JP2004041211A

JP2004041211A - XENOGENIC PPARalpha GENE-TRANSGENIC DISEASE MODEL ANIMAL AND APPLICATION OF THE SAME

Info

Publication number: JP2004041211A
Application number: JP2003273937A
Authority: JP
Inventors: Yuichiro Amano; 天野　雄一郎; Yasuo Sugiyama; 杉山　泰雄; Mayumi Nishida; 西田　真由美; Shigehisa Taketomi; 武冨　滋久
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2002-07-15
Filing date: 2003-07-14
Publication date: 2004-02-12

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a model animal used for in vivo evaluation of pharmaceutical effect of a human PPAR (Peroxisome Proliferator-Activated Receptor) α agonist or antagonist which acts on the human PPARα but does not act to endogeneous PPARα of laboratory animals. <P>SOLUTION: In a nonhuman mammalian or a part of its living body and a method for screening a xenogenic PPARα agonist/antagonist by using the animal, a DNA for coding the xenogenic PPARα is stably maintained in an expressible state, and one or more other gene modification generating a morbid state equal or similar to a disease associated with activity regulation of PPARα or an exogenous DNA under the control of a promoter having PPRE is maintained. <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO

Description

　本発明は異種ＰＰＡＲα遺伝子導入非ヒト哺乳動物に関する。より詳細には、本発明は、異種ＰＰＡＲα遺伝子が導入され、且つＰＰＡＲαの活性調節が関与する疾患の実験的動物モデルとして使用し得る表現型を示す遺伝子改変を有する非ヒト哺乳動物、およびそれを用いた異種ＰＰＡＲαの由来する動物におけるＰＰＡＲαの活性調節が関与する各種疾患の予防・治療薬のスクリーニング方法、該方法により得られうる該疾患の予防・治療薬に関する。 (4) The present invention relates to a non-human mammal into which a heterologous PPARα gene has been introduced. More specifically, the present invention relates to a non-human mammal having a genetic modification exhibiting a phenotype into which a heterologous PPARα gene has been introduced and which can be used as an experimental animal model for a disease in which regulation of PPARα activity is involved, and The present invention relates to a method for screening for a preventive / therapeutic agent for various diseases in which PPARα activity regulation is involved in an animal derived from a heterologous PPARα used, and a preventive / therapeutic agent for the disease obtainable by the method.

　ペルオキシソーム増殖剤活性化レセプター（Peroxisome Proliferator-Activated Receptor；以下、ＰＰＡＲと略記する）αは肝臓、心臓、腎臓等で高発現する核内レセプター型転写因子であり、脂肪酸β酸化系酵素群やアポリポ蛋白などの種々の脂質代謝関連蛋白質をコードする遺伝子の発現を調節することにより、脂質のホメオスタシスにおいて中心的な役割を担っている。ＰＰＡＲαはレチノイドＸレセプター（ＲＸＲ）とヘテロダイマーを形成し、リガンド存在下に標的遺伝子の５’上流に存在するペルオキシソーム増殖剤応答エレメント（ＰＰＲＥ）配列に結合して遺伝子の転写を促進する。一方で、ＰＰＡＲαによってリガンド存在下に発現が抑制される遺伝子も知られているが、これは他の転写因子との標的ＤＮＡ配列への結合やコアクチベーターをめぐる競合によるものと考えられている。 Peroxisome Proliferator-Activated Receptor (hereinafter abbreviated as PPAR) α is a nuclear receptor-type transcription factor highly expressed in liver, heart, kidney, etc., and is composed of fatty acid β-oxidizing enzymes and apolipoprotein. By regulating the expression of genes encoding various lipid metabolism-related proteins such as, for example, they play a central role in lipid homeostasis. PPARα forms a heterodimer with the retinoid X receptor (RXR) and binds to a peroxisome proliferator response element (PPRE) sequence located 5 ′ upstream of the target gene in the presence of a ligand to promote gene transcription. On the other hand, a gene whose expression is suppressed by PPARα in the presence of a ligand is also known, but this is thought to be due to binding to a target DNA sequence with another transcription factor and competition for a coactivator. .

　ＰＰＡＲαは長鎖不飽和脂肪酸やフィブレート系薬剤などの脂溶性分子によって活性化される。ＰＰＡＲα作動薬は肝臓において脂肪酸酸化活性を高める一方で、アポリポ蛋白C-III（apoC-III；中性脂肪（ＴＧ）との主要な血漿リポ蛋白構成成分）の発現を抑制するため、血中ＴＧ濃度を低下させる効果がある。また、高比重リポ蛋白−コレステロール（ＨＤＬ−Ｃ）の主要構成成分であるアポリポ蛋白A-I（apoA-I）およびアポリポ蛋白A-II（apoA-II）の発現を促進するため、血中ＨＤＬ−Ｃ濃度を増加させる効果がある。したがって、ＰＰＡＲα作動薬は高ＴＧ血症や低ＨＤＬ−Ｃ血症を含む高脂血症、および動脈硬化の予防・治療薬として実際に用いられている（例えば、非特許文献１参照）。ＰＰＡＲα作動薬はまた、虚血に対して心臓保護効果を示すことも知られている（例えば、非特許文献２参照）。 PPARα is activated by fat-soluble molecules such as long-chain unsaturated fatty acids and fibrate drugs. PPARα agonists increase fatty acid oxidizing activity in the liver while suppressing the expression of apolipoprotein C-III (apoC-III; a major component of plasma lipoproteins with triglyceride (TG)). It has the effect of lowering the concentration. Further, in order to promote the expression of apolipoprotein AI (apoA-I) and apolipoprotein A-II (apoA-II), which are main components of high density lipoprotein-cholesterol (HDL-C), blood HDL-C It has the effect of increasing the concentration. Therefore, PPARα agonists are actually used as preventive and therapeutic agents for hyperlipidemia, including hyperTGemia and hypoHDL-C blood, and arteriosclerosis (for example, see Non-Patent Document 1). PPARα agonists are also known to show a cardioprotective effect against ischemia (for example, see Non-Patent Document 2).

　新規ＰＰＡＲα作動薬の開発は、通常、例えばヒトＰＰＡＲαを用いた結合アッセイやヒト細胞株におけるＰＰＲＥ制御下にある遺伝子（例：apoA-I、ＰＰＲＥ−レポーターキメラ遺伝子等）の発現アッセイなどのインビトロでのスクリーニングを行ない、高活性が得られた化合物についてマウスやラットなどの実験動物に投与してインビボでの効果を評価するといった順序で進められる。しかしながら、ヒトと他の哺乳動物との間にはＰＰＡＲαの構造に差異があるため（例えば、ヒトとマウスの間のアミノ酸同一性は９２％）、薬物によってはヒトＰＰＡＲαに対してしかアゴニスト活性を示さない場合もあり得る。そのような薬物は実験動物の内因性ＰＰＡＲαに対しては活性がないので、現存の動物モデルでは評価することが不可能であった。
ジャン−シャルル・フルシャール（Jean-Charles Fruchart）ら，カレント・アテロスクレローシス・リポーツ（Current Atherosclerosis Reports），（米国），2001年，第3巻（第1号），p. 83-92 アントニア・タベルネロ（Antonia Tabernero）ら，ビーエムシー・ファーマコロジー（BMC Pharmacology），（英国），2002年4月9日（オンライン公開），バイオメッド・セントラル（BioMed Central），インターネット＜http://www.biomedcentral.com/1471-2210/2/10＞ Development of novel PPARα agonists is usually performed in vitro, for example, in a binding assay using human PPARα or in an expression assay for a gene under the control of PPRE (eg, apoA-I, PPRE-reporter chimera gene, etc.) in a human cell line. , And the compound having high activity is administered to experimental animals such as mice and rats to evaluate the effect in vivo. However, due to differences in the structure of PPARα between humans and other mammals (eg, 92% amino acid identity between human and mouse), some drugs have agonistic activity only against human PPARα. It may not be shown. Since such drugs have no activity on endogenous PPARα in laboratory animals, they could not be evaluated in existing animal models.
Jean-Charles Fruchart et al., Current Atherosclerosis Reports, (USA), 2001, Vol. 3, No. 1, p. 83-92. Antonia Tabernero et al., BMC Pharmacology, (UK), April 9, 2002 (published online), BioMed Central, Internet <http: // www .biomedcentral.com / 1471-2210 / 2/10>

　したがって、本発明の目的は、ヒトＰＰＡＲαに対してのみアゴニスト活性を示すＰＰＡＲα作動薬のインビボでの効果を有効に評価することができる新規動物モデルを提供することであり、当該動物モデルを用いた、高脂血症、混合型脂質異常症、動脈硬化、高血圧症、血栓症、虚血性心疾患、虚血性脳疾患などの各種疾患の予防・治療薬のスクリーニング方法を提供することである。 Therefore, an object of the present invention is to provide a novel animal model capable of effectively evaluating the in vivo effect of a PPARα agonist showing an agonist activity only on human PPARα, and using the animal model. A method for screening a preventive / therapeutic agent for various diseases such as hyperlipidemia, mixed dyslipidemia, arteriosclerosis, hypertension, thrombosis, ischemic heart disease, and ischemic brain disease.

　本発明者らは、上記の目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、ヒトＰＰＡＲαをコードするＤＮＡを発現可能な状態で安定に保持するトランスジェニックマウスを作製し、これにヒトＰＰＡＲαに対して活性を有するが、マウスＰＰＡＲαに対しては活性を有しない化合物を投与したところ、当該マウスはペルオキシソーム増殖や脂質代謝関連遺伝子の発現増強を含む、ペルオキシソーム増殖剤により誘導される種々の特徴的応答を示すことを見出した。さらに、得られたヒトＰＰＡＲα発現トランスジェニックマウスと、高脂血症や動脈硬化をはじめとするＰＰＡＲαの活性調節が関与し得る各種疾患の実験的動物モデルとを交配することにより、ヒトＰＰＡＲαを発現する当該疾患モデル動物を作製することに成功した。 The present inventors have conducted intensive studies to achieve the above object, and as a result, produced a transgenic mouse that stably retains a DNA encoding human PPARα in an expressible state. Upon administration of a compound that has activity but does not have activity against mouse PPARα, the mouse develops various characteristic responses induced by peroxisome proliferators, including peroxisomal proliferation and expression of lipid metabolism-related genes. Was found. Furthermore, human PPARα is expressed by crossing the obtained human PPARα-expressing transgenic mice with experimental animal models of various diseases in which PPARα activity regulation including hyperlipidemia and arteriosclerosis can be involved. The animal model of the disease was successfully produced.

　本発明者らは、これらの知見に基づいてさらに検討を重ねた結果、本発明を完成するに至った。 The present inventors have further studied based on these findings, and as a result, have completed the present invention.

　すなわち、本発明は、
［１］異種ＰＰＡＲαをコードするＤＮＡを発現可能な状態で安定に保持し、且つ１以上の他の遺伝子改変を有する非ヒト哺乳動物またはその生体の一部、
［２］他の遺伝子改変の少なくとも１つが、ＰＰＡＲαの活性調節が関与する疾患と同一もしくは類似の病態を生じさせるものである、上記［１］記載の動物またはその生体の一部、
［３］他の遺伝子改変の少なくとも１つが、ＰＰＲＥを有するプロモーターの制御下にある外来ＤＮＡの導入である、上記［１］記載の動物またはその生体の一部、
［４］異種ＰＰＡＲαがヒト由来ＰＰＡＲαである上記［１］記載の動物またはその生体の一部、
［５］異種ＰＰＡＲαが配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を有する上記［１］記載の動物またはその生体の一部、
［６］非ヒト哺乳動物が、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウスまたはラットである上記［１］記載の動物またはその生体の一部、
［７］非ヒト哺乳動物がマウスである上記［１］記載の動物またはその生体の一部、
［８］内因性ＰＰＡＲαを欠損するかわりに異種ＰＰＡＲαを発現させた動物である上記［１］記載の動物またはその生体の一部、
［９］内因性ＰＰＡＲαを欠損する動物と、異種ＰＰＡＲαを発現する、該動物と同種の動物とを交配することにより得られうる、上記［８］記載の動物またはその生体の一部、
［１０］内因性ＰＰＡＲαがマウス由来ＰＰＡＲαであり、異種ＰＰＡＲαがヒト由来ＰＰＡＲαである上記［８］記載の動物またはその生体の一部、
［１１］ＰＰＡＲαの活性調節が関与する疾患が、高脂血症、高トリグリセリド血症、混合型脂質異常症、低ＨＤＬ血症、動脈硬化症、末梢動脈閉塞症、間欠性跛行、壊疽、高血圧症、血栓症、虚血性心疾患、急性心筋梗塞、心不全、鬱血性心不全、不安定狭心症、ＰＴＣＡ後の再狭窄、ステント留置後の再狭窄、高フィブリノーゲン血症、心筋症、脳出血、一過性脳虚血発作、脳梗塞、脳卒中、慢性糸球体腎炎、糖尿病性腎症、腎動脈硬化症、皮膚炎、免疫不全、低血糖、低ケトン血症、脂肪肝、糖尿病、糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症、肥満、アルツハイマー病、貧血性低酸素症、性腺障害、肝臓癌、乳癌および子宮内膜炎からなる群より選択される１もしくは２以上の疾患である上記［２］記載の動物またはその生体の一部、
［１２］異種ＰＰＡＲαが、肝臓、心臓、腎臓、副腎、血管、消化管および脳からなる群より選択される１もしくは２以上の部位で特異的に発現することを特徴とする上記［１］記載の動物またはその生体の一部、
［１３］異種ＰＰＡＲαが、肝臓で特異的に発現することを特徴とする上記［１］記載の動物またはその生体の一部、
［１４］上記［１］記載の動物またはその生体の一部に被験物質を適用し、該物質の異種ＰＰＡＲαに対するアゴニストまたはアンタゴニスト活性を検定することを特徴とする異種ＰＰＡＲα作動薬または拮抗薬のスクリーニング方法、
［１５］上記［３］記載の動物またはその生体の一部に被験物質を適用し、該物質の異種ＰＰＡＲαに対するアゴニストまたはアンタゴニスト活性を、ＰＰＲＥを有するプロモーターの制御下にある外来ＤＮＡの発現を指標にして検定することを特徴とする、異種ＰＰＡＲα作動薬または拮抗薬のスクリーニング方法、および
［１６］上記［２］記載の動物に被験物質を投与し、該動物におけるＰＰＡＲαの活性調節が関与する疾患と同一もしくは類似の病態に及ぼす該物質の効果を検定することを特徴とする、異種ＰＰＡＲαの由来する動物における該ＰＰＡＲαの活性調節が関与する疾患に対して予防・治療活性を有する物質のスクリーニング方法を提供する。 That is, the present invention
[1] a non-human mammal or a part of a living body thereof, which stably holds a DNA encoding a heterologous PPARα in an expressible state and has one or more other genetic modifications;
[2] The animal or a part of the living body thereof according to [1], wherein at least one of the other genetic alterations causes the same or similar disease state as a disease associated with PPARα activity regulation,
[3] The animal or a part of the living body thereof according to the above [1], wherein at least one of the other genetic modifications is the introduction of a foreign DNA under the control of a promoter having a PPRE.
[4] The animal or a part of the living body thereof according to [1], wherein the heterologous PPARα is human-derived PPARα.
[5] The animal or a part of the living body thereof according to [1], wherein the heterologous PPARα has the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2,
[6] The animal of the above-mentioned [1], wherein the non-human mammal is a rabbit, dog, cat, guinea pig, hamster, mouse or rat, or a part of the living body thereof;
[7] The animal of the above-mentioned [1], wherein the non-human mammal is a mouse, or a part of the living body thereof,
[8] The animal of the above-mentioned [1], which is an animal expressing a heterologous PPARα instead of deficient in endogenous PPARα, or a part of the living body thereof,
[9] The animal of the above-mentioned [8], or a part of the living body thereof, which can be obtained by crossing an animal deficient in endogenous PPARα with an animal of the same species that expresses heterologous PPARα.
[10] The animal or a part of the living body thereof according to the above [8], wherein the endogenous PPARα is mouse-derived PPARα, and the heterologous PPARα is human-derived PPARα.
[11] PPARα activity-regulated diseases include hyperlipidemia, hypertriglyceridemia, mixed dyslipidemia, hypoHDLemia, arteriosclerosis, peripheral arterial occlusion, intermittent claudication, gangrene, and hypertension Disease, thrombosis, ischemic heart disease, acute myocardial infarction, heart failure, congestive heart failure, unstable angina, restenosis after PTCA, restenosis after stent placement, hyperfibrinogenemia, cardiomyopathy, cerebral hemorrhage, Transient ischemic attack, cerebral infarction, stroke, chronic glomerulonephritis, diabetic nephropathy, renal arteriosclerosis, dermatitis, immunodeficiency, hypoglycemia, hypoketemia, fatty liver, diabetes, diabetic neuropathy The above-mentioned [2], which is one or more diseases selected from the group consisting of diabetic retinopathy, obesity, Alzheimer's disease, anemia hypoxia, gonadal disorders, liver cancer, breast cancer and endometritis. An animal or part of its body,
[12] The above-mentioned [1], wherein the heterologous PPARα is specifically expressed at one or more sites selected from the group consisting of liver, heart, kidney, adrenal gland, blood vessel, digestive tract and brain. Animal or part of its living body,
[13] The animal or a part of the living body thereof according to [1], wherein the heterologous PPARα is specifically expressed in the liver.
[14] A screening for a heterologous PPARα agonist or antagonist, which comprises applying a test substance to the animal or a part of the living body according to the above [1], and assaying the substance for an agonist or antagonist activity against the heterologous PPARα. Method,
[15] A test substance is applied to the animal or a part of the living body thereof according to [3], and the agonist or antagonist activity of the substance against heterologous PPARα is measured by measuring the expression of a foreign DNA under the control of a promoter having PPRE. A screening method for a heterologous PPARα agonist or antagonist, and [16] a disease in which a test substance is administered to the animal according to the above [2], and PPARα activity is regulated in the animal. A method for screening a substance having a prophylactic / therapeutic activity against a disease associated with the regulation of the activity of PPARα in an animal derived from a heterologous PPARα, which comprises assaying the effect of the substance on the same or similar pathology as that of the above. I will provide a.

　さらに、本発明は、
［１７］上記［１４］または［１５］記載の方法により得られうる異種ＰＰＡＲα作動薬、
［１８］上記［１７］記載の作動薬を含有してなる、異種ＰＰＡＲαの由来する動物における高脂血症、高トリグリセリド血症、混合型脂質異常症、低ＨＤＬ血症、動脈硬化症、末梢動脈閉塞症、間欠性跛行、壊疽、高血圧症、血栓症、虚血性心疾患、急性心筋梗塞、心不全、鬱血性心不全、不安定狭心症、ＰＴＣＡ後の再狭窄、ステント留置後の再狭窄、高フィブリノーゲン血症、心筋症、脳出血、一過性脳虚血発作、脳梗塞、脳卒中、慢性糸球体腎炎、糖尿病性腎症、腎動脈硬化症、皮膚炎、免疫不全、低血糖、低ケトン血症、脂肪肝、糖尿病、糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症、肥満、アルツハイマー病、貧血性低酸素症および性腺障害からなる群より選択される１もしくは２以上の疾患の予防・治療薬、
［１９］異種ＰＰＡＲαの由来する動物がヒトである上記［１８］記載の予防・治療薬、
［２０］上記［１７］記載の作動薬の有効量を異種ＰＰＡＲαの由来する動物に投与することを含む、該動物における高脂血症、高トリグリセリド血症、混合型脂質異常症、低ＨＤＬ血症、動脈硬化症、末梢動脈閉塞症、間欠性跛行、壊疽、高血圧症、血栓症、虚血性心疾患、急性心筋梗塞、心不全、鬱血性心不全、不安定狭心症、ＰＴＣＡ後の再狭窄、ステント留置後の再狭窄、高フィブリノーゲン血症、心筋症、脳出血、一過性脳虚血発作、脳梗塞、脳卒中、慢性糸球体腎炎、糖尿病性腎症、腎動脈硬化症、皮膚炎、免疫不全、低血糖、低ケトン血症、脂肪肝、糖尿病、糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症、肥満、アルツハイマー病、貧血性低酸素症および性腺障害からなる群より選択される１もしくは２以上の疾患の予防・治療方法、
［２１］異種ＰＰＡＲαの由来する動物における高脂血症、高トリグリセリド血症、混合型脂質異常症、低ＨＤＬ血症、動脈硬化症、末梢動脈閉塞症、間欠性跛行、壊疽、高血圧症、血栓症、虚血性心疾患、急性心筋梗塞、心不全、鬱血性心不全、不安定狭心症、ＰＴＣＡ後の再狭窄、ステント留置後の再狭窄、高フィブリノーゲン血症、心筋症、脳出血、一過性脳虚血発作、脳梗塞、脳卒中、慢性糸球体腎炎、糖尿病性腎症、腎動脈硬化症、皮膚炎、免疫不全、低血糖、低ケトン血症、脂肪肝、糖尿病、糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症、肥満、アルツハイマー病、貧血性低酸素症および性腺障害からなる群より選択される１もしくは２以上の疾患の予防・治療薬の製造のための、上記［１７］記載の作動薬の使用、
［２２］上記［１４］または［１５］記載の方法により得られうる異種ＰＰＡＲα拮抗薬、
［２３］上記［２２］記載の拮抗薬を含有してなる、異種ＰＰＡＲαの由来する動物における肝臓癌、乳癌および子宮内膜炎からなる群より選択される１もしくは２以上の疾患の予防・治療薬、
［２４］異種ＰＰＡＲαの由来する動物がヒトである上記［２３］記載の予防・治療薬、
［２５］上記［２２］記載の拮抗薬の有効量を異種ＰＰＡＲαの由来する動物に投与することを含む、該動物における肝臓癌、乳癌および子宮内膜炎からなる群より選択される１もしくは２以上の疾患の予防・治療方法、
［２６］異種ＰＰＡＲαの由来する動物における肝臓癌、乳癌および子宮内膜炎からなる群より選択される１もしくは２以上の疾患の予防・治療薬を製造するための、上記［２２］記載の拮抗薬の使用、
［２７］上記［１６］記載の方法により得られうる、異種ＰＰＡＲαの由来する動物における該ＰＰＡＲαの活性調節が関与する疾患に対して予防・治療活性を有する物質、
［２８］上記［２７］記載の物質を含有してなる、異種ＰＰＡＲαの由来する動物における該ＰＰＡＲαの活性調節が関与する疾患の予防・治療薬、
［２９］異種ＰＰＡＲαの活性調節が関与する疾患が、高脂血症、高トリグリセリド血症、混合型脂質異常症、低ＨＤＬ血症、動脈硬化症、末梢動脈閉塞症、間欠性跛行、壊疽、高血圧症、血栓症、虚血性心疾患、急性心筋梗塞、心不全、鬱血性心不全、不安定狭心症、ＰＴＣＡ後の再狭窄、ステント留置後の再狭窄、高フィブリノーゲン血症、心筋症、脳出血、一過性脳虚血発作、脳梗塞、脳卒中、慢性糸球体腎炎、糖尿病性腎症、腎動脈硬化症、皮膚炎、免疫不全、低血糖、低ケトン血症、脂肪肝、糖尿病、糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症、肥満、アルツハイマー病、貧血性低酸素症および性腺障害からなる群より選択される１もしくは２以上の疾患である上記［２８］記載の予防・治療薬、
［３０］上記［２７］記載の物質の有効量を異種ＰＰＡＲαの由来する動物に投与することを含む、該動物におけるＰＰＡＲαの活性調節が関与する疾患の予防・治療方法、および
［３１］異種ＰＰＡＲαの由来する動物における該ＰＰＡＲαの活性調節が関与する疾患の予防・治療薬の製造のための、上記［２７］記載の物質の使用
などを提供するものである。 Further, the present invention provides
[17] A heterologous PPARα agonist obtainable by the method according to the above [14] or [15],
[18] Hyperlipidemia, hypertriglyceridemia, mixed dyslipidemia, hypoHDLemia, arteriosclerosis, peripheral disease in an animal derived from a heterologous PPARα, comprising the agonist of the above-mentioned [17]. Arterial occlusion, intermittent claudication, gangrene, hypertension, thrombosis, ischemic heart disease, acute myocardial infarction, heart failure, congestive heart failure, unstable angina, restenosis after PTCA, restenosis after stent placement, Hyperfibrinogenemia, cardiomyopathy, cerebral hemorrhage, transient ischemic attack, cerebral infarction, stroke, chronic glomerulonephritis, diabetic nephropathy, renal arteriosclerosis, dermatitis, immunodeficiency, hypoglycemia, hypoketemia Prophylactic / therapeutic agent for one or more diseases selected from the group consisting of disease, fatty liver, diabetes, diabetic neuropathy, diabetic retinopathy, obesity, Alzheimer's disease, anemia hypoxia and gonadal disorder,
[19] The prophylactic / therapeutic agent according to the above [18], wherein the animal derived from the heterologous PPARα is a human.
[20] Hyperlipidemia, hypertriglyceridemia, mixed dyslipidemia, low HDL blood in the animal, comprising administering an effective amount of the agonist of the above-mentioned [17] to an animal derived from a heterologous PPARα. Disease, arteriosclerosis, peripheral arterial occlusion, intermittent claudication, gangrene, hypertension, thrombosis, ischemic heart disease, acute myocardial infarction, heart failure, congestive heart failure, unstable angina, restenosis after PTCA, Restenosis after stenting, hyperfibrinogenemia, cardiomyopathy, cerebral hemorrhage, transient ischemic attack, cerebral infarction, stroke, chronic glomerulonephritis, diabetic nephropathy, renal arteriosclerosis, dermatitis, immunodeficiency One or more diseases selected from the group consisting of, hypoglycemia, hypoketemia, fatty liver, diabetes, diabetic neuropathy, diabetic retinopathy, obesity, Alzheimer's disease, anemia hypoxia and gonadal disorder Prevention and treatment methods,
[21] Hyperlipidemia, hypertriglyceridemia, mixed dyslipidemia, hypoHDLemia, arteriosclerosis, peripheral arterial occlusion, intermittent claudication, gangrene, hypertension, thrombosis in animals derived from heterologous PPARα Disease, ischemic heart disease, acute myocardial infarction, heart failure, congestive heart failure, unstable angina, restenosis after PTCA, restenosis after stent placement, hyperfibrinogenemia, cardiomyopathy, cerebral hemorrhage, transient brain Ischemic attack, cerebral infarction, stroke, chronic glomerulonephritis, diabetic nephropathy, renal arteriosclerosis, dermatitis, immunodeficiency, hypoglycemia, hypoketonemia, fatty liver, diabetes, diabetic neuropathy, diabetic Use of the agonist of the above-mentioned [17] for the manufacture of a prophylactic or therapeutic agent for one or more diseases selected from the group consisting of retinopathy, obesity, Alzheimer's disease, anemia hypoxia and gonadal disorders. ,
[22] a heterologous PPARα antagonist obtainable by the method according to the above [14] or [15],
[23] Prevention / treatment of one or more diseases selected from the group consisting of liver cancer, breast cancer and endometritis in an animal derived from a heterologous PPARα, comprising the antagonist of the above-mentioned [22]. medicine,
[24] the prophylactic or therapeutic agent according to the above [23], wherein the animal derived from the heterologous PPARα is a human;
[25] One or two selected from the group consisting of liver cancer, breast cancer and endometritis in an animal, which comprises administering an effective amount of the antagonist of the above-mentioned [22] to an animal derived from a heterologous PPARα. Prevention and treatment methods for the above diseases,
[26] The antagonist of the above-mentioned [22], for producing a prophylactic / therapeutic agent for one or more diseases selected from the group consisting of liver cancer, breast cancer and endometritis in an animal derived from a heterologous PPARα. Use of drugs,
[27] a substance which has a prophylactic / therapeutic activity against a disease associated with the regulation of the activity of PPARα in an animal derived from a heterologous PPARα, which can be obtained by the method according to [16];
[28] a prophylactic / therapeutic agent for a disease involving regulation of PPARα activity in an animal derived from a heterologous PPARα, comprising the substance according to the above [27];
[29] Diseases involving the regulation of heterologous PPARα activity include hyperlipidemia, hypertriglyceridemia, mixed dyslipidemia, hypoHDLemia, arteriosclerosis, peripheral arterial occlusion, intermittent claudication, gangrene, Hypertension, thrombosis, ischemic heart disease, acute myocardial infarction, heart failure, congestive heart failure, unstable angina, restenosis after PTCA, restenosis after stent placement, hyperfibrinogenemia, cardiomyopathy, cerebral hemorrhage, Transient cerebral ischemic attack, cerebral infarction, stroke, chronic glomerulonephritis, diabetic nephropathy, renal arteriosclerosis, dermatitis, immunodeficiency, hypoglycemia, hypoketonemia, fatty liver, diabetes, diabetic nerve The prophylactic / therapeutic agent according to the above [28], which is one or more diseases selected from the group consisting of a disorder, diabetic retinopathy, obesity, Alzheimer's disease, anemia hypoxia and gonad disorder;
[30] A method for preventing or treating a disease associated with the regulation of PPARα activity in an animal comprising administering an effective amount of the substance described in [27] to the animal derived from the heterologous PPARα, and [31] a heterologous PPARα. And a use of the substance described in the above [27] for the manufacture of a prophylactic / therapeutic agent for a disease associated with PPARα activity regulation in an animal derived from the above.

　本発明の異種ＰＰＡＲα遺伝子導入非ヒト哺乳動物は、該異種ＰＰＡＲαに対しては作用するが、該非ヒト哺乳動物の内因性ＰＰＡＲαに対しては作用しないＰＰＡＲα作動薬もしくは拮抗薬の薬効をインビボで評価し得る動物モデルである。 The heterologous PPARα transgenic non-human mammal of the present invention acts on the heterologous PPARα but does not act on the endogenous PPARα of the non-human mammal to evaluate the efficacy of a PPARα agonist or antagonist in vivo. This is a possible animal model.

　異種ＰＰＡＲαをコードするＤＮＡを発現可能な状態で安定に保持する非ヒト哺乳動物（以下、「本発明の遺伝子導入非ヒト哺乳動物」または単に「本発明の遺伝子導入動物」という場合もある）は、異種ＰＰＡＲαをコードするＤＮＡを発現可能な状態で「安定に保持」する。「安定に保持」するとは、該動物の細胞内に異種ＰＰＡＲαをコードするＤＮＡが発現可能な状態で永続的に存在することを意味し、該ＤＮＡが宿主染色体上に組み込まれていても、あるいは染色体外ＤＮＡとして安定に存在していてもよいが、好ましくは、該ＤＮＡは宿主染色体上に組み込まれた状態で保持される。 Non-human mammals that stably maintain a DNA encoding a heterologous PPARα in an expressible state (hereinafter sometimes referred to as “the transgenic non-human mammal of the present invention” or simply “the transgenic animal of the present invention”) The DNA encoding the heterologous PPARα is “stably maintained” in a state capable of expression. The term “stably maintained” means that the DNA encoding the heterologous PPARα is permanently present in the animal's cells in an expressible state, and whether the DNA is integrated on the host chromosome, or Although it may be stably present as extrachromosomal DNA, preferably, the DNA is maintained in a state integrated on the host chromosome.

　本発明の遺伝子導入動物は、非ヒト哺乳動物の受精卵や、未受精卵、***およびその前駆細胞（始原生殖細胞、卵原細胞、卵母細胞、卵細胞、精原細胞、***細胞、精細胞等）などに、好ましくは受精卵の胚発生の初期段階（さらに好ましくは８細胞期以前）において、リン酸カルシウム共沈殿法、電気穿孔（エレクトロポレーション）法、リポフェクション法、凝集法、顕微注入（マイクロインジェクション）法、遺伝子銃（パーティクルガン）法、ＤＥＡＥ−デキストラン法などの遺伝子導入法によって、目的とする異種ＰＰＡＲαをコードするＤＮＡを導入することにより作製される。また、該遺伝子導入法により、非ヒト哺乳動物の体細胞、組織、臓器などに目的とするＤＮＡを導入し、細胞培養、組織培養などに利用することもでき、さらに、この細胞を上述の胚（もしくは生殖）細胞と公知の細胞融合法を用いて融合させることにより遺伝子導入動物を作製することもできる。あるいは、ノックアウト動物を作製する場合と同様に、非ヒト哺乳動物の胚性幹細胞（ＥＳ細胞）に上記の遺伝子導入法を用いて目的とするＤＮＡを導入し、予め該ＤＮＡが安定に組み込まれたクローンを選択した後に、該ＥＳ細胞を胚盤胞に注入するかあるいはＥＳ細胞塊と８細胞期胚とを凝集させてキメラマウスを作製し、生殖系列に導入ＤＮＡが伝達されたものを選択することによっても遺伝子導入動物を得ることが可能である。 The transgenic animal of the present invention may be a fertilized egg of a non-human mammal, an unfertilized egg, a sperm and a precursor cell thereof (primordial germ cell, oocyte, oocyte, egg cell, spermatogonia, spermatocyte, sperm cell, Cells, etc.), preferably in the early stage of embryo development of a fertilized egg (more preferably before the 8-cell stage), calcium phosphate coprecipitation method, electroporation (electroporation) method, lipofection method, aggregation method, microinjection ( It is prepared by introducing a DNA encoding a desired heterologous PPARα by a gene transfer method such as a microinjection method, a gene gun (particle gun) method, and a DEAE-dextran method. Further, by the gene transfer method, a target DNA can be introduced into somatic cells, tissues, organs, and the like of a non-human mammal, and used for cell culture, tissue culture, and the like. A transgenic animal can also be prepared by fusing with a (or germ) cell using a known cell fusion method. Alternatively, as in the case of producing a knockout animal, a target DNA is introduced into embryonic stem cells (ES cells) of a non-human mammal using the above-described gene transfer method, and the DNA is stably integrated in advance. After selecting a clone, the ES cells are injected into a blastocyst, or the ES cell mass and the 8-cell stage embryo are aggregated to produce a chimeric mouse, and those having the introduced DNA transferred to the germline are selected. This also makes it possible to obtain transgenic animals.

　また、このようにして作製された遺伝子導入動物の生体の一部（例えば、(1)異種ＰＰＡＲαをコードするＤＮＡを安定に保持する細胞、組織、臓器など、(2)これらに由来する細胞または組織を培養し、必要に応じて継代したものなど）も、本発明の「異種ＰＰＡＲαをコードするＤＮＡを発現可能な状態で安定に保持する非ヒト哺乳動物の生体の一部」として、本発明の「異種ＰＰＡＲαをコードするＤＮＡを発現可能な状態で安定に保持する非ヒト哺乳動物」と同様な目的に用いることができる。 Further, a part of the living body of the transgenic animal thus produced (for example, (1) cells, tissues, organs, etc. stably retaining DNA encoding heterologous PPARα, (2) cells derived therefrom or Tissues cultured and passaged as necessary) are also referred to as “a part of a living body of a non-human mammal that stably holds a DNA encoding heterologous PPARα in an expressible state” of the present invention. It can be used for the same purpose as the "non-human mammal stably maintaining a DNA encoding heterologous PPARα in an expressible state" of the invention.

　本発明の遺伝子導入動物の生体の一部としては、肝臓、心臓、腎臓、副腎、血管、消化管、脳などの臓器や、当該臓器由来の組織片および細胞などが好ましく例示される。一部 Preferred examples of the living body of the transgenic animal of the present invention include organs such as liver, heart, kidney, adrenal gland, blood vessels, digestive tract, and brain, and tissue fragments and cells derived from such organs.

　本発明で対象とし得る「非ヒト哺乳動物」は、トランスジェニック系が確立されたヒト以外の哺乳動物であれば特に制限はなく、例えば、ウシ、サル、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなどが挙げられる。好ましくは、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウス、ラット等であり、なかでも疾患モデル動物作製の面から個体発生および生物サイクルが比較的短く、繁殖が容易な齧歯動物がより好ましく、とりわけマウス（例えば、純系としてＣ５７ＢＬ／６系統、ＤＢＡ２系統など、交雑系としてＢ６Ｃ３Ｆ₁系統、ＢＤＦ₁系統、Ｂ６Ｄ２Ｆ₁系統、ＢＡＬＢ／ｃ系統、ＩＣＲ系統など）およびラット（例えば、Ｗｉｓｔａｒ、ＳＤなど）が好ましい。 The `` non-human mammal '' that can be a target of the present invention is not particularly limited as long as it is a mammal other than a human whose transgenic system has been established, for example, cows, monkeys, pigs, sheep, goats, rabbits, dogs, Examples include cats, guinea pigs, hamsters, rats, mice and the like. Preferably, rabbits, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, mice, rats and the like, among which rodents that have relatively short ontogeny and biological cycle from the viewpoint of disease model animal production, and that are easy to breed, are more preferable. especially mice (e.g., C57BL / 6 strain as pure line and DBA2 strain, B6C3F ₁ strain as a cross type, BDF ₁ strain, B6D2F ₁ strain, BALB / c strain, ICR strain, etc.) and rats (e.g., Wistar, SD, etc.) Is preferred.

　また、哺乳動物以外にもニワトリなどの鳥類が本発明で対象とする「非ヒト哺乳動物」と同様の目的に用いることができる。鳥 In addition, birds such as chickens other than mammals can be used for the same purpose as the “non-human mammal” targeted in the present invention.

　「異種ＰＰＡＲαをコードするＤＮＡ」とは、遺伝子導入の対象となる非ヒト哺乳動物（例えば、マウス）にとって異種の哺乳動物（例えば、ヒト、ウシ、サル、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラットなど）由来のＰＰＡＲαもしくはそれと実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡを意味する。好ましくは、本発明の異種ＰＰＡＲαをコードするＤＮＡは、ヒトＰＰＡＲαもしくはそれと実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡである。ヒトＰＰＡＲαをコードするＤＮＡとしては、配列番号：２で表わされるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、好ましくは配列番号：１で表わされる塩基配列を有するＤＮＡが挙げられる。「実質的に同一のアミノ酸配列」としては、例えばヒトＰＰＡＲαの場合、配列番号：２で表わされるアミノ酸配列と約９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは約９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。アミノ酸配列の同一性は、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST（National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool）を用い、以下の条件（期待値=10；ギャップを許す；マトリクス=BLOSUM62；フィルタリング=OFF）にて計算することができる。 “DNA encoding a heterologous PPARα” refers to a mammal (eg, human, cow, monkey, pig, sheep, goat, rabbit, dog, etc.) that is heterogeneous to a non-human mammal (eg, mouse) to which the gene is to be introduced. Cat, guinea pig, hamster, rat, etc.) or DNA encoding a protein having an amino acid sequence substantially identical thereto. Preferably, the DNA encoding the heterologous PPARα of the present invention is a DNA encoding human PPARα or a protein having an amino acid sequence substantially identical thereto. Examples of the DNA encoding human PPARα include a DNA encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and preferably a DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 1. As the “substantially identical amino acid sequence”, for example, in the case of human PPARα, about 90% or more, preferably 95% or more, more preferably about 98% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 Amino acid sequence, etc. The amino acid sequence identity was determined using the homology calculation algorithm NCBI BLAST (National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool) under the following conditions (expected value = 10; gap allowed; matrix = BLOSUM62; filtering = OFF). Can be calculated.

　「実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質」としては、例えばヒトＰＰＡＲαの場合、配列番号：２で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、配列番号：２で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質が好ましい。「実質的に同質の活性」としては、例えば、リガンド（アゴニスト、アンタゴニストを含む）結合活性、脂質代謝関連遺伝子の発現調節作用などが挙げられる。実質的に同質とは、それらの活性が性質的に同質であることを示す。したがって、リガンド結合活性や脂質代謝関連遺伝子の発現調節作用などの活性が同等（例、約０．０１〜１００倍、好ましくは約０．５〜２０倍、より好ましくは約０．５〜２倍）であることが好ましいが、これらの活性の程度や蛋白質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。リガンド結合活性や脂質代謝関連遺伝子の発現調節作用などの活性の測定は、自体公知の方法に準じて行なうことができるが、例えば、後に記載するスクリーニング方法に従って測定することができる。 As the "protein having substantially the same amino acid sequence", for example, in the case of human PPARα, an amino acid having substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 Proteins having substantially the same activity as the protein having the sequence are preferred. “Substantially the same activity” includes, for example, ligand (including agonist and antagonist) binding activity, and expression regulation of lipid metabolism-related genes. Substantially the same indicates that their activities are the same in nature. Therefore, the activities such as the ligand binding activity and the activity of regulating the expression of lipid metabolism-related genes are equivalent (eg, about 0.01 to 100 times, preferably about 0.5 to 20 times, more preferably about 0.5 to 2 times). ) Is preferred, but the quantitative factors such as the degree of activity and the molecular weight of the protein may be different. The activities such as the ligand binding activity and the activity of regulating the expression of the lipid metabolism-related gene can be measured according to a method known per se, for example, according to the screening method described later.

　異種ＰＰＡＲαをコードするＤＮＡは、例えば配列番号：１で表わされる塩基配列を有するＤＮＡのように、イントロンを含まない形態（即ち、相補ＤＮＡ）であることが好ましいが、イントロンの５’および３’末端配列はほとんどの真核生物遺伝子で共通であるので、別の実施態様においてはイントロンを含む形態（即ち、ゲノムＤＮＡ）もまた好ましく用いられ得る。 The DNA encoding the heterologous PPARα is preferably in an intron-free form (ie, complementary DNA), such as a DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 1. Since the terminal sequence is common to most eukaryotic genes, in another embodiment, forms containing introns (ie, genomic DNA) may also be preferably used.

　異種ＰＰＡＲαをコードするＤＮＡは、ヒトや各種非ヒト哺乳動物（ウシ、サル、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）の肝臓、心臓、腎臓、副腎、血管、消化管などに由来するＤＮＡおよび市販の各種ゲノムＤＮＡライブラリーに由来するゲノムＤＮＡの全てあるいは一部を原料として用い、あるいはヒトや各種非ヒト哺乳動物の肝臓、心臓、腎臓、副腎、血管、消化管などに由来するＲＮＡから公知の方法により調製されたｃＤＮＡを原料として用い、公知のＰＰＡＲα遺伝子配列をもとに作製したオリゴヌクレオチドをプローブもしくはプライマーとして、ハイブリダイゼーション法もしくはＰＣＲ法などにより単離することができる。 DNAs encoding heterologous PPARα are derived from the liver, heart, kidney, adrenal gland of humans and various non-human mammals (bovine, monkey, pig, sheep, goat, rabbit, dog, cat, guinea pig, hamster, rat, mouse, etc.). Using all or part of DNA derived from blood vessels, digestive tracts and the like and genomic DNA derived from various commercially available genomic DNA libraries as raw materials, or liver, heart, kidney, adrenal gland, blood vessels of humans and various non-human mammals Using a cDNA prepared from RNA derived from the digestive tract or the like by a known method as a raw material, and using an oligonucleotide prepared based on the known PPARα gene sequence as a probe or primer, a simple hybridization or PCR method is used. Can be released.

　本発明の遺伝子導入動物は、異種ＰＰＡＲαをコードするＤＮＡを「発現可能な状態で」保持している。したがって、当該ＤＮＡを対象動物に導入するにあたっては、当該ＤＮＡを対象動物の細胞内で機能し得るプロモーターの下流に連結した発現カセットを含む形態（例、発現ベクターなど）で用いるのが一般に有利である。遺伝子 The transgenic animal of the present invention has a DNA encoding a heterologous PPARα in an “expressible state”. Therefore, when the DNA is introduced into a target animal, it is generally advantageous to use the DNA in a form (eg, an expression vector) containing an expression cassette linked downstream of a promoter capable of functioning in the cells of the target animal. is there.

　異種ＰＰＡＲαをコードするＤＮＡを担持するベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミド、λファージなどのバクテリオファージ、モロニー白血病ウイルスなどのレトロウイルス、ワクシニアウイルスまたはバキュロウイルスなどの動物もしくは昆虫ウイルスなどが用いられる。なかでも、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミドまたは酵母由来のプラスミドなどが好ましく用いられ、特に大腸菌由来のプラスミドが好ましい。 Examples of a vector carrying a DNA encoding a heterologous PPARα include a plasmid derived from Escherichia coli, a plasmid derived from Bacillus subtilis, a plasmid derived from yeast, a bacteriophage such as λ phage, a retrovirus such as Moloney leukemia virus, a vaccinia virus or a baculovirus, etc. And animal or insect viruses. Among them, a plasmid derived from Escherichia coli, a plasmid derived from Bacillus subtilis or a plasmid derived from yeast are preferably used, and a plasmid derived from Escherichia coli is particularly preferred.

　異種ＰＰＡＲαの遺伝子発現調節を行うプロモーターとしては、例えばウイルス（サイトメガロウイルス、モロニー白血病ウイルス、ＪＣウイルス、乳癌ウイルスなど）に由来する遺伝子のプロモーター、各種哺乳動物（ヒト、ウシ、サル、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）および鳥類（ニワトリなど）に由来する遺伝子［例えば、アルブミン、エンドセリン、オステオカルシン、筋クレアチンキナーゼ、Ｉ型およびＩＩ型コラーゲン、サイクリックＡＭＰ依存蛋白キナーゼβＩサブユニット、心房ナトリウム利尿性因子、ドーパミンβ−水酸化酵素、ニューロフィラメント軽鎖、メタロチオネインＩおよびＩＩＡ、メタロプロティナーゼ１組織インヒビター、平滑筋αアクチン、ポリペプチド鎖伸長因子１α（ＥＦ１−α）、βアクチン、αおよびβミオシン重鎖、ミオシン軽鎖１および２、ミエリン塩基性蛋白、血清アミロイドＰコンポーネント、レニンなど］のプロモーターなどが挙げられる。好ましくは、目的とする疾患モデルに応じて、標的組織で異種ＰＰＡＲαを特異的もしくは高発現させ得るプロモーター（例：肝臓で高発現可能な血清アミロイドＰコンポーネント（ＳＡＰ）、アルブミン、トランスフェリン、フィブリノーゲン、アンチトロンビンIII、α１−アンチトリプシンなどの遺伝子プロモーター；心臓で高発現可能なαおよびβミオシン重鎖、ミオシン軽鎖１および２などの遺伝子プロモーター；腎臓で高発現可能なＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ受容体などの遺伝子プロモーター；副腎で高発現可能なＡＣＴＨ受容体などの遺伝子プロモーター；消化管で高発現可能な脂肪酸結合蛋白質などの遺伝子プロモーター；脳で高発現可能なミエリン塩基性蛋白、グリア線維性酸性蛋白などの遺伝子プロモーター等）を適宜選択することができる。例えば、本発明の遺伝子導入動物が高脂血症や動脈硬化症のモデルである場合、肝臓で高発現可能なプロモーターを用いることが好ましい。 Examples of the promoter for controlling the gene expression of heterologous PPARα include promoters of genes derived from viruses (cytomegalovirus, Moloney leukemia virus, JC virus, breast cancer virus, etc.), various mammals (human, cow, monkey, pig, sheep) , Goats, rabbits, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, rats, mice, etc.) and birds (eg, chickens) [eg, albumin, endothelin, osteocalcin, muscle creatine kinase, type I and type II collagen, cyclic AMP-dependent protein kinase βI subunit, atrial natriuretic factor, dopamine β-hydroxylase, neurofilament light chain, metallothionein I and IIA, metalloproteinase 1 tissue inhibitor, smooth muscle α-actin, Ripepuchido chain elongation factor 1α (EF1-α), β-actin, alpha and beta-myosin heavy chain, myosin light chains 1 and 2, myelin basic protein, serum amyloid P component, such as a promoter of renin, etc.] and the like. Preferably, a promoter capable of specifically or highly expressing heterologous PPARα in a target tissue (eg, serum amyloid P component (SAP) capable of high expression in liver, albumin, transferrin, fibrinogen, anti-branch, etc.) depending on the disease model of interest. Gene promoters such as thrombin III and α1-antitrypsin; gene promoters such as α and β myosin heavy chains and myosin light chains 1 and 2 which can be highly expressed in the heart; genes such as PTH / PTHrP receptors which can be highly expressed in the kidney Promoter; gene promoter such as ACTH receptor which can be highly expressed in the adrenal gland; gene promoter such as fatty acid binding protein which can be highly expressed in the digestive tract; genes such as myelin basic protein and glial fibrillary acidic protein which can be highly expressed in the brain Promoter, etc.) Can. For example, when the transgenic animal of the present invention is a model for hyperlipidemia or arteriosclerosis, it is preferable to use a promoter that can be highly expressed in the liver.

　異種ＰＰＡＲαをコードするＤＮＡの下流には、遺伝子導入動物において目的とするメッセンジャーＲＮＡの転写を終結させる配列（ポリアデニレーション（ｐｏｌｙＡ）シグナル、ターミネーターとも呼ばれる）を有していることが好ましく、例えば、ウイルス遺伝子由来、あるいは各種哺乳動物または鳥類の遺伝子由来のターミネーター配列を用いて、効率よい導入遺伝子の発現を達成することができる。好ましくは、シミアンウイルスのＳＶ４０ターミネーターなどが用いられる。その他、目的の遺伝子をさらに高発現させる目的で、各遺伝子のスプライシングシグナル、エンハンサー領域、真核遺伝子のイントロンの一部を、プロモーター領域の５’上流、プロモーター領域と翻訳領域間あるいは翻訳領域の３’下流に連結することも目的により可能である。 Downstream of the DNA encoding the heterologous PPARα, it is preferable to have a sequence (also referred to as a polyadenylation (polyA) signal or a terminator) that terminates the transcription of the target messenger RNA in the transgenic animal. Efficient transgene expression can be achieved using terminator sequences derived from viral genes or from various mammalian or avian genes. Preferably, a simian virus SV40 terminator or the like is used. In addition, in order to further express the gene of interest, a splicing signal of each gene, an enhancer region, and a part of an intron of a eukaryotic gene are placed 5 'upstream of the promoter region, between the promoter region and the translation region, or between the promoter region and the translation region. 'Connection downstream is also possible depending on the purpose.

　また、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）を用いて遺伝子導入動物を作製する場合、上記のベクターは、導入ＤＮＡが安定に組み込まれたクローンを選択するための選択マーカー遺伝子（例：ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子などの薬剤耐性遺伝子）をさらに含むことが好ましい。さらに、相同組換えにより宿主染色体の特定の部位に導入ＤＮＡを組み込むこと（即ち、ノックイン動物の作製）を意図する場合には、上記のベクターは、ランダムな挿入を排除するために、標的部位と相同なＤＮＡ配列の外側に単純ヘルペスウイルス由来チミジンキナーゼ（HSV-tk）遺伝子やジフテリア毒素遺伝子をネガティブ選択マーカー遺伝子としてさらに含むことが好ましい。これらの実施態様については後で詳述する。 When a transgenic animal is produced using embryonic stem cells (ES cells), the above-described vector is used as a selection marker gene (eg, neomycin resistance gene, hygroglobin, etc.) for selecting a clone into which the introduced DNA has been stably integrated. (A drug resistance gene such as a mycin resistance gene). In addition, if the incorporation of the introduced DNA into a particular site in the host chromosome by homologous recombination (ie, the production of a knock-in animal) is intended, the above-described vector must be compatible with the target site to eliminate random insertion. It is preferable that a herpes simplex virus-derived thymidine kinase (HSV-tk) gene or a diphtheria toxin gene be further included as a negative selection marker gene outside the homologous DNA sequence. These embodiments will be described later in detail.

　上記のプロモーター、異種ＰＰＡＲαをコードするＤＮＡ、ターミネーターなどは、適当な制限酵素およびＤＮＡリガーゼ等を用いた通常の遺伝子工学的手法により、上記のベクター中に正しい配置で、即ち遺伝子導入動物において異種ＰＰＡＲαを発現可能な配置で、挿入することができる。 The above promoter, DNA encoding the heterologous PPARα, terminator and the like can be placed in the above vector in the correct arrangement, that is, in the transgenic animal, by a conventional genetic engineering technique using an appropriate restriction enzyme and DNA ligase. Can be inserted in an arrangement in which can be expressed.

　好ましい一実施態様においては、上記のようにして得られる異種ＰＰＡＲαをコードするＤＮＡを含む発現ベクターは、マイクロインジェクション法により対象となる非ヒト哺乳動物の初期胚に導入される。 In a preferred embodiment, the expression vector containing the DNA encoding the heterologous PPARα obtained as described above is introduced into the early embryo of the target non-human mammal by the microinjection method.

　対象非ヒト哺乳動物の初期胚は、同種の非ヒト哺乳動物の雌雄を交配させて得られる体内受精卵を採取するか、あるいは同種の非ヒト哺乳動物の雌雄からそれぞれ採取した卵と***を体外受精させることにより得ることができる。 For the early embryo of the target non-human mammal, the fertilized eggs obtained by crossing male and female of the same type of non-human mammal can be collected, or the eggs and sperm collected from the male and female of the same type of non-human mammal can be collected in vitro. It can be obtained by fertilization.

　用いる非ヒト哺乳動物の齢や飼育条件等は動物種によってそれぞれ異なるが、例えばマウス（好ましくはＣ５７ＢＬ／６Ｊ（Ｂ６）などの近交系マウス、Ｂ６と他の近交系とのＦ₁など）を用いる場合は、雌が約４〜約６週齢、雄が約２〜約８月齢程度のものが好ましく、また、約１２時間明期条件（例えば７：００−１９：００）で約１週間飼育したものが好ましい。 Non-human mammals age and breeding conditions are different from each other by the animal species used, for example, a mouse (preferably an inbred mouse such as C57BL / 6J (B6), etc. F ₁ of B6 and another inbred strain) When females are used, females of about 4 to about 6 weeks of age and males of about 2 to about 8 months of age are preferable, and about 1 hour under light conditions of about 12 hours (for example, 7:00 to 19:00). Those raised for weeks are preferred.

　体内受精は自然交配によってもよいが、性周期の調節と１個体から多数の初期胚を得ることを目的として、雌非ヒト哺乳動物に性腺刺激ホルモンを投与して過剰***を誘起した後、雄非ヒト哺乳動物と交配させる方法が好ましい。雌非ヒト哺乳動物の***誘発法としては、例えば初めに卵胞刺激ホルモン（妊馬血清性性腺刺激ホルモン、一般にＰＭＳＧと略する）、次いで黄体形成ホルモン（ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン、一般にｈＣＧと略する）を、例えば腹腔内注射などにより投与する方法が好ましいが、好ましいホルモンの投与量、投与間隔は非ヒト哺乳動物の種類によりそれぞれ異なる。例えば、非ヒト哺乳動物がマウス（好ましくはＣ５７ＢＬ／６Ｊ（Ｂ６）などの近交系マウス、Ｂ６と他の近交系とのＦ₁など）の場合は、通常、卵胞刺激ホルモン投与後、約４８時間後に黄体形成ホルモンを投与し、直ちに雄マウスと交配させることにより受精卵を得る方法が好ましく、卵胞刺激ホルモンの投与量は約２０〜約５０ＩＵ／個体、好ましくは約３０ＩＵ／個体、黄体形成ホルモンの投与量は約０〜約１０ＩＵ／個体、好ましくは約５ＩＵ／個体である。 In vivo fertilization may be by natural mating, but for the purpose of regulating the estrous cycle and obtaining a large number of early embryos from one individual, gonadotropin is administered to a female non-human mammal to induce superovulation, followed by male induction. A method of mating with a non-human mammal is preferred. Methods for inducing ovulation in female non-human mammals include, for example, follicle stimulating hormone (pregnant horse serum gonadotropin, generally abbreviated as PMSG) first, and then luteinizing hormone (human chorionic gonadotropin, generally hCG). Is preferably administered by, for example, intraperitoneal injection, etc., but the preferred dose and interval of the hormone differ depending on the type of non-human mammal. For example, in the case of the non-human mammal is a mouse (preferably an inbred mouse such as C57BL / 6J (B6), etc. F ₁ of B6 and another inbred strain), usually after follicle stimulating hormone administration, about 48 hours later, it is preferable to administer luteinizing hormone and immediately mate with a male mouse to obtain a fertilized egg. The dose of follicle-stimulating hormone is about 20 to about 50 IU / individual, preferably about 30 IU / individual. The dose of hormone is about 0 to about 10 IU / individual, preferably about 5 IU / individual.

　一定時間経過後、膣栓の検査等により交配を確認した雌非ヒト哺乳動物の腹腔を開き、卵管から受精卵を取り出して胚培養用培地（例：Ｍ１６培地、修正Whitten培地、ＢＷＷ培地、Ｍ２培地、ＷＭ−ＨＥＰＥＳ培地、ＢＷＷ−ＨＥＰＥＳ培地等）中で洗って卵丘細胞を除き、微小滴培養法等により５％炭酸ガス／９５％大気下でＤＮＡ顕微注入まで培養する。直ちに顕微注入を行わない場合、採取した受精卵を緩慢法または超急速法等で凍結保存することも可能である。 After a certain period of time, the abdominal cavity of the female non-human mammal whose mating has been confirmed by inspection of the vaginal plug and the like is opened, the fertilized egg is taken out from the fallopian tube, and the embryo culture medium (eg: M16 medium, modified Whitten medium, BWW medium, M2 medium, WM-HEPES medium, BWW-HEPES medium, etc.) to remove cumulus cells, and culture by microdroplet culture or the like under 5% carbon dioxide / 95% atmosphere until DNA microinjection. If microinjection is not performed immediately, the collected fertilized eggs can be cryopreserved by the slow method or the ultra-rapid method.

　一方、体外受精の場合は、採卵用雌非ヒト哺乳動物（体内受精の場合と同様のものが好ましく用いられる）に上記と同様に卵胞刺激ホルモンおよび黄体形成ホルモンを投与して***を誘発させた後、卵子を採取して受精用培地（例：ＴＹＨ培地）中で体外受精時まで微小滴培養法等により５％炭酸ガス／９５％大気下で培養する。他方、同種の雄非ヒト哺乳動物（体内受精の場合と同様のものが好ましく用いられる）から精巣上体尾部を取り出し、***塊を採取して受精用培地中で前培養する。前培養終了後の***を卵子を含む受精用培地に添加し、微小滴培養法等により５％炭酸ガス／９５％大気下で培養した後、２個の前核を有する受精卵を顕微鏡下で選抜する。直ちにＤＮＡの顕微注入を行わない場合は、得られた受精卵を緩慢法または超急速法等で凍結保存することも可能である。 On the other hand, in the case of in vitro fertilization, ovulation was induced by administering follicle stimulating hormone and luteinizing hormone to a female non-human mammal for egg collection (the same one as that used for in vivo fertilization is preferably used) as described above. Thereafter, the eggs are collected and cultured in a medium for fertilization (eg, a TYH medium) in a 5% carbon dioxide / 95% atmosphere by a microdrop culture method or the like until the time of in vitro fertilization. On the other hand, the epididymis tail is taken out from a male non-human mammal of the same species (the same one as in the case of in-vivo fertilization is preferably used), a sperm mass is collected, and precultured in a fertilization medium. The spermatozoa after the completion of the preculture are added to a fertilization medium containing eggs, and cultured under a 5% carbon dioxide / 95% atmosphere by a microdrop culture method or the like, and a fertilized egg having two pronuclei is observed under a microscope. Select. When DNA microinjection is not performed immediately, the obtained fertilized eggs can be cryopreserved by the slow method or the ultra-rapid method.

　受精卵へのＤＮＡの顕微注入は、マイクロマニピュレーター等の公知の装置を用いて常法に従って実施することができる。簡潔に言えば、胚培養用培地の微小滴中に入れた受精卵をホールディングピペットで吸引して固定し、インジェクションピペットを用いてＤＮＡ溶液を雄性もしくは雌性前核、好ましくは雄性前核内に直接注入する。導入ＤＮＡはＣｓＣｌ密度勾配超遠心等で高度に精製したものを用いることが好ましい。また、導入ＤＮＡは制限酵素を用いてベクター部分を切断し、直鎖状にしておくことが好ましい。 (4) Microinjection of DNA into a fertilized egg can be carried out using a known device such as a micromanipulator according to a conventional method. Briefly, fertilized eggs placed in microdroplets of embryo culture medium are aspirated and fixed with a holding pipette and the DNA solution is injected directly into the male or female pronucleus, preferably the male pronucleus using an injection pipette. inject. It is preferable to use a highly purified DNA introduced by CsCl density gradient ultracentrifugation or the like. In addition, it is preferable that the introduced DNA is linearized by cutting the vector portion using a restriction enzyme.

　ＤＮＡ導入後の受精卵は胚培養用培地中で微小滴培養法等により５％炭酸ガス／９５％大気下で１細胞期〜胚盤胞期まで培養した後、偽妊娠させた受胚用雌非ヒト哺乳動物の卵管または子宮内に移植される。受胚用雌非ヒト哺乳動物は移植される初期胚が由来する動物と同種のものであればよく、例えば、マウス初期胚を移植する場合は、ＩＣＲ系の雌マウス（好ましくは約８〜約１０週齢）などが好ましく用いられる。受胚用雌非ヒト哺乳動物を偽妊娠状態にする方法としては、例えば、同種の精管切除（結紮）雄非ヒト哺乳動物（例えば、マウスの場合、ＩＣＲ系の雄マウス（好ましくは約２月齢以上））と交配させて、膣栓の存在が確認されたものを選択する方法が知られている。 The fertilized egg after the DNA transfer is cultured in a culture medium for embryos from the 1-cell stage to the blastocyst stage in a 5% carbon dioxide / 95% atmosphere by a microdrop culture method or the like, and then pseudo-pregnant females for embryos Implanted into the fallopian tube or uterus of a non-human mammal. The female non-human mammal for receiving an embryo may be of the same species as the animal from which the early embryo to be transplanted is derived. For example, when transplanting a mouse early embryo, an ICR female mouse (preferably about 8 to about 10 weeks old) and the like are preferably used. Examples of a method of bringing a female non-human mammal for embryo reception into a pseudopregnancy state include, for example, a vasectomized (ligated) male non-human mammal (for example, in the case of a mouse, an ICR male mouse (preferably about 2 There is known a method in which the presence of a vaginal plug is confirmed by crossing with a child of a certain age.

　受胚用雌は自然***のものを用いてもよいし、あるいは精管切除（結紮）雄との交配に先立って、黄体形成ホルモン放出ホルモン（一般にＬＨＲＨと略する）もしくはその類縁体を投与し、受精能を誘起させたものを用いてもよい。ＬＨＲＨ類縁体としては、例えば、[3,5-DiI-Tyr⁵]-LH-RH、[Gln⁸]-LH-RH、[D-Ala⁶]-LH-RH、[des-Gly¹⁰]-LH-RH、[D-His(Bzl)⁶]-LH-RHおよびそれらのEthylamideなどが挙げられる。ＬＨＲＨもしくはその類縁体の投与量、ならびにその投与後に雄非ヒト哺乳動物と交配させる時期は、非ヒト哺乳動物の種類によりそれぞれ異なる。例えば、非ヒト哺乳動物がマウス（好ましくはＩＣＲ系のマウスなど）の場合には、通常、ＬＨＲＨもしくはその類縁体を投与した後、約４日目に雄マウスと交配させることが好ましく、ＬＨＲＨあるいはその類縁体の投与量は、通常、約１０〜６０μｇ／個体、好ましくは約４０μｇ／個体である。 The female recipient may be spontaneous ovulation, or may be administered luteinizing hormone-releasing hormone (generally LHRH) or an analog thereof prior to mating with the vasectomized (ligated) male. Alternatively, those having induced fertility may be used. Examples of LHRH analogs include [3,5-DiI-Tyr ⁵ ] -LH-RH, [Gln ⁸ ] -LH-RH, [D-Ala ⁶ ] -LH-RH, and [des-Gly ¹⁰ ]- LH-RH, [D-His (Bzl) ⁶ ] -LH-RH and their Ethylamide and the like. The dose of LHRH or an analog thereof and the timing of mating with a male non-human mammal after its administration differ depending on the type of non-human mammal. For example, when the non-human mammal is a mouse (preferably an ICR-based mouse or the like), it is usually preferable to administer LHRH or an analog thereof, and then breed it with a male mouse about 4 days later. The dose of the analog is usually about 10 to 60 μg / individual, preferably about 40 μg / individual.

　通常、移植される初期胚が桑実胚期以後の場合は受胚用雌の子宮に、それより前（例えば、１細胞期〜８細胞期胚）であれば卵管に胚移植される。受胚用雌は、移植胚の発生段階に応じて偽妊娠からある日数が経過したものが適宜使用される。例えばマウスの場合、２細胞期胚を移植するには偽妊娠後約０．５日の雌マウスが、胚盤胞期胚を移植するには偽妊娠後約２．５日の雌マウスが好ましい。受胚用雌を麻酔（好ましくはAvertin、ネンブタール等が使用される）後、切開して卵巣を引き出し、胚培養用培地に懸濁した初期胚（約５〜約１０個）を胚移植用ピペットを用いて、卵管腹腔口もしくは子宮角の卵管接合部付近に注入する。 Usually, embryos are transferred to the uterus of an embryo recipient female when the early embryo to be transferred is in the morula stage or later, and to the fallopian tube if it is earlier (for example, 1-cell stage to 8-cell stage embryo). As the female for embryo reception, one that has passed a certain number of days from pseudopregnancy according to the stage of development of the transplanted embryo is appropriately used. For example, in the case of a mouse, a female mouse about 0.5 days after pseudopregnancy is preferable to transfer a 2-cell stage embryo, and a female mouse about 2.5 days after pseudopregnancy is preferable to transfer a blastocyst stage embryo. . After anesthetizing a female for an embryo (preferably using Avertin, Nembutal, etc.), incision is made to pull out the ovary, and an early embryo (about 5 to about 10) suspended in an embryo culture medium is used as a pipette for embryo transfer Is injected into the abdominal cavity of the fallopian tube or near the fallopian tube junction at the uterine horn.

　移植胚が首尾よく着床し受胚雌が妊娠すれば、自然分娩もしくは帝王切開により仔非ヒト哺乳動物が得られる。自然分娩した受胚雌にはそのまま哺乳を継続させればよく、帝王切開により出産した場合は、産仔は別途用意した哺乳用雌（例えばマウスの場合、通常に交配・分娩した雌マウス（好ましくはＩＣＲ系の雌マウス等））に哺乳させることができる。れば If the transplanted embryo is successfully implanted and the recipient female becomes pregnant, a non-human mammal can be obtained by spontaneous delivery or cesarean section. Spontaneously delivered embryonated females may be allowed to continue nursing as they are, and if they give birth by cesarean section, the offspring are separately prepared nursing females (for example, in the case of mice, female mice that have been mated and delivered normally (preferably Can be fed to an ICR female mouse)).

　受精卵細胞段階における異種ＰＰＡＲαをコードするＤＮＡの導入は、導入ＤＮＡが対象非ヒト哺乳動物の生殖系列細胞および体細胞のすべてに存在するように確保される。導入ＤＮＡが染色体ＤＮＡに組み込まれているか否かは、例えば、産仔の尾部より分離抽出した染色体ＤＮＡをサザンハイブリダイゼーションまたはＰＣＲ法によりスクリーニングすることにより検定することができる。上記のようにして得られる仔非ヒト哺乳動物（Ｆ₀）の生殖系列細胞において異種ＰＰＡＲαをコードするＤＮＡが存在することは、その後代（Ｆ₁）の動物全てにおいて、その生殖系列細胞および体細胞のすべてに異種ＰＰＡＲαをコードするＤＮＡが存在することを意味する。 Introduction of DNA encoding the heterologous PPARα at the fertilized egg cell stage ensures that the introduced DNA is present in all germline and somatic cells of the subject non-human mammal. Whether or not the introduced DNA is integrated into the chromosomal DNA can be determined, for example, by screening chromosomal DNA separated and extracted from the tail of the offspring by Southern hybridization or PCR. The presence of the DNA encoding the heterologous PPARα in the germline cells of the non-human mammal (F ₀ ) obtained as described above indicates that the germline cells and the body of all the progeny (F ₁ ) animals are present. It means that the DNA encoding the heterologous PPARα is present in all of the cells.

　通常、Ｆ₀動物は相同染色体の一方にのみ導入ＤＮＡを有するヘテロ接合体として得られる。また、個々のＦ₀個体は相同組換えによらない限り異なる染色体上にランダムに挿入される。相同染色体の両方に異種ＰＰＡＲαをコードするＤＮＡを有するホモ接合体を得るためには、Ｆ₀動物と非トランスジェニック動物とを交雑してＦ₁動物を作製し、相同染色体の一方にのみ導入ＤＮＡを有するヘテロ接合体の兄妹同士を交雑すればよい。１遺伝子座にのみ導入ＤＮＡが組み込まれていれば、得られるＦ₂動物の１／４がホモ接合体となる。 Usually, F ₀ animals are obtained as heterozygotes having the introduced DNA on only one of the homologous chromosomes. In addition, individual _F0 individuals are randomly inserted on different chromosomes unless homologous recombination is performed. Phase to the both homologous chromosomes obtain a homozygote having a DNA encoding a heterologous PPARα is, F ₀ animals and to produce F ₁ animals and non-transgenic animals were crossed introduced only into one of the homologous chromosomal DNA May be crossed between siblings of a heterozygote having If only introduced DNA is integrated into a locus, 1/4 of the obtained F ₂ animals would be homozygotes.

　別の好ましい一実施態様においては、異種ＰＰＡＲαをコードするＤＮＡを含む発現ベクターは、エレクトロポレーション法等の公知の遺伝子導入法により対象となる非ヒト哺乳動物のＥＳ細胞に導入される。 In another preferred embodiment, the expression vector containing the DNA encoding the heterologous PPARα is introduced into a target non-human mammal ES cell by a known gene transfer method such as electroporation.

　ＥＳ細胞は胚盤胞期の受精卵の内部細胞塊（ＩＣＭ）に由来し、インビトロで未分化状態を保ったまま培養維持できる細胞をいう。ＩＣＭの細胞は将来、胚本体を形成する細胞であり、生殖細胞を含むすべての組織の基になる幹細胞である。ＥＳ細胞としては、既に樹立された細胞株ものを用いてもよく、また、EvansとKaufmanの方法（ネイチャー（Nature）第292巻、154頁、1981年）に準じて新しく樹立したものでもよい。例えば、マウスＥＳ細胞の場合、現在、一般的には１２９系マウス由来のＥＳ細胞が使用されているが、免疫学的背景がはっきりしていないので、これに代わる純系で免疫学的に遺伝的背景が明らかなＥＳ細胞を取得するなどの目的で、例えば、Ｃ５７ＢＬ／６マウスやＣ５７ＢＬ／６の採卵数の少なさをＤＢＡ／２との交雑により改善したＢＤＦ₁マウス（Ｃ５７ＢＬ／６とＤＢＡ／２とのＦ₁）から樹立されるＥＳ細胞なども良好に用いることができる。ＢＤＦ₁マウスは、採卵数が多く、かつ卵が丈夫であるという利点に加えて、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを背景に持つので、これ由来のＥＳ細胞は疾患モデルマウスを作製したとき、Ｃ５７ＢＬ／６マウスと戻し交雑することでその遺伝的背景をＣ５７ＢＬ／６マウスに代えることが可能である点で有利に用い得る。 ES cells refer to cells that are derived from the inner cell mass (ICM) of a fertilized egg at the blastocyst stage and can be cultured and maintained in vitro in an undifferentiated state. ICM cells are the cells that will form the body of the embryo in the future, and will be the stem cells that underlie all tissues, including germ cells. As the ES cell, a cell line that has already been established may be used, or a newly established ES cell may be used according to the method of Evans and Kaufman (Nature, vol. 292, p. 154, 1981). For example, in the case of mouse ES cells, currently, ES cells derived from 129 strain mice are generally used. However, since the immunological background is not clear, an alternative pure immunogenic genetically for the purpose of background to get the apparent ES cells, for example, C57BL / 6 mice and C57BL / 6 BDF ₁ mice a lack of egg collection number was improved by crossing with DBA / 2 of (C57BL / 6 and DBA / ES cells established from F ₁ ) with _No. 2 can also be used favorably. BDF ₁ mice, in addition to the advantage that many egg collection number, and eggs are tough, since with C57BL / 6 mice in the background, when this derived ES cells produced the disease model mice, C57BL / 6 mice Can be advantageously used in that the genetic background can be changed to C57BL / 6 mice by backcrossing with C57BL / 6 mice.

　ＥＳ細胞の調製は、例えば以下のようにして行うことができる。交配後の雌非ヒト哺乳動物［例えばマウス（好ましくはＣ５７ＢＬ／６Ｊ（Ｂ６）などの近交系マウス、Ｂ６と他の近交系とのＦ₁など）を用いる場合は、約２月齢以上の雄マウスと交配させた約８〜約１０週齢程度の雌マウス（妊娠約３．５日）が好ましく用いられる］の子宮から胚盤胞期胚を採取して（あるいは桑実胚期以前の初期胚を卵管から採取した後、胚培養用培地中で上記と同様にして胚盤胞期まで培養してもよい）、適当なフィーダー細胞（例えばマウスの場合、マウス胎仔から調製される初代繊維芽細胞や公知のＳＴＯ繊維芽細胞株等）層上で培養すると、胚盤胞の一部の細胞が集合して将来胚に分化するＩＣＭを形成する。この内部細胞塊をトリプシン処理して単細胞を解離させ、適切な細胞密度を保ち、培地交換を行いながら、解離と継代を繰り返すことによりＥＳ細胞が得られる。 Preparation of ES cells can be performed, for example, as follows. Female after mating non-human mammals [e.g., a mouse (preferably C57BL / 6J (B6) inbred mouse such as, F, etc. ₁ of B6 and another inbred strain) In the case of using, at least about 2 months of age A blastocyst stage embryo is collected from the uterus of a female mouse (approximately 3.5 days of gestation) of about 8 to about 10 weeks of age (approximately 3.5 days of gestation) which is bred with a male mouse. After the initial embryo is collected from the oviduct, it may be cultured in the embryo culture medium up to the blastocyst stage in the same manner as described above, and appropriate feeder cells (for example, in the case of a mouse, primary cells prepared from a mouse fetus) When cultured on a fibroblast or a known STO fibroblast cell line), some cells of the blastocyst aggregate to form an ICM that differentiates into an embryo in the future. The inner cell mass is treated with trypsin to dissociate single cells, and while maintaining an appropriate cell density, exchanging the medium and repeating dissociation and passage, ES cells can be obtained.

　ＥＳ細胞は雌雄いずれを用いてもよいが、通常雄のＥＳ細胞の方が生殖系列キメラを作製するのに都合が良い。また、煩雑な培養の手間を削減するためにもできるだけ早く雌雄の判別を行なうことが望ましい。ＥＳ細胞の雌雄の判定方法としては、例えば、ＰＣＲ法によりＹ染色体上の性決定領域の遺伝子を増幅、検出する方法が、その１例としてあげることができる。この方法を使用すれば、従来、核型分析をするのに約１０⁶個の細胞数を要していたのに対して、１コロニー程度のＥＳ細胞数（約５０個）で済むので、培養初期におけるＥＳ細胞の第一次セレクションを雌雄の判別で行なうことが可能であり、早期に雄細胞の選定を可能にしたことにより培養初期の手間は大幅に削減できる。 Although either male or female ES cells may be used, male ES cells are generally more convenient for producing a germline chimera. It is also desirable to discriminate between males and females as soon as possible in order to reduce cumbersome culture labor. As a method for determining the sex of ES cells, for example, a method of amplifying and detecting a gene in a sex-determining region on the Y chromosome by a PCR method can be mentioned. By using this method, the number of ES cells of about 1 colony (about 50 cells) is sufficient, whereas the conventional method required about 10 ⁶ cells for karyotype analysis. The primary selection of ES cells in the early stage can be performed by discriminating between male and female, and the early stage of culture can be greatly reduced by enabling the selection of male cells at an early stage.

　また、第二次セレクションとして、例えば、Ｇ−バンディング法による染色体数の確認等により行うことができる。得られるＥＳ細胞の染色体数は正常数の１００％が望ましいが、細胞株樹立の際の物理的操作等の関係上困難な場合は、ＥＳ細胞への遺伝子導入の後、正常細胞（例えば、マウスでは染色体数が２ｎ＝４０である細胞）に再びクローニングすることが望ましい。 Also, the secondary selection can be performed by, for example, confirming the number of chromosomes by the G-banding method. The number of chromosomes in the obtained ES cells is desirably 100% of the normal number. However, if it is difficult due to physical operations at the time of establishing a cell line, normal cells (eg, mouse In this case, it is desirable to clone again into cells having 2n = 40 chromosomes.

　このようにして得られるＥＳ細胞株は、未分化幹細胞の性質を維持するために注意深く継代培養することが必要である。例えば、ＳＴＯ繊維芽細胞のような適当なフィーダー細胞上で、分化抑制因子として知られるＬＩＦ（１〜１０，０００Ｕ／ｍｌ）存在下に炭酸ガス培養器内（好ましくは、５％炭酸ガス／９５％空気または５％酸素／５％炭酸ガス／９０％空気）で約３７℃で培養するなどの方法で培養し、継代時には、例えば、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液（通常０.００１〜０.５％トリプシン／０.１〜５ｍＭＥＤＴＡ、好ましくは約０.１％トリプシン／１ｍＭＥＤＴＡ）処理により単細胞化し、新たに用意したフィーダー細胞上に播種する方法などがとられる。このような継代は、通常１〜３日毎に行なうが、この際に細胞の観察を行い、形態的に異常な細胞が見受けられた場合はその培養細胞は放棄することが望まれる。ＥＳ The ES cell line thus obtained must be carefully subcultured in order to maintain the properties of undifferentiated stem cells. For example, on a suitable feeder cell such as STO fibroblast, in a carbon dioxide incubator (preferably 5% carbon dioxide / 95%) in the presence of LIF (1 to 10,000 U / ml) known as a differentiation inhibitory factor. % Air or 5% oxygen / 5% carbon dioxide / 90% air) at about 37 ° C., and at the time of subculture, for example, trypsin / EDTA solution (usually 0.001-0.5% A single cell is prepared by treatment with trypsin / 0.1 to 5 mM EDTA (preferably, about 0.1% trypsin / 1 mM EDTA), and the cells are seeded on newly prepared feeder cells. Such passage is usually carried out every 1 to 3 days. At this time, it is desirable to observe the cells and, if any morphologically abnormal cells are found, discard the cultured cells.

　ＥＳ細胞は、適当な条件により、高密度に至るまで単層培養するか、または細胞集塊を形成するまで浮遊培養することにより、頭頂筋、内臓筋、心筋などの種々のタイプの細胞に分化させることが可能であり〔M. J. Evans及びM. H. Kaufman, ネイチャー（Nature）第292巻、154頁、1981年；G. R. Martin　プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.）第78巻、7634頁、1981年；T. C. Doetschman ら、ジャーナル・オブ・エンブリオロジー・アンド・エクスペリメンタル・モルフォロジー、第87巻、27頁、1985年〕、本発明の異種ＰＰＡＲαをコードするＤＮＡを導入されたＥＳ細胞を分化させて得られる異種ＰＰＡＲα発現非ヒト哺乳動物細胞は、インビトロにおける異種ＰＰＡＲαの細胞生物学的検討において有用である。 ES cells are differentiated into various types of cells, such as parietal muscle, visceral muscle, and cardiac muscle, by monolayer culture up to high density or suspension culture until cell clumps are formed under appropriate conditions. [MJ Evans and MH Kaufman, Nature 292, 154, 1981; GR Martin} Proceedings of National Academy of Sciences USA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 78, 7634, 1981; TC Doetschman et al., Journal of Embryology and Experimental Morphology, 87, 27, 1985]. Heterologous PPARα-expressing non-human mammalian cells obtained by differentiating ES cells into which the encoding DNA has been introduced can be used for in vitro cell biology of heterologous PPARα. Useful in discussions.

　ＥＳ細胞への遺伝子導入には、リン酸カルシウム共沈殿法、電気穿孔（エレクトロポレーション）法、リポフェクション法、レトロウイルス感染法、凝集法、顕微注入（マイクロインジェクション）法、遺伝子銃（パーティクルガン）法、ＤＥＡＥ−デキストラン法などのいずれも用いることができるが、簡便に多数の細胞を処理できること等の点からエレクトロポレーション法が一般的に選択されている。エレクトロポレーションには通常の動物細胞への遺伝子導入に使用されている条件をそのまま用いればよく、例えば、対数増殖期にあるＥＳ細胞をトリプシン処理して単一細胞に分散させた後、１０⁶〜１０⁸細胞／ｍｌとなるように培地に懸濁してキュベットに移し、異種ＰＰＡＲαをコードするＤＮＡを含むベクターを１０〜１００μｇ添加し、２００〜６００Ｖ／ｃｍの電気パルスを印加することにより行なうことができる。 For gene transfer into ES cells, calcium phosphate coprecipitation, electroporation, lipofection, retrovirus infection, agglutination, microinjection (microinjection), gene gun (particle gun), Although any method such as the DEAE-dextran method can be used, the electroporation method is generally selected from the viewpoint that a large number of cells can be easily treated. Electroporation may be used as the conditions used for gene transfer ordinary into animal cells, for example, were dispersed into single cells of ES cells in the logarithmic growth phase were trypsinized, 10 ⁶ Suspending in a medium at a concentration of 〜１０10 ⁸ cells / ml, transferring to a cuvette, adding 10 to 100 μg of a vector containing DNA encoding heterologous PPARα, and applying an electric pulse of 200 to 600 V / cm. Can be.

　導入ＤＮＡが組み込まれたＥＳ細胞は、単一細胞をフィーダー細胞上で培養して得られるコロニーから分離抽出した染色体ＤＮＡをサザンハイブリダイゼーションまたはＰＣＲ法によりスクリーニングすることによっても検定することができるが、ＥＳ細胞を用いるトランスジェニック系の最大の長所は、薬剤耐性遺伝子やレポーター遺伝子の発現を指標として細胞段階で形質転換体を選択できることである。したがって、ここで使用される導入ベクターは、異種ＰＰＡＲαをコードするＤＮＡを含む発現カセットに加えて、薬剤耐性遺伝子（例：ネオマイシンホスホトランスフェラーゼII（nptII）遺伝子、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（hpt）遺伝子など）やレポーター遺伝子（例：β−ガラクトシダーゼ（lacZ）遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（cat）遺伝子など）等の選択マーカー遺伝子をさらに含むことが望ましい。例えば、選択マーカー遺伝子としてnptII遺伝子を含むベクターを用いた場合、遺伝子導入処理後のＥＳ細胞をＧ４１８などのネオマイシン系抗生物質を含有する培地中で培養し、出現した耐性コロニーをそれぞれ培養プレートに移してトリプシン処理、培地交換を繰り返した後、一部を培養用として残し、残りをＰＣＲもしくはサザンハイブリダイゼーションにかけて導入ＤＮＡの存在を確認する。 ES cells incorporating the introduced DNA can also be assayed by screening chromosomal DNA isolated and extracted from colonies obtained by culturing single cells on feeder cells by Southern hybridization or PCR, The greatest advantage of the transgenic system using ES cells is that a transformant can be selected at the cell stage using the expression of a drug resistance gene or a reporter gene as an index. Therefore, the transfer vector used herein may be a drug resistance gene (eg, neomycin phosphotransferase II (nptII) gene, hygromycin phosphotransferase (hpt) gene, etc.) in addition to an expression cassette containing DNA encoding heterologous PPARα. And a reporter gene (eg, β-galactosidase (lacZ) gene, chloramphenicol acetyltransferase (cat) gene, etc.). For example, when a vector containing the nptII gene is used as a selectable marker gene, the ES cells after the gene transfer treatment are cultured in a medium containing a neomycin antibiotic such as G418, and the emerged resistant colonies are transferred to a culture plate. After repeating trypsin treatment and medium exchange, a part is left for culture, and the remaining is subjected to PCR or Southern hybridization to confirm the presence of the introduced DNA.

　導入ＤＮＡの組込みが確認されたＥＳ細胞を同種の非ヒト哺乳動物由来の胚内に戻すと、宿主胚のＩＣＭに組み込まれてキメラ胚が形成される。これを仮親（受胚用雌）に移植してさらに発生を続けさせることにより、キメラトランスジェニック動物が得られる。キメラ動物の中でＥＳ細胞が将来卵や***に分化する始原生殖細胞の形成に寄与した場合には、生殖系列キメラが得られることとなり、これを交配することにより導入ＤＮＡが遺伝的に固定された遺伝子導入非ヒト哺乳動物を作製することができる。 (4) When the ES cell in which the integration of the introduced DNA has been confirmed is returned into an embryo derived from a non-human mammal of the same species, the ES cell is integrated into the ICM of the host embryo to form a chimeric embryo. This is transplanted to a foster parent (female for embryo reception) and the development is further continued to obtain a chimeric transgenic animal. When ES cells in chimeric animals contribute to the formation of primordial germ cells that will differentiate into eggs and sperm in the future, a germline chimera will be obtained, and by crossing these, the introduced DNA will be genetically fixed. In addition, a transgenic non-human mammal can be prepared.

　キメラ胚の作製方法としては、桑実胚期までの初期胚同士を接着させて集合させる方法（集合キメラ法）と、胚盤胞の割腔内に細胞を顕微注入する方法（注入キメラ法）とがある。ＥＳ細胞によるキメラ胚の作製においては従来より後者が広く行なわれているが、最近では、８細胞期胚の透明帯内へのＥＳ細胞の注入により集合キメラを作る方法や、マイクロマニピュレーターが不要で操作が容易な方法として、ＥＳ細胞塊と透明帯を除去した８細胞期胚とを共培養して凝集させることによって集合キメラを作製する方法も行われている。 As a method for producing a chimeric embryo, a method in which early embryos up to the morula stage are adhered to each other and aggregated (assembly chimera method), and a method in which cells are microinjected into the blastocyst dividing space (injection chimera method) There is. Although the latter has been widely used in the production of chimeric embryos using ES cells, recently, a method for producing an assembled chimera by injecting ES cells into the zona pellucida of an 8-cell stage embryo and a micromanipulator are not required. As an easy operation method, a method of producing an aggregate chimera by co-culturing an ES cell mass and an 8-cell stage embryo from which the zona pellucida has been removed and coagulating the same is also performed.

　いずれの場合も、宿主胚は受精卵への遺伝子導入における採卵用雌として使用され得る非ヒト哺乳動物から同様にして採取することができるが、例えばマウスの場合、キメラマウス形成へのＥＳ細胞の寄与率を毛色（コートカラー）で判定し得るように、ＥＳ細胞の由来する系統とは毛色の異なる系統のマウスから宿主胚を採取することが好ましい。例えば、ＥＳ細胞が１２９系マウス（毛色：アグーチ）由来であれば、採卵用雌としてＣ５７ＢＬ／６マウス（毛色：ブラック）やＩＣＲマウス（毛色：アルビノ）を用い、ＥＳ細胞がＣ５７ＢＬ／６もしくはＤＢＦ₁マウス（毛色：ブラック）由来やＴＴ２細胞（Ｃ５７ＢＬ／６とＣＢＡとのＦ₁（毛色：アグーチ）由来）であれば、採卵用雌としてＩＣＲマウスやＢＡＬＢ／ｃマウス（毛色：アルビノ）を用いることができる。 In any case, the host embryo can be similarly collected from a non-human mammal that can be used as a female for egg collection in gene transfer into a fertilized egg. For example, in the case of a mouse, the ES cell can be used to form a chimeric mouse. In order to be able to determine the contribution ratio by coat color (coat color), it is preferable to collect a host embryo from a mouse of a line with a coat color different from the line from which the ES cells are derived. For example, if ES cells are derived from a 129 strain mouse (hair color: agouti), C57BL / 6 mice (hair color: black) or ICR mice (hair color: albino) are used as females for egg collection, and ES cells are C57BL / 6 or DBF. ₁ mouse (coat color: black) (F ₁ of C57BL / 6 and CBA (coat color: agouti) derived) origin and TT2 cell if, ICR mice and BALB / c mice as the female for egg collection (coat color: albino) using be able to.

　また、生殖系列キメラ形成能はＥＳ細胞と宿主胚との組み合わせに大きく依存するので、生殖系列キメラ形成能の高い組み合わせを選択することがより好ましい。例えばマウスの場合、１２９系統由来のＥＳ細胞に対してはＣ５７ＢＬ／６系統由来の宿主胚等を用いることが好ましく、Ｃ５７ＢＬ／６系統由来のＥＳ細胞に対してはＢＡＬＢ／ｃ系統由来の宿主胚等が好ましい。 Also, since the ability to form germline chimeras greatly depends on the combination of ES cells and host embryos, it is more preferable to select a combination having a high ability to form germline chimeras. For example, in the case of mice, it is preferable to use host embryos derived from the C57BL / 6 strain for ES cells derived from the 129 strain, and to use host embryos derived from the BALB / c strain for ES cells derived from the C57BL / 6 strain. Are preferred.

　採卵用雌マウスは約４〜約６週齢程度が好ましく、交配用の雄マウスとしては約２〜約８月齢程度の同系統のものが好ましい。交配は自然交配によってもよいが、好ましくは性腺刺激ホルモン（卵胞刺激ホルモン、次いで黄体形成ホルモン）を投与して過剰***を誘起した後に行なわれる。雌 The female mouse for egg collection is preferably about 4 to about 6 weeks old, and the male mouse for mating is preferably about 2 to about 8 months old. Mating may be by natural mating, but is preferably performed after administration of gonadotropin (follicle stimulating hormone and then luteinizing hormone) to induce superovulation.

　胚盤注入法による場合は、胚盤胞期胚（例えばマウスの場合、交配後約３．５日）を採卵用雌の子宮から採取し（あるいは桑実胚期以前の初期胚を卵管から採取した後、上述の胚培養用培地中で胚盤胞期まで培養してもよい）、マイクロマニピュレーターを用いて胚盤胞の割腔内に異種ＰＰＡＲαをコードするＤＮＡが導入されたＥＳ細胞（約１０〜約１５個）を注入した後、偽妊娠させた受胚用雌非ヒト哺乳動物の子宮内に移植する。受胚用雌非ヒト哺乳動物は受精卵への遺伝子導入における受胚用雌として使用され得る非ヒト哺乳動物を同様に用いることができる。 In the case of the blastocyst injection method, a blastocyst stage embryo (for example, about 3.5 days after mating in a mouse) is collected from the uterus of a female for egg collection (or an early embryo before the morula embryo stage is collected from an oviduct). After collection, the cells may be cultured up to the blastocyst stage in the embryo culture medium described above), and ES cells in which DNA encoding a heterologous PPARα has been introduced into the blastocyst using a micromanipulator ( (About 10 to about 15), and then implanted into the uterus of a pseudopregnant female non-human mammal for embryo reception. As the non-human mammal for embryo transfer, a non-human mammal that can be used as a female for embryo transfer in gene transfer into a fertilized egg can also be used.

　共培養法による場合は、８細胞期胚および桑実胚（例えばマウスの場合、交配後約２．５日）を採卵用雌の卵管および子宮から採取して（あるいは８細胞期以前の初期胚を卵管から採取した後、上述の胚培養用培地中で８細胞期または桑実胚期まで培養してもよい）酸性タイロード液中で透明帯を溶解した後、ミネラルオイルを重層した胚培養用培地の微小滴中に異種ＰＰＡＲαをコードするＤＮＡが導入されたＥＳ細胞塊（細胞数約１０〜約１５個）を入れ、さらに上記８細胞期胚または桑実胚（好ましくは２個）を入れて一晩共培養する。得られた桑実胚または胚盤胞を上記と同様にして受胚用雌非ヒト哺乳動物の子宮内に移植する。 In the case of the co-culture method, an 8-cell stage embryo and a morula embryo (for example, in the case of a mouse, about 2.5 days after mating) are collected from the oviduct and uterus of a female for egg collection (or an early stage before the 8-cell stage). After the embryos are collected from the oviduct, they may be cultured in the embryo culture medium to the 8-cell stage or the morula stage.) After dissolving the zona pellucida in acidic Tyrode's solution, mineral oil is overlaid. An ES cell mass (about 10 to about 15 cells) into which DNA encoding heterologous PPARα has been introduced is placed in microdroplets of an embryo culture medium, and the above-mentioned 8-cell embryo or morula (preferably 2 ) And co-culture overnight. The obtained morula or blastocyst is transplanted into the uterus of a female non-human mammal for embryo reception in the same manner as described above.

　移植胚が首尾よく着床し受胚雌が妊娠すれば、自然分娩もしくは帝王切開によりキメラ非ヒト哺乳動物が得られる。自然分娩した受胚雌にはそのまま哺乳を継続させればよく、帝王切開により出産した場合は、産仔は別途用意した哺乳用雌（通常に交配・分娩した雌非ヒト哺乳動物）に哺乳させることができる。れば If the transplanted embryo is successfully implanted and the recipient female becomes pregnant, a chimeric non-human mammal can be obtained by spontaneous delivery or cesarean section. Spontaneously delivered embryonated females can continue to be fed as they are, and if they give birth by cesarean section, the offspring will be fed to a separately prepared nursing female (normally mated and delivered female non-human mammal) be able to.

　生殖系列キメラの選択は、まずＥＳ細胞の雌雄が予め判別されている場合はＥＳ細胞と同じ性別のキメラマウスを選択し（通常は雄性ＥＳ細胞が使用されるので、雄キメラマウスが選択される）、次いで毛色等の表現型からＥＳ細胞の寄与率が高いキメラマウス（例えば、５０％以上）を選択する。例えば、１２９系マウス由来の雄性ＥＳ細胞であるＤ３細胞とＣ５７ＢＬ／６マウス由来の宿主胚とのキメラ胚から得られるキメラマウスの場合、アグーチの毛色の占める割合の高い雄マウスを選択するのが好ましい。選択されたキメラ非ヒト哺乳動物が生殖系列キメラであるか否かの確認は、適当な系統の同種動物との交雑により得られるＦ₁動物の表現型に基づいて行なうことができる。例えば、上記キメラマウスの場合、アグーチはブラックに対して優性であるので、雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスと交雑すると、選択された雄マウスが生殖系列キメラであれば得られるＦ₁の毛色はアグーチとなる。 In selecting a germline chimera, first, when the sex of the ES cell is determined in advance, a chimeric mouse of the same sex as that of the ES cell is selected (male ES cells are usually used, so a male chimeric mouse is selected). ), And then select a chimeric mouse (for example, 50% or more) with a high ES cell contribution rate based on the phenotype such as coat color. For example, in the case of a chimeric mouse obtained from a chimeric embryo of a D3 cell which is a male ES cell derived from a 129 strain mouse and a host embryo derived from a C57BL / 6 mouse, a male mouse having a high proportion of agouti coat color is selected. preferable. Check selected chimeric non-human mammal of whether germline chimeras can be performed based on the phenotype of the F ₁ animal obtained by crossing with the appropriate strains of the same animal species. For example, in the case of the chimeric mice, since agouti is dominant to black, when crossed with female C57BL / 6 mice, hair color F ₁ male mice selected is obtained if germline chimeras becomes agouti .

　上記のようにして得られる異種ＰＰＡＲαをコードするＤＮＡが導入された生殖系列キメラ非ヒト哺乳動物（ファウンダー）は、通常、相同染色体の一方にのみ導入ＤＮＡを有するヘテロ接合体として得られる。また、個々のファウンダーは相同組換えによらない限り異なる染色体上にランダムに挿入される。相同染色体の両方に異種ＰＰＡＲαをコードするＤＮＡを有するホモ接合体を得るためには、上記のようにして得られるＦ₁動物のうち相同染色体の一方にのみ導入ＤＮＡを有するヘテロ接合体の兄妹同士を交雑すればよい。ヘテロ接合体の選択は、例えばＦ₁動物の尾部より分離抽出した染色体ＤＮＡをサザンハイブリダイゼーションまたはＰＣＲ法によりスクリーニングすることにより検定することができる。１遺伝子座にのみ導入ＤＮＡが組み込まれていれば、得られるＦ₂動物の１／４がホモ接合体となる。 A germline chimeric non-human mammal (founder) into which the DNA encoding the heterologous PPARα obtained as described above has been introduced is usually obtained as a heterozygote having the introduced DNA on only one of homologous chromosomes. In addition, individual founders are randomly inserted on different chromosomes unless homologous recombination is performed. To obtain a homozygote having a DNA encoding a heterologous PPARα in both homologous chromosomes, siblings of the heterozygote having the transferred DNA in only one of the F ₁ animals among homologous chromosomes of that obtained as described above Should be crossed. Selection of heterozygotes can be assayed by screening for example F ₁ animals separated extracted chromosomal DNA from the tail by Southern hybridization or PCR method. If only introduced DNA is integrated into a locus, 1/4 of the obtained F ₂ animals would be homozygotes.

　本発明の遺伝子導入動物は、異種ＰＰＡＲαに対する被験物質の作用を定量的に測定可能な程度に異種ＰＰＡＲαの発現量が確保される限り、内因性ＰＰＡＲαの発現については特に制限はない。しかしながら、本発明の遺伝子導入動物を異種ＰＰＡＲαだけでなく内因性ＰＰＡＲαにも作用し得る薬剤の評価にも使用する場合は、内因性ＰＰＡＲαの発現を不活性化することが望ましい。内因性ＰＰＡＲαの発現が不活性化された本発明の遺伝子導入動物は、公知の方法（例えば、Lee S.S.ら、モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Mol. Cell. Biol.）、第15巻、第3012頁、1995年を参照）により選択されるＰＰＡＲα遺伝子がノックアウトされたＥＳ細胞、あるいは該ＥＳ細胞から上記の方法に従って作製されるＰＰＡＲαノックアウト動物由来の初期胚もしくはＥＳ細胞に、上記の方法に従って異種ＰＰＡＲαをコードするＤＮＡを導入することによって得ることができる。ＰＰＡＲα遺伝子をノックアウトする具体的な手段としては、対象非ヒト哺乳動物由来のＰＰＡＲα遺伝子を常法に従って単離し、例えば、そのエキソン部分に他のＤＮＡ断片（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子、ｌａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ遺伝子）、ｃａｔ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子）等のレポーター遺伝子等）を挿入することによりエキソンの機能を破壊するか（この場合、前述のように導入ＤＮＡの組込みは薬剤耐性やレポーター遺伝子の発現を指標として選択され得る）、Cre-loxP系やFlp-frt系を用いてＰＰＡＲα遺伝子の全部または一部を切り出して該遺伝子を欠失させるか、蛋白質コード領域内へ終止コドンを挿入して完全な蛋白質の翻訳を不能にするか、あるいは転写領域内部へ遺伝子の転写を終結させるＤＮＡ配列（例えば、polyＡ付加シグナルなど）を挿入して、完全なメッセンジャーＲＮＡの合成を不能にすることによって、結果的に遺伝子を不活性化するように構築したＤＮＡ配列を有するＤＮＡ鎖（以下、ターゲッティングベクターと略記する）を、相同組換えにより対象非ヒト哺乳動物のＰＰＡＲα遺伝子座に組み込ませる方法が好ましく挙げられる。遺伝子 In the transgenic animal of the present invention, there is no particular limitation on the expression of endogenous PPARα as long as the expression level of the heterologous PPARα is secured to the extent that the effect of the test substance on the heterologous PPARα can be quantitatively measured. However, when the transgenic animal of the present invention is used for evaluation of a drug capable of acting not only on heterologous PPARα but also on endogenous PPARα, it is desirable to inactivate the expression of endogenous PPARα. The transgenic animal of the present invention in which the expression of endogenous PPARα has been inactivated can be prepared by a known method (for example, Lee SS et al., Molecular and Cellular Biology (Mol. Cell. Biol.), Vol. 15, (See p. 3012, 1995)), the PPARα gene knocked out ES cells, or the PPARα knockout animal-derived early embryos or ES cells produced from the ES cells according to the method described above, according to the method described above. It can be obtained by introducing DNA encoding a heterologous PPARα. As a specific means for knocking out the PPARα gene, a PPARα gene derived from a target non-human mammal is isolated according to a conventional method, and, for example, another DNA fragment (for example, a neomycin resistance gene, a hygromycin resistance gene, etc.) Or insertion of a reporter gene such as lacZ (β-galactosidase gene), cat (chloramphenicol acetyltransferase gene), etc.) to destroy exon functions (in this case, introduction as described above). DNA integration can be selected using drug resistance and reporter gene expression as indices), using the Cre-loxP system or the Flp-frt system to cut out all or part of the PPARα gene, delete the gene, or delete the protein. Insert a stop codon into the coding region to prevent complete protein translation. Or by inserting a DNA sequence that terminates gene transcription (eg, a polyA addition signal) into the transcribed region to disable synthesis of complete messenger RNA, resulting in gene inactivation. Preferably, a method of incorporating a DNA strand having a DNA sequence constructed so as to be converted (hereinafter abbreviated as a targeting vector) into the PPARα locus of the target non-human mammal by homologous recombination is preferred.

　通常、哺乳動物における遺伝子組換えは大部分が非相同的であり、導入されたＤＮＡは染色体の任意の位置にランダムに挿入される。したがって、薬剤耐性やレポーター遺伝子の発現を検出するなどの選択によっては相同組換えにより標的となる内因性ＰＰＡＲα遺伝子にターゲッティングされたクローンのみを効率よく選択することができず、選択されたすべてのクローンについてサザンハイブリダイゼーション法もしくはＰＣＲ法による組み込み部位の確認が必要となる。そこで、ターゲッティングベクターの標的配列に相同な領域の外側に、例えば、ガンシクロビル感受性を付与するHSV-tk遺伝子を連結しておけば、該ベクターがランダムに挿入された細胞はHSV-tk遺伝子を有するため、ガンシクロビル含有培地では生育できないが、相同組換えにより内因性ＰＰＡＲα遺伝子座にターゲッティングされた細胞はHSV-tk遺伝子を有しないので、ガンシクロビル耐性となり選択される。あるいは、HSV-tk遺伝子の代わりに、例えばジフテリア毒素遺伝子を連結すれば、該ベクターがランダムに挿入された細胞は自身の産生する該毒素によって死滅するので、薬剤非存在下で相同組換え体を選択することもできる。 Generally, genetic recombination in mammals is largely non-homologous, and the introduced DNA is inserted randomly at any position on the chromosome. Therefore, it is not possible to efficiently select only clones targeted to the endogenous PPARα gene targeted by homologous recombination by selection such as detection of drug resistance and reporter gene expression. It is necessary to confirm the integration site by the Southern hybridization method or the PCR method. Therefore, if an HSV-tk gene that imparts ganciclovir sensitivity is linked outside the region homologous to the target sequence of the targeting vector, cells into which the vector has been randomly inserted have the HSV-tk gene. However, cells that cannot grow on a ganciclovir-containing medium but are targeted to the endogenous PPARα locus by homologous recombination do not have the HSV-tk gene, and are therefore selected for ganciclovir resistance. Alternatively, if, for example, a diphtheria toxin gene is ligated in place of the HSV-tk gene, cells into which the vector has been randomly inserted will be killed by the toxin produced by the vector itself. You can also choose.

　また、内因性ＰＰＡＲαの発現が不活性化された本発明の遺伝子導入動物は、このようにして作製される内因性ＰＰＡＲαをノックアウトされた動物と、上述の異種ＰＰＡＲαを導入された、該動物と同種の動物とを交配することによっても得ることができる。例えば、内因性ＰＰＡＲαホモ欠損マウスと、ヒトＰＰＡＲαホモトランスジェニック（Tg）マウスとを交配して得られる産仔（内因性ＰＰＡＲαヘテロ欠損・ヒトＰＰＡＲαヘテロTgマウス）の雌雄同士をさらに交配して、２コピーのヒトＰＰＡＲαおよびノックアウトされたマウスＰＰＡＲαの欠損部分のみが確認されたマウスを選択することにより、内因性ＰＰＡＲαホモ欠損・ヒトＰＰＡＲαホモTgマウスを作製することができる。 In addition, the transgenic animal of the present invention in which the expression of endogenous PPARα has been inactivated is an animal in which the endogenous PPARα thus produced is knocked out and an animal into which the above-described heterologous PPARα has been introduced. It can also be obtained by crossing with animals of the same species. For example, males and females of offspring (endogenous PPARα hetero-deficient / human PPARα hetero-Tg mice) obtained by mating an endogenous PPARα homo-deficient mouse and a human PPARα homotransgenic (Tg) mouse are further mated, An endogenous PPARα homo-deficient / human PPARα homo-Tg mouse can be prepared by selecting a mouse in which only two copies of the human PPARα and the knocked out mouse PPARα deficient portion are confirmed.

　あるいは、内因性ＰＰＡＲαの発現が不活性化された本発明の遺伝子導入動物は、相同組換えを用いた遺伝子ターゲッティングにより異種ＰＰＡＲαをコードするＤＮＡで内因性ＰＰＡＲα遺伝子を置換したノックイン動物であってもよい。 Alternatively, the transgenic animal of the present invention in which the expression of endogenous PPARα has been inactivated is a knock-in animal in which the endogenous PPARα gene has been replaced with DNA encoding a heterologous PPARα by gene targeting using homologous recombination. Good.

　ノックイン動物はノックアウト動物と基本的に同様の手法に従って作製することができる。ＰＰＡＲαのＯＲＦは第３エキソン〜第８エキソンに存在するので、例えば、対象非ヒト哺乳動物由来のＰＰＡＲα遺伝子のこれらの領域を適当な制限酵素を用いて切除し、代わりに異種ＰＰＡＲα遺伝子の対応する領域を挿入することにより得られるＤＮＡを含むターゲッティングベクターを、上記の方法に従って対象非ヒト哺乳動物由来のＥＳ細胞に導入し、相同組換えにより該動物の内因性ＰＰＡＲα遺伝子座に異種ＰＰＡＲαをコードするＤＮＡが組み込まれたＥＳ細胞クローンを選択すればよい。クローン選択はＰＣＲ法やサザン法を用いて行なうこともできるが、例えば、ターゲッティングベクターのＰＰＡＲα遺伝子の３’非翻訳領域などにネオマイシン耐性遺伝子等のポジティブ選択用マーカー遺伝子を挿入し、さらに標的配列と相同な領域の外側にHSV-tk遺伝子やジフテリア毒素遺伝子等のネガティブ選択用マーカー遺伝子を挿入すれば、薬剤耐性を指標にして相同組換え体を選択することができる。 Knock-in animals can be prepared according to basically the same method as for knock-out animals. Since the ORF of PPARα is present in exons 3 to 8, for example, these regions of the PPARα gene from the subject non-human mammal are excised using appropriate restriction enzymes, and the corresponding The targeting vector containing the DNA obtained by inserting the region is introduced into ES cells derived from the target non-human mammal according to the above-described method, and encodes a heterologous PPARα at the endogenous PPARα locus of the animal by homologous recombination. What is necessary is just to select an ES cell clone in which the DNA is integrated. Clone selection can also be performed using the PCR method or the Southern method. For example, a positive selection marker gene such as a neomycin resistance gene is inserted into the 3 ′ untranslated region of the PPARα gene of the targeting vector, and the target sequence and If a negative selection marker gene such as the HSV-tk gene or diphtheria toxin gene is inserted outside the homologous region, a homologous recombinant can be selected using drug resistance as an index.

　また、ポジティブ選択用マーカー遺伝子が導入された異種ＰＰＡＲαの発現を妨げる場合があるので、ポジティブ選択用マーカー遺伝子の両端にloxP配列もしくはfrt配列を配したターゲッティングベクターを用い、相同組換え体選択後の適当な時期にCreもしくはFlpリコンビナーゼまたは該リコンビナーゼ発現ベクター（例：アデノウイルスベクターなど）を作用させることにより、ポジティブ選択用マーカー遺伝子を切り出すことが好ましい。あるいは、Cre-loxP系やFlp-frt系を用いる代わりに、ポジティブ選択用マーカー遺伝子の両端に標的配列と相同な配列を同方向に繰り返して配置し、該配列間での遺伝子内組換えを利用してポジティブ選択用マーカー遺伝子を切り出してもよい。 In addition, since the expression of the heterologous PPARα in which the positive selection marker gene has been introduced may be hindered, using a targeting vector having a loxP sequence or frt sequence arranged at both ends of the positive selection marker gene, after homologous recombinant selection It is preferable to cut out the marker gene for positive selection by allowing Cre or Flp recombinase or a recombinase expression vector (eg, an adenovirus vector or the like) to act at an appropriate time. Alternatively, instead of using the Cre-loxP system or the Flp-frt system, a sequence homologous to the target sequence is repeatedly arranged in the same direction at both ends of the positive selection marker gene, and intragenic recombination between the sequences is used. Then, a marker gene for positive selection may be cut out.

　本発明の遺伝子導入動物は、異種ＰＰＡＲαをコードするＤＮＡを発現可能な状態で安定に保持することに加えて、１以上の他の遺伝子改変を有することをさらなる特徴とする。「他の遺伝子改変」とは、異種ＰＰＡＲαをコードするＤＮＡが導入される以外の遺伝子改変を意味し、自然突然変異により内因性遺伝子が改変された自然発症疾患モデル動物、他の遺伝子をさらに導入されたトランスジェニック動物、内因性遺伝子を不活化されたノックアウト動物（挿入突然変異等による遺伝子破壊のほか、アンチセンスＤＮＡや中和抗体をコードするＤＮＡの導入により遺伝子発現が検出不可能もしくは無視し得る程度にまで低下したトランスジェニック動物を含む）、変異内因性遺伝子が導入されたドミナントネガティブ変異体などが含まれる。したがって、内因性ＰＰＡＲα遺伝子の改変もまた、本発明における「他の遺伝子改変」に該当する。遺伝子 The transgenic animal of the present invention is further characterized in that it has one or more other genetic modifications in addition to stably maintaining the DNA encoding the heterologous PPARα in an expressible state. "Other gene modification" means a gene modification other than introduction of DNA encoding a heterologous PPARα, and further introduces a spontaneous disease model animal in which an endogenous gene has been modified by spontaneous mutation, or another gene Transgenic animals, knockout animals in which endogenous genes have been inactivated (gene disruption due to insertion mutation, etc., and gene expression cannot be detected or ignored by introduction of antisense DNA or DNA encoding neutralizing antibody) And transgenic animals that have been reduced to the extent that they can be obtained), dominant negative mutants into which a mutant endogenous gene has been introduced, and the like. Therefore, the modification of the endogenous PPARα gene also corresponds to “other genetic modification” in the present invention.

　「他の遺伝子改変」は、異種ＰＰＡＲαに特異的な作動薬もしくは拮抗薬の薬効評価用としての本発明の遺伝子導入動物の用途に有利なものであれば特に制限はないが、例えば、ＰＰＡＲαの活性調節が関与する疾患と同一もしくは類似の病態を生じさせるような遺伝子改変であることが好ましい。 The “other genetic modification” is not particularly limited as long as it is advantageous for the use of the transgenic animal of the present invention for evaluating the efficacy of an agonist or antagonist specific for heterologous PPARα. It is preferable that the gene is modified so as to cause the same or similar disease state as the disease in which the activity is regulated.

　「ＰＰＡＲαの活性調節が関与する疾患」とは、ＰＰＡＲα活性の異常に起因するかもしくは結果的にＰＰＡＲα活性の異常を生じる疾患だけでなく、ＰＰＡＲα活性を調節することにより予防および／または治療効果が得られ得る疾患をも含めた概念として把握されるべきである。例えば、ＰＰＡＲαを活性化することにより予防・治療可能な疾患として、高脂血症、高トリグリセリド（ＴＧ）血症、混合型脂質異常症、低ＨＤＬ血症、動脈硬化症、末梢動脈閉塞症、間欠性跛行、壊疽、高血圧症、血栓症、虚血性心疾患、急性心筋梗塞、心不全、鬱血性心不全、不安定狭心症、ＰＴＣＡ（経皮的冠動脈内腔拡張術）後の再狭窄、ステント留置後の再狭窄、高フィブリノーゲン血症、心筋症、脳出血、一過性脳虚血発作、脳梗塞、脳卒中、慢性糸球体腎炎、糖尿病性腎症、腎動脈硬化症、皮膚炎、免疫不全、低血糖、低ケトン血症、脂肪肝、糖尿病、糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症、肥満、アルツハイマー病、貧血性低酸素症および性腺障害等が、ＰＰＡＲαを阻害することにより予防・治療可能な疾患として、肝臓癌、乳癌および子宮内膜炎等がそれぞれ挙げられる。 "Diseases involving PPARα activity regulation" include not only diseases caused by abnormal PPARα activity or resulting in abnormal PPARα activity, but also preventive and / or therapeutic effects by regulating PPARα activity. It should be understood as a concept that includes possible diseases. For example, diseases that can be prevented and treated by activating PPARα include hyperlipidemia, hypertriglyceride (TG) blood, mixed dyslipidemia, hypoHDLemia, arteriosclerosis, peripheral arterial occlusion, Intermittent claudication, gangrene, hypertension, thrombosis, ischemic heart disease, acute myocardial infarction, heart failure, congestive heart failure, unstable angina, restenosis after PTCA (percutaneous coronary lumen dilatation), stent Restenosis after implantation, hyperfibrinogenemia, cardiomyopathy, cerebral hemorrhage, transient ischemic attack, cerebral infarction, stroke, chronic glomerulonephritis, diabetic nephropathy, renal arteriosclerosis, dermatitis, immunodeficiency, Prevention and treatment of hypoglycemia, hypoketemia, fatty liver, diabetes, diabetic neuropathy, diabetic retinopathy, obesity, Alzheimer's disease, anemia hypoxia and gonadal disorders by inhibiting PPARα Liver cancer as a disease , Breast cancer, endometritis and the like.

　「ＰＰＡＲαの活性調節が関与する疾患と同一もしくは類似の病態を生じさせる１以上の他の遺伝子改変を有する疾患モデル」としては、例えば、高脂血症もしくは動脈硬化症モデルとしてＷＨＨＬウサギ（低比重リポ蛋白レセプター（LDLR）に変異を有する；Watanabe Y.、アテロースクレローシス（Atherosclerosis）、第36巻、第261頁、1980年）、ＳＨＬＭ（apoE欠損変異を有する自然発症マウス；Matsushima Y.ら、マンマリアン・ゲノム（Mamm. Genome）、第10巻、第352頁、1999年）、LDLRノックアウトマウス（Ishibashi S.ら、ジャーナル・オヴ・クリニカル・インヴェスティゲーション（J. Clin. Invest.）、第92巻、第883頁、1993年）、apoEノックアウトマウス（Piedrahita J.A.ら、プロシーディングズ・オヴ・ナショナル・アカデミー・オヴ・サイエンシーズ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）、第89巻、第4471頁、1992年）、ヒトapo A,ヒトapoBダブルトランスジェニックマウス（Callow M.J.ら、プロシーディングズ・オヴ・ナショナル・アカデミー・オヴ・サイエンシーズ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）、第91巻、第2130頁、1994年）等が、虚血性心疾患モデルとしてCD55 CD59ダブルトランスジェニックマウス（Cowan P.J.ら、Xenotransplantation、第5巻、第184-90頁、1998年）等が、皮膚炎モデルとしてinterleukin 1トランスジェニックマウス（Groves R.W. ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第92巻、11874頁、1995年）等が、免疫不全モデルとしてCD19ノックアウトマウス（Spielman J.ら、Immunity、第3巻、39頁、1995年）等が、低血糖モデルとしてSPC2ノックアウトマウス（Furuta M.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第94巻、6646頁、1997年）等が、脂肪肝モデルとしてob/obマウス（Herberg L.及びColeman D.L.、メタボリズム（Metabolism）、第26巻、第59頁、1977年）、KKマウス（Nakamura M.及びYamada K.、ダイアベトロジア（Diabetologia）、第3巻、第212頁、1967頁）、FLSマウス（Soga M.ら、ラボラトリー・オヴ・アニマル・サイエンス（Lab. Anim. Sci.）、第49巻、第269頁、1999年）、糖尿病モデルとしてNODマウス（Makino S.ら、エクスペリメンタル・アニマル（Exp. Anim.）、第29巻、第1頁、1980年）、BBラット（Crisa L.ら、ダイアビーティス・メタボリズム・レヴュー（Diabetes Metab. Rev.）、第8巻、第4頁、1992年）、ob/obマウス、db/dbマウス（Hummel L.ら、サイエンス（Science）、第153巻、第1127頁、1966年）、KKマウス、GKラット（Goto Y.ら、トウホク・ジャーナル・オヴ・エクスペリメンタル・メディシン（Tohoku J. Exp. Med.）、第119巻、第85頁、1976年）、Zucker fattyラット（Zucker L.M.ら、アニュアル・オヴ・ニューヨーク・アカデミー・オヴ・サイエンス（Ann. NY Acad. Sci.）、第131巻、第447頁、1965年）、OLETFラット（Kawano K.ら、ダイアビーティス（Diabetes）、第41巻、第1422頁、1992年）等が、肥満モデルとしてob/obマウス、db/dbマウス、KKマウス、Zucker fattyラット、OLETFラット等が、アルツハイマー病モデルとして変異アミロイド前駆体蛋白質遺伝子導入マウス等が、貧血性低酸素症モデルとしてbeta SAD (beta S-Antilles-D Punjab)トランスジェニックマウス（Trudel M.ら、EMBO J、第10巻、3157頁、1991年）等が、性腺障害モデルとしてSteroidogenic factor 1ノックアウトマウス（Zhao L.ら、Development、第128巻、147頁、2001年）等が、肝臓癌モデルとしてp53ノックアウトマウス（Kemp C.J. Molecular Carcinogenesis, 第12巻、132頁、1995年）等が、乳癌モデルとしてc-neuトランスジェニックマウス（Rao G.N.ら、Breast Cancer Res Treat, 第48巻、265頁、1998年）等が、子宮内膜炎モデルとしてperforin Fas-ligandダブルノックアウトマウス（Spielman J.ら、J Immunol. , 第161巻、7063頁、1998年）等が、知られている。 Examples of the “disease model having one or more other genetic alterations that cause the same or similar pathology as a disease associated with PPARα activity regulation” include, for example, WHHL rabbits (low specific gravity) as a model for hyperlipidemia or arteriosclerosis. Mutation in lipoprotein receptor (LDLR); Watanabe Y., Atherosclerosis, Vol. 36, p. 261, 1980), SHLM (spontaneous mouse having apoE deficient mutation; Matsushima Y. Et al., Mamm. Genome, Vol. 10, p. 352, 1999), LDLR knockout mouse (Ishibashi S. et al., Journal of Clinical Investigation (J. Clin. Invest.)). 92, p. 883, 1993), apoE knockout mouse (Piedrahita JA et al., Proceedings of National Academy of Sciences USA). Acad (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 89, 4471, 1992), human apo A, human apoB double transgenic mouse (Callow MJ et al., Proceedings of National Academy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 91, p. 2130, 1994) and the like, CD55 CD59 double transgenic mouse (Cowan PJ et al., Xenotransplantation) as a model for ischemic heart disease. 5, 184-90, 1998) as an interleukin 1 transgenic mouse (Groves RW et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 11874, 1995) as a dermatitis model. And CD19 knockout mouse (Spielman J. et al., Immunity, Vol. 3, p. 39, 1995) as an immunodeficiency model, and SPC2 knockout mouse (Furuta M. et al., Proc. Natl. Acad) as a hypoglycemic model. Sci. USA, Vol. 94, p. 6646, 1997), etc. Ob / ob mice (Herberg L. and Coleman DL, Metabolism, Vol. 26, p. 59, 1977), KK mice (Nakamura M. and Yamada K., Diabetologia, Vol. 3) 212, 1967), FLS mouse (Soga M. et al., Laboratory of Animal Science (Lab. Anim. Sci.), 49, 269, 1999), NOD mouse as a diabetes model (Makino S. et al., Experimental Animal (Exp. Anim.), Vol. 29, page 1, 1980), BB rat (Crisa L. et al., Diabetes Metab. Rev.) .), Volume 8, page 4, 1992), ob / ob mouse, db / db mouse (Hummel L. et al., Science, Science 153, 1127, 1966), KK mouse, GK Rat (Goto Y. et al., Tohoku J. Exp. Med.), Vol. 119, p. 85 1976), Zucker fatty rats (Zucker LM et al., Annual of New York Academy of Science (Ann. NY Acad. Sci.), Vol. 131, p. 447, 1965), OLETF rats (Kawano K Et al., Diabetes, Vol. 41, p. 1422, 1992), and ob / ob mice, db / db mice, KK mice, Zucker fatty rats, OLETF rats, etc. as obesity models. Mutant amyloid precursor protein gene-transferred mouse or the like as a disease model, and beta SAD (beta S-Antilles-D Punjab) transgenic mouse (Trudel M. et al., EMBO J, vol. 10, p. 3157) as an anemia hypoxia model 1991), as a gonad disorder model, a Steroidogenic factor 1 knockout mouse (Zhao L. et al., Development, Vol. 128, p. 147, 2001) and the like, and as a liver cancer model, a p53 knockout mouse (Kemp CJ Molecular Carcinogenesis, Volume 12, page 132 1995), and c-neu transgenic mouse (Rao GN et al., Breast Cancer Res Treat, Vol. 48, p. 265, 1998) as a breast cancer model, and perforin Fas-ligand double knockout as an endometritis model. Mouse (Spielman J. et al., J Immunol., 161: 7063, 1998) and the like are known.

　これらの「他の遺伝子改変を有する疾患モデル」は、例えば、米国のJackson研究所などから購入可能であるか、あるいは周知の遺伝子改変技術を用いて容易に作製することができる。 These “disease models having other genetic modifications” can be purchased from, for example, the Jackson Laboratory in the United States, or can be easily prepared using well-known genetic modification techniques.

　本発明の遺伝子導入動物は、「ＰＰＡＲαの活性調節が関与する疾患と同一もしくは類似の病態を生じさせる１以上の他の遺伝子改変」に加えて、同一もしくは他の疾患モデルを作製し得る非遺伝的処理を施されていてもよい。「非遺伝的処理」とは対象非ヒト哺乳動物における遺伝子改変を生じさせない処理を意味する。このような処理としては、例えば、高脂肪食負荷処理、糖負荷処理、飢餓処理、血管結紮／再灌流等が挙げられる。 The transgenic animal of the present invention may be a non-inheritable animal capable of producing the same or another disease model in addition to “one or more other genetic modifications that cause the same or similar pathology as a disease associated with PPARα activity regulation”. Treatment may be applied. “Non-genetic treatment” means a treatment that does not cause genetic modification in a target non-human mammal. Examples of such processing include high fat diet loading processing, sugar loading processing, starvation processing, vascular ligation / reperfusion, and the like.

　ＰＰＡＲαは哺乳動物の肝臓、心臓、腎臓、副腎、消化管、脳などで高発現しており、それらの臓器における疾患と関連している。従って、本発明の遺伝子導入動物は、肝臓、心臓、腎臓、副腎、消化管および脳のうちの１もしくは２以上の部位で異種ＰＰＡＲαを特異的に発現するものであることが好ましい。そのような部位特異的発現は、前記した標的組織で異種ＰＰＡＲαを特異的もしくは高発現させ得るプロモーターを用いることにより達成することができる。例えば、肝臓で高発現可能な血清アミロイドＰコンポーネント（ＳＡＰ）プロモーターを用いることにより、異種ＰＰＡＲαを肝臓特異的に、あるいは肝臓で高発現する本発明の遺伝子導入動物を作製することができる。 PPARα is highly expressed in the liver, heart, kidney, adrenal gland, digestive tract, brain and the like of mammals, and is associated with diseases in these organs. Therefore, it is preferable that the transgenic animal of the present invention specifically expresses a heterologous PPARα at one or more sites among the liver, heart, kidney, adrenal gland, digestive tract, and brain. Such site-specific expression can be achieved by using a promoter capable of specifically or highly expressing heterologous PPARα in the target tissue described above. For example, by using a serum amyloid P component (SAP) promoter that can be highly expressed in the liver, the transgenic animal of the present invention that specifically expresses the heterologous PPARα in the liver or in the liver can be produced.

　また、異種ＰＰＡＲαをコードするＤＮＡを導入された非ヒト哺乳動物がＰＰＡＲαを著しく高発現する場合、他の遺伝子改変を有することなく肝臓癌、乳癌、子宮内膜炎などの疾患を発症する表現型を示すものがある。したがって、本発明はまた、肝臓癌、乳癌および子宮内膜炎からなる群より選択される１以上の疾患を発症する、異種ＰＰＡＲαをコードするＤＮＡを導入された非ヒト哺乳動物を提供する。 In addition, when a non-human mammal into which a DNA encoding a heterologous PPARα has been introduced significantly expresses PPARα, a phenotype that causes diseases such as liver cancer, breast cancer, and endometritis without any other genetic modification. There is something that shows. Accordingly, the present invention also provides a non-human mammal into which DNA encoding a heterologous PPARα has been introduced, which develops one or more diseases selected from the group consisting of liver cancer, breast cancer and endometritis.

　異種ＰＰＡＲαに特異的な作動薬もしくは拮抗薬の薬効評価用としての本発明の遺伝子導入動物の用途に有利な「他の遺伝子改変」の別の好ましい態様としては、ＰＰＲＥを有するプロモーターの制御下にある外来ＤＮＡの導入が挙げられる。上述のように、ＰＰＡＲαはリガンド存在下に標的遺伝子の５’上流に存在するＰＰＲＥ配列に結合して該遺伝子の転写を促進する（遺伝子によっては抑制する場合もある（例：apoC-III等））。したがって、ＰＰＲＥを有するプロモーターの制御下にある外来ＤＮＡを導入された非ヒト哺乳動物では、該ＤＮＡの発現に及ぼす被験物質の効果を検定することにより、該物質のアゴニストまたはアンタゴニスト活性を評価することができる。ここで「外来ＤＮＡ」とは、外部より人為的に遺伝子導入されたＤＮＡを意味し、異種ＤＮＡだけでなく同種ＤＮＡをも包含する。「ＰＰＲＥを有するプロモーターの制御下にある外来ＤＮＡ」としては、ＰＰＡＲαの本来の標的遺伝子であり、ＰＰＲＥ配列をプロモーター領域に内在するヒトまたは他の哺乳動物由来遺伝子（ゲノムＤＮＡ）、例えば、CYP4A11、CYP7A1、PAI-1、ApoA-I、ApoA-II、ApoC-III、Acyl-CoA等の遺伝子が挙げられる。あるいは、これらの遺伝子由来のＰＰＲＥ配列を含む任意のプロモーター（対象非ヒト哺乳動物の細胞内で機能的である）の下流に適当なリポーター遺伝子（例：β−ガラクトシダーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、アルカリホスファターゼ遺伝子、ペルオキシダーゼ遺伝子等）を連結したキメラＤＮＡもまた好ましい。 Another preferred embodiment of the “other genetic modification” that is advantageous for the use of the transgenic animal of the present invention for evaluating the efficacy of an agonist or antagonist specific for a heterologous PPARα is under the control of a PPRE-containing promoter. Introducing certain foreign DNA. As described above, PPARα binds to the PPRE sequence located 5 ′ upstream of the target gene in the presence of a ligand to promote the transcription of the gene (there may be suppression depending on the gene (eg, apoC-III or the like). ). Therefore, in a non-human mammal into which a foreign DNA under the control of a promoter having a PPRE has been introduced, evaluating the agonist or antagonist activity of the test substance by assaying the effect of the test substance on the expression of the DNA. Can be. Here, the “foreign DNA” means a DNA artificially transfected from outside and includes not only heterologous DNA but also homologous DNA. As the "foreign DNA under the control of a promoter having PPRE", the target gene of PPARα is a gene derived from human or other mammal (genomic DNA) having a PPRE sequence in the promoter region, such as CYP4A11. Genes such as CYP7A1, PAI-1, ApoA-I, ApoA-II, ApoC-III, Acyl-CoA and the like can be mentioned. Alternatively, an appropriate reporter gene (eg, β-galactosidase gene, luciferase gene, chloramphenic acid gene) is located downstream of any promoter containing a PPRE sequence derived from these genes (functional in the cells of the target non-human mammal). Chimeric DNAs linked with a call acetyltransferase gene, an alkaline phosphatase gene, a peroxidase gene, etc.) are also preferable.

　異種ＰＰＡＲαをコードするＤＮＡを導入された非ヒト哺乳動物に、ＰＰＡＲαの活性調節が関与する疾患と同一もしくは類似の病態を生じさせる１以上の他の遺伝子改変、あるいはＰＰＲＥを有するプロモーターの制御下にある外来ＤＮＡを導入する方法は特に制限はなく、例えば、異種ＰＰＡＲαをコードするＤＮＡを導入された非ヒト哺乳動物と、ＰＰＡＲαの活性調節が関与する疾患と同一もしくは類似の病態を生じさせる１以上の他の遺伝子改変、あるいはＰＰＲＥを有するプロモーターの制御下にある外来ＤＮＡを有する同種の非ヒト哺乳動物とを交雑する方法；ＰＰＡＲαの活性調節が関与する疾患と同一もしくは類似の病態を生じさせる１以上の他の遺伝子改変、あるいはＰＰＲＥを有するプロモーターの制御下にある外来ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物の初期胚やＥＳ細胞に、上述の方法により異種ＰＰＡＲαをコードするＤＮＡを導入してトランスジェニック動物を得る方法；異種ＰＰＡＲαをコードするＤＮＡを導入された非ヒト哺乳動物の初期胚やＥＳ細胞に、上述の方法により、あるいはノックアウト技術により、ＰＰＡＲαの活性調節が関与する疾患と同一もしくは類似の病態を生じさせる１以上の他の遺伝子改変、あるいはＰＰＲＥを有するプロモーターの制御下にある外来ＤＮＡを導入する方法等が挙げられる。また、ＰＰＡＲαの活性調節が関与する疾患と同一もしくは類似の病態を生じさせる１以上の他の遺伝子改変が外来遺伝子やドミナント変異遺伝子の導入による場合、野生型非ヒト哺乳動物の初期胚やＥＳ細胞に、該外来遺伝子等と異種ＰＰＡＲαをコードするＤＮＡとを同時にもしくは順次導入してトランスジェニック動物を得てもよい。他の遺伝子改変がＰＰＲＥを有するプロモーターの制御下にある外来ＤＮＡの導入である場合も同様に、該外来ＤＮＡと異種ＰＰＡＲαをコードするＤＮＡとを同時にもしくは順次導入してトランスジェニック動物を得ることができる。さらに、ＰＰＡＲαの活性調節が関与する疾患と同一もしくは類似の病態を生じさせる１以上の他の遺伝子改変が内因性遺伝子の破壊による場合は、異種ＰＰＡＲαをコードするＤＮＡを破壊すべき内因性遺伝子にターゲッティングされ得るようにデザインして野生型非ヒト哺乳動物のＥＳ細胞に導入してもよい。この場合、ターゲッティングベクターは、内因性ＰＰＡＲα遺伝子を破壊されるべき内因性遺伝子に置き換える以外は、上記のノックイン動物の作製に関して例示したものが好ましく使用され得る。 Under the control of one or more other genetic modifications that cause a disease associated with the regulation of PPARα activity in a non-human mammal into which DNA encoding heterologous PPARα has been introduced, or a promoter having a PPRE, The method of introducing a foreign DNA is not particularly limited. For example, a non-human mammal into which a DNA encoding a heterologous PPARα has been introduced, and one or more that cause the same or similar disease state as a disease associated with the regulation of PPARα activity. A method of crossing with other homologous non-human mammals having a foreign DNA under the control of a promoter having a PPRE; or producing the same or similar pathology as a disease involving the regulation of PPARα activity 1 Other genetic modifications or foreign D under the control of a promoter with PPRE A method for obtaining a transgenic animal by introducing a DNA encoding a heterologous PPARα into an early embryo or an ES cell of a nonhuman mammal having NA by the method described above; a nonhuman mammal having a DNA encoding a heterologous PPARα introduced therein Control of one or more other genetic modifications that cause the same or similar pathology as a disease in which PPARα activity regulation is involved, or control of a PPRE-containing promoter, in the early embryo or ES cell of the present invention by the above-mentioned method or by the knockout technique. There is a method for introducing a foreign DNA below. In addition, when one or more other genetic modifications that cause the same or similar pathology as a disease associated with the regulation of PPARα activity are due to the introduction of a foreign gene or a dominant mutant gene, the early embryo or ES cell of a wild-type non-human mammal The transgenic animal may be obtained by simultaneously or sequentially introducing the foreign gene or the like and DNA encoding a heterologous PPARα. Similarly, when the other genetic modification is the introduction of a foreign DNA under the control of a PPRE-containing promoter, it is possible to obtain a transgenic animal by simultaneously or sequentially introducing the foreign DNA and a DNA encoding a heterologous PPARα. it can. Furthermore, when the one or more other genetic modifications that cause the same or similar pathology as the disease in which the regulation of PPARα activity is involved are due to the disruption of the endogenous gene, the DNA encoding the heterologous PPARα may be disrupted. It may be designed to be targeted and introduced into ES cells of a wild-type non-human mammal. In this case, as the targeting vector, those exemplified for the above-described production of knock-in animals can be preferably used, except that the endogenous PPARα gene is replaced with the endogenous gene to be disrupted.

　異種ＰＰＡＲαをコードするＤＮＡを導入された非ヒト哺乳動物と、ＰＰＡＲαの活性調節が関与する疾患と同一もしくは類似の病態を生じさせる１以上の他の遺伝子改変（あるいはＰＰＲＥを有するプロモーターの制御下にある外来ＤＮＡ）を有する同種の疾患モデル非ヒト哺乳動物とを交雑する場合、ホモ接合体同士を交雑することが望ましい。例えば、異種ＰＰＡＲαをコードするＤＮＡが１遺伝子座に組み込まれたホモ接合体と、apoEホモ欠損高脂血症（動脈硬化）モデルとを交雑して得られるＦ₁は両遺伝子についてヘテロである。このＦ₁同士を兄妹交配して得られるＦ₂個体の１／１６は異種ＰＰＡＲαホモ導入・apoEホモ欠損となる。 A non-human mammal into which DNA encoding a heterologous PPARα has been introduced, and one or more other genetic modifications (or under the control of a PPRE-containing promoter) that cause the same or similar pathology as a disease associated with PPARα activity regulation. When crossing with a non-human mammal of the same type of disease model having certain foreign DNA), it is desirable to cross homozygotes. For example, F ₁ to DNA encoding a heterologous PPARα is obtained by crossing a homozygous incorporated, and apoE homo-deficient hyperlipidemia (arteriosclerosis) model 1 locus is heterozygous for both genes. 1/16 of F ₂ individuals obtained the F ₁ together with sib mating is the heterologous PPARα homo introduced · apoE homo-deficient.

　上記のようにして得られる「本発明の遺伝子導入非ヒト哺乳動物」は、内因性ＰＰＡＲαに加えて（あるいはそれに代えて）異種ＰＰＡＲαを発現するので、異種ＰＰＡＲαに対してアゴニストまたはアンタゴニスト活性を有するが、内因性ＰＰＡＲαに対しては活性を有しない異種ＰＰＡＲα特異的作動薬または拮抗薬について、その薬効をインビボで評価することを可能にする。したがって、本発明は、本発明の遺伝子導入非ヒト哺乳動物またはその生体の一部に被験物質を適用し、該物質の異種ＰＰＡＲαに対するアゴニストまたはアンタゴニスト活性を検定することを特徴とする異種ＰＰＡＲα作動薬または拮抗薬のスクリーニング方法を提供する。 The “transgenic non-human mammal of the present invention” obtained as described above expresses a heterologous PPARα in addition to (or instead of) endogenous PPARα, and thus has an agonistic or antagonistic activity against a heterologous PPARα. However, for a heterologous PPARα-specific agonist or antagonist that has no activity against endogenous PPARα, its efficacy can be evaluated in vivo. Therefore, the present invention provides a heterologous PPARα agonist characterized in that a test substance is applied to the transgenic non-human mammal of the present invention or a part of the living body thereof, and the agonist or antagonist activity of the substance against heterologous PPARα is assayed. Alternatively, a method for screening for an antagonist is provided.

　ここで「アゴニスト活性」とは、ＰＰＡＲαに特異的に結合し、ＰＰＡＲαの活性型（即ち、ＲＸＲとのヘテロダイマーとしてＰＰＲＥに結合し、標的遺伝子の転写を活性化し得る状態）と不活性型の平衡状態をより活性側にシフトさせる性質をいい、その程度は特に限定されない。従って、「アゴニスト活性を有する物質（作動薬）」には、いわゆるフルアゴニストの他、パーシャルアゴニストも包含される。一方、「アンタゴニスト活性」とは、ＰＰＡＲαのリガンド結合部位に拮抗的に結合するが、活性型と不活性型の平衡状態にほとんど又は全く影響を及ぼさない性質、あるいはＰＰＡＲαの任意の部位に結合して、ＰＰＡＲαの活性型と不活性型の平衡状態をより不活性側にシフトさせる性質をいう。従って、本明細書において「アンタゴニスト活性を有する物質（拮抗薬）」とは、いわゆるニュートラルアンタゴニストとインバースアゴニストの両方を包含する概念として定義されるものとする。 As used herein, the term “agonist activity” refers to an active form of PPARα, specifically, an active form of PPARα (that is, a state capable of binding to PPRE as a heterodimer with RXR and activating transcription of a target gene) and an inactive form of PPARα. It refers to the property of shifting the equilibrium state to the more active side, and the degree is not particularly limited. Therefore, the “substance having agonist activity (agonist)” includes a so-called full agonist as well as a partial agonist. On the other hand, “antagonist activity” refers to a property of binding to the ligand binding site of PPARα but having little or no effect on the equilibrium between the active and inactive types, or binding to any site of PPARα. Refers to the property of shifting the equilibrium state between the active and inactive forms of PPARα to the more inactive side. Therefore, in the present specification, the “substance having antagonist activity (antagonist)” is defined as a concept including both a so-called neutral antagonist and an inverse agonist.

　具体的には、本発明のスクリーニング方法では、本発明の遺伝子導入非ヒト哺乳動物に被験物質を投与する。被験物質としては、公知の合成化合物、ペプチド、タンパク質、ＤＮＡライブラリーなどの他に、例えば哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ブタ、ウシ、ヒツジ、サル、ヒトなど）の組織抽出物、細胞培養上清などが用いられる。該被験物質は、本発明の遺伝子導入非ヒト哺乳動物の内因性ＰＰＡＲαおよび異種ＰＰＡＲαのそれぞれとインビトロでの結合実験を行なって異種ＰＰＡＲαのみに結合することを確認するか、あるいは、ＰＰＲＥの制御下に置かれたレポーター遺伝子をそれぞれ導入した非ヒト哺乳動物由来細胞および異種哺乳動物由来細胞における発現アッセイを行なって、後者でのみレポーター遺伝子の発現が活性化されることを確認することなどにより、予め異種ＰＰＡＲα特異的に作用することを確認しておくことが望ましい。本発明の遺伝子導入非ヒト哺乳動物において内因性ＰＰＡＲαがノックアウトされている場合は、この予備スクリーニングを省略することができる。 Specifically, in the screening method of the present invention, a test substance is administered to the transgenic non-human mammal of the present invention. As the test substance, in addition to known synthetic compounds, peptides, proteins, DNA libraries, etc., for example, tissue extracts of mammals (eg, mouse, rat, pig, cow, sheep, monkey, human, etc.), cell culture A supernatant or the like is used. The test substance is subjected to in vitro binding experiments with each of the endogenous PPARα and the heterologous PPARα of the transgenic non-human mammal of the present invention to confirm that they bind only to the heterologous PPARα, or under the control of PPRE. By performing an expression assay in a non-human mammal-derived cell and a heterologous mammal-derived cell into which the reporter gene placed in each is introduced, and confirming that the reporter gene expression is activated only in the latter, It is desirable to confirm that it acts specifically on the heterologous PPARα. If the endogenous PPARα has been knocked out in the transgenic non-human mammal of the present invention, this preliminary screening can be omitted.

　被験物質のＰＰＡＲαアゴニスト／アンタゴニスト活性は、例えば、脂肪酸β酸化活性またはそれに伴う血中ＴＧ濃度の変化、apoC-III産生またはそれに伴う血中ＴＧ濃度の変化、apoA-I産生またはそれに伴う血中ＨＤＬ−Ｃ濃度の変化、apoA-II産生またはそれに伴う血中ＨＤＬ−Ｃ濃度の変化などを指標として検定することができる。これらは自体公知の方法、例えば、Chung, B.H., Segrest, J.P., Ray, M.J., Brunzell, J.D., Hokanson, J.E., Krauss, R.M., Beaudrie, K., and Cone, J.T. 1986. Methods Enzymol. 128: 181-209に記載の方法に準じて測定することができる。「他の遺伝子改変」が「ＰＰＲＥを有するプロモーターの制御下にある外来ＤＮＡの導入」である本発明の遺伝子導入非ヒト哺乳動物においては、該外来ＤＮＡの発現を調べることによって、被験物質のＰＰＡＲαアゴニスト／アンタゴニスト活性を容易に測定することができる。 The PPARα agonist / antagonist activity of the test substance includes, for example, fatty acid β-oxidation activity or a change in blood TG concentration, apoC-III production or a change in blood TG concentration, apoA-I production or a blood HDL associated therewith. A change in -C concentration, apoA-II production or a accompanying change in blood HDL-C concentration can be assayed as an index. These are known per se, for example, Chung, BH, Segrest, JP, Ray, MJ, Brunzell, JD, Hokanson, JE, Krauss, RM, Beaudrie, K., and Cone, JT 1986. Methods Enzymol. 128: 181 It can be measured according to the method described in -209. In the transgenic non-human mammal of the present invention in which the "other genetic modification" is "introduction of a foreign DNA under the control of a promoter having a PPRE", the expression of the test substance PPARα is determined by examining the expression of the foreign DNA. Agonist / antagonist activity can be easily measured.

　このようにして選択された異種ＰＰＡＲα作動薬は、該異種ＰＰＡＲαの由来する動物における安全で低毒性な高脂血症、高トリグリセリド血症、混合型脂質異常症、低ＨＤＬ血症、動脈硬化症、末梢動脈閉塞症、間欠性跛行、壊疽、高血圧症、血栓症、虚血性心疾患、急性心筋梗塞、心不全、鬱血性心不全、不安定狭心症、ＰＴＣＡ後の再狭窄、ステント留置後の再狭窄、高フィブリノーゲン血症、心筋症、脳出血、一過性脳虚血発作、脳梗塞、脳卒中、慢性糸球体腎炎、糖尿病性腎症、腎動脈硬化症、皮膚炎、免疫不全、低血糖、低ケトン血症、脂肪肝、糖尿病、糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症、肥満、アルツハイマー病、貧血性低酸素症および性腺障害などの疾患の予防・治療薬として使用することができる。 The heterologous PPARα agonist thus selected is safe and low toxic hyperlipidemia, hypertriglyceridemia, mixed dyslipidemia, hypoHDLemia, arteriosclerosis in animals derived from the heterologous PPARα. , Peripheral arterial occlusion, intermittent claudication, gangrene, hypertension, thrombosis, ischemic heart disease, acute myocardial infarction, heart failure, congestive heart failure, unstable angina, restenosis after PTCA, re-stenting after stent placement Stenosis, hyperfibrinogenemia, cardiomyopathy, cerebral hemorrhage, transient ischemic attack, cerebral infarction, stroke, chronic glomerulonephritis, diabetic nephropathy, renal arteriosclerosis, dermatitis, immunodeficiency, hypoglycemia, low It can be used as a prophylactic / therapeutic agent for diseases such as ketonemia, fatty liver, diabetes, diabetic neuropathy, diabetic retinopathy, obesity, Alzheimer's disease, anemia hypoxia and gonadal disorders.

　異種ＰＰＡＲα作動薬は、例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。該作動薬は、生理学的に認められる担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することができる。これら製剤における有効成分量は後述する投与量を考慮して適宜選択されれる。 Heterologous PPARα agonists can be used, for example, in the form of tablets, capsules, elixirs, microcapsules, and the like, optionally in sugar-coated form, orally, or aseptic with water or other pharmaceutically acceptable liquids. It can be used parenterally in the form of injections, such as solutions or suspensions. The agonist is formulated by mixing with physiologically acceptable carriers, flavoring agents, excipients, vehicles, preservatives, stabilizers, binders, and the like in the unit dosage form generally required for the practice of formulations. Can be The amount of the active ingredient in these preparations is appropriately selected in consideration of the dosage described below.

　錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、前記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。 Examples of additives that can be incorporated into tablets, capsules, and the like include binders such as gelatin, corn starch, tragacanth, and acacia, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, and alginic acid. Useful bulking agents, lubricants such as magnesium stearate, sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin, flavoring agents such as peppermint, reddish oil or cherry and the like are used. When the preparation unit form is a capsule, a liquid carrier such as oil and fat can be further contained in the above-mentioned type of material. Sterile compositions for injection can be formulated according to normal pharmaceutical practice such as dissolving or suspending the active substance in vehicles such as water for injection, and naturally occurring vegetable oils such as sesame oil, coconut oil and the like.

　注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例えば、エタノールなど）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０^TM、ＨＣＯ−５０など）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが挙げられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液など）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプルに充填される。 Aqueous liquids for injection include, for example, physiological saline, isotonic solutions containing glucose and other adjuvants (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.), and suitable solubilizing agents. For example, it may be used in combination with an alcohol (eg, ethanol or the like), a polyalcohol (eg, propylene glycol, polyethylene glycol or the like), a nonionic surfactant (eg, polysorbate 80 ^™ , HCO-50, or the like). Examples of the oily liquid include sesame oil and soybean oil, and may be used in combination with solubilizers such as benzyl benzoate and benzyl alcohol. Also, buffers (eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer, etc.), soothing agents (eg, benzalkonium chloride, procaine hydrochloride, etc.), stabilizers (eg, human serum albumin, polyethylene glycol, etc.), You may mix | blend with a preservative (for example, benzyl alcohol, phenol etc.), an antioxidant, etc. The prepared injection is usually filled in an appropriate ampoule.

　また、異種ＰＰＡＲα作動薬がＤＮＡ、ＲＮＡなどの核酸である場合、当該核酸を単独で、あるいは当該ＤＮＡ（または当該ＲＮＡに対応するＤＮＡ）をレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って、ヒトまたは他の哺乳動物に投与することができる。当該核酸は、そのままで、あるいは摂取促進のための補助剤などの生理学的に認められる担体とともに製剤化した後、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。 Further, when the heterologous PPARα agonist is a nucleic acid such as DNA or RNA, the nucleic acid alone or the DNA (or DNA corresponding to the RNA) can be used as a retrovirus vector, an adenovirus vector, or an adenovirus associated virus vector. After insertion into an appropriate vector, such as humans or other mammals, it can be administered according to conventional means. The nucleic acid can be administered as it is or after being formulated with a physiologically acceptable carrier such as an adjuvant for promoting uptake, using a gene gun or a catheter such as a hydrogel catheter.

　このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、異種ＰＰＡＲαと同一もしくは実質的に同一のＰＰＡＲαを有する哺乳動物（例えば、ヒト、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど；「実質的に同一」とは上記と同義である）、好ましくは異種ＰＰＡＲαの由来する動物（好ましくはヒト）に対して投与することができる。 The preparations obtained in this way are safe and have low toxicity, for example, mammals (eg, humans, rats, mice, guinea pigs, rabbits, sheep, pigs) having the same or substantially the same PPARα as a heterologous PPARα , Cows, horses, cats, dogs, monkeys, etc .; "substantially the same" is as defined above), preferably an animal derived from a heterologous PPARα (preferably a human).

　異種ＰＰＡＲα作動薬の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより異なるが、例えば、高ＴＧ血症の治療目的で経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇ）においては、一日につき約０.１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口投与の場合、当該作動薬の投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、高ＴＧ血症の治療目的で注射剤として成人（体重６０ｋｇ）に投与する場合、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度である。投与対象がヒト以外の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。 The dosage of the heterologous PPARα agonist varies depending on the target disease, the administration subject, the administration route, and the like. For example, in the case of oral administration for the purpose of treating hyperTGemia, an adult (body weight of 60 kg) generally takes one day. About 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, and more preferably about 1.0 to 20 mg. In the case of parenteral administration, the dose of the agonist varies depending on the administration subject, the target disease, and the like. For example, when administered to an adult (body weight 60 kg) as an injection for the purpose of treating hyperTGemia, a daily dose The amount is about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, and more preferably about 0.1 to 10 mg. Even when the subject to be administered is an animal other than a human, the dose can be administered in terms of the weight per 60 kg.

　また、本発明のスクリーニング法により選択された異種ＰＰＡＲα拮抗薬は、哺乳動物（好ましくは異種ＰＰＡＲαの由来する動物、さらに好ましくはヒト）における安全で低毒性な肝臓癌、乳癌または子宮内膜炎などの疾患の予防・治療薬として使用することができる。異種ＰＰＡＲα拮抗薬は、上記異種ＰＰＡＲα作動薬と同様の方法により製剤化され、経口的もしくは非経口的に哺乳動物（例えば、ヒト、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど；「実質的に同一」とは上記と同義である）に投与することができる。 The heterologous PPARα antagonist selected by the screening method of the present invention may be a safe and low-toxic liver cancer, breast cancer or endometritis in a mammal (preferably an animal derived from a heterologous PPARα, more preferably a human). It can be used as a prophylactic / therapeutic agent for diseases of The heterologous PPARα antagonist is formulated in the same manner as the above heterologous PPARα agonist, and is orally or parenterally administered to a mammal (eg, human, rat, mouse, guinea pig, rabbit, sheep, pig, cow, horse, Cat, dog, monkey, etc .; “substantially the same” is as defined above).

　異種ＰＰＡＲα拮抗薬の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより異なるが、例えば、肝臓癌の治療目的で経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇ）においては、一日につき約０.１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口投与の場合、当該拮抗薬の投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、肝臓癌の治療目的で注射剤として成人（体重６０ｋｇ）に投与する場合、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度である。投与対象がヒト以外の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。 The dosage of the heterologous PPARα antagonist varies depending on the target disease, the administration subject, the administration route, and the like. For example, in the case of oral administration for the treatment of liver cancer, in general, for an adult (body weight 60 kg), it is about 0.1 mg to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg. In the case of parenteral administration, the dose of the antagonist varies depending on the administration subject, the target disease, and the like. For example, when administered to an adult (body weight 60 kg) as an injection for the treatment of liver cancer, it may be about 0 per day. The amount is about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, and more preferably about 0.1 to 10 mg. Even when the subject to be administered is an animal other than a human, the dose can be administered in terms of the weight per 60 kg.

　「本発明の遺伝子導入非ヒト哺乳動物」はＰＰＡＲαの活性調節が関与する疾患と同一もしくは類似の病態を示すので、該動物に被験物質を投与してその病態に及ぼす該物質の効果を検定することによって、異種ＰＰＡＲαの由来する哺乳動物（好ましくは、ヒト）における該ＰＰＡＲαの活性調節が関与する疾患に対して予防・治療活性を有する物質をスクリーニングすることができる。指標となる病態は疾患モデルの種類に応じて適宜選択され得るが、例えば、本発明の遺伝子導入非ヒト哺乳動物が高脂血症モデルであれば、血中コレステロール濃度（総コレステロール濃度、ＴＧ濃度、ＨＤＬ−Ｃ濃度等）の改善など、動脈硬化モデルであれば動脈硬化病変の退縮など、虚血性心疾患や脳血管疾患のモデルであれば血流の改善など、肝臓癌や乳癌のモデルであれば癌病巣の退縮などをそれぞれ指標として、被験物質の疾患予防・治療効果を評価することができる。 Since the "transgenic non-human mammal of the present invention" exhibits the same or similar pathology as a disease associated with PPARα activity regulation, a test substance is administered to the animal, and the effect of the substance on the pathology is assayed. As a result, it is possible to screen a substance having a preventive / therapeutic activity against a disease associated with the regulation of the activity of PPARα in a mammal (preferably a human) derived from the heterologous PPARα. The disease state serving as an index can be appropriately selected depending on the type of the disease model. For example, if the transgenic non-human mammal of the present invention is a hyperlipidemia model, the blood cholesterol concentration (total cholesterol concentration, TG concentration HDL-C concentration, etc.), in arteriosclerosis models, regression of atherosclerotic lesions, and in models of ischemic heart disease or cerebrovascular disease, improvement of blood flow, such as liver cancer or breast cancer models. If so, the preventive and therapeutic effects of the test substance can be evaluated using the regression of the cancer lesion as an index.

　上述のように、異種ＰＰＡＲαをコードするＤＮＡを導入された非ヒト哺乳動物がＰＰＡＲαを著しく高発現する場合、他の遺伝子改変を有することなく肝臓癌、乳癌、子宮内膜炎などの疾患を発症する表現型を示すものがある。したがって、このような異種ＰＰＡＲα導入非ヒト哺乳動物に同様に被験物質を投与して上記疾患の病態改善効果を検定することによっても、該疾患の予防・治療活性を有する物質をスクリーニングすることができる。 As described above, when a non-human mammal into which DNA encoding a heterologous PPARα has been introduced significantly expresses PPARα, a disease such as liver cancer, breast cancer, endometritis or the like develops without any other genetic modification. Some phenotypes indicate Therefore, a substance having a prophylactic / therapeutic activity for the disease can be screened by similarly administering a test substance to such a heterologous PPARα-introduced non-human mammal and assaying the effect of improving the disease state of the disease. .

　このようにして選択された物質は、安全で低毒性な高脂血症、高トリグリセリド血症、混合型脂質異常症、低ＨＤＬ血症、動脈硬化症、末梢動脈閉塞症、間欠性跛行、壊疽、高血圧症、血栓症、虚血性心疾患、急性心筋梗塞、心不全、鬱血性心不全、不安定狭心症、ＰＴＣＡ後の再狭窄、ステント留置後の再狭窄、高フィブリノーゲン血症、心筋症、脳出血、一過性脳虚血発作、脳梗塞、脳卒中、慢性糸球体腎炎、糖尿病性腎症、腎動脈硬化症、皮膚炎、免疫不全、低血糖、低ケトン血症、脂肪肝、糖尿病、糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症、肥満、アルツハイマー病、貧血性低酸素症、性腺障害、肝臓癌、乳癌および子宮内膜炎などの疾患の予防・治療薬として使用することができる。選択された物質は、上記異種ＰＰＡＲα作動薬と同様の方法により製剤化され、経口的もしくは非経口的に哺乳動物（例えば、ヒト、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に投与することができる。 The substances selected in this way are safe and low-toxic hyperlipidemia, hypertriglyceridemia, mixed dyslipidemia, hypoHDLemia, arteriosclerosis, peripheral arterial occlusion, intermittent claudication, gangrene , Hypertension, thrombosis, ischemic heart disease, acute myocardial infarction, heart failure, congestive heart failure, unstable angina, restenosis after PTCA, restenosis after stent placement, hyperfibrinogenemia, cardiomyopathy, cerebral hemorrhage , Transient ischemic attack, cerebral infarction, stroke, chronic glomerulonephritis, diabetic nephropathy, renal arteriosclerosis, dermatitis, immunodeficiency, hypoglycemia, hypoketonemia, fatty liver, diabetes, diabetic It can be used as a prophylactic / therapeutic agent for diseases such as neuropathy, diabetic retinopathy, obesity, Alzheimer's disease, anemia hypoxia, gonadal disorders, liver cancer, breast cancer and endometritis. The selected substance is formulated in the same manner as the above heterologous PPARα agonist, and is orally or parenterally administered to a mammal (eg, human, rat, mouse, guinea pig, rabbit, sheep, pig, cow, horse, Cats, dogs, monkeys, etc.).

　選択された物質の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより異なるが、例えば、高ＴＧ血症の治療目的で経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇ）においては、一日につき約０.１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口投与の場合、当該物質の投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、高ＴＧ血症の治療目的で注射剤として成人（体重６０ｋｇ）に投与する場合、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度である。投与対象がヒト以外の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。 The dose of the selected substance varies depending on the target disease, the administration subject, the administration route, and the like. For example, when orally administered for the purpose of treating hyperTGemia, generally, for an adult (body weight 60 kg), one day About 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, and more preferably about 1.0 to 20 mg. In the case of parenteral administration, the dose of the substance varies depending on the administration subject, the target disease, and the like. For example, when administered to an adult (body weight 60 kg) as an injection for the treatment of hyperTGemia, about The amount is about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, and more preferably about 0.1 to 10 mg. Even when the subject to be administered is an animal other than a human, the dose can be administered in terms of the weight per 60 kg.

　本発明の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。配列 The sequence numbers in the sequence listing of the present invention indicate the following sequences.

　〔配列番号：１〕ヒトＰＰＡＲαをコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。 [SEQ ID NO: 1] This shows the base sequence of cDNA encoding human PPARα.

　〔配列番号：２〕ヒトＰＰＡＲαのアミノ酸配列を示す。 [SEQ ID NO: 2] This shows the amino acid sequence of human PPARα.

　〔配列番号：３〕ヒトＳＡＰプロモーターを増幅するためのプライマーとして機能すべく設計されたオリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。 [SEQ ID NO: 3] This shows the base sequence of oligonucleotide designed to function as a primer for amplifying human SAP promoter.

　〔配列番号：４〕ヒトＳＡＰプロモーターを増幅するためのプライマーとして機能すべく設計されたオリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。 [SEQ ID NO: 4] This shows the base sequence of oligonucleotide designed to function as a primer for amplifying human SAP promoter.

　〔配列番号：５〕ウサギβ−グロビンエンハンサーを増幅するためのプライマーとして機能すべく設計されたオリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。 [SEQ ID NO: 5] This shows the base sequence of an oligonucleotide designed to function as a primer for amplifying rabbit β-globin enhancer.

　〔配列番号：６〕ウサギβ−グロビンエンハンサーを増幅するためのプライマーとして機能すべく設計されたオリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。 [SEQ ID NO: 6] This shows the base sequence of oligonucleotide designed to function as a primer for amplifying rabbit β-globin enhancer.

　〔配列番号：７〕ヒトＰＰＡＲα ｃＤＮＡフラグメントを増幅するためのプライマーとして機能すべく設計されたオリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。 [SEQ ID NO: 7] This shows the base sequence of oligonucleotide designed to function as a primer for amplifying human PPARα cDNA fragment.

　〔配列番号：８〕ヒトＰＰＡＲα ｃＤＮＡフラグメントを増幅するためのプライマーとして機能すべく設計されたオリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。 [SEQ ID NO: 8] This shows the base sequence of oligonucleotide designed to function as a primer for amplifying human PPARα cDNA fragment.

　〔配列番号：９〕ＰＣＲにより増幅されたヒトＰＰＡＲα ｃＤＮＡフラグメントを検出するための蛍光発生プローブとして機能すべく設計されたオリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。 [SEQ ID NO: 9] This shows the base sequence of an oligonucleotide designed to function as a fluorescence-producing probe for detecting a human PPARα cDNA fragment amplified by PCR.

　本願明細書において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclatureによる略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を次に挙げる。塩基 In the specification of the present application, bases, amino acids and the like are indicated by abbreviations based on the abbreviations by the IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature or commonly used abbreviations in the art, and examples thereof are as follows.

　ＤＮＡ　　　　　：デオキシリボ核酸
　ｃＤＮＡ　　　　：相補的デオキシリボ核酸
　　Ａ　　　　　　：アデニン
　　Ｔ　　　　　　：チミン
　　Ｇ　　　　　　：グアニン
　　Ｃ　　　　　　：シトシン
　ＲＮＡ　　　　　：リボ核酸
　ｍＲＮＡ　　　　：メッセンジャーリボ核酸
　ｄＡＴＰ　　　　：デオキシアデノシン三リン酸
　ｄＴＴＰ　　　　：デオキシチミジン三リン酸
　ｄＧＴＰ　　　　：デオキシグアノシン三リン酸
　ｄＣＴＰ　　　　：デオキシシチジン三リン酸
　ＡＴＰ　　　　　：アデノシン三リン酸
　ＥＤＴＡ　　　　：エチレンジアミン四酢酸
　ＳＤＳ　　　　　：ドデシル硫酸ナトリウム
　Ｇｌｙ：グリシン
　Ａｌａ　：アラニン
　Ｖａｌ　：バリン
　Ｌｅｕ　：ロイシン
　Ｉｌｅ：イソロイシン
　Ｓｅｒ：セリン
　Ｔｈｒ　：スレオニン
　Ｃｙｓ：システイン
　Ｍｅｔ：メチオニン
　Ｇｌｕ：グルタミン酸
　Ａｓｐ：アスパラギン酸
　Ｌｙｓ：リジン
　Ａｒｇ：アルギニン
　Ｈｉｓ：ヒスチジン
　Ｐｈｅ：フェニルアラニン
　Ｔｙｒ：チロシン
　Ｔｒｐ：トリプトファン
　Ｐｒｏ：プロリン
　Ａｓｎ：アスパラギン
　Ｇｌｎ：グルタミン
　ｐＧｌｕ　　　　：ピログルタミン酸
　Ｍｅ　　　　　　：メチル基
　Ｅｔ　　　　　　：エチル基
　Ｂｕ　　　　　　：ブチル基
　Ｐｈ　　　　　　：フェニル基
　ＴＣ　　　　　　：チアゾリジン−４（Ｒ）−カルボキサミド基
　以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明がこれらに限定されないことは言うまでもない。 DNA: deoxyribonucleic acid cDNA: complementary deoxyribonucleic acid A: adenine T: thymine G: guanine C: cytosine RNA: ribonucleic acid mRNA: messenger ribonucleic acid dATP: deoxyadenosine triphosphate dTTP: deoxythymidine triphosphate dGTP: deoxyguanosine triphosphate Phosphate dCTP: Deoxycytidine triphosphate ATP: Adenosine triphosphate EDTA: Ethylenediaminetetraacetic acid SDS: Sodium dodecyl sulfate Gly: Glycine Ala: Alanine Val: Valine Leu: Leucine Ile: Isoleucine Ser: Serine Thr: Threin Crythine : Methionine Glu: Glutamic acid Asp: Aspartic acid Lys: Lysine Ar g: Arginine His: Histidine Phe: Phenylalanine Tyr: Tyrosine Trp: Tryptophan Pro: Proline Asn: Asparagine Gln: Glutamine pGlu: Pyroglutamic acid Me: Methyl group Et: Ethyl group Bu: Thi butyl group Thi: Pthyl group Thi: Buth group R) -Carboxamide group Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to Examples, but it goes without saying that the present invention is not limited thereto.

ＰＰＡＲαベクター構築
　肝臓での導入遺伝子の高発現に必要なhSAP（human serum amyloid P component）プロモーターをPCRによりクローニングした。GENBANKヒトゲノムデータよりhSAPは第一番染色体上に存在することが公知である。cDNA配列とのホモロジーサーチにより5’上流域が特定できたため、文献（J. Biol. Chem., 111, 736, 1992; Dev. Genet., 10, 336, 1989）で使用されているプロモーター領域のゲノム配列をもとにプライマーSA1（5’-ACTGAGTAGAAGTAGCAGAA-3’（配列番号：３））およびSA4（5’-CAGCGGCTTGTTCATATTCC-3’（配列番号：４））を設計し、開始コドンに隣接するHindIII-AvrII断片0.67Kbpを、PCR（宝酒造：Ex Taq DNA polymerase使用；94℃、2分間処理後、94℃、0.5分、60℃、0.5分、68℃　1分を30サイクル）で増幅し、得られた断片をpCR2.1ベクター（invitrogen社）にTA cloning（invitrogen社）法にてクローニングしてシーケンスの確認を行った。4クローンの解析を行い、塩基置換のないクローン1個を取得した（プラスミド名：pCR2.1-SA4）。 Construction of PPARα Vector The hSAP (human serum amyloid P component) promoter required for high expression of the transgene in the liver was cloned by PCR. It is known from the GENBANK human genome data that hSAP exists on the first chromosome. Since the 5 'upstream region was identified by homology search with the cDNA sequence, the promoter region used in the literature (J. Biol. Chem., 111, 736, 1992; Dev. Genet., 10, 336, 1989) was identified. Based on the genomic sequence, primers SA1 (5'-ACTGAGTAGAAGTAGCAGAA-3 '(SEQ ID NO: 3)) and SA4 (5'-CAGCGGCTTGTTCATATTCC-3' (SEQ ID NO: 4)) were designed, and HindIII adjacent to the start codon was designed. -The AvrII fragment 0.67 Kbp was amplified by PCR (Takara Shuzo: Ex Taq DNA polymerase; treated at 94 ° C for 2 minutes, followed by 30 cycles of 94 ° C, 0.5 minutes, 60 ° C, 0.5 minutes, 68 ° C 1 minute for 30 minutes). The obtained fragment was cloned into a pCR2.1 vector (invitrogen) by the TA cloning (invitrogen) method to confirm the sequence. Four clones were analyzed and one clone without base substitution was obtained (plasmid name: pCR2.1-SA4).

　次に、宿主哺乳動物細胞における高発現に必要なrabbit β-globinエンハンサーのクローニングを以下の方法で行った。ウサギの血液より調製したゲノムDNAを鋳型にし、5’末端に発現ベクター構築用の制限酵素サイトを付加したプライマーBG2（5'-TCCTAGGTGAGAACTTCAGGGTGAGTTTG-3'（配列番号：５）；AvrIIサイトが付加されたもの）およびBG3（5'-CGGTACCTTTGCCAAAATGATGAGACAGC-3'（配列番号：６）；KpnIサイトが付加されたもの）を用いてPCR（宝酒造：Ex Taq DNA polymerase使用；94℃、2分間処理後、94℃、0.5分、60℃、0.5分、72℃　1分を30サイクル）を行ない、増幅されたエンハンサー領域約640bpを得た。増幅断片をpCR2.1-TOPOベクターにTA cloning（invitrogen社）し、8クローンについてシーケンスの確認（ABI社 BigDye Terminator使用）を行った。 8クローンのシーケンス解析結果をエンハンサー配列と比較した結果、ほぼ既知の配列と一致したのでPCRテンプレートのウサギゲノム由来のものであると判断された。クローニング Next, cloning of the rabbit β-globin enhancer required for high expression in host mammalian cells was performed by the following method. A primer BG2 (5'-TCCTAGGTGAGAACTTCAGGGTGAGTTTG-3 '(SEQ ID NO: 5); an AvrII site was added to a genomic DNA prepared from rabbit blood as a template and to which a restriction enzyme site for expression vector construction was added at the 5' end). PCR (Takara Shuzo: using Ex Taq DNA polymerase; 94 ° C., 2 minutes, 94 ° C.) using BG3 (5′-CGGTACCTTTGCCAAAATGATGAGACAGC-3 ′ (SEQ ID NO: 6); KpnI site added). , 0.5 minutes, 60 ° C, 0.5 minutes, 72 ° C for 1 minute for 30 cycles) to obtain an amplified enhancer region of about 640 bp. The amplified fragment was subjected to TA cloning (invitrogen) into the pCR2.1-TOPO vector, and the sequence of 8 clones was confirmed (using BigDye Terminator from ABI). As a result of comparing the sequence analysis results of the eight clones with the enhancer sequence, they almost agreed with the known sequence, and thus it was determined that the PCR template was derived from the rabbit genome.

　PPARα cDNAはpMCMV-neo-hPPARα（Biochem. Biophys. Res. Commun., 278: 704-711 (2000)）より切り出した1.4Kbp KpnI-SalI断片を使用した。SV40 polyAはpTB399（R. Sasadaら、Cell Structure and Function, 12：205, 1987）由来のpolyA付加シグナルを含むBglIIからHindIIIまでの断片をpSP73（stratagene社）にクローニングし、BglIIサイトにSalIリンカーを付与後、0.27Kbp のSalI-HindIII断片として使用した。 As the PPARα cDNA, a 1.4 Kbp KpnI-SalI fragment cut out from pMCMV-neo-hPPARα (Biochem. Biophys. Res. Commun., 278: 704-711 (2000)) was used. For SV40 polyA, a fragment from BglII to HindIII containing a polyA addition signal derived from pTB399 (R. Sasada et al., Cell Structure and Function, 12: 205, 1987) is cloned into pSP73 (stratagene), and a SalI linker is added to the BglII site. After the addition, it was used as a 0.27 Kbp SalI-HindIII fragment.

　発現ベクターの構築にあたり、最初pCR2.1-SA4のAvrII-KpnIサイトにpCR2.1-enh5より回収したAvrII-KpnI断片をTakara ligation kit（宝酒造）を用いてライゲーションし、プロモーターとエンハンサーが入ったpCR2.1-SAPENH1を作製した。一方、pBluescriptII KS-（stratagene）のKpnI-HindIIIサイトにpMCMV-neo-hPPARαより調製した約1.4KbpのhPPARα cDNAと約0.27KbpのSV40 polyA断片（R. Sasadaら、Cell Structure and Function, 12： 205, 1987）をライゲーションし、cDNAとpolyAが入ったpKS-PPARpolyA1を作製した。その後、pBluescriptII KS-（stratagene）のNotIサイトにpCR2.1-SAPENH1より回収したNotI-KpnI断片（約1.3Kbp）とpMCMV-neo-hPPARαより回収したKpnI-NotI断片（約1.7Kbp）をライゲーションし、発現ベクターの構築を完了した（プラスミド名：pKS-SEPP2；本プラスミドを大腸菌JM109株にクローニングした形質転換体（Escherichia coli JM109/pKS-SEPP2）はFERM BP-8151の受託番号を付され、平成１４年８月１４日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒305-8566 茨城県つくば市東1-1-1 中央第6）に寄託されている。）。トランスジェニックマウス作製のため使用されるインジェクション断片はNotI切断により切り出され、サイズは約3.0Kbpである（図１）。 In constructing the expression vector, the AvrII-KpnI fragment recovered from pCR2.1-enh5 was first ligated to the AvrII-KpnI site of pCR2.1-SA4 using Takara ligation kit (Takara Shuzo), and pCR2 containing the promoter and enhancer was inserted. .1-SAPENH1 was prepared. On the other hand, an approximately 1.4 Kbp hPPARα cDNA prepared from pMCMV-neo-hPPARα and an approximately 0.27 Kbp SV40 polyA fragment (R. Sasada et al., Cell Structure and Function, 12: 205) were added to the KpnI-HindIII site of pBluescriptII KS- (stratagene). , 1987) to produce pKS-PPARpolyA1 containing cDNA and polyA. Thereafter, the NotI site of pBluescriptII KS- (stratagene) was ligated to the NotI-KpnI fragment (about 1.3 Kbp) recovered from pCR2.1-SAPENH1 and the KpnI-NotI fragment (about 1.7 Kbp) recovered from pMCMV-neo-hPPARα. The construction of the expression vector was completed (plasmid name: pKS-SEPP2; the transformant obtained by cloning this plasmid into Escherichia coli JM109 strain (Escherichia coli JM109 / pKS-SEPP2) was assigned the accession number of FERM BP-8151, and It has been deposited on August 14, 2014 with the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST) at the Patent Organism Depositary Center (No. 6, 1-1-1 Higashi 1-1-1 Tsukuba, Ibaraki Prefecture, 305-8566). The injection fragment used to generate the transgenic mouse is cut out by NotI digestion and has a size of about 3.0 Kbp (FIG. 1).

ヒトＰＰＡＲαを導入したトランスジェニックマウスの作製
　採卵用雌マウス（C57BL/6J系統、9〜13週齢）に5IUのPMSGを腹腔内投与し、12時間明期／12時間暗期の飼育室で2日間飼育後、5IUのhCGを腹腔内投与して雄マウス（C57BL/6J系統、15〜20週齢）と交配させた。別途、自然発情している受胚用雌マウス（ICR系統、９〜20週齢）を精管結紮雄マウス（ICR系統、15〜20週齢）と交配させた。翌日、膣栓形成により交尾を確認した採卵用雌マウスの腹腔を開いて卵管を取り出し、M2培地中、実体顕微鏡下にピンセットで受精卵を取り出した。卵丘細胞がとれた受精卵をピペットで吸い上げ、ミネラルオイルで覆われたM16培地のドロップ中に入れて、インジェクションするまでの間37℃、5% CO₂下で２時間培養した。 Production of Transgenic Mice Transfected with Human PPARα 5 mg of PMSG was intraperitoneally administered to an egg-collecting female mouse (C57BL / 6J strain, 9 to 13 weeks of age). After breeding for 5 days, 5IU of hCG was intraperitoneally administered and crossed with male mice (C57BL / 6J strain, 15 to 20 weeks old). Separately, a female mouse for embryo transfer (ICR strain, 9 to 20 weeks old) having a spontaneous estrus was mated with a vasectomized male mouse (ICR strain, 15 to 20 weeks old). On the next day, the abdominal cavity of the female mouse for egg collection whose copulation was confirmed by vaginal plug formation was opened, the oviduct was taken out, and the fertilized egg was taken out with a forceps under a stereoscopic microscope in M2 medium. The fertilized eggs from which the cumulus cells were removed were pipetted up, placed in a drop of M16 medium covered with mineral oil, and cultured at 37 ° C., 5% CO ₂ for 2 hours until injection.

　受精卵をミネラルオイルで覆われたM2培地のドロップ中に入れてホールディングピペットで吸引固定した。実施例１で調製したインジェクション断片溶液（0.3〜1.0μg/ml）をインジェクションピペットに吸引し、実体顕微鏡下にインジェクションピペットを受精卵の雄性前核に突き刺し、インジェクション断片を注入した。インジェクション終了後、受精卵をミネラルオイルで覆われたM2培地のドロップ中に入れて、受胚用雌への移植までの間37℃、5% CO₂下で培養した。 The fertilized eggs were placed in a drop of M2 medium covered with mineral oil and suction-fixed with a holding pipette. The injection fragment solution (0.3 to 1.0 μg / ml) prepared in Example 1 was sucked into an injection pipette, and the injection pipette was pierced into the male pronucleus of a fertilized egg under a stereoscopic microscope, and the injection fragment was injected. After the injection was completed, the fertilized eggs were placed in a drop of M2 medium covered with mineral oil, and cultured at 37 ° C. under 5% CO ₂ until transplantation to an embryo-bearing female.

　膣栓形成により偽妊娠状態を確認した受胚用雌マウスをネンブタールで麻酔後、後背部を切開して脂肪塊をピンセットで摘まんで引き出し、クレンメで固定した。実体顕微鏡下に卵巣嚢をピンセットで引き裂き、各卵管当たり10〜15個の受精卵をトランスファーピペットを用いて卵管開口部に注入した。卵巣と卵管を体内に戻して切り口を縫合した後、12時間明期／12時間暗期の飼育室で飼育を続けた。胚移植から21日後に仔マウス（F₀）が産まれた。仔マウスへの導入DNAの伝達は、尾部を1cm程度ハサミで切り取り、該組織抽出液から常法によりDNAを単離してPCR法により確認した。 After the pseudopregnant female mouse whose pseudopregnancy was confirmed by vaginal plug formation was anesthetized with Nembutal, the back was incised, the fat mass was pinched with forceps, pulled out, and fixed with clamp. Under a stereoscopic microscope, the ovarian sac was torn with forceps, and 10 to 15 fertilized eggs for each fallopian tube were injected into the fallopian tube opening using a transfer pipette. After returning the ovaries and fallopian tubes to the body and suturing the cuts, the animals were kept in a breeding room in a 12-hour light / 12-hour dark period. Pups (F ₀ ) were born 21 days after embryo transfer. Transmission of the introduced DNA to the offspring mouse was confirmed by cutting the tail with scissors of about 1 cm, isolating DNA from the tissue extract by a conventional method, and performing PCR.

　導入DNAの伝達が確認されたF₀個体は、生殖可能になった段階でC57BL/6Jマウスと交配させて産仔（F₁）を得た。上記と同様に導入DNAの伝達を確認し、導入DNAを有するF₁個体同士を(兄妹)交配させ、導入DNAに関してホモ接合体を得た。 F ₀ individuals transfer introduced DNA was confirmed to obtain offspring (F ₁₎ by mating with C57BL / 6J mice at a stage became fertile. Check the transmission of the same manner as described above introduced DNA, introduced DNA is F ₁ individuals each other (siblings) mating with to give homozygous for the introduced DNA.

トランスジェニックマウスの遺伝子発現解析
　実施例２において得られたトランスジェニックマウスのヒトＰＰＡＲαの発現程度を調べるため、得られた5〜6週齢トランスジェニックマウスから肝臓を採取し、アイソジェン（ニッポンジーン社製）を使用してtotal RNAを抽出した。次に、RNase-free DNase set（キアゲン社製）およびRNeasy Mini Kit（キアゲン社製）により精製したtotal RNAをもとにキットTaqMan Transcription Reagents（アプライドバイオシステムズ社製）を用いた逆転写反応によりcDNAを調製した。Real-time PCR（TaqMan PCR）のためのプライマーとしては5’-CGCCAGCACGGACGA-3’（配列番号：７）および5’-TTGTCCCCACATATTCGACACTC-3’（配列番号：８）を用い、FAM（fluorescent 5-carboxyfluorescein）標識TaqManプローブとしては5’-CCCCCGGCAGTGCCCTGAA-3’（配列番号：９）を用いた。さらにTaqMan PCR Master Mix（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて、専用プレート中で各20μlのcDNAサンプルを鋳型としてReal-time PCR反応を行った。反応は、PCR装置7700シークエンスディテクター（アプライドバイオシステムズ社製）により、50℃、2分間；95℃、10分間処理後、95℃、15秒；60℃、1分のサイクルを40回行った。反応後、解析マニュアルに従ってデータ解析を行った。以上の定量の標準として同じcDNAサンプルを用いてTaqMan Rodent GAPDH Control Reagent（アプライドバイオシステムズ社製）を用いてGAPDH遺伝子発現の定量を行ってデータ値補正に用いた。実験の結果、トランスジェニックマウスの肝臓においてヒトＰＰＡＲαの発現が確認された。 Gene expression analysis of transgenic mouse To examine the expression level of human PPARα in the transgenic mouse obtained in Example 2, a liver was collected from the obtained 5 to 6-week-old transgenic mouse, and isogen (Nippon Gene) Was used to extract total RNA. Next, based on the total RNA purified by the RNase-free DNase set (Qiagen) and the RNeasy Mini Kit (Qiagen), the cDNA was subjected to a reverse transcription reaction using the kit TaqMan Transcription Reagents (Applied Biosystems). Was prepared. As primers for Real-time PCR (TaqMan PCR), 5'-CGCCAGCACGGACGA-3 '(SEQ ID NO: 7) and 5'-TTGTCCCCACATATTCGACACTC-3' (SEQ ID NO: 8) were used, and FAM (fluorescent 5-carboxyfluorescein) was used. 5) 5'-CCCCCGGCAGTGCCCTGAA-3 '(SEQ ID NO: 9) was used as a labeled TaqMan probe. Further, using TaqMan PCR Master Mix (manufactured by Applied Biosystems), a real-time PCR reaction was performed in a dedicated plate using 20 μl of each cDNA sample as a template. The reaction was carried out by a PCR apparatus 7700 sequence detector (manufactured by Applied Biosystems) at 50 ° C. for 2 minutes; at 95 ° C. for 10 minutes, and then 40 cycles of 95 ° C., 15 seconds; After the reaction, data analysis was performed according to the analysis manual. Using the same cDNA sample as a standard for the above quantification, GAPDH gene expression was quantified using TaqMan Rodent GAPDH Control Reagent (manufactured by Applied Biosystems) and used for data value correction. As a result of the experiment, expression of human PPARα was confirmed in the liver of the transgenic mouse.

ＰＰＡＲαホモ欠損マウスとの交配
　実施例２において作製されたヒトＰＰＡＲαホモTgマウスとＰＰＡＲαホモ欠損マウス（Jackson研究所、米国）とを交配させて産仔を得る。マウス産仔の尾からDNAを抽出してサザン解析を行ない、ヒトＰＰＡＲαおよびノックアウトされたマウスＰＰＡＲα遺伝子欠損部分が全ての産仔から検出された親マウスを、ヒトＰＰＡＲαヘテロTg・マウスＰＰＡＲαヘテロ欠損マウスとして選択する。次にその雌雄同士を交配させる。遺伝子判定を同様の方法で行ってヒトＰＰＡＲαが2コピーおよびノックアウトされたマウスＰＰＡＲα遺伝子の欠損部分のみが確認されるマウスをヒトＰＰＡＲαホモTg・マウスＰＰＡＲαホモ欠損マウスとして選択する。 Mating with PPARα homo-deficient mouse The human PPARα homo-Tg mouse prepared in Example 2 is mated with a PPARα homo-deficient mouse (Jackson Laboratory, USA) to obtain a litter. DNA was extracted from the tail of the offspring of mice, Southern analysis was performed, and parental mice in which human PPARα and the knocked out mouse PPARα gene-deficient portion were detected from all offspring were used as human PPARα heterozygous Tg / mouse PPARα heterodeficient mice. Select as Next, the male and female are crossed. Gene determination is performed in the same manner, and a mouse in which only the deletion of the mouse PPARα gene in which two copies of human PPARα and knockout are confirmed is selected as a human PPARα homo-Tg / mouse PPARα homo-deficient mouse.

各種高脂血症（動脈硬化）モデルマウスとの交配
(1) apoEホモ欠損マウスとの交配
　実施例２において作製されたヒトＰＰＡＲαホモTgマウスと高脂血症（動脈硬化）疾患モデルであるapoEホモ欠損マウス（Jackson研究所、米国；C57BL/6Jを遺伝的背景とする）とを交配させて得られる産仔の雌雄同士を交配させる。得られるマウス産仔の尾から上記と同様にしてDNAを抽出してサザン解析を行ない、ヒトＰＰＡＲαのDNAおよびノックアウトされたapoE遺伝子が全ての産仔から検出された親マウスを、ヒトＰＰＡＲαヘテロTg・apoEヘテロ欠損マウスとして選択する。次にその雌雄同士を交配させる。遺伝子判定を同様の方法で行ってヒトＰＰＡＲαが2コピーおよびノックアウトされたapoE遺伝子の欠損部分のみが確認されたマウスをヒトＰＰＡＲαホモTg・apoEホモ欠損マウスとして選択する。
(2) LDL受容体ホモ欠損マウスとの交配
　実施例２において作製されたヒトＰＰＡＲαホモTgマウスと高脂血症（動脈硬化）疾患モデルであるLDL受容体ホモ欠損マウス［武田薬品工業株式会社において作製されたマウス（特開平10-56915号公報に記載）、あるいはJackson研究所で保存されているマウス、米国；いずれもC57BL/6Jを遺伝的背景とする］とを交配させて産仔を得る。得られるマウス産仔の尾から上記と同様にしてDNAを抽出してサザン解析を行ない、ヒトＰＰＡＲαのDNAおよびノックアウトされたLDL受容体遺伝子が全ての産仔から検出された親マウスを、ヒトＰＰＡＲαヘテロTg・LDL受容体ヘテロ欠損マウスとして選択する。次にその雌雄同士を交配させる。遺伝子判定を同様の方法で行ってヒトＰＰＡＲαが2コピーおよびノックアウトされたLDL受容体遺伝子の欠損部分のみが確認されたマウスをヒトＰＰＡＲαホモTg・LDL受容体ホモ欠損マウスとして選択する。
(3) ヒトapoA-IホモTgマウスとの交配
　実施例２において作製されたヒトＰＰＡＲαホモTgマウスと高脂血症（動脈硬化）疾患モデルであるヒトapoA-IホモTgマウス（Jackson研究所、米国；C57BL/6Jを遺伝的背景とする）とを交配させて得られる産仔の雌雄同士を交配させる。得られるマウス産仔の尾から上記と同様にしてDNAを抽出してサザン解析を行ない、ヒトＰＰＡＲαのDNAおよびヒトapoA-Ｉ遺伝子が全ての産仔から検出された親マウスを、ヒトＰＰＡＲα・ヒトapoA-ＩヘテロTgマウスとして選択する。次にその雌雄同士を交配させる。得られた産仔の遺伝子判定を同様の方法で行ってヒトPPARαおよびヒトapoA-Ｉがそれぞれ2コピー確認されたマウスをヒトＰＰＡＲα・ヒトapoA-ＩホモTgマウスとして選択する。
(4) さらに、上記(1)〜(3)のそれぞれにおいて、実施例２で作製されたヒトＰＰＡＲαホモTgマウスの代わりに、実施例４において作製されたヒトＰＰＡＲαホモTg・マウスＰＰＡＲαホモ欠損マウスを用いて、同様の手順によりapoEホモ欠損マウス、LDL受容体ホモ欠損マウスおよびヒトapoA-I Tgマウスとそれぞれ交配させる。 Mating with various hyperlipidemia (arteriosclerosis) model mice
(1) Mating with apoE homo-deficient mouse The human PPARα homo-Tg mouse prepared in Example 2 and an apoE homo-deficient mouse which is a hyperlipidemia (arteriosclerosis) disease model (Jackson Institute, USA; C57BL / 6J (Genetic background). DNA was extracted from the tail of the obtained mouse offspring in the same manner as described above and subjected to Southern analysis. The parent mouse in which the DNA of human PPARα and the knocked out apoE gene were detected from all offspring was replaced with a human PPARα heterologous Tg. -Select as apoE hetero-deficient mice. Next, the male and female are crossed. Gene determination is performed in the same manner, and mice in which only two copies of human PPARα and the knocked out apoE gene deficient portion have been confirmed are selected as human PPARα homo Tg / apoE homo deficient mice.
(2) Mating with homozygous mice deficient in LDL receptor Human PPARα homo Tg mouse prepared in Example 2 and homozygous LDL receptor deficient mouse which is a hyperlipidemia (arteriosclerosis) disease model [Takeda Pharmaceutical Co., Ltd. Litters are obtained by crossing the produced mice (described in JP-A-10-56915), or mice stored in the Jackson Laboratory, the United States; C57BL / 6J is used as a genetic background. . DNA was extracted from the tail of the obtained mouse offspring in the same manner as described above, and Southern analysis was performed. The parent mouse in which the DNA of human PPARα and the knocked out LDL receptor gene were detected from all offspring was replaced with human PPARα. Select as heterozygous Tg / LDL receptor heterozygous mice. Next, the male and female are crossed. Gene determination is performed in the same manner, and a mouse in which only a copy of the LDL receptor gene in which two copies of human PPARα and knockout have been confirmed has been confirmed is selected as a human PPARα homo-Tg / LDL receptor homo-deficiency mouse.
(3) Mating with a human apoA-I homo-Tg mouse The human PPARα homo-Tg mouse prepared in Example 2 and a human apoA-I homo-Tg mouse which is a hyperlipidemia (arteriosclerosis) disease model (Jackson Institute, US; C57BL / 6J is used as the genetic background). DNA was extracted from the tail of the obtained mouse offspring in the same manner as described above, and Southern analysis was performed. The parent mouse in which the DNA of human PPARα and the human apoA-I gene were detected from all offspring was replaced with human PPARα / human Select as apoA-I heterologous Tg mice. Next, the male and female are crossed. The gene of the obtained offspring is determined in the same manner, and a mouse in which two copies of human PPARα and two copies of human apoA-I are confirmed is selected as a human PPARα / human apoA-I homo-Tg mouse.
(4) Further, in each of the above (1) to (3), instead of the human PPARα homo Tg mouse prepared in Example 2, the human PPARα homo Tg / mouse PPARα homo deficient mouse prepared in Example 4 And homozygous apoE-deficient mice, LDL receptor homo-deficient mice, and human apoA-I Tg mice by the same procedure.

　本発明の遺伝子導入非ヒト哺乳動物は、該異種ＰＰＡＲαに対しては作用するが、該非ヒト哺乳動物の内因性ＰＰＡＲαに対しては作用しないＰＰＡＲα作動薬もしくは拮抗薬の薬効をインビボで評価し得る動物モデルであり、当該動物モデルを用いることにより、ＰＰＡＲαの活性調節が関与する各種疾患の予防・治療薬の開発において有用なスクリーニング方法を提供することができる。 The transgenic non-human mammal of the present invention acts on the heterologous PPARα, but does not act on the endogenous PPARα of the non-human mammal, and can evaluate the efficacy of a PPARα agonist or antagonist in vivo. This is an animal model, and by using the animal model, it is possible to provide a screening method useful in the development of a preventive / therapeutic drug for various diseases in which PPARα activity regulation is involved.

ヒトＰＰＡＲα発現ベクターｐＫＳ−ＳＥＰＰ２の制限酵素地図を示す図である。図中の矢印は転写方向を示す。It is a figure which shows the restriction map of the human PPAR (alpha) expression vector pKS-SEPP2. The arrow in the figure indicates the transfer direction.

配列番号：３
　ヒトＳＡＰプロモーターを増幅するためのプライマーとして機能すべく設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号：４
　ヒトＳＡＰプロモーターを増幅するためのプライマーとして機能すべく設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号：５
　ウサギβ−グロビンエンハンサーを増幅するためのプライマーとして機能すべく設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号：６
　ウサギβ−グロビンエンハンサーを増幅するためのプライマーとして機能すべく設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号：７
　ヒトＰＰＡＲα ｃＤＮＡフラグメントを増幅するためのプライマーとして機能すべく設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号：８
　ヒトＰＰＡＲα ｃＤＮＡフラグメントを増幅するためのプライマーとして機能すべく設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号：９
　ＰＣＲにより増幅されたヒトＰＰＡＲα ｃＤＮＡフラグメントを検出するための蛍光発生プローブとして機能すべく設計されたオリゴヌクレオチド。 SEQ ID NO: 3
Oligonucleotides designed to function as primers for amplifying the human SAP promoter.
SEQ ID NO: 4
Oligonucleotides designed to function as primers for amplifying the human SAP promoter.
SEQ ID NO: 5
An oligonucleotide designed to function as a primer for amplifying rabbit β-globin enhancer.
SEQ ID NO: 6
An oligonucleotide designed to function as a primer for amplifying rabbit β-globin enhancer.
SEQ ID NO: 7
An oligonucleotide designed to function as a primer for amplifying a human PPARα cDNA fragment.
SEQ ID NO: 8
An oligonucleotide designed to function as a primer for amplifying a human PPARα cDNA fragment.
SEQ ID NO: 9
Oligonucleotides designed to function as fluorogenic probes for detecting human PPARα cDNA fragments amplified by PCR.

Claims

　異種ＰＰＡＲαをコードするＤＮＡを発現可能な状態で安定に保持し、且つ１以上の他の遺伝子改変を有する非ヒト哺乳動物またはその生体の一部。 (4) A non-human mammal or a part of a living body thereof, which stably holds a DNA encoding a heterologous PPARα in an expressible state and has one or more other genetic modifications.

　他の遺伝子改変の少なくとも１つが、ＰＰＡＲαの活性調節が関与する疾患と同一もしくは類似の病態を生じさせるものである、請求項１記載の動物またはその生体の一部。動物 The animal or a part of a living body thereof according to claim 1, wherein at least one of the other genetic alterations causes the same or similar disease state as a disease in which PPARα activity regulation is involved.

　他の遺伝子改変の少なくとも１つが、ＰＰＲＥを有するプロモーターの制御下にある外来ＤＮＡの導入である、請求項１記載の動物またはその生体の一部。動物 The animal or a part of its body according to claim 1, wherein at least one of the other genetic modifications is the introduction of a foreign DNA under the control of a promoter having a PPRE.

　異種ＰＰＡＲαがヒト由来ＰＰＡＲαである請求項１記載の動物またはその生体の一部。動物 The animal or a part of the living body thereof according to claim 1, wherein the heterologous PPARα is human-derived PPARα.

　異種ＰＰＡＲαが配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を有する請求項１記載の動物またはその生体の一部。 The animal or a part of the living body thereof according to claim 1, wherein the heterologous PPARα has the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.

　非ヒト哺乳動物が、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウスまたはラットである請求項１記載の動物またはその生体の一部。 {Circle around (2)} The animal or a part of the living body thereof according to claim 1, wherein the non-human mammal is a rabbit, dog, cat, guinea pig, hamster, mouse or rat.

　非ヒト哺乳動物がマウスである請求項１記載の動物またはその生体の一部。 The animal or a part of the living body according to claim 1, wherein the non-human mammal is a mouse.

　内因性ＰＰＡＲαを欠損するかわりに異種ＰＰＡＲαを発現させた動物である請求項１記載の動物またはその生体の一部。動物 The animal or a part of the living body thereof according to claim 1, which is an animal expressing a heterologous PPARα instead of deficient in endogenous PPARα.

　内因性ＰＰＡＲαを欠損する動物と、異種ＰＰＡＲαを発現する、該動物と同種の動物とを交配することにより得られうる、請求項８記載の動物またはその生体の一部。 The animal according to claim 8, which can be obtained by crossing an animal deficient in endogenous PPARα with an animal of the same species as the animal that expresses heterologous PPARα.

　内因性ＰＰＡＲαがマウス由来ＰＰＡＲαであり、異種ＰＰＡＲαがヒト由来ＰＰＡＲαである請求項８記載の動物またはその生体の一部。動物 The animal or a part of its living body according to claim 8, wherein the endogenous PPARα is mouse-derived PPARα, and the heterologous PPARα is human-derived PPARα.

　ＰＰＡＲαの活性調節が関与する疾患が、高脂血症、高トリグリセリド血症、混合型脂質異常症、低ＨＤＬ血症、動脈硬化症、末梢動脈閉塞症、間欠性跛行、壊疽、高血圧症、血栓症、虚血性心疾患、急性心筋梗塞、心不全、鬱血性心不全、不安定狭心症、ＰＴＣＡ後の再狭窄、ステント留置後の再狭窄、高フィブリノーゲン血症、心筋症、脳出血、一過性脳虚血発作、脳梗塞、脳卒中、慢性糸球体腎炎、糖尿病性腎症、腎動脈硬化症、皮膚炎、免疫不全、低血糖、低ケトン血症、脂肪肝、糖尿病、糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症、肥満、アルツハイマー病、貧血性低酸素症、性腺障害、肝臓癌、乳癌および子宮内膜炎からなる群より選択される１もしくは２以上の疾患である請求項２記載の動物またはその生体の一部。 Diseases associated with PPARα activity regulation include hyperlipidemia, hypertriglyceridemia, mixed dyslipidemia, hypoHDLemia, arteriosclerosis, peripheral arterial occlusion, intermittent claudication, gangrene, hypertension, thrombosis Disease, ischemic heart disease, acute myocardial infarction, heart failure, congestive heart failure, unstable angina, restenosis after PTCA, restenosis after stent placement, hyperfibrinogenemia, cardiomyopathy, cerebral hemorrhage, transient brain Ischemic attack, cerebral infarction, stroke, chronic glomerulonephritis, diabetic nephropathy, renal arteriosclerosis, dermatitis, immunodeficiency, hypoglycemia, hypoketemia, fatty liver, diabetes, diabetic neuropathy, diabetic The animal according to claim 2, which is one or more diseases selected from the group consisting of retinopathy, obesity, Alzheimer's disease, anemia hypoxia, gonadal disorder, liver cancer, breast cancer and endometritis. Part of.

　異種ＰＰＡＲαが、肝臓、心臓、腎臓、副腎、血管、消化管および脳からなる群より選択される１もしくは２以上の部位で特異的に発現することを特徴とする請求項１記載の動物またはその生体の一部。 The animal or the animal thereof according to claim 1, wherein the heterologous PPARα is specifically expressed at one or more sites selected from the group consisting of liver, heart, kidney, adrenal gland, blood vessel, digestive tract, and brain. Part of a living body.

　異種ＰＰＡＲαが、肝臓で特異的に発現することを特徴とする請求項１記載の動物またはその生体の一部。動物 The animal or a part of the living body thereof according to claim 1, wherein the heterologous PPARα is specifically expressed in the liver.

　請求項１記載の動物またはその生体の一部に被験物質を適用し、該物質の異種ＰＰＡＲαに対するアゴニストまたはアンタゴニスト活性を検定することを特徴とする異種ＰＰＡＲα作動薬または拮抗薬のスクリーニング方法。 A method for screening for a heterologous PPARα agonist or antagonist, which comprises applying a test substance to the animal or a part of the living body thereof according to claim 1, and assaying the substance for an agonistic or antagonistic activity against the heterologous PPARα.

　請求項３記載の動物またはその生体の一部に被験物質を適用し、該物質の異種ＰＰＡＲαに対するアゴニストまたはアンタゴニスト活性を、ＰＰＲＥを有するプロモーターの制御下にある外来ＤＮＡの発現を指標にして検定することを特徴とする、異種ＰＰＡＲα作動薬または拮抗薬のスクリーニング方法。 A test substance is applied to the animal or a part of the living body according to claim 3, and the agonist or antagonist activity of the substance against heterologous PPARα is assayed using the expression of a foreign DNA under the control of a promoter having PPRE as an index. A method for screening for a heterologous PPARα agonist or antagonist.

　請求項２記載の動物に被験物質を投与し、該動物におけるＰＰＡＲαの活性調節が関与する疾患と同一もしくは類似の病態に及ぼす該物質の効果を検定することを特徴とする、異種ＰＰＡＲαの由来する動物における該ＰＰＡＲαの活性調節が関与する疾患に対して予防・治療活性を有する物質のスクリーニング方法。

A test substance is administered to the animal according to claim 2, and the effect of the substance on the same or similar disease state as a disease associated with the regulation of PPARα activity in the animal is assayed. A method for screening a substance having a prophylactic / therapeutic activity against a disease associated with the regulation of PPARα activity in an animal.