JP2004135605A - 脂肪細胞分化関連遺伝子およびタンパク質 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】特定配列で表される塩基配列と同一もしくは少なくとも80%の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、及び特定配列のポリヌクレオチドがコードするタンパク質であって、そのタンパク質の全長にわたり同一もしくは少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質。
【選択図】なし
Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、脂肪細胞分化の初期に活性化するクローン104ポリヌクレオチド及びクローン104タンパク質に関し、さらには該クローン104タンパク質の抗体、アンタゴニスト、アゴニスト、およびこれらの製造、並びにこれらの物質を含有する医薬および診断薬に関する。
【0002】
【従来の技術】
【0003】
【特許文献1】
特開平8−333394
【非特許文献1】
【0004】
Biochemical and Biophysical Research Communications 254, 299−305(1999)
栄養過剰による肥満は、糖尿病・高血圧・動脈硬化などの深刻な生活習慣病の最大の要因となっている。今後の生命科学・健康科学を考えるうえで、肥満の分子機構を解明することは必須の課題といえる。肥満に直接関わるのは脂肪細胞であり、脂肪細胞生成過程が解明されれば肥満の治療に直結する。近年の分子生物学の発展に伴い、脂肪細胞分化の機構が解明されつつある。そこにはキーとなる遺伝子群が存在し、これらが巧妙に情報をやり取りするネットワークを形成していることが知られている。
【0005】
脂肪細胞分化過程は複雑なステップより成り、脂肪芽細胞(Adipoblast)→前駆脂肪細胞(Preadipocyte)→脂肪細胞(Adipocyte)へ分化する。培養細胞や遺伝子改変個体を用いた系などにより脂肪細胞分化に密接に関与する転写因子が、近年、明らかになりつつある。
【0006】
PPAR (Peroxisome Proliferator−Activated Receptor, ペルオキシソーム増殖剤応答性レセプター) 、C/EBP(CCAAT/Enhancer− Binding Protein)ファミリー、及びSREBP−1/ADD1 (Sterol Regulatory Element Binding Protein 1 または Adipocyte Determination and Differentiation−dependentFactor 1)は脂肪細胞の分化に最も重要な転写因子といわれている。
【0007】
PPARは、ファミリーを形成していることが明らかにされ、その中でもPPARγは脂肪細胞分化に特に重要であることが明らかになっている。すなわち、脂肪芽細胞や前駆脂肪細胞において、PPARγを強制的に発現させると脂肪細胞に分化することが明らかになっている。この結果は、PPARγが脂肪細胞の分化に重要な役割を担っていることを証明していると言える。
【0008】
C/EBPもPPARと同様にファミリーを形成しており、最近になって、C/EBPαがPPARγと同じように脂肪細胞分化のマスターレギュレーターとして機能していることが明らかにされている。また、C/EBPβとC/EBPδは分化の初期に発現し、C/EBPαとPPARγの発現を制御していると考えられている。
【0009】
SREBP1/ADD1は、脂肪細胞の分化を促進することが知られている一方、脂肪細胞の分化過程においてPPARγのリガンド生成に関わっていることも明らかにされている。
【0010】
前記3種類の転写因子群(PPAR、C/EBP、SREBP1/ADD1)が、クロストークすることにより分化過程が進行することが明らかになっている。
【0011】
前記3種類の転写因子群は、脂肪細胞の分化の比較的初期から発現が上昇することが明らかにされており、複数の標的遺伝子の発現を制御するマスターレギュレーターと考えられている。これらの転写因子群を発現時期の面から見ると、C/EBPβとC/EBPδにおいて比較的初期に発現が増加することが知られている。しかし、前駆脂肪細胞より脂肪細胞へ分化する最も初期に、即ち、脂肪細胞分化誘導開始から3時間目をピークとして6時間以内に、どのような遺伝子が活性化されているかについてはほとんど明らかにされていない。
【0012】
【発明が解決しようとする課題】
前駆脂肪細胞より脂肪細胞へ分化する最も初期、即ち、脂肪細胞分化誘導開始6時間以内に活性化される遺伝子の発現の有無、その程度、遺伝子産物としてのタンパク質の有無、その量、発現している場所の特定、また、遺伝子の変異を分析することは、肥満のメカニズムを解明し、さらに肥満の進行状況を適切に把握し、肥満の予防あるいは治療に役立たせる上で極めて重要な要素となりうる。そのために、この遺伝子の特定ならびにこの遺伝子産物であるタンパク質を特定し、こうした遺伝子あるいはタンパク質を検出、あるいは測定することが望まれる。
【0013】
そこで本発明は、前駆脂肪細胞より脂肪細胞へ分化誘導開始6時間以内に活性化される遺伝子を見出し、該遺伝子を含むベクター、該ベクターを保持する形質転換体、該形質転換体から生産されるタンパク質、該タンパク質に特異的な抗体、該タンパク質の製造方法、該タンパク質に対するアゴニストまたはアンタゴニスト、これらの化合物を含む医薬、診断薬を提供することを目的とする。
【0014】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、前駆脂肪培養細胞株として周知のマウス3T3−L1細胞(ATCC No.CCL−92.1.)を用い、分化の最も初期の過程で遺伝子の発現の変動を解析するために、脂肪細胞分化誘導前と誘導3時間後においてサブトラクション法によるクローニングを行った。その結果、脂肪細胞分化誘導開始後3時間目をピークとして6時間以内に活性化される遺伝子として配列番号1で表される塩基配列のポリヌクレオチドが得られた。該ポリヌクレオチドをマウスのクローン104ヌクレオチドと呼ぶ。
【0015】
即ち、本発明のポリヌクレオチドは、脂肪細胞分化に関連し且つ脂肪細胞分化誘導開始後3時間目をピークとして6時間以内に発現するタンパク質をコードするポリヌクレオチドである。
【0016】
本明細書において、活性化とは、発現することあるいは発現が亢進することを意味する。
【0017】
配列番号1で表されるマウスの塩基配列と相同性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドをhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/において検索したところ、相同性が認められる塩基配列は、本発明の出願時点において登録されていないことが分かった。
【0018】
本発明のポリヌクレオチドは、好ましくは、配列番号1で表される塩基配列に対して同一、もしくは少なくとも80%、85%、90%または95%の相同性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドであって、脂肪細胞分化誘導開始後3時間目をピークとして6時間以内に発現するタンパク質をコードし、且つ、脂肪細胞分化誘導開始後12時間以内に活性化されるポリヌクレオチドである。
【0019】
また、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号1で表される塩基配列の番号61から3681に対して同一もしくは少なくとも80%、85%、90%または95%の相同性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドであって、脂肪細胞分化誘導開始後3時間目をピークとして6時間以内に発現するタンパク質をコードするポリヌクレオチドである。
【0020】
配列番号1で表されるマウスの塩基配列のポリヌクレオチドに基づき、新規な塩基配列のヒトのポリヌクレオチドをホモロジーサーチにより推定して決定したので、該塩基配列を配列番号3に示す。
【0021】
即ち、本発明のヒトのポリヌクレオチドは、配列番号3で表される塩基配列を含むポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドであって、脂肪細胞分化に関連するタンパク質をコードするポリヌクレオチドであり、例えば、cDNAが挙げられる。該ポリヌクレオチドをヒトのクローン104ヌクレオチドと呼ぶ。本発明のポリヌクレオチドは、配列番号3で表される塩基配列に対して同一もしくは少なくとも80%、85%、90%又は95%の相同性を有するポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドである。
【0022】
また、本発明のヒトのポリヌクレオチドは、配列番号3で表される塩基配列の番号58から3669を含むポリヌクレオチドに同一、少なくとも80%、85%、90%又は95%の相同性を有するポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドである。または該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドであって、脂肪細胞分化に関連するタンパク質をコードするポリヌクレオチドである。
【0023】
配列番号1で表されるマウスのクローン104ポリヌクレオチドと配列番号3で表されるヒトのクローン104ポリヌクレオチドとの一致率は、82.4%(5678/6894)となる。
【0024】
本発明の上記マウスのポリヌクレオチドは、脂肪細胞分化誘導開始後3時間目をピークとして6時間以内にマウスの細胞、その他の動物の細胞から抽出することができる。また、本発明のヒトのポリヌクレオチドはマウスのポリヌクレオチドと同様に脂肪細胞分化誘導開始後3時間目をピークとして6時間以内にヒトの細胞、その他の動物の細胞から抽出することができると推定される。また、ゲノムDNA、細胞・組織由来のcDNA、細胞・組織由来のcDNAライブラリー、合成DNAの何れからでも本発明のポリヌクレオチドを得ることができる。本発明の「ポリヌクレオチド」には、DNAまたはRNAがある。
【0025】
本明細書で単に「クローン」と呼ぶ場合には、クローン104ヌクレオチド又はクローン104ポリヌクレオチドを意味することがある。
【0026】
本発明のマウスのタンパク質は、脂肪細胞分化誘導開始後3時間目をピークとして6時間以内に発現されるタンパク質である。
【0027】
本発明のマウスのタンパク質は、好ましくは、下記配列番号2で表されるタンパク質のアミノ酸配列の全長に対して同一もしくは少なくとも80%、85%、90%または95%の相同性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質である。さらに好ましくは、本発明のタンパク質は、配列番号1で表されるポリヌクレオチドの塩基配列の番号61から3681に対して同一もしくは少なくとも80%、85%、90%または95%の相同性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドの遺伝子翻訳産物である。
【0028】
下記配列番号2で表されるタンパク質のアミノ酸配列と100%の相同性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドには、マウスの脂肪細胞分化の初期に活性化されるタンパク質が挙げられる。該タンパク質をマウスのクローン104タンパク質と呼ぶ。
【0029】
また、本発明のヒトのタンパク質は、配列番号4で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質である。さらに、本発明のタンパク質は、配列番号4で表されるアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%または95%の相同性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質を含む。また、本発明のヒトのタンパク質は、下記配列番号3で表されるポリヌクレオチドの塩基配列の番号58から3669を含むポリヌクレオチドの遺伝子翻訳産物である。本発明は配列番号3の観点から、配列番号4で表されるアミノ酸配列のタンパク質の全長に対して少なくとも80%、85%、90%、95%または100%の相同性を有するアミノ酸配列を含む該タンパク質またはその塩を含む。
【0030】
下記配列番号4で表されるタンパク質は、ヒトの脂肪細胞分化に関連するタンパク質である。該タンパク質をヒトのクローン104タンパク質と呼ぶ。
【0031】
本発明のポリヌクレオチドあるいは、該ポリヌクレオチドの遺伝子翻訳産物として生産されるタンパク質またはペプチドは、肥満、高血圧、高脂血症、糖尿病、動脈硬化による心臓病や脳卒中等から選ばれる生活習慣病の治療または診断の用途に期待される。
【0032】
配列の相同性
本発明の別の発明において「塩基配列に対し少なくとも80%」、或いは「アミノ酸配列に対して少なくとも80%」とする理由は、マウスとヒトの間にはアミノ酸レベルで84%の相同性があることが既に報告されているからである[Y.Zhangら、Nature, 第372巻、第425頁(1994)、特開平8−333394号公報]。高血圧、糖尿病、肥満などの生活習慣病に関わる遺伝子群は相同性が動物間で80%以上保存されていることが分かっている(特開平11−75865号公報)ことから、本発明のポリヌクレオチドおよび本発明のタンパク質においてもヒトなどの霊長類、ウサギなどの齧歯類なども本配列を基本とし、相同性が80%以上を越えると考えることが妥当である。なお、配列番号1で表されるマウスのクローン104ポリヌクレオチドのうち塩基配列の番号61から3681までのORFと配列番号3で表されるヒトのクローン104ポリヌクレオチドのうち塩基配列の番号58から3669までのORFとの一致率は、82.4%(5678/6894)である。
【0033】
本発明のポリヌクレオチドのクローニング
本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドのクローニングの手段としては、例えば、本発明のタンパク質の部分塩基配列を有する合成DNAプライマーを用いてPCR法によって増幅するか、または適当なベクターに組み込んだDNAを本発明のタンパク質の一部あるいは全領域をコードするDNA断片もしくは合成DNAを用いて標識したものとのハイブリダイゼーションによって選別することができる。ハイブリダイゼーションの方法は、例えば、モレキュラー・クローニング(Molecular Cloning )2nd(J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989 )に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。クローン化されたタンパク質をコードするDNAは目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用することができる。該DNAはその5’末端側に翻訳開始コドンとしてのATGを有し、また3’末端側には翻訳終止コドンとしてのTAA、TGAまたはTAGを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成DNAアダプターを用いて付加することもできる。
【0034】
ポリヌクレオチドを発現させるベクター等
本発明のベクターは、配列番号1で表されるポリヌクレオチドに対して同一もしくは少なくとも80%、85%、90%または95%の相同性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドを含有させた組み換えベクターであり、好ましくは、配列番号1で表される塩基配列の番号61から3681に対して同一もしくは少なくとも80%、85%、90%または95%の相同性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドを含有させた組み換えベクターである。
【0035】
また、ヒトの脂肪細胞分化に関するポリヌクレオチドを含有する本発明のベクターは、配列番号3で表される塩基配列に対して同一もくしは少なくとも80%、85%、90%または95%の相同性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドを含有させた組み換えベクターであり、好ましくは、配列番号3で表される塩基配列の番号58から3669の塩基配列に対して同一もしくは少なくとも80%、85%、90%または95%の相同性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドを含有させた組み換えベクターである。
【0036】
本発明のポリヌクレオチド配列を有するベクターは既知の方法で構築することが可能である。こうした目的に適したベクターは、本発明のポリヌクレオチドの挿入部位の上流にプロモーター領域を有する。このプロモーターは既知のものを使用することが可能であり、宿主細胞により選択することが可能である。例えば、宿主を大腸菌などの細菌にした場合は、lacプロモータ、trpプロモータ、T7プロモータ、tacプロモータ、λPLプロモータなどを利用することが可能である。酵母を宿主とする場合には、GAPDHプロモータ、ADHプロモータ、PGKプロモータ、PH05プロモータなどが挙げられる。動物由来の細胞を宿主とした場合には、ヒトサイトメガロウイルスプロモータ、SV40ウイルス由来のプロモータ、EF−1αプロモータ、βアクチンプロモータ、メタロチオネインプロモータなどが挙げられる。本発明のポリヌクレオチドを発現するベクターにおける本発明のポリヌクレオチドの挿入部位下流には、転写終結シグナルがあることが望ましい。さらに、該ベクターには薬剤耐性マーカーなどの識別マーカーがあることが望ましい。
【0037】
宿主
本発明で使用可能な宿主には、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などを用いることができる。
【0038】
エシェリヒア属菌の具体例としては、Escherichia coli JM109〔ATCC53323、東洋紡株式会社製〕、JM103〔ヌクイレック・アシッズ・リサーチ,(Nucleic Acids Research),9巻,309( 1981) 〕,K12・DH1〔プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー(Proc. Natl. Acad. Sci.USA),60巻,160( 1968) 〕,JA221〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(Journal of Molecular Biology)〕,120巻,517( 1978) 〕,HB101〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー,41巻,459( 1969) 〕,C600〔ジェネティックス(Genetics),39巻,440( 1954) 〕などが挙げられる。
【0039】
バチルス属菌としては、例えば、バチルス・サブチルス(Bacillus subtilis )MI114〔ジーン,24巻,255( 1983) 〕,207−21〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリー(Journal of Biochemistry ),95巻,87( 1984) 〕などが挙げられる。
【0040】
酵母としては、例えば、サッカロマイセスセレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)AH22,AH22R− ,NA87−11A,DKD−5D,20B−12、シゾサッカロマイセスポンベ(Schizosaccharomyces pombe )NCYC1913,NCYC2036、サッカロマイセスピキアパストリス(Saccharomyces picjiapastoris )などが挙げられる。
【0041】
昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがAcNPVの場合は、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞(Spodoptera frugiperda cell;Sf細胞)、Trichoplusia ni の中腸由来のMG1細胞、Trichoplusia ni の卵由来のHigh FiveTM 細胞、Mamestrabrassicae由来の細胞またはEstigmena acrea 由来の細胞などが挙げられる。ウイルスがBmNPVの場合は、蚕由来株化細胞(Bombyx mori N 細胞;BmN細胞)などが挙げられる。該Sf細胞としては、例えば、Sf9細胞(ATCC CRL1711)、Sf21細胞(以上、Vaughn, J.L.ら、イン・ヴィボ(in Vivo ),13, 213−217,(1977) )などが挙げられる。
【0042】
昆虫としては、例えば、カイコの幼虫などが挙げられる〔前田ら、ネイチャー(Nature),315巻,592( 1985) 〕。
【0043】
動物細胞としては、例えば、サル細胞COS−7,Vero ,チャイニーズハムスター細胞CHO(以下、CHO細胞と略記),dhfr遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞CHO〔略語:CHO(dhfr− )細胞〕,マウスL細胞,マウスAtT−20,マウスミエローマ細胞,ラットGH3,ヒトFL細胞などが用いられる。
【0044】
形質転換体の製造
本発明の形質転換体は、前記組み換えベクターを前記宿主に保持させたものである。
【0045】
エシェリヒア属菌を形質転換するには、例えば、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンジイズ・オブ・ザ・ユーエスエー(Proc. Natl. Acad. Sci.USA),69巻,2110( 1972) やジーン(Gene),17巻,107( 1982) などに記載の方法に従って行なうことができる。
【0046】
バチルス属菌を形質転換するには、例えば、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス(Molecular & General Genetics ),168巻,111( 1979) などに記載の方法に従って行なうことができる。
【0047】
酵母を形質転換するには、例えば、メッソズ・イン・エンザイモロジー(Methods in Enzymology ),194巻,182−187(1991)、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー(Proc. Natl. Acad. Sci.USA),75巻,1929( 1978)などに記載の方法に従って行なうことができる。
【0048】
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、例えば、バイオ/テクノロジー(Bio/Technology),6, 47−55(1988) )などに記載の方法に従って行なうことができる。
【0049】
動物細胞を形質転換するには、例えば、細胞工学別冊8新細胞工学実験プロトコール.263−267(1995)(秀潤社発行)、ヴィロロジー(Virology),52巻,456( 1973) に記載の方法に従って行なうことができる。
【0050】
形質転換体の培養
本発明の形質転換体の培養は以下の条件を考慮したタンパク質の生成に十分な条件下で、形質転換体を培養することができ、その結果、培地または形質転換体からタンパク質を回収することができる。
【0051】
宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどが挙げられる。また、酵母、ビタミン類、生長促進因子などを添加してもよい。培地のpHは約5〜8が望ましい。
【0052】
エシェリヒア属菌を培養する際の培地としては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むM9培地〔ミラー(Miller),ジャーナル・オブ・エクスペリメンツ・イン・モレキュラー・ジェネティックス(Journal of Experiments in Molecular Genetics),431−433,Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972〕が好ましい。ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、例えば、3β−インドリルアクリル酸のような薬剤を加えることができる。宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約15〜43℃で約3〜24時間行ない、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。
【0053】
宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約30〜40℃で約6〜24時間行ない、必要により通気や撹拌を加えることもできる。宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、バークホールダー(Burkholder)最小培地〔Bostian, K. L.ら、「プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー(Proc. Natl. Acad. Sci.USA),77巻,4505( 1980) 〕や0. 5%カザミノ酸を含有するSD培地〔Bitter, G. A. ら、「プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー(Proc. Natl. Acad. Sci.USA),81巻,5330(1984)〕が挙げられる。培地のpHは約5〜8に調整するのが好ましい。培養は通常約20℃〜35℃で約24〜72時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
【0054】
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、培地としては、Grace’s Insect Medium (Grace, T.C.C.,ネイチャー(Nature),195,788(1962))に非動化した10%ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のpHは約6.2〜6.4に調整するのが好ましい。培養は通常約27℃で約3〜5日間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
【0055】
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、約5〜20%の胎児牛血清を含むMEM培地〔サイエンス(Seience ),122巻,501( 1952) 〕,DMEM培地〔ヴィロロジー(Virology),8巻,396( 1959) 〕,RPMI1640培地〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル・アソシエーション(The Jounal of the American Medical Association)199巻,519( 1967) 〕,199培地〔プロシージング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォー・ザ・バイオロジカル・メディスン(Proceeding of the Society for the Biological Medicine ),73巻,1( 1950) 〕などが用いられる。pHは約6〜8であるのが好ましい。培養は通常約30℃〜40℃で約15〜60時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。以上のようにして、形質転換体の細胞内に本発明のタンパク質を生成せしめることができる。
【0056】
無細胞系によるタンパク質生成
上述した形質転換体を培養することによってタンパク質を生成させる以外に、インビトロテック社(http://www.inbitrotech.co.jp/)の高効率無細胞タンパク質合成システムやRoche社のインビトロトランスレーション・トランスクリプションシステムなどを用いた無細胞培養システムを用いることによって、当該タンパク質を生成させることも可能である。
【0057】
タンパク質の分離精製
上記培養物から本発明のタンパク質を分離精製するには、例えば、下記の方法により行なうことができる。本発明のタンパク質を培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび/または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過によりタンパク質の粗抽出液を得る方法などが適宜用いられる。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどの蛋白質変性剤や、トリトンX−100(登録商標、Union Carbide 社製)などの界面活性剤が含まれていてもよい。これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
【0058】
上記各方法で得られるタンパク質が遊離体で得られた場合には、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に変換することができる。なお、組換え体が産生するタンパク質を、精製前または精製後に適当な蛋白修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することもできる。蛋白修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いられる。かくして生成する本発明のタンパク質またはその塩の存在は、標識したリガンドとの結合実験および特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセイなどにより測定することができる。
【0059】
ヒトホモログの塩基配列及びアミノ酸配列
脂肪細胞分化誘導開始3時間目をピークとして6時間以内に活性化されるポリヌクレオチドであって、前記に決定した配列番号1で示されるマウスの全長DNA配列をNCBI Genome Sequencing(Human Genome Database)でホモロジーサーチすることによって相同性の高い配列を見出して、ヒトホモログの全長を予測することができる。このようにして予測して配列決定を行ったヒトホモログの全長は、配列番号3で示される塩基配列である。また、配列番号3で示されるヒトホモログの全長の塩基配列において、塩基配列の番号58から3669までのORFは、1204アミノ酸からなるタンパク質をコードする遺伝子であり、該タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号4であると予想される。本発明のヒトのクローン104ポリヌクレオチドは、マウスのクローン104ポリヌクレオチドと同様に、脂肪細胞分化誘導開始3時間目をピークとして6時間以内に活性化されると推定される。
【0060】
ヒトホモログの相同性
配列番号3で表されるクローン104ヒトホモログ(単に、ヒトホモログと呼ぶときがある)の塩基配列と相同性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドは、前記したhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/には登録されていない。
【0061】
アンタゴニストおよびアゴニストの同定方法
本発明のタンパク質をアンタゴナイズまたはアゴナイズする化合物の同定方法は次の工程(a)(b)の工程を含む。
(a)本発明のタンパク質を発現している細胞または本発明のタンパク質に応答する細胞に候補化合物を接触させる工程;
(b)結合、または機能的応答の刺激もしくは阻害を観察する工程;あるいは候補化合物と接触した細胞の本発明のタンパク質の活性に関する能力を接触しなかった同種の細胞と比較する工程。
【0062】
上記同定方法により、本発明のアンタゴニスト或いはアゴニストを同定することができる。
【0063】
ポリヌクレオチドの検出方法;ポリヌクレオチドによる診断
診断対象者の本発明のタンパク質の活性化に関連した、診断対象者における疾病、またはかかる疾病に対する感受性の診断は次のように行うことができる。即ち、診断対象者のゲノム中の本発明のタンパク質をコードしている塩基配列中の変異の存在または不存在を決定すること;および/または該対象者由来の試料中の本発明のタンパク質の存在または量を分析することにより行う。
【0064】
本発明のポリヌクレオチドを検出あるいは測定するには、本発明のポリヌクレオチドの塩基配列から連続する8塩基以上100塩基以下の配列を有するプライマーを合成し、細胞あるいは血液などからmRNAを抽出し、RT−PCR法によりmRNAをDNAに変換しながら増幅する、あるいはT7−based mRNA増幅法(Van GelderR.N.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:1663−1667,1990)により、目的ポリヌクレオチドを増幅し、増幅されたポリヌクレオチドを種々の電気泳動で検出することが可能である。また、Cy3−dUTPあるいは、Cy5−dUTPをポリヌクレオチド増幅時に添加して、増幅ポリヌクレオチドを蛍光標識し、DNAチップまたはマイクロアレイ等(Brown, P.O.et al.:Nature Genet.,21 sup.:33−37,1999)により検出することも可能である。
【0065】
また、抽出したmRNAの量を定量する方法としては、蛍光色素を用いた定量的PCR法が行われる(Livak,K.et al.:PCR Methods Applic., 4:357−362,1995)。この方法により、細胞中のmRNAがどの程度存在するかがわかる。この発現の程度によって、肥満の状況を把握することができる。
【0066】
DNAチップまたはマイクロアレイ等を用いて、複数のポリヌクレオチドを同時に検出、測定することも可能である。例えば、糖尿病、高血圧、肥満などの生活習慣病に関連する、本発明のポリヌクレオチドを含む複数のポリヌクレオチドを基盤上に結合させておき、上述したような方法で、検体から調製した標識ポリヌクレオチドを反応させてどのポリヌクレオチドが活性化しているのか、存在しているのかということを判定することが可能となる。この判定によって、生活習慣病の状況を把握し、治療に役立てることが可能になる。また、本発明のポリヌクレオチドを含む複数の肥満関連ポリヌクレオチドを基盤上に結合させておき、同様の手技により、肥満の状況、程度を把握することが可能となり、治療に役立てることが可能となる。
【0067】
また、本発明のポリヌクレオチドを検出するにはアプライドバイオシステム社のABI PRISM310あるいはPRISM3100あるいはPRISM3700などを利用したキャピラリー電気泳動による検出も可能である。
【0068】
ポリヌクレオチド中の特定の核酸塩基が他の塩基と置換されていることにより、遺伝子産物としてのタンパク質の活性が変化する、本発明のタンパク質のその受容体への結合能が変化する、或いは該タンパク質の薬剤に対しての反応性が変化する、或いは該タンパク質の安定性が変化する、或いは該タンパク質の合成が途中で停止してしまうなどの、遺伝子多型(塩基多型:single nucleotide polymorphisms 、以下SNPs)が、非常に重要であることがわかってきているが、本発明のポリヌクレオチドにおいても、このSNPsを検出する意義は非常に重要である。
【0069】
本発明の脂肪細胞分化関連のポリヌクレオチドの高密度のSNPマーカーの遺伝子地図がつくられれば,糖尿病の原因遺伝子を特定できるSNPsを用いて健康者と患者間の比較が容易にできる.高密度のSNPマップを使えば家族と関連のない大規模なサンプルを用いて相関解析(Whole Genome Association Study)が可能となる。SNPsは、特に1塩基が置換することにより、対応するアミノ酸が変化し、この変化によって本来の蛋白質の物性の変化が生じる。例えば、酵素においては活性中心近傍のアミノ酸が変化することによる酵素活性の低下や亢進が挙げられ、受容体であれば受容中心近傍のアミノ酸が変化することによる結合力の低下や上昇が挙げられる。それぞれの人の遺伝子多型に応じて、薬剤の投与量を調整したり、異なる薬剤を選択することをテーラードメディシンなどと云われる。
【0070】
本発明のポリヌクレオチドにおけるSNPsを検出する方法としては、例えば、アメリカNanogen 社(http://www.nanogen.com)のnanochipを用いる方法(Gillesら、Nature biotechnology 365−370 17 1999)、ポリヌクレオチド配列を決定する方法(http://www.pyrosequencing.com )、DNAチップ又はDNAアレイを用いた方法、質量分析計を用いる方法(Leglerら、 Transfusion,36:426−431、1996 )、プライマーエクステンションを用いた方法、Luminex法(Iannone ら、Cytometry,39:131−140,2000 )などが適用可能である。
【0071】
上記各ポリヌクレオチドの検出のために構成される診断薬は、配列番号1で表される塩基配列に対して同一もしくは少なくとも80%、85%、90%又は95%の相同性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドを含有する診断薬である。好ましくは、配列番号1で表される塩基配列の番号61から3681に対して同一もしくは少なくとも80%、85%、90%又は95%の相同性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドを含有する診断薬である。
【0072】
また、配列番号1で表される塩基配列に対して同一もしくは少なくとも80%、85%、90%又は95%の相同性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチド或いは該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドのうち、連続する少なくとも10個の塩基配列を有するポリヌクレオチドを含む診断薬としてもよい。好ましくは、配列番号1で表される塩基配列の番号61から3681に対して同一もしくは少なくとも80%、85%、90%又は95%の相同性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドのうち、連続する少なくとも10個の塩基配列を有するポリヌクレオチドを含む診断薬とすることができる。
【0073】
また、ヒトのポリヌクレオチドの検出の観点にたった診断薬は、配列番号3に表される塩基配列に対して同一もしくは少なくとも80%、85%、90%又は95%の相同性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドを含有する診断薬である。好ましくは、配列番号3で表される塩基配列の番号58から3669に対して同一もしくは少なくとも80%、85%、90%又は95%の相同性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドを含有する診断薬である。
【0074】
また、ヒトのポリヌクレオチドの検出の観点にたった診断薬は、配列番号3に表される塩基配列に対して同一もしくは少なくとも80%、85%、90%又は95%の相同性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドのうち、連続する少なくとも10個の塩基配列を有するポリヌクレオチドを含む診断薬である。好ましくは、配列番号3で表される塩基配列の番号58から3669に対して同一もしくは少なくとも80%、85%、90%又は95%の相同性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドのうち、連続する少なくとも10個の塩基配列を有するポリヌクレオチドを含む診断薬である。
【0075】
タンパク質またはペプチドの検出、およびタンパク質またはペプチドに対する抗体の検出、および診断への応用
本発明のタンパク質を検出するには、免疫測定法が一般的に用いられる。例えば、配列番号2または配列番号4で示されるタンパク質、あるいはそれらの各配列に含まれる3個以上の連続したアミノ酸配列からなるペプチドを、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ニワトリなどに免疫して抗体を産生させることができる。この免疫を行う際に、通常、アジュバントといわれる物質を加えるのが一般的である。アジュバントとしては、フロイントのコンプリートアジュバント、インコンプリートアジュバント、明礬など種々の公知のアジュバントを用いることができる。マウスを免疫した場合では、一定期間免疫を行った後、免疫したマウスの脾臓を取り出して、抗体産生細胞であるこの脾臓細胞とミエローマ細胞と融合させて、クローニングを行って配列番号2または配列番号4のタンパク質を特異的に結合する抗体を産生するハイブリドーマを調製する。
【0076】
ハイブリドーマを培養することによって、産生する抗体を種々の方法で精製し、得られた抗体を固相に結合させる。これとは別に、該抗体を酵素、蛍光色素、金属コロイド、ラテックス、DNA、RNAなどで標識して標識化抗体を得る。前記固相化抗体と該標識化抗体を、細胞、血液あるいはその分画フラクションを検体として反応させ、固相に結合した標識物の有無、あるいは量を測定することにより、検体中の本発明のタンパク質の量を測定することができる。
【0077】
本発明のタンパク質は、脂肪細胞内に特異的に見出されるために、その量を測定することによって肥満の程度、状況を把握することが可能となる。
【0078】
検体中に含まれる本発明のタンパク質の量を測定するには、該タンパク質あるいは該タンパク質の一部となるペプチドを抗原として、家兎、ネズミ、ヒツジ、ヤギなどに免疫して抗体を調製する(この場合、特定の認識部位に結合することが出来るモノクローナル抗体を調製することも含まれる。)。ここで得られた抗体を、ポリスチレン、ラテックス、ニトロセルロースなどの材質のものに物理的に吸着させる、あるいは、抗体にビオチンを予め導入しておき、固相に予め結合させておいたストレプトアビジンまたはアビジンなどと反応させて固相を調製する、あるいは、固相上に存在するカルボキシル基、アミノ基、スルフヒドリル基などを介して、抗体を共有結合させることにより、抗体結合固相を調製する。ここで得られた抗体結合固相と、細胞、血液あるいはその分画フラクションを検体として反応させ、検体中に含まれる抗原を固相に結合させ、次いで、抗体結合固相に結合した抗原に、上述した工程によって調製した抗体に、放射性同位元素、酵素、蛍光色素、核酸、ビオチンなどの標識を結合させた標識抗体を反応させる。なお、抗体結合固相と検体と標識抗体を反応させる工程は、同時に行うこともできる。こうして固相に結合した標識物を、測定することによって検体中に含まれる該タンパク質を測定することが出来る。
【0079】
抗体を検出する方法は、これとは別に以下のような方法でも可能である。すなわち、本発明のタンパク質あるいは該タンパク質の一部となるペプチドを抗原として固相化して抗原固定化固相とし、次いで、該抗原固定化固相に対して、抗原に標識した物質と、細胞、血液あるいはその分画フラクションを検体として反応させ、結合した標識物を、定量することによって、検体中に含まれる抗体量を測定することができる。したがって、本発明のタンパク質に対して免疫学的に特異的な抗体を検出する診断薬を構築できる。
【0080】
以上、いずれも抗原あるいは抗体を直接固相化した反応系を説明したが、米国特許第5,789,165のように、固相にオリゴヌクレオチドを結合させておき、このオリゴヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチドを結合させた抗原あるいは抗体を結合させた反応系も適用可能である。さらに、特開平10−253632号公報、EP0905517A1の記載にあるように、異なる項目を同時に検出あるいは測定することも可能となる。例えば、糖尿病、高血圧、肥満などの生活習慣病に関連するマーカーを同時に検出することにより、どのタンパク質がどの程度検出されるかによって生活習慣病がどの程度のレベルであるのかを判断することも可能になると考えられる。また、肥満関連のタンパク質あるいはペプチドなどのマーカーを同時に検出、測定することによって、肥満の状況を把握し治療に役立てることも可能になると考えられる。
【0081】
本発明のタンパク質、あるいは該タンパク質に対する抗体を免疫学的に検出するためには上述した方法以外に、免疫凝集法による方法(特開平6−3358号公報)、Biacore International AB(スウェーデン)社(http://www.biacore.co.jp)のBIAcore などによる表面プラズモン共鳴(Surface Plasmon Resonance =SPR )による方法、水晶発振子を用いた方法(特開平9−292397号公報)、などによる方法が挙げられる。
【0082】
以上の本発明のタンパク質を検出するためのに構成される診断薬は、本発明のタンパク質またはその塩を含有している診断薬が挙げられる。また、好ましい態様の本発明の診断薬は、本発明のタンパク質またはその塩の連続する少なくとも5個のアミノ酸からなるタンパク質またはペプチドを含む診断薬が挙げられる。また、本発明のタンパク質を検出するための別の診断薬は、本発明のタンパク質に対する抗体を含有する診断薬が挙げられる。
【0083】
治療目的の使用
本発明は、過剰または不十分な量の本発明のタンパク質あるいは該タンパク質の一部を構成するペプチドの活性に関連する、肥満症、高血圧症、高脂血症、糖尿病、腎臓疾患、インスリン耐性、脂肪異栄養、CNS疾患、並びに動脈硬化による心臓病又は脳卒中、等の生活習慣病のごとき異常な状態の治療方法を提供する。本発明のタンパク質あるいは該タンパク質の一部を構成するペプチドの活性が過剰な場合、いくつかの方法を用いることができる。
【0084】
1つの手段は、有効量の上記阻害剤化合物(アンタゴニスト)を医薬上許容される担体と調合してなる医薬を治療対象者に投与して、本発明のタンパク質あるいはペプチドへのリガンドの結合をブロックすることあるいは第2のシグナルを阻害することにより活性化を阻害し、そのことにより異常な状態を改善することを特徴とする。
【0085】
他の手段は、本発明のポリヌクレオチドを活性化する治療上有効量の化合物(すなわち、アゴニスト)を医薬上許容される担体と調合してなる医薬を投与し、そのことにより異常な状態を改善することを特徴とする。
【0086】
もう1つのアプローチにおいて、本発明のタンパク質あるいはペプチドと競争してリガンドに結合する能力を有している可溶性形態の本発明のタンパク質あるいはペプチドまたはそれらの塩を投与してもよい。かかる競争物質の典型的な具体例は本発明のタンパク質あるいは該タンパク質の一部を構成するペプチドを含む。即ち、本発明の医薬は該タンパク質或いはその塩、または該タンパク質或いはその塩の連続する少なくとも5個のアミノ酸からなるペプチドを含む医薬とすることができる。
【0087】
このような本発明の医薬は、配列番号2で表されるタンパク質の全長に対して同一もしくは少なくとも80%、85%、90%又は95%の相同性を有するタンパク質またはその塩を含む医薬、或いは該タンパクの連続する少なくとも5個のアミノ酸からなるペプチドを含む医薬である。
【0088】
また、本発明の医薬は、配列番号4で表されるタンパク質の全長に対して同一もしくは少なくとも80%、85%、90%又は95%の相同性を有するタンパク質またはその塩を含む医薬、或いは該タンパクの連続する少なくとも5個のアミノ酸からなるペプチドを含む医薬である。
【0089】
さらにもう1つのアプローチにおいて、発現ブロック法を用いて本発明のポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドを投与して、遺伝子の活性化を阻害してもよい。
【0090】
このような本発明の医薬は、配列番号1で表されるクローン104ポリヌクレオチドの塩基配列に対して同一もしくは少なくとも80%、85%、90%又は95%の相同性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドを含有する医薬である。さらに好ましくは、配列番号1で表される塩基配列の番号61から3681に対して同一もしくは少なくとも80%、85%、90%又は95%の相同性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドを含有する医薬である。
【0091】
また、配列番号1で表される塩基配列に対して同一もしくは少なくとも80%、85%、90%又は95%の相同性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドのうち、連続する少なくとも10個の塩基配列を有するポリヌクレオチドを含む医薬としてもよく、さらに好ましくは、配列番号1で表される塩基配列の番号61から3681に対して同一もしくは少なくとも80%、85%、90%又は95%の相同性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドあるいは該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドに対し、相補的であり且つ連続する少なくとも10個の塩基配列を有するポリヌクレオチドを含む医薬としてもよい。
【0092】
特に、ヒトのクローン104ポリヌクレオチドについては、配列番号3で表される塩基配列に対して同一もしくは少なくとも80%、85%、90%又は95%の相同性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドを含有する医薬である。好ましくは、配列番号3で表される塩基配列の番号58から3669に対して同一もしくは少なくとも80%、85%、90%又は95%の相同性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドを含有する医薬である。
【0093】
また、配列番号3で表される塩基配列に対して同一もしくは少なくとも80%、85%、90%又は95%の相同性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドのうち、連続する少なくとも10個の塩基配列を有するポリヌクレオチドを含む医薬としてもよく、さらに好ましくは、配列番号3で表される塩基配列の58から3669に対して同一もしくは少なくとも80%、85%、90%又は95%の相同性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドあるいは該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドに対し、相補的であり且つ連続する少なくとも10個の塩基配列を有するポリヌクレオチドを含む医薬としてもよい。
【0094】
これらの医薬は、翻訳開始コドンであるATGの前後の配列のアンチセンスを治療薬に利用するものである。これらの医薬には公知の方法で、細胞内で生成した、あるいは別個に投与された、アンチセンス配列を用いることができる。例えば、Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression,CRCPress,Boca Raton, FL(1988) 中、O’Connor,J.Neurochem(1991)56:560。別法として、遺伝子とともに三重らせんを形成するオリゴヌクレオチドを提供してもよい。例えば、Lee et al.,Nucleic Acids Res(1979)6:3073;Cooney et al.,Science(1988)241:456;Dervan et al.,Science(1991)251:1360 。これらのオリゴマーはそれ自体投与することができ、あるいは関連オリゴマーをインビボで活性化させることもできる。
【0095】
別法として、遺伝子治療を用いて、治療対象者中の細胞による本発明のポリヌクレオチドの細胞内での生成を有効ならしめてもよい。例えば、上記のごとく本発明のポリヌクレオチドを処理加工して複製欠損レトロウイルスベクターに入れて活性化するようにしてもよい。次いで、レトロウイルス発現構築物を単離し、本発明のタンパク質をコードしているRNAを含むレトロウイルスプラスミドベクターでトランスダクションしたパッケージング細胞中に導入して、次いでパッケージング細胞が目的のポリヌクレオチドを含む感染性ウイルス粒子を生成するようにしてもよい。これらのプロデューサー細胞を治療対象者に投与して細胞をインビボで処理加工して、インビボでタンパク質を活性化するようにしてもよい。遺伝子治療の方法には、Human Molecular Genetics,T.Strachan and A.P.Read,BIOS Scientific Publishers Ltd(1986) 中、第20章、Gene Therapy and other Molecular Genetic−based Therapeutic Approaches (およびその中の引用文献)が適用可能である。
【0096】
配列番号2で表されるタンパク質の全長に対して同一もしくは少なくとも80%、85%、90%又は95%の相同性を有するタンパク質或いは該タンパク質を構成するアミノ酸配列の一部からなるペプチドに対して免疫学的に特異的な抗体を含有させて医薬とすることができる。また、配列番号4で表されるタンパク質の全長に対して同一もしくは少なくとも80%、85%、90%又は95%の相同性を有するタンパク質或いは該タンパク質を構成するアミノ酸配列の一部からなるペプチドに対して免疫学的に特異的な抗体を含有させて医薬とすることができる。このような抗体を投与した場合には、脂肪細胞分化活性を減弱させることが期待できる。
【0097】
処方および投与
本発明のタンパク質の増強された活性化を必要とする治療対象者の治療方法においては、可溶性形態の前記本発明のタンパク質、または該タンパク質の一部を構成するペプチド、またはそれらの塩、ならびに該タンパク質または該タンパク質の一部を構成するペプチドに対する抗体、アゴニスト、アンタゴニストペプチド、またはそれらの小型分子の治療上有効量を医薬として治療対象者に投与してもよい。
【0098】
かかる処方は、治療上有効量の前記物質、またはそれらの塩、および医薬上許容される担体または賦形剤を含んでなる。かかる担体としては、セイライン、緩衝化セイライン、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの混合物が挙げられるが、これらに限らない。処方は投与経路に適したものとすべきであり、当業者によく知られている。さらに本発明は、上記本発明成分の1種またはそれ以上を充填した、1個またはそれ以上の容器を含んでなる医薬パックおよびキットにも関する。
【0099】
本発明のタンパク質および他の化合物を単独で使用してもよく、あるいは治療化合物のごとき他の化合物と一緒に使用してもよい。医薬組成物の全身投与の好ましい形態は、注射、典型的には静脈注射を包含する。皮下、筋肉内または腹腔内のごとき他の注射経路を用いることもできる。全身投与のための別の手段は、胆汁酸塩またはフシジン酸または他の界面活性剤のごとき浸透剤を用いる経粘膜または経皮投与を包含する。さらに、腸溶処方またはカプセル処方がうまく処方されるならば、経口投与も可能である。これらの化合物の投与は局所的なものであってもよく、膏薬、パスタ、ゲル等の形態であってもよい。
【0100】
必要な用量範囲は、ペプチド、投与経路、処方の性質、治療対象者の症状の性質、および担当医師の判断による。適当な用量は治療対象者の体重1kgあたり0.1ないし100μgの範囲である。しかしながら、種々の使用化合物および種々の投与経路のさまざまな有効性を考慮すれば、必要な用量は広範囲なものと思われる。例えば、経口投与には静脈注射よりも多い用量が必要であると考えられる。当該分野においてよく理解された最適化のための標準的な常套的実験を用いてこれらの用量の変更を行うことができる。
【0101】
しばしば「遺伝子治療」と称される上記治療方法において、治療に使用する本発明のタンパク質を治療対象者中において生成させることもできる。よって、例えば、レトロウイルスプラスミドベクターを用いることにより、タンパク質をコードしているDNAまたはRNAのごときポリヌクレオチドを用いて治療対象者由来の細胞をエクスビボで処理加工してもよい。次いで、処理された細胞を治療対象者に導入する。
【0102】
【実施例】
〔実施例1〕
脂肪細胞への分化の確認
マウス3T3−L1細胞(ATCC No.CCL−92.1.)を、基本培地(DMEM, 40μg/ml KM, 10% Calf Serum )を用いて5% CO2 、37℃においてcollagen type I dish (FALCON社製) 中で培養した。細胞がコンフレントに達してから2日間おき、細胞が休止期に入った後、培地を分化誘導培地(DMEM, 40μg/ml KM, 10% FBS, 0.5mM 1−メチル−3−イソブチルキサンチン(以下、IBMXと呼ぶ)、10μg/ml インシュリン、1μM Dexamethasone(以下、Dex と呼ぶ)に変えこの分化条件において48時間培養し、培地を分化促進培地(DMEM, 40μg/ml KM,10% FBS, 5μg/ml insulin)に変えた。2日おきに分化促進培地で培地交換を行った。4 日目頃から小さな脂肪滴を含み始め、一週間後には成熟した脂肪細胞へ分化することを確認した。
【0103】
〔実施例2〕
mRNAの調製
脂肪細胞分化誘導前と分化誘導開始3時間後のマウス3T3−L1細胞(ATCC No.CCL−92.1.)からTRIzol(GIBCO BRL 社製)を用いて、TRIzol(GIBCO BRL 社製)に添付されている取扱説明書に従い全量RNAを調製した。この全量RNAからOligotex−dT 30( 第一化学薬品社製) を用いて、添付されている取扱説明書に従ってmRNAを調製した。
【0104】
〔実施例3〕
PCR−select cDNA Subtraction 法による脂肪細胞分化誘導後3時間目に発現の上昇するクローンの単離
公知のPCR selectcDNA subtraction kit (CLONTECH Laboratories 社製) に従って以下のi)−vii)工程を行った。
【0105】
i)テスターcDNA、ドライバーcDNAの合成
脂肪細胞分化誘導前のmRNAをドライバーmRNAとし、分化誘導3時間後のmRNAをテスターmRNAとした。これらのドライバーmRNAおよびテスターmRNAから1本鎖cDNAを合成し、次いで、2本鎖のドライバーcDNA、テスターcDNAを合成した。
【0106】
ii) 制限酵素RsaIによる2本鎖cDNAの切断
前記工程i)で得られた2本鎖のドライバーcDNAとテスターcDNAの各々を制限酵素RsaIで切断し、平滑末端(blunt end)の断片を作った。
【0107】
iii)アダプターのライゲーション
前記工程 ii)で得られた切断されたテスターcDNAを二つのグループに分け、一方にアダプター1をライゲーションし、他方にアダプター2をライゲーションした。
【0108】
iv)ファーストハイブリダイゼーション
前記工程iii)で得られたアダプターをライゲーションした2種類のテスターcDNAと過剰量のドライバーcDNAとの間で別々にハイブリダイゼーションを行った。
【0109】
v)セカンドハイブリダイゼーション
さらに過剰量のドライバーcDNAと、前記 iv)工程で得られたドライバーcDNAをハイブリダイズしてなる2種類のテスターcDNAを合わせ、ハイブリダイゼーションを行った。
【0110】
vi) ファーストPCR
前記 iv)工程で得られたハイブリダイズされたテスターcDNAを2種類のアダプター部位間で共通なプライマーを用いてPCR法を行ってDNAを増幅させた。
【0111】
vii)セカンドPCR
最後に2種類のアダプター部位に特異的な2種類のプライマーを用いてPCR法を行いDNAを増幅させた。
【0112】
ドライバーcDNAとハイブリダイズしてなるテスターcDNAは増幅されなかった。一方、テスター特異的、つまり分化誘導3時間目にピークとして6時間以内に活性化が増加しているポリヌクレオチド(遺伝子)のみ増幅された。
【0113】
〔実施例4〕
PCR産物のサブクローニング及びマウスのクローン104のプラスミド
図1にクローン104マウスcDNAクローニングの略図を示す。前記実施例3のサブトラクション法で得られたSecond PCRを行った後の増幅されたポリヌクレオチドを含む反応液をフェノール抽出、CIAA抽出後、EtOH沈殿を行い、DNAのペレットを滅菌水17μlに溶解し、10unitsのRsalで10mM Tris−HCl(pH 7.5),10mM MgCl2 、1mM DTT条件下、37℃一晩反応させアダプターを切断した。0.7%アガロースゲルで電気泳動後、DE81(Whatman)を用いて精製し、DNA断片Su(図1参照)を得た。
【0114】
該DNA断片Suの情報を元にプライマーを設計し、5’−RACEを行った結果、3.2kbpのバンドが得られたので、これを回収してヌクレオチドR−5’と呼んだ(図1参照)。該ヌクレオチドR−5’をTベクター(pBluescript KS+ )にサブクローニングして、DSQ−1000(島津製作所)により塩基配列を決定した。更に、ヌクレオチドR−5’の5’側に再度5’−RACE用のプライマーを設計して、5’−RACEを行った結果、1.2kbpのバンドが得られたので、これを回収してヌクレオチドR−5’’と呼んだ(図1参照)。このDNA断片も同様の方法で塩基配列を決定した。
【0115】
一方、3 ’側については、DNA断片Suを[α−32P]dCTP(Amersham Pharmacia biotech社製)標識し、これをプローブとしてcDNAライブリースクリーニングを行い、陽性ファージを単離した。この陽性ファージよりDNAを調製して、制限酵素EcoR i消化後、0.7%アガロースゲルで電気泳動、DE81(Whatman)を用いて精製してpBluescript KS+ のEcoR iサイトにサブクローニングし、DSQ−1000(島津製作所)により1.6kbpの塩基配列を決定した。これをヌクレオチドScと読んだ(図1参照)。
【0116】
次に、ヌクレオチドScを用いてデータベースに対して検索すると、一致する塩基配列がESTに登録されており、この塩基配列を参考にプライマーを設計して、RT−PCRを行った。その結果、約1.5kbpのバンドが得られたので、これを回収してヌクレオチドRTと呼んだ(図1参照)。該ヌクレオチドRTをTベクター(pBluescript KS+ )にサブクローニングして、DSQ−1000(島津製作所) により塩基配列を決定した。
【0117】
以上のようにして、マウスのクローン104cDNA全長の単離を目的に5’−RACE、cDNAライブラリースクリーニング及び、RT−PCRを行った結果、6812bpのポリヌクレオチドを得た。該ポリヌクレオチドをクローン104ポリヌクレオチド(単に、クローン104と呼ぶことがある。)と呼ぶ。該ポリヌクレオチドの塩基配列を配列番号1に示す。翻訳開始コドンはインフレームで最も5’側に出現する61塩基目のATGを翻訳開始コドンと仮定した。その結果、マウスのクローン104ポリヌクレオチドは1207アミノ酸をコードする遺伝子であると予想された。マウスのクローン104アミノ酸配列を配列番号2に示す。
【0118】
マウスのクローン104cDNA全長のうちORFが含まれるのは61bp−3681bpであった。この領域が含まれるプラスミドを作製するために、1bp−3700bpのクローン104ポリヌクレオチドをpBluescrit SK+ベクター(Xba i /EcoRV)にライゲーション反応を行った。ライゲーション反応液をコンピテントセルとしてEscherichia coli DH5α(ATCC53868、東洋紡株式会社製)にheat shock法によりトランスフォームして、サブクローニングされたマウスのクローン104全長ORFのプラスミドを得た。本実施例4で製造された形質転換体は、国際寄託当局である独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターにFERM P−18970として寄託されている。
【0119】
既存塩基配列、アミノ酸配列との比較
決定したマウスのクローン104ポリヌクレオチドの塩基配列について、GenBank 、EMBL、DDBJ、PDB の各々のデータベースにBLASTNでホモロジー検索を行った。その結果、クローン104ポリヌクレオチドの塩基配列は、登録されている既知のポリヌクレオチドとは同一性が無く、前駆脂肪細胞が脂肪細胞へと分化する際に特異的に発現が上昇するポリヌクレオチドとして、新規の物質であることが分かった。
【0120】
また、マウスのクローン104ポリヌクレオチドについて塩基配列から予想したマウスのクローン104タンパク質のアミノ酸配列をGenBank CDS translations、PDB 、SwissProt 、PIR 、PRF の各々のデータベースにBLASTPでホモロジー検索を行った。その結果、マウスのクローン104タンパク質のアミノ酸配列について登録されている既知の蛋白質とは同一性が無く、前駆脂肪細胞が脂肪細胞へと分化する際に特異的に発現が上昇する蛋白質として、新規の物質であることが分かった。
【0121】
〔実施例5〕
インサートの回収およびプローブの作製
前記実施例4において、サブトラクション法により得られたDNA断片Suが挿入されているプラスミドをMolecular Cloning に記載の方法に従いアルカリSDS法により調製し、このプラスミドを制限酵素XbaI, HindIII で切断後、1.0%アガロースゲルで電気泳動し、インサートに相当するバンドをDE81(Whatman 社製)を用いて回収した。50〜100ngのDNA断片をBcaBEST TM Labeling kit (TaKaRa社製)を用いて[α−32P]dCTP(Amersham Pharmacia biotech社製)で標識し、標識プローブを得た。得られた標識プローブをSephadex G−50 (Amersham Pharmacia biotech社製)を用いたカラムに通し、32P標識プローブを調製した。
【0122】
〔実施例6〕
3T3−L1分化初期における発現変化のノザンブロット解析
脂肪細胞分化誘導開始前(0時間)と分化誘導開始0.5、1、3、6、12、24時間後のマウス3T3−L1細胞(ATCC No.CCL−92.1.)からそれぞれ調製した総RNA25μg を1%変性ゲル(2% formaldehyde ,1×Mops, 1%アガロース)で電気泳動した。ゲルを50mM NaOH 25分(アルカリ変性)、200mM NaOAc(pH4.0)、40分 (中和) 処理後、RNA をHybondN+(Amersham Pharmacia biotech社製)にトランスファーした。トランスファーは12時間以上行い、バッファーは20×SSC を用いた。トランスファーしたフィルターを50mM NaOH ,5分間処理後、2×SSC で洗浄し、80℃、2時間乾燥させた。その後、UV照射を行い固定した。
【0123】
ハイブリダイゼーションバッファー (5× SSPE,50% formaldehyde , 5×Denhalt’s, 0.1% SDS, 20μg/ml salmon sperm DNA) で42℃一晩、プレハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーションバッファーを新しく変えた後、熱変性したプローブを加え42℃一晩、ハイブリダイゼーションを行った。その後、フィルターを一次洗浄液(2× SSPE 0.1% SDS)を用いて室温で10分間、さらに一次洗浄液を用いて55〜65℃で15分間、二次洗浄液(1× SSPE 0.1% SDS)を用いて65℃で15分間、三次洗浄液(0.5×SSPE0.1% SDS)を用いて65℃で10分間の条件で洗浄し、オートラジオグラフィーを行った。得られた結果を、図2に示す。
【0124】
図2のオートラジオグラムによれば、クローン104より調製した標識プローブは、脂肪細胞分化誘導開始前 (0時間) の細胞から調製した総RNAとは反応しないが、分化誘導開始3時間目に特に強く反応し、2時間目及び6 時間目の細胞でも若干、反応していることが分かった。このことから、クローン104は、脂肪細胞分化初期に、特に、脂肪細胞分化誘導開始後3時間目をピークとして6時間以内に、特異的に発現の上昇する配列であることがわかった。
【0125】
〔実施例7〕
3T3−L1及びNIH−3T3の休止期と増殖期における発現比較のノザンブロット解析
3T3−L1細胞(ATCC No. CCL−92.1.)(休止期の細胞に分化誘導をかけると成熟脂肪細胞に分化する性質を有し、且つ、増殖期に分化誘導をかけても成熟脂肪細胞に分化しない性質を有する。)及び、NIH−3T3細胞(ATCC No.CRL−1658)(分化誘導をかけても成熟脂肪細胞に分化しない性質を有する。)を基本培地において培養し、細胞が70−80%コンフレント時(増殖期の細胞)に分化誘導培地に変えて、分化誘導前と分化誘導開始後3時間目の細胞からTRIzol(GIBCO BRL 社製)を用いて、総RNAを回収した。
【0126】
一方、前記実施例1に示した方法で3T3−L1(ATCC No. CCL−92.1.)及び、NIH−3T3細胞(ATCC No.CRL−1658)(休止期の細胞)に対して分化誘導を行い、分化誘導前と分化誘導3 時間後の細胞からTRIzol(GIBCO BRL 社製)を用いて、総RNAを回収した。
【0127】
回収した総RNAを用いて前記実施例6に示した方法で、ノザンブロット解析を行った。その結果を図3に示す。図3のオートラジオグラムによれば、クローン104は3T3−L1細胞(ATCC No. CCL−92.1.)の休止期に分化誘導を行った3時間後に、特に強く発現が上昇していることが分かる。なお、3T3−L1細胞(ATCC No. CCL−92.1.)は、休止期の状態で分化誘導剤を添加すると脂肪細胞へと分化するが、増殖期の状態では分化しない性質を元来有している。また、3T3−L1と同じマウス胚由来の繊維芽細胞株であるNIH−3T3細胞(ATCC No.CRL−1658)は、増殖期または、休止期のいずれの場合に分化誘導剤を添加しても、脂肪細胞へは分化しない性質を元来有している。以上のことから、クローン104は脂肪細胞へと分化する条件下でのみ、強く発現していることが示され、このことはクローン104が脂肪細胞分化に深く関わっている可能性を示唆すものである。
【0128】
[実施例8]
ヒトホモログの同定
i)NCBI Genome Sequencing(Human Genome Database )を用いたヒトホモログの配列の予想
前記実施例4において決定されたクローン104 マウスの全長配列をNCBI Genome SequencingのBLAST the Human genome(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/seq/ )で、ヒトの遺伝子配列についてホモロジーサーチすることによって相同性の高い配列を3番染色体上に見出した。該配列は、計25個のエキソンにより構成されており、全てのエキソン、イントロン間にはgt−ag ルールが保存されていた。以上のことからヒトホモログの全長配列を予想することが出来た。
【0129】
本発明者等は、既に、クローン24(特願2001−374785)及び、クローン158(特願2002−048742)においても、同様の方法でヒトホモログ配列を予測している。このときの結果によれば、予測配列は実際にRT−PCRでクローニングし、シークエンスして配列を決定したものと、ほぼ100%の相同性を示すことが明らかになっている。このことから、クローン104ヒトホモログ予想配列をクローン104ヒトホモログヌクレオチド配列とすることができる。
【0130】
上記のようにして決定したクローン104ヒトホモログポリヌクレオチドの全長の核酸配列は、配列番号3に示される。
【0131】
また、配列番号1で示したマウスのクローン104ポリヌクレオチドと配列番号3で示したヒトホモログとの一致率は、5678/ 6894=82.4%であった。
【0132】
クローン104ヒトホモログポリヌクレオチドにおいて、マウスクローン104においてイニシャルメチオニンと定めたアミノ酸に対応する58塩基目のATGを翻訳開始コドンと仮定した。その結果、クローン104ヒトホモログポリヌクレオチドは1204アミノ酸からなる蛋白質をコードする遺伝子であると予想され、該蛋白質のアミノ酸配列を、配列番号4に示した。
【0133】
【発明の効果】
本発明のマウスのクローン104ポリヌクレオチド及び該クローン104ポリヌクレオチドから推定されるマウスのクローン104タンパク質は、脂肪細胞分化誘導開始後3時間目をピークとして6時間以内の細胞から抽出されるポリヌクレオチド並びにタンパク質であり、新規なものである。また、ヒトのクローン104ポリヌクレオチド及び該クローン104ポリヌクレオチドから推定されるストのクローン104タンパク質は、マウスの場合と同様に、脂肪細胞分化誘導開始後3時間目をピークとして6時間以内の細胞から抽出されると推定される。これらのポリヌクレオチドおよびタンパク質は、肥満のメカニズムを解明し、さらに肥満の進行状況を適切に把握し、肥満の予防あるいは治療に役立たせる上で極めて有用な物質である。
【0134】
本発明のクローン104ポリヌクレオチド、並びに該クローン104ポリヌクレオチドから推定されるクローン104タンパク質またはペプチド、およびこれらのペプチドに対するアンタゴニストまたはアゴニストは、肥満を含む糖尿病・高血圧・動脈硬化などの生活習慣病の治療、および診断に有用である。
【0135】
本発明のクローン104ポリヌクレオチド、あるいは該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドのうち、連続する少なくとも10個の塩基配列を有するポリヌクレオチドは、肥満を含む糖尿病・高血圧・動脈硬化などの生活習慣病の治療、および診断に有用である。
【0136】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図1】クローン104マウスcDNAクローニングの略図である。
【図2】マウスの脂肪細胞分化に特異的に発現され、脂肪細胞分化誘導開始後3時間目をピークとして6時間以内にマウスのクローン104ポリヌクレオチドが発現されることを示すオートラジオグラムである。
【図3】3T3−L1及びNIH−3T3の休止期と増殖期における、分化誘導開始0時間目と3時間目の発現比較のノザンブロット解析を示すオートラジオグラムである。
Claims (59)
- 脂肪細胞分化に関連し且つ脂肪細胞分化誘導開始後3時間目をピークとして6時間以内に発現するタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、配列番号1で表される塩基配列に対して同一もしくは少なくとも80%の相同性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド。
- 脂肪細胞分化に関連し且つ脂肪細胞分化誘導開始後3時間目をピークとして6時間以内に発現するタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、配列番号1で表される塩基配列の番号61から3681に対して同一もしくは少なくとも80%の相同性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド。
- 請求項1または2記載のポリヌクレオチドがDNAまたはRNAであるポリヌクレオチド。
- 脂肪細胞分化誘導開始後3時間目をピークとして6時間以内に発現されるタンパク質であって、配列番号2で表されるタンパク質の全長に対して同一もしくは少なくとも80%の相同性を有する脂肪細胞分化を促進するタンパク質。
- 請求項1または2記載のポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドを含有する組み換えベクター。
- 請求項5記載の組み換えベクターを保持する形質転換体。
- 請求項4記載のタンパク質に対して免疫学的に特異的な抗体。
- 請求項4記載のタンパク質をアンタゴナイズまたはアゴナイズする化合物の同定方法であって、
(a)請求項4記載のタンパク質を発現している細胞または請求項4記載のタンパク質に応答する細胞に候補化合物を接触させること;
(b)結合、または機能的応答の刺激もしくは阻害を観察すること;あるいは候補化合物と接触した細胞の請求項4記載のタンパク質の活性に関する能力を接触しなかった同種の細胞と比較することを特徴とする方法。 - 請求項8記載の方法によって同定されるアゴニスト。
- 請求項8記載の方法によって同定されるアンタゴニスト。
- 請求項4記載のタンパク質の生成に十分な条件下で、請求項6記載の形質転換体を培養し、培地または形質転換体からタンパク質を回収することを特徴とするタンパク質またはその塩の製造方法。
- 請求項1または2記載のポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドを含有する医薬。
- 配列番号1で表される塩基配列に対して同一もしくは少なくとも80%の相同性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドのうち、連続する少なくとも10個の塩基配列を有するポリヌクレオチドを含む医薬。
- 配列番号1で表される塩基配列の番号61から3681に対して同一もしくは少なくとも80%の相同性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドのうち、連続する少なくとも10個の塩基配列を有するポリヌクレオチドを含む医薬。
- 請求項1または2記載のポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドを含有する診断薬。
- 配列番号1で表される塩基配列に対して同一もしくは少なくとも80%の相同性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドのうち、連続する少なくとも10個の塩基配列を有するポリヌクレオチドを含む診断薬。
- 配列番号1で表される塩基配列の番号61から3681に対して同一もしくは少なくとも80%の相同性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドのうち、連続する少なくとも10個の塩基配列を有するポリヌクレオチドを含む診断薬。
- 請求項4記載のタンパク質またはその塩を含有している医薬。
- 請求項4記載のタンパク質またはその塩の連続する少なくとも5個のアミノ酸からなるペプチドを含む医薬。
- 請求項4記載のタンパク質またはその塩を含有している診断薬。
- 請求項4記載のタンパク質またはその塩の連続する少なくとも5個のアミノ酸からなるペプチドを含む診断薬。
- 請求項7記載の抗体を含有する医薬。
- 請求項7記載の抗体を含有する診断薬。
- 請求項9記載のアゴニストを含有している医薬。
- 請求項9記載のアゴニストを含有している診断薬。
- 請求項10記載のアンタゴニストを含有している医薬。
- 請求項10記載のアンタゴニストを含有している診断薬。
- 肥満症、高血圧症、高脂血症、糖尿病、並びに動脈硬化による心臓病及び脳卒中から選ばれた生活習慣病の治療薬である請求項12、13、14、18、19、22、24または26記載の医薬。
- 肥満症、高血圧症、高脂血症、糖尿病、並びに動脈硬化による心臓病及び脳卒中から選ばれた生活習慣病の診断薬である請求項15、16、17、20、21、23、25または27記載の診断薬。
- 脂肪細胞分化に関連するタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、配列番号3で表される塩基配列に対して同一もしくは少なくとも80%の相同性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド。
- 脂肪細胞分化に関連するタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、配列番号3で表される塩基配列の番号58から3669に対して同一もしくは少なくとも80%の相同性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド。
- 請求項30または31記載のポリヌクレオチドがDNAまたはRNAであるポリヌクレオチド。
- 配列番号4で表されるタンパク質の全長に対して同一もしくは少なくとも80%の相同性を有する脂肪細胞分化を促進するタンパク質。
- 請求項33記載のタンパク質をアンタゴナイズまたはアゴナイズする化合物の同定方法であって、
(a)請求項33記載のタンパク質を発現している細胞または請求項33記載のタンパク質に応答する細胞に候補化合物を接触させること;
(b)結合、または機能的応答の刺激もしくは阻害を観察すること;あるいは候補化合物と接触した細胞の請求項33記載のタンパク質の活性に関する能力を接触しなかった同種の細胞と比較することを特徴とする方法。 - 請求項34記載の方法によって同定されるアゴニスト。
- 請求項34記載の方法によって同定されるアンタゴニスト。
- 請求項30または31記載のポリヌクレオチドを含有する組み換えベクター。
- 請求項37記載の組み換えベクターを保持する形質転換体。
- 請求項33記載のタンパク質に対して免疫学的に特異的な抗体。
- 請求項33記載のタンパク質の生成に十分な条件下で、請求項38記載の形質転換体を培養し、培地または形質転換体からタンパク質またはその塩を回収することを特徴とするタンパク質の製造方法。
- 請求項30または31記載のポリヌクレオチドを含有している医薬。
- 配列番号3で表される塩基配列に対して同一もしくは少なくとも80%の相同性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドのうち、連続する少なくとも10個の塩基配列を有するポリヌクレオチドを含む医薬。
- 配列番号3で表される塩基配列の番号58から3669に対して同一もしくは少なくとも80%の相同性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドのうち、連続する少なくとも10個の塩基配列を有するポリヌクレオチドを含む医薬。
- 請求項30または31記載のポリヌクレオチドを含有している診断薬。
- 配列番号3で表される塩基配列に対して同一もしくは少なくとも80%の相同性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドのうち、連続する少なくとも10個の塩基配列を有するポリヌクレオチドを含む診断薬。
- 配列番号3で表される塩基配列の番号58から3669に対して同一もしくは少なくとも80%の相同性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドのうち、連続する少なくとも10個の塩基配列を有するポリヌクレオチドを含む診断薬。
- 請求項33記載のタンパク質またはその塩を含有している医薬。
- 請求項33記載のタンパク質またはその塩の連続する少なくとも5個のアミノ酸からなるペプチドを含む医薬。
- 請求項33記載のタンパク質またはその塩を含有している診断薬。
- 請求項33記載のタンパク質またはその塩の連続する少なくとも5個のアミノ酸からなるペプチドを含む診断薬。
- 請求項39記載の抗体を含有する医薬。
- 請求項39記載の抗体を含有する診断薬。
- 請求項35記載のアゴニストを含有している医薬。
- 請求項35記載のアゴニストを含有している診断薬。
- 請求項36記載のアンタゴニストを含有している医薬。
- 請求項36記載のアンタゴニストを含有している診断薬。
- 肥満症、高血圧症、高脂血症、糖尿病、並びに動脈硬化による心臓病及び脳卒中から選ばれた生活習慣病の治療薬である請求項41、42、43、47、48、51、53または55記載の医薬。
- 肥満症、高血圧症、高脂血症、糖尿病、並びに動脈硬化による心臓病及び脳卒中から選ばれた生活習慣病の診断薬である請求項44、45、46、49、50、52、54または56記載の診断薬。
- 配列番号3で表されるポリヌクレオチドについて、nanochipを用いる方法、ポリヌクレオチド配列を決定する方法、DNAチップ又はDNAアレイを用いる方法、質量分析計を用いる方法、プライマーエクステンションを用いる方法から選ばれた方法を適用することを特徴とする塩基多型を調べる方法。
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