JP2004003871A

JP2004003871A - Detecting method and detecting tip for biochemistry specimen

Info

Publication number: JP2004003871A
Application number: JP2001401874A
Authority: JP
Inventors: Tadaaki Yabubayashi; 薮林　忠顕; Masazumi Tanaka; 田中　正純
Original assignee: Sumitomo Precision Products Co Ltd
Current assignee: Sumitomo Precision Products Co Ltd
Priority date: 2001-12-28
Filing date: 2001-12-28
Publication date: 2004-01-08

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a detecting method and a detecting tip for biochemistry specimen which can detect a target gene without using a marker modification, and can simplify a detecting process with high reproducibility and does not require excessive skill of a measurer even when the marker modification is used. <P>SOLUTION: Since a probe DNA forming a loop structure is hybridized only when a target DNA exists, hence the loop structure is eliminated and the probe DNA expands, the hybridized probe DNA is apparently different from a probe DNA keeping the loop structure in height from a substrate. The existence of the hybridization is detected as the height difference and a three-dimensional step. The hybridized probe DNA can be selectively modified by various markers, and the step between it and the probe DNA keeping the loop structure is enlarged by adding modified marker size to the height difference between the probe DNAs, and the existence of the hybridization is detected and identified. <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、ハイブリダイゼーションして２本鎖を形成したプローブＤＮＡとループ構造を取っている１本鎖のプローブＤＮＡとの高さの違いをを検出して目的の生化学検体を検出する方法に係り、基板に配列されたプローブＤＮＡがループ構造を形成して解放末端側が基板側に向くように構成することで、目的ＤＮＡがある場合にハイブリダイゼーションが起こり、ループ構造が解消されるため、ハイブリダイゼーションして２本鎖を形成したプローブＤＮＡは他のループ構造のプローブＤＮＡと高さが異なること利用し、顕微鏡観察やＸ線回折などの手段で容易に目的遺伝子の検出が可能になる生化学検体の検出方法と検出チップに関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＤＮＡチップの基本原理は、ＤＮＡが相補的な二重螺旋構造を形成することを利用するものである。Ａ（アデニン）とＴ（チミン）、Ｃ（シトシン）とＧ（グアニン）が対をなすことから、例えば、ＡＧＧＴＴＡＣのＤＮＡ配列を持つ遺伝子を検出するには、プローブとしてＴＣＣＡＡＴＧの配列を持つＤＮＡを作成し、サンプリング検体遺伝子中に目的遺伝子が存在すると、ＤＮＡハイブリダイゼーションによって、プローブＤＮＡの配列にＡＧＧＴＴＡＣの配列が結合して二重螺旋構造を取るため、これを検出することで検体ＤＮＡを容易に選別できることになる。
【０００３】
二重螺旋構造のＤＮＡを検出する方法として、検体ＤＮＡ（サンプリング遺伝子ＤＮＡ）に蛍光標識の修飾を施しておき、プローブＤＮＡと前記のＤＮＡハイブリダイゼーション操作を行い、二重螺旋構造を呈したＤＮＡ、すなわち蛍光シグナルを発する物を検出する、蛍光法が知られている。
【０００４】
蛍光標識としては、蛍光色素そのものの他、蛍光色素により直接染色された染色体、糖蛋白や糖脂質から切り出された糖鎖体に修飾したイオン性蛍光物質、あるいはタンパク質、核酸、酵素、細胞等を蛍光色素でタグ化するなど、種々方法並びに物質で蛍光を発する標識が提案されている。
【０００５】
そこで、検体ＤＮＡに蛍光色素の修飾を行わずに二重螺旋構造のＤＮＡを検出する方法として、屈折率変化を検出するＳＰＲ分光法を用いた方法が提案されている。詳述すると、ガラス基板に金属薄膜を形成してこの薄膜上にプローブＤＮＡを固定しておき、これとサンプリング遺伝子をハイブリダイゼーション操作させることにより二重螺旋構造のＤＮＡを形成させ、基板裏面側からの金属薄膜への反射光強度の測定を行い、ハイブリダイゼーション前の金属薄膜の屈折率と二重螺旋構造のＤＮＡを有する場合の屈折率との変化を測定する。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
かかる蛍光法を用いたＤＮＡハイブリダイゼーションの検出には、検体ＤＮＡへの蛍光標識の修飾操作が煩雑であること、また、施術者の技量によって前記修飾効果が異なること、種々条件で蛍光色素の光消失が発生すること、未反応吸着物によるバックグラウンドノイズの上昇で検出精度が低下すること等の問題が指摘されている。
【０００７】
前記ＳＰＲ分光法において、前述したハイブリダイゼーション前後の金属薄膜の屈折率の変化を測定するが、基板裏面側からの金属薄膜への入射角度と反射率との関係として解析する際に、当該変化が僅かであるため、さらに高精度に検体ＤＮＡを検出するには、ＳＰＲ応答の増幅を図るなどの改良を施す必要がある。
【０００８】
この発明は、バックグラウンドノイズの上昇で検出精度が低下する蛍光法やＳＰＲ応答の増幅を図る必要があるＳＰＲ分光法など異なり、従来の標識修飾を用いなくとも目的遺伝子の検出が可能であり、また標識修飾を用いた場合も検出工程を再現性よく簡素化でき、測定者に過度の技量を要求することがない、簡単な工程からなる生化学検体の検出方法と検出チップの提供を目的としている。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
発明者らは、前記蛍光法を用いたＤＮＡハイブリダイゼーション検出に問題を有することから、光退色の懸念がある蛍光法に換えてＳＰＲ（Ｓｕｒｆａｃｅ　Ｐｌａｓｍｏｎ　Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）分光法を用いた方法を検討しており、このＳＰＲ応答の増幅を目的にプローブＤＮＡへの金微粒子修飾の有効性を検討中に、金薄膜表面に対するプローブＤＮＡの吸着固定量は、ＤＮＡ塩基数（鎖長）によらずほぼ一定であること、金微粒子修飾量はＤＮＡ塩基数に依存することを知見し、これよりプローブＤＮＡ塩基数の違いによってプローブＤＮＡの立体的構造が変化していることを知見した。
【００１０】
そこで、発明者らは、プローブＤＮＡ鎖長の検討を行い、プローブＤＮＡの塩基数の違いによるＳＰＲ応答、すなわち金微粒子修飾を行ったプローブＤＮＡに対してハイブリダイゼーションを施し、その後のＳＰＲ角度のシフト量についての変化や挙動を検討したところ、塩基数１０では金微粒子修飾量が少なく、塩基数３０では修飾量が増大するが、いずれも該シフト量の増大効果が少ないこと、塩基数６０では金微粒子修飾ができないこと、すなわち塩基数６０のプローブＤＮＡでは、ループ構造を形成しているため、金コロイド修飾が行なわれないことを知見した。
【００１１】
また、発明者らは、プローブＤＮＡ鎖長の検討、特に塩基数６０以上の長いプローブＤＮＡにおけるＳＰＲ応答の増幅を目的に種々検討した結果、前述のごとく検出チップに吸着固定したプローブＤＮＡに先に金微粒子修飾するのではなく、まず先にサンプルとのハイブリダイゼーションを施すと、検出チップの薄膜上でループ状となって配列していたプローブＤＮＡが伸びて金微粒子修飾が可能となり、ハイブリダイゼーション後に金微粒子修飾を行う工程にて、長いプローブＤＮＡにも修飾が可能となり、ハイブリダイゼーション後の２本鎖を形成したプローブＤＮＡにのみ金微粒子修飾することが可能であることを知見した。
【００１２】
さらに、発明者らは、基板に配列させたループ構造を形成しているプローブＤＮＡにおいて、目的ＤＮＡがある場合にのみハイブリダイゼーションが起こり、ループ構造が解消されてプローブＤＮＡが伸びることで、ハイブリダイゼーションされたプローブＤＮＡと、ハイブリダイゼーションせずにループ構造を保持したままのプローブＤＮＡとは基板からのその高さに明確な違いを生じることになり、ハイブリダイゼーションの有無をこの高さの違い、すなわち立体的な段差として検出可能であることを知見し、この発明を完成した。
【００１３】
すなわち、この発明は、基板表面にプローブＤＮＡを配列する工程、基板表面に固定されない解放端側が基板側に位置するように、ループ構造を形成しているプローブＤＮＡに検体ＤＮＡをハイブリダイゼーションする工程、２本鎖を形成したプローブＤＮＡとループ構造を取っている他プローブＤＮＡとを高さの違いで検出・識別する工程を有することを特徴とする生化学検体の検出方法である。
【００１４】
また、この発明は、基板表面にプローブＤＮＡを配列する工程、ループ構造を形成している基板上のプローブＤＮＡに検体ＤＮＡをハイブリダイゼーションする工程、ハイブリダイゼーションの実行中又は実行後のプローブＤＮＡまたは検体ＤＮＡあるいは両方にプローブＤＮＡより大きな標識を修飾する工程、２本鎖を形成したプローブＤＮＡとループ構造を取っている他プローブＤＮＡとを高さの違いで検出・識別する工程を有することを特徴とする生化学検体の検出方法である。なお、プローブＤＮＡより大きな標識とは、プローブＤＮＡの長さなどの寸法あるいはその形態より大きな寸法や形態を有する標識をいう。
【００１５】
また、この発明は、プローブＤＮＡにより小さな標識を修飾する工程、基板表面にプローブＤＮＡを配列する工程、ループ構造を形成している基板上のプローブＤＮＡに検体ＤＮＡをハイブリダイゼーションする工程、２本鎖を形成したプローブＤＮＡとループ構造を取っている他プローブＤＮＡとを高さの違いで検出・識別する工程を有することを特徴とする生化学検体の検出方法である。なお、プローブＤＮＡより小さな標識とは、プローブＤＮＡの長さなどの寸法あるいはその形態より小さな寸法や形態を有する標識をいう。
【００１６】
また、この発明は、基板表面にプローブＤＮＡを配列する工程、ループ構造を形成しているプローブＤＮＡに予め標識修飾した検体ＤＮＡをハイブリダイゼーションする工程、２本鎖を形成したプローブＤＮＡとループ構造を取っている他プローブＤＮＡとを高さの違いで検出・識別する工程を有することを特徴とする生化学検体の検出方法である。
【００１７】
さらに、この発明は、基板上に配列されたプローブＤＮＡを有し、配列したプローブＤＮＡはその基板表面に固定されない解放端側が基板側に位置するよう、また標識を修飾可能にした部位が基板側に位置するよう、あるいは標識を修飾した部位が基板側に位置するようループ構造を有することを特徴とする生化学検体の検出チップである。
【００１８】
【発明の実施の形態】
以下にこの発明の特徴である各プローブＤＮＡがループ構造を形成して解放末端が基板表面側にあるように構成した検出チップ並びにループ構造について説明する。
【００１９】
まず、検出チップの作製について説明すると、ガラス基板をアセトン、メタノール、超純水中で超音波洗浄した後、１０％フッ酸で表面を２０秒間エッチングを行ない、さらに、アセトン、メタノール、超純水中で超音波洗浄した後、窒素ガスで乾燥させた。その後、スパッタ装置（ＵＬＶＡＣ）を用いガラス基板にまず約１ｎｍ厚みのＣｒ層を設け、さらに約５０ｎｍ厚みのＡｕ層を設けた。
【００２０】
前記基板を濃硫酸中１〜２時間浸漬後、超純水で洗浄した後、プローブの３’端側をＳＨ（チオール）基で、５’端側をビオチンで修飾したプローブＤＮＡ−Ｄ−ＢＦＲ溶液（ＫＨ_２ＰＯ_４、Ｋ_２ＨＰＯ_４、ｐＨ　７．０）を基板上に滴下し、飽和水蒸気中に約１５時間放置し、プローブＤＮＡをガラス基板の金薄膜上に付着させて検出チップとなした。なお、プローブＤＮＡには日清紡製を使用した。
【００２１】
金コロイド修飾方法は、上記の検出チップをＲ−ＢＦＲ溶液（ＮａＣｌ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ　７．４）で洗浄後、窒素ガスでおだやかに乾燥させ、表面にアビジンをコートした金コロイド（粒径１０ｎｍ、ＳＩＧＭＡ製）を滴下し１〜３時間、飽和水蒸気中で放置することで、ビオチンとアビジンの特異的結合を利用して修飾させた。
【００２２】
ハイブリダイゼーションは、Ｒ−ＢＦＲ溶液とＨ−ＢＦＲ溶液（ＮａＣｌ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＥＤＴＡ、ｐＨ　７．４）で洗浄後乾燥せずに、検体ＤＮＡのＨ−ＢＦＲ溶液を所要濃度となるように滴下し、約１６時間放置して実施した。
【００２３】
ＳＰＲ測定は、検出チップをＲ−ＢＦＲ溶液で洗浄後に窒素ガスで乾燥し速やかにＳＰＲ測定を行なった。
【００２４】
上記方法で、１０〜６０の塩基数のプローブＤＮＡをそれぞれ固定した検出チップを作製した。この時、プローブＤＮＡの金薄膜への吸着量をＳＰＲ測定により評価した。プローブＤＮＡの塩基数が大きくなるにつれ、ＳＰＲ角度のシフトが大きくなった。また、ＳＰＲ角度シフトを分子量で割った値は、吸着量に比例するため、これを求めたところ、プローブＤＮＡの吸着効率は、塩基数１０が最もよく、３０、６０では、大きな変化がないこと、さらに塩基数による吸着効率の変化は、１０、１００倍と大きく変化するものではなく、塩基長によらずオーダーとしてほぼ一定であることを確認した。なお、ここでは基板への被覆率約２５％を達成した。
【００２５】
また、１０〜６０の塩基数のプローブＤＮＡをそれぞれ固定した検出チップを作製し、それぞれ上記金コロイド修飾方法により修飾を行い、塩基数による金コロイド修飾量の変化をＡＦＭ（原子間力顕微鏡）で観察し、修飾された金コロイド粒子数を計測したところ、塩基長１０では、約４００個／μｍ^２、塩基長３０では、約７００個／μｍ^２の金コロイドの修飾が観察されたが、塩基長６０では、金コロイドの修飾が全く観察されなかった。
【００２６】
これを確認するため、ＳＰＲ法を用いｉｎ−ｓｉｔｕでのＤＮＡプローブに対する金コロイド修飾の挙動を観察した。すなわち、検出チップをプリズム上に接着し、基板表面を上述のＲ−ＢＦＲ溶液で満たし、これに、金コロイド溶液を滴下し、ある一定入射角での反射光強度を継時的に観測したところ、金コロイド修飾が行なわれた場合にはＳＰＲ角度がシフトし、反射光強度の上昇が観察されるが、塩基数６０のＤＮＡでは、反射強度の変化が無くＡＦＭでの観察と同様、金コロイドの修飾が行なわれないことを確認した。
【００２７】
検出チップ金薄膜へのプローブＤＮＡの吸着は、プローブＤＮＡの鎖長に依らずオーダー的にほぼ一定であるのに対し、金薄膜に固定化されたプローブＤＮＡに対する金コロイドの修飾効率は、プローブＤＮＡの鎖長に大きく依存することが判明し、塩基数６０のプローブＤＮＡでは、全く金コロイド修飾が起こらないことを確認した。
【００２８】
前述の合成によるプローブＤＮＡに換えて、実際のＯ−１９　ｇｙｒＢ遺伝子変異部周辺の８５６ｂｐという長い遺伝子を目的ＤＮＡ（試験遺伝子）とし、これと相補的に結合する末端３０塩基、中央３０塩基、中央６０塩基の３種類をプローブＤＮＡとし、前述と同様の方法で検出チップを作製した。
【００２９】
上記の３種のプローブＤＮＡに対して前述した金コロイド修飾方法を行い、その後実際の長いＤＮＡ鎖を用いてハイブリダイゼーションを実施した後、ＳＰＲ法によるハイブリダイゼーションの検出を実施した。
【００３０】
表１のプローブＤＮＡ塩基長によるＳＰＲ角度シフトの変化を示す表に明らかなように、３０塩基のプローブＤＮＡでは、末端、中央、共に、ハイブリダイゼーションによる有意差が小さく、また、塩基数６０のプローブＤＮＡでは、全く金コロイドが修飾されず、実際の長い遺伝子を目的遺伝子とした場合、上記の条件では、ＳＰＲ法によるハイブリダイゼーションの検出は困難であることを確認した。
【００３１】
【表１】

【００３２】
表１のプローブＤＮＡ塩基長によるＳＰＲ角度シフトの変化から、８５６ｂｐの長いＤＮＡを目的遺伝子とした場合、プローブ鎖と比べて、目的遺伝子が約１４〜２８倍長いため、立体的な制約によりプローブＤＮＡと反応する確率が低いと考えられる。従って、ハイブリダイゼーションしたプローブ鎖に金コロイドが修飾される場合と、ハイブリダイゼーションしていないプローブ鎖に金コロイドが修飾される場合とでＳＰＲ角度のシフトにバラツキがみられると推測される。
【００３３】
そこで先の工程、すなわち金コロイド修飾方法を行い、その後ハイブリダイゼーションを実施しする工程とは逆に、上記と同じプローブＤＮＡの検出チップに対してハイブリダイゼーションを実施した後、金コロイド修飾方法を行い、その後ＳＰＲ法による前記ハイブリダイゼーションの検出を実施した。
【００３４】
すなわち、塩基数６０のプローブＤＮＡでは、ループ構造を形成しているため、金コロイド修飾が行なわれないと推測される。ループ構造をとっている長い１本鎖ＤＮＡはハイブリダイゼーションによりそのループ構造が解消された後に、金コロイド修飾を行なえば金コロイド修飾が可能であると推測される。そこで６０塩基のＤＮＡプローブにおいても同様の手法を用いれば金コロイド修飾が可能であると考えた。図１Ａ，Ｂ参照。
【００３５】
換言すれば、目的遺伝子がない場合には、ハイブリダイゼーションは起こらずかつ金コロイド修飾が行なわれない。これに対して、目的遺伝子がある場合には、ハイブリダイゼーションが起こり、ループ構造が解消されることにより、ハイブリダイゼーションしたＤＮＡプローブにのみ選択的に金コロイド修飾が起こり、ＳＰＲ測定でハイブリダイゼーションによるシフトに金コロイド修飾によるシフトが加わった大きなＳＰＲ角度シフトの差が得られると考えた。
【００３６】
そこで、実際の長いＤＮＡ鎖を目的遺伝子とした検出チップを用い、前述の各工程で、プローブＤＮＡの基板への付着、ハイブリダイゼーション、金コロイド修飾を実施し、水溶液中でのＳＰＲ角度シフト並びに空気中でのＳＰＲ角度シフトを測定した。
【００３７】
プローブＤＮＡのみの場合には、金コロイド修飾を行なってもＳＰＲ角度シフトが見られないが、プローブＤＮＡにハイブリダイゼーションが起こった場合には、ＳＰＲ角度が大きくシフトして金コロイド修飾が行われていることが明らかになった。
【００３８】
すなわち、空気中でのＳＰＲ角度シフトの測定結果を表２に示すように、３０塩基のプローブＤＮＡでは、金コロイド修飾によるＳＰＲ角度シフトの増幅作用が小さく、また、サンプル間における偏差も大きかった。それに対して、６０塩基のプローブＤＮＡを用いて、ハイブリダイゼーション後に金コロイド修飾した場合には、金コロイド修飾によるＳＰＲ角度シフトが約４〜５倍増幅され、かつサンプル間における偏差も小さかった。
【００３９】
要するに、ハイブリダイゼーション後に金コロイド修飾を行うことにより、溶液中、空気中ともに、６０塩基プローブＤＮＡの金コロイド修飾が可能となった。すなわち、６０塩基プローブＤＮＡの立体構造（ループ構造）を利用することにより、ハイブリダイゼーションしたプローブＤＮＡのみに選択的に金コロイド修飾させることが可能であり、その結果、大きなＳＰＲ角度シフトの増幅が可能で、サンプル間の偏差を小さくすることが可能であることを確認した。
【００４０】
【表２】

【００４１】
この発明は、以上の知見に基づきなされたもので、ループ構造を形成しているプローブＤＮＡにおいて、目的ＤＮＡがある場合にのみハイブリダイゼーションが起こり、ループ構造が解消されてプローブＤＮＡが伸びることを目的遺伝子の検出に利用するものである。すなわち、前述のようにハイブリダイゼーションされたプローブＤＮＡとハイブリダイゼーションせずにループ構造を保持したままのプローブＤＮＡとは基板からのその高さに明確な違いを生じており、これを公知の方法で検出・識別し、当該高さの違いあるいは立体的な段差をもってハイブリダイゼーションの有無の確認や目的遺伝子の検出が実施できるのである。
【００４２】
また、この発明は、ハイブリダイゼーションされたプローブＤＮＡに選択的に種々の標識修飾が可能であることから、プローブＤＮＡ同士の高さの違いにさらに修飾した標識の大きさを加えてループ構造を保持したままのプローブＤＮＡとの段差を拡大してこれを検出・識別することが可能であり、標識としてはある程度の大きさがあるものであればいずれのものも利用でき、またハイブリダイゼーション後に２本鎖を形成した目的ＤＮＡにも標識修飾して前記の高さの違いを拡大させることも可能である。
【００４３】
この発明において、基板には、ガラス基板、樹脂基板、シリコン基板等のプローブＤＮＡの配列が実施可能な基板であればいずれの材質も採用できる。また、基板に貴金属薄膜を成膜する場合は、その表面粗度はできるだけ平坦なものが好ましい。洗浄、乾燥方法としては、実施例に示すごとく、半導体ウエーハや各種デバイスを製造する際に採用される、各種溶剤による洗浄、純水中の超音波洗浄、各種酸溶液による洗浄、ブロー乾燥、スピン乾燥など公知の基板の洗浄、乾燥方法を適宜選択、組合せて採用できる。ガラス基板としては、公知のホウケイ酸ガラス等が利用でき、厚みは厚いほうが取り扱いやすいが、いずれの厚みのものも利用できる。
【００４４】
この発明において、プローブＤＮＡの配列を容易にするため、基板上に金、白金、銀などの貴金属薄膜を設けることができる。成膜方法としては膜厚みを一定に制御するため、スパッタリング、イオンプレーティング、ＣＶＤ等の公知の気相成長による方法が好ましい。なお、基板と薄膜との密着性を向上させるために下地層を適宜成膜することができる。例えば、ガラス基板、石英基板にＣｒ層を設けたり、シラン化合物によって表面改質するなどの手段を採用できる。
【００４５】
この発明において、基板上、あるいはさらに貴金属薄膜表面にプローブＤＮＡを配列する工程は、特に限定されるものでなく、公知のいずれの方法も採用でき、例えば薄膜上を酸や純水で洗浄後、プローブＤＮＡと緩衝液を用いて飽和水蒸気雰囲気中で配列させることができる。
【００４６】
また、緩衝液としては、例えばＫＨ_２ＰＯ_４とＫ_２ＨＰＯ_４を配合して所要ｐＨにした溶液が採用できる。他には、ＰＳＢや、ＮａＣｌとＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ＮａＣｌとＴｒｉｓ−ＨＣｌとＥＤＴＡを用いるなど、所要ｐＨにするため公知の薬液を選定配合した溶液等も採用できる。
【００４７】
この発明において、プローブＤＮＡは、その末端を一方は基板表面あるいは貴金属薄膜に固定し、他方端あるいはその近傍には後述の標識を修飾するために、各々の前記末端を前記基板表面あるいは標識と接合可能な物質で修飾しておくことが望ましい。
【００４８】
この発明において、プローブＤＮＡの塩基数は特に限定しないが、ハイブリダイゼーション後に、目的ＤＮＡと２本鎖を形成したプローブＤＮＡにのみ標識を修飾するには、チップ基板上にあるプローブＤＮＡはハイブリダイゼーション前にループ構造を形成して解放末端側あるいは修飾可能な部位が薄膜側にある必要がある。
【００４９】
この発明において、プローブＤＮＡは、その製造過程中又は製造後にループ構造を形成していて基板に配列されるか、基板に配列する際にループ構造を形成するか、基板に配列後にループ構造を形成するように構成するか、いずれの構成、方法も採用できる。
【００５０】
例えば、図２Ａ，Ｂに示すごとく、相補的な二重螺旋構造を形成可能な対をなすＤＮＡの配列を予め形成しておき、ループ構造を形成し得るように構成することが可能であり、塩基数は特に限定しないが、比較的長鎖の構成を有するものが望ましく、好ましくは塩基数が６０以上である。さらに塩基数が１００を超えたり、１０００程度の場合であってもこの発明を適用できる。
【００５１】
この発明において、基板表面に配列したプローブＤＮＡに検体ＤＮＡをハイブリダイゼーションする工程は、特に限定されるものでなく、公知のいずれの方法も採用でき、例えば基板の洗浄後に検体ＤＮＡと緩衝溶液を用いてハイブリダイゼーションさせることができる。緩衝溶液としては、例えばＮａＣｌとＴｒｉｓ−ＨＣｌを配合して所要ｐＨに保持した溶液が採用できる。また、ガラス基板に金薄膜を設ける場合では、ハイブリダイゼーション時の温度を３０〜４０℃に保持することが好ましい。
【００５２】
この発明において、標識には、金属粒子（Ｓｉを含む）、セラミックス粒子、公知の蛍光標識、あるいは生化学検体の検出に利用されている染色体、糖鎖体、タンパク質、核酸、酵素、細胞など、プローブＤＮＡ又は検体ＤＮＡに修飾してループ構造を形成しているプローブＤＮＡとの高さの差を拡大できるものであればいずれのものも利用できる。
【００５３】
金属微粒子標識は、Ｓｉを含み、Ａｕ、Ａｌ、Ｔｉ、Ｃｒ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｚｎ、Ｍｏなどの各種金属の微粒子を用いるもので、特に微粒子の形状や粒径寸法や均一性は任意に適宜選択でき、特に必須条件ではないが、ＤＮＡの所要部位に修飾可能とすること、微粒子表面に成膜可能なことなどから、５μｍ以下、さらに１μｍ以下が好ましく、数ｎｍ〜数百ｎｍの範囲で所定粒径が均一でかつ工業安定的に得られる微粒子が好ましい。
【００５４】
この発明において、セラミックス微粒子標識には、公知のいずれの形態も採用できるが、微粒子表面に成膜可能なことなどから、５μｍ以下、さらに１μｍ以下が好ましく、検出方法に応じて数ｎｍ〜数百ｎｍの範囲で所定粒径が均一でかつ工業安定的に得られるＳｉＯ_２、ＴｉＯ_２、ＺｒＯ_２、Ａｌ_２Ｏ_３、ＭｇＯなどのセラミックス微粒子が好ましい。
【００５５】
この発明において、蛍光標識には、公知のいずれの形態も採用でき、市販されている蛍光色素によりタグ化された染色体、糖鎖体、タンパク質、核酸、酵素、細胞、微粒子等を標識自体の性質を利用したり後述のごとく抗原−抗体反応を利用して修飾させることが可能である。また、この発明では蛍光自体は必須でないため、蛍光標識等に利用されている染色体、糖鎖体、タンパク質、核酸、酵素、細胞をそのまま利用することも可能である。
【００５６】
この発明において、上述の金属微粒子、セラミックス微粒子などの各種標識をプローブＤＮＡに修飾する方法としては、例えば金属微粒子等の粒子自体の性質を利用したり、公知の蛍光標識を修飾する方法などのように抗原−抗体反応を利用して修飾するなど、公知のいずれの方法も採用できる。また、中性のコロイダル液のごとく、金属微粒子を均一分散させた溶液の形態を利用することで修飾が容易になる。
【００５７】
また、プローブＤＮＡの末端にビオチンを修飾しておき、ストレプトアビジンをコートした金属微粒子をビオチン−アビジンの高い結合能力を利用して標識となすことができる。さらに、プローブＤＮＡの末端にＩｇＧや抗プロテイン物質を付加することで、タンパクをコートした金属微粒子を抗原−抗体反応を利用して修飾させることが可能である。
【００５８】
さらに、検体ＤＮＡに前記各種の標識を修飾することも可能で修飾方法は、検体ＤＮＡの所要箇所を適宜標識化できればよく、公知のいずれの方法も採用でき、特に末端を修飾するには上述の方法などいずれの方法も採用できる。
【００５９】
この発明において、２本鎖を形成したプローブＤＮＡとループ構造を取っている他プローブＤＮＡとを高さの違いで検出・識別する方法には、標識の修飾の有無にかかわらず、例えば半導体ウェーハやデバイスの表面性状や形状、表層部を評価するために採用されている公知の各種計測評価方法並びにその装置を適宜利用することが可能である。
【００６０】
例えば、電子線計測評価手法として、電子顕微鏡を用いた視野法、電子回折法など、Ｘ線計測評価手法として、Ｘ線回折法、Ｘ線トポグラフ、表面回折法、Ｘ線干渉法など、電界磁界計測評価手法として、走査型トンネル顕微鏡（ＳＴＭ）、走査トンネル分光（ＳＴＳ）、ＳＴＭファミリーのＡＦＭなど、光学的測評価手法として、光伝導法、光学顕微鏡法などがある。さらに、Ｘ線顕微鏡観察法、レーザー顕微鏡観察法も利用できる。雰囲気も上記の評価方法により異なるが、真空中又は所要溶液中のいずれでも評価できる。
【００６１】
また、基板に前記手法の検査対象であるシリコンウェーハを用いたり、標識の種類や性質を利用して前記手法の検出対象や信号発生源等にすることもできる。また、前記の各種評価方法において、得られた信号、画像や回折像をさらに画像処理化して３次元画像化する公知の手法や装置を併用して、ハイブリダイゼーション後の２本鎖を形成したプローブＤＮＡとループ構造を取っている他プローブＤＮＡとの高さの違いを検出、識別することができる。
【００６２】
【実施例】
実施例１
ガラス基板をアセトン、メタノール、超純水中で超音波洗浄した後、１０％フッ酸で表面を２０秒間エッチングを行ない、さらに、アセトン、メタノール、超純水中で超音波洗浄した後、窒素ガスで乾燥させた。
その後、スパッタ装置（ＵＬＶＡＣ）を用いガラス基板にまず約１ｎｍ厚みのＣｒ層を設け、さらに約５０ｎｍ厚みのＡｕ層を設けた。
【００６３】
前記基板を濃硫酸中１〜２時間浸漬後、超純水で洗浄した後、３０塩基、６０塩基のプローブＤＮＡの３’端側をＳＨ（チオール）基で、５’端側をビオチンで修飾したプローブＤＮＡ−Ｄ−ＢＦＲ溶液（ＫＨ_２ＰＯ_４、Ｋ_２ＨＰＯ_４、ｐＨ　７．０）を基板上に滴下し、飽和水蒸気中に約１５時間放置し、プローブＤＮＡをガラス基板の金薄膜上に付着させて検出チップとなした。プローブＤＮＡには日清紡製を使用した。
【００６４】
プローブＤＮＡと完全に相補的な６０塩基の目的ＤＮＡとのハイブリダイゼーションは、Ｒ−ＢＦＲ溶液とＨ−ＢＦＲ溶液（ＮａＣｌ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＥＤＴＡ、ｐＨ　７．４）で洗浄後乾燥せずに、検体ＤＮＡのＨ−ＢＦＲ溶液を所要濃度となるように滴下し、約１６時間放置して実施した。
【００６５】
プローブＤＮＡの修飾には、前述のごとくビオチンで修飾した５’端側とシリカ粒子とをビオチン−アビジン結合させるため、予めアビジンコートしたシリカ粒子を用いて、ｐＨ　７．４のコロイダルシリカとなして実施した。コロイダルシリカとしては粒径が１００ｎｍの粒径のものを用いた。
【００６６】
ハイブリダイゼーションを検出する方法として、ＳＴＭ、ＳＴＳ、ＡＦＭの３種を実施した。３０塩基の検出チップでは全てのプローブＤＮＡにシリカ微粒子標識がされているようでハイブリダイゼーション前後で差が見られなかった。
【００６７】
塩基数６０のプローブＤＮＡにおいては、目的ＤＮＡとのハイブリダイゼーション前ではシリカ微粒子標識の修飾が全く実施できず、ハイブリダイゼーション後ではシリカ微粒子標識の修飾が行われたことから、ハイブリダイゼーション前後で１００ｎｍ〜１２０ｎｍの段差を確認した。なお、ハイブリダイゼーション後に標識の修飾を行わない場合は、８ｎｍ〜２０ｎｍの段差を確認した。又、いずれの検出方法でも画像処理化することで、検出チップ表面に段差があるかないかを簡単に確認できた。
【００６８】
実施例２
実施例１の合成による目的ＤＮＡに換えて、実際のＯ−１９　ｇｙｒＢ遺伝子変異部周辺の８５６ｂｐという長い遺伝子を目的ＤＮＡ（試験遺伝子）とし、これらと相補的に結合する中央６０塩基をプローブＤＮＡとし、実施例１と同様の方法で検出チップを作製した。
【００６９】
上記のプローブＤＮＡに対して実際の長いＤＮＡ鎖を用いて実施例１と同様にハイブリダイゼーションを実施した後、Ｆｅ微粒子コロイダル修飾方法を行った。すなわち、５’端側とビオチン−アビジン結合させるため、予めアビジンコートした平均粒径が１μｍ程度のＦｅ微粒子を用いて、ｐＨ　７．４のコロイダル液となして実施した。
【００７０】
ハイブリダイゼーションを検出する方法として、走査反射電子顕微鏡による観察を実施したところ、１０００ｎｍ〜１０５０ｎｍの段差を確認した。
【００７１】
また、上記のハイブリダイゼーションを実施する際に、目的遺伝子がある場合と、ない場合を設定して、Ｆｅ微粒子コロイダル修飾を行い、その後、微分干渉顕微鏡にて観察を行った結果を図３に示す。図３に明らかなように、目的遺伝子がある場合には、Ｆｅ微粒子を多数観察されたが、目的遺伝子がない場合には、Ｆｅ微粒子はほとんど観察されず、上記の段差の検出結果と一致した。
【００７２】
【発明の効果】
この発明は、例えば、プローブＤＮＡの解放末端側が基板側に向くようにループ構造を取る構成を採用することで、目的検体がある場合にはハイブリダイゼーションが起こり、ループ構造が解消されるため、ハイブリダイゼーションしたプローブＤＮＡにのみ金属やセラミックス微粒子などの標識の修飾が可能になり、この２本鎖を形成して伸びたプローブＤＮＡの解放末端に標識が修飾されると、ループを形成している他のプローブＤＮＡとの高さの差が顕著になり、検出チップ表面にある段差の程度とその密度をみることでハイブリダイゼーションの有無、目的遺伝子の存在の確認が可能になった。
【図面の簡単な説明】
【図１】ハイブリダイゼーションによるループ構造の解消と金コロイド修飾の状況を示す模式図であり、Ａは目的遺伝子がない場合、Ｂは目的遺伝子が有る場合を示す。
【図２】Ａ、Ｂはこの発明におけるプローブＤＮＡのループ構造の概念を示す説明図である。
【図３】Ａ、Ｂはこの発明による検出チップを微分干渉顕微鏡にて観察を行った際の顕微鏡写真の模写図であり、Ａは目的遺伝子がある場合、Ｂは目的遺伝子がない場合である。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for detecting a target biochemical specimen by detecting a difference in height between a probe DNA hybridized to form a double-stranded DNA and a single-stranded probe DNA having a loop structure. In connection with this, the probe DNA arranged on the substrate forms a loop structure so that the open end side faces the substrate side, so that hybridization occurs when the target DNA is present, and the loop structure is eliminated. Utilizing the fact that the probe DNA that has formed a double strand by hybridization has a different height from the probe DNA of other loop structures, biochemical analysis enables easy detection of the target gene by means such as microscopic observation and X-ray diffraction. The present invention relates to a sample detection method and a detection chip.
[0002]
[Prior art]
The basic principle of a DNA chip is based on the fact that DNA forms a complementary double helix structure. Since A (adenine) and T (thymine) and C (cytosine) and G (guanine) form a pair, for example, to detect a gene having a DNA sequence of AGGTTAC, a DNA having a sequence of TCCAATG is used as a probe. When the target gene is present in the sampled sample gene, the sequence of AGTTAC binds to the sequence of the probe DNA by DNA hybridization to form a double helical structure. It will be possible to sort.
[0003]
As a method for detecting DNA having a double helix structure, a sample DNA (sampling gene DNA) is modified with a fluorescent label, and the above DNA hybridization operation is performed with a probe DNA to obtain a DNA having a double helix structure. That is, a fluorescence method for detecting a substance that emits a fluorescent signal is known.
[0004]
Examples of the fluorescent label include, in addition to the fluorescent dye itself, chromosomes directly stained with the fluorescent dye, ionic fluorescent substances modified into carbohydrates cut from glycoproteins and glycolipids, or proteins, nucleic acids, enzymes, cells, etc. Labels that emit fluorescence by various methods and substances, such as tagging with a fluorescent dye, have been proposed.
[0005]
Therefore, as a method of detecting a DNA having a double helix structure without modifying the sample DNA with a fluorescent dye, a method using SPR spectroscopy for detecting a change in refractive index has been proposed. More specifically, a metal thin film is formed on a glass substrate, probe DNA is fixed on the thin film, and a sampling gene is hybridized with the probe DNA to form a double helical DNA. Of the intensity of light reflected on the metal thin film is measured, and the change between the refractive index of the metal thin film before hybridization and the refractive index when the DNA has a double helical structure is measured.
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
In the detection of DNA hybridization using such a fluorescence method, the operation of modifying the fluorescent label on the sample DNA is complicated, the effect of the modification differs depending on the skill of the practitioner, and the fluorescence of the fluorescent dye under various conditions. Problems have been pointed out, such as the occurrence of disappearance and the decrease in detection accuracy due to an increase in background noise due to unreacted adsorbate.
[0007]
In the SPR spectroscopy, the change in the refractive index of the metal thin film before and after the above-described hybridization is measured. When the change is analyzed as the relationship between the incident angle from the backside of the substrate to the metal thin film and the reflectance, the change is measured. Since the amount is small, it is necessary to improve the SPR response in order to detect the sample DNA with higher accuracy.
[0008]
The present invention is different from a fluorescence method in which the detection accuracy is reduced due to an increase in background noise and an SPR spectroscopy method in which it is necessary to amplify an SPR response, and can detect a target gene without using a conventional label modification. In addition, even with the use of label modification, the purpose of the present invention is to provide a method for detecting biochemical samples and a detection chip consisting of simple steps that can simplify the detection process with good reproducibility and do not require excessive skill for the measurer. I have.
[0009]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have been studying a method using SPR (Surface Plasmon Resonance) spectroscopy instead of the fluorescence method which has a fear of photobleaching because it has a problem in detection of DNA hybridization using the fluorescence method. While examining the effectiveness of modifying the probe DNA with fine gold particles for the purpose of amplifying the SPR response, the amount of probe DNA fixed to the surface of the gold thin film by adsorption is almost constant regardless of the number of DNA bases (chain length). In addition, it was found that the amount of gold fine particle modification depends on the number of DNA bases, and from this it was found that the three-dimensional structure of the probe DNA was changed by the difference in the number of probe DNA bases.
[0010]
Therefore, the present inventors examined the probe DNA chain length, performed SPR response due to the difference in the number of bases of the probe DNA, that is, performed hybridization on the probe DNA modified with gold fine particles, and subsequently shifted the SPR angle. When the change and behavior of the amount were examined, the amount of modification of the fine gold particles was small when the number of bases was 10, and the amount of modification was increased when the number of bases was 30. It has been found that the modification of fine particles cannot be performed, that is, colloidal gold modification is not performed in a probe DNA having 60 bases because a loop structure is formed.
[0011]
In addition, the present inventors have conducted various studies for the purpose of studying the probe DNA chain length, particularly for the purpose of amplifying the SPR response in a long probe DNA having 60 or more bases. When hybridization with the sample is performed first, instead of gold particle modification, probe DNA that has been arranged in a loop on the thin film of the detection chip expands, and gold particle modification becomes possible. It has been found that in the step of modifying the gold fine particles, it is possible to modify even a long probe DNA, and it is possible to modify the gold fine particles only to the probe DNA that has formed a double strand after hybridization.
[0012]
Furthermore, the present inventors have found that hybridization occurs only in the presence of a target DNA in a probe DNA forming a loop structure arranged on a substrate, and the loop structure is eliminated and the probe DNA is elongated, whereby the hybridization occurs. The resulting probe DNA and the probe DNA that has retained the loop structure without hybridization will cause a clear difference in its height from the substrate, and the presence or absence of hybridization will be determined by this difference in height, that is, The inventor has found that it can be detected as a three-dimensional step, and completed the present invention.
[0013]
That is, the present invention provides a step of arranging a probe DNA on a substrate surface, a step of hybridizing a sample DNA to a probe DNA having a loop structure so that an open end side not fixed to the substrate surface is located on the substrate side, A method for detecting a biochemical specimen, comprising a step of detecting and discriminating a double-stranded probe DNA and another probe DNA having a loop structure based on a difference in height.
[0014]
Also, the present invention provides a process for arranging probe DNA on a substrate surface, a process for hybridizing a sample DNA to a probe DNA on a substrate having a loop structure, a process for performing probe DNA or a sample during or after hybridization. Modifying a label larger than the probe DNA on the DNA or both, and detecting and discriminating the double-stranded probe DNA and the other probe DNA having a loop structure by a difference in height. This is a method for detecting biochemical specimens. The label larger than the probe DNA refers to a label having a dimension such as the length of the probe DNA or a dimension or form larger than the form.
[0015]
The present invention also provides a step of modifying a small label with a probe DNA, a step of arranging a probe DNA on a substrate surface, a step of hybridizing a sample DNA to a probe DNA on a substrate having a loop structure, A method for detecting a biochemical specimen, comprising a step of detecting and discriminating a probe DNA having a loop and another probe DNA having a loop structure by a difference in height. The label smaller than the probe DNA refers to a label having a dimension such as the length of the probe DNA or a dimension or form smaller than the form.
[0016]
Also, the present invention provides a step of arranging probe DNA on the substrate surface, a step of hybridizing a probe DNA forming a loop structure with a sample DNA previously labeled and modified, and a step of forming a double-stranded probe DNA and a loop structure. A method for detecting a biochemical specimen, comprising a step of detecting and discriminating other probe DNAs taken at different heights.
[0017]
Further, the present invention has a probe DNA arranged on a substrate, and the arranged probe DNA is arranged such that an open end side not fixed to the substrate surface is located on the substrate side, and a site where the label can be modified is located on the substrate side. Or a biochemical specimen detection chip characterized by having a loop structure such that a label-modified site is located on the substrate side.
[0018]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Hereinafter, a detection chip and a loop structure in which each probe DNA forms a loop structure and has an open end on the substrate surface side, which is a feature of the present invention, will be described.
[0019]
First, the production of the detection chip will be described. After the glass substrate is ultrasonically cleaned in acetone, methanol and ultrapure water, the surface is etched with 10% hydrofluoric acid for 20 seconds. After ultrasonic cleaning in the inside, it was dried with nitrogen gas. Thereafter, using a sputtering apparatus (ULVAC), a Cr layer having a thickness of about 1 nm was provided on the glass substrate, and an Au layer having a thickness of about 50 nm was further provided.
[0020]
After immersing the substrate in concentrated sulfuric acid for 1 to 2 hours and washing it with ultrapure water, a probe DNA-D-BFR in which the 3 ′ end of the probe is modified with an SH (thiol) group and the 5 ′ end with biotin is modified. Solution (KH ₂ PO ₄ , K ₂ HPO ₄ , PH 7.0) was dropped on the substrate, left in saturated steam for about 15 hours, and the probe DNA was allowed to adhere to the gold thin film on the glass substrate to form a detection chip. The probe DNA used was Nisshinbo.
[0021]
The gold colloid modification method is as follows. The above detection chip is washed with an R-BFR solution (NaCl, Tris-HCl, pH 7.4), dried gently with nitrogen gas, and coated with avidin on the surface. (10 nm, manufactured by SIGMA) was dropped, and left standing in saturated steam for 1 to 3 hours, whereby modification was performed using specific binding between biotin and avidin.
[0022]
For hybridization, the sample DNA was washed with an R-BFR solution and an H-BFR solution (NaCl, Tris-HCl, EDTA, pH 7.4) and then dried, and the H-BFR solution of the sample DNA was dropped to a required concentration. Then, it was left standing for about 16 hours.
[0023]
In the SPR measurement, the detection chip was washed with an R-BFR solution, dried with nitrogen gas, and immediately subjected to SPR measurement.
[0024]
By the above method, a detection chip in which probe DNAs having 10 to 60 bases were respectively fixed was prepared. At this time, the amount of probe DNA adsorbed on the gold thin film was evaluated by SPR measurement. As the number of bases in the probe DNA increased, the shift of the SPR angle increased. Further, the value obtained by dividing the SPR angle shift by the molecular weight is proportional to the amount of adsorption, and the value was determined. Further, it was confirmed that the change in the adsorption efficiency depending on the number of bases did not greatly change by a factor of 10, 100, and was substantially constant as an order regardless of the base length. Here, a coverage of about 25% on the substrate was achieved.
[0025]
Further, a detection chip in which probe DNAs having 10 to 60 bases were respectively immobilized was prepared, and each was modified by the above-described colloidal gold modification method. Observation and measurement of the number of modified gold colloid particles showed that at a base length of 10, about 400 particles / μm ² , At a base length of 30, about 700 / μm ² However, no modification of the gold colloid was observed at a base length of 60.
[0026]
To confirm this, the behavior of colloidal gold modification to the DNA probe was observed in-situ using the SPR method. That is, the detection chip was adhered on a prism, the surface of the substrate was filled with the above-described R-BFR solution, a gold colloid solution was dropped, and the reflected light intensity at a certain incident angle was observed over time. When the colloidal gold modification was performed, the SPR angle was shifted and the reflected light intensity was increased. However, in the case of DNA having 60 bases, there was no change in the reflected intensity, and as in the case of the AFM observation, there was no change in the reflected light intensity. Was not modified.
[0027]
While the adsorption of the probe DNA to the detection chip gold thin film is almost constant in order regardless of the probe DNA chain length, the modification efficiency of the colloidal gold to the probe DNA immobilized on the gold thin film is as follows. It was found that the modification was greatly dependent on the chain length of the probe DNA, and that the probe DNA having 60 bases did not undergo any colloidal gold modification.
[0028]
Instead of the probe DNA synthesized as described above, a long gene of 856 bp around the actual mutant portion of the O-19 gyrB gene was used as the target DNA (test gene). Using three types of 60 bases as probe DNA, a detection chip was prepared in the same manner as described above.
[0029]
The above-mentioned three kinds of probe DNAs were subjected to the above-described colloidal gold modification method, and thereafter, hybridization was performed using actual long DNA chains, and then hybridization was detected by the SPR method.
[0030]
As is clear from the table showing the change in the SPR angle shift depending on the probe DNA base length in Table 1, in the 30-base probe DNA, significant differences due to hybridization were small at both the ends and the center, and the probe having 60 bases was used. In the case of DNA, the colloidal gold was not modified at all, and it was confirmed that it was difficult to detect the hybridization by the SPR method under the above conditions when the actual long gene was used as the target gene.
[0031]
[Table 1]

[0032]
From the change in the SPR angle shift depending on the probe DNA base length in Table 1, when the target DNA is 856 bp long DNA, the target gene is about 14 to 28 times longer than the probe strand, so the probe DNA is sterically restricted. It is considered that the probability of reacting with is low. Therefore, it is presumed that the SPR angle shift varies between the case where the colloidal gold is modified on the hybridized probe chain and the case where the colloidal gold is modified on the non-hybridized probe chain.
[0033]
Therefore, contrary to the previous step, that is, the step of performing the colloidal gold modification method and then performing the hybridization, the hybridization is performed on the same probe DNA detection chip as described above, and then the method of modifying the gold colloid is performed. Then, the above-mentioned hybridization was detected by the SPR method.
[0034]
That is, it is inferred that the colloidal gold modification is not performed in the probe DNA having 60 bases because the probe DNA has a loop structure. It is presumed that colloidal gold modification is possible if a long single-stranded DNA having a loop structure is modified with colloidal gold after the loop structure is eliminated by hybridization. Therefore, it was considered that colloidal gold modification was possible using a similar technique even for a 60-base DNA probe. See FIGS. 1A and 1B.
[0035]
In other words, when there is no target gene, no hybridization occurs and no gold colloid modification is performed. On the other hand, if the target gene is present, hybridization occurs and the loop structure is eliminated, so that the gold colloidal modification occurs selectively only on the hybridized DNA probe. It was considered that a large difference in the SPR angle shift was obtained, in which the shift due to the gold colloid modification was added.
[0036]
Therefore, using a detection chip having an actual long DNA chain as a target gene, in each of the above-described steps, the probe DNA was attached to the substrate, hybridized, and gold colloidal modification was performed. The SPR angle shift in was measured.
[0037]
In the case of the probe DNA alone, no SPR angle shift was observed even when the colloidal gold modification was performed, but when hybridization occurred in the probe DNA, the SPR angle was greatly shifted and the gold colloidal modification was performed. It became clear that there was.
[0038]
That is, as shown in Table 2, the measurement results of the SPR angle shift in the air show that the probe DNA of 30 bases has a small amplification effect of the SPR angle shift due to the colloidal gold modification and a large deviation between samples. On the other hand, when the gold colloid was modified after hybridization using a probe DNA of 60 bases, the SPR angle shift due to the colloidal gold modification was amplified about 4 to 5 times, and the deviation between samples was small.
[0039]
In short, by performing the colloidal gold modification after the hybridization, the colloidal gold modification of the 60-base probe DNA became possible both in solution and in air. That is, by utilizing the three-dimensional structure (loop structure) of the 60-base probe DNA, it is possible to selectively modify only the hybridized probe DNA with colloidal gold. As a result, it is possible to amplify a large SPR angle shift. It was confirmed that the deviation between samples could be reduced.
[0040]
[Table 2]

[0041]
The present invention has been made based on the above findings, and it is intended that hybridization occurs only in the presence of a target DNA in a probe DNA forming a loop structure, so that the loop structure is eliminated and the probe DNA is elongated. It is used for gene detection. That is, the probe DNA hybridized with the probe DNA as described above does not hybridize, and a clear difference is generated in the height of the probe DNA from the substrate, while maintaining the loop structure. By detecting and discriminating, it is possible to confirm the presence or absence of hybridization and to detect the target gene based on the difference in height or the three-dimensional step.
[0042]
Further, since various label modifications can be selectively performed on the hybridized probe DNA, the present invention retains the loop structure by adding the size of the modified label to the difference in height between the probe DNAs. It is possible to detect and discriminate this by enlarging the level difference from the probe DNA as it is, and any label can be used as long as it has a certain size. It is also possible to extend the difference in height by labeling and modifying the target DNA which has formed a chain.
[0043]
In the present invention, as the substrate, any material such as a glass substrate, a resin substrate, and a silicon substrate can be adopted as long as the substrate can arrange the probe DNA. When a noble metal thin film is formed on a substrate, the surface roughness is preferably as flat as possible. Cleaning and drying methods include, as shown in the examples, cleaning with various solvents, ultrasonic cleaning in pure water, cleaning with various acid solutions, blow drying, and spinning, which are employed when manufacturing semiconductor wafers and various devices. Known methods of washing and drying the substrate such as drying can be appropriately selected and combined. As the glass substrate, a known borosilicate glass or the like can be used. A thicker one is easier to handle, but any one can be used.
[0044]
In the present invention, a noble metal thin film of gold, platinum, silver or the like can be provided on the substrate to facilitate the arrangement of the probe DNA. In order to control the film thickness to be constant, a known vapor deposition method such as sputtering, ion plating, or CVD is preferable. Note that an underlayer can be appropriately formed to improve the adhesion between the substrate and the thin film. For example, means such as providing a Cr layer on a glass substrate or a quartz substrate, or modifying the surface with a silane compound can be employed.
[0045]
In the present invention, the step of arranging the probe DNA on the substrate or further on the surface of the noble metal thin film is not particularly limited, and any known method can be adopted, for example, after washing the thin film with acid or pure water, Sequence can be performed in a saturated steam atmosphere using probe DNA and a buffer.
[0046]
As the buffer, for example, KH ₂ PO ₄ And K ₂ HPO ₄ And a solution having a required pH can be employed. In addition, a solution in which a known chemical solution is selected and blended to obtain a required pH, such as PSB, NaCl and Tris-HCl, or NaCl, Tris-HCl and EDTA, may be used.
[0047]
In the present invention, one end of the probe DNA is fixed to the substrate surface or a noble metal thin film, and the other end is bonded to the substrate surface or the label at the other end or in the vicinity thereof in order to modify a label described later. It is desirable to modify with a possible substance.
[0048]
In the present invention, the number of bases of the probe DNA is not particularly limited. However, in order to modify the label only on the probe DNA that has formed a double strand with the target DNA after hybridization, the probe DNA on the chip substrate must be It is necessary that a free end side or a modifiable site is formed on the thin film side by forming a loop structure in the membrane.
[0049]
In the present invention, the probe DNA forms a loop structure during or after its production and is arranged on a substrate, forms a loop structure when arranged on a substrate, or forms a loop structure after being arranged on a substrate. Or any configuration and method can be adopted.
[0050]
For example, as shown in FIGS. 2A and 2B, a pair of DNA sequences capable of forming a complementary double helical structure can be formed in advance to form a loop structure. Although the number of bases is not particularly limited, those having a relatively long chain configuration are desirable, and the number of bases is preferably 60 or more. Furthermore, the present invention can be applied even when the number of bases exceeds 100 or is about 1000.
[0051]
In the present invention, the step of hybridizing the sample DNA to the probe DNA arranged on the substrate surface is not particularly limited, and any known method can be adopted, for example, using the sample DNA and a buffer solution after washing the substrate. For hybridization. As the buffer solution, for example, a solution in which NaCl and Tris-HCl are mixed and maintained at a required pH can be adopted. When a gold thin film is provided on a glass substrate, it is preferable to maintain the temperature during hybridization at 30 to 40 ° C.
[0052]
In the present invention, labels include metal particles (including Si), ceramic particles, known fluorescent labels, or chromosomes, carbohydrates, proteins, nucleic acids, enzymes, cells, and the like used for detecting biochemical samples. Any material can be used as long as the difference in height from the probe DNA or the probe DNA forming a loop structure by modifying the sample DNA can be increased.
[0053]
The metal fine particle label contains fine particles of various metals such as Au, Al, Ti, Cr, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Zn, and Mo. The uniformity can be arbitrarily selected as appropriate, and is not particularly essential, but is preferably 5 μm or less, more preferably 1 μm or less, since it is possible to modify a desired portion of DNA and form a film on the surface of fine particles. Fine particles having a uniform particle size within a range of several hundred nm and which can be obtained industrially stably are preferable.
[0054]
In the present invention, any known form can be used for the labeling of the ceramic fine particles, but it is preferably 5 μm or less, more preferably 1 μm or less, because the film can be formed on the surface of the fine particles, depending on the detection method. SiO with a predetermined particle size uniform and industrially stable in the range of nm ₂ , TiO ₂ , ZrO ₂ , Al ₂ O ₃ And ceramic fine particles such as MgO.
[0055]
In the present invention, any known form can be adopted as the fluorescent label, and the chromosomes, carbohydrates, proteins, nucleic acids, enzymes, cells, microparticles, and the like, which are tagged with a commercially available fluorescent dye, can be used as the label itself. And modification using an antigen-antibody reaction as described below. Further, in the present invention, since the fluorescence itself is not essential, chromosomes, carbohydrates, proteins, nucleic acids, enzymes, and cells used for fluorescent labeling and the like can be used as they are.
[0056]
In the present invention, examples of a method for modifying the probe DNA with various labels such as the above-described metal fine particles and ceramic fine particles include, for example, a method utilizing the properties of the particles themselves such as metal fine particles and a method of modifying a known fluorescent label. Any known method, such as modification using an antigen-antibody reaction, can be employed. Further, by using the form of a solution in which metal fine particles are uniformly dispersed like a neutral colloidal liquid, the modification is facilitated.
[0057]
Alternatively, biotin can be modified at the end of the probe DNA, and the metal microparticles coated with streptavidin can be labeled using the high binding ability of biotin-avidin. Further, by adding IgG or an anti-protein substance to the end of the probe DNA, it is possible to modify the protein-coated metal fine particles by utilizing an antigen-antibody reaction.
[0058]
Furthermore, it is also possible to modify the above-mentioned various labels to the specimen DNA, and the modification method may be any method as long as a required portion of the specimen DNA can be appropriately labeled, and any known method can be adopted. Any method such as a method can be adopted.
[0059]
In the present invention, a method for detecting / identifying a double-stranded probe DNA and another probe DNA having a loop structure by a difference in height includes, for example, a semiconductor wafer and Various known measurement and evaluation methods and devices used for evaluating the surface properties and shape of the device and the surface layer can be appropriately used.
[0060]
For example, field-of-view method using an electron microscope, electron diffraction method, etc. as electron beam measurement and evaluation methods, and X-ray measurement, X-ray topograph, surface diffraction method, X-ray interferometry, etc. Measurement and evaluation methods include a scanning tunneling microscope (STM), scanning tunneling spectroscopy (STS), and SFM family AFM, and optical measurement and evaluation methods include a photoconductive method and an optical microscope method. Furthermore, an X-ray microscope observation method and a laser microscope observation method can also be used. The atmosphere also depends on the evaluation method described above, but can be evaluated either in a vacuum or in a required solution.
[0061]
In addition, a silicon wafer to be inspected by the above method may be used as a substrate, or a detection target or a signal generation source of the above method may be used by utilizing the type or property of a marker. In addition, in the above-described various evaluation methods, a probe that forms a double strand after hybridization by using a known method or apparatus for further processing the obtained signal, image or diffraction image to form a three-dimensional image. Differences in height between DNA and other probe DNA having a loop structure can be detected and identified.
[0062]
【Example】
Example 1
After ultrasonic cleaning the glass substrate in acetone, methanol and ultrapure water, etching the surface with 10% hydrofluoric acid for 20 seconds, and ultrasonic cleaning in acetone, methanol and ultrapure water, then nitrogen gas And dried.
Thereafter, using a sputtering apparatus (ULVAC), a Cr layer having a thickness of about 1 nm was provided on the glass substrate, and an Au layer having a thickness of about 50 nm was further provided.
[0063]
After immersing the substrate in concentrated sulfuric acid for 1 to 2 hours and washing with ultrapure water, the 30 'and 60' probe DNAs are modified with an SH (thiol) group at the 3 'end and with biotin at the 5' end. Probe DNA-D-BFR solution (KH ₂ PO ₄ , K ₂ HPO ₄ , PH 7.0) was dropped on the substrate, left in saturated steam for about 15 hours, and the probe DNA was allowed to adhere to the gold thin film on the glass substrate to form a detection chip. Nisshinbo was used as the probe DNA.
[0064]
The hybridization between the probe DNA and the 60-base target DNA that is completely complementary is performed by washing with an R-BFR solution and an H-BFR solution (NaCl, Tris-HCl, EDTA, pH 7.4) without drying. An H-BFR solution of the sample DNA was added dropwise to a required concentration, and left standing for about 16 hours.
[0065]
In the modification of the probe DNA, colloidal silica having a pH of 7.4 was formed using silica particles previously coated with avidin to bind biotin-avidin to the 5 ′ end side modified with biotin and silica particles as described above. Carried out. A colloidal silica having a particle diameter of 100 nm was used.
[0066]
As a method for detecting hybridization, three methods of STM, STS, and AFM were performed. In the case of the 30-base detection chip, no difference was observed before and after hybridization because all the probe DNAs were labeled with silica fine particles.
[0067]
In the probe DNA having 60 bases, the modification of the silica fine particle label could not be performed at all before the hybridization with the target DNA, and the modification of the silica fine particle label was performed after the hybridization. A step of 120 nm was confirmed. When the label was not modified after the hybridization, a step of 8 nm to 20 nm was confirmed. In addition, by performing image processing with any of the detection methods, it was possible to easily confirm whether or not there was a step on the surface of the detection chip.
[0068]
Example 2
Instead of the target DNA synthesized in Example 1, a long gene of 856 bp around the actual O-19 gyrB gene mutation was used as the target DNA (test gene), and the central 60 bases complementary to these genes were used as the probe DNA. A detection chip was produced in the same manner as in Example 1.
[0069]
Hybridization was carried out on the above probe DNA using an actual long DNA chain in the same manner as in Example 1, and a colloidal modification method of Fe fine particles was performed. That is, in order to bind biotin-avidin to the 5 'end side, a colloidal solution having a pH of 7.4 was prepared using pre-avidin-coated Fe fine particles having an average particle size of about 1 μm.
[0070]
As a method for detecting hybridization, observation by a scanning reflection electron microscope was performed, and a step of 1000 nm to 1050 nm was confirmed.
[0071]
FIG. 3 shows the results of colloidal modification of Fe microparticles with and without the target gene when performing the above-described hybridization, and with a differential interference microscope. . As is clear from FIG. 3, when the target gene was present, a large number of Fe fine particles were observed, but when the target gene was not present, almost no Fe fine particles were observed, which coincided with the above-described step detection results. .
[0072]
【The invention's effect】
The present invention employs, for example, a structure in which a loop structure is formed so that the open end side of the probe DNA is directed to the substrate side. When a target sample is present, hybridization occurs and the loop structure is eliminated. Modification of a label such as metal or ceramic fine particles can be performed only on the probe DNA that has been hybridized, and if the label is modified on the open end of the probe DNA that has been extended to form this double strand, a loop may be formed. The difference in height from the probe DNA was remarkable, and it was possible to confirm the presence or absence of hybridization and the presence of the target gene by observing the degree of step and the density on the surface of the detection chip.
[Brief description of the drawings]
BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS FIG. 1 is a schematic diagram showing the situation of the elimination of the loop structure by hybridization and the modification of colloidal gold. A shows the case where there is no target gene, and B shows the case where there is a target gene.
FIGS. 2A and 2B are explanatory diagrams showing the concept of the loop structure of the probe DNA in the present invention.
FIGS. 3A and 3B are microphotographs of a detection chip obtained by observing a detection chip according to the present invention with a differential interference microscope. FIG. 3A shows a case where a target gene is present, and FIG. .

Claims

基板表面にプローブＤＮＡを配列する工程、ループ構造を形成しているプローブＤＮＡに検体ＤＮＡをハイブリダイゼーションする工程、２本鎖を形成したプローブＤＮＡとループ構造を取っている他プローブＤＮＡとを高さの違いで検出・識別する工程を有する生化学検体の検出方法。Arranging the probe DNA on the substrate surface, hybridizing the sample DNA to the probe DNA having the loop structure, and raising the probe DNA having the double-stranded structure and the other probe DNA having the loop structure. A method for detecting a biochemical sample, comprising a step of detecting and identifying the difference based on the difference.

基板表面にプローブＤＮＡを配列する工程、ループ構造を形成している基板上のプローブＤＮＡに検体ＤＮＡをハイブリダイゼーションする工程、ハイブリダイゼーションの実行中又は実行後のプローブＤＮＡまたは検体ＤＮＡあるいは両方に標識を修飾する工程、２本鎖を形成したプローブＤＮＡとループ構造を取っている他プローブＤＮＡとを高さの違いで検出・識別する工程を有する生化学検体の検出方法。Arranging the probe DNA on the substrate surface, hybridizing the sample DNA to the probe DNA on the substrate forming the loop structure, labeling the probe DNA or the sample DNA or both during and after the hybridization. A method for detecting a biochemical specimen, comprising a step of modifying, a step of detecting and discriminating a probe DNA having a double-stranded structure and another probe DNA having a loop structure by a difference in height.

プローブＤＮＡに標識を修飾する工程、基板表面にプローブＤＮＡを配列する工程、ループ構造を形成している基板上のプローブＤＮＡに検体ＤＮＡをハイブリダイゼーションする工程、２本鎖を形成したプローブＤＮＡとループ構造を取っている他プローブＤＮＡとを高さの違いで検出・識別する工程を有する生化学検体の検出方法。A step of modifying the probe DNA with a label, a step of arranging the probe DNA on the substrate surface, a step of hybridizing the sample DNA to the probe DNA on the substrate having a loop structure, a step of forming a double-stranded probe DNA and a loop A method for detecting a biochemical specimen, comprising a step of detecting and discriminating another probe DNA having a structure from a difference in height.

基板表面にプローブＤＮＡを配列する工程、ループ構造を形成しているプローブＤＮＡに予め標識修飾した検体ＤＮＡをハイブリダイゼーションする工程、２本鎖を形成したプローブＤＮＡとループ構造を取っている他プローブＤＮＡとを高さの違いで検出・識別する工程を有する生化学検体の検出方法。A step of arranging probe DNA on the substrate surface, a step of hybridizing a probe DNA forming a loop structure with a sample DNA previously labeled and modified, a probe DNA forming a double strand and another probe DNA having a loop structure A method for detecting a biochemical specimen, comprising the steps of detecting and discriminating the difference between height and height.

プローブＤＮＡの塩基数が６０以上である請求項１から請求項４のいずれかに記載の生化学検体の検出方法。The method for detecting a biochemical specimen according to any one of claims 1 to 4, wherein the number of bases of the probe DNA is 60 or more.

基板表面に貴金属薄膜を有する請求項１から請求項４のいずれかに記載の生化学検体の検出方法。The method for detecting a biochemical specimen according to any one of claims 1 to 4, further comprising a noble metal thin film on the surface of the substrate.

基板上の２本鎖を形成したプローブＤＮＡとループ構造を取っている他プローブＤＮＡとの高さの違いを検出する方法が、電子又は光学顕微鏡観察法、Ｘ線顕微鏡観察法、レーザー顕微鏡観察法、ＳＴＭ，ＳＴＳ，ＡＦＭ観察法、電子回折法、Ｘ線回折法、Ｘ線トポグラフ法、Ｘ線表面回折法のいずれかである請求項１から請求項４のいずれかに記載の生化学検体の検出方法。Methods for detecting a difference in height between a probe DNA having a double-stranded structure on a substrate and another probe DNA having a loop structure include electron or optical microscopy, X-ray microscopy, and laser microscopy. The biochemical specimen according to any one of claims 1 to 4, which is any one of STM, STS, AFM observation method, electron diffraction method, X-ray diffraction method, X-ray topography method, and X-ray surface diffraction method. Detection method.

標識がプローブＤＮＡより大きい請求項２又は請求項４に記載の生化学検体の検出方法。The method according to claim 2 or 4, wherein the label is larger than the probe DNA.

標識がプローブＤＮＡより小さい請求項３に記載の生化学検体の検出方法。4. The method for detecting a biochemical specimen according to claim 3, wherein the label is smaller than the probe DNA.

標識が、金属粒子（Ｓｉを含む）、セラミックス粒子、染色体、糖鎖体、タンパク質、核酸、酵素、細胞のいずれかである請求項２から請求項４のいずれかに記載の生化学検体の検出方法。The detection of a biochemical specimen according to any one of claims 2 to 4, wherein the label is any one of a metal particle (including Si), a ceramic particle, a chromosome, a carbohydrate, a protein, a nucleic acid, an enzyme, and a cell. Method.

基板上に配列されたプローブＤＮＡを有し、配列したプローブＤＮＡはその基板表面に固定されない解放端側が基板側に位置するようループ構造を有する生化学検体の検出チップ。A biochemical sample detection chip having a probe DNA arranged on a substrate, wherein the arranged probe DNA is not fixed to the surface of the substrate, and has a loop structure such that an open end is located on the substrate side.

基板上に配列されたプローブＤＮＡを有し、配列したプローブＤＮＡはその標識を修飾可能にした部位が基板側に位置するようループ構造を有する生化学検体の検出チップ。A biochemical sample detection chip having a probe DNA arranged on a substrate, and having a loop structure such that a portion of the arranged probe DNA whose label can be modified is located on the substrate side.

基板上に配列されたプローブＤＮＡを有し、配列したプローブＤＮＡはその標識を修飾した部位が基板側に位置するようループ構造を有する生化学検体の検出チップ。A biochemical specimen detection chip having a probe DNA arranged on a substrate and having a loop structure such that a site of the arranged probe DNA whose label is modified is located on the substrate side.

プローブＤＮＡの塩基数が６０以上である請求項１１から請求項１３のいずれかに記載の生化学検体の検出チップ。14. The detection chip for a biochemical specimen according to claim 11, wherein the number of bases of the probe DNA is 60 or more.

基板表面に貴金属薄膜を有する請求項１１から請求項１３のいずれかに記載の生化学検体の検出チップ。The biochemical sample detection chip according to claim 11, further comprising a noble metal thin film on a substrate surface.

標識が、金属微粒子（Ｓｉを含む）、セラミックス微粒子、染色体、糖鎖体、タンパク質、核酸、酵素、細胞のいずれかである請求項１３に記載の生化学検体の検出チップ。14. The biochemical sample detection chip according to claim 13, wherein the label is any one of metal fine particles (including Si), ceramic fine particles, chromosomes, carbohydrates, proteins, nucleic acids, enzymes, and cells.

基板がガラスまたは半導体シリコンからなり、表面に金薄膜を有する請求項１６に記載の生化学検体の検出チップ。17. The biochemical sample detection chip according to claim 16, wherein the substrate is made of glass or semiconductor silicon, and has a gold thin film on the surface.