【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、標識レセプタまたは標識リガンドを化学発光法（ケミカルルミネッサンス法）により検出する方法に関し、詳しくは多孔性の吸着性領域を有する生化学解析用ユニットを利用して、標識レセプタまたは標識リガンドを化学発光法により検出する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
近年、スライドガラス板やメンブレンフィルタなどを用いたガラスアレイやメンブレンアレイの担体表面上の異なる位置に、リガンドまたはレセプタ（ホルモン類、腫瘍マーカー、酵素、抗体、抗原、アブザイム、その他のタンパク質、核酸、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡなど、生体由来の物質と特異的に結合可能で、かつ、塩基配列や塩基の長さ、組成、特性などが既知の物質）を含む溶液を滴下して多数のスポット状領域を形成し、放射線標識物質、蛍光標識物質、化学発光基質と接触させることによって化学発光を生じさせる標識物質などによって標識された標識レセプタまたは標識リガンド（ホルモン類、腫瘍マーカー、酵素、抗体、抗原、アブザイム、その他のタンパク質、核酸、ＤＮＡ、ｍＲＮＡなどの抽出、単離などによって生体から採取された、あるいは、採取された後に化学的処理が施された物質であって、上記標識物質などによって標識された物質）を、スポット状領域に含まれているリガンドまたはレセプタにハイブリダイズ等させてリガンドまたはレセプタと特異的に結合させ、多数のスポット状領域に選択的に含まれている放射性標識物質によって蓄積性蛍光体シートの輝尽性蛍光体層を露光し、露光された輝尽性蛍光体層を励起光によって走査して、輝尽性蛍光体層に含まれている輝尽性蛍光体を励起し、輝尽性蛍光体から放出された輝尽光を光電的に検出、あるいは、多数のスポット状領域を励起光によって走査して多数のスポット状領域に選択的に含まれている蛍光物質を励起し、蛍光物質から放出された蛍光を光電的に検出、あるいは、多数のスポット状領城に選択的に含まれている標識物質を化学発光基質と接触させて、標識物質から放出される化学発光を光電的に検出する生化学解析システムが開発されている。
【０００３】
これらの解析システムによれば、メンブレンフィルタなどの担体表面上の異なる位置に、数多くのリガンドまたはレセプタのスポットを高密度に形成して、蛍光標識物質によって標識されたレセプタまたはリガンドをハイブリダイズさせること等によって、短時間で生体由来の物質を解析することが可能になるという利点がある。
【０００４】
上記解析システムにおいても、充分な精度で検出できることはもちろん、検出限界の向上や再現性が要求されている。しかし、上述の蛍光標識物質を利用した解析システムは、検出感度が低いために発現解析に必要な標識レセプタまたは標識リガンドを大量に必要とする。また、ガラスアレイ上に固定化できるリガンドまたはレセプタの量が少ない上、解析操作の工程でアレイ上に固定化されたリガンドまたはレセプタが剥がれ落ちる等の問題がある。
【０００５】
【特許文献１】
特許第２８３７２７６号公報
【０００６】
【非特許文献１】
「ｎａｔｕｒｅ ｇｅｎｅｔｉｃｓ」Ｖｏｌ．２１， ｐ．２５−ｐ．３２（１９９９）
【０００７】
【非特許文献２】
「バイオインダストリー」Ｖｏｌ．１８， ｐ．１３−ｐ．１９（２００１）
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
従来、上記解析システムにおいては、ハイブリダイゼーション等を行う際に、実験者が手作業で、リガンドまたはレセプタが固定されたアレイをハイブリダイゼーションバッグ内に入れ、ハイブリダイゼーションバッグ内に標識レセプタまたは標識リガンドを含む反応溶液を加え、ハイブリダイゼーションバッグに振動を加えて標識レセプタまたは標識リガンドを対流あるいは拡散によって移動させて、リガンドまたはレセプタに標識レセプタまたは標識リガンドを特異的に結合させるいわゆる振盪方式によって行うのが一般的であった。
【０００９】
しかし、振盪方式の場合、ハイブリダイゼーション反応溶液中の標識レセプタまたは標識リガンドをリガンドまたはレセプタを含む多数のスポット状領域に、効率よく拡散させることは困難であり、リガンドまたはレセプタと標識レセプタまたは標識リガンドとを効率的にハイブリダイズさせることができないという問題がある。ハイブリダイゼーション反応溶液中の標識レセプタまたは標識リガンドをリガンドまたはレセプタを含む多数のスポット状領域に効率的に拡散させることができないと、標識レセプタまたは標識リガンドが結合していないスポット状領域の発光量（ノイズあるいはバックグラウンド）に対する、標識レセプタまたは標識リガンドが結合した量に対応する発光量（信号）の比（Ｓ／Ｎ比）が小さく、スポット状領域に結合する標識レセプタまたは標識リガンドが微量となると検出することが困難になるという問題がある。
【００１０】
標識レセプタまたは標識リガンドをスポット状領域の内部にまで充分に浸透させるためには、反応溶液を強制的にスポット状領域内部に循環させればいいと考えられるが、化学発光法において反応溶液を強制的にスポット状領域内部に循環させると、バックグラウンドの発光量が上昇し検出限界が低下するという問題が生じる。
【００１１】
本発明は上記事情に鑑みなされたものであり、反応溶液を強制的にスポット状領域内部に循環させても、バックグラウンドの発光量を上昇させることがなく、解析対象物質である標識レセプタまたは標識リガンドが微量であっても検出することが可能な生化学解析用ユニットを利用した化学発光法を提供することを目的とするものである。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明の生化学解析用ユニットを利用した化学発光法は、リガンドまたはレセプタが結合された多孔性の吸着性領域を有する生化学解析用ユニットの前記リガンドまたはレセプタに標識物質により標識された標識レセプタまたは標識リガンドを特異的に結合させ、酵素標識抗体に対するブロッキングバッファを前記吸着性領域を横切るように強制的に流動させ、前記酵素標識抗体を前記吸着性領域を横切るように強制的に流動させて前記標識レセプタまたは標識リガンドと特異的に結合させ、該標識レセプタまたは標識リガンドと特異的に結合した前記酵素標識抗体に化学発光基質を反応させる化学発光法において、前記ブロッキングバッファの塩濃度を０．６Ｍ以上析出限度濃度未満とすることを特徴とする方法である。
【００１３】
前記ブロッキングバッファの塩濃度は、０．６Ｍ〜４Ｍの範囲とすることが好ましい。ここで、塩濃度は生化学解析用ユニットを利用した化学発光法においてブロッキングバッファを通常使用する際の温度における濃度である。
【００１４】
【発明の効果】
従来、酵素標識抗体に対するブロッキングバッファは一般的に塩濃度が０．１５Ｍに調整されており、反応溶液を強制的に吸着性領域内部に循環させる化学発光法においてこれを用いると、バックグラウンドの発光量が上昇し検出限界が低下する傾向にあった。
【００１５】
本発明の生化学解析用ユニットを利用した化学発光法では、酵素標識抗体に対するブロッキングバッファの塩濃度を０．６Ｍ以上析出限度濃度未満とすることによって、反応溶液を強制的に吸着性領域内部に循環させる化学発光法においてもバックグラウンドの発光量を低減させることができるので、検出限界を向上させることができ、標識レセプタまたは標識リガンドが微量であってもＳ／Ｎ比の大きい検出を行うことができる。
【００１６】
【発明の実施の形態】
以下、図面を参照して本発明の実施の形態について説明する。図１は本発明のの化学発光法に用いられる生化学解析用ユニットの概略斜視図である。図１に示す生化学解析用ユニット１は、孔３が複数設けられた基板２と、孔３の内部に充填され、多孔性材料が基板２と接着された吸着性領域４とからなる。この吸着性領域４には、構造または特性が既知のリガンドまたはレセプタ５が滴下され、その後の処理により固定化されている。
【００１７】
基板２の材質としては、生化学解析用ユニット内部での光の散乱を防止するために、光を透過させないか、減衰させる材質が好ましく、金属、セラミックが好ましい。また、孔を開ける加工が容易であるプラスチックを基板として用いる場合は、光をより一層減衰させるために、粒子をプラスチック内部に分散させることが好ましい。
【００１８】
金属としては、銅、銀、金、亜鉛、鉛、アルミニウム、チタン、錫、クロム、鉄、ニッケル、コバルト、タンタルあるいは、ステンレス鋼や黄銅などの合金が好ましくあげられる。セラミックとしては、アルミナ、ジルコニア、マグネシア、石英などが好ましくあげられる。プラスチックとしては、ポリエチレンやポリプロピレンなどのポリオレフィン、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレートなどのアクリル樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリフッ化ビニリデン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリクロロトリフルオロエチレン、ポリカーボネート、ポリエチレンナフタレートやポリエチレンテレフタレートなどのポリエステル、ナイロン−６やナイロン−６，６などの脂肪族ポリアミド、ポリイミド、ポリスルフォン、ポリフェニレンサルファイド、ポリジフェニルシロキサンなどのケイ素樹脂、ノボラックなどのフェノール樹脂、エポキシ樹脂、ポリウレタン、酢酸セルロースやニトロセルロースなどのセルロース類、ブタジエン−スチレン共重合体などのコポリマー、さらにはプラスチックをブレンドしたものなどが好ましくあげられる。
【００１９】
基板２に開ける孔３の開口部の面積（サイズ）は、孔３の密度を高めるために、一般には５ｍｍ２ 未満であり、好ましくは１ｍｍ２ 未満であり、０．３ｍｍ２ 未満がより好ましく、さらには０．０１ｍｍ２ 未満であることが好ましい。そして、より好ましくは０．００１ｍｍ２ 以上であることが好ましい。
【００２０】
孔３のピッチ（隣接する二つの孔の中心から中心までの距離）は０．０５〜３ｍｍの範囲であることが好ましく、孔３の間隔（隣接する二つの孔の端部から端部までの最短距離）は、０．０ｌ〜１．５ｍｍの範囲であることが好ましい。孔３の数（密度）は、一般には１０個／ｃｍ２ 以上であり、好ましくは１００個／ｃｍ２ 以上、より好ましくは５００個／ｃｍ２ 以上、さらには１０００個／ｃｍ２ 以上であることが好ましい。そして、好ましくは１０００００個／ｃｍ２ 以下、さらには１００００個／ｃｍ２ 以下であることが好ましい。なお、必ずしも、孔３は全て図１に示したように等間隔で設けられている必要はなく、幾つかのブロック（単位）に別れてブロック毎に複数の孔が設けられていてもよい。
【００２１】
本発明において、吸着性領域を形成する多孔性材料としては、多孔質材料あるいは繊維材料が好ましく使用される。また、多孔質材料と繊維材料とを併用して吸着性領域を形成することもできる。本発明において、吸着性領域を形成するために使用される多孔性材料は、有機材料、無機材料のいずれでもよく、有機／無機複合体でもよい。
【００２２】
吸着性領域を形成するために使用される有機多孔質材料は、特に限定されるものではないが、活性炭などの炭素多孔質材料あるいはメンブレンフィルタを形成可能な多孔質材料が好ましく用いられる。メンブレンフィルタを形成可能な多孔質材料としては、溶媒に溶解可能なポリマーが好ましく用いられる。溶媒に溶解可能なポリマーとしては、セルロース誘導体（例えば、ニトロセルロース、再生セルロース、セルロースアセテート、酢酸セルロース、酪酸酢酸セルロースなど）、脂肪族ポリアミド類（例えば、ナイロン６、ナイロン６，６、ナイロン４，１０など）、ポリオレフィン類（例えば、ポリエチレン、ポリプロピレンなど）、含塩素ポリマー類（例えば、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデンなど）、フッ素樹脂類（例えば、ポリフッ化ビニリデン、ポリテトラフルオライドなど）、ポリカーボネート、ポリスルフォン、アルギン酸及びその誘導体（例えば、アルギン酸、アルギン酸カルシウム、アルギン酸／ポリリシンポリイオンコンプレックスなど）、コラーゲンなどがあげられ、これらポリマーの共重合体や複合体（混合体）も用いることができる。
【００２３】
また、吸着性領域を形成するための繊維材料としては、特に限定されるものではないが、好ましくは前述したセルロース誘導体類、脂肪族ポリアミド類などがあげられる。
【００２４】
吸着性領域を形成するために使用される無機多孔質材料は、特に限定されるものではないが、好ましくは、金属（例えば、白金、金、鉄、銀、ニッケル、アルミニウムなど）、金属等の酸化物（例えば、アルミナ、シリカ、チタニア、ゼオライトなど）、金属塩（例えぱ、ヒドロキシアパタイト、硫酸カルシウムなど）及びこれらの複合体などがあげられる。
【００２５】
基板２に複数の孔３を開ける方法としては、ピンで打ち抜くパンチング、電極に高電圧をパルス状に印加して基板を揮発する放電加工、エッチング、レーザー照射などがあげられる。基板の材料が、金属材料またはプラスチック材料の場合は、基板の表面にコロナ放電またはプラズマ放電を施して接着剤を塗工した後、吸着性領域を形成するための多孔性材料をプレスなどの手段により貼り合わせることで生化学解析用ユニットが作製される。貼り合わせる際に、吸着性領域を形成するための多孔性材料を加熱して軟化すると、孔内部に吸着性領域が容易に形成される。また、基板に吸着性領域を形成するための多孔性材料をプレスする場合には、基板と吸着性領域を形成するための材料を、事前に１枚毎に分割してから間欠的にプレスしてもよいし、基板と吸着性領域を形成するための材料をそれぞれ長尺帯状としたものを２つのロール間に連続搬送してもよい。
【００２６】
なお、本発明の生化学解析用ユニットを利用した化学発光法においては、上記の材料や方法によって作製した生化学解析用ユニットを使用することも可能であるが、市販されている生化学解析用ユニットを用いてもよく、また多孔性の吸着性領域にリガンドまたはレセプタがすでに結合されている生化学解析用ユニットを用いることも可能である。
【００２７】
図２は、本発明の生化学解析用ユニットを利用した化学発光法に用いられるリアクタ（反応装置）の一の実施の形態を示す概略断面図である。リアクタは、反応容器１０と流動手段２０とからなり、反応容器１０は、反応容器上半部１３と反応容器下半部１４とからなり、反応容器上半部１３は反応容器下半部１４に取り外し可能に設けられている。また、反応容器１０は、リガンドまたはレセプタが結合された多孔性の吸着性領域を有する生化学解析用ユニット１を内部に着脱可能に取り付ける、上側挟持片１１と下側挟時片１２からなる取付部を有し、生化学解析用ユニット１は反応容器上半部１３を取り外すことによってセットすることができるように構成されている。さらに、反応容器下半部１４の底壁には反応溶液が流通可能な溶液流入口１５が形成され、反応容器上半部１３の頂壁には同様に反応溶液が流通可能な溶液流出口１６が形成されている。
【００２８】
流動手段２０は溶液循環パイプ２１とポンプ２２から構成され、溶液循環パイプ２１の一端は反応容器１０の溶液流入口１５に、他端は溶液流出口１６に取り外し可能に取り付けられている。反応溶液はポンプ２２によって溶液流入口１５から反応容器１０内に入り、生化学解析用ユニット１の吸着性領域４を横切るように強制的に流動した後、溶液流出口１６から出て、溶液循環パイプ２１を通って循環するように構成されている。
【００２９】
図３は、本発明の生化学解析用ユニットを利用した化学発光法に用いられるリアクタの別の実施の形態を示す概略断面図である。このリアクタは、図２に示すポンプの代わりにシリンジ２３とピストン２４が設けられているもので、反応溶液が反応容器内で往復流動するように構成したものである。このように、反応溶液の強制的流動は、生化学解析用ユニット１の吸着性領域４を往復流動するものであってもよい。
【００３０】
なお、図２および図３はともに、反応溶液が生化学解析用ユニットを循環するタイプのリアクタを示しているが、反応溶液が生化学解析用ユニットの下から上（あるいは上から下）に通過するのみで、反応溶液が循環しないタイプのリアクタを用いることも可能である。
【００３１】
次に、本発明の生化学解析用ユニットを利用した化学発光法を順を追って説明する。
本発明の生化学解析用ユニットを利用した化学発光法では、まず、多孔性の吸着性領域を有する生化学解析用ユニットの吸着性領域にリガンドまたはレセプタを結合させる。
【００３２】
多孔性の吸着性領域に結合されるリガンドまたはレセプタは、ホルモン類、腫瘍マーカー、酵素、抗体、抗原、アブザイム、その他のタンパク質、核酸、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡなどであって、特性、組成、構造あるいは塩基配列や塩基の長さなどが既知のものである。リガンドまたはレセプタは、吸着性領域に滴下した後、紫外線の照射などによって吸着性領域に固定することができる。なお、上述したように、多孔性の吸着性領域にリガンドまたはレセプタがすでに結合されている生化学解析用ユニットを用いる場合には、この段階は省略される。
【００３３】
次に、吸着性領域に結合されたリガンドまたはレセプタに標識レセプタまたは標識リガンドを特異的に結合させる。標識レセプタまたは標識リガンドは、多孔性の吸着性領域に結合されるリガンドまたはレセプタと特異的に結合するホルモン類、腫瘍マーカー、酵素、抗体、抗原、アブザイム、その他のタンパク質、核酸、ＤＮＡ、ｍＲＮＡなどの抽出、単離などによって生体から採取された、あるいは、採取された後に化学的処理が施され、標識物質によって標識されたものである。レセプタまたはリガンドを標識する標識物質としては、ジゴキシゲニン、ビオチン、アビジン、フルオロセインなどの抗原、及びこれらの抗原に対する抗体などを好ましくあげることができる。また、ビオチンに対するアビジンのような生物学的結合パートナーであってもよい。
【００３４】
なお、標識レセプタまたは標識リガンドが、多孔性の吸着性領域に結合されているリガンドまたはレセプタとではなく、生化学解析用ユニットに設けられた吸着性領域に直接結合または吸着することを防止するために、標識レセプタまたは標識リガンドを含む溶液を生化学解析用ユニットに接触させる前に、いわゆるブロッキング剤を生化学解析用ユニットの吸着性領域に接触させておくことが好ましい。ブロッキング剤は、後述する酵素標識抗体と同様に濾過して用いることが好ましい。
【００３５】
標識レセプタまたは標識リガンドを多孔性の吸着性領域に結合されているリガンドまたはレセプタと特異的に結合させた後、生化学解析用ユニットを上記図２または図３等に示す、反応溶液を吸着性領域を横切るように強制的に流動させることが可能な反応容器に取り付ける。なお、標識レセプタまたは標識リガンドが吸着性領域を閉塞させるようなものではない、例えば標識ＤＮＡのような場合には、吸着性領域に結合したリガンドまたはレセプタに標識レセプタまたは標識リガンドを特異的に結合させる段階から生化学解析用ユニットを反応容器に取り付けてもよい。この場合には、吸着性領域に結合されているリガンドまたはレセプタに、標識レセプタまたは標識リガンドを効率的かつ均一に接触させることができるので、標識レセプタまたは標識リガンドの検出限界を向上させることができるとともに、標識レセプタまたは標識リガンドが微量であっても、よりＳ／Ｎ比の大きい検出を行うことができる。
【００３６】
また、多孔性の吸着性領域に結合されているリガンドまたはレセプタと標識レセプタまたは標識リガンドを特異的に結合する段階から、標識レセプタまたは標識リガンドに酵素標識抗体に特異的に結合する段階まで、吸着性領域にそれぞれの反応溶液を強制的に流動させる方法により行うことができるので、工程を単純化することができるとともに、より精度の高い検出が可能となる。
【００３７】
なお、多孔性の吸着性領域に結合されているリガンドまたはレセプタと標識レセプタまたは標識リガンドを特異的に結合する段階から、上記図２または図３等に示す反応容器等を用いて標識レセプタまたは標識リガンドを含む反応溶液を強制的に流動させて行う場合には、その前段階のブロッキング剤を生化学解析用ユニットの吸着性領域に接触させる段階も、反応容器を用いて、ブロッキング剤を含む反応溶液を強制的に流動させて行うことが可能である。このようにすれば、工程を単純化することができるとともに、より正確で、再現性、定量性に優れたデータを得ることが可能となる。
【００３８】
反応容器に取り付けた生化学解析用ユニットは、多孔性の吸着性領域に結合されているリガンドまたはレセプタに特異的に結合しなかった標識レセプタまたは標識リガンドを除去するために、吸着性領域にいわゆる洗浄液を強制的に流動させて洗浄することが好ましい。吸着性領域を洗浄液が強制的に流動するので、多孔性の吸着性領域に結合されているリガンドまたはレセプタに特異的に結合していない標識レセプタまたは標識リガンドを、効率的に剥離させ、除去することが可能になり、洗浄効率を大幅に向上することができる。
【００３９】
なお、この洗浄工程は、後述する酵素標識抗体を吸着性領域を横切るように強制的に流動させて標識レセプタまたは標識リガンドと特異的に結合させた後、特異的に結合しなかった酵素標識抗体を除去する場合にも行うことが好ましい。これによって、標識レセプタまたは標識リガンドと特異的に結合していない酵素標識抗体を、効率的に剥離させ、除去することが可能になり、洗浄効率を大幅に向上することができる。
【００４０】
吸着性領域に結合したリガンドまたはレセプタに特異的に結合した標識レセプタまたは標識リガンドに酵素標識抗体を結合させる前に、酵素標識抗体に対するブロッキングバッファを吸着性領域を横切るように強制的に流動させて吸着性領域をブロッキングする。ブロッキングバッファには、塩濃度が０．６Ｍ以上析出限度濃度未満、好ましくは０．６Ｍ〜４Ｍの範囲に調整されたものを用いる。従来の酵素標識抗体に対するブロッキングバッファは一般的に塩濃度が０．１５Ｍに調整されている。これは生理的塩濃度（等張液）のためであるが、これを０．６Ｍ以上に引き上げることによって、バックグラウンドを低下させることができることを見いだしたものである。塩濃度は高い方がよりバックグラウンドを低下させる効果があるが、ある程度以上の濃度になると、ブロッキングバッファへの溶解性が悪くなり実際の使用時に析出してくる可能性があるため、ブロッキングバッファを通常使用する際の温度において析出限度濃度未満の濃度に調整する。塩としては入手のしやすさ、取り扱いの容易さからＮａＣｌ，ＫＣｌなどが好ましい。
【００４１】
次に、酵素標識抗体を吸着性領域を横切るように強制的に流動させて標識レセプタまたは標識リガンドと特異的に結合させるが、酵素標識抗体は吸着性領域の孔径よりも小さい孔径のフィルターで濾過したものを用いることが好ましい。酵素標識抗体は凝集しやすいため多孔性の吸着性領域に詰まる場合があるが、このように濾過することで吸着性領域の内部にまで充分に酵素標識抗体を浸透させることができる。また、酵素標識抗体は、上述の酵素標識抗体に対するブロッキングバッファで希釈して用いることが好ましい。この場合においても上述の塩濃度に調整されたブロッキングバッファを用いることが好ましい。
【００４２】
酵素標識抗体は、標識レセプタまたは標識リガンドの標識物質に対する抗体（標識レセプタまたは標識リガンドが抗体である場合には抗原）を酵素で標識したものである。酵素標識抗体の酵素としては、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼなどの酵素を好ましく用いることができる。
【００４３】
続いて、生化学解析用ユニットを反応容器から取り出して、標識レセプタまたは標識リガンドと特異的に結合した酵素標識抗体に化学発光基質を接触させる。酵素標識抗体に反応させる化学発光基質は、酵素がアルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼである場合には、特に限定するものではないが、それぞれジオキセタン、ルミノール、ルシフェリンを用いることができる。
【００４４】
化学発光基質と酵素との接触によって可視光波長領域の化学発光を生ずるので、これを光電的に検出して生化学解析用画像データを生成すれば、標識レセプタまたは標識リガンドを検出、測定することができる。
以下に本発明を実施例により具体的に説明する。
【００４５】
【実施例】
（実施例１）
大きさが８０ｍｍ×８０ｍｍ、厚み１００μｍのＳＵＳ３０４シート（基板材料シート）に、孔径０．２ｍｍの開口部が円形の微細孔を、エッチングによって孔ピッチ０．３ｍｍ、孔間隔０．１ｍｍで、１０×１０個を一単位として計６４００個形成した。
【００４６】
次に、ナイロン６（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）１４部、ギ酸６６部、水２０部を均一に溶解して、多孔性の吸着性領域形成材料の溶液を調整した。この溶液を安定した溶液状態で、乾燥膜の厚みが１６０μｍになるように、基板材料シート上にキャスティングコーターにより流延して貫通孔内に溶液を注入した後、ブレードにより基板材料シート表面の余分な溶液を掻き落とした。続いて、直ちに、基板材料シートをギ酸４０％水溶液を満たした凝固槽に浸漬して、貫通孔内の膜内に多数の微細孔を形成した。その後、水洗、乾燥してステンレス障壁と多数孔のポリマー充填領域とからなる生化学解析用ユニットを作製した。
【００４７】
ＴＥバッファに溶解した分子量マーカーｐＢＲ３２８／ＢｇＩＩ，ＨｉｎｆＩ（２５０ｎｌ／μｇ）を５分煮沸後、１分間氷冷しｐＢＲ３２８／ＢｇＩＩ，ＨｉｎｆＩを１本鎖とした。これを上記で作製した生化学解析用ユニットの吸着性領域にスポットし、その後紫外線照射（２５４ｎｍ、３３ｍＪ／ｃｍ２ ）して、吸着性領域に１本鎖のｐＢＲ３２８／ＢｇＩＩ，ＨｉｎｆＩを固定した。
【００４８】
次にジゴキシゲニン（ＤＩＧ）で標識されたｐＢＲ３２８−ＤＮＡ溶液（ロッシュ社製）１０ｐｇを熱変性し、ハイブリダイゼーションバッファ（０．５ＭＣｈｕｒｃｈリン酸バッファ（０．５Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４をＨ３ＰＯ４でｐＨ７．２に調整したもの），１ｍＭ ＥＤＴＡ，７％ＳＤＳ）５ｍｌに添加した。
【００４９】
上記生化学解析用ユニットを図２に示す反応容器に固定し、６８℃のプレハイブリダイゼーションバッファ（上記ハイブリダイゼーションバッファと同じもの）５ｍｌを１時間循環させた（線速度０．２ｃｍ／ｓｅｃ）。次に、６５℃のＤＩＧ標識ｐＢＲ３２８−ＤＮＡ溶液が添加されたハイブリダイゼーションバッファを１８時間循環させてハイブリダイゼーションを行った。続いて、洗浄バッファ１（４０ｍＭ Ｃｈｕｒｃｈリン酸バッファ，１％ＳＤＳ）で５分間２回、洗浄バッファ２（０．１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ）で５分間２回循環洗浄した（バッファ温度はいずれも６８℃）。
【００５０】
その後、ロッシュ社製ＤＩＧ、Ｗａｓｈ ａｎｄ Ｂｌｏｃｋ ｂｕｆｆｅｒ Ｓｅｔ に記載の１０×ブロッキングバッファを０．１Ｍマレイン酸、０．６ＭＮａＣｌ液にて１×に調整した。ＤＩＧウオッシュバッファ（ロッシュ社製ＤＩＧ、Ｗａｓｈ ａｎｄ Ｂｌｏｃｋ ｂｕｆｆｅｒ Ｓｅｔ に記載のもの）を５分間循環させた後、この調整済み１×ブロッキングバッファを室温で１０分間循環した後、５０分間循環を停止した。
【００５１】
次に、アルカリホスファターゼ標識ＤＩＧ抗体をあらかじめ、孔径０．２２μｍのウルトラフリー（ミリポア社製）にて濾過し、濃度が１／１００００となるように塩濃度を調整したブロッキングバッファで希釈し、これを１分間循環した後、６０分間停止した。
【００５２】
続いて、ケミルミ洗浄液（ロッシュ社製ＤＩＧ、Ｗａｓｈ ａｎｄ Ｂｌｏｃｋ ｂｕｆｆｅｒ Ｓｅｔ に記載のもの）を１５分間循環させた。これを３回繰り返し、ディテクションバッファ（ロッシュ社製ＤＩＧ、Ｗａｓｈ ａｎｄ Ｂｌｏｃｋ ｂｕｆｆｅｒ Ｓｅｔ に記載のもの）でｐＨ調整した後、最後に化学発光基質であるＣＤＰ−ｓｔａｒ（ＣＤＰ−ｓｔａｒ，ｒｅａｄ ｔｏ ｕｓｅ）を含む溶液と１時間反応させて、ＬＡＳ１０００（富士写真フィルム社製）にて生化学解析ユニットの吸着性領域の発光量を検出した。
【００５３】
（実施例２）
ブロッキングバッファのＮａＣｌ濃度を２．４Ｍに調整した以外は実施例１と同様にして発光量を検出した。
【００５４】
（実施例３）
ブロッキングバッファのＮａＣｌ濃度を４．０Ｍに調整した以外は実施例１と同様にして発光量を検出した。
【００５５】
（実施例４）
ブロッキングバッファに添加するＮａＣｌをＫＣｌに換えた以外は実施例１と同様にして発光量を検出した。
【００５６】
（実施例５）
ブロッキングバッファに添加するＮａＣｌをＫＣｌに換えた以外は実施例３と同様にして発光量を検出した。
【００５７】
（比較例１）
ＮａＣｌ濃度が０．１５Ｍのブロッキングバッファを用いた以外は実施例１と同様にして発光量を検出した。
【００５８】
（比較例２）
ＫＣｌ濃度が０．１５Ｍのブロッキングバッファを用いた以外は実施例４と同様にして発光量を検出した。
【００５９】
実施例１〜実施例５と比較例１および２の塩、塩濃度、バックグラウンドの発光量をまとめたものを表１に示す。
【００６０】
【表１】
【００６１】
表１から明らかなように、本発明の塩濃度が０．６Ｍ〜４．０Ｍに調整されたブロッキングバッファを用いた検出では、従来一般的に用いられている、塩濃度が０．１５Ｍのブロッキングバッファを用いた検出に比較して、バックグラウンドの発光量が低下した。
【００６２】
以上のように、本発明の生化学解析用ユニットを利用した化学発光法では、酵素標識抗体に対するブロッキングバッファの塩濃度を０．６Ｍ以上析出限度濃度未満としたので、反応溶液を強制的に吸着性領域内部に循環させる化学発光法においてもバックグラウンドの発光量を低減させることができた。これによって、検出限界を向上させることが可能となり、標識レセプタまたは標識リガンドが微量であってもＳ／Ｎ比の大きい検出を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の化学発光法に用いられる生化学解析用ユニットの概略斜視図
【図２】本発明の生化学解析用ユニットを利用した化学発光法に用いられるリアクタの実施の形態を示す概略断面図
【図３】本発明の生化学解析用ユニットを利用した化学発光法に用いられるリアクタの別の実施の形態を示す概略断面図
【符号の説明】
１ 生化学解析用ユニット
２ 基板
３ 孔
４ 吸着性領域
５ リガンドまたはレセプタ[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for detecting a labeled receptor or a labeled ligand by a chemiluminescence method (chemical luminescence method), and more specifically, using a biochemical analysis unit having a porous adsorptive region, the labeled receptor or the labeled ligand. The present invention relates to a method for detecting the above by chemiluminescence method.
[0002]
[Prior art]
In recent years, ligands or receptors (hormones, tumor markers, enzymes, antibodies, antigens, abzymes, other proteins, nucleic acids, glass arrays using membranes such as glass slides or membrane filters on different positions on the carrier surface of membrane arrays) Many spot-like regions are dropped by dropping a solution containing a substance that can specifically bind to biologically derived substances such as cDNA, DNA, RNA, etc. and has a known base sequence, base length, composition, characteristics, etc. Labeled receptors or labeled ligands (hormones, tumor markers, enzymes, antibodies, antigens, etc.) labeled with a radiolabeled substance, a fluorescently labeled substance, a labeling substance that produces chemiluminescence by contacting with a chemiluminescent substrate, etc. Abzyme, other proteins, nucleic acids, DNA, mRNA, etc. Or a substance that has been collected from or chemically treated after being collected and labeled with the labeling substance or the like) is hybridized to a ligand or receptor contained in the spot-like region, etc. Then, the stimulable phosphor layer of the stimulable phosphor sheet is exposed by the radioactive labeling substance that is specifically bound to the ligand or receptor and is selectively contained in a large number of spot-like regions. The stimulable phosphor layer is scanned with excitation light, the stimulable phosphor contained in the stimulable phosphor layer is excited, and the photostimulated light emitted from the stimulable phosphor is photoelectrically detected. Alternatively, a large number of spot-like areas are scanned with excitation light to excite fluorescent substances selectively contained in the many spot-like areas, and fluorescence emitted from the fluorescent substances is detected photoelectrically, or The The labeling substance to Tsu bets like Ryojo contained selectively in contact with the chemiluminescent substrate, biochemical analysis system for detecting chemiluminescent emission released from the labeling substance photoelectrically have been developed.
[0003]
According to these analysis systems, a large number of spots of ligands or receptors are formed at different positions on the surface of a carrier such as a membrane filter, and the receptors or ligands labeled with a fluorescent labeling substance are hybridized. Etc., there is an advantage that it is possible to analyze a substance derived from a living body in a short time.
[0004]
Even in the above analysis system, not only detection with sufficient accuracy but also improvement in detection limit and reproducibility are required. However, the analysis system using the fluorescent labeling substance described above requires a large amount of labeled receptor or labeled ligand necessary for expression analysis because of its low detection sensitivity. In addition, there is a problem that the amount of ligand or receptor that can be immobilized on the glass array is small, and the ligand or receptor immobilized on the array is peeled off in the analysis operation step.
[0005]
[Patent Document 1]
Japanese Patent No. 2837276
[0006]
[Non-Patent Document 1]
"Nature genetics" Vol. 21, p. 25-p. 32 (1999)
[0007]
[Non-Patent Document 2]
“Bioindustry” Vol. 18, p. 13-p. 19 (2001)
[0008]
[Problems to be solved by the invention]
Conventionally, in the above analysis system, when performing hybridization or the like, an experimenter manually places an array on which a ligand or receptor is fixed in a hybridization bag, and puts a labeled receptor or labeled ligand in the hybridization bag. It is carried out by a so-called shaking method in which the reaction solution is added, the labeled bag or labeled ligand is moved by convection or diffusion by shaking the hybridization bag, and the labeled receptor or labeled ligand is specifically bound to the ligand or receptor. It was general.
[0009]
However, in the case of the shaking method, it is difficult to efficiently diffuse the labeled receptor or labeled ligand in the hybridization reaction solution to a large number of spot-like regions containing the ligand or receptor. The ligand or receptor and the labeled receptor or labeled ligand are difficult to diffuse. Cannot be efficiently hybridized. If the labeled receptor or labeled ligand in the hybridization reaction solution cannot be efficiently diffused into a large number of spot-like regions containing the ligand or receptor, the amount of light emitted from the spot-like region to which the labeled receptor or labeled ligand is not bound ( When the ratio (S / N ratio) of the luminescence amount (signal) corresponding to the amount of the labeled receptor or labeled ligand bound to the noise or background is small, and the amount of the labeled receptor or labeled ligand bound to the spot-like region is very small There is a problem that it is difficult to detect.
[0010]
In order to fully penetrate the labeled receptor or labeled ligand into the spot-like region, it may be necessary to forcibly circulate the reaction solution inside the spot-like region. If the light is circulated inside the spot-like region, the amount of light emitted in the background increases and the detection limit decreases.
[0011]
The present invention has been made in view of the above circumstances, and even if the reaction solution is forcibly circulated inside the spot-like region, the amount of luminescence in the background is not increased, and the labeled receptor or the label as the analysis target substance It is an object of the present invention to provide a chemiluminescence method using a biochemical analysis unit that can be detected even if the amount of ligand is very small.
[0012]
[Means for Solving the Problems]
The chemiluminescence method using the biochemical analysis unit of the present invention is a labeled receptor in which the ligand or receptor of the biochemical analysis unit having a porous adsorptive region bound with a ligand or receptor is labeled with a labeling substance. Alternatively, a labeled ligand is specifically bound, a blocking buffer for the enzyme-labeled antibody is forced to flow across the adsorptive region, and the enzyme-labeled antibody is forced to flow across the adsorptive region. In the chemiluminescence method in which a chemiluminescent substrate is reacted with the enzyme-labeled antibody specifically bound to the labeled receptor or the labeled ligand and specifically bound to the labeled receptor or the labeled ligand, the salt concentration of the blocking buffer is set to 0. It is a method characterized by being made 6M or more and less than the precipitation limit concentration.
[0013]
The blocking buffer preferably has a salt concentration in the range of 0.6M to 4M. Here, the salt concentration is a concentration at a temperature when the blocking buffer is normally used in the chemiluminescence method using the biochemical analysis unit.
[0014]
【The invention's effect】
Conventionally, a blocking buffer for an enzyme-labeled antibody is generally adjusted to a salt concentration of 0.15 M, and if this is used in a chemiluminescence method in which a reaction solution is forced to circulate inside the adsorptive region, background light emission will occur. The amount increased and the detection limit tended to decrease.
[0015]
In the chemiluminescence method using the biochemical analysis unit of the present invention, the reaction solution is forced into the adsorbent region by setting the salt concentration of the blocking buffer for the enzyme-labeled antibody to 0.6 M or more and less than the precipitation limit concentration. Even in the chemiluminescence method to be circulated, the amount of luminescence in the background can be reduced, so that the detection limit can be improved, and detection with a large S / N ratio can be performed even if the amount of labeled receptor or labeled ligand is very small. Can do.
[0016]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Embodiments of the present invention will be described below with reference to the drawings. FIG. 1 is a schematic perspective view of a biochemical analysis unit used in the chemiluminescence method of the present invention. The biochemical analysis unit 1 shown in FIG. 1 includes a substrate 2 provided with a plurality of holes 3 and an adsorptive region 4 filled in the holes 3 and having a porous material bonded to the substrate 2. A ligand or receptor 5 having a known structure or characteristic is dropped on the adsorptive region 4 and immobilized by subsequent processing.
[0017]
The material of the substrate 2 is preferably a material that does not transmit or attenuate light in order to prevent light scattering inside the biochemical analysis unit, and is preferably a metal or ceramic. In addition, when a plastic that can be easily processed to form holes is used as the substrate, it is preferable to disperse the particles inside the plastic in order to further attenuate the light.
[0018]
Preferred examples of the metal include copper, silver, gold, zinc, lead, aluminum, titanium, tin, chromium, iron, nickel, cobalt, tantalum, and alloys such as stainless steel and brass. Preferred examples of the ceramic include alumina, zirconia, magnesia, and quartz. Plastics include polyolefins such as polyethylene and polypropylene, acrylic resins such as polystyrene and polymethyl methacrylate, polyvinyl chloride, polyvinylidene chloride, polyvinylidene fluoride, polytetrafluoroethylene, polychlorotrifluoroethylene, polycarbonate, polyethylene naphthalate, Polyesters such as polyethylene terephthalate, aliphatic polyamides such as nylon-6 and nylon-6,6, silicon resins such as polyimide, polysulfone, polyphenylene sulfide, polydiphenylsiloxane, phenolic resins such as novolac, epoxy resins, polyurethane, cellulose acetate And celluloses such as nitrocellulose, copolymers such as butadiene-styrene copolymers, and plastics. Such as those obtained by blending is preferably raised.
[0019]
The area (size) of the opening of the hole 3 opened in the substrate 2 is generally 5 mm in order to increase the density of the hole 3. 2 Less than, preferably 1 mm 2 Less than 0.3mm 2 Less than, more preferably 0.01 mm 2 It is preferable that it is less than. And more preferably 0.001 mm 2 The above is preferable.
[0020]
The pitch of the holes 3 (distance from the center of two adjacent holes to the center) is preferably in the range of 0.05 to 3 mm, and the interval between the holes 3 (from the end to the end of the two adjacent holes) The shortest distance) is preferably in the range of 0.01 to 1.5 mm. The number (density) of holes 3 is generally 10 / cm. 2 Or more, preferably 100 / cm 2 Or more, more preferably 500 / cm 2 Or more, 1000 / cm 2 The above is preferable. And preferably 100,000 pieces / cm 2 Below, further 10,000 / cm 2 The following is preferable. Note that the holes 3 do not necessarily have to be provided at regular intervals as shown in FIG. 1, and a plurality of holes may be provided for each block divided into several blocks (units).
[0021]
In the present invention, a porous material or a fiber material is preferably used as the porous material forming the adsorptive region. Further, the adsorptive region can be formed by using a porous material and a fiber material together. In the present invention, the porous material used for forming the adsorptive region may be either an organic material or an inorganic material, or an organic / inorganic composite.
[0022]
The organic porous material used for forming the adsorptive region is not particularly limited, but a carbon porous material such as activated carbon or a porous material capable of forming a membrane filter is preferably used. As a porous material capable of forming a membrane filter, a polymer that is soluble in a solvent is preferably used. Examples of the polymer that can be dissolved in the solvent include cellulose derivatives (for example, nitrocellulose, regenerated cellulose, cellulose acetate, cellulose acetate, cellulose butyrate acetate, etc.), aliphatic polyamides (for example, nylon 6, nylon 6,6, nylon 4, 10), polyolefins (eg, polyethylene, polypropylene, etc.), chlorine-containing polymers (eg, polyvinyl chloride, polyvinylidene chloride, etc.), fluororesins (eg, polyvinylidene fluoride, polytetrafluoride, etc.), polycarbonate , Polysulfone, alginic acid and derivatives thereof (for example, alginic acid, calcium alginate, alginic acid / polylysine polyion complex, etc.), collagen, etc., and copolymers and composites (mixtures) of these polymers It can be used.
[0023]
In addition, the fiber material for forming the adsorptive region is not particularly limited, but preferred examples include the cellulose derivatives and aliphatic polyamides described above.
[0024]
The inorganic porous material used to form the adsorptive region is not particularly limited, but is preferably a metal (for example, platinum, gold, iron, silver, nickel, aluminum, etc.), a metal or the like Examples thereof include oxides (for example, alumina, silica, titania, zeolite, etc.), metal salts (for example, hydroxyapatite, calcium sulfate, etc.), and composites thereof.
[0025]
Examples of the method for forming the plurality of holes 3 in the substrate 2 include punching by punching with pins, electric discharge machining for applying a high voltage to the electrodes in a pulsed manner to volatilize the substrate, etching, and laser irradiation. When the substrate material is a metal material or a plastic material, a corona discharge or plasma discharge is applied to the surface of the substrate and an adhesive is applied, and then a porous material for forming the adsorptive region is pressed. The unit for biochemical analysis is produced by pasting together. When the porous material for forming the adsorptive region is heated and softened at the time of bonding, the adsorptive region is easily formed inside the hole. In addition, when pressing a porous material for forming an adsorptive region on a substrate, the material for forming the substrate and the adsorptive region is divided in advance and then intermittently pressed. Alternatively, the material for forming the substrate and the adsorptive region may be continuously conveyed between the two rolls in the form of a long band.
[0026]
In addition, in the chemiluminescence method using the biochemical analysis unit of the present invention, it is possible to use a biochemical analysis unit produced by the above-mentioned materials and methods. A unit may be used, and a biochemical analysis unit in which a ligand or a receptor is already bound to a porous adsorptive region may be used.
[0027]
FIG. 2 is a schematic cross-sectional view showing an embodiment of a reactor (reaction apparatus) used in the chemiluminescence method using the biochemical analysis unit of the present invention. The reactor comprises a reaction vessel 10 and a flow means 20, and the reaction vessel 10 comprises a reaction vessel upper half 13 and a reaction vessel lower half 14, and the reaction vessel upper half 13 is connected to the reaction vessel lower half 14. It is provided so as to be removable. In addition, the reaction vessel 10 is attached to the biochemical analysis unit 1 having a porous adsorbing region to which a ligand or a receptor is bound, and is detachably attached to the reaction vessel 10 and includes an upper holding piece 11 and a lower holding piece 12. The biochemical analysis unit 1 is configured to be set by removing the upper half 13 of the reaction vessel. Further, a solution inlet 15 through which the reaction solution can flow is formed in the bottom wall of the lower half 14 of the reaction vessel, and a solution outlet 16 through which the reaction solution can similarly flow through the top wall of the upper half 13 of the reaction vessel. Is formed.
[0028]
The flow means 20 includes a solution circulation pipe 21 and a pump 22. One end of the solution circulation pipe 21 is detachably attached to the solution inlet 15 of the reaction vessel 10 and the other end is detachably attached to the solution outlet 16. The reaction solution enters the reaction vessel 10 from the solution inlet 15 by the pump 22 and forcibly flows across the adsorptive region 4 of the biochemical analysis unit 1, and then exits from the solution outlet 16 to circulate the solution. It is configured to circulate through the pipe 21.
[0029]
FIG. 3 is a schematic sectional view showing another embodiment of a reactor used in the chemiluminescence method using the biochemical analysis unit of the present invention. This reactor is provided with a syringe 23 and a piston 24 instead of the pump shown in FIG. 2, and is configured such that the reaction solution reciprocates in the reaction vessel. Thus, the forced flow of the reaction solution may reciprocate through the adsorptive region 4 of the biochemical analysis unit 1.
[0030]
2 and 3 both show a reactor in which the reaction solution circulates through the biochemical analysis unit, but the reaction solution passes from the bottom to the top (or from top to bottom) of the biochemical analysis unit. It is also possible to use a reactor that does not circulate the reaction solution.
[0031]
Next, the chemiluminescence method using the biochemical analysis unit of the present invention will be described step by step.
In the chemiluminescence method using the biochemical analysis unit of the present invention, first, a ligand or a receptor is bound to the adsorptive region of the biochemical analysis unit having a porous adsorptive region.
[0032]
The ligand or receptor bound to the porous adsorptive region includes hormones, tumor markers, enzymes, antibodies, antigens, abzymes, other proteins, nucleic acids, cDNA, DNA, RNA, etc., characteristics, composition, structure Alternatively, the base sequence and base length are known. The ligand or the receptor can be fixed to the adsorptive region by dropping it onto the adsorptive region and then irradiating it with ultraviolet rays. As described above, this step is omitted when a biochemical analysis unit in which a ligand or a receptor is already bound to a porous adsorptive region is used.
[0033]
Next, the labeled receptor or labeled ligand is specifically bound to the ligand or receptor bound to the adsorptive region. The labeled receptor or labeled ligand is a hormone or tumor marker, enzyme, antibody, antigen, abzyme, other protein, nucleic acid, DNA, mRNA, etc. that specifically binds to the ligand or receptor bound to the porous adsorptive region. It is collected from a living body by extraction, isolation, etc., or is subjected to chemical treatment after being collected and labeled with a labeling substance. Preferred examples of the labeling substance for labeling the receptor or the ligand include antigens such as digoxigenin, biotin, avidin, and fluorescein, and antibodies against these antigens. It may also be a biological binding partner such as avidin for biotin.
[0034]
To prevent the labeled receptor or labeled ligand from directly binding to or adsorbing to the adsorptive region provided in the biochemical analysis unit, not the ligand or receptor bound to the porous adsorptive region. In addition, it is preferable that a so-called blocking agent is brought into contact with the adsorptive region of the biochemical analysis unit before the solution containing the labeled receptor or the labeled ligand is brought into contact with the biochemical analysis unit. The blocking agent is preferably filtered and used in the same manner as the enzyme-labeled antibody described below.
[0035]
After the labeled receptor or labeled ligand is specifically bound to the ligand or receptor bound to the porous adsorptive region, the biochemical analysis unit shown in FIG. 2 or FIG. It is attached to a reaction vessel that can be forced to flow across the area. It should be noted that the labeled receptor or labeled ligand does not block the adsorptive region. For example, in the case of labeled DNA, the labeled receptor or labeled ligand is specifically bound to the ligand or receptor bound to the adsorptive region. The biochemical analysis unit may be attached to the reaction vessel from the stage of causing the reaction to occur. In this case, since the labeled receptor or the labeled ligand can be contacted efficiently and uniformly with the ligand or receptor bound to the adsorptive region, the detection limit of the labeled receptor or labeled ligand can be improved. In addition, even when the amount of the labeled receptor or the labeled ligand is very small, detection with a larger S / N ratio can be performed.
[0036]
In addition, adsorption from the stage of specifically binding the ligand or receptor bound to the porous adsorptive region and the labeled receptor or labeled ligand to the stage of specifically binding the enzyme-labeled antibody to the labeled receptor or labeled ligand. Since each reaction solution can be forced to flow in the sex region, the process can be simplified and detection with higher accuracy is possible.
[0037]
From the step of specifically binding the ligand or receptor bound to the porous adsorptive region and the labeled receptor or labeled ligand, the labeled receptor or the label using the reaction container shown in FIG. 2 or FIG. When the reaction solution containing the ligand is forced to flow, the step of bringing the blocking agent in the previous step into contact with the adsorptive region of the biochemical analysis unit is also performed using the reaction vessel. The solution can be forced to flow. In this way, the process can be simplified, and more accurate data with excellent reproducibility and quantification can be obtained.
[0038]
The unit for biochemical analysis attached to the reaction vessel is a so-called adsorbent region in order to remove the labeled receptor or labeled ligand that did not specifically bind to the ligand or receptor bound to the porous adsorbent region. It is preferable to wash by forcibly flowing the washing liquid. Since the washing solution is forced to flow in the adsorptive region, the labeled receptor or ligand that is not specifically bound to the ligand or receptor bound to the porous adsorptive region is efficiently stripped and removed. And the cleaning efficiency can be greatly improved.
[0039]
In this washing step, an enzyme-labeled antibody that was not specifically bound after the enzyme-labeled antibody described below was forced to flow across the adsorptive region and specifically bound to the labeled receptor or the labeled ligand. It is preferable to carry out also when removing. As a result, the enzyme-labeled antibody not specifically bound to the labeled receptor or the labeled ligand can be efficiently peeled and removed, and the washing efficiency can be greatly improved.
[0040]
Before binding the enzyme-labeled antibody to the labeled receptor or ligand specifically bound to the ligand or receptor bound to the adsorptive region, the blocking buffer for the enzyme-labeled antibody is forced to flow across the adsorptive region. Block the adsorptive region. A blocking buffer having a salt concentration of 0.6 M or more and less than the precipitation limit concentration, preferably 0.6 M to 4 M is used. The blocking buffer for the conventional enzyme-labeled antibody is generally adjusted to a salt concentration of 0.15M. This is because of the physiological salt concentration (isotonic solution), but it has been found that the background can be lowered by raising this to 0.6 M or more. A higher salt concentration has the effect of lowering the background, but if the concentration exceeds a certain level, the solubility in the blocking buffer will deteriorate and may precipitate during actual use. The concentration is adjusted to a concentration lower than the precipitation limit concentration at the temperature during normal use. As the salt, NaCl, KCl and the like are preferable because they are easily available and easy to handle.
[0041]
Next, the enzyme-labeled antibody is forced to flow across the adsorptive region to specifically bind to the labeled receptor or labeled ligand. The enzyme-labeled antibody is filtered through a filter having a pore size smaller than that of the adsorbent region. It is preferable to use what was done. Since the enzyme-labeled antibody is likely to aggregate, it may be clogged in the porous adsorptive region. By filtering in this manner, the enzyme-labeled antibody can sufficiently penetrate into the adsorptive region. The enzyme-labeled antibody is preferably diluted with a blocking buffer for the enzyme-labeled antibody described above. Even in this case, it is preferable to use a blocking buffer adjusted to the above-mentioned salt concentration.
[0042]
The enzyme-labeled antibody is obtained by labeling an antibody against a labeling substance of a labeled receptor or a labeled ligand (or an antigen when the labeled receptor or labeled ligand is an antibody) with an enzyme. As the enzyme of the enzyme-labeled antibody, enzymes such as alkaline phosphatase, peroxidase, and luciferase can be preferably used.
[0043]
Subsequently, the biochemical analysis unit is taken out from the reaction container, and the chemiluminescent substrate is brought into contact with the enzyme-labeled antibody specifically bound to the labeled receptor or the labeled ligand. The chemiluminescent substrate to be reacted with the enzyme-labeled antibody is not particularly limited when the enzyme is alkaline phosphatase, peroxidase, or luciferase, but dioxetane, luminol, or luciferin can be used, respectively.
[0044]
Since chemiluminescence in the visible light wavelength region is generated by contact between the chemiluminescent substrate and the enzyme, if this is detected photoelectrically and image data for biochemical analysis is generated, the labeled receptor or labeled ligand can be detected and measured. Can do.
Hereinafter, the present invention will be described specifically by way of examples.
[0045]
【Example】
(Example 1)
A SUS304 sheet (substrate material sheet) having a size of 80 mm × 80 mm and a thickness of 100 μm is formed into 10 × A total of 6400 pieces were formed with 10 pieces as one unit.
[0046]
Next, 14 parts of nylon 6 (manufactured by Polysciences), 66 parts of formic acid, and 20 parts of water were uniformly dissolved to prepare a solution of a porous adsorptive region forming material. The solution is cast in a stable state and casted onto a substrate material sheet by a casting coater so that the thickness of the dried film is 160 μm. Scraped off the solution. Subsequently, the substrate material sheet was immediately immersed in a coagulation tank filled with a 40% aqueous solution of formic acid to form a large number of micropores in the film in the through hole. Thereafter, it was washed with water and dried to produce a biochemical analysis unit composed of a stainless steel barrier and a polymer-filled region having a large number of holes.
[0047]
The molecular weight markers pBR328 / BgII and HinfI (250 nl / μg) dissolved in TE buffer were boiled for 5 minutes, and then ice-cooled for 1 minute to make pBR328 / BgII and HinfI single-stranded. This was spotted on the adsorptive region of the biochemical analysis unit produced above, and then irradiated with ultraviolet rays (254 nm, 33 mJ / cm 2 Then, single-stranded pBR328 / BgII and HinfI were immobilized on the adsorptive region.
[0048]
Next, 10 pg of pBR328-DNA solution (manufactured by Roche) labeled with digoxigenin (DIG) was thermally denatured, and hybridization buffer (0.5 M Church phosphate buffer (0.5 M Na) was used. 2 HPO 4 H 3 PO 4 Adjusted to pH 7.2), 1 mM EDTA, 7% SDS).
[0049]
The biochemical analysis unit was fixed to the reaction vessel shown in FIG. 2, and 5 ml of a 68 ° C. prehybridization buffer (same as the above hybridization buffer) was circulated for 1 hour (linear velocity: 0.2 cm / sec). Next, hybridization was performed by circulating a hybridization buffer to which a DIG-labeled pBR328-DNA solution at 65 ° C. was added for 18 hours. Subsequently, circulating washing was performed twice with washing buffer 1 (40 mM Church phosphate buffer, 1% SDS) for 5 minutes and twice with washing buffer 2 (0.1 × SSC, 0.1% SDS) (buffer temperature). Are both 68 ° C.).
[0050]
Thereafter, a 10 × blocking buffer described in Roche DIG, Wash and Block buffer Set was adjusted to 1 × with 0.1 M maleic acid and 0.6 M NaCl solution. After circulating DIG wash buffer (Roche DIG, described in Wash and Block buffer Set) for 5 minutes, this adjusted 1 × blocking buffer was circulated for 10 minutes at room temperature and then stopped for 50 minutes.
[0051]
Next, alkaline phosphatase-labeled DIG antibody is filtered in advance with an ultra-free pore size 0.22 μm (Millipore) and diluted with a blocking buffer whose salt concentration is adjusted to 1 / 10,000, After circulating for 1 minute, it was stopped for 60 minutes.
[0052]
Subsequently, a chemirmi washing liquid (DIG manufactured by Roche, as described in Wash and Block buffer Set) was circulated for 15 minutes. This was repeated three times, and pH was adjusted with a detection buffer (DIG manufactured by Roche, as described in Wash and Block buffer Set), and finally, a chemiluminescent substrate CDP-star (CDP-star, read to use) For 1 hour and the amount of luminescence in the adsorptive region of the biochemical analysis unit was detected with LAS1000 (Fuji Photo Film Co., Ltd.).
[0053]
(Example 2)
The amount of luminescence was detected in the same manner as in Example 1 except that the NaCl concentration of the blocking buffer was adjusted to 2.4M.
[0054]
(Example 3)
The amount of luminescence was detected in the same manner as in Example 1 except that the NaCl concentration of the blocking buffer was adjusted to 4.0M.
[0055]
Example 4
The amount of luminescence was detected in the same manner as in Example 1 except that NaCl added to the blocking buffer was changed to KCl.
[0056]
(Example 5)
The amount of luminescence was detected in the same manner as in Example 3 except that NaCl added to the blocking buffer was changed to KCl.
[0057]
(Comparative Example 1)
The amount of luminescence was detected in the same manner as in Example 1 except that a blocking buffer having a NaCl concentration of 0.15 M was used.
[0058]
(Comparative Example 2)
The amount of luminescence was detected in the same manner as in Example 4 except that a blocking buffer having a KCl concentration of 0.15 M was used.
[0059]
Table 1 shows a summary of the salt, salt concentration, and background light emission of Examples 1 to 5 and Comparative Examples 1 and 2.
[0060]
[Table 1]
[0061]
As is apparent from Table 1, in the detection using the blocking buffer in which the salt concentration of the present invention is adjusted to 0.6M to 4.0M, a blocking with a salt concentration of 0.15M, which is generally used conventionally, is used. Compared to detection using a buffer, the amount of light emitted from the background decreased.
[0062]
As described above, in the chemiluminescence method using the biochemical analysis unit of the present invention, the salt concentration of the blocking buffer for the enzyme-labeled antibody is 0.6 M or more and less than the precipitation limit concentration, so that the reaction solution is forcibly adsorbed. In the chemiluminescence method that circulates inside the sex region, the amount of background luminescence could be reduced. As a result, the detection limit can be improved, and detection with a large S / N ratio can be performed even if the amount of labeled receptor or labeled ligand is very small.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a schematic perspective view of a biochemical analysis unit used in the chemiluminescence method of the present invention.
FIG. 2 is a schematic sectional view showing an embodiment of a reactor used in a chemiluminescence method using the biochemical analysis unit of the present invention.
FIG. 3 is a schematic sectional view showing another embodiment of a reactor used in a chemiluminescence method using the biochemical analysis unit of the present invention.
[Explanation of symbols]
1 Biochemical analysis unit
2 Substrate
3 holes
4 Adsorbent area
5 Ligand or receptor
