JP2003532683A - 造血細胞のｃｘｃｒ４アンタゴニスト治療 - Google Patents

造血細胞のｃｘｃｒ４アンタゴニスト治療

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Abstract

(57)【要約】 本発明の様々な局面に従い、CXCR4アンタゴニストは、前駆細胞または幹細胞のような造血細胞を処理するため、細胞の増幅、自己複製、増殖、または増大の速度を促進するために使用することができる。CXCR4アンタゴニストは、造血幹細胞／前駆細胞の増幅／自己再生を刺激するために治療的に使用することができる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 発明の技術分野 1つの局面において、本発明は、インビトロおよびインビボにおける造血細胞
の処置で使用するためのCXCケモカイン受容体4(CXCR4)のペプチドアンタゴニス
トを含む、ケモカイン受容体アンタゴニストの治療的使用に関する。別の局面に
おいて、本発明は、造血細胞の処置で使用することができる新規CXCR4アンタゴ
ニストに関する。
【０００２】 発明の背景 サイトカインは、免疫応答を調節する単球またはリンパ球を含む様々な細胞に
より分泌される可溶性タンパク質である。ケモカインは、化学誘引性タンパク質
のスーパーファミリーである。ケモカインは、様々な生物学的反応を調節し、こ
れらは白血球およびリンパ球の多系統を生体臓器組織へ動員することを促進する
。ケモカインは、タンパク質内の最初の2個のシステイン残基の相対位置に従い
ふたつのファミリーに分類することができる。1つのファミリーは、最初の2個の
システインが1個のアミノ酸残基により隔てられている、CXCケモカインであり、
および他方のファミリーは、最初の2個のシステインが隣接している、CCケモカ
インである。ふたつの小さい亜群は、2個のシステインのうちの1個のみ有する(C
)か、もしくはシステインの間に3個のアミノ酸を有する(CX3C)。ヒトにおいて、
CXCケモカイン遺伝子は第4染色体上に(SDF-1遺伝子を除く、これは第10染色体に
位置する)、およびCCケモカインは第17染色体上にクラスター化されている。
【０００３】 ケモカインの分子標的は、細胞表面受容体である。このような受容体のひとつ
は、CXCケモカイン受容体4(CXCR4)であり、これはG1に結合された7回膜貫通タン
パク質であり、以前はLESTR(Loetscher, M.、Geiser, T.、O'Reilly, T.、Zwahl
en, R.、Baggionlini, M.、およびMoser, B.、J. Biol. Chem.、269:232-237(19
94))、HUMSTR(Federsppiel, B.、Duncan, A.M.V.、Delaney, A.、Schappert, K.
、Clark-Lewis, I.、およびJirik, F.R.、Genomics、16:707-712(1993))および
フューシン(Feng, Y.、Broeder, C.C.、Kennedy, P.E.、およびBerger, E.A.、
「HIV-1侵入補因子：7回膜貫通Gタンパク質共役型受容体の機能性cDNAクローニ
ング(HIV-1 entry cofactor: Functional cDNA cloning of a seven-transmembr
ane G protein-coupled receptor)」、Science、272:872-877(1996))と称されて
いた。CXCR4は、造血起源の細胞上に広範囲で発現しており、ヒト免疫不全ウイ
ルス1(HIV-1)のためのCD4+との主要な共受容体である(Feng, Y.、Broeder, C.C.
、Kennedy, R.E.、およびBerger, E.A.、「HIV-1侵入補因子：7回膜貫通Gタンパ
ク質共役型受容体の機能性cDNAクローニング」、Science、272:872-877(1996))
。
【０００４】 ケモカインは、7回膜貫通Gタンパク質共役型受容体との結合によりそれらの作
用を媒介し、かつ白血球サブセットを炎症部位へ誘引すると考えられている(Bag
lioniniら、Nature、392:565-568(1998))。多くのケモカインが、リンパ系組織
において構成的に発現されることが示されており、このことはこれらがリンパ系
器官間および器官内のリンパ球移行(lympnocyte trafficking)の調節における恒
常性維持機能を有し得ることを示唆している(KimおよびBroxmeyer、J. Leuk. Bi
ol.、56:6-15(1999))。
【０００５】 ストローマ細胞由来因子-1(SDF-1)は、骨髄ストローマから構成的に分泌され
ることが知られているケモカインCXCファミリーの一員である(Tashiro、Science
、261:600-602(1993))。ヒトとマウスのSDF-1推定タンパク質配列は、約92％の
同一性を有している。ストローマ細胞由来因子-1α(SDF-1α)およびストローマ
細胞由来因子-1β(SDF-1β)は密接に関連している(本明細書においてはいずれも
SDF-1と称する)。SDF-1αおよびSDF-1βの未変性のアミノ酸配列は公知であり、
これらのタンパク質をコードしているゲノム配列も知られている(1996年10月8日
に発行された米国特許第5,563,048号、および1998年5月26日に発行された米国特
許第5,756,084号を参照)。ゲノムクローンの同定は、αおよびβイソ型が、単独
の遺伝子の選択的スプライシングの結果であることを示している。α型はエクソ
ン1〜3に由来し、一方β型はエクソン4由来の追加の配列を含む。全ヒト遺伝子
はおよそ10Kbである。SDF-1は最初に、プレB細胞刺激因子として、ならびにT細
胞および単球についての高度に効果的な走化性因子として特徴付けられた(Bieul
ら、J. Exp. Med.、184:1101-1110(1996))。
【０００６】 SDF-1の生物学的作用は、造血幹細胞を含む単核白血球上に発現されるケモカ
イン受容体CXCR4(同じくフューシン(fusin)またはLESTRとしても公知)により媒
介され得る。SDF-1は、CXCR4の天然のリガンドと考えられ、CXCR4はSDF-1の天然
の受容体と考えられている(Nagasawzaら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、93:726
-732(1997))。SDF-1の遺伝的排除は、周産期(parinatal)致死率に関連し、これ
は心発生、B細胞リンパ球新生、および骨髄発生の異常を含む(Nagasawaら、Natu
re、382:635-637(1996))。
【０００７】 SDF-1は、他のケモカインとは、骨髄前駆細胞の移行、輸送、およびホーミン
グにおける基本的役割が報告されている点で機能的に区別される(Aiuti, A.、We
bb, I.J.、Bleul, C.、Springer, T.、およびGuierrez-Ramos, J.C.、J. Exp. M
ed.、185:111-120(1996)、およびNagasawa, T.、Hirota, S.、Tachibana, K.、T
akakura N.、Nishikawa, S.-I.、Kitamura, Y.、Yoshida, N.、Kikutani, H.、
およびKishimoto, T.、Nature、382:635-638(1996))。SDF-1は更に、他のCXCケ
モカインとわずかに約22％のアミノ酸配列同一性を有する点で、構造的に区別さ
れる(Bleul, C.C.、Fuhlbrigge, R.C.、Casasnovas, J.M.、Aiuti, A.、およびS
pringer, T.A.、J. Exp. Med.、184:1101-1109(1996))。SDF-1は、いくつかの細
胞型により構成的に産生されるように思われ、特に骨髄ストローマ細胞において
高レベルで認められる(Shirozu, M.、Nakano, T.、Inazawa, J.、Tashiro, K.、
Tada, H.、Shinohara, T.、およびHonjo, T.、Genomics、28:495-500(1995)、お
よびBleul, C.C.、Fuhlbrigge, R.C.、Casasnovas, J.M.、Aiuti, A.、およびSp
ringer, T.A.、J. Exp. Med.、184:1101-1109(1996))。SDF-1の基本的生理的役
割は、種間のSDF-1配列の高レベルの保存により暗示されている。インビトロに
おいて、SDF-1は、単球および骨髄由来の前駆細胞を含む広範な細胞の走化性を
刺激する(Aiuti, A.、Webb, I.J.、Bleul, C.、Springer, T.、およびGuierrez-
Ramos, J.C.、J. Exp. Med.、185:111-120(1996)およびBleul, C.C.、Fuhlbrigg
e, R.C.、Casasnovas, J.M.、Aiuti, A.、およびSpringer, T.A.、J. Exp. Med.
、184:1101-1109(1996))。SDF-1は更に、休止状態および活性化されたT-リンパ
球を高い割合で刺激する(Bleul, C.C.、Fuhlbrigge, R.C.、Casasnovas, J.M.、
Aiuti, A.、およびSpringer, T.A.、J. Exp. Med.、184:1101-1109(1996)および
Campbell, J.J.、Hendrick, J.、Zlotnik, A.、Siani, M.A.、Thompson, D.A.、
およびButcher, E.C.、Science、279:381-383(1998))。
【０００８】 未変性のSDF-1は、血小板の成熟および活性化を誘導すること(Hamada T.ら、J
. Exp. Med.、188:638-548(1998)；Hodohara K.ら、Blood、95:769-775(2000)；
Kowalska M. A.ら、Blood、96:50-57(2000))、ならびにCXCR4は、巨核球系細胞(
CFUOMeg)上に発現されること(Wang J-F.ら、Blood、92:756-764(1998))が示され
ている。
【０００９】 様々な疾患は、***細胞に対し優先的に細胞傷害性であるような作因による治
療を必要としている。例えば癌細胞は、細胞傷害性用量の放射線および化学療法
剤の標的とすることができる。癌療法のためのこれらの手法の著しい副作用は、
迅速に***している正常細胞に対するこのような治療の病因である。この正常細
胞とは、例えば毛嚢細胞、粘膜細胞ならびに造血細胞、例えば未成熟な骨髄前駆
細胞および幹細胞などを含む。造血幹細胞、前駆体または前駆細胞の無差別破壊
は、白血球、リンパ球および赤血球などの正常な成熟血液細胞数の減少につなが
り得る。成熟細胞数に対する大きな影響が、天然に比較的短い半減期を有する細
胞、特に好中球(好中球減少症)および血小板(血小板減少症)に認められる。白血
球数の減少は、免疫系の機能喪失を伴い、これは患者の日和見感染のリスクを増
大することがある。化学療法に起因した好中球減少症は、例えば細胞傷害性処置
の2回または3日以内に生じ、患者は造血系が好中球数を再生するのに十分なまで
に回復するまで、最大2週間易感染状態となる。癌療法の結果として生じる減少
した白血球数(白血球減少症)および／または血小板数(顆粒球減少症)は、この療
法が白血球数が復元するように中断しなければならないほど重篤となることがあ
る。癌療法の中断は、その後の癌細胞の生存、癌細胞における薬剤耐性発生の増
加、および最終的には癌再発につながることがある。従って、細胞傷害性作因に
よる治療を受けた患者における造血前駆細胞または幹細胞の維持を促進するよう
な治療的作因および処置の必要性が存在する。同様にこのような細胞の数が疾患
または放射線および化学療法などの治療的処置により減少した場合にも、造血細
胞集団の保持または再生(自己複製)を促進する治療的作因および処置の必要があ
る。
【００１０】 本明細書においては、最終分化した細胞型に方向付けられていない造血細胞は
、「前駆」細胞と同定される。造血前駆細胞は、特定の発生系譜を介して直接ま
たは間接に最終細胞型に分化する能力を有する。いずれの系譜にも関係づけられ
ていない未分化の多能性前駆細胞は、本明細書において「幹細胞」と称される。
全ての造血細胞は、理論上は1個の幹細胞に由来し、これは娘細胞として分化す
るため、幹細胞系譜を不滅にすることもできる。多能性幹細胞においてより多く
またはより少ない程度に濃厚化(enrich)される哺乳類骨髄細胞集団の単離が報告
されている(例えば、C. Verfaillieら、J. Exp. Med.、172:509(1990)参照、こ
れは本明細書に参照として組み入れられる)。
【００１１】 骨髄移植は、様々な血液疾患、自己免疫疾患および悪性疾患の治療において使
用されている。骨髄移植と組合わせて、このような細胞を患者に再導入する前に
、造血細胞、特に前駆細胞、または幹細胞の集団を増幅するために、エクスビボ
造血(骨髄)細胞培養が使用される。エクスビボ遺伝子治療では、造血細胞をイン
ビトロで形質転換した後、患者へ形質転換された細胞を再導入することができる
。従来の組換えDNA技術を使用する遺伝子治療において、選択された核酸、例え
ば遺伝子が単離され、ウイルスベクターなどのベクターに配置され、かつこのベ
クターが造血細胞にトランスフェクションされ、細胞が形質転換され、この細胞
は次にこの遺伝子によりコードされた産物を発現することができる。造血幹細胞
は最初に、遺伝子治療の見込みのある標的として確定された(例えば、Wilson, J
. M.ら、Proc. Natl. Acad. Sci、85:3014-3018(1988)参照)。しかし、十分な造
血幹細胞のトランスフェクションにおいて問題点に遭遇している(Miller, A. D.
、Blood、76:271-278 (1990)参照)。従ってエクスビボ細胞培養において造血細
胞の増殖を促進するような物質および方法の必要性が存在する。患者に移植され
た生着した造血細胞の確立および増殖を促進するために使用することができる物
質の必要性も存在する。
【００１２】 しかし、造血幹細胞移植療法の広範な適用は、いくつかの特徴により制限され
ている。臨床使用に十分な幹細胞を獲得するには、全身麻酔状態での骨髄採取ま
たは末梢血白血球除去のいずれかを必要としており；共に、費用がかかり、かつ
罹患危険率が存在する。移植片は、限られた数の有用な造血前駆細胞のみを含み
得る。加えて、短期間の幹細胞生着の速度論では、注入後最初の1〜3週間に、こ
れらの細胞が造血を支持することはほとんどなく、その結果、この期間にレシピ
エントは大いに骨髄抑制され続ける。
【００１３】 造血幹細胞は、健常者の末梢血に認められることが報告されている。しかしそ
の数は、標準の白血球除去による適当な移植片採取を得るには不充分であると思
われる(Kessionger, A.ら、Bone Marrow Transplant、6:643-646(1989))。幸い
なことに、骨髄から末梢血へのそれらの「動員」による前駆細胞および幹細胞の
循環を増加する様々な方法が発見されている。自家移植について、骨髄抑制性化
学療法によるか(Giralt S.ら、Blood、89:4531-4536(1997)、または造血系増殖
因子によるか(Lasky L. C.ら、Transfusion、21:247-260(1981))、または両方の
組合せにより誘導された一過性白血球減少症後の白血球のリバウンド期において
、造血幹細胞／前駆細胞が、末梢血へと動員され得る(Lane T.A.、Transfusion
、36:585-589(1996))。
【００１４】 末梢血への造血幹細胞の動員が、造血幹細胞および前駆細胞を末梢血へ動員す
るための骨髄抑制性化学治療方式に続く手法として使用されている。動員に関し
て示唆された治療方式は、シクロホスファミド単独の4〜7g/m2の単回投与、また
はアドリアマイシン(ドキソルビシン)、カルボプラチン、タキソール(パクリタ
キセル)、エトポシド、イフォスファミド、ダウノルビシン、シトシンアラビノ
シド6-チオグアニンなどの、他の物質の単独または組合せのいずれかを含む(Ric
hman, C. M.ら、Blood、47:1031-1039(1976)；Stiff P. J.ら、Transfusion、23
:500-503(1983)；To L. B.ら、Bone Marrow Transplant、9:277-284(1992))。こ
のような方式は、患者において一過性のしかし顕著な骨髄抑制を引き起すことが
でき、一部症例においては、白血球(WBC)数が化学療法後7〜14日には100個細胞/
mm3以下に減少する。その後10〜21日目には、末梢血中に白血球が迅速に再出現
し、これはベースラインレベルを上回る循環血中白血球の「リバウンド」増加で
あることが多い。白血球数の上昇につれて、造血前駆細胞も末梢血中に出現し始
め、急激に増加する。
【００１５】 動員された末梢血前駆細胞(PBPC)から採取された造血幹細胞(HSC)は、骨髄破
壊的または骨髄非破壊的療法後、自家移植および同種移植の両方への使用が増し
ている(Lane T.A.、Transfusion、36:585-589(1996))。PBPC移植の意図された利
点は、迅速かつ耐久性のある三系統(trilineage)血液学的生着、採取手技の改善
された忍容性(全身麻酔は不要)、および自家の状況における腫瘍汚染減少の可能
性を含む(Lasky L. C.ら、Transfusion、21:247-260(1981)；Moss T. J.ら、Blo
od、76:1879-1883)。動員されたPBPCの自家移植技術は、同種移植においても成
功している。動物における初期の報告およびヒトにおける同系移植は、この仮説
を裏付けている(Kessionger, A.ら、Bone Marrow Transplant、6:643-646(1989)
)。
【００１６】 多くの研究者が、化学療法と、それに続く増殖因子(GM-CSFまたはG-CSF)投与
とを併用するPBPC動員が、化学療法または増殖因子いずれか単独よりも効果があ
ることを報告している(Siena S.ら、Blood、74:1905-1914(1989)；Pettengel R.
ら、Blood、2239-2248(1993)；Haas R.ら、Bone Marrow Transplant、9:459-465
(1992)；Ho A. D.ら、Leukemia、7:1738-1746(1993))。報告によるとこの併用は
、循環血中CFU-GMの50〜75倍の増加およびCD34+細胞の10〜50倍の増加を生じる(
Pettengel R.ら、Blood、2239-2248(1993)；Haas R.ら、Bone Marrow Transplan
t、9:459-465(1992)；Ho A. D.ら、Leukemia、7:1738-1746(1993))。直接比較に
より、化学療法および増殖因子が、平均3.5倍大きな循環血中CFU-GMのピーク数
を生じることが示されている(化学療法または増殖因子単独に対し、0〜6.8倍の
範囲より大きい(Siena S.ら、Blood、74:1905-1914(1989)；Pettengel R.ら、Bl
ood、2239-2248(1993)；Haas R.ら、Bone Marrow Transplant、9:459-465(1992)
；Moskowitz C. H.ら、Clin. Cancer Res.、4:311-316(1998))。
【００１７】 報告によると、ストローマ含有系または非ストローマ系において造血前駆細胞
を増幅することも可能である。増幅系は、100倍を超えるCFU-GMの増加を示すこ
とが報告されている。CD34+細胞の濃厚化は、非ストローマ培養における増幅の
前に必要とされるが、ストローマ含有系においては不要である。臨床試験の初期
の結果は、増幅された造血細胞の生着能が、培養により損なわれないことを明ら
かにするために奨励され、採用されている。臍帯血由来の造血細胞の増幅は、採
取することができる細胞数が限られているために、特に重要である。未成熟およ
び方向付けられた臍帯血由来の造血細胞の増幅の成功は、臨床移植、特に成人患
者におけるより広範な使用をもたらすことができる。他の可能性のある幹細胞増
幅の用途としては、腫瘍細胞のパージ；樹状細胞およびNK細胞のような免疫担当
細胞の産生、および遺伝子治療がある。
【００１８】 概して細胞傷害性の薬物および放射線療法後の永久骨髄(permanent marrow)回
復は、長期再構成(LTR)能を有する造血幹細胞の生存によって左右される。化学
療法および／または放射線療法の結果としての大用量を制限する続発症は、典型
的には好中球減少症および血小板減少症である。用量集中(dose intensificatio
n)(すなわち、各々の腫瘍療法の対数殺傷(log-kill)の増加)またはスケジュール
の圧縮に関連しているプロトコールは、化学療法および／または放射線療法に関
連した脊髄抑制の程度および期間を増悪すると考えられる。例えばアジュバント
の設定において、ドキソルビシンを元にした治療の反復サイクルが、骨髄前駆細
胞集団に蓄積性および長期永続性の損傷を生じることが示されている(Lorhrman
ら、Br. J. Haematol.、40:369(1978))。化学療法により生じる短期の造血細胞
損傷の影響は、好中球再生を加速するために使用される、G-CSF(Neupogen(登録
商標))の併用によりある程度克服されている(Le Chevalier、Eur. J. Cancer、3
0A:410(1994))。この手法も同じく、治療の連続サイクルにわたって動員された
前駆細胞の質の低下を反映している進行性血小板減少症および蓄積性骨髄損傷を
併発するので制限されている。現在の関心は、腫瘍反応速度およびおそらくは患
者生存率の改善の手段としての化学療法の用量集中にあるので、化学療法および
／または放射線療法の骨髄破壊作用をレスキューするために現在の治療を改善ま
たは交代するための代替療法の必然性が増しつつあり、かつこれは現在腫瘍療法
用量漸増に関する主要な速度制限因子のひとつである。
【００１９】 移植された末梢血幹細胞(PBSC、または自家PBSC)は、血液学的悪性疾患および
固形腫瘍を有する患者への高用量の化学療法または放射線療法を投与後に、即時
および持続性の造血回復を提供することができる。PBSC移植は、生着まで比較的
短時間でおよび骨髄採取に必要な外科的手技が不要であるために、自家移植用の
幹細胞の好ましい給源となりつつある(Demirerら、Stem Cells、14:106-116(199
6)；Pettengelら、Blood、82:2239-2248(1992))。幹細胞の骨髄から末梢血への
放出の機序はよく理解されていないが、CD34+細胞の動員を増強する物質は、自
家PBSC移植の増強において有効であることを証明することができる。G-CSFおよ
びGM-CSFは、PBSC動員のために現在最も一般的に使用される造血系増殖因子であ
るが、動員された細胞プロフィールは、患者毎に著しく異なる。従って、この臨
床用途にはその他の物質が必要とされる。
【００２０】 自己免疫疾患のための幹細胞移植は、自家または同種移植片を用いて開始され
なければならず、ここで前者が合併症のリスクが低いので好ましいことが示され
ている(BurtおよびTaylor、Stem Cells、17:366-372(1999))。リンパ球枯渇も推
奨されており、この場合のリンパ球枯渇は、移植片からの自己反応性細胞をパー
ジする形である。実際には、自家移植片の攻撃的リンパ球枯渇は、免疫抑制的予
防策を伴わずとも、同種反応性(すなわち、移植片-対-宿主疾患(GVHD))を緩和し
得ることが報告されている。従ってリンパ球を枯渇した自家移植片は、自己反応
性の再発を防止することができる。結論として、CFU-GEMM骨髄性幹細胞、または
BFU-E、CFU-Meg(CFU-MK)、およびCFU-GM骨髄単球性幹細胞の生存を増強すること
ができる併用療法のいずれかは、造血幹細胞が損なわれるような自己免疫疾患の
療法において恩典を有する。
【００２１】 健常対象におけるG-CSF投与後の血小板活性化が報告されている。これらの作
用は、P-セレクチンの増加した血小板発現(Avenarius H. J.ら、Int. J. Hemato
l.、58:189-196(1993))、血液トロンボキサンB2、およびアンチトロンビン-III
複合体レベルRにより示される。報告によると、G-CSFは、コラーゲンおよびアデ
ノシン二リン酸への血小板凝集を増強する(Kuroiwa M.ら、Int. J. Hematol.、6
3:311-316(1996))。しかし化学療法後にG-CSFを受け取った癌患者2名において動
脈血栓症の報告があり(Shimoda K.ら、J. Clin. Invest.、91:1310-1313(1993))
、一部の健常ドナーにおいて、前血栓状態の誘導の可能性に関する懸念が示され
ており(Conti J. A.ら、Cancer、70:2699-2707(1992)；Kawachi Y.ら、Br. J. H
aematol.、94:413-416(1996))、かつこのようなリスクが2症例において示唆され
た(Anderlini P.ら、Blood、90:903-908(1997))。
【００２２】 PBPC採取後に、抑制された血小板数が同種移植の健常ドナーにおいて生じるこ
とがある。自家移植レシピエントのアフェレーシス時の血小板数の減少は、特に
化学療法と増殖因子の両方により動員された重度に前処置された患者にとって、
重要であることが報告されている。血小板輸血は、アフェレーシス後に数が20.0
00/mm3以下へ下落した場合に考慮されるが、この閾値は個別化され、かつ患者の
状態(入院患者および外来患者)、化学療法後の血小板回復の既応、注入された抗
凝固剤の量(従って同じ動員および採取シリーズ内のアフェレーシス期間前の数)
、およびアフェレーシスが翌日行われるかどうかによって左右される。低速遠心
分離法を用い、PBPC産物から血小板を分離することは可能である。これらの血小
板は、新たに注入されるか、または後日注入のために極低温保存することができ
る(Schiffer C. A.ら、Ann N. Y. Acad. Sci.、411:161-169(1983))。しかし血
小板の低温保存法は、一般には受け入れられていない(Law P.、Exp. Hematol.、
10:351-357(1983))。更に、低血小板数の患者および輸血を必要とする患者のPBP
C産物は、典型的にはプロセシングを保証するのに十分な血小板を含んでいない(
Lane、未発表の知見(Lane T.A.、Transfusion、36:585-589(1996))。
【００２３】 HSCへの遺伝子導入を使用する臨床試験は、一般にレトロウイルスが媒介した
遺伝子導入法に依存している。レトロウイルスは、遺伝子操作された遺伝因子の
標的T細胞の染色体への安定し、比較的に効果的な組込みに関する必要性を満た
している。現在利用可能なアデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルスのベクター
のような他のウイルスベクター系、もしくはリポフェクション、電気穿孔、リン
酸カルシウム沈降法、または遺伝子銃などのトランスフェクション法は、***し
ているHSCにおける導入遺伝子の同様の長期発現効率を欠いている。一部のベク
ターは、細胞傷害性を伴わずに十分数細胞に侵入することができず、および／ま
たは有用な効率で染色体に安定性を組込むことができない。***細胞において、
組込まれていないDNAは一般に、希釈され喪失される。更にアデノウウイルスベ
クターは高度に免疫原性である。
【００２４】 マウスの造血幹細胞へのレトロウイルス媒介型遺伝子導入および同系マウスの
再構築により、長期にわたる導入遺伝子の持続性および機能性が明らかにされて
いる(Kumeら、69:227-233(1999))。最終的に分化した細胞は、記憶BおよびTリン
パ球以外は、比較的短期間生存し、非常に多数の血液細胞が毎日入れ替わってい
る。従って遺伝子導入による血液細胞の長期間の機能補正が必要とされる場合、
標的細胞は造血幹細胞であり得る(Kumeら、69:227-233(1999))。従って前駆幹細
胞の生存および／または自己複製(例えば細胞周期のS期細胞の増大された数)を
維持することができる化合物は、造血幹細胞のより大きな集団を得ることができ
る点で遺伝子導入効率を増大することができる。
【００２５】 多くのタンパク質が、造血前駆細胞発生および造血細胞増殖または増幅のイン
ヒビターとして同定されかつ臨床利用されている。これらは、組換えメチオニル
ヒトG-CSF(Neupogen(登録商標)、フィルグラスチム；Amgen社)、GM-CSF(Leukine
(登録商標)、サルグラモスチム；Immunex社)、エリスロポイエチン(rhEPO、Epog
en(登録商標)；Amgen社)、トロンボポイエチン(rhTPO；Genentech社)、インター
ロイキン-11(rhIL-11、Neumega(登録商標)；American Home Products社)、Flt3
リガンド(Mobista；Immunex社)、多系統造血因子(MARstem(登録商標)；Maret Ph
arm社)、ミエロポイエチン(Leridistem；Searle社)、IL-3、骨髄前駆体阻害因子
-1(Mirostipen；Human Genome Sciences社)、幹細胞因子(rhSCF、Stemgen(登録
商標)；Amgen社)を含む。
【００２６】 発明の概要 本発明の様々な局面に従い、CXCR4アンタゴニストは、造血細胞を処理するた
めに、例えば造血幹細胞または前駆細胞の増幅、自己複製、増大、増殖、または
末梢化(peripheralization)の速度を増大するために使用することができる。様
々な局面において、本発明は、造血細胞増幅速度を促進する方法に関連し、これ
は細胞の増幅、自己複製、増大、増殖、または末梢化を増大および／または維持
するプロセスを包含している。これは、例えば骨髄移植において使用されるイン
ビトロ造血細胞培養、末梢血動員、またはエクスビボ増幅に関する一部の態様に
おいて有用である。CXCR4アンタゴニストは更に、造血細胞のインビボにおける
増幅、自己複製、増大、増殖、または末梢化を刺激するために治療的に使用する
こともでき、例えば一部の態様において、癌または自己免疫疾患のようなヒト疾
患に関連している。本発明の方法により標的とされた造血細胞は、造血前駆細胞
または幹細胞を含むことができる。
【００２７】 別の態様において、CXCR4アンタゴニストは、様々な造血細胞の処置に使用す
ることができ、このような細胞は、単離されるか、またはインビボもしくはイン
ビトロにおいて処理された細胞集団の一部のみを形成することができる。CXCR4
アンタゴニストによる処理に適用できる細胞は、例えば、多能性幹細胞から始ま
る造血細胞系の細胞、例えば、骨髄幹細胞もしくは前駆細胞、リンパ系幹細胞も
しくは前駆細胞、骨髄系幹細胞、CFU-GEMM細胞(コロニー形成単位-顆粒球、赤芽
球、マクロファージ、巨核球)、B系幹細胞、T系幹細胞、DC系幹細胞、プレB細胞
、前胸腺細胞、BFU-E細胞(赤芽球バースト形成単位)、BFU-MK細胞(巨核球バース
ト形成単位)、CFU-GM細胞(コロニー形成単位-顆粒球-マクロファージ)、CFU-bas
細胞(コロニー形成単位-好塩基球)、CFU-Mast細胞(コロニー形成単位-マスト細
胞)、CFU-G細胞(コロニー形成単位-顆粒球)、CFU-M/DC細胞(コロニー形成単位-
単球/樹状細胞)、CFU-Eo細胞(コロニー形成単位-好酸球)、CFU-E細胞(コロニー
形成単位-赤芽球)、CFU-MK細胞(コロニー形成単位-巨核球)、骨髄芽細胞、単芽
球、B-リンパ芽球、Tリンパ芽球、前赤血球、好中球性骨髄球、前単球、または
マクロファージ、骨髄細胞に関連した樹状細胞、マスト細胞、形質細胞、赤血球
、血小板、好中球、単球、好酸球、好塩基球、B細胞、T細胞またはリンパ系関連
樹状細胞などの成熟細胞を生じるように分化するその他の造血細胞などのような
、多能性幹細胞で始まる造血系統の細胞を含む。
【００２８】 一部の態様において、本発明は、(1)骨髄抑制性化学療法により、(2)造血性増
殖因子により、または(3)両方の組合せにより誘導された一過性顆粒球減少症お
よび血小板減少症の後の白血球および／または血小板のリバウンド期の間、造血
幹細胞／前駆細胞が末梢血に動員されているような自家動員を受けている患者の
造血細胞に、有効量のCXCR4アンタゴニストを投与することを含む、骨髄から末
梢血への動員による造血細胞の循環を増加する方法を提供する。このような処置
は、例えば、骨髄部分(すなわち骨髄中の位置)から末梢血部分(すなわち末梢血
中の位置)への造血細胞の動員に効果があるように実行することができる。この
ような処置は、例えば白血球除去またはアフェレーシスの状況において、または
そのような臨床手法のために行うことができる。別の態様において、CXCR4アン
タゴニストは、汎血球減少症、顆粒球減少症、血小板減少症、貧血またはこれら
の組合せなどの状態を含む、造血細胞枯渇を短期化または潜在的に防止するため
、成熟前駆体による幹細胞移植片の補充のため；高用量療法の反復サイクルのた
めの確実な造血支持を助けるために、未熟な前駆体の数を増加するために；1回
の骨髄吸引またはアフェレーシス手技から幹細胞を充分数得て、その結果として
複数回の白血球除去の必要な大規模骨髄採取を減少させるため；高用量化学療法
後の成人における再構築を可能にするために1個の臍帯血単位から十分な細胞を
作成するため；腫瘍細胞が混入している幹細胞産物をパージするため；免疫療法
方式において使用される抗腫瘍活性を伴う大容量の免疫学的に活性のある細胞を
作成するか、または遺伝子治療の送達のための標的とされる幹細胞プールを増加
するために、エクスビボ幹細胞増幅において使用することができる。
【００２９】 別の態様において、本発明は、骨髄(BM)および末梢血(PB)幹細胞移植において
利用されるCD34+前駆細胞を濃厚化する方法を提供し、ここで造血幹細胞移植(HS
CT)プロトコールは、例えば下記疾患の治療目的のために使用することができる(
Ball, E.D.、Lister, J.、およびLaw, P.、「造血幹細胞療法(Hematopeietic St
em Cell Therapy)」、Chruchill Livingston(Harcourt社)、ニューヨーク(2000)
)：再生不良性貧血；急性リンパ芽急性貧血；急性骨髄性白血病；骨髄形成異常
；多発性骨髄腫；慢性リンパ球性白血病；先天性免疫不全症(例えば、自己免疫
性リンパ増殖性疾患、ウィスコット-アルドリッチ症候群、X鎖連鎖型リンパ球増
殖性疾患、慢性緑内障性疾患、コストマン好中球減少症、白血球接着不全など)
；代謝性疾患(例えば、ハーラー症候群(MPS I/II)、スライ症候群(MPS VII)、小
児に発症する脳X副腎白質萎縮症、Globard_細胞白質萎縮症などHSCTであること
が示されたもの)。
【００３０】 一部の態様において、本発明のペプチドCXCR4アンタゴニストは、疑似N末端β
ターン、またはC末端αヘリックスへの修飾を含む、第2のN末端ペプチドとリン
カーにより共有結合した、SDF-1由来のN末端部分を含む。SDF-1アンタゴニスト
は、更にN末端二量体として存在することもできる。
【００３１】 発明の詳細な説明 ある局面において、本発明は、2位のアミノ酸で、グリシンとプロリンが置換
されているような、SDF-1[P2G]由来のCXCR4アンタゴニストの使用を提供する。
この類似体の完全な(67個のアミノ酸長)バージョンは、SDF-1(1-67)[P2G]または
SDF-1[P2G](配列番号：1)と称され、強力なCXCR4受容体アンタゴニストである(C
rumpら、EMBO J.、16(23):6996-7007(1997))。SDF-1は、主にそのN末端を介して
CXCR4に結合しており、これはSDF-1の活性N末端ペプチドのNMR試験において柔軟
性(flexible)があるように見える(Elisseevaら、J. Biol Chem、275(35):26799-
805(2000))。残基5〜8、およびより少ない程度で11〜14が、β-αR型のβターン
として特徴付けることができる類似構造を形成する。これらの構造モチーフは、
他の状態と相互転換される可能性があるが、主要な立体配座は、受容体結合時の
認識にとって重要であると思われる。ペプチドおよびタンパク質のβターンの重
要性は、最終的に生物学的活性につながる受容体相互作用にとって決定的である
。この認識において、ペプチドおよびタンパク質をβターン立体配置に「ロック
」するいくつかの試みがなされている(Ripka, W. C.ら、Tetrahedron、49(17):3
593-3608(1993)、およびElseviers, M.ら、Biochem. Biophys. Res. Commun.、1
54-515(1988))。天然のアミノ酸プロリンは、βターン誘導体として公知である
。本発明のひとつの局面において、プロリン(P)が単独の位置残基5〜8に置換さ
れた完全長アンタゴニスト類似体のバージョンは、配列番号：2〜5に示される。
同じスキームにおいて、完全長アンタゴニストにおける天然のアミノ酸プロリン
のいわゆるプロリン-アミノ酸キメラ(P*)(Garland, R. M.、Tetrahedron、49(17
):3547-3558(1993)およびRaman, S.ら、J. Org. Chem.、61(1):202-208(1996))
との交換は、類似体(配列番号：6〜9)と称されるものを生じる。βターン誘導／
「ロック」の別の機構は、プロリンおよびプロリンキメラについてのような完全
長アンタゴニストの配列における、βターン擬態としての、二環式ターンジペプ
チド(Bicyclic Turned Dipetide：Btd)の導入である(Ukon Nagaiら、Tetrahedro
n、49(17):3577-3592(1993))。この立体配置において、2個の連続するアミノ酸
が、Btd分子により1回交換され、これはSDF-1[P2G]アンタゴニストへ挿入された
場合、配列番号：10〜12が示される。 配列： 式中、P*は、
【化２１】 および、Btdは、
【化２２】 、
【化２３】 、または
【化２４】 (式中、Xは、アルキル、Ar、Ar-OHなどである) 。
【００３２】 いずれも本明細書に参照として組み入れられる、国際公開公報第00/09152号(2
000年2月24日公開)および国際公開公報第99/47158号(1999年9月23日公開)に開示
されたような、様々な小型のSDF-1ペプチド類似体も、CXCR4アンタゴニストとし
て使用することができる。このようなペプチドのひとつは、下記配列を有する単
量体である； またはアミノ酸1〜9の二量体(配列番号：13中)、ここでアミノ酸鎖は、各配列の
9位のシステイン間のジスルフィド結合により連結されている(下記配列を有しSD
F-1(1-9)2[P2G]と称される： 他の代わりのペプチドは、例えば下記ペプチドからなる群より選択される： これはアミノ酸1〜8の二量体であり、ここでアミノ酸鎖は、連結部分Xにより連
結されている(Xは、リシン；オルニチン、または各配列の8位の各アルギニン間
のリンカーとして利用できる天然または非天然のアミノ酸などの、アミノ酸であ
りうる)(SDF-1(1-8)2[P2G]と称する)。ここで再度、βターン擬態は単量体(配列
番号：13)のいずれかに適用されることに注目し、この場合下記類似体が示され
る(配列番号：17〜27)。
【００３３】 同様の修飾を、本発明の単量体ペプチド(配列番号：14)に行うことができる。
【００３４】 配列番号：15を基にした代わりのペプチドは、下記のものであり、配列番号：
39〜49と称される。
【００３５】 同じ方法で、配列番号:16を基にした類似体は、下記のものであり、配列番号
：50〜61と称される。 式中、Xは、リシン、オルニチン、または各配列の8位の各アルギニン間のリンカ
ーとして利用できる天然または非天然のアミノ酸などの、アミノ酸であることが
できる。
【００３６】 一部の態様において、本発明において使用するためのCXCR4アンタゴニストは
、SDF-1αまたはSDF-1βのいずれかの、実質的に精製されたペプチド断片、修飾
されたペプチド断片、類似体または薬学的に許容される塩でありうる。SDF-1由
来のCXCR4ペプチドアンタゴニストは、公知の生理学的アッセイ法および様々な
合成技術により同定することができる(例えば、Crumpら、The EMBO Journal、16
(23):6996-7007(1997)；および、Hevekerら、Current Biology、8(7):369-376(1
998)に説明されたもの；いずれも、本明細書に参照として組み入れられる)。こ
のようなSDF-1由来のペプチドは、ペプチドがCXCR4アンタゴニスト活性を有する
という条件で、天然のイソ型または遺伝的変種のような未変性のSDF-1のホモロ
グ、または未変性のSDF-1の少なくとも一部と20％、30％、40％、50％、60％、7
0％、80％、90％、95％または99％の配列同一性を有するようなSDF-1に類似した
実質的配列を有するポリペプチド、10、20、30、40、50個またはそれ以上のアミ
ノ酸の連続する配列である未変性のSDF-1の一部を含むことができる。一部の態
様において、化学的に類似したアミノ酸は、未変性のSDF-1配列におけるアミノ
酸を置換することができる(保存的アミノ酸置換を提供する)。一部の態様におい
て、N末端の10個または7個のアミノ酸の内部にN末端LSY配列モチーフ、および／
またはN末端の20個のアミノ酸の内部にN末端RFFESH(配列番号：62)配列モチーフ
を有するペプチドを、これらがCXCR4アンタゴニスト活性を有する場合には使用
することができる。このようなペプチドアンタゴニスト候補のひとつのファミリ
ーは、アミノ酸5〜7にLSYモチーフを有する。別のペプチドは更に、アミノ酸12
〜17にRFFESH(配列番号：62)モチーフを含む。別の態様において、LSYモチーフ
は、ペプチドの3〜5位に位置している。本発明は更に、2種のアミノ酸配列を有
するペプチド二量体も提供し、これらは各々、N末端の20個、または好ましくは1
0個以内のアミノ酸でジスルフィド架橋により結合され、システイン残基または
αアミノ酪酸残基を連結している、前記配列要素を有することができる。
【００３７】 別の局面において、本発明は、SDF-1[P2G]由来の新規CXCR4アンタゴニストお
よび造血幹細胞／前駆細胞の細胞増幅および／または自己複製の速度を増加させ
るための、それらの使用に関する。本発明のアンタゴニスト化合物は、第二のペ
プチドにリンカーにより共有結合したSDF-1[P2G]のN末端部分を含む。このN末端
部分は、CXCR4に結合しているSDF-1[P2G]N末端の任意の部分であることができる
。この第二のペプチドは、SDF-1[P2G]のN末端を含まないが、好ましくはこの化
合物の拮抗作用を増強し、SDF-1のC末端断片、例えばGAGへの結合によりその活
性を改善することが公知のいずれかのケモカインのC末端断片であることができ
る(Gabriele S.ら、Biochemistry、38:12959-12968(1999)参照)。SDF-1アンタゴ
ニストは、4個のグリシンリンカーでC末端残基55〜67に連結したSDF-1[P2G]のN
末端アミノ酸1〜14または1〜17を有する、酸またはアミドペプチド類似体を含む
： ここで、N末端およびC末端アミノ酸を連結するグリシンの数は、例えば0〜10個
の間を変動することができ、および選択された態様においては4、3または2個で
あることができる。リンカーのサイズは、未変性の折りたたまれたSDF-1構造に
おけるC末端領域とN末端領域の間の距離にほぼ相当するように合わせられる。
【００３８】 別の態様において、(CH2)nリンカーを、N末端とC末端のアミノ酸を結合するた
めに使用することができる： (式中、nは1〜20またはそれ以上である)。このような態様において、リンカーの
長さは、その未変性の形(対応するリンカーにより置換されたアミノ酸が存在す
る)において完全長SDF-1[P2G]ポリペプチドのN末端およびC末端の間の距離に相
当するように合わせられる。
【００３９】 βターンを形成するN末端LSYR残基は(Elisseevaら、J. Bio. Chem.、275(35):
26799-26805参照)、完全長SDF-1[P2G]アンタゴニスト同様、例えばロイシン(L)
；セリン(S)；チロシン(Y)およびアルギニン(R)をプロリン(P)と置換することに
より、修飾され得る： ここで、グリシンの数またはn((CH2)nにおける)は、4個のグリシンに与えられた
リンカーの長さ、もしくは対応するリンカーと交換されているようなアミノ酸が
存在するその未変性の形での完全長SDF-1[P2G]ポリペプチドのN末端およびC末端
の間の距離に相当する。
【００４０】 別の態様において、ロイシン(L)、セリン(S)、チロシン(Y)またはアルギニン(
R)は、プロリン-アミノ酸キメラ( )により置換され得る(完全長SDF-1アンタゴニ
ストにおける配列番号：6〜9に類似)： ここで、グリシンの数またはn((CH2)nにおける)は、4個のグリシンに与えられた
リンカーの長さ、もしくは対応するリンカーと交換されているアミノ酸が存在す
るその未変性の形での完全長SDF-1[P2G]ポリペプチドのN末端およびC末端の間の
距離に相当する。
【００４１】 一部の態様において、ペプチド擬態は、完全長SDF-1アンタゴニストにおける
先に説明されたBTD(二環式ターンジペプチド(Bicyclo Turned Dipeptide))(配列
番号：99〜110)である： ここで、グリシンの数またはn((CH2)nにおける)は、4個のグリシンに与えられた
リンカーの長さ、もしくは対応するリンカーと交換されているアミノ酸が存在す
るその未変性の形での完全長SDF-1[P2G]ポリペプチドのN末端およびC末端の間の
距離に相当する。
【００４２】 本発明のSDF-1-由来のCXCR4アンタゴニストは、直鎖状または環化することが
できる。一部の態様において、これらのアンタゴニストは、24位のグルタミン酸
において20位または28位のリシンと、パラジウム-(0)技術(Katesら、Anal. Bioc
hem.、212:303-310(1993)に記載)：1-アリル除去：5％酢酸に溶解したテトラキ
ス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(0)溶液(3倍過剰量)；アルゴン下クロロ
ホルム中の2.5％N-メチルモルホリン(NMM)を用いるリシンおよびグルタミン酸の
両側鎖からのアリル基の除去により、環化することができる。この溶液は、穏や
かに攪拌するための小型の磁気攪拌子を含む反応バイアル内のカラムから先に除
去された支持体に結合したペプチドに添加される。この混合液は、アルゴンでフ
ラッシュされ、密封され、室温で6時間攪拌される。支持体に結合したペプチド
は、濾過ロートに移され、ジクロロメタン(DMF)を溶媒とする0.5％ジエチルジチ
オカルバミン酸ナトリウム溶液で洗浄し、その後、ジクロロメタンで洗浄する。
2-ラクタム形成は、リシンおよびグルタミン酸の間の内部アミド結合形成により
媒介される。環化は、ペプチド合成バイアル内で、室温で一晩穏やかに攪拌して
、手動で行われる。カップリング剤は、7-アザベンゾトリアゾール-1-イルオキ
シトリス(ピロリジノ)ホスホニウムヘキサフルオロリン酸(PyAOP)/N-メチルモル
ホリン(NMM)(3倍過剰量)である(Jean-Rene Barbierら、J. Med Chem.、40:1373-
1380(1997)；同著者、Biochemistry、39:14522-14530(2000))。下記類似体が、
示されている(配列番号：111〜114)。
【００４３】 一部の態様において、24位のグルタミン酸(E)はアスパラギン酸(D)と置換され
、およびアスパラギン酸(D)は、先に説明されたように20位または28位のリシン
により環化される。別の態様において、20位または28位のリシンは、オルニチン
で置換され、先に説明されたような24位のアスパラギン酸またはグルタミン酸の
いずれかで環化される。この種の置換、それに続く環化は、先に説明された全て
の類似体において行うことができる(配列番号：67〜110)。
【００４４】 別の態様において、20位または28位のリシン(K)は、オルニチン(0)で置換され
(配列番号：42〜73)、および20位または28位のオルニチンは、先に説明されたよ
うに、24位のグルタミン酸(または置換されたアスパラギン酸(配列番号：74〜89
))で置換される。加えて、他の環式環を形成するために、リシンは、ロイシン(L
)、または他の疎水性残基、例えばイソロイシン(I)、ノルロイシン(Nle)、バリ
ン(V)、アラニン(A)、トリプトファン(W)、またはフェニルアラニン(F)により置
換される。リシンは、更にメチオニンで置換されるが、しかし酸化メチオニンは
ジスルフィド結合を形成し、これはこのペプチドの合成および精製をより困難な
ものとする。
【００４５】 本発明のCXCR4アンタゴニストは、更に、SDF-1[P2G]のN末端アミノ酸残基、お
よび、例えば関連するSDF-1 GAG-結合配列を交換することによりケモカイン受容
体のGAG結合に会合されたMIP-1αのアミノ酸残基を含むハイブリッド類似体も含
むことができ、これはMIP-1α程は特異的ではないと考えられる(Gabriele S.ら
、Biochemistry、38:12959-12968(1999)およびElisabeth M.ら、Virology、265:
354-364(1999)参照)。
【００４６】 SDF-1[P2G](1-14)/MIP-1α(36-50)ハイブリッド類似体： SDF-1(1-14)/MIP-1α(55-70)類似体： ここで、グリシンの数またはn((CH2)nにおける)は、4個のグリシンに与えられた
リンカーの長さ、もしくは対応するリンカーと交換されているアミノ酸が存在す
るその未変性の形での完全長SDF-1[P2G]ポリペプチドのN末端およびC末端の間の
距離に相当する。
【００４７】 生物学的に同等のポリペプチドを得るために、ポリペプチド構造において、そ
のペプチドの生物学的機能を実質的に変更することなく、一部の修飾および変更
を行うことができることは当技術分野において周知である。本発明のひとつの局
面において、SDF-1由来のCXCR4ペプチドアンタゴニストは、保存的アミノ酸置換
により、未変性のSDF-1配列とは一部が異なるペプチドを含むことができる。本
発明は更に、保存的アミノ酸置換により、本発明の新規アンタゴニストの配列の
一部が異なるような、生物学的に同等のペプチドにも及んでいる。本明細書にお
いて使用される「保存的アミノ酸置換」という用語は、ペプチドの所定の位置で
の1個のアミノ酸の別のものとの置換であり、この置換は機能を喪失しないこと
を意味する。このような変更を行う際には、同様のアミノ酸残基の置換を、例え
ばそれらのサイズ、電荷、疎水性、親水性などの側鎖置換基の相対類似性を基に
行うことができ、このような置換は、通常の試験によりペプチド機能に対するそ
れらの作用について、アッセイされうる。
【００４８】 一部の態様において、保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が同様の親水値(
例えば、±2.0以内の値)を有する別のものと置換された場合に成され、ここで下
記の親水値がアミノ酸残基に割当てられている(本明細書に参照として組み入れ
られる米国特許第4,554,101号に開示されている)：
【００４９】 別の態様において、保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が同様のハイドロパ
シー指標(例えば、±2.0以内の値)を有する別のものと置換された場合に成され
る。このような態様において、各アミノ酸残基には、以下のような、その疎水性
および電荷特性を基にしたハイドロパシー指標が割当てられている：
【００５０】 別の態様において、保存されたアミノ酸置換は、アミノ酸残基が同じクラスの
別のものと置換された場合に成され、ここでアミノ酸は、下記のように、非極性
、酸性、塩基性および中性のクラスに分類される：非極性：Ala、Val、Leu、Ile
、Phe、Trp、Pro、Met；酸性：Asp、Glu；塩基性：Lys、Arg、His；中性：Gly、
Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Tyr。
【００５１】 一部の態様において、CXCR4アンタゴニストは、十分な親和性でCXCR4に結合す
るリガンドであり、このような状況において、細胞におけるSDF-1で誘導された[
Ca2+]i動員のような、天然のリガンドSDF-1などのアゴニストによる結合の作用
を阻害する。CXCR4アンタゴニストアッセイ法の例は、例えば、国際公開公報第0
0/09152号(2000年2月24日)および国際公開公報第99/47158号(1999年9月23日)に
開示されている。CXCR4アンタゴニスト活性に関するアッセイ法の例において、
フラ-2、AM負荷したTHP-1細胞は、例えば推定アンタゴニストと共に、例えば10n
M SDF-1による[Ca2+]i動員の誘導前に60分間インキュベーションすることができ
る。アンタゴニストは、典型的にはSDF-1で誘導された[Ca2+]i動員の用量依存型
阻害を示すと思われる。
【００５２】 CXCR4アンタゴニストとしての分子機能を決定するために使用することができ
る方法は以下を含むが、これらに限定されるものではない：未変性のSDF-1(また
はSDF-1のアゴニスト類似体)に反応する、SDF-1受容体が媒介した遊離細胞質Ca2 + 濃度([Ca2+])上昇の誘導の阻害(Loetscher P.ら、J. Biol. Chem.、273:24966-
24970(1998))、ホスホイノシチド-3-キナーゼまたはプロテインキナーゼC活性の
SDF-1-誘導の阻害(Wang, J-Fら、Blood、95:2505-2513(2000))、2-チャンバー移
動(ウェル貫通)アッセイ法におけるCD34+造血幹細胞のSDF-1-誘導した移動の阻
害(Dung J.ら、 Leukemia、14:1652-1660(2000)；Peled A.ら、Blood、95:3289-
2396(2000))、細胞走化性アッセイ法、細胞接着アッセイ法、または3-D細胞外マ
トリックスゲルアッセイ法でのCD34+細胞移動の実時間追跡における、血管内皮
細胞を通過するCD34+/CXCR4+細胞のSDF-1に関連した移行の阻害(Peled A.ら、Bl
ood、95:3289-2396(2000))、骨髄由来のB細胞の前駆体のSDF-1が関連した走化性
の阻害(Dauzzo M.ら、Eur. J. Immunol.、27:1788-1793(1997))、T-および二重
向性(dual-tropic)HIV単離体の侵入を媒介することにおけるCXCR4シグナル伝達
および共受容体機能の防止(Zhou N.ら、39:3782-3787(2000))、末梢血Inc+ CD34+ 前駆細胞によるSDF-1が関連したCFU-GM、CGU-MまたはBFU-Eコロニー形成の増加
の阻害(Lataillade J-J.ら、Blood、95:756-768(2000))、またはインテグリンが
媒介したT細胞のフィブロネクチンおよびICAM-1への接着の阻害(Buckley C. Dら
、J. Immunology、165:3423-3429(2000))。前述のアッセイ法においてSDF-1に関
連した機構の阻害を評価することが必要な場合、各機構のCXCR4アンタゴニスト
が関連した抑制が、CXCR4受容体の阻害から直接生じるかどうかを決定するアッ
セイ法において、様々な濃度のCXCR4アンタゴニストを、適当な実験条件下で、S
DF-1存在下、インキュベーションすることができる。([Ca2+])動員、走化性アッ
セイ法、またはCXCR4誘導を測定する他のアッセイ法は、関連した参考文献に示
された細胞型には制限されないが、CXCR4関連した、特異性活性化を示すその他
の細胞型を含むことができる。
【００５３】 代替的な局面において、本発明は、CXCR4に結合し(可逆的または不可逆的のい
ずれかで)かつCXCR4関連した活性の抑制に関連した分子として同定されたCXCR4
アンタゴニストの使用を提供する。CXCR4アンタゴニストの結合親和性は、例え
ば最低1pM、10pM、100pM、lμM、10μMまたは100μMから最大1mMまでの範囲、ま
たはこの範囲のいずれかの値であるリガンド結合アッセイ法の解離定数(KD)に関
連している。CXCR4アンタゴニスト関連したKD値は、ハイスループット蛍光偏向
、シンチレーション近接アッセイ法(SPA)、およびFlashplates(登録商標)を含む
、放射性リガンド結合アッセイ法の標準法のような、代替手法により決定するこ
とができ(Alienら、J. Biomolecular Screening、5:63-69(2000))、ここで競合
リガンドは未変性のSDF-1である。あるいは、CXCR4アンタゴニストのSDF-1受容
体(CXCR4)に対する親和性は、CXCR4に対する未変性のSDF-1結合の阻害により確
認することができ、ここでは様々な濃度のCXCR4アンタゴニストが、SDF-1および
組換えCXCR4または適当な受容体力価を発揮している細胞型の存在下添加される
。
【００５４】 別の態様において、本発明は、本明細書において3-ヒドロキシ-2-ナフトエ酸(
CAS92-70-6；分子式
【化２５】 ：C11H8O3；分子量：188.18)として示されているナフトエ酸誘導体などのような
、小型の非ペプチドCXCR4アンタゴニスト分子の使用に関する。
【００５５】 一部の態様において、本発明はCXCR4アンタゴニストを含有する薬学的組成物
を提供する。ある態様において、このような組成物は、CXCR4アンタゴニスト化
合物を、骨髄前駆細胞または幹細胞の成長を変更するのに十分な治療的または予
防的有効量、ならびに薬学的に許容される担体とを含有する。別の態様において
、この組成物は、CXCR4アンタゴニスト化合物を、癌の化学療法または放射線治
療において使用される細胞傷害性作因のような、細胞傷害性作因の細胞傷害性作
用を阻害するのに十分な治療的または予防的有効量、ならびに薬学的に許容され
る担体とを含有する。
【００５６】 「治療的有効量」とは、骨髄前駆細胞または幹細胞の増幅の低下、もしくは細
胞傷害性作因の細胞傷害性作用の低下または阻害のような、所望の治療的結果を
達成するのに必要な用量または期間での有効量を意味する。CXCR4アンタゴニス
トの治療的有効量は、個体の病態、年齢、性別、および体重、ならびにCXCR4ア
ンタゴニストの個体において望ましい反応を誘起する能力のような要因に従い変
動しうる。用量は、最適な治療反応を提供するように調節することができる。治
療的有効量は、CXCR4アンタゴニストの毒性または有害な作用が治療的に恩典を
有する作用を上回らないようなものである。
【００５７】 「予防的有効量」とは、細胞傷害性作因の細胞傷害性作用の防止または阻害の
ような、所望の予防的結果を達成するのに必要な用量または期間での有効量を意
味する。典型的には、予防的用量は、早期病期の前またはその時点で対象におい
て使用され、予防的有効量は治療的有効量よりも少ない。
【００５８】 特定の態様において、CXCR4アンタゴニストの治療的または予防的有効量の好
ましい範囲は、0.1nM〜0.1M、0.1nM〜0.05M、0.05nM〜15μMまたは0.01nM〜100
μMである。用量値は緩和されるべき状態の重症度により変動することに注意し
なければならない。いずれか特定の対象について、具体的な用量は、個人の必要
性におよびこの組成物を投与するまたは投与を監督する専門家の判定に従い、時
間をかけて調節することができる。本明細書において言及した用量範囲は単なる
例証であり、医療従事者により選択され得る用量範囲を制限するものではない。
【００５９】 前記組成物中の活性化合物の量は、個体の病態、年齢、性別、および体重など
の要因により変動しうる。用量は、最適な治療的反応を提供するように調節する
ことができる。例えば、単回ボーラス量で投与することができ、数回の分割用量
で経時的に投与することができ、もしくは用量は治療状況の緊急性により指示さ
れるように比例して減少または増加させることができる。投与を容易にしかつ用
量を均一にするために、単位剤形中に非経口組成物を製剤化することは有利であ
ると思われる。本明細書において使用される「単位剤形」は、治療される対象へ
の単位用量として適した物理的に個別の単一体を意味し；各単一体は、望ましい
治療的作用を生じるように計算された活性化合物の予め決定された量を、必要な
薬学的担体と関連して含有する。本発明の単位剤形についての詳細は、(a)活性
化合物の独自の特性および達成されるべき特定の治療的作用、および(b)個体の
感受性において、治療のために活性化合物を製剤化することに対する当技術分野
における固有の制限により指示され、これにより直接左右される。
【００６０】 本明細書において使用される「薬学的に許容される担体」または「賦形剤」は
、生理的適合性のある溶剤、分散媒、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、
等張剤および吸収遅延剤などのいずれか、ならびに全てを含む。ある態様におい
て、担体は非経口投与に適している。あるいは担体は、静脈内、腹腔内、筋肉内
、舌下または経口投与に適している場合がある。薬学的に許容される担体は、無
菌の注射溶液または分散体の用時調製のための無菌水溶液または分散体および無
菌粉末を含む。薬学的活性のある物質のためのこのような媒質および物質の使用
は、当技術分野において周知である。通常の媒質または物質がこの活性化合物と
相溶性がない場合を除いて、本発明の薬学的組成物におけるこれらの使用が企図
されている。補助的活性化合物も、この組成物中に混入させることができる。
【００６１】 一部の態様において、CXCR4アゴニストは、追加の活性成分と共に薬学的組成
物中に製剤化するか、または1種または複数の追加の薬物適用による治療と一緒
にした治療法において投与することができ、このような医薬品は、下記から選択
される：組換えメチオニルヒトG-CSF(Neupogen(登録商標)、フィルグラスチム；
Amgen社)、GM-CSF(Leukine(登録商標)、サルグラモスチム；Immunex社)、エリス
ロポイエチン(rhEPO、Epogen(登録商標)；Amgen社)、トロンボイエチン(rhTPO；
Genentech社)、インターロイキン-11(rhIL-11、Neumega(登録商標)；American H
ome Products社)、Flt3リガンド(Mobista；Immunex社)、多系統造血因子(MARste
m(登録商標)；Maret Pharm.社)、ミエロポイエチン(Leridistem；Searle社)、IL
-3、骨髄前駆体阻害因子-1(Mirostipen；Human Genome Sciences社)、および幹
細胞因子(rhSCF、Stemgen(登録商標)；Amgen社)。
【００６２】 治療的組成物は典型的には、製造および貯蔵の条件下において無菌かつ安定し
ていなければならない。本組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム
、または高薬物濃度に適したその他の規則的構造として製剤化することができる
。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピ
レングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど)、ならびにそれらの混
合物を含む、溶媒または分散媒でありうる。適当な流動性は、例えば、レシチン
などのコーティングの使用により、分散剤の場合に必要とされる粒子サイズの維
持により、および界面活性剤の使用により維持することができる。多くの場合、
糖、多価アルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、または塩化ナトリウ
ムなどのような等張剤を該組成物中に含むことが好ましいと思われる。注射可能
な組成物の持続吸収は、例えばモノステアリン酸塩およびゼラチンなどの吸収を
遅延する物質をこの組成物中に含むことによりもたらすことができる。更にCXCR
4アンタゴニストは、例えば徐放型ポリマーを含むような組成物中の、持効性放
出型製剤において投与することができる。この活性化合物は、例えばインプラン
トおよびマイクロカプセル封入された送達系を含む制御型放出製剤のように、化
合物を迅速な放出に対して保護するような担体と共に調製することができる。酢
酸ビニルエチレン、ポリアンヒドリド(polyanhydride)、ポリグリコール酸、コ
ラーゲン、ポリオルトエステル(polyorthoester)、ポリ乳酸、およびポリ乳酸ポ
リグリコール酸コポリマー(PLG)のような、生分解性ポリマー、生体適合性ポリ
マーを使用することができる。このような製剤を調製するための多くの方法は、
特許とされており、一般に当業者に公知である。
【００６３】 無菌注射液は、先に列挙された成分のひとつまたは組合せとの、適当な溶剤中
に必要量の活性化合物を混入させ、必要な場合には、続いて滅菌濾過することに
より調製することができる。一般に分散剤は、基本の分散媒および前述のものか
らの必要なその他の成分を含む無菌ビヒクルへの活性化合物の混入により調製さ
れる。無菌注射液の調製用の無菌粉末の場合、好ましい調製法は、活性成分に加
えいずれか追加の望ましい成分の粉末を予め滅菌濾過したそれらの溶液から生じ
る真空乾燥および凍結乾燥である。本発明の別の局面において、CXCR4アンタゴ
ニストは、1種または複数のCXCR4アンタゴニストの溶解度を増大する追加の化合
物と共に配合することができる。本発明は更に、本発明の新規アンタゴニストの
このような誘導体を含む。
【００６４】 本発明のCXCR4アンタゴニスト化合物は、C末端ヒドロキシメチル誘導体、0-修
飾された誘導体(例えば、C末端ヒドロキシメチルベンジルエーテル)、アルキル
アミドおよびヒドラジドのような置換されたアミドを含むN末端が修飾された誘
導体、ならびにC末端フェニルアラニン残基がフェネチルアミド類似体と置換さ
れた化合物(例えば、トリペプチドSer-Ile-Pheの類似体としてのSer-Ile-フェネ
チルアミド)のような、SDF-1誘導体を含むことができる。本発明は更に、本発明
の新規アンタゴニストのこのような誘導体を含む。
【００６５】 本発明のCXCR4アンタゴニスト化合物内で、ペプチド構造(SDF-1由来のペプチ
ドなど)は、少なくとも1個の修飾基に直接または間接に結合することができる。
このような修飾されたペプチドも、本発明の範囲内である。「修飾基」という用
語は、ペプチド構造に直接的に結合した構造(例えば、共有結合により)に加え、
ペプチド構造に間接的に結合したもの(例えば安定した非共有的会合により、ま
たはSDF-1コアペプチド構造の側方にある追加のアミノ酸残基、またはそれらの
擬態、類似体もしくは誘導体への共有結合により)を含むことが意図されている
。例えば、この修飾基は、SDF-1ペプチド構造のアミノ末端もしくはカルボキシ
ル末端に、またはコアドメインの側方にあるペプチド、またはペプチド擬態領域
に結合することができる。あるいは、修飾基は、SDF-1ペプチド構造の少なくと
も1個のアミノ酸残基の側鎖、またはコアドメインの側方にあるペプチドもしく
はペプチド擬態領域に結合することができる(例えば、リシル残基のイプシロン
アミノ基を介して、アスパラギン酸残基またはグルタミン酸残基のカルボキシル
基を介して、チロシル残基、セリン残基またはトレオニン残基のヒドロキシ基、
または他の適当なアミノ酸側鎖上の反応基を介して)。ペプチド構造に共有結合
した修飾基は、例えば、アミド結合、アルキルアミノ結合、カルバミン酸エステ
ル結合または尿素結合を含む、化学構造連結に関する当技術分野において周知の
手段によりまたは方法を用いて結合することができる。
【００６６】 一部の態様において、修飾基は、環式、ヘテロ環式、多環式基を含むことがで
きる。本明細書において使用される「環式基」という用語は、3〜10個、4〜8個
、または5〜7個の炭素原子を有する環状の飽和または不飽和(すなわち芳香族)基
を含む。環式基の例は、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シク
ロヘキシル、およびシクロオクチルを含む。環式基は、未置換であるか、または
1個もしくは複数の環位置において置換されることができる。環式基は、例えば
、ハロゲン、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、
ヘテロ環、ヒドロキシル、アミノ、ニトロ、チオール、アミン、イミン、アミド
、ホスホネート、ホスフィン、カルボニル、カルボキシル、シリル、エーテル、
チオエーテル、スルホニル、スルホネート、セレノエーテル、ケトン、アルデヒ
ド、エステル、-CF3、-CNで置換することができる。
【００６７】 「ヘテロ環式基」という用語は、3〜10個、4〜8個、または5〜7個の炭素原子
を有する環状の飽和、不飽和、および芳香族基を含み、ここで環構造は、およそ
1個または複数のヘテロ原子を含む。ヘテロ環式基は、ピロリジン、オキソラン
、チオラン、イミダゾール、オキサゾール、ピペリジン、ピペラジン、モルホリ
ンを含む。ヘテロ環式環は、例えば、ハロゲン、アルキル、シクロアルキル、ア
ルケニル、アルキニル、アリール、他のヘテロ環、ヒドロキシル、アミノ、ニト
ロ、チオール、アミン、イミン、アミド、ホスホネート、ホスフィン、カルボニ
ル、カルボキシル、シリル、エーテル、チオエーテル、スルホニル、セレノエー
テル、ケトン、アルデヒド、エステル、-CF3、-CNのような置換基と、1個または
複数の位置で置換され得る。ヘテロ環は、以下に説明したように、他の環式基と
架橋または融合することもできる。
【００６８】 本明細書において使用される「多環式基」という用語は、2個またはそれ以上
の炭素が、2個の隣接環に共通である、2個以上の飽和、不飽和または芳香族環式
環を意味し、その結果これらの環は「融合環」であることが意図されている。隣
接していない原子により一緒になった環は、「架橋」環と称される。多環式基の
環は各々、例えば、ハロゲン、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキ
ニル、ヒドロキシル、アミノ、ニトロ、チオール、アミン、イミン、アミド、ホ
スホネート、ホスフィン、カルボニル、カルボキシル、シリル、エーテル、チオ
エーテル、スルホニル、セレノエーテル、ケトン、アルデヒド、エステル、-CF3 、または-CNのような、先に記したような置換基で置換され得る。
【００６９】 「アルキル」という用語は、直鎖アルキル基、分枝鎖アルキル基、環式アルキ
ル(脂環式)基、アルキル置換されたシクロアルキル基、およびシクロアルキル置
換されたアルキル基を含む、飽和された脂肪族基のラジカルを意味する。一部の
態様において、直鎖または分枝鎖のアルキルは、その主鎖に20個またはそれより
も少ない炭素原子(直鎖についてC1-C20、分枝鎖についてC3-C20)、または10個ま
たはそれよりも少ない炭素原子を有する。一部の態様において、シクロアルキル
は、例えば5個、6個または7個の炭素環のように、それらの環構造内に4〜10個の
炭素原子を有することができる。炭素数を特に特定しない限りは、本明細書にお
いて使用される「低級アルキル」とは、先に定義されたようなその主鎖構造に1
〜10個の炭素原子を有するアルキル基を意味する。同様に「低級アルケニル」お
よび「低級アルキニル」とは、10個以下の炭素鎖長を有する。
【００７０】 本明細書および特許請求の範囲を通じて使用される「アルキル」(または「低
級アルキル」)という用語は、「未置換のアルキル」および「置換されたアルキ
ル」の両方を含むことが意図されており、後者は、炭化水素主鎖の1個または複
数の炭素上の水素と置き換わる置換基を有するアルキル部分を意味する。このよ
うな置換基は、例えば、ハロゲン、ヒドロキシル、カルボニル(例えば、カルボ
キシル、ケトン(アルキルカルボニルおよびアリールカルボニル基を含む)、およ
びエステル(アルキルオキシカルボニルおよびアリールオキシカルボニル基を含
む))、チオカルボニル、アシルオキシ、アルコキシ、ホスホリル、ホスホネート
、ホスフィネート、アミノ、アシルアミノ、アミド、アミジン、イミノ、シアノ
、ニトロ、アジド、スルフィドリル、アルキルチオ、スルフェート、スルホネー
ト、スルファモイル、スルホンアミド、ヘテロサイクリル、アラルキル、または
芳香族もしくはヘテロ芳香族部分を含むことができる。炭化水素主鎖上の置換さ
れた部分は、適当である場合には、それ自身置換され得る。例えば、置換された
アルキルの置換基は、アミノ、アジド、イミノ、アミド、ホスホリル(ホスホネ
ートおよびホスフィネートを含む)、スルホニル(スルフェート、スルホンアミド
、スルファミルおよびスルホネートを含む)、およびシリル基、更にはエーテル
、アルキルチオ、カルボニル(ケトン、アルデヒド、カルボキシラート、および
エステルを含む)、-CF3、-CNなどの置換および未置換の形を含むことができる。
置換されたアルキルの例は、以下に説明される。シクロアルキルは更に、アルキ
ル、アルケニル、アルコキシ、アルキルチオ、アミノアルキル、カルボニルで置
換されたアルキル、-CF3、-CNなどで置換され得る。
【００７１】 「アルケニル」および「アルキニル」という用語は、先に説明したアルキルと
長さおよび可能な置換が類似しているが、各々、二重または三重結合を少なくと
も1個含むような不飽和の脂肪族基を意味する。
【００７２】 本明細書において使用される「アラルキル」という用語は、少なくとも1個の
アリール基で置換されたアルキルまたはアルキレニル基を意味する。アラルキル
の例は、ベンジル(すなわちフェニルメチル)、2-ナフチルエチル、2-(2-ピリジ
ル)プロピル、5-ジベンゾスベリルなどを含む。
【００７３】 本明細書において使用される「アルキルカルボニル」という用語は、-C(O)-ア
ルキルを意味する。同様に「アリールカルボニル」という用語は、-C(O)-アリー
ルを意味する。本明細書において使用される「アルキルオキシカルボニル」とい
う用語は、基 -C(O)-O-アルキルを意味し、および「アリールオキシカルボニル
」という用語は、-C(O)-O-アリールを意味する。「アシルオキシ」という用語は
、-O-C(O)-R7(式中、R7は、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ア
ラルキル、またはヘテロサイクリルである）を意味する。
【００７４】 本明細書において使用される「アミノ」という用語は、-N(Rα)(Rβ)(式中、Rα およびRβは、各々独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、ア
ラルキル、アリールであるか、またはRαおよびRβは、それらが結合した窒素原
子と共に4〜8原子を有する環を形成する）を意味する。従って本明細書において
使用される「アミノ」という用語は、未置換、一置換されたアミノ基(例えば、
モノアルキルアミノまたはモノアリールアミノ)、および二置換されたアミノ基(
例えば、ジアルキルアミノまたはアルキルアリールアミノ)を含む。「アミド」
という用語は、-C(O)N(R8)(R9)を意味する(式中、R8およびR9は先に定義された
ものである）。「アシルアミノ」という用語は、-N(R'8)C(O)-R7を意味する(式
中、R7は先に定義されたものであり、およびR'8はアルキルである）。
【００７５】 本明細書において使用される「ニトロ」という用語は-NO2を意味し；「ハロゲ
ン」という用語は-F、-Cl、-Brまたは-Iと定義され；「スルフヒドリル」という
用語は-SHを意味し；および「ヒドロキシル」という用語は-OHを意味する。
【００７６】 本明細書において使用される「アリール」という用語は、その環内に0〜4個の
ヘテロ原子を含むことができる5員、6員、および7員の芳香族基、例えば、フェ
ニル、ピロリル、フリル、チオフェニル、イミダゾリル、オキサゾール、チアゾ
リル、トリアゾリル、ピラゾリル、ピリジル、ピラジニル、ピリダジニル、およ
びピリミジニルなどを含む。これらの環構造にヘテロ原子を有するアリール基は
、「アリールヘテロ環式」または「ヘテロ芳香族」とも称される。この芳香環は
、1個または複数の環位置において、先に記したような置換基、例えば、ハロゲ
ン、アジド、アルキル、アラルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル
、ヒドロキシル、アミノ、ニトロ、スルフヒドリル、イミノ、アミド、ホスホネ
ート、ホスフィネート、カルボニル、カルボキシル、シリル、エーテル、アルキ
ルチオ、スルホニル、スルホンアミド、ケトン、アルデヒド、エステル、ヘテロ
環式、芳香族またはヘテロ芳香族部分、-CF3、-CNなどで置換され得る。アリー
ル基は、多環式基の一部であることもできる。例えばアリール基は、ナフチル、
アントラセニル、キノリル、インドリルなどの融合された芳香族部分を含む。
【００７７】 修飾基は、ビオチニル構造を含む基、フルオレセイン含有基、ジエチレン-ト
リアミンペンタアセチル基、(-)-メトキシアセチル基、N-アセチルノイラミル基
、コリル構造、またはイミノビオチニル基を含みうる。CXCR4アンタゴニスト化
合物は、当技術分野において公知の方法によりそのカルボキシ末端がコリル基で
修飾されている(例えば、Wess, G.ら、Tetrahedron Letters、34:817-822(1993)
；Wess, G.ら、Tetrahedron Letters、33:195-198(1992)；および、Kramer, W.
ら、J. Biol. Chem.、267:18598-18604(1992)参照)。コリル誘導体および類似体
も、修飾基として使用することができる。例えば、好ましいコリル誘導体は、Ai
c(3-(O-アミノエチル-イソ)-コリル)であり、これはCXCR4アンタゴニスト化合物
を更に修飾するために使用することができるような遊離のアミノ基を有する。修
飾基は、「ビオチニル構造」であることができ、これはビオチニル基ならびにそ
れらの類似体および誘導体(例えば、2-イミノビオチニル基)を含む。別の態様に
おいて、修飾基は、例えばSDF-1由来したペプチド構造の5-(および6-)-カルボキ
シフルオレセイン、スクシンイミジルエステル、またはフルオレセインイソチオ
シアナートとの反応に由来した基などの「フルオレセイン含有基」を含むことが
できる。様々な他の態様において、修飾基は、N-アセチルノイラミニル基、tran
s-4-コチニンカルボキシル基、2-イミノ-1-イミダゾリジンアセチル基、(S)-(-)
-インドリン-2-カルボキシル基、(-)-メントキシアセチル基、2-ノルボナンアセ
チル基、-オキソ-5-アセナフテンブチリル、(-)-2-オキソ-4-チアゾリジンカル
ボキシル基、テトラヒドロ-3-フロイル基、2-イミノビオチニル基、ジエチレン
トリアミンペンタアセチル基、4-モルホリンカルボニル基、2-チオフェンアセチ
ル基、または2-チオフェンスルホニル基を含むことができる。
【００７８】 本発明のCXCR4アンタゴニスト化合物は更に、この化合物の望ましい官能性を
維持しつつ、この化合物の特異的特性を変更するように修飾することができる。
例えばある態様において、この化合物は、インビボ安定性、バイオアベイラビリ
ティまたは半減期のような化合物の薬物動態学的特性を変更するように修飾する
ことができる。この化合物は、検出可能な物質でこの化合物を標識するように修
飾することができる。この化合物は、追加の治療的部分にこの化合物を結合する
ように修飾することができる。更にこの化合物をその薬物動態学的特性を変更す
るなどのために化学的に修飾するためには、反応基を誘導することができる。例
えば修飾基がSDF-1コアドメインのアミノ末端に結合している場合は、この化合
物のカルボキシル末端を更に修飾することができる。可能性のあるC末端修飾は
、カルボキシペプチダーゼの基質として作用する化合物の能力を低下するものを
含む。C末端修飾因子の例は、アミド基、エチルアミド基および様々な非天然の
アミノ酸、例えばD-アミノ酸およびβ-アラニンを含む。あるいは、修飾基が会
合コアドメインのカルボキシル末端に結合している場合は、この化合物のアミノ
末端は、例えばアミノペプチダーゼの基質として作用する化合物の能力を低下す
るように更に修飾することができる。
【００７９】 CXCR4アンタゴニスト化合物は、更に化合物と検出可能な物質との反応により
化合物を標識するように修飾される。適当な検出可能な物質は、様々な酵素、補
欠分子団、蛍光物質、発光物質、および放射性物質を含む。適当な酵素の例は、
西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ
、またはアセチルコリンエステラーゼであり；適当な補欠分子団複合体の例は、
ストレプトアビジン／ビオチン、およびアビジン／ビオチンを含み；適当な蛍光
物質の例は、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシア
ナート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルク
ロライド、またはフィコエリスリンを含み；発光物質の例は、ルミノールを含み
；および適当な放射性物質の例は、14C、123I、124I、125I、131I、99mTc、35S
または3Hを含む。CXCR4アンタゴニスト化合物は、修飾基へもしくはCXCR4アンタ
ゴニスト化合物の1個または複数のアミノ酸構造のいずれかへ14Cを組込むことに
より、14Cで放射標識することもできる。標識したCXCR4アンタゴニスト化合物は
、化合物のインビボにおける薬物動態を評価することに加え、例えば診断のため
に疾患の進行および疾患を発症している対象の性向を検出するために使用するこ
とができる。組織分布しているCXCR4受容体は、対象から得たインビボ試料また
はインビトロ試料のいずれかについて、標識したCXCR4アンタゴニスト化合物を
用いて検出することができる。インビボ診断薬としての使用のためには、本発明
のCXCR4アンタゴニスト化合物を、放射性テクネチウムまたはヨウ素により標識
することができる。遊離アミノ基を有するコール酸のAic誘導体のような、この
標識についてのキレート基が導入される部位を提供する修飾基を選択することが
できる。例えば、SDF-1配列内のフェニルアラニン残基(アミノ酸残基13など)を
、放射性イオドチロシルで置換することができる。様々な放射性ヨウ素同位体の
いずれかを導入して、診断薬を作成することができる。全身のシンチグラフィー
のためには123I(半減期=13.2時間)を使用することができ、陽電子放出断層撮影(
PET)のためには124I(半減期=4日)を使用することができ、代謝回転試験のために
は125I(半減期=60日)を使用することができ、ならびに全身の計測および遅延型
低解像度造影(delayed low resolution imaging)試験のためには131I(半減期=8
日)を使用することができる。
【００８０】 代わりの化学修飾において、本発明のCXCR4アンタゴニスト化合物は、「プロ
ドラッグ」型で調製することができ、ここではこの化合物それ自身はCXCR4アン
タゴニストとしては作用しないが、むしろインビボにおける代謝時に本明細書に
定義されたようなCXCR4アンタゴニスト化合物へと変換されることが可能である
。例えばこの種の化合物は、修飾基が、代謝時に活性CXCR4アンタゴニストへ変
換されることが可能であるようなプロドラッグ型で存在することができる。この
ような修飾基のプロドラッグ型は、本明細書において「二次的修飾基」と称され
る。ペプチドを基にした薬物の活性型の送達を最適化するために代謝を制限する
ペプチドプロドラッグを調製する様々な戦略が当技術分野において公知である(
例えば、Moss, J.、「ペプチドを基にした薬物設計：制御輸送および代謝(Pepti
de-Based Drug Design: Controlling Transport and Metabolism)」、Taylor, M
. D.およびAmidon, G. L.(編)、第18章、(1995)を参照のこと)。
【００８１】 本発明のCXCR4アンタゴニスト化合物は、当技術分野において公知の標準の技
術により調製することができる。CXCR4アンタゴニストのペプチド成分は、少な
くとも一部は標準の技術を用いて合成されたペプチドにより構成され得る(例え
ば、Bodansky, M.、「ペプチド合成の原理(Principles of Peptide Synthesis)
」、Springer Verlag、ベルリン(1993)；Grant, G. A.編、「合成ペプチド：使
用の手引き(Synthetic Peptides: A User's Guide)」、W. H. Freeman and Comp
any、ニューヨーク(1992)；または、Clark-Lewis, I.、Dewald, B.、Loetscher,
M.、Moser, B.、およびBaggiolini, M.、J. Biol. Chem.、269:16075-16081(19
94)に説明されたものなど)。自動化されたペプチド合成装置は市販されている(
例えば、Advanced ChemTech Model 396；Milligen/Biosearch 9600)。ペプチド
は、標準の方法に従いCXCR4アンタゴニスト活性についてアッセイすることがで
きる。ペプチドは、HPLCにより精製し、および質量分析により分析することがで
きる。ペプチドは、水を溶媒とする10％DMSOを使用するシステインの穏やかな酸
化により形成されたジスルフィド架橋を介して二量体化することができる。HPLC
精製後、質量分析により二量体形成を証明することができる。1個または複数の
修飾基を、例えばアミノ基(例えばペプチドのアミノ末端のαアミノ基)、カルボ
キシル基(例えばペプチドのカルボキシ末端)、ヒドロキシル基(例えばチロシン
、セリンまたはトレオニン残基上)またはその他のアミノ酸側鎖上の適当な反応
基を介した反応の方法を用いるような、標準の方法によりSDF-1由来のペプチド
成分に結合することができる(例えば、Greene, T. W.およびWuts, P. G. M.、「
有機合成の保護基(Protective Groups in Organic Synthesis)」、John Wiley a
nd Sons、ニューヨーク、(1991))。
【００８２】 別の本発明の局面において、CXCR4アンタゴニストペプチドは、このペプチド
をコードしている核酸分子を用いる標準の組換えDNA技術に従い調製することが
できる。このペプチドをコードしているヌクレオチド配列は、遺伝暗号を用いて
決定することができ、およびこのヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチド
分子は、標準のDNA合成法により合成することができる(例えば、自動DNA合成装
置を使用)。あるいは、ペプチド化合物をコードしているDNA分子は、標準の分子
生物学的方法に従い、天然の前駆体タンパク質遺伝子またはcDNAに由来すること
ができる(例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)および／または制限酵素消化の使
用)。
【００８３】 本発明は更に、本発明のペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含む単
離された核酸分子を提供する。一部の態様において、これらのペプチドは、未変
性のSDF-1と比較して少なくとも1個のアミノ酸欠失を有するアミノ酸配列を含む
ことができる。「核酸分子」という用語は、DNA分子およびRNA分子を含むことが
意図されており、1本鎖または2本鎖であることができる。代わりの態様において
、単離された核酸は、SDF-1のN末端、C末端および／または内側部位から1個また
は複数のアミノ酸が欠失されているペプチドをコードしている。
【００８４】 標準の組換えDNA技術により宿主細胞におけるペプチド化合物の発現を促進す
るために、このペプチドをコードしている単離された核酸を、組換え発現ベクタ
ーに組込むことができる。従って本発明は、本発明の核酸分子を含む組換え発現
ベクターも提供する。本明細書において使用される「ベクター」という用語は、
それが機能的に連結されている別の核酸を輸送することが可能な核酸分子を意味
する。ベクターは、環状2本鎖DNAプラスミド、ウイルスベクターを含むことがで
きる。ある種のベクターは、それらが導入された宿主細胞において自律複製が可
能である(例えば細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム型哺乳
類ベクターなど)。その他のベクター(例えば非エピソーム型哺乳類ベクター)は
、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組込むことができ、これにより宿主
ゲノムと共に増幅することができる。ある種のベクターは、それらが機能的に連
結された遺伝子の発現を誘導することが可能である。このようなベクターは、本
明細書において「組換え発現ベクター」または「発現ベクター」と称される。
【００８５】 本発明の組換え発現ベクターにおいて、ペプチドをコードしているヌクレオチ
ド配列は、発現に使用される宿主細胞を基に選択された、1個または複数の調節
配列に機能的に連結され得る。「機能的に連結された」または「操作可能に」連
結されたという語句は、ペプチドをコードしている配列が、ペプチド化合物の発
現を可能にするように調節配列に連結されていることを意味する。「調節配列」
という用語は、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、および
他の発現制御要素を含む。このような調節配列は、例えばGoeddel；「遺伝子発
現技術：酵素学的方法(Gene Expression Technology: Methods in Enzymology)
」185、Academic Press社、サンディエゴ、カリフォルニア(1990)(これは本明細
書に参照として組み入れられる)に記されている。調節配列は、多くの種類の宿
主細胞におけるヌクレオチド配列の構成的発現を誘導するもの、ある種の宿主細
胞においてのみヌクレオチド配列の発現を誘導するもの(例えば組織特異性調節
配列)、および調節可能な方法で発現を誘導するもの(例えば誘導剤が存在する場
合にのみ)を含む。発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択およ
び望ましいペプチド化合物の発現レベルなどの要因によって左右される。
【００８６】 本発明の組換え発現ベクターは、原核細胞または真核細胞におけるペプチド化
合物の発現のために設計することができる。例えば、ペプチド化合物は、大腸菌
のような細菌細胞、昆虫細胞(バキュロウイルス発現ベクター)、酵母細胞または
哺乳類細胞において発現することができる。適当な宿主細胞は更に、Goeddel、
「遺伝子発現技術：酵素学的方法」185、Academic Press社、サンディエゴ、カ
リフォルニア(1990)において論じられている。あるいはこの組換え発現ベクター
は、例えばT7プロモーター調節配列およびT7ポリメラーゼを用いて、インビトロ
において転写および翻訳することができる。酵母S.セレビシエ(S. cerivisae)に
おける発現のためのベクターの例は、pYepSec1(Baldariら、 EMBO J. 6:229-234
(1987))、pMFa(KurjanおよびHerskowitz、Cell、30:933-943(1982))、pJRY88(Sc
hultzら、Gene、54:113-123(1987))、およびpYES2(Invitrogen社、サンディエゴ
、カリフォルニア)を含む。培養された昆虫細胞(例えばSf9細胞)内のタンパク質
またはペプチドの発現に利用できるバキュロウイルスベクターは、pAcシリーズ(
Smithら、Mol. Cell. Biol.、3:2156-2165(1983))およびpVLシリーズ(Lucklow,
V. A.およびSummers, M. D.、Virology、170:31-39(1989))を含む。哺乳類発現
ベクターの例は、pCDM8(Seed, B.、Nature、329:840(1987))およびpMT2PC(Kaufm
anら、EMBO J.、6:187-195(1987))を含む。哺乳類細胞において使用される場合
、発現ベクターの制御機能は、ウイルス調節要素により提供されることが多い。
例えば一般に使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス2、サイ
トメガロウイルス、およびシミアンウイルス40に由来する。
【００８７】 組換え発現ベクターは、調節制御配列に加え、ベクターに組込まれている宿主
細胞を同定するための選択マーカー遺伝子のような、追加のヌクレオチド配列を
含むことができる。選択マーカー遺伝子は、当技術分野において周知である。宿
主細胞からのペプチド化合物の分泌を促進するために、特定の哺乳類宿主細胞に
おいて、組換え発現ベクターは、発現時にペプチド化合物がそのアミノ末端に融
合されたシグナル配列により合成されるような、ペプチド化合物のアミノ末端を
コードしている配列に機能的に連結されたシグナル配列をコードしていることが
好ましい。このシグナル配列は、ペプチド化合物を細胞の分泌経路へと向かわせ
、その後切断され、成熟ペプチド化合物(すなわち、シグナル配列を伴わないペ
プチド化合物)を宿主細胞から放出することを可能にする。哺乳類宿主細胞から
のタンパク質またはペプチドの分泌を促進するシグナル配列の使用は、当技術分
野において周知である。
【００８８】 ペプチド化合物をコードしている核酸を含む組換え発現ベクターは、宿主細胞
に導入され、宿主細胞においてペプチド化合物を産生することができる。従って
、本発明は更に、本発明の組換え発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。「宿
主細胞」および「組換え宿主細胞」という用語は、本明細書において互換的に使
用される。このような用語は、単に特定の対象細胞のみを意味するのではなく、
そのような細胞の子孫または可能性のある子孫も意味する。ある種の修飾は、突
然変異または環境の影響のいずれかにより後続世代において生じることがあるの
で、このような子孫は、実際は親細胞と同じではないが、依然として本明細書に
おいて使用されるこの用語の範囲内に含まれる。宿主細胞は、原核または真核細
胞のいずれかであってよい。例えばペプチド化合物は、大腸菌のような細菌細胞
、昆虫細胞、酵母または哺乳類細胞で発現することができる。このペプチド化合
物は、遺伝子治療により対象毎にインビボ発現することができる(以下にさらに
記載する)。
【００８９】 ベクターDNAは、通常の形質転換、トランスフェクションまたは感染技術によ
り、原核細胞または真核細胞へ導入することができる。「形質転換」、「トラン
スフェクション」、または「感染」という用語は、リン酸カルシウムまたは塩化
カルシウム共沈法、DEAE-デキストラン媒介型トランスフェクション、リポフェ
クション、電気穿孔、微量注入およびウイルス媒介型感染を含む、宿主細胞に外
来核酸を導入する技術を意味する。宿主細胞の形質転換、トランスフェクション
または感染の適当な方法は、例えば、Sambrookらの著書(「分子クローニング：
実験マニュアル(Molecular Cloning: A Laboratory Manual)」第2版、Cold Spri
ng Harbor Laboratory press社(1989))、および他の実験マニュアルに見ること
ができる。インビボにおいてDNAを哺乳類細胞に導入する方法は公知であり、本
発明のベクターDNAを遺伝子治療の対象に送達するために使用することができる
。
【００９０】 安定した哺乳類細胞のトランスフェクションについて、使用した発現ベクター
およびトランスフェクション技術に応じて、細胞のわずかな画分のみがそれらの
ゲノムへ外来DNAを組込み得ることが知られている。これらの組込み体を同定お
よび選択するために、選択マーカー(抗生物質に対する抵抗性など)をコードして
いる遺伝子を、対象となる遺伝子と共に宿主細胞へ導入することができる。好ま
しい選択マーカーは、G418、ハイグロマイシン、およびメトトレキセートなどの
薬物に対する抵抗性を付与するものを含む。選択マーカーをコードしている核酸
を、そのペプチド化合物をコードしているものと同じベクター上で宿主細胞へ導
入するか、または個別のベクターにより導入することができる。導入された核酸
で安定してトランスフェクションされた細胞は、薬物選択について同定すること
ができる(この選択マーカー遺伝子を組込んでいる細胞は生存するが、他の細胞
は死滅する)。
【００９１】 本発明の核酸は、DNAの直接注入、受容体を介したDNA取り込み、またはウイル
ス媒介型トランスフェクションのような方法を用い、細胞へとインビボにおいて
送達することができる。直接注入は、裸のDNAを細胞へインビボにおいて導入す
るために使用されている(例えば、Acsadiら、Nature、332:815-818(1991)；Wolf
fら、Science、247:1465-1468(1990)参照)。細胞へのインビボにおけるDNA注入
のための送達装置(例えば「遺伝子銃」)を使用することができる。このような装
置は市販されている(例えばBioRad社)。裸のDNAは、細胞表面受容体のリガンド
へ結合されるポリリシンのようなカチオンへ、DNAを複合体化することにより細
胞へ導入することもできる(例えばWu, G.およびWu, C. H.、J. Biol. Chem.、26
3:14621(1988)；Wilsonら、J. Biol. Chem.、267:963-967(1992)；および米国特
許第5,166,320号を参照のこと)。DNA-リガンド複合体の受容体への結合は、受容
体が媒介したエンドサイトーシスによりDNAの取り込みを促進することができる
。アデノウイルスキャプシドに連結したDNA-リガンド複合体は、エンドソームを
破壊し、これにより物質が細胞質へ放出されるが、この複合体の細胞内リボソー
ムによる分解を避けるために使用することができる(例えばCurielら、Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA、88:8850(1991)；Cristianoら、Proc. Natl. Acad. Sci. US
A、90:2122-21 26(1993)参照のこと)。
【００９２】 欠損レトロウイルスは、遺伝子治療を目的とした遺伝子導入における使用につ
いてよく特徴決定されている(総説については、Miller, A. D.、Blood、76:271(
1990)、Kumeら、International. J. Hematol.、69:227-233(1999)参照のこと)。
組換えレトロウイルスの作出、およびこのようなウイルスによるインビトロまた
はインビボにおける細胞の感染のためのプロトコールは、「分子生物学最新プロ
トコール(Current Protocols in Molecular Biology)」、Ausubel, F. M.ら(編)
、Greene Publishing Associates社、(1989)、第9.10〜9.14章およびその他の標
準の実験マニュアルに見ることができる。適当なレトロウイルスの例は、pLJ、p
ZIP、pWEおよびpEMを含み、これらは当業者には周知である。適当なパッケージ
ングウイルス株の例は、.pΨ.Crip、.pΨi.Cre、.pΨi.2および.pΨi.Amである
。レトロウイルスは、様々な遺伝子の、上皮細胞、胚細胞、リンパ球、単球、肝
細胞、骨髄細胞を含む多くの異なる細胞型へのインビトロおよび／またはインビ
ボにおける導入に使用される(例えばEglitisら、Science、230:1395-1398(1985)
；DanosおよびMulligan、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、85:6460-6464(1988)；W
ilsonら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、85:3014-3018(1988)；Armentanoら、Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA、87:6141-6145(1990)；Huberら、Proc. Natl. Acad.
Sci. USA、88:8039-8043(1991)；Ferryら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、88:8
377-8381(1991)；Chowdhuryら、Science、254:1802-1805(1991)；van Beusechem
ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、89:7640-7644(1992)；Kayら、Human Gene Th
erapy、3:641-647(1992)；Daiら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、89:10892-1089
5(1992)；Hwuら、J. Immunol.、150:4104-4115(1993)；米国特許第4,868,116号
；米国特許第4,980,286号；国際公開公報第89/07136号；国際公開公報第89/0246
8号；国際公開公報第89/05345号；および国際公開公報第92/07573号)。様々な態
様において、本発明のポリペプチド化合物をコードおよび発現しているレトロウ
イルスのゲノムは、造血前駆幹細胞などの細胞の繁殖および／または生存のため
、輸血または生着、宿主馴化、もしくは化学療法、放射線療法または骨髄破壊的
療法のための関連用途のための臨床目的の細胞の維持および／または増殖の目的
に使用することができる。
【００９３】 遺伝子治療ベクターとして使用するために、アデノウイルスのゲノムを、本発
明のペプチド化合物をコードおよび発現するように操作することができるが、正
常なウイルスの溶菌化サイクルにおいてその増幅能は失活される。例えばBerkne
rら、BioTechniques、6:616(1988)；Rosenfeldら、Science、252:431-434(1991)
；および、Rosenfeldら、Cell、68:143-155(1992)を参照のこと。アデノウイル
ス株Ad型5 dl324または他のアデノウイルス株(例えば、Ad2、Ad3、Ad7など)に由
来した適当なアデノウイルスベクターは、当業者に周知である。組換えアデノウ
イルスは、これらは有効な遺伝子送達ビヒクルであるためには***細胞を必要と
しない点で有利であり、および気道上皮(Rosenfeldら、(1992)、前掲)、内皮細
胞(Lemarchandら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、89:6482-6486(1992))、肝細胞
(HerzおよびGerard、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、90:2812-2816(1993))および
筋細胞(Quantinら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、89:2581-2584(1992))を含む
多種多様な細胞型の感染に使用することができる。様々な態様において、本発明
のポリペプチド化合物をコードおよび発現しているアデノウイルスのゲノムは、
造血前駆幹細胞、ストローマ細胞、または間葉細胞などの細胞の繁殖および／ま
たは生存のため、輸血または生着、宿主馴化、もしくは化学療法、放射線療法ま
たは骨髄破壊的療法のための関連用途のための臨床目的の細胞の維持および／ま
たは増殖の目的に使用することができる。
【００９４】 一部の態様において、アデノ随伴ウイルス(AAV)を、遺伝子治療目的のDNAの送
達のための遺伝子治療ベクターとして使用することができる。AAVは、アデノウ
イルスまたはヘルペスウイルスなどの別のウイルスを、効率的増幅および生産的
生活環のためのヘルパーウイルスとして必要とする天然の欠損ウイルスである(M
uzyczkaら、Curr. Topics in Micro. and Immunol.、158:97-129(1992))。AAVは
、非***細胞へのDNAの組込みに使用することができる(例えばFlotteら、Am. J.
Respir. Cell. Mol. Biol.、7:349-356(1992)；Samulskiら、J. Virol.、63:38
22-3828(1989)；およびMcLaughlinら、J. Virol.、62:1963-1973(1989)を参照の
こと)。Tratschinらの論文(Mol. Cell. Biol.、5:3251-3260(1985))に記されたA
AVベクターを、細胞へのDNAの導入に使用することができる(例えばHermonatら、
Proc. Natl. Acad. Sci. USA、81:6466-6470(1984)；Tratschinら、Mol. Cell B
iol.、4:2072-2081(1985)；Wondisfordら、Mol. Endocrinol.、2:32-39(1988)；
Tratschinら、J. Virol.、51:611-619(1984)；およびFlotteら、J. Biol. Chem.
、268:3781-3790(1993)を参照のこと)。一部の態様において、本発明のポリペプ
チド化合物をコードおよび発現しているAAVのゲノムは、造血前駆幹細胞、スト
ローマ細胞、または間葉細胞などの細胞の繁殖および／または生存のため、輸血
または生着、宿主馴化、もしくは化学療法、放射線療法または骨髄破壊的療法の
ための関連用途のための臨床目的の細胞の維持および／または増殖の目的に使用
することができる。
【００９５】 遺伝子治療に関する一般的方法は当技術分野において公知である。例えばAnde
rsonらの米国特許第5,399,346号を参照のこと。遺伝的物質を送達するための生
体適合性カプセルは、Baetgeらの国際公開公報第95/05452号に開示されている。
中枢神経系障害を治療するために遺伝的に修飾された細胞を移植する方法は、全
てGageらの米国特許第5,082,670号および国際公開公報第90/06757号および国際
公開公報第93/10234号に開示されている。造血細胞への遺伝子導入の方法もこれ
までに報告されている(Clapp, D. W.ら、Blood、78:1132-1139(1991)；Anderson
、Science、288:627-9(2000)；および、Cavazzana-Calvoら、Science、288:669-
72(2000)参照、これらは全て本明細書に参照として組み入れられる)。
【００９６】 本発明の様々な局面のCXCR4アンタゴニスト治療に感受性のある癌は、***、
結腸、直腸、中咽頭、下咽頭、食道、胃、膵、肝、胆嚢および胆管、小腸、尿管
(腎、膀胱および尿路上皮を含む)、女性生殖道(子宮頸部、子宮、および卵巣に
加え、絨毛上皮腫および妊娠絨毛性疾患)、男性生殖道(前立腺、精嚢、精巣およ
び生殖細胞腫瘍を含む)、内分泌腺(甲状腺、副腎、および下垂体を含む)、なら
びに皮膚の癌腫、更には血管腫、黒色腫、肉腫(骨および軟組織に生じるものに
加え、カポジ肉腫を含む)ならびに脳、神経、目、および髄膜の腫瘍(星状細胞腫
、神経膠腫、網膜芽腫、神経腫、神経芽細胞腫、シュワン細胞腫、および髄膜腫
)を含む、固形腫瘍のような原発性および転移性の両方の腫瘍である。本発明の
一部の局面において、CXCR4アンタゴニストは、白血病のような、造血系悪性疾
患から生じる固形腫瘍のような腫瘍(すなわち、緑色腫、形質細胞腫ならびに菌
状息肉腫および皮膚T細胞リンパ腫/白血病のプラークおよび腫瘍)の治療に加え
、リンパ腫(ホジキンおよび非ホジキンリンパ腫の両方)の治療にも有用である。
加えて、CXCR4アンタゴニストは、単独で使用した場合または放射線療法または
化学治療剤などの細胞傷害性作因との併用した場合のいずれかで、前述の腫瘍か
らの転移の防止において有用であることができる(例えばZlotnikら、Nature、41
0:50-56(2001)参照)。
【００９７】 別の本発明の局面において、SDF-1ポリペプチドのようなCXCR4アンタゴニスト
および非ペプチド低分子アンタゴニストは、CD34+細胞を末梢血へ放出すること
に関与するために、CD34+細胞を標的とすることができる。本発明のこれらの局
面において、CXCR4アンタゴニストは、循環血中CD34+細胞の増殖および造血幹細
胞または前駆細胞の生存またはレベルを増強することができ、これは例えば幹細
胞の移植またはエクスビボ増幅において有用である。更にCXCR4アンタゴニスト
は、造血幹細胞または前駆細胞の動員を増強することができる。
【００９８】 様々な本発明の局面において、CXCR4アンタゴニストは、造血細胞の増幅速度
の維持または増大において使用することができる。本発明の方法は、有効量のCX
CR4アンタゴニストを、造血幹細胞および造血前駆細胞、ストローマ細胞または
間葉細胞からなる群より選択される細胞へ投与することを含む。別の態様におい
て、CXCR4アンタゴニストの治療的有効量が、そのような治療が必要な患者に投
与される。そのような治療が必要な患者は、例えば、癌の患者、自己免疫疾患の
患者、造血幹細胞、ストローマ細胞または間葉細胞への機能的遺伝子導入が必要
な患者(例えば幹細胞が分化し得る組織または臓器の機能不全)、リンパ球枯渇が
必要な患者、自家または同種移植片を用いて自己反応性または癌性細胞をパージ
する形での血液癌の枯渇が必要な患者、または自家末梢血幹細胞移植が必要な患
者を含む。本発明の治療が必要な患者は、化学療法または放射線療法などの細胞
傷害性治療を受けることもできる。一部の態様において、CXCR4アンタゴニスト
は、細胞傷害性治療を受けた癌細胞のエクスビボ造血幹細胞培養物をパージする
ための治療において使用することができるが、造血前駆細胞または幹細胞の生存
力および自己複製は保存している。
【００９９】 別の局面において、本発明の治療法は、汎血球減少症、顆粒球減少症、血小板
減少症、貧血またはこれらの組合せを含む、患者が造血細胞枯渇を引き起す骨髄
抑制療法を受けている場合に利用することができる。更なる別の態様において、
治療される患者はAIDSに罹患しており、および治療は例えば造血細胞数の増大に
効果がある。
【０１００】 本発明の様々な態様が本明細書において明らかにされているが、当業者の共通
の一般的知識に従い本発明の範囲内で多くの適合および修飾を行うことが可能で
ある。このような修飾は、実質的に同一の方法で同一の結果を達成するための、
本発明のいずれかの局面について公知の等価物の置換を含む。数値の範囲は、そ
の範囲に示された数字を含むものとする。特許請求の範囲において、「含む」と
いう用語は、実質的に「含むが、これらに限定されるものではない」という語句
と実質的に同じ非制限的な用語として使用される。様々な態様について明らかに
された用途は、全ての態様において必ずしも得られるものではなく、本発明は代
わりの利用性を得るために当業者により適合することができる。
【０１０１】 実施例 下記実施例は、本発明を例証するためのものであって、限定するためのもので
はない。
【０１０２】実施例1 図1は、CXCR4受容体結合アッセイ法の結果を示している。これらの結果を得る
ために、アンタゴニスト(競合リガンド)(20M)を、4nM 125I-SDF-1の存在下で、5
x106 CEM細胞/mlに添加した。CEM細胞を、2時間インキュベーションした後、125 I-SDF-1結合についてアッセイした。結果は、競合リガンド非存在下での最大比
結合の割合(％)で表し、3回の個別の実験の平均であった。図1において、試験し
たアンタゴニストは以下のものであった：
【０１０３】実施例2 表1は、CXCR4アンタゴニストの造血細胞に対する、特に未成熟赤血球系細胞お
よび未成熟顆粒球(造血前駆細胞)に対する作用を、成熟顆粒球と比較して示して
いる。表1のデータを得るために、細胞を各化合物と共にまたは生理食塩水単独(
対照)でプレインキュベーションした。その後細胞を、細胞傷害性物質である高
用量H3-チミジンに曝した。急激に***する細胞は、細胞傷害性放射性チミジン
を比例を上回る割合で蓄積し、その結果、優先的に殺傷された。チミジン処理に
より殺傷された細胞の対照に対する相対割合を、細胞増幅の増加、すなわち細胞
周期進行およびDNA合成速度の増大における本化合物の相対的効果の指標とした
。対照に比べ殺傷された細胞の割合が高いことは、該化合物が所定の細胞型にお
いて細胞増幅を増大したことの指標である。
【０１０４】
【表１】 H3-チミジンに曝された骨髄前駆細胞の周期におけるCXCR4ペプチドア
ンタゴニストの作用(殺傷された細胞％)
【０１０５】 表1において、SDF-1(G2)は、ペプチド であり、CTCE9907は、ペプチド であり、CTCE9908は、ペプチド であり、CTCEOO12は、ペプチド であり、およびCTCEOO16は、ペプチド であり、およびCTCEOO17は、ペプチド である。
【０１０６】実施例3 図2は、インビボ生着モデルにおけるCXCR4アンタゴニストのヒト前駆細胞増殖
の増強に対する作用を示している。
【０１０７】 図2において、移植されたNOD/SCIDマウスの骨髄から単離したCD34+細胞懸濁液
中の、成熟および未成熟コロニー形成細胞(CFU-GM；コロニー形成単位-顆粒球-
単球-前駆体(colony forming unit-granulocyte-monocyte precursor)、BFU-E；
バースト形成単位-赤血球前駆体(burst forming unit-erythroid precursor)、L
TC-IC；長期培養開始細胞(long-term culture initiating cell))の周期の状態
を、高比活性の3H-チミジン20μg/mlへの細胞の短期間(20分間)または一晩(16時
間)の曝露により失活(殺傷)されたこれらの前駆体の割合をアッセイすることに
より決定した(値は最大4回の実験で各点につき最大4匹のマウスから得たデータ
の平均±S.D.で表す)。結果の有意性は、高比活性の3H-チミジン(これは増殖細
胞にのみ作用する)への曝露により殺傷された細胞の低下として測定されたよう
な、SDF-1ペプチドアンタゴニストが「未成熟」ヒト前駆細胞の増殖の増強にお
いて有効である点で認められた。
【０１０８】 図2において、対照は未処理の細胞を表し、CTCE9907は、ペプチド であり、CTCE9908は、ペプチド であり、CTCE0012は、ペプチド であり、CTCE0016は、ペプチド であり、CTCE0017は、ペプチド である。
【０１０９】実施例4 図3、本実施例は、ヒト胎児肝移植されたNOD/SCIDマウスにおける、CXCR4ペプ
チドアンタゴニストのヒト細胞の生着に対する作用を説明している。マウスの長
骨(頸骨および大腿骨)において検出された表現型で定義したヒト造血細胞の頻度
を決定した。SDF-1 0.5mg/kg投与は、CD45/71、CD19/20、またはCD34細胞の数に
対し有意な作用を有さず、CFCまたはLTC-ICに対しても有さなかった。加えて、
ヒト細胞型のいずれも、このCXCR4アゴニスト投与計画では検出可能には作用し
なかった。このデータは、SDF-1ペプチドアンタゴニストは、ヒト前駆細胞の二
次的生着を効果的に増強すること、およびこれらの化合物は示された用量におい
て動物にとって本質的に無毒であることを示している。
【０１１０】 図3において、対照は未処理の細胞を表し、CTCE99O7は、ペプチド であり、CTCE9908は、ペプチド であり、CTCE0012は、ペプチド であり、CTCE0016は、ペプチド であり、およびCTCE0017は、ペプチド
【図面の簡単な説明】
【図１】 125I-SDF-1結合競合アッセイ法におけるSDF-1ペプチドアンタゴ
ニストと結合しているCXCR4受容体の作用を示す。完全長SDF-1アンタゴニストお
よび示された類似体(競合リガンド)を、4nM 125I-SDF-1の存在下、CEM細胞へ添
加した。2時間インキュベーション後、CEM細胞を、125I-SDF-1結合についてアッ
セイした。結果は、競合リガンドなしで測定された最大比結合に対する割合(％)
として表した。
【図２】 SDF-1ペプチドアンタゴニスト(実施例において定義)の、 胎児肝
移植したNOD/SCIDマウス由来のヒト前駆体の周期に対する作用を示す。移植され
たNOD/SCIDマウス骨髄から単離されたCD34+細胞懸濁液中の成熟および未成熟コ
ロニー形成細胞(CFU-GM；コロニー形成単位-顆粒球-単球前駆体、BFU-E；バース
ト形成単位-赤血球前駆体)の周期の状態は、短時間(20分)または一晩(LTC-IC；
長期培養開始細胞)を20μg/mlの高比活性3H-チミジンに曝露することにより失活
(殺傷)したこれらの前駆体の割合の評価により決定した。値は、各点につき最大
4匹のマウスの最大4回の実験データの平均±S.D.で表す。高比活性3H-チミジン
は増殖している細胞に影響を及ぼすので、SDF-1アンタゴニストとのインキュベ
ーションから生じるより高い程度の細胞死は、細胞周期における顕著な増強(自
己複製)を表している。
【図３】 SDF-1ペプチドアンタゴニスト(実施例において定義した)のヒト
胎児肝移植したNOD/SCIDマウスにおけるヒト細胞の生着に対する作用を示す。107 個の低密度ヒト胎児肝血液細胞を移植して4週間後、およびその後、SDF-1アン
タゴニスト(0.5mg/kg)を1週間に3回で2週間投与した後に屠殺したマウスの長骨(
頸骨および大腿骨)において検出された表現型で定義した造血細胞数の比較を示
す。値は、3回の実験における3〜7匹の個別のマウスから得た結果の平均±1S.D.
として表す。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１４年７月１１日（２００２．７．１１）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【化１】 (X=Ar、Ar-OH、アルキルなど) および、Btdは、
【化２】 、
【化３】 、または
【化４】 (X=アルキル、Ar、Ar-OHなど)である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 43/00 １１１ Ｃ０７Ｋ 7/06 Ｃ１２Ｎ 5/06 7/08 // Ｃ０７Ｋ 7/06 14/00 7/08 Ａ６１Ｋ 37/02 14/00 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｅ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＯ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＣ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ， ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，Ｉ Ｎ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ， ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，Ｐ Ｌ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ， ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (71)出願人 ケモカイン セラピューティクス コーポ レーション カナダ国 ブリティッシュ コロンビア州 バンクーバー スート 400 ウェスト ブロードウェイ 601 (72)発明者 テュダン クリストファー アール． カナダ国 ブリティッシュ コロンビア州 バンクーバー ヨーク ストリート 204−2335 (72)発明者 マーツォーク アーメッド カナダ国 ブリティッシュ コロンビア州 リッチモンド ＃112 ナンバー ５ ロード 9071 (72)発明者 アレブ レクダー カナダ国 ブリティッシュ コロンビア州 バンクーバー ウェスト 13ス アベニ ュー 975 (72)発明者 サクセナ ジータ カナダ国 ブリティッシュ コロンビア州 バンクーバー オゾイウーズ クレセン ト 110−2875 (72)発明者 イーブス コニー ジェイ． カナダ国 ブリティッシュ コロンビア州 バンクーバー ウェスト 31スト アベ ニュー 2705 (72)発明者 キャッシュマン ジョアンヌ カナダ国 ブリティッシュ コロンビア州 バンクーバー ブレンハイム ストリー ト 6070 (72)発明者 クラーク−ルイス イアン カナダ国 ブリティッシュ コロンビア州 バンクーバー オゾイウーズ クレセン ト ＃409 2875 (72)発明者 サラリ ハッサン カナダ国 ブリティッシュ コロンビア州 デルタ パシフィック ドライブ 927 Ｆターム(参考） 4B065 AA94X AC20 BA30 CA44 CA46 4C084 AA01 AA02 AA17 BA01 BA08 BA18 BA19 BA23 BA28 BA32 BA41 DA01 NA14 ZB082 ZB262 ZC022 ZC422 4H045 AA10 AA30 BA14 BA15 BA16 BA17 BA18 BA30 BA40 BA50 EA20 FA20 FA50

Claims (30)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 有効量のCXCR4アンタゴニストを造血細胞へ投与する段階を
    含む、造血細胞の増幅速度を促進する方法。
  2. 【請求項２】 造血細胞が、造血幹細胞または前駆細胞である、請求項1記
    載の方法。
  3. 【請求項３】 骨髄部分から末梢血部分へと造血細胞を動員するのに有効量
    のCXCR4アンタゴニストを患者に投与する段階を含む、そのような治療が必要な
    患者における造血細胞の循環を増大する方法。
  4. 【請求項４】 遺伝子治療のために、造血細胞へ異種遺伝子を導入する段階
    をさらに含む、請求項1または2記載の方法。
  5. 【請求項５】 造血細胞がエクスビボである、請求項1、2または3記載の方
    法。
  6. 【請求項６】 造血細胞がインビボである、請求項1、2または3記載の方法
    。
  7. 【請求項７】 造血細胞が、赤血球、血小板、好中球、単球、マクロファー
    ジ、樹状細胞(骨髄系およびリンパ系関連)、好酸球、好塩基球、マスト細胞、B
    細胞、およびT細胞を含む、成熟した骨髄系およびリンパ系の血液細胞へ分化す
    ることが知られる造血幹細胞および造血前駆細胞(CFU-GEMM、BFU-E、CFU-Meg、C
    FU-GM、CFU-M/DC CFU-Eo、CFU-Bas、Pro-B細胞、およびリンパ系幹細胞を含む)
    からなる群より選択される、請求項1〜6いずれか一項記載の方法。
  8. 【請求項８】 CXCR4アンタゴニストが、CXCR4アンタゴニストペプチドを含
    む、請求項1〜7のいずれか1項記載の方法。
  9. 【請求項９】 CXCR4アンタゴニストペプチドが、下記からなる群より選択
    される、請求項8記載の方法： 式中、P*は、 【化１】 (X=Ar、Ar-OH、アルキルなど) および、Btdは、 【化２】 、 【化３】 、または 【化４】 (X=アルキル、Ar、Ar-OHなど)である。
  10. 【請求項１０】 CXCR4アンタゴニストペプチドが、下記からなる群より選
    択される、請求項8記載の方法：
  11. 【請求項１１】 CXCR4アンタゴニストペプチドが、下記からなる群より選
    択される、請求項8記載の方法： 式中、P*は、 【化５】 (X=Ar、Ar-OH、アルキルなど) および、Btdは、 【化６】 、 【化７】 、または 【化８】 (X=アルキル、Ar、Ar-OHなど)である。
  12. 【請求項１２】 CXCR4アンタゴニストペプチドが、下記からなる群より選
    択される、請求項8記載の方法： 式中、P*は、 【化９】 (X=Ar、Ar-OH、アルキルなど) および、Btdは、 【化１０】 、 【化１１】 、または 【化１２】 (X=アルキル、Ar、Ar-OHなど)である。
  13. 【請求項１３】 CXCR4アンタゴニストペプチドが、下記からなる群より選
    択される、請求項8記載の方法： 式中、Xは、各配列の8位の各アルギニンの間における、天然または非天然のアミ
    ノ酸リンカーであり；ならびに 式中、P*は、 【化１３】 (X=Ar、Ar-OH、アルキルなど) および、Btdは、 【化１４】 、 【化１５】 、または 【化１６】 (X=アルキル、Ar、Ar-OHなど)である。
  14. 【請求項１４】 CXCR4アンタゴニストペプチドが、下記からなる群より選
    択される、請求項8記載の方法： 式中、nは、0または1〜10の整数である。
  15. 【請求項１５】 CXCR4アンタゴニストペプチドが、下記からなる群より選
    択される、請求項8記載の方法： 式中、nは、0または1〜20の整数である。
  16. 【請求項１６】 CXCR4アンタゴニストペプチドが、下記からなる群より選
    択される、請求項8記載の方法： 式中、nは、0または1〜20の整数である。
  17. 【請求項１７】 CXCR4アンタゴニストペプチドが、下記からなる群より選
    択される、請求項8記載の方法： 式中、nは、0または1〜20の整数であり、ならびに 式中、P*は、 【化１７】 (X=Ar、Ar-OH、アルキルなど) および、Btdは、 【化１８】 、 【化１９】 、または 【化２０】 (X=アルキル、Ar、Ar-OHなど)である。
  18. 【請求項１８】 CXCR4アンタゴニストペプチドが、下記からなる群より選
    択される、請求項8記載の方法：
  19. 【請求項１９】 下記からなる群より選択される、CXCR4アンタゴニストペ
    プチド：
  20. 【請求項２０】 CXCR4アンタゴニストペプチドが、下記からなる群より選
    択される、請求項8記載の方法： 式中、nは、0または1〜20の整数である。
  21. 【請求項２１】 造血細胞増幅の速度を促進するのに有効量のCXCR4アンタ
    ゴニストを患者に投与する段階を含む、そのような治療が必要な患者における癌
    の治療法。
  22. 【請求項２２】 造血細胞増幅の速度を促進するのに有効量のCXCR4アンタ
    ゴニストを患者に投与する段階を含む、そのような治療が必要な患者における自
    己免疫疾患の治療法。
  23. 【請求項２３】 造血細胞増幅の速度を促進するための、CXCR4アンタゴニ
    ストの使用。
  24. 【請求項２４】 造血細胞が、造血幹細胞または前駆細胞である、請求項23
    記載のCXCR4アンタゴニストの使用。
  25. 【請求項２５】 骨髄部分から末梢血部分へと造血細胞を動員する医薬品を
    製剤化するための、CXCR4アンタゴニストの使用。
  26. 【請求項２６】 造血細胞増幅の速度を促進する医薬品を製剤化するための
    、CXCR4アンタゴニストの使用。
  27. 【請求項２７】 患者において造血細胞増幅の速度を促進することによる、
    患者の癌を治療するための有効量のCXCR4アンタゴニストの使用。
  28. 【請求項２８】 患者において造血細胞増幅の速度を促進することによる、
    患者の自己免疫疾患を治療するための有効量のCXCR4アンタゴニストの使用。
  29. 【請求項２９】 患者において造血細胞増幅の速度を促進することによる、
    患者の癌を治療する医薬品を製剤化するためのCXCR4アンタゴニストの使用。
  30. 【請求項３０】 患者において造血細胞増幅の速度を促進することによる、
    患者の自己免疫疾患を治療する医薬品を製剤化するためのCXCR4アンタゴニスト
    の使用。
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