JP2004000003A - 新規なダイズ突然変異体及びそれを用いたダイズ油脂の製造方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】ダイズの種子中の多価不飽和脂肪酸含量を低下させる品種改良に使用可能な突然変異体及びそれを用いて多価不飽和脂肪酸含量の低いダイズ油脂を製造することを目的とする。
【解決手段】配列表配列番号１の塩基配列を有する遺伝子により特徴づけられるダイズ突然変異体ＫＫ２１、配列表配列番号２の塩基配列を有する遺伝子により特徴づけられるダイズ突然変異体Ｍ２３、配列表配列番号３の塩基配列を有する遺伝子により特徴づけられるダイズ突然変異体Ｍ２４、配列表配列番号４の塩基配列を有する遺伝子により特徴づけられるダイズ突然変異体Ｍ５、配列表配列番号５の塩基配列を有する遺伝子により特徴づけられるダイズ突然変異体Ｊ１８であり、これらのダイズ突然変異体の少なくとも１種を交配及び選抜し、育成して多価不飽和脂肪酸含量の低いダイズ油脂を製造する。
【選択図】 なし
【解決手段】配列表配列番号１の塩基配列を有する遺伝子により特徴づけられるダイズ突然変異体ＫＫ２１、配列表配列番号２の塩基配列を有する遺伝子により特徴づけられるダイズ突然変異体Ｍ２３、配列表配列番号３の塩基配列を有する遺伝子により特徴づけられるダイズ突然変異体Ｍ２４、配列表配列番号４の塩基配列を有する遺伝子により特徴づけられるダイズ突然変異体Ｍ５、配列表配列番号５の塩基配列を有する遺伝子により特徴づけられるダイズ突然変異体Ｊ１８であり、これらのダイズ突然変異体の少なくとも１種を交配及び選抜し、育成して多価不飽和脂肪酸含量の低いダイズ油脂を製造する。
【選択図】 なし
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ダイズ品種ベイ（Ｂａｙ）を親品種として、Ｘ線照射により得られる新規な突然変異体及びこれを用いて多価不飽和脂肪酸含量の低いダイズ油脂を製造する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
一般に、植物、特にその種子中に存在する油脂の主成分であるトリアシルグリセロールは、１分子のグリセロールに対して３分子の脂肪酸が結合した化合物であるが、その結合した脂肪酸の種類により、物理的、化学的性質や栄養価が異なる。そして、この脂肪酸組成は、それらが由来する植物種により特異的であり、そのため、植物種ごとにその用途が制限されるのを免れない。
他方、この植物油脂の貯蔵に際し、酸化による変質を抑制するには、酸化しやすい多価不飽和脂肪酸含量を低下させることが必要である。
【０００３】
ところで、ダイズ種子中には、パルミチン酸→ステアリン酸→オレイン酸→リノール酸→リノレン酸の生合成系が存在し、このオレイン酸からリノール酸への変換は、小胞体型ω−６脂肪酸不飽和化酵素により、またリノール酸からリノレン酸への変換は、小胞体型ω−３脂肪酸不飽和化酵素により行われていること、これらの酵素によるω−６及びω−３脂肪酸不飽和化には、複数の遺伝子が関連し、その一部はＦＡＤ２位及びＦＡＤ３位の遺伝子によりコントロールされていることが知られている［「Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．」，（１９９３），第１０３巻，第４６７〜４７６ページ、「Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．」，（１９９７）第９４巻，第３５６〜３５９ページ］。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ダイズの種子中の多価不飽和脂肪酸含量を低下させる品種改良に使用可能な突然変異体及びそれを用いて多価不飽和脂肪酸含量の低いダイズ油脂を製造することを目的としてなされたものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、油脂品質が改良されたダイズ品種を得るために鋭意研究を重ねた結果、ダイズ品種Ｂａｙを親品種としてこれにＸ線照射して得られる突然変異体がリノール酸及びリノレン酸の含量が低下した油脂を生成させることを見出し、この知見に基づいて本発明をなすに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は、配列表配列番号１の塩基配列を有する遺伝子により特徴づけられるダイズ突然変異体ＫＫ２１、配列表配列番号２の塩基配列を有する遺伝子により特徴づけられるダイズ突然変異体Ｍ２３、配列表配列番号３の塩基配列を有する遺伝子により特徴づけられるダイズ突然変異体Ｍ２４、配列表配列番号４の塩基配列を有する遺伝子により特徴づけられるダイズ突然変異体Ｍ５、配列表配列番号５の塩基配列を有する遺伝子により特徴づけられるダイズ突然変異体Ｊ１８、及びこれらのダイズ突然変異体の少なくとも１種を交配及び選抜し、育成することを特徴とする多価不飽和脂肪酸含量の低いダイズ油脂の製造方法を提供するものである。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明のダイズ突然変異体ＫＫ２１を特徴づける配列表配列番号１の塩基配列をもつ変異遺伝子は、ダイズ中の小胞体型ω−６脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の１つであるＦＡＤ２−１における開始コドンから２３３番目の塩基チミン（ｔ）が欠失したものであり、このためリノール酸の合成に必要な酵素の１つが正常に形成されない。また、ダイズ突然変異体Ｍ２３を特徴づける変異遺伝子は、配列表配列番号２の塩基配列をもつＦＡＤ２−１遺伝子の発現が認められず、必要な酵素の１つが合成されない。また、ダイズ突然変異体Ｍ２４を特徴づける配列表配列番号３の塩基配列をもつ変異遺伝子は、ダイズ中の小胞体型ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の１つであるＦＡＤ３−１ａにおける開始コドンから１０７８番目の塩基アデニン（ａ）が欠失したものであり、このためリノレン酸の合成に必要な酵素の１つが正常に形成されない。ダイズ突然変異体Ｍ５を特徴づける配列表配列番号４の塩基配列をもつ変異遺伝子は、ＦＡＤ３−１ｂ遺伝子の開始コドンから１０３３番目のシトシン（ｃ）から１０５１番目のグアニン（ｇ）までの塩基が欠失したものであり、このためリノレン酸の合成に必要な酵素の１つが正常に形成されない。さらに、ダイズ突然変異体Ｊ１８を特徴づける変異遺伝子は、配列表配列番号５の塩基配列をもつＦＡＤ３−１ｂの遺伝子の発現が全く認められず必要な酵素の１つが全然合成されない。
【０００８】
これらのダイズ突然変異体は、親品種のダイズ品種Ｂａｙ４０００粒に、Ｘ線を１Ｓｖ／分の強さで２００分間、計約２００Ｓｖ（シーベルト）を照射して突然変異を誘発させることにより得られる。
【０００９】
次に、このようにしてＸ線照射した種子、すなわち照射第１世代（以下Ｍ１種子という）を圃場に播種し栽培することにより自殖後代、すなわち照射第２世代（以下Ｍ２種子という）を得る。そして、このＭ２種子のそれぞれから同様にして照射第３世代（以下Ｍ３種子という）を育成し、Ｍ２種子の個体別に脂肪酸組成を分析する。このようにして、脂肪酸組成の分析結果から、Ｍ２種子約２０００個から平均４〜５個の突然変異体が発生することを確認し、突然変異体を分離した。このようにして得たＭ３種子から得られる照射Ｍ４世代以降については、突然変異体を確認する実験を継続して行い、各突然変異体を得た。
【００１０】
本発明において、これらの各遺伝子の検出は、以下の（１）〜（５）に示すように、ＲＴ−ＰＣＲ（ｒｅｖｅｒｓ ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、この方法とジデオキシ法との組合せ又はサザンブロット法などによって行うことができる。
【００１１】
（１）ＫＫ２１系統（高オレイン酸突然変異系統）に生じた変異型ＦＡＤ２−１遺伝子の検出；
ＲＴ−ＰＣＲ法とジデオキシ法を組み合わせることにより、次のようにして行うことができる。
すなわち、植物材料（未熟種子）から常法に従い、全ＲＮＡの抽出を行ったのち、常法に従いｏｌｉｇｏ−ｄＴプライマーを用いてｃＤＮＡを作成する。次にこのｃＤＮＡを鋳型として、プライマー１：５´−ａｔｔｇａｔａｇｃｃｃｃｔｃｃｇｔｔｃｃｃａａｇａ−３´及びプライマー２：５´−ａｔｔｇｔｇａｇｔｇｔｇａｃｇａｇａａｇａｇａａａｃ−３´を用いて常法に従ってＰＣＲ反応を行い、ＦＡＤ２−１遺伝子の塩基配列の一部を増幅したのち、精製したＤＮＡ断片を鋳型として、プライマー３：５´−ｇｇｇｔｃｔａｇｃａａａｇｇａａａｃａａｃａａｔｇｇｇａｇｇｔ−３´を用いて常法に従い塩基配列の解析を行う。その結果、図１下に示したｔ塩基の欠失が観察されれば、ＫＫ２１系統由来の変異型ＦＡＤ２−１遺伝子であると識別できる。
【００１２】
（２）Ｍ２３系統（高オレイン酸突然変異系統）に生じた変異型ＦＡＤ２−１遺伝子の検出；
（ａ）サザンブロット法による検出；
植物材料（緑葉、種子、根などいずれの組織でも可）から常法に従って抽出を行ったＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲ Ｉを用いて消化し、常法に従ってサザンブロット法による分析を行う。この際、プローブとしてＦＡＤ２−１遺伝子を用いるが、プローブの標識化については放射性同位体を用いる方法、あるいは化学的な修飾を用いる方法のいずれでも差しつかえない。正常なＦＡＤ２−１遺伝子をもつＢａｙ（原品種）では、約１．９ｋｂｐ、２．５ｋｂｐ及び４．６ｋｂｐの３本のバンドが検出されるが、Ｍ２３系統由来の変異型ＦＡＤ２−１遺伝子をもつ場合には、このうち約４．６ｋｂｐのバンドが消失することから識別ができる。この方法による分析パターンを図２に示す。
【００１３】
（ｂ）ＲＴ−ＰＣＲ法による検出；
植物材料（未熟種子）から常法に従い、全ＲＮＡの抽出を行ったのち、常法に従いｏｌｉｇｏ−ｄＴプライマーを用いてｃＤＮＡを作成する。次にこのｃＤＮＡを鋳型として、プライマー１：５´−ａｔｔｇａｔａｇｃｃｃｃｔｃｃｇｔｔｃｃｃａａｇａ−３´及びプライマー４：５´−ａｔａｃａｃａｃａａａｇｔｃａｔｔａｃｇｃｇｇｃａａ−３´を用い、常法に従ってＰＣＲ反応を行うことによりＦＡＤ２−１遺伝子のタンパク質コード領域の全長を含む塩基配列を増幅する。この反応生成物を常法に従いアガロース電気泳動法により分析すると、正常なＦＡＤ２−１遺伝子をもつＢａｙ（原品種）では、約１．３ｋｂｐの１本のバンドが検出されるが、Ｍ２３系統由来の変異型ＦＡＤ２−１遺伝子をもつ場合には、全くバンドが検出されないことから識別できる。この解析データを図３に示す。
【００１４】
（３）Ｍ２４系統（低リノレン酸突然変異系統）に生じた変異型ＦＡＤ３−１ａ遺伝子の検出；
ＲＴ−ＰＣＲ法とジデオキシ法を組み合わせることにより、次のようにして行うことができる。
植物材料（未熟種子）から常法に従い、全ＲＮＡの抽出を行ったのち、常法に従い、ｏｌｉｇｏ−ｄＴプライマーを用いてｃＤＮＡを作成する。次にこのｃＤＮＡを鋳型として、プライマー５：５´−ｔｔａｔｔａｃｇｃａｃｃａｃｃｃａｃｃａｃｇｔａｔｃｃｃｔ−３´及びプライマー６：５´−ｇｔｔｇｃｇａｇｔｇｇａｇｇａｇｃａｇａｇａａｔｃａｇｔｃ−３´を用いて常法に従ってＰＣＲ反応を行い、ＦＡＤ３−１ａ及びＦＡＤ３−１ｂ遺伝子のタンパク質コード領域の全長を含む塩基配列を同時に増幅する。次いで常法に従って精製したＤＮＡ断片を制限酵素Ｋｐｎ Ｉを用いて消化し、約１．２ｋｂｐのＤＮＡ断片をアガロースゲルを用いてＦＡＤ３−１ａ遺伝子のみを分離、精製したのち、これを鋳型として、プライマー７：５´−ｇｔｇｇａｔｃｇｔｇａｃｔａｔｇｇｔｔｇｇａｔｃｔａ−３´を用いて、常法に従い塩基配列の解析を行う。この際の分析パターンを図４に示す。その結果、図４下に示したａ塩基の欠失が観察されれば、Ｍ２４系統由来の変異型ＦＡＤ３−１ａ遺伝子であると識別できる。
【００１５】
（４）Ｍ５系統（低リノレン酸突然変異系統）に生じた変異型ＦＡＤ３−１ｂ遺伝子の検出；
ＲＴ−ＰＣＲ法とジデオキシ法を組み合わせることにより、次のようにして行うことができる。
植物材料（未熟種子）から常法に従い、全ＲＮＡの抽出を行ったのち、常法に従いｏｌｉｇｏ−ｄＴプライマーを用いてｃＤＮＡを作成する。次にこのｃＤＮＡを鋳型として、プライマー５：５´−ｔｔａｔｔａｃｇｃａｃｃａｃｃｃａｃｃａｃｇｔａｔｃｃｃｔ−３´及びプライマー６：５´−ｇｔｔｇｃｇａｇｔｇｇａｇｇａｇｃａｇａｇａａｔｃａｇｔｃ−３´を用いて常法に従ってＰＣＲ反応を行い、ＦＡＤ３−１ａ及びＦＡＤ３−１ｂ遺伝子のタンパク質コード領域の全長を含む塩基配列を同時に増幅する。次いで、常法に従って精製したＤＮＡ断片を制限酵素Ｋｐｎ Ｉを用いて消化し、約０．３ｋｂｐのＤＮＡ断片をアガロースゲルを用いてＦＡＤ３−１ｂ遺伝子のみを分離、精製したのち、これを鋳型として、プライマー７：５´−ｇｔｇｇａｔｃｇｔｇａｃｔａｔｇｇｔｔｇｇａｔｃｔａ−３´を用いて常法に従い塩基配列の解析を行う。この際の分析パターンを図５に示す。その結果、図５下に示した１９塩基（５´−ｃｔｔｃｇｔａａｇｔｇａｃａｃｔｇｇａ−３´）の欠失が観察されれば、Ｍ５系統由来の変異型ＦＡＤ３−１ｂ遺伝子であると識別できる。
【００１６】
（５）Ｊ１８系統（低リノレン酸突然変異系統）に生じた変異型ＦＡＤ３−１ｂ遺伝子の検出；
（ａ）サザンブロット法による検出；
常法に従って抽出を行ったＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲ Ｉを用いて消化し、常法に従ってサザンブロット法による分析を行う。この際、プローブとしてＦＡＤ３−１ｂ遺伝子を用いるが、プローブの標識化については放射性同位体を用いた方法又は化学的な修飾を用いた方法のいずれでも差しつかえない。正常なＦＡＤ３−１ｂ遺伝子をもつＢａｙ（原品種）では、約０．３５ｋｂｐ、２．１ｋｂｐ、２．３ｋｂｐ及び４．３ｋｂｐの４本のバンドが検出されるが、Ｊ１８系統由来の変異型ＦＡＤ３−１ｂ遺伝子をもつ場合には、このうち約０．３５ｋｂｐ及び４．３ｋｂｐの２本のバンドが消失することから識別が可能である。この際の分析パターンを図６に示す。
【００１７】
（ｂ）ＲＴ−ＰＣＲ法による検出；
植物材料（未熟種子を用いる）から常法に従い、全ＲＮＡの抽出を行ったのち、常法に従いｏｌｉｇｏ−ｄＴプライマーを用いてｃＤＮＡを作成する。次にこのｃＤＮＡを鋳型として、プライマー５：５´−ｔｔａｔｔａｃｇｃａｃｃａｃｃｃａｃｃａｃｇｔａｔｃｃｃｔ−３´及びプライマー６：５´−ｇｔｔｇｃｇａｇｔｇｇａｇｇａｇｃａｇａｇａａｔｃａｇｔｃ−３´を用いて、常法に従ってＰＣＲ反応を行い、ＦＡＤ３−１ａ及びＦＡＤ３−１ｂ遺伝子のタンパク質コード領域の全長を含む塩基配列を同時に増幅する。常法に従って精製したＤＮＡ断片を制限酵素Ｋｐｎ Ｉを用いて消化し、アガロースゲルを用いてＤＮＡ断片を分離すると、正常なＦＡＤ３−１ａ及びＦＡＤ３−１ｂ遺伝子をもつＢａｙ（原品種）では、ＦＡＤ３−１ｂ遺伝子に由来する約１．２ｋｂｐのＤＮＡ断片とＦＡＤ３−１ａ遺伝子に由来する約９００ｂｐ及び３００ｂｐのＤＮＡ断片が検出されるが、Ｊ１８系統由来の変異型ＦＡＤ３−１ｂ遺伝子をもつ場合には、このうち約１．２ｋｂｐのＤＮＡ断片が消失することから識別できる。この際の分析パターンを図７に示す。
【００１８】
【実施例】
次に実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの例によってなんら限定されるものではない。
【００１９】
なお、植物材料としては、原品種Ｂａｙ及びＢａｙにＸ線を照射して得られた３種の低リノレン酸含量の突然変異体Ｍ２４、Ｍ５及びＪ１８を、佐賀大学農学部温室内で栽培し、その緑葉をサンプリングしたのち、液体窒素中で凍結し、−８０℃のフリーザー中に保存したものを用いた。
【００２０】
実施例
（１）ゲノミックＤＮＡの抽出；
凍結した葉を乳鉢中で粉砕後、この粉末１ｇに対して３ｍｌの２％ＣＴＡＢバッファー［１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１．４Ｍ ＮａＣｌ，２０ｍＭ ＥＤＴＡ，２％ＣＴＡＢ］を加え、ゆっくり撹拌した。これを、６５℃のウォーターバス中で３０分間インキュベートし、等量のクロロホルムを加えてゆっくり撹拌したのち、４℃、８０００ｒｐｍの条件で、１０分間遠心してタンパク質を除去し、再度、クロロホルム抽出により水層中のタンパク質除去を行った。この水層を新しい遠心管に移し、１％ＣＴＡＢ沈殿バッファー［５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１％ＣＴＡＢ］を総量が１２ｍｌになるように加えて、ゆっくりと混合したのち、４℃、８０００ｒｐｍの条件で、１０分間遠心することによりＣＴＡＢ−ＤＮＡ複合体を沈殿させた。上清を捨てたのち、ＣＴＡＢを除去するために４ｍｌの１Ｍ ＮａＣｌに沈殿を溶解して、４ｍｌのイソプロパノールを加え、４℃、８０００ｒｐｍの条件で、１０分間遠心することにより、ＤＮＡを回収した。この沈殿を７０％エタノールで洗ったのち、ＲＮａｓｅ Ａ（１０μｇ／μｌ）を含むＴＥバッファー［１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１ｍＭ ＥＤＴＡ］２００μｌに溶解し、３７℃で１時間インキュベートすることによりＲＮＡを消化した。タンパク質を除去するため、これに、ＴＬＥ飽和フェノール−クロロホルム（１：１）を等量加えて、４℃、１５０００ｒｐｍの条件で、５分間遠心し、水層を１．５ｍｌの新しい遠心管に移し再度抽出操作を行ったのち、クロロホルムのみを用いて水層中のフェノールを除去した。これらのサンプルを、切断していないλＤＮＡと共に電気泳動を行い、濃度を測定したのち、ＤＮＡ濃度が０．２μｇ／μｌとなるように調整して−２０℃に保存した。
【００２１】
（２）ｔｏｔａｌ ＲＮＡの調製；
フェノール／ＳＤＳ法を改良した方法に従い、４ステージ（５ｍｍ以下、５〜７ｍｍ、７〜１０ｍｍ及び１０ｍｍ以上）に分けてサンプリングしたダイズの種子を液体窒素中で凍結し、乳鉢中で粉砕したのち、この粉末５ｇに対して、２５ｍｌの抽出バッファー［１８０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．２），９０ｍＭ ＬｉＣｌ，４．５ｍＭ ＥＤＴＡ，１％ＳＤＳ］及び、１０ｍｌの水飽和フェノールを加え、ポリトロン型ホモジナイザーを用いて最高速で約１分間撹拌した。さらに９ｍｌのクロロホルムを加えよく撹拌し、４℃、８０００ｒｐｍの条件で、１０分間遠心した。この水層を新しい遠心管に移して、５ｍｌの２Ｍ ＮａＯＡｃ（ｐＨ４．０）及び水飽和フェノールとクロロホルムを５ｍｌずつ加えよく撹拌して、４℃、８０００ｒｐｍの条件で１０分間遠心した。その後、１０ｍｌの水飽和フェノールとクロロホルムによる抽出を合計６回行ったのち、上清を１０ｍｌのクロロホルムで抽出することによりフェノールを除去した。１５ｍｌの８Ｍ ＬｉＣｌにこの水層を加えて、ゆっくりと上下に撹拌したのち、氷上で一晩静置してＲＮＡのリチウム塩を沈殿させ、４℃、８０００ｒｐｍの条件で１０分間遠心することにより、沈殿を回収した。得られた沈殿を５００μｌの滅菌水に溶かし、１．５ｍｌの遠心管に移したのち、１／１０量の３Ｍ ＮａＯＡｃを加え、氷上で３０分冷却したのち、４℃、１５０００ｒｐｍの条件で５分間遠心し、混入する多糖類を除去した。１．５倍量のイソプロパノール７５０μｌを分注した１．５ｍｌの遠心管に上清を加えて、４℃、１５０００ｒｐｍの条件で５分間遠心し、上清を捨てて、沈殿を５００μｌの滅菌水に溶解した。
【００２２】
（３）ｃＤＮＡの精製；
５μｇのｔｏｔａｌ ＲＮＡから、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、７５ｍＭ ＫＣｌ、３ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＤＤＴ、３００μＭ ｄＮＴＰｓ、０．５μｇのＯｌｉｇｏ−ｄＴプライマー及び２００ｕｎｉｔのＭ−ＭＬＶ逆転写酵素（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社製）を含む全量２０μｌの反応液を、３７℃において、１時間インキュベートし、ｃＤＮＡ合成を行った。次に、この１０倍希釈したｃＤＮＡ溶液１μｌをテンプレートとして、０．４μｌのＡｄｖａｎｔａｇｅＩＩポリメラーゼ（ＣＲＯＮＴＥＣＨ社製）、１×ＡｄｖａｎｔａｇｅＩＩ ｂｕｆｆｅｒ、１×ＧＣ−ＲＩＣＨ ｓｏｌｕｔｉｏｎ、２５０μＭ ｄＮＴＰｓ及び０．１ｐｍｏｌのプライマーを含むＰＣＲ反応液２０μｌを調製し、ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応の条件は９５℃で２分間のインキュベートを１サイクルに続いて、９５℃で３０秒間、６５℃で３０秒間、７２℃で３分間の反応サイクルインキュベートを３５回繰り返した。得られたＰＣＲ生成物は、１％アガロースゲルを用い、１００Ｖで３０分間の電気泳動処理し、エチジウムブロマイドで染色により検出された目的のｃＤＮＡ断片（Ｇｍ ＦＡＤ３−１：約１．２ｋｂｐ，Ｇｍ ＦＡＤ３−２：約１．３ｋｂｐ）を、ＱＩＡＥＸＩＩ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、ゲルから回収した。
【００２３】
（４）ＲＮＡプローブの作成；
１μｌのプラスミド（ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｅｒ）、５μｌのＴ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ、１×Ｒａｐｉｄ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ及び１μｌのＴ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅに３μｌの精製したＦＡＤ３−１若しくはＦＡＤ３−２遺伝子断片を加え、１２℃で一晩インキュベートした。ライゲーションしたプラスミドは大腸菌（ＸＬ−１０ Ｇｏｌｄ）に形質転換した後、５０ｍｇ／ｌのカルベニシリン、４０ｍｇ／ｌのＸ−ｇａｌ及び２００μＭのＩＰＴＧを含むＬＢ寒天培地にプレーティングし、３７℃にて一晩培養した後、白色コロニーを選んで、ＰＣＲ法を用いて断片の組み込みと方向を確認した。目的とするプラスミドを保持する菌を、カルベニシリンを含むＬＢ液体培地に植え付け、３７℃で約１４時間培養したのち、プラスミドを抽出した。得られたプラスミドをテンプレートとしてＰＣＲ反応を行い、マルチクローニングサイトを含むＤＮＡ断片を増幅して、アガロース電気泳導により精製した。このＤＮＡ断片に対し、３７℃で２時間のプロテアーゼ処理［０．５％ ＳＤＳ、２０μｇ／ｍｌプロテアーゼ］を行い、ＤＮＡ溶液中に混在するＲＮａｓｅを完全に消化し、２回のフェノール−クロロホルム抽出により、プロテアーゼを除去した。この上清に７５μｌのイソプロパノール及び５μｌの３Ｍ ＮａＯＡｃを加え、−８０℃で１５分間冷却したのち、４℃、１５０００ｒｐｍの条件で１０分間遠心し、生じた沈殿を２０μｌの滅菌水に溶解した。このＤＮＡを鋳型としてＤＩＧ ＲＮＡ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｍｉｘ（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いて標識したＲＮＡプローブを作成した。
【００２４】
（５）サザンブロット分析；
ゲノミックＤＮＡをＥｃｏＲ Ｉで完全に消化し、１％アガロースゲル電気泳動によって分子量に応じて分離した。このゲル上のＤＮＡ断片をアルカリ液［１．５Ｍ ＮａＣｌ，０．５Ｍ ＮａＯＨ］でトランスファーを行い、バイオダインプラスメンブレン（ＰＡＬＬ社製）に転写した。その後、高ＳＤＳ濃度ハブリダイゼーションバッファー［５０％ホルムアミド，５×ＳＳＣ，０．１％Ｎ−ラウロイルサルコシン，０．０２％ＳＤＳ，１％ブロッキング試薬］中で、５０℃で５時間以上プレハイブリダイゼーションを行い、ＤＩＧ−標識したＧｍ ＦＡＤ３−１及びＧｍ ＦＡＤ３−２のＲＮＡプローブを加え、さらに５０℃で一晩ハイブリダイゼーションを行った。その後、メンブレンを２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳを含む水溶液中で５分間ずつ２回、さらに、０．１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳを含む水溶液中で６５℃にて２０分ずつ３回の洗浄を行い、メンブレンに付着した余分なプローブを取り除いたのち、ＳＤＳを除去するため室温の洗浄バッファー［０．１Ｍ マレイン酸，０．１５Ｍ ＮａＣｌ，０．３％Ｔｗｅｅｎ２０（ｐＨ７．５）］で５分間の洗浄を行った。次に、バッファー２［０．１Ｍ マレイン酸，０．１５Ｍ ＮａＣｌ，０％ブロッキング試薬（ｐＨ７．５）］中で１時間のブロッキング反応を行い、１０００倍に希釈したＡｎｔｉ−Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ−ＡＰ Ｆａｂ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ（Ｒｏｃｈｅ社製）を含むバッファー２中で１時間のインキュベートを行い、ＤＩＧ標識したプローブに標識抗体を結合させた。その後、洗浄バッファー中で１５分間ずつ３回の洗浄を行い、余分な抗体を取り除いた。これをバッファー３［１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１０ｍＭ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＭｇＣｌ２］中で平衡化したのち、ＣＤＰ−Ｓｔａｒ溶液（Ｒｏｃｈｅ社製）中で５分間のインキュベートを行い、メンブレンをラップで密閉して３７℃で１５分間インキュベートした。化学発光は、Ｘ線フィルムに感光させることにより検出した。
【００２５】
（６）ノーザンブロット分析；
５μｇのｔｏｔａｌ ＲＮＡを１．２％のホルムアルデヒド・アガロースゲル［１×ＭＯＰＳバッファー，５％ホルムアルデヒド，１．２％アガロース］を用いた電気泳動により分離し、２０×ＳＳＣバッファーを用いて、バイオダインプラスメンブレン（ＰＡＬＬ社製）に転写した。メンブレンを２×ＳＳＣで濯いだのち、ＵＶクロスリンカー（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を用いて７０ｍＪ／ｃｍ２のＵＶ光を照射することによりＲＮＡの固定化を行った。ハイブリダイゼーションは、サザンブロット分析と同様に、高ＳＤＳ濃度ハイブリダイゼーションバッファーを用い６５℃にて行い、検出についても同様に行った。
【００２６】
（７）シークエンス解析；
塩基配列の解析は、Ｂｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．０ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて行った。テンプレートにはＱＩＡＥＸ ＩＩ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてゲルより回収したｃＤＮＡ断片（ｃＤＮＡ断片：テンプレートの濃度，１００〜２００ｂｐ：２ｎｇ／μｌ，２００〜５００ｂｐ：５ｎｇ／μｌ，５００〜１０００ｂｐ：１０ｎｇ／μｌ，１０００〜２０００ｂｐ：２０ｎｇ／μｌ，＞２０００ｂｐ：５０ｎｇ／μｌ）、１×Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ＰｒｅＭｉｘ、１×シークエンシングバッファー［８０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０），２ｍＭ ＭｇＣｌ２，０．０１％ＢＳＡ］、１ｐｍｏｌ／μｌのプライマーを含むシークエンス反応液を作成し、９５℃で３０秒間インキュベートを１回行ったのち、９５℃で３０秒間、６０℃で４分間の反応サイクルを３０回繰り返すことによりシークエンス反応を行った。この反応液を、マルチスクリーンＨＶプレート（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）にＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０ Ｆｉｎｅ（Ａｍａｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を充填したスピンカラムを用いて反応産物の精製を行い、６５℃のオーブン中で精製物を乾固した。これを３０μｌのＴｅｍｐｌａｔｅ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔで完全に溶解し、９５℃で１０分間加熱し熱変性を行ったのち、１０分間氷水で急冷したものを、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ
Ａｎａｌｙｚｅｒを用いて分析した。
【００２７】
このようにして得られた突然変異体Ｍ２４、Ｍ５及びＪ１８の遺伝子の塩基配列を配列表配列番号３、４及び５に示す。
【００２８】
次に、本発明方法に従い、多価不飽和脂肪酸含量の低いダイズ油脂を製造するには、前記のようにして得たダイズ突然変異体を交配、選抜し、育成することにより増殖栽培して種子を収穫する。この際、突然変異体中の遺伝子は１種であってもよいし、２種以上であってもよい。
【００２９】
そして、ダイズ突然変異体ＫＫ２１及びＭ２３の場合は、オレイン酸からリノール酸を生成する小胞体型ω−６脂肪酸不飽和化酵素を欠くことになるので、リノール酸及びそれがさらに変化するリノレン酸の生成が抑制され、リノール酸及びリノレン酸含量の低いダイズ油脂が得られることになるし、またダイズ突然変異体Ｍ２４、Ｍ５及びＪ１８は、リノール酸からリノレン酸を生成する小胞体型ω−３脂肪酸不飽和化酵素を欠くことになるので、リノレン酸含量の低いダイズ油脂が得られることになる。
【００３０】
【発明の効果】
本発明によれば、酸化による品質低下の原因となる多価不飽和脂肪酸含量の低いダイズ種子を生産するダイズ品種の突然変異体を得ることができ、これを用いて酸化安定性の優れたダイズ油脂を効率よく製造することができる。
【００３１】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】ダイズ突然変異体ＫＫ２１の遺伝子の分析パターン。
【図２】ダイズ突然変異体Ｍ２３の遺伝子及びそれと対比される他の遺伝子のサザンブロット法による分析パターン。
【図３】ダイズ突然変異体Ｍ２３の遺伝子及びそれと対比される他の遺伝子のＲＴ−ＰＣＲ法による分析パターン。
【図４】ダイズ突然変異体Ｍ２４の遺伝子の分析パターン。
【図５】ダイズ突然変異体Ｍ５の遺伝子の分析パターン。
【図６】ダイズ突然変異体Ｊ１８の遺伝子及びそれと対比される他の遺伝子のサザンブロット法による分析パターン。
【図７】ダイズ突然変異体Ｊ１８の遺伝子及びそれと対比される他の遺伝子のＲＴ−ＰＣＲ法による分析パターン。
【発明の属する技術分野】
本発明は、ダイズ品種ベイ（Ｂａｙ）を親品種として、Ｘ線照射により得られる新規な突然変異体及びこれを用いて多価不飽和脂肪酸含量の低いダイズ油脂を製造する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
一般に、植物、特にその種子中に存在する油脂の主成分であるトリアシルグリセロールは、１分子のグリセロールに対して３分子の脂肪酸が結合した化合物であるが、その結合した脂肪酸の種類により、物理的、化学的性質や栄養価が異なる。そして、この脂肪酸組成は、それらが由来する植物種により特異的であり、そのため、植物種ごとにその用途が制限されるのを免れない。
他方、この植物油脂の貯蔵に際し、酸化による変質を抑制するには、酸化しやすい多価不飽和脂肪酸含量を低下させることが必要である。
【０００３】
ところで、ダイズ種子中には、パルミチン酸→ステアリン酸→オレイン酸→リノール酸→リノレン酸の生合成系が存在し、このオレイン酸からリノール酸への変換は、小胞体型ω−６脂肪酸不飽和化酵素により、またリノール酸からリノレン酸への変換は、小胞体型ω−３脂肪酸不飽和化酵素により行われていること、これらの酵素によるω−６及びω−３脂肪酸不飽和化には、複数の遺伝子が関連し、その一部はＦＡＤ２位及びＦＡＤ３位の遺伝子によりコントロールされていることが知られている［「Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．」，（１９９３），第１０３巻，第４６７〜４７６ページ、「Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．」，（１９９７）第９４巻，第３５６〜３５９ページ］。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ダイズの種子中の多価不飽和脂肪酸含量を低下させる品種改良に使用可能な突然変異体及びそれを用いて多価不飽和脂肪酸含量の低いダイズ油脂を製造することを目的としてなされたものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、油脂品質が改良されたダイズ品種を得るために鋭意研究を重ねた結果、ダイズ品種Ｂａｙを親品種としてこれにＸ線照射して得られる突然変異体がリノール酸及びリノレン酸の含量が低下した油脂を生成させることを見出し、この知見に基づいて本発明をなすに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は、配列表配列番号１の塩基配列を有する遺伝子により特徴づけられるダイズ突然変異体ＫＫ２１、配列表配列番号２の塩基配列を有する遺伝子により特徴づけられるダイズ突然変異体Ｍ２３、配列表配列番号３の塩基配列を有する遺伝子により特徴づけられるダイズ突然変異体Ｍ２４、配列表配列番号４の塩基配列を有する遺伝子により特徴づけられるダイズ突然変異体Ｍ５、配列表配列番号５の塩基配列を有する遺伝子により特徴づけられるダイズ突然変異体Ｊ１８、及びこれらのダイズ突然変異体の少なくとも１種を交配及び選抜し、育成することを特徴とする多価不飽和脂肪酸含量の低いダイズ油脂の製造方法を提供するものである。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明のダイズ突然変異体ＫＫ２１を特徴づける配列表配列番号１の塩基配列をもつ変異遺伝子は、ダイズ中の小胞体型ω−６脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の１つであるＦＡＤ２−１における開始コドンから２３３番目の塩基チミン（ｔ）が欠失したものであり、このためリノール酸の合成に必要な酵素の１つが正常に形成されない。また、ダイズ突然変異体Ｍ２３を特徴づける変異遺伝子は、配列表配列番号２の塩基配列をもつＦＡＤ２−１遺伝子の発現が認められず、必要な酵素の１つが合成されない。また、ダイズ突然変異体Ｍ２４を特徴づける配列表配列番号３の塩基配列をもつ変異遺伝子は、ダイズ中の小胞体型ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の１つであるＦＡＤ３−１ａにおける開始コドンから１０７８番目の塩基アデニン（ａ）が欠失したものであり、このためリノレン酸の合成に必要な酵素の１つが正常に形成されない。ダイズ突然変異体Ｍ５を特徴づける配列表配列番号４の塩基配列をもつ変異遺伝子は、ＦＡＤ３−１ｂ遺伝子の開始コドンから１０３３番目のシトシン（ｃ）から１０５１番目のグアニン（ｇ）までの塩基が欠失したものであり、このためリノレン酸の合成に必要な酵素の１つが正常に形成されない。さらに、ダイズ突然変異体Ｊ１８を特徴づける変異遺伝子は、配列表配列番号５の塩基配列をもつＦＡＤ３−１ｂの遺伝子の発現が全く認められず必要な酵素の１つが全然合成されない。
【０００８】
これらのダイズ突然変異体は、親品種のダイズ品種Ｂａｙ４０００粒に、Ｘ線を１Ｓｖ／分の強さで２００分間、計約２００Ｓｖ（シーベルト）を照射して突然変異を誘発させることにより得られる。
【０００９】
次に、このようにしてＸ線照射した種子、すなわち照射第１世代（以下Ｍ１種子という）を圃場に播種し栽培することにより自殖後代、すなわち照射第２世代（以下Ｍ２種子という）を得る。そして、このＭ２種子のそれぞれから同様にして照射第３世代（以下Ｍ３種子という）を育成し、Ｍ２種子の個体別に脂肪酸組成を分析する。このようにして、脂肪酸組成の分析結果から、Ｍ２種子約２０００個から平均４〜５個の突然変異体が発生することを確認し、突然変異体を分離した。このようにして得たＭ３種子から得られる照射Ｍ４世代以降については、突然変異体を確認する実験を継続して行い、各突然変異体を得た。
【００１０】
本発明において、これらの各遺伝子の検出は、以下の（１）〜（５）に示すように、ＲＴ−ＰＣＲ（ｒｅｖｅｒｓ ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、この方法とジデオキシ法との組合せ又はサザンブロット法などによって行うことができる。
【００１１】
（１）ＫＫ２１系統（高オレイン酸突然変異系統）に生じた変異型ＦＡＤ２−１遺伝子の検出；
ＲＴ−ＰＣＲ法とジデオキシ法を組み合わせることにより、次のようにして行うことができる。
すなわち、植物材料（未熟種子）から常法に従い、全ＲＮＡの抽出を行ったのち、常法に従いｏｌｉｇｏ−ｄＴプライマーを用いてｃＤＮＡを作成する。次にこのｃＤＮＡを鋳型として、プライマー１：５´−ａｔｔｇａｔａｇｃｃｃｃｔｃｃｇｔｔｃｃｃａａｇａ−３´及びプライマー２：５´−ａｔｔｇｔｇａｇｔｇｔｇａｃｇａｇａａｇａｇａａａｃ−３´を用いて常法に従ってＰＣＲ反応を行い、ＦＡＤ２−１遺伝子の塩基配列の一部を増幅したのち、精製したＤＮＡ断片を鋳型として、プライマー３：５´−ｇｇｇｔｃｔａｇｃａａａｇｇａａａｃａａｃａａｔｇｇｇａｇｇｔ−３´を用いて常法に従い塩基配列の解析を行う。その結果、図１下に示したｔ塩基の欠失が観察されれば、ＫＫ２１系統由来の変異型ＦＡＤ２−１遺伝子であると識別できる。
【００１２】
（２）Ｍ２３系統（高オレイン酸突然変異系統）に生じた変異型ＦＡＤ２−１遺伝子の検出；
（ａ）サザンブロット法による検出；
植物材料（緑葉、種子、根などいずれの組織でも可）から常法に従って抽出を行ったＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲ Ｉを用いて消化し、常法に従ってサザンブロット法による分析を行う。この際、プローブとしてＦＡＤ２−１遺伝子を用いるが、プローブの標識化については放射性同位体を用いる方法、あるいは化学的な修飾を用いる方法のいずれでも差しつかえない。正常なＦＡＤ２−１遺伝子をもつＢａｙ（原品種）では、約１．９ｋｂｐ、２．５ｋｂｐ及び４．６ｋｂｐの３本のバンドが検出されるが、Ｍ２３系統由来の変異型ＦＡＤ２−１遺伝子をもつ場合には、このうち約４．６ｋｂｐのバンドが消失することから識別ができる。この方法による分析パターンを図２に示す。
【００１３】
（ｂ）ＲＴ−ＰＣＲ法による検出；
植物材料（未熟種子）から常法に従い、全ＲＮＡの抽出を行ったのち、常法に従いｏｌｉｇｏ−ｄＴプライマーを用いてｃＤＮＡを作成する。次にこのｃＤＮＡを鋳型として、プライマー１：５´−ａｔｔｇａｔａｇｃｃｃｃｔｃｃｇｔｔｃｃｃａａｇａ−３´及びプライマー４：５´−ａｔａｃａｃａｃａａａｇｔｃａｔｔａｃｇｃｇｇｃａａ−３´を用い、常法に従ってＰＣＲ反応を行うことによりＦＡＤ２−１遺伝子のタンパク質コード領域の全長を含む塩基配列を増幅する。この反応生成物を常法に従いアガロース電気泳動法により分析すると、正常なＦＡＤ２−１遺伝子をもつＢａｙ（原品種）では、約１．３ｋｂｐの１本のバンドが検出されるが、Ｍ２３系統由来の変異型ＦＡＤ２−１遺伝子をもつ場合には、全くバンドが検出されないことから識別できる。この解析データを図３に示す。
【００１４】
（３）Ｍ２４系統（低リノレン酸突然変異系統）に生じた変異型ＦＡＤ３−１ａ遺伝子の検出；
ＲＴ−ＰＣＲ法とジデオキシ法を組み合わせることにより、次のようにして行うことができる。
植物材料（未熟種子）から常法に従い、全ＲＮＡの抽出を行ったのち、常法に従い、ｏｌｉｇｏ−ｄＴプライマーを用いてｃＤＮＡを作成する。次にこのｃＤＮＡを鋳型として、プライマー５：５´−ｔｔａｔｔａｃｇｃａｃｃａｃｃｃａｃｃａｃｇｔａｔｃｃｃｔ−３´及びプライマー６：５´−ｇｔｔｇｃｇａｇｔｇｇａｇｇａｇｃａｇａｇａａｔｃａｇｔｃ−３´を用いて常法に従ってＰＣＲ反応を行い、ＦＡＤ３−１ａ及びＦＡＤ３−１ｂ遺伝子のタンパク質コード領域の全長を含む塩基配列を同時に増幅する。次いで常法に従って精製したＤＮＡ断片を制限酵素Ｋｐｎ Ｉを用いて消化し、約１．２ｋｂｐのＤＮＡ断片をアガロースゲルを用いてＦＡＤ３−１ａ遺伝子のみを分離、精製したのち、これを鋳型として、プライマー７：５´−ｇｔｇｇａｔｃｇｔｇａｃｔａｔｇｇｔｔｇｇａｔｃｔａ−３´を用いて、常法に従い塩基配列の解析を行う。この際の分析パターンを図４に示す。その結果、図４下に示したａ塩基の欠失が観察されれば、Ｍ２４系統由来の変異型ＦＡＤ３−１ａ遺伝子であると識別できる。
【００１５】
（４）Ｍ５系統（低リノレン酸突然変異系統）に生じた変異型ＦＡＤ３−１ｂ遺伝子の検出；
ＲＴ−ＰＣＲ法とジデオキシ法を組み合わせることにより、次のようにして行うことができる。
植物材料（未熟種子）から常法に従い、全ＲＮＡの抽出を行ったのち、常法に従いｏｌｉｇｏ−ｄＴプライマーを用いてｃＤＮＡを作成する。次にこのｃＤＮＡを鋳型として、プライマー５：５´−ｔｔａｔｔａｃｇｃａｃｃａｃｃｃａｃｃａｃｇｔａｔｃｃｃｔ−３´及びプライマー６：５´−ｇｔｔｇｃｇａｇｔｇｇａｇｇａｇｃａｇａｇａａｔｃａｇｔｃ−３´を用いて常法に従ってＰＣＲ反応を行い、ＦＡＤ３−１ａ及びＦＡＤ３−１ｂ遺伝子のタンパク質コード領域の全長を含む塩基配列を同時に増幅する。次いで、常法に従って精製したＤＮＡ断片を制限酵素Ｋｐｎ Ｉを用いて消化し、約０．３ｋｂｐのＤＮＡ断片をアガロースゲルを用いてＦＡＤ３−１ｂ遺伝子のみを分離、精製したのち、これを鋳型として、プライマー７：５´−ｇｔｇｇａｔｃｇｔｇａｃｔａｔｇｇｔｔｇｇａｔｃｔａ−３´を用いて常法に従い塩基配列の解析を行う。この際の分析パターンを図５に示す。その結果、図５下に示した１９塩基（５´−ｃｔｔｃｇｔａａｇｔｇａｃａｃｔｇｇａ−３´）の欠失が観察されれば、Ｍ５系統由来の変異型ＦＡＤ３−１ｂ遺伝子であると識別できる。
【００１６】
（５）Ｊ１８系統（低リノレン酸突然変異系統）に生じた変異型ＦＡＤ３−１ｂ遺伝子の検出；
（ａ）サザンブロット法による検出；
常法に従って抽出を行ったＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲ Ｉを用いて消化し、常法に従ってサザンブロット法による分析を行う。この際、プローブとしてＦＡＤ３−１ｂ遺伝子を用いるが、プローブの標識化については放射性同位体を用いた方法又は化学的な修飾を用いた方法のいずれでも差しつかえない。正常なＦＡＤ３−１ｂ遺伝子をもつＢａｙ（原品種）では、約０．３５ｋｂｐ、２．１ｋｂｐ、２．３ｋｂｐ及び４．３ｋｂｐの４本のバンドが検出されるが、Ｊ１８系統由来の変異型ＦＡＤ３−１ｂ遺伝子をもつ場合には、このうち約０．３５ｋｂｐ及び４．３ｋｂｐの２本のバンドが消失することから識別が可能である。この際の分析パターンを図６に示す。
【００１７】
（ｂ）ＲＴ−ＰＣＲ法による検出；
植物材料（未熟種子を用いる）から常法に従い、全ＲＮＡの抽出を行ったのち、常法に従いｏｌｉｇｏ−ｄＴプライマーを用いてｃＤＮＡを作成する。次にこのｃＤＮＡを鋳型として、プライマー５：５´−ｔｔａｔｔａｃｇｃａｃｃａｃｃｃａｃｃａｃｇｔａｔｃｃｃｔ−３´及びプライマー６：５´−ｇｔｔｇｃｇａｇｔｇｇａｇｇａｇｃａｇａｇａａｔｃａｇｔｃ−３´を用いて、常法に従ってＰＣＲ反応を行い、ＦＡＤ３−１ａ及びＦＡＤ３−１ｂ遺伝子のタンパク質コード領域の全長を含む塩基配列を同時に増幅する。常法に従って精製したＤＮＡ断片を制限酵素Ｋｐｎ Ｉを用いて消化し、アガロースゲルを用いてＤＮＡ断片を分離すると、正常なＦＡＤ３−１ａ及びＦＡＤ３−１ｂ遺伝子をもつＢａｙ（原品種）では、ＦＡＤ３−１ｂ遺伝子に由来する約１．２ｋｂｐのＤＮＡ断片とＦＡＤ３−１ａ遺伝子に由来する約９００ｂｐ及び３００ｂｐのＤＮＡ断片が検出されるが、Ｊ１８系統由来の変異型ＦＡＤ３−１ｂ遺伝子をもつ場合には、このうち約１．２ｋｂｐのＤＮＡ断片が消失することから識別できる。この際の分析パターンを図７に示す。
【００１８】
【実施例】
次に実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの例によってなんら限定されるものではない。
【００１９】
なお、植物材料としては、原品種Ｂａｙ及びＢａｙにＸ線を照射して得られた３種の低リノレン酸含量の突然変異体Ｍ２４、Ｍ５及びＪ１８を、佐賀大学農学部温室内で栽培し、その緑葉をサンプリングしたのち、液体窒素中で凍結し、−８０℃のフリーザー中に保存したものを用いた。
【００２０】
実施例
（１）ゲノミックＤＮＡの抽出；
凍結した葉を乳鉢中で粉砕後、この粉末１ｇに対して３ｍｌの２％ＣＴＡＢバッファー［１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１．４Ｍ ＮａＣｌ，２０ｍＭ ＥＤＴＡ，２％ＣＴＡＢ］を加え、ゆっくり撹拌した。これを、６５℃のウォーターバス中で３０分間インキュベートし、等量のクロロホルムを加えてゆっくり撹拌したのち、４℃、８０００ｒｐｍの条件で、１０分間遠心してタンパク質を除去し、再度、クロロホルム抽出により水層中のタンパク質除去を行った。この水層を新しい遠心管に移し、１％ＣＴＡＢ沈殿バッファー［５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１％ＣＴＡＢ］を総量が１２ｍｌになるように加えて、ゆっくりと混合したのち、４℃、８０００ｒｐｍの条件で、１０分間遠心することによりＣＴＡＢ−ＤＮＡ複合体を沈殿させた。上清を捨てたのち、ＣＴＡＢを除去するために４ｍｌの１Ｍ ＮａＣｌに沈殿を溶解して、４ｍｌのイソプロパノールを加え、４℃、８０００ｒｐｍの条件で、１０分間遠心することにより、ＤＮＡを回収した。この沈殿を７０％エタノールで洗ったのち、ＲＮａｓｅ Ａ（１０μｇ／μｌ）を含むＴＥバッファー［１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１ｍＭ ＥＤＴＡ］２００μｌに溶解し、３７℃で１時間インキュベートすることによりＲＮＡを消化した。タンパク質を除去するため、これに、ＴＬＥ飽和フェノール−クロロホルム（１：１）を等量加えて、４℃、１５０００ｒｐｍの条件で、５分間遠心し、水層を１．５ｍｌの新しい遠心管に移し再度抽出操作を行ったのち、クロロホルムのみを用いて水層中のフェノールを除去した。これらのサンプルを、切断していないλＤＮＡと共に電気泳動を行い、濃度を測定したのち、ＤＮＡ濃度が０．２μｇ／μｌとなるように調整して−２０℃に保存した。
【００２１】
（２）ｔｏｔａｌ ＲＮＡの調製；
フェノール／ＳＤＳ法を改良した方法に従い、４ステージ（５ｍｍ以下、５〜７ｍｍ、７〜１０ｍｍ及び１０ｍｍ以上）に分けてサンプリングしたダイズの種子を液体窒素中で凍結し、乳鉢中で粉砕したのち、この粉末５ｇに対して、２５ｍｌの抽出バッファー［１８０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．２），９０ｍＭ ＬｉＣｌ，４．５ｍＭ ＥＤＴＡ，１％ＳＤＳ］及び、１０ｍｌの水飽和フェノールを加え、ポリトロン型ホモジナイザーを用いて最高速で約１分間撹拌した。さらに９ｍｌのクロロホルムを加えよく撹拌し、４℃、８０００ｒｐｍの条件で、１０分間遠心した。この水層を新しい遠心管に移して、５ｍｌの２Ｍ ＮａＯＡｃ（ｐＨ４．０）及び水飽和フェノールとクロロホルムを５ｍｌずつ加えよく撹拌して、４℃、８０００ｒｐｍの条件で１０分間遠心した。その後、１０ｍｌの水飽和フェノールとクロロホルムによる抽出を合計６回行ったのち、上清を１０ｍｌのクロロホルムで抽出することによりフェノールを除去した。１５ｍｌの８Ｍ ＬｉＣｌにこの水層を加えて、ゆっくりと上下に撹拌したのち、氷上で一晩静置してＲＮＡのリチウム塩を沈殿させ、４℃、８０００ｒｐｍの条件で１０分間遠心することにより、沈殿を回収した。得られた沈殿を５００μｌの滅菌水に溶かし、１．５ｍｌの遠心管に移したのち、１／１０量の３Ｍ ＮａＯＡｃを加え、氷上で３０分冷却したのち、４℃、１５０００ｒｐｍの条件で５分間遠心し、混入する多糖類を除去した。１．５倍量のイソプロパノール７５０μｌを分注した１．５ｍｌの遠心管に上清を加えて、４℃、１５０００ｒｐｍの条件で５分間遠心し、上清を捨てて、沈殿を５００μｌの滅菌水に溶解した。
【００２２】
（３）ｃＤＮＡの精製；
５μｇのｔｏｔａｌ ＲＮＡから、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、７５ｍＭ ＫＣｌ、３ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＤＤＴ、３００μＭ ｄＮＴＰｓ、０．５μｇのＯｌｉｇｏ−ｄＴプライマー及び２００ｕｎｉｔのＭ−ＭＬＶ逆転写酵素（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社製）を含む全量２０μｌの反応液を、３７℃において、１時間インキュベートし、ｃＤＮＡ合成を行った。次に、この１０倍希釈したｃＤＮＡ溶液１μｌをテンプレートとして、０．４μｌのＡｄｖａｎｔａｇｅＩＩポリメラーゼ（ＣＲＯＮＴＥＣＨ社製）、１×ＡｄｖａｎｔａｇｅＩＩ ｂｕｆｆｅｒ、１×ＧＣ−ＲＩＣＨ ｓｏｌｕｔｉｏｎ、２５０μＭ ｄＮＴＰｓ及び０．１ｐｍｏｌのプライマーを含むＰＣＲ反応液２０μｌを調製し、ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応の条件は９５℃で２分間のインキュベートを１サイクルに続いて、９５℃で３０秒間、６５℃で３０秒間、７２℃で３分間の反応サイクルインキュベートを３５回繰り返した。得られたＰＣＲ生成物は、１％アガロースゲルを用い、１００Ｖで３０分間の電気泳動処理し、エチジウムブロマイドで染色により検出された目的のｃＤＮＡ断片（Ｇｍ ＦＡＤ３−１：約１．２ｋｂｐ，Ｇｍ ＦＡＤ３−２：約１．３ｋｂｐ）を、ＱＩＡＥＸＩＩ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、ゲルから回収した。
【００２３】
（４）ＲＮＡプローブの作成；
１μｌのプラスミド（ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｅｒ）、５μｌのＴ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ、１×Ｒａｐｉｄ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ及び１μｌのＴ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅに３μｌの精製したＦＡＤ３−１若しくはＦＡＤ３−２遺伝子断片を加え、１２℃で一晩インキュベートした。ライゲーションしたプラスミドは大腸菌（ＸＬ−１０ Ｇｏｌｄ）に形質転換した後、５０ｍｇ／ｌのカルベニシリン、４０ｍｇ／ｌのＸ−ｇａｌ及び２００μＭのＩＰＴＧを含むＬＢ寒天培地にプレーティングし、３７℃にて一晩培養した後、白色コロニーを選んで、ＰＣＲ法を用いて断片の組み込みと方向を確認した。目的とするプラスミドを保持する菌を、カルベニシリンを含むＬＢ液体培地に植え付け、３７℃で約１４時間培養したのち、プラスミドを抽出した。得られたプラスミドをテンプレートとしてＰＣＲ反応を行い、マルチクローニングサイトを含むＤＮＡ断片を増幅して、アガロース電気泳導により精製した。このＤＮＡ断片に対し、３７℃で２時間のプロテアーゼ処理［０．５％ ＳＤＳ、２０μｇ／ｍｌプロテアーゼ］を行い、ＤＮＡ溶液中に混在するＲＮａｓｅを完全に消化し、２回のフェノール−クロロホルム抽出により、プロテアーゼを除去した。この上清に７５μｌのイソプロパノール及び５μｌの３Ｍ ＮａＯＡｃを加え、−８０℃で１５分間冷却したのち、４℃、１５０００ｒｐｍの条件で１０分間遠心し、生じた沈殿を２０μｌの滅菌水に溶解した。このＤＮＡを鋳型としてＤＩＧ ＲＮＡ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｍｉｘ（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いて標識したＲＮＡプローブを作成した。
【００２４】
（５）サザンブロット分析；
ゲノミックＤＮＡをＥｃｏＲ Ｉで完全に消化し、１％アガロースゲル電気泳動によって分子量に応じて分離した。このゲル上のＤＮＡ断片をアルカリ液［１．５Ｍ ＮａＣｌ，０．５Ｍ ＮａＯＨ］でトランスファーを行い、バイオダインプラスメンブレン（ＰＡＬＬ社製）に転写した。その後、高ＳＤＳ濃度ハブリダイゼーションバッファー［５０％ホルムアミド，５×ＳＳＣ，０．１％Ｎ−ラウロイルサルコシン，０．０２％ＳＤＳ，１％ブロッキング試薬］中で、５０℃で５時間以上プレハイブリダイゼーションを行い、ＤＩＧ−標識したＧｍ ＦＡＤ３−１及びＧｍ ＦＡＤ３−２のＲＮＡプローブを加え、さらに５０℃で一晩ハイブリダイゼーションを行った。その後、メンブレンを２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳを含む水溶液中で５分間ずつ２回、さらに、０．１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳを含む水溶液中で６５℃にて２０分ずつ３回の洗浄を行い、メンブレンに付着した余分なプローブを取り除いたのち、ＳＤＳを除去するため室温の洗浄バッファー［０．１Ｍ マレイン酸，０．１５Ｍ ＮａＣｌ，０．３％Ｔｗｅｅｎ２０（ｐＨ７．５）］で５分間の洗浄を行った。次に、バッファー２［０．１Ｍ マレイン酸，０．１５Ｍ ＮａＣｌ，０％ブロッキング試薬（ｐＨ７．５）］中で１時間のブロッキング反応を行い、１０００倍に希釈したＡｎｔｉ−Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ−ＡＰ Ｆａｂ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ（Ｒｏｃｈｅ社製）を含むバッファー２中で１時間のインキュベートを行い、ＤＩＧ標識したプローブに標識抗体を結合させた。その後、洗浄バッファー中で１５分間ずつ３回の洗浄を行い、余分な抗体を取り除いた。これをバッファー３［１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１０ｍＭ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＭｇＣｌ２］中で平衡化したのち、ＣＤＰ−Ｓｔａｒ溶液（Ｒｏｃｈｅ社製）中で５分間のインキュベートを行い、メンブレンをラップで密閉して３７℃で１５分間インキュベートした。化学発光は、Ｘ線フィルムに感光させることにより検出した。
【００２５】
（６）ノーザンブロット分析；
５μｇのｔｏｔａｌ ＲＮＡを１．２％のホルムアルデヒド・アガロースゲル［１×ＭＯＰＳバッファー，５％ホルムアルデヒド，１．２％アガロース］を用いた電気泳動により分離し、２０×ＳＳＣバッファーを用いて、バイオダインプラスメンブレン（ＰＡＬＬ社製）に転写した。メンブレンを２×ＳＳＣで濯いだのち、ＵＶクロスリンカー（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を用いて７０ｍＪ／ｃｍ２のＵＶ光を照射することによりＲＮＡの固定化を行った。ハイブリダイゼーションは、サザンブロット分析と同様に、高ＳＤＳ濃度ハイブリダイゼーションバッファーを用い６５℃にて行い、検出についても同様に行った。
【００２６】
（７）シークエンス解析；
塩基配列の解析は、Ｂｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．０ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて行った。テンプレートにはＱＩＡＥＸ ＩＩ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてゲルより回収したｃＤＮＡ断片（ｃＤＮＡ断片：テンプレートの濃度，１００〜２００ｂｐ：２ｎｇ／μｌ，２００〜５００ｂｐ：５ｎｇ／μｌ，５００〜１０００ｂｐ：１０ｎｇ／μｌ，１０００〜２０００ｂｐ：２０ｎｇ／μｌ，＞２０００ｂｐ：５０ｎｇ／μｌ）、１×Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ＰｒｅＭｉｘ、１×シークエンシングバッファー［８０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０），２ｍＭ ＭｇＣｌ２，０．０１％ＢＳＡ］、１ｐｍｏｌ／μｌのプライマーを含むシークエンス反応液を作成し、９５℃で３０秒間インキュベートを１回行ったのち、９５℃で３０秒間、６０℃で４分間の反応サイクルを３０回繰り返すことによりシークエンス反応を行った。この反応液を、マルチスクリーンＨＶプレート（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）にＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０ Ｆｉｎｅ（Ａｍａｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を充填したスピンカラムを用いて反応産物の精製を行い、６５℃のオーブン中で精製物を乾固した。これを３０μｌのＴｅｍｐｌａｔｅ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔで完全に溶解し、９５℃で１０分間加熱し熱変性を行ったのち、１０分間氷水で急冷したものを、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ
Ａｎａｌｙｚｅｒを用いて分析した。
【００２７】
このようにして得られた突然変異体Ｍ２４、Ｍ５及びＪ１８の遺伝子の塩基配列を配列表配列番号３、４及び５に示す。
【００２８】
次に、本発明方法に従い、多価不飽和脂肪酸含量の低いダイズ油脂を製造するには、前記のようにして得たダイズ突然変異体を交配、選抜し、育成することにより増殖栽培して種子を収穫する。この際、突然変異体中の遺伝子は１種であってもよいし、２種以上であってもよい。
【００２９】
そして、ダイズ突然変異体ＫＫ２１及びＭ２３の場合は、オレイン酸からリノール酸を生成する小胞体型ω−６脂肪酸不飽和化酵素を欠くことになるので、リノール酸及びそれがさらに変化するリノレン酸の生成が抑制され、リノール酸及びリノレン酸含量の低いダイズ油脂が得られることになるし、またダイズ突然変異体Ｍ２４、Ｍ５及びＪ１８は、リノール酸からリノレン酸を生成する小胞体型ω−３脂肪酸不飽和化酵素を欠くことになるので、リノレン酸含量の低いダイズ油脂が得られることになる。
【００３０】
【発明の効果】
本発明によれば、酸化による品質低下の原因となる多価不飽和脂肪酸含量の低いダイズ種子を生産するダイズ品種の突然変異体を得ることができ、これを用いて酸化安定性の優れたダイズ油脂を効率よく製造することができる。
【００３１】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】ダイズ突然変異体ＫＫ２１の遺伝子の分析パターン。
【図２】ダイズ突然変異体Ｍ２３の遺伝子及びそれと対比される他の遺伝子のサザンブロット法による分析パターン。
【図３】ダイズ突然変異体Ｍ２３の遺伝子及びそれと対比される他の遺伝子のＲＴ−ＰＣＲ法による分析パターン。
【図４】ダイズ突然変異体Ｍ２４の遺伝子の分析パターン。
【図５】ダイズ突然変異体Ｍ５の遺伝子の分析パターン。
【図６】ダイズ突然変異体Ｊ１８の遺伝子及びそれと対比される他の遺伝子のサザンブロット法による分析パターン。
【図７】ダイズ突然変異体Ｊ１８の遺伝子及びそれと対比される他の遺伝子のＲＴ−ＰＣＲ法による分析パターン。
Claims (7)
- 配列表配列番号１の塩基配列を有する遺伝子により特徴づけられるダイズ突然変異体ＫＫ２１。
- 配列表配列番号２の塩基配列を有する遺伝子により特徴づけられるダイズ突然変異体Ｍ２３。
- 配列表配列番号３の塩基配列を有する遺伝子により特徴づけられるダイズ突然変異体Ｍ２４。
- 配列表配列番号４の塩基配列を有する遺伝子により特徴づけられるダイズ突然変異体Ｍ５。
- 配列表配列番号５の塩基配列を有する遺伝子により特徴づけられるダイズ突然変異体Ｊ１８。
- 請求項１ないし５のいずれかに記載のダイズ突然変異体の少なくとも１種を交配及び選抜し、育成することを特徴とする多価不飽和脂肪酸含量の低いダイズ油脂の製造方法。
- 多価不飽和脂肪酸がリノール酸又はリノレン酸あるいはその両方である請求項６記載のダイズ油脂の製造方法。
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