JPH10513045A

JPH10513045A - ヒトの胎児の脾臓で発現する新規なケモカイン、その産生と使用

Info

Publication number: JPH10513045A
Application number: JP8522444A
Authority: JP
Inventors: コールマン、ロジャー; ワイルド、クレイグ・ジー; シールヘイマー、ジェフリー・ジェイ
Original assignee: Incyte Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Incyte Corp
Priority date: 1995-01-19
Filing date: 1996-01-19
Publication date: 1998-12-15
Also published as: AU5168096A; CA2207009A1; US5605817A; AU717721B2; WO1996022374A1; US20020142398A1; EP0807177A1; MX9705366A; US5945506A

Abstract

(57)【要約】本発明は、ヒトの胎児の脾臓細胞において初めに発見された新規なケモカイン（ＦＳＥＣ）をコードするヌクレオチド配列を提供する。更に、本発明には、ＦＳＥＣをコードするヌクレオチド配列に対するアンチセンス分子、精製ＦＳＥＣ産生のための発現ベクター、ＦＳＥＣをコードするヌクレオチド配列の検出のためのハイブリダイゼーションプローブ、またはオリゴヌクレオチド、ＦＳＥＣの発現のための生物工学的に処理された宿主細胞、ＦＳＥＣをコードする核酸分子及びＦＳＥＣに特異的に結合し得る抗体に基づく、ケモカイン活性化のための診断テスト方法も含まれる。

Description

【発明の詳細な説明】ヒトの胎児の脾臓で発現する新規なケモカイン、その産生と使用背景技術ケモカインは、免疫システムが非自己の抗原、例えば微生物や、非和合性の組織タイプの抗原の侵入に応答して産生され、異常状態、炎症状態、または疾病状態における白血球輸送に関連している、サイトカインファミリーに属する。ケモカインは、内皮細胞上の特定の接着分子の発現を媒介し、特定の細胞タイプを誘因する化学誘因物質因子の濃度勾配を生成する。更にケモカインは、特定の細胞のタイプの増殖を刺激し、それに特異的なレセプタを備えた細胞の活性化を調節する。これらの活性は、高度な標的細胞特異性を実証している。ケモカインは、一般に長さ約７０〜１００アミノ酸、分子量８〜１１ｋＤで、１〜１００ｎｇ／ｍｌの範囲で活性な小型のポリペプチドである。初めに、ケモカインは炎症組織から単離、精製され、その生物活性に対して特徴づけられた。最近では、ケモカインは、分子クローニング技術を通して発見されてきており、機能分析と構造分析の両面から特徴づけられている。各ケモカインは、成熟細胞における４−システインモチーフを通して近縁関係を有し、この近縁関係は主として初めの２つのシステイン残基の間隔に基づいている。現在、各種ケモカインは２つのファミリー、即ちＣ−Ｘ−Ｃケモカイン（ α）及びＣ−Ｃケモカイン（β）の何れか一方に割り当てられている。例外は存在するが、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカインは、好中球及び繊維芽細胞を活性化し、Ｃ−Ｃケモカインは単球／マクロファージ、好塩基球、好酸球、Ｔ細胞他を含むより多様な標的細胞のグループに作用する。これらのケモカインの両ファミリーは多種多様なタイプの細胞により合成され、その概要は“ＴｈｏｍｓｏｎＡ．（１９９４）ＴｈｅＣｙｔｏｋｉｎｅＨａｎｄｂｏｏｋ，２ｄＥｄ．ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＮＹ．”に記載されている。ケモカインのこの２つのグループについては後に再び説明する。Ｃ−ＣケモカインのＮ末端プロセシングの数は、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカインうより少ないようである。既知のヒト及び／またはネズミのＣ−Ｃケモカインには、ＭＩＰ−１α及びβと、Ｉ−３０９と、ＲＡＮＴＥＳ、及びＭＣＰ−１が含まれる。マクロファージ炎症性タンパク質α及びβ（ＭＩＰ−１α及びβ）は、初めに、刺激されたマウスのマクロファージ株細胞から精製され、通常の組織に注入されると炎症反応を誘発した。少なくとも３つの異なる非対立遺伝子が、ヒトＭＩＰ−１αをコードし、異なる７つの遺伝子がＭＩＰ−１βをコードする。ＭＩＰ−１α及びＭＩＰ−１βは６８〜６９アミノ酸からなり、これらのアミノ酸の約７０％が、その酸性、成熟分泌型について同一である。これらのタンパク質は双方共に、刺激されたＴ細胞、Ｂ細胞、及び単球においてミトゲン、抗− ＣＤ３、及び内毒素に応じて発現され、また両ポリペプチドはヘバリンを結合する。両分子は単球を刺激し、ＭＩＰ−１αはＴ細胞のＣＤ８サブセット及び好酸球を化学誘因し、ＭＩＰ−１βはＴ細胞のＣＤ４サブセットを化学誘因する。マウスにおいては、これらのタンパク質が骨髄造血を刺激することが知られている。Ｉ−３０９はヒトγ−δＴ細胞株からクローニングされ、マウスからクローニングされたＴ細胞活性化遺伝子３（ＴＣＡ３）と４２％のアミノ酸同一性を示している。これらの２つのタンパク質の５′フランキング領域の間には、かなりのレベルのヌクレオチド相同性が存在しており、他のケモカインにおいては見られない特別なシステイン残基の対を共通に持っている。このような類似性は、Ｉ−３０９とＴＣＡ３とが、時間の経過のうちに配列及び機能が分かれた種のホモログであることを示唆している。ＲＡＮＴＥＳは、Ｃ−Ｃケモカインの一種であって、発現されるのはＴ細胞（Ｂ細胞では発現されない）、血小板、ある種の腫瘍細胞株、及び刺激されたリウマチ滑膜線維芽細胞においてである。後者においては、ＩＬ（インターロイキン）１及びＩＬ４、形質転換神経因子及びインターフェロンγにより調節される。Ｔ細胞からクローニングされたｃＤＮＡは、Ｎ結合型グリコシル化を欠いた基本的な８ｋＤのタンパク質をコードし、白血球、単球、好塩基球、及び好酸球に影響を与え得る。ＲＡＮＴＥＳのｍＲＮＡの発現は、Ｔ細胞刺激により実質的に低減する。単球走化性タンパク質（ＭＣＰ−１）は、７６アミノ酸のタンパク質であって、様々な媒介物の刺激に応じてほとんど全ての細胞及び組織において発現されるようである。しかし、ＭＣＰ−１の標的は、単球及び好塩基球に限定されており、そこでＭＣＰ−１は、ＭＣＰ−１レセプタ、Ｇタンパク質結合カルシウム流動（flux）を誘発する（ＣｈａｒｏＩ，ｐｅｒｓｏｎａｌｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ参照）。他の２つの近縁関係にあるタンパク質、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ −３は、ヒト骨肉腫細胞株から精製された。ＭＣＰ−２及びＭＣＰ−３はＭＣＰ −１とそれぞれ６２％及び７３％のアミノ酸配列の同一性を有し、単球に対するその化学誘因物質特異性を共通のものとしている。このケモカイン分子について説明している文献には、“ＳｃｈａｌｌＴＪ（１９９４）ＣｈｅｍｏｔａｃｔｉｃＣｙｔｏｋｉｎｅｓ：ＴａｒｇｅｔｓｆｏｒＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＢｕｓｉｎｅｓｓＣｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，ＳｏｕｔｈｂｏｒｏｕｇｈＭＡｐｐ１８０ −２７０”；及び“ＰａｕｌＷＥ（１９９３）ＦｕｎｄａｍｅｎｔａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３ｒｄＥｄ．ＲａｖｅｎＰｒｅｓｓ，ＮＹｐｐ８２２−８２６”がある。ヒトにおける脾臓の機能は、血液から微生物や粒子抗原を除去したり異物に対する抗原を生成すること、過剰な、古い及び／または異常な血液細胞を隔離及び除去すること、門脈の血流を調節すること、発育時または骨髄のみが十分な血球を生成できるときに造血に関わることである。他の組織と同様脾臓においても、単球、マクロファージ、好塩基球、及び好酸球を含む白血球を、Ｔ細胞及び／またはＢ細胞により開始される病理的機構において重要な役目を果たす。特に、マクロファージは、強力な酸化剤及び組織の破壊に役立つタンパク質分解酵素を作り出し、かつ他の炎症性細胞を増やし活性化するサイトカイン類を分泌する。炎症組織または患部組織における異常の診断のための現在の技術は、主に臨床的な症状の観察、若しくは人体組織または体液の、ホルモン、ポリペプチドまたは様々な代謝物質についての血清学的な分析に大きく依存している。患者は、病気または腫瘍形成の初期の段階では何の症状も示さないことが多い。更に、血清学的な分析では、侵入性の疾病の症状と、それと重複または非常に類似した範囲を有する遺伝子症状との区別が、必ずしもつくわけではない。従って本発明のケモカインの使用を含む新たな診断技術の開発により、早期の正確な診断が可能になり、分子病原（melecular pathogenesis）に対する理解が進み、それを用いたより効果的な治療法の開発がもたらされることになろう。発明の開示本発明は、ヒトの胎児の脾臓において初めに発見された新規なケモカインをコードするヌクレオチド配列を提供する。この新たな遺伝子は、ヒトの胎児の脾臓で発現されることからヒト胎児脾臓発現型ケモカイン、または符号でｆｓｅｃ（インサイト社クローンＮｏ．２９５９２）と称するものであり、Ｃ−Ｃケモカインファミリーに属し、符号ＦＳＥＣで表されるポリペプチドをコードする。また本発明は、ｆｓｅｃＤＮＡ、またはそのフラグメント、またはオリゴマーによる、試料またはその抽出物のテスト過程を有する病気状態の診断テスト方法を含む。更に、本発明には、ｆｓｅｃアンチセンス分子、ｆｓｅｃをコードする核酸を含むクローニングベクターまたは発現ベクター、ｆｓｅｃをコードする核酸を含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞または生物、精製ＦＳＥＣ、及び宿主細胞からの精製ＦＳＥＣの産生及び回収方法も含まれる。図面の簡単な説明第１図は、ヒト胎児脾臓発現型ケモカインのヌクレオチド配列（ｆｓｅｃ；配列番号：１）及び予測アミノ酸配列（ＦＳＥＣ；配列番号：２）を示した図である。第２図は、Ｃ−Ｃファミリーの他のヒトケモカインとＦＳＥＣとのアミノ酸アラインメントを示した図である。ここに示したアラインメントは、ＤＮＡＳＴＡＲｓｏｆｔｗａｒｅ社（ＭａｄｉｓｏｎＷＩ）の多重配列アラインメントプログラム（multisequence alignment program）を用いて作製されたものである。第３図は、予測アミノ酸配列及び組成に基づくＦＳＥＣの疎水性の分析結果を示した図である。第４図は、ヒトＣ−Ｃケモカインの近縁関係樹形図である。系統樹は、ＰＡＭ２５０残基表とともにＣｌｕｓｔａｌ法を用いるＤＮＡＳＴＡＲｓｏｆｔｗａｒｅ系統樹プログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）により作製された。発明の実施の形態用語の定義本明細書において、“ヒト胎児脾臓発現型ケモカイン”またはＦＳＥＣなる用語は、配列番号：１の核酸から転写されたｍＲＮＡによりコードされる配列番号：２に示すポリペプチド、若しくはそのフラグメントを意味する。ＦＳＥＣは、自然発生したものか、化学的に合成されたものであるかの何れかである。本明細書において、“ｆｓｅｃ”は、核酸配列を表し、“ＦＳＥＣ”は、タンパク質、ペプチドまたはアミノ酸配列を表す。本明細書において、“活性”なる用語は、自然発生ＦＳＥＣの生物学的及び／または免疫学的活性を保持しているＦＳＥＣの形態を意味する。本明細書において、“自然発生ＦＳＥＣ”なる用語は、生物工学的処理を受けていないヒト細胞により生成されたＦＳＥＣを意味し、より具体的には、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化（lipidation）及びアシル化を含む翻訳語修飾されたポリペプチドから生成される様々なＦＳＥＣの形態を表現する用語である。本明細書において、“誘導体”なる用語は、ユビキチン化、ラベリング（例えば放射性核種や、様々な酵素修飾による標識付け）、ペジレーション（ポリエチレングリコールによる誘導体化）のような化学的修飾、若しくは例えばオルニチンのような通常はヒトタンパク質において自然発生しないアミノ酸の化学合成による挿入、置換によって得られた自然発生ＦＳＥＣに由来するポリペプチドを意味する。本明細書において、“変異体”または“突然変異体”または“組換え変異体” なる用語は、組換えＤＮＡ技術を用いて生成されるアミノ酸の挿入、除去、及び／または置換により自然発生ＦＳＥＣとは異なるものとなった任意のポリペプチドを意味する。興味の対象となる活性、細胞接着性、走化性を損なわずに置換、付加、あるいは除去され得るアミノ酸残基を決定するためには、特定のＦＳＥＣの配列と相同体のサイトカインの配列とを比較し、相同性の高い領域でのアミノ酸配列の変化の数を最小にすればよい。アミノ酸の置換では、例えばロイシンからイソロイシンまたはバリンへの置換、アスピレートからグルタメートへの置換、スレオニンからセリンへの置換、即ち保存的アミノ酸置換のような１個のアミノ酸が構造的及び／または化学的特性がそれに類似した他の１個のアミノ酸で置換されるのが好ましい。アミノ酸の挿入または除去は、通常１〜５個のアミノ酸の範囲で行われる。組換えＤＮＡ技術を用いてＦＳＥＣのアミノ酸の挿入、除去、または置換を体系的に行い、得られた組換え変異体の活性を検定することにより、許容される変異体が実験的に決定され得る。必要ならば、ＦＳＥＣまたはＦＳＥＣ変異体に生物工学的処理を施して、“シグナル配列またはリーダー配列”を含むようにすることができる。これにより、細胞膜を通してポリペプチドを移動させることが可能となる。このような配列は、本発明のポリペプチド上に自然に存在するか、あるいは組換えＤＮＡ技術により異種タンパク質源から得られる。本明細書において、ＦＳＥＣ“フラグメント（断片）”、“部分”、または“ セグメント”なる用語は、生物学的及び／または免疫学的活性を示すに十分な長さを有するアミノ酸の伸展（ストレッチ）を意味する。好適実施例では、このＦＳＥＣ断片は少なくとも約５個のアミノ酸、少なくとも約７個のアミノ酸、または少なくとも約８〜１３個のアミノ酸を含み、別の実施例では約１７個またはそれ以上のアミノ酸を含む。本明細書において、“オリゴヌクレオチド”またはポリヌクレオチド“フラグメント”、“部分”、または“セグメント”なる用語は、同一の、若しくは近縁関係にある核酸を同定、若しくは増幅するためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法や、当業者には周知の様々なハイブリッド形成法におけるプライマーとして使用するのに十分な長さを有するＦＳＥＣをコードする核酸の任意のストレッチを意味する。本発明には、ＦＳＥＣをコードする組換え核酸分子で形質転換された宿主細胞、ベクター、及び天然または組換えポリペプチド源から得られた精製ＦＳＥＣポリペプチドが含まれる。ＦＳＥＣポリペプチドを単離するための様々な方法は、当業者の周知となっている。例えばこのようなポリペプチドの精製のために、本発明の提供する抗体を用いたイムノアフィニティクロマトグラフィーを利用することができる。タンパク質精製のための他の周知の方法は、例えば、“’ＤｅｕｔｓｃｈｅｒＭ（１９９０）ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙＶｏｌ１８２，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏ ”及び“ＳｃｏｐｅｓＲ（１９８２）ＰｒｏｔｅｉｎＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，ＮＹＣ”に記載されており、これらの文献を本明細書と共に参照されたい。本明細書において、“組換え”なる用語は、組換えＤＮＡ技術を用いて調製されるＦＳＥＣをコードするポリヌクレオチドを意味する。ＦＳＥＣをコードするＤＮＡも対立形質の変異体または組換え変異体、及びその突然変異体を含み得る。本明細書において、“プローブ”または“核酸プローブ”または“オリゴヌクレオチドプローブ”なる用語は、所望の標的配列とハイブリッド形成し得るＦＳＥＣの部分、フラグメント、またはセグメントを意味する。分子生物学における従来の技術を用いることにより、ＦＳＥＣをコードするｃＤＮＡまたは内生核酸を検出し、増幅し、または定量するのにこのプローブが使用され得る。プローブの長さは様々であり、好ましくは、約１０から最大約数１００ヌクレオチドの長さを有するものである。当業者には理解されようが、ハイブリッド形成条件及びプローブの設計は、使用目的に応じて変化する。例えば、ＰＣＲでの使用を目的としたプローブは、長さが１５〜３０ヌクレオチドであり、変性プローブのプールの一部分であり得る。即ちＰＣＲ用プローブは、ヌクレオチドのミスマッチに対する許容性を有するが、未知の配列に対する結合に適用するオリゴヌクレオチドである得るのに対して、サザンハイブリダイゼーションまたはノーザンハイブリダイゼーション用のプローブは、長さが数１００ヌクレオチドの、１つの特定のヌクレオチド配列である得る。従って、ＦＳＥＣに対する特異的検出用のプローブで好適なものは、配列番号：１の配列の非保存ヌクレオチド領域から得られるポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドフラグメントであり得る。本明細書において、“非保存的ヌクレオチド領域”なる用語は、配列番号：１に独特に存在し、かつＣ− Ｃケモカインのファミリーにおける保存される領域を含まないヌクレオチド領域を意味する。プローブは一本鎖または二本鎖で、ｉｎｓｉｔｕハイブリッド形成及びＥＬＩＳＡ（固相酵素免疫検定法）のような技術を含む膜ベースのハイブリダイゼーション、溶液、細胞、組織またはにおいて特異性を有し得る。本発明の範囲には、ここに開示するポリペプチドのオリゴヌクレオチド、フラグメント、または部分、若しくはその相補的な鎖であって、プローブとして用いられるものが含まれる。 “オリゴヌクレオチド”または“オリゴヌクレオチドプローブ”は、ＦＳＥＣをコードするここに開示するヌクレオチド配列に基づいて調製される。オリゴヌクレオチドは、ここに開示するヌクレオチド配列の部分を含み、少なくとも約１５個のヌクレオチドからなるが、通常は約２０ヌクレオチド、最大約６０個のヌクレオチドからなる。核酸プローブは、約６ｋｂより少ない塩基対数の、通常は約１ｋｂ未満の配列の部分からなり得る。本発明のオリゴヌクレオチド及び核酸プローブは、細胞または組織内にＦＳＥＣをコードする核酸が存在するか否かを判定するため、または“ＷａｌｓｈＰＳｅｔａｌ（１９９２）ＰＣＲＭｅｔｈｏｄｓＡｐｐｌ．１：２４１−２５０”に記載のように染色体ＤＮＡから類似した核酸配列を分離するのに使用され得る。本発明の核酸プローブは、自然発生核酸、組換え一本鎖または二本鎖核酸から誘導されるか、若しくは化学的に合成され得る。プローブの標識化は、ニックトランスレーション法、クレノウフィルイン反応法、ＰＣＲ法、または当分野において周知の他の方法を用いて行われ得る。本発明のプローブを調製し、標識する方法は、“ＳａｍｂｒｏｏｋＪｅｔａｌ（１９８９）ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，２ｄＥｄ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮＹ”または“ＡｕｓｕｂｅｌＦＭｅｔａｌ（１９８９）ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ２，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ”に詳しく述べられており、これらの文献を本明細書と共に参照されたい。別の形態として、本発明のポリペプチド、またはそれと近縁関係にあるポリペプチドをコードする組換え変異体は、当業者に周知の技術を用いて、遺伝暗号の “冗長性”を利用することにより合成、または同定され得る。様々な切断部位を作り出すサイレント変化のような、様々なコドン置換を導入することで、プラスミドやウィルスベクターへのクローニング、または特定の原核細胞形または真核細胞形における発現を最適化することができる。また、突然変異を導入することによって、ポリペプチドの特性を変更し、リガンド結合親和力、鎖間親和力、またはポリペプチド変性またはターンオーバー速度を変えることもできる。発明の詳細な説明本発明は、新規なＣ−ＣケモカインファミリーＦＳＥＣを同定する独特なヌクレオチド配列を提供する。ＦＳＥＣをコードするヌクレオチド配列は、ヒト胎児脾臓組織から作られたｃＤＮＡライブラリ、胎児の脾臓組織から作られたｃＤＮＡライブラリ、及び股関節のリウマチ様滑膜から作られたｃＤＮＡライブラリにおいて同定された。ＦＳＥＣをコードするヌクレオチド配列は、３時間培養された接着性単球培地、及びＴ細胞培地においても同定された。ＦＳＥＣをコードするヌクレオチド配列は、７２時間培養された接着性単球培地または酢酸ミリスチル酸ホルボール（ＰＭＡ）で処理されたＴ細胞においても見いだされた。ＦＳＥＣが同定された組織において、その発現の検出のための診断テストを行うことは有用である。タンパク質分解酵素及び組織の損傷または破壊をもたらし得る他の分子の産生に応じて好中球及び繊維芽細胞は活性化する。従って、ＦＳＥＣの過剰な発現に対する診断テストを行うことにより、診断が速やかになり、過剰な組織の損傷や破壊が起こる前に炎症の適切な治療を行うことができる。最近の研究成果は、走化性サイトカインのＣ−Ｃケモカインファミリーは炎症性の活性を有していると共に、血管新生の媒介における不同性の効果を、その機能として示すか、またはＥＬＲドメインの存在または不存在（上述のＳｔｒｉｅｔｅｒＡ論文及びＢ論文参照）を示すことを示唆している。非ＥＬＲＣ−Ｃケモカインは血管新生の抑制効果を示してきた。従って、ＦＳＥＣまたはそのフラグメントを用いて、血管新生依存性疾患、例えば腫瘍形成、慢性関節リウマチ、強皮症、及び乾癬を予防しまたは治療することが可能である。ＦＳＥＣまたはその相補配列をコードするヌクレオチド配列は、分子生物学の分野における当業者には周知の技術において数多くの用途を有する。これらの技術には、ハイブリダイゼーションプローブとしての使用、ＰＣＲ用オリゴマーとしての使用、染色体及び遺伝子マッピングにおける使用、ＦＳＥＣの組換え体産生における使用、及びアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡの、またはこれらの化学的類似体等の産生における使用が含まれる。ここに開示するＦＳＥＣをコードするヌクレオチドの使用方法は、周知の技術の一例であり、当業者に周知の何らかの技術にその使用を限定しようとするものではない。更に、未だ開発されていない分子生物学的技術であっても、それが例えばトリプレット遺伝暗号及び特異的な塩基対相互作用のような既知のポリヌクレオチド配列の特性に基づく技術である限り、ここに開示するヌクレオチド配列を使用することができる。遺伝暗号の同義性（degeneracy）の結果、そのヌクレオチド配列がＦＳＥＣをコードするもので限り、既知のヌクレオチド配列及び自然発生遺伝子のヌクレオチド配列に対する相同性を有する最小限のヌクレオチド配列を有するヌクレオチド配列を含む、様々なＦＳＥＣをコードするヌクレオチド配列が産生され得る、ということは当業者には理解されよう。本発明は、より具体的には可能なコドン選択に基づいて組合せを選択することにより作られ得る全ての可能なヌクレオチド配列をその範囲に含んでいる。これらの組合せは、自然発生ＦＳＥＣのヌクレオチド配列に対して適用されるような標準的なトリプレット遺伝暗号に基づいて作られる。また、このような全ての変異体は、具体的にここで開示されたものと考えられたい。ＦＳＥＣ及び／またはＦＳＥＣ変異体をコードするヌクレオチド配列は、厳格な条件の下で自然発生ＦＳＥＣ遺伝子のヌクレオチド配列とハイブリッド形成可能なものであるのが好ましいが、実質的に異なるコドン使用頻度をプロセシングするＦＳＥＣまたはＦＳＥＣ誘導体をコードするヌクレオチド配列を作り出すことは有益であり得る。コドンの選択は、特定の原核細胞または真核細胞の発現宿主におけるペプチドの発現速度を高めるように選択することができ、このときこの発現速度は、その宿主における特定のコドンの使用頻度に基づいて決まる。本発明のＦＳＥＣ及び／またはＦＳＥＣ誘導体をコードするヌクレオチド配列を、このコードされたアミノ酸配列を変えることなく実質的に変化させる他の理由は、より望ましい特性、例えば自然発生ヌクレオチド配列から産生されたものより長い半減期を有するＲＮＡ転写物を産生するためである。ＦＳＥＣをコードするヌクレオチド配列は、完全に確立された組換えＤＮＡ技術（“ＳａｍｂｒｏｏｋＪｅｔａｌ．（１９８９）ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，２ｄＥｄ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮＹ”参照）により様々な他のヌクレオチド配列と結合してもよい。ｆｓｅｃに結合するのに有用なヌクレオチド配列には、例えば従来より周知のプラスミド、コスミド、λファージ誘導体、ファージミド等のクローニングベクターの組合せが含まれる。興味の対象であるベクターには、発現ベクター、複製ベクター、プローブ産生ベクターシークエンシングベクター等が含まれる。一般に、興味の対象となるベクターは、少なくとも１つの生物において複製起点機能を発揮する便利な制限エンドヌクレアーゼ検知サイト、及び宿主細胞用として選択可能なマーカーを含み得る。本発明の別の実施例では、ＦＳＥＣをコードする自然発生ヌクレオチド配列とハイブリッド形成可能なｆｓｅｃ特異的核酸ハイブリダイゼーションプローブが提供される。ＦＳＥＣをコードする配列の検知のためのこのようなプローブは、配列番号：１の非保存領域から得られるヌクレオチドフラグメントを含むのが好ましい。近縁関係にあるケモカインをコードする配列の検出のためのこのようなプローブは、Ｃ−ＣまたはＣ−Ｃをコードする配列のヌクレオチドの少なくとも５０％を含むのが好ましい。本発明のハイブリダイゼーションプローブは、配列番号：１のヌクレオチド配列、または自然発生ｆｓｅｃのプロモータ、エンハンサー要素、及びイントロンを含むゲノムの配列に由来するものであり得る。ハイブリダイゼーションプローブは、様々なリポーターグループにより標識され得るが、このリポーターグループには、³²Ｐまたは³⁵Ｓのような放射性核種、若しくはアルカリホスファターゼのような酵素標識が含まれ、これらはアビジン／ビオチン結合系を介してプローブに結合する。この他当業者に周知の技術を用いてプローブを標識することができる。米国特許第４，９６５，１８８号、第４，６８３，１９５号、及び第４，８００，１９５号明細書に記載されているようなＰＣＲ法の実施において、ＦＳＥＣをコードするヌクレオチド配列に基づくオリゴヌクレオチドの別の使用方法がある。このようなＰＣＲにおいて使用されるプローブは、組換えにより得られたものであるか、化学的に合成されたものであるか、若しくは両者の混合であり得、また、診断的な使用に供される分散したヌクレオチドまたは近縁関係にあるゲノム配列の同定に用いられる可能な変性配列のプールを含み得る。ｆｓｅｃ特異的ハイブリダイゼーションプローブを産生するための他の方法には、ｍＲＮＡプローブの産生のためのベクターへの、ＦＳＥＣ及びＦＳＥＣ誘導体をコードする核酸配列のクローニングが含まれる。このようなベクターは従来より周知であり、または市販されており、例えばＴ７またはＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼのような適当なＲＮＡポリメラーゼ及び適当な放射性の標識をなされたヌクレオチドを添加することによりｉｎｖｉｔｒｏでＲＮＡプローブを合成するのに使用することができる。現在完全に化学合成によりＦＳＥＣ及びＦＳＥＣ誘導体をコードするＤＮＡ配列、またはその部分を産生することが可能であり、その後、従来より周知の試薬、ベクター、及び細胞を用いて様々な市販のＤＮＡベクターに挿入することができる。化学合成を用いて、ｆｓｅｃポリヌクレオチド配列若しくはその部分に突然変異を起こさせることも可能である。ＤＮＡ配列決定の方法は、従来より周知である。従来の酵素を用いる方法では、ＤＮＡポリメラーゼクレノウフラグメント、ＳＥＱＵＥＮＡＳＥ（登録商標）（ＵＳＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＣｏｒｐ．Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）またはＴａｑポリメラーゼを用いて、興味の対象のＤＮＡ鋳型にアニーリングされたオリゴヌクレオチドプライマーからＤＮＡ鎖を延長する。この方法は、一本鎖及び二本鎖の双方の鋳型を用いるのに開発されたものである。チェーンターミネーション反応の生成物は、通常ユリアアクリルアミドゲル上で電気泳動処理され、オートラジオグラフィ（放射性核種で標識された前駆体の検出）、または蛍光体（蛍光体で標識化された前駆体の検出）の何れかにより検出される。機械を用いた反応調製、蛍光体検出を利用した分析及び配列決定の技術の近年の進歩により、１日当たりに決定され得る配列数は増加した（ここでは、例えばＣａｔａｌｙｓｔ８００及びＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍ３７３ＤＮＡシーケンサのような機械を用いる）。このヌクレオチド配列を用いて、ＦＳＥＣの発現レベルの異常に関連する炎症及び疾病の検出のためのアッセイを構築することができる。このヌクレオチド配列は、従来より周知の方法で標識した上で、ハイブリッド形成条件の下で患者の体液または組織の試料に添加することができる。インキュベーション時間の経過後、ヌクレオチドが酵素で標識されていた場合には、所望に応じて染料（または他の展開剤を必要とする標識）を含有する適合性の液体で試料が洗浄される。この適合性の液体を洗い流した後、染料を定量し、標準値と比較する。染料の量が著しく多い場合には、このヌクレオチド配列は試料とハイブリッド形成したことになる。ｆｓｅｃが異常なレベルで存在している場合には、このアッセイにより炎症及び／または疾病の存在が確認されたことになる。ｆｓｅｃのヌクレオチド配列を用いて、その遺伝子のマッピングのためのハイブリダイゼーションプローブを構築することができる。ここに開示するヌクレオチド配列の染色体及び染色体の特定の領域へのマッピングを、周知の遺伝子及び／または染色体マッピング技術を用いて行うこともできる。このような技術には、ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション、既知の染色体マーカーに対するリンケージ分析、既知の染色体に対して特異的なライブラリまたはフローソートされた染色体調合物を用いたハイブリダイゼーションスクリーニング等が含まれる。染色体延展（chromosome spread）の蛍光ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション技術については、他の文献、即ち“Ｖｅｒｍａｅｔａｌ（１９８８）ＨｕｍａｎＣｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：ＡＭａｎｕａｌｏｆＢａｓｉｃＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ＰｅｒｇａｍｏｎＰｒｅｓｓ，ＮＹＣ”に記載されている。染色体調合物の蛍光ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション及び他の物理的染色体マッピング技術は、追加的な遺伝子地図データと関連付けられ得る。遺伝子地図データの例としては、“Ｏ’Ｂｒｉｅｎ（１９９０）ＧｅｎｅｔｉｃＭａｐｓ：ＬｏｃｕｓＭａｐｓｏｆＣｏｍｐｌｅｘＧｅｎｏｍｅｓ，Ｂｏｏｋ５；ＨｕｍａｎＭａｐｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ”がある。物理的染色体地図上でのｆｓｅｃをコードする遺伝子の位置と特定の疾病（若しくは特定の疾病に対する素因）との間の相関関係は、この遺伝病に関連するＤＮＡの領域の範囲を特定するための助けとなる。本発明のヌクレオチド配列を用いて、健常者の遺伝子配列と、キャリアまたは遺伝病の保因者の遺伝子配列との相違を検出することができる。ＦＳＥＣをコードするヌクレオチド配列を用いて、周知の組換えＤＮＡ技術を利用して精製ＦＳＥＣを作り出すことができる。遺伝子を単離した後、その遺伝子を発現させる方法を記載した文献は数多くあるが、その例としては、“Ｇｏｅｄｄｅｌ（１９９０）ＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ．Ｖｏｌ１８５，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏ”がある。ＦＳＥＣは、原核細胞または真核細胞の何れかの様々な宿主細胞内において発現され得る。宿主細胞は、ｆｓｅｃヌクレオチド配列が内生である種と同一の種、あるいは異なる種の何れからでも得ることができる。組換えＤＮＡ技術によってＦＳＥＣを産生することの利点には、精製用として高濃度に濃縮されたタンパク質源が得られること、及び精製のための簡単な手順が利用できるようになることがある。ＦＳＥＣは、タンパク質精製を容易にするべく添加された１または２以上の追加のポリペプチドを有するキメラタンパク質として発現され得る。このような精製促進ドメイン（分子内領域）には、固定化金属上での精製を可能にするヒスチジン−トリプトファンモジュールのような金属キレート化ペプチド固定化免疫グロブリン上での精製を可能にするタンパク質Ａドメイン、及びＦＬＡＧＳ伸展／アフィニティ精製システム（ＩｍｍｕｎｅｘＣｏｒｐ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）において利用されるドメイン等があるが、これらに限定されるものではない。切断可能なリンカー配列（例えばＸＡ因子またはエンテロキナーゼ）が精製ドメインと、ＦＳＥＣをコードする配列との間に含まれていると、ＦＳＥＣの精製を促進するのに役立つことがある。ＦＳＥＣをコードするＤＮＡによって形質転換された細胞は、ＦＳＥＣの発現及び細胞培地からのタンパク質の回収に適切な条件の下で培養され得る。組換え細胞により産生されたＦＳＥＣは、使用される特定の遺伝子構造に応じて、分泌されるか、あるいは細胞内に保持され得る。一般に、組換えタンパク質は、分泌される形態で準備しておくのがより便利である。精製のステップは、使用される産生プロセスの性質及び産生される特定のＦＳＥＣの性質に基づいて決まる。本発明のＦＳＥＣｃＤＮＡのタンパク質への翻訳は、ｃＤＮＡを適当な発現ベクターにサブクローニングし、このベクターを適切な発現宿主に感染させることによりなされ得る。実施例７に記載されているように、ＦＳＥＣの発現及び精製のための好適な発現ベクターは、ＦＳＥＣを含む融合タンパク質の発現用として使用でき、かつ６個のヒスチジン残基、次いでチオレドキシン及びエンテロキナーゼ切断サイトをコードする核酸を含むものである。ヒスチジン残基は、ＩＭＩＡＣ（固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィー“Ｐｏｒａｔｈｅｔａｌ．（１９９２）ＰｒｏｔｅｉｎＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ３：２６３：２８１”に記載）上での精製を促進し、一方エンテロキナーゼ切断サイトは、融合タンパク質からのケモカインの精製のための手段となる。ここに開示するｃＤＮＡライブラリの産生に用いられる発現ベクターは、クローニングサイトの上流にあるβ−ガラクシトシダーゼに対するプロモータ、それに続くアミノ末端Ｍｅｔで、それに続くβ−ガラクシトシダーゼの７つの残基、それに続く人工的プライミング及び転写のために有用なバクテリオファージプロモータ及び多数の独特の制限サイト（ＥｃｏＲＩを含む）を含むヌクレオチド配列を有し、またこの発現ベクターは本発明のケモカインの発現のためにも用いることができる。ＩＰＴＧを有する単離された菌株を、標準的な方法で導入することにより、β−ガラクシトシダーゼの７つの残基に始まり、リンカーの約１５個の残基、及びｃＤＮＡ内部でコードされたＦＳＥＣに対応する融合タンパク質が産生される。ｃＤＮＡクローン挿入断片は、必ずランダムプロセスにより産生されることから、含まれたｃＤＮＡが適切な翻訳のための正しい読み枠に存在する可能性は３つに１つである。ｃＤＮＡが適切な読み枠に存在しない場合には、ｉｎｖｉｔｒｏ突然変異を含む周知の方法による適切な数の塩基の除去または挿入や、エキソヌクレアーゼＩＩＩまたは大豆ヌクレアーゼを用いた消化、若しくはオリゴヌクレオチドリンカーの混入により、正しい読み枠に存在するものを得ることができる。上述のように、ＦＳＥＣは細菌系において発現される。ＦＳＥＣをコードする本発明のヌクレオチド配列は、特定の宿主におけるタンパク質源の発現のために有用であることが知られているベクターに移入され得る。クローニングサイトと共に、目標ｃＤＮＡ（２５塩基）の両端における伸展部分とハイブリッドを形成するのに十分なＤＮＡのセグメントを含むオリゴヌクレオチドアンブリマーは、標準的な方法で化学的に合成され得る。次いで、これらのプライマーを用いて、ＰＣＲ法により所望の遺伝子セグメントを増幅することができる。得られた新たな遺伝子セグンメントは、標準的な条件の下で適当な制限酵素で切断し、ゲル電気泳動法により単離することができる。別の形態として、適当な制限酵素を用いてヌクレオチド配列を切断し、欠失した遺伝子セグメントに化学的に合成されたオリゴヌクレオチドを埋め込むことにより、類似の遺伝子セグメントを産生することができる。更に、複数の遺伝子から得られた配列をコードするセグメントを相互に結合し、適当なベクターにクローニングして、組換え配列の発現を最適化することができる。このようなキメラ分子用の適切な発現宿主には、チャイニーズハムスターの卵巣及びヒト２９３細胞のような哺乳類の細胞、Ｓｆ９細胞のような昆虫の細胞、サッカロミセスセルビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のような酵母菌細胞、及びＥ．ｃｏｌｉのような細菌が含まれるが、これらに限定されるものではない。このような細胞系のそれぞれに対して有用な各発現ベクターも、細菌内での増殖を可能にする複製起点、及びβ−ラクタマーゼ抗抗生物質遺伝子のような細菌内での選択を可能にする選択可能なマーカーを含み得る。更に、このベクターは、感染された真核宿主細胞群における選択を可能にする、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子のような第２の選択可能なマーカーを有し得る。真核細胞の発現宿主において使用するためのベクターは、３′ポリアデニル化配列のようなＲＮＡプロセシング要素を、それが興味の対象であるｃＤＮＡに含まれていない場合には必要とすることがある。更に、このベクターは遺伝子発現を増加させるプロモータまたはエンハンサーを含み得る。このようなプロモータは宿主特異的であって、ＭＭＴＶ、ＳＶ４０、またはＣＨＯ細胞用のメタロチオネインプロモータや、細菌宿主用のｔｒｐ、ｌａｃ、ｔａｃ、またはＴ７プロモータや、酵母菌用のα因子、アルコール酸化酵素、またはＰＧＨプロモータが含まれる。ＲＳＶエンハンサーのような転写エンハンサーは、哺乳類の宿主細胞において使用され得る。ひとたび標準的な培養法により均一な組換え細胞の培養物が得られると、組換えにより産生されたＦＳＥＣが大量に条件培地から得られ、当技術分野において周知のクロマトグラフィー法により分析できることになる。組換え体の産生に加えて、固相技術を用いた直接のペプチド合成によりＦＳＥＣフラグメントを産生することもできる。（“Ｓｔｅｗａｒｔｅｔａｌ（１９６９）Ｓｏｌｉｄ−ＰｈａｓｅＰｅｐｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ，ＷＨＦｒｅｅｍａｎＣｏ．ＳａｎＦｒａｎｃｉｓｃｏ；ＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄＲ（１９６３）ＪＡｍＣｈｅｍＳｏｃ８５：２１４９ −２１５４”参照）。ｉｎｖｉｔｒｏタンパク質合成は、手作業、あるいは機械により自動的に行うことができる。自動的な合成は、例えばＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ４３１ＡＰｅｐｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を製造業者の指示に従って用いることにより行うことができる。ＦＳＥＣの様々なフラグメントを個別に化学合成し、化学的な方法により結合することによってＦＳＥＣの全体を産生することもできる。抗体の誘発において使用するためのＦＳＥＣは、免疫活性を有していなければならない。ＦＳＥＣ特異的抗体の誘発において使用するためのペプチドは、そのペプチドが、自然発生ＦＳＥＣの一部分の三次元的構造を保持しているような少なくとも５個、好ましくは少なくとも１０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を含み、自然発生ＦＳＥＣの全アミノ酸配列を含んでいてもよい。ＦＳＥＣのアミノ酸配列の短いストレッチは、ヒザラガイヘモシアニン（ＫＬＨ）や抗体産生に使用されるキメラ分子のような他のタンパク質のストレッチと融合され得る。本発明のＦＳＥＣに対するモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を調製するための方法は、様々なものが当業者の知るところであろう。その方法の１つは、逆相ＨＰＬＣ分離から変性ＦＳＥＣを得て、これを用いて当業者に周知の技術でマウスまたはウサギを免疫化する方法である。マウスの免疫化には変性ＦＳＥＣ約１００μｇで十分であり、ウサギの免疫化には最大１ｍｇを用いることができる。マウスハイブリドーマを同定するために、変性タンパク質を放射性要素で標識し、これを用いて潜在性ネズミＢ細胞ハイブリドーマをスクリーニングして、抗体を産生するものを分離することができる。この方法では、必要なタンパク質の量はわずかであり、数１０００のクローンを標識しスクリーニングするためには２０ｍｇで十分である。別の方法では、ＦＳＥＣのアミノ酸配列はｃＤＮＡ配列から推論されるように、その分析により免疫抗原性の高い領域が決定される。これらの領域を含むポリペプチドを合成し、適切な免疫化プロトコルで使用して抗体を産生する。適切なエピトープを選択するための分析方法は、“ＡｕｓｕｂｅｌＦＭｅｔａｌ（１９８９，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ２．ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ）”に記載されている。免疫化のための最適なアミノ酸配列は、通常、そのタンパク質が自然のコンフォーメーションをなしているときに外部環境にさらされやすいポリペプチドのＣ末端、Ｎ末端、及びその間に介在する親水性領域に存在する。典型的には、約１５残基の長さを有する選択されたポリペプチドは、ｆｍｏｃ化学を用いるＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＰｅｐｔｉｄｅｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒｍｏｄｅｌ４３１Ａを用いて合成され、Ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ；上述のＡｕｓｕｂｅｌＦＭｅｔａｌ参照）と反応させることによりヒザラガイヘモシアニンまたはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ；Ｓｉｇｍａ）と結合される。必要ならば、ＫＬＨに結合できるようにペプチドのＮ末端にシステインを挿入してもよく、動物は、フロイント完全アジュバントによりペプチド−ＫＬＨ複合体で免疫化される。得られた抗血清は、ペプチドをプラスチックに結合し、１％のＢＳＡでブロックし、抗血清と反応させ、その後洗浄し、（放射性または蛍光性の）標識をなされたアフィニティ精製された特異的ヒツジ抗ウサギＩｇＧと反応させることにより、抗ペプチド活性をテストすることができる。ハイブリドーマも標準的な技術を用いて調製される。興味の対象となるハイブリドーマは、標識化ＦＳＥＣでスクリーニングし、所望の特異性を有するモノクローナル抗体を産生するそれらの融合体を同定することにより検出される。例えば、典型的なプロトコルでは、プレート（ＦＡＳＴ，Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ＰａｌｏＡｌｔｏ，ＣＡ）の穴が、アフィニティ精製された特異的ウサギ抗マウス（または適当な抗種Ｉｇ）抗体約１０ｍｇ／ｍｌでコーティングされる。コーティングされた穴は１％のＢＳＡでブロックされ、洗浄されて、ハイブリドーマの上清液にさらされる。インキュベーションの後、この穴は約１ｍｇ／ｍｌの濃度の標識化ＦＳＥＣにさらされる。抗体を産生するクローンは、上述のような条件の下で検出可能な量の標識化ＦＳＥＣと結合する。このようなクローンは、増殖された上で、限界希釈（１細胞／３穴）で２サイクルのクローニングをなされる。クローニングされたハイブリドーマは、プリスタン処置を受けたマウスに注射され、マウスの復水が作り出される。モノクローナル抗体は、タンパク質Ａを用いるアフィニティクロマトグラフィーにより、マウスの復水から精製される。少なくとも１０⁸Ｍ^-1、好ましくは１０⁹〜１０¹⁰以上の親和力を有するモノクローナル抗体は、典型的には、“ＨａｒｌｏｗａｎｄＬａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ”または“Ｇｏｄｉｎｇ（１９８６）ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅ，２ｄＥｄ．ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓＮｅｗＹｏｒｋＣｉｔｙ”に記載の標準的な手順により作られる。これらの文献を本明細書と共に参照されたい。特定のＦＳＥＣ配列に対して特異的な抗体は、適当な動物にＦＳＥＣ配列を接種することにより産生され得る。抗体が、配列番号：２に開示されたＦＳＥＣポリペプチドの全体または一部分に対して産生され、そのタンパク質の全体または一部分に結合するならば、その抗体はＦＳＥＣに対して特異的であると言える。抗体の誘発は、動物への注射により生ずる免疫反応の刺激作用によるもののみならず、合成抗体、または組換え免疫グロブリンライブラリ（“Ｏｒｌａｎｄｉｅｔａｌ（１９８９）ＰＮＡＳ８６：３８３３−３８３７またはＨｕｓｅｅｔａｌ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ２５６：１２７５−１２８１ ”参照）またはリンパ球集団のｉｎｖｉｔｒｏ刺激作用によっても起こる。現在の技術（“ＷｉｎｔｅｒａｎｄＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ３４９：２９３−２９９”）では、抗体形成の原理に基づき、高度に特異的に結合する多数の試薬を提供することができる。このような技術は、ＦＳＥＣに特異的に結合し得る分子の産生に容易く適用することができる。ＦＳＥＣをコードするポリペプチドは、例えば腫瘍形成、慢性関節リウマチ、強皮症、及び乾癬のような血管新生に関連する様々な異常な状態を治療するのに有用なものとなり得る。ＦＳＥＣ遺伝子配列を細胞に導入することにより遺伝子治療を用いて、血管新生関連の病気の状態に関連するＦＳＥＣの過剰発現または発現不足によって特徴付けられる状態を治療することができる。例えば、ＦＳＥＣをコードするポリヌクレオチドは、機能不全内生遺伝子を置換したり、またはそれに代わって効果を発揮することができる。これとは別に、ＦＳＥＣ若しくはそのフラグメントを用いて、血管新生関連の病気または状態の治療を行うことができる。レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、またはウシ乳頭腫ウイルスのようなウイルス由来の発現ベクターを用いて、ＦＳＥＣをコードするヌクレオチド配列を、標的細胞集団に分配することができる。当業者には周知の方法を用いて、ＦＳＥＣポリヌクレオチド配列を含む組換えウイルスベクターを構成することができる。このような技術の例は“Ｍａｎｉａｔｉｓｅｔａｌ．，１９８９，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎ．Ｙ．”及び“Ａｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．，１９８９ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＧｒｅｅｎｅＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＡｓｓｏｃｉａｔｅｓａｎｄＷｉｌｅｙＩｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．”に記載されており、これらを参照されたい。別の形態として、組換えＦＳＥＣ分子を、リボソーム内に再構成して、標的細胞に分配することができる。従って、本発明は、効果的な量のＦＳＥＣをコードするポリヌクレオチド配列及び薬化学的に適格の担体を含む血管新生関連の病気状態を治療する薬化学的組成物を提供する。本発明は更に、効果的な量のＦＳＥＣをコードするポリヌクレオチドの患者への投与を含む、血管新生関連の疾病を患っている患者の治療方法を提供する。これとは別に、炎症に関連する状態のような、ＦＳＥＣの過剰発現によって特徴付けられる異常状態の治療を、ＦＳＥＣｍＲＮＡの翻訳を抑制するアンチセンス核酸を遺伝子治療技術を用いて導入することにより、行うことができる。ＦＳＥＣの抗体、阻害剤、アンチセンス分子、レセプタ、若しくは類似体（過剰なＦＳＥＣ産生に対する処理剤、以下略して“ＴＥＣ”と称する）は、治療的に投与されたときそれぞれ異なる効果を与え得る。このＴＥＣは、無毒性で、不活性で薬化学的に適格な水性担体媒質でありそのｐＨは約５〜８、より好適には６〜８のである。但し、このｐＨ値は、照合される抗体、阻害剤、レセプタ、または類似体の特性や治療される病状に応じて変わってくる。ＴＥＣの特性には、分子の可溶性、半減期、及び抗原性／免疫抗原性が含まれ、効果的な担体を決定するのに役立ち得る。自然発生ヒトタンパク質はＴＥＣとして好適であるが、薬物スクリーニングによって得られた有機分子も特定の状態の下では同様に効果的であり得る。ＴＥＣは、局所塗布用クリームまたはゲル、粘膜透過性スプレーまたはエーロゾル、皮膚透過性パッチまたは包帯、注射可能な静脈内または洗浄調合物及び経口投与液若しくは錠剤を含む周知の投与経路によって与えられ得るが、投与の仕方は以上挙げたものに限定されない。特定の配合、正確な投与量、及び投与経路は、病院所属医師により決定され、それぞれの状況に応じて変わってくる。このような決定は、治療を受ける条件、投与されるＴＥＣ、及び特定のＴＥＣの薬動力学的プロフィールのような様々な変量を考慮してなされる。考慮され得る他の因子には、病状、患者の年齢、体重、性別、食事、投与の回数、薬物の組合せ、反応感受性及び治療に対する耐性／反応が含まれる。長時間作用するＴＥＣ調剤の投与の頻度は、特定のＴＥＣの半減期及び消失速度に応じて、３日から４日に１回、１週間に１回、または２週間に１回であり得る。通常の投与量は、投与経路に応じて０．１〜１００，０００μｇ、最大１ｇの間で変化し得る。ＴＥＣの特定の投与量に関しての説明は以下の文献、即ち米国特許第４，６５７，７６０号、第５，２０６，３４４号、または第５，２２５，２１２号明細書に記載されている。ＴＥＣの種類に応じて効果的な配合も変わり、また肝臓を標的にする投与と、下垂体を標的にする場合では、投与方法も異なってくることが予測される。ヒトの脾臓に関連する状態、または白血球、特定の単球及びマクロファージを活性化する疾病及び永久損傷は、ＴＥＣで治療され得ると考えられる。これらの状態若しくは病気は、後に説明する診断テストにより詳しく診断され得る。このような診断テストは、例えばエプスタイン・バーウイルス、ホジキン病、様々な新生物または非特異的咽頭炎にかかっている疑いのある患者に対して行われるべきである。以下の実施例は、本発明を説明するためのものであり、本発明を限定するものではない。実施例１．ｍＲＮＡの単離及びｃＤＮＡライブラリの構築ｆｓｅｃのｃＤＮＡ配列は、初めにヒト胎児脾臓ライブラリを含むポリヌクレオチド配列の中から同定された。このライブラリは、ヒトの胎児の脾臓から外科的に取り出された組織から構築された。ヒト胎児脾臓組織は、カリフォルニア大学ロスアンジェルス校から冷凍状態のものが得られた。冷凍組織は、乳鉢と乳棒ですりつぶされ、すぐにグアニジウムイソチオシアナーテ（“ＣｈｉｒｇｗｉｎＪＭｅｔａｌ（１９７９）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１８：５２９４”参照）を含有する緩衝液に溶解された。溶解に続けて、セノール−クロロホルム抽出及びエタノール沈殿が数回行われた。ポリ（Ａ＋）ｍＲＮＡは、常磁性粒子に結合されたストレプトアビジンとビオチン化オリゴｄ（Ｔ）を用いて単離された（ “Ｐｏｌｙ（Ａ）ＴｒａｃｔＩｓｏｌａｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍ；Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ”）。ヒト胎児脾臓組織から得られたポリ（Ａ）ｍＲＮＡ（ＳｔｒａｔａｇｅｎｅＩｎｃ．；１１０１１Ｎ．ＴｏｒｒｅｙＰｉｎｅｓＲｄ．，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ９２０３７）を用いて、ｃＤＮＡライブラリを構築した。ｃＤＮＡの合成は、オリゴｄ（Ｔ）及び／またはランダム六量体をプライマーとして用いて行われた。合成アダプタオリゴヌクレオチドはＵＮＩ−ＺＡＰ（商標）ｖｅｃｔｏｒｓｙｓｔｅｍ（ＳｔｒａｔａｇｅｎｅＩｎｃ．）に挿入することができるようにｃＤＮＡの末端に結合された。これにより高い効率で一方向性（センス方向）のλライブラリ構築が可能となり、ｃＤＮＡ挿入体を有するクローンを検出するための青−白の色による選択ができるプラスミド系の利点を利用できるようになる。各ｃＤＮＡライブラリの品質は、ＤＮＡプローブと抗体プローブの何れかを用いてスクリーニングされ、次いでｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（商標登録）ファージミド（ＳｔｒａｔａｇｅｎｅＩｎｃ．）が生細胞の中で手早く切り取られた。このファージミドにより、簡単に挿入断片の特徴付け、配列決定、部位指定突然変異誘発、一方向性の形質の形成及び融合タンパク質発現のために、プラスミド系を使用することが可能となる。各ライブラリからのファージ粒子は、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞株ＸＬ１−ＢＬＵＥ（商標登録）（ＳｔｒａｔａｇｅｎｅＩｎｃ．）に感染させられた。ＸＬ１−ＢＬＵＥの形質転換効率が高いために、少ない比率で表現されたクローンをｃＤＮＡライブラリから得られる可能性が高められる。２．ｃＤＮＡクローンの単離ファージミド形態の個々のｃＤＮＡクローンは、ｉｎｖｉｖｏ切除プロセスにより得られた。このプロセスでは、ＸＬＩ−ＢＬＵＥが、ｆ１ヘルパーファージと同時に感染された。λファージ及びｆ１ヘルパーファージの双方に由来するタンパク質は、λ標的ＤＮＡ上の定められた配列から新たなＤＮＡ合成を開始し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミド及びｃＤＮＡ挿入断片の全てのＤＮＡ配列を含む小さな一本鎖環状ファージミドＤＮＡ分子を形成した。このファージミドＤＮＡは、細胞から放出され、精製されて、更に新鮮な細菌性宿主細胞（ＳＯＬＲ，ＳｔｒａｔａｇｅｎｅＩｎｃ．）に再感染するのに使用されて、ここで二本鎖のファージミドＤＮＡが産生された。ファージミドがβ−ラクタマーゼに対する遺伝子を保有していることから、新たに形質転換された細菌が、アンピシリンを含有する培地上で選択された。ファージミドＤＮＡは、ＱＩＡＧＥＮ（商標登録）ＤＮＡＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍ（ＱＩＡＧＥＮＩｎｃ．，９２５９ＥｔｏｎＡｖｅ．，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ９１３１１）のＱＩＡＷＥＬＬ −８ＰｌａｓｍｉｄＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍを用いて精製された。この技術は、細菌細胞を溶解し、高度に精製されたファージミドＤＮＡを単離するための、高速で信頼性が高く高スループットの方法である。精製樹脂から溶離されたこのＤＮＡは、ＤＮＡ配列決定及び他の分析的操作に適したものであった。３．ｃＤＮＡクローンの配列決定ヒト胎児脾臓ライブラリのランダム分離により得られたｃＤＮＡ挿入断片は、部分的に配列決定された。このｃＤＮＡは、ＨａｍｉｌｔｏｎＭｉｃｒｏＬａｂ２２００（Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＲｅｎｏＮＶ）と、４台のＰｅｌｔｉｅｒＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒｓ（ＰＴＣ２００ｆｒｏｍＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ，ＷａｔｅｒｔｏｗｎＭＡ）及びＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ３７７ｏｒ３７３ＤＮＡＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＳｙｓｔｅｍｓ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を組み合わせて用いて、ＳａｎｇｅｒＦ．ＡｎｄＡＲＣｏｕｌｓｏｎ（１９７５；Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，９４：４４１ｆ）記載の方法により配列決定され、ＤＮＡの読み枠が決定された。４．ｃＤＮＡクローン及び演繹されたタンパク質の相同性検索各ｃＤＮＡの配列は、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製の検索アルゴリズムを、ＩＮＨＥＲＩＴ（商標）６７０ＳｅｑｕｅｎｃｅＡｎａｌｙｓｉｓＳｙｓｔｅｍに組み込んで用いて、ＧｅｎＢａｎｋの配列と比較された。このアルゴリズムでは、ＰａｔｔｅｒｎＳｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎＬａｎｇｕａｇｅ（ＴＲＷＩｎｃ．，ＬｏｓＡｎｇｅｌｅｓＣＡ）を用いて、相同性領域を決定した。配列比較をどのように行うかを定める３つのパラメータは、ウィンドウサイズ、ウィンドウオフセット、及び誤差許容度であった。これら３つのパラメータの組合せを用いて、興味の対象である配列に対して相同性を有する領域を含む配列を、ＤＮＡデータベースから検索し、適当な配列に対して初期値と共にスコアが付けられた。続いて、これらの相同領域を、ドットマトリクス相同性プロット法を用いて検定し、偶然の一致と真の相同領域とを区別した。相同性検索の結果を表示するためにＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアラインメント用いた。ペプチド及びタンパク質配列の相同性は、ＩＮＨＥＲＩＴ（商標）６７０ＳｅｑｕｅｎｃｅＡｎａｌｙｓｉｓＳｙｓｔｅｍを用いて、ＤＮＡ配列の相同性の検査に類似した方法で確認された。ＰａｔｔｅｒｎＳｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎＬａｎｇｕａｇｅ及びパラメータウィンドウを用いて、相同性領域を含むタンパク質配列のデータベースを検索し、相同性領域は初期値と共にスコアを付けられて表示された。ドットマトリクス相同性プロット法により検定を行い、有意な相同性領域を偶然の一致と区別した。ＢＬＡＳＴ（ベーシック局部的一致検索ツール）（“ＢａｓｉｃＬｏｃａｌＡｌｉｇｎｍｅｎｔＳｅａｒｃｈＴｏｏｌ（ＡｌｔｓｃｈｕｌＳＦ（１９９３）ＪＭｏｌＥｖｏｌ３６：２９０−３００，Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ＳＦｅｔａｌ（１９９０）ＪＭｏｌＢｉｏｌ２１５：４０３−１０）”参照）を用いて、局部的な配列の一致を検索した。ＢＬＡＳＴは、ヌクレオチド及びアミノ酸配列双方のアライメントを検出して、これにより配列の類似性が決定される。アライメントが局部的であるために、ＢＬＡＳＴは、ギャップを含まないアライメントを求めるのに有用なものである。ＢＬＡＳＴアルゴリズム出力の基本単位は、Ｈｉｇｈ−ｓｃｏｒｉｎｇＳｅｇｍｅｎｔＰａｉｒ（ＨＳＰ）である。ＨＳＰは、アライメントが局部的に最大となる部分の長さが等しく、アライメントスコアがユーザがセットしたカットオフスコアまたは閾値スコア以上であるような２つの配列フラグメントからなる。ＢＬＡＳＴを用いる方法により、興味の対象となる配列と、データベース配列とのＨＳＰを捜し、発見された一致の統計的優位性を評価し、ユーザが選択した優位性の閾値を超える一致のみを知ることができる。パラメータＥは、データベース配列との一致で報告されるものを選択するための、統計的優位性の閾値を設定する。Ｅは、データベース検索全体の文脈の中で、ＨＳＰ（若しくはＨＳＰの組）の偶然の一致の予定頻度の上限と解釈される。Ｅを満たすデータベース配列は、プログラムの出力において報告される。ヒト胎児脾臓発現型ケモカイン（ＦＳＥＣ）に対するヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は、それぞれ配列番号：１及び配列番号：２に示されている。５．遺伝子の同定及び全長さにわたる配列決定ヒト胎児脾臓ライブラリのクローンの中からランダムにピックアップし配列決定すると、既知のＣ−Ｃケモカイン分子との相同性を有するが、明らかに異なっているｆｓｅｃ配列が見つけられた。このｆｓｅｃに対するヌクレオチド配列はサイトカイン社クローンＮＯ．２９５９２内において発見された。予測される全ての可能な３つのこの配列の翻訳物について、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ及びＰＩＲのようなタンパク質データベースを検索したが、ｆｓｅｃの可能な翻訳物と完全に一致するものは見つけられなかった。第２図に示すのは、ＦＳＥＣと他のケモカイン分子との比較であって、Ｃ−Ｃモチーフを含む実質的な相同領域が共有されているところが示されている。しかし、系統分析により、ＦＳＥＣは、他のよく特徴付けられたヒトＣ−Ｃケモカインとは近縁関係にないことが分かった（第４図参照）もこれらの分子の最も近縁なものは、図面の右側に集まっている。この結果が表しているのは、ＦＳＥＣが、Ｃ−Ｃケモカインの新たなサブファミリーまたは変異体であることだと考えられる。６．アンチセンス分析ＦＳＥＣの正しい完全なｃＤＮＡ配列を知ることにより、遺伝子機能の調査でのアンチセンス技術に、これを適用することが可能になる。ＦＳＥＣをコードするポリヌクレオチド配列のアンチセンス鎖を含むゲノムのまたはｃＤＮＡのフラグメントをｉｎｖｉｔｒｏまたはｉｎｖｉｖｏで用いて、特定のタンパク質の発現を阻害することができる。このような技術は周知であり、ヌクレオチド配列の様々な部位に付くプローブをデザインすることができる。細胞または実験動物の全体をこのようなアンチセンス配列で処理することより、興味の対象である遺伝子の機能を効果的に遮断することができる。多くの場合、細胞レベル、組織レベル、若しくは生物体全体のレベルでの挙動（例えば死亡率、分化した機能の消失、形態の変化等）を観察することにより、その遺伝子の機能を確認することができる。開放された読み枠の転写を妨害するように構築された配列を用いることに加えて、イントロン領域、プロモータ／エンハンサー要素、またはトランス作用調節遺伝子に対するアンチセンス配列をデザインすることにより、遺伝子発現を修飾することかできる。同様に、“三重らせん体（トリプルヘリックス）”塩基対として知られるＨｏｇｅｂｏｏｍ塩基対を用いて阻害を達成することができる。７．ＦＳＥＣの発現ＦＳＥＣをコードするヌクレオチド配列を発現ベクターにクローニングした。この発現ベクターは、Ｔ７プロモータに始まり、それに続く開始メチオニンコドン（ＡＴＧ）、それに続くＥ．ｃｏｌｉのＴｒｘＡ遺伝子（チオレドキシンをコードするもの）、それに続くエンテロキナーゼ切断可能部位をコードする配列、及びＦＳＥＣをコードするヌクレオチド配列を含むものである。ＦＳＥＣに対しては、発現されたタンパク質のＮ末端残基は配列番号：２の配列の第２４残基のＬｅｕ（ロイシン）である。６個のヒスチジンコドンを含む上述の発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換させ、宿主細胞培地をＩＰＴＧで誘発して発現されたタンパク質に、変性ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法を施した。発現ベクターから得られた核酸は、上述のＳａｍｂｒｏｏｋのミニプレッププロシージャを用いて部分的に精製され、これによりスーパーコイルしたＤＮＡが産生された。約１００ｎｇのＤＮＡを用いて、宿主細菌細胞Ｗ３１１０／ＤＥ３を形質転換させた。Ｗ３１１０／ＤＥ３は、ＡＴＣＣのＷ３１１０及びＮｏｖａｇｅｎ社製のｌａｍｂｄａＤＥ３ｌｙｓｏｇｅｎｉｚａｔｉｏｎｋｉｔ（ＤＥ３溶原化キット）を用いて構築された。ＤＥ３溶源は、その親Ｗ３１１０より形質転換受容性が低いことが多く、効率的な形質転換のためのスーパーコイルしたＤＮＡの使用に適用される。各ケモカイン形質転換から１つの形質転換体が選択され、それを用いてアンピシリン含有Ｌ−ブロスの５ｍｌの培地に接種した。各５ｍｌの培地は、振とうした上で３７℃で一晩（１２〜１５時間）増殖させた。一晩おいた後、その培地の１ｍｌを、５００ｍｌのフラスコ内で、アンピシリン含有Ｌ−ブロスの１００ｍｌの培地に接種し、振とうした上で３７℃で増殖させ、培地のＯＤ６００が０．４〜０．６に達するで放置した。接種された細胞がＯＤ６００の値で０．６を越えるまで増殖した場合には定常期に入り、誘発レベルは低減する。接種の時に、５ｍｌの試料を取り出し、氷上に設置して、前誘発（preinducti on）試料（または０時間試料）として用いた。この細胞培地がＯＤ６００の値で０．６に達したとき、１００ｍＭＩＰＴＧ原液の４００μｌを添加して、最終的な濃度は０．４ｍＭになるようにした。この培地は、振とうした上、３７℃で３時間増殖させた。１時間から最大６時間の間隔で、培地の５ｍｌの分割量を取り、変性ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法で発現誘発の分析を行った。融合タンパク質は、細胞の不溶性分画に蓄積していることが観察された。ＦＳＥＣの誘発が最大となるのは２時間経過したときであった。４時間以上増殖させると、培地で溶解が生じ、このタンパク質分解により所望のタンパク質の全体としての収量は低減した。０時間、１時間、及び２時間経過したときに細胞培地の５ｍｌの分割量を取り４℃で５分間３０００ＲＰＭで遠心分離した。その上清を吸引し、細胞の溶解を促進すべくピペットに凍結融解処理を施した。このピペットは４℃でＴＥ［１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＬｐＨ８．０，１ｍＭＥＤＴＡｐＨ８．０］に再懸濁した。その量はＴＥ（μｌ）＝（ＯＤ６００）（２５０）で計算される量であった。各試料には同量の２×ＳＤＳＳａｍｐｌｅＬｏａｄｉｎｇＢｕｆｆｅｒ（Ｎｏｖｅｘ）が添加された。この試料を５分間煮沸し、各レーンにつき１０μｌの各試料を負荷したゲル電気泳動法の結果、ＦＳＥＣ融合タンパク質は、変性ＳＤＳゲル上で２４ＫＤ分子量（予定分子量２４０９３ダルトン）の位置に移動した。８．組換えＦＳＥＣの単離ＦＳＥＣはキメラタンパク質として発現された。このキメラタンパク質は、６個のヒスチジン、それに続くＥ．ｃｏｌｉのチオレドキシン（ＴｒｘＡ）遺伝子を有し、ＴｒｘＡタンパク質とＦＳＥＣとの間にエンテロキナーゼ切断部位を有していた。ヒスチジンは、タンパク質の精製を促進するために添加されたものである。ヒスチジンが存在することにより、ＩＭＩＡＣクロマトグラフィー（Ｐｏｒａｔｈ：上述）上での精製が可能となる。９．ＦＳＥＣ特異的抗体の産生ＰＧＥＣに対するポリクローナル抗体を、上述のセクション７に記載したように、電気泳動で精製されたＰＧＥＣ融合タンパク質を約１００μｇウサギに注射することにより調製した。一次抗体の注射から約８週間の後、ポリクローナル血清を回収した。配列番号：２のＦＳＥＣのうちの残基２５〜４２からなるＦＳＥＣのペプチドに対するポリクローナル抗体が、通常の方法により調製された。１０．ＦＳＥＣ特異的抗体を用いた診断テスト特定のＦＳＥＣ抗体を、前病状態の診断、及びＦＳＥＣの量または分布の差によって特徴付けられる慢性または急性の疾病に対する診断に用いることができる。ＦＳＥＣは、それが同定される特定の組織の異常または病状に対して特異的であることが多い。ＦＳＥＣに対する診断テストには、ヒトの体液、組織またはこのような組織の抽出物においてＦＳＥＣを検出するために抗体及び標識を用いる方法が含まれる。本発明のポリペプチド及び抗体は、修飾した上で使用されることもあれば、修飾せずに使用されることもある。多くの場合ポリペプチド及び抗体は、検出可能なシグナルを提供する物質と共有結合または非共有結合で結合させることにより標識される。標識及び接着技術には様々なものが知られており、化学的な文献あるいは特許明細書の双方において広く記載されている。適当な標識としては、放射線核種、酵素、気質、補因子、阻害剤、蛍光剤、化学ルミネセンス剤、磁性粒子等が有る。このような標識の使用について記載されている特許明細書には、例えば米国特許第３，８１７，８３７号、第３，８５０，７５２号、第３，９３９，３５０号、第３，９９６，３４５号、第４，２７７，４３７号、第４，２７５，１４９号、第４，３６６，２４１号の明細書がある。また組換え免疫グロブリンの産生方法は、米国特許第４，８１６，５７６号明細書に記載されている方法を用いることができ、本明細書と共に参照されたい。可溶性または膜結合型ＦＳＥＣを測定するための、ＦＳＥＣに対して特異的なポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体の何れかを用いる様々なプロトコルが周知となっている。その例を挙げると、固相酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）、放射線免疫検定法（ＲＩＡ）、及び蛍光活性化細胞分析分類法（ＦＡＣＳ）等が有る。好適なのは、ＦＳＥＣ上の２つの非干渉エピトープに反応するモノクローナル抗体を利用した２つの部位のモノクローナルベースの免疫検定法であるが、競合的結合検定法を用いてもよい。これらの検定法は、“Ｍａｄｄｏｘ，ＤＥｅｔａｌ（１９８３，ＪＥｘｐＭｅｄ１５８：１２１１）”他の文献に記載されている。１１．特異的抗体を用いる未変性ＦＳＥＣの精製未変性または組換えＦＳＥＣは、ＦＳＥＣ特異的抗体を用いたイムノアフィニティクロマトグラフィーにより精製された。一般に、イムノアフィニティカラムは、抗ＦＳＥＣ抗体と活性化クロマトグラフィー樹脂が共有結合で結びつくことによって構成される。ポリクローナル免疫グロブリンは、実施例４に記載したように調製され、モノクローナル抗体は硫安沈殿または固定化タンパク質Ａ上でのクロマトグラフィーによりマウスの復水から調製される。部分的に精製された免疫グロブリンは、ＣｎＢｒ活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＰｈａｒｍａｃｉａＬＫＢＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）のようなクロマトグラフィー樹脂に共有結合によって付着する。抗体は樹脂に結合し、製造者の指示に従いこの樹脂をブロックした後、誘導体樹脂を洗浄する。このようなイムノアフィニティカラムは、可溶型のＦＳＥＣを含む細胞から分核を調製することによってＦＳＥＣの精製において用いられる。可溶化ＦＳＥＣは、界面活性剤の添加または従来より周知の他の方法により遠心分離法を用いて得られた細胞成分分画、若しくは細胞全体を可溶化することによって誘導される。別の形態として、シグナル配列を含む可溶化ＦＳＥＣは、細胞が増殖する培地に有用な量だけ分泌され得る。可溶化ＦＳＥＣ含有調合物は、イムノアフィニティカラムを通されて、このカラムはＦＳＥＣの好適な吸収が可能となる条件の下で（即ち、界面活性剤の存在の下、高イオン強度の緩衝液の中で）ＦＳＥＣはカラムから溶離され、次いでＦＳＥＣが回収された。１２．ＥＣ誘発走化性または細胞活性化の判定ＦＳＥＣの走化性の活性は、４８穴マイクロケモタキシスチャンバ（“ＦａｌｋＷＲｅｔａｌ（１９８０）ＪＩｍｍｕｎｏｌＭｅｔｈｏｄｓ３３：２３９”参照）で測定される。各穴はフィルタによって２つの区画に分割されており、細胞が化学的勾配に応じてこのフィルタを通過できるようになっている。ＦＳＥＣを含むＲＭＰＩ１６４０のような細胞培養地は、通常はポリカーボネート製のフィルタの一方の側に配置され、同じ媒地内で懸濁された細胞がフィルタの他方の区画に配置される。十分なインキュベーション時間が経過すると、フィルタ前後の濃度勾配に応じて細胞がフィルタを通過する。その後、フィルタは各穴から取り出され、フィルタのＦＳＥＣ側に付着した細胞が分類され定量される。特異的な細胞集団に対してケモタキシスアッセイを実施することにより、化学誘因物質の特異性が判定される。初めに、静脈穿刺で得られた血液細胞が密度勾配遠心分離法により分画され、好中球、末梢血単球細胞、単球及びリンパ球の濃縮された集団に対して、特定のＦＳＥＣの走化性（ケモタキシス）の活性がテストされる。所望に応じて、このような濃縮細胞集団は、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋濃縮Ｔ細胞集団のネガティブ選択のために、ＣＤ８＋及びＣＤ４＋特異的抗体を用いてそれぞれ更に分画される。別の実験（アッセイ）により、活性化Ｔ細胞に対するＦＳＥＣの走化性効果が解明される。この実験では、未分画のＴ細胞または分画されたＴ細胞サブセットが、ＣＤ−３抗体でコーティングされた組織培養容器内で６〜８時間培養される。このＣＤ３活性化の後、ＦＳＥＣの走化性の活性が上述のようにテストされる。また、濃縮細胞集団を得るための方法は、他にも様々なものが従来より周知である。ケモカインの中には、好中球及び単球の非走化性細胞活性化作用を示すものもある。これは、アクチン重合、呼吸バースト作用の増加、アズール親和性顆粒の脱顆粒、及びシグナル伝達経路の一部としてのＣａ²⁺動員のような好中球活性化作用の標準的な測定基準を媒介にして検定される。Ｃａ²⁺の動員の検定法には、Ｃａ²⁺の結合によって放射特性が変化する蛍光プローブを好中球に前負荷する処理過程が含まれる。細胞が活性化刺激にさらされたとき、蛍光光度計により細胞を観測することにより、Ｃａ²⁺の流れを知ることができる。Ｃａ²⁺動員の測定については、“ＧｒｙｎｋｉｅｖｉｃｚＧｅｔａｌ．（１９８５）ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２６０：３４４０，ａｎｄＭｃＣｏｌｌＳｅｔａｌ．（１９９３）ＪＩｍｍｕｎｏｌ１５０：４５５０−４５５５”に記載されており、これを本明細書と共に参照されたい。脱顆粒及び呼吸バースト反応は、単球においても測定される（“ＺａｃｈａｒｉａｅＣＯＣｅｔａｌ．（１９９０）ＪＥｘｐＭｅｄ１７１：２１７７−８２”参照）。更に、単球活性化作用の測定基準には、接着分子発現及びサイトカインの産生の調節を利用することができる（“ＪｉａｎｇＹｅｔａｌ．（１９９２）ＪＩｍｍｕｎｏｌ１４８：２４２３−８”参照）。接着分子の発現は、リンパ球の活性にも応じて変化する（“ＴａｕｂＤｅｔａｌ．（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ２６０：３５５−３５８”参照）。１３．薬物スクリーニングＦＳＥＣ若しくはそのフラグメントは、様々な薬物スクリーニング技術で化合物をスクリーニングする際に有用である。このようなテストにおいて用いられるＦＳＥＣポリペプチドまたはフラグメントは、溶液の中に遊離している形態のものか、固体の支持体に付着している形態のものか、細胞の表面に支持されている形態のものか、あるいは細胞内に存在する形態のものの何れかである。薬物スクリーニングの一方法では、宿主細胞として、ＦＳＥＣポリペプチドまたはそのフラグメントを発現する組換え核酸で安定的に形質転換される真核細胞または原核細胞を利用する。薬物は、競合的結合実験において形質転換された細胞からスクリーニングされる。このような細胞は、生存型であれ固定型であれ標準的な結合実験に使用することができる。これを用いて、例えばＦＳＥＣまたはそのフラグメントと試験される薬剤との複合体形成を測定したり、あるいは試験される薬剤によって生じた、ＦＳＥＣまたはそのフラグメントと好中球または繊維芽細胞との複合体の減少を検査することができる。従って、本発明は、炎症及び疾病に作用する薬剤または薬物のスクリーニング方法を提供するものである。これらの方法は、本発明のＦＳＥＣポリペプチド、若しくはそのフラグメントをこのような薬剤に接触させる過程と、（ｉ）ＦＳＥＣポリペプチド若しくはそのフラグメントとその薬剤との複合体の存在、若しくは（ｉｉ）ＦＳＥＣポリペプチドまたはそのフラグメントと細胞との複合体の存在を、周知の方法により検定（アッセイ）する過程とを含む。このような競合的結合検定法においては、ＦＳＥＣポリペプチドまたはそのフラグメントは通常標識される。適当なインキュベーションの後、遊離したＦＳＥＣポリペプチドまたはそのフラグメントが、結合した形態で存在するそれから分離され、遊離した、複合体を形成していない標識の量が、特定の薬剤がＦＳＥＣに結合する能力、またはＦＳＥＣ／細胞複合体に干渉する能力の尺度となる。薬物スクリーニングのための他の技術では、本発明のＦＳＥＣポリペプチドに対する適切な結合親和性を有する複合体を高スループットでスクリーニングすることができ、その技術の詳細は１９８４年９月１３日公開の欧州特許出願第８４／０３５６４号明細書に記載されており、本明細書と共にこれを参照されたい。この方法を簡単に述べると、たくさんの異なる小さなペプチドのテスト化合物が、例えばプラスチックピンまたは他の物質でできた固体基板の表面上で合成される。ペプチドテスト化合物は、ＦＳＥＣポリペプチドと反応させられたた上で、洗浄される。次いで、結合ＦＳＥＣポリペプチドが、周知の方法により検出される。上述の薬物スクリーニング技術において使用するために、精製ＦＳＥＣをプレート上に直接コーティングすることもできる。更に、非中和性抗体を用いて、固体支持体上にペプチドを捕捉若しくは固定化することができる。ＦＳＥＣポリペプチド若しくはそのフラグメントに結合するテスト化合物と、ＦＳＥＣに結合できる中和性抗体とが特異的に競合する競合的薬物スクリーニングアッセイの利用も本発明の企図するところである。このようにして、この抗体を用いて、１または２以上の抗原決定基がＦＳＥＣと共通な任意のペプチドの存在を検出することができる。１４．合理的薬物デザイン合理的薬物デザインの目標は、興味の対象の生物学的に活性のポリペプチド、若しくは、例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、または阻害剤のような、そのポリペプチドが相互作用する小分子の構造的な類似体を作り出すことである。ここに例として挙げたものは何れも、より活性の高いまたは安定な形態のポリペプチドである薬剤、またはｉｎｖｉｖｏでポリペプチドの機能を強化、または阻害する薬剤を作り出すのに用いることができる（“ＨｏｄｇｓｏｎＪ（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ９：１９−２１”を本明細書とともに参照されたい）。１つの方法では、ＦＳＥＣまたはＦＳＥＣ−阻害剤複合体の三次元構造の決定を、Ｘ線結晶解析、コンピュータによるモデル化、若しくは最も典型的にはこの２つの手段を組合せて行う。構造を解明し、分子の活性部位を決定するために、ポリペプチドの形状及び電荷を確認しなければならない。ポリペプチドの構造に関する有用な情報が、相同タンパク質の構造に基づいたモデリングにより得られることもある。何れの場合においても、対象物の構造の情報を用いて、類似体ケモカイン状分子をデザインしたり、あるいは効果的な阻害剤を同定している。合理的薬物デザインの有用なものの例としては、ＢｒａｘｔｏｎＳａｎｄＷｅｌｌｓＪＡ（１９９２Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３１：７７９６−７８０１）により提示されたような、活性または安定性が改善された分子、若しくは、ＡｔｈａｕｄａＳＢ等（１９９３ＪＢｉｏｃｈｅｍ１１３：７４２−７４６）によって提示された自然発生ＦＳＥＣの阻害剤、アゴニストまたはアンタゴニストとして作用する分子があり、ここでは上述の両文献を参照されたい。上述のように、機能検定により選択された標的特異的抗体を単離し、次いでその結晶構造を解明することも可能である。通常この方法により、続けて行われる薬物デザインにおける基礎となり得るファーマコア（pharmacore）が得られる。機能的な、薬理学的に活性の抗体に対する抗イデオタイプの抗体（抗ｉｄ）を産生することにより、タンパク質の結晶解析をバイパスすることが可能である。鏡像の鏡像と同様の意味で、抗ｉｄの結合部位は、もとのレセプタの類似体であることが期待される。次いで、抗ｉｄを用いて、化学的または生物学的に作られたペプチドのバンク（bank）から、ペプチドを同定し単離することができる。単離されたペプチドは、ファーマコアとして役立つ。本発明により、Ｘ線結晶解析のような分析的研究を行うのに使用できる十分な量のポリペプチドを作ることができる。更に、ここに開示したＦＳＥＣアミノ酸配列の知識を、Ｘ線結晶解析の代わり、またはそれと共に用いられるコンピュータによるモデル化技術に応用することができる。１５．ＦＳＥＣレセプタの同定精製ＦＳＥＣを、特異的細胞表面レセプタ及び他の結合分子を特徴付け、精製に利用することができる。走化性若しくは他の特異的反応によりＦＳＥＣに反応する細胞は、ＦＳＥＣに対するレセプタを発現しやすい。ＦＳＥＣに放射性標識を組み込むためには、様々な周知の方法を用いることができる。好適実施例では、ＦＳＥＣの主たるアミノ基を、¹²⁵Ｉボルトンハンター試薬（“Ｂｏｌｔｏｎ，ＡＥａｎｄＨｕｎｔｅｒ，ＷＭ（１９７３）ＢｉｏｃｈｅｍＪ１３３：５２９”参照）で標識する。この試薬は、他のケモカインについても、その生物学的活性を損なうことなく標識するために用いられてきた（“ＨｅｂｅｒｔＣＡｅｔａｌ（１９９１）ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２６６：１８９８９；ＭｃＣｏｌｌＳｅｔａｌ（１９９３）ＪＩｍｍｕｎｏｌ１５０：４５５０−４５５５”参照）。レセプタ保有細胞は、標識化ＦＳＥＣと共にインキュベートされる。次いで、この細胞は洗浄されて非結合ＦＳＥＣが除去され、次いでレセプタ結合ＦＳＥＣが定量される。異なる濃度のＦＳＥＣを用いて得られたデータから、レセプタの数及び親和性を表す数値を計算することができる。標識化ＦＳＥＣは、その特異的レセプタの精製のための試薬として有用である。ＦＳＥＣはクロマトグラフィカラムに共有結合で結合される。レセプタ保有細胞が抽出され、その抽出物がカラムに通される。レセプタは、そのリガンドとの生物学的親和性のためにカラムに結合する。レセプタはカラムから回収され、Ｎ末端タンパク質シークエンシングを受ける。得られたアミノ酸配列は、そのレセプタ遺伝子のクローニングのための変性オリゴヌクレオチドプローブのデザインに使用される。別の実施例においては、発現クローニングｍＲＮＡがレセプタ保有細胞から得られ、それからｃＤＮＡ発現ライブラリが形成される。このライブラリは、細胞集団へのトランスフェクションがなされ、レセプタを発現する細胞集団は蛍光標識化ＦＳＥＣを用いて選択される。このレセプタは、高度に標識された細胞から組換えＤＮＡを回収し配列決定することにより同定される。別の方法では、レセプタ保有細胞の表面に対する抗体、好ましくはモノクローナル抗体が産生され、更にスクリーニングによりこのうち標識化ＦＳＥＣの結合を阻害するものが同定される。このモノクローナル抗体は、アフィニティ精製またはレセプタの発現クローニングのために用いられる。可溶性レセプタ、若しくは他の可溶性結合分子の同定も類似した方法で行われる。標識化ＦＳＥＣを、抽出物、またはヒト胎児脾臓由来の他の適切な材料と共にインキュベートする。インキュベーションの後、精製ＦＳＥＣより大きいサイズのＦＳＥＣ複合体を、例えば、サイズ排除クロマトグラフィまたは密度勾配遠心分離法のような分子の大きさによって分離するサイジング技術を用いて同定し、従来より周知の方法で精製する。可溶性レセプタまたは結合タンパク質はＮ末端シークエンシングを受けて、その可溶性タンパク質が既知である場合にはデータベースによる同定のため、その可溶性タンパク質が未知である場合にはクローニングのための十分な情報が獲得される。上述の明細書の記載の中で引用された全ての文献及び特許明細書は、本明細書と一体に組み込まれる。上述の本明細書の内容は、当業者が本発明を実行するのに十分なものであると考えられる。実際、当業者は、以下の請求の範囲に記載の本発明の範囲内で、上述の実施例に様々に変更を加えて実施することができるであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＧ０１Ｎ 33/50 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｐ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ )，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者シールヘイマー、ジェフリー・ジェイアメリカ合衆国カリフォルニア州94022・ロスアルトスヒルズ・ラクレスタドライブ 12555

Claims

【特許請求の範囲】１．配列番号：２の配列のポリペプチド、またはその相補的ポリペプチドをコードする核酸配列を含むことを特徴とする精製ポリヌクレオチド。２．前記核酸配列が、配列番号：１の配列からなることを特徴とする請求項１に記載のポリヌクレオチド。３．請求項２に記載の前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター。４．請求項３に記載の前記発現ベクターを含むことを特徴とする宿主細胞。５．請求項２に記載の前記ポリヌクレオチドの非保存フラグメントを含むことを特徴とする核酸プローブ。６．請求項２に記載の前記ポリヌクレオチドの少なくとも一部分に対して相補的なポリヌクレオチド配列を含むことを特徴とするアンチセンス分子。７．配列番号：２の配列を含むポリペプチドを産生する方法であって、ａ）前記ポリペプチドの発現に適切な条件の下で、請求項４に記載の前記宿主細胞を培養する過程と、ｂ）前記細胞培養物から前記ポリペプチドを回収する過程とを有することを特徴とするポリペプチドの産生方法。８．配列番号：２のアミノ酸配列を含むことを特徴とする精製胎児脾臓発現型ケモカイン。９．配列番号：２の第１６番残基のプロリンをＮ末端アミノ酸残基として有することを特徴とする精製胎児脾臓発現型ケモカイン。１０．請求項９の精製ポリペプチドに対して特異的なことを特徴とする抗体。１１．請求項５の前記核酸プローブを含む胎児脾臓発現型ケモカイン（ＦＳＥＣ）をコードする核酸配列を検出するための診断用組成物。１２．生物学的試料において胎児脾臓発現型ケモカイン（ＦＳＥＣ）をコードするヌクレオチド配列を検出するための診断テスト方法であって、ａ）前記生物学的試料と、配列番号：１のヌクレオチド配列含む第１ヌクレオチド配列、若しくはそのフラグメントとを、核酸ハイブリダイゼーション複合体の形成に適切な条件の下で結合する過程と、ｂ）前記ハイブリダイゼーション複合体を検出する過程であって、前記複合体の存在が、前記生物学的試料におけるＦＳＥＣをコードする第２ヌクレオチド配列の存在と相関している、該過程と、ｃ）前記試料における前記第２ヌクレオチド配列の量と標準値とを比較し、前記第２ヌクレオチド配列の量が前記標準値と異なっているか否かを判定する過程であって、前記第２ヌクレオチド配列の異常レベルの存在が、ＦＳＥＣの異常発現に関連する状態と正の相関を有する、該過程とを有することを特徴とする診断テスト方法。１３．前記第１ヌクレオチド配列がリポーター分子で標識され、前記ハイブリダイゼーション複合体が前記リポーター分子を測定することにより検出されることを特徴とする請求項１２に記載の診断テスト方法。１４．生物学的試料において胎児脾臓発現型ケモカイン（ＦＳＥＣ）をコードするヌクレオチド配列を検出するための診断テスト方法であって、ａ）核酸増幅に適した条件の下で、前記生物学的試料とＰＣＲプライマーとを結合する過程であって、前記プライマーが配列番号：１のヌクレオチド配列の非保存領域に由来するフラグメントを含む、該過程と、ｂ）増幅されたヌクレオチド配列を検出する過程と、ｃ）前記生物学的試料における前記増幅されたヌクレオチド配列の量を、標準値と比較し、前記ヌクレオチド配列の量が前記標準値と異なっているか否かを判定する過程であって、前記ヌクレオチド配列の異常レベルの存在が、ＦＳＥＣの異常発現に関連する状態と正の相関を有する、該過程とを有することを特徴とする診断テスト方法。１５．請求項８のポリペプチド、またはその一部分を用いた特異的結合実験のための複数の組成物をスクリーニングする方法であって、ａ）複数の組成物を用意する過程と、ｂ）適当な条件のもとで結合できる十分な時間をかけて、前記複数の組成物のそれぞれと胎児脾臓発現型ケモカイン（ＦＳＥＣ）とを結合する過程と、ｃ）前記複数の組成物のそれぞれとＦＳＥＣとの結合とを検定して、ＦＳＥＣに特異的に結合する組成物を同定する過程とを有することを特徴とする特異的結合実験のための複数の組成物のスクリーニング方法。