JP2006325452A - Tzf/tzf-l gene knockout non-human mammal, method for preparation of the same and method for using the same - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、Ｔｅｓｔｉｃｕｌａｒ Ｚｉｎｃ Ｆｉｎｇｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ（以下、「ＴＺＦ」という）／Ｔｅｓｔｉｃｕｌａｒ Ｚｉｎｃ Ｆｉｎｇｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｌ（以下、「ＴＺＦ−Ｌ」という）遺伝子が破壊された非ヒト哺乳動物、その作製方法、およびその利用方法に関する。 The present invention relates to a non-human mammal having a disrupted gene of Testicular Zinc Finger protein (hereinafter referred to as “TZF”) / Testicular Zinc Finger protein-L (hereinafter referred to as “TZF-L”), a method for producing the same, and use thereof Regarding the method.
ＴＺＦは、骨形成を司る骨芽細胞から単離されたタンパク質である。ＴＺＦは、９４２アミノ酸残基から構成され、この中に核酸との結合に関与するＣｙｓ2−Ｈｉｓ2型のｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ領域が１箇所存在し、核移行シグナルと考えられる塩基性アミノ酸に富む領域が４箇所存在する。さらにＴＺＦは、成体マウスの細精管、特に減数***前期のパキテン期の精細胞等で高頻度に発現している。これらのことから、ＴＺＦは、核内に存在し、***形成期、特に減数***期における***形成に関連する遺伝子の転写調節因子として作用することが示唆されている（非特許文献１）。なおＴＺＦｃＤＮＡ配列は、ＧｅｎＢａｎｋにコード番号ＡＦ１５９４５５で登録されている。 TZF is a protein isolated from osteoblasts responsible for bone formation. TZF is composed of 942 amino acid residues, in which there is one Cys 2 -His 2 type zinc finger region involved in binding to nucleic acid, and a region rich in basic amino acids that is considered to be a nuclear translocation signal. There are four places. Furthermore, TZF is expressed at high frequency in the seminiferous tubules of adult mice, particularly the sperm cells in the pachytene phase in the early meiosis. These facts suggest that TZF is present in the nucleus and acts as a transcriptional regulator of genes related to spermatogenesis in the spermatogenesis phase, particularly in the meiosis phase (Non-patent Document 1). The TZF cDNA sequence is registered with GenBank with the code number AF159455.
またＴＺＦには、アイソフォームであるＴＺＦ−Ｌが存在する。ＴＺＦ−Ｌは、２,０２５アミノ酸残基から構成され、そのＮ末端側９０２アミノ酸残基まではＴＺＦと共通する。ＴＺＦ−Ｌには、Ｃｙｓ2−Ｈｉｓ2型のｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ領域が２箇所存在し、核移行シグナルと考えられる塩基性アミノ酸に富んだ領域が４箇所存在する。またＴＺＦ−Ｌも、成体マウスの細精管、特に減数***前期のパキテン期の精細胞等で高頻度に発現している。これらのことから、ＴＺＦ−ＬもＴＺＦと同様に、核内に存在し、***形成期、特に減数***期における***形成に関連する遺伝子の転写調節因子として作用することが示唆されている（非特許文献２）。なおＴＺＦ−ＬｃＤＮＡ配列は、ＧｅｎＢａｎｋにコード番号ＡＦ２２７１９４で登録されている。 Moreover, TZF-L which is an isoform exists in TZF. TZF-L is composed of 2,025 amino acid residues, and up to the N-terminal 902 amino acid residues is common to TZF. In TZF-L, there are two Cys 2 -His 2 type zinc finger regions and four regions rich in basic amino acids that are considered to be nuclear translocation signals. TZF-L is also expressed at high frequency in the seminiferous tubules of adult mice, particularly in the meiotic cells of the pachytene phase. From these, it is suggested that TZF-L is also present in the nucleus, like TZF, and acts as a transcriptional regulatory factor for genes related to spermatogenesis in the spermatogenesis phase, particularly in meiosis phase (non-) Patent Document 2). The TZF-L cDNA sequence is registered in GenBank with the code number AF227194.
さらにＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子スクリーニングおよび遺伝子解析により、ＴＺＦおよびＴＺＦ−Ｌは、同一遺伝子からオルタナティブスプライシングにより形成されること、ＴＺＦ−Ｌ遺伝子は、ＴＺＦ遺伝子と同一翻訳開始点を持つことが明らかになっている（非特許文献２）。なおＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子配列は、ＧｅｎＢａｎｋにＺｆｐ３１８（ＮＭ２０７６７１、ＮＭ０２１３４６、ＮＭ０１４３４５）として登録されている。 Furthermore, TZF / TZF-L gene screening and gene analysis reveal that TZF and TZF-L are formed from the same gene by alternative splicing, and that the TZF-L gene has the same translation initiation point as the TZF gene. (Non-Patent Document 2). The TZF / TZF-L gene sequence is registered in GenBank as Zfp318 (NM207671, NM021346, NM014345).
このようにＴＺＦおよびＴＺＦ−ＬｃＤＮＡ、ならびにＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子のクローニングによってＴＺＦまたはＴＺＦ−Ｌの分子レベルでの解析は可能となりつつあるが、個体レベルでの生理的機能の解析には至らない。ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子が破壊された遺伝的に安定な変異動物が系統的に得られれば、該タンパク質の個体レベルでの生理的機能の研究のみならず、ＴＺＦおよび／またはＴＺＦ−Ｌが関与する疾患に対する予防・治療用医薬の開発に有用であると期待される。しかしながら、現在のところＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子の機能が欠損した遺伝的に安定な動物は知られていない。
すなわち本発明は、ＴＺＦおよびＴＺＦ−Ｌの個体レベルにおける生理的役割の解明、ならびにＴＺＦおよび／またはＴＺＦ−Ｌが関与する疾患の予防・治療用医薬の開発に有用な、遺伝的背景の明確な非ヒト哺乳動物を提供することを目的とするものである。 That is, the present invention has a clear genetic background that is useful for elucidating the physiological role of TZF and TZF-L at the individual level and for developing a drug for the prevention and treatment of diseases involving TZF and / or TZF-L. The object is to provide a non-human mammal.
本発明者らは、上記課題を解決すべく、人為的にＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子が破壊された非ヒト哺乳動物モデルの作製を試みた。具体的には、実施例に詳しく示されるように、マウスＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子のクローニングを行い、これを用いてターゲティングベクターを構築し、これをマウス胚性幹細胞（ＥＳ細胞）に導入して組み換えクローンを得て、それをマウス個体に戻すという手法により、ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子が破壊されたマウスを得ることに成功した。そして、本マウスの機能解析を進めたところ、雄性マウスにおける不妊が認められるとともに、予想外にも雌性マウスにおける著しい海綿骨密度低下が認められた。本発明は、かかる知見をもとに完成されたものである。 In order to solve the above problems, the present inventors have attempted to artificially produce a non-human mammal model in which the TZF / TZF-L gene is disrupted. Specifically, as detailed in the Examples, the mouse TZF / TZF-L gene was cloned, a targeting vector was constructed using this, and this was introduced into mouse embryonic stem cells (ES cells). By obtaining a recombinant clone and returning it to a mouse individual, we succeeded in obtaining a mouse in which the TZF / TZF-L gene was disrupted. As a result of functional analysis of this mouse, infertility was observed in male mice and unexpectedly a significant decrease in cancellous bone density was observed in female mice. The present invention has been completed based on such knowledge.
すなわち本発明は、以下の発明を包含する。
（１）ゲノム中のＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子のＤＮＡ配列の全部または一部を改変することにより得られ、相同染色体上の双方のＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子が破壊されたことを特徴とするノックアウト非ヒト哺乳動物。
（２）遺伝子ターゲティング法により作製されたことを特徴とする（１）に記載のノックアウト非ヒト哺乳動物。
（３）ゲノム中のＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子の翻訳開始コドンを含む領域を相同組み換えにより他の塩基配列に置換する工程を含んで作製されたことを特徴とする（２）に記載のノックアウト非ヒト哺乳動物。
（４）齧歯目動物であることを特徴とする（１）〜（３）のいずれか１つに記載のノックアウト非ヒト哺乳動物。
（５）マウスであることを特徴とする（４）に記載のノックアウト非ヒト哺乳動物。
（６）ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子の機能が染色体上で欠損したことを特徴とする（１）〜（５）のいずれか１つに記載の不妊モデル非ヒト哺乳動物。
（７）ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子の機能が染色体上で欠損したことを特徴とする（１）〜（５）のいずれか１つに記載の骨量減少症または骨粗鬆症モデル非ヒト哺乳動物。
（８）（６）の不妊モデル非ヒト哺乳動物を用いた不妊の予防または治療用医薬のスクリーニング方法。
（９）（７）の骨量減少症または骨粗鬆症モデル非ヒト哺乳動物を用いた骨量減少症または骨粗鬆症の予防または治療用医薬のスクリーニング方法。
（１０）以下の（ｉ）〜（vi）の工程を含む（１）〜（７）のいずれか１つに記載のＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子ノックアウト非ヒト哺乳動物の作製方法。
（ｉ）ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子ターゲティングベクターを作製する工程、
（ii）前記ターゲティングベクターをＥＳ細胞に導入し、相同組み換えＥＳ細胞等を作製する工程、
（iii）前記相同組み換えＥＳ細胞を妊娠した雌から得た胚に挿入し、キメラ胚を作製する工程、
（iv）前記キメラ胚を偽妊娠させた雌の子宮に移植し、キメラ動物を作製する工程、
（ｖ）前記キメラ動物を同種動物と交配させ、Ｆ１ヘテロ接合体を作製する工程、および
（vi）前記Ｆ１ヘテロ型産仔同士を交配させ、Ｆ２ホモ接合体を作製する工程。
That is, the present invention includes the following inventions.
(1) Knockout obtained by modifying all or part of the DNA sequence of the TZF / TZF-L gene in the genome and disrupting both TZF / TZF-L genes on homologous chromosomes Non-human mammals.
(2) The knockout non-human mammal according to (1), which is produced by a gene targeting method.
(3) The knockout non-description according to (2), comprising a step of substituting a region containing the translation initiation codon of the TZF / TZF-L gene in the genome with another base sequence by homologous recombination Human mammal.
(4) The knockout non-human mammal according to any one of (1) to (3), which is a rodent.
(5) The knockout non-human mammal according to (4), which is a mouse.
(6) The infertility model non-human mammal according to any one of (1) to (5), wherein the function of the TZF / TZF-L gene is deficient on the chromosome.
(7) The bone loss or osteoporosis model non-human mammal according to any one of (1) to (5), wherein the function of the TZF / TZF-L gene is deficient on the chromosome.
(8) A method for screening a medicament for preventing or treating infertility using the infertility model non-human mammal according to (6).
(9) The screening method for a medicament for the prevention or treatment of osteopenia or osteoporosis using the bone loss or osteoporosis model non-human mammal according to (7).
(10) A method for producing a TZF / TZF-L gene knockout non-human mammal according to any one of (1) to (7), comprising the following steps (i) to (vi):
(I) producing a TZF / TZF-L gene targeting vector;
(Ii) introducing the targeting vector into ES cells to produce homologous recombinant ES cells and the like,
(Iii) inserting the homologous recombinant ES cell into an embryo obtained from a pregnant female to produce a chimeric embryo,
(Iv) a step of transplanting the chimeric embryo into a pseudo-pregnant female uterus to produce a chimeric animal;
(V) mating the chimeric animal with the same species to produce an F1 heterozygote, and (vi) mating the F1 heterozygous infants to produce an F2 homozygote.
本発明によれば、ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子が破壊された非ヒト哺乳動物が提供される。すなわち本発明により、ＴＺＦおよびＴＺＦ−Ｌの生理的機能の個体レベルでの解析のためのツールを提供することができる。 According to the present invention, a non-human mammal having a disrupted TZF / TZF-L gene is provided. That is, according to the present invention, a tool for analyzing the physiological functions of TZF and TZF-L at an individual level can be provided.
生殖細胞（***形成細胞）の精原細胞から***までを再現した培養系でのモデルシステムは、開発されておらず、***形成の研究は大きく立ち遅れている。したがって現在、雄性不妊予防・治療用医薬の開発は、非常に困難な状況におかれている。本発明の雄性ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子ノックアウト非ヒト哺乳動物は、雄性不妊を呈することから、雄性不妊の予防・治療用医薬のスクリーニングのモデル動物として有用である。すなわち、本発明の雄性ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子ノックアウト非ヒト哺乳動物が提供されることにより、今まで不可能であった雄性不妊の予防・治療用医薬の大規模、かつ迅速な開発が可能となる。 A model system in a culture system that reproduces germ cells (spermatogenic cells) from spermatogonia to spermatozoa has not been developed, and research on spermatogenesis is far behind. Therefore, at present, the development of a medicine for preventing and treating male infertility is in a very difficult situation. Since the male TZF / TZF-L gene knockout non-human mammal of the present invention exhibits male infertility, it is useful as a model animal for screening pharmaceuticals for prevention / treatment of male infertility. That is, by providing the male TZF / TZF-L gene knockout non-human mammal of the present invention, large-scale and rapid development of a pharmaceutical for preventing and treating male infertility, which has been impossible until now, is possible. Become.
骨量減少症や骨粗鬆症の早期には海綿骨に異常が認められること、閉経後の女性に起きる骨量減少症や骨粗鬆症は、海綿骨の骨梁数減少に伴う骨密度の低下に起因することが知られている。本発明の雌性ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子ノックアウト非ヒト哺乳動物は、著しい海綿骨密度減少を呈することから、上記疾患に極めて近い様相を呈すると考えられる。したがって本発明により、骨量減少症や骨粗鬆症の予防・治療用医薬のスクリーニングに極めて有用なモデル動物を提供することができる。その結果、骨量減少症や骨粗鬆症等の予防・治療用医薬の大規模、かつ迅速な開発が可能となる。 Abnormalities in cancellous bone are observed at an early stage of osteopenia and osteoporosis, and osteopenia and osteoporosis occurring in postmenopausal women are caused by a decrease in bone density associated with a decrease in trabecular bone trabeculae It has been known. The female TZF / TZF-L gene knockout non-human mammal of the present invention exhibits a marked decrease in cancellous bone density, and is thus considered to be very close to the above disease. Therefore, according to the present invention, it is possible to provide a model animal that is extremely useful for screening pharmaceuticals for prevention / treatment of osteopenia and osteoporosis. As a result, large-scale and rapid development of pharmaceuticals for prevention / treatment of osteopenia and osteoporosis becomes possible.
以下に本発明の実施の形態について詳細に説明する。
１．用語の定義
本発明の「ノックアウト非ヒト哺乳動物」は、ゲノム中のＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子のＤＮＡ配列の全部または一部を改変することにより得られ、相同染色体上の双方のＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子が破壊されていることを特徴とする。
Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail.
1. Definition of Terms A “knockout non-human mammal” of the present invention is obtained by modifying all or part of the DNA sequence of the TZF / TZF-L gene in the genome, and both TZF / TZF− on the homologous chromosome. The L gene is disrupted.
（１）「ＴＺＦ遺伝子」、「ＴＺＦ−Ｌ遺伝子」、および「ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子」
図１に示すようにＴＺＦおよびＴＺＦ−Ｌは、１１個のエクソン部分と各エクソン間に存在する１０個のイントロン部分からなる同一遺伝子から、オルタナティブスプライシングにより形成される。すなわちＴＺＦは第２〜第７および第１１エクソンから形成され、ＴＺＦ−Ｌは、第２〜第１０エクソンから形成される。したがって本発明における「ＴＺＦ遺伝子」、「ＴＺＦ−Ｌ遺伝子」、および「ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子」とは、ＴＺＦおよびＴＺＦ−Ｌをコードする遺伝子、すなわち図１に示した、第１エクソンを含む１１個のエクソン部分と各エクソン間に存在するイントロン部分からなる遺伝子全体をいう。
(1) "TZF gene", "TZF-L gene", and "TZF / TZF-L gene"
As shown in FIG. 1, TZF and TZF-L are formed by alternative splicing from the same gene consisting of 11 exon parts and 10 intron parts existing between each exon. That is, TZF is formed from the second to seventh and eleventh exons, and TZF-L is formed from the second to tenth exons. Therefore, the “TZF gene”, “TZF-L gene”, and “TZF / TZF-L gene” in the present invention include genes encoding TZF and TZF-L, that is, the first exon shown in FIG. This refers to the entire gene consisting of 11 exon parts and intron parts existing between each exon.
（２）「ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子が破壊された」
本発明における「ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子が破壊された」とは、本発明のノックアウト非ヒト哺乳動物において、野生型ＴＺＦおよびＴＺＦ−Ｌの全長、ならびに断片化タンパク質が発現されないことを意味する。ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子の機能解析、およびＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子機能異常に起因する疾患に対する予防・治療剤のスクリーニングのためには、上記タンパク質の一部断片（ポリペプチド）も発現されないことが好ましいが、そのポリペプチドが野生型タンパク質の機能を有しない限り、当該ポリペプチドを発
現するものであってもよい。
(2) “The TZF / TZF-L gene was destroyed”
The term “TZF / TZF-L gene is disrupted” in the present invention means that the full-length wild-type TZF and TZF-L and the fragmented protein are not expressed in the knockout non-human mammal of the present invention. For the functional analysis of the TZF / TZF-L gene and the screening of prophylactic / therapeutic agents for diseases caused by TZF / TZF-L gene dysfunction, a partial fragment (polypeptide) of the above protein may not be expressed. Preferably, the polypeptide may express the polypeptide as long as the polypeptide does not have the function of a wild-type protein.
（３）「ゲノム中のＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子のＤＮＡ配列の全部または一部を改変すること」
本発明における「ゲノム中のＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子のＤＮＡ配列の全部または一部を改変すること」における「全部」とは、ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子の第１エクソンの５’末端から第１１エクソンの３’末端までの領域をいう。また「一部」とは、この領域の一部であって、（ｉ）野生型ＴＺＦおよびＴＺＦ−Ｌの全長タンパク質の発現のみならずその一部断片（ポリペプチド）の発現をも阻害するために塩基配列を改変することが必要な領域（例えば、翻訳開始コドン等）、または（ii）野生型ＴＺＦおよびＴＺＦ−Ｌの機能を何ら有していないその一部断片（ポリペプチド）の発現のみ許容する程度に塩基配列の改変が必要な領域をいう。さらに「改変」とは、単一または複数のヌクレオチドを置換、欠失、挿入および／または転位させることにより、ゲノムＤＮＡ中の対象領域の塩基配列を他の塩基配列に改変することをいう。
(3) “Modifying all or part of the DNA sequence of the TZF / TZF-L gene in the genome”
In the present invention, “all” in “modifying all or part of the DNA sequence of the TZF / TZF-L gene in the genome” refers to the 11th from the 5 ′ end of the first exon of the TZF / TZF-L gene. This refers to the region up to the 3 'end of the exon. “Part” means a part of this region, and (i) inhibits not only the expression of full-length proteins of wild-type TZF and TZF-L but also the expression of a partial fragment (polypeptide) thereof. Only the expression of a region (for example, translation initiation codon, etc.), or (ii) a partial fragment (polypeptide) thereof that does not have any function of wild type TZF and TZF-L This refers to a region that requires modification of the base sequence to an acceptable extent. Furthermore, “modification” refers to modifying the base sequence of a target region in genomic DNA to another base sequence by substituting, deleting, inserting and / or transposing single or multiple nucleotides.
（４）「非ヒト哺乳動物」
本発明における「非ヒト哺乳動物」とは、ヒトを除く哺乳動物であれば特に限定されないが、飼育や交配の容易性の観点から、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ等の齧歯目に属する動物が好ましく、その中でも近交系が多数作出されており、体外受精の技術が整っているマウスが、特に好ましい。
(4) "Non-human mammal"
The “non-human mammal” in the present invention is not particularly limited as long as it is a mammal excluding humans, but from the viewpoint of ease of breeding and mating, rodents such as mice, rats, guinea pigs, hamsters, rabbits, etc. The animal to which the animal belongs is preferable, and among them, a mouse in which a large number of inbred strains have been produced and in vitro fertilization techniques are particularly preferable.
２．ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子ノックアウト非ヒト哺乳動物の作製方法
本発明者は、後述の実施例に示すように、遺伝子ターゲティング法を用いてＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子の破壊されたノックアウト非ヒト哺乳動物を作製した。本発明のノックアウト非ヒト哺乳動物の作製方法は、以下の工程を含む。
（１）ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子ターゲティングベクターを作製する工程。
（２）前記ターゲティングベクターをＥＳ細胞等に導入し、相同組み換えＥＳ細胞を作製する工程。
（３）前記相同組み換えＥＳ細胞を妊娠した雌から得た胚に挿入し、キメラ胚を作製する工程。
（４）前記キメラ胚を偽妊娠させた雌の子宮に移植し、キメラ動物を作製する工程。
（５）前記キメラ動物を同種動物と交配させ、Ｆ１ヘテロ接合体を作製する工程。
（６）前記Ｆ１ヘテロ型産仔同士を交配させ、Ｆ２ホモ接合体を作製する工程。
以下、この遺伝子ターゲティング法を用いたＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子ノックアウト動物の作製方法について詳しく説明する。
2. Method for Producing TZF / TZF-L Gene Knockout Non-Human Mammal As shown in the Examples below, the present inventor used a gene targeting method to prepare a knock-out non-human mammal having a TZF / TZF-L gene disrupted. Produced. The method for producing a knockout non-human mammal of the present invention includes the following steps.
(1) A step of producing a TZF / TZF-L gene targeting vector.
(2) A step of introducing the targeting vector into an ES cell or the like to produce a homologous recombinant ES cell.
(3) A step of inserting a homologous recombinant ES cell into an embryo obtained from a pregnant female to produce a chimeric embryo.
(4) A step of transplanting the chimeric embryo into a female uterus subjected to pseudopregnancy to produce a chimeric animal.
(5) A step of mating the chimeric animal with the same species to produce an F1 heterozygote.
(6) A step of mating the F1 heterozygous pups to produce an F2 homozygote.
Hereinafter, a method for producing a TZF / TZF-L gene knockout animal using this gene targeting method will be described in detail.
（１）ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子ターゲティングベクターの作製
ターゲティングベクターの作製のため、対象となる動物のＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子（標的遺伝子）を単離する。例えば、ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子ノックアウト動物を作製する場合は、対象となる動物の遺伝子ライブラリーから、プローブとしてＴＺＦもしくはＴＺＦ−ＬのｃＤＮＡ、またはＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子の全部または一部の配列を用いて、ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子をスクリーニングする。スクリーニングの条件、方法は特に限定されず、スクリーニングに用いるプローブについても、他の動物由来のｃＤＮＡから調製してもよい。後述の実施例においては、マウスＴＺＦのｃＤＮＡから調製したプローブを用いてマウスのゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングしたが、他の動物のｃＤＮＡからプローブを調製してもよい。このようにスクリーニングされたＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子を、市販のプラスミドベクターなどを用いてサブクローニングし、ＤＮＡシーケンシングにより特定し、このクローンのＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子の翻訳開始コドンを含むフラグメントを調製する。
(1) Preparation of TZF / TZF-L gene targeting vector In order to prepare a targeting vector, a target animal's TZF / TZF-L gene (target gene) is isolated. For example, when preparing a TZF / TZF-L gene knockout animal, a TZF or TZF-L cDNA, or a whole or a partial sequence of the TZF / TZF-L gene as a probe from a gene library of the animal of interest. Is used to screen the TZF / TZF-L gene. Screening conditions and methods are not particularly limited, and probes used for screening may also be prepared from cDNA derived from other animals. In the Examples described later, a mouse genomic DNA library was screened using a probe prepared from mouse TZF cDNA, but a probe may be prepared from cDNA of other animals. The TZF / TZF-L gene thus screened is subcloned using a commercially available plasmid vector, etc., identified by DNA sequencing, and a fragment containing the translation initiation codon of the TZF / TZF-L gene of this clone is prepared. To do.
上記スクリーニングにより得られたＴＺＦ／ＴＺＦ−ＬゲノムＤＮＡを用いて、相同組み換えのためのターゲティングベクターを構築する。ターゲティングベクターは、公知の方法により作製することができる。すなわち標的動物のＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子の機能を欠損させるために、部位指定突然変異誘発（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）などの手段により、上記ＴＺＦ／ＴＺＦ−ＬゲノムＤＮＡから、その一部の核酸を欠失した核酸配列を調製してもよく、また制限酵素等を用いて、ＴＺＦ／ＴＺＦ−ＬゲノムＤＮＡに他の遺伝子を挿入した核酸配列を調製してもよい。 Using the TZF / TZF-L genomic DNA obtained by the above screening, a targeting vector for homologous recombination is constructed. The targeting vector can be prepared by a known method. That is, in order to delete the function of the target animal's TZF / TZF-L gene, a part of the nucleic acid is extracted from the TZF / TZF-L genomic DNA by means such as site-directed mutagenesis. A deleted nucleic acid sequence may be prepared, or a nucleic acid sequence in which another gene is inserted into TZF / TZF-L genomic DNA may be prepared using a restriction enzyme or the like.
ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子に挿入される他の遺伝子としては、相同組み換えが起こった細胞の選別を容易にするために、ポジティブ選別を行うためのマーカーとして機能する遺伝子や、目的の相同組み換えが起こらなかった場合に発現して選別を行うことのできるネガティブ選別を行うためのマーカーとして機能する遺伝子が好ましい。ポジティブ選択マーカー遺伝子としてはネオマイシン耐性遺伝子（例えば、ＧＦＰ−ｎｅｏカセット、ジェネティシン耐性により選択）等の薬剤耐性遺伝子やβ−ガラクトシダーゼ遺伝子等のレポータ遺伝子等が挙げられる。また、ネガティブ選択マーカー遺伝子としては単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子（例えば、ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子）やジフテリア毒素Ａフラグメント遺伝子などが挙げられる。さらに、このようなターゲティングベクターを構築する際に、ターゲティングベクター構築用として市販されているプラスミドベクターを利用してもよい。 Other genes inserted into the TZF / TZF-L gene include a gene that functions as a marker for performing positive selection or a desired homologous recombination in order to facilitate selection of cells in which homologous recombination has occurred. A gene that functions as a marker for performing negative selection that can be expressed and selected when not present is preferable. Examples of the positive selection marker gene include drug resistance genes such as neomycin resistance gene (for example, GFP-neo cassette, selected by geneticin resistance), reporter genes such as β-galactosidase gene, and the like. Examples of the negative selection marker gene include a herpes simplex virus thymidine kinase gene (for example, HSV-tk gene) and a diphtheria toxin A fragment gene. Furthermore, when constructing such a targeting vector, a plasmid vector that is commercially available for constructing a targeting vector may be used.
これら遺伝子のＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子における挿入場所は、標的におけるＴＺＦおよびＴＺＦ−Ｌの機能を有するタンパク質の発現を抑制しうる位置であれば特に限定されないが、通常エクソンに欠損が生じるように挿入する。ＴＺＦおよびＴＺＦ−Ｌ遺伝子は、同一の翻訳開始点を有することから、翻訳開始コドン（ＡＧＴ）を含む領域が破壊されるように遺伝子を挿入して、ターゲティングベクターを構築するのが好ましい。このとき、目的とする制限酵素切断部位が、適切な位置に配されるようにターゲティングベクターを設計するとよい。またターゲティング効率は、相同領域の長さに依存するので、相同領域はできるだけ長い方が好ましい。さらにターゲティングベクターは、環状より直鎖状の方が、ターゲティング効率の観点から望ましいので、直鎖状化のため相同領域以外の部分に一箇所適当な制限酵素切断部位を設けておくとよい。 The insertion position of these genes in the TZF / TZF-L gene is not particularly limited as long as it can suppress the expression of a protein having a function of TZF and TZF-L in the target. To do. Since the TZF and TZF-L genes have the same translation start point, it is preferable to construct the targeting vector by inserting the gene so that the region containing the translation start codon (AGT) is destroyed. At this time, the targeting vector may be designed so that the target restriction enzyme cleavage site is located at an appropriate position. Moreover, since the targeting efficiency depends on the length of the homologous region, the homologous region is preferably as long as possible. Furthermore, since the targeting vector is preferably linear rather than circular in terms of targeting efficiency, an appropriate restriction enzyme cleavage site may be provided in a portion other than the homologous region for linearization.
（２）相同組み換え胚性幹細胞（ＥＳ細胞）の作製
作製したターゲティングベクターを、制限酵素で切断して直鎖状ＤＮＡとし、例えばフェノール・クロロフォルム抽出、アガロース電気泳動、超遠心等により精製して、ＥＳ細胞へ導入する。調製したターゲッティングベクターをＥＳ細胞にエレクトロポレーション法、リポソーム法、リン酸カルシウム法等の公知の方法により導入する（導入遺伝子の相同遺伝子組み換え効率を勘案した場合、ＥＳ細胞へのエレクトロポレーション法が好ましい）。ターゲティングベクターのＥＳ細胞等への導入により、一部の細胞内において細胞中の野生型ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子とターゲティングベクターの対応する領域との間で相同組み換えが生じ、ターゲティングベクター中に構築されていた遺伝子と野生型の遺伝子とが置き換わる。このようにして変異型ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子を持つＥＳ細胞、すなわち相同組み換えＥＳ細胞を得ることができる。
(2) Production of homologous recombinant embryonic stem cells (ES cells) The produced targeting vector is cleaved with a restriction enzyme to form a linear DNA, and purified by, for example, phenol / chloroform extraction, agarose electrophoresis, ultracentrifugation, etc. Introduce into ES cells. The prepared targeting vector is introduced into ES cells by known methods such as electroporation method, liposome method, calcium phosphate method, etc. (in consideration of the efficiency of homologous gene recombination of the transgene, the electroporation method to ES cells is preferred) . By introducing the targeting vector into an ES cell or the like, homologous recombination occurs between the wild-type TZF / TZF-L gene in the cell and the corresponding region of the targeting vector in some cells, and is constructed in the targeting vector. The former gene and the wild-type gene are replaced. In this way, ES cells having a mutant TZF / TZF-L gene, that is, homologous recombinant ES cells can be obtained.
なおＥＳ細胞は、作製すべきノックアウト動物と通常同一種の細胞を用いる。したがって、例えばノックアウトマウスを作製する場合には、マウスＥＳ細胞を使用する。 Note that ES cells are usually of the same species as the knockout animal to be prepared. Therefore, for example, when producing a knockout mouse, mouse ES cells are used.
ターゲティングベクターに上記ポジティブ選択マーカー遺伝子が挿入されている場合には、所望の相同組み換えが行なわれた細胞では、ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子が破壊されるとともに、マーカー遺伝子が存在しているので、このマーカー遺伝子の特性を利用し選別することができる。すなわちマーカー遺伝子として薬剤耐性遺伝子を用いた場合には、タ
ーゲティングベクター導入後のＥＳ細胞を、致死濃度の薬剤の存在下で培養することにより、所望の相同組み換えが行なわれたＥＳ細胞を選別することができる。またマーカー遺伝子として酵素（例えば、β−ガラクトシダーゼ）をコードするレポータ遺伝子を用いた場合には、適当な酵素基質を添加することにより、相同組み換えが行われたことを確認することができる。
When the positive selection marker gene is inserted into the targeting vector, the TZF / TZF-L gene is disrupted and the marker gene is present in cells in which the desired homologous recombination has been performed. Selection can be made using the characteristics of the marker gene. That is, when a drug resistance gene is used as a marker gene, the ES cells after the introduction of the targeting vector are cultured in the presence of a lethal concentration of the drug to select the ES cells that have undergone the desired homologous recombination. Can do. Further, when a reporter gene encoding an enzyme (for example, β-galactosidase) is used as a marker gene, it can be confirmed that homologous recombination has been performed by adding an appropriate enzyme substrate.
相同組み換え体の確認は、さらにサザンブロット解析やＰＣＲ等で行うことができる。サザンブロット解析は、ＤＮＡを細胞から抽出し、該ＤＮＡを特定の制限酵素でダイジェストし、相同組み換えが起こったＤＮＡと相同組み換えが行われていないＤＮＡとが区別できるように設計されたプローブを用いて行う。別法としては、ターゲティングベクター上のＤＮＡ配列と、ターゲティングベクターに使用したＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子以外の近傍領域のＤＮＡ配列とをプライマーとしたＰＣＲ法による解析で判定することができる。また、ターゲティングベクターがランダムに挿入されていないことは、ターゲティングベクター内のＤＮＡをプローブとしてサザンブロット解析することにより確認できる。これらの方法を組み合わせることにより、相同組み換えを起こしたＥＳ細胞を取得することができる。 Homologous recombinants can be confirmed by Southern blot analysis or PCR. Southern blot analysis uses a probe designed to extract DNA from cells, digest the DNA with specific restriction enzymes, and distinguish between DNA that has undergone homologous recombination and DNA that has not undergone homologous recombination. Do it. As another method, it can be determined by PCR analysis using a DNA sequence on a targeting vector and a DNA sequence in a neighboring region other than the TZF / TZF-L gene used for the targeting vector. Moreover, it can confirm that the targeting vector is not inserted at random by performing Southern blot analysis using DNA in the targeting vector as a probe. By combining these methods, ES cells that have undergone homologous recombination can be obtained.
（３）キメラ胚の作製
上記のように調製したＥＳ細胞を、胚形成の初期の適当な時期、例えば、８細胞期の動物胚または胚盤胞（ブラストシスト）に注入することによりキメラ胚を作製することができる。注入に用いる動物胚または胚盤胞は、妊娠した雌の子宮を取り出し、灌流することによって得ることができる。
(3) Production of Chimera Embryo The ES cells prepared as described above are injected into a suitable early stage of embryogenesis, for example, an 8-cell stage animal embryo or blastocyst (blast cyst) to obtain a chimeric embryo. Can be produced. Animal embryos or blastocysts used for injection can be obtained by removing and perfusing a pregnant female uterus.
ＥＳ細胞の胚盤胞等への注入は、好ましくはマイクロインジェクションによって行うことができる。マイクロインジェクションでは、約１０〜３０個のＥＳ細胞をマイクロピペットに収集し、胚盤胞等に注入する。マイクロインジェクションは、例えば倒立顕微鏡下で、マイクロマニピュレーター、マイクロインジェクター、インジェクションピペット及びホールディングピペットを用いて行うことができる。 Injection of ES cells into blastocysts and the like can be preferably performed by microinjection. In microinjection, about 10 to 30 ES cells are collected in a micropipette and injected into a blastocyst or the like. The microinjection can be performed using, for example, a micromanipulator, a microinjector, an injection pipette, and a holding pipette under an inverted microscope.
胚に注入したＥＳ細胞が発生分化中の胚に取り込まれたか否かを個体作製後に確認できるようにするために、作製された個体の外部的特徴（例えば、毛色）が、注入したＥＳ細胞に由来する部分と胚盤胞に由来する部分とで異なるように、胚盤胞を選択することが好ましい。 In order to be able to confirm after embryo production whether or not the ES cells injected into the embryo have been taken up into the developing and differentiated embryo, the external characteristics (for example, hair color) of the produced individual are The blastocyst is preferably selected so that the part derived from the part derived from the part derived from the blastocyst differs.
（４）キメラ動物の作製
上記で得られたキメラ胚を偽妊娠させた哺乳動物の子宮角に移植する。作出された動物は正常なＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子座をもつ細胞と人為的に変異したＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子座をもつ細胞との両者から構成されるキメラ動物である。
(4) Preparation of chimeric animal The chimeric embryo obtained above is transplanted into the uterine horn of a pseudopregnant mammal. The produced animal is a chimeric animal composed of both cells having a normal TZF / TZF-L locus and cells having an artificially mutated TZF / TZF-L locus.
（５）Ｆ１ヘテロ接合体の作製
このキメラ動物を、野生型ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子をホモでもつ、適当な系統の同種動物と交配させることによって、第１世代（Ｆ１）として、相同染色体上の一方のＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子が破壊されたヘテロ接合体を得ることができる。娩出される産仔はキメラマウスの生殖細胞が相同組み換えＥＳ細胞に由来していれば、該ＥＳ細胞が由来するマウスと同じ野生色を呈し、胚盤胞に由来していれば、該胚盤胞が由来するマウスと同じ色を呈する。
(5) Preparation of F1 heterozygote This chimeric animal is crossed with a homologous animal of an appropriate strain having a wild-type TZF / TZF-L gene as a homozygote to obtain the first generation (F1) on the homologous chromosome. A heterozygote in which one of the TZF / TZF-L genes is disrupted can be obtained. If the germ cells of the chimeric mouse are derived from homologous recombinant ES cells, the pups to be delivered will exhibit the same wild color as the mouse from which the ES cells are derived, and if they are derived from blastocysts, It has the same color as the mouse from which the cyst originated.
（６）Ｆ２ホモ接合体の作製
上記で得られたＦ１ヘテロ接合体同士を交配させて、第２世代（Ｆ２）として、相同染色体上の双方のＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子が破壊されたホモ接合体、すなわち本発明のＴ
ＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子ノックアウト動物を得ることができる。ホモ接合体の同定は、体の一部（例えば尾）を切断し、ＤＮＡを抽出してサザンブロット解析、ノーザンブロット解析、またはＰＣＲ法などによって遺伝子型を調べればよい。なお第２世代として、ＴＺＦ／ＴＺＦ遺伝子ノックアウト動物と同腹の野生型動物（野生型遺伝子をホモで持つ）を得ることができるが、この野生型動物は対照実験に好適に用いることができる。
(6) Preparation of F2 homozygote H2 heterozygote obtained by crossing the F1 heterozygotes obtained above to disrupt both TZF / TZF-L genes on homologous chromosomes as the second generation (F2) The body, ie the T of the invention
ZF / TZF-L gene knockout animals can be obtained. The homozygote can be identified by cutting a part of the body (eg, tail), extracting the DNA, and examining the genotype by Southern blot analysis, Northern blot analysis, PCR method or the like. As a second generation, a wild-type animal (having a wild-type gene homozygous) that is the same as a TZF / TZF gene knockout animal can be obtained. This wild-type animal can be suitably used for a control experiment.
３．本発明のＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子ノックアウト動物の利用
本発明のＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子ノックアウト動物は、ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子が破壊されたものであるから、第一義的には、個体レベルにおけるＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子の機能解析に用いられるものではあるが、これに止まらず、以下の様々な用途に使用することができる。
3. Use of TZF / TZF-L Gene Knockout Animal of the Present Invention Since the TZF / TZF-L gene knockout animal of the present invention has a disrupted TZF / TZF-L gene, Although it is used for functional analysis of TZF / TZF-L gene in, it can be used for the following various applications.
（１）医薬のスクリーニング
（ｉ）雄性不妊治療薬のスクリーニング
本発明のＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子ノックアウト動物は、後述する実施例に示すように雄性動物における不妊（雄性不妊）という興味ある挙動を示す。さらにＴＺＦおよびＴＺＦ−Ｌは、***形成期、特に減数***期における転写調節因子として作用することが示唆されていることから、雄性ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子ノックアウト動物は、雄性不妊のモデル動物と考えることができる。
(1) Screening for pharmaceuticals (i) Screening for male infertility drugs The TZF / TZF-L gene knockout animal of the present invention exhibits an interesting behavior of infertility (male infertility) in male animals as shown in the examples described later. . Furthermore, since TZF and TZF-L have been suggested to act as transcriptional regulators during spermatogenesis, particularly in meiosis, male TZF / TZF-L gene knockout animals are considered to be male infertility model animals. be able to.
したがって本発明の雄性ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子ノックアウト動物は、以下の態様で医薬のスクリーニングに使用することができる。例えば、本発明の雄性ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子ノックアウト動物に被験物質を投与し、該ノックアウト動物と交配させた雌性動物の妊娠率を指標として、被験物質の中から雄性不妊の予防・治療用医薬の候補物質をスクリーニングすることができる。 Therefore, the male TZF / TZF-L gene knockout animal of the present invention can be used for drug screening in the following manner. For example, the test substance is administered to the male TZF / TZF-L gene knockout animal of the present invention, and the pregnancy rate of the female animal mated with the knockout animal is used as an index to prevent or treat male infertility from the test substance Candidate substances can be screened.
（ii）骨量減少症および骨粗鬆症治療薬のスクリーニング
さらに本発明のＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子ノックアウト動物は、後述する実施例に示すように雌性動物における著しい海綿骨密度低下という興味ある挙動を示す。骨量減少症および骨粗鬆症の早期には海綿骨に異常が観察されることが多く、さらに女性の閉経後に起こる骨量減少症および骨粗鬆症は、海綿骨の骨梁数低下に起因することから、本発明の雌性ノックアウト動物は、前記疾患のモデル動物と考えることができる。
(Ii) Screening for therapeutic agents for osteopenia and osteoporosis Furthermore, the TZF / TZF-L gene knockout animal of the present invention exhibits an interesting behavior of a marked decrease in cancellous bone density in female animals as shown in the Examples described later. Abnormalities are often observed in cancellous bone in the early stages of osteopenia and osteoporosis, and since osteopenia and osteoporosis that occurs after menopause in women are caused by a decrease in the number of trabecular bones, The female knockout animal of the invention can be considered as a model animal of the disease.
したがって本発明の雌性ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子ノックアウト動物は、以下の態様で医薬のスクリーニングに使用することができる。例えば、本発明の雌性ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子ノックアウト動物に被験物質を投与し、該ノックアウト動物の海綿骨密度を指標として、被験物質の中から骨量減少症および骨粗鬆症の予防・治療用医薬の候補物質をスクリーニングすることができる。 Therefore, the female TZF / TZF-L gene knockout animal of the present invention can be used for drug screening in the following manner. For example, a test substance is administered to the female TZF / TZF-L gene knockout animal of the present invention, and a drug for the prevention / treatment of osteopenia and osteoporosis is selected from the test substance using the cancellous bone density of the knockout animal as an index. Candidate substances can be screened.
本発明のスクリーニング方法の対象となる被験物質の種類は特に限定されない。例えば、天然に生じる分子(例えば、アミノ酸、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、核酸など)；脂質、ステロイド、グリコペプチド、糖タンパク質、プロテオグリカンなど；あるいは天然に生じる分子の合成アナログ又は誘導体(例えば、ペプチド擬態物など)；及び天然に生じない分子(例えば、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作成した低分子有機化合物)；ならびにそれらの混合物などを挙げることができる。また、被験物質としては単一の被験物質を独立に試験しても、いくつかの候補となる被験物質の混合物（ライブラリーなどを含む）について試験をしてもよい。複数の被験物質を含むライブラリーとしては、合成化合物ライブラリー（コンビナトリアルライブラリーなど）、ペプチドライブラリー（コンビナトリアルライブラリーなど）などが挙げられる。 The type of the test substance that is the subject of the screening method of the present invention is not particularly limited. For example, naturally occurring molecules (eg, amino acids, peptides, oligopeptides, polypeptides, proteins, nucleic acids, etc.); lipids, steroids, glycopeptides, glycoproteins, proteoglycans, etc .; or synthetic analogs or derivatives of naturally occurring molecules (eg, , Peptidomimetics, etc.); and non-naturally occurring molecules (eg, low molecular weight organic compounds made using combinatorial chemistry techniques); and mixtures thereof. In addition, as a test substance, a single test substance may be tested independently, or a test substance mixture (including a library) may be tested. Examples of the library containing a plurality of test substances include a synthetic compound library (such as a combinatorial library) and a peptide library (such as a combinatorial library).
（２）***形成機構の研究
本発明の雄性ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子ノックアウト動物は、***形成機構の研究に用いることができる。具体的には、***形成の各分化段階における細胞（精原細胞、***細胞等）の形態や機能等を、野生型動物とＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子ノックアウト動物とで比較検討することにより、ＴＺＦおよび／またはＴＺＦ−Ｌが***形成に及ぼす影響を、組織・細胞レベルで検討することができる。
(2) Study on Spermatogenesis Mechanism The male TZF / TZF-L gene knockout animal of the present invention can be used for research on spermatogenesis. Specifically, by comparing and examining the morphology and function of cells (spermatogonia, spermatocytes, etc.) at each differentiation stage of spermatogenesis in wild type animals and TZF / TZF-L gene knockout animals, The effect of TZF and / or TZF-L on spermatogenesis can be examined at the tissue / cell level.
（３）骨代謝機構の研究
本発明の雌性ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子ノックアウト動物は、骨代謝機構の研究に用いることができる。具体的には、野生型動物とＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子ノックアウト動物との骨代謝速度等を比較検討することにより、ＴＺＦおよび／またはＴＺＦ−Ｌが骨代謝に及ぼす影響を、組織・細胞レベルで検討することができる。
(3) Study of bone metabolism mechanism The female TZF / TZF-L gene knockout animal of the present invention can be used for the study of bone metabolism mechanism. Specifically, by comparing the bone metabolism rate between wild-type animals and TZF / TZF-L gene knockout animals, the effects of TZF and / or TZF-L on bone metabolism are examined at the tissue and cell level. Can be considered.
（４）診断薬等への応用
本発明のＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子ノックアウト動物は、ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子治療法の開発や雄性不妊、骨量減少症、および骨粗鬆症の新たな診断法、診断用医薬の開発に利用することができる。
(4) Application to Diagnostic Agents, etc. The TZF / TZF-L gene knockout animal of the present invention is a new diagnostic method and diagnosis of development of TZF / TZF-L gene therapy and male infertility, osteopenia and osteoporosis. It can be used for the development of medicinal drugs.
（５）ダブルノックアウト動物の作製
さらに本発明のＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子ノックアウト動物、および該動物から得られた細胞（特に***、卵細胞、ＥＳ細胞、体性幹細胞）は、他の遺伝子を破壊したダブルノックアウト動物の作製に有用である。
(5) Preparation of double knockout animal Further, the TZF / TZF-L gene knockout animal of the present invention and cells obtained from the animal (especially sperm, egg cell, ES cell, somatic stem cell) disrupted other genes. Useful for the generation of double knockout animals.
以下、本発明のＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子ノックアウト動物として、ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子ノックアウトマウスを作製した実施例について説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, although the Example which produced the TZF / TZF-L gene knockout mouse as a TZF / TZF-L gene knockout animal of this invention is demonstrated, this invention is not limited to a following example.
１．ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子ノックアウトマウスの作製
（１）ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子ターゲティングベクターの作製
マウスＴＺＦ／ＴＺＦ−ＬゲノムＤＮＡを単離するために、プローブとしてマウスＴＺＦｃＤＮＡの５’末端〜ＥｃｏＲＩ（ヌクレオチド＃１０９８）ｃＤＮＡフラグメントを用いて、プラークハイブリダイゼーション法により、マウス１２９ｓｖｊゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。得られた陽性クローン（Ｃｌｏｎｅ １）をサブクローニングし、シーケンスを行った。ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子の５’末端測約１５kbpが含まれていることを確認した（図２）。
1. Preparation of TZF / TZF-L gene knockout mouse (1) Preparation of TZF / TZF-L gene targeting vector To isolate mouse TZF / TZF-L genomic DNA, 5 ′ end of mouse TZF cDNA to EcoRI (nucleotide) # 1098) A mouse 129svj genomic DNA library was screened by plaque hybridization using the cDNA fragment. The resulting positive clone (Clone 1) was subcloned and sequenced. It was confirmed that the 15 ′ bp of the 5 ′ end of the TZF / TZF-L gene was included (FIG. 2).
得られたマウスＴＺＦ／ＴＺＦ−ＬのゲノムＤＮＡのうちエクソン２（翻訳開始コドンを含む）を含む、約４kbのＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩ断片をＧＦＰ−ｎｅｏカセットによって置換した。さらに上流の相同領域の５’末端にネガティブセレクション用のマーカーとしてＨＳＶ−ｔｋ遺伝子のカセットを保持させた（図２）。なお制限酵素切断部位は、図中それぞれ次の略号で表記している。ＢａｍＨＩ（Ｂ）、ＨｉｎｄIII（Ｈ）、ＰＩ（Ｐ）。 Of the obtained mouse TZF / TZF-L genomic DNA, an approximately 4 kb PstI-BamHI fragment containing exon 2 (including the translation initiation codon) was replaced with a GFP-neo cassette. Furthermore, an HSV-tk gene cassette was retained as a marker for negative selection at the 5 'end of the upstream homologous region (Fig. 2). The restriction enzyme cleavage sites are indicated by the following abbreviations in the figure. BamHI (B), HindIII (H), PI (P).
このベクターは以下のような特徴を持つ。
（ｉ）エクソン２（翻訳開始コドンを含む）を含む、約４kbのＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩ断片が、ネオマイシン耐性遺伝子（ＧＦＰ−ｎｅｏカセット）により置換されている。
（ii）ネガティブ選択用マーカー遺伝子としてＨＳＶ−ｔｋ遺伝子を持つ。
（iii）野生型ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子との相同部分は、ネオマイシン耐性遺伝子の上流が約１.５kb、ネオマイシン耐性遺伝子下流が約７kbである。
This vector has the following characteristics.
(I) An approximately 4 kb PstI-BamHI fragment containing exon 2 (including the translation initiation codon) is replaced by a neomycin resistance gene (GFP-neo cassette).
(Ii) It has an HSV-tk gene as a negative selection marker gene.
(Iii) The homologous portion with the wild-type TZF / TZF-L gene is about 1.5 kb upstream of the neomycin resistance gene and about 7 kb downstream of the neomycin resistance gene.
（２）相同組み換えによるＪ１ＥＳ細胞でのＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子変異
Ｊ１ＥＳ細胞に直鎖状化したターゲティングベクターをエレクトロポレーション法により導入、培養し、目的とする相同組み換えが起こった細胞をジェネティシンで選別した。
(2) Mutation of TZF / TZF-L gene in J1ES cells by homologous recombination Introducing and culturing a linearized targeting vector in J1ES cells by electroporation, the cells in which the desired homologous recombination has occurred are geneticin. Sorted.
ジェネティシン耐性コロニーについては、変異アレイ中に存在するＧＦＰ部分（詳細についてはクロンテック社カタログ参照）をプローブとしてサザンブロット解析により相同組み換え体の確認を行った。ジェネティシン耐性のＥＳクローンの中から実際に相同組み換えによりＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子が破壊された１１個のクローンが得られた。 For geneticin-resistant colonies, homologous recombinants were confirmed by Southern blot analysis using the GFP portion present in the mutant array (see the Clontech catalog for details) as a probe. Eleven clones in which the TZF / TZF-L gene was actually disrupted by homologous recombination were obtained from ES clones resistant to geneticin.
（３）ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子変異ＥＳ細胞によるキメラマウスの作製
得られたクローンの中から３つのクローンを選択しＣ５７ＢＬ／６Ｊ雌性マウスから採取した胚盤胞にマイクロインジェクション法により注入した。その後、胚盤胞を偽妊娠雌性マウスに移植し、生殖系列のキメラマウスを得た。このキメラマウス（雄）とＣ５７ＢＬ／Ｂ６雌性マウスとを交配させることにより、第１世代（Ｆ１）として、相同染色体上の一方のＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子が破壊されたヘテロ接合体マウスを得た。
(3) Production of chimeric mice using TZF / TZF-L gene mutant ES cells Three clones were selected from the obtained clones and injected into blastocysts collected from C57BL / 6J female mice by the microinjection method. Thereafter, blastocysts were transplanted into pseudopregnant female mice to obtain germline chimeric mice. By crossing this chimeric mouse (male) with a C57BL / B6 female mouse, a heterozygous mouse in which one TZF / TZF-L gene on the homologous chromosome was disrupted was obtained as the first generation (F1). .
（４）ホモ接合体マウスの作製
さらに、これらへテロ接合体マウス同士を交配させることにより、第２世代（Ｆ２）として、相同染色体上の双方のＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子が破壊されたホモ接合体マウス、すなわち本発明のＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子ノックアウトマウスを作製した。ヘテロ接合体マウス同士の交配により生まれたＦ２はメンデルの法則に従い、野生型（＋/＋）、ヘテロ接合体（＋/−）、ホモ接合体（−/−）のは１：２：１の比率で娩出された。
(4) Production of homozygous mice Furthermore, by mating these heterozygous mice, homozygous in which both TZF / TZF-L genes on the homologous chromosome were disrupted as the second generation (F2). A body mouse, that is, a TZF / TZF-L gene knockout mouse of the present invention was prepared. F2 born by mating of heterozygous mice follows Mendel's law, and wild type (+ / +), heterozygous (+/-), and homozygous (-/-) are 1: 2: 1. It was delivered in proportion.
（５）ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子ノックアウトマウスの遺伝型の判定
（ｉ）ゲノムＤＮＡによるサザンブロッティング解析
５.５週齢の野生型マウス、ヘテロ接合体マウス、およびホモ接合体マウスの尾を、それぞれ約１cm採取し、ＤＮＡ抽出ｂｕｆｆｅｒ（５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ８.０、１００mM ＮａＣｌ、２０mM ＥＤＴＡ、１％ ＳＤＳ）１００μL、２０mg／mL ｐｒｏｔｅｎａｓｅ Ｋ（５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ８.０、１００mM ＮａＣｌ、 ２０mM ＥＤＴＡ）１μL中で、５５℃で一晩処理し、組織を溶解した。その後、ＤＮＡ抽出キット（ＴＯＹＯＢＯ、ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−Ｇｅｎｏｍｅ−Ｃｏｄｅ：ＮＰＫ−１０２）を用いて組織中に含まれるＤＮＡを精製した。ＤＮＡの精製過程はキットに付属するマニュアルに従った。精製したＤＮＡは滅菌水に溶解した。
(5) Determination of genotype of TZF / TZF-L gene knockout mouse (i) Southern blotting analysis using genomic DNA 5.5 Tail of wild-type mouse, heterozygous mouse, and homozygous mouse at the age of 5 weeks About 1 cm was collected, and DNA extraction buffer (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 100 mM NaCl, 20 mM EDTA, 1% SDS) 100 μL, 20 mg / mL proteinase K (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 100 mM NaCl, 20 mM EDTA) ) Treated in 1 μL overnight at 55 ° C. to lyse the tissue. Thereafter, the DNA contained in the tissue was purified using a DNA extraction kit (TOYOBO, MagExtractor-Genome-Code: NPK-102). The DNA purification process followed the manual attached to the kit. The purified DNA was dissolved in sterilized water.
このようにして調製した野生型マウス、ヘテロ接合体マウス、およびホモ接合体マウスゲノムＤＮＡをＨｉｎｄIIIでダイジェストし、配列番号１のプローブＡ（２５０ｂｐ、エクソン１とエクソン２の間にあるイントロン部分：野生型および変異型アレイの最も５’末端側にあるＨｉｎｄIIIサイトのすぐ下流、図２参照）を用い、サザンブロッティング法により解析した。
The wild-type, heterozygous and homozygous mouse genomic DNAs thus prepared were digested with HindIII, and probe A of SEQ ID NO: 1 (250 bp, intron portion between
サザンブロッティング解析用プローブ：
５’−ＣＴＴＴＡＧＣＴＧＴＣＡＴＧＧＡＧＴＣＴＣＡＧＴＴＡＴＡＧＣＴＧＴＴＡＴＴＣＣＧＡＣＧＧＧＡＧＧＴＧＴＧＣＡＴＡＡＴＣＡＡＴＣＡＴＴＧＴＧＡＴＴＧＣＴＧＣＣＡＴＣＡＧＣＴＡＧＡＧＡＣＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＣＴＡＣＣＡＧＣＡＡＴＣＴＴＴＴＡＧＧＴＴＡＧＧＧＣＴＣＡＣＧＧＴＣＣＣＴＴＧＡＧＧＴＡＡＡＧＣＡＡＴＡＧＣＡＡＴＡＧＧＴＧＴＴＡＴＣＡＣＡＧＣＣＡＡＧＧＡＡＣＣＡＧＣＴＣＡＧＡＧＡＧＧＴＴＴＡＡＧＴＡＧＣＴＴＧＡＴＣＡＡＧＧＴＧＡＣＡＣＡＣＡＡＧＴＧＡＴＧＧＡＧＣＴＧＴＧＧＴＴＣＡＧＣＴＣＡＣＡ−３’（配列番号１）
Southern blotting analysis probes:
5'-CTTTAGCTGTCATGGAGTCTCAGTTATAGCTGTTATTCCGACGGGAGGTGTGCATAATCAATCATTGTGATTGCTGCCATCAGCTAGAGACACAAGAGCAGCTACCAGCAATCTTTTAGGTTAGGGCTCACGGTCCCTTGAGGTAAAGCAATAGCAATAGGTGTTATCACAGCCAAGGAACCAGCTCAGAGAGGTTTAAGTAGCTTGATCAAGGTGACACACAAGTGATGGAGCTGTGGTTCAGCTCACA-3 '(SEQ ID NO: 1)
結果を図３に示す。野生型マウスにおいては野生型ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子の存在を示す５.６kbpにバンドが認められ、変異ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子の存在を示す３.３kbpにバンドが認められなかったのに対し、ホモ接合体マウスでは全く逆の結果が得られた。なおヘテロ接合体マウスでは、５.６kbpと３.３kbpの両方にバンドが認められた。 The results are shown in FIG. In the wild type mouse, a band was observed at 5.6 kbp indicating the presence of the wild type TZF / TZF-L gene, whereas no band was observed at 3.3 kbp indicating the presence of the mutant TZF / TZF-L gene. In the homozygous mice, completely opposite results were obtained. In heterozygous mice, bands were observed at both 5.6 kbp and 3.3 kbp.
（ii）マウス精巣より抽出したＲＮＡを用いたノーザンブロッティング解析
マウス精巣を摘出し、その半分をＲＮＡ抽出試薬ＩＳＯＧＥＮ（和光純薬社製）溶液１mL中でホモゲナイズした。懸濁液の遠心操作により、ＲＮＡと不純物を分離した。ＲＮＡの精製過程はキットに付属するマニュアルに従った。精製したＲＮＡは滅菌水に溶解した。このようにして調製したｍＲＮＡを、ＴＺＦとＴＺＦ−Ｌとの共通領域に当たる配列番号２のプローブ（１１８ｂｐ、ＴＺＦのＣ末端に対応）を用い、ノーザンブロッティング法により解析した。
(Ii) Northern blotting analysis using RNA extracted from mouse testis Mouse testis was extracted, and half of it was homogenized in 1 mL of RNA extraction reagent ISOGEN (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). RNA and impurities were separated by centrifugation of the suspension. The RNA purification process followed the manual attached to the kit. The purified RNA was dissolved in sterilized water. The thus prepared mRNA was analyzed by Northern blotting using the probe of SEQ ID NO: 2 (118 bp, corresponding to the C-terminus of TZF) corresponding to the common region of TZF and TZF-L.
ノーザンブロッティング用プローブ：
５’−ＧＴＴＣＣＡＧＡＡＧＴＣＴＴＣＡＣＡＴＴＴＴＣＡＡＡＣＧＧＡＡＧＧＡＣＴＧＡＡＧＣＡＧＡＴＧＴＴＴＣＴＧＣＴＣＣＡＧＧＡＡＴＧＣＡＧＧＧＡＴＡＧＡＡＡＣＣＡＣＡＧＡＧＡＴＴＡＴＧＧＡＡＡＴＡＡＴＧＴＧＣＧＴＣＣＴＴＧＴＧＧＣＣＡＧＴＡＧ−３’（配列番号２）
Northern blotting probes:
5'-GTTCCAGAAGTCTTCACATTTTCAAACGGAAGGACTGAAGCAGAGTTTTCTGCTCCAGGAATGCAGGGATAGAACACCAGAGAATTATGAAATAATGTGCGTCCCTTGTGCCAGTAG-3 '(SEQ ID NO: 2)
結果を図４に示す。野生型マウスおよびヘテロ接合体マウスにおいてはＴＺＦおよびＴＺＦ−ＬｍＲＮＡの存在を示すバンドが認められたのに対し、ホモ接合体マウスでは全く認められなかった。 The results are shown in FIG. Bands indicating the presence of TZF and TZF-L mRNA were observed in wild-type mice and heterozygous mice, whereas none were observed in homozygous mice.
（iii）ゲノムＤＮＡを用いたＰＣＲ解析
上記（ｉ）に記載した方法により調製したＤＮＡを用いて、ＰＣＲ解析によってホモ接合体マウス遺伝子型を確定した。ＰＣＲは上記精製ＤＮＡ １μＬをテンプレートとし、反応系を２０μＬとして６０℃ ３０秒、７２℃ １分４５秒、９４℃ ３０秒を３５サイクル行った。この際に用いたプライマーの配列は以下のとおりである。
(Iii) PCR analysis using genomic DNA Using the DNA prepared by the method described in (i) above, the homozygous mouse genotype was determined by PCR analysis. PCR was performed by using 1 μL of the purified DNA as a template and 20 μL of the reaction system for 35 cycles of 60 ° C. for 30 seconds, 72 ° C. for 1 minute 45 seconds, and 94 ° C. for 30 seconds. The primer sequences used at this time are as follows.
（ア）遺伝型解析用プライマー：
ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ（野生型ＤＮＡの検出）；
「センス（ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ ｍｕｔａｎｔと共通）」
５’−ＣＴＣＡＧＡＴＴＧＧＴＡＣＡＧＴＴＧＣＣＴＴＣＴＴＣＧＴＡＡ−３’（配列番号３）
「アンチセンス」
５’−ＴＴＣＣＡＣＴＧＧＡＣＡＣＡＧＡＴＡＣＴ−３’（配列番号４）
（イ）ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ ｍｕｔａｎｔ（変異の入ったＤＮＡの検出）；
「センス（ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌと共通）」
５’−ＣＴＣＡＧＡＴＴＧＧＴＡＣＡＧＴＴＧＣＣＴＴＣＴＴＣＧＴＡＡ−３’（配列番号３）
「アンチセンス」
５’−ＧＣＣＧＧＡＣＡＣＧＣＴＧＡＡＣＴＴＧＴ−３’（配列番号５）
(A) Genotype analysis primers:
TZF / TZF-L (detection of wild type DNA);
“Sense (Common with TZF / TZF-L Mutant)”
5′-CTCAGATTGGTACAGTGCCTTCTTCGTAA-3 ′ (SEQ ID NO: 3)
"Antisense"
5′-TTCCACTGGGACACAGATACT-3 ′ (SEQ ID NO: 4)
(A) TZF / TZF-L mutant (detection of DNA having mutation);
"Sense (shared with TZF / TZF-L)"
5′-CTCAGATTGGTACAGTGCCTTCTTCGTAA-3 ′ (SEQ ID NO: 3)
"Antisense"
5′-GCCGGACACGCTGAACTGT-3 ′ (SEQ ID NO: 5)
ＰＣＲ産物を１％アガロースゲルにより電気泳動し、エチジウムブロマイド染色により可視化した。ＤＮＡマーカーIII（ＴＯＹＯＢＯ）をサイズマーカーとして用いた。 PCR products were electrophoresed on a 1% agarose gel and visualized by ethidium bromide staining. DNA marker III (TOYOBO) was used as a size marker.
結果を図５に示す。野生型マウスではＷＴ（野生型）−ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子のバンド（１,５００ｂｐ）のみが観察されるのに対し、ホモ接合体マウスでは変異型ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子のバンド（１，５００ｂｐ）のみが観察された。ヘテロ接合体マウスでは、ＷＴ−ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子と変異型ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子の２本のバン
ドが観察された。
以上（ｉ）〜（iii）で得られた結果から、本発明の方法により得られたマウスは、ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子が破壊された、ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子ノックアウトマウスであることが確認された。
The results are shown in FIG. In the wild type mouse, only the WT (wild type) -TZF / TZF-L gene band (1,500 bp) is observed, whereas in the homozygous mouse, the mutant TZF / TZF-L gene band (1,1) is observed. Only 500 bp) was observed. In the heterozygous mouse, two bands of a WT-TZF / TZF-L gene and a mutant TZF / TZF-L gene were observed.
From the results obtained in (i) to (iii) above, it was confirmed that the mouse obtained by the method of the present invention was a TZF / TZF-L gene knockout mouse in which the TZF / TZF-L gene was disrupted. It was done.
２．ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子の機能解析
（１）ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子ノックアウトマウスの妊娠率
８週齢雄性マウス（野生型７匹、ヘテロ接合体８匹、ホモ接合体１３匹）に１匹あたり３〜４匹の８週齢雌性マウス（ｄｄｙマウス）を２週間交配させた。その後、妊娠した雌性マウスの数を集計し、雌性マウスの妊娠率を算出した。結果を図６に示す。ヘテロ接合体マウスでは妊娠率の低下は全く認められなかったのに対し、ホモ接合体マウスでは有意な妊娠率の低下が認められた（ｐ＜０.０００１）。なお、雌性ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子ノックアウトマウスでは不妊は確認されなかった（データ示さず）。
2. Functional analysis of TZF / TZF-L gene (1) Pregnancy rate of TZF / TZF-L gene knockout mice Eight weeks old male mice (7 wild type, 8 heterozygotes, 13 homozygotes) per mouse Three to four 8 week old female mice (ddy mice) were mated for 2 weeks. Thereafter, the number of pregnant female mice was counted and the pregnancy rate of female mice was calculated. The results are shown in FIG. In heterozygous mice, no decrease in pregnancy rate was observed, whereas in homozygous mice, a significant decrease in pregnancy rate was observed (p <0.0001). Infertility was not confirmed in female TZF / TZF-L gene knockout mice (data not shown).
以上の結果から、ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子は雄性マウスの生殖機能に深く関与していることが示された。また本発明のＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子ノックアウト動物は、雄性不妊のモデル動物として、雄性不妊の予防・治療用医薬のスクリーニングに有用であることが示された。 From the above results, it was shown that the TZF / TZF-L gene is deeply involved in the reproductive function of male mice. Moreover, it was shown that the TZF / TZF-L gene knockout animal of the present invention is useful as a model animal for male infertility in screening for drugs for preventing and treating male infertility.
（２）ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子ノックアウトマウスの骨量の変化
（ｉ）骨組織の摘出
生後７０日齢、１４０日齢に達した野生型マウス、ヘテロ接合型マウス、ホモ接合型マウスを、ＳＰＦ環境から取り出し頚椎脱臼法により致死させた。その後解剖し、後足の股関節を脱臼させてから後足を摘出した。骨密度測定のため、筋肉等の骨以外の組織を取り除き、１０ｍＬの７０％エタノール中で、４℃で固定した。
(2) Changes in bone mass of TZF / TZF-L gene knockout mice (i) Removal of bone tissue Wild type mice, heterozygous mice, and homozygous mice that reached 70 days of age and 140 days of age were treated with SPF. It was removed from the environment and killed by cervical dislocation. After dissection, the hip joint of the hind leg was dislocated and the hind leg was removed. For bone density measurement, tissues other than bone such as muscle were removed and fixed in 10 mL of 70% ethanol at 4 ° C.
（ii）ｐＱＣＴ（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｃｏｍｐｕｔｅｄ Ｔｏｐｏｇｒａｐｈｙ）法による骨密度の測定
ｐＱＣＴ法によるマウス大腿骨の骨密度の骨密度測定には、Ｓｔｒａｔｅｃ Ｍｅｄｉｚｉｎｔｅｃｈｎｉｋ ＧｍｂＨ社製骨密度測定装置であるＸＣＴ ＲＥＳｅａｒｃｈ ＳＡを用いた。この装置はマウス組織の横断画像を得る位置を指定でき、さらに海綿骨と皮質骨を識別して骨密度を測定することができる装置である。骨密度の測定は付属のマニュアルに従って行った。また、コリメータをマウス、ラットの摘出骨及び生体を測定できるＲＥＳｅａｒｃｈ Ｍモード（ＣＵＲ＿Ｍ、緑色）に設定した。骨密度の測定部位の決定は、マウス大腿骨遠位部に存在する成長板をＸ線の吸収値によって特定し、次に成長板から海綿骨、皮質骨それぞれ１.５mm、５.５mmの部位の断層映像を取得し、野生型マウス、ヘテロ接合型マウス、ホモ接合型マウスの骨密度を測定した。算出された海綿骨密度と皮質骨密度について、測定した日齢（７０日齢、１４０日齢）、性別ごとに分けて統計解析（一元分散分析、有意差が認められた場合には、さらに個別の２群を比較するｔ検定）を行った。
(Ii) Measurement of bone density by pQCT (peripheral Quantitative Computated Topography) method The bone density of mouse femur by pQCT method is measured using XCT RESar, a bone density measuring device manufactured by Stratec Medizintechnik GmbH. This device is a device that can specify the position at which a cross-sectional image of mouse tissue is obtained, and can measure the bone density by identifying cancellous bone and cortical bone. The bone density was measured according to the attached manual. In addition, the collimator was set to a RESearch M mode (CUR_M, green) capable of measuring mouse, rat isolated bone and living body. To determine the bone density measurement site, the growth plate existing in the distal part of the mouse femur is identified by the X-ray absorption value, and then the cancellous bone and cortical bone are 1.5 mm and 5.5 mm respectively from the growth plate. Tomographic images were obtained, and the bone density of wild-type mice, heterozygous mice, and homozygous mice was measured. The calculated cancellous bone density and cortical bone density are statistically analyzed separately for each measured age (70 days, 140 days) and sex (one-way analysis of variance. (T-test) comparing the two groups.
（iii）雌性ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子ノックアウトマウスの骨量減少
７０日齢、および１４０日齢の雄性野生型マウス、ヘテロ接合体マウス、およびホモ接合体マウスの皮質骨、および海綿骨密度を比較したが、３群間の骨密度に有意差は認められなかった（図７、Ａ、Ｂ）。
(Iii) Bone loss in female TZF / TZF-L gene knockout mice Correlation of cortical bone and cancellous bone density in 70-day and 140-day-old male wild-type, heterozygous and homozygous mice However, there was no significant difference in bone density among the three groups (FIGS. 7, A and B).
７０日齢の雌ホモ接合体マウスの皮質骨において有意な骨密度減少が認められたものの、大きな変化ではなかった（図８、Ａ）。しかし、海綿骨においては、７０日齢、１４０
日齢の両方においてヘテロ接合体マウス、ホモ接合体マウスの順に骨密度が大きく減少した（図８、Ｂ）。
Although a significant decrease in bone density was observed in the cortical bone of 70-day-old female homozygous mice, it was not a significant change (FIG. 8, A). However, in cancellous bone, 70 days old, 140
In both ages, the bone density decreased greatly in the order of heterozygous mice and homozygous mice (FIG. 8, B).
以上の結果から、ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子は雌性マウスの海綿骨形成に深く関与していることが示された。また骨量減少症および骨粗鬆症の早期には海綿骨に異常が観察されることが多く、さらに女性の閉経後に起こる骨量減少症および骨粗鬆症は、海綿骨の骨梁数減少による骨密度低下に起因することから、本発明のＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子ノックアウト動物は、前記疾患のモデル動物として、骨量減少症または骨粗鬆症の予防・治療用医薬のスクリーニングに有用であることが示された。 From the above results, it was shown that the TZF / TZF-L gene is deeply involved in cancellous bone formation in female mice. In addition, abnormalities in cancellous bone are often observed in early stages of osteopenia and osteoporosis. Furthermore, osteopenia and osteoporosis that occurs after menopause in women are caused by a decrease in bone density due to a decrease in the number of trabecular bone. Therefore, it was shown that the TZF / TZF-L gene knockout animal of the present invention is useful as a model animal for the above-mentioned diseases in screening for a drug for prevention / treatment of osteopenia or osteoporosis.
Claims (10)
（１）ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子ターゲティングベクターを作製する工程、
（２）前記ターゲティングベクターをＥＳ細胞に導入し、相同組み換えＥＳ細胞を作製する工程、
（３）前記相同組み換えＥＳ細胞を妊娠した雌から得た胚に挿入し、キメラ胚を作製する工程、
（４）前記キメラ胚を偽妊娠させた雌の子宮に移植し、キメラ動物を作製する工程、
（５）前記キメラ動物を同種動物と交配させ、Ｆ１ヘテロ接合体を作製する工程、および
（６）前記Ｆ１ヘテロ型産仔同士を交配させ、Ｆ２ホモ接合体を作製する工程。 The method for producing a TZF / TZF-L gene knockout non-human mammal according to any one of claims 1 to 7, comprising the following steps (1) to (6).
(1) producing a TZF / TZF-L gene targeting vector;
(2) introducing the targeting vector into ES cells to produce homologous recombinant ES cells;
(3) inserting the homologous recombinant ES cell into an embryo obtained from a pregnant female to produce a chimeric embryo,
(4) Transplanting the chimeric embryo into a pseudo-pregnant female uterus to produce a chimeric animal,
(5) a step of mating the chimeric animal with the same species to produce an F1 heterozygote, and (6) a step of mating the F1 heterozygous offspring to produce an F2 homozygote.
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