JP2004135605A - 脂肪細胞分化関連遺伝子およびタンパク質 - Google Patents

Abstract

【課題】前駆脂肪細胞より脂肪細胞へ分化誘導開始後３時間目をピークとして６時間以内に発現される遺伝子とそれによりコードされるタンパク質を提供する事。
【解決手段】特定配列で表される塩基配列と同一もしくは少なくとも８０％の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、及び特定配列のポリヌクレオチドがコードするタンパク質であって、そのタンパク質の全長にわたり同一もしくは少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質。
【選択図】なし

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、脂肪細胞分化の初期に活性化するクローン１０４ポリヌクレオチド及びクローン１０４タンパク質に関し、さらには該クローン１０４タンパク質の抗体、アンタゴニスト、アゴニスト、およびこれらの製造、並びにこれらの物質を含有する医薬および診断薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
【０００３】
【特許文献１】
特開平８−３３３３９４
【非特許文献１】
【０００４】
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ　２５４，　２９９−３０５（１９９９）
栄養過剰による肥満は、糖尿病・高血圧・動脈硬化などの深刻な生活習慣病の最大の要因となっている。今後の生命科学・健康科学を考えるうえで、肥満の分子機構を解明することは必須の課題といえる。肥満に直接関わるのは脂肪細胞であり、脂肪細胞生成過程が解明されれば肥満の治療に直結する。近年の分子生物学の発展に伴い、脂肪細胞分化の機構が解明されつつある。そこにはキーとなる遺伝子群が存在し、これらが巧妙に情報をやり取りするネットワークを形成していることが知られている。
【０００５】
脂肪細胞分化過程は複雑なステップより成り、脂肪芽細胞（Ａｄｉｐｏｂｌａｓｔ）→前駆脂肪細胞（Ｐｒｅａｄｉｐｏｃｙｔｅ）→脂肪細胞（Ａｄｉｐｏｃｙｔｅ）へ分化する。培養細胞や遺伝子改変個体を用いた系などにより脂肪細胞分化に密接に関与する転写因子が、近年、明らかになりつつある。
【０００６】
ＰＰＡＲ　（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ　Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ，　ペルオキシソーム増殖剤応答性レセプター）　、Ｃ／ＥＢＰ（ＣＣＡＡＴ／Ｅｎｈａｎｃｅｒ−　Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｐｒｏｔｅｉｎ）ファミリー、及びＳＲＥＢＰ−１／ＡＤＤ１　（Ｓｔｅｒｏｌ　Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　Ｅｌｅｍｅｎｔ　Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　１　または　Ａｄｉｐｏｃｙｔｅ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔＦａｃｔｏｒ　１）は脂肪細胞の分化に最も重要な転写因子といわれている。
【０００７】
ＰＰＡＲは、ファミリーを形成していることが明らかにされ、その中でもＰＰＡＲγは脂肪細胞分化に特に重要であることが明らかになっている。すなわち、脂肪芽細胞や前駆脂肪細胞において、ＰＰＡＲγを強制的に発現させると脂肪細胞に分化することが明らかになっている。この結果は、ＰＰＡＲγが脂肪細胞の分化に重要な役割を担っていることを証明していると言える。
【０００８】
Ｃ／ＥＢＰもＰＰＡＲと同様にファミリーを形成しており、最近になって、Ｃ／ＥＢＰαがＰＰＡＲγと同じように脂肪細胞分化のマスターレギュレーターとして機能していることが明らかにされている。また、Ｃ／ＥＢＰβとＣ／ＥＢＰδは分化の初期に発現し、Ｃ／ＥＢＰαとＰＰＡＲγの発現を制御していると考えられている。
【０００９】
ＳＲＥＢＰ１／ＡＤＤ１は、脂肪細胞の分化を促進することが知られている一方、脂肪細胞の分化過程においてＰＰＡＲγのリガンド生成に関わっていることも明らかにされている。
【００１０】
前記３種類の転写因子群（ＰＰＡＲ、Ｃ／ＥＢＰ、ＳＲＥＢＰ１／ＡＤＤ１）が、クロストークすることにより分化過程が進行することが明らかになっている。
【００１１】
前記３種類の転写因子群は、脂肪細胞の分化の比較的初期から発現が上昇することが明らかにされており、複数の標的遺伝子の発現を制御するマスターレギュレーターと考えられている。これらの転写因子群を発現時期の面から見ると、Ｃ／ＥＢＰβとＣ／ＥＢＰδにおいて比較的初期に発現が増加することが知られている。しかし、前駆脂肪細胞より脂肪細胞へ分化する最も初期に、即ち、脂肪細胞分化誘導開始から３時間目をピークとして６時間以内に、どのような遺伝子が活性化されているかについてはほとんど明らかにされていない。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
前駆脂肪細胞より脂肪細胞へ分化する最も初期、即ち、脂肪細胞分化誘導開始６時間以内に活性化される遺伝子の発現の有無、その程度、遺伝子産物としてのタンパク質の有無、その量、発現している場所の特定、また、遺伝子の変異を分析することは、肥満のメカニズムを解明し、さらに肥満の進行状況を適切に把握し、肥満の予防あるいは治療に役立たせる上で極めて重要な要素となりうる。そのために、この遺伝子の特定ならびにこの遺伝子産物であるタンパク質を特定し、こうした遺伝子あるいはタンパク質を検出、あるいは測定することが望まれる。
【００１３】
そこで本発明は、前駆脂肪細胞より脂肪細胞へ分化誘導開始６時間以内に活性化される遺伝子を見出し、該遺伝子を含むベクター、該ベクターを保持する形質転換体、該形質転換体から生産されるタンパク質、該タンパク質に特異的な抗体、該タンパク質の製造方法、該タンパク質に対するアゴニストまたはアンタゴニスト、これらの化合物を含む医薬、診断薬を提供することを目的とする。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、前駆脂肪培養細胞株として周知のマウス３Ｔ３−Ｌ１細胞（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＣＣＬ−９２．１．）を用い、分化の最も初期の過程で遺伝子の発現の変動を解析するために、脂肪細胞分化誘導前と誘導３時間後においてサブトラクション法によるクローニングを行った。その結果、脂肪細胞分化誘導開始後３時間目をピークとして６時間以内に活性化される遺伝子として配列番号１で表される塩基配列のポリヌクレオチドが得られた。該ポリヌクレオチドをマウスのクローン１０４ヌクレオチドと呼ぶ。
【００１５】
即ち、本発明のポリヌクレオチドは、脂肪細胞分化に関連し且つ脂肪細胞分化誘導開始後３時間目をピークとして６時間以内に発現するタンパク質をコードするポリヌクレオチドである。
【００１６】
本明細書において、活性化とは、発現することあるいは発現が亢進することを意味する。
【００１７】
配列番号１で表されるマウスの塩基配列と相同性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドをｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／において検索したところ、相同性が認められる塩基配列は、本発明の出願時点において登録されていないことが分かった。
【００１８】
本発明のポリヌクレオチドは、好ましくは、配列番号１で表される塩基配列に対して同一、もしくは少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％の相同性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドであって、脂肪細胞分化誘導開始後３時間目をピークとして６時間以内に発現するタンパク質をコードし、且つ、脂肪細胞分化誘導開始後１２時間以内に活性化されるポリヌクレオチドである。
【００１９】
また、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１で表される塩基配列の番号６１から３６８１に対して同一もしくは少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％の相同性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドであって、脂肪細胞分化誘導開始後３時間目をピークとして６時間以内に発現するタンパク質をコードするポリヌクレオチドである。
【００２０】
配列番号１で表されるマウスの塩基配列のポリヌクレオチドに基づき、新規な塩基配列のヒトのポリヌクレオチドをホモロジーサーチにより推定して決定したので、該塩基配列を配列番号３に示す。
【００２１】
即ち、本発明のヒトのポリヌクレオチドは、配列番号３で表される塩基配列を含むポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドであって、脂肪細胞分化に関連するタンパク質をコードするポリヌクレオチドであり、例えば、ｃＤＮＡが挙げられる。該ポリヌクレオチドをヒトのクローン１０４ヌクレオチドと呼ぶ。本発明のポリヌクレオチドは、配列番号３で表される塩基配列に対して同一もしくは少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の相同性を有するポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドである。
【００２２】
また、本発明のヒトのポリヌクレオチドは、配列番号３で表される塩基配列の番号５８から３６６９を含むポリヌクレオチドに同一、少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の相同性を有するポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドである。または該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドであって、脂肪細胞分化に関連するタンパク質をコードするポリヌクレオチドである。
【００２３】
配列番号１で表されるマウスのクローン１０４ポリヌクレオチドと配列番号３で表されるヒトのクローン１０４ポリヌクレオチドとの一致率は、８２．４％（５６７８／６８９４）となる。
【００２４】
本発明の上記マウスのポリヌクレオチドは、脂肪細胞分化誘導開始後３時間目をピークとして６時間以内にマウスの細胞、その他の動物の細胞から抽出することができる。また、本発明のヒトのポリヌクレオチドはマウスのポリヌクレオチドと同様に脂肪細胞分化誘導開始後３時間目をピークとして６時間以内にヒトの細胞、その他の動物の細胞から抽出することができると推定される。また、ゲノムＤＮＡ、細胞・組織由来のｃＤＮＡ、細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡの何れからでも本発明のポリヌクレオチドを得ることができる。本発明の「ポリヌクレオチド」には、ＤＮＡまたはＲＮＡがある。
【００２５】
本明細書で単に「クローン」と呼ぶ場合には、クローン１０４ヌクレオチド又はクローン１０４ポリヌクレオチドを意味することがある。
【００２６】
本発明のマウスのタンパク質は、脂肪細胞分化誘導開始後３時間目をピークとして６時間以内に発現されるタンパク質である。
【００２７】
本発明のマウスのタンパク質は、好ましくは、下記配列番号２で表されるタンパク質のアミノ酸配列の全長に対して同一もしくは少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％の相同性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質である。さらに好ましくは、本発明のタンパク質は、配列番号１で表されるポリヌクレオチドの塩基配列の番号６１から３６８１に対して同一もしくは少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％の相同性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドの遺伝子翻訳産物である。
【００２８】
下記配列番号２で表されるタンパク質のアミノ酸配列と１００％の相同性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドには、マウスの脂肪細胞分化の初期に活性化されるタンパク質が挙げられる。該タンパク質をマウスのクローン１０４タンパク質と呼ぶ。
【００２９】
また、本発明のヒトのタンパク質は、配列番号４で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質である。さらに、本発明のタンパク質は、配列番号４で表されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％の相同性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質を含む。また、本発明のヒトのタンパク質は、下記配列番号３で表されるポリヌクレオチドの塩基配列の番号５８から３６６９を含むポリヌクレオチドの遺伝子翻訳産物である。本発明は配列番号３の観点から、配列番号４で表されるアミノ酸配列のタンパク質の全長に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含む該タンパク質またはその塩を含む。
【００３０】
下記配列番号４で表されるタンパク質は、ヒトの脂肪細胞分化に関連するタンパク質である。該タンパク質をヒトのクローン１０４タンパク質と呼ぶ。
【００３１】
本発明のポリヌクレオチドあるいは、該ポリヌクレオチドの遺伝子翻訳産物として生産されるタンパク質またはペプチドは、肥満、高血圧、高脂血症、糖尿病、動脈硬化による心臓病や脳卒中等から選ばれる生活習慣病の治療または診断の用途に期待される。
【００３２】
配列の相同性
本発明の別の発明において「塩基配列に対し少なくとも８０％」、或いは「アミノ酸配列に対して少なくとも８０％」とする理由は、マウスとヒトの間にはアミノ酸レベルで８４％の相同性があることが既に報告されているからである［Ｙ．Ｚｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ，　第３７２巻、第４２５頁（１９９４）、特開平８−３３３３９４号公報］。高血圧、糖尿病、肥満などの生活習慣病に関わる遺伝子群は相同性が動物間で８０％以上保存されていることが分かっている（特開平１１−７５８６５号公報）ことから、本発明のポリヌクレオチドおよび本発明のタンパク質においてもヒトなどの霊長類、ウサギなどの齧歯類なども本配列を基本とし、相同性が８０％以上を越えると考えることが妥当である。なお、配列番号１で表されるマウスのクローン１０４ポリヌクレオチドのうち塩基配列の番号６１から３６８１までのＯＲＦと配列番号３で表されるヒトのクローン１０４ポリヌクレオチドのうち塩基配列の番号５８から３６６９までのＯＲＦとの一致率は、８２．４％（５６７８／６８９４）である。
【００３３】
本発明のポリヌクレオチドのクローニング
本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドのクローニングの手段としては、例えば、本発明のタンパク質の部分塩基配列を有する合成ＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ法によって増幅するか、または適当なベクターに組み込んだＤＮＡを本発明のタンパク質の一部あるいは全領域をコードするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを用いて標識したものとのハイブリダイゼーションによって選別することができる。ハイブリダイゼーションの方法は、例えば、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　）２ｎｄ（Ｊ．　Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ．　Ｐｒｅｓｓ，　１９８９　）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。クローン化されたタンパク質をコードするＤＮＡは目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用することができる。該ＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。
【００３４】
ポリヌクレオチドを発現させるベクター等
本発明のベクターは、配列番号１で表されるポリヌクレオチドに対して同一もしくは少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％の相同性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドを含有させた組み換えベクターであり、好ましくは、配列番号１で表される塩基配列の番号６１から３６８１に対して同一もしくは少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％の相同性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドを含有させた組み換えベクターである。
【００３５】
また、ヒトの脂肪細胞分化に関するポリヌクレオチドを含有する本発明のベクターは、配列番号３で表される塩基配列に対して同一もくしは少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％の相同性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドを含有させた組み換えベクターであり、好ましくは、配列番号３で表される塩基配列の番号５８から３６６９の塩基配列に対して同一もしくは少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％の相同性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドを含有させた組み換えベクターである。
【００３６】
本発明のポリヌクレオチド配列を有するベクターは既知の方法で構築することが可能である。こうした目的に適したベクターは、本発明のポリヌクレオチドの挿入部位の上流にプロモーター領域を有する。このプロモーターは既知のものを使用することが可能であり、宿主細胞により選択することが可能である。例えば、宿主を大腸菌などの細菌にした場合は、ｌａｃプロモータ、ｔｒｐプロモータ、Ｔ７プロモータ、ｔａｃプロモータ、λＰＬプロモータなどを利用することが可能である。酵母を宿主とする場合には、ＧＡＰＤＨプロモータ、ＡＤＨプロモータ、ＰＧＫプロモータ、ＰＨ０５プロモータなどが挙げられる。動物由来の細胞を宿主とした場合には、ヒトサイトメガロウイルスプロモータ、ＳＶ４０ウイルス由来のプロモータ、ＥＦ−１αプロモータ、βアクチンプロモータ、メタロチオネインプロモータなどが挙げられる。本発明のポリヌクレオチドを発現するベクターにおける本発明のポリヌクレオチドの挿入部位下流には、転写終結シグナルがあることが望ましい。さらに、該ベクターには薬剤耐性マーカーなどの識別マーカーがあることが望ましい。
【００３７】
宿主
本発明で使用可能な宿主には、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などを用いることができる。
【００３８】
エシェリヒア属菌の具体例としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９〔ＡＴＣＣ５３３２３、東洋紡株式会社製〕、ＪＭ１０３〔ヌクイレック・アシッズ・リサーチ，（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ），９巻，３０９（　１９８１）　〕，Ｋ１２・ＤＨ１〔プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．ＵＳＡ），６０巻，１６０（　１９６８）　〕，ＪＡ２２１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ）〕，１２０巻，５１７（　１９７８）　〕，ＨＢ１０１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー，４１巻，４５９（　１９６９）　〕，Ｃ６００〔ジェネティックス（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），３９巻，４４０（　１９５４）　〕などが挙げられる。
【００３９】
バチルス属菌としては、例えば、バチルス・サブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ　）ＭＩ１１４〔ジーン，２４巻，２５５（　１９８３）　〕，２０７−２１〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　），９５巻，８７（　１９８４）　〕などが挙げられる。
【００４０】
酵母としては、例えば、サッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＨ２２，ＡＨ２２Ｒ−　，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ−１２、シゾサッカロマイセスポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ　）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３６、サッカロマイセスピキアパストリス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｉｃｊｉａｐａｓｔｏｒｉｓ　　）などが挙げられる。
【００４１】
昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡｃＮＰＶの場合は、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ　ｃｅｌｌ；Ｓｆ細胞）、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ　ｎｉ　の中腸由来のＭＧ１細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ　ｎｉ　の卵由来のＨｉｇｈ　ＦｉｖｅＴＭ　細胞、Ｍａｍｅｓｔｒａｂｒａｓｓｉｃａｅ由来の細胞またはＥｓｔｉｇｍｅｎａ　ａｃｒｅａ　由来の細胞などが挙げられる。ウイルスがＢｍＮＰＶの場合は、蚕由来株化細胞（Ｂｏｍｂｙｘ　ｍｏｒｉ　Ｎ　細胞；ＢｍＮ細胞）などが挙げられる。該Ｓｆ細胞としては、例えば、Ｓｆ９細胞（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ１７１１）、Ｓｆ２１細胞（以上、Ｖａｕｇｈｎ，　Ｊ．Ｌ．ら、イン・ヴィボ（ｉｎ　Ｖｉｖｏ　），１３，　２１３−２１７，（１９７７）　）などが挙げられる。
【００４２】
昆虫としては、例えば、カイコの幼虫などが挙げられる〔前田ら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），３１５巻，５９２（　１９８５）　〕。
【００４３】
動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ−７，Ｖｅｒｏ　，チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ細胞と略記），ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ〔略語：ＣＨＯ（ｄｈｆｒ−　）細胞〕，マウスＬ細胞，マウスＡｔＴ−２０，マウスミエローマ細胞，ラットＧＨ３，ヒトＦＬ細胞などが用いられる。
【００４４】
形質転換体の製造
本発明の形質転換体は、前記組み換えベクターを前記宿主に保持させたものである。
【００４５】
エシェリヒア属菌を形質転換するには、例えば、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンジイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．ＵＳＡ），６９巻，２１１０（　１９７２）　やジーン（Ｇｅｎｅ），１７巻，１０７（　１９８２）　などに記載の方法に従って行なうことができる。
【００４６】
バチルス属菌を形質転換するには、例えば、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　＆　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　），１６８巻，１１１（　１９７９）　などに記載の方法に従って行なうことができる。
【００４７】
酵母を形質転換するには、例えば、メッソズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　），１９４巻，１８２−１８７（１９９１）、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．ＵＳＡ），７５巻，１９２９（　１９７８）などに記載の方法に従って行なうことができる。
【００４８】
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、例えば、バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），６，　４７−５５（１９８８）　）などに記載の方法に従って行なうことができる。
【００４９】
動物細胞を形質転換するには、例えば、細胞工学別冊８新細胞工学実験プロトコール．２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行）、ヴィロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ），５２巻，４５６（　１９７３）　に記載の方法に従って行なうことができる。
【００５０】
形質転換体の培養
本発明の形質転換体の培養は以下の条件を考慮したタンパク質の生成に十分な条件下で、形質転換体を培養することができ、その結果、培地または形質転換体からタンパク質を回収することができる。
【００５１】
宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどが挙げられる。また、酵母、ビタミン類、生長促進因子などを添加してもよい。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。
【００５２】
エシェリヒア属菌を培養する際の培地としては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地〔ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ），ジャーナル・オブ・エクスペリメンツ・イン・モレキュラー・ジェネティックス（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），４３１−４３３，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　１９７２〕が好ましい。ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、例えば、３β−インドリルアクリル酸のような薬剤を加えることができる。宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行ない、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。
【００５３】
宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通気や撹拌を加えることもできる。宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、バークホールダー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ）最小培地〔Ｂｏｓｔｉａｎ，　Ｋ．　Ｌ．ら、「プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．ＵＳＡ），７７巻，４５０５（　１９８０）　〕や０．　５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地〔Ｂｉｔｔｅｒ，　Ｇ．　Ａ．　ら、「プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．ＵＳＡ），８１巻，５３３０（１９８４）〕が挙げられる。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
【００５４】
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、培地としては、Ｇｒａｃｅ’ｓ　Ｉｎｓｅｃｔ　Ｍｅｄｉｕｍ　（Ｇｒａｃｅ，　Ｔ．Ｃ．Ｃ．，ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），１９５，７８８（１９６２））に非動化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のｐＨは約６．２〜６．４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３〜５日間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
【００５５】
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地〔サイエンス（Ｓｅｉｅｎｃｅ　），１２２巻，５０１（　１９５２）　〕，ＤＭＥＭ培地〔ヴィロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ），８巻，３９６（　１９５９）　〕，ＲＰＭＩ１６４０培地〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル・アソシエーション（Ｔｈｅ　Ｊｏｕｎａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）１９９巻，５１９（　１９６７）　〕，１９９培地〔プロシージング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォー・ザ・バイオロジカル・メディスン（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｓｏｃｉｅｔｙ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　），７３巻，１（　１９５０）　〕などが用いられる。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０℃〜４０℃で約１５〜６０時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。以上のようにして、形質転換体の細胞内に本発明のタンパク質を生成せしめることができる。
【００５６】
無細胞系によるタンパク質生成
上述した形質転換体を培養することによってタンパク質を生成させる以外に、インビトロテック社（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｎｂｉｔｒｏｔｅｃｈ．ｃｏ．ｊｐ／）の高効率無細胞タンパク質合成システムやＲｏｃｈｅ社のインビトロトランスレーション・トランスクリプションシステムなどを用いた無細胞培養システムを用いることによって、当該タンパク質を生成させることも可能である。
【００５７】
タンパク質の分離精製
上記培養物から本発明のタンパク質を分離精製するには、例えば、下記の方法により行なうことができる。本発明のタンパク質を培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過によりタンパク質の粗抽出液を得る方法などが適宜用いられる。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどの蛋白質変性剤や、トリトンＸ−１００（登録商標、Ｕｎｉｏｎ　Ｃａｒｂｉｄｅ　社製）などの界面活性剤が含まれていてもよい。これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
【００５８】
上記各方法で得られるタンパク質が遊離体で得られた場合には、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に変換することができる。なお、組換え体が産生するタンパク質を、精製前または精製後に適当な蛋白修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することもできる。蛋白修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いられる。かくして生成する本発明のタンパク質またはその塩の存在は、標識したリガンドとの結合実験および特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセイなどにより測定することができる。
【００５９】
ヒトホモログの塩基配列及びアミノ酸配列
脂肪細胞分化誘導開始３時間目をピークとして６時間以内に活性化されるポリヌクレオチドであって、前記に決定した配列番号１で示されるマウスの全長ＤＮＡ配列をＮＣＢＩ　Ｇｅｎｏｍｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｏｍｅ　Ｄａｔａｂａｓｅ）でホモロジーサーチすることによって相同性の高い配列を見出して、ヒトホモログの全長を予測することができる。このようにして予測して配列決定を行ったヒトホモログの全長は、配列番号３で示される塩基配列である。また、配列番号３で示されるヒトホモログの全長の塩基配列において、塩基配列の番号５８から３６６９までのＯＲＦは、１２０４アミノ酸からなるタンパク質をコードする遺伝子であり、該タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号４であると予想される。本発明のヒトのクローン１０４ポリヌクレオチドは、マウスのクローン１０４ポリヌクレオチドと同様に、脂肪細胞分化誘導開始３時間目をピークとして６時間以内に活性化されると推定される。
【００６０】
ヒトホモログの相同性
配列番号３で表されるクローン１０４ヒトホモログ（単に、ヒトホモログと呼ぶときがある）の塩基配列と相同性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドは、前記したｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／には登録されていない。
【００６１】
アンタゴニストおよびアゴニストの同定方法
本発明のタンパク質をアンタゴナイズまたはアゴナイズする化合物の同定方法は次の工程（ａ）（ｂ）の工程を含む。
（ａ）本発明のタンパク質を発現している細胞または本発明のタンパク質に応答する細胞に候補化合物を接触させる工程；
（ｂ）結合、または機能的応答の刺激もしくは阻害を観察する工程；あるいは候補化合物と接触した細胞の本発明のタンパク質の活性に関する能力を接触しなかった同種の細胞と比較する工程。
【００６２】
上記同定方法により、本発明のアンタゴニスト或いはアゴニストを同定することができる。
【００６３】
ポリヌクレオチドの検出方法；ポリヌクレオチドによる診断
診断対象者の本発明のタンパク質の活性化に関連した、診断対象者における疾病、またはかかる疾病に対する感受性の診断は次のように行うことができる。即ち、診断対象者のゲノム中の本発明のタンパク質をコードしている塩基配列中の変異の存在または不存在を決定すること；および／または該対象者由来の試料中の本発明のタンパク質の存在または量を分析することにより行う。
【００６４】
本発明のポリヌクレオチドを検出あるいは測定するには、本発明のポリヌクレオチドの塩基配列から連続する８塩基以上１００塩基以下の配列を有するプライマーを合成し、細胞あるいは血液などからｍＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲ法によりｍＲＮＡをＤＮＡに変換しながら増幅する、あるいはＴ７−ｂａｓｅｄ　ｍＲＮＡ増幅法（Ｖａｎ　ＧｅｌｄｅｒＲ．Ｎ．ｅｔ　ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：１６６３−１６６７，１９９０）により、目的ポリヌクレオチドを増幅し、増幅されたポリヌクレオチドを種々の電気泳動で検出することが可能である。また、Ｃｙ３−ｄＵＴＰあるいは、Ｃｙ５−ｄＵＴＰをポリヌクレオチド増幅時に添加して、増幅ポリヌクレオチドを蛍光標識し、ＤＮＡチップまたはマイクロアレイ等（Ｂｒｏｗｎ，　Ｐ．Ｏ．ｅｔ　ａｌ．：Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔ．，２１　ｓｕｐ．：３３−３７，１９９９）により検出することも可能である。
【００６５】
また、抽出したｍＲＮＡの量を定量する方法としては、蛍光色素を用いた定量的ＰＣＲ法が行われる（Ｌｉｖａｋ，Ｋ．ｅｔ　ａｌ．：ＰＣＲ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ａｐｐｌｉｃ．，　４：３５７−３６２，１９９５）。この方法により、細胞中のｍＲＮＡがどの程度存在するかがわかる。この発現の程度によって、肥満の状況を把握することができる。
【００６６】
ＤＮＡチップまたはマイクロアレイ等を用いて、複数のポリヌクレオチドを同時に検出、測定することも可能である。例えば、糖尿病、高血圧、肥満などの生活習慣病に関連する、本発明のポリヌクレオチドを含む複数のポリヌクレオチドを基盤上に結合させておき、上述したような方法で、検体から調製した標識ポリヌクレオチドを反応させてどのポリヌクレオチドが活性化しているのか、存在しているのかということを判定することが可能となる。この判定によって、生活習慣病の状況を把握し、治療に役立てることが可能になる。また、本発明のポリヌクレオチドを含む複数の肥満関連ポリヌクレオチドを基盤上に結合させておき、同様の手技により、肥満の状況、程度を把握することが可能となり、治療に役立てることが可能となる。
【００６７】
また、本発明のポリヌクレオチドを検出するにはアプライドバイオシステム社のＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ３１０あるいはＰＲＩＳＭ３１００あるいはＰＲＩＳＭ３７００などを利用したキャピラリー電気泳動による検出も可能である。
【００６８】
ポリヌクレオチド中の特定の核酸塩基が他の塩基と置換されていることにより、遺伝子産物としてのタンパク質の活性が変化する、本発明のタンパク質のその受容体への結合能が変化する、或いは該タンパク質の薬剤に対しての反応性が変化する、或いは該タンパク質の安定性が変化する、或いは該タンパク質の合成が途中で停止してしまうなどの、遺伝子多型（塩基多型：ｓｉｎｇｌｅ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ　、以下ＳＮＰｓ）が、非常に重要であることがわかってきているが、本発明のポリヌクレオチドにおいても、このＳＮＰｓを検出する意義は非常に重要である。
【００６９】
本発明の脂肪細胞分化関連のポリヌクレオチドの高密度のＳＮＰマーカーの遺伝子地図がつくられれば，糖尿病の原因遺伝子を特定できるＳＮＰｓを用いて健康者と患者間の比較が容易にできる．高密度のＳＮＰマップを使えば家族と関連のない大規模なサンプルを用いて相関解析（Ｗｈｏｌｅ　Ｇｅｎｏｍｅ　Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ　Ｓｔｕｄｙ）が可能となる。ＳＮＰｓは、特に１塩基が置換することにより、対応するアミノ酸が変化し、この変化によって本来の蛋白質の物性の変化が生じる。例えば、酵素においては活性中心近傍のアミノ酸が変化することによる酵素活性の低下や亢進が挙げられ、受容体であれば受容中心近傍のアミノ酸が変化することによる結合力の低下や上昇が挙げられる。それぞれの人の遺伝子多型に応じて、薬剤の投与量を調整したり、異なる薬剤を選択することをテーラードメディシンなどと云われる。
【００７０】
本発明のポリヌクレオチドにおけるＳＮＰｓを検出する方法としては、例えば、アメリカＮａｎｏｇｅｎ　社（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎａｎｏｇｅｎ．ｃｏｍ）のｎａｎｏｃｈｉｐを用いる方法（Ｇｉｌｌｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ　ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　３６５−３７０　１７　１９９９）、ポリヌクレオチド配列を決定する方法（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．ｃｏｍ　）、ＤＮＡチップ又はＤＮＡアレイを用いた方法、質量分析計を用いる方法（Ｌｅｇｌｅｒら、　Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ，３６：４２６−４３１、１９９６　）、プライマーエクステンションを用いた方法、Ｌｕｍｉｎｅｘ法（Ｉａｎｎｏｎｅ　ら、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，３９：１３１−１４０，２０００　）などが適用可能である。
【００７１】
上記各ポリヌクレオチドの検出のために構成される診断薬は、配列番号１で表される塩基配列に対して同一もしくは少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の相同性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドを含有する診断薬である。好ましくは、配列番号１で表される塩基配列の番号６１から３６８１に対して同一もしくは少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の相同性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドを含有する診断薬である。
【００７２】
また、配列番号１で表される塩基配列に対して同一もしくは少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の相同性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチド或いは該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドのうち、連続する少なくとも１０個の塩基配列を有するポリヌクレオチドを含む診断薬としてもよい。好ましくは、配列番号１で表される塩基配列の番号６１から３６８１に対して同一もしくは少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の相同性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドのうち、連続する少なくとも１０個の塩基配列を有するポリヌクレオチドを含む診断薬とすることができる。
【００７３】
また、ヒトのポリヌクレオチドの検出の観点にたった診断薬は、配列番号３に表される塩基配列に対して同一もしくは少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の相同性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドを含有する診断薬である。好ましくは、配列番号３で表される塩基配列の番号５８から３６６９に対して同一もしくは少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の相同性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドを含有する診断薬である。
【００７４】
また、ヒトのポリヌクレオチドの検出の観点にたった診断薬は、配列番号３に表される塩基配列に対して同一もしくは少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の相同性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドのうち、連続する少なくとも１０個の塩基配列を有するポリヌクレオチドを含む診断薬である。好ましくは、配列番号３で表される塩基配列の番号５８から３６６９に対して同一もしくは少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の相同性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドのうち、連続する少なくとも１０個の塩基配列を有するポリヌクレオチドを含む診断薬である。
【００７５】
タンパク質またはペプチドの検出、およびタンパク質またはペプチドに対する抗体の検出、および診断への応用
本発明のタンパク質を検出するには、免疫測定法が一般的に用いられる。例えば、配列番号２または配列番号４で示されるタンパク質、あるいはそれらの各配列に含まれる３個以上の連続したアミノ酸配列からなるペプチドを、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ニワトリなどに免疫して抗体を産生させることができる。この免疫を行う際に、通常、アジュバントといわれる物質を加えるのが一般的である。アジュバントとしては、フロイントのコンプリートアジュバント、インコンプリートアジュバント、明礬など種々の公知のアジュバントを用いることができる。マウスを免疫した場合では、一定期間免疫を行った後、免疫したマウスの脾臓を取り出して、抗体産生細胞であるこの脾臓細胞とミエローマ細胞と融合させて、クローニングを行って配列番号２または配列番号４のタンパク質を特異的に結合する抗体を産生するハイブリドーマを調製する。
【００７６】
ハイブリドーマを培養することによって、産生する抗体を種々の方法で精製し、得られた抗体を固相に結合させる。これとは別に、該抗体を酵素、蛍光色素、金属コロイド、ラテックス、ＤＮＡ、ＲＮＡなどで標識して標識化抗体を得る。前記固相化抗体と該標識化抗体を、細胞、血液あるいはその分画フラクションを検体として反応させ、固相に結合した標識物の有無、あるいは量を測定することにより、検体中の本発明のタンパク質の量を測定することができる。
【００７７】
本発明のタンパク質は、脂肪細胞内に特異的に見出されるために、その量を測定することによって肥満の程度、状況を把握することが可能となる。
【００７８】
検体中に含まれる本発明のタンパク質の量を測定するには、該タンパク質あるいは該タンパク質の一部となるペプチドを抗原として、家兎、ネズミ、ヒツジ、ヤギなどに免疫して抗体を調製する（この場合、特定の認識部位に結合することが出来るモノクローナル抗体を調製することも含まれる。）。ここで得られた抗体を、ポリスチレン、ラテックス、ニトロセルロースなどの材質のものに物理的に吸着させる、あるいは、抗体にビオチンを予め導入しておき、固相に予め結合させておいたストレプトアビジンまたはアビジンなどと反応させて固相を調製する、あるいは、固相上に存在するカルボキシル基、アミノ基、スルフヒドリル基などを介して、抗体を共有結合させることにより、抗体結合固相を調製する。ここで得られた抗体結合固相と、細胞、血液あるいはその分画フラクションを検体として反応させ、検体中に含まれる抗原を固相に結合させ、次いで、抗体結合固相に結合した抗原に、上述した工程によって調製した抗体に、放射性同位元素、酵素、蛍光色素、核酸、ビオチンなどの標識を結合させた標識抗体を反応させる。なお、抗体結合固相と検体と標識抗体を反応させる工程は、同時に行うこともできる。こうして固相に結合した標識物を、測定することによって検体中に含まれる該タンパク質を測定することが出来る。
【００７９】
抗体を検出する方法は、これとは別に以下のような方法でも可能である。すなわち、本発明のタンパク質あるいは該タンパク質の一部となるペプチドを抗原として固相化して抗原固定化固相とし、次いで、該抗原固定化固相に対して、抗原に標識した物質と、細胞、血液あるいはその分画フラクションを検体として反応させ、結合した標識物を、定量することによって、検体中に含まれる抗体量を測定することができる。したがって、本発明のタンパク質に対して免疫学的に特異的な抗体を検出する診断薬を構築できる。
【００８０】
以上、いずれも抗原あるいは抗体を直接固相化した反応系を説明したが、米国特許第５，７８９，１６５のように、固相にオリゴヌクレオチドを結合させておき、このオリゴヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチドを結合させた抗原あるいは抗体を結合させた反応系も適用可能である。さらに、特開平１０−２５３６３２号公報、ＥＰ０９０５５１７Ａ１の記載にあるように、異なる項目を同時に検出あるいは測定することも可能となる。例えば、糖尿病、高血圧、肥満などの生活習慣病に関連するマーカーを同時に検出することにより、どのタンパク質がどの程度検出されるかによって生活習慣病がどの程度のレベルであるのかを判断することも可能になると考えられる。また、肥満関連のタンパク質あるいはペプチドなどのマーカーを同時に検出、測定することによって、肥満の状況を把握し治療に役立てることも可能になると考えられる。
【００８１】
本発明のタンパク質、あるいは該タンパク質に対する抗体を免疫学的に検出するためには上述した方法以外に、免疫凝集法による方法（特開平６−３３５８号公報）、Ｂｉａｃｏｒｅ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　ＡＢ（スウェーデン）社（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉａｃｏｒｅ．ｃｏ．ｊｐ）のＢＩＡｃｏｒｅ　などによる表面プラズモン共鳴（Ｓｕｒｆａｃｅ　Ｐｌａｓｍｏｎ　Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ　＝ＳＰＲ　）による方法、水晶発振子を用いた方法（特開平９−２９２３９７号公報）、などによる方法が挙げられる。
【００８２】
以上の本発明のタンパク質を検出するためのに構成される診断薬は、本発明のタンパク質またはその塩を含有している診断薬が挙げられる。また、好ましい態様の本発明の診断薬は、本発明のタンパク質またはその塩の連続する少なくとも５個のアミノ酸からなるタンパク質またはペプチドを含む診断薬が挙げられる。また、本発明のタンパク質を検出するための別の診断薬は、本発明のタンパク質に対する抗体を含有する診断薬が挙げられる。
【００８３】
治療目的の使用
本発明は、過剰または不十分な量の本発明のタンパク質あるいは該タンパク質の一部を構成するペプチドの活性に関連する、肥満症、高血圧症、高脂血症、糖尿病、腎臓疾患、インスリン耐性、脂肪異栄養、ＣＮＳ疾患、並びに動脈硬化による心臓病又は脳卒中、等の生活習慣病のごとき異常な状態の治療方法を提供する。本発明のタンパク質あるいは該タンパク質の一部を構成するペプチドの活性が過剰な場合、いくつかの方法を用いることができる。
【００８４】
１つの手段は、有効量の上記阻害剤化合物（アンタゴニスト）を医薬上許容される担体と調合してなる医薬を治療対象者に投与して、本発明のタンパク質あるいはペプチドへのリガンドの結合をブロックすることあるいは第２のシグナルを阻害することにより活性化を阻害し、そのことにより異常な状態を改善することを特徴とする。
【００８５】
他の手段は、本発明のポリヌクレオチドを活性化する治療上有効量の化合物（すなわち、アゴニスト）を医薬上許容される担体と調合してなる医薬を投与し、そのことにより異常な状態を改善することを特徴とする。
【００８６】
もう１つのアプローチにおいて、本発明のタンパク質あるいはペプチドと競争してリガンドに結合する能力を有している可溶性形態の本発明のタンパク質あるいはペプチドまたはそれらの塩を投与してもよい。かかる競争物質の典型的な具体例は本発明のタンパク質あるいは該タンパク質の一部を構成するペプチドを含む。即ち、本発明の医薬は該タンパク質或いはその塩、または該タンパク質或いはその塩の連続する少なくとも５個のアミノ酸からなるペプチドを含む医薬とすることができる。
【００８７】
このような本発明の医薬は、配列番号２で表されるタンパク質の全長に対して同一もしくは少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の相同性を有するタンパク質またはその塩を含む医薬、或いは該タンパクの連続する少なくとも５個のアミノ酸からなるペプチドを含む医薬である。
【００８８】
また、本発明の医薬は、配列番号４で表されるタンパク質の全長に対して同一もしくは少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の相同性を有するタンパク質またはその塩を含む医薬、或いは該タンパクの連続する少なくとも５個のアミノ酸からなるペプチドを含む医薬である。
【００８９】
さらにもう１つのアプローチにおいて、発現ブロック法を用いて本発明のポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドを投与して、遺伝子の活性化を阻害してもよい。
【００９０】
このような本発明の医薬は、配列番号１で表されるクローン１０４ポリヌクレオチドの塩基配列に対して同一もしくは少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の相同性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドを含有する医薬である。さらに好ましくは、配列番号１で表される塩基配列の番号６１から３６８１に対して同一もしくは少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の相同性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドを含有する医薬である。
【００９１】
また、配列番号１で表される塩基配列に対して同一もしくは少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の相同性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドのうち、連続する少なくとも１０個の塩基配列を有するポリヌクレオチドを含む医薬としてもよく、さらに好ましくは、配列番号１で表される塩基配列の番号６１から３６８１に対して同一もしくは少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の相同性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドあるいは該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドに対し、相補的であり且つ連続する少なくとも１０個の塩基配列を有するポリヌクレオチドを含む医薬としてもよい。
【００９２】
特に、ヒトのクローン１０４ポリヌクレオチドについては、配列番号３で表される塩基配列に対して同一もしくは少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の相同性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドを含有する医薬である。好ましくは、配列番号３で表される塩基配列の番号５８から３６６９に対して同一もしくは少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の相同性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドを含有する医薬である。
【００９３】
また、配列番号３で表される塩基配列に対して同一もしくは少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の相同性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドのうち、連続する少なくとも１０個の塩基配列を有するポリヌクレオチドを含む医薬としてもよく、さらに好ましくは、配列番号３で表される塩基配列の５８から３６６９に対して同一もしくは少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の相同性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドあるいは該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドに対し、相補的であり且つ連続する少なくとも１０個の塩基配列を有するポリヌクレオチドを含む医薬としてもよい。
【００９４】
これらの医薬は、翻訳開始コドンであるＡＴＧの前後の配列のアンチセンスを治療薬に利用するものである。これらの医薬には公知の方法で、細胞内で生成した、あるいは別個に投与された、アンチセンス配列を用いることができる。例えば、Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ　ａｓ　Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ　ｏｆ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＣＲＣＰｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ　Ｒａｔｏｎ，　ＦＬ（１９８８）　中、Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ（１９９１）５６：５６０。別法として、遺伝子とともに三重らせんを形成するオリゴヌクレオチドを提供してもよい。例えば、Ｌｅｅ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ（１９７９）６：３０７３；Ｃｏｏｎｅｙ　ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２４１：４５６；Ｄｅｒｖａｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９１）２５１：１３６０　。これらのオリゴマーはそれ自体投与することができ、あるいは関連オリゴマーをインビボで活性化させることもできる。
【００９５】
別法として、遺伝子治療を用いて、治療対象者中の細胞による本発明のポリヌクレオチドの細胞内での生成を有効ならしめてもよい。例えば、上記のごとく本発明のポリヌクレオチドを処理加工して複製欠損レトロウイルスベクターに入れて活性化するようにしてもよい。次いで、レトロウイルス発現構築物を単離し、本発明のタンパク質をコードしているＲＮＡを含むレトロウイルスプラスミドベクターでトランスダクションしたパッケージング細胞中に導入して、次いでパッケージング細胞が目的のポリヌクレオチドを含む感染性ウイルス粒子を生成するようにしてもよい。これらのプロデューサー細胞を治療対象者に投与して細胞をインビボで処理加工して、インビボでタンパク質を活性化するようにしてもよい。遺伝子治療の方法には、Ｈｕｍａｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｔ．Ｓｔｒａｃｈａｎ　ａｎｄ　Ａ．Ｐ．Ｒｅａｄ，ＢＩＯＳ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ　Ｌｔｄ（１９８６）　中、第２０章、Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ　ａｎｄ　ｏｔｈｅｒ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃ−ｂａｓｅｄ　Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ　Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ　（およびその中の引用文献）が適用可能である。
【００９６】
配列番号２で表されるタンパク質の全長に対して同一もしくは少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の相同性を有するタンパク質或いは該タンパク質を構成するアミノ酸配列の一部からなるペプチドに対して免疫学的に特異的な抗体を含有させて医薬とすることができる。また、配列番号４で表されるタンパク質の全長に対して同一もしくは少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の相同性を有するタンパク質或いは該タンパク質を構成するアミノ酸配列の一部からなるペプチドに対して免疫学的に特異的な抗体を含有させて医薬とすることができる。このような抗体を投与した場合には、脂肪細胞分化活性を減弱させることが期待できる。
【００９７】
処方および投与
本発明のタンパク質の増強された活性化を必要とする治療対象者の治療方法においては、可溶性形態の前記本発明のタンパク質、または該タンパク質の一部を構成するペプチド、またはそれらの塩、ならびに該タンパク質または該タンパク質の一部を構成するペプチドに対する抗体、アゴニスト、アンタゴニストペプチド、またはそれらの小型分子の治療上有効量を医薬として治療対象者に投与してもよい。
【００９８】
かかる処方は、治療上有効量の前記物質、またはそれらの塩、および医薬上許容される担体または賦形剤を含んでなる。かかる担体としては、セイライン、緩衝化セイライン、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの混合物が挙げられるが、これらに限らない。処方は投与経路に適したものとすべきであり、当業者によく知られている。さらに本発明は、上記本発明成分の１種またはそれ以上を充填した、１個またはそれ以上の容器を含んでなる医薬パックおよびキットにも関する。
【００９９】
本発明のタンパク質および他の化合物を単独で使用してもよく、あるいは治療化合物のごとき他の化合物と一緒に使用してもよい。医薬組成物の全身投与の好ましい形態は、注射、典型的には静脈注射を包含する。皮下、筋肉内または腹腔内のごとき他の注射経路を用いることもできる。全身投与のための別の手段は、胆汁酸塩またはフシジン酸または他の界面活性剤のごとき浸透剤を用いる経粘膜または経皮投与を包含する。さらに、腸溶処方またはカプセル処方がうまく処方されるならば、経口投与も可能である。これらの化合物の投与は局所的なものであってもよく、膏薬、パスタ、ゲル等の形態であってもよい。
【０１００】
必要な用量範囲は、ペプチド、投与経路、処方の性質、治療対象者の症状の性質、および担当医師の判断による。適当な用量は治療対象者の体重１ｋｇあたり０．１ないし１００μｇの範囲である。しかしながら、種々の使用化合物および種々の投与経路のさまざまな有効性を考慮すれば、必要な用量は広範囲なものと思われる。例えば、経口投与には静脈注射よりも多い用量が必要であると考えられる。当該分野においてよく理解された最適化のための標準的な常套的実験を用いてこれらの用量の変更を行うことができる。
【０１０１】
しばしば「遺伝子治療」と称される上記治療方法において、治療に使用する本発明のタンパク質を治療対象者中において生成させることもできる。よって、例えば、レトロウイルスプラスミドベクターを用いることにより、タンパク質をコードしているＤＮＡまたはＲＮＡのごときポリヌクレオチドを用いて治療対象者由来の細胞をエクスビボで処理加工してもよい。次いで、処理された細胞を治療対象者に導入する。
【０１０２】
【実施例】
〔実施例１〕
脂肪細胞への分化の確認
マウス３Ｔ３−Ｌ１細胞（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＣＣＬ−９２．１．）を、基本培地（ＤＭＥＭ，　４０μｇ／ｍｌ　ＫＭ，　１０％　Ｃａｌｆ　Ｓｅｒｕｍ　）を用いて５％　　ＣＯ_２、３７℃においてｃｏｌｌａｇｅｎ　ｔｙｐｅ　Ｉ　ｄｉｓｈ　（ＦＡＬＣＯＮ社製）　中で培養した。細胞がコンフレントに達してから２日間おき、細胞が休止期に入った後、培地を分化誘導培地（ＤＭＥＭ，　４０μｇ／ｍｌ　ＫＭ，　１０％　ＦＢＳ，　０．５ｍＭ　１−メチル−３−イソブチルキサンチン（以下、ＩＢＭＸと呼ぶ）、１０μｇ／ｍｌ　　インシュリン、１μＭ　Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ（以下、Ｄｅｘ　と呼ぶ）に変えこの分化条件において４８時間培養し、培地を分化促進培地（ＤＭＥＭ，　４０μｇ／ｍｌ　ＫＭ，１０％　ＦＢＳ，　５μｇ／ｍｌ　ｉｎｓｕｌｉｎ）に変えた。２日おきに分化促進培地で培地交換を行った。４　日目頃から小さな脂肪滴を含み始め、一週間後には成熟した脂肪細胞へ分化することを確認した。
【０１０３】
〔実施例２〕
ｍＲＮＡの調製
脂肪細胞分化誘導前と分化誘導開始３時間後のマウス３Ｔ３−Ｌ１細胞（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＣＣＬ−９２．１．）からＴＲＩｚｏｌ（ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ　社製）を用いて、ＴＲＩｚｏｌ（ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ　社製）に添付されている取扱説明書に従い全量ＲＮＡを調製した。この全量ＲＮＡからＯｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ　３０（　第一化学薬品社製）　を用いて、添付されている取扱説明書に従ってｍＲＮＡを調製した。
【０１０４】
〔実施例３〕
ＰＣＲ−ｓｅｌｅｃｔ　ｃＤＮＡ　Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ　 法による脂肪細胞分化誘導後３時間目に発現の上昇するクローンの単離
公知のＰＣＲ　ｓｅｌｅｃｔｃＤＮＡ　ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ　ｋｉｔ　（ＣＬＯＮＴＥＣＨ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　社製）　に従って以下のｉ）−ｖｉｉ）工程を行った。
【０１０５】
ｉ）テスターｃＤＮＡ、ドライバーｃＤＮＡの合成
脂肪細胞分化誘導前のｍＲＮＡをドライバーｍＲＮＡとし、分化誘導３時間後のｍＲＮＡをテスターｍＲＮＡとした。これらのドライバーｍＲＮＡおよびテスターｍＲＮＡから１本鎖ｃＤＮＡを合成し、次いで、２本鎖のドライバーｃＤＮＡ、テスターｃＤＮＡを合成した。
【０１０６】
ｉｉ）　制限酵素ＲｓａＩによる２本鎖ｃＤＮＡの切断
前記工程ｉ）で得られた２本鎖のドライバーｃＤＮＡとテスターｃＤＮＡの各々を制限酵素ＲｓａＩで切断し、平滑末端（ｂｌｕｎｔ　ｅｎｄ）の断片を作った。
【０１０７】
ｉｉｉ）アダプターのライゲーション
前記工程　ｉｉ）で得られた切断されたテスターｃＤＮＡを二つのグループに分け、一方にアダプター１をライゲーションし、他方にアダプター２をライゲーションした。
【０１０８】
ｉｖ）ファーストハイブリダイゼーション
前記工程ｉｉｉ）で得られたアダプターをライゲーションした２種類のテスターｃＤＮＡと過剰量のドライバーｃＤＮＡとの間で別々にハイブリダイゼーションを行った。
【０１０９】
ｖ）セカンドハイブリダイゼーション
さらに過剰量のドライバーｃＤＮＡと、前記　ｉｖ）工程で得られたドライバーｃＤＮＡをハイブリダイズしてなる２種類のテスターｃＤＮＡを合わせ、ハイブリダイゼーションを行った。
【０１１０】
ｖｉ）　ファーストＰＣＲ
前記　ｉｖ）工程で得られたハイブリダイズされたテスターｃＤＮＡを２種類のアダプター部位間で共通なプライマーを用いてＰＣＲ法を行ってＤＮＡを増幅させた。
【０１１１】
ｖｉｉ）セカンドＰＣＲ
最後に２種類のアダプター部位に特異的な２種類のプライマーを用いてＰＣＲ法を行いＤＮＡを増幅させた。
【０１１２】
ドライバーｃＤＮＡとハイブリダイズしてなるテスターｃＤＮＡは増幅されなかった。一方、テスター特異的、つまり分化誘導３時間目にピークとして６時間以内に活性化が増加しているポリヌクレオチド（遺伝子）のみ増幅された。
【０１１３】
〔実施例４〕
ＰＣＲ産物のサブクローニング及びマウスのクローン１０４のプラスミド
図１にクローン１０４マウスｃＤＮＡクローニングの略図を示す。前記実施例３のサブトラクション法で得られたＳｅｃｏｎｄ　ＰＣＲを行った後の増幅されたポリヌクレオチドを含む反応液をフェノール抽出、ＣＩＡＡ抽出後、ＥｔＯＨ沈殿を行い、ＤＮＡのペレットを滅菌水１７μｌに溶解し、１０ｕｎｉｔｓのＲｓａｌで１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ　７．５），１０ｍＭ　ＭｇＣｌ_２、１ｍＭ　ＤＴＴ条件下、３７℃一晩反応させアダプターを切断した。０．７％アガロースゲルで電気泳動後、ＤＥ８１（Ｗｈａｔｍａｎ）を用いて精製し、ＤＮＡ断片Ｓｕ（図１参照）を得た。
【０１１４】
該ＤＮＡ断片Ｓｕの情報を元にプライマーを設計し、５’−ＲＡＣＥを行った結果、３．２ｋｂｐのバンドが得られたので、これを回収してヌクレオチドＲ−５’と呼んだ（図１参照）。該ヌクレオチドＲ−５’をＴベクター（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＫＳ＋　）にサブクローニングして、ＤＳＱ−１０００（島津製作所）により塩基配列を決定した。更に、ヌクレオチドＲ−５’の５’側に再度５’−ＲＡＣＥ用のプライマーを設計して、５’−ＲＡＣＥを行った結果、１．２ｋｂｐのバンドが得られたので、これを回収してヌクレオチドＲ−５’’と呼んだ（図１参照）。このＤＮＡ断片も同様の方法で塩基配列を決定した。
【０１１５】
一方、３　’側については、ＤＮＡ断片Ｓｕを［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ｂｉｏｔｅｃｈ社製）標識し、これをプローブとしてｃＤＮＡライブリースクリーニングを行い、陽性ファージを単離した。この陽性ファージよりＤＮＡを調製して、制限酵素ＥｃｏＲ　ｉ消化後、０．７％アガロースゲルで電気泳動、ＤＥ８１（Ｗｈａｔｍａｎ）を用いて精製してｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＫＳ＋　のＥｃｏＲ　ｉサイトにサブクローニングし、ＤＳＱ−１０００（島津製作所）により１．６ｋｂｐの塩基配列を決定した。これをヌクレオチドＳｃと読んだ（図１参照）。
【０１１６】
次に、ヌクレオチドＳｃを用いてデータベースに対して検索すると、一致する塩基配列がＥＳＴに登録されており、この塩基配列を参考にプライマーを設計して、ＲＴ−ＰＣＲを行った。その結果、約１．５ｋｂｐのバンドが得られたので、これを回収してヌクレオチドＲＴと呼んだ（図１参照）。該ヌクレオチドＲＴをＴベクター（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＫＳ＋　）にサブクローニングして、ＤＳＱ−１０００（島津製作所）　により塩基配列を決定した。
【０１１７】
以上のようにして、マウスのクローン１０４ｃＤＮＡ全長の単離を目的に５’−ＲＡＣＥ、ｃＤＮＡライブラリースクリーニング及び、ＲＴ−ＰＣＲを行った結果、６８１２ｂｐのポリヌクレオチドを得た。該ポリヌクレオチドをクローン１０４ポリヌクレオチド（単に、クローン１０４と呼ぶことがある。）と呼ぶ。該ポリヌクレオチドの塩基配列を配列番号１に示す。翻訳開始コドンはインフレームで最も５’側に出現する６１塩基目のＡＴＧを翻訳開始コドンと仮定した。その結果、マウスのクローン１０４ポリヌクレオチドは１２０７アミノ酸をコードする遺伝子であると予想された。マウスのクローン１０４アミノ酸配列を配列番号２に示す。
【０１１８】
マウスのクローン１０４ｃＤＮＡ全長のうちＯＲＦが含まれるのは６１ｂｐ−３６８１ｂｐであった。この領域が含まれるプラスミドを作製するために、１ｂｐ−３７００ｂｐのクローン１０４ポリヌクレオチドをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｔ　ＳＫ＋ベクター（Ｘｂａ　ｉ　／ＥｃｏＲＶ）にライゲーション反応を行った。ライゲーション反応液をコンピテントセルとしてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＤＨ５α（ＡＴＣＣ５３８６８、東洋紡株式会社製）にｈｅａｔ　ｓｈｏｃｋ法によりトランスフォームして、サブクローニングされたマウスのクローン１０４全長ＯＲＦのプラスミドを得た。本実施例４で製造された形質転換体は、国際寄託当局である独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センターにＦＥＲＭ　Ｐ−１８９７０として寄託されている。
【０１１９】
既存塩基配列、アミノ酸配列との比較
決定したマウスのクローン１０４ポリヌクレオチドの塩基配列について、ＧｅｎＢａｎｋ　、ＥＭＢＬ、ＤＤＢＪ、ＰＤＢ　の各々のデータベースにＢＬＡＳＴＮでホモロジー検索を行った。その結果、クローン１０４ポリヌクレオチドの塩基配列は、登録されている既知のポリヌクレオチドとは同一性が無く、前駆脂肪細胞が脂肪細胞へと分化する際に特異的に発現が上昇するポリヌクレオチドとして、新規の物質であることが分かった。
【０１２０】
また、マウスのクローン１０４ポリヌクレオチドについて塩基配列から予想したマウスのクローン１０４タンパク質のアミノ酸配列をＧｅｎＢａｎｋ　ＣＤＳ　ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｓ、ＰＤＢ　、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ　、ＰＩＲ　、ＰＲＦ　の各々のデータベースにＢＬＡＳＴＰでホモロジー検索を行った。その結果、マウスのクローン１０４タンパク質のアミノ酸配列について登録されている既知の蛋白質とは同一性が無く、前駆脂肪細胞が脂肪細胞へと分化する際に特異的に発現が上昇する蛋白質として、新規の物質であることが分かった。
【０１２１】
〔実施例５〕
インサートの回収およびプローブの作製
前記実施例４において、サブトラクション法により得られたＤＮＡ断片Ｓｕが挿入されているプラスミドをＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　に記載の方法に従いアルカリＳＤＳ法により調製し、このプラスミドを制限酵素ＸｂａＩ，　ＨｉｎｄＩＩＩ　で切断後、１．０％アガロースゲルで電気泳動し、インサートに相当するバンドをＤＥ８１（Ｗｈａｔｍａｎ　社製）を用いて回収した。５０〜１００ｎｇのＤＮＡ断片をＢｃａＢＥＳＴ　^ＴＭ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　ｋｉｔ　（ＴａＫａＲａ社製）を用いて［α−^３２Ｐ］ｄＣＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ｂｉｏｔｅｃｈ社製）で標識し、標識プローブを得た。得られた標識プローブをＳｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−５０　（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いたカラムに通し、^３２Ｐ標識プローブを調製した。
【０１２２】
〔実施例６〕
３Ｔ３−Ｌ１分化初期における発現変化のノザンブロット解析
脂肪細胞分化誘導開始前（０時間）と分化誘導開始０．５、１、３、６、１２、２４時間後のマウス３Ｔ３−Ｌ１細胞（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＣＣＬ−９２．１．）からそれぞれ調製した総ＲＮＡ２５μｇ　を１％変性ゲル（２％　ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ　，１×Ｍｏｐｓ，　１％アガロース）で電気泳動した。ゲルを５０ｍＭ　ＮａＯＨ　２５分（アルカリ変性）、２００ｍＭ　ＮａＯＡｃ（ｐＨ４．０）、４０分　（中和）　処理後、ＲＮＡ　をＨｙｂｏｎｄＮ＋（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ｂｉｏｔｅｃｈ社製）にトランスファーした。トランスファーは１２時間以上行い、バッファーは２０×ＳＳＣ　を用いた。トランスファーしたフィルターを５０ｍＭ　ＮａＯＨ　，５分間処理後、２×ＳＳＣ　で洗浄し、８０℃、２時間乾燥させた。その後、ＵＶ照射を行い固定した。
【０１２３】
ハイブリダイゼーションバッファー　（５×　ＳＳＰＥ，５０％　ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ　，　５×Ｄｅｎｈａｌｔ’ｓ，　０．１％　ＳＤＳ，　２０μｇ／ｍｌ　ｓａｌｍｏｎ　ｓｐｅｒｍ　ＤＮＡ）　で４２℃一晩、プレハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーションバッファーを新しく変えた後、熱変性したプローブを加え４２℃一晩、ハイブリダイゼーションを行った。その後、フィルターを一次洗浄液（２×　ＳＳＰＥ　０．１％　ＳＤＳ）を用いて室温で１０分間、さらに一次洗浄液を用いて５５〜６５℃で１５分間、二次洗浄液（１×　ＳＳＰＥ　０．１％　ＳＤＳ）を用いて６５℃で１５分間、三次洗浄液（０．５×ＳＳＰＥ０．１％　ＳＤＳ）を用いて６５℃で１０分間の条件で洗浄し、オートラジオグラフィーを行った。得られた結果を、図２に示す。
【０１２４】
図２のオートラジオグラムによれば、クローン１０４より調製した標識プローブは、脂肪細胞分化誘導開始前　（０時間）　の細胞から調製した総ＲＮＡとは反応しないが、分化誘導開始３時間目に特に強く反応し、２時間目及び６　時間目の細胞でも若干、反応していることが分かった。このことから、クローン１０４は、脂肪細胞分化初期に、特に、脂肪細胞分化誘導開始後３時間目をピークとして６時間以内に、特異的に発現の上昇する配列であることがわかった。
【０１２５】
〔実施例７〕
３Ｔ３−Ｌ１及びＮＩＨ−３Ｔ３の休止期と増殖期における発現比較のノザンブロット解析
３Ｔ３−Ｌ１細胞（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．　ＣＣＬ−９２．１．）（休止期の細胞に分化誘導をかけると成熟脂肪細胞に分化する性質を有し、且つ、増殖期に分化誘導をかけても成熟脂肪細胞に分化しない性質を有する。）及び、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＣＲＬ−１６５８）（分化誘導をかけても成熟脂肪細胞に分化しない性質を有する。）を基本培地において培養し、細胞が７０−８０％コンフレント時（増殖期の細胞）に分化誘導培地に変えて、分化誘導前と分化誘導開始後３時間目の細胞からＴＲＩｚｏｌ（ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ　社製）を用いて、総ＲＮＡを回収した。
【０１２６】
一方、前記実施例１に示した方法で３Ｔ３−Ｌ１（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．　ＣＣＬ−９２．１．）及び、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＣＲＬ−１６５８）（休止期の細胞）に対して分化誘導を行い、分化誘導前と分化誘導３　時間後の細胞からＴＲＩｚｏｌ（ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ　社製）を用いて、総ＲＮＡを回収した。
【０１２７】
回収した総ＲＮＡを用いて前記実施例６に示した方法で、ノザンブロット解析を行った。その結果を図３に示す。図３のオートラジオグラムによれば、クローン１０４は３Ｔ３−Ｌ１細胞（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．　ＣＣＬ−９２．１．）の休止期に分化誘導を行った３時間後に、特に強く発現が上昇していることが分かる。なお、３Ｔ３−Ｌ１細胞（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．　ＣＣＬ−９２．１．）は、休止期の状態で分化誘導剤を添加すると脂肪細胞へと分化するが、増殖期の状態では分化しない性質を元来有している。また、３Ｔ３−Ｌ１と同じマウス胚由来の繊維芽細胞株であるＮＩＨ−３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＣＲＬ−１６５８）は、増殖期または、休止期のいずれの場合に分化誘導剤を添加しても、脂肪細胞へは分化しない性質を元来有している。以上のことから、クローン１０４は脂肪細胞へと分化する条件下でのみ、強く発現していることが示され、このことはクローン１０４が脂肪細胞分化に深く関わっている可能性を示唆すものである。
【０１２８】
［実施例８］
ヒトホモログの同定
ｉ）ＮＣＢＩ　Ｇｅｎｏｍｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｏｍｅ　Ｄａｔａｂａｓｅ　）を用いたヒトホモログの配列の予想
前記実施例４において決定されたクローン１０４　マウスの全長配列をＮＣＢＩ　Ｇｅｎｏｍｅ　ＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇのＢＬＡＳＴ　ｔｈｅ　Ｈｕｍａｎ　ｇｅｎｏｍｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅ／ｓｅｑ／　）で、ヒトの遺伝子配列についてホモロジーサーチすることによって相同性の高い配列を３番染色体上に見出した。該配列は、計２５個のエキソンにより構成されており、全てのエキソン、イントロン間にはｇｔ−ａｇ　ルールが保存されていた。以上のことからヒトホモログの全長配列を予想することが出来た。
【０１２９】
本発明者等は、既に、クローン２４（特願２００１−３７４７８５）及び、クローン１５８（特願２００２−０４８７４２）においても、同様の方法でヒトホモログ配列を予測している。このときの結果によれば、予測配列は実際にＲＴ−ＰＣＲでクローニングし、シークエンスして配列を決定したものと、ほぼ１００％の相同性を示すことが明らかになっている。このことから、クローン１０４ヒトホモログ予想配列をクローン１０４ヒトホモログヌクレオチド配列とすることができる。
【０１３０】
上記のようにして決定したクローン１０４ヒトホモログポリヌクレオチドの全長の核酸配列は、配列番号３に示される。
【０１３１】
また、配列番号１で示したマウスのクローン１０４ポリヌクレオチドと配列番号３で示したヒトホモログとの一致率は、５６７８／　６８９４＝８２．４％であった。
【０１３２】
クローン１０４ヒトホモログポリヌクレオチドにおいて、マウスクローン１０４においてイニシャルメチオニンと定めたアミノ酸に対応する５８塩基目のＡＴＧを翻訳開始コドンと仮定した。その結果、クローン１０４ヒトホモログポリヌクレオチドは１２０４アミノ酸からなる蛋白質をコードする遺伝子であると予想され、該蛋白質のアミノ酸配列を、配列番号４に示した。
【０１３３】
【発明の効果】
本発明のマウスのクローン１０４ポリヌクレオチド及び該クローン１０４ポリヌクレオチドから推定されるマウスのクローン１０４タンパク質は、脂肪細胞分化誘導開始後３時間目をピークとして６時間以内の細胞から抽出されるポリヌクレオチド並びにタンパク質であり、新規なものである。また、ヒトのクローン１０４ポリヌクレオチド及び該クローン１０４ポリヌクレオチドから推定されるストのクローン１０４タンパク質は、マウスの場合と同様に、脂肪細胞分化誘導開始後３時間目をピークとして６時間以内の細胞から抽出されると推定される。これらのポリヌクレオチドおよびタンパク質は、肥満のメカニズムを解明し、さらに肥満の進行状況を適切に把握し、肥満の予防あるいは治療に役立たせる上で極めて有用な物質である。
【０１３４】
本発明のクローン１０４ポリヌクレオチド、並びに該クローン１０４ポリヌクレオチドから推定されるクローン１０４タンパク質またはペプチド、およびこれらのペプチドに対するアンタゴニストまたはアゴニストは、肥満を含む糖尿病・高血圧・動脈硬化などの生活習慣病の治療、および診断に有用である。
【０１３５】
本発明のクローン１０４ポリヌクレオチド、あるいは該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドのうち、連続する少なくとも１０個の塩基配列を有するポリヌクレオチドは、肥満を含む糖尿病・高血圧・動脈硬化などの生活習慣病の治療、および診断に有用である。
【０１３６】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】クローン１０４マウスｃＤＮＡクローニングの略図である。
【図２】マウスの脂肪細胞分化に特異的に発現され、脂肪細胞分化誘導開始後３時間目をピークとして６時間以内にマウスのクローン１０４ポリヌクレオチドが発現されることを示すオートラジオグラムである。
【図３】３Ｔ３−Ｌ１及びＮＩＨ−３Ｔ３の休止期と増殖期における、分化誘導開始０時間目と３時間目の発現比較のノザンブロット解析を示すオートラジオグラムである。

Claims (59)

1. 脂肪細胞分化に関連し且つ脂肪細胞分化誘導開始後３時間目をピークとして６時間以内に発現するタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、配列番号１で表される塩基配列に対して同一もしくは少なくとも８０％の相同性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド。
2. 脂肪細胞分化に関連し且つ脂肪細胞分化誘導開始後３時間目をピークとして６時間以内に発現するタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、配列番号１で表される塩基配列の番号６１から３６８１に対して同一もしくは少なくとも８０％の相同性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド。
3. 請求項１または２記載のポリヌクレオチドがＤＮＡまたはＲＮＡであるポリヌクレオチド。
4. 脂肪細胞分化誘導開始後３時間目をピークとして６時間以内に発現されるタンパク質であって、配列番号２で表されるタンパク質の全長に対して同一もしくは少なくとも８０％の相同性を有する脂肪細胞分化を促進するタンパク質。
5. 請求項１または２記載のポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドを含有する組み換えベクター。
6. 請求項５記載の組み換えベクターを保持する形質転換体。
7. 請求項４記載のタンパク質に対して免疫学的に特異的な抗体。
8. 請求項４記載のタンパク質をアンタゴナイズまたはアゴナイズする化合物の同定方法であって、
   （ａ）請求項４記載のタンパク質を発現している細胞または請求項４記載のタンパク質に応答する細胞に候補化合物を接触させること；
   （ｂ）結合、または機能的応答の刺激もしくは阻害を観察すること；あるいは候補化合物と接触した細胞の請求項４記載のタンパク質の活性に関する能力を接触しなかった同種の細胞と比較することを特徴とする方法。
9. 請求項８記載の方法によって同定されるアゴニスト。
10. 請求項８記載の方法によって同定されるアンタゴニスト。
11. 請求項４記載のタンパク質の生成に十分な条件下で、請求項６記載の形質転換体を培養し、培地または形質転換体からタンパク質を回収することを特徴とするタンパク質またはその塩の製造方法。
12. 請求項１または２記載のポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドを含有する医薬。
13. 配列番号１で表される塩基配列に対して同一もしくは少なくとも８０％の相同性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドのうち、連続する少なくとも１０個の塩基配列を有するポリヌクレオチドを含む医薬。
14. 配列番号１で表される塩基配列の番号６１から３６８１に対して同一もしくは少なくとも８０％の相同性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドのうち、連続する少なくとも１０個の塩基配列を有するポリヌクレオチドを含む医薬。
15. 請求項１または２記載のポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドを含有する診断薬。
16. 配列番号１で表される塩基配列に対して同一もしくは少なくとも８０％の相同性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドのうち、連続する少なくとも１０個の塩基配列を有するポリヌクレオチドを含む診断薬。
17. 配列番号１で表される塩基配列の番号６１から３６８１に対して同一もしくは少なくとも８０％の相同性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドのうち、連続する少なくとも１０個の塩基配列を有するポリヌクレオチドを含む診断薬。
18. 請求項４記載のタンパク質またはその塩を含有している医薬。
19. 請求項４記載のタンパク質またはその塩の連続する少なくとも５個のアミノ酸からなるペプチドを含む医薬。
20. 請求項４記載のタンパク質またはその塩を含有している診断薬。
21. 請求項４記載のタンパク質またはその塩の連続する少なくとも５個のアミノ酸からなるペプチドを含む診断薬。
22. 請求項７記載の抗体を含有する医薬。
23. 請求項７記載の抗体を含有する診断薬。
24. 請求項９記載のアゴニストを含有している医薬。
25. 請求項９記載のアゴニストを含有している診断薬。
26. 請求項１０記載のアンタゴニストを含有している医薬。
27. 請求項１０記載のアンタゴニストを含有している診断薬。
28. 肥満症、高血圧症、高脂血症、糖尿病、並びに動脈硬化による心臓病及び脳卒中から選ばれた生活習慣病の治療薬である請求項１２、１３、１４、１８、１９、２２、２４または２６記載の医薬。
29. 肥満症、高血圧症、高脂血症、糖尿病、並びに動脈硬化による心臓病及び脳卒中から選ばれた生活習慣病の診断薬である請求項１５、１６、１７、２０、２１、２３、２５または２７記載の診断薬。
30. 脂肪細胞分化に関連するタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、配列番号３で表される塩基配列に対して同一もしくは少なくとも８０％の相同性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド。
31. 脂肪細胞分化に関連するタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、配列番号３で表される塩基配列の番号５８から３６６９に対して同一もしくは少なくとも８０％の相同性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド。
32. 請求項３０または３１記載のポリヌクレオチドがＤＮＡまたはＲＮＡであるポリヌクレオチド。
33. 配列番号４で表されるタンパク質の全長に対して同一もしくは少なくとも８０％の相同性を有する脂肪細胞分化を促進するタンパク質。
34. 請求項３３記載のタンパク質をアンタゴナイズまたはアゴナイズする化合物の同定方法であって、
    （ａ）請求項３３記載のタンパク質を発現している細胞または請求項３３記載のタンパク質に応答する細胞に候補化合物を接触させること；
    （ｂ）結合、または機能的応答の刺激もしくは阻害を観察すること；あるいは候補化合物と接触した細胞の請求項３３記載のタンパク質の活性に関する能力を接触しなかった同種の細胞と比較することを特徴とする方法。
35. 請求項３４記載の方法によって同定されるアゴニスト。
36. 請求項３４記載の方法によって同定されるアンタゴニスト。
37. 請求項３０または３１記載のポリヌクレオチドを含有する組み換えベクター。
38. 請求項３７記載の組み換えベクターを保持する形質転換体。
39. 請求項３３記載のタンパク質に対して免疫学的に特異的な抗体。
40. 請求項３３記載のタンパク質の生成に十分な条件下で、請求項３８記載の形質転換体を培養し、培地または形質転換体からタンパク質またはその塩を回収することを特徴とするタンパク質の製造方法。
41. 請求項３０または３１記載のポリヌクレオチドを含有している医薬。
42. 配列番号３で表される塩基配列に対して同一もしくは少なくとも８０％の相同性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドのうち、連続する少なくとも１０個の塩基配列を有するポリヌクレオチドを含む医薬。
43. 配列番号３で表される塩基配列の番号５８から３６６９に対して同一もしくは少なくとも８０％の相同性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドのうち、連続する少なくとも１０個の塩基配列を有するポリヌクレオチドを含む医薬。
44. 請求項３０または３１記載のポリヌクレオチドを含有している診断薬。
45. 配列番号３で表される塩基配列に対して同一もしくは少なくとも８０％の相同性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドのうち、連続する少なくとも１０個の塩基配列を有するポリヌクレオチドを含む診断薬。
46. 配列番号３で表される塩基配列の番号５８から３６６９に対して同一もしくは少なくとも８０％の相同性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドのうち、連続する少なくとも１０個の塩基配列を有するポリヌクレオチドを含む診断薬。
47. 請求項３３記載のタンパク質またはその塩を含有している医薬。
48. 請求項３３記載のタンパク質またはその塩の連続する少なくとも５個のアミノ酸からなるペプチドを含む医薬。
49. 請求項３３記載のタンパク質またはその塩を含有している診断薬。
50. 請求項３３記載のタンパク質またはその塩の連続する少なくとも５個のアミノ酸からなるペプチドを含む診断薬。
51. 請求項３９記載の抗体を含有する医薬。
52. 請求項３９記載の抗体を含有する診断薬。
53. 請求項３５記載のアゴニストを含有している医薬。
54. 請求項３５記載のアゴニストを含有している診断薬。
55. 請求項３６記載のアンタゴニストを含有している医薬。
56. 請求項３６記載のアンタゴニストを含有している診断薬。
57. 肥満症、高血圧症、高脂血症、糖尿病、並びに動脈硬化による心臓病及び脳卒中から選ばれた生活習慣病の治療薬である請求項４１、４２、４３、４７、４８、５１、５３または５５記載の医薬。
58. 肥満症、高血圧症、高脂血症、糖尿病、並びに動脈硬化による心臓病及び脳卒中から選ばれた生活習慣病の診断薬である請求項４４、４５、４６、４９、５０、５２、５４または５６記載の診断薬。
59. 配列番号３で表されるポリヌクレオチドについて、ｎａｎｏｃｈｉｐを用いる方法、ポリヌクレオチド配列を決定する方法、ＤＮＡチップ又はＤＮＡアレイを用いる方法、質量分析計を用いる方法、プライマーエクステンションを用いる方法から選ばれた方法を適用することを特徴とする塩基多型を調べる方法。

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