【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、細胞培養分野における、マイクロチップの微小空間中の培養面に接着して凍結保存されている動物細胞の解凍方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
動物細胞は一般に−８０℃以下のディープフリーザーや液体窒素中に凍結された状態で保存されている。動物細胞の凍結保存の形態は一般的にはアンプルや凍結保存用のチューブに凍結用培地とともに細胞浮遊液の形で凍結されている。このように凍結され保存されている動物細胞は、必要なときに解凍されて、再び培養を行うことができる。
この解凍において、重要なことは速やかに解凍することである。解凍に時間がかかると細胞へのダメージが大きく、解凍時の生存率を下げることになる。また温度を高く上げすぎると細胞が死んだり、ヒートショックプロテインの発現のように細胞のストレス応答を惹起することになるため、一般的には３７℃の温水中に浸漬し解凍する方法がとられている。動物細胞の凍結保存の形態は一般的には上記のアンプルや凍結用チューブの場合が多く密閉状態を保つことができる構造であり、温水に浸漬しても容器中へ菌が混入する危険性は少ない。
【０００３】
近年は特公平５−７７３８９号公報に開示されているように培養容器に足場依存性動物細胞を接着した状態で凍結保存を行う方法が提唱されている。この凍結方法は培養器中に既に所定数の動物細胞が培養されており、解凍するだけで実験に使用できる細胞付の培養器を得られる。これは細胞の播種とその後の増殖培養を行うための時間と労力を削減できる点で、非常に魅力的である。
これとは別に、最近、マイクロリアクターやマイクロアナリシスシステムと呼ばれる微細加工技術を利用した化学反応や分離システムの微小化の研究が盛んになっており、マイクロチャンネルを持つマイクロチップ上で行う核酸、タンパク質などの分析や合成、微量化学物質の迅速分析、医薬品・薬物のハイスループットスクリーニングへの応用が期待されている。このようなシステムのマイクロ化の利点としては、サンプルや試薬の使用量あるいは廃液の排出量が軽減され、省スペースで持ち運び可能な安価なシステムの実現が考えられている。また体積に対する表面積の比率が向上することにより、熱移動・物質移動の高速化が実現でき、その結果、反応や分離の精密な制御、高速・高効率化、副反応の抑制が期待される。
【０００４】
上記の目的でマイクロチップに組み込まれるシステムの一つとして細胞培養も含まれており、マイクロチップ上で細胞培養を行う目的としては、培養細胞を利用した化学物質のスクリーニングやセンサー、神経伝達などの細胞間相互作用のモデル化ほか様々のものが考えられる。
このようにマイクロチップ上で細胞培養が行われ様々な成果が示されているが、培養システムとしては十分なツールがまだ整備されている状態ではなく、シリンジなどで個々の研究者が独自の工夫を施して培養操作を行っている。
その中でも特に細胞を入手、調整してからマイクロチップに播種、培養を行うまでは、マイクロチップの特徴である反応の高速・高率化とは別に、細胞自身の培養環境への適合化の速度に依存するため、実際に実験・分析操作を行うまでには従来と同様に多大な労力と時間を費やしている。
またマイクロチップでは使用するサンプルなどの使用量は極微量であり、マイクロチップでの培養に使用する細胞も従来のシャーレやマルチウェルの培養方法と比べて極少量で十分であるが、実験毎に細胞播種を行っていては調整する細胞の量が少ないことも重なって、実験毎に細胞の生存率が大きくばらついてしまい、その結果として得られる分析評価データがばらついてしまう。
そこで前述した培養容器に足場依存性動物細胞を接着した状態で凍結保存を行う方法をマイクロチップの細胞培養で用いることにより、凍結保存したマイクロチップを解凍することで迅速に実験・分析作業を開始することが可能である。かつ同じロット及び条件で凍結されているので、毎回の実験・分析でも同じ条件で解凍操作を行うことにより、細胞の生存率を再現良く得ることができ、そして分析評価でも再現性の良いデータを得ることが可能となる。
マイクロチップのような小容積中の凍結細胞を解凍する方法として、凍結用チューブの解凍方法と同様に温水中に直接沈める方法が考えられる。しかし、マイクロチップの培養面に連絡してあるマイクロチャンネルは試薬の注入、採取を行うため、外部と通じる開口部を有しており、この方法で解凍を行うと温水が流入して、菌による汚染や保存していた細胞の死滅の要因となってしまう。マイクロチャンネルの開口部に蓋を取り付けて温水中に沈めた場合、直接温水がマイクロチャンネルに流入することはないが、取り上げた後にマイクロチップの外部には菌が付着しておりやはり菌の汚染原因になる。
温度コントロールしたホットプレートにマイクロチップをのせて解凍を行うと、マイクロチップの片面は加熱されるが、反対側の面は冷たい状態で外気に晒されるため、やはり結露による水滴が付着して、きちんと除去しないと菌が付着して汚染を招く恐れがある。またマイクロチップの加熱と同時にホットプレートも一時的に冷却されて、ホットプレートは熱を加えるための制御を行うが、温度の制御には時間的ズレがあるため、ホットプレートは一時的に許容範囲より加熱されて細胞が死んだり、ヒートショックプロテインの発現のように細胞のストレス応答を惹起する可能性がある。
また、培養用インキュベータで解凍する方法も考えられるが、冷凍状態のマイクロチップを高湿状態のインキュベータに投入するとマイクロチップの外部には結露による水滴が付着して、きちんと除去しないと菌が付着して汚染を招く恐れがある。
【０００５】
【特許文献１】
特公平５−７７３８９号公報
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は前述したマイクロチップの解凍操作を毎回同じ条件下で実施することにより、細胞の培養状態を再現良く得ることができ、そして分析評価でも再現性の良いデータを得ることが可能で、菌の汚染の危険性を抑えた、マイクロチップに含まれる動物細胞の解凍方法を提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
すなわち本発明は、
（１） 動物細胞が凍結用培養液とともに凍結保存されているマイクロチップの解凍方法であって、マイクロチップを水不透過性を有する袋中に納め、袋ごとマイクロチップ全体を１〜３７℃の範囲の水中に浸漬して、マイクロチップ中の動物細胞を解凍することを特徴とする動物細胞の解凍方法、
（２） マイクロチップの少なくとも培養面が設置されている部分についての厚さが５ｍｍ以下である（１）記載の動物細胞の解凍方法、
（３） 凍結前にマイクロチップを水不透過性を有する袋に納め、袋をシールする（１）または（２）記載の動物細胞の解凍方法、
（４） 水不透過性を有する袋の内面の面積が、納められているマイクロチップの表面積の１．４〜３倍を有し、かつ１気圧下で０〜３７℃の温度範囲において袋内のマイクロチップ以外の気体の体積が、マイクロチップの占める体積の１倍以下の量である状態でシールする（３）記載の動物細胞の解凍方法、
（５） 水不透過性を有する袋の内面の面積が、納められているマイクロチップの表面積の１．４〜３倍を有し、水不透過性を有する袋の一部または全体が通気性を有している（３）記載の動物細胞の解凍方法、
である。
【０００８】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明の解凍対象となるマイクロチップは内部または外表面に微小空間が設置されており、空間を構成する一部の面あるいは空間内に存在するビーズなどの担体表面を培養面として足場依存性動物細胞が培養することが可能であり、一つのマイクロチップに一つ、或いは二つ以上の微小空間が設置されている。
【０００９】
またマイクロチップの少なくとも培養面が設置されている部分についての厚さが５ｍｍ以下であることが好ましい。特にマイクロチップの厚さが薄いほうが培養面への加温効率が高くなり、細胞をより速やかに解凍することが可能となるため、より好ましくは３ｍｍ以下、さらに好ましくは１ｍｍ以下である。マイクロチップの厚さが５ｍｍを超えると、マイクロチップ本体の熱容量が大きく、マイクロチップでの培養面の位置が内側の細胞ほど解凍効率が低下してしまい、均等に解凍を行うことができず、解凍時の細胞の生存率の低下やばらつきが発生してしまう。
マイクロチップの原材料としては−８０℃以下に対するの耐冷却性を有していれば特に限定はせず、例えば、ガラス、シリコン、またはポリプロピレンなどのプラスチックを用いることが可能である。
【００１０】
また、細胞はマイクロチップの培養面に接着した状態で凍結用培養液とともに凍結保存されている。
培養面に接着していない状態であると、解凍直後の凍結用培養液を培養用培養液に入れ替える操作で、凍結用培養液と共に解凍された細胞も排出されてしまう。本発明の解凍作業時の状態の模式図を図１に示す。（１）は動物細胞が凍結用培養液と共に凍結されたマイクロチップ、（２）は水不透過性を有する袋、（３）は水である。
マイクロチップを水中に浸漬すると、水圧によって袋がマイクロチップ全体に密着する。袋とマイクロチップ外表面との間には空気の層はほとんど存在せず、マイクロチップ全体を直接水中に浸漬した場合と同等の加温が可能になる。
【００１１】
解凍方法についてさらに詳細に述べる。本発明では、１０℃以下の水温でも細胞の解凍が可能である。解凍効率は先に述べたマイクロチップの厚さのほかに温水の温度による影響が大きく、当然であるが温度が高いほど解凍効率は大きく、短時間で作業を完了できる。
水温が低いと解凍効率が下がり、解凍が完了するまでの時間は長くなるが、マイクロチップの厚さが５ｍｍ以下であればマイクロチップ全体がほぼ均一に解凍されるため、マイクロチップでの培養面の位置が内側の細胞ほど解凍効率が低下して生存率がばらつく支障は発生しない。マイクロチップの厚さが３ｍｍ以下であれば解凍効率の低下による生存率の低下も見られず、さらに厚さが１ｍｍ以下であればマイクロチップの熱容量も小さくなり温水に沈めたときと同様の速度で解凍が行われる。
また解凍効率を左右する要因としてマイクロチップ内の培養液量があるが、特殊な大きさ、形態の培養面により過多な量であっても、マイクロチップの厚さが５ｍｍ以下であれば何ら支障はない。
【００１２】
細胞を解凍する上で注意すべきことは、完全に培養液が解凍しないうちにチップを水中より引き上げないことである。解凍の途中でチップを水中より引き上げると加温が中断し、一旦解凍した細胞が再び凍ることにより細胞の生存率が大きく低下するので、解凍を確認してから引き上げを行う。
本発明における解凍方法では、袋中にマイクロチップが納められているため、解凍中外気に触れることがなく、マイクロチップに霜がついたり、その霜が解けてマイクロチップを濡らすことがなく、マイクロチップに菌が付着して汚染される危険性が少ない。
また本発明における解凍方法では特別な解凍用装置を調達する必要がなく、実験室にあるウォーターバスで実施可能であり、また単に水を貯めた容器でも良い。
食品などでは、脱気後に袋をシールするいわゆる真空包装の用いたレトルト食品があり、この場合食品をお湯にそのまま入れることで効率良く過熱を行うが、マイクロチップについてはこのような処方でマイクロチップを包装して加温する方法はなかった。
その理由として、マイクロリアクターやマイクロアナリシスシステムの考え方では微細加工技術、マイクロマシン、マイクロデバイスを駆使し、極限られた部位に加熱、冷却等の機能とその効果を付与することに注目しており、マイクロチップ全体を加温するという発想自体が余り行われないためである。
【００１３】
本発明では、動物細胞が凍結保存されているマイクロチップを解凍する方法として、マイクロチップを水不透過性の袋に入れて水中に沈める時に、袋全体がマイクロチップに密着させることにより、培養面を効率良く加熱している。
この方法を可能とするには、マイクロチップを収納する包装方法と条件の二点が重要である。第一に袋の大きさであり、第二に凍結前の室温における袋内の気体の量である。
まず、袋の大きさであるが、マイクロチップ全体を袋に密着させ、さらに袋に余裕がある大きさが必要である。より具体的には、袋の内面の面積が納められているマイクロチップの表面積の１．４〜３倍であることが好ましい。上記のような袋の大きさであれば、マイクロチップを水中に浸漬したときに水圧でマイクロチップ全体を無理なく密着させることができる。
【００１４】
次に凍結前の室温における袋内の気体の量であるが、凍結時の袋内の気体が多いとマイクロチップと袋が密着しない。マイクロチップと袋の間に空気の層が存在していしまい、断熱材として熱伝達を阻害するため解凍した細胞の生存率を著しく低下する。包装するときに空気を押し出すようにすることで、マイクロチップを水中に沈めたときに袋内に残った空気も袋の余裕の部分に集めることで、袋とマイクロチップを確実に密着させることが可能である。具体的には１気圧下で０〜３７℃の温度範囲において袋内のマイクロチップ以外の気体の体積が、マイクロチップの占める体積の１倍以下であることが好ましい。
しかし、凍結前の包装時にレトルト食品のようにマイクロチップを袋に納めて脱気を行うと、凍結用培養液が除去され、また細胞が一気圧以下の環境に晒されて細胞内外の圧力差により破裂する恐れがあるので、脱気は特に必要でない。
また袋がガス透過性であれば、マイクロチップを水中に沈めたときに袋内の空気は水圧により袋の外に押し出され、袋とマイクロチップを確実に密着させることが可能である。
【００１５】
図１で解凍の手順を説明すると、−８０℃以下で凍結保存されているマイクロチップ全体を袋ごと水中に沈める。水圧により袋は培養液に密着し、袋内の空気（４）は袋の余裕部分に溜まる。しばらく沈めたままマイクロチップを加温する。
水の温度が低い場合は、水を撹拌することでマイクロチップ周辺の水の還流を良くして効率良くし、効率良くマイクロチップを加温する。マイクロチップを静かに動かして水の還流を行っても良いが、動きが激しいと細胞にダメージを与える可能性がある。
３７℃の温水中で、特に厚さ１ｍｍ以下のマイクロチップでは解凍効率が非常に高く、１０数秒程度で解凍を完了できる。
【００１６】
【実施例】
（実施例１）
大きさ７５ｍｍ×２５ｍｍ、厚さ１ｍｍのガラス製基板の内部に直径３ｍｍ、厚さ１００μｍの微小空間に連絡する分注用と排出用の直径１００μｍのマイクロチャンネルが２本設けられているマイクロチップに、ＨｅＬａ細胞を懸濁した培養液をマイクロチャンネルより注入して、微小空間の培養面に播種した。培養液は５％子牛血清を添加したＭＥＭ培地を用いた。培養面一つあたり約２０００個の細胞を播種し、炭酸ガスインキュベーター中で培養を行った。顕微鏡観察によりサブコンフルエントな状態に達したところで細胞と共にマイクロチップごと数枚を凍結した。凍結の手順は以下の通り。
培養していた培養液を除去し、ＤＭＳＯを１０％の濃度で上記培養用の培養液に添加した凍結用培養液を各微小空間に充填し、無菌操作で大きさ６０ｍｍ×８５ｍｍ、フィルム厚さ０．０４ｍｍのポリエチレン製の袋に納め、シールし、直ちにディープフリーザー中で１分間あたり１℃の割合で−８０℃まで冷却し凍結した。その後、ディープフリーザー中に−８０℃で保存した。
保存の後、ディープフリーザーよりマイクロチップを取り出し、３７℃の温水中に沈め完全に解凍した。解凍に要した時間は１０秒未満であった。即座に凍結用の培養液を排出し、培養用の培養液を充填して３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中で培養を開始した。
【００１７】
（比較例１）
実施例１で用いたマイクロチップにＨｅＬａ細胞を懸濁した培養液をマイクロチャンネルより注入して、微小空間の培養面に播種した。培養液は５％子牛血清を添加したＭＥＭ培地を用いた。培養面一つあたり約２０００個の細胞を播種し、炭酸ガスインキュベーター中で培養を行った。顕微鏡観察によりサブコンフルエントな状態に達したところで細胞と共にマイクロチップごと数枚を凍結した。凍結の手順は以下の通り。
培養していた培養液を除去し、ＤＭＳＯを１０％の濃度で上記培養用の培養液に添加した凍結用培養液を各微小空間に充填し、無菌操作で大きさ６０ｍｍ×８５ｍｍ、フィルム厚さ０．０４ｍｍのポリエチレン製の袋に納め、シールし、直ちにディープフリーザー中で１分間あたり１℃の割合で−８０℃まで冷却し凍結した。その後、ディープフリーザー中に−８０℃で保存した。
保存の後、ディープフリーザーのマイクロチップを袋から取り出し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中で完全に解凍した。解凍に要した時間は約６０秒であった。マイクロチップの外表面に結露した液滴を滅菌済みの脱脂綿で除去した後に凍結用の培養液を排出し、培養用の培養液を充填して３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中で培養を開始した。
【００１８】
（比較例２）
実施例１で用いたマイクロチップにＨｅＬａ細胞を懸濁した培養液をマイクロチャンネルより注入して、微小空間の培養面に播種した。培養液は５％子牛血清を添加したＭＥＭ培地を用いた。培養面一つあたり約２０００個の細胞を播種し、炭酸ガスインキュベーター中で培養を行った。顕微鏡観察によりサブコンフルエントな状態に達したところで細胞と共にマイクロチップごと数枚を凍結した。凍結の手順は以下の通り。
培養していた培養液を除去し、ＤＭＳＯを１０％の濃度で上記培養用の培養液に添加した凍結用培養液を各微小空間に充填し、無菌操作でマイクロチャンネルの開口部に蓋を取り付けて、直ちにディープフリーザー中で１分間あたり１℃の割合で−８０℃まで冷却し凍結した。その後、ディープフリーザー中に−８０℃で保存した。
保存の後、ディープフリーザーからマイクロチップを取り出し、３７℃の温水中に沈め完全に解凍した。解凍に要した時間は１０秒未満であった。マイクロチップの外表面に付着した液滴を滅菌済みの脱脂綿で除去した後に凍結用の培養液を排出し、培養用の培養液を充填して３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中で培養を開始した。
【００１９】
（比較例３）
実施例１で用いたマイクロチップ１枚にＨｅＬａ細胞を懸濁した培養液をマイクロチャンネルより注入して、微小空間の培養面に播種した。培養液は５％子牛血清を添加したＭＥＭ培地を用いた。培養面一つあたり約２０００個の細胞を播種し、炭酸ガスインキュベーター中で培養を行った。
【００２０】
（マイクロチップの細胞の生存率及びチップ間のばらつき、及び菌の汚染状況）
実施例１及び比較例１、２を用いた。また比較例３は数回実施した。
培養２時間後、生細胞数確認用試薬（ＷＳＴ−１（同仁））を１０％含有する培養液で培地交換を行い、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中で２時間培養した。その後生細胞数に応じて生成されるホルマザンをマイクロチップより採取して、吸光光度計により波長４５０ｎｍの吸光度を測定した。
解凍時の細胞生存率は、数枚のマイクロチップの凍結を行う前に、コントロールとして凍結まで同条件で同時に行われたマイクロチップにＷＳＴ１を加えた培養液で培地交換して２時間培養を継続し、生成したホルマザンの吸光度を測定して、その平均値で実施例及び比較例１、２の吸光度を除すことにより算出した。ばらつきは、変動係数（ＣＶ値）で比較した。比較例３については各回のホルマザンの吸光度についてＣＶ値を算出した。
またさらに培養を継続し、菌の汚染についての状況を確認した。
それぞれの結果を表１に示す。
【００２１】
【表１】
【００２２】
【発明の効果】
本発明に従うと、足場依存性動物細胞が凍結されたマイクロチップの解凍操作を毎回同じ条件下で実施することにより、細胞の生存率を再現良く得ることができ、そして分析評価でも再現性の良いデータを得ることが可能で、菌の汚染の危険性を抑えた、マイクロチップに含まれる動物細胞の解凍方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の動物細胞の解凍方法の模式図である。
【符号の簡単な説明】
１ マイクロチップ
２ 袋
３ 水
４ 袋内の空気
５ 水槽[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for thawing animal cells cryopreserved by being adhered to a culture surface in a micro space of a microchip in the field of cell culture.
[0002]
[Prior art]
Animal cells are generally stored in a deep freezer at −80 ° C. or lower or frozen in liquid nitrogen. The form of cryopreservation of animal cells is generally frozen in the form of a cell suspension together with a freezing medium in an ampoule or a cryopreservation tube. The animal cells thus frozen and stored can be thawed when necessary and can be cultured again.
In this thawing, the important thing is to thaw quickly. If the thawing takes time, the damage to the cells is large, and the survival rate at the time of thawing is reduced. If the temperature is raised too high, the cells will die or a stress response of the cells will be induced as in the expression of heat shock protein. Therefore, a method of immersing the cells in 37 ° C warm water and thawing them is generally used. ing. The form of cryopreservation of animal cells is generally such that the ampoule or the tube for freezing described above can be kept in a sealed state in many cases, and there is no danger of bacteria entering the container even when immersed in warm water. Few.
[0003]
In recent years, as disclosed in Japanese Patent Publication No. 5-77389, a method for cryopreservation while anchoring anchorage-dependent animal cells to a culture vessel has been proposed. According to this freezing method, a predetermined number of animal cells are already cultured in an incubator, and an incubator with cells that can be used in an experiment can be obtained only by thawing. This is very attractive in that it saves time and effort for seeding cells and subsequent growth culture.
Apart from this, recently, research on miniaturization of chemical reactions and separation systems using microfabrication technologies called microreactors and microanalysis systems has been actively conducted, and nucleic acids and proteins performed on microchips with microchannels have been actively studied. It is expected to be applied to analysis and synthesis of compounds, rapid analysis of trace chemical substances, and high-throughput screening of drugs and drugs. As an advantage of the micronization of such a system, the realization of an inexpensive system that is space-saving and portable in which the amount of used samples and reagents or the amount of discharged waste liquid is reduced is considered. In addition, by increasing the ratio of surface area to volume, heat transfer and mass transfer can be accelerated, and as a result, precise control of reaction and separation, high speed and high efficiency, and suppression of side reactions are expected.
[0004]
Cell culture is also included as one of the systems incorporated into the microchip for the above purposes.The purpose of cell culture on the microchip is to screen chemical substances using cultured cells, sensors, neurotransmission, etc. There are many other possibilities, including modeling of cell-cell interactions.
In this way, cell culture is performed on a microchip, and various results have been shown.However, as a culture system, sufficient tools have not yet been prepared, and individual researchers have used their own ingenuity with a syringe or the like. To perform the culturing operation.
In particular, from the acquisition and preparation of cells to the seeding and cultivation of microchips, the speed of adaptation of the cells to their own culture environment, apart from the high-speed and high-rate reactions that are characteristic of microchips, Therefore, a great deal of labor and time is spent as in the prior art before actually performing the experiment and analysis operations.
In addition, microchips use only a very small amount of samples, etc., and the cells used for culturing on microchips require a very small amount compared to conventional petri dishes or multiwell culture methods. When cell seeding is performed, the amount of cells to be adjusted is also small, and the survival rate of the cells varies greatly from experiment to experiment, and the analytical evaluation data obtained as a result varies.
Therefore, the method of cryopreservation with the anchorage-dependent animal cells adhered to the culture vessel described above is used in microchip cell culture, and the experiment and analysis work is started quickly by thawing the cryopreserved microchip. It is possible to do. In addition, since the cells are frozen under the same lot and conditions, thawing operation can be performed under the same conditions in each experiment and analysis, so that cell viability can be obtained with good reproducibility. It is possible to obtain.
As a method of thawing frozen cells in a small volume such as a microchip, a method of directly submerging in warm water as in the method of thawing a freezing tube can be considered. However, the microchannel connected to the culture surface of the microchip has an opening that communicates with the outside for injecting and collecting reagents. It causes contamination and kills stored cells. When the lid is attached to the opening of the microchannel and submerged in warm water, the hot water does not flow directly into the microchannel, but bacteria are attached to the outside of the microchip after picking up, which is also a cause of bacterial contamination. become.
When the microchip is placed on a hot plate with temperature control and thawed, one side of the microchip is heated, but the other side is exposed to the outside air in a cold state, so that water droplets due to condensation also adhere to it and properly If not removed, bacteria may adhere and cause contamination. In addition, the hot plate is temporarily cooled simultaneously with the heating of the microchip, and the hot plate performs control to apply heat. There is a possibility that the cell will die due to more heat, or cause a stress response of the cell such as expression of heat shock protein.
Thawing in a culture incubator is also conceivable.However, when a frozen microchip is placed in a high-humidity incubator, water droplets due to condensation will adhere to the outside of the microchip and bacteria will adhere if not properly removed. Risk of contamination.
[0005]
[Patent Document 1]
Japanese Patent Publication No. 5-77389 [0006]
[Problems to be solved by the invention]
According to the present invention, by performing the above-described thawing operation of the microchip under the same conditions each time, it is possible to obtain a cell culture state with good reproducibility, and it is possible to obtain data with good reproducibility even in analytical evaluation. An object of the present invention is to provide a method for thawing animal cells contained in a microchip, which suppresses the risk of contamination of animal cells.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
That is, the present invention
(1) A method for thawing a microchip in which animal cells are cryopreserved together with a freezing culture solution, wherein the microchip is placed in a water-impermeable bag, and the whole microchip together with the bag is kept at 1 to 37 ° C. Immersing in a range of water, thawing the animal cells in the microchip, characterized by thawing the animal cells in the microchip,
(2) The method for thawing animal cells according to (1), wherein the thickness of at least the portion of the microchip on which the culture surface is provided is 5 mm or less.
(3) The method for thawing animal cells according to (1) or (2), wherein the microchip is placed in a water-impermeable bag before freezing, and the bag is sealed.
(4) The area of the inner surface of the bag having water impermeability is 1.4 to 3 times the surface area of the contained microchip, and the inside of the bag is in a temperature range of 0 to 37 ° C. under 1 atm. (3) The method for thawing animal cells according to (3), wherein the volume of the gas other than the microchip is less than or equal to one time the volume occupied by the microchip.
(5) The area of the inner surface of the water-impermeable bag is 1.4 to 3 times the surface area of the contained microchip, and a part or the whole of the water-impermeable bag is breathable. (3) the method of thawing animal cells according to (3),
It is.
[0008]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
The microchip to be thawed according to the present invention has a micro space provided inside or outside thereof, and a scaffold-dependent animal is used as a culture surface using a part of the surface constituting the space or a carrier surface such as beads existing in the space. Cells can be cultured, and one or two or more microspaces are provided on one microchip.
[0009]
The thickness of at least the portion of the microchip where the culture surface is provided is preferably 5 mm or less. In particular, the smaller the thickness of the microchip, the higher the efficiency of heating the culture surface and the more quickly the cells can be thawed. Therefore, the thickness is more preferably 3 mm or less, further preferably 1 mm or less. If the thickness of the microchip exceeds 5 mm, the heat capacity of the main body of the microchip is large, and the position of the culture surface in the microchip is lower on the inner side of the cell, so that the thawing efficiency is reduced, and the thawing cannot be performed uniformly. The cell viability at the time of thawing is reduced or uneven.
The raw material of the microchip is not particularly limited as long as it has a cooling resistance to −80 ° C. or lower, and for example, glass, silicon, or plastic such as polypropylene can be used.
[0010]
The cells are cryopreserved together with a freezing culture solution in a state of being adhered to the culture surface of the microchip.
If the cells are not adhered to the culture surface, the operation of replacing the freezing culture solution immediately after thawing with the culture medium will also discharge the thawed cells together with the freezing culture solution. FIG. 1 is a schematic diagram showing a state during the thawing operation of the present invention. (1) is a microchip in which animal cells are frozen together with a freezing medium, (2) is a water-impermeable bag, and (3) is water.
When the microchip is immersed in water, the bag comes into close contact with the entire microchip due to water pressure. There is almost no air layer between the bag and the outer surface of the microchip, and the same heating as when the entire microchip is directly immersed in water is possible.
[0011]
The thawing method will be described in more detail. In the present invention, cells can be thawed even at a water temperature of 10 ° C. or less. The thawing efficiency is greatly affected by the temperature of the hot water in addition to the thickness of the microchip described above. Naturally, the higher the temperature, the greater the thawing efficiency, and the work can be completed in a short time.
When the water temperature is low, the thawing efficiency decreases and the time required for thawing to be completed increases, but when the microchip thickness is 5 mm or less, the entire microchip is almost uniformly thawed. There is no hindrance in which the thawing efficiency is lower and the survival rate is more variable as the cells are located inside. If the thickness of the microchip is 3 mm or less, there is no decrease in the survival rate due to a decrease in thawing efficiency, and if the thickness is 1 mm or less, the heat capacity of the microchip is small and the speed is the same as when submerged in warm water. Decompression is performed.
The amount of culture solution in the microchip is a factor that affects the thawing efficiency. However, even if the amount is too large due to the special size and form of the culture surface, there is no problem if the microchip thickness is 5 mm or less. There is no.
[0012]
What should be noted in thawing cells is that the chip is not pulled out of the water until the culture has completely thawed. If the chip is pulled out of the water during the thawing, the heating is interrupted, and once the thawed cells freeze again, the survival rate of the cells is greatly reduced.
In the thawing method of the present invention, since the microchip is contained in the bag, it does not come into contact with the outside air during thawing, the microchip does not frost, or the frost melts and the microchip does not get wet, There is little danger of bacteria being attached to the chip and being contaminated.
In the thawing method of the present invention, it is not necessary to procure a special thawing device, the thawing method can be carried out in a water bath in a laboratory, or a container simply storing water may be used.
In foods and the like, there are retort foods using so-called vacuum packaging that seal bags after degassing.In this case, the food is heated as it is in hot water as it is, but it is efficiently heated. There was no way to package and heat.
The reason for this is that the concept of microreactors and microanalysis systems uses microfabrication technology, micromachines and microdevices, and focuses on adding functions and effects such as heating and cooling to extremely limited parts. This is because the idea of heating the entire chip is not often performed.
[0013]
In the present invention, as a method of thawing a microchip in which animal cells are cryopreserved, when the microchip is placed in a water-impermeable bag and submerged in water, the entire bag is brought into close contact with the microchip, thereby providing a culture surface. Is efficiently heated.
To make this method possible, two important points are a packaging method for housing the microchip and conditions. First, the size of the bag, and second, the amount of gas in the bag at room temperature before freezing.
First, as for the size of the bag, it is necessary that the entire microchip is brought into close contact with the bag and that the bag has a sufficient size. More specifically, it is preferable that the area of the inner surface of the bag is 1.4 to 3 times the surface area of the contained microchip. With the size of the bag as described above, when the microchip is immersed in water, the whole microchip can be brought into close contact with the water pressure with ease.
[0014]
Next, the amount of gas in the bag at room temperature before freezing. If the amount of gas in the bag at the time of freezing is large, the microchip and the bag do not adhere to each other. A layer of air exists between the microchip and the bag, which inhibits heat transfer as a thermal insulator and significantly reduces the viability of thawed cells. By pushing out air when packaging, the air remaining in the bag when the microchip is submerged in water is also collected in the margin of the bag, so that the bag and the microchip can be tightly adhered. It is possible. Specifically, it is preferable that the volume of gas other than the microchip in the bag in the temperature range of 0 to 37 ° C. under 1 atm is not more than one time the volume occupied by the microchip.
However, if the microchip is packed in a bag and degassed like a retort food at the time of packaging before freezing, the culture solution for freezing is removed, and the cells are exposed to an environment of one atmosphere or less, causing a pressure difference between the inside and outside of the cells. Degassing is not particularly necessary because it can cause rupture.
Further, if the bag is gas-permeable, when the microchip is submerged in water, the air in the bag is pushed out of the bag by water pressure, and the bag and the microchip can be securely adhered.
[0015]
The thawing procedure will be described with reference to FIG. 1. The whole microchip frozen and stored at -80 ° C. or lower is immersed in water together with the bag. Due to the water pressure, the bag comes into close contact with the culture solution, and the air (4) in the bag accumulates in the margin of the bag. Heat the microchip while submerging for a while.
When the temperature of the water is low, the water around the microchip is improved by stirring the water to improve the efficiency, and the microchip is efficiently heated. The microchip may be gently moved to recirculate the water, but if the movement is severe, the cells may be damaged.
In hot water at 37 ° C., especially for a microchip having a thickness of 1 mm or less, the thawing efficiency is extremely high, and thawing can be completed in about 10 seconds or more.
[0016]
【Example】
(Example 1)
A microchip provided with two microchannels having a diameter of 3 mm and a diameter of 100 μm for communicating with a minute space having a diameter of 3 mm and a thickness of 100 μm inside a glass substrate having a size of 75 mm × 25 mm and a thickness of 1 mm. , A culture solution in which HeLa cells were suspended was injected from a microchannel, and was inoculated on a culture surface in a minute space. The culture solution used was a MEM medium supplemented with 5% calf serum. Approximately 2,000 cells were inoculated per culture surface and cultured in a carbon dioxide incubator. When a subconfluent state was reached by microscopic observation, several microchips together with the cells were frozen together. The freezing procedure is as follows.
The culture medium that had been cultured was removed, DMSO was added to the culture medium for culture at a concentration of 10%, and a freezing culture medium was filled in each microspace, and the size was 60 mm x 85 mm and the film thickness was aseptically operated. It was placed in a 0.04 mm polyethylene bag, sealed, immediately cooled in a deep freezer at a rate of 1 ° C. per minute to −80 ° C., and frozen. Thereafter, it was stored at -80 ° C in a deep freezer.
After storage, the microchip was removed from the deep freezer, immersed in warm water at 37 ° C., and completely thawed. The time required for thawing was less than 10 seconds. The culture solution for freezing was immediately discharged, the culture solution for culture was filled, and the culture was started at 37 ° C. in a 5% CO 2 incubator.
[0017]
(Comparative Example 1)
A culture solution in which HeLa cells were suspended in the microchip used in Example 1 was injected from a microchannel, and was seeded on a culture surface in a minute space. The culture solution used was a MEM medium supplemented with 5% calf serum. Approximately 2,000 cells were inoculated per culture surface and cultured in a carbon dioxide incubator. When a subconfluent state was reached by microscopic observation, several microchips together with the cells were frozen together. The freezing procedure is as follows.
The culture medium that had been cultured was removed, DMSO was added to the culture medium for culture at a concentration of 10%, and a freezing culture medium was filled in each microspace, and the size was 60 mm x 85 mm and the film thickness was aseptically operated. It was placed in a 0.04 mm polyethylene bag, sealed, immediately cooled in a deep freezer at a rate of 1 ° C. per minute to −80 ° C., and frozen. Thereafter, it was stored at -80 ° C in a deep freezer.
After storage, the microchip in the deep freezer was removed from the bag and thawed completely at 37 ° C. in a 5% CO 2 incubator. The time required for thawing was about 60 seconds. After the droplets condensed on the outer surface of the microchip are removed with sterilized cotton wool, the culture solution for freezing is discharged, the culture solution for culture is filled, and the culture is started at 37 ° C. in a 5% CO 2 incubator. did.
[0018]
(Comparative Example 2)
A culture solution in which HeLa cells were suspended in the microchip used in Example 1 was injected from a microchannel, and was seeded on a culture surface in a minute space. The culture solution used was a MEM medium supplemented with 5% calf serum. Approximately 2,000 cells were inoculated per culture surface and cultured in a carbon dioxide incubator. When a subconfluent state was reached by microscopic observation, several microchips together with the cells were frozen together. The freezing procedure is as follows.
The culture solution that had been cultured was removed, and a freezing culture solution in which DMSO was added to the above culture solution at a concentration of 10% was filled in each microspace, and a lid was attached to the opening of the microchannel by aseptic operation. Then, it was immediately cooled in a deep freezer at a rate of 1 ° C. per minute to −80 ° C. and frozen. Thereafter, it was stored at -80 ° C in a deep freezer.
After storage, the microchip was taken out of the deep freezer, immersed in warm water at 37 ° C. and thawed completely. The time required for thawing was less than 10 seconds. After removing the droplets adhering to the outer surface of the microchip with sterilized cotton wool, the culture solution for freezing is discharged, the culture solution for culture is filled, and the culture is started at 37 ° C. in a 5% CO 2 incubator. did.
[0019]
(Comparative Example 3)
A culture solution in which HeLa cells were suspended on one microchip used in Example 1 was injected from a microchannel and inoculated on a culture surface in a minute space. The culture solution used was a MEM medium supplemented with 5% calf serum. Approximately 2,000 cells were inoculated per culture surface and cultured in a carbon dioxide incubator.
[0020]
(Cell viability of microchip, variation among chips, and bacterial contamination)
Example 1 and Comparative Examples 1 and 2 were used. Comparative Example 3 was performed several times.
After 2 hours of culture, the medium was replaced with a culture solution containing 10% of a reagent for confirming the number of viable cells (WST-1 (Dojin)), and cultured for 2 hours in a 5% CO 2 incubator at 37 ° C. Thereafter, formazan produced according to the number of living cells was collected from the microchip, and the absorbance at a wavelength of 450 nm was measured with an absorptiometer.
Before the freezing of several microchips, the cell viability at the time of thawing was as follows: As a control, the culture medium was replaced with a culture solution containing WST1 added to the microchips that were simultaneously performed under the same conditions until freezing, and the culture was continued for 2 hours. Then, the absorbance of the produced formazan was measured, and the calculated value was obtained by dividing the absorbances of Examples and Comparative Examples 1 and 2 by the average value. The variation was compared by a coefficient of variation (CV value). For Comparative Example 3, the CV value was calculated for each of the absorbances of formazan.
Further, the cultivation was continued, and the status of bacterial contamination was confirmed.
Table 1 shows the results.
[0021]
[Table 1]
[0022]
【The invention's effect】
According to the present invention, the viability of the cells can be obtained with good reproducibility by performing the thawing operation of the microchip on which the anchorage-dependent animal cells are frozen under the same conditions each time, and the reproducibility is high even in the analysis evaluation. It is possible to provide a method for thawing animal cells contained in a microchip, which can obtain data and suppresses the risk of bacterial contamination.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a schematic diagram of the method for thawing animal cells of the present invention.
[Brief description of reference numerals]
1 microchip 2 bag 3 water 4 air in bag 5 water tank
