JP2003530090A

JP2003530090A - ヒトｃｈｋ１遺伝子のアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびその用途

Info

Publication number: JP2003530090A
Application number: JP2001567321A
Authority: JP
Inventors: ルオ，ヤン; ジランダ，ビンセント・エル; ロツクオウ−マグノーン，シヤイナ・ケイ
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 2000-03-10
Filing date: 2001-03-02
Publication date: 2003-10-14
Also published as: EP1259603A2; WO2001068837A3; CA2402041A1; US6211164B1; MXPA02008845A; WO2001068837A2

Abstract

(57)【要約】本発明は、ヒトＣｈｋ１遺伝子のアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびその用途に関する。ヒトＣｈｋ１遺伝子は、ＤＮＡ損傷に応答して活性化される主要なＧ２／Ｍチェックポイント遺伝子である。特に、該遺伝子は、該抑制性シグナルをＤＮＡ損傷センサーから基礎細胞周期装置に伝達する。したがって、ヒトＣｈｋ１遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用して、例えば該遺伝子を抑制し、それにより、ＤＮＡ損傷剤により誘発されるＧ２停止を妨げることができる。また、そのようなアンチセンスオリゴヌクレオチドは更に腫瘍細胞の感受性を高めて、療法に対してそれを正常細胞より感受性にしうる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（発明の背景）（技術分野）本発明は、ヒトＣｈｋ１遺伝子のアンチセンスオリゴヌクレオチドの構築およ
びその用途に関する。ヒトＣｈｋ１遺伝子は、ＤＮＡ損傷に応答して活性化され
る主要なＧ２／Ｍチェックポイント遺伝子である。特に、該遺伝子は、該抑制性
シグナルをＤＮＡ損傷センサーから基礎細胞周期装置に伝達する。したがって、
ヒトＣｈｋ１遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用して、遺伝
子発現を抑制し、それにより、ＤＮＡ損傷剤により誘発されるＧ２停止を妨げる
ことができる。また、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、腫瘍細胞の感受性を
高めるように作用して、療法に対してそれを正常細胞より感受性にしうる。

【０００２】（背景的情報）多数の癌治療剤は、重篤な細胞ＤＮＡ損傷を誘発することにより細胞死を引き
起こす。そのようなＤＮＡ損傷は、正常な真核細胞内で、１）細胞周期停止、お
よび２）遺伝的忠実性を維持するためのＤＮＡ修復の２つの応答を惹起する。特
に、チェックポイント遺伝子は、ＤＮＡ損傷に応答して活性化される。これらの
チェックポイント遺伝子の遺伝子産物は、抑制性シグナルをＤＮＡ損傷センサー
から基礎細胞周期装置に伝達するシグナル伝達経路を形成し、Ｇ１期およびＧ２
期の両方で細胞周期停止を引き起こす。同時に、ＤＮＡ損傷はまた、ＤＮＡ修復
を促進する転写および産生酵素の活性化を誘発する（Ｐａｕｌｏｖｉｃｈら，Ｃｅｌｌ８８：３１５−３２１（１９９７））。

【０００３】ｐ５３は主要なＧ１期チェックポイント遺伝子である。このタンパク質はＤＮ
Ａ損傷の事象において活性化される（Ｓｈｉｅｈら，Ｃｅｌｌ９１：３２５−
３４（１９９７）；Ｋａｓｔａｎら，ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ５１：
６３０４−１１（１９９１））。それは、ｐ２１のような細胞周期インヒビター
を転写的に活性化し、そしてこれがＧ１サイクリン−Ｃｄｋを抑制して、細胞が
Ｇ１／Ｓ境界を越えるのを妨げる（ｅｌ−Ｄｅｉｒｙら，ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ５４：１１６９−７４（１９９４）；Ｄｕｌｉｃら，Ｃｅｌｌ７
６：１０１３−１０２３（１９９４））。

【０００４】Ｇ２／Ｍ境界においては、***の開始は活性なサイクリンＢ−Ｃｄｃ２キナー
ゼ複合体に依存する（Ｋｉｎｇら，Ｃｅｌｌ７９：５６３−７１（１９９４）
；Ｌｅｗら，ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎｉｏｎｉｎＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙ８：７９５−８０４（１９９６））。Ｗｅｅ１キナーゼおよびＣｄｃ２５Ｃ
ホスファターゼはＣｄｃ２活性を調節する。特に、Ｗｅｅ１はＣｄｃ２をチロシ
ン１５でリン酸化して、Ｃｄｃ２を不活性化する。Ｃｄｃ２５Ｃは、この抑制性
リン酸を除去し、Ｃｄｃ２を活性のまま維持する（Ｎｕｒｓｅら，Ｃｅｌｌ９
１：８６５−７（１９９７））。

【０００５】Ｇ２期中、ＤＮＡ損傷はＣｈｋ１リン酸化および活性化をＡＴＭ依存的に引き
起こす（Ｗａｌｗｏｒｔｈら，Ｓｃｉｅｎｃｅ２７１：３５３−６（１９９６
））。活性なＣｈｋ１はＣｄｃ２５Ｃをセリン２１６でリン酸化し、１４−３−
３タンパク質が該リン酸化Ｃｄｃ２５ｃを細胞の核から輸出する。したがって、
Ｃｄｃ２はチロシン１５におけるリン酸化により抑制され、細胞はＤＮＡ修復の
ためにＧ２で停止する（Ｆｕｒｎａｒｉら，Ｓｃｉｅｎｃｅ２７７：１４９５
−７（１９９７）；Ｆｕｒｎａｒｉら，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙｏｆｔｈｅＣｅｌｌ１０：８３３−４５（１９９９）；Ｓａｎｃｈｅｚら
，Ｓｃｉｅｎｃｅ２７７：１４９７−５０１（１９９７）；Ｐｅｎｇら，Ｓｃｉｅｎｃｅ２７７：１５０１−５（１９９７））。

【０００６】腫瘍の大多数はＧ１チェックポイント装置に欠損を有し、それらの多くはｐ５
３突然変異によるものであることが、しばらく前から公知である（Ｋａｓｔａｎ
ら（１９９１）ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ５１：６３０４−１１）。Ｄ
ＮＡ損傷の事象においては、これらのＧ１チェックポイント欠損腫瘍細胞は主に
、ＤＮＡ修復に関してはＧ２チェックポイントに依存する。Ｇ１チェックポイン
トにおいてＤＮＡを修復できないことは、ＤＮＡ損傷性療法に対して腫瘍細胞が
正常細胞より感受性であるという観察と一致している。この観察を考慮すると、
正常組織に対する毒性は尚も、癌療法における一般的な副作用である。したがっ
て、抗癌薬または放射線療法に対して腫瘍を特異的に感作するための相当な努力
がなされている。

【０００７】１つのそのようなアプローチは、ＤＮＡ損傷に応答したＧ２停止を妨げること
である（Ｐｏｗｅｌｌら，ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ５５：１６４３−
８（１９９５）；Ｙａｏら，ＮａｔｕｒｅＭｅｄｉｃｉｎｅ２：１１４０−
３（１９９６））。Ｇ１チェックポイント欠損腫瘍細胞はＧ２期でＤＮＡを修復
しうるに過ぎないため、Ｃｈｋ１遺伝子の抑制は、ＤＮＡ損傷応答におけるＧ２
停止を妨げ、化学療法／放射線療法に対する感受性を腫瘍細胞内で正常細胞内よ
り顕著に上昇させると予想される。

【０００８】すべての米国特許および刊行物の全体を、参照により本明細書に組み入れるこ
ととする。

【０００９】（発明の概要）本発明は、Ｃｈｋ１タンパク質の発現を抑制する哺乳類Ｃｈｋ１遺伝子の単離
されたアンチセンスヌクレオチド配列に関する。この配列は、配列番号１（オリ
ゴ７）、配列番号２（オリゴ８）、配列番号３（オリゴ９）、配列番号４（オリ
ゴ１４）、またはこれらの配列の１つの相補体に特異的にハイブリダイズするそ
れらの断片により代表されうる。該配列はまた、配列番号１、配列番号２、配列
番号３または配列番号４に対して少なくとも４０％の同一性を有しうる。あるい
は、それは、それらの断片であって、配列番号１、配列番号２、配列番号３また
は配列番号４に対して少なくとも４０％の同一性を有する配列に対して４０％の
同一性を有する配列の相補体にハイブリダイズするものでありうる。

【００１０】さらに、本方法は、細胞によるＣｈｋ１タンパク質の発現を妨げる方法であっ
て、前記ヌクレオチド配列またはそれらの断片の少なくとも１つを含むベクター
を該細胞内に導入する工程を含んでなる方法を含む。

【００１１】さらに、本発明はまた、細胞によるＣｈｋ１タンパク質の発現を妨げる方法で
あって、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４よりなる群から選ば
れるヌクレオチド配列に対して少なくとも４０％の同一性を有する単離されたヌ
クレオチド配列を及び前記の単離されたヌクレオチド配列の相補体に特異的にハ
イブリダイズするそれらの断片を含むベクターを該細胞内に導入する工程を含ん
でなる方法を含む。

【００１２】本発明はまた、細胞によるＣｈｋ１タンパク質の発現を抑制する能力に関して
化合物を選択する方法であって、関心のある化合物を該細胞にさらし、該細胞に
よるＣｈｋ１タンパク質の発現を測定する工程を含んでなり、Ｃｈｋ１タンパク
質の発現の欠如が、Ｃｈｋ１タンパク質の発現を抑制する能力を有する化合物を
示すことを特徴とする方法を含む。

【００１３】さらに、本発明はまた、Ｃｈｋ１タンパク質の発現を抑制する哺乳類Ｃｈｋ１
遺伝子またはそのホモログの単離されたアンチセンスヌクレオチド配列と医薬上
許容される担体とを含んでなる医薬組成物を含む。

【００１４】本発明はまた、１）配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号４よ
りなる群から選ばれるヌクレオチド配列に対して少なくとも４０％の同一性を有
する単離されたヌクレオチド配列、または２）前記の単離されたヌクレオチド配
列の相補体に特異的にハイブリダイズするその断片と、３）医薬上許容される担
体とを含んでなる医薬組成物を含む。該配列および／またはそれらの断片の２以
上が該組成物中に含まれていてもよい。

【００１５】さらに、本発明は、化学療法を要する患者において化学療法に対する悪性細胞
の感受性を増大する方法であって、前記医薬組成物の有効量を該患者に投与する
工程を含んでなる方法を含む。

【００１６】（図面の簡単な記載）図１は、Ｃｈｋ１タンパク質の半減期を示す。

【００１７】図２は、完全長センスまたはアンチセンスＣｈｋ１ｃＤＮＡを含有するベク
ターでトランスフェクトしたＮＣＩ−Ｈ１２９９細胞におけるＣｈｋ１の発現を
示すウエスタンブロットを示す。Ｃｈｋ１タンパク質の発現は、Ｃｈｋ１センス
ｃＤＮＡでトランスフェクトした場合には、内因性レベルの２倍であった。完全
長Ｃｈｋ１アンチセンスｃＤＮＡの発現は、内因性Ｃｈｋ１発現の約５０〜７０
％を阻止した。

【００１８】図３は、Ｃｈｋ１アンチセンスｃＤＮＡを発現するベクターでのトランスフェ
クションの結果としてＣｈｋ１発現が阻止された場合に死亡した細胞の割合（％
）を示す。Ｃｈｋ１センスｃＤＮＡの発現は、該トランスフェクト化細胞を細胞
死から中等度に防御した。

【００１９】図４は、設計したアンチセンスＣｈｋ１オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配
列を表す。

【００２０】図５は、アンチセンスオリゴヌクレオチド１（配列番号５）、２（配列番号６
）、３（配列番号７）、４（配列番号８）、５（配列番号９）、６（配列番号１
０）、７（配列番号１）、８（配列番号２）、９（配列番号３）、１０（配列番
号１１）、１１（配列番号１２）、１２（配列番号１３）、１３（配列番号１４
）および１４（配列番号４）でトランスフェクトした細胞におけるＣｈｋ１発現
のレベルを示す。オリゴヌクレオチド７、８、９および１４でトランスフェクト
した細胞においては、Ｃｈｋ１の発現は有意に阻止された。

【００２１】図６は、ＤＮＡ損傷試薬により誘発されるＧ２停止から逃れた細胞の割合（％
）を示す。完全長Ｃｈｋ１アンチセンスｃＤＮＡでトランスフェクトした細胞の
ほうが、ベクターでトランスフェクトした細胞の場合よりも、Ｇ２停止を逃れる
割合が高かった

【００２２】図７は、アドリアマイシンおよびＣｈｋ１完全長アンチセンスｃＤＮＡトラン
スフェクションにより誘発された細胞死の割合（％）を示す。アドリアマイシン
により引き起こされた細胞死は、Ｃｈｋ１完全長アンチセンスｃＤＮＡトランス
フェクションにより誘発された細胞死に対して付加的なものである。

【００２３】図８は、該Ｃｈｋ１遺伝子の完全なＤＮＡおよびペプチド配列を示す。

【００２４】（発明の詳細な記載）本発明は、いくつかの目的（例えば治療目的を含む）に使用されうるＣｈｋ１
の新規アンチセンスオリゴヌクレオチドの設計に関する。特に、そのようなオリ
ゴヌクレオチドを使用して、Ｃｈｋ１タンパク質の発現を抑制し、それにより、
腫瘍細胞における特異的欠損を増強し、放射線または化学療法に対して、それら
の細胞を正常細胞より感受性にするために使用することができる。

【００２５】Ｃｈｋ１のアンチセンスオリゴヌクレオチド該Ｃｈｋ１遺伝子の、設計したアンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオチ
ド配列を、図４に示す。本発明は、これらの配列、それらの断片、該配列および
断片の相補体、ならびに図４中のヌクレオチドの少なくとも約４０％、好ましく
は少なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも約７０％に対応する（すなわ
ち、それらに対する同一性を有する）または相補的な配列を含む。さらに、本発
明はまた、これらの配列の断片および相補体をも含む。

【００２６】本発明の目的においては、ヌクレオチド配列の「断片」は、特定されているヌ
クレオチド配列の領域に対応する少なくとも約６、好ましくは少なくとも約８、
より好ましくは少なくとも約１０〜１２ヌクレオチド、より一層好ましくは少な
くとも約１５〜１８ヌクレオチドの連続的な配列と定義される。

【００２７】さらに、本発明の目的においては、「相補体」は、塩基対律に基づいて所与配
列と対（ペア）を形成する配列と定義される。例えば、一方のヌクレオチド鎖内
の配列Ａ−Ｇ−Ｔは、他方の鎖内のＴ−Ｃ−Ａに「相補的」である。

【００２８】配列同一性または同一性（％）は、２つの整列された配列間の厳密なマッチの
数を、短い方の配列の長さで割り、１００を掛けたものである。核酸配列のおよ
そのアライメントは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ，ＡｄｖａｎｃｅｓｉｎＡｐｐｌｉｅｄＭａｔｈｅｍａｔｉｃｓ２：４８２−４８９（１９８
１）のローカルホモロジーアルゴリズムにより与えられる。このアルゴリズムは
、Ｄａｙｈｏｆｆ，ＡｔｌａｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎＳｅｑｕｅｎｃｅｓａｎｄＳｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ編，５ｓｕｐｐｌ．３
：３５３−３５８，ＮａｔｉｏｎａｌＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃ
ｈＦｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，ＵＳＡにより作
製されＧｒｉｂｓｋｏｖ，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１４（６）：６７
４５−６７６３（１９８６）により標準化されたスコアリング・マトリックスを
使用してペプチドまたはタンパク質配列での使用に拡張されうる。核酸およびペ
プチド配列に関するこのアルゴリズムの導入は、ＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐｕ
ｔｅｒＧｒｏｕｐ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）により、それらのＢｅｓｔＦｉｔ
ユーティリティアプリケーションにおいて行われる。この方法のためのデフォル
トパラメーターは、ＷｉｓｃｏｎｓｉｎＳｅｑｕｅｎｃｅＡｎａｌｙｓｉｓ
ＰａｃｋａｇｅＰｒｏｇｒａｍＭａｎｕａｌ，Ｖｅｒｓｉｏｎ８（１９
９５）（ＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐｕｔｅｒＧｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，
ＷＩから入手可能）に記載されている。配列間の同一性または類似性の割合（％
）を計算するための他の同等に適したプログラムが、当技術分野において一般に
公知である。

【００２９】該アンチセンスオリゴヌクレオチドに関連した配列は、非ヒト（例えば、細菌
、ウイルス、哺乳類など）に由来するものであってもよく、同様に本発明に含ま
れる。前記配列の機能的等価体（すなわち、該Ｃｈｋ１遺伝子の部分的または完
全な発現を抑制する能力を有する配列）、特に、非哺乳類種中に存在するＣｈｋ
１遺伝子の等価的領域にハイブリダイズする能力を有する配列も、本発明に含ま
れる。より詳しくは、そのような等価体は、該Ｃｈｋ１ヌクレオチド配列のＣｈ
ｋ１タンパク質コード領域にハイブリダイズする能力を有する。

【００３０】核酸分子が別の核酸分子に「ハイブリダイズ可能」なのは、該核酸分子の一本
鎖形態が、適当な温度およびイオン強度条件下、その相手の核酸分子にアニール
しうる場合である（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，“ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎ
ｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，第２版（１９８９），Ｃｏｌｄ
ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ
ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ）。温度およびイオン強度の
条件は、該ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する。「ハイブ
リダイゼーション」は、２つの核酸配列が相補的配列を含有することを要する。
しかし、該ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに応じて、塩基間のミ
スマッチが生じうる。核酸をハイブリダイズさせるための適当なストリンジェン
シーは、該核酸の長さおよび相補性の度合に左右される。そのような変数は当技
術分野で良く知られている。より詳しくは、２つのヌクレオチド配列間の類似性
または相同性の度合が大きくなればなるほど、それらの配列を有する核酸のハイ
ブリッドのＴｍの値は大きくなる。１００ヌクレオチド長を超えるハイブリッド
では、Ｔｍを計算するための式を導き出すことができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，
前掲を参照されたい）。より短い核酸とのハイブリダイゼーションの場合には、
ミスマッチの位置がより重要となり、該オリゴヌクレオチドの長さがその特異性
を決定する（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前掲を参照されたい）。

【００３１】また、本発明は、図４に示すヌクレオチド配列に対応する翻訳されたアミノ酸
配列にコードされる精製されたポリペプチドを含む。本発明はまた、図４中に存
在するヌクレオチド配列の翻訳から生じるアミノ酸配列に対して少なくとも約６
０％のアミノ酸類似性、好ましくは少なくとも約７０％のアミノ酸類似性、より
好ましくは少なくとも約８０％のアミノ酸類似性を有するアミノ酸配列を有する
ペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質、またはそれらの断片を含む。本発
明はまた、前記の翻訳されたヌクレオチド配列にコードされるこれらのアミノ酸
配列により表される精製されたペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を含む
。本発明の目的においては、「類似性」は、適当な位置における２以上のポリペ
プチドの厳密なアミノ酸対アミノ酸の比較として定められ、この場合、アミノ酸
は同一であるか、または類似した化学的および／または物理的特性（例えば、電
荷または疎水性）を有する。「類似性（％）」は、当技術分野で公知のプログラ
ムを使用して、比較するポリペプチド配列の間で計算することができる（前記を
参照されたい）。

【００３２】宿主細胞内への配列のトランスフェクションＣｈｋ１のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはそれらの断片の１以上は、
１以上のトランスフェクション試薬を使用して原核性または真核性宿主細胞内に
導入して、該宿主細胞内でのＣｈｋ１タンパク質の発現を阻止することができる
。

【００３３】該トランスフェクション試薬またはベクター、例えば、バクテリオファージ、
コスミドまたはプラスミドは、完全長Ｃｈｋ１センスまたはアンチセンスｃＤＮ
Ａと、該ヌクレオチド配列にコードされるペプチドまたはタンパク質の発現を惹
起しうる該宿主細胞内で機能的な任意のプロモーターとを含みうる。該プロモー
ターは、該ヌクレオチド配列に、機能しうる様態で結合している又は機能しうる
様態で連結している（プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を及ぼ
す場合、該プロモーターは該コード配列に「機能しうる様態で連結」していると
称される）。適当なプロモーターは、例えば、哺乳類細胞内での発現には、ＣＭ
Ｖに基づくプロモーター（テトラサイクリンにより調節されるＣＭＶプロモータ
ーを含むが、これに限定されるものではない）、エクジソン応答性プロモーター
および５’ＬＴＲ、酵母内での発現には、ＧＬ４（ガラクトース誘導性）および
ＡＤＨ１、そして細菌内での発現には、Ｔ７、Ｔ３、Ｓｐ６およびＬａｃを含む
。

【００３４】また、他のヌクレオチド配列、他の調節配列、例えば、***後に該ベクターを
該細胞内に維持する複製起点、および／または抗生物質耐性を付与する抗生物質
耐性遺伝子（例えば、アンピシリン耐性遺伝子）も、該ベクター内に含まれうる
。該構築物またはベクター内に存在する配列の選択は、所望の発現産物に及び該
宿主細胞の性質に左右される。

【００３５】該ベクターを構築したら、ついでそれを、例えばトランスフェクション、形質
転換およびエレクトロポレーションを含む当業者に公知の方法により（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，第２
版，Ｖｏｌ．１−３，Ｓａｍｂｒｏｏｋら編，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒ
ｂｏｒＰｒｅｓｓ（１９８９）を参照されたい）、選択した宿主細胞（例えば
、真核性または原核性細胞）内に導入することができる。真核性宿主細胞の適当
な具体例には、例えば、哺乳類細胞（例えば、ヒト、ラットおよびマウス細胞）
および酵母細胞が含まれる。ヒト細胞には、例えば、初代細胞（例えば、繊維芽
細胞）、不死化細胞系（例えば、１８４Ｂ５）、および腫瘍細胞系（例えば、Ｎ
ＣＩ−Ｈ１２９９、Ｈｅｌａ細胞、ＨＣＴ１１６、ＭＣＦ７、ＰＣ−３、Ａ４３
１およびＳＷ６８４）が含まれる。ラット細胞には、例えば、初代細胞、不死化
細胞系および腫瘍細胞系（例えば、Ｍａｔｌｙｌｕ）が含まれる。マウス細胞に
は、例えば、初代細胞、不死化細胞系（例えば、ＮＩＨ３Ｔ３）が含まれる。適
当な酵母細胞には、例えば、サッカロミセス種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ｓｐｐ．）（例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
））およびカンジダ種（Ｃａｎｄｉｄａｓｐｐ．）（カンジダ・アルビカンス
（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ））が含まれる。

【００３６】宿主細胞内での発現は、一過性または安定な様態で達成されうる。一過性発現
は、該宿主細胞内で機能的な発現シグナルを含有する導入された構築物から生じ
うるが、該構築物は該宿主細胞内で複製されず、めったに組込まれないか、また
は該宿主細胞は増殖性ではない。また、一過性発現は、関心のある遺伝子に機能
しうる様態で連結した調節可能なプロモーターの活性を誘導することにより達成
されうるが、そのような誘導可能な系は、低い基礎発現レベルしか示さないこと
が多い。適当な発現は、宿主ゲノム内に組込まれうる又は宿主細胞内で自律的に
複製される構築物の導入により達成されうる。関心のある遺伝子産物の安定発現
は、該発現構築物上に位置する又は該発現構築物でトランスフェクトされた選択
マーカーの使用およびそれに続く該マーカーを発現する細胞の選択により、選択
することができる。安定発現が組込みから生じる場合、該構築物の組込みの部位
は、該宿主ゲノム内でランダムに生じたり、あるいは宿主遺伝子座との組換えを
標的化するのに十分な宿主ゲノムとの相同性の領域を含有する構築物の使用によ
り標的化されうる。構築物を内在性遺伝子座に標的化する場合には、該転写およ
び翻訳調節領域の全部または一部は、該内在性遺伝子座により与えられうる。

【００３７】Ｃｈｋ１のアンチセンスオリゴヌクレオチドの用途本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの用途は多種多様である。例えば、
前記のとおり、該オリゴヌクレオチドを宿主細胞内に導入して、Ｃｈｋ１タンパ
ク質をコードするヌクレオチド配列の翻訳を阻止し、それにより腫瘍または悪性
細胞内の欠損を増強し、腫瘍細胞の特異的な殺傷を引き起こすことができる。

【００３８】特に、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその断片は、Ｃｈｋ１
タンパク質の翻訳を抑制する医薬としても使用することができる。したがって、
該アンチセンスオリゴヌクレオチドの１以上を含む医薬は、該タンパク質の産生
を抑制し、それにより化学療法または放射線療法中の細胞のＧ２停止を妨げるで
あろう。ほとんどの化学療法試薬または放射線療法はＤＮＡ損傷を誘発する。通
常、ＤＮＡを修復するために、細胞はＧ１およびＧ２期の両方で停止する（Ｎｕ
ｒｓｅら，（１９９７）Ｃｅｌｌ９１：８６５−７）。腫瘍の大多数はＧ１チ
ェックポイントに何らかの欠損を有する。実際のところ、腫瘍細胞の約５０％は
ｐ５３機能を欠損している。他の腫瘍は他のＧ１チェックポイント遺伝子の欠損
を有する。したがって、Ｇ２停止は、腫瘍細胞がＤＮＡを修復するための唯一の
機会である。Ｃｈｋ１タンパク質発現の抑制は、Ｇ２チェックポイントの欠損を
誘発するであろう。したがって、このメカニズムは、正常細胞に対してよりも腫
瘍または悪性細胞に対して顕著な影響を及ぼし、それにより、療法（例えば、化
学療法および放射線）に対して、それらを正常細胞より感受性する。その結果、
腫瘍細胞の特異的殺傷が生じ、それにより患者の健常細胞の生存性が維持され、
より良好な成果が得られる。したがって、このようにして治療ウィンドウを増加
させることも可能である。

【００３９】該医薬組成物は、該アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその断片の１以上
と、標準的な良く知られた無毒性の医薬上許容される担体、補助剤またはビヒク
ル、例えばリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、水、エタノール、多価アルコール、植
物油、湿潤剤またはエマルション、例えば水／油エマルションとを含みうる。該
組成物は、液体または固体形態でありうる。例えば、該組成物は、錠剤、カプセ
ル剤または注射剤の形態でありうる。該組成物および該形態の投与量は、当業者
により容易に決定されうる。

【００４０】また、本発明の単離されたヌクレオチド配列および配列同一性に関する前記関
連配列は、プライマーおよびプローブを作製するために使用することができる。
該プローブは、試験サンプル中の核酸を検出するために使用することができ、該
プライマーは、増幅目的に使用することができる。

【００４１】アッセイにおける最適化のためのそのようなプローブの設計は、当業者の知識
の範囲内に十分に含まれる。一般に、最大特異性を得たい場合には、核酸プロー
ブは非保存領域から作製する。例えば関連種における又は多遺伝子ファミリーの
異なるメンバーに密接に関連したヌクレオチド領域に関してアッセイする場合に
は、核酸プローブは保存領域から作製する。

【００４２】本発明のプローブ（ヌクレオチド配列）は、例えば、本発明のものと関連した
他のアンチセンスオリゴヌクレオチドを見出すために使用することができる。し
たがって、該プローブは、後に例えば治療用途に使用されうるＣｈｋ１ヌクレオ
チド配列の一部にハイブリダイズするであろう。

【００４３】本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応
（ＰＣＲ）において使用するためのプライマーも作製することができる（米国特
許第４，６８３，１９５号および米国特許第４，６８３，２０２号を参照された
い）。ＰＣＲは、核酸またはその混合物中に含まれる所望の核酸配列を増幅する
ための技術である。標的核酸を鋳型として使用して、該プライマーはそれぞれ、
ポリメラーゼにより伸長される。該伸長産物は、元の標的鎖から解離した後、標
的配列となる。ついで新たなプライマーをハイブリダイズさせ、ポリメラーゼに
より伸長させ、該サイクルを繰返して標的配列分子数を増加させる。

【００４４】本発明はまた、本発明のＣｈｋ１アンチセンスオリゴヌクレオチドに対して少
なくとも４０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも９０
％の同一性を有する核酸配列を含有するポリヌクレオチドを有するベクターをト
ランスフェクトすることにより、哺乳類細胞によるＣｈｋ１発現を阻止すること
を含む方法を含む。

【００４５】本発明は、以下の非限定的な実施例を用いて例示することができる。

【００４６】実施例Ｉ完全長Ｃｈｋ１アンチセンスｃＤＮＡを発現するベクターを使用する哺乳類細胞内でのＣｈｋ１発現の阻止完全長Ｃｈｋ１センスｃＤＮＡ（図８を参照されたい）およびアンチセンスｃ
ＤＮＡのコード領域をｐＣＭＶ５またはｐＣＭＶ４ベクター（Ｄｅｐａｒｔｍｅ
ｎｔｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
ｏｆＴｅｘａｓＳｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎＭｅｄｉｃａｌＣｅｎｔｅｒ
，Ｄａｌｌｓ，Ｔｅｘａｓ）内にクローニングした。ｐＣＭＶ１およびｐＣＭＶ
４の構築は、Ａｎｄｅｒｓｏｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：８２２
２−９（１９８８）に記載されている。ｐＣＭＶ５を作製するために、ＳＶ４０
起点に最も近いＨｐａＩおよびＥｃｏＩ制限部位間のＤＮＡのセグメントを、ｐ
ＣＭＶ１から欠失させた。該ｐＣＭＶ５ベクターは、哺乳類細胞内で該下流遺伝
子を発現するＣＭＶプロモーターを含有する。配列決定によりクローンを確認し
た。

【００４７】短い半減期を有するタンパク質の発現レベルは、一過性トランスフェクション
実験では減少する可能性が高いため、Ｃｈｋ１タンパク質の半減期を測定し、そ
れは３〜５時間であることを確認した（図１）。Ｃｈｋ１アンチセンスｃＤＮＡ
の効果を調べるために、一過性トランスフェクション実験を行った。特に、１０
％ウシ胎仔血清、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１ｍＭＮ−［２−ヒドロ
キシエチル］ピペラジン−Ｎ’−［２−エタンスルホン酸］（ＨＥＰＥＳ）、１
ｍＭグルタミンおよび４ｇ／Ｌグルコースで補足したＲｏｓｗｅｌｌＰａ
ｒｋＭｅｍｏｒｉａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅ１６４０（ＲＰＭＩ１６４０
培地）（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍ
Ｄ）中、ＮＣＩ−Ｈ１２９９細胞（ＡＴＣＣ，ＣａｔａｌｏｇｕｅＮｕｍｂｅ
ｒＣＲＬ−５８０３）を３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気中で増殖させた。ついで
該細胞を、トランスフェクションの前日に１０ｃｍ組織培養プレート上にプレー
ティングした。該細胞は、トランスフェクションの時点で８０％コンフルエン
トであった。トランスフェクションは、該販売業者の指示（ＬｉｆｅＴｅｃｎ
ｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）に従い行った。特に、１．
５μｇ／ｍｌの適当なＤＮＡを、７５０μｌの無血清ＲＰＭＩ１６４０倍地（
溶液Ｉ）（ＬｉｆｅＴｅｃｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍ
Ｄ，ＣａｔａｌｏｇｕｅＮｕｍｂｅｒ１０９６４−０１３）中、リポフェク
タミン＋試薬と混合し、室温で１５分間インキュベートした。ついで溶液Ｉを、
７５０μｌの無血清ＲＰＭＩ１６４０培地（溶液ＩＩ）中にリポフェクタミン
試薬を含有する混合物に加え、混合し、室温で更に１５分間インキュベートして
、ＤＮＡ複合体を形成させた。最後の１５分間のインキュベーションの後、トラ
ンスフェクトされるべきＮＣＩ−Ｈ１２９９細胞をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）
で１回洗浄し、３．５ｍｌの無血清培地を各１０ｃｍディッシュに加えた。つい
で溶液Ｉおよび溶液ＩＩの混合物（トランスフェクション混合物）を、１０ｃｍ
組織培養皿に既に加えられた３．５ｍｌの無血清ＲＰＭＩ１６４０に滴下した
。該細胞を３７℃で４時間インキュベートした。４時間のインキュベーションの
後、該トランスフェクション混合物を該細胞から吸引した。ついで該細胞を無血
清培地で１回洗浄し、ＲＰＭＩ１６４０培地（１０％ウシ胎仔血清、１ｍＭ
ピルビン酸ナトリウム、１ｍＭＨＥＰＥＳ、１ｍＭグルタミンおよび４ｇ
／Ｌグルコースを含有する）を、該トランスフェクト化ＮＣＩ０Ｈ１２９９細
胞を含有する組織培養に加えた。トランスフェクションの２４時間後、該細胞を
回収し、ウエスタンブロット分析に付して、Ｃｈｋ１のタンパク質レベルの減少
に基づきアンチセンス活性を評価した。

【００４８】ウエスタンブロット分析は、Ｃｈｋ１センスｃＤＮＡの発現が、該内因性レベ
ルと比較して約２倍のＣｈｋ１発現をもたらすことを示した。これとは対照的に
、完全長Ｃｈｋ１アンチセンスｃＤＮＡは内因性Ｃｈｋ１発現の約５０〜７０％
を阻止した（図２を参照されたい）。

【００４９】通常、Δ−Ｃｈｋ１対立遺伝子を有するエス・ポンベ（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）細胞
は、それらがｗｅｅＩ−５０Δ−ｍｉｋＩバックグラウンドにおけるガンマ照射
誘発性有糸***遅延において欠損している場合を除き生存可能である。Ｃｈｋ１
アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは対照オリゴヌクレオチドでトランスフェ
クトした細胞のアポトーシス率を調べた。特に、トランスフェクションの２４時
間後、該細胞をトリプシン処理により回収し、ＰＢＳで洗浄し、２μｇ／ｍｌ
４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）色素（Ｓｉｇｍａ
，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，Ｃａｔａ．ＮｕｍｂｅｒＤ−８４１７）で染色し
た。該アポトーシス細胞を、染色体凝縮および断片化に基づき評価した。各デー
タ点に関して、少なくとも６００個の細胞を調べた。

【００５０】Ｃｈｋ１タンパク質レベルの減少の結果として、ＮＣＩ−Ｈ１２９９細胞にお
ける細胞死が観察された。これに対して、Ｃｈｋ１タンパク質発現における２倍
の増加を示す細胞は、Ｃｈｋ１ｃＤＮＡ発現のため、細胞死から中等度に防御
された（図３を参照されたい）。Ｈｅｌａ細胞においても、同じ結果が観察され
た（データは示されていない）。

【００５１】実施例ＩＩアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用による哺乳類細胞におけるＣｈｋ１発現の阻止Ｃｈｋ１のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、それらが、各末端において５
個の２−Ｏ−メチル置換ヌクレオチドに隣接する９個のホスホチオール置換ヌク
レオチドのコアを有する１９ヌクレオチドからなるように設計した。該オリゴヌ
クレオチドの配列を図４に示す。特に、アンチセンスオリゴヌクレオチド７、８
、９および１０は、ＡＴＧ開始コドン周囲のＣｈｋ１ヌクレオチド配列の領域に
ハイブリダイズするように設計した。アンチセンスオリゴヌクレオチド１１、１
２、１３および１４は、ＧＧＧＡ配列を含有するコード領域の異なる部位にハイ
ブリダイズするように設計した。

【００５２】トランスフェクションの前日、ＮＣＩ−Ｈ１２９９細胞を１０ｃｍ組織培養プ
レート上に１．３×１０^６／皿の密度で播いた。アンチセンスオリゴヌクレオチ
ドのトランスフェクションの当日、ＮＣＩ−Ｈ１２９９細胞の密度は２．６×１
０^６または８０％のコンフルエント／１０ｃｍ皿に達した。１μＭの適当なＣｈ
ｋ１アンチセンスオリゴヌクレオチドを４μｇ／ｍｌのサイトフェクチン（ｃｙ
ｔｏｆｅｃｔｉｎ）ＧＳＶトランスフェクション試薬（ＧｌｅｎＲｅｓｅａｒ
ｃｈ，Ｓｔｅｒｌｉｌｎｇ，ＶＡ，ＣａｔａｌｏｇｕｅＮｕｍｂｅｒＧ８１
０５０２）と共に室温で１５分間コインキュベートした。ついで該ＤＮＡ複合体
溶液を、既に記載されているとおりに（Ｗａｇｎｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ３７２
：３３３−５（１９９４））、該細胞に滴下した。トランスフェクションの２４
時間後、ＮＣＩ−Ｈ１２９９細胞を回収し、ウエスタンブロット分析に付して、
Ｃｈｋ１のタンパク質レベルの減少に基づきアンチセンス活性を評価した。

【００５３】アンチセンスオリゴヌクレオチド７、８、９および１４は、Ｃｈｋ１タンパク
質発現を約５０％減少させた。さらに、Ｃｈｋ１完全長アンチセンスｃＤＮＡは
Ｃｈｋ１発現を阻止し、Ｃｈｋ１タンパク質レベルの減少は細胞死を引き起こし
たため、Ｃｈｋ１アンチセンスオリゴヌクレオチド７、８、９および１４は細胞
死をも誘発しうる。

【００５４】実施例ＩＩＩアドリアマイシンに対するトランスフェクト化細胞の応答ＤＮＡが損傷されると、Ｃｈｋ１がリン酸化され活性化されることが示されて
いる（Ｗａｌｗｏｒｔｈら，Ｓｃｉｅｎｃｅ２７１：３５３−５６（１９９６
））。Ｃｈｋ１がリン酸化され、Ｃｄｃ２活性化に必要なＣｄｃ２５Ｃを不活性
化すると仮定して、Ｃｈｋ１は哺乳類細胞における該ＤＮＡ損傷応答に関与する
と考えられている（ＤＮＡ損傷試薬により誘発されるＧ２停止にはエス・ポンベ
（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）Ｃｈｋ１が必要である）。

【００５５】この実験においては、トランスフェクト化細胞に対するアドリアマイシンの効
果を調べた。アドリアマイシンの効果が適切に観察されるよう該トランスフェク
ト化細胞の細胞死の度合を減少させるために、以下の実験では、より穏やかなト
ランスフェクション試薬であるＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｌｉｆ
ｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ），Ｃａｔ．
Ｎｕｍｂｅｒ１１６６８−０１９）を使用した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ
２０００トランスフェクション試薬の使用の結果、トランスフェクション効率
が約１０％減少した。しかし、該トランスフェクト化細胞は、トランスフェクシ
ョンの２４時間後、リポフェクタミン＋トランスフェクト化細胞と比較して、ア
ドリアマイシンおよびエトポシド処理に対してはるかに良く応答した（データは
示していない）。特に、トランスフェクションの２４時間後、ＮＣＩ−Ｈ１２９
９細胞を３００ｎｇ／ｍｌのアドリアマイシンで処理した。アドリアマイシンに
さらして８時間後、アドリアマイシンにより誘発されたＧ２停止を逃れた細胞を
捕捉するために、４０ｎｇ／ｍｌのノコダゾールを該トランスフェクト化細胞に
加えた。該ノコダゾール処理の１６時間後、細胞をトリプシン処理により回収し
た。ついで該細胞をＰＢＳで洗浄し、７５μＭＫＣｌを含有する低張バッファ
ーで膨張させ、販売業者（ＤａｄｅＢｅｈｒｉｎｇ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗａｒｋ
，ＤＥ，Ｃａｔ．ＮｕｍｂｅｒＢ４１３２−２）の指示に従い準備したＤｉｆ
ｆ−ｑｗｉｋを使用して染色した。***細胞を染色体凝縮および核膜の消失に基
づき評価した。各データ点に関して、少なくとも６００個の細胞を計数した。

【００５６】Ｃｈｋ１アンチセンスｃＤＮＡでトランスフェクトした細胞の***指数は、ベ
クター対照またはＣｈｋ１センスｃＤＮＡでトランスフェクトした細胞のものよ
り、はるかに高かった（図６）。これは、該ベクターでトランスフェクトした細
胞より多数のアンチセンストランスフェクト体が、停止することなくＧ２／Ｍ境
界を超えて進行することを示した。したがって、Ｃｈｋ１タンパク質レベルの減
少は、該損傷応答中にＧ２停止の欠損を引き起こした。

【００５７】該アンチセンスオリゴヌクレオチドでトランスフェクトした細胞は、前記の完
全長アンチセンスＣｈｋ１ｃＤＮＡでトランスフェクトした細胞と同様の表現
型を示すと予想される。

【００５８】実施例ＩＶアドリアマイシンでの処理に際するＣｈｋ１センスおよびアンチセンスｃＤＮＡでトランスフェクトした細胞のアポトーシス率アドリアマイシンで処理した完全長センスまたはアンチセンスＣｈｋ１ｃＤ
ＮＡでトランスフェクトした細胞のアポトーシス率を調べた。特に、トランスフ
ェクションの２４時間後、該トランスフェクト化ＮＣＩ−Ｈ１２９９細胞を６０
０ｎｇ／ｍｌのアドリアマイシンで４８時間にわたり処理した。ついで該細胞を
トリプシン処理により収穫し、ＰＢＳで１回洗浄し、２μｇ／ｍｌＤＡＰＩで
染色した。ついで該アポトーシス細胞を、染色体凝縮および断片化に基づき評価
した。特に、各データ点に関して、少なくとも６００個の細胞を調べた。

【００５９】Ｃｈｋ１アンチセンスｃＤＮＡの殺傷効果に加えて、アドリアマイシンは腫瘍
細胞を殺した。アドリアマイシンとＣｈｋ１アンチセンスｃＤＮＡとの間の相乗
作用は、あったとしても弱い（図７を参照されたい）（該Ｃｈｋ１アンチセンス
オリゴヌクレオチドに関しても、同じ結果が予想される）。

【００６０】この実験はまた、Ｇ１チェックポイント状態においてのみ異なる１対の細胞系
を使用して行うことができる。そのような細胞系は、正常細胞および腫瘍細胞を
模擬するであろう。なぜなら、ほとんどの腫瘍細胞はＧ１チェックポイントの欠
損を有するからである。そのような実験は、Ｃｈｋ１のインヒビターが、癌療法
で治療されている腫瘍の特異的感受性増加をもたらしうるか否かを明らかにする
であろう。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、Ｃｈｋ１タンパク質の半減期を示す。

【図２】図２は、完全長センスまたはアンチセンスＣｈｋ１ｃＤＮＡを含有するベク
ターでトランスフェクトしたＮＣＩ−Ｈ１２９９細胞におけるＣｈｋ１の発現を
示すウエスタンブロットを示す。

【図３】図３は、Ｃｈｋ１アンチセンスｃＤＮＡを発現するベクターでのトランスフェ
クションの結果としてＣｈｋ１発現が阻止された場合に死亡した細胞の割合（％
）を示す。

【図４】図４は、設計したアンチセンスＣｈｋ１オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配
列を表す。

【図５】図５は、アンチセンスオリゴヌクレオチド１（配列番号５）、２（配列番号６
）、３（配列番号７）、４（配列番号８）、５（配列番号９）、６（配列番号１
０）、７（配列番号１）、８（配列番号２）、９（配列番号３）、１０（配列番
号１１）、１１（配列番号１２）、１２（配列番号１３）、１３（配列番号１４
）および１４（配列番号４）でトランスフェクトした細胞におけるＣｈｋ１発現
のレベルを示す。

【図６】図６は、ＤＮＡ損傷試薬により誘発されるＧ２停止から逃れた細胞の割合（％
）を示す。

【図７】図７は、アドリアマイシンおよびＣｈｋ１完全長アンチセンスｃＤＮＡトラン
スフェクションにより誘発された細胞死の割合（％）を示す。

【図８Ａ】図８Ａは、該Ｃｈｋ１遺伝子の完全なＤＮＡおよびペプチド配列を示す。

【図８Ｂ】図８Ｂは、該Ｃｈｋ１遺伝子の完全なＤＮＡおよびペプチド配列を示す。

【図８Ｃ】図８Ｃは、該Ｃｈｋ１遺伝子の完全なＤＮＡおよびペプチド配列を示す。

【図８Ｄ】図８Ｄは、該Ｃｈｋ１遺伝子の完全なＤＮＡおよびペプチド配列を示す。

【図８Ｅ】図８Ｅは、該Ｃｈｋ１遺伝子の完全なＤＮＡおよびペプチド配列を示す。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ４Ｃ０８７ 1/68 33/50 ＺＧ０１Ｎ 33/15 Ａ６１Ｋ 35/76 33/50 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ // Ａ６１Ｋ 35/76 Ａ６１Ｋ 37/02 (72)発明者ジランダ，ビンセント・エルアメリカ合衆国、イリノイ・60031、ガーニー、サウス・フオーク・ドライブ・272 (72)発明者ロツクオウ−マグノーン，シヤイナ・ケイアメリカ合衆国、イリノイ・60067、パラタイン、ウエスト・イーサンズ・アレン・ドライブ・1532 Ｆターム(参考） 2G045 AA40 BA13 BB20 CB01 CB21 DA12 DA13 DA14 DA36 FB04 4B024 AA01 AA11 CA05 EA04 4B063 QA19 QA20 QQ08 QQ43 QR08 QR42 QR56 QS25 QS34 QX02 4C084 AA02 AA13 BA44 CA62 NA14 ZB261 ZB262 4C086 AA02 AA03 EA16 MA02 MA05 NA14 ZB26 4C087 AA02 BC83 NA14 ZB26

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】Ｃｈｋ１タンパク質の発現を抑制する哺乳類Ｃｈｋ１遺伝子
の単離されたアンチセンスヌクレオチド配列。
【請求項２】配列番号１に対して少なくとも４０％の同一性を有する単離
されたヌクレオチド配列、または前記の単離されたヌクレオチド配列の相補体に
特異的にハイブリダイズする前記の単離されたヌクレオチド配列の断片。
【請求項３】配列番号２に対して少なくとも４０％の同一性を有する単離
されたヌクレオチド配列、または前記の単離されたヌクレオチド配列の相補体に
特異的にハイブリダイズする該配列の断片。
【請求項４】配列番号３に対して少なくとも４０％の同一性を有する単離
されたヌクレオチド配列、または前記の単離されたヌクレオチド配列の相補体に
特異的にハイブリダイズする該配列の断片。
【請求項５】配列番号４で表される配列に対して少なくとも４０％の同一
性を有する単離されたヌクレオチド配列、または前記の単離されたヌクレオチド
配列の相補体に特異的にハイブリダイズする該配列の断片。
【請求項６】細胞によるＣｈｋ１タンパク質の発現を妨げる方法であって
、請求項１記載のヌクレオチド配列を含むベクターを該細胞内に導入する工程を
含んでなる方法。
【請求項７】細胞によるＣｈｋ１タンパク質の発現を妨げる方法であって
、配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号４よりなる群から選ばれ
るヌクレオチド配列に対して少なくとも４０％の同一性を有する単離されたヌク
レオチド配列を又は前記の単離されたヌクレオチド配列の相補体に特異的にハイ
ブリダイズする前記の単離されたヌクレオチド配列の断片を含むベクターを該細
胞内に導入する工程を含んでなる方法。
【請求項８】細胞によるＣｈｋ１タンパク質の発現を抑制する能力に関し
て化合物を選択する方法であって、該細胞を該化合物にさらし、該細胞によるＣ
ｈｋ１タンパク質の発現を測定する工程を含んでなり、Ｃｈｋ１タンパク質の発
現の欠如が、Ｃｈｋ１タンパク質の発現を抑制する能力を有する化合物を示すこ
とを特徴とする方法。
【請求項９】請求項１記載のヌクレオチド配列と医薬上許容される担体と
を含んでなる医薬組成物。
【請求項１０】１）配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号
４よりなる群から選ばれる配列に対して少なくとも４０％の同一性を有する単離
されたヌクレオチド配列、または２）前記の単離されたヌクレオチド配列の相補
体に特異的にハイブリダイズする前記の単離されたヌクレオチド配列の断片と、
３）医薬上許容される担体とを含んでなる医薬組成物。
【請求項１１】化学療法を要する患者において化学療法に対する悪性細胞
の感受性を増大させる方法であって、請求項９または１０の医薬組成物の有効量
を該患者に投与する工程を含んでなる方法。