JP2004089155A - タンパク質水溶液の精製方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】ウイルス等の不純物をタンパク質水溶液から濾過することにより除去するに際し、従来の方法に比較して、タンパク質水溶液の濾過速度及び透過率が向上した方法を提供する。
【解決手段】タンパク質水溶液を膜により濾過する祭に、タンパク質水溶液をＤＮａｓｅで処理した後、あるいは処理しつつ濾過する方法
【解決手段】タンパク質水溶液を膜により濾過する祭に、タンパク質水溶液をＤＮａｓｅで処理した後、あるいは処理しつつ濾過する方法
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明の利用分野は医薬・医療の分野におけるタンパク質水溶液の精製方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
医薬・医療の分野で、目的物であるタンパク質に不純物が混入した場合には、ウイルス性肝炎等の疾病に罹患する恐れがある（Ｋ． Ｙａｍａｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｅｌｅｃｔｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｓｃ． ４０， ３３７（１９９１））。よって、不純物、特に感染性ウイルスが不活化ないし除去された安全性の高い医薬・医療用タンパク質が希求されている。
【０００３】
不純物を実質的に含まない有用タンパク質を得る方法としては、その製造段階で該タンパク質を含む水溶液を加熱処理、放射線照射、クロマトグラム処理、溶剤及び界面活性剤による処理（いわゆるＳＤ法）、膜分離等で処理する方法が知られている（Ｓ． Ｈａｒａｄａ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ， ２２， ９０８ （１９８５））。しかしながら、膜分離を除く上記の方法は目的とする有用タンパク質を変性・失活させて回収率の低下、変性物による危険性の増加を招いたり、不活化のために加えた界面活性剤等の薬品の除去ないしは無害化が容易でなかったり、不純物の充分な除去効果が得られないなどの問題点を有している（Ｂ． Ｈｏｒｏｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．， Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ， ２５， ５１６ （１９８５））。
【０００４】
一方、膜分離法は、膜構造中に存在する細孔と通過すべき有用タンパク質と阻止すべき粒子（例えばウイルス）の相対的な大きさの差により、物理的にこれら粒子を分離して、結果的に不純物を除去する、いわゆる ｓｉｚｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ 原理によっている。従って有用タンパク質の変性・失活の恐れがなく、また不活化のために薬品を添加することもないのでその除去・無害化も不要である。このため、医薬・医療の分野における有用タンパク質の精製用途において、膜分離の利用が広がっている。
【０００５】
しかし、ｓｉｚｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ原理によれば、除去対象粒子としての不純物の効果的除去と、回収対象粒子としてのタンパク質の効率的な膜透過・回収は二律背反の現象となりがちである。すなわち、除去対象粒子の除去を効果的ならしめようとして膜の細孔の大きさを小さく設定すると、回収対象粒子の膜透過が抑制され、濾過効率すなわち、濾過速度及び透過率（ふるい係数）が低下する。一方、回収対象粒子の膜透過・回収を効率的ならしめようと膜の細孔の大きさを大きく設定すると、除去対象粒子の除去効果を犠牲にすることになる。また、一般に濾過時間の経過に従って、濾過効率を示すこれらのパラメーターは悪化してくる。その理由は、濾過の継続に従って、溶質による細孔の閉塞が発生するためである。この点においても、粒子の大きさと細孔の大きさの相対的関係が影響を及ぼす。不純物の高い除去効果を維持しながら、短時間で、高い透過率で回収対象粒子としてのタンパク質を濾過しようとすれば、膜面積の増大が必要となり、精製コストが増大する。
【０００６】
これらの問題を解決する手段として、膜による分離すなわち濾過に供する前段階で、通過すべき粒子の大きさを減じる方法が考案されている。例えば、後者に関しては、特表平１０−５０２０７４ には、「少なくとも１種の高分子を含む溶液をウイルス濾過する方法であって、該溶液の総塩含有量が約０．２ Ｍ 〜関係塩による該溶液の飽和状態の範囲であることを特徴とする前記方法」が開示されている。塩濃度を高めることにより、濾過効率が向上するのは、タンパク質粒子自体の大きさの収縮、タンパク質粒子同士及びまたはタンパク質と膜との相互作用が減少するためと考えられる。ただし、特表平１０−５０２０７４において、上記効果を奏する塩濃度は０．２Ｍ以上、さらに０．８〜１．５Ｍの範囲が特に好ましいとしているように、生理的に等張な塩濃度を大きく上回る塩濃度が必要とされている。このため静脈注射あるいは筋肉注射により人体に投与する医薬品の場合は、濾過後に透析等によって塩濃度を生理的等張濃度まで低減させる操作が必須である。また、塩濃度を高めていくと、塩析によりタンパク質の溶解度が低下し、逆効果となる可能性もある。
【０００７】
また、典型的なタンパク質水溶液中には、ｐｐｂオーダーのＤＮＡが不純物として含有しており、このＤＮＡとタンパク質との複合体が膜透過における透過流量の減少を引き起していることが動的光散乱法並びに蛍光分光光度法を用いて明らかにされている（Ａ． Ｈｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｓｃｉ．， １８６， ９ （２００１））．この改善策として、タンパク質水溶液中の ＤＮＡ並びにＲＮＡの濃度を低減させた後に、膜濾過を行なってタンパク質水溶液を精製する方法が報告されている（特開平２０００−３１９２９４）。しかしながら、この方法では、タンパク質水溶液中のＤＮＡ並びにＲＮＡの濃度を低減するための前処理に多大な時間がかかってしまい、たとえウイルス等不純物除去の膜濾過時間が低減したとしてもトータルとしての不純物処理精製時間は長くなり、本末転倒した方法であった。
【０００８】
従って、種々のタンパク質水溶液から不純物を、膜濾過により、高い効率すなわち高い濾過速度及び透過率で、安全に、分離・除去する方法が求められている。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
医薬・医療の分野において、タンパク質水溶液から濾過により、ウイルス等の不純物を除去する手段として、膜濾過法は目的とするタンパク質の変性・失活がないため、回収率が高く、他の精製法に比し、優れた方法であるが、不純物の効果的な除去と目的とするタンパク質の濾過効率、すなわち高い濾過速度及び透過率との両立が困難である。本発明の課題はタンパク質水溶液中の不純物として含有するＤＮＡを一部切断することにより、タンパク質ーＤＮＡ複合体を解離させて、タンパク質中に混在しているウイルス等の不純物の効果的な除去を維持しつつ、かつ、高い濾過効率を得る方法を提供することである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明は濾過すべきタンパク質水溶液中に不純物として含有するＤＮＡをＤＮａｓｅを用いることにより、優先的にＤＮＡを切断させることによりタンパク質ーＤＮＡ複合体を解離させて、膜濾過における目詰まりを低減させて、タンパク質水溶液の膜濾過を行なうことを特徴とするタンパク質水溶液精製方法である。タンパク質水溶液中のタンパク質ーＤＮＡ複合体を解離させて、濾過効率を向上させるために、特開平２０００−３１９２９４ではＤＮＡ濃度の低減を主に膜濾過法で行なうことを提言している。しかしながら、本発明者は、ＤＮＡ濃度を低減させなくとも、ＤＮＡ鎖をＤＮａｓｅで処理してＤＮＡ鎖を短くすることにより、タンパク質水溶液中のタンパク質ーＤＮＡ複合体を解離させることが可能であることを実証するに至り、本発明を考案するに至った。
また、本発明は膜濾過により除去すべき対象が主にウイルスであることを特徴とするタンパク質水溶液精製方法である。
【００１１】
本発明で用いられるＤＮａｓｅは、タンパク質水溶液中に溶解していても、胆体に固定化されていても、あるいは膜に固定化されていても良く、ＤＮａｓｅの形状には無関係である。
本発明で用いられるタンパク質の起源は本発明の使用には無関係である。従って、ヒト、動物、植物由来の遺伝子組み替え又は細胞融合技術を使って培養細胞で生産されたあらゆるタンパク質、さらには天然に生産されたタンパク質である。
本発明でいうタンパク質を例示すれば、血漿タンパク質、血清タンパク質、血液凝固第ＶＩＩＩ因子、同第ＩＸ因子、ヘモグロビン、フィブリノーゲン、アンチトロンビンＩＩＩ、免疫ガンマグロブリン、アルブミン、インターフェロン、アポリポ蛋白質、細胞成長増殖因子、細胞外マトリックス、細胞接着因子及び成長ホルモンがあげられる。
本発明で言うタンパク質水溶液とは水を除いた構成成分のうち、タンパク質が１０％以上含有する水溶液を意味している。従って、ヒト並びに動物由来の血漿、血清もこの範疇である。
本発明でいう膜濾過による除去対象となる不純物は感染性ウイルス、細菌、真菌、原虫類、伝達性海綿状脳症病原因子である。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明において用いられる濾過膜は１μｍ以下好ましくは１００ｎｍ以下の平均孔径を有する精密濾過膜（Ｍｉｃｒｏ−ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｍｅｍｂｒａｎｅ）、限外濾過膜（Ｕｌｔｒａ−ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｍｅｍｂｒａｎｅ）、ウイルス除去膜等である。
本発明に用いる濾過膜の素材は、水溶性溶液を濾過できる物であれば、いかなる素材でも良い。例えば、セルロース、セルロースアセテート、ポリフッ化ビニリデン、ポリスルホン、ポリ塩化ビニル、ポリエステル、ポリメチルメタクリレート、ポリアクリロニトリル、ナイロン等であるが、これに限定されるものではない。その中でも、セルロースを素材としたものは親水性であることから、水溶液の透過速度が高く、タンパク質の吸着が少なく、その透過に適しており望ましい。
【００１３】
タンパク質水溶液からのウイルス等の不純物分離用途に用いられる濾過膜を例示すれば、旭化成株式会社製の Ｐｌａｎｏｖａ ３５Ｎ、Ｐｌａｎｏｖａ ２０Ｎ 及びＰｌａｎｏｖａ １５Ｎ（いずれも素材は再生セルロース）， 旭化成株式会社製のポリスルホン中空糸膜（例えば、ＳＩ−１膜）、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ 社製の Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ ７０， Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ １８０（いずれも素材はポリフッ化ビニリデン）、住友電工社製のフロロポア膜（素材は４フッ化エチレン）、コーニングコスター社製ニュクリポァー膜（素材はポリカーボネート）などがあげられる。
本発明に用いる濾過膜の形態は、平膜、中空糸膜、スパイラル膜、プリーツ状膜等いかなる形態を有していてもよい。また、濾過の形式は ｄｅａｄ ｅｎｄ 方式、ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ ｆｌｏｗ 方式のいずれでも適用可能である。
【００１４】
本発明に適したタンパク質水溶液の濃度は種類によって異なるが、例えば、ガンマグロブリン溶液の場合、０．０５〜１０％である。好ましくは３％〜８％である。１０％以下であるのはそれ以上の濃度では、ガンマグロブリン分子同士の会合が高まり、本発明を用いても濾過が非常に困難になるためである。一般にグロブリン溶液の濃度は高ければ高いほどＤＮＡが介在した会合の可能性も高くなり、ＤＮＡータンパク質複合体の解離による透過効率向上の効果が現れやすいので好ましい。
本発明を実施する際のタンパク質水溶液の温度及びｐＨはタンパク質が変性しない範囲であることが望ましい。例えば、ガンマグロブリン溶液の場合、通常、溶液の温度は２℃〜４０℃でｐＨは約７〜８の範囲が望ましい。
【００１５】
溶液中のＤＮＡの測定に関しては、従来ＰＣＲ法、紫外線可視分光光度法、蛍光法が使われてきた。 ＰＣＲ法においては、その検出限界は例えばλファージＤＮＡの場合、約１０ｐｐｍである（バイオ総合カタログ １９９７／１９９８ ｖｏｌ．１ 遺伝子工学、Ｄ−１７， 宝酒造株式会社）。また 、紫外線可視分光度法においては１．０ｐｐｍ程度とされている（Ａ． Ｈｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｓｃｉ．，１１６，１９１（１９９６））。また、エチレンブロマイド（インターカレート剤）を用いた蛍光測定法では、約０．１ｐｐｍである。しかし、蛍光プローブ（ＢＥＡＣＯＮ Ｖ２１６５， ＤＮＡ ＱＵＡＮＴＩＴＡＴＩＯＮ ＫＩＴ、 宝酒造株式会社製）を用いた蛍光測定法では、検出限界を０．５ｐｐｂ以下にすることが可能である（Ｒ． Ｂｏｌｇｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， ２３，５３２（１９９７））。
【００１６】
タンパク質の産生は生体ないしは細胞により行われるので、通常、精製前の生物由来高分子タンパク質水溶液には、ＤＮＡが不可避的に含有されている。
例えば、シグマ社製凍結乾燥ガンマグロブリン（Ｇ−５００９、牛由来）を緩衝液に溶解し、５０００ｐｐｍ （０．５％） の水溶液を調製し、この時のＤＮＡ濃度を測定したところ、ＬｏｔによりＤＮＡ濃度は異なったが、８〜２５±２ｐｐｂであった（Ａ． Ｈｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｓｃｉ．， ｉｎ ｐｒｅｓｓ）。また、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製凍結ガンマグロブリン（１９７−７０００、牛由来）を溶解して得た５％溶液中のＤＮＡ濃度を測定したところ、３７±４ｐｐｂであった。
【００１７】
タンパク質水溶液中のタンパク質ーＤＮＡ複合体を解離させるために、ＤＮＡを切断しなくてはならない。このために用いられるＤＮａｓｅとしては、エンドヌクレアーゼあるいはエキソヌクレアーゼに分類されるいずれのＤＮａｓｅでもよい。またＤＮＡをランダムに切断するＭｉｃｒｏｃｏｃｃａｌ ｎｕｃｌｅａｓｅ、ＤＮａｓｅ Ｉ （Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｉ）、ＤＮａｓｅ ＩＩ （Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ ＩＩ）等もこの範疇である。また、ＤＮＡ中の特異的塩基配列部位で切断する制限エンドヌクレアーゼであるＡｃｃ１、Ａｃｃ２、Ａｃｃ３、Ａｃｙ１、Ａｆｌ２、Ａｇｅ１、Ａｌｕ１、Ａｌｗ ４４ １（ＡｐａＬ １）、Ａｐａ１、Ａｓｅ１、Ａｖａ １、Ａｖａ２、Ａｘｙ１、Ｂａｌ１、Ｂａｍ Ｈ１、Ｂｃｌ１、Ｂｇｌ１、Ｈｐａ Ｉ、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ、ＥｃｏＲ Ｉ等いずれもこの範疇である。これらのうち、比較的安価で汎用性であるＭｉｃｒｏｃｏｃｃａｌ ｎｕｃｌｅａｓｅは本特許の実施するに当たり取り扱いやすいＤＮａｓｅである。
【００１８】
タンパク質水溶液をＤＮａｓｅで処理する方法として、（１）ＤＮａｓｅを直接タンパク質水溶液に添加して撹拌放置する方法、（２）ＤＮａｓｅを胆体に固定化して、このＤＮａｓｅ固定化胆体をタンパク質水溶液中に投入して撹拌放置する方法、さらに（３）膜上にＤＮａｓｅを固定化して、濾過とともにタンパク質水溶液をＤＮａｓｅ処理する方法が考えられる。
【００１９】
（１）のＤＮａｓｅを直接タンパク質水溶液に添加して撹拌放置する方法においては、本発明においては、ＤＮａｓｅ濃度を０．００１ｕｎｉｔ／１００ ｍｌから１０００ｕｎｉｔ／１００ ｍｌの濃度で処理することが適切である。あまり酵素濃度が低いと処理時間が長く要するようになり、また酵素濃度が高くなるとタンパク質水溶液中にＤＮａｓｅという不純物が増大してしまうので、０．１ｕｎｉｔ／１００ ｍｌから１０ｕｎｉｔ／１００ ｍｌの濃度のＤＮａｓｅで処理することが好ましい。また、処理温度は酵素が機能し、かつ変性しない２℃〜５０℃で３０秒から２４時間処理することが適切である。長期時間処理は、前処理時間が長くなるために本発明の趣旨と異なってくるために、１分から１時間程度の処理時間が好ましい。
【００２０】
２）のＤＮａｓｅを胆体に固定化して、このＤＮａｓｅ固定化胆体をタンパク質水溶液中に投入して撹拌放置する方法においては、ＤＮａｓｅを胆体上に固定化されたＤＮａｓｅ固定化胆体をタンパク質水溶液中に投入してＤＮａｓｅ処理を２℃〜５０℃で３０秒から２４時間処理を行なう。長期時間処理は、前処理時間が長くなるために本発明の趣旨と異なってくるために、１分から１時間程度の処理時間が好ましい。また、処理温度は酵素が機能し、かつ変性しない２℃〜５０℃が好ましい。
ＤＮａｓｅ固定化用の胆体として、ポリスチレン、ポリアミド、ポリメチルメタクリレート等より調製されたカラムビーズ、並びにポリエステル、セルロース、ナイロン等より調製された不織布または布、さらに、セルロース、テフロン（登録商標）、ポリフッ化ビニリデン、ポリエチレン、ポリスルホン、ポリイミド等より調製された膜等、ＤＮａｓｅが水溶液中で不容化されていれば、いかなる形式でも良い。ＤＮａｓｅの胆体化反応としては、カルボジイミド法（住田秀司ら、高分子論文集、４３， ６６５ （１９８６））あるいは、スクシンイミド法（Ｈ． Ｋｉｔａｎｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， １１１， ６８０９ （１９８９）） を用いることが可能であるが、これらの方法にとらわれるものではない。
また、ＤＮａｓｅの胆体への固定化法として、物理吸着法でも良いが、一部のＤＮａｓｅが水溶液中に流出することが考えられるために上記（１）の効果もこの場合には含まれることになる。
【００２１】
３）の膜上にＤＮａｓｅを固定化して、濾過とともにタンパク質水溶液をＤＮａｓｅ処理する方法では、ＤＮａｓｅを膜上に固定化されたＤＮａｓｅ固定化膜を調製した後に、タンパク質水溶液をＤＮａｓｅ固定化膜に透過させればよい。この時の処理温度は酵素が機能し、かつ変性しない２℃〜５０℃が好ましい。
ＤＮａｓｅ固定化用の膜の素材は、水溶性溶液を濾過できる物であれば、いかなる素材でも良い。例えば、セルロース、セルロースアセテート、ポリフッ化ビニリデン、ポリスルホン、ポリ塩化ビニル、ポリエステル、ポリメチルメタクリレート、ポリアクリロニトリル、ナイロン等であるが、これに限定されるものではない。その中でも、ウイルス除去膜を用いた場合には、タンパク質水溶液の前処理とともにウイルス除去双方を行なうために本発明では好ましい。同様に、ウイルス除去以外にも、本発明の主眼点である本濾過用の不純物濾過膜上にＤＮａｓｅを固定化した場合には、タンパク質水溶液の前処理とともに不純物除去双方を行なうために本発明では好ましい。しかしながら、ＤＮａｓｅ固定化膜を用いてタンパク質水溶液を処理（透過）させた後に、不純物濾過を膜を用いて行なっても本発明の範疇である。
【００２２】
本発明に従って、タンパク質水溶液をＤＮａｓｅ処理した後、適切に選択された膜を用いて膜濾過を行えば、効果的な不純物除去と同時に、従来の方法に比し、著しく効率的な濾過が実現される。また、不純物濾過用膜上に、ＤＮａｓｅを固定化した場合には、タンパク質水溶液の前処理無しに効果的な不純物除去と同時に、従来の方法に比し、著しく効率的な濾過が実現される。
ＤＮＡを含有するタンパク質水溶液を膜濾過する場合、ＤＮＡの介在により、タンパク質が会合し、その粒子サイズが大きくなり、膜細孔を通過しにくくなるため、濾過効率すなわち濾過速度、透過率が低下する。また、濾過を継続すると、時間の経過に伴い、膜表面及び膜内部の細孔が閉塞していき、濾過効率は通常さらに低下するが、会合によるタンパク質ーＤＮＡ複合体の巨大化により、この傾向が加速される。ＤＮａｓｅ処理を行なうことによりタンパク質ーＤＮＡ複合体を低減させた後、膜濾過することにより、これらの現象を解消することができる。
【００２３】
【実施例】
次に実施例によってこの発明をさらに具体的に説明する。
【実施例１】
ガンマグロブリン（シグマ社製、Ｇ−５００９、牛由来）をトリスアミノメタン塩酸塩（５ ｍＭ／ｌ）／エチレンジアミン−４酢酸−２ナトリウム（０．５ｍＭ／ｌ）緩衝液に溶解し、酢酸を添加してｐＨ８．０の ５０００ｐｐｍガンマグロブリン水溶液を調製した。
このガンマグロブリン水溶液 ３ｍｌに、Ｂｅａｃｏｎ ＤＮＡ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ Ｋｉｔ （Ｖ２１６５、Ｐａｎ Ｖｅｒａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製、宝酒造株式会社より購入）中の蛍光プローブを３０μｌ添加した。励起波長 ４８５ｎｍ，蛍光波長 ５３０ｎｍ（日本分光製、分光蛍光光度計ＦＰ−７７７使用）の条件で、ガンマグロブリン水溶液中のＤＮＡ濃度を、ＤＮＡにインターカレートされた蛍光プローブの蛍光強度より定量した。この時のＤＮＡ濃度は、２５±２ｐｐｂであった。このガンマグロブリン水溶液２００ ｍｌを３７℃に保温した後に、Ｍｉｃｒｏｃｃｏｃａｌ ｎｕｃｌｅａｓｅ （Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ 社製）３Ｕ添加させて、恒温槽中で１時間緩やかに震盪撹拌させた。調製したガンマグロブリン水溶液のＤＮＡ濃度を測定した所、２４±２ｐｐｂであった。このガンマグロブリン水溶液をウイルス除去用フィルター、ＰＬＡＮＯＶＡ ３５Ｎ （旭化成株式会社製、有効膜面積０．００１ｍ２）を用いて圧力０．３気圧、２５℃の条件下で、デッドエンド法による濾過を行なった。透過液を５ ｇづつ採取して、透過液Ｎｏ．を１から順に番号を振った。この透過液に対するガンマグロブリンの透過率並びに透過速度を測定した。ここで、ガンマグロブリンの透過率は以下のように定義した。
透過率 （％）＝（（透過液中のガンマグロブリン濃度）／（原液中のガンマグロブリン濃度））×１００
これらの結果を表１に示す。
【００２４】
【表１】
【００２５】
【比較例１】
実施例１と同様にして、ＤＮａｓｅ未処理の５０００ｐｐｍガンマグロブリン水溶液（ｐＨ８．０）を調製した。さらに、実施例１と同様にしてガンマグロブリン水溶液をウイルス除去用フィルター、ＰＬＡＮＯＶＡ ３５Ｎ （旭化成株式会社製、有効膜面積０．００１ｍ２）を用いて圧力０．３気圧、２５℃の条件下で、デッドエンド法による濾過を行なった。透過液を５ ｇづつ採取して、透過液Ｎｏ．を１から順に番号を振った。この透過液に対するガンマグロブリンの透過率並びに透過速度を測定した。この結果を表２に示す。透過液５０ｇ採取後におけるガンマグロブリン水溶液の透過速度は、０．０１１±０．００２ｍ３／ｍ２ｄａｙであり、実施例１の透過液５０ｇ採取後におけるガンマグロブリン水溶液の透過速度に比べて、１／４２と著しく減少していた。また、ガンマグロブリンの透過率は、実施例１に比べて、いずれの透過液採取後においても、２０％〜４０％減少していた。
【００２６】
【表２】
【００２７】
【実施例２】
酵素処理条件を変化させた以外は実施例１と同様の実験を行なった。酵素処理条件（酵素の種類、酵素処理濃度、処理時間、処理温度）並びに透過液５０ｇ採取後におけるガンマグロブリン水溶液の透過速度と透過率を表３に示す。ここで、Ｍ．Ｎａｓｅは、Ｍｉｃｒｏｃｃｏｃａｌ ｎｕｃｌｅａｓｅ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ 社製）を意味し、ＤＮａｓｅ Ｉは、Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．製（コード番号８９８３５）の酵素を用いた。いずれの場合も、ＤＮａｓｅ処理後のガンマグロブンリン水溶液中には、１０ｐｐｂ以上のＤＮＡが含有していた。透過液５０ｇ採取後における比較例１（表２）並びに表３中の実験１（ＤＮａｓｅ未処理）の値と比較すると、ガンマグロブリン水溶液をＤＮａｓｅ処理することにより、透過速度並びに透過率が共に向上していた。
【００２８】
【表３】
【００２９】
【実施例３】
実施例１と同様に、ガンマグロブリン水溶液を調製し、さらにＤＮａｓｅ処理を行なった。このガンマグロブリン水溶液を、ａ）ウイルス除去用フィルター、ＰＬＡＮＯＶＡ １５Ｎ （旭化成株式会社製、有効膜面積０．００１ｍ２）、ｂ）ＰＬＡＮＯＶＡ ７５Ｎ （旭化成株式会社製、有効膜面積０．００１ｍ２）、ｃ）精密濾過膜、フロロポア膜（ＦＰ−１００、平膜、孔径１．０μｍ、膜面積 １７．３ｃｍ２、住友電工社製）、ｄ）精密濾過膜、ニュクリポァー膜（１１１１０５、平膜、孔径０．１μｍ、膜面積 １７．３ｃｍ２、コーニングコスター社製）並びにｅ）限外濾過膜、ＳＩ−１（ポリスルホン製、中空糸膜、長さ１ｍ、旭化成株式会社製）を用いて圧力０．３気圧、２５℃の条件下で、デッドエンド法による濾過を行なった。透過液５０ｇ採取後におけるガンマグロブリン水溶液の透過速度並びに透過率を表４に示す。
【００３０】
【表４】
【００３１】
【比較例２】
実施例１と同様にして、ＤＮａｓｅ未処理の５０００ｐｐｍガンマグロブリン水溶液（ｐＨ８．０）を調製した。さらに、実施例３と同様にしてガンマグロブリン水溶液を、ａ）ウイルス除去用フィルター、ＰＬＡＮＯＶＡ １５Ｎ （旭化成株式会社製、有効膜面積０．００１ｍ２）、ｂ）ＰＬＡＮＯＶＡ ７５Ｎ （旭化成株式会社製、有効膜面積０．００１ｍ２）、ｃ）精密濾過膜、フロロポア膜（ＦＰ−１００、平膜、孔径１．０μｍ、膜面積 １７．３ｃｍ２、住友電工社製）、ｄ）精密濾過膜、ニュクリポァー膜（１１１１０５、平膜、孔径０．１μｍ、膜面積 １７．３ｃｍ２、コーニングコスター社製）並びにｅ）限外濾過膜、ＳＩ−１（ポリスルホン製、中空糸膜、長さ１ｍ、旭化成株式会社製）を用いて圧力０．３気圧、２５℃の条件下で、デッドエンド法による濾過を行なった。透過液５０ｇ採取後におけるガンマグロブリン水溶液の透過速度並びに透過率を表５に示す。
透過液５０ｇ採取後における実施例３（表４）の値と比較すると、ガンマグロブリン水溶液をＤＮａｓｅ処理することにより、いずれの膜を用いても透過速度が共に向上していた。
【００３２】
【表５】
【００３３】
【実施例４】
８ｗｔ％濃度のガンマグロブリン水溶液を調製した以外は、実施例１と同様な実験を行なった。この時のＤＮＡ濃度は４００±３０ｐｐｂであった。透過液５０ｇ採取後におけるガンマグロブリン水溶液の透過速度は、ＤＮａｓｅ未処理の８ｗｔ％濃度のガンマグロブリン水溶液を用いて測定した透過速度より２３５倍向上していた。
【００３４】
【実施例５】
５００ｐｐｍの濃度のガンマグロブリン水溶液を調製した以外は、実施例１と同様な実験を行なった。透過液５０ｇ採取後におけるガンマグロブリン水溶液の透過速度は、ＤＮａｓｅ未処理の５００ｐｐｍ濃度のガンマグロブリン水溶液を用いて測定した透過速度より１１倍向上していた。
【００３５】
【実施例６】
血液凝固因子ＩＸ水溶液（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＡＢ社製、Ｎａｎｏｔｉｖ、ヒト血漿由来）２００ ｍｌを３７℃に保温した後に、Ｍｉｃｒｏｃｃｏｃａｌ ｎｕｃｌｅａｓｅ （Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ 社製）３Ｕ添加させて、恒温槽中で１時間緩やかに震盪撹拌させた。調製した血液凝固因子ＩＸ水溶液のＤＮＡ濃度を測定した所、７±２ｐｐｂであった。この血液凝固因子ＩＸ水溶液をウイルス除去用フィルター、Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ／１８０ （ミリポア社製、有効膜面積１／３ｆｔ２）を用いて圧力０．３気圧、２５℃の条件下で、デッドエンド法による濾過を行なった。透過液５０ｇ採取後における血液凝固因子ＩＸ水溶液の透過速度は、ＤＮａｓｅ未処理の血液凝固因子ＩＸ水溶液を用いて測定した透過速度より４．８倍向上していた。
【００３６】
【実施例７】
ヒト血清アルブミン４ｗｔ％水溶液（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＡＢ社製）２００ ｍｌを３７℃に保温した後に、Ｍｉｃｒｏｃｃｏｃａｌ ｎｕｃｌｅａｓｅ （Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ 社製）３Ｕ添加させて、恒温槽中で１時間緩やかに震盪撹拌させた。調製したヒト血清アルブミン水溶液のＤＮＡ濃度を測定した所、４３±２ｐｐｂであった。このヒト血清アルブミン水溶液をウイルス除去用フィルター、Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ／１８０ （ミリポア社製、有効膜面積１／３ｆｔ２）を用いて圧力０．３気圧、２５℃の条件下で、デッドエンド法による濾過を行なった。透過液５０ｇ採取後における血液凝固因子ＩＸ水溶液の透過速度は、ＤＮａｓｅ未処理のヒト血清アルブミン水溶液を用いて測定した透過速度より５６．３倍向上していた。
【００３７】
【実施例８】
アンチトロンビン（ＡＴＩＩＩ）水溶液（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＡＢ社製、ＡＴｅｎａｔｉｖ、ヒト血漿由来）２００ ｍｌを３７℃に保温した後に、Ｍｉｃｒｏｃｃｏｃａｌ ｎｕｃｌｅａｓｅ （Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ 社製）３Ｕ添加させて、恒温槽中で１時間緩やかに震盪撹拌させた。調製したアンチトロンビン水溶液のＤＮＡ濃度を測定した所、９±２ｐｐｂであった。このアンチトロンビン水溶液をウイルス除去用フィルター、Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ／１８０ （ミリポア社製、有効膜面積１／３ｆｔ２）を用いて圧力０．３気圧、２５℃の条件下で、デッドエンド法による濾過を行なった。透過液５０ｇ採取後におけるアンチトロンビンＩＸ水溶液の透過速度は、ＤＮａｓｅ未処理の血液凝固因子ＩＸ水溶液を用いて測定した透過速度より６．２倍向上していた。
【００３８】
【実施例９】
ウイルス除去用フィルター、ＰＬＡＮＯＶＡ ３５Ｎ （旭化成株式会社製、有効膜面積０．００１ｍ２）へのＤＮａｓｅの固定化を行なった。すなわち、ｐＨ１０．５に調製した１０ｍｇ／ｍｌのＣＮＢｒ水溶液をＰＬＡＮＯＶＡ ３５Ｎ膜中にマイクロチューブポンプ（ＭＰ−３Ｎ、東京理化器械社製）を用いて６０分間、２５℃で循環させた。６０分経過した後、０．１ｍｏｌ／ｌ炭酸水素ナトリウム水溶液でＰＬＡＮＯＶＡ ３５Ｎ膜を洗浄した。次にマイクロチューブポンプを用いて、ｐＨ９．１に調製したエタノールアミン溶液を６０分間、２５℃でＰＬＡＮＯＶＡ ３５Ｎ膜中に循環させた。このＣＮＢｒ活性化ＰＬＡＮＯＶＡ ３５Ｎ膜を０．５ｍｏｌ／ｌの塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、続いて超純水で洗浄を行なった。ヒドラジン１水和物５０ｍｌに超純水１５０ｍｌを溶解させたヒドラジン水溶液をＣＮＢｒ活性化ＰＬＡＮＯＶＡ ３５Ｎ膜中にマイクロチューブポンプを用いて１０時間、２５℃で循環させた。１０時間後、このＮＨ２基導入ＰＬＡＮＯＶＡ ３５Ｎ膜を超純水で洗浄した。二塩化ズベジミン酸ジメチル０．００８２ｇを２００ｍｌの超純水に溶解させたｐＨ１０の水溶液をＮＨ２基導入ＰＬＡＮＯＶＡ ３５Ｎ膜中にマイクロチューブポンプを用いて３０分間、２５℃で循環させた。超純水で二塩化ズベジミン酸ジメチル処理済みＰＬＡＮＯＶＡ ３５Ｎ膜を洗浄した後に、２００ｍｌのｐＨ８．５の１０００ｕｎｉｔＤＮａｓｅ（Ｍｉｃｒｏｃｃｏｃａｌ ｎｕｃｌｅａｓｅ （Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ 社製））水溶液をマイクロチューブポンプを用いて１８時間、２５℃で循環させた。その後、超純水でＤＮａｓｅ固定化ＰＬＡＮＯＶＡ ３５Ｎ膜を洗浄した。ＤＮａｓｅ固定化ＰＬＡＮＯＶＡ ３５Ｎ膜に固定されたＤＮａｓｅ量を水溶液中の既知量のＤＮａｓｅによるＤＮＡの分解量と比較検討したところ、１１ｕｎｉｔ／０．００１ｍ２量がＤＮａｓｅ固定化ＰＬＡＮＯＶＡ ３５Ｎ膜上にＤＮａｓｅが固定化されていることが確認された。
ＤＮａｓｅ固定化ＰＬＡＮＯＶＡ ３５Ｎを用いた以外は、比較例１と同様な実験を行なった。透過液５０ｇ採取後における透過速度は比較例１より４７％向上しており、ガンマグロブリンの透過率は比較例１より１６％向上していた。
【００３９】
【実施例１０】
乾燥ポリスルホン中空糸膜（ＳＩ−１、公称分画分子量６０００、旭化成株式会社製）を１００％のエタノール溶液に１時間浸漬させた。その後、５０％エタノール＋５０％ヘキサン溶液中に中空糸を１時間浸漬させた。さらに、１００％ヘキサン溶液中に中空糸を１時間浸漬させた。上記処理により、中空糸膜に含有するグリセリンを除去した。
上記ポリスルホン中空糸膜（３ｍ）をクロロジメチルエーテル（東京化成工業製、７．７２ｇ）、塩化第２スズ（和光純薬製、２５ｇ）、ヘキサン（和光純薬、２２８ｍｌ）の混合溶液中（上記試薬のモル比は、５：５：９０）に浸漬させ、２８℃で、６時間反応させた。このクロロメチル化ポルスルホン中空糸膜は、赤外吸収スペクトルより７６０ｃｍ−１にＣ−Ｃｌ結合に基づく赤外吸収が観察された。また、上記で調製したクロロメチル化ポルスルホン中空糸膜を重水素化クロロホルムに溶解させて１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを測定した。１Ｈ−ＮＭＲスペクトルよりクロロメチル基のメチレン部位のプロトンに基づくピークが４．５ｐｐｍに観察された。元素分析より、ポリスルホンの繰り返し構造単位当たり０．４３個のクロロメチル基が導入されていることを確認した。
次にクロロメチル化ポルスルホン中空糸膜をエチレンジアミン溶液２００ｍｌ中に浸漬させ、２０分間穏やかに攪拌しながらエチレンジアミン化反応を行った。エチレンジアミン化ポリスルホン中空糸膜は、赤外吸収スペクトルより３３００ｃｍ−１にＮＨ２基に基づく赤外吸収が観察された。また、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルより４．５ｐｐｍに観察されたクロロメチル基のメチレン部位のプロトンに基づくピークがほぼ消失していた。エチレンジアミン化ポリスルホン中空糸膜のイオン交換容量よりポリスルホンの繰り返し構造単位当たり０．０６個のエチレンジアミン基が導入されていることを確認した。
二塩化ズベジミン酸ジメチル０．００８２ｇを２００ｍｌの超純水に溶解させたｐＨ１０の水溶液中にエチレンジアミン化ポリスルホン中空糸膜を、３０分間、２５℃の条件下で浸漬させた。超純水で二塩化ズベジミン酸ジメチル処理済みポリスルホン中空糸膜を洗浄した後に、２００ｍｌのｐＨ８．５の１０００ｕｎｉｔＤＮａｓｅ（Ｍｉｃｒｏｃｃｏｃａｌ ｎｕｃｌｅａｓｅ （Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ 社製））水溶液中に１８時間、２５℃の条件下で浸漬させた。その後、超純水でＤＮａｓｅ固定化ポリスルホン中空糸膜を洗浄した。ＤＮａｓｅ固定化ポリスルホン中空糸膜に固定されたＤＮａｓｅ量を水溶液中の既知量のＤＮａｓｅによるＤＮＡの分解量と比較検討したところ、４ｕｎｉｔ／０．００１ｍ２量のＤＮａｓｅがＤＮａｓｅ固定化ポリスルホン中空糸膜上に固定化されていることが確認された。
ＤＮａｓｅ固定化ポリスルホン中空糸膜を用いた以外は、比較例１と同様な実験を行なった。透過液５０ｇ採取後における透過速度はＤＮａｓｅが固定化されていないポリスルホン中空糸膜より２３％向上しており、ガンマグロブリンの透過率は比較例１より７％向上していた。
【００４０】
【実施例１１】
０．２Ｍ ＮａＨＣＯ３と０．５Ｍ ＮａＣｌを含有するｐＨ８．３の水溶液１０ｍｌに１００ｕｎｉｔのＤＮａｓｅ（Ｍｉｃｒｏｃｃｏｃａｌ ｎｕｃｌｅａｓｅ （Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ 社製））を溶解させた。このＤＮａｓｅ水溶液をリガンド固定化用カップリング担体（ＨｉＴｒａｐ ＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＨＰ ｃｏｌｕｍｎ、アマシャムファルマシアバイオテク株式会社製）に注入して、１時間室温で放置した。その後、ブロッキング水溶液（Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅ ４倍希釈液、ＵＫ−Ｂ８０、大日本製薬株式会社）を５０ｍｌ上記調製カラムに流した。酵素固定化率は、８５％であることが、カラム流出液中の酵素濃度より算出された。
比較例１と同様にして、ＤＮａｓｅ未処理の５０００ｐｐｍガンマグロブリン水溶液（ｐＨ８．０）を調製した。このガンマグロブリン水溶液をＤＮａｓｅ固定化カラム中に１ｍｌ／ｍｉｎの速度で流した。次に、カラム処理ガンマグロブリン水溶液を実施例１と同様にしてウイルス除去用フィルター、ＰＬＡＮＯＶＡ ３５Ｎ （旭化成株式会社製、有効膜面積０．００１ｍ２）を用いて圧力０．３気圧、２５℃の条件下で、デッドエンド法による濾過を行なった。透過液５０ｇ採取後における透過速度は比較例１と比較して、５８倍上昇しており、ガンマグロブリンの透過率は比較例１より１８％向上していた。
【００４１】
【実施例１２】
ポリエステル製不織布０．５ｇをクロロジメチルエーテル（東京化成工業製、７．７２ｇ）、塩化第２スズ（和光純薬製、２５ｇ）、ヘキサン（和光純薬、２２８ｍｌ）の混合溶液中（上記試薬のモル比は、５：５：９０）に浸漬させ、２８℃、６時間反応させて、クロロメチル化ポリエステル不織布を調製した。次にクロロメチル化ポリエステル不織布をエチレンジアミン溶液２００ｍｌ中に浸漬させ、２０分間穏やかに攪拌しながらエチレンジアミン化反応を行った。その後、超純水でエチレンジアミン化ポリエステル不織布を洗浄した。
二塩化ズベジミン酸ジメチル０．００８２ｇを２００ｍｌの超純水に溶解させたｐＨ１０の水溶液中にエチレンジアミン化ポリエステル不織布を、３０分間、２５℃の条件下で浸漬させた。超純水で二塩化ズベジミン酸ジメチル処理済みポリエステル不織布を洗浄した後に、２００ｍｌのｐＨ８．５の１０００ｕｎｉｔＤＮａｓｅ（Ｍｉｃｒｏｃｃｏｃａｌ ｎｕｃｌｅａｓｅ （Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ 社製））水溶液中に１８時間、２５℃の条件下で浸漬させた。その後、超純水でＤＮａｓｅ固定化ポリエステル不織布を洗浄した。ＤＮａｓｅ固定化ポリエステル不織布に固定されたＤＮａｓｅ量を水溶液中の既知量のＤＮａｓｅによるＤＮＡの分解量と比較検討したところ、２０ｕｎｉｔ／０．００１ｍ２量がＤＮａｓｅ固定化ポリエステル不織布上にＤＮａｓｅが固定化されていることが確認された。
比較例１で調製したガンマグロブリン水溶液をＤＮａｓｅ固定化ポリエステル不織布に３０分接触させた。その後、実施例１と同様にしてガンマグロブリン水溶液をウイルス除去用フィルター、ＰＬＡＮＯＶＡ ３５Ｎ （旭化成株式会社製、有効膜面積０．００１ｍ２）を用いて圧力０．３気圧、２５℃の条件下で、デッドエンド法による濾過を行なった。透過液５０ｇ採取後における透過速度は比較例１と比較して、３４倍上昇しており、ガンマグロブリンの透過率は比較例１より１５％向上していた。
【００４２】
【実施例１３】
実施例１におけるガンマグロブリン水溶液に、ブタ日本脳炎ウイルスを加え、実施例１に従って、５０ｇの溶液（原液）を濾過し、透過液を採取した。これを実験Ａとする。比較例１におけるガンマグロブリン水溶液に、ブタ日本脳炎ウイルスを加え、比較例１に従って、５０ｇの溶液（原液）を濾過し、透過液を採取した。これを実験Ｂとする。濾過前の水溶液（原液）は実験Ａ及び実験Ｂのいずれについても、その中のウイルスの感染力価はいずれも８．２ｌｏｇであった。Ｍｉｃｒｏｃｃｏｃａｌ ｎｕｃｌｅａｓｅ処理した実験Ａの透過液中のウイルス感染力価を分析したところ、ウイルス除去率は５．５であった。また、Ｍｉｃｒｏｃｃｏｃａｌ ｎｕｃｌｅａｓｅ処理していない実験Ｂの透過液中のウイルス感染力価を分析してウイルス除去率を求めたところ、５．８であった。ここで、ウイルス除去率（ＬＲＶ）は、下記の定義によった。
ＬＲＶ ＝ −ｌｏｇ（（透過液中のウイルス感染力価）／（原液中のウイルス感染力価））
上記の結果はウイルス安全性に関する規制当局のガイドラインを充分満たすものであり、本発明によっても、従来の方法と同様に高効率でのウイルス除去が可能である。
【００４３】
【発明の効果】
本発明の方法によれば、タンパク質水溶液をＤＮａｓｅで処理することにより、ウイルス等の不純物をタンパク質水溶液から除去するに際し、従来の方法に比較して、タンパク質水溶液の濾過速度及び透過率が向上し、これにより、生産効率が向上し、製造コストが低減できる。
【産業上の利用分野】
本発明の利用分野は医薬・医療の分野におけるタンパク質水溶液の精製方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
医薬・医療の分野で、目的物であるタンパク質に不純物が混入した場合には、ウイルス性肝炎等の疾病に罹患する恐れがある（Ｋ． Ｙａｍａｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｅｌｅｃｔｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｓｃ． ４０， ３３７（１９９１））。よって、不純物、特に感染性ウイルスが不活化ないし除去された安全性の高い医薬・医療用タンパク質が希求されている。
【０００３】
不純物を実質的に含まない有用タンパク質を得る方法としては、その製造段階で該タンパク質を含む水溶液を加熱処理、放射線照射、クロマトグラム処理、溶剤及び界面活性剤による処理（いわゆるＳＤ法）、膜分離等で処理する方法が知られている（Ｓ． Ｈａｒａｄａ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ， ２２， ９０８ （１９８５））。しかしながら、膜分離を除く上記の方法は目的とする有用タンパク質を変性・失活させて回収率の低下、変性物による危険性の増加を招いたり、不活化のために加えた界面活性剤等の薬品の除去ないしは無害化が容易でなかったり、不純物の充分な除去効果が得られないなどの問題点を有している（Ｂ． Ｈｏｒｏｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．， Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ， ２５， ５１６ （１９８５））。
【０００４】
一方、膜分離法は、膜構造中に存在する細孔と通過すべき有用タンパク質と阻止すべき粒子（例えばウイルス）の相対的な大きさの差により、物理的にこれら粒子を分離して、結果的に不純物を除去する、いわゆる ｓｉｚｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ 原理によっている。従って有用タンパク質の変性・失活の恐れがなく、また不活化のために薬品を添加することもないのでその除去・無害化も不要である。このため、医薬・医療の分野における有用タンパク質の精製用途において、膜分離の利用が広がっている。
【０００５】
しかし、ｓｉｚｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ原理によれば、除去対象粒子としての不純物の効果的除去と、回収対象粒子としてのタンパク質の効率的な膜透過・回収は二律背反の現象となりがちである。すなわち、除去対象粒子の除去を効果的ならしめようとして膜の細孔の大きさを小さく設定すると、回収対象粒子の膜透過が抑制され、濾過効率すなわち、濾過速度及び透過率（ふるい係数）が低下する。一方、回収対象粒子の膜透過・回収を効率的ならしめようと膜の細孔の大きさを大きく設定すると、除去対象粒子の除去効果を犠牲にすることになる。また、一般に濾過時間の経過に従って、濾過効率を示すこれらのパラメーターは悪化してくる。その理由は、濾過の継続に従って、溶質による細孔の閉塞が発生するためである。この点においても、粒子の大きさと細孔の大きさの相対的関係が影響を及ぼす。不純物の高い除去効果を維持しながら、短時間で、高い透過率で回収対象粒子としてのタンパク質を濾過しようとすれば、膜面積の増大が必要となり、精製コストが増大する。
【０００６】
これらの問題を解決する手段として、膜による分離すなわち濾過に供する前段階で、通過すべき粒子の大きさを減じる方法が考案されている。例えば、後者に関しては、特表平１０−５０２０７４ には、「少なくとも１種の高分子を含む溶液をウイルス濾過する方法であって、該溶液の総塩含有量が約０．２ Ｍ 〜関係塩による該溶液の飽和状態の範囲であることを特徴とする前記方法」が開示されている。塩濃度を高めることにより、濾過効率が向上するのは、タンパク質粒子自体の大きさの収縮、タンパク質粒子同士及びまたはタンパク質と膜との相互作用が減少するためと考えられる。ただし、特表平１０−５０２０７４において、上記効果を奏する塩濃度は０．２Ｍ以上、さらに０．８〜１．５Ｍの範囲が特に好ましいとしているように、生理的に等張な塩濃度を大きく上回る塩濃度が必要とされている。このため静脈注射あるいは筋肉注射により人体に投与する医薬品の場合は、濾過後に透析等によって塩濃度を生理的等張濃度まで低減させる操作が必須である。また、塩濃度を高めていくと、塩析によりタンパク質の溶解度が低下し、逆効果となる可能性もある。
【０００７】
また、典型的なタンパク質水溶液中には、ｐｐｂオーダーのＤＮＡが不純物として含有しており、このＤＮＡとタンパク質との複合体が膜透過における透過流量の減少を引き起していることが動的光散乱法並びに蛍光分光光度法を用いて明らかにされている（Ａ． Ｈｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｓｃｉ．， １８６， ９ （２００１））．この改善策として、タンパク質水溶液中の ＤＮＡ並びにＲＮＡの濃度を低減させた後に、膜濾過を行なってタンパク質水溶液を精製する方法が報告されている（特開平２０００−３１９２９４）。しかしながら、この方法では、タンパク質水溶液中のＤＮＡ並びにＲＮＡの濃度を低減するための前処理に多大な時間がかかってしまい、たとえウイルス等不純物除去の膜濾過時間が低減したとしてもトータルとしての不純物処理精製時間は長くなり、本末転倒した方法であった。
【０００８】
従って、種々のタンパク質水溶液から不純物を、膜濾過により、高い効率すなわち高い濾過速度及び透過率で、安全に、分離・除去する方法が求められている。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
医薬・医療の分野において、タンパク質水溶液から濾過により、ウイルス等の不純物を除去する手段として、膜濾過法は目的とするタンパク質の変性・失活がないため、回収率が高く、他の精製法に比し、優れた方法であるが、不純物の効果的な除去と目的とするタンパク質の濾過効率、すなわち高い濾過速度及び透過率との両立が困難である。本発明の課題はタンパク質水溶液中の不純物として含有するＤＮＡを一部切断することにより、タンパク質ーＤＮＡ複合体を解離させて、タンパク質中に混在しているウイルス等の不純物の効果的な除去を維持しつつ、かつ、高い濾過効率を得る方法を提供することである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明は濾過すべきタンパク質水溶液中に不純物として含有するＤＮＡをＤＮａｓｅを用いることにより、優先的にＤＮＡを切断させることによりタンパク質ーＤＮＡ複合体を解離させて、膜濾過における目詰まりを低減させて、タンパク質水溶液の膜濾過を行なうことを特徴とするタンパク質水溶液精製方法である。タンパク質水溶液中のタンパク質ーＤＮＡ複合体を解離させて、濾過効率を向上させるために、特開平２０００−３１９２９４ではＤＮＡ濃度の低減を主に膜濾過法で行なうことを提言している。しかしながら、本発明者は、ＤＮＡ濃度を低減させなくとも、ＤＮＡ鎖をＤＮａｓｅで処理してＤＮＡ鎖を短くすることにより、タンパク質水溶液中のタンパク質ーＤＮＡ複合体を解離させることが可能であることを実証するに至り、本発明を考案するに至った。
また、本発明は膜濾過により除去すべき対象が主にウイルスであることを特徴とするタンパク質水溶液精製方法である。
【００１１】
本発明で用いられるＤＮａｓｅは、タンパク質水溶液中に溶解していても、胆体に固定化されていても、あるいは膜に固定化されていても良く、ＤＮａｓｅの形状には無関係である。
本発明で用いられるタンパク質の起源は本発明の使用には無関係である。従って、ヒト、動物、植物由来の遺伝子組み替え又は細胞融合技術を使って培養細胞で生産されたあらゆるタンパク質、さらには天然に生産されたタンパク質である。
本発明でいうタンパク質を例示すれば、血漿タンパク質、血清タンパク質、血液凝固第ＶＩＩＩ因子、同第ＩＸ因子、ヘモグロビン、フィブリノーゲン、アンチトロンビンＩＩＩ、免疫ガンマグロブリン、アルブミン、インターフェロン、アポリポ蛋白質、細胞成長増殖因子、細胞外マトリックス、細胞接着因子及び成長ホルモンがあげられる。
本発明で言うタンパク質水溶液とは水を除いた構成成分のうち、タンパク質が１０％以上含有する水溶液を意味している。従って、ヒト並びに動物由来の血漿、血清もこの範疇である。
本発明でいう膜濾過による除去対象となる不純物は感染性ウイルス、細菌、真菌、原虫類、伝達性海綿状脳症病原因子である。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明において用いられる濾過膜は１μｍ以下好ましくは１００ｎｍ以下の平均孔径を有する精密濾過膜（Ｍｉｃｒｏ−ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｍｅｍｂｒａｎｅ）、限外濾過膜（Ｕｌｔｒａ−ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｍｅｍｂｒａｎｅ）、ウイルス除去膜等である。
本発明に用いる濾過膜の素材は、水溶性溶液を濾過できる物であれば、いかなる素材でも良い。例えば、セルロース、セルロースアセテート、ポリフッ化ビニリデン、ポリスルホン、ポリ塩化ビニル、ポリエステル、ポリメチルメタクリレート、ポリアクリロニトリル、ナイロン等であるが、これに限定されるものではない。その中でも、セルロースを素材としたものは親水性であることから、水溶液の透過速度が高く、タンパク質の吸着が少なく、その透過に適しており望ましい。
【００１３】
タンパク質水溶液からのウイルス等の不純物分離用途に用いられる濾過膜を例示すれば、旭化成株式会社製の Ｐｌａｎｏｖａ ３５Ｎ、Ｐｌａｎｏｖａ ２０Ｎ 及びＰｌａｎｏｖａ １５Ｎ（いずれも素材は再生セルロース）， 旭化成株式会社製のポリスルホン中空糸膜（例えば、ＳＩ−１膜）、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ 社製の Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ ７０， Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ １８０（いずれも素材はポリフッ化ビニリデン）、住友電工社製のフロロポア膜（素材は４フッ化エチレン）、コーニングコスター社製ニュクリポァー膜（素材はポリカーボネート）などがあげられる。
本発明に用いる濾過膜の形態は、平膜、中空糸膜、スパイラル膜、プリーツ状膜等いかなる形態を有していてもよい。また、濾過の形式は ｄｅａｄ ｅｎｄ 方式、ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ ｆｌｏｗ 方式のいずれでも適用可能である。
【００１４】
本発明に適したタンパク質水溶液の濃度は種類によって異なるが、例えば、ガンマグロブリン溶液の場合、０．０５〜１０％である。好ましくは３％〜８％である。１０％以下であるのはそれ以上の濃度では、ガンマグロブリン分子同士の会合が高まり、本発明を用いても濾過が非常に困難になるためである。一般にグロブリン溶液の濃度は高ければ高いほどＤＮＡが介在した会合の可能性も高くなり、ＤＮＡータンパク質複合体の解離による透過効率向上の効果が現れやすいので好ましい。
本発明を実施する際のタンパク質水溶液の温度及びｐＨはタンパク質が変性しない範囲であることが望ましい。例えば、ガンマグロブリン溶液の場合、通常、溶液の温度は２℃〜４０℃でｐＨは約７〜８の範囲が望ましい。
【００１５】
溶液中のＤＮＡの測定に関しては、従来ＰＣＲ法、紫外線可視分光光度法、蛍光法が使われてきた。 ＰＣＲ法においては、その検出限界は例えばλファージＤＮＡの場合、約１０ｐｐｍである（バイオ総合カタログ １９９７／１９９８ ｖｏｌ．１ 遺伝子工学、Ｄ−１７， 宝酒造株式会社）。また 、紫外線可視分光度法においては１．０ｐｐｍ程度とされている（Ａ． Ｈｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｓｃｉ．，１１６，１９１（１９９６））。また、エチレンブロマイド（インターカレート剤）を用いた蛍光測定法では、約０．１ｐｐｍである。しかし、蛍光プローブ（ＢＥＡＣＯＮ Ｖ２１６５， ＤＮＡ ＱＵＡＮＴＩＴＡＴＩＯＮ ＫＩＴ、 宝酒造株式会社製）を用いた蛍光測定法では、検出限界を０．５ｐｐｂ以下にすることが可能である（Ｒ． Ｂｏｌｇｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， ２３，５３２（１９９７））。
【００１６】
タンパク質の産生は生体ないしは細胞により行われるので、通常、精製前の生物由来高分子タンパク質水溶液には、ＤＮＡが不可避的に含有されている。
例えば、シグマ社製凍結乾燥ガンマグロブリン（Ｇ−５００９、牛由来）を緩衝液に溶解し、５０００ｐｐｍ （０．５％） の水溶液を調製し、この時のＤＮＡ濃度を測定したところ、ＬｏｔによりＤＮＡ濃度は異なったが、８〜２５±２ｐｐｂであった（Ａ． Ｈｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｓｃｉ．， ｉｎ ｐｒｅｓｓ）。また、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製凍結ガンマグロブリン（１９７−７０００、牛由来）を溶解して得た５％溶液中のＤＮＡ濃度を測定したところ、３７±４ｐｐｂであった。
【００１７】
タンパク質水溶液中のタンパク質ーＤＮＡ複合体を解離させるために、ＤＮＡを切断しなくてはならない。このために用いられるＤＮａｓｅとしては、エンドヌクレアーゼあるいはエキソヌクレアーゼに分類されるいずれのＤＮａｓｅでもよい。またＤＮＡをランダムに切断するＭｉｃｒｏｃｏｃｃａｌ ｎｕｃｌｅａｓｅ、ＤＮａｓｅ Ｉ （Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｉ）、ＤＮａｓｅ ＩＩ （Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ ＩＩ）等もこの範疇である。また、ＤＮＡ中の特異的塩基配列部位で切断する制限エンドヌクレアーゼであるＡｃｃ１、Ａｃｃ２、Ａｃｃ３、Ａｃｙ１、Ａｆｌ２、Ａｇｅ１、Ａｌｕ１、Ａｌｗ ４４ １（ＡｐａＬ １）、Ａｐａ１、Ａｓｅ１、Ａｖａ １、Ａｖａ２、Ａｘｙ１、Ｂａｌ１、Ｂａｍ Ｈ１、Ｂｃｌ１、Ｂｇｌ１、Ｈｐａ Ｉ、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ、ＥｃｏＲ Ｉ等いずれもこの範疇である。これらのうち、比較的安価で汎用性であるＭｉｃｒｏｃｏｃｃａｌ ｎｕｃｌｅａｓｅは本特許の実施するに当たり取り扱いやすいＤＮａｓｅである。
【００１８】
タンパク質水溶液をＤＮａｓｅで処理する方法として、（１）ＤＮａｓｅを直接タンパク質水溶液に添加して撹拌放置する方法、（２）ＤＮａｓｅを胆体に固定化して、このＤＮａｓｅ固定化胆体をタンパク質水溶液中に投入して撹拌放置する方法、さらに（３）膜上にＤＮａｓｅを固定化して、濾過とともにタンパク質水溶液をＤＮａｓｅ処理する方法が考えられる。
【００１９】
（１）のＤＮａｓｅを直接タンパク質水溶液に添加して撹拌放置する方法においては、本発明においては、ＤＮａｓｅ濃度を０．００１ｕｎｉｔ／１００ ｍｌから１０００ｕｎｉｔ／１００ ｍｌの濃度で処理することが適切である。あまり酵素濃度が低いと処理時間が長く要するようになり、また酵素濃度が高くなるとタンパク質水溶液中にＤＮａｓｅという不純物が増大してしまうので、０．１ｕｎｉｔ／１００ ｍｌから１０ｕｎｉｔ／１００ ｍｌの濃度のＤＮａｓｅで処理することが好ましい。また、処理温度は酵素が機能し、かつ変性しない２℃〜５０℃で３０秒から２４時間処理することが適切である。長期時間処理は、前処理時間が長くなるために本発明の趣旨と異なってくるために、１分から１時間程度の処理時間が好ましい。
【００２０】
２）のＤＮａｓｅを胆体に固定化して、このＤＮａｓｅ固定化胆体をタンパク質水溶液中に投入して撹拌放置する方法においては、ＤＮａｓｅを胆体上に固定化されたＤＮａｓｅ固定化胆体をタンパク質水溶液中に投入してＤＮａｓｅ処理を２℃〜５０℃で３０秒から２４時間処理を行なう。長期時間処理は、前処理時間が長くなるために本発明の趣旨と異なってくるために、１分から１時間程度の処理時間が好ましい。また、処理温度は酵素が機能し、かつ変性しない２℃〜５０℃が好ましい。
ＤＮａｓｅ固定化用の胆体として、ポリスチレン、ポリアミド、ポリメチルメタクリレート等より調製されたカラムビーズ、並びにポリエステル、セルロース、ナイロン等より調製された不織布または布、さらに、セルロース、テフロン（登録商標）、ポリフッ化ビニリデン、ポリエチレン、ポリスルホン、ポリイミド等より調製された膜等、ＤＮａｓｅが水溶液中で不容化されていれば、いかなる形式でも良い。ＤＮａｓｅの胆体化反応としては、カルボジイミド法（住田秀司ら、高分子論文集、４３， ６６５ （１９８６））あるいは、スクシンイミド法（Ｈ． Ｋｉｔａｎｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， １１１， ６８０９ （１９８９）） を用いることが可能であるが、これらの方法にとらわれるものではない。
また、ＤＮａｓｅの胆体への固定化法として、物理吸着法でも良いが、一部のＤＮａｓｅが水溶液中に流出することが考えられるために上記（１）の効果もこの場合には含まれることになる。
【００２１】
３）の膜上にＤＮａｓｅを固定化して、濾過とともにタンパク質水溶液をＤＮａｓｅ処理する方法では、ＤＮａｓｅを膜上に固定化されたＤＮａｓｅ固定化膜を調製した後に、タンパク質水溶液をＤＮａｓｅ固定化膜に透過させればよい。この時の処理温度は酵素が機能し、かつ変性しない２℃〜５０℃が好ましい。
ＤＮａｓｅ固定化用の膜の素材は、水溶性溶液を濾過できる物であれば、いかなる素材でも良い。例えば、セルロース、セルロースアセテート、ポリフッ化ビニリデン、ポリスルホン、ポリ塩化ビニル、ポリエステル、ポリメチルメタクリレート、ポリアクリロニトリル、ナイロン等であるが、これに限定されるものではない。その中でも、ウイルス除去膜を用いた場合には、タンパク質水溶液の前処理とともにウイルス除去双方を行なうために本発明では好ましい。同様に、ウイルス除去以外にも、本発明の主眼点である本濾過用の不純物濾過膜上にＤＮａｓｅを固定化した場合には、タンパク質水溶液の前処理とともに不純物除去双方を行なうために本発明では好ましい。しかしながら、ＤＮａｓｅ固定化膜を用いてタンパク質水溶液を処理（透過）させた後に、不純物濾過を膜を用いて行なっても本発明の範疇である。
【００２２】
本発明に従って、タンパク質水溶液をＤＮａｓｅ処理した後、適切に選択された膜を用いて膜濾過を行えば、効果的な不純物除去と同時に、従来の方法に比し、著しく効率的な濾過が実現される。また、不純物濾過用膜上に、ＤＮａｓｅを固定化した場合には、タンパク質水溶液の前処理無しに効果的な不純物除去と同時に、従来の方法に比し、著しく効率的な濾過が実現される。
ＤＮＡを含有するタンパク質水溶液を膜濾過する場合、ＤＮＡの介在により、タンパク質が会合し、その粒子サイズが大きくなり、膜細孔を通過しにくくなるため、濾過効率すなわち濾過速度、透過率が低下する。また、濾過を継続すると、時間の経過に伴い、膜表面及び膜内部の細孔が閉塞していき、濾過効率は通常さらに低下するが、会合によるタンパク質ーＤＮＡ複合体の巨大化により、この傾向が加速される。ＤＮａｓｅ処理を行なうことによりタンパク質ーＤＮＡ複合体を低減させた後、膜濾過することにより、これらの現象を解消することができる。
【００２３】
【実施例】
次に実施例によってこの発明をさらに具体的に説明する。
【実施例１】
ガンマグロブリン（シグマ社製、Ｇ−５００９、牛由来）をトリスアミノメタン塩酸塩（５ ｍＭ／ｌ）／エチレンジアミン−４酢酸−２ナトリウム（０．５ｍＭ／ｌ）緩衝液に溶解し、酢酸を添加してｐＨ８．０の ５０００ｐｐｍガンマグロブリン水溶液を調製した。
このガンマグロブリン水溶液 ３ｍｌに、Ｂｅａｃｏｎ ＤＮＡ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ Ｋｉｔ （Ｖ２１６５、Ｐａｎ Ｖｅｒａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製、宝酒造株式会社より購入）中の蛍光プローブを３０μｌ添加した。励起波長 ４８５ｎｍ，蛍光波長 ５３０ｎｍ（日本分光製、分光蛍光光度計ＦＰ−７７７使用）の条件で、ガンマグロブリン水溶液中のＤＮＡ濃度を、ＤＮＡにインターカレートされた蛍光プローブの蛍光強度より定量した。この時のＤＮＡ濃度は、２５±２ｐｐｂであった。このガンマグロブリン水溶液２００ ｍｌを３７℃に保温した後に、Ｍｉｃｒｏｃｃｏｃａｌ ｎｕｃｌｅａｓｅ （Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ 社製）３Ｕ添加させて、恒温槽中で１時間緩やかに震盪撹拌させた。調製したガンマグロブリン水溶液のＤＮＡ濃度を測定した所、２４±２ｐｐｂであった。このガンマグロブリン水溶液をウイルス除去用フィルター、ＰＬＡＮＯＶＡ ３５Ｎ （旭化成株式会社製、有効膜面積０．００１ｍ２）を用いて圧力０．３気圧、２５℃の条件下で、デッドエンド法による濾過を行なった。透過液を５ ｇづつ採取して、透過液Ｎｏ．を１から順に番号を振った。この透過液に対するガンマグロブリンの透過率並びに透過速度を測定した。ここで、ガンマグロブリンの透過率は以下のように定義した。
透過率 （％）＝（（透過液中のガンマグロブリン濃度）／（原液中のガンマグロブリン濃度））×１００
これらの結果を表１に示す。
【００２４】
【表１】
【比較例１】
実施例１と同様にして、ＤＮａｓｅ未処理の５０００ｐｐｍガンマグロブリン水溶液（ｐＨ８．０）を調製した。さらに、実施例１と同様にしてガンマグロブリン水溶液をウイルス除去用フィルター、ＰＬＡＮＯＶＡ ３５Ｎ （旭化成株式会社製、有効膜面積０．００１ｍ２）を用いて圧力０．３気圧、２５℃の条件下で、デッドエンド法による濾過を行なった。透過液を５ ｇづつ採取して、透過液Ｎｏ．を１から順に番号を振った。この透過液に対するガンマグロブリンの透過率並びに透過速度を測定した。この結果を表２に示す。透過液５０ｇ採取後におけるガンマグロブリン水溶液の透過速度は、０．０１１±０．００２ｍ３／ｍ２ｄａｙであり、実施例１の透過液５０ｇ採取後におけるガンマグロブリン水溶液の透過速度に比べて、１／４２と著しく減少していた。また、ガンマグロブリンの透過率は、実施例１に比べて、いずれの透過液採取後においても、２０％〜４０％減少していた。
【００２６】
【表２】
【実施例２】
酵素処理条件を変化させた以外は実施例１と同様の実験を行なった。酵素処理条件（酵素の種類、酵素処理濃度、処理時間、処理温度）並びに透過液５０ｇ採取後におけるガンマグロブリン水溶液の透過速度と透過率を表３に示す。ここで、Ｍ．Ｎａｓｅは、Ｍｉｃｒｏｃｃｏｃａｌ ｎｕｃｌｅａｓｅ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ 社製）を意味し、ＤＮａｓｅ Ｉは、Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．製（コード番号８９８３５）の酵素を用いた。いずれの場合も、ＤＮａｓｅ処理後のガンマグロブンリン水溶液中には、１０ｐｐｂ以上のＤＮＡが含有していた。透過液５０ｇ採取後における比較例１（表２）並びに表３中の実験１（ＤＮａｓｅ未処理）の値と比較すると、ガンマグロブリン水溶液をＤＮａｓｅ処理することにより、透過速度並びに透過率が共に向上していた。
【００２８】
【表３】
【実施例３】
実施例１と同様に、ガンマグロブリン水溶液を調製し、さらにＤＮａｓｅ処理を行なった。このガンマグロブリン水溶液を、ａ）ウイルス除去用フィルター、ＰＬＡＮＯＶＡ １５Ｎ （旭化成株式会社製、有効膜面積０．００１ｍ２）、ｂ）ＰＬＡＮＯＶＡ ７５Ｎ （旭化成株式会社製、有効膜面積０．００１ｍ２）、ｃ）精密濾過膜、フロロポア膜（ＦＰ−１００、平膜、孔径１．０μｍ、膜面積 １７．３ｃｍ２、住友電工社製）、ｄ）精密濾過膜、ニュクリポァー膜（１１１１０５、平膜、孔径０．１μｍ、膜面積 １７．３ｃｍ２、コーニングコスター社製）並びにｅ）限外濾過膜、ＳＩ−１（ポリスルホン製、中空糸膜、長さ１ｍ、旭化成株式会社製）を用いて圧力０．３気圧、２５℃の条件下で、デッドエンド法による濾過を行なった。透過液５０ｇ採取後におけるガンマグロブリン水溶液の透過速度並びに透過率を表４に示す。
【００３０】
【表４】
【比較例２】
実施例１と同様にして、ＤＮａｓｅ未処理の５０００ｐｐｍガンマグロブリン水溶液（ｐＨ８．０）を調製した。さらに、実施例３と同様にしてガンマグロブリン水溶液を、ａ）ウイルス除去用フィルター、ＰＬＡＮＯＶＡ １５Ｎ （旭化成株式会社製、有効膜面積０．００１ｍ２）、ｂ）ＰＬＡＮＯＶＡ ７５Ｎ （旭化成株式会社製、有効膜面積０．００１ｍ２）、ｃ）精密濾過膜、フロロポア膜（ＦＰ−１００、平膜、孔径１．０μｍ、膜面積 １７．３ｃｍ２、住友電工社製）、ｄ）精密濾過膜、ニュクリポァー膜（１１１１０５、平膜、孔径０．１μｍ、膜面積 １７．３ｃｍ２、コーニングコスター社製）並びにｅ）限外濾過膜、ＳＩ−１（ポリスルホン製、中空糸膜、長さ１ｍ、旭化成株式会社製）を用いて圧力０．３気圧、２５℃の条件下で、デッドエンド法による濾過を行なった。透過液５０ｇ採取後におけるガンマグロブリン水溶液の透過速度並びに透過率を表５に示す。
透過液５０ｇ採取後における実施例３（表４）の値と比較すると、ガンマグロブリン水溶液をＤＮａｓｅ処理することにより、いずれの膜を用いても透過速度が共に向上していた。
【００３２】
【表５】
【実施例４】
８ｗｔ％濃度のガンマグロブリン水溶液を調製した以外は、実施例１と同様な実験を行なった。この時のＤＮＡ濃度は４００±３０ｐｐｂであった。透過液５０ｇ採取後におけるガンマグロブリン水溶液の透過速度は、ＤＮａｓｅ未処理の８ｗｔ％濃度のガンマグロブリン水溶液を用いて測定した透過速度より２３５倍向上していた。
【００３４】
【実施例５】
５００ｐｐｍの濃度のガンマグロブリン水溶液を調製した以外は、実施例１と同様な実験を行なった。透過液５０ｇ採取後におけるガンマグロブリン水溶液の透過速度は、ＤＮａｓｅ未処理の５００ｐｐｍ濃度のガンマグロブリン水溶液を用いて測定した透過速度より１１倍向上していた。
【００３５】
【実施例６】
血液凝固因子ＩＸ水溶液（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＡＢ社製、Ｎａｎｏｔｉｖ、ヒト血漿由来）２００ ｍｌを３７℃に保温した後に、Ｍｉｃｒｏｃｃｏｃａｌ ｎｕｃｌｅａｓｅ （Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ 社製）３Ｕ添加させて、恒温槽中で１時間緩やかに震盪撹拌させた。調製した血液凝固因子ＩＸ水溶液のＤＮＡ濃度を測定した所、７±２ｐｐｂであった。この血液凝固因子ＩＸ水溶液をウイルス除去用フィルター、Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ／１８０ （ミリポア社製、有効膜面積１／３ｆｔ２）を用いて圧力０．３気圧、２５℃の条件下で、デッドエンド法による濾過を行なった。透過液５０ｇ採取後における血液凝固因子ＩＸ水溶液の透過速度は、ＤＮａｓｅ未処理の血液凝固因子ＩＸ水溶液を用いて測定した透過速度より４．８倍向上していた。
【００３６】
【実施例７】
ヒト血清アルブミン４ｗｔ％水溶液（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＡＢ社製）２００ ｍｌを３７℃に保温した後に、Ｍｉｃｒｏｃｃｏｃａｌ ｎｕｃｌｅａｓｅ （Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ 社製）３Ｕ添加させて、恒温槽中で１時間緩やかに震盪撹拌させた。調製したヒト血清アルブミン水溶液のＤＮＡ濃度を測定した所、４３±２ｐｐｂであった。このヒト血清アルブミン水溶液をウイルス除去用フィルター、Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ／１８０ （ミリポア社製、有効膜面積１／３ｆｔ２）を用いて圧力０．３気圧、２５℃の条件下で、デッドエンド法による濾過を行なった。透過液５０ｇ採取後における血液凝固因子ＩＸ水溶液の透過速度は、ＤＮａｓｅ未処理のヒト血清アルブミン水溶液を用いて測定した透過速度より５６．３倍向上していた。
【００３７】
【実施例８】
アンチトロンビン（ＡＴＩＩＩ）水溶液（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＡＢ社製、ＡＴｅｎａｔｉｖ、ヒト血漿由来）２００ ｍｌを３７℃に保温した後に、Ｍｉｃｒｏｃｃｏｃａｌ ｎｕｃｌｅａｓｅ （Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ 社製）３Ｕ添加させて、恒温槽中で１時間緩やかに震盪撹拌させた。調製したアンチトロンビン水溶液のＤＮＡ濃度を測定した所、９±２ｐｐｂであった。このアンチトロンビン水溶液をウイルス除去用フィルター、Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ／１８０ （ミリポア社製、有効膜面積１／３ｆｔ２）を用いて圧力０．３気圧、２５℃の条件下で、デッドエンド法による濾過を行なった。透過液５０ｇ採取後におけるアンチトロンビンＩＸ水溶液の透過速度は、ＤＮａｓｅ未処理の血液凝固因子ＩＸ水溶液を用いて測定した透過速度より６．２倍向上していた。
【００３８】
【実施例９】
ウイルス除去用フィルター、ＰＬＡＮＯＶＡ ３５Ｎ （旭化成株式会社製、有効膜面積０．００１ｍ２）へのＤＮａｓｅの固定化を行なった。すなわち、ｐＨ１０．５に調製した１０ｍｇ／ｍｌのＣＮＢｒ水溶液をＰＬＡＮＯＶＡ ３５Ｎ膜中にマイクロチューブポンプ（ＭＰ−３Ｎ、東京理化器械社製）を用いて６０分間、２５℃で循環させた。６０分経過した後、０．１ｍｏｌ／ｌ炭酸水素ナトリウム水溶液でＰＬＡＮＯＶＡ ３５Ｎ膜を洗浄した。次にマイクロチューブポンプを用いて、ｐＨ９．１に調製したエタノールアミン溶液を６０分間、２５℃でＰＬＡＮＯＶＡ ３５Ｎ膜中に循環させた。このＣＮＢｒ活性化ＰＬＡＮＯＶＡ ３５Ｎ膜を０．５ｍｏｌ／ｌの塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、続いて超純水で洗浄を行なった。ヒドラジン１水和物５０ｍｌに超純水１５０ｍｌを溶解させたヒドラジン水溶液をＣＮＢｒ活性化ＰＬＡＮＯＶＡ ３５Ｎ膜中にマイクロチューブポンプを用いて１０時間、２５℃で循環させた。１０時間後、このＮＨ２基導入ＰＬＡＮＯＶＡ ３５Ｎ膜を超純水で洗浄した。二塩化ズベジミン酸ジメチル０．００８２ｇを２００ｍｌの超純水に溶解させたｐＨ１０の水溶液をＮＨ２基導入ＰＬＡＮＯＶＡ ３５Ｎ膜中にマイクロチューブポンプを用いて３０分間、２５℃で循環させた。超純水で二塩化ズベジミン酸ジメチル処理済みＰＬＡＮＯＶＡ ３５Ｎ膜を洗浄した後に、２００ｍｌのｐＨ８．５の１０００ｕｎｉｔＤＮａｓｅ（Ｍｉｃｒｏｃｃｏｃａｌ ｎｕｃｌｅａｓｅ （Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ 社製））水溶液をマイクロチューブポンプを用いて１８時間、２５℃で循環させた。その後、超純水でＤＮａｓｅ固定化ＰＬＡＮＯＶＡ ３５Ｎ膜を洗浄した。ＤＮａｓｅ固定化ＰＬＡＮＯＶＡ ３５Ｎ膜に固定されたＤＮａｓｅ量を水溶液中の既知量のＤＮａｓｅによるＤＮＡの分解量と比較検討したところ、１１ｕｎｉｔ／０．００１ｍ２量がＤＮａｓｅ固定化ＰＬＡＮＯＶＡ ３５Ｎ膜上にＤＮａｓｅが固定化されていることが確認された。
ＤＮａｓｅ固定化ＰＬＡＮＯＶＡ ３５Ｎを用いた以外は、比較例１と同様な実験を行なった。透過液５０ｇ採取後における透過速度は比較例１より４７％向上しており、ガンマグロブリンの透過率は比較例１より１６％向上していた。
【００３９】
【実施例１０】
乾燥ポリスルホン中空糸膜（ＳＩ−１、公称分画分子量６０００、旭化成株式会社製）を１００％のエタノール溶液に１時間浸漬させた。その後、５０％エタノール＋５０％ヘキサン溶液中に中空糸を１時間浸漬させた。さらに、１００％ヘキサン溶液中に中空糸を１時間浸漬させた。上記処理により、中空糸膜に含有するグリセリンを除去した。
上記ポリスルホン中空糸膜（３ｍ）をクロロジメチルエーテル（東京化成工業製、７．７２ｇ）、塩化第２スズ（和光純薬製、２５ｇ）、ヘキサン（和光純薬、２２８ｍｌ）の混合溶液中（上記試薬のモル比は、５：５：９０）に浸漬させ、２８℃で、６時間反応させた。このクロロメチル化ポルスルホン中空糸膜は、赤外吸収スペクトルより７６０ｃｍ−１にＣ−Ｃｌ結合に基づく赤外吸収が観察された。また、上記で調製したクロロメチル化ポルスルホン中空糸膜を重水素化クロロホルムに溶解させて１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを測定した。１Ｈ−ＮＭＲスペクトルよりクロロメチル基のメチレン部位のプロトンに基づくピークが４．５ｐｐｍに観察された。元素分析より、ポリスルホンの繰り返し構造単位当たり０．４３個のクロロメチル基が導入されていることを確認した。
次にクロロメチル化ポルスルホン中空糸膜をエチレンジアミン溶液２００ｍｌ中に浸漬させ、２０分間穏やかに攪拌しながらエチレンジアミン化反応を行った。エチレンジアミン化ポリスルホン中空糸膜は、赤外吸収スペクトルより３３００ｃｍ−１にＮＨ２基に基づく赤外吸収が観察された。また、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルより４．５ｐｐｍに観察されたクロロメチル基のメチレン部位のプロトンに基づくピークがほぼ消失していた。エチレンジアミン化ポリスルホン中空糸膜のイオン交換容量よりポリスルホンの繰り返し構造単位当たり０．０６個のエチレンジアミン基が導入されていることを確認した。
二塩化ズベジミン酸ジメチル０．００８２ｇを２００ｍｌの超純水に溶解させたｐＨ１０の水溶液中にエチレンジアミン化ポリスルホン中空糸膜を、３０分間、２５℃の条件下で浸漬させた。超純水で二塩化ズベジミン酸ジメチル処理済みポリスルホン中空糸膜を洗浄した後に、２００ｍｌのｐＨ８．５の１０００ｕｎｉｔＤＮａｓｅ（Ｍｉｃｒｏｃｃｏｃａｌ ｎｕｃｌｅａｓｅ （Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ 社製））水溶液中に１８時間、２５℃の条件下で浸漬させた。その後、超純水でＤＮａｓｅ固定化ポリスルホン中空糸膜を洗浄した。ＤＮａｓｅ固定化ポリスルホン中空糸膜に固定されたＤＮａｓｅ量を水溶液中の既知量のＤＮａｓｅによるＤＮＡの分解量と比較検討したところ、４ｕｎｉｔ／０．００１ｍ２量のＤＮａｓｅがＤＮａｓｅ固定化ポリスルホン中空糸膜上に固定化されていることが確認された。
ＤＮａｓｅ固定化ポリスルホン中空糸膜を用いた以外は、比較例１と同様な実験を行なった。透過液５０ｇ採取後における透過速度はＤＮａｓｅが固定化されていないポリスルホン中空糸膜より２３％向上しており、ガンマグロブリンの透過率は比較例１より７％向上していた。
【００４０】
【実施例１１】
０．２Ｍ ＮａＨＣＯ３と０．５Ｍ ＮａＣｌを含有するｐＨ８．３の水溶液１０ｍｌに１００ｕｎｉｔのＤＮａｓｅ（Ｍｉｃｒｏｃｃｏｃａｌ ｎｕｃｌｅａｓｅ （Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ 社製））を溶解させた。このＤＮａｓｅ水溶液をリガンド固定化用カップリング担体（ＨｉＴｒａｐ ＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＨＰ ｃｏｌｕｍｎ、アマシャムファルマシアバイオテク株式会社製）に注入して、１時間室温で放置した。その後、ブロッキング水溶液（Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅ ４倍希釈液、ＵＫ−Ｂ８０、大日本製薬株式会社）を５０ｍｌ上記調製カラムに流した。酵素固定化率は、８５％であることが、カラム流出液中の酵素濃度より算出された。
比較例１と同様にして、ＤＮａｓｅ未処理の５０００ｐｐｍガンマグロブリン水溶液（ｐＨ８．０）を調製した。このガンマグロブリン水溶液をＤＮａｓｅ固定化カラム中に１ｍｌ／ｍｉｎの速度で流した。次に、カラム処理ガンマグロブリン水溶液を実施例１と同様にしてウイルス除去用フィルター、ＰＬＡＮＯＶＡ ３５Ｎ （旭化成株式会社製、有効膜面積０．００１ｍ２）を用いて圧力０．３気圧、２５℃の条件下で、デッドエンド法による濾過を行なった。透過液５０ｇ採取後における透過速度は比較例１と比較して、５８倍上昇しており、ガンマグロブリンの透過率は比較例１より１８％向上していた。
【００４１】
【実施例１２】
ポリエステル製不織布０．５ｇをクロロジメチルエーテル（東京化成工業製、７．７２ｇ）、塩化第２スズ（和光純薬製、２５ｇ）、ヘキサン（和光純薬、２２８ｍｌ）の混合溶液中（上記試薬のモル比は、５：５：９０）に浸漬させ、２８℃、６時間反応させて、クロロメチル化ポリエステル不織布を調製した。次にクロロメチル化ポリエステル不織布をエチレンジアミン溶液２００ｍｌ中に浸漬させ、２０分間穏やかに攪拌しながらエチレンジアミン化反応を行った。その後、超純水でエチレンジアミン化ポリエステル不織布を洗浄した。
二塩化ズベジミン酸ジメチル０．００８２ｇを２００ｍｌの超純水に溶解させたｐＨ１０の水溶液中にエチレンジアミン化ポリエステル不織布を、３０分間、２５℃の条件下で浸漬させた。超純水で二塩化ズベジミン酸ジメチル処理済みポリエステル不織布を洗浄した後に、２００ｍｌのｐＨ８．５の１０００ｕｎｉｔＤＮａｓｅ（Ｍｉｃｒｏｃｃｏｃａｌ ｎｕｃｌｅａｓｅ （Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ 社製））水溶液中に１８時間、２５℃の条件下で浸漬させた。その後、超純水でＤＮａｓｅ固定化ポリエステル不織布を洗浄した。ＤＮａｓｅ固定化ポリエステル不織布に固定されたＤＮａｓｅ量を水溶液中の既知量のＤＮａｓｅによるＤＮＡの分解量と比較検討したところ、２０ｕｎｉｔ／０．００１ｍ２量がＤＮａｓｅ固定化ポリエステル不織布上にＤＮａｓｅが固定化されていることが確認された。
比較例１で調製したガンマグロブリン水溶液をＤＮａｓｅ固定化ポリエステル不織布に３０分接触させた。その後、実施例１と同様にしてガンマグロブリン水溶液をウイルス除去用フィルター、ＰＬＡＮＯＶＡ ３５Ｎ （旭化成株式会社製、有効膜面積０．００１ｍ２）を用いて圧力０．３気圧、２５℃の条件下で、デッドエンド法による濾過を行なった。透過液５０ｇ採取後における透過速度は比較例１と比較して、３４倍上昇しており、ガンマグロブリンの透過率は比較例１より１５％向上していた。
【００４２】
【実施例１３】
実施例１におけるガンマグロブリン水溶液に、ブタ日本脳炎ウイルスを加え、実施例１に従って、５０ｇの溶液（原液）を濾過し、透過液を採取した。これを実験Ａとする。比較例１におけるガンマグロブリン水溶液に、ブタ日本脳炎ウイルスを加え、比較例１に従って、５０ｇの溶液（原液）を濾過し、透過液を採取した。これを実験Ｂとする。濾過前の水溶液（原液）は実験Ａ及び実験Ｂのいずれについても、その中のウイルスの感染力価はいずれも８．２ｌｏｇであった。Ｍｉｃｒｏｃｃｏｃａｌ ｎｕｃｌｅａｓｅ処理した実験Ａの透過液中のウイルス感染力価を分析したところ、ウイルス除去率は５．５であった。また、Ｍｉｃｒｏｃｃｏｃａｌ ｎｕｃｌｅａｓｅ処理していない実験Ｂの透過液中のウイルス感染力価を分析してウイルス除去率を求めたところ、５．８であった。ここで、ウイルス除去率（ＬＲＶ）は、下記の定義によった。
ＬＲＶ ＝ −ｌｏｇ（（透過液中のウイルス感染力価）／（原液中のウイルス感染力価））
上記の結果はウイルス安全性に関する規制当局のガイドラインを充分満たすものであり、本発明によっても、従来の方法と同様に高効率でのウイルス除去が可能である。
【００４３】
【発明の効果】
本発明の方法によれば、タンパク質水溶液をＤＮａｓｅで処理することにより、ウイルス等の不純物をタンパク質水溶液から除去するに際し、従来の方法に比較して、タンパク質水溶液の濾過速度及び透過率が向上し、これにより、生産効率が向上し、製造コストが低減できる。
Claims (3)
- 濾過すべきタンパク質水溶液を０．００１ｕｎｉｔ／１００ ｍｌから１０００ｕｎｉｔ／１００ ｍｌの濃度のＤＮａｓｅで処理した後、あるいは処理しながら膜濾過することを特徴とするタンパク質水溶液の精製方法
- 濾過すべきタンパク質水溶液をＤＮａｓｅ固定化胆体を用いて処理した後、膜濾過することを特徴とする請求項１記載のタンパク質水溶液の精製方法
- 濾過すべきタンパク質水溶液をＤＮａｓｅ固定化膜を用いて処理しつつ、膜濾過することを特徴とする請求項１記載のタンパク質水溶液の精製方法
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| WO2004089403A1 (ja) * | 2003-04-09 | 2004-10-21 | Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute | アルブミン凝集体及び／または不純蛋白質の除去方法 |
| JP2013141620A (ja) * | 2012-01-06 | 2013-07-22 | Tokyo Univ Of Agriculture & Technology | ろ過膜 |
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-
2002
- 2002-09-04 JP JP2002258814A patent/JP2004089155A/ja active Pending
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