【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＥｐｈＢ６受容体遺伝子ノックアウト動物およびその利用方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
受容体型チロシンキナーゼは、種々の細胞に広範囲に発現し、細胞の増殖と分化の際に重要な役割を担うことが知られている。このようなチロシンキナーゼ活性を有する受容体のうち、Ｅｐｈファミリーは最大のファミリーであり、これまで同ファミリーに属する１５種類のＥｐｈ受容体が単離・同定されている。これらＥｐｈ受容体は、配列の相同性により、ＥｐｈＡ受容体およびＥｐｈＢ受容体の２つのグループに大別される。一方、Ｅｐｈ受容体に対するリガンドは、ｅｐｈｒｉｎと呼ばれ、これまで９種類のｅｐｈｒｉｎが同定されている。ｅｐｈｒｉｎも２つのグループに大別され、一方のｅｐｈｒｉｎ−Ａは、グリコシルホスファチジルイノシトールと結合して細胞膜に固定され、他方のｅｐｈｒｉｎ−Ｂは、自身の膜貫通領域を介して細胞膜に固定される。概括的にはｅｐｈｒｉｎ−Ａおよびｅｐｈｒｉｎ−Ｂは、それぞれ、ＥｐｈＡ受容体およびＥｐｈＢ受容体と高い親和性で結合する。しかし、親和性の程度は、Ｅｐｈ受容体およびｅｐｈｒｉｎの各種類の組み合わせによって異なる。さらに、Ｅｐｈ受容体の中には、他方のグループのｅｐｈｒｉｎと結合するものも知られている。その上、ＥｐｈＢ受容体は、ｅｐｈｒｉｎのリガンドのように振る舞い、ｅｐｈｒｉｎを発現する細胞内にシグナルを伝達する作用を持つことが報告され、これらＥｐｈ受容体およびｅｐｈｒｉｎは「Ｅｐｈ／ｅｐｈｒｉｎファミリー」とも総称されている。
【０００３】
上記「Ｅｐｈ／ｅｐｈｒｉｎファミリー」は、生体内で多様かつ重要な機能を担っていることが最近の研究から明らかにされつつある。例えば、神経系での軸索伸長方向や細胞の移動を制御する働き、さらに、血管形成や胚形成における同ファミリーの重要な役割が報告されている。また、生体内でのＥｐｈ／ｅｐｈｒｉｎファミリーに属する各分子の機能を詳細に解析するために、既に何種類かのノックアウトマウスが作製され、研究が進められている。その結果、各分子の結合特性、生理機能および発現パターンについて、種類間での多様性と冗長性とが明らかにされると共に、特に発生中の形態形成において各分子がそれぞれ特有の働きを有していることが明らかにされつつある。例えば、ＥｐｈＡ４受容体、ＥｐｈＡ８受容体、ｅｐｈｒｉｎ−Ａ２、ｅｐｈｒｉｎ−Ａ５の各遺伝子は、それぞれ、皮質脊髄路、視蓋交連部、ｒｅｔｉｎｏｃｏｌｌｉｃｕｌａｒ、網膜および鋤骨鼻における各神経軸索のガイダンスに重要であり、ＥｐｈＢ２受容体、ＥｐｈＢ３受容体、およびｅｐｈｒｉｎ−Ｂ３は、大脳前交連、脳梁、皮質脊髄路における各神経軸索経路の決定に関与している。さらに、ＥｐｈＢ４受容体およびｅｐｈｒｉｎ−Ｂ２遺伝子は、マウス胚において血管形成に重要であることが報告されている。
【０００４】
このように、Ｅｐｈ／ｅｐｈｒｉｎファミリーに属する各分子の機能や発現パターンには多様性が認められる。ところで、Ｅｐｈ受容体は、前述のように受容体型チロシンキナーゼであり、各分子間でよく保存されているキナーゼドメインを有するが、ＥｐｈＢ６受容体については、このキナーゼドメイン中のアミノ酸が他の分子と一部異なっている（例えば、下記の非特許文献１参照）。実際にＥｐｈＢ６受容体を発現させて調べてみてもキナーゼ活性は検出されず、この点でＥｐｈＢ６受容体は非常に特徴的である。
【０００５】
また、上記ＥｐｈＢ６受容体は、キナーゼ欠損型であるという特徴のほかに、正常ヒト組織中（特に脳および胸腺）に強く発現し、胸腺においてはＣＤ４＋ＣＤ８＋両陽性細胞に高頻度に発現する点、および造血細胞においてはＴ細胞特異的に発現する点で特徴的である（例えば、下記の非特許文献２参照）。上記ＥｐｈＢ６受容体のリガンドと考えられるｅｐｈｒｉｎ−Ｂ２もまた、胸腺での発現が報告されているが、ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ２以外に他のリガンドが存在するかどうかは明らかになっていない。
【０００６】
【非特許文献１】
Ｈ．Ｍａｔｓｕｏｋａ， Ｎ．Ｉｗａｔａ， Ｍ．Ｉｔｏ， Ｍ．Ｓｈｉｍｏｙａｍａ， Ａ．Ｎａｇａｔａ， Ｋ．Ｃｈｉｈａｒａ， Ｓ．Ｔａｋａｉ， ａｎｄ Ｔ．Ｍａｔｓｕｉ， Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｋｉｎａｓｅ−ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ Ｅｐｈ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｎ ｔｈｅ ｎｏｒｍａｌ ｈｕｍａｎ ｂｒａｉｎ， Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２３５ （１９９７） ４８７−４９２
【０００７】
【非特許文献２】
Ｍ．ｓｈｉｍｏｙａｍａ， Ｈ．Ｍａｔｓｕｏｋａ， Ａ．Ｔａｍｅｋａｎｅ， Ｍ．Ｉｔｏ， Ｎ．Ｉｗａｔａ， Ｒ．Ｉｎｏｕｅ， Ｋ．Ｃｈｉｈａｒａ， Ａ．Ｆｕｒｕｙａ， Ｎ．Ｈａｎａｉ， ａｎｄ Ｔ．Ｍａｔｕｉ， Ｔ−ｃｅｌｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｋｉｎａｓｅ−ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ Ｅｐｈ−ｆａｍｉｌｙ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ， ＥｐｈＢ６ ｉｎ ｎｏｒｍａｌ ａｓ ｗｅｌｌ ａｓ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｃｅｌｌ， Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ １８ （２０００） ６３−７８
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
上記のように、ＥｐｈＢ６受容体はキナーゼ欠損型であるが、ｉｎ ｖｉｔｒｏの実験では細胞内へのシグナル伝達に介在することが報告されており、その機能については依然不明な点が多い。ＥｐｈＢ６受容体の機能を解明することは、Ｅｐｈ／ｅｐｈｒｉｎファミリー全体の機能、役割、相互作用、相互補完の仕組みを総合的に理解し解明することにもつながり、ひいては、同ファミリーに属する遺伝子の異常に起因する遺伝子疾患等の病態解析、発症メカニズムの解明、その治療法・治療薬の開発や、新たな診断法・診断薬の開発などにも資するものである。
【０００９】
本発明は、上記の課題に鑑みなされたものであり、その目的は、ＥｐｈＢ６受容体の機能を個体レベルで解析可能とした実験動物モデルを提供することにあり、具体的には、ＥｐｈＢ６受容体の遺伝子が破壊されたノックアウト動物、およびその利用方法を提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明のノックアウト非ヒト動物は、上記目的のため、ゲノム中のＥｐｈＢ６受容体遺伝子のＤＮＡ配列の全部または一部を改変することにより得られ、相同染色体上の双方のＥｐｈＢ６受容体遺伝子が破壊されたことを特徴としている。
【００１１】
本発明における「ＥｐｈＢ６受容体遺伝子が破壊された」とは、換言すれば、本発明のノックアウト非ヒト動物において野生型ＥｐｈＢ６受容体の全長および断片化タンパク質が発現されないことを意味する。ＥｐｈＢ６受容体遺伝子の機能解析のためには上記タンパク質の一部断片（ポリペプチド）の発現も排除されることが好ましいが、そのポリペプチドが野生型タンパク質の機能を何ら有していない限りにおいて、当該ポリペプチドを発現するものであってもよい。
【００１２】
本発明の「ゲノム中のＥｐｈＢ６受容体遺伝子のＤＮＡ配列の全部または一部を改変すること」における「全部」とは、ゲノムＤＮＡ中の最初のエクソンの５’端から最後のエクソンの３’端までの領域をいう。また、「一部」とは、この領域の一部であって、１）野生型ＥｐｈＢ６受容体の全長タンパク質の発現のみならずその一部断片（ポリペプチド）の発現をも阻害するために塩基配列を改変することが必要な領域、または、２）野生型ＥｐｈＢ６受容体の機能を何ら有していないその一部断片（ポリペプチド）の発現のみ許容する程度に塩基配列の改変が必要な領域、をいう。さらに、「改変」とは、単一または複数のヌクレオチドを置換、欠失、挿入、及び／又は転位させることにより、ゲノムＤＮＡ中の対象領域の塩基配列を他の塩基配列に改変することをいう。
【００１３】
本発明のノックアウト非ヒト動物は、後述のように遺伝子ターゲティング法を用いて作製することができる。同方法において、ゲノム中のＥｐｈＢ６受容体遺伝子の少なくとも開始コドンを含む領域を相同組換えにより他の塩基配列に置換することは、タンパク質の一部断片の発現も高頻度で排除できるため、好ましいものである。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明者は、後述の実施例に示すように、遺伝子ターゲティング法を用いてＥｐｈＢ６受容体の遺伝子が破壊されたノックアウト動物（以下、「ＥｐｈＢ６ノックアウト動物」という）を作製した。そこで以下、この遺伝子ターゲティング法を用いたＥｐｈＢ６ノックアウト動物の作製方法について簡単に説明する。
【００１５】
（１）ＥｐｈＢ６遺伝子ターゲティングベクターの作製
まず、ターゲティングベクターの作製のため、対象となる動物のＥｐｈＢ６遺伝子（標的遺伝子）を単離する。例えば、ノックアウトマウスを作製する場合は、マウスのゲノムＤＮＡライブラリーからＥｐｈＢ６遺伝子をスクリーニングすればよい。スクリーニングの条件、方法は特に限定されず、スクリーニングに用いるプローブについても他の動物由来のｃＤＮＡ等から調製してもよい。後述の実施例においては、ヒトＥｐｈＢ６のｃＤＮＡ（アクセッション番号：Ｄ８３４９２）から調製したプローブを用いてマウスのゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングしたが、勿論、マウスＥｐｈＢ６のｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ番号：００７６８０）からプローブを調製してもよい。
【００１６】
上記スクリーニングにより得られたゲノムＤＮＡクローンを用いて、相同組換えのためのターゲティングベクターを構築する。ターゲティングベクターは、公知の方法により作製することができ、大略、上記ゲノムＤＮＡクローン、市販のプラスミド、ポジティブセレクション用のマーカー（ＰＧＫ−ｎｅｏカセット等）、およびネガティブセレクション用のマーカー（ＤＴＡ遺伝子、ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子等）などの各フラグメントを適切に連結することにより作製することができる。このとき、目的とする制限酵素切断部位が適切な位置に配されるようターゲティングベクターを設計するとよい。また、ターゲティングの効率は相同領域の長さに依存するので、相同領域はできるだけ長いほうが好ましい。さらに、ターゲティングベクターは環状より直鎖状のほうが好ましいので、直鎖状化のため相同領域以外の部分に一カ所適当な制限酵素切断部位を設けておくとよい。
【００１７】
（２）ＥｐｈＢ６ノックアウト動物の作製
上記方法により作製したＥｐｈＢ６遺伝子ターゲティングベクターを、ＥＳ細胞等の対象動物由来の全能性細胞にエレクトロポレーション法等により導入し、その後、目的とする相同組換えが起こった細胞を選別する。選別は、ポジティブ−ネガティブ選択法により薬剤を用いて効率よくスクリーニングできる。選別後、目的とする相同組換えが起こった細胞を、サザンブロットやＰＣＲ法などによって確認する。最終的に相同組換えが確認された全能性細胞を、妊娠中の子宮から採取された胚盤胞（ブラストシスト）に導入する。胚盤胞への細胞の導入は、マイクロインジェクション法等により行うことができるが、これに限定されるものではない。
【００１８】
上記胚盤胞を常法に従い仮親に移植する。仮親から生まれた生殖系列キメラ動物（好ましくは雄）と、野生型ＥｐｈＢ６遺伝子をホモで持つ野生型動物（好ましくは雌）とを交配させることにより、第１世代（Ｆ１）として、相同染色体上の一方のＥｐｈＢ６遺伝子が相同組換えにより破壊されたヘテロ接合体を得ることができる。さらに、これらヘテロ接合体同士を交配させることにより、第２世代（Ｆ２）として、相同染色体上の双方のＥｐｈＢ６遺伝子が破壊されたホモ接合体、即ち本発明のＥｐｈＢ６ノックアウト動物を得ることができる。ホモ接合体の同定は、体の一部（例えば尻尾）を切断し、ＤＮＡを抽出してサザンブロットやＰＣＲ法などによって遺伝子型を調べればよい。また、第２世代（Ｆ２）として、ＥｐｈＢ６ノックアウト動物と同腹の野生型動物（野生型遺伝子をホモで持つ）を得ることができるが、この野生型動物は対照実験に好適に用いることができる。
【００１９】
以上説明した遺伝子ターゲティング法は、あくまでその一例を示すものであって、公知の種々の変更が可能であることはいうまでもない。
【００２０】
ＥｐｈＢ６ノックアウト動物の対象となる動物は、特に限定されるものではないが、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウス、ラットなどの哺乳動物が例示される。これらのうち、実験動物として用いるには、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウス、ラットが好ましく、なかでも齧歯目がさらに好ましく、近交系が多数作出されており、受精卵の培養、体外受精等の技術が整っているマウスが、特に好ましい。また、全能性細胞としては、受精卵や初期胚のほか、多分化能を有するＥＳ細胞、体性幹細胞のような培養細胞を対象とすることができる。
【００２１】
（３）本発明のＥｐｈＢ６ノックアウト動物の利用方法（有用性）
本発明のＥｐｈＢ６ノックアウト動物は、ＥｐｈＢ６遺伝子が破壊されたものであり、第一義的にはＥｐｈＢ６遺伝子の機能解析に利用できるものであるが、単に遺伝子機能解析への利用に止まらず、以下に掲げるような種々の産業上の利用性（有用性）を有するものである。
【００２２】
Ａ） 前述したように、ＥｐｈＢ６受容体は、▲１▼ヒトの特に脳および胸腺に強く発現し、▲２▼胸腺においてはＣＤ４＋ＣＤ８＋両陽性細胞に高頻度に発現し、▲３▼造血細胞においてはＴ細胞特異的に高発現する分子である。このように、ＥｐｈＢ６分子は、ヒトの中枢神経系および免疫系に強く発現し機能しており、神経疾患および免疫疾患と関係している可能性が高い。これまでの機能解析からも、ＥｐｈＢ６分子の機能として、▲１▼中枢神経系における神経軸索の伸長方向や神経細胞の移動、シナプス形成の制御、▲２▼Ｔ細胞の発生・成長・分化の調節、さらには、▲３▼血管（網）形成への関与が考えられる。また、リンパ性悪性腫瘍、とりわけＴリンパ性白血病／リンパ腫との関連性が指摘されており、最近ではＥｐｈＢ６分子が神経芽細胞腫の悪性の表現型を改善する作用を持つことが報告されている。
【００２３】
このようなＥｐｈＢ６分子と関係する各種疾患に対する薬剤のスクリーニング方法に、本発明のＥｐｈＢ６ノックアウト動物を利用することができる。スクリーニング方法としては、ノックアウト動物を用いた公知の方法、例えば、薬剤の候補分子を本発明のノックアウト動物に静注または経口投与等により投与し、その治療効果を個体、器官、組織、細胞の各レベルで観察・確認する方法を挙げることができ、その他、▲１▼遺伝子治療法の開発、▲２▼新たな検査（診断）法、検査（診断）薬の開発にも、本発明のノックアウト動物を利用することができる。
【００２４】
Ｂ） ＥｐｈＢ６分子は受容体であり、未知のリガンド、アゴニスト、アンタゴニストの同定に、本発明のＥｐｈＢ６ノックアウト動物を利用することができる。ＥｐｈＢ６受容体は、キナーゼ欠損型であるが、細胞内へのシグナル伝達に関与しており、このシグナル伝達を介して、胚形成、形態形成、細胞の増殖、分化、細胞間相互作用など生体内での種々の生理機能に広く関与していると考えられる。ＥｐｈＢ６受容体に対する未知のリガンド、アゴニスト、アンタゴニストは、このシグナル伝達機構の異常に起因する疾患の治療薬として利用できる可能性が高い。
【００２５】
Ｃ） Ｅｐｈ／ｅｐｈｒｉｎファミリーに属する他の分子、さらに、同ファミリー全体の機能、役割を解明するための研究ツールとしても、本発明のＥｐｈＢ６ノックアウト動物は有用である。Ｅｐｈ／ｅｐｈｒｉｎファミリーは腫瘍形成に関与していることが指摘されており、上記の研究成果は臨床応用できる可能性が高い。
【００２６】
Ｄ） 本発明のＥｐｈＢ６ノックアウト動物から得られた細胞（特に、***、卵細胞、ＥＳ細胞、体性幹細胞）は、本発明のＥｐｈＢ６ノックアウト動物の作出や、Ｅｐｈ／ｅｐｈｒｉｎファミリーに属する他の遺伝子をも破壊したダブルノックアウト動物の作出に有用である。
【００２７】
【実施例】
以下、本発明のＥｐｈＢ６ノックアウト動物として、ＥｐｈＢ６ノックアウトマウスを作製した実施例について説明するが、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。
【００２８】
（１）ＥｐｈＢ６遺伝子ターゲティングベクターの作製
マウスＥｐｈＢ６遺伝子を単離するために、マウス１２９ｓｖゲノムＤＮＡライブラリーから、ヒトＥｐｈＢ６のｃＤＮＡプローブを用いてスクリーニングを行った。得られた４つのクローン（ｃｌ １−４）は、マウスＥｐｈＢ６の遺伝子座を含む１８ｋｂのゲノム領域を共通に有していた。このゲノム領域のうち、エクソン１の一部とエクソン２および３とを含む、約２．０ｋｂのＡｃｃＩ−ＸｂａＩ断片を、ＰＧＫ−ｎｅｏカセットによって置換した（図１（ａ）参照）。この置換によって、翻訳開始のメチオニンが欠失するため、ＥｐｈＢ６の蛋白発現を排除することができる。ターゲティングベクターは、上記置換領域の上流に１．４ｋｂの、その下流に７ｋｂの相同領域をそれぞれ含んでいる。また、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ９３ （１９９６） １１８２５−１１８３０記載の方法と同様に、上流の相同領域の５’端にネガティブセレクション用のマーカーとしてジフテリア毒素Ａ（ＤＴＡ）のカセットを保持させた。図１（ａ）において、斜線模様の四角は、相同組換えによっても変化が生じないエクソンを示す。制限酵素切断部位は、図中それぞれ次の略記号で表記している。ＡｃｃＩ（Ａｃ），ＢａｍＨＩ（Ｂ），ＥｃｏＲＩ（Ｅ），ＨｉｎｄＩＩＩ（Ｈ），ＸｂａＩ（Ｘｂ），ＸｈｏＩ（Ｘｈ）。
【００２９】
（２）ＥｐｈＢ６ノックアウトマウスの作製
Ｊ１胚性幹（ＥＳ）細胞に、直鎖状化したターゲティングベクターをエレクトロポレーション法により導入し、コレシストキニンＢ受容体ノックアウトマウスの胚から調製した胚性繊維芽細胞をフィーダー細胞に用いて培養し、その後、目的とする相同組換えが起こった細胞をジェネティシンで選別した。ジェネティシン耐性の３４６個のＪ１ＥＳクローンを、１．１ｋｂの外側プローブＡおよび１．１ｋｂの内側プローブＢ（図１（ａ）参照）を用いてサザンブロット解析した。その結果、相同組換えによりＥｐｈＢ６遺伝子が破壊された３つのクローンが得られた。図１（ｂ）には、このうち＃１６および＃９５の２つのクローンをＥｃｏＲＩでダイジェストした後、外側プローブＡを用いてサザンブロット解析した結果が示される。図中、左のレーンは、相同組換えされていない野生型のＥＳ細胞の結果である。
【００３０】
上記２つのクローンを、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雌マウスから採取した胚盤胞にマイクロインジェクション法により注入した。その後、胚盤胞を、偽妊娠雌マウスに移植し、生殖系列のキメラマウスを得た。このキメラマウス（雄）とＣ５７ＢＬ／Ｂ６雌マウスとを交配させることにより、第１世代（Ｆ１）として、相同染色体上の一方のＥｐｈＢ６遺伝子が相同組換えにより破壊されたヘテロ接合体（ＥｐｈＢ６＋／−）マウスを発生させた。
【００３１】
さらに、これらヘテロ接合体マウス同士を交配させることにより、第２世代（Ｆ２）として、相同染色体上の双方のＥｐｈＢ６遺伝子が破壊されたホモ接合体（ＥｐｈＢ６−／−）マウス、即ち本発明のＥｐｈＢ６ノックアウトマウスを作製した。以下の表１には、ヘテロ接合体マウス同士の交配により生まれたＦ２の個体数を各遺伝子型（野生型（＋／＋）、ヘテロ接合（＋／−）、ホモ接合（−／−））ごとに示すものである。
【００３２】
【表１】
【００３３】
Ｆ２の遺伝子型は、ＥｃｏＲＩまたはＨｉｎｄＩＩＩでダイジェストした後、外側プローブＡまたは内側プローブＢを用いたサザンブロット解析により確認した（図１（ｂ）参照）。また、内側プローブＢを用いたサザンブロット解析によって、ターゲティングベクターのゲノムＤＮＡ中への単一組み込みが確認された。
【００３４】
本発明のＥｐｈＢ６ノックアウトマウスの作製のため使用されたマウスは、神戸大学医学部動物実験施設の下で生育された。
【００３５】
（３）イムノブロット法
上記の方法により作製されたＥｐｈＢ６ノックアウトマウスにおいて、実際にＥｐｈＢ６蛋白が発現していないことをイムノブロット法により確認した。
【００３６】
ＥｐｈＢ６ノックアウトマウスから胸腺細胞を取り出し、溶解バッファーで溶解した。溶解バッファーの組成は、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４），１％のトライトンＸ−１００，２０ｍＭの塩化ナトリウム，５ｍＭのＥＤＴＡ，２ｍＭのフッ化ナトリウム，０．０２％のアジ化ナトリウム，１ｍＭのフェニルメチルスルフォニルフッ化物，１６．５ｍｇ／ｍｌのアプロチニン，１．０ｍｇ／ｍｌのレイペプシン，１．２５ｍｇ／ｍｌのペプスタチンである。細胞溶解液を、３０分間、４℃、１４，０００ｘｇで遠心後、タンパク質を含む画分を抽出し、７％ポリアクリルアミドゲルを用いてタンパク質を展開した。その後、タンパク質を、イモビロン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｂｅｄｆｏｒｄ， ＭＡ）膜へトランスファーした。膜を、ブロット液（組成：２％無脂肪ドライミルク，１％トライトンＸ−１００，５．０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１０ｍＭＥＤＴＡ，０．０１％アジ化ナトリウム）中で、２時間室温にてインキュベートし、洗浄後、抗ＥｐｈＢ６モノクルーナル抗体を用いて２時間室温にてインキュベートした。次いで、ラビット抗ラットＩｇＧを用いて１時間室温にて反応させ、さらに、１２５Ｉ−ｐｒｏｔｅｉｎＡ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐ．， ＮＪ）で処理した後、シグナルを可視化した。その結果を図１（ｃ）に示す。
【００３７】
同図に示すように、野生型（＋／＋）、ヘテロ接合（＋／−）の遺伝子型では、約１３５ｋＤａのＥｐｈＢ６蛋白の発現が観察される一方、本発明のＥｐｈＢ６ノックアウトマウス（遺伝子型（−／−））においては、ＥｐｈＢ６蛋白の発現が全く認められなかった。
【００３８】
（４）ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション
ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ （１９９０） ２４２７−２４３６記載の方法と同様に行った。胎児マウス（胎生１５．５日）を４％パラホルムアルデヒドで固定した後、厚さ５−７ミクロンの連続切片を順次ゼラチンスライド上に載置した。一方、マウスのＥｐｈＢ６ｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ番号：００７６８０）の塩基配列中、５５１−１１１６番目の領域に相当するｃＲＮＡプローブを、メーカー（Ａｍｂｉｏｎ）説明書記載の方法に従って合成し、３５Ｓ−ＵＴＰ（＞１０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ；Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐ．）でラベルした。得られたプローブと切片とによりハイブリダイゼーションを行い、ハイブリダイゼーション後、切片を通常の方法に従い洗浄した。洗浄後、スライドを脱水し、エマルジョンに浸し、その後、２〜３週間４℃にて露光させた。その結果を図２（ｂ）に示す。
【００３９】
なお同図は、野生型（＋／＋）胎児の切片に対し、アンチセンスプローブまたはセンスプローブを用いてハイブリダイゼーションを行った結果を示すものであり、同図に示すように、野生型（＋／＋）胎児の胸腺ではＥｐｈＢ６遺伝子の強い発現が観察された。これに対して、本発明のＥｐｈＢ６−／−マウスでは、胎児期の胸腺においてＥｐｈＢ６遺伝子の発現は観察されなかった（データ示さず）。図２（ｂ）中、各記号は、ｈ；心臓，ｊ；あご，ｓｔ；胸骨，ｔｈ；胸腺，ｔｏ；舌をそれぞれ示す。
【００４０】
ところで、本発明のＥｐｈＢ６−／−マウスは、野生型（＋／＋）と比べて外見上明白な相違は観察されなかった。ＥｐｈＢ６遺伝子は精巣を含む様々な組織での発現が報告されているが、ＥｐｈＢ６−／−マウスには生殖能力があり、ＥｐｈＢ６−／−マウス同士の交配は、野生型（＋／＋）同士の交配と同様の同腹子数を生じさせた（下記表２参照）。また、ＥｐｈＢ６−／−マウスは最長で２４カ月以上生存し、その間特に異常も観察されなかった。
【００４１】
【表２】
【００４２】
次に、野生型（ＥｐｈＢ６＋／＋）マウスとノックアウト（ＥｐｈＢ６−／−）マウスのリンパ組織における各値を比較した。その結果を以下の表３に示す。
【００４３】
【表３】
【００４４】
表３に示されるように、野生型マウスとノックアウトマウスとの間では特に大きな変化は認められず、リンパ球の比率、胸腺細胞の総数についても両者の間に有意差はなかった。
【００４５】
また、野生型（ＥｐｈＢ６＋／＋）マウスとノックアウト（ＥｐｈＢ６−／−）マウスにおけるＣＤ４−ＣＤ８特性を比較した。その結果を以下の表４に示す。
【００４６】
【表４】
【００４７】
表４に示されるように、ＣＤ４−ＣＤ８特性についても、野生型マウスとノックアウトマウスとの間では特に大きな相違は観察されなかった。
【００４８】
（５）胎生期の胸腺組織の培養（ＦＴＯＣ）
胎生期の胸腺におけるＥｐｈＢ６の発現を調べるため、野生型（ＥｐｈＢ６＋／＋）マウスの胎生期の胸腺組織の培養（ＦＴＯＣ）を実施した。ＦＴＯＣは、ＥｕｒＪ Ｉｍｍｕｎｏｌ １２ （１９８２） ５８３−５８７記載の方法と同様に行われた。
【００４９】
上記ＦＴＯＣにより得られた胎生１４．５日（以下、「Ｅ１４．５」という様に略記する），Ｅ１５．５，Ｅ１６．５，Ｅ１７．５，Ｅ１８．５の各胸腺組織から試料を調製し、抗ＥｐｈＢ６モノクローナル抗体を用いたイムノブロット分析を行った。その結果を図２（ａ）に示す。
【００５０】
発生中、胸腺はＥ１４．５で明確に判別できるようになり、その後、成長、分化を続ける。図２（ａ）に示されるように、野生型マウスではＥ１４．５でＥｐｈＢ６蛋白の発現が検出され、その後、胸腺の成長にしたがってその発現は徐々に増大し、Ｅ１７．５およびＥ１８．５で最大になった。このようなＥｐｈＢ６蛋白の発現量の変化は、胎生胸腺におけるＣＤ４＋ＣＤ８＋両陽性細胞の増加とも符合する。ＣＤ４＋ＣＤ８＋両陽性胸腺細胞の比率は、Ｅ１４．５で１％以下，Ｅ１５．５で１４％，Ｅ１６．５で４９％，Ｅ１７．５で８７％，Ｅ１８．５で８６％である。
【００５１】
（６）ＥｐｈＢ６受容体に対するリガンドの同定
ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ２がＥｐｈＢ６受容体に対するリガンドであるかどうかを確かめるため、また、他のｅｐｈｒｉｎがＥｐｈＢ６受容体に対するリガンドとなりうるかどうか確かめるため、以下の実験を行った。
【００５２】
実験には、８種類のｅｐｈｒｉｎ（ｅｐｈｒｉｎ−Ａ１〜Ａ５、ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ１〜Ｂ３）と、８週齢のノックアウト（ＥｐｈＢ６−／−）マウスおよび野生型（ＥｐｈＢ６＋／＋）マウスから採取・調製した各胸腺細胞とを用い、各ｅｐｈｒｉｎと各胸腺細胞との結合特性をフローサイトメトリー法により解析した。その結果を図３（ａ）・（ｂ）に示す。
【００５３】
図３（ａ）・（ｂ）に示すように、８種類のｅｐｈｒｉｎのうち、ｅｐｈｒｉｎ−Ａ１〜Ａ３，ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ１〜Ｂ３は、野生型胸腺細胞との結合が認められた。一方、ノックアウトマウスの胸腺細胞では、ｅｐｈｒｉｎ−Ａ１〜Ａ３，ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ１・Ｂ３との結合は観察されたが、ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ２との結合は認められなかった。また、ｅｐｈｒｉｎ−Ａ４・Ａ５については、野生型およびノックアウトマウスの何れの胸腺細胞との結合も観察されなかった。なお図中、細線はネガティブコントロールの実験結果を示すものである。
【００５４】
新生児（生後２日）のノックアウト（ＥｐｈＢ６−／−）マウスおよび野生型（ＥｐｈＢ６＋／＋）マウスから採取・調製した各胸腺細胞とｅｐｈｒｉｎ−Ｂ２との結合特性を調べた結果も、上記成体マウスのものと同様であった（データ示さず）。
【００５５】
また、胎生期（Ｅ１５．５）のノックアウト（ＥｐｈＢ６−／−）マウスおよび野生型（ＥｐｈＢ６＋／＋）マウスから採取・調製した各胸腺細胞とｅｐｈｒｉｎ−Ｂ１〜Ｂ３との結合特性を調べた結果を図３（ｃ）に示す。同図に示されるように、ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ２は、ノックアウトマウスおよび野生型マウスの胎生期（Ｅ１５．５）の胸腺細胞双方へ結合することが認められた。ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ１・Ｂ３も上記胸腺細胞双方への結合が認められたが、その結合特性はｅｐｈｒｉｎ−Ｂ２より少なかった。
【００５６】
以上の結果から、▲１▼調査した８種類のｅｐｈｒｉｎのうち、ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ２がＥｐｈＢ６受容体と高親和性を持つリガンドであり、▲２▼成体マウスの胸腺細胞においてはｅｐｈｒｉｎ−Ｂ２に強く結合するＥｐｈＢ受容体はＥｐｈＢ６受容体のみで、▲３▼胎生期の胸腺細胞においてはｅｐｈｒｉｎ−Ｂ２との結合能を有するＥｐｈＢ６以外の受容体も発現している、ことが示唆された。
【００５７】
（７）野生型マウスおよびノックアウトマウスにおけるＣＤ４―ＣＤ８特性の比較
胎生期のＴ細胞の発生・成長・分化とＥｐｈＢ６分子との関係を調べるため、前記と同様に、野生型マウスおよびノックアウトマウスの胎生期の胸腺組織の培養（ＦＴＯＣ）を実施した。具体的には、同腹子の野生型（ＥｐｈＢ６＋／＋）マウスとノックアウト（ＥｐｈＢ６−／−）マウスのＥ１５．５で採取された各胸腺細胞を培養後（または培養せずに）、抗ＣＤ４抗体または抗ＣＤ８抗体を用いて染色し、ＣＤ４・ＣＤ８の各陽性細胞、陰性細胞の割合をフローサイトメトリー法により調べた。その結果を図４に示す。
【００５８】
同図には、培養０日と５日後における、ＣＤ４−ＣＤ８−両陰性，ＣＤ４＋ＣＤ８＋両陽性，ＣＤ４＋単陽性，ＣＤ８＋単陽性の胸腺細胞の比率が示されるが、結果として、ＣＤ４・ＣＤ８の各陽性細胞、陰性細胞の割合は、野生型マウスとノックアウトマウスとの間で顕著な相違は認められなかった。
【００５９】
【発明の効果】
本発明のＥｐｈＢ６ノックアウト動物は、以上のように、ＥｐｈＢ６遺伝子が破壊されたものであり、ＥｐｈＢ６遺伝子の機能解析に利用できるほか、前述した種々の有用性を有するものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】（ａ）は、本発明のＥｐｈＢ６ノックアウト動物の作製のために用いられたターゲティングベクターの構造等を説明する図であり、（ｂ）は、サザンブロット解析の結果を、（ｃ）は、イムノブロット解析の結果を示す図である。
【図２】（ａ）は、胎生期の胸腺細胞におけるＥｐｈＢ６タンパク質の発現を調べた結果を示す図であり、（ｂ）は、胎生期におけるＥｐｈＢ６遺伝子の発現を調べた結果を示す図である。
【図３】（ａ）〜（ｃ）は、ＥｐｈＢ６−／−胸腺細胞またはＥｐｈＢ６＋／＋胸腺細胞と、各ｅｐｈｒｉｎとの結合特性を調べた結果を示す図である。
【図４】ＥｐｈＢ６−／−胸腺細胞およびＥｐｈＢ６＋／＋胸腺細胞におけるＣＤ４―ＣＤ８特性を調べた結果を示す図である。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to an EphB6 receptor gene knockout animal and a method for using the same.
[0002]
[Prior art]
It is known that receptor tyrosine kinase is widely expressed in various cells and plays an important role in cell proliferation and differentiation. Among the receptors having such tyrosine kinase activity, the Eph family is the largest family, and 15 types of Eph receptors belonging to the family have been isolated and identified so far. These Eph receptors are roughly divided into two groups, EphA receptors and EphB receptors, based on sequence homology. On the other hand, the ligand for the Eph receptor is called ephrin, and nine types of ephrins have been identified so far. Ephrins are also roughly divided into two groups. One ephrin-A binds to glycosylphosphatidylinositol and is fixed to the cell membrane, and the other ephrin-B is fixed to the cell membrane via its own transmembrane region. Broadly, ephrin-A and ephrin-B bind with high affinity to EphA and EphB receptors, respectively. However, the degree of affinity differs for each combination of Eph receptor and ephrin. In addition, some Eph receptors are known that bind to the other group of ephrins. In addition, it has been reported that the EphB receptor behaves like an ephrin ligand and has an action of transmitting a signal into cells expressing ephrin. These Eph receptor and ephrin are also collectively referred to as “Eph / ephrin family”. Have been.
[0003]
Recent studies have revealed that the “Eph / ephrin family” plays various and important functions in vivo. For example, they have been reported to control the direction of axonal outgrowth and cell migration in the nervous system, and furthermore play an important role for the family in angiogenesis and embryogenesis. In order to analyze in detail the function of each molecule belonging to the Eph / ephrin family in a living body, several types of knockout mice have already been produced and research is under way. As a result, the diversity and redundancy between the types of the binding characteristics, physiological functions and expression patterns of each molecule are revealed, and each molecule has a unique function particularly in the morphogenesis during development. Is being revealed. For example, the EphA4 receptor, EphA8 receptor, ephrin-A2, and ephrin-A5 genes are important in the guidance of each axon in the corticospinal tract, the optic tectonic commissure, the retinocular, the retina and the vomeronasal, respectively. Yes, the EphB2 receptor, EphB3 receptor, and ephrin-B3 are involved in determining each axon pathway in the precerebral commissure, corpus callosum, and corticospinal tract. In addition, the EphB4 receptor and ephrin-B2 gene have been reported to be important for angiogenesis in mouse embryos.
[0004]
Thus, diversity is recognized in the function and expression pattern of each molecule belonging to the Eph / ephrin family. By the way, the Eph receptor is a receptor tyrosine kinase, as described above, and has a kinase domain that is well conserved among molecules. For the EphB6 receptor, the amino acid in this kinase domain is different from other molecules. Some are different (for example, see Non-Patent Document 1 below). When the EphB6 receptor is actually expressed and examined, no kinase activity is detected, and in this respect, the EphB6 receptor is very characteristic.
[0005]
Further, the EphB6 receptor is strongly expressed in normal human tissues (particularly brain and thymus), and has CD4 + CD8 + It is characteristic in that it is frequently expressed in both positive cells, and that it is specifically expressed in T cells in hematopoietic cells (for example, see Non-Patent Document 2 below). Ephrin-B2, which is considered to be a ligand for the EphB6 receptor, has also been reported to be expressed in the thymus, but it has not been clarified whether other ligands exist other than ephrin-B2.
[0006]
[Non-patent document 1]
H. Matsuoka, N .; Iwata, M .; Ito, M .; Shimoyama, A .; Nagata, K .; Chihara, S.M. Takai, and T.M. Matsui, Expression of a Kinase-Defective Eph-like Receptor in the Normal Human Brain, Biochem Biophys Res Commun 235 (1997) 487-492.
[0007]
[Non-patent document 2]
M. Shimoyama, H .; Matsuoka, A .; Namekane, M .; Ito, N.M. Iwata, R .; Inoue, K .; Chihara, A .; Furya, N .; Hanai, and T.M. Matui, T-cell-specific expression of kinase-defective Eph-family receptor protein, EphB6 normal aswell as a first-hand technical exchange medicine.
[0008]
[Problems to be solved by the invention]
As described above, the EphB6 receptor is a kinase-deficient type, but it has been reported in an in vitro experiment that the EphB6 receptor mediates signal transduction into cells, and its function is still largely unknown. Elucidating the function of the EphB6 receptor leads to a comprehensive understanding and elucidation of the functions, roles, interactions, and the mechanisms of complementation of the entire Eph / ephrin family. It also contributes to the analysis of pathological conditions of genetic diseases and the like caused by the disease, the elucidation of the onset mechanism, the development of therapeutic methods and therapeutic agents, and the development of new diagnostic methods and diagnostic agents.
[0009]
The present invention has been made in view of the above problems, and an object of the present invention is to provide an experimental animal model capable of analyzing the function of an EphB6 receptor at an individual level. The present invention provides a knockout animal in which the gene has been disrupted, and a method for using the same.
[0010]
[Means for Solving the Problems]
The knockout non-human animal of the present invention can be obtained by modifying all or part of the DNA sequence of the EphB6 receptor gene in the genome for the above purpose, and both EphB6 receptor genes on homologous chromosomes are disrupted. It is characterized by having.
[0011]
The phrase “EphB6 receptor gene is disrupted” in the present invention means, in other words, that the full-length wild-type EphB6 receptor and the fragmented protein are not expressed in the knockout non-human animal of the present invention. For the function analysis of the EphB6 receptor gene, it is preferable that the expression of a partial fragment (polypeptide) of the above protein is also excluded, but as long as the polypeptide has no function of the wild-type protein, It may be one that expresses the polypeptide.
[0012]
In the present invention, “all or part of the DNA sequence of the EphB6 receptor gene in the genome is altered” means “all” from the 5 ′ end of the first exon to the 3 ′ end of the last exon in the genomic DNA. The area up to. The term “part” refers to a part of this region. 1) The base is used to inhibit not only the expression of the full-length protein of the wild-type EphB6 receptor but also the expression of a fragment (polypeptide) thereof. A region in which the sequence needs to be modified, or 2) a region in which the base sequence needs to be modified to such an extent that only expression of a partial fragment (polypeptide) having no function of the wild-type EphB6 receptor is permitted. , Further, "modification" refers to altering the base sequence of the target region in genomic DNA to another base sequence by substituting, deleting, inserting, and / or transposing single or plural nucleotides. .
[0013]
The knockout non-human animal of the present invention can be prepared using a gene targeting method as described below. In the same method, it is preferable to replace at least the region containing the initiation codon of the EphB6 receptor gene in the genome with another nucleotide sequence by homologous recombination, since expression of a partial fragment of the protein can be eliminated at a high frequency. It is.
[0014]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
The present inventors have produced a knockout animal in which the gene of the EphB6 receptor has been disrupted using a gene targeting method (hereinafter, referred to as an “EphB6 knockout animal”), as described in Examples below. Therefore, a method for producing an EphB6 knockout animal using this gene targeting method will be briefly described below.
[0015]
(1) Construction of EphB6 gene targeting vector
First, to prepare a targeting vector, the EphB6 gene (target gene) of a target animal is isolated. For example, when producing a knockout mouse, the EphB6 gene may be screened from a mouse genomic DNA library. The screening conditions and methods are not particularly limited, and probes used for screening may be prepared from cDNA derived from other animals. In the examples described below, a mouse genomic DNA library was screened using a probe prepared from human EphB6 cDNA (accession number: D83492). Of course, a probe was prepared from mouse EphB6 cDNA (GenBank number: 007680). May be prepared.
[0016]
Using the genomic DNA clone obtained by the above screening, a targeting vector for homologous recombination is constructed. The targeting vector can be prepared by a known method. Generally, the genomic DNA clone, a commercially available plasmid, a marker for positive selection (such as PGK-neo cassette), and a marker for negative selection (DTA gene, HSV- tk gene) can be produced by appropriately ligating each fragment. At this time, the targeting vector may be designed such that the target restriction enzyme cleavage site is located at an appropriate position. Since the targeting efficiency depends on the length of the homologous region, the homologous region is preferably as long as possible. Furthermore, since the targeting vector is preferably linear rather than circular, an appropriate restriction enzyme cleavage site may be provided in a portion other than the homologous region for linearization.
[0017]
(2) Preparation of EphB6 knockout animal
The EphB6 gene targeting vector prepared by the above method is introduced into a totipotent cell derived from a target animal such as an ES cell by electroporation or the like, and then cells in which the desired homologous recombination has occurred are selected. The selection can be efficiently performed by using a drug by a positive-negative selection method. After the selection, cells in which the desired homologous recombination has occurred are confirmed by Southern blot, PCR, or the like. The totipotent cells, for which homologous recombination is finally confirmed, are introduced into blastocysts (blastocysts) collected from the pregnant uterus. Introduction of cells into the blastocyst can be performed by a microinjection method or the like, but is not limited thereto.
[0018]
The blastocyst is transplanted to a foster mother according to a conventional method. By crossing a germ-line chimeric animal (preferably male) born from a foster mother with a wild-type animal (preferably female) homozygous for the wild-type EphB6 gene, a first generation (F1) is formed on the homologous chromosome. A heterozygote in which one EphB6 gene has been disrupted by homologous recombination can be obtained. Furthermore, by mating these heterozygotes, a homozygote in which both EphB6 genes on homologous chromosomes are disrupted, that is, an EphB6 knockout animal of the present invention can be obtained as a second generation (F2). The homozygote can be identified by cutting a part of the body (for example, the tail), extracting DNA, and examining the genotype by Southern blot, PCR, or the like. In addition, as the second generation (F2), a wild-type animal (having a wild-type gene homozygously) with the EphB6 knockout animal can be obtained, and this wild-type animal can be suitably used for a control experiment.
[0019]
The gene targeting method described above is merely an example, and it goes without saying that various known changes can be made.
[0020]
The target animal of the EphB6 knockout animal is not particularly limited, and examples thereof include mammals such as cows, pigs, sheep, goats, rabbits, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, mice, rats, and the like. Of these, rabbits, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, mice, and rats are preferred for use as experimental animals, among which rodents are more preferred, and a large number of inbred strains have been produced. Mice equipped with techniques such as in vitro fertilization are particularly preferred. In addition, as totipotent cells, in addition to fertilized eggs and early embryos, cultured cells such as multipotent ES cells and somatic stem cells can be used.
[0021]
(3) Method of using EphB6 knockout animal of the present invention (utility)
The EphB6 knockout animal of the present invention, in which the EphB6 gene has been disrupted, can be used primarily for functional analysis of the EphB6 gene. It has various industrial uses (usefulness) as listed below.
[0022]
A) As described above, the EphB6 receptor is strongly expressed in (1) human, especially in the brain and thymus, and (2) CD4 is expressed in thymus. + CD8 + It is a molecule that is frequently expressed in both positive cells, and (3) highly expressed in T cells in hematopoietic cells. Thus, the EphB6 molecule is strongly expressed and functions in the human central nervous system and immune system, and is likely to be related to neurological and immune diseases. From the functional analysis to date, the functions of the EphB6 molecule include: (1) control of the direction of elongation of nerve axons and migration of nerve cells in the central nervous system, control of synapse formation, and (2) development, growth and differentiation of T cells. Regulation, and (3) involvement in blood vessel (retinal) formation. In addition, it has been pointed out that there is a connection with lymphoid malignancies, particularly T lymphocytic leukemia / lymphoma, and it has recently been reported that the EphB6 molecule has an effect of improving the malignant phenotype of neuroblastoma. .
[0023]
The EphB6 knockout animal of the present invention can be used in a method for screening a drug for various diseases related to the EphB6 molecule. As a screening method, a known method using a knockout animal, for example, a drug candidate molecule is administered to a knockout animal of the present invention by intravenous injection or oral administration, and the therapeutic effect thereof is determined for each individual, organ, tissue, and cell. The knockout animal of the present invention can be used for (1) the development of gene therapy, (2) the development of new test (diagnosis) methods, and the development of test (diagnosis) drugs. Can be used.
[0024]
B) The EphB6 molecule is a receptor, and the EphB6 knockout animal of the present invention can be used for identification of unknown ligands, agonists and antagonists. The EphB6 receptor is a kinase-deficient type, but is involved in signal transduction into cells. Through this signal transduction, the EphB6 receptor is used in vivo such as embryogenesis, morphogenesis, cell proliferation, differentiation, and cell-cell interaction. Is considered to be widely involved in various physiological functions in the human body. Unknown ligands, agonists, and antagonists to the EphB6 receptor are likely to be usable as therapeutics for diseases caused by abnormalities in this signaling mechanism.
[0025]
C) The EphB6 knockout animal of the present invention is also useful as a research tool for elucidating other molecules belonging to the Eph / ephrin family, as well as functions and roles of the whole family. It has been pointed out that the Eph / ephrin family is involved in tumor formation, and it is highly possible that the above research results can be clinically applied.
[0026]
D) Cells (especially sperm, egg cells, ES cells, somatic stem cells) obtained from the EphB6 knockout animal of the present invention contain the EphB6 knockout animal of the present invention or other genes belonging to the Eph / ephrin family. Useful for creating destroyed double knockout animals.
[0027]
【Example】
Hereinafter, an example in which an EphB6 knockout mouse was prepared as the EphB6 knockout animal of the present invention will be described, but the present invention is not limited to the following examples.
[0028]
(1) Construction of EphB6 gene targeting vector
In order to isolate the mouse EphB6 gene, screening was performed using a human EphB6 cDNA probe from a mouse 129sv genomic DNA library. The resulting four clones (cl 1-4) had a common 18 kb genomic region containing the mouse EphB6 locus. In this genomic region, an approximately 2.0 kb AccI-XbaI fragment containing a part of exon 1 and exons 2 and 3 was replaced with a PGK-neo cassette (see FIG. 1 (a)). By this substitution, methionine at the initiation of translation is deleted, so that protein expression of EphB6 can be excluded. The targeting vector contains a homologous region of 1.4 kb upstream of the above-mentioned substitution region and a 7 kb downstream region thereof. Further, similarly to the method described in Proc Natl Acad Sci USA 93 (1996) 11825-11830, a cassette of diphtheria toxin A (DTA) was held at the 5 'end of the upstream homologous region as a marker for negative selection. . In FIG. 1A, hatched squares indicate exons that are not changed even by homologous recombination. Restriction enzyme cleavage sites are indicated by the following abbreviations in the figure. AccI (Ac), BamHI (B), EcoRI (E), HindIII (H), XbaI (Xb), XhoI (Xh).
[0029]
(2) Preparation of EphB6 knockout mouse
A linearized targeting vector was introduced into J1 embryonic stem (ES) cells by electroporation, and embryonic fibroblasts prepared from cholecystokinin B receptor knockout mouse embryos were used as feeder cells. After culturing, cells in which the desired homologous recombination had occurred were selected with Geneticin. 346 J1ES clones resistant to geneticin were subjected to Southern blot analysis using a 1.1 kb outer probe A and a 1.1 kb inner probe B (see FIG. 1 (a)). As a result, three clones in which the EphB6 gene was disrupted by homologous recombination were obtained. FIG. 1 (b) shows the results of Southern blot analysis using the outer probe A after digesting two clones # 16 and # 95 with EcoRI. In the figure, the left lane shows the results of wild-type ES cells that have not undergone homologous recombination.
[0030]
The above two clones were injected by microinjection into blastocysts collected from C57BL / 6J female mice. Thereafter, the blastocysts were transplanted into pseudopregnant female mice to obtain germ-line chimeric mice. By mating this chimeric mouse (male) with a C57BL / B6 female mouse, as a first generation (F1), a heterozygote (EphB6) in which one EphB6 gene on a homologous chromosome was disrupted by homologous recombination. +/- A) Mouse was raised.
[0031]
Furthermore, by crossing these heterozygous mice, as a second generation (F2), homozygotes (EphB6) in which both EphB6 genes on homologous chromosomes were disrupted were obtained. − / − ) A mouse, that is, an EphB6 knockout mouse of the present invention was prepared. In Table 1 below, the number of F2 individuals born by mating between heterozygous mice is shown for each genotype (wild type (+ / +), heterozygous (+/-), homozygous (-/-)). It is shown for each.
[0032]
[Table 1]
[0033]
After digesting with EcoRI or HindIII, the genotype of F2 was confirmed by Southern blot analysis using outer probe A or inner probe B (see FIG. 1 (b)). In addition, Southern blot analysis using the inner probe B confirmed that the targeting vector was single integrated into the genomic DNA.
[0034]
The mice used to generate the EphB6 knockout mice of the present invention were grown under Kobe University School of Medicine Animal Research Facility.
[0035]
(3) Immunoblot method
In the EphB6 knockout mouse prepared by the above method, it was confirmed by an immunoblot method that the EphB6 protein was not actually expressed.
[0036]
Thymocytes were removed from EphB6 knockout mice and lysed with lysis buffer. The composition of the lysis buffer was 50 mM HEPES (pH 7.4), 1% Triton X-100, 20 mM sodium chloride, 5 mM EDTA, 2 mM sodium fluoride, 0.02% sodium azide, 1 mM phenyl. Methylsulfonyl fluoride, 16.5 mg / ml aprotinin, 1.0 mg / ml leipepsin, 1.25 mg / ml pepstatin. The cell lysate was centrifuged at 14,000 × g at 4 ° C. for 30 minutes, a protein-containing fraction was extracted, and the protein was developed using a 7% polyacrylamide gel. Thereafter, the proteins were transferred to Immobilon (Millipore Corporation, Bedford, MA) membranes. The membrane is placed in a blot solution (composition: 2% non-fat dry milk, 1% Triton X-100, 5.0 mM Tris HCl (pH 7.5), 10 mM EDTA, 0.01% sodium azide) for 2 hours at room temperature. After washing, the cells were incubated with an anti-EphB6 monoclonal antibody for 2 hours at room temperature. Then, the mixture was reacted with rabbit anti-rat IgG for 1 hour at room temperature. 125 After treatment with I-proteinA (Amersham Biosciences Corp., NJ), the signal was visualized. The result is shown in FIG.
[0037]
As shown in the figure, in the wild type (+ / +) and heterozygous (+/−) genotypes, expression of an EphB6 protein of about 135 kDa was observed, while the EphB6 knockout mouse of the present invention (genotype ( In-/-)), expression of EphB6 protein was not observed at all.
[0038]
(4) In situ hybridization
In situ hybridization was carried out in the same manner as described in J Cell Biol (1990) 2427-2436. After fetal mice (15.5 days old) were fixed with 4% paraformaldehyde, serial sections having a thickness of 5-7 microns were sequentially mounted on a gelatin slide. On the other hand, a cRNA probe corresponding to the 551-1116 region in the nucleotide sequence of mouse EphB6 cDNA (GenBank number: 007680) was synthesized according to the method described in the manufacturer's (Ambion) manual, 35 Labeled with S-UTP (> 1000 Ci / mmol; Amersham Biosciences Corp.). Hybridization was carried out using the obtained probe and the slice, and after hybridization, the slice was washed according to a conventional method. After washing, slides were dehydrated and immersed in the emulsion, and then exposed at 4 ° C. for 2-3 weeks. The result is shown in FIG.
[0039]
The figure shows the results of hybridization of a section of a wild-type (+ / +) fetus using an antisense probe or a sense probe. As shown in FIG. / +) Strong expression of the EphB6 gene was observed in the fetal thymus. In contrast, the EphB6 of the present invention − / − In mice, no EphB6 gene expression was observed in the fetal thymus (data not shown). In FIG. 2B, each symbol indicates h; heart, j; chin, st; sternum, th; thymus, to;
[0040]
By the way, EphB6 of the present invention − / − No apparent differences were observed in the mice compared to the wild type (+ / +). The expression of the EphB6 gene in various tissues including the testis has been reported. − / − Mice are fertile and EphB6 − / − Mating between mice resulted in similar litter sizes as mating between wild-type (+ / +) (see Table 2 below). In addition, EphB6 − / − The mice survived for a maximum of 24 months or more, during which no abnormalities were observed.
[0041]
[Table 2]
[0042]
Next, wild-type (EphB6 + / + ) Mouse and knockout (EphB6 − / − ) Each value in mouse lymphoid tissue was compared. The results are shown in Table 3 below.
[0043]
[Table 3]
[0044]
As shown in Table 3, no significant change was observed between the wild-type mouse and the knockout mouse, and there was no significant difference between the two in the ratio of lymphocytes and the total number of thymocytes.
[0045]
In addition, wild-type (EphB6 + / + ) Mouse and knockout (EphB6 − / − ) CD4-CD8 properties in mice were compared. The results are shown in Table 4 below.
[0046]
[Table 4]
[0047]
As shown in Table 4, no particularly large difference was observed between the wild-type mouse and the knockout mouse in the CD4-CD8 characteristics.
[0048]
(5) Culture of embryonic thymus tissue (FTOC)
To examine the expression of EphB6 in the embryonic thymus, wild-type (EphB6 + / + 3.) Fetal thymic tissue culture (FTOC) of mouse embryos was performed. FTOC was performed in the same manner as described in EurJ Immunol 12 (1982) 583-587.
[0049]
A sample was prepared from each thymus tissue of E15.5, E16.5, E17.5, and E18.5 obtained from the FTOC for 14.5 days of embryo (hereinafter abbreviated as “E14.5”). And immunoblot analysis using an anti-EphB6 monoclonal antibody. The result is shown in FIG.
[0050]
During development, the thymus can be clearly distinguished at E14.5, after which it continues to grow and differentiate. As shown in FIG. 2 (a), in the wild-type mouse, the expression of EphB6 protein was detected at E14.5, and thereafter, the expression gradually increased as the thymus grew, and at E17.5 and E18.5, It was the largest. Such a change in the expression level of the EphB6 protein is caused by the CD4 in the embryonic thymus. + CD8 + This is consistent with the increase in both positive cells. CD4 + CD8 + The ratio of both positive thymocytes is 1% or less at E14.5, 14% at E15.5, 49% at E16.5, 87% at E17.5, and 86% at E18.5.
[0051]
(6) Identification of ligand for EphB6 receptor
The following experiments were performed to determine whether ephrin-B2 was a ligand for the EphB6 receptor and to determine whether other ephrins could be ligands for the EphB6 receptor.
[0052]
In the experiment, eight kinds of ephrins (ephrin-A1 to A5, ephrin-B1 to B3) and an 8-week-old knockout (EphB6) were used. − / − ) Mouse and wild type (EphB6) + / + ) Using each thymocyte collected and prepared from a mouse, the binding characteristic between each ephrin and each thymocyte was analyzed by flow cytometry. The results are shown in FIGS.
[0053]
As shown in FIGS. 3A and 3B, out of the eight types of ephrins, ephrin-A1 to A3 and ephrin-B1 to B3 were found to bind to wild-type thymocytes. On the other hand, in the thymocytes of the knockout mouse, binding to ephrin-A1 to A3 and ephrin-B1 · B3 was observed, but binding to ephrin-B2 was not observed. In addition, no binding of ephrin-A4 / A5 to thymocytes of both wild type and knockout mice was observed. In addition, in the figure, the thin line shows the experimental result of the negative control.
[0054]
Knockout of newborn (2 days old) (EphB6 − / − ) Mouse and wild type (EphB6) + / + ) The results of examining the binding characteristics between each thymocyte collected and prepared from the mouse and ephrin-B2 were also similar to those of the adult mouse (data not shown).
[0055]
In addition, knockout (EphB6) in the embryonic stage (E15.5) − / − ) Mouse and wild type (EphB6) + / + 3) The results of examining the binding characteristics of each thymocyte collected and prepared from a mouse to ephrin-B1 to B3 are shown in FIG. 3 (c). As shown in the figure, ephrin-B2 was found to bind to both embryonic (E15.5) thymocytes of knockout mice and wild-type mice. Ephrin-B1 • B3 also showed binding to both of the above thymocytes, but its binding characteristics were less than ephrin-B2.
[0056]
From the above results, (1) out of the eight types of ephrins investigated, ephrin-B2 is a ligand having a high affinity to the EphB6 receptor, and (2) strongly binds to ephrin-B2 in thymocytes of adult mice. It is suggested that the only EphB receptor to be expressed is the EphB6 receptor, and that (3) embryonic thymocytes also express receptors other than EphB6, which have the ability to bind to ephrin-B2.
[0057]
(7) Comparison of CD4-CD8 characteristics between wild type mice and knockout mice
In order to investigate the relationship between the development, growth and differentiation of embryonic T cells and EphB6 molecules, thymic tissue culture (FTOC) of embryonic embryos of wild-type mice and knockout mice was carried out as described above. Specifically, littermate wild type (EphB6 + / + ) Mouse and knockout (EphB6 − / − After culturing (or not culturing) each thymocyte collected at mouse E15.5, staining with an anti-CD4 antibody or an anti-CD8 antibody, the ratio of each positive and negative cell of CD4 / CD8 was determined. It was examined by flow cytometry. The result is shown in FIG.
[0058]
The figure shows CD4 on day 0 and day 5 after culture. − CD8 − Both negative, CD4 + CD8 + Both positive, CD4 + Single positive, CD8 + The ratio of single positive thymocytes is shown, but as a result, the ratio of each positive and negative cell of CD4 / CD8 was not significantly different between wild type mice and knockout mice.
[0059]
【The invention's effect】
As described above, the EphB6 knockout animal of the present invention, in which the EphB6 gene has been disrupted, can be used for functional analysis of the EphB6 gene, and has various usefulness as described above.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 (a) is a diagram illustrating the structure and the like of a targeting vector used for producing an EphB6 knockout animal of the present invention. FIG. 1 (b) shows the results of Southern blot analysis, and FIG. FIG. 2 shows the results of immunoblot analysis.
FIG. 2 (a) shows the results of examining the expression of EphB6 protein in embryonic thymocytes, and FIG. 2 (b) shows the results of examining the expression of EphB6 gene in embryonic period. .
FIG. 3 (a) to (c) show EphB6 − / − Thymocytes or EphB6 + / + It is a figure which shows the result of having investigated the binding characteristic of a thymocyte and each ephrin.
FIG. 4. EphB6 − / − Thymocytes and EphB6 + / + It is a figure which shows the result of having investigated the CD4-CD8 characteristic in a thymocyte.
