含まれる配列を確認した。以下、このプラスミドをｈＡ３Ｒ ｉｎ ｐＣＡＧと称す。
【０１８７】
実施例５ ヒトＡ３アデノシン受容体の発現ベクターの哺乳類細胞への導入と特異的薬物の反応性の評価
（１）一過性発現による薬物反応性の評価
宿主細胞マウスミエローマ細胞Ｐ３．Ｘ６３／Ａｇ８．Ｕ１（以下、Ｐ３Ｕ１と略す）に、アポエクオリンの発現プラスミドｐＣＡＧ−ＡＥＱ−ｐＨＰＲＴｐを導入した安定形質転換細胞株であるクローン２１△ｈｐｒｔ株（ＷＯ ０１／３３９５７）に、実施例４（４）で構築したヒトＡ３アデノシン受容体発現プラスミドｈＡ３Ｒ ｉｎ ｐＣＡＧを導入し、ヒトＡ３アデノシン受容体の一過的発現細胞株を作製した。クローン２１△ｈｐｒｔ株が発現するアポエクオリンは発光基質セレンテラジンおよび分子状酸素と蛋白質複合体エクオリンを形成し、エクオリンはＣａ２＋との結合により発光する。
【０１８８】
クローン２１△ｈｐｒｔ細胞株へのプラスミドｈＡ３Ｒ ｉｎ ｐＣＡＧの導入は、エレクトロポレーション法により以下のようにして行なった。
該細胞株を８×１０６個／ｍＬになるようにＫ−ＰＢＳ緩衝液（１３７ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＣｌ、２．７ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ、８．１ｍｍｏｌ／Ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４、１．５ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４、４ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２）に懸濁し、この細胞懸濁液２００μＬと４μｇのプラスミドｈＡ３Ｒ ｉｎ ｐＣＡＧをエレクトロポレーション用キュベット〔ジーン・パルサー・キュベット（Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ Ｃｕｖｅｔｔｅ）、電極間距離２ｍｍ、バイオラッド（ＢＩＯＲＡＤ）社製〕に入れ、パルス電圧０．２５ｋＶ、電気容量１２５μＦの条件で遺伝子導入し、１０ｍＬのＦＣＳを含むＲＰＭＩ １６４０培地（インビトロジェン社製）に懸濁後、３７℃、５％ＣＯ２条件下で２４時間培養した。
【０１８９】
この一過性発現細胞株を用いて、ヒトＡ３アデノシン受容体がマウス細胞内において正常に機能することができるかを検証するため、Ａ３アデノシン受容体に特異的なアゴニストであるクロロ−Ｎ６−（３−ヨードベンジル）−アデノシン−５’−Ｎ−メチルウロンアミド〔ｃｈｌｏｒｏ−Ｎ６−（３−ｉｏｄｏｂｅｎｚｙｌ）−ａｄｅｎｏｓｉｎｅ−５’−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｕｒｏｎａｍｉｄｅ、以下Ｃｌ−ＩＢ−ＭＥＣＡと略す〕（Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｓｃｉ．， １９， ５， １９９８）に対する応答性（細胞内Ｃａ２＋上昇量）を以下のようにしてエクオリンの発光量で評価した。コントロール細胞として、ヒトＡ３アデノシン受容体発現プラスミドを導入していないクローン２１△ｈｐｒｔ株についても、Ｃｌ−ＩＢ−ＭＥＣＡに対する応答性を調べた。
【０１９０】
培養後、各細胞株を１×１０６個／ｍｌになるように１０μｍｏｌ／Ｌのセレンテラジン〔モレキュラー・プローブズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）社製〕を含むＲＰＭＩ １６４０培地に懸濁し、培養用ガラスチューブ（岩城硝子社製）へ懸濁液を１００μＬずつ分注して４時間培養した。
培養後、各細胞株の発光量を１秒間毎に５秒間、ルミノメーターＡｕｔｏ Ｌｕｍａｔ ＬＢ９５３〔ＥＧ＆Ｇベルトールド（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ）社製〕で測定したのち、２μｍｏｌ／ＬのＣｌ−ＩＢ−ＭＥＣＡ溶液（１０ｍｍｏｌ／ＬになるようにＤＭＳＯに懸濁した溶液をＲＰＭＩ １６４０培地で希釈した溶液）を各培養用ガラスチューブへ１００μＬずつ添加し、添加直後からの発光量を１秒間毎に６０秒間測定した。また、コントロールとして、Ｃｌ−ＩＢ−ＭＥＣＡが含まれていないＤＭＳＯを用いて同様の測定を行なった。
【０１９１】
本測定の結果を図２４に示す。Ｃｌ−ＩＢ−ＭＥＣＡを最終濃度１μｍｏｌ／Ｌで加えた結果、ヒトＡ３アデノシン受容体発現プラスミドを導入していないコントロール細胞株と比較して、ヒトＡ３アデノシン受容体を一過性発現させた細胞株では約２倍のエクオリン発光量の上昇がみられた。
以上の結果より、マウス細胞で一過性発現させたヒトＡ３アデノシン受容体が、Ａ３アデノシン受容体特異的なアゴニストに対して正常な応答性（Ｃａ２＋上昇）を有することが示された。
【０１９２】
（２）安定発現株を用いた薬物反応性の評価
クローン２１△ｈｐｒｔ株に、実施例４（４）で構築したヒトＡ３アデノシン受容体発現プラスミドｈＡ３Ｒ ｉｎ ｐＣＡＧを導入し、ヒトＡ３アデノシン受容体の安定発現細胞株を作製した。この安定発現細胞株を用いて、ヒトＡ３アデノシン受容体がマウス細胞内において正常に機能することができるかを検証するため、Ａ３アデノシン受容体に特異的なアゴニストであるＣｌ−ＩＢ−ＭＥＣＡに対する応答性（細胞内Ｃａ２＋上昇量）をエクオリンの発光量で評価した。
【０１９３】
クローン２１△ｈｐｒｔ細胞株へのプラスミドｈＡ３Ｒ ｉｎ ｐＣＡＧの導入は、（１）に記載したエレクトロポレーション法に準じて行なった。遺伝子導入し、１０ｍＬのＦＣＳを含むＲＰＭＩ １６４０培地に懸濁後、３７℃、５％ＣＯ２条件下で２４時間培養した。培養後、ＨＡＴ培地添加物〔ＨＡＴ−Ｍｅｄｉａ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ （５０×）、ベーリンガー・マンハイム・バイオケミカ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ）社製、アミノプテリン、ヒポキサンチンおよびチミジンを含む〕を２００μＬ添加し、さらに６日間培養することでアミノプテリン耐性株を取得した。取得した薬剤耐性株の生細胞数を計測し、５個／ｍＬになるように、２％ＨＴ培地添加物（ＨＴ−Ｍｅｄｉａ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（５０×）、ベーリンガー・マンハイム・バイオケミカ社製、ヒポキサンチンおよびチミジンを含む）および１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ １６４０培地を用いて希釈し、１００μＬ／穴で９６穴プレートに播種した。１週間後、単一コロニーを形成した穴の細胞を回収することにより、プラスミドｈＡ３Ｒ ｉｎ ｐＣＡＧを導入した細胞群から４クローンの細胞株を得ることができた。各クローンは１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ １６４０培地を用いて拡大培養を行なった。
【０１９４】
培養後、各細胞株のＣｌ−ＩＢ−ＭＥＣＡに対する応答性を（１）に記載した方法に準じて測定した。各プラスミドを導入していないコントロール細胞株（クローン△ｈｐｒｔ細胞株）と比較して、ヒトＡ３アデノシン受容体を発現させた細胞株では、４クローン株中３クローン株で有意な発光量の上昇がみられた（図２５参照）。特にクローン４は、コントロール細胞株と比べて６倍以上の上昇がみられた。
【０１９５】
以上の結果より、マウス細胞で安定発現させたヒトＡ３アデノシン受容体がＡ３アデノシン受容体特異的なアゴニストに対して正常な応答性（Ｃａ２＋上昇）を有することが示された。
【０１９６】
実施例６ 相同組換え体を検出するためのサザンハイブリダイゼーションに用いる５’側および３’側プローブの作製
（１）５’側プローブの作製
実施例３で作製したターゲットベクターによって相同組換えが正確に行われたかどうかは、サザンハイブリダイゼーションにより解析するが、そのサザンハイブリダイゼーションで用いる５’側プローブとする、ターゲットベクターに含まれるマウスＡ３アデノシン受容体遺伝子のエクソン１の上流のマウスゲノム配列よりもさらに５’側のゲノム配列を含むＤＮＡを以下のようにして作製した（図２６参照）。
【０１９７】
３μｇのプラスミドｐＢＳ−ｅｘ１を０．０１％のＢＳＡを含む２０μＬのユニバーサルバッファーＴに溶解し、８単位のＳｍａＩを加えて３７℃で１６時間消化反応を行なった。該反応液をフェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収した。ＤＮＡ断片を２０μＬのユニバーサルバッファーＬに溶解し、１０単位のＳａｃＩを加えて３７℃で６時間消化反応を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動し、約１．２ｋｂｐのＤＮＡ断片を、ジーンクリーンＩＩキットを用い、添付マニュアルに従って回収した。
【０１９８】
５μｇのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ（−）を０．０１％ＢＳＡを含む５０μＬのユニバーサルバッファーＴに溶解し、２４単位のＳｍａＩを加えて３７℃で１６時間消化反応を行なった。該反応液をフェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収した。ＤＮＡ断片を４０μＬのユニバーサルバッファーＬに溶解し、２０単位のＳａｃＩを加えて３７℃で６時間消化反応を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動し、約３ｋｂｐのＤＮＡ断片を、ジーンクリーンＩＩキットを用い、添付マニュアルに従って回収した。
【０１９９】
上記で得た、マウスＡ３アデノシン受容体遺伝子のエクソン１よりも上流のマウスゲノムＤＮＡ断片（約１．２ｋｂｐ）１００ｎｇとｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ（−）由来のＳｍａＩ−ＳａｃＩ断片（約３ｋｂｐ）１００ｎｇを１０μＬの蒸留水に溶解し、ライゲーション・キットＶｅｒ．２のＩ液１０μＬを加え、１６℃で２時間結合反応を行なった。
該反応液を用いてＥ． ｃｏｌｉ ＤＨ５αをコーエンらの方法によって形質転換し、Ａｍｐｒ株を得た。この形質転換株からバーンボイムらの方法に従ってプラスミドＤＮＡを単離した。得られたプラスミドの構造は制限酵素消化により確認した。また、ＤＮＡシークエンサー３７７を用い、塩基配列を決定し、該プラスミドに含まれるマウスゲノム配列を確認した。配列番号２６にその塩基配列を示す。以下、このプラスミドをｐＢＳ−ｐｒｏｂｅ５’と称す。
【０２００】
サザンハイブリダイゼーションで用いる５’側プローブは、プラスミドｐＢＳ−ｐｒｏｂｅ５’を鋳型としたＰＣＲにより作製した。すなわち、プラスミドｐＢＳ−ｐｒｏｂｅ５’に含まれるマウスゲノム配列に基づいて、配列番号２７で示される塩基配列を有する２６ｍｅｒのプライマー、および配列番号２８で示される塩基配列を有する２６ｍｅｒのプライマーを作製した。これらのプライマーおよび、鋳型としてｐＢＳ−ｐｒｏｂｅ５’を用いてＰＣＲの反応液を調製し、９４℃で５分間反応させ、続いて９４℃で１分間、６０℃で３０秒間、７２℃で１分間のサイクルを３０サイクル反復し、４℃で一晩保存する条件でＰＣＲを行なった。このＰＣＲ反応液をアガロースゲル電気泳動して約３００ｂｐのＤＮＡ断片を、ジーンクリーンＩＩキットを用い、添付マニュアルに従って回収した。以下、このＤＮＡ断片を５’側プローブとして用いる。
【０２０１】
（２）３’側プローブの作製
サザンハイブリダイゼーションで用いる３’側プローブとする、ターゲットベクターに含まれるマウスＡ３アデノシン受容体遺伝子のエクソン２よりも下流のマウスゲノム配列よりもさらに３’側のマウスゲノム配列を含むＤＮＡを以下のようにして作製した（図２７参照）。
【０２０２】
３μｇのプラスミドｐＢＳ−ｅｘ２を２０μＬのユニバーサルバッファーＭに溶解し、１０単位のＮｈｅＩを加えて３７℃で１６時間消化反応を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動し、約６００ｂｐのＤＮＡ断片を、ジーンクリーンＩＩキットを用い、添付マニュアルに従って回収した。
３μｇのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ（−）を４０μＬのユニバーサルバッファーＭに溶解し、２０単位のＳｐｅＩを加えて３７℃で１６時間消化反応を行なったのち、該反応液をアガロースゲル電気泳動し、約３ｋｂｐのＤＮＡ断片を、ジーンクリーンＩＩキットを用い、添付マニュアルに従って回収した。次に、回収したＤＮＡを５０μＬのアルカリホスファターゼ用バッファーに溶解し、４０単位のウシ小腸由来のアルカリホスファターゼを加えて５０℃で３０分間反応を行ない、フェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿法により末端が脱リン酸化された約３ｋｂｐのＤＮＡ断片を回収した。
【０２０３】
上記で得た、マウスＡ３アデノシン受容体のエクソン２よりも下流のマウスゲノムＤＮＡ断片（約６００ｂｐ）１００ｎｇとｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ（−）由来のＳｐｅＩ断片（約３ｋｂｐ）１００ｎｇを１０μＬの蒸留水に溶解し、ライゲーション・キットＶｅｒ．２のＩ液１０μＬを加え、１６℃で２時間結合反応を行なった。
該反応液を用いてＥ． ｃｏｌｉ ＤＨ５αをコーエンらの方法によって形質転換し、Ａｍｐｒ株を得た。この形質転換株からバーンボイムらの方法に従ってプラスミドＤＮＡを単離した。得られたプラスミドの構造は制限酵素消化により確認した。また、ＤＮＡシークエンサー３７７を用い、塩基配列を決定し、該プラスミドに含まれるマウスゲノム配列を確認した。配列番号２９にその塩基配列を示す。以下、このプラスミドをｐＢＳ−ｐｒｏｂｅ３’と称す。
【０２０４】
サザンハイブリダイゼーションで用いる３’側プローブを作製するため、プラスミドｐＢＳ−ｐｒｏｂｅ３’を鋳型としてＰＣＲを行なった。すなわち、プラスミドｐＢＳ−ｐｒｏｂｅ３’に含まれるマウスゲノムＤＮＡ配列に基づいて、配列番号３０で示される塩基配列を有する２６ｍｅｒのプライマー、および配列番号３１で示される塩基配列を有する２６ｍｅｒのプライマーを作製した。これらのプライマーおよび、鋳型としてｐＢＳ−ｐｒｏｂｅ３’を用いてＰＣＲの反応液を調製し、９４℃で５分間反応させ、続いて９４℃で１分間、６８℃で２分間のサイクルを３０サイクル反復し、４℃で一晩保存する条件でＰＣＲを行なった。このＰＣＲ反応液をアガロースゲル電気泳動して、約２４０ｂｐのＤＮＡ断片を、ジーンクリーンＩＩキットを用い、添付マニュアルに従って回収した。以下、このＤＮＡ断片を３’側プローブとして用いる。
【０２０５】
実施例７ ヒトＡ３アデノシン受容体を発現するトランスジェニックマウスの作出（１）ＥＳ細胞へのターゲットベクターの導入
マウスＥＳ細胞ＡＢ２．２（レキシコン・ジェネティクス社製、カタログ番号Ｃ１００、以下ＡＢ２．２細胞と称す）の培養は、Ｍ１５培地〔１５％ＦＣＳ（レキシコン・ジェネティクス社製、カタログ番号Ｂ１００）、１０−４ｍｏｌ／Ｌのβメルカプトエタノール（レキシコン・ジェネティクス社製、カタログ番号Ｍ２６０）、２ｍｍｏｌ／ＬのＬ−グルタミン（レキシコン・ジェネティクス社製）、５０単位／ｍＬのペニシリンおよび５０μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（レキシコン・ジェネティクス社製、カタログ番号Ｍ２５０）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、レキシコン・ジェネティクス社製、カタログ番号Ｍ２０５）〕を用いて、フィーダープレート上で３７℃、５％ＣＯ２条件下で行なった。
【０２０６】
フィーダープレートは、以下のようにゼラチンコート処理を施した細胞培養用ディッシュにマイトマイシンＣ処理したマウス胚線維芽細胞（レキシコン・ジェネティクス社製、カタログ番号Ｃ２００、以下、ＳＴＯ細胞と称す）を培養して作製した。まず、０．１％ゼラチン溶液（レキシコン・ジェネティクス社製、カタログ番号Ｍ２１０）で２時間以上、細胞培養用ディッシュ（９６穴プレート、２４穴プレート、３ｃｍディッシュ、６ｃｍディッシュ、８．５ｃｍディッシュ）の培養面を覆うことによりゼラチンコート処理を行なった。続いて、購入したＳＴＯ細胞を融解後、ＳＴＯ培地（７％のＦＣＳ、２ｍｍｏｌ／ＬのＬ−グルタミン、５０単位／ｍＬのペニシリンおよび５０μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ）に４．４×１０５個／ｍＬになるよう懸濁し、ゼラチンコート処理を施した細胞培養用ディッシュに、９６穴プレートには０．０７ｍＬ／穴、２４穴プレートには０．５ｍＬ／穴、３ｃｍディッシュには２ｍＬ／枚、６ｃｍディッシュには４ｍＬ／枚、８．５ｃｍディッシュには１２ｍＬ／枚を播種し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で４８時間以上培養したものをフィーダープレートとした。
【０２０７】
ＡＢ２．２細胞はＭ１５培地に懸濁した後、フィーダープレートに播種して培養を開始した。Ｍ１５培地は９６穴プレートには０．１ｍＬ／穴、３ｃｍディッシュには２ｍＬ／枚、６ｃｍディッシュには４ｍＬ／枚、８．５ｃｍディッシュには１０ｍＬ／枚、マルチディッシュおよび２４穴プレートには０．５ｍＬ／穴を使用した。細胞がコンフルエントに到達する前に以下のようにして継代を行なった。まず、継代に先駆け、２時間前にＭ１５培地を交換した。細胞をＰＢＳ（レキシコン・ジェネティクス社製）で２回洗浄した後、９６穴プレートには０．０２５ｍＬ／穴、２４穴プレートには０．２５ｍＬ／穴、３ｃｍディッシュには１ｍＬ／枚、６ｃｍディッシュには２ｍＬ／枚、８．５ｃｍディッシュには２ｍＬ／枚の０．０４％ＥＤＴＡを含む０．２５％トリプシン溶液（レキシコン・ジェネティクス社製、カタログ番号Ｍ２２０、以下、トリプシン溶液と略す）を添加し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で１５分間放置した。等量のＭ１５培地を添加し、３ｍＬトランスファーピペット（ファルコン社製、カタログ番号７５７５）を用いて４０回激しくピペッティングし細胞を分散させた。細胞を含む溶液から、遠心分離により細胞を沈殿させて回収した。回収した細胞をＭ１５培地に再び懸濁し、新しいフィーダープレート上に播種することで継代を行なった。
【０２０８】
ＡＢ２．２細胞へのターゲットベクターｐｌｏｘＰ−ＤＴ−ａｒｍ１−ＨＰＲＴ−ｈＡ３Ｒ−ａｒｍ２の導入は、以下のようにして、エレクトロポレーション法により行なった。実施例３（１５）で得られたターゲットベクターｐｌｏｘＰ−ＤＴ−ａｒｍ１−ＨＰＲＴ−ｈＡ３Ｒ−ａｒｍ２は、制限酵素ＳａｌＩで切断して直鎖状にし、フェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿を行ない、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡを含む１ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ８．０）に溶解したものを用いた。購入したＡＢ２．２細胞３．０×１０６個を６ｃｍディッシュに播種し、４８時間培養した後、８．５ｃｍディッシュへ継代し、さらに２４時間培養した。２４時間後、７ｍＬのＰＢＳで２回洗浄し、上記の継代方法に準じて細胞を回収した。回収した細胞１．０×１０７個を０．９ｍＬのＰＢＳに懸濁し、２５μｇの直鎖状ｐｌｏｘＰ−ＤＴ−ａｒｍ１−ＨＰＲＴ−ｈＡ３Ｒ−ａｒｍ２をエレクトロポレーション用キュベット（ジーン・パルサー・キュベット、電極間距離４ｍｍ、バイオ・ラッド社製、カタログ番号１６５−２０８８）内で混合した。エレクトロポレーション装置ジーンパルサー（バイオ・ラッド社製）を用いて、パルス電圧０．２３ｋＶ、電気容量５００μＦの条件で遺伝子導入し、７０ｍＬのＭ１５培地に懸濁後、７枚の８．５ｃｍフィーダープレートに１０ｍＬずつ播種し、２４時間培養した。
【０２０９】
２４時間後、１００×ＨＡＴ添加物（ＨＡＴ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ （１００×）、インビトロジェン社製、カタログ番号３９９２、アミノプテリン、ヒポキサンチンおよびチミジンを含む）を１×濃度で含むＭ１５培地で５日間培養した後、１００×ＨＴ添加物（ＨＴ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ （１００×）、インビトロジェン社製、カタログ番号１１０６７−０３０、ヒポキサンチンおよびチミジンを含む）を１×濃度で含むＭ１５培地でさらに３日間培養することでアミノプテリン耐性コロニーを出現させた。各コロニーを、以下のようにして単離し、培養を継続した。まず、出現したコロニーをＰＢＳで２回洗浄した後、プラスチック製の滅菌チップを用いて計２０５コロニーを直接拾いあげて、３０μＬのトリプシン溶液を添加した丸底９６穴プレート（ファルコン社製、カタログ番号３０７７）へ１コロニー／穴になるように移した。３７℃、５％ＣＯ２条件下で１５分間以上放置した後、７０μＬ／穴のＭ１５培地を添加し、プラスチック製の滅菌チップで４０回激しくピペッティングを行ない細胞を分散させた。細胞懸濁液を、各穴に１００μＬのＭ１５培地を添加した９６穴フィーダープレートに播種して３日間培養を行なった。
【０２１０】
３日後、以下のようにしてレプリカプレートを作製し、さらに５日間培養した。まず、上記の９６穴フィーダープレートで培養した細胞を１００μＬ／穴のＰＢＳで２回洗浄した後、２５μＬのトリプシン溶液を添加し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で１５分間以上放置した。２５μＬのＭ１５培地を添加し、プラスチック製の滅菌チップで４０回激しくピペッティングを行ない分散させた。続いて２０％ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ、シグマ・アルドリッチ社製、カタログ番号Ｄ２６５０）、４０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ（以下、２×フリージング培地と称す）を５０μＬ添加して混合した細胞懸濁液から５０μＬを分取し、あらかじめゼラチンコート処理し、１００μＬ／穴のＭ１５培地を添加しておいた９６穴プレートに移すことにより、レプリカプレートを作製した。残りの細胞懸濁液を含むプレートはマスタープレートとして−８０℃で凍結保存した。
【０２１１】
（２）サザンハイブリダイゼーションによる相同組換え体の選択
（１）で作製したレプリカプレートを５日間培養後、培地を除いて１００μＬ／穴のＰＢＳで２回洗浄した後、細胞溶解液〔１０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ７．５）、１０ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ、１０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、０．５％サルコシル、１ｍｇ／ｍＬプロテイナーゼＫ（インビトロジェン社製、カタログ番号２５５３０−０４９）〕を５０μＬ／穴ずつ加え、密封容器の中へ十分水を含ませた紙と共に入れたのち、６０℃で２４時間保温し、細胞を溶解させた。細胞の溶解液に、７５ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌを含むエタノールを１００μＬ／穴ずつ加えて室温で３０分間以上放置し、ゲノムＤＮＡを沈殿させた後、９６穴プレートを逆さにすることにより溶液を廃棄した。続いて１５０μＬ／穴の７０％エタノールで３回洗浄した後、室温で２０分間放置することにより残ったエタノールを揮発させた。
【０２１２】
１２単位のＥｃｏＲＩと５μｇのリボヌクレアーゼＡ（シグマ社製；カタログＮｏ．Ｒ５１２５）を含むユニバーサルバッファーＨ ３０μＬ／穴を添加して、激しくピペッティングを行ないゲノムＤＮＡをよく溶解させてから、３７℃で２０時間消化反応を行なった。反応後、該反応液をアガロースゲル電気泳動し、Ｓｏｕｔｈｅｒｎの方法（Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ９８， ５０３， １９７５）でナイロンフィルター（ＨｙｂｏｎｄＴＭ−Ｎ＋、アマシャム・バイオサイエンス社製）へ移した。実施例９で作製した５’側プローブおよび３’側プローブを、Ｔ７クイックプライム・キット（アマシャム・バイオサイエンス社製）を用いて［α−３２Ｐ］ ｄＣＴＰ（ＮＥＮ社製）で標識した。この標識した各プローブと上記で作製したフィルターを一晩ハイブリダイズさせ、０．１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＰＥを用いて６５℃で１５分間の洗浄を３回、０．１％ＳＤＳを含む０．２×ＳＳＰＥを用いて６５℃で１５分間の洗浄を２回行ない、Ｘ線フィルム（コダック・サイエンティフィック・イメージング・フィルムＸ−ＯＭＡＴＴＭ ＡＲ、コダック社製）と重ね合わせて−８０℃で一晩感光させ、翌日現像した。
【０２１３】
上記のサザンハイブリダイゼーションでは、野生型のマウスゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩで切断した場合、５’側プローブを用いることにより約９ｋｂｐのＤＮＡ断片、３’側プローブを用いることにより約６．５ｋｂｐのＤＮＡ断片が検出される。一方、ターゲットベクターｐｌｏｘＰ−ＤＴ−ａｒｍ１−ＨＰＲＴ−ｈＡ３Ｒ−ａｒｍ２によって正常に相同組換えが引き起こされ、マウスゲノムＤＮＡ中のマウスＡ３アデノシン受容体遺伝子がヒトＡ３アデノシン受容体ｃＤＮＡに置換されている場合には、５’側プローブを用いることにより約８．５ｋｂｐのＤＮＡ断片が、３’側プローブを用いることにより約８．８ｋｂｐのＤＮＡ断片が検出される（図２８参照）。
【０２１４】
以上のサザンハイブリダイゼーションの結果、（１）で得られたＥＳ細胞のアミノプテリン耐性株２０５コロニーのうち、１６コロニー（１Ｂ７、１Ｃ３、１Ｃ６、１Ｄ１、１Ｄ７、１Ｄ１２、１Ｆ９、１Ｆ１１、１Ｇ２、１Ｇ１１、１Ｈ１１、２Ａ４、２Ｂ３、２Ｂ１２、２Ｄ９、２Ｅ３）が片方の染色体においてマウスＡ３アデノシン受容体遺伝子がヒトＡ３アデノシン受容体ｃＤＮＡに置換された相同組換え体であることが判明した。
【０２１５】
相同組換え体である１６コロニーのＥＳ細胞について、以下のようにして凍結保存用ストックを作製した。
１６コロニーの凍結保存したマスタープレートを融解し、各相同組換え体を含む細胞懸濁液を、２ｍＬ／穴のＭ１５培地を添加した２４穴フィーダープレートの各穴に播種し、２４時間培養した。培地を交換し、２日間培養を行なった後、３ｃｍディッシュのフィーダープレートに継代しさらに３日間培養した。（１）に記載した継代方法に準じて、ディッシュより剥離後、回収した細胞を０．５ｍＬのＭ１５培地に懸濁した。さらに０．５ｍＬの２×フリージング培地を加えて混合した懸濁液を、０．１ｍＬずつ細胞凍結用チューブに分注し、−８０℃で凍結保存し、ストックとして保管した。
【０２１６】
（３）相同組換え体からの薬剤耐性遺伝子の除去
（２）で得た相同組換え体より、形態と増殖能が良い４クローン（１Ｃ６、１Ｄ１、１Ｆ１１、２Ａ４）を選び、Ｃｒｅ発現ベクターを導入することにより、ｌｏｘＰ配列間に存在する薬剤耐性遺伝子（ｈｐｒｔ遺伝子）の除去を行なった。上記４クローンの凍結保存ストックを各クローン１本ずつ融解し、それぞれ２ｍＬ／穴のＭ１５培地の入った２４穴フィーダープレートに播種して２日間培養した。３ｃｍディッシュフィーダープレートへ継代し、２４時間後に培地交換を行なった。さらにその２４時間後、１ｍＬのＰＢＳで２回洗浄し、１ｍＬのトリプシン溶液を添加した。３７℃、５％ＣＯ２条件下で１５分間放置した後、１ｍＬのＭ１５培地を添加し、３ｍＬトランスファーピペットを用いて４０回激しくピペッティングすることにより細胞を剥離させた。遠心分離により細胞を沈殿させて回収し、０．９ｍＬのＰＢＳに懸濁させた。該細胞懸濁液とＣｒｅ発現ベクターｐＢＳ１８５（インビトロジェン社製）２５μｇを０．１ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡを含む１ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ８．０）に溶解させたものを用いて、（１）に記載したエレクトロポレーション法に準じて細胞に遺伝子導入し、１０ｍＬのＭ１５培地に懸濁後、８．５ｃｍディッシュのフィーダープレートに播種し、２４時間培養した。２４時間後、培地交換を行ない、さらに３日間培養した。
【０２１７】
培養した細胞を７ｍｌのＰＢＳで２回洗浄した後、（１）に記載した継代方法に準じて、ディッシュより剥離して回収し、１０ｍＬのＭ１５培地に懸濁し、細胞数を測定した。続いて、１０００×の６−チオグアニン（シグマ・アルドリッチ社製）を１×濃度で含むＭ１５培地を用いて、５００個／ｍＬ、５０個／ｍＬ、５個／ｍＬに細胞を希釈し、各１０ｍＬずつ８．５ｃｍディッシュのフィーダープレートに播種して７日間培養することでｈｐｒｔ遺伝子欠損コロニーを出現させた。これら各コロニーを（１）に記載した方法に準じて、単離し、９６穴フィーダープレートに播種して３日間培養を行なった。形態の良いクローンを、各コロニーについて１２クローンずつそれぞれ２４穴フィーダープレートへ継代し、２日間培養を行なった。さらに形態の良い６クローンずつをそれぞれ３ｃｍディッシュのフィーダープレートに継代して３日間培養を行なった。細胞を（１）に記載した継代方法に準じてディッシュより剥離して、回収し、０．５ｍＬのＭ１５培地に懸濁した。該細胞懸濁液に、さらに０．５ｍＬの２×フリージング培地を加えて混合した懸濁液を０．１ｍｌずつ細胞凍結用チューブに分注し、計２４クローン（１Ｃ６−１〜−６、１Ｄ１−１〜−６、１Ｆ１１−１〜−６、２Ａ４−１〜−６）を−１６０℃で凍結保存用ストックとして保管した。
【０２１８】
（４）サザンハイブリダイゼーションによるｈｐｒｔ遺伝子の除去の確認
上記、２４クローンの凍結保存用ストックを各１本ずつ融解し、２ｍＬのＭ１５培地の入ったゼラチンコート処理済み３ｃｍディッシュに播種して３日間培養を行なった。３日後、培地を除いて１ｍＬのＰＢＳ緩衝液で２回洗浄した後、（２）に記載の細胞溶解液を１．７５ｍＬずつ加え、密封容器の中へ十分水を含ませた紙と共に入れたのち、６０℃で２４時間保温し、細胞を溶解させた。細胞の溶解液に７５ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌを含むエタノールを３ｍＬずつ加えて室温で３０分間以上放置した後、滅菌チップの先にひっかけるようにしてゲノムＤＮＡを回収した。このゲノムＤＮＡを７０％エタノールで３回洗浄した後、室温で２０分間放置することによりエタノールを揮発させた。ゲノムＤＮＡを２００μｇ／ｍＬのリボヌクレアーゼＡおよび０．１ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡを含む１ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ８．０）１００μＬに溶解した。得られた各ゲノムＤＮＡを１２μｇずつ１２０μＬのユニバーサルバッファーＨに溶解し、１２単位のＥｃｏＲＩを加えて３７℃で１６時間消化反応を行なった。該反応液を滅菌チップで３回ピペッティングすることにより未消化のゲノムＤＮＡを切断した。さらに０．５ｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を１．２μＬおよびエタノール３００μＬを加えたのち、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行ないゲノムＤＮＡの沈殿を得た。
【０２１９】
ゲノムＤＮＡの沈殿を０．１ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡを含む１ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ８．０）２０μＬに溶解したのち、全量をアガロースゲル電気泳動し、（２）に記載の方法に準じて、ナイロンフィルターに移し、３２Ｐで標識した３’側プローブとサザンハイブリダイゼーションを行なった。上記のサザンハイブリダイゼーションにより、マウスＡ３アデノシン受容体遺伝子がヒトＡ３アデノシン受容体ｃＤＮＡに置換されているマウスゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩで切断した場合には、（２）で示す通り、３’側プローブを用いることにより約８．８ｋｂｐのＤＮＡ断片が検出されるが、Ｃｒｅ蛋白質によってｌｏｘＰ配列の間に存在するＰＧＫプロモーターおよびｈｐｒｔ遺伝子（約３．８ｋｂｐ）が除去されていると約５ｋｂｐと短いＤＮＡ断片が検出される（図２９参照）。
【０２２０】
サザンハイブリダイゼーションの結果より、解析した２４クローン全てにおいてヒトＡ３アデノシン受容体遺伝子の下流に存在していたｌｏｘＰ配列の間に挟まれていたＰＧＫプロモーターおよびｈｐｒｔ遺伝子（約３．８ｋｂｐ）がマウスゲノム上より除去されていることが確認された。
【０２２１】
（５）ヒトＡ３アデノシン受容体ｃＤＮＡを有するＥＳ細胞を用いたキメラマウスの作製（４）で樹立した、マウスＡ３アデノシン受容体遺伝子の片方のアリルをヒトのＡ３アデノシン受容体ｃＤＮＡに置換したＥＳ細胞のうち、形態と増殖性の良い３クローン（１Ｃ６−１、１Ｆ１１−４、２Ａ４−５）をマウス胚盤胞へ注入するため、フィーダープレート上で培養を行なった。各クローンの凍結保存用ストック１本を融解後、１０ｍＬのＭ１５培地に懸濁し、遠心分離して沈殿させ細胞を回収した。細胞をＭ１５培地を０．５ｍＬ／穴添加した２４穴フィーダープレートに播種し培養を開始した。２日後、３ｃｍディッシュのフィーダープレートに継代した。さらに２日後、ＰＢＳ１ｍＬで２回洗浄した後、０．５ｍＬのトリプシン溶液を加えて、３７℃、５％ ＣＯ２条件下で１５分間放置した。０．５ｍｌのＭ１５培地を添加し、３ｍＬトランスファーピペットを用いて４０回激しくピペッティングして懸濁したところに、ＦＣＳを加えて混合し、該細胞懸濁液をマウス胚盤胞への注入に用いた。
【０２２２】
マウス胚盤胞は、過***処理を施した雌のＣ５７Ｂｌ／６Ｊマウスを同系の雄マウスと自然交配させ、４日後に摘出した子宮の内部をＭ１５培地で潅流することにより取得した。取得したマウス胚盤胞を３７℃、５％ ＣＯ２条件下で胚盤胞腔が十分に膨らむまで放置した後、約４℃に冷却した２０ｍｍｏｌ／ＬのＨＥＰＥＳを含むＭ１５培地中に移し、マイクロインジェクター（成茂科学社製）およびマイクロマニピュレーター（成茂科学社製）を装備した倒立顕微鏡（ニコン社製）下で観察しながら、注入針を操作し、各ＥＳ細胞クローン（１Ｃ６−１、１Ｆ１１−４、２Ａ４−５）１０〜１５個ずつをそれぞれ胚盤胞腔内へ顕微注入した。該胚盤胞を３７℃、５％ＣＯ２条件下で胚盤胞腔が膨らむまで放置した後、マニピュレーティング・マウス・エンブリオ第２版に記載された方法に従い、偽妊娠の雌ＭＣＨ系統マウスの卵管側子宮部分に移植後、着床させた。偽妊娠の雌ＭＣＨ系統マウス（１０週齢以降）は、発情期前期から発情期にある雌ＭＣＨ系統マウスを精管結紮雄マウスＭＣＨ系統マウス１０週以降の個体と移植３日前の１７：００に１：１で同居、交配させ、翌朝９：００に膣栓確認を行ない、２日後に上記の目的で使用した。
【０２２３】
注入したＥＳ細胞（１Ｃ６−１、１Ｆ１１−４、２Ａ４−５）の寄与により、黒色の被毛の中に茶褐色の被毛が現れたキメラ個体のうちキメラ率が４０％を超える雄の個体が、１Ｆ１１−４より１１匹、２Ａ４−５より１１匹得られた。
【０２２４】
（６）キメラ個体の交配によるヒトＡ３アデノシン受容体ｃＤＮＡを有するヘテロ接合体マウスの取得
（５）で得られたキメラ個体を８週齢まで飼育した後、雌のＣ５７Ｂｌ／６Ｊ系統８週齢以降の個体と１：１で交配させ産仔を得た。該産仔のうち、茶褐色の被毛を有する個体の尾よりゲノムＤＮＡを調製し、相同組換えの有無を試験した。ゲノムＤＮＡの調製は、マニピュレーティング・マウス・エンブリオ第２版に記載された方法により、尾の約０．５ｃｍ断片から抽出した。得られたゲノムＤＮＡは７０％エタノールで洗浄した後に乾燥させ、２００μｇ／ｍｌのリボヌクレアーゼＡおよび０．１ｍｍｏｌ／ｌのＥＤＴＡを含む１０ｍｍｏｌ／ｌのトリス（ｐＨ８．０）溶液３００μＬに溶解して用いた。各ゲノムＤＮＡ１２μｇを制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し、（４）に記載の方法に準じてサザンハイブリダイゼーションを行なった。その結果、１Ｆ１１−４と２Ａ４−５から産まれた産仔において、実施例８に示すように、６．５ｋｂｐと５．０ｋｂｐの２本のバンドが見られ、Ａ３アデノシン受容体遺伝子がヒトＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡに置換されたヘテロ接合体マウスが含まれていた。以上の結果から、キメラ率が４０％を超えていたキメラ個体は生殖系列キメラマウスであると同定した。このヘテロ接合体マウスは、自己のＡ３アデノシン受容体と共にヒトＡ３アデノシン受容体を発現するマウスである。
【０２２５】
（７）ヒトＡ３アデノシン受容体のみを発現するマウスの取得
上記（６）で得られたヘテロ接合体マウスを８週齢まで飼育した後、雄と雌を交配させ産仔を得た。該産仔の個体の尾より（４）に記載の方法に準じてゲノムＤＮＡを調製し、サザンハイブリダイゼーションを行なった。その結果、実施例８に示すように、５．０ｋｂｐのバンドのみが見られ、両方の染色体においてＡ３アデノシン受容体遺伝子がヒトＡ３アデノシン受容体ｃＤＮＡに置換しているホモ接合体マウスが、産仔に含まれていた。このホモ接合体マウスは、マウスＡ３アデノシン受容体の代わりにヒトＡ３アデノシン受容体を発現するマウスである。
【０２２６】
実施例８ Ａ３アデノシン受容体遺伝子をヒトＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡに置換したマウスのゲノム構造解析
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（日本クレア）、実施例７の（６）に記載したＡ３アデノシン受容体遺伝子をヒトＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡに置換したヘテロ接合体マウス、および実施例７の（７）に記載したＡ３アデノシン受容体遺伝子をヒトＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡに置換したホモ接合体マウスより尻尾を採取し、実施例９（４）と同様にしてゲノムＤＮＡを調製した。該ゲノムＤＮＡをＴＥバッファー（インビトロジェン社製）に溶解した後、１０μｇのゲノムＤＮＡを１６時間ＥｃｏＲＩ（タカラバイオ社製）で切断し、実施例７の（２）に記した方法でサザンハイブリダイゼーションを行なった。
【０２２７】
実施例６の（１）記載の５’側プローブを用いてサザンハイブリダイゼーションを行なった結果、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスでは約９ｋｂｐのバンド、Ａ３アデノシン受容体遺伝子をヒトＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡに置換したヘテロ接合体マウスでは約９ｋｂｐと約８．５ｋｂｐのバンド、Ａ３アデノシン受容体遺伝子をヒトＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡに置換したホモ接合体マウスでは約８．５ｋｂｐのバンドが検出された（図３０）。続いて、実施例６の（２）記載の３’側プローブを用いてサザンハイブリダイゼーションを行なった結果、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスでは約６．５ｋｂｐのバンド、Ａ３アデノシン受容体遺伝子をヒトＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡに置換したヘテロ接合体マウスでは約６．５ｋｂｐと約５．０ｋｂｐのバンド、Ａ３アデノシン受容体遺伝子をヒトＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡに置換したホモ接合型マウスでは約５．０ｋｂｐのバンドが検出された（図３１）。以上の結果は図２８および図２９にて模式的に示したゲノム構造と合致しており、該ヘテロ接合体マウスでは、片方の染色体上のＡ３アデノシン受容体遺伝子がヒトＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡに置換されていることが、該ホモ接合体マウスは両染色体上のＡ３アデノシン受容体遺伝子がヒトＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡに置換されていることが確認された。
【０２２８】
実施例９ Ａ３アデノシン受容体遺伝子をヒトＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡに置換したホモ接合体マウス由来マスト細胞を用いた、ヒトＡ３アデノシン受容体特異的アンタゴニストの評価
（１）骨髄細胞由来マスト細胞（ＢＭＭＣ）の作製
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスおよび実施例７の（７）で作製したＡ３アデノシン受容体遺伝子をキメラＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡに置換したホモ接合体マウスより取得した骨髄細胞より、以下に記すＳｕｐａｊａｔｕｒａらの方法［ザ・ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．）， １６７， ４ （２００１） ］に準じた方法により、骨髄細胞由来マスト細胞（以下、ＢＭＭＣとよぶ）を作製した。
【０２２９】
オスＢＡＬＢ／ｃＡマウス（日本クレア）２０匹より脾臓を摘出後ホモジナイズにより単離した脾臓細胞を、脾臓細胞培養培地〔１０％ＦＣＳ（ハイクローン社製）、１０ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ緩衝液（インビトロジェン社製）、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ ２メルカプトエタノール（インビトロジェン社製）、５０ｍｇ／Ｌのゲンタマイシン（ナカライテスク社製）、３．４ｍｇ／ＬのＰｈｙｔｏｌａｃｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａ（ヨウシュヤマゴボウ）由来レクチン（シグマ−アルドリッチ社製）含むＲＰＭＩ １６４０培地（インビトロジェン社製）〕にて２×１０６細胞／ｍＬに懸濁し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で５日間培養した。培養後、培養上清を回収した。以下、該培養上清をＰＷＭ−ＳＣＭ（ヨウシュヤマゴボウ・マイトジェンで刺激した脾臓細胞の培養上清の略）と呼ぶ。
【０２３０】
続いて、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスおよび実施例７の（７）で作製したＡ３アデノシン受容体遺伝子をヒトＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡに置換したホモ接合体マウスの大腿骨よりそれぞれ骨髄細胞を回収し、ＢＭＭＣ培地〔１０％ＦＣＳ、０．１ｍｍｏｌ／Ｌピルビン酸ナトリウム（インビトロジェン社製）、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ非必須アミノ酸（インビトロジェン社製）、５０μｍｏｌ／Ｌの２メルカプトエタノール、５０ｍｇ／Ｌのゲンタマイシン、１０％のＰＷＭ−ＳＣＭを含むＲＰＭＩ １６４０培地〕にて３７℃、５％ ＣＯ２条件下で培養を行なった。４日おきに新鮮な培地に交換し、培養開始後２８日目に以下に示した抗体染色を行なった。
【０２３１】
２×１０５細胞をダルベッコのリン酸緩衝液（以下、ＰＢＳと表す）（インビトロジェン社製）で洗浄後、０．２μｇのフルオレセインイソチオシアネート（以下、ＦＩＴＣと略す）で標識したトリニトロフェノール（以下ＴＮＰと略す）特異的ＩｇＥ〔ＫＭ３９３細胞（ＡＴＣＣ番号：ＴＩＢ１４２）より取得〕および０．２μｇのフィコエリスリン（以下、ＰＥと略す）で標識した抗マウスｃ−ｋｉｔ抗体（ファーミンジェン社製）を含むＰＢＳにて、氷上で１時間反応した。反応後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ（ベクトン・ディッキンソン）にてＦＩＴＣおよびＰＥの蛍光強度を測定した。マスト細胞細胞膜上にはＩｇＥ Ｆｃ受容体およびｃ−ｋｉｔが存在し、ＩｇＥと抗マウスｃ−ｋｉｔ抗体の両抗体が結合することが報告されているが（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ， １６， ４４１， ２００２）、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス由来細胞（図３２）およびＡ３アデノシン受容体遺伝子をヒトＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡに置換したホモ接合体マウス由来細胞（図３３）の９５％以上が両抗体で染色され、これら細胞群がＢＭＭＣに分化していることが確認された。
【０２３２】
（２）細胞内Ｃａ２＋量測定によるヒトＡ３アデノシン受容体特異的アンタゴニストの評価
Ａ３アデノシン受容体アゴニストならびにアンタゴニストによるＢＭＭＣの細胞内Ｃａ２＋量の変動を以下に示す方法により測定した。
【０２３３】
ＴＮＰ特異的ＩｇＥを１００ｎｇ／ｍＬで添加したＢＭＭＣ培地にて、上記（１）で作製したＢＭＭＣを１×１０６細胞／ｍＬ、３７℃、５％ ＣＯ２条件下で１６時間培養した。培養後、ＢＭＭＣをカルシウム測定緩衝液〔２０ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ（ナカライテスク社製）、１１５ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ（純正化学社製）、５．４ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＣｌ（ナカライテスク社製）、０．８ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２（ナカライテスク社製）、１．８ｍｍｏｌ／Ｌ ＣａＣｌ２（ナカライテスク社製）、１３．８ｍｍｏｌ／Ｌグルコース（ナカライテスク社製）、０．２％ ＢＳＡ（シグマ−アルドリッチ社製）、２．５ｍＭ プロベネシド（ｐｒｏｂｅｎｅｃｉｄ、シグマ−アルドリッチ社製）〕で２回洗浄したのち、最終濃度５μｍｏｌ／ＬのＦｌｕｏ−３ ＡＭ（モレキュラープローブズ社製）と最終濃度０．５％のプルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）Ｆ−１２７（シグマ−アルドリッチ社製）を加えたカルシウム測定緩衝液に懸濁して３７℃、５％ ＣＯ２条件下で１時間培養した。培養後、カルシウム測定緩衝液で２回洗浄した後、２．５×１０５細胞／ｍＬになるようにカルシウム測定緩衝液で懸濁後、１００μｌずつ９６穴プレートに分注して３７℃、５％ ＣＯ２条件下で３０分培養した。培養後、（ａ）カルシウム測定緩衝液のみ添加、（ｂ）最終濃度１μｍｏｌ／ＬのＡ３アデノシン受容体アゴニストＣｌ−ＩＢ−ＭＥＣＡを添加、（ｃ）最終濃度１μｍｏｌ／ＬのＣｌ−ＩＢ−ＭＥＣＡを添加する１０分前に最終濃度１μｍｏｌ／ＬのヒトＡ３アデノシン受容体特異的アンタゴニストＫＦ２６７７７を添加、もしくは（ｄ）最終濃度１０ｎｇ／ｍＬのＴＮＰ−ＢＳＡ（コスモバイオ社製）を添加した。（ａ）〜（ｄ）それぞれの細胞について、細胞内Ｃａ２＋量の指標として、ＦＤＳＳ ６０００（浜松ホトニクス社製）を用いて、励起波長４８０ｎｍによって生じる波長５３０ｎｍの蛍光を、ブルーダイクロイックミラーに透過させた後、吸光５２０〜５６０ｎＭフィルターで１分間測定した。
【０２３４】
図３４に示すように、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス由来ＢＭＭＣではＣｌ−ＩＢ−ＭＥＣＡ添加による細胞内Ｃａ２＋量の増加が観察されたが、その増加はＣｌ−ＩＢ−ＭＥＣＡ添加の１０分前に最終濃度１μｍｏｌ／ＬのヒトＡ３アデノシン受容体アンタゴニストＫＦ２６７７７を添加した場合においても同様に観察され、アンタゴニストによる抑制は見られなかった。一方、図３５に示すように、Ａ３アデノシン受容体遺伝子をヒトＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡに置換したマウス由来ＢＭＭＣではＣｌ−ＩＢ−ＭＥＣＡ添加による細胞内Ｃａ２＋量の増加が観察され、さらにその増加はＣｌ−ＩＢ−ＭＥＣＡ添加の１０分前に最終濃度１μｍｏｌ／ＬのヒトＡ３アデノシン受容体アンタゴニストＫＦ２６７７７を添加することにより完全に抑制された。したがって、ヒトＡ３アデノシン受容体特異的アンタゴニストは、ＢＭＭＣにおいてＡ３アデノシン受容体を介した細胞内Ｃａ２＋の増加を抑制することが確認された。このことは通常のマウスのＢＭＭＣでは確認できなかったのに対し、Ａ３アデノシン受容体遺伝子をキメラＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡに置換したマウス由来ＢＭＭＣを用いることにより初めて確認することができた。なお、両ＢＭＭＣにおいて細胞に結合しているＴＮＰ特異的ＩｇＥの抗原であるＴＮＰ−ＢＳＡ添加により、細胞内Ｃａ２＋量の増加が観察され（図３４および３５）、抗原によるＩｇＥの架橋を介したマスト細胞の活性化が正常に起きていることを確認した。
【０２３５】
以上の結果より、従来のマウスでは不可能であったヒトＡ３アデノシン受容体特異的アンタゴニストの薬理評価が、本発明のＡ３アデノシン受容体遺伝子をヒトＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡに置換したマウスを用いることによって可能であることが明らかとなり、本マウスはヒトＡ３アデノシン受容体に対する特異的薬物の薬理評価に有用であることが示された。
【０２３６】
【発明の効果】
本発明により、ヒトＡ３アデノシン受容体に特異的に作用する物質の薬理評価を行なうことのできる非ヒト哺乳動物が提供される。
【０２３７】
「配列表フリーテキスト」
配列番号１−ヒトＡ３アデノシン受容体ｃＤＮＡ増幅用プライマー
配列番号２−ヒトＡ３アデノシン受容体ｃＤＮＡ増幅用プライマー
配列番号５−マウスＡ３アデノシン受容体遺伝子増幅用プライマー
配列番号６−マウスＡ３アデノシン受容体遺伝子増幅用プライマー
配列番号７−マウスＡ３アデノシン受容体遺伝子増幅用プライマー
配列番号８−マウスＡ３アデノシン受容体遺伝子増幅用プライマー
配列番号９−マウスＡ３アデノシン受容体遺伝子増幅用プライマー
配列番号１０−マウスＡ３アデノシン受容体遺伝子増幅用プライマー
配列番号１２−ｐｌｏｘＰ−ＲＥ−ＨＰＲＴ−ｈＡ３Ｒ−ａｒｍ２構築用オリゴＤＮＡ
配列番号１３−ｐｌｏｘＰ−ＲＥ−ＨＰＲＴ−ｈＡ３Ｒ−ａｒｍ２構築用オリゴＤＮＡ
配列番号１４−Ａ３Ｒ−Ｃ２構築用オリゴＤＮＡ
配列番号１５−Ａ３Ｒ−Ｃ２構築用オリゴＤＮＡ
配列番号１６−Ａ３Ｒ−Ｃ３構築用プライマー
配列番号１７−Ａ３Ｒ−Ｃ３構築用プライマー
配列番号１８−マウスゲノムＤＮＡ増幅用プライマー
配列番号１９−マウスゲノムＤＮＡ増幅用プライマー
配列番号２０−ヒトＡ３アデノシン受容体ｃＤＮＡ断片増幅用プライマー
配列番号２１−ヒトＡ３アデノシン受容体ｃＤＮＡ断片増幅用プライマー
配列番号２２−ＳＶ４０のポリアデニル化シグナルを含むＤＮＡ断片増幅用プライマー
配列番号２３−ＳＶ４０のポリアデニル化シグナルを含むＤＮＡ断片増幅用プライマー
配列番号２４−ＦＬＡＧタグを付加したヒトＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡ増幅用プライマー
配列番号２５−ＦＬＡＧタグを付加したヒトＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡ増幅用プライマー
配列番号２７−マウスＡ３受容体遺伝子５’側プローブ増幅用プライマー
配列番号２８−マウスＡ３受容体遺伝子５’側プローブ増幅用プライマー
配列番号３０−マウスＡ３受容体遺伝子３’側プローブ増幅用プライマー
配列番号３１−マウスＡ３受容体遺伝子３’側プローブ増幅用プライマー
【０２３８】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ヒトＡ３アデノシン受容体ｃＤＮＡを含むプラスミドｐＢＳ−ｈＡ３Ｒの構築を示す。
【図２】図２は、Ａ３アデノシン受容体遺伝子のエクソン１を含む約９ｋｂｐのマウスゲノムＤＮＡ配列に存在する、各制限酵素に対する認識配列を示す。
【図３】図３は、Ａ３アデノシン受容体遺伝子のエクソン２を含む約６．５ｋｂｐのマウスゲノムＤＮＡ配列に存在する、各制限酵素に対する認識配列を示す。
【図４】図４は、本発明で決定したＡ３アデノシン受容体遺伝子を含む約５．２ｋｂｐのマウスゲノムＤＮＡ配列、および公知であるＡ３アデノシン受容体遺伝子を含む約６ｋｂｐのマウスゲノムＤＮＡ配列の領域を示す。
【図５】図５は、マウスＡ３アデノシン受容体遺伝子をヒトＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡで置換するためのターゲットベクターｐｌｏｘＰ−ＤＴ−ａｒｍ１−ＨＰＲＴ−ｈＡ３Ｒ−ａｒｍ２の構築（全１５工程）の第１工程、プラスミドｐｌｏｘＰ−ＨＰＲＴ−ｈＡ３Ｒ−ａｒｍ２の構築を示す。
【図６】図６は、ターゲットベクターｐｌｏｘＰ−ＤＴ−ａｒｍ１−ＨＰＲＴ−ｈＡ３Ｒ−ａｒｍ２の構築（全１５工程）の第２工程、プラスミドｐｌｏｘＰ−ＲＥ−ＨＰＲＴ−ｈＡ３Ｒ−ａｒｍ２の構築を示す。
【図７】図７は、ターゲットベクターｐｌｏｘＰ−ＤＴ−ａｒｍ１−ＨＰＲＴ−ｈＡ３Ｒ−ａｒｍ２の構築（全１５工程）の第３工程、プラスミドＡ３Ｒ−Ｃ１の構築を示す。
【図８】図８は、ターゲットベクターｐｌｏｘＰ−ＤＴ−ａｒｍ１−ＨＰＲＴ−ｈＡ３Ｒ−ａｒｍ２の構築（全１５工程）の第４工程、プラスミドＡ３Ｒ−Ｃ２の構築を示す。
【図９】図９は、ターゲットベクターｐｌｏｘＰ−ＤＴ−ａｒｍ１−ＨＰＲＴ−ｈＡ３Ｒ−ａｒｍ２の構築（全１５工程）の第５工程、プラスミドＡ３Ｒ−Ｃ３の構築を示す。
【図１０】図１０は、ターゲットベクターｐｌｏｘＰ−ＤＴ−ａｒｍ１−ＨＰＲＴ−ｈＡ３Ｒ−ａｒｍ２の構築（全１５工程）の第６工程、プラスミドＡ３Ｒ−Ｃ４の構築を示す。
【図１１】図１１は、ターゲットベクターｐｌｏｘＰ−ＤＴ−ａｒｍ１−ＨＰＲＴ−ｈＡ３Ｒ−ａｒｍ２の構築（全１５工程）の第７工程、プラスミドｐｌｏｘＰ−ＲＥ−Ｃ−ＨＰＲＴ−ｈＡ３Ｒ−ａｒｍ２の構築を示す。
【図１２】図１２は、ターゲットベクターｐｌｏｘＰ−ＤＴ−ａｒｍ１−ＨＰＲＴ−ｈＡ３Ｒ−ａｒｍ２の構築（全１５工程）の第８工程、プラスミドＡ３Ｒ−Ｎ１の構築を示す。
【図１３】図１３は、ターゲットベクターｐｌｏｘＰ−ＤＴ−ａｒｍ１−ＨＰＲＴ−ｈＡ３Ｒ−ａｒｍ２の構築（全１５工程）の第９工程、プラスミドＡ３Ｒ−Ｎ２の構築を示す。
【図１４】図１４は、ターゲットベクターｐｌｏｘＰ−ＤＴ−ａｒｍ１−ＨＰＲＴ−ｈＡ３Ｒ−ａｒｍ２の構築（全１５工程）の第１０工程、プラスミドＡ３Ｒ−Ｎ３の構築を示す。
【図１５】図１５は、ターゲットベクターｐｌｏｘＰ−ＤＴ−ａｒｍ１−ＨＰＲＴ−ｈＡ３Ｒ−ａｒｍ２の構築（全１５工程）の第１１工程、プラスミドＡ３Ｒ−Ｎ４の構築を示す。
【図１６】図１６は、ターゲットベクターｐｌｏｘＰ−ＤＴ−ａｒｍ１−ＨＰＲＴ−ｈＡ３Ｒ−ａｒｍ２の構築（全１５工程）の第１２工程、プラスミドＡ３Ｒ−Ｎ５の構築を示す。
【図１７】図１７は、ターゲットベクターｐｌｏｘＰ−ＤＴ−ａｒｍ１−ＨＰＲＴ−ｈＡ３Ｒ−ａｒｍ２の構築（全１５工程）の第１３工程、プラスミドＡ３Ｒ−Ｎ６の構築を示す。
【図１８】図１８は、ターゲットベクターｐｌｏｘＰ−ＤＴ−ａｒｍ１−ＨＰＲＴ−ｈＡ３Ｒ−ａｒｍ２の構築（全１５工程）の第１４工程、プラスミドｐｌｏｘＰ−ａｒｍ１−ＨＰＲＴ−ｈＡ３Ｒ−ａｒｍ２の構築を示す。
【図１９】図１９は、ターゲットベクターｐｌｏｘＰ−ＤＴ−ａｒｍ１−ＨＰＲＴ−ｈＡ３Ｒ−ａｒｍ２の構築（全１５工程）の第１５工程、プラスミドｐｌｏｘＰ−ＤＴ−ａｒｍ１−ＨＰＲＴ−ｈＡ３Ｒ−ａｒｍ２の構築を示す。
【図２０】図２０は、ヒトＡ３アデノシン受容体の発現ベクターｈＡ３Ｒ ｉｎ ｐＣＡＧの構築（全４工程）の第１工程、プラスミドｐｏｌｙＡ ｉｎ ｐＢＳの構築を示す。
【図２１】図２１は、ヒトＡ３アデノシン受容体の発現ベクターｈＡ３Ｒ ｉｎ ｐＣＡＧの構築（全４工程）の第２工程、プラスミドｈＡ３Ｒ ｉｎ ｐＢＳの構築を示す。
【図２２】図２２は、ヒトＡ３アデノシン受容体の発現ベクターｈＡ３Ｒ ｉｎ ｐＣＡＧの構築（全４工程）の第３工程、プラスミドｈＡ３Ｒ−ｐｏｌｙＡ ｉｎ ｐＢＳの構築を示す。
【図２３】図２３は、ヒトＡ３アデノシン受容体の発現ベクターｈＡ３Ｒ ｉｎ ｐＣＡＧの構築（全４工程）の第３工程、プラスミドｈＡ３Ｒ ｉｎ ｐＣＡＧの構築を示す。
【図２４】図２４は、ヒトＡ３アデノシン受容体を一過的に発現させたマウスミエローマ細胞Ｐ３Ｕ１の、Ａ３アデノシン受容体に特異的なアゴニストＣｌ−ＩＢ−ＭＥＣＡに対する反応性（細胞内Ｃａ２＋の上昇量）を測定した結果を示す。横軸は時間（秒）で、矢印の時点でＣｌ−ＩＢ−ＭＥＣＡを細胞に添加した。縦軸はエクオリンの発光量で、細胞内Ｃａ２＋の上昇量を表す。●はヒトＡ３アデノシン受容体を発現させたＰ３Ｕ１細胞、△はコントロールのＰ３Ｕ１細胞、□はＣｌ−ＩＢ−ＭＥＣＡを添加しなかったコントロールのＰ３Ｕ１細胞の測定結果である。
【図２５】図２５は、ヒトＡ３アデノシン受容体を安定発現させたマウスミエローマ細胞株（計４株）のＡ３アデノシン受容体に特異的なアゴニストＣｌ−ＩＢ−ＭＥＣＡに対する反応性（細胞内Ｃａ２＋の上昇量）を測定した結果を示す。横軸は時間（秒）で、矢印の時点でＣｌ−ＩＢ−ＭＥＣＡを細胞に添加した。縦軸はエクオリンの発光量で、細胞内Ｃａ２＋の上昇量を表す。●、▲、黒い四角および◆はヒトＡ３アデノシン受容体を安定発現させたＰ３Ｕ１細胞、□はコントロールのＰ３Ｕ１細胞の測定結果である。
【図２６】図２６は、プラスミドｐＢＳ−ｐｒｏｂｅ５’が含むマウスゲノムＤＮＡのＳａｃＩ−ＳｍａＩ断片の位置を模式的に示す。
【図２７】図２７は、プラスミドｐＢＳ−ｐｒｏｂｅ３’が含むマウスゲノムＤＮＡのＮｈｅＩ断片の位置を模式的に示す。
【図２８】図２８は、Ａ３アデノシン受容体遺伝子周辺のマウスゲノム構造および、相同組換えによりマウスＡ３アデノシン受容体遺伝子がヒトＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡに置換された時の同マウスゲノム構造を示す。
【図２９】図２９は、相同組換えによりマウスＡ３アデノシン受容体遺伝子がヒトＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡに置換された時のマウスゲノム構造および、Ｃｒｅタンパク質によりｌｏｘＰ配列とｌｏｘＰ配列の間に存在する薬剤耐性マーカー（ＰＧＫプロモーター及びｈｐｒｔ遺伝子）が除去された時の同マウスゲノム構造を示す。
【図３０】図３０は、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス、Ａ３アデノシン受容体遺伝子をヒトＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡに置換したヘテロ接合体マウスおよびホモ接合体マウスのゲノムＤＮＡに対する５’側プローブを使用したサザンハイブリダイゼーションの解析結果を示す。レーン１はＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス、レーン２はヘテロ接合体マウス、レーン３はホモ接合体マウスの結果を示す。
【図３１】図３１は、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス、Ａ３アデノシン受容体遺伝子をヒトＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡに置換したヘテロ接合体マウスおよびホモ接合体マウスのゲノムＤＮＡに対する３’側プローブを使用したサザンハイブリダイゼーションの解析結果を示す。レーン１はＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス、レーン２はヘテロ接合体マウス、レーン３はホモ接合体マウスの結果を示す。
【図３２】図３２は、ＴＮＰ特異的ＩｇＥおよび抗ｃ−ｋｉｔ抗体を用いたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス由来ＢＭＭＣのＦＡＣＳによる解析を示す。ａ）は未染色のＢＭＭＣ、ｂ）は抗体によって染色したＢＭＭＣのＦＡＣＳ解析結果を示す。縦軸はＰＥ標識した抗ｃ−ｋｉｔ抗体により染色された細胞の蛍光強度、横軸はＦＩＴＣ標識したＴＮＰ特異的ＩｇＥにより染色された細胞の蛍光強度を示す。
【図３３】図３３は、ＴＮＰ特異的ＩｇＥおよび抗ｃ−ｋｉｔ抗体に対するＡ３アデノシン受容体をヒトＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡに置換したマウス由来ＢＭＭＣのＦＡＣＳによる解析を示す。ａ）は未染色のＢＭＭＣ、ｂ）は抗体によって染色したＢＭＭＣのＦＡＣＳ解析結果を示す。縦軸はＰＥ標識した抗ｃ−ｋｉｔ抗体により染色された細胞の蛍光強度、横軸はＦＩＴＣ標識したＴＮＰ特異的ＩｇＥにより染色された細胞の蛍光強度を示す。
【図３４】図３４は、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス由来ＢＭＭＣの細胞内Ｃａ２＋量の変動を示す。ａ）はカルシウム測定緩衝液のみを添加した結果、ｂ）は最終濃度１μｍｏｌ／ＬのＡ３アデノシン受容体アゴニストＣｌ−ＩＢ−ＭＥＣＡを添加した結果、ｃ）は最終濃度１μｍｏｌ／ＬのＡ３アデノシン受容体アゴニストＣｌ−ＩＢ−ＭＥＣＡを加える１０分前にヒトＡ３アデノシン受容体アンタゴニストＫＦ２６７７７を添加した結果、ｄ）は最終濃度１０ｎｇ／ｍＬのＴＮＰ−ＢＳＡを添加した結果を示す。縦軸はＣａ２＋により励起されるＦｌｕｏ−３の波長５３０ｎｍの蛍光量を、薬物添加前の値を１．０とした相対値で示す。横軸は薬物添加後の時間を秒で示す。
【図３５】図３５は、Ａ３アデノシン受容体遺伝子をヒトＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡに置換したマウス由来ＢＭＭＣの細胞内Ｃａ２＋量の変動を示す。ａ）はカルシウム測定緩衝液のみを添加した結果、ｂ）は最終濃度１μｍｏｌ／ＬのＡ３アデノシン受容体アゴニストＣｌ−ＩＢ−ＭＥＣＡを添加した結果、ｃ）は最終濃度１μｍｏｌ／ＬのＡ３アデノシン受容体アゴニストＣｌ−ＩＢ−ＭＥＣＡを加える１０分前にヒトＡ３アデノシン受容体アンタゴニストＫＦ２６７７７を添加した結果、ｄ）は最終濃度１０ｎｇ／ｍＬのＴＮＰ−ＢＳＡを添加した結果を示す。縦軸はＣａ２＋により励起されるＦｌｕｏ−３の波長５３０ｎｍの蛍光量を、薬物添加前の値を１．０とした相対値で示す。横軸は薬物添加後の時間を秒で示す。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to transgenic non-human mammals that express the human A3 adenosine receptor. The present invention also relates to a method for producing the above-mentioned transgenic non-human mammal, a method for pharmacological evaluation of a test substance using the transgenic non-human mammal, and a target vector used for producing the transgenic non-human mammal.
[0002]
[Prior art]
A3 adenosine receptor is a receptor discovered as a subtype of adenosine receptor (see Non-Patent
[0003]
However, no compound having the same strong antagonistic activity as the human A3 adenosine receptor has been found for the A3 adenosine receptor of model animals used for pharmacological evaluation such as mice and rats. Overcoming differences in drug responsiveness, and its efficacy has not been properly evaluated in human disease models. In other words, the inability to substantially evaluate the drug efficacy and side effects of the obtained candidate compounds for drug development against diseases is a major obstacle in developing A3 adenosine receptor antagonists.
[0004]
As one means for solving the problem of such species differences, humanization of model animals, such as expression of human genes in animals, has attracted attention. Expression of a human gene in an animal can be performed using a transgenic technique. For example, transgenic mice expressing human adrenergic β2 receptor (see Non-Patent Document 4) and transgenic mice expressing human bradykinin B2 receptor (see Non-Patent Document 5) have been reported. In these animals, the corresponding gene (ortholog gene) of the original transgenic animal is expressed together with the human gene. On the other hand, by using a method combining positive selection and negative selection, a gene modification called a knock-in that introduces a human gene into the position of a corresponding non-human mammal ortholog gene is used to introduce the gene in place of its own ortholog gene. An animal expressing the human gene can be produced (see
[0005]
[Patent Document 1]
UK Patent Application Publication No. 2264948
[0006]
[Patent Document 2]
WO 98/15555 pamphlet
[0007]
[Patent Document 3]
WO 00/64894 pamphlet
[0008]
[Patent Document 4]
International Publication No. 00/02861 pamphlet
[0009]
[Patent Document 5]
WO 00/10391 pamphlet
[0010]
[Patent Document 6]
WO 00/15231 pamphlet
[0011]
[Patent Document 7]
International Patent Publication No. WO99 / 65912 pamphlet
[0012]
[Patent Document 8]
WO 99/64418 pamphlet
[0013]
[Patent Document 9]
WO 99/51606 pamphlet
[0014]
[Patent Document 10]
WO 97/33879 pamphlet
[0015]
[Patent Document 11]
WO 97/27177 pamphlet
[0016]
[Patent Document 12]
JP-A-11-193281
[0017]
[Patent Document 13]
Japanese Patent Application Laid-Open No. 9-291089
[0018]
[Patent Document 14]
U.S. Pat. No. 5,441,883
[0019]
[Patent Document 15]
U.S. Pat. No. 5,646,156
[0020]
[Patent Document 16]
US Patent 5,557,772
[0021]
[Patent Document 17]
UK Patent Application No. 2320430
[0022]
[Patent Document 18]
WO 99/18191 pamphlet
[0023]
[Non-patent document 1]
FEBS Letters, (Netherlands), 1991, Vol. 284, No. 2, p. 155-160
[0024]
[Non-patent document 2]
(Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America) 89, No. 16, p. 7432-7436
[0025]
[Non-Patent Document 3]
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, No. 21, p. 10365-10369
[0026]
[Non-patent document 4]
European Journal of Biochemistry, (Germany), 1996, Vol. 241, No. 2, p. 417-424
[0027]
[Non-Patent Document 5]
Hypertension, (USA), 1997, Vol. 29, No. 1, p. 488-493
[0028]
[Non-Patent Document 6]
The Journal of Biological Chemistry (USA), 1997, Vol. 272, No. 29, p. 17972-17980
[0029]
[Non-Patent Document 7]
Human Molecular Genetics, (UK), 1997, Vol. 6, No. 7, p. 1153-1162
[0030]
[Non-Patent Document 8]
Cell, (USA), 1996, Vol. 87, No. 4, p. 687-696
[0031]
[Problems to be solved by the invention]
There is a need for non-human mammals that can perform pharmacological evaluation of substances that specifically act on the human A3 adenosine receptor.
[0032]
[Means for Solving the Problems]
The present invention provides the following (1) to (28).
(1) A transgenic non-human mammal that has a DNA encoding a human A3 adenosine receptor in its genome and expresses the receptor.
(2) The transgenic non-human mammal according to (1), wherein the DNA encoding the human A3 adenosine receptor is inserted in both homologous chromosomes, replacing the region encoding the own A3 adenosine receptor. animal.
(3) (1) or (1) wherein the non-human mammal is a non-human mammal selected from the group consisting of mouse, rat, guinea pig, hamster, rabbit, cat, dog, sheep, pig, goat, cow and monkey. The transgenic non-human mammal according to 2).
(4) The method for producing a transgenic non-human mammal according to (1), comprising the following steps (a) to (d).
(A) Step of constructing expression vector containing DNA encoding human A3 adenosine receptor
(B) introducing the expression vector into a fertilized egg of a non-human mammal
(C) transplanting the fertilized egg into the oviduct or uterus of a pseudopregnant female non-human mammal
(D) breeding the non-human mammal and selecting, from the offspring, an individual having a DNA encoding the human A3 adenosine receptor in the genome.
(5) The method for producing a transgenic non-human mammal according to (1), comprising the following steps (a) to (e).
(A) Step of constructing expression vector containing DNA encoding human A3 adenosine receptor
(B) a step of introducing the expression vector into a non-human mammal embryonic stem cell
(C) a step of introducing the embryonic stem cells into a fertilized egg of a non-human mammal
(D) transplanting the fertilized egg into the oviduct or uterus of a pseudopregnant female non-human mammal
(E) breeding the non-human mammal and selecting an individual from the offspring in a genome having DNA encoding the human A3 adenosine receptor
[0033]
(6) The method for producing a transgenic non-human mammal according to (1), comprising the following steps (a) to (e).
(A) Step of constructing expression vector containing DNA encoding human A3 adenosine receptor
(B) a step of incorporating the expression vector into sperm
(C) fertilizing an unfertilized egg of a non-human mammal with the sperm
(D) transplanting the fertilized egg into the oviduct or uterus of a pseudopregnant female non-human mammal
(E) a step of breeding the non-human mammal and selecting an individual having a DNA encoding a human A3 adenosine receptor in the genome from the offspring;
(7) The method for producing a transgenic non-human mammal according to (1), comprising the following steps (a) to (f).
(A) Step of constructing a retroviral vector containing DNA encoding human A3 adenosine receptor
(B) a step of producing a recombinant retrovirus using the retrovirus vector
(C) a step of infecting an unfertilized egg of a non-human mammal with the recombinant retrovirus
(D) a step of in vitro fertilizing the unfertilized egg
(E) transplanting the fertilized egg into the oviduct or uterus of a pseudopregnant female non-human mammal
(F) a step of breeding the non-human mammal and selecting an individual having in its genome a DNA encoding a human A3 adenosine receptor from the offspring of the offspring;
(8) The method for producing a transgenic non-human mammal according to (2), comprising the following steps (a) to (h).
(A) Step of constructing target vector containing DNA encoding human A3 adenosine receptor
(B) a step of introducing the target vector into embryonic stem cells of a non-human mammal
(C) selecting an embryonic stem cell having a chromosome inserted by replacing the DNA encoding the human A3 adenosine receptor with the region encoding the own A3 adenosine receptor
(D) a step of introducing the selected embryonic stem cells into a fertilized egg
(E) transplanting the fertilized egg into the oviduct or uterus of a pseudopregnant female non-human mammal; and (f) breeding the non-human mammal and selecting a germline chimera from the offspring.
(G) mating the germ-line chimera and selecting, from the offspring, an individual having a chromosome in which the DNA encoding the human A3 adenosine receptor has been replaced by the region encoding the own A3 adenosine receptor Process
(H) The individuals obtained in (g) are crossed, and the DNA encoding the human A3 adenosine receptor is replaced with the region encoding the own A3 adenosine receptor in both homologous chromosomes of the offspring. For selecting a homozygote inserted by insertion
(9) The method for producing a transgenic non-human mammal according to (1), comprising the following steps (a) to (e).
(A) Step of constructing expression vector containing DNA encoding human A3 adenosine receptor
(B) Step of introducing the constructed expression vector into cells of a non-human mammal
(C) a step of introducing the nucleus of the cell obtained in (b) into a non-fertilized egg of a denucleated non-human mammal to start development
(D) transplanting the unfertilized egg that has started to develop into the oviduct or uterus of a pseudopregnant female non-human mammal
(E) a step of breeding the non-human mammal and selecting an individual having a DNA encoding a human A3 adenosine receptor in the genome from the offspring;
(10) The method for producing a transgenic non-human mammal according to (2), comprising the following steps (a) to (g).
(A) Step of constructing target vector containing DNA encoding human A3 adenosine receptor
(B) Step of introducing the constructed target vector into a non-human mammal cell
(C) a step of selecting a cell having a chromosome in which the DNA encoding the human A3 adenosine receptor has been replaced with the region encoding the own A3 adenosine receptor
(D) introducing the nucleus of the selected cell into an unfertilized egg of a non-human mammal that has undergone enucleation and initiating development
(E) transplanting the unfertilized egg that has started development into the oviduct or uterus of a pseudopregnant female non-human mammal
(F) breeding the non-human mammal and selecting, from the offspring, an individual having a chromosome into which the DNA encoding the human A3 adenosine receptor has been substituted and inserted into the region encoding the own A3 adenosine receptor Process
(G) The individuals obtained in (f) are bred to each other, and the DNA encoding the human A3 adenosine receptor is replaced with the region encoding the own A3 adenosine receptor in both homologous chromosomes of the offspring. For selecting a homozygote inserted by insertion
[0034]
(11) A cell derived from the transgenic non-human mammal according to (1) or (2).
(12) The cell according to (11), wherein the cell is an egg, sperm or embryonic stem cell.
(13) A method for producing a transgenic non-human mammal, further comprising introducing a foreign gene into the cell according to (11) or (12).
(14) A transgenic non-human mammal produced by the method according to (13).
(15) A method for producing a knockout non-human mammal, comprising introducing a foreign gene into the cell according to (11) or (12) to delete a specific gene.
(16) A knockout non-human mammal produced by the method according to (15).
(17) A disease model non-human mammal expressing a human A3 adenosine receptor, wherein the transgenic non-human mammal according to (1) or (2) is crossed with a disease model animal of the same or different strain. How to make animals.
(18) A disease model non-human mammal expressing a human A3 adenosine receptor, which is produced by the method according to (17).
(19) A method for producing a disease model non-human mammal expressing a human A3 adenosine receptor, wherein the method induces a disease in the transgenic non-human mammal according to (1) or (2).
(20) A disease model non-human mammal expressing the human A3 adenosine receptor, which is produced by the method according to (19).
[0035]
(21) A pharmacological evaluation method of a test substance for a human A3 adenosine receptor, comprising the following steps (a) and (b):
(A) a step of administering a test substance to the non-human mammal according to any one of (1), (2), (14), (16), (18) and (20) and examining a pharmacological effect;
(B) examining the pharmacological effect of the test substance on the non-human mammal by comparing with the pharmacological effect of the test substance not administered to the non-human mammal;
(22) A pharmacological evaluation method of a test substance for a human A3 adenosine receptor, comprising the following steps (a) and (b):
(A) a step of administering a test substance to the cells according to (11) and examining the pharmacological effect;
(B) examining the pharmacological effect of the test substance on the cell by comparing the pharmacological effect with the case where no test substance is administered to the cell;
(23) A pharmacological evaluation method of a test substance for a human A3 adenosine receptor, comprising the following steps (a) to (c).
(A) a step of inducing differentiation of the embryonic stem cells according to (12) and obtaining the differentiated cells; (b) a step of administering a test substance to the differentiated cells obtained in (a) and examining a pharmacological effect
(C) examining the pharmacological effect of the test substance on the differentiated cells obtained in (a) when not administering the test substance to the cells,
(24) The pharmacological evaluation method according to any one of (21) to (23), wherein the test substance is an agonist or antagonist for human A3 adenosine receptor.
(25) The agonist according to (24), wherein the agonist for the human A3 adenosine receptor is a human selective agonist having an agonist activity on the human A3 adenosine receptor at least 10 times that of the non-human mammal on the A3 adenosine receptor. Pharmacological evaluation method described.
(26) The antagonist according to (24), wherein the antagonist to the human A3 adenosine receptor is a human selective antagonist in which the antagonist activity to the human A3 adenosine receptor is 10 times or more that of the non-human mammal to the A3 adenosine receptor. Pharmacological evaluation method described.
(27) A target vector containing DNA encoding human A3 adenosine receptor.
(28) DNA consisting of a sequence of 500 or more consecutive bases of the 1st to 637th base sequence of the base sequence shown in SEQ ID NO: 11 and 500 consecutive bases of the 3735th to 5270th base sequence of the base sequence shown in SEQ ID NO: 11 The target vector according to (27), comprising a DNA having the above sequence.
[0036]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
The transgenic non-human mammal of the present invention expresses the human A3 adenosine receptor and can be used to evaluate a drug that selectively acts on the human A3 adenosine receptor.
Non-human mammals include mice, rats, guinea pigs, hamsters, rabbits, dogs, cats, sheep, pigs, goats, cows or monkeys, and preferably mice, rats, rabbits, monkeys and the like.
[0037]
Hereinafter, the method for producing and using the transgenic non-human mammal of the present invention will be described in detail.
The transgenic non-human mammal expressing the human A3 adenosine receptor of the present invention comprises: 1) a method for producing a transgenic animal for introducing a target gene into an animal individual; 2) a target gene and a target transgene; And 3) a method for preparing a cloned individual using the nucleus of a cell subjected to the intended genetic modification, and the like. Each of these will be specifically described below.
[0038]
1. Production of the transgenic non-human mammal of the present invention using the method for producing a transgenic animal for introducing a gene of interest into an animal individual
(1) Obtaining DNA encoding human A3 adenosine receptor
Examples of the DNA encoding the human A3 adenosine receptor include cDNA and genomic DNA encoding the human A3 adenosine receptor. Genomic DNA may contain introns. The codons of the coding region are not limited to codons in cDNA and genomic DNA, but may be any combination of codons as long as they code for the amino acid sequence of human A3 adenosine receptor. Examples of the DNA encoding the human A3 adenosine receptor include a human A3 adenosine receptor cDNA consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 14.
[0039]
The base sequence database is searched for a human A3 adenosine receptor cDNA sequence or a human A3 adenosine receptor gene genomic sequence, and the base sequence information is obtained. Examples of the genomic sequence of the human A3 adenosine receptor gene that can be obtained from the nucleotide sequence database include, for example, the nucleotide sequences registered under GenBank accession numbers L77729, L77730 and AH003597, and the sequence of the human A3 adenosine receptor cDNA include, for example, GenBank Base sequences registered under the registration numbers L20463, L22607 and NM_000677 can be exemplified.
[0040]
Based on the obtained base sequence information of the DNA encoding the human A3 adenosine receptor, a region of the cDNA sequence or genomic sequence containing the region encoding the human A3 adenosine receptor is appropriately selected, and 5 ′ of this region is selected. A DNA containing a sequence of 20 to 40 bp at the 3 ′ end and a DNA containing a sequence complementary to the sequence of 20 to 40 bp of the 3 ′ end of this region at the 3 ′ end are prepared. Using these DNAs as primers, cDNA encoding human A3 adenosine receptor was isolated by PCR using human cDNA as a template, and genomic DNA encoding human A3 adenosine receptor was isolated by PCR using human genomic DNA as a template. can do.
[0041]
Human cDNA can be made from RNA prepared from human tissues or cells. As a method for preparing total RNA from tissues or cells, guanidine thiocyanate-cesium trifluoroacetate method (Methods @ in @ Enzymology,154, 3,） 1987), guanidine acid thiocyanate-phenol-chloroform method (Analytical Biochemistry,)162, {156, 1987; {Experimental Medicine,}9, $ 1937, $ 1991). Alternatively, kits such as Absolutely RNA RT-PCR miniprep kit (Absolutely RNA RT-PCR Miniprep Kit, manufactured by Stratagene) and RN Easy Mini Kit (RNeasy Minii Kit, manufactured by Qiagen) may be used. Can be prepared. Poly (A) from total RNA+As a method for preparing mRNA as RNA, oligo (dT) -immobilized cellulose column method [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001] (hereinafter referred to as Molecular Cloning) And the like. Furthermore, human tissues can be prepared by using kits such as FastTrack 2.0 mRNA isolation kit (FastTrack 2.0 mRNA Isolation Kit, manufactured by Invitrogen) and QuickPrep mRNA purification kit (QuickPrep mRNA Purification Kit, manufactured by Amersham Bioscience). Alternatively, mRNA can be prepared from cells. Methods for synthesizing cDNA from total RNA or mRNA include Molecular Cloning, Third Edition, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, 1987-2001 (hereinafter abbreviated as Current Protocols in Molecular Biology). Or a commercially available kit, for example, a superscript first-strand synthesis system for RT-PCR (SUPERSCRIPT @ First-StrandSynthesis @ System @ for-RT-PCR, manufactured by Invitrogen), a Prostar first-strand RT-PCR kit (ProSTAR @ First) Strand RT-PCR Kit, manufactured by Stratagene), PCR-Select c NA subtraction Kit (PCR-Select cDNA Subtraction Kit, Clontech) a method using thereof. CDNAs of various human tissues commercially available from Clontech and the like can also be used. Examples of the DNA encoding the human A3 adenosine receptor thus obtained include a DNA having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 14.
[0042]
Human genomic DNA can be prepared from human tissues or cells by the method described in Molecular Cloning, Third Edition. Alternatively, it can be prepared by using a kit such as an easy DNA kit (Easy-DNA @ Kit, manufactured by Invitrogen) or a DNA extraction kit (DNA @ Extraction @ Kit, manufactured by Stratagene). Human genomic DNA commercially available from Clontech, etc. can also be used.
[0043]
(2) Preparation of transgene containing DNA encoding human A3 adenosine receptor
When introducing the DNA encoding the human A3 adenosine receptor obtained in (1) into a non-human mammal, it is preferable to use, as a transgene, an expression vector in which the DNA is ligated downstream of an appropriate promoter.
[0044]
As the promoter used for the expression vector, any promoter can be used as long as it can initiate transcription in cells of a non-human mammal into which DNA encoding the human A3 adenosine receptor is introduced. For example, promoters of genes derived from viruses (cytomegalovirus, Moloney leukemia virus, JC virus, breast cancer virus, simian virus, retrovirus, etc.), various mammals (human, rabbit, dog, cat, guinea pig, hamster, rat, mouse, etc.) And genes derived from birds (such as chickens) [eg, albumin, insulin II, erythropoietin, endothelin, osteocalcin, muscle creatine kinase, platelet-derived growth factor β, keratins K1, K10 and K14, collagen types I and II, atrial natriuretic Factor, dopamine β-hydroxylase, endothelial receptor tyrosine kinase (Tie2), sodium potassium adenosine 3 kinase (Na, K-ATPase), neurofilament light chain, metallo Thionein I and IIA, metalloproteinase 1 tissue inhibitor (TIMP1), MHC class I antigen (H-2L), smooth muscle α-actin, polypeptide chain elongation factor 1α (EF-1α), β-actin, α and β myosin heavy chain , Myosin light chains 1 and 2, myelin basic protein, serum amyloid P component, glycolytic enzymes such as myoglobin, renin, phosphoglycerate kinase (PGK), and genes such as heat shock proteins], enhancers of the above genes A promoter fused with a sequence or a promoter sequence [for example, an SRα promoter consisting of a promoter of an early gene of simian virus 40 (SV40) and a part of a long terminal repeat of human T-cell leukemia virus 1; CAG promoter comprising an early (IE) gene enhancer and a chicken β-actin promoter, etc.], but it is preferable to use the promoter of the A3 adenosine receptor gene, and particularly to use the promoter of the human A3 adenosine receptor gene. preferable. By using a promoter of a gene showing tissue-specific expression, it can be expressed in a specific tissue of a transgenic non-human mammal into which DNA encoding the receptor has been introduced. In addition, it is also possible to control the expression timing, expression amount, etc. of the introduced foreign gene in the following manner in combination with the Cre-loxP system.
[0045]
A DNA encoding a human A3 adenosine receptor in an expression vector is inserted between two loxP sequences, and a transgenic non-human mammal is prepared using the expression vector by the method described later in (3). If Cre recombinase is expressed in the transgenic non-human mammal using an adenovirus vector, the human A3 adenosine receptor is specifically encoded at the site or stage of infection with the adenovirus for Cre recombinase expression. The DNA is deleted, and the expression of the human A3 adenosine receptor can be suppressed. In addition, a transgenic non-human mammal is prepared by introducing a Cre recombinase expression vector using a promoter exhibiting tissue-specific expression, for example, in addition to a human A3 adenosine receptor expression vector by the method described later in (3). By doing so, it is possible to produce a transgenic non-human mammal in which the expression of the human A3 adenosine receptor is suppressed only in a tissue in which Cre recombinase is expressed.
[0046]
The expression vector preferably has a polyadenylation signal required for polyadenylation at the 3 'end of mRNA, downstream of the DNA encoding the human A3 adenosine receptor. Examples of the polyadenylation signal include polyadenylation signals contained in the above-mentioned virus-derived genes, various mammalian and bird-derived genes, such as SV40 late or early gene, rabbit β-globin gene, bovine growth hormone gene, and human A3 adenosine. Examples include polyadenylation signals such as receptor genes. In addition, in order to further express the human A3 adenosine receptor, a part of the splicing signal, enhancer region and intron of each gene is ligated 5 ′ upstream of the promoter region, between the promoter region and the translation region or 3 ′ downstream of the translation region. May be. Hereinafter, a DNA construct comprising a promoter, DNA encoding the human A3 adenosine receptor and a polyadenylation signal is referred to as a human A3 adenosine receptor expression unit.
[0047]
Furthermore, Escherichia coli (Escherichia coli,Less thanE.coliAbbreviated as) to prepare the vector,E.coliReplication start point andE.coliRequires a drug resistance gene containing an endogenous promoter to be a selectable marker for the transformant. As drug resistance genes,E.coliDerived genes such as ampicillin resistance gene (β-lactamase gene), tetracycline resistance gene and kanamycin resistance gene.E.coliExamples of the replication start point that can be replicated in the above include a replication start point of pBR322 and a replication start point of colE1.
[0048]
When a retrovirus is used for gene transfer, a recombinant retrovirus vector in which a human A3 adenosine receptor expression unit is inserted into a retrovirus vector is prepared. By introducing the recombinant retrovirus vector into an appropriate packaging cell, a recombinant retrovirus can be produced. By infecting a fertilized egg or the like with the obtained recombinant retrovirus, a recombinant retrovirus vector can be introduced. For the introduction of the recombinant retrovirus vector into the packaging cells, known gene transfer methods (for example, calcium phosphate method, electric pulse method, lipofection method, aggregation method, microinjection method, particle gun method, DEAE-dextran method, etc.) ) Can be used.
[0049]
(3) Introduction of Expression Vector into Fertilized Eggs and Selection of Transgenic Non-Human Animal The transgenic non-human mammal of the present invention contains the gene containing DNA encoding the human A3 adenosine receptor prepared in (2). It can be produced by introducing into a target non-human mammal. Specifically, an individual obtained by introducing the gene into a fertilized egg, embryonic stem cell (hereinafter abbreviated as ES cell), sperm or unfertilized egg of a target non-human mammal, and generating using these cells From the above, the transgenic non-human mammal of the present invention can be produced by selecting an individual in which the gene containing the DNA encoding the human A3 adenosine receptor is integrated on the chromosome of all cells including germ cells. The presence of the transgene in the created transgenic non-human mammal germ cell can be confirmed by the fact that the offspring of the produced animal have the transgene in all of its germ cells and somatic cells. The selection of the individual is performed by introducing the genomic DNA on a genomic DNA prepared from a tissue constituting the individual, for example, a blood tissue, an epithelial tissue, a connective tissue, a cartilage tissue, a bone tissue, a muscular tissue, an oral tissue or a part of a skeletal tissue. This is done by confirming the presence of the gene at the DNA level. Since the individual selected in this way is usually a heterozygote having the transgene on one of the homologous chromosomes, by mating the heterozygous individuals, the transgene has the transgene on both homologous chromosomes from among the progeny A homozygous animal can be obtained. By mating male and female animals of this homozygote, all offspring become homozygotes stably retaining the gene, so that the transgenic non-human mammal of the present invention can be propagated in a normal breeding environment. Can be replaced.
[0050]
(I) Production of a transgenic non-human mammal by introducing a gene into a fertilized egg
Production of transgenic non-human mammals by gene transfer into fertilized eggs can be performed by the following procedures: Manipulating the Mouse Mouse Embryo A Laboratory Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Laboratories, and the following publications are available. ), Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, (1993),
[0051]
A fertilized egg into which a gene containing DNA encoding the human A3 adenosine receptor is introduced can be obtained by mating a male non-human mammal with a female non-human mammal of the same species. For example, a fertilized egg of a mouse can be obtained by mating a male mouse and a female mouse, preferably an inbred male mouse and a female mouse, and a male rat and a female rat, preferably a Wistar male rat and a Wistar female. By mating the rat, a fertilized egg of the rat is obtained. Although a fertilized egg can be obtained by natural mating, a method of artificially regulating the estrous cycle of a female non-human mammal and then mating it with a male non-human mammal is preferred. As a method for artificially regulating the estrous cycle of a female non-human mammal, for example, a method in which follicle-stimulating hormone and then luteinizing hormone are first administered by, for example, intraperitoneal injection is preferable. Varies depending on the type of non-human mammal. When the non-human mammal is a mouse, a method in which luteinizing hormone is administered to the female mouse about 48 hours after administration of the follicle stimulating hormone to the female mouse, and a fertilized egg is obtained by mating with the male mouse, is preferred. The amount is 2-20 IU / individual, preferably about 5 IU / individual, and the dose of luteinizing hormone is 0-10 IU / individual, preferably about 5 IU / individual. When the non-human mammal is a rat, a method of administering luteinizing hormone to female rats about 48 hours after administration of follicle stimulating hormone to female rats and obtaining fertilized eggs by mating with male rats is preferable. The amount is 20-50 IU / individual, preferably about 30 IU / individual, and the dose of luteinizing hormone is 0-10 IU / individual, preferably about 5 IU / individual. When using inbred mice or rats of the Wister strain, it is preferable to use those that are reared for about 1 week under light conditions (for example, 7:00 to 19:00) for about 12 hours, and are 8 weeks old or older. .
[0052]
The obtained fertilized eggs were microinjected (W. J. Gordon et al .; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, USA).77J., 7380, 1980; {J. {Mullins et al .; {Nature,}344, $ 541, $ 1990; E. {Hammer et al .; Nature,}315, $ 680, $ 1985; G. {Pursel et al .;} Immunol. {Immunopathol. ,17, 303, 1987) or a method using a retrovirus (manipulating mouse Embrio 2nd edition) or the like, and after introducing a gene containing DNA encoding the human A3 adenosine receptor, the fertilized egg is transformed into a female non-human mammal. By artificially transplanting and implanting the animal, a non-human mammal having a chromosomal DNA into which a gene containing a DNA encoding the introduced human A3 adenosine receptor is obtained.
[0053]
When a gene is introduced by the microinjection method, it is preferable to use a fertilized egg in which a male pronucleus has appeared for about 12 to about 24 hours after fertilization. The gene containing the DNA encoding the human A3 adenosine receptor introduced by the microinjection method can be used in any of a circularized state and a linearized state, and the expression of the region encoding the human A3 adenosine receptor and the promoter can be used. It is preferred to introduce the linearization in such a way that the control region is not destroyed. When a gene is introduced by a method using a retrovirus, it is preferable to use a fertilized egg at a developmental stage before the morula embryo (generally, before the 8-cell stage).
[0054]
When a fertilized egg is transplanted into a female non-human mammal, the fertilized egg obtained from the pseudopregnant female non-human mammal in which fertilization has been induced is artificially bred by crossing with a vasectomy male non-human mammal. The method of implanting and implanting is preferred. Pseudopregnant female non-human mammals can also be obtained by natural breeding, but fertilized by administering luteinizing hormone-releasing hormone (hereinafter abbreviated as LHRH) or an analog thereof and mating with male non-human mammals. In addition, a pseudopregnant female non-human mammal in which has been induced can be obtained. As analogs of LHRH, for example, [3,5-diiodo-Tyr]5] -LHRH, [Gln8] -LHRH, [D-Ala6] -LHRH, des-Gly10-[D-His (Bzl)6] -LHRH ethylamide and the like. The dose of LHRH or its analog and the timing of mating with a male non-human mammal after its administration differ depending on the type of non-human mammal. When the non-human mammal is a female rat, it is usually preferable to mate with a male rat about 4 days after administration of LHRH or an analog thereof, and the dose of LHRH or an analog thereof is usually 10 to 10 days. It is 60 μg / individual, preferably about 40 μg / individual.
[0055]
(Ii) Production of transgenic non-human mammal by introducing a gene into ES cells
Production of transgenic non-human mammals by gene transfer into ES cells is described in Manipulating Mouse Embryo 2nd Edition, Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press At Oxford University Press, (1993), Biomanagement Series. Production of mutant mice using ES cells, Yodosha Co., Ltd. (1995), Manual for Developmental Engineering, {How to Make Transgenic Mice, Kodansha Co., Ltd.} (1987), and the like.
[0056]
After introducing a gene containing DNA encoding the human A3 adenosine receptor into ES cells of a non-human mammal, the obtained ES cells are incorporated into a fertilized egg of a non-human mammal by using an assembly chimera method or an injection chimera method. The fertilized eggs are partially transplanted into a female non-human mammal and artificially implanted and implanted into a female non-human mammal to partially introduce cells containing chromosomal DNA incorporating a gene containing DNA encoding the human A3 adenosine receptor. A human mammal chimeric animal is obtained.
[0057]
Non-human mammal ES cells are mouse ES cells (M. J. Evans et al .; Nature,292, {154, {1981}; R. {Martin;} Proc. {Natl. {Acad. {Sci. USA,78, 7634, 1981), rat ES cells (P. M. Iannaccone et al .; Dev. Biol.,).163, 288, ブ タ 1994) Porcine ES cells (M. B. Wheeler; Reprod. Fertil. Dev.,)6Monkey ES cells (J. A. Thomson et al .; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, USA).92, 7844, 1996), and the method of establishing ES cells described in US Pat. No. 5,453,357 or US Pat. No. 5,670,372. AB2.2 (manufactured by Lexicon Genetics) and the like can be used as mouse ES cells.
[0058]
For introducing an exogenous gene into ES cells, known gene transfer methods (for example, calcium phosphate method, electric pulse method, lipofection method, agglutination method, microinjection method, particle gun method, DEAE-dextran method, virus vector method) Etc.) can be used. The gene containing the DNA encoding the human A3 adenosine receptor to be introduced can be used in any of a circularized state and a linearized state. However, the gene encoding the human A3 adenosine receptor and the expression control region such as a promoter are disrupted. It is preferable to introduce in a straightened form in a manner not to do so.
[0059]
A fertilized egg can be obtained by the method described in (i).
When the ES cells are incorporated into a fertilized egg of a non-human mammal by using the chimeric assembly method, it is generally preferable to use a fertilized egg in a developmental stage before the 8-cell stage. When ES cells are incorporated into a fertilized egg of a non-human mammal using the injection chimera method, it is generally preferable to use a fertilized egg in the stage of blastocyst development from the 8-cell stage.
[0060]
When a fertilized egg is transplanted into a female non-human mammal, the fertilized egg obtained from the pseudopregnant female non-human mammal in which fertilization has been induced is artificially bred by crossing with a vasectomy male non-human mammal. A method of transplantation and implantation is preferred, and a pseudopregnant female non-human mammal can be obtained by using the method described in (i).
If the non-human mammal of the ES cell and the non-human mammal of the fertilized egg are of the same species but different in appearance phenotype such as the color of the hair, the individual is a chimeric non-human mammal, and An individual having a high chimera rate (a ratio of cells derived from ES cells, that is, cells having chromosomal DNA into which the introduced exogenous gene has been incorporated) can be easily selected.
[0061]
Among the non-human mammal chimeric animals partially having cells having chromosomal DNA into which a gene containing a DNA encoding human A3 adenosine has been incorporated, an individual having a high chimera rate (preferably male) and an individual of a non-human mammal (preferably Mating female). Human A3 adenosine receptor introduced on genomic DNA prepared from a part of a born pup's tissue, such as blood tissue, epithelial tissue, connective tissue, cartilage tissue, bone tissue, muscle tissue, oral tissue or skeletal tissue The presence of a gene containing DNA encoding the human A3 adenosine receptor introduced into the genomic DNA of all offspring is examined for the presence of a gene containing DNA encoding The parent non-human mammal chimera is selected as the germline chimera. By mating a germline chimera with an individual of a non-human mammal, an individual having a gene containing a DNA encoding the human A3 adenosine receptor introduced on the chromosome of cells of the whole body can be obtained as a pup. This individual is usually a heterozygote having a gene containing the DNA encoding the introduced human A3 adenosine receptor on only one of the homologous chromosomes. Further, by crossing males and females of the individual, a transgenic non-human mammal homozygous containing the gene containing the DNA encoding the human A3 adenosine receptor introduced into both homologous chromosomes can be obtained.
[0062]
(Iii) Preparation of transgenic non-human mammal by gene transfer into sperm
Production of transgenic non-human mammals by gene transfer into sperm has been described by Perry et al. (Science,284, {1180, {1999)} and Wakayama et al. (Nature {Biotechnology,}).16, $ 639, $ 1998).
[0063]
After incorporating the gene containing the DNA encoding the human A3 adenosine receptor prepared in (4) into non-human mammal sperm, the obtained sperm is fertilized into an unfertilized egg using a method of microinsemination, Non-human mammal in which a gene containing DNA encoding human A3 adenosine receptor incorporated into sperm is integrated into a chromosome by artificially transplanting and implanting an egg that has started to develop into a female non-human mammal. Is obtained.
[0064]
In the case of incorporating a foreign gene into sperm, a sperm whose cell membrane has been disrupted is transformed into a medium containing a foreign gene at a concentration of about 0.5 to about 100 ng / mL (preferably 5 to 10 ng / mL) (for example, It is preferable to use a method of incubating for several minutes (preferably about 1 minute) in a CZB medium or NIM medium. As a method for destroying the cell membrane of sperm, a method of treating with a low-concentration (for example, 0.05%) surfactant (for example, Triton X-100 or the like) and a 10% fetal calf serum (hereinafter abbreviated as FCS) are used. ), A method of freeze-drying spermatozoa suspended in a medium (eg, a CZB medium or the like) containing no EDTA and a method of freeze-thawing the sperm suspension are preferred. Sperm whose cell membrane has been destroyed by such a treatment no longer has the ability to spontaneously fertilize, but it promotes embryo development by fertilizing using a microinsemination method using a micromanipulator etc. Can be. In the case of performing microinsemination, a method of injecting the head of a sperm into which an exogenous gene has been incorporated into the cytoplasm of a non-fertilized egg of a female non-human mammal of the same species in metaphase II is preferred.
[0065]
(Iv) Gene transfer into unfertilized eggs and production of transgenic non-human mammals by in vitro fertilization
Production of transgenic non-human mammals by gene transfer into unfertilized eggs and in vitro fertilization was carried out by the method reported by Chan et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, USA).95, $ 14028, $ 1998).
[0066]
Non-human mammals (preferably mice, rats, cows, etc.) are transfected with a retrovirus in which a gene containing DNA encoding the human A3 adenosine receptor has been introduced into an unfertilized egg, thereby introducing the gene. The obtained egg is started to develop using the method of in vitro fertilization, and the fertilized egg that has started to develop is artificially transplanted and implanted into a female non-human mammal, thereby encoding the introduced human A3 adenosine receptor. A non-human mammal having a gene containing DNA integrated on the chromosome is obtained.
[0067]
A retrovirus into which a gene containing a DNA encoding the human A3 adenosine receptor has been incorporated can be prepared by the method described in Manipulating Mouse Embryo Second Edition and the like. When infecting unfertilized eggs with a recombinant retrovirus, it is preferable to use unfertilized eggs from which the zona pellucida has been removed. Methods for removing the zona pellucida of unfertilized eggs include physically removing the membrane using a micromanipulator or the like, or chemically dissolving and removing the membrane using a chemical substance (for example, acidic Tyrode). Is preferred.
[0068]
2. Production of the transgenic non-human mammal of the present invention using a method for producing a gene-replaced animal in which a target gene and a transgene of interest are exchanged.
(1) Obtaining DNA encoding human A3 adenosine receptor
1. According to the method described in (1), a DNA encoding the human A3 adenosine receptor is obtained. As described below, to add the non-coding region of the non-human mammalian A3 adenosine receptor gene to the 5 'and 3' of the region encoding the human A3 adenosine receptor, the code near the start codon and stop codon Since an appropriate restriction enzyme site is required in the region, if such a restriction enzyme site does not exist, select a codon so that the restriction enzyme site can be formed without changing the sequence of the PCR primer and the amino acid sequence to be encoded. And appropriate restriction enzyme sites near the start codon and stop codon in the coding region of the human A3 adenosine receptor.
[0069]
(2) Obtaining genomic DNA containing A3 adenosine receptor gene of non-human mammal
A genomic DNA containing the A3 adenosine receptor gene of a non-human mammal is obtained. The genomic DNA must contain, in addition to the region encoding the A3 adenosine receptor and the intron, regions 5 'and 3' to the region encoding the A3 adenosine receptor. The region 5 'and 3' to the region encoding the A3 adenosine receptor is at least 500 bp, preferably at least 1 kbp, more preferably at least 3 kbp.
[0070]
As a method for preparing a genomic DNA containing the A3 adenosine receptor gene, a method of preparing a genomic DNA library of the non-human mammal and isolating the genomic DNA clone containing the gene by plaque hybridization or colony hybridization Is raised.
A genomic DNA library is obtained by extracting genomic DNA from the cells or tissues of the non-human mammal, partially cutting with a restriction enzyme, inserting the fragment into an appropriate vector,E.coliAnd the like, and can be prepared by introducing into an appropriate host such as Preparation of genomic DNA and genomic DNA library can be prepared by methods described in Molecular Cloning Third Edition, Current Protocols in Molecular Biology, and the like. Examples of the vector include a λ phage vector such as λΔEMBL3 (manufactured by Stratagene), λ DASH II (manufactured by Stratagene), λ FIX II (manufactured by Stratagene), a bacterial artificial chromosome (BAC) vector such as BeroBACII, and pAd10sacBII. And P1 artificial chromosome (PAC) vectors such as pCYPAC1, cosmid vectors such as SuperCosII (manufactured by Stratagene) and the like.
[0071]
Probes used for plaque hybridization or colony hybridization may be those labeled with a partial fragment of the genomic gene of the A3 adenosine receptor of the non-human mammal and a partial fragment of the cDNA of the A3 adenosine receptor. These partial fragments can be obtained by searching a genomic sequence or a cDNA sequence of the A3 adenosine receptor gene of the non-human mammal from a base sequence database and performing PCR using primers prepared based on the base sequence. .
[0072]
Plaque hybridization, colony hybridization, and labeling and preparation of the probe can be performed by methods described in Molecular Cloning Third Edition, Current Protocols in Molecular Biology, and the like.
When the genomic sequence of the A3 adenosine receptor gene of the non-human mammal can be obtained by searching a base sequence database, a region of the genomic sequence to be amplified is appropriately selected, and a sequence of 20 to 40 bp at the 5 'end of this region is selected. At the 3 'end and a DNA complementary at the 3' end to a sequence of 20 to 40 bp of the 3 'end of this region are prepared. Using this DNA as a primer, the genomic DNA of the non-human mammal is prepared. By using PCR as a template, genomic DNA containing the receptor gene of the non-human mammal can be isolated.
[0073]
In addition, a genomic DNA library screening system (manufactured by Genome @ Systems) and a universal genome walker kit (Universal @ GenomeWalker)TMBy using a kit such as Kit (manufactured by Clontech), genomic DNA containing the A3 adenosine receptor gene of the non-human mammal can also be isolated.
Examples of the genomic DNA containing the A3 adenosine receptor gene of a non-human mammal obtained by the above method include a mouse genomic DNA containing a mouse A3 adenosine receptor gene containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 10.
[0074]
(3) Preparation of DNA in which 5 'non-coding region and 3' non-coding region of genomic sequence of non-human mammal A3 adenosine receptor gene are added to both ends of DNA encoding human A3 adenosine receptor
The 5 'end of the region encoding the human A3 adenosine receptor (the region from the initiation codon to the termination codon) of the DNA encoding the human A3 adenosine receptor prepared in (1), which is necessary for homologous recombination, A non-coding region of an appropriate length 5 'to the start codon of the genomic sequence of the A3 adenosine receptor gene is added, and a non-coding region of an appropriate length 3' to the stop codon of the genomic sequence is added to the 3 'end. The DNA to which the region has been added can be obtained as follows. The length of the non-coding region to be added is preferably 500 bp or more, more preferably 1 kbp or more, and still more preferably 3 kbp or more, on both the 3 'and 5' sides.
[0075]
(A) DNA having a sequence of a
[0076]
(4) Preparation of target vector and introduction into ES cells
The target vector for homologous recombination of a non-human mammal ortholog gene was Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press At at Oxford University Press, (1993),
[0077]
As a specific target vector, a vector obtained by inserting a DNA for homologous recombination and an expression unit of the DT gene into ploxpHPRT2 (WO $ 01/33957), for example, non-coding genomic DNA containing the mouse A3 adenosine receptor gene in ploxpHPRT2 PloxP-DT-arm1-HPRT-hA3R-arm2 into which a DNA for homologous recombination comprising a region and a human A3 adenosine receptor cDNA and an expression unit of a DT gene are inserted.
[0078]
For introducing a target vector into ES cells, known gene transfer methods such as a calcium phosphate method, an electric pulse method, a lipofection method, an agglutination method, a microinjection method, a particle gun method, a DEAE-dextran method, and a virus vector method are used. Can be used. The target vector to be introduced can be used in any of a circular and linear form, but it is preferable to introduce the homologous recombination DNA and the homologous recombinant in a form that does not destroy the gene required for selection. .
[0079]
Methods for efficiently selecting homologous recombinants include, for example, Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, (1993),
[0080]
(5) Incorporation of ES cells into fertilized eggs and production of non-human transgenic animals
Incorporation of ES cells into a fertilized egg and transplantation of the fertilized egg into a non-human mammal include: (3) It can be performed by the method described in (ii).
[0081]
From the obtained pups: (3) By the method described in (ii), a heterozygote having a gene replacement by homologous recombination on one of homologous chromosomes of whole body cells can be obtained. Further, by crossing the male and female of the individual, a transgenic non-human mammal having a homozygote having a gene replacement by homologous recombination on both homologous chromosomes can be obtained.
[0082]
The homozygous transgenic non-human mammal thus obtained expresses the human A3 adenosine receptor encoded by the introduced gene, and does not express the A3 adenosine receptor possessed by itself. A mammal. The transgenic non-human mammal of this homozygote comprises: Than the transgenic non-human mammal obtained by the method of 4. And 5. As a non-human mammal used for the pharmacological evaluation of the test substance described later, (a) Since the non-human mammal does not express the A3 adenosine receptor originally expressed, the A3 adenosine receptor is not used for the pharmacological evaluation. It is not necessary to consider the pharmacological effects mediated by the body. This is preferable in that there is almost no possibility of occurrence.
[0083]
3. Production of the transgenic non-human mammal of the present invention using the method for producing a cloned individual using the nucleus of a cell subjected to the intended genetic modification
The transgenic non-human mammals of the present invention may be cloned sheep (I. Wilmut et al .; Nature,385, 810, 1997), cloned bovine (J. B. Cibellli et al .; Science,280, {1256, 1998, Akira Iriya; {protein nucleic acid enzyme,}44, 892, 1999), cloned goats (A. Baguisi et al .; Nature Nature Biotechnology, Inc.).17, 456, 1999), cloned mouse (T. Wakayama et al .; Nature,).394369, 1998; {Wakayama et al .; {Nature} Genetics,}22, # 127, # 1999), for example, can be manufactured as follows.
[0084]
The above 1. Or 2. A gene containing a DNA encoding the human A3 adenosine receptor is introduced into the chromosome of any cell of a non-human mammal (preferably, mouse, sheep, goat, cow, etc.) using the method described in (1). The nucleus of the obtained cells is initialized (operation for returning the nucleus to a state in which development can be repeated again).
Development is initiated by injecting the nuclei of the reprogrammed cells into unfertilized eggs of an enucleated non-human mammal.
[0085]
The transgenic non-human mammal of the present invention that expresses the introduced gene by artificially transplanting and implanting an egg that has started to develop into a female non-human mammal is obtained. Also, 2. In the transgenic non-human mammal obtained by using the nucleus of a cell subjected to gene replacement by the method described in 1, the gene containing the DNA encoding the human A3 adenosine receptor is usually introduced into one of the homologous chromosomes. Since the heterozygotes are heterozygotes, transgenic non-human mammals expressing human A3 adenosine receptors without expressing their own A3 adenosine receptor can be obtained by crossing the obtained heterozygotes. This homozygous transgenic non-human mammal also As non-human mammals used for pharmacological evaluation in the same manner as the homozygous transgenic non-human mammals obtained by the method described in 1. It is preferable to the transgenic non-human mammal obtained by the method described in (1).
[0086]
The method of initializing the nucleus of a cell differs depending on the type of non-human mammal. When the non-human mammal is a sheep, a goat, a cow, or the like, the cells into which the exogenous gene has been introduced are transformed from a medium containing 5 to 30%, preferably 10% FCS (eg, M2 medium) for 3 to 10 days, preferably 3 to 10 days. Is preferably induced in a resting state (G0 phase or G1 phase) by cell culture in an oligotrophic medium containing 0 to 1%, preferably 0.5% FCS for 5 days to initialize. When the non-human mammal is a mouse or the like, a nucleus of a cell into which an exogenous gene has been introduced is injected into an enucleated unfertilized egg of the same type of non-human mammal, and cultured for several hours, preferably for about 1 to 6 hours. It is preferable to perform initialization.
[0087]
The method of starting the reprogrammed nucleus in an enucleated unfertilized egg differs depending on the type of non-human mammal. When the non-human mammal is a sheep, a goat, a cow, or the like, the nucleus that has induced the cell cycle to a quiescent state (G0 phase or G1 phase) and initialized is removed from the same type of non-human mammal by electrofusion or the like. It is preferred that the ovum be activated to start its development by transplantation into a nucleated unfertilized egg. When the non-human mammal is a mouse or the like, an unfertilized egg into which the nucleus of the cell into which the exogenous gene has been introduced is injected is stimulated with an egg activating substance (eg, strontium) to inhibit cell division (eg, cytotoxicity). It is preferable that the generation be started by treating with calasin B) to suppress the release of the second polar body.
[0088]
4. Pharmacological evaluation method of test substance using transgenic non-human mammal of the present invention
A transgenic non-human mammal of the present invention is administered with a test substance, for example, an agonist or antagonist that selectively acts on the human A3 adenosine receptor, and the blood pressure of the animal is compared with that of the animal not administered with the test substance. The pharmacological evaluation of the test substance can be performed by measuring various physical parameters such as respiratory rate and body weight, observing appearance and behavior, and examining pharmacological actions such as histopathological examination.
[0089]
In addition, a pathological model animal in which various diseases are induced in the transgenic non-human mammal of the present invention is prepared, and a test substance, for example, an agonist or antagonist that selectively acts on a human A3 adenosine receptor in the pathological model animal is prepared. And the measurement of various physical parameters such as blood pressure, respiratory rate, body weight, etc., disease state, appearance, behavior observation, histopathological examination, etc. of the disease state model animal. By performing the test in comparison with a model animal, pharmacological evaluation such as the efficacy and side effects of the test substance for the disease can be performed. Further, based on this evaluation, a substance that is preferable as a therapeutic drug for the disease can be selected. In particular, for a drug specific to a human receptor having a higher binding amount to human A3 adenosine receptor and higher activity as an agonist or antagonist than a non-human mammal's A3 adenosine receptor, a normal disease model animal is used. Although the pharmacological evaluation was difficult, the pharmacological evaluation can be performed by using the transgenic animal of the present invention. The disease induced in the transgenic non-human mammal of the present invention includes heart disease (eg, acute heart failure, chronic heart failure, myocarditis, etc.), respiratory disease, joint disease (eg, rheumatoid arthritis, osteoarthritis, etc.) ), Renal diseases (eg, renal failure, glomerulonephritis, IgA nephropathy, etc.), arteriosclerosis, psoriasis, hyperlipidemia, allergic diseases (eg, asthma, allergic rhinitis, atopic dermatitis, etc.), Bone disease (eg, osteoporosis, rickets, osteomalacia, hypocalcemia, etc.), blood disease, cerebrovascular injury, traumatic brain injury, infection, dementia, cancer, diabetes, liver disease, skin disease, Examples include neurodegenerative diseases and chronic inflammatory diseases. The preparation of a disease model animal is performed using a “manual disease model mouse” [Molecular Medicine, Inc.31Extra edition, {Nakayama Shoten Co., Ltd. (1994)], "Pathological animal model for illustration and pharmacology" [Nishimura Shoten Co., Ltd. (1984)], "Arthritis model animal", "Dental Medicine Publishing Co., Ltd. (1985)", "Nerve and muscle. Disease model animals "[Ishin-Denshi Publishing Co., Ltd. (1982)]," Active oxygen and pathology {From disease models to bedside "", and so on.
[0090]
4. The present pharmacological evaluation method and And 8. As test substances to be used in the pharmacological evaluation method described below, antagonists to A3 adenosine receptor (WO98 / 15555; WO00 / 64894; WO00 / 02861; WO00 / 10391; WO00 / 15231; WO99 / 65512; WO99 / 64418; WO99 / 51606; WO97 / 33879; WO97 / 27177; JP-A-11-193281; JP-A-9-291089; US Pat. No. 5,441,883; US Pat. No. 5,646,156; US Pat. No. 5,573,772; GB2320430).
[0091]
5. Pharmacological evaluation method of test substance using cells obtained from transgenic non-human mammal of the present invention
Various cells obtained from the transgenic non-human mammal of the present invention are brought into contact with a test substance and compared with cells in the absence of the test substance.2+By examining pharmacological actions such as various cell responses such as an increase in concentration and changes in cell morphology, pharmacological evaluation of a test substance with respect to the test substance can be performed.
[0092]
Various types of cells can be obtained by inducing differentiation of ES cells obtained from the transgenic non-human mammal of the present invention. As a method of inducing differentiation, a method of inducing a teratoma (teratoma) mixed with various tissues by implanting ES cells subcutaneously into animals of the same type and same strain (manipulating mouse Embrio 2nd edition) By culturing in vitro under appropriate conditions, endoderm cells, ectoderm cells, mesoderm cells, blood cells, endothelial cells, chondrocytes, skeletal muscle cells, smooth muscle cells, cardiomyocytes, nerve cells, glial cells, epithelium Method for inducing differentiation into cells, melanocytes, and keratinocytes (Reprod. {Fertil.} Dev.,}10, $ 31, $ 1998). The differentiated cells are brought into contact with a test substance, and compared with cells in the absence of the test substance, the intracellular Ca2+By examining pharmacological effects such as various cell responses such as an increase in concentration and changes in cell morphology, pharmacological evaluation of a test substance on the cells can be performed. By these methods, pharmacological evaluation can be performed on cells that are difficult to remove from a human body or cells that exist only in a small number.
[0093]
6. Preparation of Genetically Modified Animal Using ES Cell, Egg, Sperm or Nucleus of Transgenic Non-Human Mammal of the Present Invention
Using ES cells, eggs, sperm or nuclei obtained from the transgenic non-human mammal of the present invention, ~ 3. By the method described in (1), a genetically modified non-human mammal expressing the human A3 adenosine receptor and further modifying the gene on the chromosome can be obtained. In particular, a gene that is known to cause a disease state that disrupts the function of the gene, Knockout animals deficient using the homologous recombination method described in 1) and dominant negative genes that inhibit the function of the gene. Or 3. The transgenic animal introduced and expressed by the method described in (1) is useful as a disease model animal.
[0094]
7. Production of a genetically modified animal by crossing the transgenic non-human mammal of the present invention with an animal of the same species or other strain, and use of the produced genetically modified animal
By crossing the transgenic non-human mammal of the present invention with an animal of the same or different strain (for example, a human disease model animal), the human A3 adenosine receptor is expressed and a certain expression system (for example, Genetically modified mammal exhibiting the above symptoms) can be obtained. If the animal to be bred is a human disease model animal, a pathological model animal that expresses human A3 adenosine receptor and exhibits a symptom similar to a human pathological condition as an expression system can be obtained. Methods of mating include in vitro fertilization in addition to natural mating. As the disease model animal, any disease model animal can be used, regardless of whether the disease is congenital or acquired. For example, an acquired pathological model animal is a "manual disease model mouse" [Molecular Medicine, Inc.]31Extra edition, {Nakayama Shoten Co., Ltd. (1994)], "Pathological animal model for illustration and pharmacology" [Nishimura Shoten Co., Ltd. (1984)], "Arthritis model animal", "Dental Medicine Publishing Co., Ltd. (1985)", "Nerve and muscle. Disease model animals "[Ishin-Denshi Publishing Co., Ltd. (1982)]," Active oxygen and pathology {From disease models to bedside "", Gakkai Shuppan Center (1992), and the like.
[0095]
8. Pharmacological evaluation of test substances using genetically modified animals
A test substance, for example, an agonist or antagonist acting on an A3 adenosine receptor is administered to the genetically modified disease model animal obtained by the method described in 6 or 7, and the blood pressure, respiratory rate, body weight, etc. of the disease model animal are measured. By measuring various physical parameters, observing the disease state, appearance, behavior, histopathological examination, and the like, in comparison with the disease state model animal to which the test substance is not administered, the test substance is effective against the disease. Pharmacological evaluation of sex and side effects can be performed. Further, based on this evaluation, a substance that is preferable as a therapeutic drug for the disease state can be selected. In particular, a drug selective for the human receptor, which has a higher activity as an agonist or antagonist for the human A3 adenosine receptor than the non-human mammal's A3 adenosine receptor, is a pharmacological method using a normal disease model animal. Although evaluation was difficult, pharmacological evaluation can be performed by using the above genetically modified disease model animal.
Hereinafter, examples of the present invention will be described.
[0096]
【Example】
Example 1 Isolation of cDNA for Human A3 Adenosine Receptor
(1) Synthesis of cDNA derived from human liver
Human liver poly A purchased from Clontech+ＣＤＮＡ Using 4 μg of RNA as a template, cDNA was obtained according to the attached manual using a superscript preamplification system for synthesizing first-strand cDNA (SuperScript \ Preamplification \ System \ for \ first \ strand \ Synthesis, manufactured by Invitrogen).
[0097]
(2) Isolation of human A3 adenosine receptor cDNA by PCR
Subsequently, PCR was performed using the obtained human liver-derived cDNA as a template. That is, M. R. {A report by Atkinson et al. (Neurosci. {Res.,}29, 1, 1997), a 24-mer primer having the base sequence of SEQ ID NO: 1 based on the base sequence of human genomic DNA containing the human A3 adenosine receptor gene (GenBank accession numbers: L77729 and L77730), And a 25-mer primer having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 was prepared. Using these primers, a PCR reaction solution was prepared using human liver-derived cDNA as a template, reacted at 94 ° C. for 5 minutes, and then repeated 30 times at 94 ° C. for 1 minute and at 68 ° C. for 2 minutes. . After performing PCR again in the same manner as described above using 2 μL of this PCR reaction solution, the PCR reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis, and a DNA fragment of about 1 kbp containing human A3 adenosine receptor cDNA was transcribed into GeneClean II. Using a kit (GENECEAN II II Kit, manufactured by BIO101), the cells were collected according to the attached manual.
[0098]
(3) Construction of plasmid pBS-hA3R having human A3 adenosine receptor cDNA
Next, 250 ng of the recovered DNA fragment containing the human A3 adenosine receptor cDNA (about 1 kbp) and 50 ng of the plasmid pT7Blue @ T-Vector (Novagen) were dissolved in 10 μL of distilled water, and the DNA ligation kit Ver. 2 (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) was added in an amount of 10 μL, and a binding reaction was carried out at 16 ° C. for 2 hours.
[0099]
Using the reaction solutionE.coliDH5α was transformed by the method of Cohen et al.r) Strain was obtained. From this transformant, the method of Birnboim et al. (Nuc. {Acids Res.,})7, 1513, 1979). The structure of the obtained plasmid was confirmed by restriction enzyme digestion. The nucleotide sequence was determined using a DNA sequencer 377 (manufactured by Applied Biosystems), and the sequence of the human A3 adenosine receptor cDNA contained in the plasmid was confirmed. Was the same as SEQ ID NO: 3 shows the nucleotide sequence of the obtained human A3 adenosine receptor cDNA, and SEQ ID NO: 4 shows the amino acid sequence of the human A3 adenosine receptor encoded by the cDNA. Hereinafter, this plasmid is referred to as pBS-hA3R. The construction process of pBS-hA3R is shown in FIG.
[0100]
Example 2 Isolation and Analysis of Mouse Genomic DNA Containing Mouse A3 Adenosine Receptor Gene
(1) Screening of mouse genomic DNA containing mouse A3 adenosine receptor gene
PCR primers for determining a clone having the sequence of the mouse A3 adenosine receptor gene by PCR were prepared. That is, Z.報告 A report by Zhao et al. (Genomics,57, 1, 1999), which has a base sequence represented by SEQ ID NO: 5, which amplifies a region including a part of
[0101]
(2) Isolation of mouse genomic DNA containing mouse A3 adenosine receptor gene
aboveE.coliプ ラ ス ミ ド A plasmid was isolated from the DH10B strain clone according to the method of Burnboim et al. The plasmid was named pmA3R / BeloBacII. Next, the obtained plasmid was treated with each restriction enzyme as follows, and Southern hybridization was performed using a radioisotope-labeled DNA probe containing the mouse A3 adenosine receptor gene sequence.
[0102]
First, 100 ng of the pmA3R / BeloBacII plasmid isolated above was used.SacI,SacII,NotI,XbaI,SpeI,BamHI,SmaI,PstI,EcoRI,EcoRV,HindIII,ClaI,HincII,AccI,SalI,XhoI,ApaI,KpnAfter complete digestion by performing a digestion reaction at 37 ° C. for 6 hours using 12 units of each restriction enzyme I (manufactured by Takara Shuzo) according to the attached manual, a pulse field device [manufactured by Bio-Rad (BIO-RAD)] Agarose gel electrophoresis (separation fragment size: using a program for 5-150 kbp) and further using the method of Southern (J. {Mol.98, $ 503, $ 1975) with a nylon filter [HybondTM) -N +; manufactured by Amersham Bioscience). Next, in order to prepare a probe used for Southern hybridization, PCR was performed using mouse genomic DNA as a template. That is, a 20-mer primer having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 7 and a 20-mer primer having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 8 for amplifying DNA containing a region encoding mouse A3 adenosine receptor in
[0103]
Each of the labeled probes was hybridized with the filter prepared above overnight, and 2 × SSPE (300 mmol / L NaCl, 20 mmol / L NaH) containing 0.1% sodium dodecyl sulfate (SDS) was used.2PO4, 2 mmol / L EDTA, pH 7.4) at 65 ° C. for 3 times, 0.2 × SSPE containing 0.1% SDS (30 mmol / L NaCl, 2 mmol /
[0104]
As a result of this hybridization, the pmA3R / BeloBacII plasmid wasEcoIt was shown that cleavage with RI yields a DNA fragment of about 9
Subsequently, 5 μg of the above-mentioned pmA3R / BeloBacII plasmid was dissolved in 100 μL of Universal Buffer H (Takara Shuzo) and 60 units ofEcoRI was added and a digestion reaction was performed at 37 ° C. for 16 hours. After the reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis, a DNA fragment of about 9
[0105]
1 μg of plasmid pBluescriptII @ SK (-) (manufactured by Stratagene) was dissolved in 50 μL of Universal Buffer H and 12 units ofEcoRI was added and a digestion reaction was performed at 37 ° C. for 16 hours. After extracting the reaction solution with phenol / chloroform, a DNA fragment of about 3 kbp was recovered by an ethanol precipitation method. The recovered DNA was dissolved in 50 μL of a buffer for alkaline phosphatase, and 40 units of alkaline phosphatase derived from bovine small intestine was added, followed by a reaction at 50 ° C. for 3 hours. After phenol / chloroform extraction, a DNA fragment of about 3 kbp dephosphorylated by the ethanol precipitation method was recovered.
[0106]
from the pmA3R / BeloBacII plasmidEco10 ng of a mouse genomic DNA fragment (about 9 kbp) containing
[0107]
Using the reaction solutionE.coliDH5α was transformed by the method of Cohen et al.rGot the strain. Plasmid DNA was isolated from this transformant according to the method of Burnboim et al. The structure of the obtained plasmid was confirmed by restriction enzyme digestion. Hereinafter, these plasmids are referred to as pBS-ex1 and pBS-ex2.
[0108]
(3) Analysis of mouse genomic DNA containing mouse A3 adenosine receptor gene
1 μg each of pBS-ex1 and pBS-ex2SacI,SacII,NotI,XbaI,SpeI,BamHI,SmaI,PstI,EcoRI,EcoRV,HindIII,ClaI,HincII,AccI,SalI,XhoI,ApaI,KpnUsing 12 units of each restriction enzyme I (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.), digestion was carried out at 37 ° C. for 16 hours in accordance with the attached manual, followed by complete digestion, followed by agarose gel electrophoresis. From the results, the position of the recognition sequence for each restriction enzyme present in the mouse genomic DNA of about 15.5
Next, using a DNA sequencer 377, the nucleotide sequence from a region of about 300 bp upstream of
[0109]
Example 3 Construction of Target Vector for Replacing Mouse A3 Adenosine Receptor Gene with DNA Encoding Human A3 Adenosine Receptor
About 5 kbp upstream of
[0110]
(1) Construction of plasmid ploxP-HPRT-hA3R-arm2
Plasmid ploxpHPRT2 in which the hprt gene connected downstream of the PGK promoter is present between the two loxP sequences.SmaI /BamBetween the HI sites, in the untranslated region of
[0111]
3 μg of the plasmid pBS-ex2 prepared in Example 2 (2) was dissolved in 100 μL of Universal Buffer M (manufactured by Takara Shuzo) containing 0.01% bovine serum albumin (hereinafter abbreviated as BSA), and 75 units of the solution were added.XbaI was added and a digestion reaction was performed at 37 ° C. for 12 hours. After extracting the reaction solution with phenol / chloroform, a DNA fragment was recovered by an ethanol precipitation method. The DNA fragment was dissolved in 100 μL of Universal Buffer L (Takara Shuzo) and 75 units ofApaI was added and a digestion reaction was performed at 37 ° C. for 12 hours. After extracting the reaction solution with phenol / chloroform, a DNA fragment was recovered by an ethanol precipitation method. The DNA fragment was dissolved in 10 μL of distilled water, and after agarose gel electrophoresis, a DNA fragment of about 4 kbp was recovered using a GeneClean II kit according to the attached manual. Subsequently, both ends of the recovered DNA fragment were subjected to a blunting treatment using a DNA blunting kit (manufactured by Takara Shuzo) according to the attached manual. After extracting the reaction solution with phenol / chloroform, a DNA fragment was recovered by an ethanol precipitation method. This DNA fragment was dissolved in 15 μL of Universal Buffer K (Takara Shuzo), and 7.5 units ofBamHI was added and digestion reaction was performed at 37 ° C. for 10 hours. After the reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis, a DNA fragment of about 2.8 kbp was recovered using a GeneClean II kit according to the attached manual. This fragment is located in the untranslated region of
[0112]
2.8 μg of plasmid ploxpHPRT2 (WOＷ01 / 33957) was dissolved in 100 μL of Universal Buffer T (manufactured by Takara Shuzo) containing 0.01% BSA, and 75 units ofSmaI was added and a digestion reaction was performed at 37 ° C. for 16 hours. After extracting the reaction solution with phenol / chloroform, a DNA fragment was recovered by an ethanol precipitation method. The DNA fragment is dissolved in 100 μL of Universal Buffer K and 75 units ofBamHI was added and a digestion reaction was performed at 37 ° C. for 12 hours. After extracting the reaction solution with phenol / chloroform, DNA fragments were recovered by an ethanol precipitation method and dissolved in 20 μL of distilled water.
[0113]
90 ng of the mouse genomic DNA fragment (about 2.8 kbp) containing
Using the reaction solutionE.coliDH5α was transformed by the method of Cohen et al.rGot the strain. Plasmid DNA was isolated from this transformant according to the method of Burnboim et al. The structure of the obtained plasmid was confirmed by restriction enzyme digestion. Further, the nucleotide sequence was determined using a DNA sequencer 377, and the sequence contained in the plasmid was confirmed. Hereinafter, this plasmid is referred to as “ploxP-HPRT-hA3R-arm2”.
[0114]
(2) Construction of plasmid ploxP-RE-HPRT-hA3R-arm2
In plaxP-HPRT-hA3R-arm2 constructed in (1)EcoWith RISacThe plasmid ploxP-RE-HPRT-hA3R-arm2 to which the II recognition sequence was added was constructed as follows (see FIG. 6).
[0115]
2 μg of plasmid ploxP-HPRT-hA3R-arm2 was dissolved in 100 μL of Universal Buffer K and 40 units ofHpaI was added and a digestion reaction was performed at 37 ° C. for 16 hours. After extracting the reaction solution with phenol / chloroform, a DNA fragment was recovered by an ethanol precipitation method. This DNA fragment was dissolved in 100 μL of Universal Buffer L, and 50 units ofKpnI was added and a digestion reaction was performed at 37 ° C. for 16 hours. After extracting the reaction solution with phenol / chloroform, a DNA fragment was recovered by an ethanol precipitation method. After dissolving the DNA fragment in 15 μL of distilled water, agarose gel electrophoresis was performed, and a DNA fragment of about 9 kbp was recovered using a GeneClean II kit according to the attached manual.
[0116]
Subsequently, a 38-mer synthetic oligo DNA represented by SEQ ID NO: 12 and a 34-mer synthetic oligo DNA represented by SEQ ID NO: 13 were prepared, 10 pmol of each was added to 100 μL of distilled water, heated at 90 ° C. for 10 minutes and then room temperature To allow annealing.
Derived from plasmid ploxP-HPRT-hA3R-arm2, obtained aboveHpaI-KpnI fragment (about 9 kbp) (30 ng) and annealed synthetic oligo DNA (0.2 pmol) were dissolved in 10 μL of distilled water, and ligation kit Ver. 10 μL of 2 I solution was added, and the binding reaction was performed at 16 ° C. for 1 hour.
[0117]
Using the reaction solutionE.coliDH5α was transformed by the method of Cohen et al.rGot the strain. Plasmid DNA was isolated from this transformant according to the method of Burnboim et al. The structure of the obtained plasmid was confirmed by restriction enzyme digestion. Further, the nucleotide sequence was determined using a DNA sequencer 377, and the sequence contained in the plasmid was confirmed. Hereinafter, this plasmid is referred to as ploxP-RE-HPRT-hA3R-arm2.
[0118]
(3) Construction of plasmid A3R-C1
A plasmid A3R-C1 having a mouse genomic DNA of about 1.8 kbp containing a polyadenylation signal present in
[0119]
5 μg of plasmid pBS-ex2 was dissolved in 100 μL of Universal Buffer K, and 30 units ofPstI and 30 unitsBamAfter adding HI and performing a digestion reaction at 37 ° C. for 16 hours, the reaction solution was extracted with phenol / chloroform, and then a DNA fragment was recovered by an ethanol precipitation method. The DNA fragment was dissolved in 20 μL of distilled water, and after agarose gel electrophoresis, a DNA fragment of about 1.8 kbp was recovered using a GeneClean II kit according to the attached manual.
[0120]
Dissolve 2.8 μg of pBluescriptII @ SK (-) in 100 μL of Universal Buffer K and add 30 units ofPstI and 30 unitsBamHI was added and digestion reaction was performed at 37 ° C. for 24 hours. After extracting the reaction solution with phenol / chloroform, a DNA fragment was recovered by an ethanol precipitation method.
100 ng of the mouse genomic DNA fragment (about 1.8 kbp) containing the polyadenylation signal present in
[0121]
Using the reaction solutionE.coliDH5α was transformed by the method of Cohen et al.rGot the strain. Plasmid DNA was isolated from this transformant according to the method of Burnboim et al. The structure of the obtained plasmid was confirmed by restriction enzyme digestion. Further, the nucleotide sequence was determined using a DNA sequencer 377, and the sequence contained in the plasmid was confirmed. Hereinafter, this plasmid is referred to as A3R-C1.
[0122]
(4) Construction of plasmid A3R-C2
About 1.6 kbp of the sequence downstream of the polyadenylation signal was removed from the plasmid A3R-C1, andSacThe plasmid A3R-C2 to which the II recognition sequence was added was constructed as follows (see FIG. 8).
[0123]
Dissolve 2 μg of plasmid A3R-C1 in 100 μL of Universal Buffer M and add 50 units ofHinAfter cII was added and digestion reaction was performed at 37 ° C. for 16 hours, the reaction solution was extracted with phenol / chloroform, and then a DNA fragment was recovered by an ethanol precipitation method. The DNA fragment is dissolved in 100 μL of Universal Buffer L and 50 units ofKpnI was added and a digestion reaction was performed at 37 ° C. for 16 hours. After extracting the reaction solution with phenol / chloroform, a DNA fragment was recovered by an ethanol precipitation method. After dissolving the DNA fragment in 20 μL of distilled water, agarose gel electrophoresis was performed, and a DNA fragment of about 3.2 kbp was recovered using a GeneClean II kit according to the attached manual.
[0124]
Subsequently, a 17-mer synthetic oligo DNA represented by SEQ ID NO: 14 and a 13-mer synthetic oligo DNA represented by SEQ ID NO: 15 were prepared, 10 pmol of each was added to 100 μL of distilled water, heated at 90 ° C. for 10 minutes, and then room temperature The respective synthetic oligo DNAs were annealed by returning to the above.
The plasmid A3R-C1 derived from the plasmid obtained by removing about 1.6 kbp of the mouse genomic DNA sequence obtained above.HincII-Kpn30 ng of the I fragment (about 3.2 kbp) and 0.2 pmol of the annealed synthetic oligo DNA were dissolved in 10 μL of distilled water, and the ligation kit Ver. 10 μL of 2 I solution was added, and the binding reaction was performed at 16 ° C. for 1 hour.
[0125]
Using the reaction solutionE.coliDH5α was transformed by the method of Cohen et al.rGot the strain. Plasmid DNA was isolated from this transformant according to the method of Burnboim et al. The structure of the obtained plasmid was confirmed by restriction enzyme digestion. Hereinafter, this plasmid is referred to as A3R-C2.
[0126]
(5) Construction of plasmid A3R-C3
The human A3 adenosine receptor cDNA has a sequence obtained by adding 380 bp downstream of the stop codon of
[0127]
To add a 13 bp 3 'end of the A3 adenosine receptor encoding region (including the stop codon) of the human A3 adenosine receptor cDNA to the 380 bp 5' downstream of the stop codon of the mouse A3 adenosine
[0128]
Dissolve 2.8 μg of plasmid pBluescriptII @ SK (-) in 50 μL of Universal Buffer K and add 30 units ofBamHI was added and digestion reaction was performed at 37 ° C. for 16 hours. After the reaction solution was extracted with ethanol / chloroform, a DNA fragment was recovered by an ethanol precipitation method. Subsequently, this DNA fragment was dissolved in 20 μL of Universal Buffer H and 12 units ofEcoRI was added and a digestion reaction was performed at 37 ° C. for 16 hours. After extracting the reaction solution with ethanol / chloroform, a DNA fragment of about 3 kbp was recovered by an ethanol precipitation method.
[0129]
A 380 bp downstream from the stop codon of the mouse A3 adenosine
[0130]
Using the reaction solutionE.coliDH5α was transformed by the method of Cohen et al.rGot the strain. Plasmid DNA was isolated from this transformant according to the method of Burnboim et al. The structure of the obtained plasmid was confirmed by restriction enzyme digestion. Further, the nucleotide sequence was determined using a DNA sequencer 377, and the sequence contained in the plasmid was confirmed. Hereinafter, this plasmid is referred to as A3R-C3.
[0131]
(6) Construction of plasmid A3R-C4
Plasmid A3R-C4 in which a mouse genomic DNA sequence containing a polyadenylation signal was added downstream of a sequence derived from mouse A3 adenosine
[0132]
1 μg of plasmid A3R-C2 was dissolved in 100 μL of Universal Buffer T containing 0.01% BSA and 20 units ofSacII was added and digestion reaction was performed at 37 ° C. for 20 hours. After extracting the reaction solution with phenol / chloroform, a DNA fragment was recovered by an ethanol precipitation method. This DNA fragment was dissolved in 20 μL of Universal Buffer K, and 15 units ofBamHI was added and digestion reaction was performed at 37 ° C. for 16 hours. The reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis, and a DNA fragment of about 150 bp was recovered using a Geneclean II kit according to the attached manual.
[0133]
2 μg of plasmid A3R-C3 was dissolved in 100 μL of Universal Buffer T containing 0.01% BSA and 20 units ofSacII was added and digestion reaction was performed at 37 ° C. for 20 hours. After extracting the reaction solution with phenol / chloroform, a DNA fragment was recovered by an ethanol precipitation method. This DNA fragment was dissolved in 20 μL of Universal Buffer K, and 15 units ofBamHI was added and digestion reaction was performed at 37 ° C. for 16 hours. The reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis, and a DNA fragment of about 3.4 kbp was recovered using a GeneClean II kit according to the attached manual.
[0134]
10 ng of the mouse genomic DNA fragment (about 150 bp) containing the polyadenylation signal present in
[0135]
Using the reaction solutionE.coliDH5α was transformed by the method of Cohen et al.rGot the strain. Plasmid DNA was isolated from this transformant according to the method of Burnboim et al. The structure of the obtained plasmid was confirmed by restriction enzyme digestion. Further, the nucleotide sequence was determined using a DNA sequencer 377, and the sequence contained in the plasmid was confirmed. Hereinafter, this plasmid is referred to as A3R-C4.
[0136]
(7) Construction of plasmid ploxP-RE-C-HPRT-hA3R-arm2
Upstream of the hprt gene of the plasmid ploxP-RE-HPRT-hA3R-arm2, a DNA fragment derived from the plasmid A3R-C4 (downstream 13 bp of the 3 'end of the region encoding the A3 adenosine receptor of the human A3 adenosine receptor cDNA, A mouse genomic DNA containing a polyadenylation signal downstream of the stop codon of the A3 adenosine receptor geneHincThe plasmid ploxP-RE-C-HPRT-hA3R-arm2 into which the DNA having the region up to the II site was added was constructed as follows (see FIG. 11).
[0137]
3 μg of plasmid A3R-C4 was dissolved in 100 μL of Universal Buffer T containing 0.01% BSA and 50 units ofSacII was added and a digestion reaction was performed at 37 ° C. for 16 hours. After extracting the reaction solution with phenol / chloroform, a DNA fragment was recovered by an ethanol precipitation method. This DNA fragment was dissolved in 20 μL of Universal Buffer H and 12 units ofEcoThe digestion reaction was performed at 37 ° C. for 6 hours after adding RI. The reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis, and a DNA fragment of about 500 bp was recovered using a GeneClean II kit according to the attached manual.
[0138]
3.2 μg of plasmid ploxP-RE-HPRT-hA3R-arm2 was dissolved in 100 μL of Universal Buffer T containing 0.01% BSA and 50 units ofSacII was added and a digestion reaction was performed at 37 ° C. for 16 hours. After extracting the reaction solution with phenol / chloroform, a DNA fragment was recovered by an ethanol precipitation method. This DNA fragment was dissolved in 20 μL of Universal Buffer H and 12 units ofEcoThe digestion reaction was performed at 37 ° C. for 6 hours after adding RI. The reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis, and a DNA fragment of about 8.5 kbp was recovered using a GeneClean II kit according to the attached manual.
[0139]
Derived from plasmid A3R-C4 obtained aboveSacII-Eco50 ng of the RI fragment (about 500 bp) and the plasmid ploxP-RE-HPRT-hA3R-arm2SacII-Eco200 ng of the RI fragment (about 8.5 kbp) was dissolved in 10 μL of distilled water, and the ligation kit Ver. 10 µL of 2 I solution was added, and the binding reaction was performed at 16 ° C for 2 hours.
Using the reaction solutionE.coliDH5α was transformed by the method of Cohen et al.rGot the strain. Plasmid DNA was isolated from this transformant according to the method of Burnboim et al. The structure of the obtained plasmid was confirmed by restriction enzyme digestion. Further, the nucleotide sequence was determined using a DNA sequencer 377, and the sequence contained in the plasmid was confirmed. Hereinafter, this plasmid is referred to as ploxP-RE-C-HPRT-hA3R-arm2.
[0140]
(8) Construction of plasmid A3R-N1
A plasmid A3R-N1 having a mouse genomic DNA sequence of about 350 bp upstream of the initiation codon of the mouse A3 adenosine receptor gene was constructed as follows (see FIG. 12).
[0141]
To obtain a mouse
[0142]
Dissolve 2.8 μg of plasmid pBluescriptII @ SK (-) in 50 μL of Universal Buffer K and add 30 units ofBamHI was added and digestion reaction was performed at 37 ° C. for 16 hours. After the reaction solution was extracted with ethanol / chloroform, a DNA fragment was recovered by an ethanol precipitation method. Subsequently, this DNA fragment was dissolved in 20 μL of Universal Buffer H and 12 units ofEcoRI was added and a digestion reaction was performed at 37 ° C. for 16 hours. After extracting the reaction solution with ethanol / chloroform, a DNA fragment of about 3 kbp was recovered by an ethanol precipitation method.
[0143]
50 ng of a DNA fragment of about 350 bp upstream from the initiation codon of the mouse A3 adenosine receptor gene obtained above and plasmid pBluescriptII @ SK (-)-derivedBamHI-Eco50 ng of the RI fragment (about 3 kbp) was dissolved in 10 μL of distilled water, and ligation kit Ver. 10 µL of 2 I solution was added, and the binding reaction was performed at 16 ° C for 2 hours.
Using the reaction solutionE.coliDH5α was transformed by the method of Cohen et al.rGot the strain. Plasmid DNA was isolated from this transformant according to the method of Burnboim et al. The structure of the obtained plasmid was confirmed by restriction enzyme digestion. Further, the nucleotide sequence was determined using a DNA sequencer 377, and the sequence contained in the plasmid was confirmed. Hereinafter, this plasmid is referred to as A3R-N1.
[0144]
(9) Construction of plasmid A3R-N2
A plasmid A3R-N2 having a nucleotide sequence of about 200 bp downstream from the initiation codon of the human A3 adenosine receptor cDNA was constructed as follows (see FIG. 13).
[0145]
In order to obtain a DNA fragment of about 200 bp downstream from the initiation codon of the human A3 adenosine receptor cDNA sequence, PCR was performed using plasmid pBS-hA3R as a template. That is, a 28-mer primer having the base sequence of SEQ ID NO: 20 and a 26-mer primer having the base sequence of SEQ ID NO: 21 based on the sequence of the human A3 adenosine receptor cDNA were prepared. Using these primers, a reaction solution for PCR was prepared using pBS-hA3R as a template and reacted at 94 ° C for 5 minutes, followed by a cycle of 94 ° C for 1 minute, 52 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 1 minute Was repeated for 8 cycles, followed by a further 22 cycles of a cycle of 94 ° C. for 1 minute and 68 ° C. for 2 minutes, and PCR was performed under the condition of storing at 4 ° C. overnight.
[0146]
After extracting the PCR reaction solution with phenol / chloroform, a DNA fragment of about 350 bp was recovered by an ethanol precipitation method. The DNA fragment is dissolved in 100 μL of Universal Buffer K and 75 units ofBamHI was added and digestion reaction was performed at 37 ° C. for 20 hours. Subsequently, the reaction solution was extracted with phenol / chloroform, and then a DNA fragment was recovered by an ethanol precipitation method. The DNA fragment was dissolved in 100 μL of Universal Buffer H and 60 units ofEcoRI was added and a digestion reaction was performed at 37 ° C. for 16 hours. After extracting the reaction solution with phenol / chloroform, a DNA fragment was recovered by an ethanol precipitation method. The DNA fragment was subjected to agarose gel electrophoresis, and a DNA fragment of about 200 bp was recovered using a GeneClean II kit according to the attached manual.
[0147]
Dissolve 2.8 μg of plasmid pBluescriptII @ SK (-) in 50 μL of Universal Buffer K and add 30 units ofBamHI was added and digestion reaction was performed at 37 ° C. for 16 hours. After the reaction solution was extracted with ethanol / chloroform, a DNA fragment was recovered by an ethanol precipitation method. Subsequently, this DNA fragment was dissolved in 20 μL of Universal Buffer H and 12 units ofEcoRI was added and a digestion reaction was performed at 37 ° C. for 16 hours. After extracting the reaction solution with ethanol / chloroform, a DNA fragment of about 3 kbp was recovered by an ethanol precipitation method.
[0148]
50 ng of a DNA fragment of about 200 bp downstream from the initiation codon of human A3 adenosine receptor cDNA obtained above and plasmid pBluescriptII @ SK (-)BamHI-Eco50 ng of the RI fragment (about 3 kbp) was dissolved in 10 μL of distilled water, and ligation kit Ver. 10 µL of 2 I solution was added, and the binding reaction was performed at 16 ° C for 2 hours.
Using the reaction solutionE.coliDH5α was transformed by the method of Cohen et al.rGot the strain. Plasmid DNA was isolated from this transformant according to the method of Burnboim et al. The structure of the obtained plasmid was confirmed by restriction enzyme digestion. Further, the nucleotide sequence was determined using a DNA sequencer 377, and the sequence contained in the plasmid was confirmed. Hereinafter, this plasmid is referred to as A3R-N2.
[0149]
(10) Construction of plasmid A3R-N3
A DNA fragment derived from the plasmid A3R-N2 (about 200 bp downstream from the start codon of the human A3 adenosine receptor cDNA) downstream of the sequence 5 'to the start codon of the mouse A3 adenosine receptor gene of the plasmid A3R-N1 The plasmid A3R-N3 into which was introduced was constructed as follows (see FIG. 14).
[0150]
2.3 μg of plasmid A3R-N2 was dissolved in 40 μL of Universal Buffer H and 12 units ofEcoRI and 10 unitsSphI was added and a digestion reaction was performed at 37 ° C. for 20 hours. The reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis, and a DNA fragment of about 200 bp was recovered using a GeneClean II kit according to the attached manual.
1.6 μg of plasmid A3R-N1 was dissolved in 40 μL of Universal Buffer H and 12 units ofEcoRI and 10 unitsSphI was added and a digestion reaction was performed at 37 ° C. for 20 hours. The reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis, and a DNA fragment of about 3.35 kbp was recovered using a GeneClean II kit according to the attached manual.
[0151]
From the plasmid A3R-N2 obtained aboveEcoRI-Sph10 ng of the I fragment (about 200 bp) and plasmid A3R-N1EcoRI-Sph50 ng of the I fragment (about 3.35 kbp) was dissolved in 10 μL of distilled water, and the ligation kit Ver. 10 µL of 2 I solution was added, and the binding reaction was performed at 16 ° C for 2 hours.
Using the reaction solutionE.coliDH5α was transformed by the method of Cohen et al.rGot the strain. Plasmid DNA was isolated from this transformant according to the method of Burnboim et al. The structure of the obtained plasmid was confirmed by restriction enzyme digestion. Further, the nucleotide sequence was determined using a DNA sequencer 377, and the sequence contained in the plasmid was confirmed. Hereinafter, this plasmid is referred to as A3R-N3.
[0152]
(11) Construction of plasmid A3R-N4
Plasmid A3R-N4 having a sequence in which a human A3 adenosine receptor cDNA (region after the start codon) was linked downstream of a base sequence of about 350 bp upstream of the initiation codon of the mouse A3 adenosine receptor gene was constructed as follows. . (See FIG. 15).
[0153]
0.7 μg of plasmid A3R-N3 was dissolved in 100 μL of Universal Buffer K containing 0.01% BSA and 50 units ofNcoI was added and a digestion reaction was performed at 37 ° C. for 20 hours. After the reaction solution was extracted with ethanol / chloroform, a DNA fragment was recovered by an ethanol precipitation method. Subsequently, this DNA fragment was dissolved in 20 μL of Universal Buffer L and 10 units ofSacI was added and a digestion reaction was performed at 37 ° C. for 16 hours. The reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis, and a DNA fragment of about 400 bp was recovered using a Geneclean II kit according to the attached manual.
[0154]
Further, 2.2 μg of plasmid pBS-hA3R was dissolved in 100 μL of Universal Buffer K containing 0.01% BSA, and 50 units ofNcoI was added and a digestion reaction was performed at 37 ° C. for 20 hours. After the reaction solution was extracted with ethanol / chloroform, a DNA fragment was recovered by an ethanol precipitation method. Subsequently, the DNA fragment was dissolved in 100 μL of Universal Buffer L and 50 units ofSacI was added and a digestion reaction was performed at 37 ° C. for 16 hours. After the reaction solution was extracted with ethanol / chloroform, a DNA fragment was recovered by an ethanol precipitation method. This DNA fragment was subjected to agarose gel electrophoresis, and a DNA fragment of about 4 kbp was recovered using a GeneClean II kit according to the attached manual.
[0155]
From the plasmid A3R-N4, obtained aboveNcoI-Sac20 ng of the I fragment (about 400 bp) and the plasmid pBS-hA3R-derivedNcoI-Sac50 ng of the I fragment (about 4 kbp) was dissolved in 10 μL of distilled water, and ligation kit Ver. 10 µL of 2 I solution was added, and the binding reaction was performed at 16 ° C for 2 hours.
Using the reaction solutionE.coliDH5α was transformed by the method of Cohen et al.rGot the strain. Plasmid DNA was isolated from this transformant according to the method of Burnboim et al. The structure of the obtained plasmid was confirmed by restriction enzyme digestion. Further, the nucleotide sequence was determined using a DNA sequencer 377, and the sequence contained in the plasmid was confirmed. Hereinafter, this plasmid is referred to as A3R-N4.
[0156]
(12) Construction of plasmid A3R-N5
A plasmid A3R-N5 having a mouse
[0157]
3.3 μg of plasmid pBS-ex1 was dissolved in 20 μL of Universal Buffer T containing 0.01% BSA and 4 units ofSmaI and 5 unitsSacAfter addition of I and digestion reaction at 37 ° C. for 20 hours, the reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis, and a DNA fragment of about 5 kbp was recovered using a GeneClean II kit according to the attached manual.
1.1 μg of plasmid pBS-hA3R was dissolved in 50 μL of Universal Buffer H and 20 units ofNdeI was added and a digestion reaction was performed at 37 ° C. for 16 hours. After the reaction solution was extracted with ethanol / chloroform, a DNA fragment was recovered by an ethanol precipitation method. Subsequently, both ends of the recovered DNA fragment were subjected to a blunting treatment using a DNA blunting kit (manufactured by Takara Shuzo) according to the attached manual. After extracting the reaction solution with phenol / chloroform, a DNA fragment was recovered by an ethanol precipitation method. This DNA fragment was dissolved in 40 μL of Universal Buffer H, and 20 units ofSacAfter addition of I and digestion reaction at 37 ° C. for 16 hours, the reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis, and a DNA fragment of about 3 kbp was recovered using a GeneClean II kit according to the attached manual.
[0158]
1 μg of the DNA fragment (about 5 kbp) derived from the plasmid pBS-ex1 and the plasmid pBS-hA3RNdeI (blunted)Sac50 ng of the I fragment (about 3 kbp) was dissolved in 10 μL of distilled water, and ligation kit Ver. 10 μL of 2 I solution was added, and the binding reaction was performed at 16 ° C. for 16 hours.
Using the reaction solutionE.coliDH5α was transformed by the method of Cohen et al.rGot the strain. Plasmid DNA was isolated from this transformant according to the method of Burnboim et al. The structure of the obtained plasmid was confirmed by restriction enzyme digestion. Further, the nucleotide sequence was determined using a DNA sequencer 377, and the sequence contained in the plasmid was confirmed. Hereinafter, this plasmid is referred to as A3R-N5.
[0159]
(13) Construction of plasmid A3R-N6
Plasmid A3R-N6 having a sequence in which a human A3 adenosine receptor cDNA (after the start codon) is linked downstream of a mouse genomic DNA sequence of about 5.4 kbp upstream of the initiation codon of the mouse A3 adenosine receptor gene is as follows: (See FIG. 17).
[0160]
3 μg of plasmid A3R-N4 was dissolved in 50 μL of Universal Buffer L and 20 units ofSacI was added and a digestion reaction was performed at 37 ° C. for 20 hours. After the reaction solution was extracted with ethanol / chloroform, a DNA fragment was recovered by an ethanol precipitation method. Subsequently, the DNA fragment was dissolved in 20 μL of Universal Buffer H and 12 units ofEcoRI was added and a digestion reaction was performed at 37 ° C. for 16 hours. The reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis, and a DNA fragment of about 1.2 kbp was recovered using a GeneClean II kit according to the attached manual.
[0161]
Dissolve 3.4 μg of plasmid A3R-N5 in 50 μL of Universal Buffer L and add 20 units ofSacI was added and a digestion reaction was performed at 37 ° C. for 20 hours. After the reaction solution was extracted with ethanol / chloroform, a DNA fragment was recovered by an ethanol precipitation method. Subsequently, the DNA fragment was dissolved in 20 μL of Universal Buffer H and 12 units ofEcoRI was added and a digestion reaction was performed at 37 ° C. for 16 hours. The reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis, and a DNA fragment of about 9 kbp was recovered using a GeneClean II kit according to the attached manual.
[0162]
From the plasmid A3R-N4, obtained aboveSacI-Eco60 ng of the RI fragment (about 1.2 kbp) and plasmid A3R-N5SacI-Eco50 ng of the RI fragment (about 9 kbp) was dissolved in 10 μL of distilled water, and the ligation kit Ver. 10 μL of 2 I solution was added, and the binding reaction was performed at 16 ° C. for 16 hours.
Using the reaction solutionE.coliDH5α was transformed by the method of Cohen et al.rGot the strain. Plasmid DNA was isolated from this transformant according to the method of Burnboim et al. The structure of the obtained plasmid was confirmed by restriction enzyme digestion. Hereinafter, this plasmid is referred to as A3R-N6.
[0163]
(14) Construction of ploxP-arm1-HPRT-hA3R-arm2
Downstream of the mouse genomic DNA sequence of about 5.4 kbp 5 'to the start codon of the mouse A3 adenosine receptor gene, 3' from the human A3 adenosine receptor cDNA (coding region) and the stop codon of the mouse A3 adenosine receptor gene On the sideHincA sequence in which the sequence of the mouse genomic DNA up to the II site was linked was constructed as follows using the plasmid ploxP-arm1-HPRT-hA3R-arm2 inserted upstream of the hprt gene of the plasmid ploxP-RE-HPRT-hA3R-arm2. (See FIG. 18).
[0164]
1.5 μg of the plasmid A3R-N6 prepared in (13) was dissolved in 50 μL of Universal Buffer M, and 50 units ofSpeI was added and a digestion reaction was performed at 37 ° C. for 20 hours. After the reaction solution was extracted with ethanol / chloroform, a DNA fragment was recovered by an ethanol precipitation method. Subsequently, the DNA fragment was dissolved in 20 μL of Universal Buffer H and 12 units ofEcoRI was added and a digestion reaction was performed at 37 ° C. for 16 hours. The reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis, and a DNA fragment of about 7 kbp was recovered using a GeneClean II kit according to the attached manual.
[0165]
2 μg of the plasmid ploxP-RE-C-HPRT-hA3R-arm2 prepared in (7) was dissolved in 100 μL of universal buffer M, and 50 units ofNheI was added and a digestion reaction was performed at 37 ° C. for 20 hours. After the reaction solution was extracted with ethanol / chloroform, a DNA fragment was recovered by an ethanol precipitation method. Subsequently, the DNA fragment was dissolved in 20 μL of Universal Buffer H and 12 units ofEcoRI was added and a digestion reaction was performed at 37 ° C. for 16 hours. The reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis, and a DNA fragment of about 9 kbp was recovered using a GeneClean II kit according to the attached manual.
[0166]
From the plasmid A3R-N6, obtained aboveSpeI-Eco10 ng of RI DNA fragment (about 7 kbp) and plasmid ploxP-RE-C-HPRT-hA3R-arm2NheI-Eco50 ng of the RI fragment (about 9 kbp) was dissolved in 10 μL of distilled water, and the ligation kit Ver. 10 μL of 2 I solution was added, and the binding reaction was performed at 16 ° C. for 20 hours.
Using the reaction solutionE.coliDH5α was transformed by the method of Cohen et al.rGot the strain. Plasmid DNA was isolated from this transformant according to the method of Burnboim et al. The structure of the obtained plasmid was confirmed by restriction enzyme digestion. Further, the nucleotide sequence was determined using a DNA sequencer 377, and the sequence contained in the plasmid was confirmed. Hereinafter, this plasmid is referred to as ploxP-arm1-HPRT-hA3R-arm2.
[0167]
(15) Construction of plasmid ploxP-DT-arm1-HPRT-hA3R-arm2
A diphtheria toxin (DT) expression unit (a DT gene and SV40 downstream of the RNA @ polymerase II promoter) is located approximately 5.4 kbp upstream of the initiation codon of the mouse A3 adenosine receptor gene of the plasmid ploxP-arm1-HPRT-hA3R-arm2. Plasmid ploxP-DT-arm1-HPRT-hA3R-arm2 into which a polyadenylation signal of interest was inserted was constructed as follows (see FIG. 19).
[0168]
3.55 μg of plasmid pKO @ SelectDT (manufactured by Lexicon Genetics) was dissolved in 40 μL of NE buffer 4 [manufactured by New England Biolabs] and 2 units ofRsrII (manufactured by New England Biolabs) was added and digestion reaction was performed at 37 ° C. for 24 hours. After extracting the reaction solution with phenol / chloroform, a DNA fragment was recovered by an ethanol precipitation method. Subsequently, the DNA fragment was subjected to agarose gel electrophoresis, and a DNA fragment of about 1.3 kbp was recovered using a GeneClean II kit according to the attached manual.
[0169]
3 μg of the plasmid ploxP-arm1-HPRT-hA3R-arm2 constructed in (14) was dissolved in 100 μL of
[0170]
From the plasmid pKO @ SelectDT derived aboveRsr50 ng of the II fragment (about 1.3 kbp) and the plasmid ploxP-arm1-HPRT-hA3R-arm2RsrIIng fragment (about 16 kbp) (100 ng) was dissolved in 10 μL of distilled water, and ligation kit Ver. 10 μL of 2 I solution was added, and the binding reaction was performed at 16 ° C. for 16 hours.
Using the reaction solutionE.coliDH5α was transformed by the method of Cohen et al.rGot the strain. Plasmid DNA was isolated from this transformant according to the method of Burnboim et al. The structure of the obtained plasmid was confirmed by restriction enzyme digestion. Further, the nucleotide sequence was determined using a DNA sequencer 377, and the sequence contained in the plasmid was confirmed. Hereinafter, this plasmid is referred to as ploxP-DT-arm1-HPRT-hA3R-arm2.
[0171]
Example 4 Construction of Expression Vector for Human A3 Adenosine Receptor
(1) Construction of plasmid polyA @ in @ pBS
The plasmid polyA in pBS containing the SV40 polyadenylation signal was constructed as follows (see FIG. 20).
[0172]
Preparation of a 26-mer primer having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 22 containing the polyadenylation signal of SV40 of the plasmid pCAG-GFP-pHPRTp (WO $ 01/33957), and a 35-mer primer having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 23 did. Using these primers and a plasmid pCAG-GFP-pHPRTp as a template, a PCR reaction solution was prepared and reacted at 94 ° C. for 5 minutes, followed by 94 ° C. for 30 seconds, 60 ° C. for 30 seconds, and 72 ° C. for 1 second. The cycle for 30 minutes was repeated 30 times, and PCR was performed under the condition of storing at 4 ° C. overnight. After extracting the PCR reaction solution with phenol / chloroform, a DNA fragment was recovered by an ethanol precipitation method. The DNA fragment was dissolved in 40 μL of Universal Buffer T containing 0.01% BSA and 15 units ofXbaI and 10 unitsSacII was added and a digestion reaction was performed at 37 ° C. for 16 hours. After the reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis, a DNA fragment of about 300 bp containing the SV40 polyadenylation signal was recovered using a GeneClean II kit according to the attached manual.
[0173]
3 μg of plasmid pBluescriptII @ SK (−) was dissolved in 40 μL of Universal Buffer T containing 0.01% BSA, and 15 units ofXbaI and 10 unitsSacII was added and a digestion reaction was performed at 37 ° C. for 16 hours. The reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis, and a DNA fragment of about 3 kbp was recovered using a GeneClean II kit according to the attached manual.
100 ng of the DNA fragment (about 300 bp) containing the polyadenylation signal of SV40 obtained above and plasmid pBluescriptII @ SK (-)XbaI-Sac100 ng of the II fragment (about 3 kbp) was dissolved in 10 μL of distilled water, and ligation kit Ver. 10 μL of Solution I was added, and a binding reaction was performed at 16 ° C. for 2 hours.
[0174]
Using the reaction solutionE.coliDH5α was transformed by the method of Cohen et al.rGot the strain. Plasmid DNA was isolated from this transformant according to the method of Burnboim et al. The structure of the obtained plasmid was confirmed by restriction enzyme digestion. The nucleotide sequence was determined using a DNA sequencer 377, and the SV40 polyadenylation signal contained in the plasmid was confirmed. Hereinafter, this plasmid is referred to as polyA @ in @ pBS.
[0175]
(2) Construction of hA3R @ in @ pBS
A plasmid hA3R in pBS having a sequence encoding a human A3 adenosine receptor having a FLAG tag added to the N-terminus was constructed as follows (see FIG. 21).
[0176]
Based on the sequence of the human A3 adenosine receptor cDNA, a 55-mer primer having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 24 containing a sequence encoding the FLAG tag and a 30-mer primer having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 25 were prepared. did. Using these primers and using the plasmid pBS-hA3R as a template, a PCR reaction solution was prepared and reacted at 94 ° C for 5 minutes, followed by 94 ° C for 30 seconds, 60 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 1 minute. The cycle was repeated 30 times, and PCR was performed under the condition of storing at 4 ° C. overnight. After extracting the PCR reaction solution with phenol / chloroform, a DNA fragment was recovered by an ethanol precipitation method. The DNA fragment was dissolved in 50 μL of Universal Buffer M containing 0.01% BSA and 37.5 units ofXbaI was added and a digestion reaction was performed at 37 ° C. for 16 hours. After extracting the reaction solution with phenol / chloroform, a DNA fragment was recovered by an ethanol precipitation method. The DNA fragment was dissolved in 40 μL of Universal Buffer H and 24 units ofEcoRI was added and a digestion reaction was performed at 37 ° C. for 16 hours. After agarose gel electrophoresis of the reaction solution, a DNA fragment of about 1 kbp containing a sequence encoding a human A3 adenosine receptor with a FLAG tag added to the N-terminus was recovered using a GeneClean II kit according to the attached manual.
[0177]
3 μg of plasmid pBluescriptII @ SK (−) is dissolved in 40 μL of Universal Buffer M containing 0.01% BSA, and 30 units ofXbaI was added and a digestion reaction was performed at 37 ° C. for 16 hours. After extracting the reaction solution with phenol / chloroform, a DNA fragment was recovered by an ethanol precipitation method. This DNA fragment was dissolved in 40 μL of Universal Buffer H, and 24 units ofEcoRI was added and a digestion reaction was performed at 37 ° C. for 16 hours. The reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis, and a DNA fragment of about 3 kbp was recovered using a GeneClean II kit according to the attached manual.
[0178]
100 ng of the DNA fragment (about 1 kbp) containing the sequence encoding the human A3 adenosine receptor to which the FLAG tag was added at the N-terminus and the plasmid pBluescriptII @ SK (-)XbaI-Eco50 ng of the RI fragment (about 3 kbp) was dissolved in 10 μL of distilled water, and ligation kit Ver. 10 µL of 2 I solution was added, and the binding reaction was performed at 16 ° C for 2 hours.
Using the reaction solutionE.coliDH5α was transformed by the method of Cohen et al.rGot the strain. Plasmid DNA was isolated from this transformant according to the method of Burnboim et al. The structure of the obtained plasmid was confirmed by restriction enzyme digestion. The nucleotide sequence was determined using a DNA sequencer 377, and the sequence contained in the plasmid and encoding the human A3 adenosine receptor with a FLAG tag added to the N-terminus was confirmed. Hereinafter, this plasmid is referred to as hA3R in pBS.
[0179]
(3) Construction of plasmid hA3R-polyA in pBS
A plasmid hA3R-polyA @ in @ pBS in which a polyadenylation signal of SV40 was added downstream of a sequence encoding a human A3 adenosine receptor having a FLAG tag added to the N-terminus was constructed as follows (see FIG. 22).
[0180]
Dissolve 1.25 μg of the plasmid hA3R in pBS prepared in (2) above in 40 μL of Universal Buffer M containing 0.01% BSA, and add 30 units ofXbaI was added and a digestion reaction was performed at 37 ° C. for 16 hours. After extracting the reaction solution with phenol / chloroform, a DNA fragment was recovered by an ethanol precipitation method. The DNA fragment was dissolved in 20 μL of Universal Buffer H and 12 units ofEcoThe digestion reaction was performed at 37 ° C. for 6 hours after adding RI. After agarose gel electrophoresis of the reaction solution, a DNA fragment of about 1 kbp containing a sequence encoding a human A3 adenosine receptor with a FLAG tag added to the N-terminus was recovered using a GeneClean II kit according to the attached manual.
[0181]
2.5 μg of the plasmid polyAｐin pBS prepared in the above (1) was dissolved in 50 μL of Universal Buffer M containing 0.01% BSA, and 30 units ofXbaI was added and a digestion reaction was performed at 37 ° C. for 16 hours. After extracting the reaction solution with phenol / chloroform, a DNA fragment was recovered by an ethanol precipitation method. The recovered DNA fragment was dissolved in 40 μL of Universal Buffer H, and 24 units ofEcoRI was added and a digestion reaction was performed at 37 ° C. for 16 hours. After the reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis, a DNA fragment of about 3.3 kbp was recovered using a GeneClean II kit according to the attached manual.
[0182]
40 ng of the DNA fragment (about 1 kbp) containing the sequence encoding the human A3 adenosine receptor to which the FLAG tag was added at the N-terminus and the plasmid polyA in pBS-derivedXbaI-Eco50 ng of the RI fragment (about 3.3 kbp) was dissolved in 10 μL of distilled water, and the ligation kit Ver. 10 µL of 2 I solution was added, and a binding reaction was performed at 16 ° C for 3 hours.
Using the reaction solutionE.coliDH5α was transformed by the method of Cohen et al.rGot the strain. Plasmid DNA was isolated from this transformant according to the method of Burnboim et al. The structure of the obtained plasmid was confirmed by restriction enzyme digestion. Further, the nucleotide sequence was determined using a DNA sequencer 377, and the sequence contained in the plasmid was confirmed. Hereinafter, this plasmid is referred to as hA3R-polyA in pBS.
[0183]
(4) Construction of human A3 adenosine receptor expression vector hA3R in pCAG
A human A3 adenosine receptor expression vector hA3R in pCAG containing a FLAG tag at the N-terminus containing a CAG promoter was constructed as follows (see FIG. 23).
[0184]
3 μg of the plasmid hA3R-polyA in pBS prepared in the above (3) was dissolved in 40 μL of universal buffer H, and 12 units ofEcoRI and 15 creditsEcoRV was added and digestion reaction was performed at 37 ° C. for 16 hours. The reaction mixture was subjected to agarose gel electrophoresis, and a DNA fragment of about 1.5 kbp (a DNA fragment containing a polyadenylation signal of SV40 downstream of a sequence encoding a human A3 adenosine receptor with a FLAG tag added to the N-terminus) was obtained. And using Gene Clean II kit according to the attached manual.
[0185]
4 μg of plasmid pCAG-GFP-pHPRTp was dissolved in 50 μL of Universal Buffer K and 20 units ofHpaI was added and a digestion reaction was performed at 37 ° C. for 16 hours. After extracting the reaction solution with phenol / chloroform, a DNA fragment was recovered by an ethanol precipitation method. Dissolve in 40 μL of Universal Buffer H and add 24 units ofEcoRI was added and a digestion reaction was performed at 37 ° C. for 16 hours. After the reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis, a DNA fragment of about 8 kbp was recovered using a GeneClean II kit according to the attached manual.
[0186]
From the plasmid hA3R-polyAｐin pBS obtained aboveEcoRI-Eco100 ng of RV fragment (about 1.5 kbp) and pCAG-GFP-pHPRTp-derivedEcoRI-Hpa50 ng of the I fragment (about 8 kbp) was dissolved in 10 μL of distilled water, and the ligation kit Ver. 10 μL of Solution I was added, and a binding reaction was performed at 16 ° C. for 3 hours.
Using the reaction solutionE.coliDH5α was transformed by the method of Cohen et al.rGot the strain. Plasmid DNA was isolated from this transformant according to the method of Burnboim et al. The structure of the obtained plasmid was confirmed by restriction enzyme digestion. Further, the nucleotide sequence was determined using a DNA sequencer 377, and the sequence contained in the plasmid was confirmed. Hereinafter, this plasmid is referred to as hA3R in pCAG.
[0187]
Example 5 Introducing Human A3 Adenosine Receptor Expression Vector into Mammalian Cells and Evaluation of Reactivity of Specific Drug
(1) Evaluation of drug responsiveness due to transient expression
Host cell mouse myeloma cell P3. X63 / Ag8. In Example 4 (4), clone 21 △ hprt (WO 01/33957), which is a stable transformed cell line in which apoaequorin expression plasmid pCAG-AEQ-pHPRTp was introduced into U1 (hereinafter abbreviated as P3U1), was used in Example 4 (4). The constructed human A3 adenosine receptor expression plasmid hA3R in pCAG was introduced to prepare a transient cell line for human A3 adenosine receptor. Apoaequorin expressed by clone 21 @ hprt forms a protein complex aequorin with the luminescent substrate coelenterazine and molecular oxygen, and aequorin is Ca2+Light is emitted by bonding with
[0188]
The introduction of the plasmid hA3R in pCAG into the clone 21 △ hprt cell line was performed by electroporation as follows.
8 × 106K-PBS buffer (137 mmol / L @ KCl, 2.7 mmol / L NaCl, 8.1 mmol / L @ Na2HPO4, 1.5 mmol / L @ KH2PO4, 4 mmol / L @ MgCl2), And 200 μL of the cell suspension and 4 μg of the plasmid hA3R @ in @ pCAG were placed in a cuvette for electroporation (Gene Pulser Cuvette, distance between
[0189]
To examine whether the human A3 adenosine receptor can function normally in mouse cells using this transient expression cell line, chloro-N, an agonist specific to the A3 adenosine receptor, was used.6-(3-Iodobenzyl) -adenosine-5'-N-methyluronamide [chloro-N6-(3-iodobenzyl) -adenosine-5'-N-methyluronamide, hereinafter abbreviated as Cl-IB-MECA] (Trends Pharmacol. Sci.,)19, 5, 1998) (intracellular Ca2+The amount of increase) was evaluated by the amount of luminescence of aequorin as follows. As a control cell, the responsiveness to Cl-IB-MECA was examined for the clone 21Δhprt strain into which the human A3 adenosine receptor expression plasmid was not introduced.
[0190]
After culture, each cell line was6The suspension was suspended in RPMI 1640 medium containing 10 μmol / L of coelenterazine (Molecular Probes) at a concentration of 10 μmol / L, and 100 μL of the suspension was dispensed into a glass tube for culture (Iwaki Glass). The cells were poured and cultured for 4 hours.
After the culture, the luminescence of each cell line is measured for 5 seconds per second for 5 seconds using a luminometer Auto @ Lumat @ LB953 (manufactured by EG & G Berthold) and then a 2 μmol / L Cl-IB-MECA solution (10 mmol / L) Was added to each glass tube for culture, and the amount of luminescence immediately after the addition was measured for 60 seconds every second. The same measurement was performed using DMSO containing no Cl-IB-MECA as a control.
[0191]
FIG. 24 shows the result of this measurement. As a result of adding Cl-IB-MECA at a final concentration of 1 μmol / L, the cell line in which the human A3 adenosine receptor was transiently expressed as compared with the control cell line into which the human A3 adenosine receptor expression plasmid was not introduced. In this case, the amount of aequorin emission was increased about twice.
From the above results, human A3 adenosine receptor transiently expressed in mouse cells showed normal responsiveness (Ca2+Rise).
[0192]
(2) Evaluation of drug reactivity using a stable expression strain
The human A3 adenosine receptor expression plasmid hA3R @ in @ pCAG constructed in Example 4 (4) was introduced into the clone 21 @ hprt strain to prepare a cell line stably expressing the human A3 adenosine receptor. Using this stable expression cell line, in order to verify whether the human A3 adenosine receptor can function normally in mouse cells, the response to Cl-IB-MECA, an agonist specific for the A3 adenosine receptor, was examined. Sex (intracellular Ca2+Rise) was evaluated by the amount of luminescence of aequorin.
[0193]
Introduction of the plasmid hA3R in pCAG into the clone 21 △ hprt cell line was performed according to the electroporation method described in (1). After gene transfer and suspension in RPMIｍＬ1640 medium containing 10 mL of FCS, 37 ° C., 5
[0194]
After the culture, the responsiveness of each cell line to Cl-IB-MECA was measured according to the method described in (1). Compared with a control cell line into which each plasmid was not introduced (clone @hprt cell line), a significant increase in luminescence was observed in three out of four clone lines in the cell line expressing human A3 adenosine receptor. (See FIG. 25). In particular,
[0195]
From the above results, it can be seen that human A3 adenosine receptor stably expressed in mouse cells has normal responsiveness to A3 adenosine receptor-specific agonist (Ca2+Rise).
[0196]
Example 6 Preparation of 5 'and 3' Probes Used for Southern Hybridization to Detect Homologous Recombinants
(1) Preparation of 5'-side probe
Whether or not homologous recombination was correctly performed by the target vector prepared in Example 3 is analyzed by Southern hybridization. The mouse A3 adenosine contained in the target vector was used as a 5′-side probe used in the Southern hybridization. A DNA containing a
[0197]
3 μg of plasmid pBS-ex1 was dissolved in 20 μL of Universal Buffer T containing 0.01% BSA, and 8 units ofSmaI was added and a digestion reaction was performed at 37 ° C. for 16 hours. After extracting the reaction solution with phenol / chloroform, a DNA fragment was recovered by an ethanol precipitation method. The DNA fragment was dissolved in 20 μL of Universal Buffer L and 10 units ofSacI was added and a digestion reaction was performed at 37 ° C. for 6 hours. The reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis, and a DNA fragment of about 1.2 kbp was recovered using a GeneClean II kit according to the attached manual.
[0198]
5 μg of pBluescriptII @ SK (−) was dissolved in 50 μL of Universal Buffer T containing 0.01% BSA, and 24 units ofSmaI was added and a digestion reaction was performed at 37 ° C. for 16 hours. After extracting the reaction solution with phenol / chloroform, a DNA fragment was recovered by an ethanol precipitation method. The DNA fragment is dissolved in 40 μL of Universal Buffer L and 20 units ofSacI was added and a digestion reaction was performed at 37 ° C. for 6 hours. The reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis, and a DNA fragment of about 3 kbp was recovered using a GeneClean II kit according to the attached manual.
[0199]
100 ng of the mouse genomic DNA fragment (about 1.2 kbp) upstream of
Using the reaction solutionE.coliDH5α was transformed by the method of Cohen et al.rGot the strain. Plasmid DNA was isolated from this transformant according to the method of Burnboim et al. The structure of the obtained plasmid was confirmed by restriction enzyme digestion. Further, the nucleotide sequence was determined using a DNA sequencer 377, and the mouse genomic sequence contained in the plasmid was confirmed. SEQ ID NO: 26 shows the nucleotide sequence. Hereinafter, this plasmid is referred to as pBS-probe 5 '.
[0200]
The 5'-side probe used in Southern hybridization was prepared by PCR using plasmid pBS-probe 5 'as a template. That is, a 26-mer primer having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 27 and a 26-mer primer having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 28 were prepared based on the mouse genomic sequence contained in the plasmid pBS-probe 5 '. A PCR reaction solution was prepared using these primers and pBS-
[0201]
(2) Preparation of 3'-side probe
A DNA containing a mouse
[0202]
3 μg of plasmid pBS-ex2 was dissolved in 20 μL of Universal Buffer M and 10 units ofNheI was added and a digestion reaction was performed at 37 ° C. for 16 hours. The reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis, and a DNA fragment of about 600 bp was recovered using a GeneClean II kit according to the attached manual.
3 μg of pBluescriptII @ SK (−) was dissolved in 40 μL of Universal Buffer M and 20 units ofSpeAfter addition of I and digestion reaction at 37 ° C. for 16 hours, the reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis, and a DNA fragment of about 3 kbp was recovered using a GeneClean II kit according to the attached manual. Next, the recovered DNA was dissolved in 50 μL of an alkaline phosphatase buffer, 40 units of bovine small intestine-derived alkaline phosphatase was added, the reaction was carried out at 50 ° C. for 30 minutes, and phenol / chloroform extraction was performed. A dephosphorylated DNA fragment of about 3 kbp was recovered.
[0203]
100 ng of a mouse genomic DNA fragment (about 600 bp) downstream of
Using the reaction solutionE.coliDH5α was transformed by the method of Cohen et al.rGot the strain. Plasmid DNA was isolated from this transformant according to the method of Burnboim et al. The structure of the obtained plasmid was confirmed by restriction enzyme digestion. Further, the nucleotide sequence was determined using a DNA sequencer 377, and the mouse genomic sequence contained in the plasmid was confirmed. SEQ ID NO: 29 shows the nucleotide sequence. Hereinafter, this plasmid is referred to as pBS-probe 3 '.
[0204]
To prepare a 3 'probe for use in Southern hybridization, PCR was performed using plasmid pBS-probe 3' as a template. That is, a 26-mer primer having the base sequence of SEQ ID NO: 30 and a 26-mer primer having the base sequence of SEQ ID NO: 31 were prepared based on the mouse genomic DNA sequence contained in the plasmid pBS-probe 3 '. A PCR reaction solution was prepared using these primers and pBS-
[0205]
Example 7 Production of Transgenic Mice Expressing Human A3 Adenosine Receptor (1) Introduction of Target Vector into ES Cells
Culture of mouse ES cells AB2.2 (manufactured by Lexicon Genetics, catalog number C100, hereinafter referred to as AB2.2 cells) was performed using M15 medium [15% FCS (catalog number B100, manufactured by Lexicon Genetics).-4mol / L β-mercaptoethanol (manufactured by Lexicon Genetics, Catalog No. M260), 2 mmol / L L-glutamine (manufactured by Lexicon Genetics), 50 units / mL penicillin and 50 μg / mL streptomycin (Lexicon) Using a Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM, Lexicon Genetics, catalog number M205) containing Genetics, catalog number M250) on a feeder plate at 37 ° C, 5% CO22Performed under conditions.
[0206]
The feeder plate is obtained by culturing mouse embryonic fibroblasts (manufactured by Lexicon Genetics, catalog number C200, hereinafter referred to as STO cells) treated with mitomycin C in a cell culture dish that has been subjected to a gelatin coating treatment as described below. Produced. First, a cell culture dish (96-well plate, 24-well plate, 3 cm dish, 6 cm dish, 8.5 cm dish) was placed in a 0.1% gelatin solution (manufactured by Lexicon Genetics, catalog number M210) for 2 hours or more. A gelatin coat treatment was performed by covering the culture surface. Subsequently, after the purchased STO cells were thawed, 4.4 × 10 5 were added to STO medium (DMEM containing 7% FCS, 2 mmol / L L-glutamine, 50 units / mL penicillin and 50 μg / mL streptomycin).5Cells / mL, suspended in a gelatin-coated cell culture dish, 0.07 mL / well for a 96-well plate, 0.5 mL / well for a 24-well plate, 2 mL / sheet for a 3
[0207]
AB2.2 cells were suspended in an M15 medium and then seeded on a feeder plate to start culturing. The M15 medium was 0.1 mL / well for 96-well plates, 2 mL / plate for 3 cm dishes, 4 mL / plate for 6 cm dishes, 10 mL / plate for 8.5 cm dishes, and 0.1 mL / plate for multi-dish and 24-well plates. 5 mL / well was used. Before the cells reached confluence, they were passaged as follows. First, prior to the passage, the M15 medium was replaced two hours before. After washing the cells twice with PBS (manufactured by Lexicon Genetics), 0.025 mL / well for a 96-well plate, 0.25 mL / well for a 24-well plate, 1 mL / plate for a 3 cm dish, 6 cm dish 2 mL / plate, 8.5 mL dish with 2 mL / plate of 0.25% trypsin solution containing 0.04% EDTA (manufactured by Lexicon Genetics, catalog number M220, hereinafter abbreviated as trypsin solution) And 37 ° C, 5% CO2It was left under the conditions for 15 minutes. An equal volume of M15 medium was added, and the cells were dispersed by
[0208]
The introduction of the target vector ploxP-DT-arm1-HPRT-hA3R-arm2 into AB2.2 cells was performed by electroporation as follows. The target vector ploxP-DT-arm1-HPRT-hA3R-arm2 obtained in Example 3 (15) is a restriction enzymeSalI was cut into linear form, extracted with phenol / chloroform, ethanol-precipitated, and dissolved in 1 mmol / L {Tris-HCl} (pH 8.0) containing 0.1 mmol / L {EDTA}. AB2.2 cells purchased 3.0 × 106The seeds were seeded on a 6 cm dish, cultured for 48 hours, then subcultured to an 8.5 cm dish, and further cultured for 24 hours. Twenty-four hours later, the cells were washed twice with 7 mL of PBS, and the cells were collected according to the above passage method. 1.0 × 10 cells recovered7The cells were suspended in 0.9 mL of PBS, and 25 μg of linear plaxP-DT-arm1-HPRT-hA3R-arm2 was cuvette for electroporation (Gene Pulser Cuvette, distance between
[0209]
After 24 hours, the cells were cultured for 5 days in an M15 medium containing 1 × concentration of 100 × HAT supplement (HAT {supplement} (100 ×), manufactured by Invitrogen, catalog No. 3992, including aminopterin, hypoxanthine and thymidine). An aminopterin-resistant colony is further cultured for 3 days in a M15 medium containing a 100 × HT additive (HT {Supplement} (100 ×), manufactured by Invitrogen, catalog number 11067-030, containing hypoxanthine and thymidine) at a 1 × concentration. Appeared. Each colony was isolated as follows, and the culture was continued. First, after appearing colonies were washed twice with PBS, a total of 205 colonies were directly picked up using a sterile plastic tip, and a round-bottom 96-well plate (Falcon Corp., Catalog No. 3077) at 1 colony / well. 37 ° C, 5% CO2After standing for 15 minutes or more under the conditions, 70 μL / well of M15 medium was added, and the cells were dispersed by
[0210]
Three days later, a replica plate was prepared as described below, and cultured for another five days. First, the cells cultured in the above 96-well feeder plate were washed twice with 100 μL / well of PBS, and then 25 μL of a trypsin solution was added thereto.2It was left for more than 15 minutes under the conditions. 25 μL of M15 medium was added, and the mixture was vigorously pipetted 40 times with a sterile plastic tip to disperse. Subsequently, 50 μL of 20% dimethyl sulfoxide (DMSO, manufactured by Sigma-Aldrich, catalog number D2650) and DMEM containing 40% FCS (hereinafter referred to as 2 × freezing medium) were added and mixed from the cell suspension. A replica plate was prepared by dispensing 50 μL, pre-gelatin-coated, and transferring to a 96-well plate to which 100 μL / well of M15 medium had been added. The plate containing the remaining cell suspension was stored frozen at -80 ° C as a master plate.
[0211]
(2) Selection of homologous recombinants by Southern hybridization
After culturing the replica plate prepared in (1) for 5 days, removing the medium and washing twice with 100 μL / well of PBS, the cell lysate [10 mmol / L Tris-HCl (pH 7.5), 10 mmol / L EDTA, 10 mmol / L NaCl, 0.5% sarkosyl, 1 mg / mL proteinase K (manufactured by Invitrogen, catalog No. 25530-049)] was added at 50 μL / hole, and together with paper containing sufficient water in a sealed container. After putting, the cells were kept at 60 ° C. for 24 hours to lyse the cells. 100 μL / well of ethanol containing 75 mmol / L NaCl was added to the cell lysate, left at room temperature for 30 minutes or longer to precipitate genomic DNA, and the 96-well plate was inverted to discard the solution. Subsequently, the plate was washed three times with 150 μL / well of 70% ethanol, and left at room temperature for 20 minutes to evaporate the remaining ethanol.
[0212]
12 unitsEcoAfter adding 30 μL / well of universal buffer H containing RI and 5 μg of ribonuclease A (manufactured by Sigma; Catalog No. R5125), vigorously pipetting to thoroughly dissolve the genomic DNA, and then digestion reaction at 37 ° C. for 20 hours. Was performed. After the reaction, the reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis, and subjected to the method of Southern (J. {Mol.98, $ 503, $ 1975) with a nylon filter (Hybond)TM-N +, manufactured by Amersham Bioscience). Using the T7 quick prime kit (Amersham Biosciences), the 5 'probe and the 3' probe prepared in Example 9 were [α-32P] ＰdCTP (manufactured by NEN). Each of the labeled probes was hybridized with the filter prepared above overnight, washed three times for 15 minutes at 65 ° C. using 2 × SSPE containing 0.1% SDS, and then washed with 0.1% SDS. Washing was performed twice at 65 ° C. for 15 minutes using 2 × SSPE, and X-ray film (Kodak Scientific Imaging Film X-OMAT) was used.TM(AR, manufactured by Kodak Co., Ltd.), exposed at -80 ° C. overnight, and developed the next day.
[0213]
In the above-mentioned Southern hybridization, when a wild-type mouse genomic DNA is digested with EcoRI, a DNA fragment of about 9 kbp is obtained by using a 5 ′ probe, and a DNA fragment of about 6.5 kbp is obtained by using a 3 ′ probe. Is detected. On the other hand, when the homologous recombination is normally induced by the target vector ploxP-DT-arm1-HPRT-hA3R-arm2, and the mouse A3 adenosine receptor gene in the mouse genomic DNA is replaced with the human A3 adenosine receptor cDNA, In this method, a DNA fragment of about 8.5 kbp is detected by using a 5 ′ probe, and a DNA fragment of about 8.8 kbp is detected by using a 3 ′ probe (see FIG. 28).
[0214]
As a result of the above Southern hybridization, 16 colonies (1B7, 1C3, 1C6, 1D1, 1D7, 1D12, 1F9, 1F11, 1G2, 1G11, out of 205 colonies of the aminopterin-resistant strain of the ES cells obtained in (1)) were obtained. 1H11, 2A4, 2B3, 2B12, 2D9, 2E3) were found to be homologous recombinants in which the mouse A3 adenosine receptor gene was replaced with the human A3 adenosine receptor cDNA in one chromosome.
[0215]
Stocks for cryopreservation were prepared for ES cells of 16 colonies, which are homologous recombinants, as follows.
Sixteen colonies of the cryopreserved master plate were thawed, and a cell suspension containing each homologous recombinant was inoculated into each well of a 24-well feeder plate supplemented with 2 mL / well of M15 medium and cultured for 24 hours. After changing the medium and culturing for 2 days, the cells were subcultured on a feeder plate of 3 cm dish and further cultured for 3 days. According to the subculturing method described in (1), the cells recovered after detachment from the dish were suspended in 0.5 mL of M15 medium. Further, a suspension obtained by adding and mixing 0.5 mL of 2 × freezing medium was dispensed in 0.1 mL portions into a cell freezing tube, cryopreserved at −80 ° C., and stored as stock.
[0216]
(3) Removal of drug resistance gene from homologous recombinant
From the homologous recombinant obtained in (2), four clones (1C6, 1D1, 1F11, 2A4) having good morphology and growth ability were selected, and a Cre expression vector was introduced to introduce a drug resistance gene existing between the loxP sequences. (Hprt gene) was removed. Each of the above-mentioned frozen stocks of the four clones was thawed one by one, inoculated on a 24-well feeder plate containing 2 mL / well of M15 medium, and cultured for 2 days. The medium was replaced with a 3 cm dish feeder plate, and the medium was replaced 24 hours later. Twenty-four hours later, the plate was washed twice with 1 mL of PBS, and 1 mL of a trypsin solution was added. 37 ° C, 5% CO2After standing for 15 minutes under the conditions, 1 mL of M15 medium was added, and the cells were detached by vigorously pipetting 40 times using a 3 mL transfer pipette. The cells were precipitated and recovered by centrifugation and suspended in 0.9 mL of PBS. Using the cell suspension and 25 μg of Cre expression vector pBS185 (manufactured by Invitrogen) dissolved in 1 mmol / L Tris-HCl (pH 8.0) containing 0.1 mmol / L EDTA, described in (1). The gene was introduced into the cells according to the electroporation method described above, suspended in 10 mL of M15 medium, seeded on an 8.5 cm dish feeder plate, and cultured for 24 hours. Twenty-four hours later, the medium was replaced and the cells were further cultured for three days.
[0219]
After washing the cultured cells twice with 7 ml of PBS, the cells were detached from the dish and collected according to the subculture method described in (1), suspended in 10 mL of M15 medium, and the number of cells was measured. Subsequently, the cells were diluted to 500 cells / mL, 50 cells / mL, and 5 cells / mL using an M15 medium containing 1000X 6-thioguanine (manufactured by Sigma-Aldrich) at a concentration of 1X. Each was seeded on a feeder plate of 8.5 cm dish and cultured for 7 days, so that colonies deficient in the hprt gene appeared. Each of these colonies was isolated according to the method described in (1), inoculated on a 96-well feeder plate, and cultured for 3 days. The clones with good morphology were subcultured to 24-hole feeder plates, 12 clones for each colony, and cultured for 2 days. Further, each of the 6 clones having good morphology was subcultured on a feeder plate of 3 cm dish and cultured for 3 days. The cells were detached from the dish according to the passaging method described in (1), collected, and suspended in 0.5 mL of M15 medium. To the cell suspension, 0.5 mL of 2 × freezing medium was further added and mixed, and the resulting suspension was dispensed in 0.1 ml portions into a cell freezing tube, and a total of 24 clones (1C6-1 to -6, 1D1 -1 to -6, 1F11-1 to -6, and 2A4-1 to -6) were stored at -160 ° C as cryopreservation stock.
[0218]
(4) Confirmation of hprt gene removal by Southern hybridization
One of the 24 cryopreservation stocks described above was thawed one by one, seeded on a gelatin-coated 3 cm dish containing 2 mL of M15 medium, and cultured for 3 days. Three days later, the medium was removed, and the cells were washed twice with 1 mL of PBS buffer. Then, 1.75 mL of the cell lysate described in (2) was added thereto, and the resultant was placed in a sealed container together with paper sufficiently containing water. Thereafter, the cells were kept at 60 ° C. for 24 hours to lyse the cells. 3 mL of ethanol containing 75 mmol / L NaCl was added to the cell lysate, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 30 minutes or more. Then, the genomic DNA was collected by hooking it to the tip of a sterile chip. After washing the genomic DNA three times with 70% ethanol, the ethanol was volatilized by being left at room temperature for 20 minutes. Genomic DNA was dissolved in 100 μL of 1 mmol / L Tris-HCl (pH 8.0) containing 200 μg / mL ribonuclease A and 0.1 mmol / L EDTA. 12 g of each of the obtained genomic DNAs was dissolved in 120 L of Universal Buffer H, and 12 units ofEcoRI was added and a digestion reaction was performed at 37 ° C. for 16 hours. Undigested genomic DNA was cut by pipetting the reaction solution three times with a sterile tip. Furthermore, after adding 1.2 μL of 0.5 mol / L EDTA (pH 8.0) and 300 μL of ethanol, the mixture was centrifuged at 15,000 rpm for 10 minutes to obtain a precipitate of genomic DNA.
[0219]
After dissolving the genomic DNA precipitate in 20 μL of 1 mmol / L Tris-HCl (pH 8.0) containing 0.1 mmol / L EDTA, the whole amount was subjected to agarose gel electrophoresis, and nylon was prepared according to the method described in (2). Transfer to the filter,32Southern hybridization was performed with the 3'-side probe labeled with P. By the above-described Southern hybridization, mouse genomic DNA in which the mouse A3 adenosine receptor gene has been replaced with the human A3 adenosine receptor cDNA is obtained.EcoWhen digested with RI, as shown in (2), a DNA fragment of about 8.8 kbp is detected by using the 3′-side probe. However, the PGK promoter and hprt present between the loxP sequence by the Cre protein are detected. When the gene (about 3.8 kbp) has been removed, a DNA fragment as short as about 5 kbp is detected (see FIG. 29).
[0220]
From the results of the Southern hybridization, the PGK promoter and the hprt gene (about 3.8 kbp) sandwiched between the loxP sequences existing downstream of the human A3 adenosine receptor gene were found in the mouse genome in all of the 24 clones analyzed. It was confirmed that it was more removed.
[0221]
(5) Preparation of chimeric mice using ES cells having human A3 adenosine receptor cDNA ES cells established in (4), wherein one allele of the mouse A3 adenosine receptor gene was replaced with human A3 adenosine receptor cDNA Among them, three clones (1C6-1, 1F11-4, 2A4-5) having good morphology and proliferation were cultured on a feeder plate in order to inject them into mouse blastocysts. One of the cryopreservation stocks of each clone was thawed, suspended in 10 mL of M15 medium, centrifuged and precipitated to collect cells. The cells were seeded on a 24-well feeder plate to which 0.5 mL / well of M15 medium was added, and culture was started. Two days later, the cells were passaged to a 3 cm dish feeder plate. Two days later, after washing twice with 1 mL of PBS, 0.5 mL of a trypsin solution was added, and the mixture was added at 37 ° C., 5% CO 2.2It was left under the conditions for 15 minutes. After adding 0.5 ml of M15 medium and suspending by vigorously pipetting 40 times using a 3 mL transfer pipette, FCS was added and mixed, and the cell suspension was injected into mouse blastocysts. Using.
[0222]
Mouse blastocysts were obtained by spontaneously mating superovulated female C57B1 / 6J mice with syngeneic male mice, and after 4 days, perfusing the inside of the removed uterus with M15 medium. The obtained mouse blastocysts are subjected to 37 ° C., 5
[0223]
Among the chimeric individuals in which brown hair appeared in black hair due to the contribution of the injected ES cells (1C6-1, 1F11-4, 2A4-5), male individuals having a chimera rate of more than 40% were found. 11 animals were obtained from 1F11-4 and 11 animals were obtained from 2A4-5.
[0224]
(6) Obtaining heterozygous mice having human A3 adenosine receptor cDNA by crossing chimeric individuals
After breeding the chimeric individual obtained in (5) until the age of 8 weeks, it was mated 1: 1 with female C57B1 /
[0225]
(7) Obtaining mice expressing only human A3 adenosine receptor
After breeding the heterozygous mouse obtained in the above (6) until the age of 8 weeks, males and females were bred to obtain offspring. Genomic DNA was prepared from the tail of the offspring individual according to the method described in (4) and subjected to Southern hybridization. As a result, as shown in Example 8, only a 5.0 kbp band was observed, and a homozygous mouse in which the A3 adenosine receptor gene was replaced with the human A3 adenosine receptor cDNA in both chromosomes, Was included. This homozygous mouse is a mouse that expresses human A3 adenosine receptor instead of mouse A3 adenosine receptor.
[0226]
Example 8 Genomic structure analysis of mouse in which A3 adenosine receptor gene was replaced with DNA encoding human A3 adenosine receptor
C57BL / 6J mouse (CLEA Japan), a heterozygous mouse in which the A3 adenosine receptor gene described in (6) of Example 7 has been replaced with DNA encoding a human A3 adenosine receptor, and (7) of Example 7 A tail was collected from a homozygous mouse in which the A3 adenosine receptor gene described in (1) was replaced with DNA encoding a human A3 adenosine receptor, and genomic DNA was prepared in the same manner as in Example 9 (4). After dissolving the genomic DNA in TE buffer (manufactured by Invitrogen), 10 μg of the genomic DNA was added for 16 hours.EcoIt was cut with RI (manufactured by Takara Bio Inc.), and Southern hybridization was performed by the method described in Example 7, (2).
[0227]
As a result of Southern hybridization using the 5′-side probe described in Example 6, (1), a C57BL / 6J mouse band of about 9 kbp, the A3 adenosine receptor gene was converted to DNA encoding human A3 adenosine receptor About 9 kbp and about 8.5 kbp bands were detected in the substituted heterozygous mice, and about 8.5 kbp bands were detected in the homozygous mice in which the A3 adenosine receptor gene was replaced with DNA encoding the human A3 adenosine receptor. (FIG. 30). Subsequently, as a result of Southern hybridization using the 3′-side probe described in Example 6 (2), the C57BL / 6J mouse had a band of about 6.5 kbp, and the A3 adenosine receptor gene was replaced with the human A3 adenosine receptor. Approximately 6.5 kbp and approximately 5.0 kbp bands in heterozygous mice substituted with DNA encoding DNA, and approximately 5.5 kbp in homozygous mice in which the A3 adenosine receptor gene was substituted with DNA encoding human A3 adenosine receptor. A band of 0 kbp was detected (FIG. 31). The above results are consistent with the genomic structure schematically shown in FIGS. 28 and 29. In the heterozygous mouse, the A3 adenosine receptor gene on one chromosome encodes the human A3 adenosine receptor It was confirmed that the homozygous mouse had the A3 adenosine receptor gene on both chromosomes replaced with DNA encoding the human A3 adenosine receptor.
[0228]
Example 9 Evaluation of Human A3 Adenosine Receptor-Specific Antagonist Using Mast Cells Derived from Homozygous Mice with A3 Adenosine Receptor Gene Replaced by DNA Encoding Human A3 Adenosine Receptor
(1) Preparation of bone marrow cell-derived mast cell (BMMC)
From bone marrow cells obtained from C57BL / 6J mice and homozygous mice in which the A3 adenosine receptor gene prepared in (7) of Example 7 was replaced with DNA encoding a chimeric A3 adenosine receptor, the following Supajatura et al. Bone marrow cell-derived mast cells (hereinafter, referred to as BMMC) were produced by a method according to the method [The Journal of Immunology (J. Immunol.), {167, {4} (2001)}.
[0229]
The spleen was isolated from 20 male BALB / cA mice (CLEA Japan) and homogenized. The spleen cells were isolated from the spleen cell culture medium [10% FCS (Hyclone), 10 mmol / L @ HEPES buffer (Invitrogen). ), 0.1 mmol / L @ 2 mercaptoethanol (Invitrogen), 50 mg / L gentamicin (Nacalai Tesque), 3.4 mg / LPhytolacca americana2 × 10 5 in RPMI 1640 medium (manufactured by Invitrogen) containing lectin (manufactured by pokeweed) derived from pokeweed (Sigma-Aldrich)6Cells / mL, 37 ° C, 5% CO2The cells were cultured under the conditions for 5 days. After the culture, the culture supernatant was collected. Hereinafter, the culture supernatant is referred to as PWM-SCM (abbreviation for culture supernatant of spleen cells stimulated with pokeweed mitogen).
[0230]
Subsequently, bone marrow cells were collected from femurs of C57BL / 6J mice and homozygous mice in which the A3 adenosine receptor gene prepared in Example 7, (7) was replaced with DNA encoding human A3 adenosine receptor. BMMC medium [10% FCS, 0.1 mmol / L sodium pyruvate (Invitrogen), 0.1 mmol / L non-essential amino acid (Invitrogen), 50 μmol /
[0231]
2 × 105After washing the cells with Dulbecco's phosphate buffer (hereinafter referred to as PBS) (Invitrogen), trinitrophenol (hereinafter abbreviated as TNP) labeled with 0.2 μg of fluorescein isothiocyanate (hereinafter abbreviated as FITC) PBS containing specific IgE (obtained from KM393 cells (ATCC No .: TIB142)) and an anti-mouse c-kit antibody (Pharmingen) labeled with 0.2 μg of phycoerythrin (hereinafter abbreviated as PE) And reacted on ice for 1 hour. After the reaction, the cells were washed twice with PBS, and the fluorescence intensity of FITC and PE was measured by FACS @ Calibur (Becton Dickinson). It has been reported that IgE Fc receptor and c-kit exist on the mast cell membrane, and both IgE and anti-mouse c-kit antibody bind (Immunity,).1695% or more of cells derived from C57BL / 6J mice (FIG. 32) and cells derived from homozygous mice in which the A3 adenosine receptor gene was replaced with DNA encoding human A3 adenosine receptor (FIG. 33). Staining with both antibodies confirmed that these cell groups had differentiated into BMMC.
[0232]
(2) Intracellular Ca2+Of Human A3 Adenosine Receptor Specific Antagonist by Assay
Intracellular Ca of BMMC by A3 adenosine receptor agonists and antagonists2+The variation of the amount was measured by the following method.
[0233]
In a BMMC medium supplemented with 100 ng / mL of TNP-specific IgE, 1 × 10 66Cells / mL, 37 ° C, 5% CO2The cells were cultured under the conditions for 16 hours. After the culture, the BMMC was added to a calcium measurement buffer [20 mmol / L @ HEPES (manufactured by Nacalai Tesque), 115 mmol / L NaCl (manufactured by Junsei Chemical), 5.4 mmol / L @ KCl (manufactured by Nacalai Tesque), 0.8 mmol / L MgCl2(Manufactured by Nacalai Tesque) 1.8 mmol / L @
[0234]
As shown in FIG. 34, in BMMC derived from C57BL / 6J mice, intracellular Ca by Cl-IB-MECA addition2+Although an increase in the amount was observed, the increase was also observed when the human A3 adenosine receptor antagonist KF26777 at a final concentration of 1 μmol / L was added 10 minutes before the addition of Cl-IB-MECA, and inhibition by the antagonist was observed. Was not seen. On the other hand, as shown in FIG. 35, in BMMC derived from a mouse in which the A3 adenosine receptor gene was replaced with DNA encoding the human A3 adenosine receptor, intracellular Ca by Cl-IB-MECA addition2+An increase in the amount was observed, and the increase was completely suppressed by adding a final concentration of 1 μmol / L of the human A3 adenosine
[0235]
From the above results, the pharmacological evaluation of the human A3 adenosine receptor-specific antagonist, which was impossible with the conventional mouse, was performed on the mouse in which the A3 adenosine receptor gene of the present invention was replaced with the DNA encoding the human A3 adenosine receptor. It has been clarified that the method can be used, and this mouse was shown to be useful for the pharmacological evaluation of a specific drug for human A3 adenosine receptor.
[0236]
【The invention's effect】
According to the present invention, there is provided a non-human mammal capable of performing a pharmacological evaluation of a substance that specifically acts on a human A3 adenosine receptor.
[0237]
"Sequence List Free Text"
SEQ ID NO: 1—Primer for amplifying human A3 adenosine receptor cDNA
SEQ ID NO: 2-Primer for amplifying human A3 adenosine receptor cDNA
SEQ ID NO: 5-primer for amplifying mouse A3 adenosine receptor gene
SEQ ID NO: 6: Primer for amplifying mouse A3 adenosine receptor gene
SEQ ID NO: 7—Primer for amplifying mouse A3 adenosine receptor gene
SEQ ID NO: 8—Primer for amplifying mouse A3 adenosine receptor gene
SEQ ID NO: 9—Primer for amplifying mouse A3 adenosine receptor gene
SEQ ID NO: 10—Primer for amplifying mouse A3 adenosine receptor gene
SEQ ID NO: 12-ploxP-RE-HPRT-hA3R-arm2 construction oligo DNA
SEQ ID NO: 13-ploxP-RE-HPRT-hA3R-arm2 construction oligo DNA
SEQ ID NO: 14-A3R-C2 oligo DNA for construction
SEQ ID NO: 15-A3R-C2 oligo DNA for construction
SEQ ID NO: 16-A3R-C3 construction primer
SEQ ID NO: 17-A3R-C3 construction primer
SEQ ID NO: 18—Primer for amplifying mouse genomic DNA
SEQ ID NO: 19—Primer for amplifying mouse genomic DNA
SEQ ID NO: 20--Primer for amplifying human A3 adenosine receptor cDNA fragment
SEQ ID NO: 21—Primer for amplifying human A3 adenosine receptor cDNA fragment
Primer for amplifying DNA fragment containing polyadenylation signal of SEQ ID NO: 22-SV40
Primer for amplifying DNA fragment containing polyadenylation signal of SEQ ID NO: 23-SV40
SEQ ID NO: 24-A primer for amplifying DNA encoding human A3 adenosine receptor to which a FLAG tag has been added
A primer for amplifying DNA encoding human A3 adenosine receptor to which SEQ ID NO: 25-FLAG tag is added
SEQ ID NO: 27—Primer for amplifying probe on mouse 5'-side 5'-side receptor gene
SEQ ID NO: 28—Primer for amplifying probe on mouse 5 'side on mouse A3 receptor gene
SEQ ID NO: 30--Primer for amplifying probe on mouse 3 'side of A3 receptor gene
SEQ ID NO: 31-Primer for amplifying probe at mouse A3 receptor gene 3 'side
[0238]
[Sequence list]
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows the construction of plasmid pBS-hA3R containing human A3 adenosine receptor cDNA.
FIG. 2 shows recognition sequences for each restriction enzyme present in a mouse genomic DNA sequence of about 9
FIG. 3 shows recognition sequences for each restriction enzyme present in a mouse genomic DNA sequence of about 6.5
FIG. 4 shows a region of a mouse genomic DNA sequence of about 5.2 kbp containing an A3 adenosine receptor gene determined according to the present invention and a mouse genomic DNA sequence of about 6 kbp containing a known A3 adenosine receptor gene. Is shown.
FIG. 5 shows the construction of a target vector ploxP-DT-arm1-HPRT-hA3R-arm2 for replacing mouse A3 adenosine receptor gene with DNA encoding human A3 adenosine receptor (15 steps in total). The first step shows the construction of the plasmid ploxP-HPRT-hA3R-arm2.
FIG. 6 shows the second step of the construction of the target vector ploxP-DT-arm1-HPRT-hA3R-arm2 (15 steps in total), the construction of the plasmid ploxP-RE-HPRT-hA3R-arm2.
FIG. 7 shows the third step of the construction of the target vector ploxP-DT-arm1-HPRT-hA3R-arm2 (15 steps in total), the construction of the plasmid A3R-C1.
FIG. 8 shows the fourth step of the construction of the target vector ploxP-DT-arm1-HPRT-hA3R-arm2 (15 steps in total), the construction of the plasmid A3R-C2.
FIG. 9 shows the fifth step of the construction of the target vector ploxP-DT-arm1-HPRT-hA3R-arm2 (15 steps in total), the construction of the plasmid A3R-C3.
FIG. 10 shows the sixth step of the construction of the target vector ploxP-DT-arm1-HPRT-hA3R-arm2 (15 steps in total), and the construction of the plasmid A3R-C4.
FIG. 11 shows the seventh step of the construction of the target vector ploxP-DT-arm1-HPRT-hA3R-arm2 (15 steps in total), the construction of the plasmid ploxP-RE-C-HPRT-hA3R-arm2.
FIG. 12 shows the eighth step in the construction of the target vector ploxP-DT-arm1-HPRT-hA3R-arm2 (15 steps in total), the construction of the plasmid A3R-N1.
FIG. 13 shows the ninth step of the construction of the target vector ploxP-DT-arm1-HPRT-hA3R-arm2 (a total of 15 steps), and the construction of the plasmid A3R-N2.
FIG. 14 shows the tenth step of the construction of the target vector ploxP-DT-arm1-HPRT-hA3R-arm2 (a total of 15 steps), and the construction of the plasmid A3R-N3.
FIG. 15 shows the eleventh step of the construction of the target vector ploxP-DT-arm1-HPRT-hA3R-arm2 (total of 15 steps), and the construction of the plasmid A3R-N4.
FIG. 16 shows the twelfth step of the construction of the target vector ploxP-DT-arm1-HPRT-hA3R-arm2 (a total of 15 steps), and the construction of the plasmid A3R-N5.
FIG. 17 shows the thirteenth step of the construction of the target vector ploxP-DT-arm1-HPRT-hA3R-arm2 (15 steps in total), and the construction of the plasmid A3R-N6.
FIG. 18 shows the 14th step of the construction of the target vector ploxP-DT-arm1-HPRT-hA3R-arm2 (15 steps in total), the construction of the plasmid ploxP-arm1-HPRT-hA3R-arm2.
FIG. 19 shows the fifteenth step of the construction of the target vector ploxP-DT-arm1-HPRT-hA3R-arm2 (a total of 15 steps), and the construction of the plasmid ploxP-DT-arm1-HPRT-hA3R-arm2.
FIG. 20 shows the first step of the construction of a human A3 adenosine receptor expression vector hA3R in pCAG (four steps in total), construction of plasmid polyA in pBS.
FIG. 21 shows the second step in the construction of the expression vector hA3R 受 容 in pCAG for human A3 adenosine receptor (4 steps in total), construction of the plasmid hA3R in pBS.
FIG. 22 shows the third step of the construction of a human A3 adenosine receptor expression vector hA3R in pCAG (4 steps in total), construction of plasmid hA3R-polyA in pBS.
FIG. 23 shows the third step in the construction of the expression vector hA3R 受 容 in pCAG for human A3 adenosine receptor (4 steps in total), construction of the plasmid hA3R in pCAG.
FIG. 24 shows the reactivity of mouse myeloma cell P3U1 transiently expressing the human A3 adenosine receptor to the A3-adenosine receptor-specific agonist Cl-IB-MECA (intracellular Ca).2+The figure shows the results of measurement of The horizontal axis is time (seconds), and Cl-IB-MECA was added to the cells at the time of the arrow. The vertical axis is the amount of luminescence of aequorin, and the intracellular Ca2+Represents the amount of increase. The open circles indicate the results of measurement of P3U1 cells expressing human A3 adenosine receptor, the open squares indicate the results of measurement of control P3U1 cells, and the solid squares indicate the measurement results of control P3U1 cells without addition of Cl-IB-MECA.
FIG. 25 shows the reactivity of the mouse myeloma cell line (four in total), in which human A3 adenosine receptor was stably expressed, with the A3 adenosine receptor-specific agonist Cl-IB-MECA (intracellular Ca).2+The figure shows the results of measurement of The horizontal axis is time (seconds), and Cl-IB-MECA was added to the cells at the time of the arrow. The vertical axis is the amount of luminescence of aequorin, and the intracellular Ca2+Represents the amount of increase. ●, 、, black square and ◆ indicate P3U1 cells stably expressing human A3 adenosine receptor, and □ indicate control P3U1 cells.
FIG. 26 shows the genomic DNA content of mouse contained in plasmid pBS-probe5 ′.SacI-SmaThe position of the I fragment is schematically shown.
FIG. 27 is a diagram showing mouse genomic DNA contained in plasmid pBS-probe3 ′.NheThe position of the I fragment is schematically shown.
FIG. 28 shows the mouse genomic structure around the A3 adenosine receptor gene and the mouse genomic structure when the mouse A3 adenosine receptor gene was replaced with DNA encoding the human A3 adenosine receptor by homologous recombination. Is shown.
FIG. 29 shows the mouse genomic structure when the mouse A3 adenosine receptor gene was replaced by DNA encoding the human A3 adenosine receptor by homologous recombination, and the locus between loxP and loxP sequences by the Cre protein. The genomic structure of the same mouse when the existing drug resistance markers (PGK promoter and hprt gene) are removed.
FIG. 30 shows the use of a 5 ′ probe for genomic DNA of a C57BL / 6J mouse, a heterozygous mouse in which the A3 adenosine receptor gene was replaced with DNA encoding the human A3 adenosine receptor, and a homozygous mouse. 4 shows the results of Southern hybridization analysis.
FIG. 31 shows the use of a 3 ′ probe for genomic DNA of a C57BL / 6J mouse, a heterozygous mouse in which the A3 adenosine receptor gene was replaced with DNA encoding the human A3 adenosine receptor, and a homozygous mouse. 4 shows the results of Southern hybridization analysis.
FIG. 32 shows FACS analysis of C57BL / 6J mouse-derived BMMC using TNP-specific IgE and anti-c-kit antibody. a) shows the result of FACS analysis of unstained BMMC, and b) shows the result of FACS analysis of BMMC stained with an antibody. The vertical axis indicates the fluorescence intensity of cells stained with the PE-labeled anti-c-kit antibody, and the horizontal axis indicates the fluorescence intensity of cells stained with FITC-labeled TNP-specific IgE.
FIG. 33 shows FACS analysis of mouse-derived BMMC in which the A3 adenosine receptor for TNP-specific IgE and anti-c-kit antibody was replaced with DNA encoding a human A3 adenosine receptor. a) shows the result of FACS analysis of unstained BMMC, and b) shows the result of FACS analysis of BMMC stained with an antibody. The vertical axis indicates the fluorescence intensity of cells stained with the PE-labeled anti-c-kit antibody, and the horizontal axis indicates the fluorescence intensity of cells stained with FITC-labeled TNP-specific IgE.
FIG. 34 shows intracellular Ca of BMMC derived from C57BL / 6J mouse.2+Shows the variation of the amount. a) the result of adding only the calcium measurement buffer, b) the result of adding the final concentration of 1 μmol / L of the A3 adenosine receptor agonist Cl-IB-MECA, and c) the result of adding the final concentration of 1 μmol / L of the A3 adenosine receptor. Ten minutes before the addition of the agonist Cl-IB-MECA, the human A3 adenosine receptor antagonist KF26777 was added, and d) shows the result of adding a final concentration of 10 ng / mL TNP-BSA. The vertical axis is Ca2+The fluorescence amount of Fluo-3 at a wavelength of 530 nm, which is excited by the above, is shown as a relative value with the value before adding the drug being 1.0. The horizontal axis shows the time after drug addition in seconds.
FIG. 35 shows intracellular Ca of mouse-derived BMMC in which the A3 adenosine receptor gene was replaced with DNA encoding human A3 adenosine receptor.2+Shows the variation of the amount. a) the result of adding only the calcium measurement buffer, b) the result of adding the final concentration of 1 μmol / L of the A3 adenosine receptor agonist Cl-IB-MECA, and c) the result of adding the final concentration of 1 μmol / L of the A3 adenosine receptor. Ten minutes before the addition of the agonist Cl-IB-MECA, the human A3 adenosine receptor antagonist KF26777 was added, and d) shows the result of adding 10 ng / mL final concentration of TNP-BSA. The vertical axis is Ca2+The fluorescence amount of Fluo-3 at a wavelength of 530 nm, which is excited by the above, is shown as a relative value with the value before adding the drug being 1.0. The horizontal axis shows the time after drug addition in seconds.
Claims (28)
（ａ）ヒトＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡを含む発現ベクターを構築する工程
（ｂ）該発現ベクターを非ヒト哺乳動物の受精卵に導入する工程
（ｃ）該受精卵を偽妊娠雌性非ヒト哺乳動物の卵管あるいは子宮に移植する工程
（ｄ）該非ヒト哺乳動物を飼育し、産まれた仔から、ヒトＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡをゲノム中に有する個体を選択する工程The method for producing a transgenic non-human mammal according to claim 1, comprising the following steps (a) to (d).
(A) a step of constructing an expression vector containing a DNA encoding a human A3 adenosine receptor (b) a step of introducing the expression vector into a fertilized egg of a non-human mammal (c) a step of transforming the fertilized egg into a pseudopregnant female non-human (D) breeding the non-human mammal and selecting an individual having a DNA encoding the human A3 adenosine receptor in the genome from the offspring of the non-human mammal
（ａ）ヒトＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡを含む発現ベクターを構築する工程
（ｂ）該発現ベクターを非ヒト哺乳動物の胚性幹細胞に導入する工程
（ｃ）該胚性幹細胞を非ヒト哺乳動物の受精卵に導入する工程
（ｄ）該受精卵を偽妊娠雌性非ヒト哺乳動物の卵管あるいは子宮に移植する工程
（ｅ）該非ヒト哺乳動物を飼育し、産まれた仔から、ヒトＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡを有するゲノム中に個体を選択する工程The method for producing a transgenic non-human mammal according to claim 1, comprising the following steps (a) to (e).
(A) a step of constructing an expression vector containing DNA encoding the human A3 adenosine receptor (b) a step of introducing the expression vector into embryonic stem cells of a non-human mammal (c) transforming the embryonic stem cells into a non-human mammal (D) introducing the fertilized egg into the oviduct or uterus of a pseudopregnant female non-human mammal; (e) breeding the non-human mammal; Selecting an individual in a genome having DNA encoding the receptor
（ａ）ヒトＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡを含む発現ベクターを構築する工程
（ｂ）該発現ベクターを***に取り込ませる工程
（ｃ）該***により非ヒト哺乳動物の未受精卵を受精させる工程
（ｄ）該受精卵を偽妊娠雌性非ヒト哺乳動物の卵管あるいは子宮に移植する工程
（ｅ）該非ヒト哺乳動物を飼育し、産まれた仔から、ヒトＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡをゲノム中に有する個体を選択する工程The method for producing a transgenic non-human mammal according to claim 1, comprising the following steps (a) to (e).
(A) a step of constructing an expression vector containing DNA encoding the human A3 adenosine receptor (b) a step of incorporating the expression vector into sperm (c) a step of fertilizing an unfertilized egg of a non-human mammal with the sperm (D) a step of transplanting the fertilized egg into the oviduct or uterus of a pseudopregnant female non-human mammal; (e) breeding the non-human mammal and genomically encoding a DNA encoding a human A3 adenosine receptor from the offspring. The step of selecting an individual to have in it
（ａ）ヒトＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡを含むレトロウイルスベクターを構築する工程
（ｂ）該レトロウイルスベクターを用いて組換えレトロウイルスを作製する工程
（ｃ）該組換えレトロウイルスを非ヒト哺乳動物の未受精卵に感染させる工程
（ｄ）該未受精卵を体外受精させる工程
（ｅ）該受精卵を偽妊娠雌性非ヒト哺乳動物の卵管あるいは子宮に移植する工程
（ｆ）該非ヒト哺乳動物を飼育し、産まれた仔から、ヒトＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡをゲノム中に有する個体を選択する工程The method for producing a transgenic non-human mammal according to claim 1, comprising the following steps (a) to (f).
(A) a step of constructing a retroviral vector containing a DNA encoding a human A3 adenosine receptor (b) a step of preparing a recombinant retrovirus using the retroviral vector (c) Infecting a mammalian unfertilized egg (d) in vitro fertilizing the unfertilized egg (e) transplanting the fertilized egg into the oviduct or uterus of a pseudopregnant female non-human mammal (f) the non-human A step of breeding a mammal and selecting an individual having in its genome a DNA encoding a human A3 adenosine receptor from the offspring born
（ａ）ヒトＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡを含むターゲットベクターを構築する工程
（ｂ）該ターゲットベクターを非ヒト哺乳動物の胚性幹細胞に導入する工程
（ｃ）ヒトＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡが、自己のＡ３アデノシン受容体をコードする領域と置換して挿入された染色体を有する胚性幹細胞を選択する工程
（ｄ）選択した胚性幹細胞を受精卵に導入する工程
（ｅ）該受精卵を偽妊娠雌性非ヒト哺乳動物の卵管あるいは子宮に移植する工程
（ｆ）該非ヒト哺乳動物を飼育し、産まれた仔から、生殖系列キメラを選択する工程
（ｇ）該生殖系列キメラを交配させ、産まれた仔から、ヒトＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡが、自己のＡ３アデノシン受容体をコードする領域と置換して挿入された染色体を有する個体を選択する工程
（ｈ）（ｇ）で得られた個体同士を交配させ、産まれた仔から、両方の相同染色体において、ヒトＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡが、自己のＡ３アデノシン受容体をコードする領域と置換して挿入されたホモ接合体を選択する工程The method for producing a transgenic non-human mammal according to claim 2, comprising the following steps (a) to (h).
(A) Step of constructing a target vector containing DNA encoding human A3 adenosine receptor (b) Step of introducing the target vector into non-human mammal embryonic stem cells (c) Encoding human A3 adenosine receptor A step of selecting an embryonic stem cell having a chromosome inserted by replacing the DNA with a region encoding the own A3 adenosine receptor; (d) introducing the selected embryonic stem cell into a fertilized egg; Transplanting eggs into the oviduct or uterus of a pseudopregnant female non-human mammal (f) breeding the non-human mammal and selecting a germ-line chimera from the offspring (g) mating the germ-line chimera The chromosome into which the human A3 adenosine receptor-encoding DNA was replaced by the self-A3 adenosine receptor-encoding region was inserted from the offspring of the offspring. The individuals obtained in steps (h) and (g) are selected from the offspring, and the DNA encoding the human A3 adenosine receptor is expressed on both homologous chromosomes of the offspring. Selecting the inserted homozygote by replacing the region encoding
（ａ）ヒトＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡを含む発現ベクターを構築する工程
（ｂ）構築した発現ベクターを非ヒト哺乳動物の細胞に導入する工程
（ｃ）（ｂ）で得られた細胞の核を脱核した非ヒト哺乳動物の未受精卵に導入し、発生を開始させる工程
（ｄ）発生を開始した該未受精卵を偽妊娠雌性非ヒト哺乳動物の卵管あるいは子宮に移植する工程
（ｅ）該非ヒト哺乳動物を飼育し、産まれた仔から、ヒトＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡをゲノム中に有する個体を選択する工程The method for producing a transgenic non-human mammal according to claim 1, comprising the following steps (a) to (e).
(A) a step of constructing an expression vector containing DNA encoding the human A3 adenosine receptor (b) a step of introducing the constructed expression vector into cells of a non-human mammal (c) the cells obtained in (b) A step of introducing the nucleus into an unfertilized egg of a non-human mammal having a nucleus and initiating the development (d) transplanting the unfertilized egg having started the development into the oviduct or uterus of a pseudopregnant female non-human mammal (E) a step of breeding the non-human mammal and selecting an individual having a DNA encoding a human A3 adenosine receptor in the genome from the offspring of the offspring;
（ａ）ヒトＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡを含むターゲットベクターを構築する工程
（ｂ）構築したターゲットベクターを非ヒト哺乳動物の細胞に導入する工程
（ｃ）ヒトＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡが、自己のＡ３アデノシン受容体をコードする領域と置換して挿入された染色体を有する細胞を選択する工程
（ｄ）選択した細胞の核を脱核した非ヒト哺乳動物の未受精卵に導入し、発生を開始させる工程
（ｅ）発生を開始した該未受精卵を偽妊娠雌性非ヒト哺乳動物の卵管あるいは子宮に移植する工程
（ｆ）該非ヒト哺乳動物を飼育し、産まれた仔から、ヒトＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡが、自己のＡ３アデノシン受容体をコードする領域と置換して挿入された染色体を有する個体を選択する工程
（ｇ）（ｆ）で得られた個体同士を交配させ、産まれた仔から、両方の相同染色体において、ヒトＡ３アデノシン受容体をコードするＤＮＡが、自己のＡ３アデノシン受容体をコードする領域と置換して挿入されているホモ接合体を選択する工程The method for producing a transgenic non-human mammal according to claim 2, comprising the following steps (a) to (g).
(A) Step of constructing a target vector containing DNA encoding human A3 adenosine receptor (b) Step of introducing the constructed target vector into cells of a non-human mammal (c) DNA encoding human A3 adenosine receptor Selecting a cell having a chromosome inserted by substituting the region encoding its own A3 adenosine receptor (d) introducing a nucleus of the selected cell into an unfertilized egg of a non-nucleated non-human mammal; (E) transplanting the unfertilized egg that has started development into the oviduct or uterus of a pseudopregnant female non-human mammal; (f) breeding the non-human mammal, A step of selecting an individual having a chromosome inserted by replacing the DNA encoding the human A3 adenosine receptor with the region encoding the own A3 adenosine receptor (g) The individuals obtained in (f) are bred to each other, and from the offspring, the DNA encoding the human A3 adenosine receptor is inserted into both homologous chromosomes, replacing the region encoding the own A3 adenosine receptor. The step of selecting homozygotes
（ａ）請求項１、２、１４、１６、１８および２０のいずれか１項に記載の非ヒト哺乳動物に試験物質を投与して薬理効果を調べる工程
（ｂ）該非ヒト哺乳動物に試験物質を投与しなかった場合の薬理効果と比較し、該試験物質が該非ヒト哺乳動物に与えた薬理効果を調べる工程A pharmacological evaluation method of a test substance for a human A3 adenosine receptor, comprising the following steps (a) and (b):
(A) a step of administering a test substance to the non-human mammal according to any one of claims 1, 2, 14, 16, 18, and 20 and examining a pharmacological effect; and (b) a test substance to the non-human mammal. Examining the pharmacological effect of the test substance on the non-human mammal in comparison with the pharmacological effect of the case where no is administered.
（ａ）請求項１１に記載の細胞に試験物質を投与して薬理効果を調べる工程
（ｂ）該細胞に試験物質を投与しなかった場合の薬理効果と比較し、試験物質が該細胞に与えた薬理効果を調べる工程A pharmacological evaluation method of a test substance for a human A3 adenosine receptor, comprising the following steps (a) and (b):
(A) a step of administering a test substance to the cell according to claim 11 and examining a pharmacological effect; and (b) comparing the pharmacological effect obtained when the test substance is not administered to the cell with the test substance. The process of examining the pharmacological effects
（ａ）請求項１２に記載の胚性幹細胞を分化誘導し、分化した細胞を取得する工程
（ｂ）（ａ）で得られた分化した細胞に試験物質を投与して薬理効果を調べる工程
（ｃ）（ａ）で得られた分化した細胞に試験物質を投与しなかった場合の薬理効果と比較し、試験物質が該細胞に与えた薬理効果を調べる工程A pharmacological evaluation method for a test substance for a human A3 adenosine receptor, comprising the following steps (a) to (c):
(A) a step of inducing differentiation of the embryonic stem cells according to claim 12 and obtaining the differentiated cells (b) a step of administering a test substance to the differentiated cells obtained in (a) and examining a pharmacological effect ( c) examining the pharmacological effect of the test substance on the differentiated cells obtained in (a) when not administering the test substance to the cells,
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|---|---|---|---|---|
| JP2008522182A (en) * | 2004-12-02 | 2008-06-26 | キャン−ファイト・バイオファーマ・リミテッド | Biomarkers for inflammation |
| JP2009517458A (en) * | 2005-11-30 | 2009-04-30 | キャン−ファイト・バイオファーマ・リミテッド | Use of A3 adenosine receptor agonists in the treatment of osteoarthritis |
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2003
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