JP2003529321A - Ｐ−ｈｙｄｅファミリーの単離された核酸、ｐ−ｈｙｄｅタンパク質、及び癌における細胞死の誘導に対する感受性を誘導する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ｐ−Ｈｙｄｅファミリーのｐ−Ｈｙｄｅ遺伝子、その類似体、断片、変異体、及び異型の単離された核酸を提供する。本発明は、ポリペプチド、融合タンパク質、キメラ、融合体、アンチセンス分子、抗体、及びそれらの使用を提供する。また、本発明は、ｐ−Ｈｙｄｅによりアポトーシスに対する感受性を誘導する方法、ｐ−Ｈｙｄｅにより腫瘍の増殖を抑制する方法、及び単独の、もしくは放射線療法もしくはＵＶ模倣薬物と組み合わせられたｐ−Ｈｙｄｅにより癌を有する対象を治療する方法に関する。本発明は、遺伝子治療、タンパク質補充療法、及びタンパク質模倣体を含む、ｐ−Ｈｙｄｅ遺伝子の突然変異を有するヒト癌の療法にも関する。本発明は、癌療法のための薬物のスクリーニングにさらに関する。最後に、本発明は、癌に対する素因を診断するために有用な、突然変異に関するｐ−Ｈｙｄｅ遺伝子のスクリーニングに関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （技術分野） 本発明は、ｐ−Ｈｙｄｅ遺伝子の単離された核酸、ｐ−Ｈｙｄｅファミリーの
タンパク質、それらの類似体、断片、模倣体、変異体、合成物、及び異型を提供
する。本発明は、ｐ−Ｈｙｄｅによりアポトーシスに対する感受性を誘導する方
法、ｐ−Ｈｙｄｅにより腫瘍の増殖を抑制する方法、及び単独の、又は放射線、
化学療法、もしくはＵＶ模倣薬と組み合わせられたｐ−Ｈｙｄｅにより癌を有す
る対象を治療する方法に関する。

【０００２】 （背景技術） 前立腺癌は、米国において、新症例が３１７，０００を越える男性における最
も一般的な悪性疾患であり、男性の癌による死亡の第２の原因である（Ｂｏｒｉ
ｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９３；Ｓｔｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９５）。
前立腺癌の発生、進展、及び転移を担う分子機序については、未だ不明な点が多
い。２０％もの前立腺癌が６５歳未満の男性に起こり（Ｓｉｌｖｅｒｂｅｒｇ，
１９８６）、このことは、前立腺癌の発生が、加齢のみならず、遺伝的な要因と
も関連していることを示唆している（Ｓｉｌｖｅｒｂｅｒｇ，１９８７；ＭｃＬ
ｅｌｌａｎ ａｎｄ Ｎｏｒｍａｎ，１９９５；Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，
１９９２）。６９１の罹患家系の遺伝連鎖研究により、発端者の発症年齢が比較
的低いこと、及び複数の罹患家系メンバーが存在すること、が前立腺癌のリスク
を増加させる重要な決定因子であることが明らかとなった。推定前立腺癌遺伝子
の遺伝パターンは、常染色体優性であり、浸透度は８８％と考えられている（Ｓ
ｔｅｉｎｂｅｒｇ，１９９０）。従って、遺伝的要因は、前立腺癌の発生におい
て重要な役割を果たしている。

【０００３】 多くの癌腫と同様に、前立腺癌の形成は、腫瘍のイニシエーション（ｉｎｉｔ
ｉａｔｉｏｎ）、プロモーション（ｐｒｏｍｏｔｉｏｎ）、コンバージョン（ｃ
ｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）、及びプログレッション（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ）を含
む多段階の過程である（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０；Ｓａｎｄｂｅ
ｒｇ，１９９２）。この過程は、染色体の不安定性、自発的突然変異、及び発癌
物質により誘導される遺伝的及び後成的な変化により推進される。染色体の不安
定性は、染色体の完全又は部分的な増加又は減少、転座、及びその他の異常をも
たらす。自発的機序は、年齢と関係しており、遺伝子の突然変異による癌遺伝子
の活性化又は腫瘍抑制遺伝子の不活化を含む。これらの突然変異は、コーディン
グ領域のＤＮＡ複製中のヌクレオチドの誤取り込み、スプライシング機序に影響
を与えるイントロン−エキソン接合配列の改変、及び重要遺伝子の調節を変化さ
せる制御配列の異常をもたらす。これらの突然変異は、一連のＤＮＡ修復機序、
並びにｐ５３（Ｅｆｆｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｉｓａａｃｓ ｅｔ
ａｌ，１９９１；Ｍｅｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２）及びｐ２１（Ｅｌ−
Ｄｅｉｒｙ ｅｔ ａｌ．，１９９４）及びＰＣＮＡ（Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎ ｅ
ｔ ａｌ．，１９９６）のようなその関連遺伝子産物による遺伝子サーベイラン
スを回避する。発癌物質により誘導される遺伝的及び後成的な変化は、遺伝子発
現を改変する、発癌剤の直接的なＤＮＡ損傷効果の結果として、腫瘍をイニシエ
ートする。腫瘍イニシエーションの後には、腫瘍プロモーションが続き、影響を
受けた細胞が、改変されたシグナル伝達及び増殖因子に対する増殖応答、細胞毒
性に対する抵抗性、並びに終末分化の脱制御を介して、選択的、複製的、かつク
ローン的な増幅能を有するようになる（Ｙｕｓｐａ ａｎｄ Ｐｏｉｒｉｅｒ，
１９９８；Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ，１９８７）。最後に、腫瘍プロモーションが、
ホルモン感度の欠損、細胞死の増加、浸潤、プログラム細胞死の改変、及び転移
をもたらす、その他の遺伝子突然変異イベントにより進行する。従って、癌のイ
ニシエーション及びプログレッションは、遺伝学的改変又は重要遺伝子の突然変
異が、最終的には、細胞の増殖、分化、及びプログラム細胞死を含む多くの重要
な細胞活性に関して異なっている、明確な細胞表現型を指令する、多段階の過程
である。しかしながら、前立腺癌の多段階プログレッションを担う正確な突然変
異イベントは、不明である。前立腺癌を担う分子機序のより詳細な理解は、前立
腺癌に対抗し、おそらくは予防もするための新規な療法をもたらすかもしれない
。

【０００４】 （発明の開示） 本発明は、ｐ−Ｈｙｄｅファミリーのｐ−Ｈｙｄｅ遺伝子をコードする単離さ
れた核酸を提供する。本明細書に示されたようなｐ−Ｈｙｄｅ遺伝子は、（１）
インビボの腫瘍増殖の減退、（２）ＵＶ又は化学療法により誘導されるＤＮＡの
損傷により引き起こされるアポトーシスに対する感受性の誘導、及び（３）ＵＶ
による損傷及びＤＮＡ修復能欠如の結果としてのアポトーシスのアップレギュレ
ーションによるＤＮＡ修復の防止：と関連している。

【０００５】 本発明は、ＤＮＡ修復酵素の阻害剤として作用し、細胞死に対する癌細胞の感
受性を誘導する新規な遺伝子クラスを提供する。また、本発明は、細胞死に対す
る癌細胞の感受性を誘導する哺乳動物ｐ−Ｈｙｄｅタンパク質をコードする単離
された核酸（その対立遺伝子、類似体、断片、模倣体、変異体、合成物、又は異
型を含む）を提供する。本発明は、細胞死に対する癌細胞の感受性を誘導するヒ
トｐ−Ｈｙｄｅタンパク質をコードする単離された核酸（その対立遺伝子、類似
体、断片、模倣体、変異体、合成物、又は異型を含む）を提供する。

【０００６】 本発明において、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７
、又は配列番号：９に示されたようなヌクレオチド配列を有する核酸が提供され
る。

【０００７】 また、本発明には、配列番号：２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、又
は配列番号１０のアミノ酸配列を有するポリペプチドの断片（配列番号：２、配
列番号４、配列番号６、配列番号８、又は配列番号１０の少なくとも１５（２５
、３０、５０、６０、又は６３）個の連続アミノ酸を含む）をコードする核酸分
子が含まれる。

【０００８】 また、本発明には、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：
７、又は配列番号：９に示されたような核酸配列と少なくとも約８２％、８４％
、８５％、８７％、９０％、９２％、９５％、又は９８％同一であるヌクレオチ
ド配列を有する核酸分子が含まれる。

【０００９】 また、本発明には、配列番号：２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、も
しくは配列番号１０、又はそれらの相補配列を含む核酸分子とストリンジェント
な条件下でハイブリダイズする、配列番号：２、配列番号４、配列番号６、配列
番号８、又は配列番号１０のアミノ酸配列を含むポリペプチドの天然に存在する
対立遺伝子異型をコードする核酸分子が含まれる。

【００１０】 また、本発明には、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：
７、又は配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも約８２％、８４％、８５％、８
７％、９０％、９５％、又は９８％同一であるアミノ酸配列を有する、単離され
たｐ−Ｈｙｄｅタンパク質が含まれる。

【００１１】 また、本発明には、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：
７、又は配列番号：９と少なくとも約６５％、好ましくは７５％、８０％、８５
％、又は９５％同一であるヌクレオチド配列を有する核酸分子によりコードされ
る、単離されたｐ−Ｈｙｄｅタンパク質；及び配列番号：１、配列番号：３、配
列番号：５、配列番号：７、もしくは配列番号９、又はそれらの相補配列のヌク
レオチド配列を有する核酸分子とストリンジェントなハイブリダイゼーション条
件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する核酸分子によりコードされ
る、単離されたｐ−Ｈｙｄｅタンパク質：が含まれる。

【００１２】 本発明のｐ−Ｈｙｄｅタンパク質、又は生物学的活性を有するその一部は、非
ｐ−Ｈｙｄｅポリペプチド（例えば、異種アミノ酸配列）と機能的に連結し、ｐ
−Ｈｙｄｅ融合タンパク質を形成していてもよい。

【００１３】 本発明は、Ｐ−Ｈｙｄｅ遺伝子をコードする単離された核酸を含むベクターを
提供する。本発明は、短縮ＲＳＶプロモーターとｐ−Ｈｙｄｅ ｃＤＮＡ遺伝子
とを含有する複製欠損性組換えＥ１／Ｅ３欠失アデノウイルス（ＡｄＲＳＶｐＨ
ｙｄｅ）を提供する。

【００１４】 本発明は、ｐ−Ｈｙｄｅをコードする核酸内に存在するヌクレオチドの配列、
又はｐ−Ｈｙｄｅをコードする核酸と相補的な配列と特異的にハイブリダイズす
ることができる、少なくとも１５ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドを提供する
。本発明は、ｐ−Ｈｙｄｅをコードする単離された核酸と特異的にハイブリダイ
ズすることができるアンチセンス分子、３重鎖オリゴヌクレオチド、又はリボザ
イムを提供する。

【００１５】 本発明は、ポリペプチドの産生を許容する適当な条件下で宿主ベクター系を増
殖させること、及びそのようにして産生されたポリペプチドを回収することを含
む、ポリペプチドを作製するための方法を提供する。１つの実施態様において、
精製された形態でポリペプチドを得る方法は、（ａ）適当な宿主細胞へベクター
を導入すること；（ｂ）ポリペプチドを産生させるため得られた細胞を培養する
こと；（ｃ）工程（ｂ）において産生されたポリペプチドを回収すること；及び
（ｄ）そのようにして回収されたポリペプチドを精製すること：を含む。

【００１６】 本発明は、ｐ−Ｈｙｄｅのアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。本発
明は、ポリペプチドを含む融合タンパク質又はキメラを提供する。本発明は、ポ
リペプチドと特異的に結合する抗体を提供する。本発明は、ある量のポリペプチ
ドと、薬学的に有効な担体又は希釈剤とを含む薬学的組成物を提供する。

【００１７】 本発明は、（ａ）対象から適切な核酸試料を得ること；及び（ｂ）工程（ａ）
からの核酸試料が、変異型ｐ−Ｈｙｄｅをコードする核酸であるか、又はそれに
由来するか否かを決定することにより、対象がｐ−Ｈｙｄｅ遺伝子の突然変異を
保持するか否かを決定すること：を含む、対象がｐ−Ｈｙｄｅ遺伝子の突然変異
を保持するか否かを決定するための方法を提供する。１つの実施態様において、
工程（ａ）における核酸試料は、変異型ｐ−ＨｙｄｅをコードするＤＮＡの転写
物に相当するｍＲＮＡを含み、かつ工程（ｂ）の決定は、（ｉ）ｍＲＮＡとオリ
ゴヌクレオチドとの結合を許容する条件下で、ｍＲＮＡをオリゴヌクレオチドと
接触させ、複合体を形成させること；（ｉｉ）そのようにして形成した複合体を
単離すること；及び（ｉｉｉ）単離された複合体内のｍＲＮＡを同定することに
より、ｍＲＮＡが変異型ｐ−Ｈｙｄｅをコードする核酸であるか、又はそれに由
来するか否かを決定すること：を含む。

【００１８】 本発明は、ヒト対象由来の腫瘍試料を、該腫瘍内のｐ−Ｈｙｄｅ遺伝子の体細
胞性改変についてスクリーニングするための方法であって、該腫瘍試料由来のｐ
−Ｈｙｄｅ遺伝子、該腫瘍由来のｐ−Ｈｙｄｅ ＲＮＡ、及び該腫瘍試料由来の
ｍＲＮＡから作成されたｐ−Ｈｙｄｅ ｃＤＮＡからなる群より選択される第１
の配列を、該対象の非腫瘍試料由来のｐ−Ｈｙｄｅ遺伝子、該非腫瘍試料由来の
ｐ−Ｈｙｄｅ ＲＮＡ、及び該非腫瘍試料由来のｍＲＮＡから作成されたｐ−Ｈ
ｙｄｅ ｃＤＮＡからなる群より選択される第２の配列と比較し、その際、該腫
瘍試料由来のｐ−Ｈｙｄｅ遺伝子、ｐ−Ｈｙｄｅ ＲＮＡ、又はｐ−Ｈｙｄｅ
ｃＤＮＡの配列の、該非腫瘍試料由来のｐ−Ｈｙｄｅ遺伝子、ｐ−Ｈｙｄｅ Ｒ
ＮＡ、又はｐ−Ｈｙｄｅ ｃＤＮＡの配列との差違を、該腫瘍試料内のｐ−Ｈｙ
ｄｅ遺伝子の体細胞性改変の指標とすることを含む方法を提供する。

【００１９】 本発明は、ヒト対象由来の腫瘍試料を、該腫瘍内のｐ−Ｈｙｄｅ遺伝子の体細
胞性改変の存在についてスクリーニングするための方法であって、ポリペプチド
間の差違を分析するため、該対象由来の該腫瘍試料由来のｐ−Ｈｙｄｅポリペプ
チドを、該対象由来の非腫瘍試料由来のｐ−Ｈｙｄｅポリペプチドと比較し、そ
の際、該腫瘍試料由来のｐ−Ｈｙｄｅポリペプチドの、該非腫瘍試料由来のｐ−
Ｈｙｄｅポリペプチドとの差違を、該腫瘍試料内のｐ−Ｈｙｄｅ遺伝子の体細胞
性改変の存在の指標とすることを含む方法であって、該比較が、（ｉ）各試料内
の全長ポリペプチドもしくは短縮ポリペプチドのいずれかを検出すること、又は
（ｉｉ）改変されたｐ−Ｈｙｄｅポリペプチドのエピトープもしくは野生型ｐ−
Ｈｙｄｅポリペプチドのエピトープのいずれかと特異的に結合する抗体を各試料
由来のｐ−Ｈｙｄｅポリペプチドと接触させ、抗体結合を検出すること、により
実施される方法を提供する。

【００２０】 本発明は、（ａ）ｐ−Ｈｙｄｅと化学的化合物との結合を許容する条件下で、
ｐ−Ｈｙｄｅを化学的化合物と接触させること；（ｂ）化学的化合物とｐ−Ｈｙ
ｄｅとの特異的結合を検出すること；及び（ｃ）化学的化合物がｐ−Ｈｙｄｅを
阻害するか否かを決定することにより、細胞死に対する感受性を誘導することが
できる化学的化合物を同定すること：を含む、細胞死に対する感受性を誘導する
ことができる化学的化合物を同定するための方法を提供する。

【００２１】 本発明は、細胞を得る工程、並びにゲノムのＥ１及びＥ３領域に欠失を有し、
かつｐ−Ｈｙｄｅをコードする核酸のラウス肉腫ウイルスプロモーターの調節下
での挿入をその領域内に有するアデノウイルスゲノムを含む複製欠損性アデノウ
イルス５型発現ベクターと、対象の細胞を接触させることにより、前立腺癌細胞
の増殖を阻害する工程を含む、癌細胞の増殖を阻害する方法を提供する。

【００２２】 本発明は、１）対象から前立腺細胞の試料を得ること；２）ゲノムのＥ１及び
Ｅ３領域に欠失を有し、かつｐ−Ｈｙｄｅ ｃＤＮＡのラウス肉腫ウイルスプロ
モーターの調節下での挿入をその領域内に有するアデノウイルスゲノムを含む複
製欠損性アデノウイルス５型発現ベクターと、細胞を接触させること；並びに３
）細胞を対象へ導入することにより、癌細胞の増殖を阻害すること：を含む、癌
細胞の増殖を阻害する方法を提供する。

【００２３】 本発明は、ある量の、ｐ−Ｈｙｄｅタンパク質をコードする核酸、ｐ−Ｈｙｄ
ｅタンパク質の断片をコードする核酸、又は変異型ｐ−Ｈｙｄｅタンパク質をコ
ードする核酸を、癌細胞へ導入することにより、対象における癌細胞の増殖を抑
制することを含む、対象における癌細胞の増殖を抑制する方法を提供する。

【００２４】 本発明は、治療に有効な量の、ｐ−Ｈｙｄｅタンパク質をコードする核酸、ｐ
−Ｈｙｄｅタンパク質の断片をコードする核酸、又は変異型ｐ−Ｈｙｄｅタンパ
ク質をコードする核酸と、薬学的に許容される担体又は希釈剤とを含む薬学的組
成物を対象へ投与することにより、対象における癌細胞の増殖を抑制することを
含む、対象における癌細胞の増殖を抑制する方法を提供する。

【００２５】 本発明は、ある量の、ｐ−Ｈｙｄｅタンパク質をコードする核酸、ｐ−Ｈｙｄ
ｅタンパク質の断片をコードする核酸、又は変異型ｐ−Ｈｙｄｅタンパク質をコ
ードする核酸を、癌細胞へ導入することにより、アポトーシスに対する感受性を
誘導することを含む、対象における癌細胞のアポトーシスに対する感受性を誘導
する方法を提供する。

【００２６】 本発明は、治療に有効な量の、ｐ−Ｈｙｄｅタンパク質をコードする核酸、ｐ
−Ｈｙｄｅタンパク質の断片をコードする核酸、又は変異型ｐ−Ｈｙｄｅタンパ
ク質をコードする核酸と、薬学的に許容される担体又は希釈剤とを含む薬学的組
成物を対象へ投与することにより、アポトーシスに対する感受性を誘導すること
を含む、対象における癌細胞のアポトーシスに対する感受性を誘導する方法を提
供する。

【００２７】 本発明は、治療的に有効な量の、ｐ−Ｈｙｄｅタンパク質をコードする核酸、
ｐ−Ｈｙｄｅタンパク質の断片をコードする核酸、又は変異型ｐ−Ｈｙｄｅタン
パク質をコードする核酸と、薬学的に許容される担体又は希釈剤とを含む薬学的
組成物を対象へ投与することにより、癌を有する対象を治療することを含む、癌
を有する対象を治療する方法を提供する。

【００２８】 本発明は、１）放射線、化学療法、又はＵＶ模倣薬と組み合わせられた、治療
的に有効な量の、ｐ−Ｈｙｄｅタンパク質をコードする核酸、ｐ−Ｈｙｄｅタン
パク質の断片をコードする核酸、又は変異型ｐ−Ｈｙｄｅタンパク質をコードす
る核酸と、２）薬学的に許容される担体又は希釈剤とを含む薬学的組成物を対象
へ投与することにより、癌を有する対象を治療することを含む、癌を有する対象
を治療する方法を提供する。

【００２９】 本発明は、治療に有効な量の、１）ゲノムのＥ１及びＥ３領域に欠失を有し、
かつ全長センスｐ−ＨｙｄｅｃＤＮＡのラウス肉腫ウイルスプロモーターの調節
下での挿入をその領域内に有するアデノウイルスゲノムを含む複製欠損性アデノ
ウイルス５型発現ベクターと、２）適当な担体又は希釈剤とを含む薬学的組成物
を対象へ投与することにより、癌を有する対象を治療することを含む、癌を有す
る対象を治療する方法を提供する。１つの実施態様において、癌は、黒色腫；リ
ンパ腫；白血病；及び前立腺、結腸直腸、膵臓、***、脳、又は胃の癌腫：から
なる群より選択される。

【００３０】 最後に、本発明は、癌細胞へ指向させた遺伝子に基づく療法を作製するために
必要な手段を提供する。これらの治療用薬剤は、ｐ−Ｈｙｄｅタンパク質の機能
が再生されるよう、適切なベクター内に置かれる、又はより直接的に標的細胞へ
輸送される、ｐ−Ｈｙｄｅ遺伝子座の全部又は一部を含むポリヌクレオチドの形
態をとりうる。治療用薬剤は、ｐ−Ｈｙｄｅのタンパク質配列の一部又は全部の
いずれかに基づくポリペプチドの形態もとりうる。これらは、インビボでｐ−Ｈ
ｙｄｅの活性を機能的に補充する。

【００３１】 （発明の実施の形態） 本発明は、ＤＮＡ修復酵素の阻害剤として作用し、細胞死に対する癌細胞の感
受性を誘導する新規な遺伝子クラスを提供する。機能的には、ｐ−Ｈｙｄｅは、
インビボの腫瘍増殖の抑制、及びＵＶ照射又はＦＵｒＤ処置により誘導されるア
ポトーシスに対する感受性の増加と関連している。ＵＶ損傷によるアポトーシス
のアップレギュレーションは、ｐ−Ｈｙｄｅで安定的にトランスフェクトされた
前立腺癌細胞系における完全な光産物の存在と相関している。単独療法として、
又は放射線もしくは化学療法と組み合わせて、ヒト遺伝子治療においてｐ−Ｈｙ
ｄｅを使用することは、癌又は過剰増殖性ヒト疾患に対して有用である。１つの
実施態様において、Ｐ−Ｈｙｄｅのようなタンパク質クラスは、前立腺癌におけ
るヌクレオチド除去修復（ＮＥＲ）経路、結腸癌細胞系におけるＭＧＭＴ ＣＮ
Ａ修復経路、Ｏ₆メチルグアニンメチルトランスフェラーゼ酵素（Ｏ₆ＭｇＭＴ）
及び６，４光産物（６，４ＰＰ）をダウンレギュレートするＤＮＡ修復酵素阻害
剤である。その遺伝子クラスは、ロイシンジッパー結合ドメイン、及び細胞のア
ポトーシスを引き起こすデスドメイン（ｄｅａｔｈ ｄｏｍａｉｎ）を含むこと
により特徴付けられる。ヒトｐ−Ｈｙｄｅ（Ｉ）及びヒトｐ−Ｈｙｄｅ４０（Ｉ
Ｉ）は、ある種の相同配列、並びに保存された構造的及び機能的特徴を有する分
子ファミリー（「ｐ−Ｈｙｄｅファミリー」）の、本明細書に記載された例であ
る。

【００３２】 本発明は、細胞死に対する癌細胞の感受性を誘導する哺乳動物ｐ−Ｈｙｄｅタ
ンパク質をコードする、単離された核酸（その対立遺伝子、類似体、断片、模倣
体、変異体、合成物、又は異型を含む）を提供する。本発明は、細胞死に対する
癌細胞の感受性を誘導するヒトｐ−Ｈｙｄｅタンパク質をコードする、単離され
た核酸（その対立遺伝子、類似体、断片、模倣体、変異体、合成物、又は異型を
含む）を提供する。

【００３３】 本明細書において交換可能に使用されるように、「ｐ−Ｈｙｄｅ活性」、「ｐ
−Ｈｙｄｅの生物学的活性」、又は「ｐ−Ｈｙｄｅの機能的活性」とは、細胞の
アポトーシスを引き起こす標準的な技術に従いインビボ又はインビトロで決定さ
れるような、ｐ−Ｈｙｄｅのタンパク質、ポリペプチド、又は核酸分子がｐ−Ｈ
ｙｄｅ応答性細胞に対して及ぼす活性をさす。ｐ−Ｈｙｄｅとは、ｐ−Ｈｙｄｅ
活性を有する遺伝子ファミリーをさす。そのような遺伝子の例は、ラットｐ−Ｈ
ｙｄｅ、ヒトｐ−Ｈｙｄｅ（Ｉ）、及びヒトｐ−Ｈｙｄｅ４０（ＩＩ）である。
１つの実施態様において、これらの配列は、ヌクレオチドレベルで配列番号：７
を含み、アミノ酸レベルで配列番号：８を含む。また、ファミリーｐ−Ｈｙｄｅ
の遺伝子メンバーの例には、ヌクレオチドレベルで配列番号：１、３、５、又は
７の単離されたヌクレオチド配列が含まれ、アミノ酸レベルでは配列番号：２、
４、６、又は８のアミノ酸配列が含まれる。

【００３４】 １つの実施態様において、ｐ−Ｈｙｄｅ遺伝子は、配列番号：１の配列をコー
ドする核酸との少なくとも８５％の類似性を有するヌクレオチド配列を有する。
もう１つの実施態様において、核酸は、配列番号：１の配列をコードする核酸と
の少なくとも８７％の類似性を有するヌクレオチド配列を有する。もう１つの実
施態様において、核酸は、配列番号：１の配列をコードする核酸との少なくとも
９０％の類似性を有するヌクレオチド配列を有する。もう１つの実施態様におい
て、核酸は、配列番号：１の配列をコードする核酸との少なくとも９５％の類似
性を有するヌクレオチド配列を有する。もう１つの実施態様において、核酸断片
は、配列番号：１の１位の核酸で開始し、配列番号：１の５５７位で終止する断
片を含む。もう１つの実施態様において、核酸は、配列番号：１の１位の核酸で
開始し、配列番号：１の１５８位で終止する断片を含む。もう１つの実施態様に
おいて、核酸は、配列番号：１の５０位の核酸で開始し、配列番号：１の１２０
位で終止する断片を含む。核酸は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノミックＤＮＡ、又は
ＲＮＡである。

【００３５】 ヒトｐ−Ｈｙｄｅ核酸コーディング領域： （配列番号：１） もう１つの実施態様において、核酸は、配列番号２に記載されたような配列を
有するアミノ酸配列をコードする。１つの実施態様において、アミノ酸断片は、
配列番号２の１位のアミノ酸で開始し、１０１位で終止する断片を含む。１つの
実施態様において、アミノ酸断片は、配列番号２の１位のアミノ酸で開始し、８
０位で終止する断片を含む。１つの実施態様において、アミノ酸断片は、配列番
号２の１位のアミノ酸で開始し、６０位で終止する断片を含む。１つの実施態様
において、アミノ酸は、配列番号２の配列をコードする核酸との少なくとも８５
％の類似性を有する。もう１つの実施態様において、アミノ酸は、配列番号２の
配列をコードする核酸との少なくとも９０％の類似性を有する。もう１つの実施
態様において、アミノ酸は、配列番号２の配列をコードする核酸との少なくとも
９５％の類似性を有する。

【００３６】 ヒトｐ−Ｈｙｄｅのアミノ酸配列： （配列番号：２） １つの実施態様において、ｐ−Ｈｙｄｅ遺伝子は、配列番号：３の配列をコー
ドする核酸との少なくとも７５％の類似性を有するヌクレオチド配列を有する。
もう１つの実施態様において、核酸は、配列番号：３の配列をコードする核酸と
の少なくとも８５％の類似性を有するヌクレオチド配列を有する。もう１つの実
施態様において、核酸は、配列番号：３の配列をコードする核酸との少なくとも
９０％の類似性を有するヌクレオチド配列を有する。もう１つの実施態様におい
て、核酸は、配列番号：３の配列をコードする核酸との少なくとも９５％の類似
性を有するヌクレオチド配列を有する。もう１つの実施態様において、核酸断片
は、配列番号：３の１位の核酸で開始し、配列番号：３の５５７位で終止する断
片を含む。もう１つの実施態様において、核酸は、配列番号：３の１位の核酸で
開始し、配列番号：３の１５８位で終止する断片を含む。もう１つの実施態様に
おいて、核酸は、配列番号：３の５０位の核酸で開始し、配列番号：３の１２０
位で終止する断片を含む。核酸は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノミックＤＮＡ、又は
ＲＮＡである。

【００３７】 ヒトｐ−Ｈｙｄｅ４０の核酸配列： （配列番号：３） もう１つの実施態様において、核酸は、配列番号４に記載されたような配列を
有するアミノ酸配列をコードする。１つの実施態様において、アミノ酸断片は、
配列番号４の１位のアミノ酸で開始し、１０１位で終止する断片を含む。１つの
実施態様において、アミノ酸断片は、配列番号４の１位のアミノ酸で開始し、８
０位で終止する断片を含む。１つの実施態様において、アミノ酸断片は、配列番
号４の１位のアミノ酸で開始し、６０位で終止する断片を含む。１つの実施態様
において、アミノ酸は、配列番号４の配列をコードする核酸との少なくとも８５
％の類似性を有する。もう１つの実施態様において、アミノ酸は、配列番号４の
配列をコードする核酸との少なくとも９０％の類似性を有する。もう１つの実施
態様において、アミノ酸は、配列番号４の配列をコードする核酸との少なくとも
９５％の類似性を有する。

【００３８】 ヒトｐ−Ｈｙｄｅ４０のアミノ酸配列： （配列番号：４） １つの実施態様において、ｐ−Ｈｙｄｅ遺伝子は、配列番号：５の配列をコー
ドする核酸との少なくとも７５％の類似性を有するヌクレオチド配列を有する。
もう１つの実施態様において、核酸は、配列番号：５の配列をコードする核酸と
の少なくとも８５％の類似性を有するヌクレオチド配列を有する。もう１つの実
施態様において、核酸は、配列番号：５の配列をコードする核酸との少なくとも
９０％の類似性を有するヌクレオチド配列を有する。もう１つの実施態様におい
て、核酸は、配列番号：５の配列をコードする核酸との少なくとも９５％の類似
性を有するヌクレオチド配列を有する。もう１つの実施態様において、核酸断片
は、配列番号：５の１位の核酸で開始し、配列番号：５の５５７位で終止する断
片を含む。もう１つの実施態様において、核酸は、配列番号：５の１位の核酸で
開始し、配列番号：５の１５８位で終止する断片を含む。もう１つの実施態様に
おいて、核酸は、配列番号：５の５０位の核酸で開始し、配列番号：５の１２０
位で終止する断片を含む。核酸は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノミックＤＮＡ、又は
ＲＮＡである。

【００３９】 ラットｐ−Ｈｙｄｅの核酸配列： （配列番号：５） もう１つの実施態様において、核酸は、配列番号６に記載されたような配列を
有するアミノ酸配列をコードする。１つの実施態様において、アミノ酸断片は、
配列番号６の１位のアミノ酸で開始し、１０１位で終止する断片を含む。１つの
実施態様において、アミノ酸断片は、配列番号６の１位のアミノ酸で開始し、８
０位で終止する断片を含む。１つの実施態様において、アミノ酸断片は、配列番
号２の１位のアミノ酸で開始し、６０位で終止する断片を含む。１つの実施態様
において、アミノ酸断片は、配列番号６の６１位のアミノ酸で開始し、２４１位
で終止する断片を含む。１つの実施態様において、アミノ酸断片は、配列番号６
の８１位のアミノ酸で開始し、３６１位で終止する断片を含む。１つの実施態様
において、アミノ酸断片は、配列番号２の８１位のアミノ酸で開始し、４２１位
で終止する断片を含む。もう１つの実施態様において、アミノ酸は、配列番号６
の配列をコードする核酸との少なくとも７０％の類似性を有する。もう１つの実
施態様において、アミノ酸は、配列番号６の配列をコードする核酸との少なくと
も７５％の類似性を有する。もう１つの実施態様において、アミノ酸は、配列番
号６の配列をコードする核酸との少なくとも８０％の類似性を有する。１つの実
施態様において、アミノ酸は、配列番号６の配列をコードする核酸との少なくと
も８５％の類似性を有する。もう１つの実施態様において、アミノ酸は、配列番
号６の配列をコードする核酸との少なくとも９０％の類似性を有する。もう１つ
の実施態様において、アミノ酸は、配列番号６の配列をコードする核酸との少な
くとも９５％の類似性を有する。

【００４０】 ラットｐ−Ｈｙｄｅのアミノ酸配列： （配列番号：６） さらに、本発明は、アミノ酸配列をコードする単離された核酸ｔｃｃｃｔｇｇ
ｃｃａｃａｃｇｃｃｔｇｇｔｇｇｇｃｔｃｔｇｇｃｔｔｃ（配列番号：７）を提
供する。さらに、本発明は、アミノ酸配列ＡＡＰＣＶＡＹＶＬＬＳＬＶＹＬＰＧ
ＶＬＡＡＡＬＱＬＲＲＧＴＫＹＱＲＦＰＤＷＬＤＨＷＬＱＨＲＫＱＩＧＬＬＳＦ
Ｆ（配列番号：８）をコードする単離された核酸を提供する。さらに、本発明は
、アミノ酸配列ＮＦＩＲＤＶＬＱＰＹＩＲＫＤＥＮＫをコードする単離された核
酸を提供する。

【００４１】 本発明は、遺伝暗号の縮重のために配列番号１、配列番号：３、配列番号：５
、又は配列番号：７のヌクレオチド配列と異なっており、従って配列番号：１、
配列番号：３、配列番号：５、又は配列番号：７に示されたヌクレオチド配列に
よりコードされるタンパク質と同一のｐ−Ｈｙｄｅタンパク質をコードする核酸
分子をさらに包含する。ｐ−Ｈｙｄｅのアミノ酸配列の変化をもたらすＤＮＡ配
列多型が、集団（例えば、ヒト集団）内に存在しうることが、当業者には理解さ
れよう。そのようなｐ−Ｈｙｄｅ遺伝子の遺伝学的多型は、天然の対立遺伝子変
動により、集団内の個体間に存在しうる。対立遺伝子は、特定の遺伝子座に代替
的に存在する遺伝子群のうちの１つである。そのような天然の対立遺伝子変動は
、典型的には、ｐ−Ｈｙｄｅ遺伝子のヌクレオチド配列の１〜５％の分散をもた
らす。代替的対立遺伝子は、多数の異なる個体において目的遺伝子を配列決定す
ることにより同定されうる。これは、多様な個体において、同一遺伝子座を同定
するためのハイブリダイゼーションプローブを使用することにより、容易に実施
されうる。天然の対立遺伝子変動の結果であり、ｐ−Ｈｙｄｅの機能的活性を改
変しない、ｐ−Ｈｙｄｅにおける任意の全てのそのようなヌクレオチド変動、及
び得られるアミノ酸多型が、本発明の範囲内に含まれるものとする。さらに、ヒ
トｐ−Ｈｙｄｅのヌクレオチド配列とは異なるヌクレオチド配列を有する、他の
種に由来するｐ−Ｈｙｄｅタンパク質（ｐ−Ｈｙｄｅ相同体）をコードする核酸
分子も、本発明の範囲内に含まれるものとする。本発明のｐ−Ｈｙｄｅ ｃＤＮ
Ａの天然の対立遺伝子異型及び相同体に相当する核酸分子は、ストリンジェント
なハイブリダイゼーション条件下で、標準的なハイブリダイゼーション技術に従
い、ヒトｃＤＮＡ又はその一部をハイブリダイゼーションプローブとして使用し
て、本明細書に開示されたヒトｐ−Ｈｙｄｅ核酸との同一性に基づき単離されう
る。例えば、ヒト及びマウスのｐ−Ｈｙｄｅ ｃＤＮＡのスプライス異型は、ヒ
ト及びマウスのｐ−Ｈｙｄｅとの同一性に基づき単離されうる。

【００４２】 本明細書において使用されるように、「ストリンジェントな条件下でハイブリ
ダイズする」という用語は、相互に少なくとも６０％（６５％、７０％、好まし
くは７５％）同一のヌクレオチド配列が典型的には相互にハイブリダイズしたま
までいる、ハイブリダイゼーション及び洗浄の条件を記載するものとする。その
ようなストリンジェントな条件は、当業者に既知であり、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒ
ｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ,Ｊｏｈｎ Ｗｉ
ｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），６．３．１−６．３．６に見出され
る。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の好ましい非制限的な例は
、約４５℃における６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中での
ハイブリダイゼーション、それに続く５０〜６５℃における０．２×ＳＳＣ、０
．１％ＳＤＳ中での１回以上の洗浄である。好ましくは、配列番号：１、配列番
号：２、配列番号：５、又は配列番号：７のコーディング配列又は非コーディン
グ配列（又は「センス」配列もしくは「アンチセンス」配列）とストリンジェン
トな条件下でハイブリダイズする本発明の単離された核酸分子は、天然に存在す
る核酸分子に相当する。本明細書において使用されるように、「天然に存在する
」核酸分子とは、天然に存在するヌクレオチド配列を有する（例えば、天然タン
パク質をコードする）ＲＮＡ分子又はＤＮＡ分子をさす。集団内に存在しうるｐ
−Ｈｙｄｅ配列の天然に存在する対立遺伝子異型に加え、ｐ−Ｈｙｄｅタンパク
質の生物学的能力を改変することなく、配列番号：１、配列番号：３、配列番号
：５、又は配列番号：７のヌクレオチド配列へと突然変異により変化を導入する
ことにより、コードされたｐ−Ｈｙｄｅタンパク質のアミノ酸配列の変化をもた
らしうることを、当業者は、さらに理解するであろう。突然変異は、部位特異的
突然変異誘発及びＰＣＲ媒介突然変異誘発のような標準的な技術により導入され
うる。好ましくは、保存的アミノ酸置換が、１個以上の非必須と予測されるアミ
ノ酸残基においてなされる。

【００４３】 「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸
残基と交換されるものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが
、当分野において定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖を有す
るアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性塩基性側鎖を有
するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、電荷を有しない極性
側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン
、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば
、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、
メチオニン、トリプトファン）、ベータ分岐側鎖を有するアミノ酸（例えば、ト
レオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば
、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。従
って、ｐ−Ｈｙｄｅ内の非必須と予測されるアミノ酸残基が、好ましくは、同一
側鎖ファミリーのもう１つのアミノ酸残基と交換される。又は、飽和突然変異誘
発などによりｐ−Ｈｙｄｅコーディングの全部又は一部にランダムに突然変異を
導入し、得られた変異体をＰ−Ｈｙｄｅ生物学的活性についてスクリーニングし
、活性を保持する変異体を同定することもできる。突然変異誘発の後、コードさ
れたタンパク質を組み換え発現させ、タンパク質の活性を決定することができる
。

【００４４】 生物学的活性が大きく減少するか又は排除されることを回避するため、様々な
種のｐ−Ｈｙｄｅタンパク質の間で保存されているアミノ酸残基は、改変されな
い（保存的置換は除く）。マウス及びヒトのｐ−Ｈｙｄｅタンパク質は、いずれ
も、６システイン残基の保存されたパターンを有している。そのような保存され
たドメイン及びシステイン残基は、突然変異を容認する可能性が低い。しかしな
がら、その他のアミノ酸残基（例えば、様々な種のｐ−Ｈｙｄｅの間で、例えば
マウスとヒトのｐ−Ｈｙｄｅの間で保存されていないか、又は半保存しかされて
いないもの）は、活性にとって必須ではないかもしれず、従って改変を容認する
可能性が高い。従って、本発明のもう一つの面は、活性にとって必須でないアミ
ノ酸残基の変化を含有するｐ−Ｈｙｄｅタンパク質をコードする核酸分子に関す
る。そのようなｐ−Ｈｙｄｅタンパク質は、配列番号：２又は配列番号：４とは
アミノ酸配列が異なるが、生物学的活性を保持している。１つの実施態様におい
て、単離された核酸分子は、配列番号：２、４、６、又は８のアミノ酸配列と少
なくとも約８４％、８５％、９０％、９５％、又は９８％同一であるアミノ酸配
列を含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。

【００４５】 当業者には容易に理解されるように、ｐ−Ｈｙｄｅをコードするヌクレオチド
は、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノミックＤＮＡ、合成型、及び混合重合体の、センス
鎖及びアンチセンス鎖の両方を含み、化学的もしくは生化学的に修飾されていて
もよく、又は非天然の、もしくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含有してい
てもよい。そのような修飾には、例えば、標識、メチル化、１個以上の天然に存
在するヌクレオチドの、類似体との置換、電荷を有しない結合（例えば、メチル
ホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カルバメート等）、電
荷を有する結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート等）のよ
うなヌクレオチド間修飾、付属部分（ｐｅｎｄｅｎｔ ｍｏｉｅｔｙ）（例えば
、ポリペプチド）、インターカレーター（例えば、アクリジン、ソラレン等）、
キレート化剤、アルキル化剤、及び修飾された結合（例えば、アルファアノマー
核酸等）が含まれる。水素結合及びその他の化学的相互作用を介して、指定され
た配列と結合する能力について、ヌクレオチドと同様の能力を示す合成分子も含
まれるものとする。そのような分子は、当分野において既知であり、例えば、一
次構造配列と実質的に相同であるが、例えばインビボ又はインビトロの化学的及
び生化学的修飾を含むか、又は一般的でないアミノ酸が取り込まれているペプチ
ド結合が、分子骨格のホスフェート結合にとって代わっているものを含む。核酸
は修飾されていてもよい。当業者には容易に理解されるように、そのような修飾
には、例えばアセチル化、カルボキシル化、リン酸化、グリコシル化、ユビキチ
ン化、例えば放射性核種による標識、及び様々な酵素的修飾が含まれる。そのよ
うな目的のため有用である多様なポリペプチド標識法及び置換基又は標識が、当
分野において周知であり、それらには、³²Ｐのような放射性同位体、標識された
アンチリガンド（例えば、抗体）と結合するリガンド、フルオロフォア、化学発
光剤、酵素、及び標識されたリガンドに対する特異的結合対のメンバーとして作
用しうるアンチリガンドが含まれる。標識の選択は、必要とされる感度、プライ
マーとの結合の容易度、安定性要件、及び利用可能な装置に依存する。ポリペプ
チド標識法は、当分野において周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ
ａｌ．，１９８９又はＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９２を参照のこと。
実質的に全長のｐ−Ｈｙｄｅの他に、本発明は、当業者に既知の、生物学的活性
を有するｐ−Ｈｙｄｅ断片を提供する。

【００４６】 本明細書において定義されるように、「単離された」又は「実質的に純粋な」
核酸（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、又は混合重合体）とは、天然型ヒト配列又はタ
ンパク質に天然に付随している他の細胞成分、例えばリボソーム、ポリメラーゼ
、その他の多くのヒトゲノム配列及びタンパク質から実質的に分離されているも
のである。その用語には、それが天然に存在する環境から取り出されている核酸
配列又はタンパク質が包含され、組換えの、又はクローニングされたＤＮＡ単離
物、及び化学的に合成された類似体、又は異種系により生物学的に合成された類
似体が含まれる。

【００４７】 「ｐ−Ｈｙｄｅ対立遺伝子」とは、ｐ−Ｈｙｄｅ遺伝子座の正常対立遺伝子、
並びに例えば***、卵巣、結腸直腸、及び前立腺の癌を含む多くの部位の癌を発
症する素因を個体に与える変動を保持している対立遺伝子をさす。そのような素
因付与対立遺伝子は、「ｐ−Ｈｙｄｅ感受性対立遺伝子」とも呼ばれる。

【００４８】 「ｐ−Ｈｙｄｅ遺伝子座」、「ｐ−Ｈｙｄｅ遺伝子」、「ｐ−Ｈｙｄｅ核酸」
、又は「ｐ−Ｈｙｄｅポリヌクレオチド」とは、それぞれ、ｐ−Ｈｙｄｅ活性を
有する、正常組織において発現される可能性が高い、全てがｐ−Ｈｙｄｅ領域内
に存在するポリヌクレオチド（ある種の対立遺伝子が、***、卵巣、結腸直腸、
及び前立腺の癌を発症する素因を個体に与える）をさす。ｐ−Ｈｙｄｅ遺伝子座
の突然変異は、その他の型の腫瘍のイニシエーション及び／又はプログレッショ
ンにも関与しているかもしれない。その遺伝子座は、癌を発症する素因を個体に
与える突然変異により一部示される。これらの突然変異は、下記のｐ−Ｈｙｄｅ
領域内に含まれる。ｐ−Ｈｙｄｅ遺伝子座は、コーディング配列、介在配列、及
び転写及び／又は翻訳を調節する制御因子を含むものとする。ｐ−Ｈｙｄｅ遺伝
子座は、ＤＮＡ配列の全ての対立遺伝子変動を含むものとする。

【００４９】 「核酸」とは、一本鎖の形態か、又は二本鎖ヘリックスの、リボヌクレオシド
（アデノシン、グアノシン、ウリジン、又はシチジン；「ＲＮＡ分子」）又はデ
オキシリボヌクレオシド（デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシ
チミジン、又はデオキシシチジン；「ＤＮＡ分子」）のリン酸エステル重合形態
をさす。ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ、及びＲＮＡ−ＲＮＡの二本鎖ヘリッ
クスが可能である。核酸分子、特にＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子という用語は、分
子の一次構造及び二次構造のみをさし、特定の３次形態に制限されない。従って
、この用語は、特に直鎖状又は環状のＤＮＡ分子（例えば、制限断片）、プラス
ミド、及び染色体に見出される二本鎖ＤＮＡを含む。特定の二本鎖ＤＮＡ分子の
構造について論ずる場合、配列は、ＤＮＡの非転写鎖（即ち、ｍＲＮＡと相同な
配列を有する鎖）上の配列のみを５’から３’の方向で与えるという通常の慣例
に従い、本明細書において記載されうる。「組換えＤＮＡ」とは、分子生物学的
操作を受けたＤＮＡである。

【００５０】 「をコードする核酸」という句は、特定のタンパク質又はペプチドの発現を指
図する核酸分子をさす。核酸配列には、ＲＮＡへと転写されるＤＮＡ鎖配列、及
びタンパク質へと翻訳されるＲＮＡ配列の両方が含まれる。核酸分子には、全長
核酸配列、及び全長タンパク質に由来する非全長配列の両方が含まれる。配列に
は、特定の宿主細胞におけるコドン優先性を提供するために導入されうる（１つ
又は複数の）天然型配列の縮重コドンが含まれることを、さらに理解されたい。

【００５１】 「組換え核酸」とは、天然には存在しない核酸、又は本来は分離している２個
の配列分節の人工的組み換えにより作成された核酸である。この人工的組み換え
は、化学的合成手段、又は単離された核酸分節の人工的操作、例えば遺伝子工学
技術のいずれかにより、達成される場合が多い。それらは、あるコドンを、同一
の又は保存的なアミノ酸をコードする重複（ｒｅｄｕｎｄａｎｔ）コドンと交換
し、典型的には配列認識部位を導入又は除去するために実施される。又は、それ
は、所望の機能の組み合わせを生成させるため、所望の機能を有する核酸分節を
接合するために実施される。

【００５２】 本明細書において使用されるように、「癌細胞」という用語は、通常よりも急
速に、例えば組織内の隣接細胞又はその他の細胞よりも急速に、細胞増殖により
増殖する組織を意味する。新生物細胞は、増殖刺激が停止した後も増殖し続ける
。一般に、腫瘍は異なる組織重量を示すか、又は形成する。本発明は、両方の型
の腫瘍に関するが、癌の治療において特に貴重である。

【００５３】 １つの実施態様において、癌細胞は、黒色腫；リンパ腫；白血病；及び前立腺
、結腸直腸、膵臓、***、脳、又は胃の癌からなる群より選択される。腫瘍の例
には、これらに限定されないが、肉腫及び癌腫、例えばこれらに限定されないが
、線維肉腫、粘液肉種、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、
内皮肉腫（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）、リンパ管肉腫、リンパ管内
皮肉種（ｌｙｍｐｈａｎｇｉｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）、骨膜腫
、中皮腫、ユーイング肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌腫、膵臓癌、乳癌
、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭状
癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌、
絨毛癌、精上皮腫、胎生期癌、ウィルムス腫、頸癌、原基腫（ｇｅｒｍ ｔｕｍ
ｏｒ）、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、
髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄
膜腫、黒色腫、神経芽腫、及び網膜芽腫が含まれる。好ましい実施態様において
、腫瘍は黒色種又は前立腺細胞である。

【００５４】 特定のコドンが、異なるアミノ酸をコードするコドンに変化するが、細胞死に
対する感受性の誘導は維持されるような突然変異が、ｐ−Ｈｙｄｅをコードする
核酸に作成されうる。そのような突然変異は、一般に、最少のヌクレオチド変化
を作成することにより作成される。この種の置換突然変異は、得られたタンパク
質内のアミノ酸を非保存的に（即ち、特定のサイズ又は特徴を有するアミノ酸の
群に属するアミノ酸から、他の群に属するアミノ酸へとコドンを変化させること
により）、又は保存的に（即ち、特定のサイズ又は特徴を有するアミノ酸の群に
属するアミノ酸から、同一の群に属するアミノ酸へとコドンを変化させることに
より）変化させるために作成されうる。そのような保存的変化は、一般に、得ら
れたタンパク質の構造及び機能の比較的少ない変化をもたらす。非保存的変化は
、得られたタンパク質の構造、活性、又は機能を改変させる可能性が比較的高い
。本発明は、得られたタンパク質の活性又は結合特徴を有意には改変しない保存
的変化を含有する配列を含むものと見なされるべきである。配列内のアミノ酸の
置換基は、そのアミノ酸が属するクラスの他のメンバーから選択されうる。例え
ば、非極性（疎水性）アミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリ
ン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、及びメチオニンが含まれる
。芳香環構造を含有するアミノ酸は、フェニルアラニン、トリプトファン、及び
チロシンである。極性中性アミノ酸には、グリシン、セリン、トレオニン、シス
テイン、チロシン、アスパラギン、及びグルタミンが含まれる。正の電荷を有す
る（塩基性）アミノ酸には、アルギニン、リジン、及びヒスチジンが含まれる。
負の電荷を有する（酸性）アミノ酸には、アスパラギン酸及びグルタミン酸が含
まれる。そのような改変は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又は等電点により
決定されるような見かけの分子量に影響を与えないと予想される。この単離され
た核酸も、変異型ｐ−Ｈｙｄｅ又は野生型タンパク質をコードする。

【００５５】 本発明は、アンチセンス方向で発現ベクターへクローニングされた本発明のＤ
ＮＡ分子を含む組み換え発現ベクターをさらに提供する。即ち、ＤＮＡ分子は、
ｐ−Ｈｙｄｅ ｍＲＮＡに対してアンチセンスのＲＮＡ分子の（ＤＮＡ分子の転
写による）発現を可能にする様式で、制御配列と機能的に連結している。多様な
細胞型におけるアンチセンスＲＮＡ分子の連続的発現を指図する、アンチセンス
方向でクローニングされた核酸と機能的に連結した制御配列、例えばウイルスプ
ロモーター及び／又はエンハンサーを選択してもよいし、又は構成性の、組織特
異的な、又は細胞型特異的なアンチセンスＲＮＡの発現を指図する制御配列を選
択してもよい。アンチセンス発現ベクターは、ベクターが導入されている細胞型
により決定されうる活性を有する、アンチセンス核酸が高効率制御領域の調節下
で産生される組み換えプラスミド、ファージミド、又は弱毒化ウイルスの形態で
あり得る。アンチセンス遺伝子を使用した遺伝子発現の制御についての考察は、
Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ ｅｔ ａｌ．（Ｒｅｖｉｅｗｓ−Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇ
ｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．１（１）１９８６）を参照のこと。

【００５６】 本発明は、ＤＮＡウイルスの単離された核酸分子を含む複製可能ベクターを提
供する。ベクターには、これらに限定されないが、単離された核酸分子の少なく
とも一部を含有するプラスミド、コスミド、ファージ、又は酵母人工染色体（Ｙ
ＡＣ）が含まれる。これらのベクターを得るための一例として、挿入配列及びベ
クターＤＮＡの両方を制限酵素に曝露して、両分子上に相互に塩基対を形成する
相補的末端を作出し、次いで、それらをＤＮＡリガーゼによりライゲートするこ
とができる。又は、ベクターＤＮＡ内の制限部位に相当するリンカーを挿入ＤＮ
Ａにライゲートし、次いでそれをその部位で切断する制限酵素で消化することも
できる。その他の手段も、利用可能であり、当業者に既知である。１つの実施態
様において、アデノウイルスベクターは複製欠損性アデノウイルス５型発現ベク
ターである。もう１つの実施態様において、アデノウイルスベクターは、ゲノム
のＥ１及びＥ３領域に欠失を有し、ｐ−Ｈｙｄｅをコードする核酸のプロモータ
ーの調節下での挿入をその領域内に有するアデノウイルスゲノムを含む。プロモ
ーターは、ラウス肉腫ウイルスプロモーターでありうる。

【００５７】 ３６ｋＢの直鎖状二本鎖ＤＮＡウイルスであるアデノウイルスの遺伝子構成の
知識は、大きなアデノウイルスＤＮＡ片の、最大７ｋＢの外来配列との置換を可
能にする（Ｇｒｕｎｈａｕｓ ａｎｄ Ｈｏｒｗｉｔｚ，１９９２）。アデノウ
イルスＤＮＡは、潜在的な遺伝毒性なしにエピソーム的に複製しうるため、レト
ロウイルスとは対照的に、アデノウイルスＤＮＡの宿主細胞への感染は、染色体
組み込みをもたらさない。また、アデノウイルスは、構造的に安定であり、多く
の増幅の後も、ゲノムの再編成は検出されていない。アデノウイルスは、細胞周
期段階に関わらず、事実上全ての上皮細胞に感染しうる。これまでのところ、ア
デノウイルス感染は、ヒトにおいて、急性呼吸器疾患のような軽度の疾患としか
関連していないと考えられている。

【００５８】 アデノウイルスは、ゲノムのサイズが中程度であること、操作が容易であるこ
と、力価が高いこと、標的細胞域が広いこと、及び感染性が高いことから、遺伝
子移入ベクターとしての使用に特に適している。ウイルスゲノムの両端は、ウイ
ルスＤＮＡの複製及びパッケージングにとって必要なシス因子である１００〜２
００塩基対の逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）を含有している。ゲノムの初期領域
（Ｅ）及び後期領域（Ｌ）は、ウイルスＤＮＡ複製の開始時点で分割される異な
る転写単位を含有している。Ｅ１領域（Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂ）は、ウイルスゲノム
及び数種の細胞遺伝子の転写の制御を担うタンパク質をコードする。Ｅ２（Ｅ２
Ａ及びＥ２Ｂ）の発現は、ウイルスＤＮＡ複製のためのタンパク質の合成をもた
らす。これらのタンパク質は、ＤＮＡ複製、後期遺伝子の発現、及び宿主細胞の
シャットオフ（ｓｈｕｔ ｏｆｆ）（Ｒｅｎａｎ，１９９０）に関与している。
ウイルスカプシドタンパク質の大半を含む後期遺伝子の産物は、主要後期プロモ
ーター（ＭＬＰ）により生じる単一の一次転写物の重要なプロセシングの後にの
み発現される。ＭＬＰ（１６．８ｍ．ｕ．に位置している）は、感染後期に特に
効率的となり、このプロモーターから生じる全てのｍＲＮＡが、それらを翻訳に
とって好ましいｍＲＮＡにする、３成分リーダー（ＴＬ）配列を５’に保有して
いる。

【００５９】 現在の系において、組換えアデノウイルスは、シャトルベクターとプロウイル
スベクターとの相同的組み換えにより生成させられている。２つのプロウイルス
ベクターの間の組み換えが可能であるため、野生型アデノウイルスがこの過程か
ら生成しうる。従って、各プラークから単一のウイルスクローンを単離し、その
ゲノム構造を調査することが重要である。ＹＡＣ系の使用は、組換えアデノウイ
ルスの作製のための別法である。

【００６０】 複製欠損性である現在のアデノウイルスベクターの生成及び繁殖は、Ａｄ５
ＤＮＡ断片によりヒト胎児腎細胞から形質転換され、Ｅ１タンパク質を構成性発
現している、２９３と呼ばれる特別なヘルパー細胞系に依存している（Ｇｒａｈ
ａｍ，ｅｔ ａｌ．，１９７７）。Ｅ３領域は、アデノウイルスゲノムから削除
可能であるため（Ｊｏｎｅｓ ａｎｄ Ｓｈｅｎｋ，１９７８）、２９３細胞に
補助された現在のアデノウイルスベクターは、Ｅ１、Ｅ３のいずれか又は両方の
領域に外来ＤＮＡを保持している（Ｇｒａｈａｍ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｃ，１９
９１）。天然に、アデノウイルスは野生型ゲノムのおよそ１０５％をパッケージ
ングし（Ｇｈｏｓｈ−Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙ，ｅｔ ａｌ．，１９８７）、約２ｋ
Ｂの追加的なＤＮＡの収容力を提供することができる。Ｅ１及びＥ３の領域にお
いて交換可能なおよそ５．５ｋＢのＤＮＡと組み合わせると、現在のアデノウイ
ルスベクターの最大収容力は、７．５ｋＢ未満、又はベクターの全長の約１５％
である。アデノウイルスゲノムの８０％超が、ベクター骨格に残存しており、そ
れがベクター由来細胞毒性の起源となる。また、Ｅ１欠失ウイルスの複製欠損性
は不完全である。例えば、ウイルス遺伝子発現の漏出が、高い感染多重度におい
て、現在利用可能なアデノウイルスベクターで観察されている（Ｍｕｌｌｉｇａ
ｎ，１９９３）。

【００６１】 ヘルパー細胞系は、ヒト胎児の腎細胞、筋肉細胞、造血系細胞、又はその他の
ヒト胎児の間葉細胞もしくは上皮細胞のようなヒト細胞に由来しうる。又は、ヘ
ルパー細胞は、ヒトアデノウイルスに対して許容性のその他の哺乳動物種の細胞
に由来していてもよい。そのような細胞には、例えば、Ｖｅｒｏ細胞、又はその
他のサル胎児の間葉細胞もしくは上皮細胞が含まれる。前述のように、好ましい
ヘルパー細胞系は２９３である。

【００６２】 アデノウイルスベクターが複製欠損性、又は少なくとも条件的に複製欠損性で
あるという要件を除けば、アデノウイルスウイルスの性質は、本発明の実施の成
功にとって重要でないと考えられる。アデノウイルスは、４２の異なる既知の血
清型又はＡ〜Ｆ亜群のうちのいずれであってもよい。Ｃ亜群のアデノウイルス５
型は、本発明の方法において使用するための条件的複製欠損性アデノウイルスベ
クターを得るための好ましい出発材料である。それは、アデノウイルス５型が、
生化学的及び遺伝学的な情報が詳細に既知のヒトアデノウイルスであり、ベクタ
ーとしてアデノウイルスを使用した大部分の構築のため、歴史的に使用されてい
るためである。

【００６３】 前述のように、典型的な本発明に係るベクターは、複製欠損性であり、アデノ
ウイルスＥ１領域を有していないであろう。従って、Ｅ１コーディング配列が除
去された位置に、ｐ−Ｈｙｄｅをコードする核酸を導入することが最も便利であ
ろう。しかしながら、アデノウイルス配列内のｐ−Ｈｙｄｅコーディング領域の
挿入位置は、本発明にとって重要でない。ｐ−Ｈｙｄｅ転写単位をコードする核
酸は、Ｋａｒｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８６）により以前に記載されたよ
うな、Ｅ３交換ベクター内の欠失したＥ３領域の代わりに、又はヘルパー細胞系
もしくはヘルパーウイルスがＥ４欠損を補足するＥ４領域に、挿入されうる。

【００６４】 アデノウイルスは、増殖及び操作が容易であり、インビトロ及びインビボで広
い宿主域を示す。このウイルス群は、高力価、例えば１０⁹〜１０¹¹プラーク形
成単位（ＰＦＵ）／ｍｌで得られ、高度に感染性である。アデノウイルスの生活
環は、宿主細胞ゲノムへの組み込みを必要としない。アデノウイルスベクターに
より輸送された外来遺伝子は、エピソーム性であり、従って宿主細胞に対する低
い遺伝毒性を有する。野生型アデノウイルスの予防接種の研究において、副作用
は報告されておらず（Ｃｏｕｇｈ ｅｔ ａｌ．，１９６３；Ｔｏｐ ｅｔ ａ
ｌ．，１９７１）、このことは、それらのインビボ遺伝子移入ベクターとしての
安全性及び治療的可能性を証明している。

【００６５】 アデノウイルスベクターは、真核遺伝子発現（Ｌｅｖｒｅｒｏ ｅｔ ａｌ．
，１９９１；Ｇｏｍｅｚ−Ｆｏｉｘ ｅｔ ａｌ．，１９９２）及びワクチン開
発（Ｇｒｕｎｈａｕｓ ａｎｄ Ｈｏｒｗｉｔｚ，１９９２；Ｇｒａｈａｍ ａ
ｎｄ Ｐｒｅｖｅｃ，１９９２）において使用されている。最近、動物研究によ
り、組換えアデノウイルスが遺伝子治療に使用されうることが示唆された（Ｓｔ
ｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ ａｎｄ Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ，
１９９１；Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｒｒｉｃａｕｄｅｔ ａｌ．，１９９０；Ｒ
ｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９９３）。組換えアデノウイルスの異なる組織への投
与実験には、気管滴注（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９９１；Ｒｏｓ
ｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９９２）、筋肉注射（Ｒａｇｏｔ ｅｔ ａｌ
．，１９９３）、末梢静脈内注射（Ｈｅｒｚ ａｎｄ Ｇｅｒａｒｄ，１９９３
）、及び脳への定位接種（Ｌｅ Ｇａｌ Ｌａ Ｓａｌｌｅ ｅｔ ａｌ．，１
９９３）が含まれる。

【００６６】 好ましいプロモーターおよび他の必要なベクター配列を、宿主において機能的
であるように選択してよく、好ましい場合、ｐ−Ｈｙｄｅ遺伝子と本質的に関連
しているものを含んでよい。細胞株および発現ベクターの働きうる組合せの例は
、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９またはＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａ
ｌ．，１９９２に記述されており、またたとえばＭｅｔｚｇｅｒ ｅｔ ａｌ．
，１９８８も参照のこと。多くの有用なベクターが本技術分野で公知であり、ス
トラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ニュー イングランド バイオラボズ
（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、プロメガ バイオテック（Ｐｒ
ｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）などのような製造供給元より入手してよい。ｔｒ
ｐ、ｌａｃおよびファージプロモーター、ｔＲＮＡプロモーターおよび解糖酵素
プロモーターのようなプロモーターを原核生物宿主で使用してよい。有用な酵母
プロモーターは、金属結合性タンパク質、３−ホスホグリセレートキナーゼまた
は、エノラーゼまたはグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、マル
トースおよびガラクトース利用に応答性の酵素およびその他のものに対するプロ
モーター領域を含む。酵母発現で使用するのに好適なベクターおよびプロモータ
ーはさらにＨｉｔｚｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．，欧州特許第７４，６７５Ａでさら
に記述されている。好ましい非天然哺乳動物プロモーターには、ＳＶ４０（Ｆｉ
ｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，１９７８）からの早期および後期プロモーターまたは齧
歯類モロニー白血病ウイルス、鳥類肉腫ウイルス、アデノウイルスＩＩ、ウシパ
ピローマウイルスまたはポリオーマから由来したプロモーターを含んでよい。さ
らに、構造を、遺伝子の多重コピーを作製しうるように、増幅可能遺伝子（たと
えばＤＨＦＲ）に連結してよい。好ましいエンハンサーおよび他の発現調節配列
に関して、「エンハンサーと原核細胞遺伝子発現（Ｅｈａｎｃｅｒｓ ａｎｄ
Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｇｅｎｅ Ｅｘｒｅｓｓｉｏｎ）」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ．
Ｎ．Ｙ．（１９８３）も参照のこと。

【００６７】 そのような発現ベクターは自発的に複製可能である一方で、これらはまた、宿
主細胞のゲノム内に導入することによって、本技術分野でよく公知の方法にて複
製可能である。発現およびクローニングベクターは選択可能マーカー、ベクター
を形質導入した宿主細胞の生存または増殖に必要なタンパク質をコードしている
遺伝子を含む可能性がある。この遺伝子の存在が、挿入物を発現しているそれら
の宿主細胞のみの増殖を保証する。典型的な選別遺伝子は、ａ）抗生物質または
他の毒性基質、たとえばアンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサートなどに
対する耐性性を付与する、ｂ）栄養要求性不足を補う、またはｃ）複合培地では
入手不可能な重要栄養素、たとえばバチルス（Ｂａｃｉｌｌｉ）に対するＤ−ア
ラニンラセマーゼをコードしている遺伝子を供給する、タンパク質をコードして
いる。適切な選別可能マーカーの選択は宿主細胞に依存する可能性があり、異な
る宿主に対する好ましいマーカーが本技術分野でよく公知である。

【００６８】 対象の核酸を含んでいるベクターを、ｉｎ ｖｉｔｒｏで翻訳でき、よく公知
の方法、たとえば注入（Ｋｕｂｏ ｅｔ ａｌ．，１９８８を参照のこと）によ
って宿主細胞に導入した得られたＲＮＡまたはベクターを、細胞宿主の種類に依
存して変化する、エレクトロポレーション、塩化カルシウム、塩化ルビジウム、
リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストランまたは他の基質を使用したトランス
フェクション、マイクロ発射砲撃、リポフェクション、（ベクターがレトロウイ
ルスゲノムのような感染性薬剤である場合）感染を含む、本技術分野でよく公知
の方法によって、宿主細胞内へ直接導入できる。一般的にＳａｍｂｒｏｏｋ ｅ
ｔ ａｌ．，１９８９およびＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９２を参照の
こと。とりわけ以上で記述したものを含む、本技術分野で公知の任意の方法によ
るポリヌクレオチドの宿主細胞内への導入が、本明細書で「形質導入（ｔｒａｎ
ｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）」として称する。上述した核酸を導入した細胞は、また
そのような細胞の子孫を含むことを意味する。

【００６９】 発現のために必要な一般的な要素には、ＲＮＡポリメラーゼおよびリボソーム
結合のための転写開始配列に結合するためのプロモーターまたはエンハンサー配
列が含まれる。たとえば、微生物発現ベクターには、ｌａｃプロモーターのよう
なプロモーター、転写開始のためのシャイン−ダルガーノ配列および開始コドン
ＡＵＧが含まれる。同様に、真核生物発現ベクターには、ＲＮＡポリメラーゼＩ
Ｉに対する異種および同種プロモーター、下流ポリアデニル化シグナル、開始コ
ドンＡＵＧ、およびリボソームの分離のための終止コドンが含まれる。そのよう
なベクターは、商業的に入手してよく、または本技術分野でよく公知の方法、た
とえば一般的にベクターを構築するのための上述した方法によって記述した方法
より組み立ててよい。

【００７０】 発現構造物内でｐ−Ｈｙｄｅをコードしている核酸との組合せで使用できるウ
イルスプロモーター、細胞プロモーター／エンハンサーおよび誘導可能プロモー
タ／エンハンサーには、以下の、免疫グロブリン重鎖、免疫グロブリン軽鎖、Ｔ
−細胞レセプター、ＨＬＡ ＤＱアルファおよびＤＱベータ、ベータ−インター
フェロン、インターロイキン−２、インターロイキン−２レセプター、ＭＨＣク
ラスＩＩ５アルファ、ＭＨＣクラスＩＩ ＨＬＡ−ＤＲアルファ、ベータ−アク
チン、筋肉クレアチニンキナーゼ、プレアルブミン（トランスサイレチン）、エ
ラスターゼＩ、金属結合性タンパク質、コラゲナーゼ、アルブミン遺伝子、アル
ファ−フェトタンパク質、タウ−グロブリン、ベータ−グロブリン、ｃ−ｆｏｓ
、ｃ−ＨＡ−ｒａｓ、神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）、アルファ１−抗トリプシ
ン、Ｈ２Ｂ（ＴＨ２Ｂ）ヒストン、マウスまたはＩ型コラーゲン、グルコース調
節タンパク質（ＧＲＰ９４およびＧＲＰ７８）、ラット成長ホルモン、ヒト血清
アミロイドＡ（ＳＡＡ）、トロポニンＩ（ＴＮ Ｉ）、血小板由来増殖因子、デ
ュシェーヌ筋、ＳＶ４０、ポリオーマ、レトロウイルス、パピローマウイルス、
Ｂ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、サイトメガロウイルス、テナガザル
Ａｐｅ白血病ウイルス、ＭＴ ＩＩ、ＭＭＴＶ（マウス***グルココルチコイド
、アデノウイルス５Ｅ２が限定はしないが含まれる。

【００７１】 さらに任意のプロモーター／エンハンサー組合せ（真核生物プロモーターデー
タベース（Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ Ｄａｔａ Ｂａｓｅ；Ｅ
ＰＤＢによると）をまた、ｐ−Ｈｙｄｅの発現を駆動するように使用できる。Ｔ
３、Ｔ７またはＳＰ６転写発現システムの使用は他の可能な形態である。真核細
胞は、好ましい微生物ポリメラーゼが、伝送複合体の部分として、または追加的
な遺伝子発現構造物としてのいずれかで提供される場合に、特定の微生物プロモ
ーターからの細胞質転写を支持できる。

【００７２】 本発明は、以上のベクターを含んでいる宿主細胞を提供する。宿主細胞は、そ
の宿主細胞内に人工的に導入した単離ＤＮＡ分子を含んでよい。宿主細胞は、真
核細胞、（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のような）微生物細胞、酵母細胞、真菌細胞
、昆虫細胞および動物細胞であってよい。好適な動物細胞には、Ｖｅｒｏ細胞、
ＨｅＬａ細胞、Ｃｏｓ細胞、ＣＶ１細胞およびさまざまな初代哺乳動物細胞が限
定しないが含まれる。

【００７３】 本発明の他の観点は、その中に本発明の発現ベクターを導入した宿主細胞に関
する。語句「宿主細胞（ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ）」および「組換え体宿主細胞（ｒ
ｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ）」は、本明細書で交換可能に使用
する。そのような語句が、特定の対象細胞のみでなく、そのような細胞の子孫ま
たは潜在的な子孫をも意味することが理解される。特定の改変が、変異導入また
は環境の影響のいずれかによって世代に引き継がれて起こる可能性があるので、
そのような子孫は、実際には、親細胞とは同一ではないが、しかし本明細書で使
用するような語句の範囲内に含まれる。宿主細胞は、任意の原核細胞または真核
細胞であり得る。たとえばｐ−Ｈｙｄｅタンパク質は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）
のような微生物細胞、昆虫細胞、酵母または（チャイニーズハムスター卵巣細胞
（ＣＨＯ）またはＣＯＳ細胞のような）哺乳動物細胞、および当業者に公知の他
の好適な宿主細胞で発現させることができる。ベクターＤＮＡは、従来の形質転
換またはトランスフェクション技術を介して原核、または真核細胞内に導入でき
る。本明細書で使用するところの、語句「形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉ
ｏｎ）」および「トランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）」は、リ
ン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共−沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン−仲介
トランスフェクション、リポフェクション、またはエレクトロポレーションを含
む、外来核酸（たとえばＤＮＡ）を宿主細胞内に導入するためのさまざまな本技
術分野で認識された技術を意味するつもりである。宿主細胞を形質転換、または
トランスフェクトするための好適な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， ｅｔ ａｌ．
（上記）および他の研究室マニュアルで見ることができる。哺乳動物細胞の安定
トランスフェクションに関して、使用した発現ベクターおよびトランスフェクシ
ョン技術に依存して、小画分の細胞のみが、そのゲノム内に外来ＤＮＡを統合可
能であることが知られている。これらの統合を同定し、選択するために、一般的
に（たとえば抗生物質に対する抵抗性に関して）選別可能マーカーを、対象の遺
伝子と一緒に宿主細胞内へ導入する。

【００７４】 好ましい選別可能マーカーには、Ｇ４１８、ハイグロマイシンおよびメトトレ
キサートのような薬剤に対する抵抗性を提供するものが含まれる。選別可能マー
カーをコードしている核酸を、ｐ−Ｈｙｄｅをコードしているものと同様のベク
ター上で宿主細胞内に導入でき、または別々のベクター上で導入できる。導入し
た核酸で安定にトランスフェクトした細胞は、薬物選別（たとえば、好適なマー
カー遺伝子を挿入した細胞は、他の細胞が死ぬ一方で生存する）によって同定で
きる。培養液中の原核または真核宿主細胞のような本発明の宿主細胞を、ｐ−Ｈ
ｙｄｅタンパク質を産出（すなわち発現）するために使用できる。

【００７５】 したがって、本発明はさらに、本発明の宿主細胞を用いてｐ−Ｈｙｄｅタンパ
ク質を産出するための方法を提供する。１つの実施様態において、本方法は、（
ｐ−Ｈｙｄｅをコードしている組換え体発現ベクターを導入した）本発明の宿主
細胞を、ｐ−Ｈｙｄｅタンパク質を産出するように、好適な培地中で培養するこ
とを含む。他の実施様態において、方法はさらに、培地または宿主細胞からｐ−
Ｈｙｄｅを単離することを含む。本発明の宿主細胞はまた、非ヒトトランスジェ
ニック動物を産出するために使用できる。

【００７６】 たとえば、１つの実施様態において、本発明の宿主細胞は、ｐ−Ｈｙｄｅコー
ド配列を導入した受精卵母細胞または胎児幹細胞である。次いでそのような宿主
細胞を、外来ｐ−Ｈｙｄｅ配列をそれらのゲノムまたは外来ｐ−Ｈｙｄｅ配列を
除去した同種組換え体動物内に導入した非ヒトトランスジェニック動物を作製す
るために使用できる。そのような動物は、ｐ−Ｈｙｄｅの機能および／または活
性を研究するために、およびｐ−Ｈｙｄｅ活性の調節剤を同定および／または評
価するために有用である。本明細書で使用するところの、「トランスジェニック
動物（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ａｎｉｍａｌ）」は、１つまたはそれ以上のその
動物の細胞が導入遺伝子を含む、非ヒト動物、好ましくは哺乳動物、さらに好ま
しくはラットまたはマウスのような齧歯類である。トランスジェニック動物の他
の例には、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギ、ニワトリ、両生類などが
含まれる。

【００７７】 本発明のトランスジェニック動物は、ｐ−Ｈｙｄｅ−コード核酸を、たとえば
マイクロインジェクション、レトロウイルス感染によって、受精卵母細胞の雄性
前核内へ導入すること、および卵母細胞を偽妊娠メス里親動物内で発達させるこ
とによって作製できる。たとえば（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１、３、５または７）
のもののようなｐ−Ｈｙｄｅ ｃＤＮＡ配列を、導入遺伝子として、非ヒト動物
のゲノム内に導入できる。あるいは、ヒトｐ−Ｈｙｄｅ遺伝子の非ヒト相同物を
、ヒトｐ−Ｈｙｄｅ ｃＤＮＡへのハイブリッド形成に基づいて単離し、導入遺
伝子として使用できる。導入配列およびポリアデニル化シグナルをまた、導入遺
伝子の発現の効率を増加させるために、導入遺伝子内に含ませてもよい。組織特
異的調節配列（類）を、特定の細胞に対してｐ−Ｈｙｄｅタンパク質の直接発現
を指向するために、ｐ−Ｈｙｄｅ導入遺伝子に実施可能に連結できる。胎児操作
およびマイクロインジェクションを介したトランスジェニック動物、とりわけマ
ウスのような動物を作成するための方法は、本技術分野で慣例的になってきてお
り、たとえば米国特許第４，７３６，８６６号および第４，８７０，００９号、
米国特許第４，８７３，１９１号、およびＨｏｇａｎ，マウス胎児の操作（Ｍａ
ｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ）、（Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８６）で記述されている。同様の方
法を、他のトランスジェニック動物の産出のために使用する。トランスジェニッ
ク創始動物を、そのゲノム中のｐ−Ｈｙｄｅ導入遺伝子の存在および／またはそ
の動物の組織または細胞内のｐ−Ｈｙｄｅ ｍＲＮＡの発現に基づいて同定でき
る。トランスジェニック創始動物を次いで、導入遺伝子を持っているさらなる動
物を繁殖させるために使用できる。さらに、ｐ−Ｈｙｄｅをコードしている導入
遺伝子を持っているトランスジェニック動物は、他の導入遺伝子を持っている他
のトランスジェニック動物に交配させることができる。

【００７８】 相同組換え動物を作製するために、ベクターを、その中に挿入、添加または置
換を導入し、それによってｐ−Ｈｙｄｅ遺伝子（たとえばｐ−Ｈｙｄｅ遺伝子の
ヒトまたは非ヒト相同物、たとえば齧歯類ｐ−Ｈｙｄｅ遺伝子）を変化させ、た
とえば機能的に崩壊させたような、ｐ−Ｈｙｄｅ遺伝子の少なくとも一部分を含
むように調製する。好ましい実施様態において、内因性ｐ−Ｈｙｄｅ遺伝子を、
機能的に崩壊させる（すなわち機能的なタンパク質をもはやコードせず、また「
ノックアウト（ｋｎｏｃｋ ｏｕｔ）」ベクターと呼ぶ）。あるいは、ベクター
を、相同組換えにおいて、内因性ｐ−Ｈｙｄｅ遺伝子が変異導入され、さもなけ
れば変更され、しかしまだ機能的タンパク質をコードしているように（たとえば
、上流調節領域を変更でき、それによって内因性ｐ−Ｈｙｄｅタンパク質の発現
を変更するように）設計できる。

【００７９】 語句「ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）」は、ウイルス発現系、自発的自己複製環状
ＤＮＡ（プラスミド）を指し、発現および非発現プラスミド両方を含む。組換え
体微生物または細胞培養が、「発現ベクター（ｅｘｐｒｅｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏ
ｒ）」の宿主となるように記述される場合、これには、染色体外環状ＤＮＡおよ
び宿主クロモソーム内に組み込んだＤＮＡの両方を含む。ベクターが宿主細胞に
よって保持されている場合、ベクターは自発的構造として有糸***の間に細胞に
よって安定に複製されるか、または宿主ゲノム内に組み込まれるかどちらかでよ
い。

【００８０】 語句「プラスミド（ｐｌａｓｍｉｄｅ）」は、細胞内で複製可能な自発的環状
ＤＮＡ分子であり、発現および非発現型両方を含む。組換え微生物または細胞培
養を、「「発現プラスミド（ｅｘｐｒｅｓｉｏｎ ｐｌａｓｍｉｄｅ）」の宿主
となるように記述される場合、これには、宿主クロモソーム（類）内に組み込ん
だ潜在的ウイルスＤＮＡを含む。プラスミドが宿主細胞によって保持されている
場合、プラスミドは自発的構造として有糸***の間に細胞によって安定に複製さ
れるか、または宿主ゲノム内に組み込まれるかどちらかでよい。

【００８１】 以下の語句は、２つまたはそれ以上の核酸分子またはポリヌクレオチド間の配
列関係を記述するために使用する。「参照配列（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｓｅｑｕ
ｅｎｃｅ）」、「比較ウインドウ（ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｗｉｎｄｏｗ）」、
「配列同一性（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」、「配列同一性の割合
（ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」、お
よび「本質的同一性（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ ｉｄｅｎｔｉｙ）」。「参照配
列」は、配列比較の基礎として使用した定義された配列であり、比較配列は、た
とえば配列表で与えられた全長ｃＤＮＡまたは遺伝子配列の一区画のようなより
大きな配列の部分集合であってよく、または完全ｃＤＮＡまたは遺伝子配列を含
んでよい。

【００８２】 比較ウインドウを並べるための配列の最適な配置は、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗ
ａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２の局所相
同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ（１９
７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の相同性配列アルゴリズムによって
、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８５：２４４４の類似性の検索方法によって、また
はこれらのアルゴリズムのコンピューター処理履行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅ
ｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ Ｒｅｌｅａｓｅ ７．０、
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ
Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩでのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよび
ＴＦＡＳＴＡ）によって実施してよい。

【００８３】 「本質的同一性（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」または「本
質的配列同一性（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｉｄｅｎｔｉｔ
ｙ）」は、デフォルトギャップを用いたプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴ
によってのような、任意で配列したときに、２つのペプチド配列が少なくとも９
０パーセント、好ましくは少なくとも９５パーセント配列同一性、さらに好まし
くは少なくとも９９パーセント配列同一性またはそれ以上を共有することを意味
する。「パーセンテージアミノ酸同一性（ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ ａｍｉｎｏ
ａｃｉｄ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」または「パーセンテージアミノ酸配列同一性（
ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｉｄｅｎｔ
ｉｔｙ）」は、任意に配列したときに、同一のアミノ酸のおよその設計したパー
センテージを持っている２つのポリペプチドのアミノ酸の比較を示す。たとえば
、「９５％アミノ酸同一性（９５％ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｉｄｅｎｔｉｔｙ
）」は、任意に配列したときに、９５％アミノ酸同一性を持つ２つのポリペプチ
ドのアミノ酸の比較を指す。好ましくは、同一でない残基の位置は、保存的なア
ミノ酸置換によって異なる。たとえば、電荷または極性のような類似の化学特性
を持っているアミノ酸の置換は、タンパク質の特性に影響を与えない可能性があ
る。例には、アスパラギンの代わりにグルタミン、アスパラギン酸の代わりにグ
ルタミン酸が含まれる。

【００８４】 ２つの配列間のパーセント同一性は、配列によって共有された同一の位置の数
の関数である（すなわち、同一の位置の％同一性／位置（たとえば重なり）の合
計＃×１００）。好ましくは２つの配列は、同一の長さである。２つの配列の間
のパーセント相同性の決定は、数学的アルゴリズムを用いて実行できる。２つの
配列の比較のために使用する数学的アルゴリズムの好ましい、非限定的な例は、
Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−５８７７においてのように改変した
、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６４−２２６８のアルゴリズムである。
そのようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍ
ｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプ
ログラム内に組み込まれている。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、本発明のｐ−
Ｈｙｄｅ核酸分子に対するヌクレオチド配列相同性を得るために、ＮＢＬＡＳＴ
プログラム、スコア＝１００、文字長＝１２で実施できる。ＢＬＡＳＴタンパク
質検索は、本発明のｐ−Ｈｙｄｅタンパク質分子に対するアミノ酸配列相同性を
得るために、Ｘ１３ＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、文字長＝３にて実施で
きる。比較の目的のためにギャップ調整アライメントを得るために、ギャップ調
節ＢＬＡＳＴを、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９７） Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．：３３８９−３４０２に記述にように使用できる。Ｂ
ＬＡＳＴおよびギャップ調節ＢＬＡＳＴプログラムを使用する場合、それぞれの
プログラム（たとえばＸ１３ＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメ
ータを使用できる。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ
を参照のこと。配列の比較のために使用した数学的アルゴリズムの他の好ましい
、非限定的な例は、Ｍｙｅｒｓ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ，ＣＡＢＩＯＳ ４：１
１−１７（１９８８）のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、ＧＣ
Ｇ配列アライメントソフトウェアパッケージの一部分であるＡＬＩＧＮプログラ
ム（バージョン２．０）に組み込まれている。アミノ酸配列比較のためのＡＬＩ
ＧＮプログラムを使用する場合、ＰＡＭ１２０重量残基表、１２のギャップ長ペ
ナルティー、および４のギャップペナルティーを使用できる。２つの配列間のパ
ーセント同一性は、ギャップを許容するか、またはせずに、上述のものと同様の
技術を使用して決定できる。パーセント同一性を計算する際、正確な適合のみを
計数する。

【００８５】 本発明は、ヒトｐ−Ｈｙｄｅ遺伝子の単離した核酸の配列と相補的な配列を持
っている核酸を提供する。とりわけ、本発明は、ヒトｐ−Ｈｙｄｅをコードして
いる核酸内に存在するヌクレオチドの配列と、特異的にハイブリッド形成するこ
とが可能な、少なくとも１５ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドを提供する。１
つの実施様態において、核酸はＤＮＡまたはＲＮＡである。他の実施様態におい
て、オリゴヌクレオチドは、検出可能なマーカーで標識する。他の実施様態にお
いて、オリゴヌクレオチドは放射活性同位体、蛍光発色団または酵素である。

【００８６】 相補的であるオリゴヌクレオチドは以下のように入手してよい。ポリメラーゼ
連鎖反応を２つのプライマーを用いて実施する。ＰＣＲプロトコール：方法およ
び適用へのガイド（ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）［７４］を参照のこと。ＰＣ
Ｒ増幅の後、ウイルスＤＮＡのＰＣＲ−増幅領域を、以上で列記した３つの特定
の核酸プローブにハイブリッド形成するその能力に関して試験できる。あるいは
、ウイルスＤＮＡの上記核酸プローブへのハイブリッド形成を、ウイルスＤＮＡ
増幅無しで、そして本明細書で記述したような厳密なハイブリッド形成条件下で
のサザンブロット手順によって実施できる。

【００８７】 プローブまたはＰＣＲプライマーとして使用するためのオリゴヌクレオチドは
、Ｎｅｅｄｈａｍ−ＶａｎＤｅｖａｎｔｅｒ［６９］で記述されたように、自動
化合成機を用いてＢｅａｕｃａｇｅ ａｎｄ Ｃａｒｒｕｔｈｅｒｓ［１９］に
よって最初に記述された固相ホスホラミダイトトリエスエテル法にしたがって化
学的に合成する。オリゴヌクレオチドの精製は、ネイティブなアクリルアミドゲ
ル電気泳動によってか、またはＰｅａｒｓｏｎ，Ｊ．Ｄ． ａｎｄ Ｒｅｇｎｉ
ｅｒ、Ｆ．Ｅ．［７５Ａ］で記述されたような、陽イオン交換ＨＰＬＣによって
かのいずれかで行う。合成オリゴヌクレオチドの配列は、Ｍａｘａｍ，Ａ．Ｍ．
ａｎｄ Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｗ．［６３］の化学的分解方法を用いて確認できる
。

【００８８】 高い厳密性ハイブリッド形成条件を、定義したイオン強度およびｐＨでの特異
的配列に対する温度融解点（Ｔｍ）よりも約５℃低いところで選択する。Ｔｍは
、５０％の標的配列が完全に一致したプローブにハイブリッド形成する（定義し
たイオン強度およびｐＨでの）温度である。典型的に、厳密な条件は、ｐＨ７で
塩濃度が少なくとも約０．０２モーラーであり、温度が少なくとも約６０℃であ
るものである。他の中で、塩基含量および相補的鎖の大きさ、有機溶媒の存在、
すなわちえんま他はホルムアミド濃度および塩基不適合の程度が含まれる、他の
因子が、ハイブリッド形成の厳密性に明らかに影響を与えるので、パラメータの
組合せが、任意の１つの絶対的測定よりも重要である。たとえば、高い厳密性を
、たとえば、６×ＳＳＣ溶液中の約６８℃での一晩ハイブリッド形成、６×ＳＳ
Ｃ溶液での室温にての洗浄、続いて０．６６×ＳＳＸ中、６×ＳＳＣ溶液中約６
８℃での洗浄によって達成する。

【００８９】 中程度の厳密性でのハイブリッド形成を、たとえば、１）３×塩化ナトリウム
、クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）、５０％ホルムアミド、ｐｈ７．５での０．１
Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液でのフィルター前ハイブリ
ッド形成およびハイブリッド形成、２）４時間、３７℃での前ハイブリッド形成
、３）１６時間での合計３，０００，０００ｃｐｍと等しい量の標識化プローブ
で３７℃にてのハイブリッド形成、４）２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ溶液中
での洗浄、５）それぞれ室温での１分間の４回の洗浄、それぞれ３０分間６０℃
での４回の洗浄、および６）乾燥およびフィルムへの感光によって実施してよい
。

【００９０】 語句「選択的にハイブリッド形成する（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ ｈｙｂｒｉ
ｄｉｚｉｎｇ ｔｏ）」は、標的配列が、全細胞内ＤＮＡまたはＲＮＡの調製に
おいて存在する場合に、特定の標的ＤＮＡまたはＲＮＡ配列にのみハイブリッド
形成、二本鎖形成、または結合する核酸プローブを指す。選択的ハイブリッド形
成によって、異なった高い厳密性のハイブリッド形成条件下で、非標的配列とは
違った様式で検出可能な様式で与えられた標的に結合するプローブを意味する。
「相補的（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｔａｒｙ）」または「標的（ｔａｒｇｅｔ）」核酸
配列は、選択的に核酸プローブにハイブリッド形成するそれらの核酸配列を指す
。適切なアニーリング条件は、たとえばプローブの長さ、塩基組成、および不適
合の数とプローブ上のその位置に依存し、しばしば経験的に決定されなければな
らない。核酸プローブ設計とアニーリング条件の議論に関しては、たとえばＳａ
ｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，［８１］またはＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．，ｅｔ ａ
ｌ．，［８］を参照のこと。

【００９１】 参考文献が特定の配列法に関して作られている場合に、そのような参考文献に
は、本質的にその相補的配列と関連する配列、およびそのような変化が、関連性
のある配列表が関係する病原性生物または疾患マーカーの核酸配列に相当するよ
うに、少量の配列エラー、単一塩基変化、欠失、弛緩のようなものの許容を含ん
で記述される配列が含まれる。

【００９２】 本発明のプライマーの組は、ＰＣＲを用いた特定のｐ−Ｈｙｄｅ対立遺伝子の
ヌクレオチド配列の決定に有用である。一本鎖ＤＮＡプライマーの組は、ｐ−Ｈ
ｙｄｅ遺伝子それ自身の増幅ＤＮＡ合成を開始するために、ｐ−Ｈｙｄｅ遺伝子
内またはその周辺の配列にアニールすることができる。これらのプライマーの完
全な組は、配列、すなわちエクソンをコードしているｐ−Ｈｙｄｅ遺伝子のすべ
てのヌクレオチドの合成を許容する。プライマーの組は、好ましくはイントロン
およびエクソン両方の合成を許容する。対立遺伝子特異的プライマーも使用でき
る。そのようなプライマーは、特定のｐ−Ｈｙｄｅ変異体対立遺伝子にのみアニ
ールし、したがって、鋳型としての変異体対立遺伝子の存在下で産物を増幅する
だけである可能性がある。

【００９３】 核酸プローブ技術は、そのようなプローブが長さにおいてかなり変化してよく
、プローブの検出を容易にするために、放射性同位元素または蛍光色素のような
検出可能標識で標識化してよいことを簡単に理解する当業者によく公知である。
ＤＮＡプローブ分子は、またはＤＮＡウイルスの単離した核酸分子の全長または
断片を、プラスミドまたはバクテリオファージのような好適なベクターに挿入し
、続いて好適な宿主細胞に形質転換し、微生物宿主細胞内で増幅し、本技術分野
でよく公知の方法を用いてＤＮＡプローブを回収することによって産出してよい
。あるいは、プローブはＤＮＡ合成機より化学的に作製してよい。

【００９４】 ＲＮＡプローブは、ＤＮＡウイルスの単離した核酸分子の全長または断片を、
Ｔ３、Ｔ７およびＳＰ６のようなバクテリオファージプロモーターの下流に挿入
することで作製してよい。多量のＲＮＡプローブを、標識化したヌクレオチドを
、好ましいＲＮＡポリメラーゼの存在下で、上流プロモーターを含む、ＤＮＡウ
イルスの直線化した単離した核酸分子またはその断片とともにインキュベートす
ることで産出してよい。

【００９５】 本明細書で定義したように、核酸プローブはＤＮＡまたはＲＮＡ断片であって
よい。ＤＮＡ断片は、たとえば、プラスミドＤＮＡを消化することで、またはＰ
ＣＲを使用することで調製でき、またはＢｅａｕｃａｇｅ ａｎｄ Ｃａｒｒｕ
ｔｈｅｒｓ［１９］によって記述されたホスホラミダイト方法によってか、また
はＭａｔｔｅｕｃｃｉ ｅｔ ａｌ．，［６２］にしたがったトリエステル法に
よってのいずれかで合成できる（両方とも参考文献として本明細書に組み込む）
。二本鎖断片を、望むのならば、化学的に合成した一本鎖を、好ましい条件下で
一緒にアニーリングすることによって、またはＤＮＡポリメラーゼを用いて、適
切なプライマー配列で相補鎖を合成することで入手してよい。核酸プローブの特
異的配列が与えられている場合、相補鎖もまた同定され、含まれると理解される
。相補鎖は、標的が二本鎖核酸である条件で同様によく働く可能性がある。特定
の配列が、核酸プローブの使用のために同定される場合、長さにして２５塩基対
またはそれ以上である列記した配列のサブシークエンスがまた、プローブとして
の使用のために含まれることも理解される。

【００９６】 本発明の核酸には、１つまたはそれ以上のアミノ酸残基の同定または局在に関
して天然に存在する形態とは異なった（タンパク質に特異的なすべての残基以下
を含む欠失類似体、１つまたはそれ以上の特異的残基が他の残基によって置換さ
れた置換類似体および１つ以上のアミノ酸残基が、ポリペプチドの末端または中
間部分に加わった添加類似体）そして天然に存在する形態のいくつかまたはすべ
ての特性を共有するポリペプチド類似体、抗原性ポリペプチドの断片または誘導
体をコードしているＤＮＡ分子を含む。これらの分子には、選別した非哺乳動物
宿主による発現に「好ましい」コドンの挿入、制限エンドヌクレアーゼ酵素によ
る開裂のための部位の供給、および簡単な発現ベクターの構築を容易にするさら
なる開始、終端または中間ＤＮＡ配列の供給が含まれる。

【００９７】 また、本発明は、ヒトｐ−Ｈｙｄｅ遺伝子の単離した核酸と特異的にハイブリ
ッド形成可能なアンチセンス分子を提供する。本発明は、単離したＤＮＡ分子に
よってコードされたペプチドまたはポリペプチドの発現を阻害することが可能な
アンタゴニストを提供する。１つの実施様態において、アンタゴニストは二本鎖
ＤＮＡ分子とハイブリッド形成できる。他の実施様態において、アンタゴニスト
は、ＤＮＡ分子にハイブリッド形成可能である三本鎖オリゴヌクレオチドである
。他の実施様態において、三本鎖オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド配列を持
つ単離したＤＮＡ分子少なくとも一部分に対して結合できる。

【００９８】 アンチセンス分子は、ＤＮＡまたはＲＮＡまたはその変異体であってよい（す
なわちタンパク質骨格を持つＤＮＡまたはＲＮＡ）。本発明は、特定のｍＲＮＡ
の翻訳において、アンチセンス核酸でＭＲＮＡを覆うこと、またはそれをリボザ
イムで開裂させることのどちらかによって、レセプター認識タンパク質の発現を
干渉するのに使用してよいアンチセンスヌクレオチドおよびリボザイムの調製に
まで発展する。

【００９９】 アンチセンス核酸は、特定のＭＲＮＡ分子の少なくとも一部分に相補的である
ＤＮＡまたはＲＮＡ分子である。細胞において、そのＭＲＮＡにハイブリッド形
成し、二本鎖分子を形成する。細胞は二本鎖形態でＭＲＮＡを翻訳しない。した
がって、アンチセンス核酸は、タンパク質内へのＭＲＮＡの発現を干渉する。

【０１００】 アンチセンスヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列は、当業者によって理
解されるであろうように、ｐ−Ｈｙｄｅ遺伝子の発現を防ぐか、または減少させ
るのに有用である。たとえば、ｐ−Ｈｙｄｅ遺伝子のすべてまたは一部分、また
はｐ−Ｈｙｄｅ領域からの他の配列（とりわけｐ−Ｈｙｄｅ遺伝子と隣接するも
の）を含んでいるポリヌクレオチドベクターを、アンチセンス方向でプロモータ
ーの制御下で配置してよく、細胞内に導入してよい。そのようなアンチセンス構
造物の細胞内での発現は、ｐ−Ｈｙｄｅ転写および／または翻訳および／または
複製を干渉する可能性がある。合成するのが簡単であり、細胞への導入に際して
より大きな分子よりも問題が少ないことから、約１５ヌクレオチドのオリゴマー
およびＡＵＧ開始コドンにハイブリッド形成する分子がとりわけ有効である。

【０１０１】 本発明は、胎児の段階での哺乳動物へ導入した単離したＤＮＡ分子の少なくと
も一部分を含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物を提供する。トランスジェニ
ック非ヒト哺乳動物を産出する方法は当業者に公知である。

【０１０２】 本発明は、ヒトｐ−Ｈｙｄｅのアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。
１つの実施様態において、アミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ．２、４、６ま
たは８で列記する。本発明は、融合タンパク質またはポリペプチドを含むキメラ
を提供する。本発明は、ポリペプチドに特異的に結合する抗体を提供する。１つ
の実施様態において、抗体はモノクローナルまたはポリクローナル抗体である。

【０１０３】 本発明はまた、ｐ−Ｈｙｄｅキメラまたは融合タンパク質も提供する。本明細
書で使用するところの「キメラタンパク質（ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ
）」または融合タンパク質（ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）」は、動作可能に
非ｐ−Ｈｙｄｅポリペプチドに連結したｐ−Ｈｙｄｅポリペプチドを含む。「ｐ
−Ｈｙｄｅポリペプチド（ｐ−Ｈｙｄｅ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」は、ｐ−
Ｈｙｄｅに相当するアミノ酸配列を持っているポリペプチドを指し、一方で「非
ｐ−Ｈｙｄｅポリペプチド（ｎｏｎ−ｐ−Ｈｙｄｅ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）
」は、本質的にｐ−Ｈｙｄｅタンパク質と同一でないタンパク質、たとえばｐ−
Ｈｙｄｅとは異なる、および同一または異なる生物より由来したタンパク質に相
当するアミノ酸配列を持っているポリペプチドを指す。ｐ−Ｈｙｄｅ融合タンパ
ク質内で、ｐ−Ｈｙｄｅポリペプチドは、ｐ−Ｈｙｄｅタンパク質のすべてまた
は一部分に相当し、好ましくはｐ−Ｈｙｄｅタンパク質の少なくとも１つの生物
学的に活性な部分に相当してよい。

【０１０４】 融合タンパク質内で、語句「動作可能に連結する（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎ
ｋｅｄ）」は、ｐ−Ｈｙｄｅポリペプチドおよび非ｐ−Ｈｙｄｅポリペプチドが
、インフレームで互いに融合していることを示すつもりである。非ｐ−Ｈｙｄｅ
ポリペプチドは、ｐ−ＨｙｄｅポリペプチドのＮ−末端またはＣ−末端に融合さ
せることができる。また他の実施様態において、融合タンパク質は、ｐ−Ｈｙｄ
ｅのすべてまたは一部分が免疫グロブリンタンパク質ファミリーのメンバーに由
来する配列と融合する、ｐ−Ｈｙｄｅ免疫グロブリン融合タンパク質である。本
発明のｐ−Ｈｙｄｅ免疫グロブリン融合タンパク質は、薬理学的組成物中に組み
込み、患者に投与できる。

【０１０５】 本発明はさらに、ｐ−Ｈｙｄｅ座の少なくとも８つの連続するヌクレオチドか
らなる配列を産出するための、重合化したヌクレオチドを含むポリヌクレオチド
を調整するための方法、およびｐ−Ｈｙｄｅ座内にコードされた少なくとも５つ
のアミノ酸を含む配列を産出するために、重合化したアミノ酸を含むポリペプチ
ドを調整する方法を提供する。

【０１０６】 本発明は、ｐ−Ｈｙｄｅ座の、または変異したｐ−Ｈｙｄｅ座のすべてまたは
一部分を含んでいる単離したポリヌクレオチドを提供する。そのようなポリヌク
レオチドは、アンチセンスポリヌクレオチドであってよい。本発明はまた、その
ような単離したポリヌクレオチドを含んでいる組換え体構造物、たとえば形質転
換した宿主細胞中での発現に好適である組換え体構造物も提供する。

【０１０７】 また、本発明では、ｐ−Ｈｙｄｅ座の一部分を含むポリペプチドまたは解析物
中のその発現産物を検出する方法が提供される。そのような方法は、さらに、ｐ
−Ｈｙｄｅ座の部分を増幅する工程を含んでよく、さらに、ｐ−Ｈｙｄｅ座の前
記部分の増幅のためのプライマーであるポリヌクレオチドの組を提供する工程を
含んでもよい。この方法は、癌の疾病素質の診断または癌の診断または予後のい
ずれかで有効である。

【０１０８】 本発明はまた、単離した分子によってコードされたポリペプチドを産出する方
法を提供し、それには、以上の宿主ベクター系を、ポリペプチドの産出を許容し
、そのようにして産出されたポリペプチドを回収するのに好適な条件下で増殖さ
せることが含まれる。

【０１０９】 さらに、単離したＤＮＡ分子によってコードされた単離したポリペプチドを、
核酸分子によってコードされた第二ポリペプチドに連結して、好適な宿主細胞内
での発現による融合タンパク質を形成してもよい。１つの実施様態において、第
二核酸分子はベータ−ガラクトシダーゼをコードしている。融合タンパク質を形
成するのに使用する他の核酸分子は、当業者に公知である。

【０１１０】 本発明は、単離したＤＮＡ分子によってコードされたポリペプチドに特異的に
結合する抗体を提供する。１つの実施様態において、抗体はモノクローナル抗体
である。他の実施様態において、抗体はポリクローナル抗体である。抗体または
ＤＮＡ分子は、放射活性標識または比色、発光または蛍光マーカー、または金を
限定しないが含む検出可能マーカーで標識してよい。放射活性標識には、³Ｈ、^{1 4} Ｃ、³²Ｐ、³³Ｐ、³⁵Ｓ、³⁶Ｃｌ、⁵¹Ｃｒ、⁵⁷Ｃｏ、⁵⁹Ｃｏ、⁵⁹Ｆｅ、⁹⁰Ｙ、¹²⁵ Ｉ、¹³¹Ｉおよび¹⁸⁶Ｒｅが限定はしないが、含まれる。発光マーカーには、フル
オレセイン、ローダミンおよびオーラミンが限定はしないが含まれる。比色マー
カーには、ビオチンおよびジゴキシゲニンが限定はしないが含まれる。ポリクロ
ーナルまたはモノクローナル抗体を産出するための方法は、当業者に公知である
。

【０１１１】 さらに、抗体または核酸分子複合体を、アルカリホスファターゼまたはセイヨ
ウワサビペルオキシダーゼのような酵素に連結してよい第二抗体によって検出し
てよい。使用しいてよい他の酵素は当業者に公知である。

【０１１２】 タンパク質またはペプチドに関する場合、「抗体に特異的に結合する（Ｓｐｅ
ｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｂｉｎｄｓ ｔｏ ａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」または「
特異的免疫活性（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｉｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｖｅ
ｗｉｔｈ）」は、ｐ−Ｈｙｄｅ以外の、ウイルスを含むタンパク質および他の微
生物の異種の集団の存在下で、本発明のｐ−Ｈｙｄｅの存在を決定する結合反応
を指す。したがって、設計した免疫アッセイ条件下で、特定化した抗体は、ｐ−
Ｈｙｄｅ抗原に結合し、試料に存在する他の抗原には有意な量では結合しない。
そのような条件下での抗体への特異的結合には、特定のタンパク質に対するその
特異性に関して選別した抗体が必要である可能性がある。たとえば、本明細書で
記述したヒトｐ−Ｈｙｄｅ免疫原に対して作製した抗体を、ｐ−Ｈｙｄｅタンパ
ク質と特異的に免疫応答性であり、他のタンパク質には免疫応答性ではない抗体
を得るために選別できる。これらの抗体は、ヒトｐ−Ｈｙｄｅタンパク質と相同
性のタンパク質を認識する。さまざまな免疫アッセイフォーマットが、特定のタ
ンパク質と特異的に免疫応答性である抗体を選別するのに使用できる。たとえば
、固相ＥＬＩＳＡ免疫アッセイが、タンパク質と特異的に免疫活性なモノクロー
ナル抗体を選別するのに慣例的に使用される。特異的な免疫活性を決定するのに
使用できる免疫アッセイフォーマットおよび条件の記述に関して、Ｈａｒｌｏｗ
ａｎｄ Ｌａｎｅ［３２］を参照のこと。

【０１１３】 本発明は、ＤＮＡウイルスの単離したＤＮＡ分子によってコードされたポリペ
プチド上の特異的な領域を選別し、抗体を作製する方法を提供する。タンパク質
配列は、ｃＤＮＡ配列より決定してよい。アミノ酸配列は、それらが構築したタ
ンパク質内の親水性または疎水性領域を産出するかどうかを決定するために、当
業者によってよく公知の方法で解析してよい。細胞膜タンパク質の場合、疎水性
領域は、細胞膜の脂質二重膜内に挿入されるタンパク質の部分を形成することが
よく知られており、一方親水性領域は、水性環境中で、細胞表面上に局在する。
通常、疎水性領域は親水性領域よりも免疫原性であり得る。したがって、疎水性
アミノ酸配列を、ＤＮＡウイルスによってコードされている単離した核酸分子に
よってコードされたポリペプチドに特異的な抗体を作製するために選択し、使用
してよい。選択したペプチドは、商業的に入手可能な機械を用いて調製してよい
。代案として、そのようなｃＤＮＡまたはその断片を、クローン化し、発現させ
、得られたポリペプチドを回収し、免疫原として使用してよい。

【０１１４】 これらのペプチドに対するポリクローナル抗体は、選択したペプチドを用いて
動物を免役することで産出してよい。モノクローナル抗体は、免役した動物から
の抗体産出Ｂ細胞を、骨髄腫細胞と融合させること、および望ましい抗体を産出
している得られたハイブリドーマ株を選別することによるハイブリドーマ技術を
用いて調製してよい。あるいは、モノクローナル抗体は、当業者に公知のｉｎ
ｖｉｔｒｏ技術によって産出してよい。これらの抗体は、生存している動物、ヒ
ト、または動物またはヒトから単離した生物学的組織または流体中でのＤＮＡウ
イルスの単離したＤＮＡ分子によってコードされたポリペプチドの発現を検出す
るのに有用である。

【０１１５】 抗体は、本技術分野でよく公知の従来の標識化技術を使用して、直接的に標識
してよい。したがって、抗体は、たとえば³Ｈ、¹²⁵Ｉ、¹³¹Ｉおよび³⁵Ｓのよう
な放射活性同位体を使用して放射標識してよい。抗体はまた、本技術分野で公知
の技術を用いて、蛍光標識、酵素標識、フリーラジカル標識、またはバクテリオ
ファージ標識を用いて標識化してよい。典型的な蛍光標識には、フルオレセイン
、イソチオシアネート、ローダミン、フィコエリスリン、フィコシアニン、アロ
フィコシアニンおよびテキサスレッド（Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ）が含まれる。

【０１１６】 そのような特定の酵素を、共有結合にて他の分子と共役させてよく、トレーサ
ー物質の産出に関する標識として使用してよい可能性も存在する。好適な酵素に
は、アルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、グルコース−６−ホ
スフェートデヒドロゲナーゼ、マレイン酸デヒドロゲナーゼおよびペルオキシダ
ーゼが含まれる。２つの原則的な型の酵素免疫アッセイは、酵素連結免疫溶媒ア
ッセイ（ＥＬＩＳＡ）と、酵素−多重化免疫アッセイ（ＥＭＩＴ、シバ社（Ｓｙ
ｖａ Ｃｏｒｐｒａｔｉｏｎ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）としても知られてい
る、同種酵素免疫アッセイである。ＥＬＩＳＡ系において、分離は、たとえば固
相に共役した抗体の使用によって実施してよい。ＥＭＩＴ系は、トレーサー−抗
体複合体中の酵素の不活性化に依存し、活性を、分離工程の必要がなく測定でき
る。

【０１１７】 さらに、化学発光化合物を標識として使用してよい。典型的な化学発光化合物
には、ルミノール、イソルミノール、芳香族アクリジニウムエステル、イミダゾ
ール、アクリジニウム塩、およびアキサレートエステルが含まれる。同様に、化
学発光化合物は、ルシフェリン、ルシフェラーゼ、およびアクオリンを含む生物
化学発光を標識化するために使用してよい。いったん標識化したならば、抗体を
、本技術分野でよく公知の技術を用いて、免疫学的相対物（抗体または抗原性ポ
リペプチド）を同定および定量するために使用してよい。

【０１１８】 放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）の記述は、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉ
ｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂ
ｉｏｌｏｇｙ［５２］の、Ｃｈａｒｄ，Ｔ．による表題「放射免疫アッセイおよ
び関連技術への序説（Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｒａｄｉｏｉｍ
ｍｕｎｅ Ａｓｓａｙ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｔｅｑｕｎｉｑｕｅｓ）」の
章の特定の参考文献で見られ、これは本明細書で参考文献にて組み込む。さまざ
まな型の一般的な免疫性アッセイの記述は、以下の米国特許第４，３７６，１１
０号（Ｄａｖｉｄ ｅｔ ａｌ．）または４，０９８，８７６号（Ｐｉａｓｉｏ
）で見ることができる。

【０１１９】 ｐ−Ｈｙｄｅ遺伝子、特定のペプチドに関して、またはウイルスまたはペプチ
ド対する抗体に関して検出するために、免疫アッセイを使用できる。適用可能な
技術の一般的な概説は、本明細書に参考文献にて組み込んだ、Ｈａｒｌｏｗ ａ
ｎｄ Ｌａｎｅ［３２］でである。

【０１２０】 １つの実施様態において、ヒトｐ−Ｈｙｄｅに対する抗体を、試料中の薬剤を
検出するために使用できる。簡単には、薬剤またはペプチドに対する抗体を産出
するために、標的にした配列をトランスフェクト細胞、好ましくは微生物細胞内
で発現させ、精製する。産物を抗体を産出することができる哺乳動物に注入する
。遺伝子産物に特異的なモノクローナルまたはポリクローナルどちらかの抗体（
および任意の組換え体抗体）を、さまざまな免疫アッセイで使用できる。そのよ
うなアッセイには、競合的免疫アッセイ、放射免疫アッセイ、ウエスタンブロッ
ト、ＥＬＩＳＡ、間接免疫蛍光アッセイなどが含まれる。競合的免疫アッセイに
関しては、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ［３２］のページ５６７−５７３お
よび５８４−５８９を参照のこと。

【０１２１】 本発明のさらなる実施様態において、医療専門者による使用に好適な商業的な
試験キットが、先に決定した結合活性、または疑わしい標的細胞に対する先に決
定した結合活性応力があるかまたはないかを決定するために調製してよい。以上
で議論した試験技術に関して、そのようなキットの１つの種類には、もちろん選
択した方法、「競合的（ｃｏｍｐａｔｉｔｉｖｅ）」、「サンドイッチ（ｓａｎ
ｄｗｉｃｈ）」、「ＤＡＳＰ」などに依存して、少なくとも標識したポリペプチ
ドまたはその結合相手、たとえばそれに対して特異的な抗体、および指示書が含
まれる。キットはまた、緩衝液、安定剤などの周辺薬剤も含んでよい。

【０１２２】 モノクローナル抗体または組換え抗体は、当業者によく知られているさまざま
な技術によって入手できる。簡単には、一般的に骨髄腫細胞との融合によって望
ましい抗原にて免役した動物からの脾臓または他のリンパ球を不死化させる（本
明細書で参考文献にて組み込んだ、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ［
５０］を参照のこと）。不死化の他の方法には、エプスタイン バーウイルス癌
遺伝子またはレトロウイルスでの形質転換、または本技術分野でよく公知の方法
が含まれる。単一の不死化した細胞から取ったコロニーを、抗原に対する望まし
い特異性および親和性の抗体の産出に関して選別し、そのような細胞によって産
出したモノクローナル抗体の収量を、脊椎宿主の腹膜腔内への注入を含むさまざ
まな技術によって増強してよい。組換え体ファージ抗体発現系を用いた新規技術
もまた、モノクローナル抗体を作製するのに使用できる。たとえば、ＭｃＣａｆ
ｆｅｒｔｙ，Ｊ ｅｔ ａｌ．，［６４］、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｈ．Ｒ．ｅ
ｔ ａｌ．［３９］、およびＭａｒｋｓ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．［６０］を参照
のこと。

【０１２３】 そのようなペプチドは、微生物、酵母、フィラメンタス真菌、（特にバキュロ
ウイルスベクターを用いた）昆虫、および哺乳動物細胞のような組み換えて遺伝
子工学的に作製した細胞中での特定の配列を発現させることによって産出してよ
い。当業者は、ヘルペスウイルスタンパク質の発現に関して入手可能な多くの発
現系の知識を持つ。

【０１２４】 簡単には、ウイルスタンパク質をコードしている天然の、または合成の核酸の
発現は、一般的には、（構成性または誘導可能のどちらかの）プロモーターに対
する望ましい配列またはその部分を動作可能に連結することで実施し、発現ベク
ター内に組み込む。ベクターは、原核細胞または真核細胞どちらかでの複製また
は統合に好適である。典型的なクローニングベクターは、抗生物質耐性マーカー
、トランスフォーマントの選別のための遺伝子、誘導可能または調節可能プロモ
ーター領域およびウイルス遺伝子の発現に有用である翻訳末端を含む。

【０１２５】 微生物中でのクローン化した遺伝子の発現のための方法もまたよく公知である
。一般的に、原核生物系でのクローン化した遺伝子の高レベルの発現を得るため
に、ｍＲＮＡ転写を指向する強力なプロモーターを含んでいる発現ベクターを構
築することが望ましい。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に形質転換したＤＮＡベクター
中の選別マーカーの包含もまた有用である。そのようなマーカーの例には、抗生
物質に対する耐性を特定化する遺伝子が含まれる。大腸菌中での使用のための選
別マーカーおよびプロモーターに関する詳述に関して、上記［８１］を参照のこ
と。好適な原核生物宿主には、植物細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞、酵母、およ
びフィラメンタス真菌が含まれてよい。

【０１２６】 核酸から由来したペプチド、ペプチド断片を、組換え体技術によって産出し、
当業者によく公知の標準の技術によって精製してよい。組換えて産出した配列は
、直接発現するか、融合タンパク質として発現することができる。次いでタンパ
ク質を、細胞溶解（たとえば音波処理）とアフィニティークロマトグラフィーの
組合せで精製する。融合産物に関して、融合タンパク質の好ましい蛋白分解酵素
による続く消化で望ましいペプチドを放出する。

【０１２７】 タンパク質は、硫酸アンモニウムのような物質との選択的沈殿、カラムクロマ
トグラフィー、免疫精製方法などを含む、本技術分野でよく公知の標準の技術に
よって実質的な精度まで精製してよい。たとえば、参考文献にて本明細書に組み
込んだ、Ｓｃｏｐｅｓ，Ｒ．［８４］を参照のこと。

【０１２８】 本発明は、以上で列記したアミノ酸配列を含む単離した核酸およびポリペプチ
ドの類似体を指向している。類似体は、アミノ酸配列を含んだポリペプチドのＮ
またはＣＯＯＨ末端に任意に結合したＮ−末端メチオニンまたはＮ−末端ポリヒ
スチジンを持ってよい。

【０１２９】 他の実施様態において、本発明は、ポリペプチドのタンパク質分解消化産物の
結果であるポリペプチドのペプチド断片を企図する。他の実施様態において、ポ
リペプチドの誘導体は、それに結合する１つまたはそれ以上の化学部位を持つ。
他の実施様態において、この化学部位は水溶性ポリマーである。他の実施様態に
おいて、化学部位はポリエチレングリコールである。他の実施様態において、化
学部位は、モノ−、ジ−、トリ−またはテトラペギレート化される。他の実施様
態において、化学部位はＮ−末端モノペギレート化される。

【０１３０】 ポリペプチド「断片（ｆｒａｇｍｅｎｔ）」、「部分（ｐｏｒｔｉｏｎ）」ま
たは「区画（ｓｅｇｍｅｎｔ）」は、少なくとも５〜７の連続するアミノ酸、し
ばしば少なくとも約７〜９の連続するアミノ酸、典型的には少なくとも約９〜１
３の連続するアミノ酸、最も好ましくは少なくとも約２０〜３０またはそれ以上
の連続するアミノ酸のアミノ酸残基の範囲である。

【０１３１】 本発明のポリペプチドは、もし可溶性ならば、固相支持体、たとえばニトロセ
ルロース、ナイロン、カラムに詰めた物質（たとえばセファロース（Ｓｅｐｈａ
ｒｏｓｅ）ビーズ）、磁気ビーズ、グラスウール、プラスチック、金属、ポリマ
ーゲル、細胞または他の基質に共役させてよい。そのような支持体は、たとえば
ビーズ、ウェル、計量棒、または膜の形態をとってよい。

【０１３２】 「標的領域（ｔａｒｇｅｔ ｒｅｇｉｏｎ）」は、増幅および／または検出し
た核酸の領域を指す。語句「標的配列（ｔａｒｇｅｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」は
、プローブまたはプライマーが望ましい条件下で安定なハイブリッドを形成する
であろう配列を指す。

【０１３３】 ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は哺乳動物内でとても低毒性であるので（
Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９７１）、ＰＥＧの化合物への接着が好
ましく有用である。たとえば、アデノシンデアミナーゼのＰＥＧ付加物が、重症
複合免疫不全症候群の処置用にヒトでの使用のために米国にて承認された。ＰＥ
Ｇの結合によって付与される第二の利点は、異種化合物の免疫原性および抗原性
を効果的に減少させることである。本発明の化合物は、その化合物に対する、ま
たは化合物を産出する可能性のある細胞に対する宿主免疫応答を減少させるか防
ぐように、マイクロカプセル化器具中で伝送してよい。

【０１３４】 タンパク質との直接反応に好適なＰＥＧの多くの活性化形態が記述されてきた
。タンパク質アミノ酸との反応に有用なＰＥＧ薬剤には、カルボン酸の活性エス
テル、またはカルボン酸塩誘導体が含まれ、とりわけ脱離基が、Ｎ−ヒドロキシ
サクシミド、ｐ−ニトロフェノール、イミダゾールまたは１−ヒドロキシ−２−
ニトロベンゼン−４−スルフォン酸であるようなものを含む。マレイミドまたは
ハロアセチル基を含むＰＥＧ誘導体が、タンパク質のフリーのメルカプト基の改
変のための有用な薬剤である。同様に、アミノヒドラジンまたはヒドラジン基を
含むＰＥＧ薬剤は、タンパク質中の炭水化物基のペルオキシダーゼ酸化によって
生成するアルデヒドとの反応に有用である。

【０１３５】 １つの実施様態において、本明細書で記述したポリペプチドのアミノ酸残基は
、「Ｌ」異性形態であることが好ましい。他の実施様態において、レクチン活性
の望んだ機能的特性がポリペプチドによって保存される限りは、「Ｄ」異性形態
の残基を、Ｌ−アミノ酸残基の代わりに用いてよい。ＮＨ₂はポリペプチドのア
ミノ末端に存在するフリーのアミノ基を指す。ＣＯＯＨはポリペプチドのカルボ
キシ末端に存在するフリーのカルボキシ基を指す。本明細書で使用した略語は、
標準のポリペプチド命名法、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４３：３５５２−５
９（１９６９）で保存されている。

【０１３６】 すべてのアミノ酸残基配列が、左および右方向が、アミノ末端からカルボキシ
末端への従来の方向であるような式によって示されていることに注意すべきであ
る。さらに、アミノ酸残基配列の開始または終了点でのダッシュが、１つまたは
それ以上のアミノ酸残基のさらなる配列に結合したペプチドを示すことに注意す
べきである。

【０１３７】 固相、液相またはペプチド濃縮技術またはそれらの組合せのよく公知の技術を
用いて調製した合成ポリペプチドは、天然および非天然のアミノ酸を含みうる。
ペプチド合成のために使用したアミノ酸は、もともとのＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（
１９６３，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−２１５４）の固相手
順の標準の脱保護、中和、共役および洗浄プロトコールでの標準Ｂｏｃ（Ｎ−ア
ミノ保護Ｎ−ｔ−ブチルオキシカルボニル）アミノ酸樹脂または、Ｃａｒｐｉｎ
ｏ ａｎｄ Ｈａｎ（１９７２，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．３７：３４０３−３４
０９）によって最初に記述された塩基不安定性Ｎ−アミノ保護９−フルオレニル
メトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）アミノ酸であってよい。したがって、本発明の
ポリペプチドは、特別な特性を導くために、Ｄ−アミノ酸、Ｄ−およびＬ−アミ
ノ酸の混合、およびさまざまな「デザイナー（ｄｅｓｉｇｎｅｒ）」アミノ酸（
たとえばメチルアミノ酸、Ｃ−メチルアミノ酸、およびＮ−メチルアミノ酸など
）を含んでよい。合成アミノ酸には、リシンに対するオルニチン、フェニルアラ
ニンに対するフルオロフェニルアラニン、ロイシンまたはイソロイシンに対する
ノルロイシンが含まれる。さらに、特定の共役段階で特定のアミノ酸を割り当て
ることによって、アルファ−ヘリックス、アルファターン、ベータシート、ベー
タ−ターンおよび環状特性を作製できる。

【０１３８】 本発明の１つの観点において、ペプチドは、フリーのグリシンまたはグリシン
−アミド基を刺激するために、ＣＯ₂ＨまたはＣＯＮＨ₂側鎖のいずれかを組み込
んだＣ−末端に特別なアミノ酸を含んでよい。この特定の残基を考慮するための
他の方法は、リンカーからなる、またはビーズに結合した側鎖を持つＤまたはＬ
アミノ酸類似体としてのものである。１つの実施様態において、疑似フリーＣ−
末端残基は、ＤまたはＬ光学配置であってよく、他の実施例では、ＤおよびＬア
イソマーのラセミ体を使用してよい。

【０１３９】 さらなる実施様態において、ピログルタメートを、ペプチドのＮ−末残基とし
て含んでよい。ピログルタメートは、エドマン分解によってによって配列に対し
て影響を受けやすくはないけれども、置換をＮ−末ピログルタメートで与えられ
たビーズ上のペプチドの５０％のみと限定することで、シークエンシングのため
にビーズ上に十分な非ピログルタメートペプチドが残される可能性がある。当業
者は、簡単に、この技術が、Ｎ−末にエドマン分解に対して抵抗性の残基を組み
込んだ任意のペプチドのシークエンシングに使用できることを認識するであろう
。望ましい活性を示している個々のペプチドを特性化するための他の方法は、以
下に詳細に記述されている。封鎖したＮ−末基、たとえばピログルタメートを含
むペプチドの特定の活性は、特定のＮ末基が５０％のペプチドで存在する場合、
封鎖していない（０％）ペプチドとの完全な（１００％）封鎖ペプチドの活性を
比較することで簡単に示される可能性がある。

【０１４０】 さらに、本発明は、よりよく定義された構造特性を持つペプチドを調製するこ
と、および新規特性を持つペプチドを調製するために、ペプチド模倣物およびエ
ステル結合のようなペプチド模倣およびペプチド模倣結合の使用を構想している
。他の実施様態において、ペプチドが、ペプチド結合を減少させて、すなわちＲ₁ −ＣＨ₂−ＮＨ−Ｒ₂、式中Ｒ₁およびＲ₂はアミノ酸残基または配列であるよう
に組み込んで、作製してよい。ペプチド結合の減少はジペプチドサブユニットと
して導入される。そのような分子は、ペプチド結合加水分解、たとえばプロテア
ーゼ活性に抵抗性である可能性がある。そのようなペプチドは、代謝分解または
プロテアーゼ活性に対する抵抗性のために、ｉｎ ｖｉｖｏでの半減期が引き延
ばされるなどのような、固有の機能および活性を持つリガンドを提供する可能が
ある。さらに、特定の系において、不自然なペプチドが機能的活性の増強を示す
ことがよく知られており（Ｈｒｕｂｙ，１９８２，Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ
３１：１８９−１９９、Ｈｒｕｂｙ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ Ｊ．２６８：２４９−２６２）、本発明は、すべての他の位置で無作為な配
列を組み込んだ強制的ペプチドを産出するための方法を提供する。

【０１４１】 不自然な、環状または硬くなったペプチドを、ペプチドの配列中の少なくとも
二つの位置で、アミノ酸またはアミノ酸類似物が、架橋を形成するための処理の
後にペプチドを強制し、環状化し、または硬くするように架橋することが可能で
ある化学的官能基尾を提供するように挿入して合成的に提供するように調製して
よい。環状化は、ターン誘導アミノ酸を組み込む場合に好ましい可能性がある。
ペプチドを架橋することのできるアミノ酸の例は、ジスルフィド結合を形成する
システイン、ラクトンまたはラクターゼを形成するアスパラギン酸、および遷移
金属をキレートし、架橋を形成するカルボキシル−グルタミン酸（Ｇｌａ）（Ｂ
ａｃｈｅｍ）のようなキレーターである。保護したカルボキシルグルタミン酸を
、Ｚｅｅ−Ｃｈｅｎｇ ａｎｄ Ｏｌｓｏｎ（１９８０，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．９４：１１２８−１１３２）によって記述
された合成を改変することで調製してよい。ペプチドを架橋し、強制した環状の
または硬くなったペプチドを形成するように、そのペプチド配列が少なくとも二
つの架橋可能なアミノ酸を含むペプチドを、たとえばジスルフィドを形成するた
めにシステイン残基の酸化、またはキレートを形成するために金属イオンの添加
によって処理してよい。

【０１４２】 本発明は、架橋を合成的に調製するための戦略を提供する。たとえば、４つの
システイン残基をペプチド配列に組み込んだ場合、異なる保護基を使用してよい
（Ｈｉｓｋｅｙ，１９８１，ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌｙｓｉ
ｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．３，Ｇｒｏｓｓ ａｎｄ
Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ Ｙ
ｏｒｋ，ｐｐ．１３７−１６７、Ｐｏｎｓａｎｔｉ ｅｔ ａｌ．，１９９０、
Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ４６：８２５５−８２６６）。システインの第一の組
を、脱保護し、酸化し、次いで第二の組を脱保護して、酸化してよい。この方式
では、ジスルフィド架橋の定義した組が形成されうる。あるいは、システインの
一つの組と対照アミノ酸類似体の一つの組を、架橋が異なる化学特性のものであ
るように組み込んでよい。

【０１４３】 以下の非伝統的アミノ酸を、特定の構造モチーフ、１，２，３，４−テトラヒ
ドロイソキノリン−３−カルボキシレート（Ｋａｚｍｉｅｒｓｋｉ ｅｔ ａｌ
．，１９９１，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１３：２２７５−２２８３）、
（２Ｓ，３Ｓ）−メチル−フェニルアラニン、（２Ｓ、３Ｒ）−メチル−フェニ
ルアラニン、（２Ｒ、３Ｓ）−メチル−フェニルアラニンおよび（２Ｒ、３Ｒ）
−メチル−フェニルアラニン（Ｋａｚｍｉｅｒｓｋｉ ａｎｄ Ｈｒｕｂｙ，１
９９１，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．）、２−アミノテトラヒドロナフ
タレン−２−カルボン酸（Ｌａｎｄｉｓ．１９８９，Ｐｈ．Ｄ．Ｔｈｅｓｉｓ
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ａｒｉｚｏｎａ）、ヒドロキシ−１，２，３，４
−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボキシレート（Ｍｉｙａｋｅ ｅｔ ａ
ｌ．，１９８９，Ｊ．Ｔａｋｅｄａ Ｒｅｓ．Ｌａｂｓ．４３：５３−７６）、
？−カルボリン（ＤおよびＬ）（Ｋａｚｍｉｅｒｓｋｉ，１９８８，Ｐｈ．Ｄ．
Ｔｈｅｓｉｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ａｒｉｚｏｎａ）、ＨＩＣ（ヒス
チジンイソキノリンカルボン酸）（Ｚｅｃｈｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｉ
ｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．４３）、およびＨＩＣ（ヒスチジ
ン環状ウレア）（Ｄｈａｒａｎｉｐｒａｇａｄａ）を導入するためにペプチド内
に組み込んでよい。

【０１４４】 以下のアミノ酸類似体およびペプチド模倣物を、特定の二次構造を誘導または
助けるために、ペプチド内に組み込んでよい。ＬＬ−Ａｃｐ（ＬＬ−３−アミノ
−２−プロペニドン−６−カルボン酸）、ジペプチド類似体（Ｋｅｍｐ ｅｔ
ａｌ．，１９８５，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５０：５８３４−５８３８）および
以下の参考文献、Ｎａｇａｉ ａｎｄ Ｓａｔｏ，１９８５，Ｔｅｔｒａｈｅｄ
ｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２６：６４７−６５０、ＤｉＭａｉｏ ｅｔ ａｌ．，１９
８９，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．ｐ．１６８７によっ
て提供された類似物、またＧｌｙ−Ａｌａターン類似物（Ｋａｈｎ ｅｔ ａｌ
．，１９８９，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．３０：２３１７）、アミド
結合等配電子体（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏ
ｎ Ｌｅｔｔ．２９：３８５３−５８５６）、テトラゾール（Ｚａｂｒｏｃｋｉ
ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１０：５８７５−
５８８０）、ＤＴＣ（Ｓａｍａｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｉｎｔ．Ｊ．
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｅｐ．Ｒｅｓ．３５：５０１：５０９）、およびＯｌｓｏ
ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１１２：３２３−３３
３およびＧａｒｖｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５６
：４３６で教授された類似体。ベータターンおよびベータバルジオの構造的に制
限した模倣物およびそれらを含むペプチドは、１９９５年８月８日にＫａｈｎに
付与された米国特許第５，４４０，０１３号で記述されている。

【０１４５】 本発明はさらに、本発明のポリペプチドまたはペプチドの改変または誘導に関
する方法を提供する。ペプチドの改変は、当業者によく公知であり、リン酸化、
カルボキシメチル化およびアシル化を含む。改変は、化学的または酵素的方法に
よって実施してよい。他の観点において、グリコシル化または脂肪アシル化ペプ
チド誘導体を調製してよい。グリコシル化または脂肪アシル化ペプチドの調製は
本技術分野でよく公知である。脂肪アシルペプチド誘導体もまた調製してよい。
たとえば、限定した方法でではなく、フリーのアミノ基（Ｎ−末端またはリシル
）をアシル化、たとえばミリストイル化してよい。他の実施様態において、構造
−（ＣＨ₂）_nＣＨ₃の脂肪族側鎖を含むアミノ酸を、ペプチド内に組み込んでよ
い。本発明での使用に好適であるこれと他のペプチド−脂肪酸共役物は、英国特
許第ＧＢ−８８０９１６２．４、国際特許明細書番号第ＰＣＴ／ＡＵ８９／００
１６６号および以上の参考文献５で開示されている。

【０１４６】 本発明にしたがって、本技術分野内の従来の分子生物学、微生物学および組換
えＤＮＡ技術を実施してよい。そのような技術は、文献にて完全に説明されてい
る。たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」（１９８９）、「Ｃｕ
ｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ
」 Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ−ＩＩＩ［Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．，ｅｄ．（１９９
４）］、「Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂ
ｏｏｋ」Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ−ＩＩＩ［Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｉｓ，ｅｄ．（１９９４
）］、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」
Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ−ＩＩＩ［Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．，ｅｄ，（１９９４）
］、「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｔｈｅｓｉｓ」（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉ
ｔ ｅｄ．１９８４）、「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉ
ｏｎ」［Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．（１９８
５）］、「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」［
Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｓ ｅｄｓ．（１９８４）」、「
Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ」［Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ
．（１９８６）］、「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙ
ｍｅｓ」［ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）］、Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，「Ａ Ｐ
ｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」
（１９８４）を参照のこと。 誘導のための化学モチーフ 誘導のために好適である化学モチーフを、水溶性ポリマーの間より選択してよ
い。選択したポリマーは、結合する化合物が、生理学的環境のような水様環境中
で沈殿しないように、水溶性であるべきである。好ましくは、最終産物調製物の
治療的使用のために、ポリマーは薬理学的に許容可能である可能性がある。当業
者は、ポリマー／成分共役物が治療的に使用できるかどうかに関するような考慮
、もしそうなら、望ましい投与、循環時間、タンパク質分解に対する抵抗性およ
び他の考慮に基づいて、望むポリマーを選択することができるであろう。本成分
または成分類に関して、これらを、本明細書で提供されたアッセイを使用して確
かめてよい。

【０１４７】 水溶性ポリマーは、たとえばポリエチレングリコール、エチレングリコール／
プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラ
ン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラ
ン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、
ポリアミノ酸（ホモポリマーまたは無作為コポリマーのいずれか）、およびデキ
ストランまたはポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロプ
ロピレングリコールホモポリマー、プロリプロピレンオキシド／エチレンオキシ
ドコ−ポリマー、ポリオキシエチレン化ポリオールおよびポリビニルアルコール
からなる群より選択してよい。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは
、水中でのその安定性によって製造において利点を持ちうる。

【０１４８】 そのように結合するポリマー分子の数は、変化してよく、当業者は機能におけ
る効果を確かめることができる。１つはモノ誘導体化してよく、または同様のま
たは異なる化学部位（たとえば、異なる重量のポリエチレングリコールのような
ポリマー）を持つ誘導体のジ−、トリ−、テトラ−またはいくつかの組合せを準
備してよい。ポリマー分子の、成分または成分群に対する割合は、反応混合液中
のその濃度のように変化する可能性がある。一般的に、（過剰な未反応の成分ま
たは成分群およびポリマーが存在しないような反応の効率に関して）最適な比は
、誘導の望ましい程度（たとえば、モノ、ジ−、トリ−など）、選択したポリマ
ーの分子量、ポリマーが分岐しているかまたは分岐していないかどうか、および
反応条件のような因子によって決定される可能性がある。

【０１４９】 本発明は、ａ）対象より好ましい核酸試料を入手すること、（ｂ）工程（ａ）
からの核酸試料が、それによって対象がｐ−Ｈｙｄｅ遺伝子内に変異を持ってい
るかどうかを決定するように、変異ｐ−Ｈｙｄｅをコードする核酸であるか、そ
れより由来するものであるかどうかを決定することを含む、対象がｐ−Ｈｙｄｅ
遺伝子中に変異を持っているかどうかを決定するための方法を提供する。１つの
実施様態において、工程（ａ）での核酸試料は、変異ｐ−Ｈｙｄｅをコードして
いるＤＮＡの転写物に相当しているｍＲＮＡを含み、そこで工程（ｂ）の決定に
は、（ｉ）複合体を形成するように、ｍＲＮＡのオリゴヌクレオチドへの結合を
許容する条件下で、ｍＲＮＡをオリゴヌクレオチドと接触させること、（ｉｉ）
そのようにして形成した複合体を単離すること、および（ｉｉｉ）それによって
、ｍＲＮＡが変異ｐ−Ｈｙｄｅをコードしている核酸であるか、またはそれより
由来したものであるかどうか決定するために、単離した複合体中のｍＲＮＡを同
定することが含まれる。他の実施様態において、工程（ｂ）の決定することには
、ｉ）工程（ａ）の核酸試料および単離した核酸を、核酸試料および単離した核
酸の核酸の異なった、区別可能な断片への消化を許容する条件下で、制限酵素と
接触させること、（ｉｉ）核酸の断片を単離すること、および（ｉｉｉ）それに
よって、核酸試料が、変異ｐ−Ｈｙｄｅをコードしている核酸であるか、または
それより由来するものであるかどうかを決定するように、核酸試料から由来した
核酸の断片を、単離核酸 から由来した核酸の断片と比較することを含む。

【０１５０】 本発明はさらに、重合化ヌクレオチドを含んでいるポリヌクレオチドを調製し
、ｐ−Ｈｙｄｅ遺伝子の少なくとも８つの連続するヌクレオチドからなる配列を
産出するための方法、およびｐ−Ｈｙｄｅ遺伝子内にコードされた少なくとも５
つのアミノ酸を含んでいる配列を産出するために、ポリマー化しているアミノ酸
を含むポリペプチドを調整する方法を提供する。

【０１５１】 本発明は、多くのポリペプチドおよび薬理学的に効果的な担体または希釈液を
含んでいる薬理学的組成物を提供する。

【０１５２】 本発明は、ａ）対象より好ましい核酸試料を入手すること、（ｂ）工程（ａ）
からの核酸試料が、それによって対象がｐ−Ｈｙｄｅ遺伝子内に変異を持ってい
るかどうかを決定するように、変異ｐ−Ｈｙｄｅをコードする核酸であるか、そ
れより由来するものであるかどうかを決定することを含む、対象がｐ−Ｈｙｄｅ
遺伝子中に変異を持っているかどうかを決定するための方法を提供する。１つの
実施様態において、工程（ａ）での核酸試料は、変異ｐ−Ｈｙｄｅをコードして
いるＤＮＡの転写物に相当しているｍＲＮＡを含み、そこで工程（ｂ）の決定に
は、（ｉ）複合体を形成するように、ｍＲＮＡのオリゴヌクレオチドへの結合を
許容する条件下で、ｍＲＮＡをオリゴヌクレオチドと接触させること、（ｉｉ）
そのようにして形成した複合体を単離すること、および（ｉｉｉ）それによって
、ｍＲＮＡが変異ｐ−Ｈｙｄｅをコードしている核酸であるか、またはそれより
由来したものであるかどうか決定するために、単離した複合体中のｍＲＮＡを同
定することを含む。他の実施様態において、工程（ｂ）の決定することには、ｉ
）工程（ａ）の核酸試料および請求項１の単離した核酸を、核酸試料および単離
した核酸の核酸の異なった、区別可能な断片への消化を許容する条件下で、制限
酵素と接触させること、（ｉｉ）核酸の断片を単離すること、および（ｉｉｉ）
それによって、核酸試料が、変異ｐ−Ｈｙｄｅをコードしている核酸であるか、
またはそれより由来するものであるかどうかを決定するように、核酸試料から由
来した核酸の断片を、単離核酸 から由来した核酸の断片と比較することを含む
。

【０１５３】 点変異または変異体の検出は、本技術分野でよく公知の技術を使用して、ｐ−
Ｈｙｄｅ対立遺伝子の分子クローニングおよび対立遺伝子（群）のシークエンシ
ングによっって実行してよい。あるいは、公知の技術を用いて、遺伝子配列を腫
瘍組織からのゲノムＤＮＡ調製品より直接増幅できる。次いで増幅した配列のＤ
ＮＡ配列を決定できる。感受性対立遺伝子の存在を確認するためのさらに完全な
、しましまだ間接的な試験のための６つのよく公知の方法が存在する。１）一本
鎖構造解析（ＳＳＣＡ）（Ｏｒｉｔａ ｅｔ ａｌ．，１９８９）、２）還元勾
配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）（Ｗａｒｔｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０、Ｓｈ
ｅｆｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９８９）、３）ＲＮａｓｅ保護アッセイ（Ｆ
ｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９０、Ｋｉｎｓｚｌｅｒ ｅｔ ａ
ｌ．，１９９１）、４）対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯｓ）（Ｃ
ｏｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８３）、５）大腸菌ｍｕｔＳタンパク質のよう
なヌクレオチド不適合を認識するタンパク質の使用（Ｍｏｄｒｉｃｈ，１９９１
）、および６）対立遺伝子特異的ＰＣＲ（Ｒａｎｏ ＆ Ｋｉｄｄ，１９８９）
。対立遺伝子特異的ＰＣＲに関して、プライマーは、その３’末端で特定のｐ−
Ｈｙｄｅ変異とハイブリッド形成するものを使用する。特定のｐ−Ｈｙｄｅ変異
が存在しない場合、増幅産物は観察されない。増幅無反応性変異系（Ａｍｐｌｉ
ｆｉｃａｔｉｏｎ Ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ：
ＡＲＭＳ）もまた使用でき、欧州特許明細書番号第０３３２４３５およびＮｅｗ
ｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８９で開示されている。遺伝子の挿入および欠失も
また、クローニング、シークエンシングおよび増幅によって検出できる。さらに
、遺伝子または周りのマーカー遺伝子に対する消化断片長遺伝的多型（ＲＦＬＰ
）プローブを、対立遺伝子または多型断片中の挿入の変化をスコア化するのに使
用できる。そのような方法は、個々の中で発見されたｐ−Ｈｙｄｅ変異の存在に
関して影響を与える個々の関係物をスクリーニングするのにとりわけ有用である
。本技術分野で公知の挿入および欠失を検出するための他の技術も使用できる。

【０１５４】 同様の様式にて、ＤＮＡプローブを、酵素的または化学的開裂を介して不適正
を検出するのに使用できる。たとえばＣｏｔｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８、
Ｓｈｅｎｋ ｅｔ ａｌ．，１９７５、Ｎｏｖａｃｋ ｅｔ ａｌ．，１９８６
を参照のこと。あるいは、不適正は、適正二本鎖と比較した不適正二本鎖の電気
泳動移動度の変化によって検出できる。たとえば、Ｃａｒｉｅｌｌｏ，１９８８
を参照のこと。リボプローブまたはＤＮＡプローブのいずれかによって、変異を
含んでいる可能性のある細胞ｍＲＮＡまたはＤＮＡを、ハイブリッド形成の前に
ＰＣＲ（以下を参照のこと）を用いて増幅させることができる。ｐ−Ｈｙｄｅ遺
伝子のＤＮＡの変化はまた、特に変化が、欠失または挿入のようなかなりの再配
列の場合、サザンハイブリッド形成を使用して検出できる。

【０１５５】 以上で記したように、ＰＣＲに基づかないスクリーニングアッセイもまた、本
発明で企図される。本手順は、核酸プローブ（または通常のホスホジエステルを
置換したメチルホスフェート骨格のような類似体）を、低濃度のＤＮＡ標的とハ
イブリッド形成させる。このプローブは、プローブに共有結合した酵素を持って
いてよく、その共有結合はハイブリッド形成の特異性を干渉はしない。次いでこ
の酵素−プローブ−共役−標的核酸複合体を、フリーのプローブ酵素共役物より
単離し、酵素を検出のために基質を加える。酵素活性を、感度が１０ｓｕｐ３〜
１０ｓｕｐ６の増加となる、顕色または発光出力の変化として観察する。オリゴ
デオキシヌクレオチド−アルカリホスファターゼ共役物およびハイブリッド形成
プローブとしてのその使用に関する例としては、Ｊａｂｌｏｎｓｋｉ ｅｔ ａ
ｌ．，１９８６を参照のこと。

【０１５６】 二段階標識増幅方法が本技術分野で公知である。これらのアッセイは、（ジゴ
キシゲニン、ビオチンのような）小さなリガンドが、ｐ−Ｈｙｄｅに特異的に結
合できる核酸プローブに接着するという原理に基づいて働く。対立遺伝子特異的
プローブもまた、この例の範囲内で企図される。１つの例において、核酸プロー
ブに接着した小さなリガンドは、抗体−酵素共役物によって特異的に認識される
。この例の１つの実施様態において、ジゴキシゲニンは核酸プローブと接着する
。ハイブリッド形成は、化学発光基質となる、抗体−アルカリホスファターゼ共
役物によって検出する。この実施様態にしたがった核酸プローブを標識化するた
めの方法に関しては、Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９０を参照のこと。

【０１５７】 第二の例において、小さなリガンドは、第一リガンドと特異的に複合体形成す
ることのできる第二リガンド−酵素共役物によって認識される。この例のよく公
知の実施様態は、ビオチン−アビジン型の相互作用である。核酸プローブを標識
化するための方法およびビオチン−アビジンに基づいたアッセイでのその使用に
関しては、Ｒｉｇｂｙ ｅｔ ａｌ．，１９７７およびＮｇｕｙｅｎ ｅｔ ａ
ｌ．，１９９２を参照のこと。

【０１５８】 本発明の核酸プローブアッセイで、ｐ−Ｈｙｄｅを検出することが可能な核酸
プローブの反応混液を使用することもまた、本発明の範囲内で企図される。した
がって、細胞試料中のｐ−Ｈｙｄｅの存在を検出するための１つの例において、
ｐ−Ｈｙｄｅに相補的な１つ以上のプローブを使用し、特に異なったプローブの
数は、あるいは２、３または５個の異なった核酸プローブ配列である。他の例で
は、患者でのｐ−Ｈｙｄｅ遺伝子配列中の変異の存在を検出するために、反応混
液が、ｐ−Ｈｙｄｅ中に変化を持つ患者の集団で同定された、特異的変異を持つ
患者であり得るプローブを含むところで、ｐ−Ｈｙｄｅに相補的な１つ以上のプ
ローブを使用する。この実施様態では、任意の数のプローブが使用でき、好まし
くは、乳癌に対して個々のものを前もって処理したときに同定した主要な遺伝子
変異に適合しているプローブを含む可能性がある。

【０１５９】 本発明は、ヒト患者からの腫瘍試料を、前記腫瘍試料からのｐ−Ｈｙｄｅ遺伝
子、前記腫瘍試料からのｐ−Ｈｙｄｅ ＲＮＡおよび前記腫瘍試料からのｍＲＮ
Ａから作製したｐ−Ｈｙｄｅ ｃＤＮＡからなる群から選択した第一配列を、前
記患者の非腫瘍試料からのｐ−Ｈｙｄｅ遺伝子、前記非腫瘍試料からのｐ−Ｈｙ
ｄｅ ＲＮＡおよび前記非腫瘍試料からのｍＲＮＡより作製したｐ−Ｈｙｄｅ
ｃＤＮＡからなる群から選択した第二配列の遺伝子と比較することを含む前記腫
瘍中のｐ−Ｈｙｄｅ遺伝子の体細胞変化に関してスクリーニングするための方法
を提供し、ここで前記腫瘍試料からのｐ−Ｈｙｄｅ遺伝子、ｐ−Ｈｙｄｅ ＲＮ
Ａｍ、またはｐ−Ｈｙｄｅ ｃＤＮＡの配列における、前記非腫瘍試料からのｐ
−Ｈｙｄｅ遺伝子、ｐ−Ｈｙｄｅ ＲＮＡｍ、またはｐ−Ｈｙｄｅ ｃＤＮＡの
配列との違いは、前記腫瘍試料中でのｐ−Ｈｙｄｅ遺伝子の体細胞変化を示唆し
ている。

【０１６０】 本発明は、ヒト患者からの腫瘍試料を、ポリペプチド間の違いに関して解析す
るために、前記患者からの前記使用試料からのｐ−Ｈｙｄｅポリペプチドを、前
記患者の非腫瘍試料からのｐ−Ｈｙｄｅポリペプチドと比較することを含む前記
腫瘍中のｐ−Ｈｙｄｅ遺伝子の体細胞変化の存在に関するスクリーニングをする
ための方法を提供し、そこで、比較は、（ｉ）それぞれの試料中の全長ポリペプ
チドまたは切断されたポリペプチドを検出すること、または（ｉｉ）変化したｐ
−Ｈｙｄｅポリペプチドのエピトープ、または野生型ｐ−Ｈｙｄｅポリペプチド
のエピトープのいずれかに特異的に結合する抗体を、それぞれの試料からのｐ−
Ｈｙｄｅポリペプチドに接触させ、抗体結合を検出することによって実施し、前
記腫瘍試料からのｐ−Ｈｙｄｅポリペプチドと、前記非腫瘍試料からのｐ−Ｈｙ
ｄｅポリペプチドとの間の違いは、前記腫瘍試料中のｐ−Ｈｙｄｅ遺伝子の体細
胞変化の存在を示唆している。

【０１６１】 本発明は、任意のさまざまな薬物スクリーニング技術で、ｐ−Ｈｙｄｅポリペ
プチドまたはその結合断片を使用することで、化合物をスクリーニングするのに
とりわけ有用である。そのような試験で使用するｐ−Ｈｙｄｅポリペプチドまた
はその断片は、溶液中で遊離しているか、固相支持体に固定されているか、また
は細胞表面上に存在するかのいずれかであってよい。薬剤スクリーニングの１つ
の方法は、好ましくは競合的結合アッセイにおいて、ポリペプチドまたは断片を
発現している組換え体ポリヌクレオチドで安定にトランスフォームした、原核ま
たは真核宿主細胞を使用する。そのような細胞は、生存しているか、または固定
形態であるかのいずれかで、標準結合アッセイのために使用できる。たとえば、
ｐ−Ｈｙｄｅポリペプチドまたは断片と、試験している薬剤間の複合体の形成を
測定してよいし、またはｐ−Ｈｙｄｅポリペプチドまたは断片と公知のリガンド
間の複合体の形成の、試験している薬剤による干渉の程度を試験してよい。

【０１６２】 したがって、本発明は、本技術分野でよく公知の方法によって、そのような薬
剤をｐ−Ｈｙｄｅポリペプチドまたはその断片と接触させること、（ｉ）薬剤と
ｐ−Ｈｙｄｅポリペプチドまたは断片間の複合体の存在に関して、または（ｉｉ
）ｐ−Ｈｙｄｅポリペプチドまたは断片とリガンド間の複合体の存在に関してア
ッセイすることを含む、薬物のスクリーニングの方法を提供する。そのような競
合的結合アッセイにおいて、ｐ−Ｈｙｄｅポリペプチドまたは断片は、典型的に
は標識化する。遊離ｐ−Ｈｙｄｅポリペプチドまたは断片を、タンパク質：タン
パク質複合体の存在より分離し、この遊離（すなわち複合体形成しなかった）標
識の量は、それぞれ試験している薬剤のｐ−Ｈｙｄｅに対する結合またはｐ−Ｈ
ｙｄｅ：リガンド結合によるその干渉の測定である。

【０１６３】 薬剤スクリーニングの他の技術は、ｐ−Ｈｙｄｅポリペプチドに対する好適な
結合親和性を持っている化合物に対する高出力スクリーニングを提供し、１９８
４年９月１３日に発行されたＧｅｙｓｅｎ、ＰＣＴ明細書番号第ＷＯ８４／０３
５６４号で詳細に記述されている。簡単にのべると、多数の異なる小ペプチド試
験化合物を、プラスチックピンまたはいくつかの他の表面のような固相基質上に
合成する。ペプチド試験化合物を、ｐ−Ｈｙｄｅポリペプチドと反応させ、洗浄
する。次いで結合したｐ−Ｈｙｄｅポリペプチドを本技術分野でよく公知の方法
によって検出する。

【０１６４】 精製したｐ−Ｈｙｄｅをは、前述の薬物スクリーニング技術での使用のために
、プレート上に直接コートできる。しかしながら、ポリペプチドに対する非中和
抗体を、固相上のｐ−Ｈｙｄｅポリペプチドを固定化するために抗体を捕獲する
のに使用できる。本発明はまた、特異的にｐ−Ｈｙｄｅポリペプチドに結合する
ことができる中和抗体が、ｐ−Ｈｙｄｅポリペプチドまたはその断片に対する結
合で、試験化合物と競合する、競合的薬物スクリーニングアッセイの使用を企図
している。この様式では、抗体を、ｐ−Ｈｙｄｅポリペプチドの１つまたはそれ
以上の抗原決定基を共有する任意のペプチドの存在を検出するのに使用できる。

【０１６５】 薬物スクリーニングのためのさらなる技術には、機能しないｐ−Ｈｙｄｅ遺伝
子を持っている（以上で記述したような）真核細胞株または細胞群の使用が含ま
れる。これらの宿主細胞株または細胞群は、ｐ−Ｈｙｄｅポリペプチドレベルに
おいて不完全である。宿主細胞株または細胞群を薬物化合物の存在下で増殖させ
る。宿主細胞の増殖速度を測定し、化合物がｐ−Ｈｙｄｅ欠失細胞の増殖を調節
することができるのか決定する。

【０１６６】 理想的な薬物設計の目標は、対象の生物学的に活性なポリペプチド、またはた
とえばより活性であるか安定である形態のポリペプチドである、またはたとえば
ｉｎ ｖｉｖｏでのポリペプチドの機能を増強したり干渉したりする薬物を形成
するために、それが相互作用する小分子（たとえばアゴニスト、アンタゴニスト
、阻害剤）の構造的類似体を産出することである。たとえばＨｏｄｇｓｏｎ，１
９９１を参照のこと。１つのアプローチにおいて、まず対象のタンパク質の、ま
たはたとえばｐ−Ｈｙｄｅレセプターまたはリガンド複合体の三次元構造を、Ｘ
線結晶解析によって、コンピュータモデリングによって、または最も一般的には
、アプローチの組合せによって、決定する。そうしばしばではないが、ポリペプ
チドの構造に関した有用な情報を、相同的タンパク質の構造に基づいてモデリン
グすることで得てもよい。理想的な薬物設計の例は、ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤
の発展である（Ｅｒｉｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９０）。さらに、ペプチ
ド（たとえばｐ−Ｈｙｄｅポリペプチド）を、アラニックスキャン（Ｗｅｌｌｓ
，１９９１）によって解析する。この技術では、アミノ酸残基をＡｌａによって
置換し、ペプチドの活性におけるその効果を測定する。ペプチドのそれぞれのア
ミノ酸残基をこの様式で解析し、ペプチドの重要な領域を決定する。

【０１６７】 標的特異的抗体を単離し、機能的アッセイによって選別し、次いでその結晶構
造を解釈することも可能である。原則として、このアプローチによって、続く薬
物設計で基にすることのできる薬物コアが産出される。機能的な、薬理学的に活
性の抗体に対する抗イディオタイプ抗体（抗−ｉｄｓ）を作製することによって
、タンパク質結晶学を全く無視することもできる。副次的イメージの副次的イメ
ージとして、抗−ｉｄｓの結合部位が、本来のレセプターの類似物であると予想
される。次いで抗−ｉｄはペプチドの化学的または生物学的に産出されたバンク
からペプチドを同定および単離するために使用できる。選択したペプチドは、こ
こで薬物コアとして働く。

【０１６８】 したがって、たとえばｐ−Ｈｙｄｅポリペプチドの活性または安定性が改善さ
れた、またはｐ−Ｈｙｄｅポリペプチド活性の阻害剤、アゴニスト、アンタゴニ
ストとして働く薬物を設計してもよい。クローン化したｐ−Ｈｙｄｅ配列の有用
性によって、ｘ線結晶解析のような解析研究を実施するために十分な量のｐ−Ｈ
ｙｄｅポリペプチドが入手可能になる可能性がある。さらに、本明細書で提供し
たｐ−Ｈｙｄｅタンパク質配列の知識により、ｘ−線構造学に変わって、または
加えてコンピュータモデリング技術を使用することが導かれる可能性がある。

【０１６９】 本発明は、（ａ）ｐ−Ｈｙｄｅと化学化合物間の結合を許容するような条件下
で、ｐ−Ｈｙｄｅを化学化合物と接触させること、（ｂ）化学化合物のｐ−Ｈｙ
ｄｅへの結合を検出すること、（ｃ）細胞死に対する感受性を誘導可能である化
学化合物を同定するように、化学化合物がｐ−Ｈｙｄｅを阻害するかどうか決定
すること、を含む細胞死に対する感受性を誘導可能である化学物質を同定するた
めの方法を提供する。有用な診断技術には、さらに以下で詳細に議論するような
、ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリッド形成（ＦＩＳＨ）、直接ＤＮＡシークエンシン
グ、ＰＦＧＥ解析、サザンブロット解析、一本鎖構造解析（ＳＳＣＡ）、Ｒｎａ
ｓｅ保護アッセイ、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、ドットブ
ロット解析およびＰＣＲ−ＳＳＣＰが限定はしないが含まれる。

【０１７０】 ＤＮＡ配列中の多型を検出するための迅速な予備解析を、１つまたはそれ以上
の制限酵素、好ましくは多数の制限酵素によるＤＮＡ切断の連続するサザンブロ
ットを見ることによって実施できる。それぞれのブロットは、一連の正常固体お
よび一連の腫瘍を含む。ハイブリッド形成している断片（ｐ−Ｈｙｄｅ遺伝子の
近くまたは含んでいる配列でプローブした時に対照ＤＮＡと長さが異なる）を提
示しているサザンブロットは、変異の可能性を示唆している。とても多数の制限
断片を産出する制限酵素を使用する場合、パルス領域ゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）
を使用する。

【０１７１】 点変異の検出は、ｐ−Ｈｙｄｅ対立遺伝子（群）の分子クローニングおよび本
技術分野でよく公知の技術を用いた対立遺伝子（群）のシークエンシングによっ
て達成してよい。あるいは、遺伝子配列を、公知の技術を用いて、腫瘍組織から
のゲノムＤＮＡ調製品より直接的に増幅することができる。次いで増幅した配列
のＤＮＡ配列を決定できる。感受性対立遺伝子の存在を確認するためのより完全
な、しかし間接的である試験に関する６つのよく公知の方法が存在する。１）一
本鎖構造解析（ＳＳＣＡ）（Ｏｒｉｔａ ｅｔ ａｌ．，１９８９）、２）還元
勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）（Ｗａｒｔｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０、Ｓ
ｈｅｆｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９８９）、３）ＲＮａｓｅ保護アッセイ（
Ｆｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９０、Ｋｉｎｓｚｌｅｒ ｅｔ
ａｌ．，１９９１）、４）対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯｓ）（
Ｃｏｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８３）、５）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｍｕｔ
Ｓタンパク質のような、ヌクレオチド不適応を認識するタンパク質の使用（Ｍｏ
ｄｒｉｃｈ，１９９１）、および６）対立遺伝子特異的ＰＣＲ（Ｒａｎｏ ＆
Ｋｉｄｄ，１９８９）。対立遺伝子特異的ＰＣＲに関して、プラアイマーを、そ
の３’末端で特定のｐ−Ｈｙｄｅ変異とハイブリッド形成するのに使用する。特
定のｐ−Ｈｙｄｅ変異が存在しない場合、増幅産物は観察されない。増幅無反応
性変異系（Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ Ｍｕｔａｔｉ
ｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ：ＡＲＭＳ）もまた使用でき、欧州特許明細書番号第０３３
２４３５号およびＮｅｗｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８９で開示されている。遺
伝子の挿入および欠失もまた、クローニング、シークエンシングおよび増幅によ
って検出できる。さらに、遺伝子または周りのマーカー遺伝子に対する制限断片
長遺伝的多型（ＲＦＬＰ）プローブを、対立遺伝子または多型断片中の挿入の変
化をスコア化するのに使用できる。そのような方法は、個々の中で発見されたｐ
−Ｈｙｄｅ変異の存在に関して影響を与える個々の関係物をスクリーニングする
のにとりわけ有用である。本技術分野で公知の挿入および欠失を検出するための
他の技術も使用できる。

【０１７２】 同様の様式にて、ＤＮＡプローブを、酵素的または化学的開裂を介して不適正
を検出するのに使用できる。たとえばＣｏｔｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８、
Ｓｈｅｎｋ ｅｔ ａｌ．，１９７５、Ｎｏｖａｃｋ ｅｔ ａｌ．，１９８６
を参照のこと。あるいは、不適正は、適正二本鎖と比較した不適正二本鎖の電気
泳動移動度の変化によって検出できる。たとえば、Ｃａｒｉｅｌｌｏ，１９８８
を参照のこと。リボプローブまたはＤＮＡプローブのいずれかによって、変異を
含んでいる可能性のある細胞ｍＲＮＡまたはＤＮＡを、ハイブリッド形成の前に
ＰＣＲ（以下を参照のこと）を用いて増幅させることができる。ｐ−Ｈｙｄｅ遺
伝子のＤＮＡの変化はまた、特に変化が、欠失または挿入のようなかなりの再配
列の場合、サザンハイブリッド形成を使用して検出できる。

【０１７３】 ＰＣＲの使用によって増幅したｐ−Ｈｙｄｅ遺伝子のＤＮＡ配列をまた、対立
遺伝子特異的プローブを用いて選別してもよい。これらのプローブは核酸オリゴ
マーであり、それぞれは公知の変異を含んでいるｐ−Ｈｙｄｅ遺伝子配列の領域
を含む。たとえば、１つのオリゴマーは長さにして約３０ヌクレオチドでありえ
、ｐ−Ｈｙｄｅ遺伝子配列の一部分に相当している。一連のそのような対立遺伝
子プローブの使用によって、ＰＣＲ増幅産物を、ｐ−Ｈｙｄｅ遺伝子中のすでに
同定した変異の存在を同定するために選別できる。対立遺伝子特異的プローブの
、増幅したｐ−Ｈｙｄｅ配列とのハイブリッド形成は、たとえばナイロンフィル
ター上で実施できる。厳密なハイブリッド形成条件下での特定のプローブへのハ
イブリッド形成は、腫瘍組織中での対立遺伝子特異的プローブ中でと同様の変異
の存在を示唆している。

【０１７４】 ｐ−Ｈｙｄｅ ｍＲＮＡ発現の変化は、本技術分野で公知の任意の技術によっ
て検出できる。これらには、ノザンブロット解析、ＰＣＲ増幅およびＲＮａｓｅ
保護が含まれる。ｍＲＮＡ発現の減少は、野生型ｐ−Ｈｙｄｅ遺伝子の変化を示
唆している。野生型ｐ−Ｈｙｄｅ遺伝子の変化はまた、野生型ｐ−Ｈｙｄｅタン
パク質の変化に対するスクリーニングによっても検出できる。たとえば、ｐ−Ｈ
ｙｄｅでのモノクローナル抗体免疫活性を、組織を選別するのに使用できる。同
起源の抗体の欠失は、ｐ−Ｈｙｄｅ変異を示唆している可能性がある。変異対立
遺伝子の産物に特異的である抗体をまた、変異ｐ−Ｈｙｄｅ遺伝子産物を検出す
るのに使用できる。そのような免疫学的アッセイは、本技術分野で公知の任意の
従来の形式で行うことができる。これらには、ウエスタンブロット、免疫組織学
的アッセイおよびＥＬＩＳＡアッセイが含まれる。変化したｐ−Ｈｙｄｅタンパ
ク質の検出のための任意の方法を、野生型ｐ−Ｈｙｄｅ遺伝子の変化を検出する
ために使用できる。タンパク質結合測定のような機能性アッセイを使用できる。
さらに、アッセイは、ｐ−Ｈｙｄｅ生化学的機能を検出するのに使用できる。変
異ｐ−Ｈｙｄｅ遺伝子産物の発見は、野生型ｐ−Ｈｙｄｅ遺伝子の変化を示唆す
る。変異ｐ−Ｈｙｄｅ遺伝子または遺伝子産物はまた、血清、便、尿、および唾
液のような他のヒトの体試料中で検出できる。

【０１７５】 本発明はまた、ｐ−Ｈｙｄｅポリペプチドおよび断片を含む、融合ポリペプチ
ドも提供する。同種ポリペプチドは、２つまたはそれ以上のｐ−Ｈｙｄｅポリペ
プチド配列間、またはｐ−Ｈｙｄｅの配列と関連するタンパク質の間で融合して
よい。同様に、異種融合が、誘導タンパク質の特性または活性の組み合わせを示
すように構築してよい。たとえば、リガンド結合または他の領域を、異なる新規
の融合ポリペプチドまたは断片の間で「交換」してよい。そのような同種または
異種融合ポリペプチドは、たとえば結合の強度または特異性の変化を提示する可
能性がある。融合相手には、免疫グロブリン、微生物ベータ−ガラクトシダーゼ
、ｔｒｐＥ、タンパク質Ａ、ベータ−ラクタマーゼ、アルファアミラーゼ、アル
コールデヒドロゲナーゼおよび酵母アルファ交配因子が含まれる。たとえば、Ｇ
ｏｄｗｓｌｉ ｅｔ ａｌ．，１９８８を参照のこと。融合タンパク質は、典型
的には以下で記述した組換え核酸方法によって作製し、または化学的合成によっ
て作製してよい。ポリペプチドの合成のための技術は、たとえば、Ｍｅｒｒｉｆ
ｉｅｌｄ，１９６３で記述されている。

【０１７６】 ｐ−Ｈｙｄｅ対立遺伝子に関するプローブは、ｐ−Ｈｙｄｅ領域の配列または
そのｃＤＮＡより由来してよい。プローブは、任意の好適な長さであってよく、
それはｐ−Ｈｙｄｅ領域のすべてまたは一部分であり、ｐ−Ｈｙｄｅ領域に対す
る特異的なハイブリッド形成を許容する。標的配列に、プローブの配列と同一の
配列が含まれる場合、ハイブリッドが厳密な条件下でも安定であるので、プロー
ブは、たとえば約８〜３０塩基対の範囲でより短くてよい。いくらかの程度の不
適合がプローブで予想される場合、すなわちプローブがさまざまな領域に対して
ハイブリッド形成する可能性が予想される場合、必要な特異性で標的配列とハイ
ブリッド形成するより長いプローブを使用してよい。

【０１７７】 プローブには、標識またはレポーター分子に結合した単離したポリヌクレオチ
ドが含まれる可能性があり、他のポリヌクレオチド配列を単離するのに使用して
よく、標準の方法によって配列類似性を持っている。プローブを調製し、標識化
するための技術に関しては、たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９
８９またはＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９２を参照のこと。

【０１７８】 本発明の合成オリゴヌクレオチドまたは他のポリヌクレオチドを含むプローブ
は、天然に存在する、または組換え体一本鎖または二本鎖ポリヌクレオチドより
由来してよく、または化学的に合成してよい。プローブはまた、ニック翻訳、ク
レノーフィルイン反応、または他の本技術分野で公知の方法によって標識化して
よい。少なくとも約８つのヌクレオチド、通常少なくとも約１５ヌクレオチドを
持ち、ｐ−Ｈｙｄｅをコードしているポリヌクレオチド配列よりも約６ｋｂ以下
、通常約１．０ｋｂ以下であるポリヌクレオチド配列の部分がプローブとして好
ましい。プローブはまた、ｐ−ＨｙｄｅをコードしているｍＲＮＡが細胞または
組織内に存在するかどうかを決定するために使用してもよい。

【０１７９】 本発明は、細胞を入手し、この対象の細胞を、ラウス肉腫ウイルスプロモータ
ーの制御下で、ゲノムのＥ１およびＥ３領域で欠失を、そしてｐ−Ｈｙｄｅをコ
ードしている核酸の領域内に挿入を持つアデノウイルスゲノムを含んでいる複製
欠損アデノウイルス５型発現ベクターと接触させ、それによって前立腺癌細胞の
増殖を抑制する工程を含む、癌細胞の増殖を抑制する方法を提供する。

【０１８０】 本発明は、１）患者より前立腺細胞の試料を得ること、２）この細胞をラウス
肉腫ウイルスプロモーターの制御下で、ゲノムのＥ１およびＥ３領域で欠失を、
そしてｐ−Ｈｙｄｅをコードしている核酸の領域内に挿入を持つアデノウイルス
ゲノムを含んでいる複製欠損アデノウイルス５型発現ベクターと接触させること
、そして３）細胞を患者に導入し、これによって癌細胞の増殖を抑制することを
含む、前立腺癌細胞の増殖を抑制する方法を提供する。

【０１８１】 本発明は、癌細胞内に、ｐ−Ｈｙｄｅタンパク質をコードしている核酸、ｐ−
Ｈｙｄｅタンパク質の断片をコードしている核酸、または変異ｐ−Ｈｙｄｅタン
パク質をコードしている核酸を導入し、それによって患者での癌細胞の増殖を抑
制することを含む、患者内の癌細胞の増殖を抑制する方法を提供する。

【０１８２】 本発明は、患者に、治療的効果量の、ｐ−Ｈｙｄｅタンパク質をコードしてい
る核酸、ｐ−Ｈｙｄｅタンパク質の断片をコードしている核酸、または変異ｐ−
Ｈｙｄｅタンパク質をコードしている核酸および薬理学的に許容可能な担体また
は希釈液を含む薬理学的組成物を投与し、それによって患者での癌細胞の増殖を
抑制することを含む、患者内の癌細胞の増殖を抑制する方法を提供する。

【０１８３】 本明細書で論証したように、アポトーシス応答は、ＤＮＡラダーリングアッセ
イを用いて査定する。ＤＮＡを（２４時間 １ｍＭ ヒドロ尿素、続いて２４時
間 ０．１ｍＭ ５’−ｄＦＵｒｄでの）それぞれの処理の後に抽出し、１．６
％アガロースゲル電気泳動上で解析した。細胞周期解析にしたがって、安定トラ
ンスフェクタント、ＡＴ１−Ｈ１およびＡＴ３−Ｈ１（ｐｃＨＹＤＥをトランス
フェクトしたＡＴ−１およびＡＴ−３）のアポトーシス応答は、親（ＡＴ−１お
よびＡＴ−３）およびｐｃＤＮＡトランスフェトした親細胞株（ＡＴ１−ｐｃ１
およびＡＴ３−ｐｃ１）と比較して、一貫して、そして有意に高い。とりわけ、
最も高いアポトーシス応答が、図１５で示したように、０．１ｍＭの５’−ｄＦ
Ｕｒｄとのインキュベーション下での同期培養中で起こった。ヒドロキシ尿素処
理の後のＡＴ１−Ｈ１およびＡＴ３−Ｈ１トランスフェクタントのアポトーシス
応答の増強は、フルオロデオキシウリジンによるチミジレートシンターゼの直接
の阻害を介した細胞内チミジン−５−三リン酸（ＴＴＰ）プールの枯渇を導いて
いる、「チミン欠失死」（Ｋｙｐｒｉａｎｏｕ，１９９４，Ｋｙｐｒｉａｎｏｕ
ｅｔ ａｌ．，１９９４）の結果である。しかしながら、ＴＴＰ枯渇に関連し
たアポトーシスそれ自身の実際の機構は知られていない。一緒に考えると、これ
らのデータは、ｐｃＨＹＤＥ安定トランスフェクタントでのアポトーシス応答は
、ｐｃＨＹＤＥ遺伝子産物の下流効果による可能性がある。

【０１８４】 本発明は、癌細胞内に、ｐ−Ｈｙｄｅタンパク質をコードしている核酸、ｐ−
Ｈｙｄｅタンパク質の断片をコードしている核酸、または変異ｐ−Ｈｙｄｅタン
パク質をコードしている核酸を導入し、それによってアポトーシスの感受性を誘
導することを含む、癌細胞のアポトーシスの感受性を誘導する方法を提供する。

【０１８５】 本発明は、患者に、治療的効果量の、ｐ−Ｈｙｄｅタンパク質をコードしてい
る核酸、ｐ−Ｈｙｄｅタンパク質の断片をコードしている核酸、または変異ｐ−
Ｈｙｄｅタンパク質をコードしている核酸および薬理学的に許容可能な担体また
は希釈液を含む薬理学的組成物を投与し、それによってアポトーシスの感受性を
誘導することを含む、癌細胞のアポトーシスの感受性を誘導する方法を提供する
。

【０１８６】 本明細書で論証したように、ｐ−Ｈｙｄｅはｉｎ ｖｉｖｏでの癌増殖を抑制
する。低レベルのｐ−Ｈｙｄｅ発現が図９で示したようにＡＴ３細胞株で観察さ
れた。この理由に関して、ＡＴ３細胞株に、Ｇ４１８選別下、ｐｃＨＹＤＥ、ｐ
ｃＤＮＡ３．１（−）の哺乳動物発現ベクター内のｐ−Ｈｙｄｅの構造物をトラ
ンスフェクトした。陰性対照として、ＡＴ−３細胞株にベクターのみをトランス
フェクトし、得られた安定トランスフェクタントをＡＴ３−ｐｃとした。ＡＴ−
３の親細胞株の腫瘍増殖および安定トランスフェクタントＡＴ３−Ｈ１およびＡ
Ｔ３−Ｈ２でのものをｉｎ ｖｉｖｏで評価した。０．３ｍｌのハンクス溶液中
のそれぞれの細胞株の１００万個の細胞を、それぞれのインブリードオスコペン
ハーゲンラットに皮下で移植した。初期実験において、それぞれ５匹のラットの
３つの群にそれぞれの細胞株を注入した。腫瘍の大きさを図１８で示した工程の
後にスコア化した。これらの予備の結果は、ＡＴ３−Ｈ１およびＡＴ３−Ｈ２両
方の安定トランスフェクタントが、ＡＴ−３親細胞株よりも有意にゆっくりと増
殖し、両安定トランスフェクタントでの腫瘍増殖退行がｐｃＨＹＤＥ遺伝子産物
によって調節されたことを示していることを示唆している。

【０１８７】 興味深いことに、ｐ−Ｈｙｄｅは、腫瘍抑制遺伝子のように働く能力と、よっ
てｐ５３に依存しない経路である可能性のあるアポトーシスに対する感受性を誘
導する能力の二重能力を持つ。ラットでの前立腺癌の増殖はｐ−Ｈｙｄｅによっ
て顕著に阻害される。さらに、ｐ−Ｈｙｄｅを発現している前立腺癌細胞は、細
胞を細胞のプログラムされた死に誘導するＵＶ ＤＮＡ損傷に対してより感受性
である。ＤＮＡ修復酵素活性の解析によって、結果として本来の（６−４）ＰＰ
の存在と、コロニー形成アッセイによる細胞生存の減少となる欠陥が示唆された
。しかしながら、ｐ−Ｈｙｄｅの、アポトーシスに対する感受性を誘導する能力
は、ＵＶ ＤＮＡ損傷に限定はされない。フルオロウラシル（５−ＦＵ）に関連
し、広い範囲のヒト上皮悪性腫瘍の治療で使用されているピリミジン代謝拮抗物
質であり、化学治療剤である、フルオロデオキシウリジンもまた、ｐ−Ｈｙｄｅ
を発現している前立腺癌細胞でのアポトーシスを誘導する。さらに、ｐ−Ｈｙｄ
ｅを発現している癌細胞はまた、ガンマ放射により感受性である。したがって、
細胞ＤＮＡ損傷の機構は、ＵＶ、ガンマ照射、およびフルオロデオキシウリジン
で異なるので、細胞をアポトーシスに対してより感受性にする能力は、活性にお
いてより包括的であることを示している。ｐ−Ｈｙｄｅのこの固有の機能は、ア
ポトーシスに対する感受性を誘導する新しい型の遺伝子を表している可能性があ
る。これは、直接的にアポトーシスを誘導し、アポトーシスに対する感受性を誘
導するのではないｐ５３のような癌抑制遺伝子の原因である機能とは異なる（Ｙ
ｏｎｉｓｈ−Ｒｏｕａｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９９１）。さらに、ｐ−Ｈｙｄｅ
活性は、ｂｃｌ−２がない場合には起こらない、ｂｃｌ−２と対照的に、癌細胞
を細胞のプログラムされた死に対してより感受性にする（ＭｃＤｏｎｅｌｌ ｅ
ｔ ａｌ．，１９９２）。

【０１８８】 本発明は、癌細胞内に、ｐ−Ｈｙｄｅタンパク質をコードしている核酸、ｐ−
Ｈｙｄｅタンパク質の断片をコードしている核酸、または変異ｐ−Ｈｙｄｅタン
パク質をコードしている核酸を導入し、それによってアポトーシスの感受性を誘
導することを含む、癌細胞を抑制する方法を提供する。

【０１８９】 本発明は、患者に、治療的効果量の、ｐ−Ｈｙｄｅタンパク質をコードしてい
る核酸、ｐ−Ｈｙｄｅタンパク質の断片をコードしている核酸、または変異ｐ−
Ｈｙｄｅタンパク質をコードしている核酸および薬理学的に許容可能な担体また
は希釈液を含む薬理学的組成物を投与し、それによって癌細胞を抑制することを
含む、癌細胞を抑制する方法を提供する。

【０１９０】 本発明は、治療的効果量の、ｐ−Ｈｙｄｅタンパク質をコードしている核酸、
ｐ−Ｈｙｄｅタンパク質の断片をコードしている核酸、または変異ｐ−Ｈｙｄｅ
タンパク質をコードしている核酸および薬理学的に許容可能な担体または希釈液
を含む薬理学的組成物を投与し、それによって癌患者を処置することを含む、癌
患者を処置する方法を提供する。

【０１９１】 本発明は、１）患者に、放射線療法、化学治療、またはＵＶ模倣薬剤との組合
せで、ｐ−Ｈｙｄｅタンパク質をコードしている核酸、ｐ−Ｈｙｄｅタンパク質
の断片をコードしている核酸、または変異ｐ−Ｈｙｄｅタンパク質をコードして
いる核酸および２）薬理学的に許容可能な担体または希釈液を含む薬理学的組成
物を投与して、それによって癌患者を処置することを含む、癌患者を処置する方
法を提供する。

【０１９２】 ｐ−Ｈｙｄｅ遺伝子の固有の機能特性は、過剰増殖損傷および癌の処置に活用
してよい。１つの効果的な治療戦略は、たとえば、（アセチルアミノフルオリン
のような）化学治療剤またはＵＶ模倣薬物でのｐ−Ｈｙｄｅを発現している癌腫
細胞の処置であってよい。しかしながら、癌細胞は、ｐ−Ｈｙｄｅの有意なレベ
ルの増殖抑制を産出しなさそうである。その結果として、ｐ−Ｈｙｄｅ遺伝子を
、遺伝子治療によって癌細胞内に導入してよい。ｐ−Ｈｙｄｅを含んでいるベク
ターで形質転換した癌は、本研究で示したようにｐ−Ｈｙｄｅによって直接抑制
されるだけではなく、化学療法、ＵＶ模倣薬物または放射線療法のようなＤＮＡ
損傷治療との組合せで処理した場合に、よりすぐれた抗癌効果さえ持つ可能性が
ある。遺伝子治療は、癌細胞を標的にする可能性があるので、ここで、アポトー
シス増強が、ＤＮＡ損傷（ＵＶ、放射線療法または化学療法）を受けた癌細胞で
より選択的に起こる可能性がある。

【０１９３】 ３つのＤＮＡ酵素修復系が、ｐ−Ｈｙｄｅトランスフェクト細胞と比較して親
で上昇した。ウリジンホスホリラーゼ、ウリジンキナーゼ、およびＵＶ損傷修復
である。ＵＶ損傷修復は、ｐ−Ｈｙｄｅトランスフェクト細胞で正常に機能しな
かった。図１６は、ＤＮＡ修復活性の減少が、結果として、より高い濃度のもと
もとの光化学反応生成物（６４ＰＰ）となることを示している。これらのデータ
と一致して、ｐ−Ｈｙｄｅトランスフェクト細胞はまた、コロニー形成アッセイ
によって測定したように、親ＡＴ３細胞と比較してＵＶ曝露の後の生存が有意に
減少した。したがって、ＤＮＡ修復酵素欠陥は、ｐ−Ｈｙｄｅをトランスフェク
トした前立腺癌でのより短い生存とアポトーシスの誘導に関連した。

【０１９４】 本発明は、１）ラウス肉腫ウイルスプロモーターの制御下で、ゲノムのＥ１お
よびＥ３領域で欠失を、そしてｐ−Ｈｙｄｅをコードしている核酸の領域内に挿
入を持つアデノウイルスゲノムを含んでいるアデノウイルス５型発現ベクター、
および２）好適な担体または希釈液を含む、治療的に効果的な量の薬理学的に許
容可能な組成物を患者に投与することを含む、癌患者を処置する方法を提供する
。１つの実施様態において、癌は、黒色腫、リンパ腫、白血病および前立腺、直
腸、膵臓、乳、脳または胃癌からなる群より選択されてよい。

【０１９５】 本発明は、癌細胞に指向した遺伝子に基づいた治療の産出に必要である方法を
提供する。これらの治療適薬剤は、好ましいベクター内に位置する、ｐ−Ｈｙｄ
ｅ座のすべてまたは一部分を含むポリヌクレオチドの形態をとってよく、または
ｐ−Ｈｙｄｅ タンパク質の機能がもとにもどるような、より直接的な方法で標
的細胞に伝送してよい。治療適薬剤はまた、ｐ−Ｈｙｄｅの一部分、または全タ
ンパク質配列のいずれかに基づいたポリペプチドの形態を取ってよい。これらは
、ｉｎ ｖｉｖｏで、ｐ−Ｈｙｄｅの活性を機能的に置換する可能性がある。

【０１９６】 好適な体液には、血清、血漿、脳脊髄液、リンパ球、尿、濾出液、または滲出
液が限定はしないが含まれる。好ましい実施様態において、好適な体液試料は血
清または血漿である。さらに、体液試料は、骨髄からの細胞または細胞培養液か
らの上清であってよい。患者から好適な体液試料を得る方法は、当業者に公知で
ある。抗体または抗原の濃度を決定する方法には、ＥＬＩＳＡ、ＩＦＡおよびウ
エスタンブロッティングが限定はしないが含まれる。

【０１９７】 本発明の診断的アッセイは、核酸ハイブリッド形成アッセイおよび、本明細書
で記述したヒトｐ−Ｈｙｄｅの核酸配列に関して検出するための特定の核酸の増
幅を検出するアッセイのような核酸アッセイであり得る。

【０１９８】 標的特異的プローブは、核酸ハイブリッド形成診断で使用してよい。プローブ
は、対象の標的に特異的であるかまたは相補的である。正確な対立分化に関して
、プローブは約１４ヌクレオチド長、好ましくは２０〜３０ヌクレオチドである
べきである。本発明のヒトｐ−Ｈｙｄｅのより一般的な検出に関して、核酸プロ
ーブは、約５０〜約１０００ヌクレオチドであり、より好ましくは約２００〜約
４００ヌクレオチドである。

【０１９９】 特異的核酸プローブは、ＲＮＡまたはＤＮＡポリヌクレオチドまたはオリゴヌ
クレオチド、またはその類似体でありうる。プローブは一本鎖または二本鎖ヌク
レオチドであってよい。本発明のプローブは、本技術分野でよく公知の方法（た
とえばニック翻訳、プライマー伸張、逆転写、ポリメラーゼ連鎖反応など）を用
いて酵素的に、または化学的に（たとえば、両方とも参考文献として本明細書で
記述されている、Ｂｅａｕｃａｇｅ ａｎｄ Ｃａｒｒｕｔｈｅｒｓ［１９］に
よって記述されたホスホラミダイト法のような方法にて、またはＭａｔｔｅｕｃ
ｃｉ ｅｔ ａｌ．［６２］にしたがったトリエステル方法にて）合成してよい
。

【０２００】 ヒトｐ−Ｈｙｄｅの存在を決定するための他の方法は、ｉｎ ｓｉｔｕハイブ
リッド形成、またはより最近は、ｉｎ ｓｉｔｕポリメラーゼ連鎖反応である。
ｉｎ ｓｉｔｕ ＰＣＲはＮｅｕｖｏ ｅｔ ａｌ．［７１］ポリメラーゼ連鎖
反応（ＰＣＲ）増幅Ｃ型肝炎ｃＤＮＡの細胞内局在（Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａ
ｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒ
ｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）−ａｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｃ
ＤＮＡ）、Ｂａｇａｓｒａ ｅｔ ａｌ．［１０］、ｉｎ ｓｉｔｕポリメラー
ゼ連鎖反応での単核細胞中のＩ型ヒト免疫不全ウイルスプロウイルスの検出（Ｄ
ｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖ
ｉｒｕｓ ｔｙｐｅ Ｉ ｐｒｏｖｉｒｕｓ ｉｎ ｍｏｎｏｃｕｌｅａｒ ｃ
ｅｌｌｓ ｂｙ ｉｎ ｓｉｔｕ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａ
ｃｔｉｏｎ）、およびＨｅｎｉｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．［３５］、ｉｎ ｓｉｔ
ｕ逆転写ポリメラーゼ連鎖反応によって示された細胞内ＥＧＦレセプターｍＲＮ
Ａ発現の変化（Ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｉｎ ｃｅｌｌｕｌａｒ ＥＧＦ ｒｅｃ
ｅｐｔｏｒ ｍＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ ｂ
ｙ ｉｎ ｓｉｔｕ ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒ
ｅａｃｔｉｏｎ）で記述されている。ｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成アッセイ
は、よく公知であり、一般的に、本明細書に参考文献にて組み込んだ、Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．［６７］に記述されている。ｉｎ ｓｉｔｕハイブリ
ッド形成において、細胞を固体支持体、典型的にはガラススライドに固定する。
次いで細胞を、標識化した標的特異的プローブのアニーリングを許容するような
適度の温度で、ハイブリッド形成溶液と接触させる。プローブは好ましくは放射
性同位体または蛍光レポーターで標識化する。

【０２０１】 上述したプローブはまた、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成のために、または
この遺伝子を発現している組織の位置を確認するために、またはさまざまな生物
学的組織中のこの遺伝子またはそのＭＲＮＡの存在に関する他のハイブリッド形
成アッセイのために有用である。ｉｎ−ｓｉｔｕハイブリッド形成は、抗原の発
現または天然対変性条件に依存しない、感度のよい局在化方法である。

【０２０２】 簡単には、阻害核酸治療アプローチは、ＤＮＡ配列を標的にするもの、（前ｍ
ＲＮＡおよびｍＲＮＡを含む）ＲＮＡ配列を標的にするもの、タンパク質を標的
にするもの（センス鎖アプローチ）および標的核酸の開裂または化学的改変を引
き起こすものに分類できる。

【０２０３】 ＤＮＡを標的にするアプローチは、いくつかの種類に分けられる。核酸は、三
重らせんまたは「三つ組み」構造を形成するように、二本鎖ＤＮＡの大きい方の
溝に結合するように設計できる。あるいは、阻害核酸は、複製または転写の間の
二本鎖ＤＮＡの開裂の結果としての一本鎖ＤＮＡの領域に結合するように設計で
きる。

【０２０４】 さらに一般的には、阻害核酸は、ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ前駆体に結合するよ
うに設計する。阻害核酸は、前−ｍＲＮＡの成熟化を防止するために使用する。
阻害核酸は、ＲＮＡプロセシング、スプライシングまたは翻訳を干渉するために
設計してよい。

【０２０５】 阻害核酸は、ｍＲＮＡを標的化できる。このアプローチにおいて、阻害核酸は
、コードされたタンパク質の翻訳を特に阻害するように設計する。このアプロー
チを用いて、阻害核酸は、重要なタンパク質をコードしているｍＲＮＡの翻訳の
阻害によって、ある細胞機能を選択的に抑制するために使用できる。たとえば、
ｃ−ｍｙｃ ｍＲＮＡの領域に相補的な阻害核酸は、ｃ−ｍｙｓプロト癌遺伝子
を過剰発現している、ヒト前骨髄球細胞株ＨＬ６０中でのｃ−ｍｙｓタンパク質
発現を阻害する。Ｗｉｃｈｓｔｒｏｍ Ｅ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．［９３］および
Ｈａｒｅｌ−Ｂｅｌｌａｎ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．［３１Ａ］を参照のこと。Ｈｅ
ｌｅｎ ａｎｄ Ｔｏｕｌｍｅで記述されたように、ｍＲＮＡを標的としている
阻害核酸は、コードされたタンパク質（類）の翻訳を阻害するためにいくつかの
異なった機構で働いていることが示された。

【０２０６】 結論として、阻害核酸は、標的遺伝子またはｍＲＮＡの化学的不活性化または
開裂を誘導するのに使用できる。化学的開裂は、細胞内で阻害核酸と標的核酸の
間の架橋の誘導によって起こりうる。好ましく誘導された阻害核酸によって誘導
された標的核酸の他の化学的改変も使用してよい。

【０２０７】 標的核酸の開裂、したがって不活性化は、開裂反応を誘導するために活性化さ
せることができる阻害核酸への置換基の結合によって影響を受けうる。置換基は
、化学的または酵素的開裂のいずれかに影響を与えるものであり得る。あるいは
、開裂は、リボゾームまたは触媒ＲＮＡの使用によって誘導できる。このアプロ
ーチにおいて、阻害核酸は、天然に存在するＲＮＡ（リボザイム）または触媒活
性を持った合成核酸のいずれかを含む可能性がある。

【０２０８】 本明細書で使用するところの、「薬理学的組成物（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃ
ａｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）」は、ＳＣＦ（幹細胞因子）治療で有用な、好
適な希釈液、保存剤、安定化剤、乳化剤、アジュバントおよび／または担体と一
緒の、治療的に効果量の本発明のポリペプチド産物を意味する。本明細書で使用
するところの「治療的に効果量（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ ｅｆｆｅｃ
ｔｉｖｅ ａｍｏｕｎｔ）」は、与えられた条件および投与計画に対して治療効
果を提供する量を指す。そのような組成物は液体または凍結乾燥、またはさもな
ければ乾燥処方であり、さまざまな緩衝液成分（たとえばＴｒｉｓ−ＨＣｌ、酢
酸、リン酸）、ｐＨおよびイオン強度、表面への吸収を防止するためのアルブミ
ンまたはゼラチンのような添加物、界面活性剤（たとえばＴｗｅｅｎ２０、Ｔｗ
ｅｅｎ８０、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８、胆汁酸塩）、可溶化剤（たとえばグリ
セロール、ポリエチレングリコール）、抗酸化剤（たとえばアスコルビン酸、メ
タ重亜硫酸ナトリウム）、保存剤（たとえばチメロサル（Ｔｈｉｍｅｒｏｓａｌ
）、ベンジルアルコール、パラベン類）、粉砕基質または張力改変剤（たとえば
ラクトース、マンニトール）、ポリエチレングリコールのようなポリマーのタン
パク質への共有結合、金属イオンとの錯体化、またはポリ乳酸、ポリグルコール
酸、ヒドロゲルなどのような重合化化合物の微粒子調製物内または上、またはリ
ポソーム、マイクロエマルション、ミセル、単層粒子、赤血球形骸またはスフェ
ロプラスト上への物質の埋め込みを含む。そのような組成物は、物理的状態、可
溶性、安定性、ｉｎ ｖｉｖｏでの放出速度およびｉｎ ｖｉｖｏでのＳＦＣの
クリアランス率に影響を与える可能性がある。組成物の選択は、ＳＦＣ活性を持
っているタンパク質の物理的および化学的活性に依存する可能性がある。たとえ
ば、ＳＣＦの膜結合形態から由来した産物は、界面活性剤を含んだ処方を必要と
する可能性がある。制御された、または保持された放出組成物には、脂肪親和性
徐放性製剤（たとえば脂肪酸、蝋、油）中の処方が含まれる。また、本発明によ
って、ポリマー（たとえばポリオキサマーまたはポリオキサミン）でコートした
微粒子組成物および組織特異的レセプター、リガンドまたは抗原に対する抗体に
共役した、または組織特異的レセプターのリガンドと共役したＳＣＦも企図され
る。本発明の組成物の他の実施様態は、微粒子形態保護コーティング、非経口、
肺、鼻および口を含むさまざまな投与経路に対するプロテアーゼ阻害剤または浸
透増強剤を組み込む。１つの実施様態において、薬理学的組成物は、非経口、経
粘膜、経皮、筋肉内、静脈内、皮内、皮下、腹腔内、心室内、頭蓋内で投与する
。

【０２０９】 さらに、本明細書で使用するところの、「薬理学的に許容可能な担体（ｐｈａ
ｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ ｃａｒｒｉｅｒ）」は当
業者によく公知であり、０．０１〜０．１Ｍおよび好ましくは０．０５Ｍリン酸
緩衝液、または０．８％生理食塩水を限定しないが含む。さらに、そのような薬
理学的に許容可能な担体は、水性または非水性の溶液、懸濁液およびエマルショ
ンであってよい。非水性溶媒の例は、ポリピレングリコール、ポリエチレングリ
コール、オリーブ油のような植物油、およびオレイン酸エチルのような注射可能
な有機エステルである。水性担体には、生理食塩水および干渉溶媒を含む、水、
アルコール／水性溶液、エマルションまたは懸濁液が含まれる。非経口賦形剤に
は、塩化ナトリウム溶液、リンガーデキストロース、デキストロースおよび塩化
ナトリウム、乳化リンガーまたは固定油が含まれる。静脈内賦形剤には、流体お
よび栄養補給剤、リンガーデキストロースを基にしたもののような電解質補給剤
などが含まれる。たとえば抗微生物剤、抗酸化剤、側支剤、不活性気体などのよ
うな保存剤および他の添加剤もまた存在してもよい。

【０２１０】 語句「アジュバント（ａｄｊｕｖａｎｔ）」は、抗原に対する免疫応答を増強
する化合物または混合物を指す。アジュバントは、抗原をゆっくりと放出する組
織徐放性製剤として、また免疫応答を非特異的に増強するリンパ系活性剤として
役に立ちうる（Ｈｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．Ｓｅｃｏｎｄ
Ｅｄ．１９８４，Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ、Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒ
ｋ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ｐ．３８４）アジュバントなしの、抗原のみを用い
た一次攻撃はしばしば、体性または細胞性免疫応答を誘導をしない可能性がある
。アジュバントには、完全フロイント（ｆｒｅｕｎｔ）アジュバント、不完全フ
ロイント（ｆｒｅｕｎｔ）アジュバント、サポニン、水酸化アルミニウムのよう
なミネラルゲル、リソレシチンのような表面活性剤、プルロニンポリオール、ポ
リアニオン、ペプチド、油または炭化水素エマルジョン、スカシガイ科ヘモシア
ニン、ジニトロフェノール、およびＢＣＧ（ｂａｃｉｌｌｉ Ｃａｌｍｅｔｔｅ
−Ｇｕｅｒｉｎ）およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍのよう
な潜在的に有用なヒトアジュバントが限定しないが含まれる。好ましくは、アジ
ュバントは薬理学的に許容可能である。

【０２１１】 制御または保持放出組成物は、脂肪親和性徐放性製剤（例えば脂肪酸、ろう、
油）中の処方を含む。本発明がさらに企図しているのは、ポリマー（例えばポロ
キサマーまたはポロキサミン）で被覆した粒状組成物および組織特異性レセプタ
ーに対する抗体に結合した化合物、組織特異性レセプターのリガンドに結合した
リガンドまたは抗原である。本発明の組成物の他の実施様態は、保護被覆した粒
子、非経口、経肺、経鼻、経口を含む様々な投与経路に対するプロテアーゼ阻害
剤または浸透増加剤を組み込んでいる。

【０２１２】 投与の際、化合物はしばしば、粘膜表面または循環から急速に除かれ、相対的
に短期の薬理学活性を誘導する。従って、治療的効果を維持するためには相対的
に多量の、生体に作用する化合物の頻繁な投与が必要である。ポリエチレングリ
コール、ポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコールのコポリマー
、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビ
ニルピロリドンまたはポリプロリンのような水溶性ポリマーの共有結合により修
飾した化合物は、対応する非修飾化合物に比べ、静脈注射後の血中でかなり長い
半減期を現すことが知られている（Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９
８１、Ｎｅｗｍａｒｋ ｅｔ ａｌ．，１９８２、ａｎｄ Ｋａｔｒｅ ｅｔ
ａｌ．，１９８７）。そのような修飾はまた、水性溶液での化合物の溶解性を増
加させ、凝集を除去し、化合物の物理的、化学的安定性を増大させ、化合物の免
疫原性および反応性を大きく減少させうる。結果として、望ましいｉｎ ｖｉｖ
ｏ生物学的活性は、非修飾化合物を用いるよりも少ない頻度または少ない投与量
で外転するそのようなポリマー化合物の投与により得られる。

【０２１３】 投与量：十分な量としては、約１μｇ／ｋｇから約１０００ｍｇ／ｋｇまでが
あるが、それに限定しない。量は１０ｍｇ／ｋｇであってよい。組成物の薬理学
的に許容可能な形態は、薬理学的に許容可能な担体を含む。

【０２１４】 活性成分を含む治療的組成物の調製は、当業者によく公知である。一般的に、
そのような組成物は鼻咽腔に投与するポリペプチドのエアゾルとして、または注
射可能物質として、液体溶液または懸濁液として調製するがしかし、溶液中また
は懸濁液中、注射前の液体で安定な固体形としても調製してよい。調製は乳化型
でもよい。治療的活性成分はしばしば薬理学的に許容でき、活性成分に適合性の
ある賦形剤と混合する。好適な賦形剤は例えば、水、塩水、デキストロース、グ
リセロール、エタノールまたはその種の他のもの、およびその組み合わせである
。さらに、必要であれば、組成物は活性成分の効果を増大させる湿潤または乳化
剤、腫瘍組織中でのｐＨ緩衝剤のような補助物質を少量含んでよい。

【０２１５】 活性成分は中和した薬理学的に許容可能な塩の形態で治療組成物中に処方して
よい。薬理学的に許容可能な塩としては、（ポリペプチドまたは抗体分子の遊離
アミノ基で形成した）酸付加塩および例えば、塩化水素酸またはリン酸のような
無機酸、または酢酸、オキサリン酸、酒石酸、マンデル酸などのような有機酸に
より形成した塩があげられる。遊離カルボニル基から形成した塩もまた、例えば
ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、または水酸化鉄のような無
機塩基、およびイソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタ
ノール、ヒスチジン、プロカインなどのような有機塩基から誘導してよい。

【０２１６】 組成物のうちタンパク質、ＤＮＡ、ベクターの少なくとも約７５重量％（Ａお
よびＢが属する種のカテゴリーに依存する）が「Ａ」である場合、（ここで「Ａ
」は単一タンパク質、ＤＮＡ分子、ベクターなど）を含む組成物は、実質上「Ｂ
」（「Ｂ」はひとつまたはそれ以上のタンパク質、ＤＮＡ分子、ベクターなどか
らなる）を含まない。好ましくは、「Ａ」が少なくとも、組成物中Ａ＋Ｂ種の約
９０重量％を構成し、最も好ましくは少なくとも約９９重量％を構成する。

【０２１７】 「治療的に効果量（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ
ａｍｏｕｎｔ）」という語句は、本明細書においては、宿主の活性、機能、応答
の臨床的に重要な障害を少なくとも１５％減少、好ましくは少なくとも５０％減
少、さらに好ましくは少なくとも９０％減少させ、最も好ましくは防止するのに
十分な量を指す。

【０２１８】 本発明によれば、本発明の成分または治療組成物の成分は、非経口的、経粘膜
的に、例えば経口、鼻、肺、または直腸、または経皮的に、非経口的、経粘膜的
に導入してよい。好ましくは、投与は非経口、例えば静脈注射により、または動
脈内、筋肉内、皮内、皮下、腹膜内、心室内、および頭蓋内投与も含むが、それ
に限定はしない。経口または肺の導入は粘膜の免疫性を活性化する。肺炎双球菌
は概して鼻咽腔および肺粘膜にコロニーを作るので、粘膜免疫性はとりわけ効果
的な予防治療である。本発明の治療組成物に対する参照において用いる語「単位
量（ｕｎｉｔ ｄｏｓｅ）」は、ヒトに対するまとまった投与量として好適な、
物理的に別々の単位を指し、それぞれの単位は、あらかじめ決定した量の、必要
な賦形剤、すなわち担体または媒介物と共同して望ましい治療効果を生むように
計算した活性物質を含む。

【０２１９】 本発明によれば、野生型ｐ−Ｈｙｄｅ機能の、変異型ｐ−Ｈｙｄｅ対立遺伝子
を持つ細胞への供給する手法も得られる。そのような機能の供給は、レシピエン
ト細胞の新生物の増殖を抑制することが期待できる。野生型ｐ−Ｈｙｄｅ遺伝子
またはこの遺伝子の一部を、遺伝子が染色体外に残っているようにベクターによ
り細胞内に導入してよい。そのような場合には、遺伝子は染色体外の部位で細胞
により発現される。遺伝子断片が変異型ｐ−Ｈｙｄｅ対立遺伝子を持つ細胞に導
入され、発現すれば、その遺伝子断片は、細胞の非新生物増殖に対して必要とな
るｐ−Ｈｙｄｅタンパク質の一部をコードするはずである。さらに好ましいのは
、野生型ｐ−Ｈｙｄｅ遺伝子またはその一部を、細胞内に存在する内生ｐ−Ｈｙ
ｄｅ遺伝子を用いて組換えるような方法で変異型細胞に導入する場合である。そ
のような組換えはｐ−Ｈｙｄｅ遺伝子変異の修正となるような二重組換えを必要
とする。組換えおよび染色体外保持における遺伝子の導入のためのベクターは、
当業者に公知であり、任意の好適なベクターを用いてよい。エレクトロポーレー
ション法、リン酸カルシウム沈降およびウイルスを用いた形質導入のような、細
胞内にＤＮＡを導入するための手法は、当業者に公知であり、手法の選択は行う
人次第である。野生型ｐ−Ｈｙｄｅ遺伝子で形質転換した細胞は、癌の鎮静およ
びそのような鎮静を助長する薬剤治療の研究においてモデル系として用いること
ができる。

【０２２０】 異常で一般的に議論したように、ｐ−Ｈｙｄｅ遺伝子または断片は、適用可能
であれば、癌細胞中のそのような遺伝子の発現産物の量を増加させるために遺伝
子治療に用いてよい。そのような遺伝子治療はとりわけ、正常な細胞と比較して
ｐ−Ｈｙｄｅポリペプチド濃度がないか、または減少しているような、癌および
前癌細胞の両方での使用に適している。変異遺伝子が「正常」レベルで発現して
いるが、遺伝子産物が十分に機能しないようなルーモア細胞中の与えられたｐ−
Ｈｙｄｅ付与遺伝子の発現レベルを増加させることもまた、有用である。

【０２２１】 遺伝子治療は、一般的に認められた手法、例えば、Ｆｒｉｅｄｍａｎ，１９９
１に記載のような手法に従って行ってよい。患者の腫瘍由来の細胞はまず、ルー
モア細胞中のｐ−Ｈｙｄｅポリペプチドの産生物を確かめるために上記の診断的
な手法によって分析する。発現制御成分に連結していて、ルーモア細胞中で複製
することができるｐ−Ｈｙｄｅ遺伝子のコピーを含むウイルス性またはプラスミ
ドベクター（下記の詳細を参照のこと）を調製する。好適なベクターは、例えば
米国特許第５，２５２，４７９号およびＰＣＴ出願明細書番号第ＷＯ ９３／０
７２８２号に記載のように、公知である。次いでベクターを、ルーモア部位に局
所的に、または全身的のどちらかで患者に注入する（他の部位に転移する可能性
のあるルーモア細胞全てに届くように）。トランスフェクトした遺伝子がそれぞ
れの標的小細胞のゲノムに永久的に組み込まれなければ、その処置を定期的に繰
り返す必要がある。

【０２２２】 当業者に公知の遺伝子伝送系は、本発明の遺伝子治療法の実行に有用でありう
る。これらにはウイルス性および非ウイルス性伝送法が含まれる。遺伝子伝送ベ
クターとして用いられているいくつかのウイルスとしては、パポバウイルス、例
えばＳＶ４０（Ｍａｄｚａｋ ｅｔ ａｌ．，１９９２）、アデノウイルス（Ｂ
ｅｒｋｎｅｒ，１９９２、Ｂｅｒｋｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８８、Ｇｏｒｚ
ｉｇｌｉａ ａｎｄ Ｋａｐｉｋｉａｎ，１９９２、Ｑｕａｎｔｉｎ ｅｔ ａ
ｌ．，１９９２、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９９２、Ｗｉｋｉｎｓ
ｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２、Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ
ｅｔ ａｌ．，１９９０）、ワクシニアウイルス（Ｍｏｓｓ，１９９２）、ア
デノ関連ウイルス（Ｍｕｚｙｃｚｋａ，１９９２、Ｏｈｉ ｅｔ ａｌ．，１９
９０）、ＨＳＶおよびＥＢＶを含むヘルペスウイルス（Ｍａｒｇｏｌｓｋｅｅ
，１９９２、Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９０、Ｆｉｎｋ ｅｔ ａｌ
．，１９９２、Ｂｒｅａｋｆｉｌｄ ａｎｄ Ｇｅｌｌｅｒ，１９８７、Ｆｒｅ
ｅｓｅ ｅｔ ａｌ．，１９９０）、および鳥類の （Ｂｒａｎｄｙｏｐａｄｈ
ｙａｙ ａｎｄ Ｔｅｍｉｎ，１９８４、Ｐｅｔｒｏｐｏｕｌｏｓ ｅｔ ａｌ
．，１９９２）、齧歯類の（Ｍｉｌｌｅｒ，１９９２、Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａ
ｌ．，１９８５、Ｓｏｒｇｅ ｅｔ ａｌ．，１９８４、Ｍａｎｎ ａｎｄ Ｂ
ａｌｔｉｍｏｒｅ，１９８５、Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８８）、およ
びヒト由来の（Ｓｈｉｍａｄａ ｅｔ ａｌ．，１９９１、Ｈｅｌｓｅｔｈ ｅ
ｔ ａｌ．，１９９０、Ｐａｇｅ ｅｔ ａｌ．，１９９０、Ｂｕｃｈｓｃｈａ
ｃｈｅｒ ａｎｄ Ｐａｎｇａｎｉｂａｎ，１９９２）レトロウイルスがあげら
れる。ほとんどのヒト遺伝子治療プロトコールは、無害化した齧歯類レトロウイ
ルスに基づいている。

【０２２３】 ｐ−Ｈｙｄｅ活性を持つペプチドを、変異型または欠失ｐ−Ｈｙｄｅ対立遺伝
子を持つ細胞に供給できる。Ｐ−Ｈｙｄｅタンパク質の配列は開示されている（
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）。タンパク質は、例えば公知の発現ベクターを用いた
、微生物中のｃＤＮＡ配列の発現により産生される。あるいは、ｐ−Ｈｙｄｅポ
リペプチドをｐ−Ｈｙｄｅ産生哺乳動物細胞から得ることができる。さらに、合
成化学の技術をｐ−Ｈｙｄｅタンパク質の合成に用いることができる。そのよう
な技術はどれもｐ−Ｈｙｄｅタンパク質を含む、本発明の調製物を供給可能であ
る。調製物は、他のヒトヒトタンパク質を実質上含まない。このことは微生物中
またはｉｎ ｖｉｔｒｏでの合成によってたやすく達成できる。

【０２２４】 ｐ−Ｈｙｄｅ分子は、例えばミクロ注入またはリポソームの利用により、細胞
内に導入してよい。あるいは、いくつかの活性分子は、能動的にまたは拡散によ
り細胞に取り込んでよい。Ｐ−Ｈｙｄｅ遺伝子産物の細胞外での適用はルーモア
増殖に作用するのに十分でありうる。Ｐ−Ｈｙｄｅ活性を持つ分子は新生物状態
の部分的逆転を導き得る。Ｐ−Ｈｙｄｅ活性を持つその他の分子（例えばペプチ
ド、薬剤または有機化合物）の供給もまた、そのような逆転をさせるために用い
てよい。

【０２２５】 別の実施様態において、活性化合物は小胞、とりわけリポソームにより導入し
てよい（Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３（１９９
０）、Ｔｒｅａｔ ｅｔ ａｌ．，感染症および癌の治療におけるリポソーム（
Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏ
ｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ），Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅ
ｉｎ ａｎｄ Ｆｉｄｌｅｒ（ｅｄｓ．），Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ
．３５３−３６５（１９８９）、Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ，ｉｂｉｄ．
，ｐｐ．３１７−３２７を参照のこと、また一般的に同書を参照のこと）。

【０２２６】 また別の実施様態において、治療的な化合物は制御放出系により導入してよい
。例えば、ポリペプチドは静脈点滴、移植浸透性ポンプ、経皮パッチ、リポソー
ム、またはその他の投与形態を用いて投与してよい。１つの実施様態では、ポン
プを用いてよい（Ｌａｎｇｅｒ，上記、Ｓｅｆｔｏｎ，ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅ
ｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１（１９８７）、Ｂｕｃｈｗａｌｄ ｅ
ｔ ａｌ．，Ｓｕｒｇｅｒｙ ８８：５０７（１９８０）、Ｓａｕｄｅｋ ｅｔ
ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５７４（１９８９）を参照のこ
と）。別の実施様態では、重合物質を使用できる（制御放出の医療への応用（Ｍ
ｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌ
ｅａｓｅ），Ｌａｎｇｅｒ ａｎｄ Ｗｉｓｅ（ｅｄｓ．），ＣＲＣ Ｐｒｅｓ
ｓ．，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ（１９７４）、制御薬剤の生物学
的利用能の制御、薬剤生産設計および実行（Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ
Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｄｅｓｉｇｎ
ａｎｄ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ），Ｓｍｏｌｅｎ ａｎｄ Ｂａｌｌ（ｅｄｓ
．），Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８４）、Ｒａｎｇｅｒ ａｎｄ Ｐ
ｅｐｐａｓ，Ｊ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．２３：６１（１９８３）を参照のこと、また、Ｌｅｖｙ ｅｔ ａｌ．，
Ｓｃｉｅｎｃｅ２２８：１９０（１９８５）、Ｄｕｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａ
ｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３５１（１９８９）、Ｈｏｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．
，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５（１９８９）も参照のこと）。さらに
別の実施様態では、制御放出系は治療標的、すなわち脳の付近においてよく、従
って全身投与量のほんの一部しか必要としない（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ， 制
御放出の医療への応用（Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃ
ｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ），上記，ｖｏｌ．２，ｐｐ．１１５−１
３８（１９８４）を参照のこと）。好ましくは、制御放出装置を、患者の、不適
当な免疫活性部位または腫瘍部の付近に導入する。別の制御放出系はＬａｎｇｅ
ｒによる総覧（Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９：１５２７−１５３３（１９９０））に記
載されている。

【０２２７】 前述のような、活性化合物の投与が、細菌感染に対する効果的な治療的投与計
画であるような患者は、ヒトが好ましいが、どんな動物でもよい。したがって、
当業者により容易に理解されるように、本発明の手法および薬理学的組成は任意
の動物、好ましくは哺乳類、またそれに限定はしないがネコ科またはイヌ科動物
のような、飼いならされた動物、それに限定はしないが例えばウシ亜科、ウマ科
、ヤギ、ヒツジ、ブタのような家畜動物、野生動物（野生または動物園内どちら
でも）、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコなど、すな
わち獣医学に利用するための研究動物への応用に特に適している。

【０２２８】 本発明の治療的手法および組成物において、治療に効果的な投与量の活性組成
物が得られる。治療に効果的な投与量は、当業者に公知のように、患者の特徴（
年齢、体重、性別、健康状態、合併症、その他の疾病など）に基づいて医学の専
門家が決定してよい。さらに、従来の研究がさらに行われれば、様々な状態の様
々な患者の治療のために適切な投与量に関してより明確な情報が得られ、専門家
は、治療状況、受治療者の年齢および大体の健康状態を考慮して適切な投与量を
確かめることができる。一般に、静脈注射または点滴における投与量は、腹膜内
、筋肉内、またはその他の投与経路におけるものよりも少なくてよい。投与計画
は循環半減期、および使用形態により変化させてよい。組成物は、治療に効果的
な量の投薬処方に合った方法で投与する。投与する必要のある活性成分の正確な
量は実務者の判断に依存し、個々人に特有である。しかしながら、適切な投与量
は、投与経路によって、１日当たり、個々人の体重Ｋｇ当たり活性成分約０．１
〜２０ｍｇ、好ましくは約０．５〜約１０ｍｇ、さらに好ましくは１から数ｍｇ
の範囲でよい。好適な初期投与の投与計画および追加抗原投与量も変化してよい
が、初期投与とそれに続く注射またはその他の投与による一回またはそれ以上の
時間間隔での繰り返し投与により類型化できる。あるいは、血中濃度を１０ｎＭ
〜１０μＭに維持するために十分な、連続的な静脈点滴が企図される。

【０２２９】 本発明は、ｐ−Ｈｙｄｅ交替治療を化学療法または放射線療法的介入と共同し
て用いることを企図している。本発明の手法および組成物を用いて、悪性または
転移細胞のような細胞の細胞死に対する感受性を誘導するが、または細胞増殖を
阻害する、または細胞を殺すために、「標的」細胞を発現ベクターおよび少なく
ともひとつのＤＮＡ損傷薬剤に接触させる。１つの実施様態において、細胞は単
一組成物または、両方の薬剤を含む、薬理学的処方と接触させ、または同時に２
つの別個の組成物または処方、ここで１つの組成物はベクターを含み、他方はＤ
ＮＡ損傷薬剤を含む、を同時に細胞に接触させることにより薬理学的処方と接触
している。別の実施様態において、ベクターを用いた治療は、数分から数週間間
隔のＤＮＡ損傷薬剤処置の先に行うかまたは次に行う。プロトコールおよび手法
は当業者に公知である。

【０２３０】 ＤＮＡ損傷薬剤または因子は当業者に公知であり、細胞に適用した際の化学化
合物またはＤＮＡ損傷を含む治療法を指す。そのような薬剤および因子は、ガン
マ線照射、Ｘ線、ＵＶ照射、マイクロ波、電子放出などの放射線および波動を含
む。「化学療法薬剤（ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｇｅｎｔｓ）」と
して記載した多様な化学化合物は、ＤＮＡ損傷を誘導するように作用するが、そ
れらのすべてが本明細書にて開示した混合治療法で使用することを企図している
。有益だと思われる化学療法的薬剤としては例えば、アドリアマイシン、５−フ
ルオロウラシル（５ＦＵ）、エトポシド（ＶＰ−６）、カンプトテシン、アクチ
ノマイシン−Ｄ、ミトマイシンＣ、シスプラチン（ＣＤＤＰ）および過酸化水素
があげられる。本発明はまた、シスプラチンとのＸ線の使用またはエトポシドの
シスプラチンとの使用のような放射線に基づいたもの、または実際の化合物でも
、ひとつまたはそれ以上のＤＮＡ損傷薬剤を組み合わせた利用も包含する。

【０２３１】 別の実施様態においては、局所的な腫瘍部位をＸ線、ＵＶ光、ガンマ線または
マイクロ波のようなＤＮＡ損傷放射線を用いて放射線治療してよい。あるいは、
腫瘍細胞を治療に効果的な量の、アドリアマイシン、５−フルオロウラシル、エ
トポシド、カンプトテシン、アクチノマイシン−Ｄ、ミトマイシンＣ、またはさ
らに好ましくはシスプラチンのようなＤＮＡ損傷化合物を含む薬理学的化合物を
患者に投与することによりＤＮＡ損傷薬剤と接触させよい。ＤＮＡ損傷薬剤は、
上記のようにｐ−Ｈｙｄｅ発現構造物と結合させることにより、化合治療組成物
またはキットとして調製、利用してよい。核酸、とりわけＤＮＡに直接架橋する
薬剤は、相乗的な抗新生物的な組み合わせを導くＤＮＡ損傷を起こすことが本明
細書において予見し示されている。シスプラチン、およびその他のＤＮＡアルキ
ル化薬を用いてよい。シスプラチンは、臨床的に合計三過程で三週間毎に５日間
２０ｍｇ／ｍ²の効果的な投与量で癌の治療に広く用いられている。シスプラチ
ンは経口吸収されず、静脈内、皮下的、腫瘍内または腹膜内注射により投与しな
ければならない。ＤＮＡを損傷させる薬剤にはまた、ＤＮＡ複製、有糸***、お
よび染色体分離を妨げる化合物も含む。そのような化学療法化合物としては、ド
キソルビシンとしても知られるアドリアマイシン、エトポシド、ベラパミル、ポ
ドフィロトキシンなどがあげられる。腫瘍の治療に広く臨床的に用いられていて
、これらの化合物は、アドリアマイシンに対して２１日間隔で２７〜７５ｍｇ／
ｍ²、エトポシドに対して３５〜５０ｍｇ／ｍ²、静脈注射でまたは静脈の２倍を
経口で虚丸剤静脈注射により投与する。

【０２３２】 核酸前駆体およびサブユニットの合成および忠実度を乱す薬剤はまたＤＮＡ損
傷を導く。そのような場合、核酸前駆体の数が上昇する。とりわけ有用なのは、
多量の試験を行い、簡単に入手可能である薬剤である。そのように、５−フルオ
ロウラシル（５−ＦＵ）のような薬剤は、新生物組織によって好ましく使用され
るが、この薬剤を新生物細胞に対して標的化するために有用であるようにしてい
る。かなり毒性ではあるけれども、５−ＦＵは、局所を含む広い範囲の担体で適
用可能であり、しかしながら３〜１５ｍｇ／ｋｇ／日の範囲の用量での静脈内投
与が一般的に使用されている。

【０２３３】 ＤＮＡ損傷を引き起こし、広く利用されているその他の因子には、ガンマ線、
Ｘ線としてよく知られるものおよび／または腫瘍細胞への放射性同位体の直接供
与を含む。その他のＤＮＡ損傷因子の形態としては、マイクロ波およびＵＶ照射
などを企図している。これらの因子全てが損傷ＤＮＡ、ＤＮＡ前駆物質、ＤＮＡ
の複製および修復、および染色体の会合および維持の広範囲に影響すること最も
ありうる。Ｘ線線量は、長期間（３〜４週間）で１日当たり５０〜２００レント
ゲンから、一回２０００〜６０００レントゲンの範囲である。放射性同位体の量
は広く変化し、同位体の半減期、放射の強さと種類、および新生物細胞による取
り込みに依存する。

【０２３４】 哺乳動物培養細胞へ発現構築物を導入するための、ウイルスを用いないいくつ
かの方法もまた本発明において企図している。これらには、カルシウムリン酸沈
殿（Ｇｒａｈａｍ ａｎｄ Ｖａｎ Ｄｅｒ Ｅｂ，１９７３、Ｃｈｅｎ ａｎ
ｄ Ｏｋａｙａｍａ，１９８７、Ｒｉｐｐｅ ｅｔ ａｌ．，１９９０）、ＤＥ
ＡＥ−デキストラン（Ｇｏｐａｌ，１９８５）、エレクトロポーレーション法（
Ｔｕｒ−Ｋａｓｐａ ｅｔ ａｌ．，１９８６、Ｐｏｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，
１９８４）、直接ミクロ注入（Ｈａｒｌａｎｄ ａｎｄ Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，
１９８５）、ＤＮＡ含有リポソーム（Ｎｉｃｏｌａｕ ａｎｄ Ｓｅｎｅ，１９
８２、Ｆｒａｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９７９）、およびリポフェクタミン−Ｄ
ＮＡ複合体、超音波細胞分解（Ｆｅｃｈｈｅｉｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８７
）、高速ミクロプロジェクチルを用いた遺伝子衝撃（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，
１９９０）、およびレセプター媒介トランスフェクション（Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ
，１９８７、Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ，１９８８）があげられる。これらの技術のい
くつかは、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏにうまく適合させてよい。また
、ヘルパー細胞系をヒト胎児肝細胞、筋細胞、造血細胞またはその他のヒト胎児
の間葉性または上皮細胞のようなヒト細胞から摘出してよい。あるいは、ヘルパ
ー細胞は、ヒトアデノウイルスを許容するその他の哺乳動物種の細胞から摘出し
てよい。それらの細胞としては例えば、ベロ（Ｖｅｒｏ）細胞またはその他のサ
ル胎児の間葉性または上皮細胞があげられる。上記のように、好ましいヘルパー
細胞株は２９３である。

【０２３５】 他の実施様態では、活性化合物は小胞、とりわけリポソーム（Ｌａｎｇｅｒ，
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３（１９９０）、Ｔｒｅａｔ ｅｔ
ａｌ．， 感染症および癌の治療中のリポソームにより伝送してよい（Ｌｉｐ
ｏｓｏｍｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ
Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ），Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ
ａｎｄ Ｆｉｄｌｅｒ（ｅｄｓ．），Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．３５
３−３６５（１９８９）、Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ，同書．，ｐｐ．３
１７−３２７を参照のこと、一般的に同書を参照のこと）。

【０２３６】 また別の実施様態では、治療的化合物は制御放出系中に導入してよい。例えば
、例えば、ポリペプチドは静脈点滴、移植浸透性ポンプ、経皮パッチ、リポソー
ム、またはその他の投与形態を用いて投与してよい。１つの実施様態では、ポン
プを用いてよい（Ｌａｎｇｅｒ，上記、Ｓｅｆｔｏｎ，ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅ
ｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１（１９８７）、Ｂｕｃｈｗａｌｄ ｅ
ｔ ａｌ．，Ｓｕｒｇｅｒｙ ８８：５０７（１９８０）、Ｓａｕｄｅｋ ｅｔ
ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５７４（１９８９）を参照のこ
と）。別の実施様態では、重合物質が使用できる（制御放出の医療への応用（Ｍ
ｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌ
ｅａｓｅ），Ｌａｎｇｅｒ ａｎｄ Ｗｉｓｅ（ｅｄｓ．），ＣＲＣ Ｐｒｅｓ
ｓ．，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ（１９７４）、制御薬剤の生物学
的利用能の制御、薬剤生産設計および実行（Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ
Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｄｅｓｉｇｎ
ａｎｄ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ），Ｓｍｏｌｅｎ ａｎｄ Ｂａｌｌ（ｅｄｓ
．），Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８４）、Ｒａｎｇｅｒ ａｎｄ Ｐ
ｅｐｐａｓ，Ｊ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．２３：６１（１９８３）を参照のこと、また、Ｌｅｖｙ ｅｔ ａｌ．，
Ｓｃｉｅｎｃｅ２２８：１９０（１９８５）、Ｄｕｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａ
ｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３５１（１９８９）、Ｈｏｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．
，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５（１９８９）も参照のこと）。さらに
別の実施様態では、制御放出系は治療標的、すなわち脳の付近においてよく、従
って全身投与量のほんの一部しか必要としない（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ， 制
御放出の医療への応用（Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃ
ｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ），上記，ｖｏｌ．２，ｐｐ．１１５−１
３８（１９８４）を参照のこと）。好ましくは、制御放出装置は、患者の、不適
当な免疫活性部位または腫瘍部の付近に導入する。別の制御放出系はＬａｎｇｅ
ｒによる総覧（Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９：１５２７−１５３３（１９９０））に記
載されている。

【０２３７】 当業者により容易に理解されるように、本発明の手法および薬理学的組成物は
哺乳動物、好ましくはヒト対象への投与に適している。

【０２３８】 本発明の治療的手法および組成物において、治療に効果的な投与量の活性組成
物が提供される。治療に効果的な投与量は、当業者に公知のように、患者の特徴
（年齢、体重、性別、健康状態、合併症、その他の疾病など）に基づいて医学の
専門家が決定してよい。さらに、従来の研究がさらに行われれば、様々な状態の
様々な患者の治療のために適切な投与量に関してより明確な情報が得られ、専門
家は、治療状況、受治療者の年齢および大体の健康状態を考慮して適切な投与量
を確かめることができる。一般に、静脈注射または点滴における投与量は、腹膜
内、筋肉内、またはその他の投与経路におけるものよりも少なくてよい。投与計
画は循環半減期、および使用形態により変化させてよい。組成物は、治療に効果
的な量の投薬処方に合った方法で投与する。投与する必要のある活性成分の正確
な量は実務者の判断に依存し、個々人に特有である。しかしながら、適切な投与
量は、投与経路によって、１日当たり、個々人の体重Ｋｇ当たり活性成分約０．
１〜２０ｍｇ、好ましくは約０．５〜約１０ｍｇ、さらに好ましくは１から数ｍ
ｇの範囲でよい。好適な初期投与の投与計画および追加抗原投与量も変化してよ
いが、初期投与とそれに続く注射またはその他の投与による一回またはそれ以上
の時間間隔での繰り返し投与により類型化できる。あるいは、血中濃度を１０ｎ
Ｍ〜１０μＭに維持するために十分な、連続的な静脈点滴が企図される。

【０２３９】 本発明は、必須物質を全て含むキットを提供し、前立腺腫瘍細胞増殖を抑制し
、前立腺細胞を形質転換させる、または前立腺癌細胞を検出するために必要な試
薬をキットの中に含んでよい。これは一般的に選択的発現構築物を含む。また発
現構築物の複製のための様々な溶媒およびそのような複製のための宿主細胞も含
んでよい。そのようなキットは個々の試薬に対して別々の容器を含む。キットの
組成物がひとつ、あるいはそれ以上の液体溶液で供給される場合、その液体溶液
は好ましくは水性溶液で、特に好ましいのは滅菌水性溶液である。ｉｎ ｖｉｖ
ｏでの使用では、発現構築物は薬理学的に許容可能な、注射可能な組成に処方し
てよい。この場合、肺のような体の感染部位への適用、動物への注射、またはキ
ットの他の組成物への利用および混合を行う処方なので、容器自体がインハレン
ト、シリンジ、ピペット、点眼器、または他のそのような器具である。キットの
組成物はまた、乾燥または凍結乾燥した形態で供給してよい。試薬または組成物
が乾燥形態で供給された場合、元の状態に戻すことは、適した溶媒により行う。
その溶媒も別の容器で供給することを構想している。

【０２４０】 本発明のキットはまた、一般的に、例えば望ましいバイアルを保持しているプ
ラスチック容器への注射または吹き込みのような工業販売のための精密な閉じ込
めでのバイアル含有のための手段も含む。容器の種類の数に関わらず、本発明の
キットは動物の体内への根本的な複合物の注射／投与または配置を補助する器具
も含んでよく、またはそれをパッケージしてよい。そのような器具は、インハレ
ント、シリンジ、ピペット、ホーセプス、計量スプーン、点眼器またはそのよう
な認可された医用伝送媒体であってよい。

【０２４１】 以下の実施例は、本発明の好ましい実施様態をより完全に例示するために存在
する。しかしながら、これらは本発明の広い範囲を限定するものとしては解釈さ
れるべきでない。

【０２４２】 （実施例） 実施例：ｐ−Ｈｙｄｅは、前立腺癌の細胞のプログラムされた細胞死の誘導に
対する感受性を誘導する。

【０２４３】 材料と方法 細胞株：２つのラット前立腺癌細胞株（未分化腫瘍、低転移性ＡＴ−１および
高転移性ＭＡＴ−ＬｙＬｕ）を、ｃＤＮＡ競合的ハイブリッド形成戦略のために
使用した（Ｒｉｎａｌｄｙ ａｎｄ Ｓｔｅｉｎｅｒ，１９９７）。ノザン解析
のために使用した他のダニングラット前立腺癌細胞株は、ＡＴ−３、ＭＡＴ−Ｌ
ｙＬｕ、ＭＡＴ−ＬｕおよびＧであった。これらの細胞株は、確立されたｉｎ−
ｖｉｔｒｏダニングＲ３３２７ラット前立腺腫瘍亜系より由来し、さらに、ジョ
ン ホーキンス癌センター（Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ
Ｃｅｎｔｅｒ），Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ Ｍａｒｙｌａｎｄ（Ｉｓｓａｃｓ ｅｔ
ａｌ．１９８６）にてＩｓａａｃｓ ｅｔ ａｌ．によってｉｎ−ｖｉｔｒｏ
細胞株として発展した。ノザン解析のために使用したヒト前立腺癌細胞株ＰＰＣ
−１、ＬＮＣａＰ、ＴＳＵおよびＤＵ１４５は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕ
ｅ Ｃｕｌｕｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙ
ｌａｎｄより得た。すべての細胞は、先に記述された（Ｉｓｓａｃｓ ｅｔ ａ
ｌ，１９８６）ように、１ｍｌあたり１０％ウシ胎児血清、５０ユニットのペニ
シリンＧおよび５０μｇの硫酸ストレプトマイシン、そして２５０μＭデキサメ
タゾンの存在下で、ＲＰＭＩ １６４０培地（メディアテック（Ｍｅｄｉａｔｅ
ｃｈ），Ｈｅｒｎｄｏｎ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ）中で増殖させた。

【０２４４】 クローニング戦略：大過剰の競合剤である非放射標識ＡＴ−１ ｃＤＮＡ集団
の存在下で、放射標識したＭＡＴ−ＬｙＬｕ ｃＤＮＡ集団を、ＭＡＴ−ＬｙＬ
ｕ ｃＤＮＡライブラリー（Ｒｉｎａｌｄｙ ａｎｄ Ｓｔｅｉｎｅｒ，１９９
７）中のｃＤＮＡクローンを同定するために使用した。これらのｃＤＮＡのうち
の１つは、新規であり、ｐ−Ｈｙｄｅと名付けた。ｐ−Ｈｙｄｅ ｃＤＮＡに関
連した前立腺癌をさらに特性化した。

【０２４５】 ｃＤＮＡの特性化：シークエンシングｐ−Ｈｙｄｅ ｃＤＮＡは、もともと？
ＺＡＰ Ｕｎｉ ＸＲクローンとして得、記述されたような（ストラタジーン（
Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ），Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）ｉｎ ｖ
ｉｖｏ摘出プロトコールを介してｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ−ベクター内に
さらにサブクローン化した。この二本鎖ｃＤＮＡをさらに、ＡＢＩ ３７７自動
化ＤＮＡシークエンサー バージョン３．０を用いてダイ ターミネーター サ
イクル シークエンシング（Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓ
ｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：パーキンエルマー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）Ｆｏｓｔ
ｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）にかけた。ｐ−Ｈｙｄｅの読みとり枠
を、ＤＮＡストリダープログラム（パスツール インスティテュート（Ｐａｓｔ
ｅｕｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）を用いて決定した。

【０２４６】 ノザンブロット解析：供給業者（テル−テスト社（Ｔｅｌ−Ｔｅｓｔ，Ｉｎｃ
．），Ｆｒｉｅｎｄｗｏｏｄ，Ｔｅｘａｓ）によって指示されたように、ＲＮＡ
Ｚｏｌ Ｂを用いて、指数増殖（７０％コンフレント）の間の細胞株からトータ
ルＲＮＡを単離し、ノザンブロット解析にかけた。リバースおよびフォワードＰ
ＣＲプライマーを設計し、その読みとり枠の１４６７塩基を示している１．３５
ｋｂのｐ−Ｈｙｄｅ配列を増幅するために使用した。ＰＣＲ産物を無作為オリゴ
標識化技術（多重プライムＤＮＡ標識化系（Ｍｕｌｔｉｐｒｉｍｅ ＤＮＡ Ｌ
ａｂｅｌｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ）、アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））によって
放射標識し、ノザン解析のためのプローブとして使用した。ｐ−Ｈｙｄｅ遺伝子
の比較発現を、Ｑｕａｎｔｉｔｙ Ｏｎｅソフトウェアを備えるＰＤＩ Ｄｉｓ
ｃｏｖｅｒｙ Ｓｅｒｉｅｓ Ｓｃａｎｎｅｒでのオートラジオグラムのスキャ
ニングによって内部対照（シクロフィリン）と比較した。

【０２４７】 ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写および翻訳：ｃＤＮＡの読みとり枠を、記述したように
ｉｎ−ｖｉｔｒｏ転写（キャップｍＲＮＡ）、引きつづいて７５ＣｉのＬ−［³⁵ Ｓ］メチオニン（アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ），Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅ
ｉｇｈｔｓ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）の存在下でのウサギ網状赤血球溶解物（ストラ
タジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ），Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ
）を用いたｉｎ−ｖｉｔｒｏ翻訳を用いて確認した。ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳産物
をさらに、オートラジオグラムによって１０％ ＳＤＳポリアクリルアミドゲル
電気泳動上で同定した。

【０２４８】 ｐ−ＨｙｄｅのｐｃＤＮＡ３．１（−）のサブクローニング：ｃＤＮＡ挿入物
を、ＫｐｎＩおよびＳａｃＩによる二重消化によってｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ
ＳＫ＋ベクターより放出させる（ＳＫ断片）。この断片は、本来のｐ−Ｈｙｄｅ
配列を示しており、次いで、哺乳動物シャトルベクターｐｃＤＮＡ３．１（−）
（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））の脱ホスホリル化ＫｐｎＩ−Ｓ
ａｃＩ二重消化物内にライゲーションした。ライゲーション混合液をコンピテン
トＤＨ５？をトランスフェクトするのに使用し、アンピシリン耐性に関して選別
し、続いて標準の塩化セシウム密度勾配遠心を用いてプラスミドを調製した。次
いでｐ−Ｈｙｄｅの新規構造物を、リポフェクタミン（ギブコ／ＢＲＬ（Ｇｉｂ
ｃｏ／ＢＲＬ）を用いることによってＡＴ３ラット前立腺癌亜系にトランスフェ
クトするのに使用し、続いてＧ４１８選別した（Ｒｉｎａｌｄｙ ｅｔ ａｌ．
，１９８８）。８個のクローンを得、それらのうちの２つ、ＡＴ３−Ｈ１とＡＴ
３−Ｈ２を使用して、そのアポトーシスとの関係におけるｐ−Ｈｙｄｅの機能を
査定した。さらに、ＡＴ３細胞株にまた、ｐｃＤＮＡ３．１（−）ベクターのみ
をトランスフェクトし、ＡＴ３−ｐｃと命名したその安定トランスフェクト細胞
株を、ｐ−Ｈｙｄｅの機能的査定に関してＡＴ−Ｈ１およびＡＴ−Ｈ２の安定ト
ランスフェクタントと比較する陰性対照として使用した。

【０２４９】 アポトーシスアッセイ：ＡＴ３親細胞株でのアポトーシス強度を、ＡＴ３−Ｈ
１、ＡＴ３−Ｈ２および陰性対照としてのＡＴ３−ｐｃと比較して査定した。２
つのアポトーシス薬剤をこのアッセイに使用した。（１）２００Ｊ／ｍ２のＵＶ
投与を用いたＤＮＡのＵＶ傷害、アポトーシス強度はＵＶ照射後３６時間の時点
でアッセイした。および（２）３６時間の１００μＭ フルオロデオキシウリジ
ン（ＦＵｒＤ）処理とそれに続いたアポトーシスアッセイ。これらのアポトーシ
ス誘導の後、細胞を２つの画分、浮遊細胞および接着細胞で回収した。両方の細
胞画分を、Ｎｅｕｂａｕｅｒチャンバーおよびトリパンブルー除去を用いて計数
した。ＤＮＡを両方の画分から別々に抽出し、１６％アガロースゲル電気泳動上
で、ＤＮＡラダーを視覚化して解析した。

【０２５０】 ＵＶ−傷害修復アッセイ：ＤＮＡ中の紫外線誘導傷害を、シクロブタンピリミ
ジンダイマー（ＴＭＤ−２）および光化学反応産物（６４Ｍ−２）と特異的に交
差反応するマウスモノクローナル抗体を用いてアッセイした。ＤＮＡ中のシクロ
ブタンダイマーおよび６４光化学反応産物の存在を、標準のＥＬＩＳＡ技術で別
々に両方の抗体を用いて、マイクロタイタープレート（１００および２００ｎｇ
／ウェル）中でアッセイした。さらに、ＵＶ抵抗性も、発行された（Ｒｉｎａｌ
ｄｙ ｅｔ ａｌ．，１９８８）ようにＵＶ勾配アッセイを用いることで査定し
た。

【０２５１】 ウリジンホスホリラーゼアッセイ：細胞抽出物を、２４時間の１ｍＭの５−ｄ
ＦＵｒｄでの誘導の前後で細胞ペレットより調製し、この相当する細胞抽出物を
超音波処理を介して、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．４中で調製し、
続いて反応緩衝液（５０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７．４）に対して透析する。
タンパク質の量は、標準のＬｏｗｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｒａｄアッセイを用いる
ことで決定する。すべての細胞株からの同量のタンパク質を、基質として１０ｍ
Ｍウリジンまたはチミジンを含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）
中で、ＵＰ活性に関してアッセイする。３７℃での３０分間のインキュベーショ
ンの後、反応をメタノールを添加することで終了させ、続いて遠心する。上清の
一部分をＥＲＣ−ＯＤＳ−１１７１（ＥＲＭＡ ＣＲ．Ｉｎｃ）のＨＰＬＣカラ
ム（６×２００ｍｍ）上に流した。反応産物ウラシルまたはチミジンの量を、ス
タンダードと比較して２６５ｎｍにてＵＶ検出器で測定できる。陰性対照として
、同様の反応混合液を、インキュベーションの前に煮沸する。

【０２５２】 ｃＤＮＡライブラリーの構築：第一段階において、ＡＴ−１およびＭＡＴ−Ｌ
ｙＬｕ細胞株から由来したｃＤＮＡライブラリーを、ストラタジーン（Ｓｔｒａ
ｔａｇｅｎｅ）のプロトコールに基づいてＵｎｉ ＺＡＰ ＸＲを用いて作製し
た。得た独立したクローンはＭＡＴ−ＬｙＬｕおよびＡＴ−１に関して、それぞ
れ１９０万および３４０万クローンであった。これらの非増幅ライブラリーをｃ
ＤＮＡ挿入物集団のＰＣＲ増幅にかけた。ＸｈｏＩおよびＥｃｏＲＩクローニン
グ部位の下流および上流であるリバースプライマー（ＲＰ）およびフォワードプ
ライマー（ＦＰ）を、ｃＤＮＡ挿入物集団の増幅のために使用した。？ Ｕｎｉ
ＺＡＰまたはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中の両方のプライマーの間の距離は２２
８塩基であった。

【０２５３】 競合的プライマーの設計：２つのＰＣＲプローブ、放射標識化ＭＡＴ−ＬｙＬ
ｕ ｃＤＮＡ集団プローブおよび非放射標識化ＡＴ−１ ｃＤＮＡ集団プローブ
（コールドコンペティター）を増幅した。放射標識化ＭＡＴ−ＬｙＬｕ ＰＣＲ
産物をＳ４００セファクリルスピンカラムを用いて濃縮した。挿入物なしの？
ＤＮＡの増幅の結果である主要な非取り込み³²Ｐ−ｄＣＴＰ、プライマーダイマ
ー、および２２８ｂｐのＰＣＲ産物を、ｃＤＮＡより分離した。精製した放射標
識化ｃＤＮＡを３０倍過剰な非放射標識化コールドコンペティターＡＴ−１ Ｐ
ＣＲ産物と混合し、ＭＡＴ−ＬｙＬｕ ｃＤＮＡライブラリーを選別するための
競合−プローブとして用いた。

【０２５４】 本質的に競合プローブの放射標識化ｃＤＮＡとライブラリーの選別したｃＤＮ
Ａ間のハイブリッド形成を干渉する可能性のある２種類の予期しない放射標識化
ＰＣＲ産物は、１）ｃＤＮＡの非指数関数的増殖、２）ｃＤＮＡ挿入のない？
ＤＮＡから由来した２２８ｂｐ ＰＣＲ産物であった。選別したライブラリーの
ベクターを持つこれらの２つの予期しないＰＣＲ産物間の可能性のある交差ハイ
ブリッド形成を減少させるために、過剰量のＨｉｎｄＩＩＩ消化ＤＮＡ、Ｐｖｕ
ＩＩ消化ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＤＮＡ、および両方のプライマーに基づいた
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔの２２８ｂｐ ＰＣＲ産物を競合プローブと混合した。
この完全混合競合プローブの予備的な査定は、このプローブでのＭＡＴ−ＬｙＬ
ｕ ｃＤＮＡライブラリーのハイブリッド形成が、極度に弱く、一方で、非放射
標識化ＡＴ−１ ＰＣＲ産物なしで、同様のプローブでハイブリッド形成した二
重フィルターは、きわめて陽性であったことを示唆した。このことは、ＭＡＴ−
ＬｙＬｕ産物の陽性ハイブリッド形成は、ＡＴ−１ ｃＤＮＡによって競合しな
いＰＣＲ産物の放射標識化ＭＡＴ−ＬｙＬｕ ｃＤＮＡによるものであったこと
を明らかに示唆している。

【０２５５】 ＭＡＴ−ＬｙＬｕ ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング：非増幅ＭＡＴ−
ＬｙＬｕファージｃＤＮＡライブラリー（２５０，０００クローン）の独立した
ｃＤＮＡクローンを、以上で記述したように競合プローブで選別した。１９個の
増幅されたシグナルが観察され、次いでこれらの推定前立腺癌−または転移−関
連プラークを再選別した。この再選別の結果として、１２個の独立したプラーク
を精製した。ｃＤＮＡを切断し、プラスミドに基づいたベクター（ｐＢｌｕｅｓ
ｃｒｉｐｔ）内にサブクローン化した。このことは、ヘルパーファージＥｘＡｓ
ｓｉｓｔ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））の、フィラメンタスファ
ージのような環状形態でのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ配列でｃＤＮＡを切断する能
力によって可能であり、細胞より分泌する（図２）。組換え体ｐＢｌｕｓｃｒｉ
ｐｔプラスミドを、大腸菌（ＳＯＬＲ株、ストラタジーン）のＦ’種を感染させ
ることで回収し、アンピシリン耐性コロニーを選別し、プラスミドＤＮＡを抽出
した。得られたプラスミドをＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで消化し、アガロースゲ
ル電気泳動にてｃＤＮＡ挿入物を同定した。結果は、ただ４つのプラスミドのみ
がｃＤＮＡ挿入物を含んだことを示唆した。

【０２５６】 候補遺伝子のシークエンシング：すべての４つのｃＤＮＡを、３’および５’
末端両方で部分的に配列決定した。これらの初期配列を使用し、相同性または類
似性に関してＮＣＢＩのＧｅｎｂａｎｋ核酸データベースを検索した。３つのｃ
ＤＮＡが公知の配列、１）バリンおよびフェニルアラニンに対して特異的な１６
ｓおよび１２ｓ ｒＲＮＡおよびｔＲＮＡをコードしているラットミトコンドリ
ア遺伝子（受け入れ番号＃ ｅｍｂ／Ｖ００６８０／ＭＩＲＮＲ２）、２）ラッ
ト核小体タンパク質Ｂ２３．１ ｍＲＮＡ（受け入れ番号＃ ｇｂ／Ｊ０３９６
９／ＲＡＴＢ２３ＮＰ）および３）ラット核小体タンパク質Ｂ２３．１およびＢ
２３．２（受け入れ番号＃ ｇｂ／Ｍ３７０４１／ＲＡＴＮＩＣＢＡ７）と適合
した。この競合ハイブリッド形成の結果は、両細胞株間の認識表現型差異と一致
した。ＭＡＴ−ＬｙＬｕは、核小体およびミトコンドリアの数が２倍を示してい
る（Ｉｓａａｃｓ ｅｔ ａｌ，１９８６）。このことはまた、ＭＡＴ−ＬｙＬ
ｕ細胞株が、核小体およびミトコンドリアｔＲＮＡおよびその関連した遺伝子の
より高い遺伝子用量または遺伝子増幅のために代謝的により活性であることを示
唆している。

【０２５７】 推定遺伝子、ｐ−Ｈｙｄｅの完全な配列：ｐ−Ｈｙｄｅと命名した、第四のｃ
ＤＮＡ（レーン１）は、ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴＮ核酸データベースでの公知の全
長配列のいずれとも適合しなかった最初の配列を持っていた。したがって、ｐ−
Ｈｙｄｅ ｃＤＮＡを、３つの冗長性に関して両方の方向でのウォークスルーシ
ークエンシング戦略を用いることで完全に配列決定した。それぞれのシークエン
シング方向より９つの隣接が得られ、２６９４塩基の全長合成物として合成した
。３’末端上のポリ（Ａ）末端とポリ（Ａ）の上流２７の位置に局在するＧＡＧ
ＡＡＡのポリアデニル化シグナル配列（保存されたＡＡＴＡＡＡ配列のわずかな
改変）も同定した。図６は、シークエンシング戦略と、ｐ−Ｈｙｄｅの読み取り
枠を例示している制限地図を示している。ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３は、ラットｐ
−Ｈｙｄｅの得られた核酸配列およびラットｐ−Ｈｙｄｅの得られたアミノ酸配
列を列記している。

【０２５８】 読みとり枠ｐ−Ｈｙｄｅ遺伝子を示しているＰＣＲプローブの産出：図８は、
３つの組のシークエンシングプライマーを用いたｃＤＮＡ挿入物のＰＣＲ増幅を
示している。プライマー１１および５に基づいたＰＣＲ産物は、ｐ−Ｈｙｄｅ
ｃＤＮＡの読みとり枠を示している。それをさらにＲａｎｄｏｍ−Ｏｌｉｇｏ−
Ｌａｂｅｌｉｎｇ技術によって放射標識し、ノザン解析でのｃＤＮＡ挿入物に対
する代表的なプローブとして使用した。

【０２５９】 ｐ−Ｈｙｄｅのノザンブロット解析：いくつかのラット前立腺癌亜系（ＡＴ−
１、ＭＡＬＴ−ＬｙＬｕ、ＭＡＴ−Ｌｕ、ＡＴ−３およびＧ）およびヒト前立腺
癌細胞株（ＰＰＣ、ＬＮＣａＰ、ＤＵ１４５およびＴＳＵ）を、ＰＣＲ放射標識
化プローブを用いたノザンブロット解析によって査定した。結果は、ヒト対応物
の転写がラットｐ−Ｈｙｄｅ ｍＲＮＡと比較してわずかに小さかったことを示
唆した。同一のブロットをさらに、内部対照として、シクロフィリンｃＤＮＡと
ハイブリッド形成させた。このオートラジオグラフにおいては、２８Ｓおよび１
８ＳリボソームＲＮＡをマーカーとして使用した。転写物の長さを、スピリンの
式、Ｍ＝１５５０×Ｓ^2.1に基づいて計算した。式中Ｍ＝分子量およびＳ＝スヴ
ェードベリー定数である（ＭｃＣｏｎｋｅｙ，１９６７）。ｐ−Ｈｙｄｅおよび
シクロフィリン転写物のシグナルをコンピュータ濃度計（Ｑｕａｎｉｔｙ−Ｏｎ
ｅソフトウェア、ＰＤＩ）を用いて、定量し、標準化した。ラットおよびヒト前
立腺癌細胞株両方からのｐ−Ｈｙｄｅ ｍＲＮＡの発現のレベルを比較した（表
Ｉ）。データは、ｐ−Ｈｙｄｅ発現と前立腺癌進行の間の機能的な関係が存在す
る可能性があることを示唆している、ダニングラットおよびヒト前立腺癌細胞株
両方でのｐ−Ｈｙｄｅ遺伝子の異なる発現が存在することを示唆した。ＭＡＴ−
Ｌｕは、最も高いレベルの転写を示し、一方でＡＴ−３は最も低かった。これら
のデータはまた、ＭＡＴ−ＬｙＬｕでの転写のレベルが、ＡＴ−１のものよりも
相対的に高く、新規ｃＤＮＡが、ＭＡＴ−ＬｙＬｕとＡＴ−１ ｃＤＮＡ間のｃ
ＤＮＡ競合の結果であったことを示していることを示唆した。より重要なことと
して、ｐ−Ｈｙｄｅのヒト相同物が、ヒト前立腺癌細胞株中で示されたように存
在している。最も高いレベルのｐ−Ｈｙｄｅ転写はＰＰＣ−１で起こり、一方で
ＬＮＣａＰ細胞株で最も低かった（表Ｉ）。

【０２６０】 ＯＲＦから由来したｐ−Ｈｙｄｅの予想されるアミノ酸配列の解析：ｃＤＮＡ
の読み取り枠は、４８９アミノ酸残基をコードしている１４６７塩基からなり、
このタンパク質の計算分子量は５４．８ｋＤである。この予想されるアミノ酸配
列のさらなる分子解析は、Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ親水性プロット、Ｊａ
ｍｅｓ−Ｗｏｌｆ抗原性指数およびＬａｓｅｒ Ｇｅｎｅ ＤＮＡｓｔａｒ ソ
フトウェアを用いたＥｍｉｎｉ表面確率プロットに基づく。さらに、予想される
アミノ酸配列の親水性特性を、その抗原性決定基の想に関するＡｎｉｔｉｇｅｎ
プログラムを用いたＨｏｐｐ ａｎｄ Ｗｏｏｄｓに基づいて予想した（表ＩＩ
）。最初の３つの解析の結果は、４つ目のものと一致した。２つのペプチド領域
（残基１１３から残基１３１と残基２２３から残基２４９）が最も高い親水およ
び抗原性指数の点を示した。両方のペプチド配列は、抗体を作製するために免疫
原性ペプチドとして使用できる。ウエスタン解析でのｐ−Ｈｙｄｅの翻訳産物の
検出のためのその適用は、その表面確率の最も高い数値と一致した。

【０２６１】 （表ＩＩ） 平均親水性 アミノ酸配列 ２．５３ ２４１〜２４６ １．９３ １１７〜１２２ １．７３ １１９〜１２４ ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写および翻訳によるＯＲＦの確認：シークエンシングデー
タに基づいた読みとり枠を確認するために、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ内に構築し
たｐ−ＨｙｄｅｃＤＮＡをＫｐｎＩで消化し、直線化した構造をＴ３−ＲＮＡポ
リメラーゼに対して接近可能にした。この酵素は、真核生物ｍＲＮＡ（ストラタ
ジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））内に存在するものと同様の、５’キャップ構
造（５’ｍｅ７Ｇｐｐｐ５’Ｇ類似体）でのリボプローブの合成を指向する。５
’キャップは、合成したｍＲＮＡの収量および安定性を増加させ、³⁵Ｓ−メチオ
ニンの存在下でウサギ網状赤血球溶解物（ストラタジーン）を使用したｉｎ−ｖ
ｉｔｒｏ翻訳を増強するのに重要である。翻訳産物を、８Ｍ尿素を含むポリアク
リルアミドゲル電気泳動を用いて還元条件下で同定した。図１３で示したオート
ラジオグラフは、２つの翻訳産物（５５および５５．５ｋＤａタンパク質）が観
察されたことを示した。

【０２６２】 これらの２つのタンパク質の分子量は、読み取り枠の予想されたアミノ酸の計
算した分子量と一致している。さらに、２つの開始コドンもまた、リボプローブ
のｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳を介して得た２つの転写産物と関連したこの読みとり枠
中で同定された。両翻訳産物間の分子量の差異は、両開始コドン間のＣ末端上の
４つのアミノ酸残基（ＭＳＧＥ）での差異と一致している。両翻訳産物間の分子
量の差異は、ＭＳＧＥの０．５ｋＤａ分子量と一致する。

【０２６３】 ｐ−Ｈｙｄｅ挿入物のｐｃＤＮＡ３．１（−）内へのサブクローニングおよび
ラットおよびヒト前立腺癌細胞株内へのトランスフェクション：ラットおよびヒ
ト前立腺癌細胞株内でのｐ−Ｈｙｄｅの差示的発現のデータに関連して、この遺
伝子を最も低いレベルのｐ−Ｈｙｄｅを発現している細胞株内に挿入し、続くそ
の安定トランスフェクト内でのこの遺伝子の機能の査定が導かれる。この目的の
ために、ｐ−Ｈｙｄｅ ｃＤＮＡをｐｃＤＮＡ３．１（−）哺乳動物発現ベクタ
ー（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））内にサブクローン化した。ｐ
ｃＤＮＡ３．１の以下の特徴が、サブクローニングおよび遺伝子発現を促進する
。（１）一方向でのクローニングを促進するための広範囲な多重クローニング部
位、（２）挿入ｐ−Ｈｙｄｅ ｃＤＮＡの構成性転写および翻訳を駆動するため
のＣＭＶプロモーター、および（３）発現を促進するためのＳＶ４０ポリアデニ
ル化シグナルに連結したＳＶ４０スプライスアクセプター。本来の読みとり枠を
含むｐ−Ｈｙｄｅ ｃＤＮＡのＫｐｎＩ−ＸｂａＩ断片を首尾よくｐｃＤＮＡ３
．１（−）ベクター内にサブクローン化した。次いでＨＹＤＥ挿入物を含むＣｓ
Ｃｌ−結合−精製−ｐｃＤＮＡ（ｐｓＨＹＤＥと命名した）を、Ｇ４１８選別下
、リポフェクタミン（ギブコ／ＢＲＬ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ））を用いて、ラッ
ト（ＡＴ−１およびＡＴ−３）、およびヒト（ＤＵ１４５およびＰＰＣ−１）前
立腺癌細胞株内にトランスフェクトした。このｐｃＨＹＤＥに加えて、すべての
細胞株にまた、陰性対照としてｐｃＤＮＡ３．１（−）ベクターを首尾よくトラ
ンスフェクトした。安定トランスフェクトを得た結果は、ｐｃＨＹＤＥ遺伝子産
物が宿主細胞に対して毒性ではないことを示唆した。

【０２６４】 安定ｐ−Ｈｙｄｅトランスフェクタントのｉｎ ｖｉｔｒｏ査定：列記した安
定トランスフェクト（ＡＴ１およびＡＴ３群）でのｐｃＨＹＤＥ機能を、細胞周
期およびアポトーシスに関連してｉｎ ｖｉｔｒｏで査定した。アポトーシス査
定の目的は、ｐ−Ｈｙｄｅが、癌抑制遺伝子ｐ５３の誘導化でのアポトーシス応
答のアップレギュレーションに関連する、齧歯類の推定ＴＳＡＰ−６のラット相
同物であるという仮定（Ａｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６）に基づいている
。一方で、細胞周期アッセイが、ＭＡＴ−ＬｙＬｕ細胞株が大いに転移性であり
、この細胞株でのｐ−Ｈｙｄｅ発現のレベルがＡＴ−１細胞株よりも相対的に高
いという事実を指している。

【０２６５】 細胞周期解析：細胞周期解析の戦略は、１ｍＭ ヒドロキシ尿素での処理の２
４時間後、細胞集団をＧ１およびＳ境界で止めることに基づいている（Ｉｗａｓ
ａｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９９５）。結果として、Ｇ２期がゼロになるべきであ
る。細胞を０、１０および２４時間の時点でのヒドロキシ尿素放出の後に回収し
、標準のヨー化プロピジウム染色を用いたフローサイトメーター解析にかけた。
結果は表ＩＩＩに示し、ヒドロキシ尿素の放出後１０時間の時点でＡＴ１−Ｈ１
およびＡＴ３−Ｈ１両方が、Ｓ期にはいるのに比較的ゆっくりであり、一方で親
細胞株（ＡＴ１およびＡＴ３）はより速かったことを示している。放出後２４時
間の時点で、Ｇ２細胞はすべて高められ、細胞周期が進行していたことを示唆し
ている。全体に、両ｐｃＨＹＤＥ安定トランスフェクタントでのＳ期へのゆっく
りとした入りは、ｉｎ ｖｉｖｏでのよりゆっくりとした腫瘍増殖と関連すると
いうことを直接的に確証していない。ヒドロキシ尿素の放出後０、１０および２
４時間の時点での細胞周期の再入の進行をフローサイトメーターで追った。一貫
して、ｔ．−ヒドロキシ尿素で処理した２４時間後でＧ２期は検出されず、この
ことは、細胞周期がＧ１とＳ期境界で止まっていることを示唆している。

【０２６６】 全体的に、２４時間の１ｍＭ ヒドロキシ尿素処理によるすべての細胞培養の
Ｇ１およびＳ境界での停止が、Ｇ２の０％集団に関連して確認された。これらの
結果は、ＡＴ１−Ｈ１およびＡＴ３−Ｈ１でのＳ期へ入るよりゆっくりとした応
答は、ｉｎ ｖｉｖｏでのこれらの安定トランスフェクタントの増殖特性を反映
している可能性のある、ｐｃＨＹＤＥ遺伝子産物の効果による可能性があること
を示唆している。

【０２６７】 アポトーシスに対する感受性の誘導：アポトーシス応答をＤＮＡラダーリング
アッセイを用いて査定した。ＤＮＡをそれぞれの処理（１ｍＭ ヒドロキシ尿素
で２４時間、続いて０．１ｍＭ ５’−ｄＦＵｒｄで２４時間）の後に抽出し、
１．６％アガロースゲル電気泳動上で解析した。細胞周期解析と一致して、安定
トランスフェクタントＡＴ１−Ｈ１およびＡＴ１−Ｈ３（ｐｃＨＹＤＥトランス
フェクトＡＴ−１およびＡＴ−３）のアポトーシス応答は、親（ＡＴ−１および
ＡＴ−３）およびｐｃＤＮＡ−トランスフェクト親細胞株（ＡＴ１−ｐｃ１およ
びＡＴ３−ｐｃ１）両方と比較して、持続的にそして有意により高かった。とり
わけ、最も高いアポトーシス応答は、０．１ｍＭ ５’−ｄＦＵｒｄでのインキ
ュベーション下での同期培養で起こった。

【０２６８】 ヒドロキシ尿素処理の後のＡＴ１−Ｈ１およびＡＴ３−Ｈ１トランスフェクタ
ントでの増強されたアポトーシス応答は、フルオロデオキシウリジンによるチミ
ジンシンターゼの直接の阻害を介した細胞内チミジン−２−三リン酸（ＴＴＰ）
の枯渇を導く、「チミジン欠失死（ｔｈｙｍｉｎｅｌｅｓｓ ｄｅａｔｈ）」（
Ｋｙｐｉａｎｏｕ，１９９４、Ｋｙｐｒｉａｎｏｕ ｅｔ ａｌ．，１９９４）
の結果である。一緒に考えると、これらのデータは、ｐｃＨＹＤＥ安定トランス
フェクタントでのアポトーシス応答は、ｐｃＨＹＤＥ遺伝子産物の下流効果によ
ることを示唆している。

【０２６９】 ＵＶ傷害ＤＮＡは、ｐ−Ｈｙｄｅでトランスフェクトした前立腺癌で修復され
得ない：３つのＤＮＡ酵素修復系、ウリジンホスホリラーゼ、ウリジンキナーゼ
およびＵＶ傷害修復が、ｐ−Ｈｙｄｅトランスフェクトした細胞と比較して、親
株で上昇した。ＵＶ傷害修復は、ｐ−Ｈｙｄｅトランスフェクト細胞で機能を果
たさなかった。ＤＮＡ修復機能の減少は、もともとの光反応産物（６４ＰＰ）の
より高い濃度となる。これらのデータと一致して、ｐ−Ｈｙｄｅトランスフェク
ト細胞はまた、コロニー形成アッセイにて測定したように、親ＡＴ３細胞と比較
して、ＵＶ曝露をの後の生存の有意な減少を示した。したがって、ＤＮＡ修復酵
素の欠陥は、ｐ−Ｈｙｄｅでトランスフェクトした前立腺癌細胞でのより短い生
存およびアポトーシスの誘導と相関した。

【０２７０】 ｐ−ＨｙｄｅのノザンＲＮＡ解析はｐ−Ｈｙｄｅの過剰発現を確かにする：ア
ポトーシス応答と転写レベルでのｐ−Ｈｙｄｅの間の関係を確かめるために、Ａ
Ｔ３親細胞株と比較した、ＡＴ３−Ｈ１、ＡＴ３−Ｈ２から由来したトータルＲ
ＮＡのノザン解析を実施した。結果は、ＡＴ３−Ｈ１およびＡＴ３−Ｈ２の安定
トランスフェクタントでのｐｃＨＹＤＥ転写レベルは、ＡＴ３親細胞株と比較し
て有意に高かったことを明らかに示唆している。このノザン解析は、プローブと
してＰＣＲ産物および内部対照シクロフィリンを用いて、ＡＴ３、ＡＴ３−Ｈ１
およびＡＴ３−Ｈ２でのみ実施した。

【０２７１】 ｐ−Ｈｙｄｅはｉｎ ｖｉｖｏでの前立腺癌増殖を抑制する：最も低いレベル
のｐ−Ｈｙｄｅ発現はＡＴ３細胞株で観察された。このため、ＡＴ３細胞株を、
Ｇ４１８選別化でのｐｃＤＮＡ３．１（−）の哺乳動物発現ベクター内のｐ−Ｈ
ｙｄｅの構造物である、ｐｃＨＹＤＥでトランスフェクトした。陰性対照として
、ＡＴ−３細胞株もまた、ベクターのみでトランスフェクトし、得られた安定ト
ランスフェクタントをＡＴ３−ｐｃと呼ぶ。

【０２７２】 ＡＴ−３の親細胞株の腫瘍増殖および安定トランスフェクタントＡＴ３−Ｈ１
およびＡＴ３−Ｈ２でのものをｉｎ ｖｉｖｏで評価した。０．３ｍｌのハンク
ス溶液中のそれぞれの細胞株の１００万個の細胞を、インブリード オス コペ
ンハーゲンラットの各脇腹に皮下移植した。この初期実験において、それぞれ５
匹のラットの３つの群にそれぞれの細胞株を注入した。腫瘍の大きさを工程の後
にスコア化した。これらの結果は、ＡＴ３−Ｈ１とＡＴ３−Ｈ２両方の安定トラ
ンスフェクタントが、ＡＴ−３親細胞株よりも有意に遅く増殖し、両方の安定ト
ランスフェクタントでの腫瘍増殖抑制が、ｐｃＨＹＤＥ遺伝子産物によって調節
されていることを示唆していることを示した。

【０２７３】 腫瘍進行は、癌遺伝子および癌抑制遺伝子の発現に影響を与える遺伝的変化の
蓄積を示し、これによって細胞の、オートクラインおよびパラクライン陽性およ
び陰性増殖調節剤に対する応答性が変化する。前立腺癌腫瘍進行のダニング腫瘍
ラットモデルは、アンドロゲンに対する異なった応答を示す、よく分化したもの
から、あまり分化していないものまでの、前立腺癌表現型の範囲からなる。さら
に亜系が、同一のもともとの自発的ラット前立腺腫瘍から起こり、進展し、した
がって腫瘍進行そのもののみの本研究を行った。これらの細胞株の発達は、単一
および多重連続継代内での腫瘍の進行の結果としてである。

【０２７４】 高い転移性ラットＭＡＴ−ＬｙＬｕ細胞株から合成したｃＤＮＡライブラリー
の競合ハイブリッド形成のスクリーニング戦略は、結果としてｐ−Ｈｙｄｅと命
名したｃＤＮＡクローンとなった（Ｒｉｎａｌｄｙ ａｎｄ Ｓｔｅｉｎｅｒ，
１９９７）。その制限地図として示した、このｃＤＮＡの全長は、２７１３核酸
残基からなり、それぞれ１４６７および１４５２残基からなる２つの読みとり枠
を含む。配列の４６パーセントが非翻訳領域であり、この大部分が遺伝子の３’
末端にある。ラットｐ−Ｈｙｄｅの核酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ３に列記し
、ヒトｐ−Ｈｙｄｅの核酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １に列記する。

【０２７５】 ｐ−Ｈｙｄｅの発現レベルを、ラットおよびヒト前立腺癌細胞株両方で、ノザ
ンブロット解析にて決定し、内部対照としてのシクロフィリン発現と比較した。
ダニングラット前立腺癌細胞株ＡＴ−１、ＭＡＴ−ＬｙＬｕ、ＭＡＴ−Ｌｕ、Ａ
Ｔ−３およびＧ、およびヒト前立腺癌細胞株ＰＰＣ１、ＬＮＣａＰ、ＴＳＵおよ
びＤＵ１４５は、異なる発現レベルですべて陽性である（表Ｉ）。ヒト対応物の
転写サイズは、ラットｐ−Ｈｙｄｅ ｍＲＮＡと比較してわずかに小さい。デー
タはまた、ラットおよびヒト前立腺癌細胞株中のｐ−Ｈｙｄｅ遺伝子の差次的発
現が存在し、ｐ−Ｈｙｄｅ発現と前立腺癌進行の間に機能的相関が存在する可能
性があることを示唆していることを示している。ＭＡＴ−Ｌｕは、最も高い転写
レベルを示し、一方でＡＴ−３が最も低かった。これらの２つの細胞株間の著し
い差は、高い転移性のＭＡＴ−Ｌｕ細胞株の増殖特性とのその関連において重要
である。これらのデータはまた、ＭＡＴ−ＬｙＬｕでの転写のレベルが、ＡＴ−
１よりも比較的（１０％）高いことを示唆し、このことは、新規ｃＤＮＡがＭＡ
Ｔ−ＬｙＬｕとＡＴ−１ ｃＤＮＡ間のｃＤＮＡ競合の結果であることを示して
いる（Ｒｉｎａｌｄｙ ａｎｄ Ｓｔｅｉｎｅｒ，１９９７）。重要なものは、
ｐ−Ｈｙｄｅのヒト相同物が、ヒト前立腺癌細胞株内に存在することである。最
も高いｐ−Ｈｙｄｅ転写レベルはＰＰＣ１、初代アンドロゲン感受性ヒト前立腺
癌細胞株で起こり、一方でＬＮＣａＰ細胞株、アンドロゲン−不感受性前立腺癌
細胞株で最も低かった。したがって、ｐ−Ｈｙｄｅは哺乳動物前立腺組織に特異
的であるように見えないけれども、しかし胎盤および乳を含む他の組織、および
マウスおよびヒトのような他の種で見られ、このことは、その役割が基礎細胞生
物学で重要であることを示唆している。

【０２７６】 腫瘍抑制とアポトーシスに対する感受性の誘導：興味深いことに、ｐ−Ｈｙｄ
ｅは、腫瘍抑制遺伝子のように働く能力と、ｐ５３非依存的経路によってである
可能性のあるアポトーシスに対する感受性を誘導する能力の二重能力を持つ。ラ
ットでの前立腺腫瘍の増殖は、ｐ−Ｈｙｄｅによって顕著に抑制された。さらに
、ｐ−Ｈｙｄｅを発現している前立腺癌は、細胞のプログラムされた死へこれら
の細胞を駆動させるＵＶ ＤＮＡ傷害により感受性であった。ＤＮＡ修復酵素活
性の解析は、本来の（６−４）ＰＰの存在となり、コロニー形成アッセイにて細
胞生存の減少となる欠陥を示唆している。しかしながら、ｐ−Ｈｙｄｅの、アポ
トーシスに対する感受性を誘導する能力は、ＵＶ ＤＮＡ傷害に限らない。フル
オロウラシル（５−ＦＵ）と関連し、および広い範囲のヒト上皮悪性腫瘍の処置
のために使用されてきた化学治療剤、フルオロデオキシウリジン、ピリミジン抗
生物質もまた、ｐ−Ｈｙｄｅを発現している前立腺癌細胞でのアポトーシスをよ
り容易に誘導する。さらに、ｐ−Ｈｙｄｅを発現している癌細胞はまた、ガンマ
放射により感受性である。したがって、細胞ＤＮＡ傷害の機構は、ＵＶ、ガンマ
照射およびフルオロデオキシウリジンに関して異なり、このことは、細胞をアポ
トーシスにより感受性にする能力は、機能においてより包括的であることを示唆
している。このｐ−Ｈｙｄｅの固有の機能は、アポトーシスに対する感受性を誘
導する新しい種類の遺伝子を表している。これは、アポトーシスを直接的に誘導
するｐ５３のような癌抑制遺伝子に帰する機能（Ｙｏｎｉｓｈ−Ｒｏｕａｃｈ
ｅｔ ａｌ．，１９９１）とは異なる。さらに、ｐ−Ｈｙｄｅ活性は、ｂｃｌ−
２が存在しているときではなく、存在しないときのｂｃｌ−２と対比して、癌細
胞を、細胞のプログラムされた死に対してより感受性にする（ＭｃＤｏｎｎｅｌ
ｌ ｅｔ ａｌ．，１９９２）。

【０２７７】 ヒト疾患の治療での使用：ｐ−Ｈｙｄｅ遺伝子のこれらの固有の機能的特性を
、過形成疾患および癌の治療のために活用してよい。たとえば１つの効果的な治
療戦略は、（アセチルアミノフルオリンのような）化学療法剤またはＵＶ模倣薬
物でのｐ−Ｈｙｄｅを発現している癌腫細胞の治療である。しかしながら、癌細
胞は、有意なレベルの増殖阻害ｐ−Ｈｙｄｅを産出しないようである。その結果
、ｐ−Ｈｙｄｅ遺伝子は、本研究で示したようにｐ−Ｈｙｄｅによって直接的に
抑制されるだけではなく、化学療法、ＵＶ模倣薬物または放射のようなＤＮＡ傷
害治療との組合せで処置したときに、よりよい抗癌効果を持つ可能性がある。遺
伝子治療は癌細胞を標的にするので、アポトーシスの増加が、ＤＮＡ傷害（ＵＶ
、照射、または化学療法）を受けた癌細胞でより選択的に起こる可能性がある。

【０２７８】 実施例２：新規腫瘍抑制遺伝子ｐＨｙｄｅを発現しているアデノウイルスを用
いた前立腺癌遺伝子治療 材料と方法 細胞株および組織培養条件：（ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａ
ｎｄより入手した）ヒト前立腺癌細胞株ＰＰＣ−１、ＤＵ１４５、ＰＣ−３、Ｌ
ＮＣａＰおよびＴＳＵ−Ｐｒ１を、３７℃および５％ＣＯ₂にて、１０％ウシ胎
児血清（ハイクローン ラボラトリーズ（Ｈｙｃｌｏｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｉｅｓ），Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）を含むＲＰＭＩ−１６４０培地（セルグロ（Ｃｅ
ｌｌｇｒｏ），Ｈｅｒｎｄｏｎ，ＶＡ）中で増殖させた。ヒト胎児腎臓細胞株２
９３（ＡＴＣＣ）は、３７℃および５％ＣＯ₂にて、１０％熱不活性化ウシ胎児
血清を含むＤ−ＭＥＭ培地（セルグロ（Ｃｅｌｌｇｒｏ））中で増殖させた。

【０２７９】 ＡｄＲＳＶｐＨｙｄｅの構築：ラットｐＨｙｄｅ ｃＤＮＡ遺伝子を、米国特
許明細書番号第０９／３０２，４５７号で記述したように単離した。ＥｃｏＲＩ
での消化の後、ｐＨｙｄｅ ｃＤＮＡの１４６７ｂｐ全長コード配列を含む２．
６ｋｂの断片を、切断ＲＳＶプロモーター（３９５ｂｐ）の制御下で、Ｅ１／Ｅ
３欠失アデノウイルスシャトルベクター内にサブクローン化した。得られたアデ
ノウイルスシャトルベクターを、リン酸カルシウム法にて、ｐＪＭ１７、アデノ
ウイルス５型ゲノムプラスミドとともに２３９細胞内へ共トランスフェクトした
。個々のプラークを、ＲＳＶプロモーターとｐＨｙｄｅ ｃＤＮＡ配列両方に特
異的なプライマーを用いたＰＣＲにて、組換え体ＡｄＲＳＶｐＨｙｄｅに関して
選別した。単一ウイルスクローンを２９３細胞内で増殖させた。完全細胞変性効
果（ＣＰＥ）を示している２９３細胞の培養培地を回収し、アデノウイルスを２
回のＣｓＣｌ₂勾配超遠心にて精製し、濃縮した。ウイルス滴定および導入をす
でに記述したように実施した。ＡｄＲＳＶｐＨｙｄｅの概略図を図１に示した。
ＡｄＲＳＶｐＨｙｄｅの配列を図１０に列記する。

【０２８０】 ノザンブロット：細胞を抽出し、トータルＲＮＡをＲＮｅａｓｙ Ｋｉｔ（キ
アゲン（Ｑｉａｇｅｎ），Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒｉｔａ，ＣＡ）にて単離した。
トータルＲＮＡを１．２％ポリアクリルアミドゲル上にのせ、電気泳動を実施し
た。ナイロン膜（Ｎｙｂｏｎｄ−Ｎ⁺，アマシャム ライフ サイエンス（Ａｍ
ｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ），Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ
，Ｅｎｇｌａｎｄ）への標準ノザンブロット転写をすでに記述したように実施し
た。ｃＤＮＡプローブ（ｐＨｙｄｅまたはｐ５３）を、ランダムプライマー法（
Ｐｒｉｍｅ−Ｉｔ ＩＩ Ｋｉｔ，ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ），
Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いてａ−³²Ｐ−ｄＣＴＰにて標識した。膜を、取
り扱いプロトコールにしたがって、Ｒａｐｉｄ−ｈｙｂ干渉液（アマシャム ラ
イフ サイエンス（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ））中でこの
プローブとハイブリッド形成させた。膜を、オートラジオグラフィーのための−
８０℃で、１枚の増強スクリーン下、コダック（Ｋｏｄａｋ）Ｘ線フィルムに感
光した。ＧＡＰＤＨ ｃＤＮＡプローブを、上述にように標識し、標準化のため
の内部標準として使用した。

【０２８１】 ウエスタンブロット：細胞を、すでに記述されたように（Ｌｕ Ｙ，Ｗｈｉｔ
ａｋｅｒ Ｌ，Ｌｉ Ｘ，ｅｔ ａｌ．齧歯類ＰＣＣ４．ａｚａ１Ｒ胎児癌腫細
胞内でのガレクチン−１およびその相補的糖共役物ラミニン、およびリソソーム
関連膜タンパク質の共発現がブチレートによる分化を誘導する（Ｃｏｅｘｐｒｅ
ｓｓｉｏｎ ｏｆ ｇａｌｅｃｔｉｎｅ−１ ａｎｄ ｉｔｓ ｃｏｍｐｌｅｍ
ｅｎｔａｒｙ ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｌａｍｉｎｉｎ ａｎｄ ｌ
ｙｓｏｓｏｍｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ
ｉｎ ｍｕｒｉｎｅ ＰＣＣ４．ａｚａ１Ｒ ｅｍｂｒｙｏｎａｌ ｃａｒｃ
ｉｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｔｏ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉ
ｏｎ ｂｙ ｂｕｔｙｒａｔｅ．）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒ．１９９５
：３：１７５−１９１）、抽出して、ゲル電気泳動で処理した。細胞抽出溶解物
（１００ｍｇ）を１２％ポリアクリルアミドゲル上にのせ、ドデシルスルフェー
トナトリウム（ＳＤＳ）ゲル電気泳動にかけ、次いでニトロセルロース膜（バイ
オ−ラッド ラボラトリーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ），
Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）に転写した。この膜をブロッキング緩衝液（リン酸緩
衝食塩水中、１５％非脂肪牛乳、０．０２％アジ化ナトリウム）で、４℃にて一
晩処理した。この膜を室温にて１時間、（ｐＨｙｄｅコード配列から由来したコ
ンピュータ作成抗原性ペプチドに基づいてリサーチ ジェネティックス社（Ｒｅ
ｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．）より特別に合成された）ウサギ抗
ラットｐＨｙｄｅポリクローナル抗体とともにインキュベートした。次いで膜を
室温にて１時間、¹²⁵Ｉ−標識化二次抗体（アマシャム ライフ サイエンス（
Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ），Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉ
ｇｈｔｓ，ＩＬ）と共にインキュベートした。膜をオートラジオグラフィーのた
めに−８０℃にて、２枚の増強スクリーンの間でコダック（Ｋｏｄａｋ）Ｘ線フ
ィルムに感光させた。

【０２８２】 ＡｄＲＳＶｐＨｙｄｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ研究：ヒト前立腺癌細胞を、１００
または２００の多重感染（ＭＯＩ）で、ｉｎ ｖｉｔｒｏにてＡｄＲＳＶｐＨｙ
ｄｅを感染させた。ウイルス感染の後、細胞を３７℃にてインキュベートし、細
胞数をウイルス感染の５日後に測定した。

【０２８３】 ＤＵ１４５異種組織片腫瘍を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ研究：ＤＵ１４５細胞（
０．２ｍｌのＰＢＳ中１．４×１０⁷細胞）をオスヌードマウス（ハーラン ス
プレーグ ドーリー（Ｈａｒｌａｎ Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ））の脇腹
内に皮下注射した。腫瘍が平均用量８０ｍｍ³に達したならば、５×１０⁹ｐｆｕ
のアデノウイルス（ＡｄＲＳＶｐＨｙｄｅまたはコントロールアデノウイルスＡ
ｄＲＳＶｌａｃＺ）または未処理対照としてＰＢＳのみを腫瘍内に直接注入した
。腫瘍体積を、動物を安楽死させるまで、毎３〜４日ごとに測定した。すべての
動物を、何匹かが苦痛を示し、総体重の１５％以上の腫瘍負荷量であった、ウイ
ルス感染後５２日目に犠牲死させた。腫瘍試料を回収し、Ｈ＆Ｅ染色を施した。

【０２８４】 ＤＮＡ抽出およびＤＮＡ断片化のゲル電気泳動的解析：可溶性ＤＮＡをすでに
（Ｏｒｉｄａｔｅ Ｎ，Ｌｏｔａｎ Ｄ，Ｘｕ Ｘ−Ｃ，Ｈｏｎｇ ＷＫ，ａｎ
ｄ Ｌｏｔａｎ Ｒ．ヒト頭頸扁平上皮細胞癌腫細胞株での全トランスレチノイ
ン酸およびＮ−（４−ヒドロキシフェニル）レチナミドによるアポトーシスの差
次的誘導（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｐｏｐｔ
ｏｓｉｓ ｂｙ ａｌｌ−ｔｒａｎｓ−ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ ａｎｄ
Ｎ−（４−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｒｅｔｉｎａｍｉｄｅ ｉｎ ｈｕｍ
ａｎ ｈｅａｄ ａｎｄ ｎｅｃｋ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉ
ｎｏｍａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ．）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９９
６；２：８５５−８６３）記述されたように抽出した。簡単には、培地に浮遊し
ている細胞を、遠心にて形質導入後４８時間で回収した。ペレットをＴｒｉｓ−
ＥＤＴＡ乾燥液（ｐＨ８．０）中に再懸濁させた。細胞を、氷上で１５分間、１
０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．５％
Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００中で溶解させた。溶解物を１２，０００×ｇにて１
５分間遠心し、可溶性（断片化）ＤＮＡをペレット（本来のゲノム）ＤＮＡより
分離した。可溶性ＤＮＡをＲｎａｓｅＡ（５０ｕｇ／ｍｌ）で、３７℃にて１時
間処理し、続いて５０℃にて２時間、０．５％ＳＤＳ中のプロテイナーゼＫ（１
００ｕｇ／ｍｌ）で処理した。残余物質を、フェノール／クロロホルムにて抽出
し、エタノール沈殿し、２％アガロースゲル上で電気泳動した。

【０２８５】 結果 ＤＵ１４５細胞中での外生ｐＨｙｄｅ発現：ＡｄＲＳＶｐＨｙｄｅが、ｍＲＮ
Ａおよびタンパク質レベルで、ラットｐＨｙｄｅを首尾よく伝送し、発現できる
かどうか決定するために、ＤＵ１４５細胞を、ＭＯＩ＝２００でＡｄＥＳＶｐＨ
ｙｄｅにて形質導入した。細胞抽出物をウイルス感染後４８時間で回収し、ｐＨ
ｙｄｅ発現を測定した。ＤＵ１４５細胞において、ｍＲＮＡレベルで、わずかな
外生のｐＨｙｄｅは発現があり、（図２Ａ）しかしタンパク質レベルではなかっ
た一方で、ＡｄＲＳＶｐＨｙｄｅによって誘導された明らかに高い外生ｐＨｙｄ
ｅ発現がｍＲＮＡ（図２Ａ）およびタンパク質（図２Ｂ）レベル両方で、存在し
た。

【０２８６】 ＡｄＲＳＶＨｙｄｅによって抑制された前立腺癌細胞増殖：ｐＨｙｄｅのヒト
前立腺癌細胞株の細胞増殖における効果を決定するために、ＤＵ１４５およびＬ
ＮＣａＰを、ｉｎ ｖｉｔｒｏにて、ＡｄＲＳＶｐＨｙｄｅ、ＡｄＲＳＶｌａｃ
Ｚ（コントロールベクター）で、またはウイルスなしで処理した。ＡｄＲＳＶｐ
Ｈｙｄｅは、未処理対照細胞と比較して、それぞれ７６．９％（図３Ａ）および
８３．１％（図３Ｂ）にて、ＤＵ１４５およびＬＮＣａＰ細胞の増殖を有意に抑
制した。

【０２８７】 ＡｄＲＳＶｐＨｙｄｅはｉｎ ｖｉｖｏでの前立腺癌増殖を抑制した：ｉｎ
ｖｉｖｏでの前立腺癌細胞増殖のＡｄＲＳＶｐＨｙｄｅ処置の効果を評価するた
めに、ＤＵ１４５ヒト前立腺腫瘍を、ヌードマウスの脇腹に１．４×１０⁷ＰＰ
Ｃ−１細胞を皮下注射することでヌードマウス内で確立した。マウスが平均８０
ｍｍ³体積の癌を発達させた時に、マウスを３つの群、ＡｄＲＳＶｐＨｙｄｅ処
理（ｎ＝７）、ＡｄＲＳＶｌａｃＺコントロールベクター処理（ｎ＝７）、およ
び未処理群（ｎ＝７）に分けた。処理した腫瘍に、コントロールウイルスまたは
ＡｄＲＳＶｐＨｙｄｅいずれかの５×１０⁹ｐｆｕの単一投与を注入した。図４
で示したように、未処理およびコントロールウイルス処理ＤＵ１４５腫瘍は、Ａ
ｄＲＳＶｐＨｙｄｅ処理腫瘍と比較して素早く増殖した。ウイルス注入後５３日
までに、未処理およびコントロールウイルス処理ＤＵ１４５腫瘍を持つヌードマ
ウスでの腫瘍付加は、それぞれ５９５３ｍｍ³および４７７７ｍｍ³に達した。反
対に、ＡｓＲＳＶｐＨｙｄｅを形質導入したＤＵ１４５腫瘍は、未処理およびコ
ントロールウイルス処理−Ｄｕ１４５腫瘍と比較して、腫瘍体積（１５１５ｍｍ³ ）における有意な減少、すなわち未処理の２５．４％、およびコントロールウ
イルス処理ＤＵ１４５腫瘍体積の３１．７％（図４）を示した。

【０２８８】 ＡｄＲＳＶｐＨｙｄｅによる増殖抑制は、前立腺癌細胞でのｐ５３発現に関係
した：ｉｎ ｖｉｔｒｏ研究での１つの観察は、ＡｄＲＳＶｐＨｙｄｅによって
形質導入したＤＵ１４５およびＬＮＣａＰ細胞の表現型も変化したことである。
対照およびコントロールウイルス処理細胞とは異なり、ＡｄＲＳＶｐＨｙｄｅ形
質導入細胞は、丸く、分離し、浮遊した死亡細胞の明らかな形態、アポトーシス
を受けている細胞の特徴、および細胞数のそのうちの素早い減少を示した（図５
）。一貫して、ＡｄＲＳＶｐＨｙｄｅは、これら２つの細胞株の増殖において強
い抑制を示した。しかしながら、これらの株での未処理対照、コントロールウイ
ルス処理およびＡｄＲＳＶｐＨｙｄｅ処理細胞間に明白な形態学的差異はなかっ
た（図６）。さまざまな遺伝子、とりわけアポトーシス経路に含まれるものの差
次的発現が、異なる前立腺癌細胞株上のＡｄＲＳＶｐＨｙｄｅによる差次的阻害
効果について説明するかどうかを決定するために、ｐ５３およびＲｂを含むさま
ざまな遺伝子を、ノザンハイブリッド形成にてｍＲＮＡレベルで選別した。興味
深いが、しかしそれほど驚くべきことではなく、ｐ５３はＤＵ１４５およびＬＮ
ＣａＰでのみ発現が見られたが、ＰＣ−３、ＴＳＵ−ＰｒおよびＰＰＣ細胞では
見られず、一方で、Ｒｂ遺伝子はこれらの細胞にてｍＲＮＡレベルですべて発現
していた（図７）。したがって、ｐ５３発現とＡｄＲＳＶｐＨｙｄｅ仲介抑制の
間に関係が存在したことが明らかである。ｐＨｙｄｅがｐ５３の発現を調節する
かどうか決定するために、図２Ａでの同様のノザンブロットを、分離し、ｐ５３
プローブで再ハイブリッド形成させた。実際に、ｐ５３ ｍＲＮＡの誘導がＡｄ
ＲＳＶｐＨｙｄｅ形質導入ＤＵ１４５細胞で観察された（図８）。さらに、Ａｄ
ＲＳＶｐＨｙｄｅによるＬＮＣａＰ細胞の形質導入は、アポトーシスを受けてい
る細胞に対するマーカーである、ＤＮＡラダーリング傾向を示し（図９）、ｐＨ
ｙｄｅ発現がＬＮＣａＰ細胞でアポトーシスを誘導したことを示唆している。共
に考えると、これらの結果は、ｐＨｙｄｅが、ｐ５３経路を介して、アポトーシ
スを誘導するように機能する可能性があり、その増殖抑制は、標的細胞内のｐ５
３発現に依存する可能性がある。

【０２８９】 先の研究は、ｐＨｙｄｅが、腫瘍抑制遺伝子様にはたらき、そしてアポトーシ
スに対する感受性を誘導する二重能力を持っていることを示した。ラットでの前
立腺腫瘍の増殖は、ｐＨｙｄｅに顕著に抑制された。さらに、ｐＨｙｄｅを発現
している前立腺癌細胞は、これらの細胞を細胞のプログラムされた死へと駆動す
るＵＶ ＤＮＡ傷害により感受性であった。この研究において、ＡｄＲＳＶｐＨ
ｙｄｅは、ｐ５３を発現している前立腺癌細胞に対して、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよ
びｉｎ ｖｉｖｏ両方で細胞の増殖を効果的に抑制するが、ｐ５３発現を欠いた
前立腺癌細胞では抑制しなかったことを示した。１つの可能性は、ｐＨｙｄｅが
（ＤＵ１４５およびＬＮＣａＰ細胞のような）ｐ５３依存経路および、アポトー
シスの共誘導体として働くＵＶまたは（メチルニトロソ尿素のような）化学物質
などの外部細胞死誘引を必要とするｐ５３非依存的経路によってアポトーシスを
誘導できることである。ＰＰＣ−１、ＰＣ−３およびＴＳＵ−Ｐｒではなく、Ｄ
Ｕ１４５およびＬＮＣａＰのみがｍＲＮＡレベルでｐ５３を発現しているという
本発明者らの結果（図１０）と一致して、他のグループが、ＤＵ１４５およびＬ
ＮＣａＰ細胞のみがタンパク質レベルでｐ５３を発現し、ＰＣ−３およびＴＳＵ
−Ｐｒでは発現しなかったことを発見した。興味深いことに、ＤＵ１４５でのｐ
５３タンパク質は変異ｐ５３であることが主張された。²¹したがって、その野生
型または変異体状態に関わらず、ｐ５３タンパク質の存在は、単独で腫瘍抑制遺
伝子として働くためにｐＨｙｄｅにとって必要であると考えられる。ＤＵ１４５
でのｐ５３タンパク質中の変異が、ｐＨｙｄｅ仲介増殖抑制に関するその能力に
影響を与えない可能性があるという可能性は、さらに研究する必要がある。さら
に、（ＰＣ−３およびＴＳＵ−Ｐｒのような）ｐ５３タンパク質発現を欠いてい
る細胞でのＡｄＲＳＶｐＨｙｄｅとＵＶ（またはメチルニトロソ尿素）の組合せ
の潜在的抑制効果がさらに特性化されるであろう。

【０２９０】 本研究の１つの興味深く、重要な発見は、ＡｄＲＳＶｐＨｙｄｅがＤＵ１４５
細胞でのｐ５３発現を誘導したことであった。このことは、ｐＨｙｄｅが、アポ
トーシスに対する感受性を誘導するためのより一般的な様式で働くことを説明す
るだけでなく、またｐＨｙｄｅがＴＳＡＰ−６遺伝子のラット相同物、またはｐ
５３関連経路に含まれるＴＳＡＰ−６様ファミリーの一員である可能性があるの
で、ｐＨｙｄｅがなぜ、ｐ５２−関連経路に含まれると主張されたヒトタンパク
質、ＴＳＡＰ−６と部分配列相同性を持つのかも部分的に説明し得、。さらに、
もしあるならば、本当に少量の、ｐ５３遺伝子の調節物として働く同定された細
胞タンパク質が存在し、これは多くの下流遺伝子を働かせる転写因子である。ｐ
Ｈｙｄｅがｐ５３発現をアップレギュレートするという発見の重要性、および続
いて新規細胞調節機構に関する探索が起こっている。しかしながら、ｐＨｙｄｅ
が、転写レベルで、直接ｐ５３遺伝子を調節しているかどうかは、ＤＵ１４５細
胞中のｐＨｙｄｅタンパク質の存在および非存在下で、ｐ５３プロモーター／Ｃ
ＡＴレポーターキメラ遺伝子を使用することによる本発明者らの現在の研究で決
定される予定である。

【０２９１】 まとめると、ｐＨｙｄｅは、新規癌抑制遺伝子であり、ＡｄＲＳＶｐＨｙｄｅ
は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ両方で、前立腺癌を効果的に抑制す
る。ＡｄＲＳＶｐＨｙｄｅのみの単一治療またはＡｄＲＳＶｐＨｙｄｅの放射−
または化学−治療との組合せ治療が、局所的に発達した前立腺癌の処置のために
効果的な治療潜在力を持っているに違いない。

【０２９２】 実施例３ アポトーシスを検出するための他の伝統的な方法である、ＴＵＮＥＬアッセイ
をまた、ＡｄＲＳＶｐＨｙｄｅが実際にＤＵ１４５細胞にアポトーシスを引き起
こすことを示すために使用した。ウイルス形質導入後７２時間、培養ディッシュ
上で増殖しているＤＵ１４５細胞にＴＵＮＥＬアッセイを行った。未処理対照（
図１５Ａおよび１５Ｄ）またはコントロールウイルス形質転換細胞（図１５Ｂお
よび１５Ｅ）と比較して、ＡｄＲＳＶｐＨｙｄｅ形質転換細胞（図１５Ｃおよび
１５Ｆ）でより蛍光染色細胞が存在し、このことは、後者２つの場合よりもＡｄ
ＲＳＶｐＨｙｄｅ処理細胞でよりアポトーシス細胞が存在したことを示唆してい
る。さらに、ヌードマウス内で増殖しているＤＵ１４５異種移植片腫瘍からの腫
瘍分泌が、未処理腫瘍（図１７Ａ）およびコントロールウイルス処理腫瘍のもの
と比較して、ＡｄＲＳＶｐＨｙｄｅ処理腫瘍（図１７Ｂ）で有意なアポトーシス
が起こっていたことを示している。

【０２９３】 ＡｄＲＳＶｐＨｙｄｅ形質導入ＤＵ１４５細胞のＴＵＮＥＬアッセイは、増殖
抑制（７６．９％抑制、図１７Ａ）と適応した程度までの比較可能なアポトーシ
ス細胞量（約１０％染色細胞、図１５）を示さなかった。１つの説明は、細胞の
増殖抑制は、ＡｄＲＳＶｐＨｙｄｅ形質転換の５日後に記録し（図１７Ａ）、一
方で、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＴＵＮＥＬ染色はＡｄＲＳＶｐＨｙｄｅ形質導入の３
日後の細胞で実施した（図１５）ということである。ＡｄＲＳＶｐＨｙｄｅ形質
導入２１日後より由来した、ｉｎ ｖｉｖｏ ＡｄＲＳＶｐＨｙｄｅ処置ＤＵ１
４５異種移植片腫瘍区画のＴＵＮＥＬ染色が、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＴＵＢＥＬ染
色（図１５）と比較して、有意に高い量のアポトーシス細胞を示した（図１６）
ので、ｐ−Ｈｙｄｅ仲介アポトーシスは、ウイルス形質導入の３日後に細胞内で
はまだ入手可能ではないアポトーシスのピークを示すのに時間がかかる可能性が
ある。他の説明は、アポトーシスが、ｐＨｙｄｅ仲介増殖阻害の単に部分を説明
している可能性があり、言い換えれば、ｐＨｙｄｅ仲介増殖阻害は、アポトーシ
スと他の既知の機構からなっている可能性があるということである。以下で記述
するように、ＡｄＲＳＶｐＨｙｄｅは、他のヒト前立腺癌細胞株ＴＳＵの細胞増
殖を阻害することができるが、しかしながらＡｄＲＳＶｐＨｙｄｅ形質転換ＴＳ
Ｕ細胞でアポトーシスは観察されなかった。

【０２９４】 ｐ５３状態とｐＨｙｄｅによるアポトーシスに対する感受性の間に関係がある
かどうかを決定するために、４つの異なるヒト前立腺癌細胞株ＰＣ３、ＴＳＵ、
ＬＮＣａＰおよびＤＵ１４５を、ｐ５３の外因性発現ｖおよびｐＨｙｄｅ仲介増
殖抑制に対するその感受性に関して選別し、アポトーシスを比較した。ノザンブ
ロット解析は、ＰＣ−３およびＴＳＵ細胞がｍＲＮＡレベルでｐ５３を発現せず
、一方で、ＬＮＣａＰとＣＵ１４５細胞は両方ともｐ５３ ｍＲＮＡを発現して
いることを示した。反対に、４つの細胞株すべてが、ｍＲＮＡレベルで比較可能
なＲｂを発現していた（図１８）。一貫して、他のグループが、ＰＣ−３細胞で
はなく、ＤＵ１４５とＬＮＣａＰ細胞が、ウエスタンブロット解析でｐ５３タン
パク質を発現していることを示した。

【０２９５】 これらの４つの細胞株の、ｐＨｙｄｅ仲介増殖抑制およびアポトーシスに対す
る感受性を決定するために、細胞をＡｄＲＳＶｐＨｙｄｅで形質導入し、増殖を
モニタした。ＡｄＲＳＶｐＨｙｄｅは、ｐ５３を発現している２つの細胞株であ
る、ＤＵ１４５およびＬＮＣａＰ細胞において、強力な増殖抑制を持った（ぞれ
ぞれ、未処理対照と比較して７６．９％および８３．１％抑制、図１７）。興味
深いことに、２つのｐ５３を発現していない細胞株ＰＣ−３およびＴＳＵに関し
て、ＡｄＲＳＶｐＨｙｄｅは、ＰＣ−３細胞の増殖になんの抑制効果も持たず、
しかしＴＵＳ細胞の増殖においては、小さな抑制を示した（未処理対照と比較し
て２４．５％）（図１９）。しかしながら、ＡｄＲＳＶｐＨｙｄｅ形質導入ＰＣ
−３およびＴＳＵ細胞はどちらも、ＤＮＡ断片かおよびＴＵＮＥＬアッセイによ
って検出したようなアポトーシスを示さなかった。これらの結果は、ｐ５３の存
在と、細胞のｐＨｙｄｅ仲介アポトーシスに対する感受性の間に関係がある可能
性があることを示唆している。ｐ５３は、ｐＨｙｄｅ仲介アポトーシス誘導に必
要である可能性がある。さらに、予備結果は、鍵となるアポトーシスプロテアー
ゼである、カスパーゼ−３が、ＤＵ１４５細胞でのＡｄＲＳＶｐＨｙｄｅ形質導
入後に上昇したことを示した。

【０２９６】 参考文献 Ａｍｓｏｎ ＲＢ，Ｎｅｍａｎｉ Ｍ，Ｒｏｐｅｒｃｈ ＪＰ，Ｉｓｒａｅｌ
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ｒｏｓｔａｔｅ ｃａｒｃｉｎｏｍａ），Ｊ Ｕｒｏｌ，１４７，７８９−７９
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ジドチミジンによるヒト大腸癌細胞株での５−フルオロウラシル抵抗性の調節（
Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ５−Ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ ｒｅｓｉｓｔａ
ｎｃｅ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｏｌｏｎ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ
ｂｙ ａｚｉｄｏｔｈｙｍｉｄｉｎｅ），Ｏｃｏｌ． Ｒｅｓ． （ＵＳ），８
，１８９−１９６。

【０３０５】 Ｆｏｕｒｎｉｅｒ ＲＥＫ， ａｎｄ ＦＨ Ｒｕｄｄｌｅ（１９９７）マウ
ス、チャイニーズハムスターおよびヒト体細胞内への齧歯類クロモソームの微少
セル仲介伝送（Ｍｉｃｒｏｃｅｌｌ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏ
ｆ ｍｕｒｉｎｅ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ ｉｎｔｏ ｍｏｕｓｅ， ｃｈｉ
ｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｓｏｍａｔｉｃ ｃｅｌｌｓ
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【０３０６】 Ｇｅｒｓｃｈｅｎｆｅｌｄｔ ＨＫ ａｎｄ Ｗｅｉｓｓｍａｎ ＩＬ（１９
８６），細胞傷害性Ｔリンパ球からのＴ細胞特異的セリンプロテアーゼに関する
ｃＤＮＡのクローニング（Ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ａ ｃＤＮＡ ｆｏｒ ａ
Ｔ ｃｅｌｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｅｒｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｆｒｏｍ
ａ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２
３２，８５４−８５８。

【０３０７】 Ｇｒｅｍ ＪＬ（１９９０） 癌化学療法でのフッ素化ピリミジン：原理と実
践（Ｆｌｕｏｒｏｎａｔｅｄ ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅｓ， ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ
Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ
），ｅｄ ｂｙ ＢＡ Ｃｈａｐｎｅｒ ａｎｄ ＪＭ Ｃｏｌｌｉｎｓ． Ｐ
ｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ：ＪＢ Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，ｐｐ．８９−１９０。

【０３０８】 Ｉｎａｂａ Ｍ，Ｍｉｔｓｕｈａｓｈｉ Ｊ，Ｓａｗａｄａ Ｈ，Ｍｉｋｋｅ
Ｎ，Ｎａｏｅ Ｙ，Ｄａｉｍｏｎ Ａ，Ｋｏｉｚｕｍｉ Ｋ，Ｔｓｕｊｉｍｏ
ｔｏ Ｈ ａｎｄ Ｍ Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ（１９９６），５−フルオロウラシ
ル抵抗性ヒト胃癌細胞での 酵素の活性の減少（Ｒｅｄｕｃｅｄ ａｃｔｉｖ
ｉｔｙ ｏｆ ａｎａｂｏｌｉｚｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅｓ ｉｎ ５−ｆｌｕｏ
ｒｏｕｒａｃｉｌ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｈｕｍａｎ ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎ
ｃｅｒ ｃｅｌｌｓ），Ｊｐｎ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（Ｊａｐａｎ），８
７，２１２−２２０。

【０３０９】 Ｉｓａａｃｓ ＷＢ，Ｃａｒｔｅｒ ＢＳ，Ｅｗｉｎｇ ＣＭ（１９９１）
野生型ｐ５３は変異ｐ５３対立遺伝子を含むヒト前立腺癌細胞の増殖を抑制する
（Ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ ｐ５３ ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ
ｈｕｍａｎ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ｃｏｎｔａｉｎｉ
ｎｇ ｍｕｔａｎｔ ｐ５３ ａｌｌｅｌｅｓ），Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５１
，４７１６−４７２０。

【０３１０】 Ｉｓａａｃｓ ＪＴ， Ｉｓｓａｃｓ ＷＢ，Ｆｅｉｔｚ ＷＦＪ， ａｎｄ
Ｓｃｈｅｒｅｓ Ｊ（１９８６） ７つのダニングラット前立腺癌細胞株の確
立と特性化、および前立腺癌の転移能力を予想するための方法の発展でのその使
用（Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ
ｏｆ ｓｅｖｅｎ Ｄｕｎｎｉｎｇ ｒａｔ ｐｒｏｓｔａｔｉｃ ｃａｎｃ
ｅｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｕｓｅ ｉｎ ｄｅｖｅｌ
ｏｐｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ ｍｅｔａｓｔａ
ｔｉｃ ａｂｉｌｉｔｅｓ ｏｆ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ）， Ｔｈ
ｅ Ｐｒｏｓｔａｔｅ，９，２６１−２８１。

【０３１１】 Ｉｓｓａｃｓ ＪＴ，Ｗａｋｅ Ｎ，Ｃｏｆｆｅｙ ＤＳ，ａｎｄ Ｓａｎｄ
ｂｅｒｇ ＡＡ（１９８２），Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ， ４２，２３５３−２３
６１。

【０３１２】 Ｉｗａｓａｋｉ Ｔ，Ｓｈｉｎｋａｉ Ｋ，Ｍｕｋａｉ Ｍ，Ｙｏｓｈｉｏｋ
ａ Ｋ，Ｆｕｊｉ Ｙ，Ｎａｋａｈａｒａ Ｋ，Ｍａｔｓｕｄａ Ｈ ａｄｎｄ
Ｈ Ａｋｅｄｏ（１９９５） ラット腹水肝癌細胞によるｉｎ ｖｉｔｒｏで
の細胞周期依存浸潤（Ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｉｎｖａｓ
ｉｏｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｂｙ ｒａｔ ａｓｃｉｔｅｓ ｈｅｐａｔｏｍａ
ｃｅｌｌｓ），Ｉｎｔ Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ，６３，２８２−２８７。

【０３１３】 Ｋａｕｒ ＧＰ，Ｒｉｎａｌｄｙ Ａ，Ｌｌｏｙｄ ＲＳ ａｎｄ ＲＳ Ａ
ｔｈｗａｌ（１９９２） Ａ型色素性乾皮症に部分的に相補的な遺伝子はヒトク
ロモソーム８に位置する（Ａ ｇｅｎｅ ｔｈａｔ ｐａｒｔｉａｌｌｙ ｃｏ
ｍｐｌｅｍｅｎｔｓ ｘｅｒｏｄｅｒｍａ ｐｉｇｍｅｎｔｏｓｕｍ ｇｒｏｕ
ｐ Ａ ｃｅｌｌｓ ｍａｐｓ ｔｏ ｈｕｍａｎ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ８
），Ｓｔｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉ
ｃｓ，１８，３７１−３７９。

【０３１４】 Ｋｙｐｒｉａｎｏｕ， Ｎ，Ｂａｉｎｓ ＡＫ， ａｎｄ Ｊａｃｏｂｓ Ｓ
Ｃ．（１９９４） チミン欠失死が起こっているアンドロゲン非依存ヒト前立腺
癌細胞でのアポトーシスの誘導（Ｉｎｄｕｃｄｔｉｏｎ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓ
ｉｓ ｉｎ ａｎｄｒｏｇｅｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｈｕｍａｎ ｐｒｏ
ｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ｕｎｄｅｒｇｏｉｎｇ ｔｈｙｍｉｎ
ｅｌｅｓｓ ｄｅａｔｈ），Ｐｒｏｓｔａｔｅ ２５，６６−７５。

【０３１５】 Ｋｙｐｒｉａｎｏｕ， Ｎ．（１９９４） アポトーシス：アンドロゲン依存
およびアンドロゲン非違損前立腺癌の治療での治療的重要性ａｐｏｐｔｏｓｉｓ
：Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｉｎ ｔｈｅ ｔｒｅ
ａｔｍｅｎｔ ｏｆ ａｎｄｒｏｇｅｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｎｄ ａｎｄ
ｒｏｇｅｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ），Ｗ
ｏｒｌｄ Ｊ Ｕｒｏｌ １２，２９９−３０３。

【０３１６】 Ｌｅｎｎｏｎ Ｇ， Ａｕｆｆｒａｙ Ｃ，Ｐｏｌｙｍｅｒｏｐｏｕｌｏｓ
Ａ ａｎｄ ＭＢ Ｓｏａｒｅｓ（１９９６） Ｉ．Ｍ．Ａ．Ｇ．Ｅ．コンソル
チウム：ゲノムおよびその発現の統合分子解析（Ｉ．Ｍ．Ａ．Ｇ．Ｅ Ｃｏｎｓ
ｏｒｔｉｕｍ：Ａｎ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｎａｌｙ
ｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｒｎｏｍｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
），Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，３３，１５１−１５２。

【０３１７】 Ｌｏｗｅ ＳＷ，Ｓｃｈｍｉｔｔ ＥＭ，Ｓｍｉｔｈ ＳＷ，Ｏｓｂｏｒｎｅ
ＢＡ ａｎｄ Ｔ Ｊａｃｋｓ（１９９３） Ｎａｔｕｒｅ （Ｌｏｎｄｏｎ
）３６２，８４７−８４９。

【０３１８】 Ｍａｎｇｉａｒｏｔｔｉ Ｇ，Ｃｈｕｎｇ Ｓ，Ｚｕｃｋｅｒ Ｃ ａｎｄ
Ｌｏｄｉｓｈ ＨＦ（１９８１） ハイブリット形成−競合によるクローンした
発生調節されたジクチオステリウムジスコイダム遺伝子の選別と解析Ｓｅｌｅｃ
ｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｌｏｎｅｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍ
ｅｎｔａｌｌｙ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ Ｄｉｃｔｉｏｓｔｅｌｉｕｍ ｄｉｓｃ
ｏｉｄｕｍ ｇｅｎｅｓ ｂｙ ｈｙｂｒｉｄｉａｔｉｏｎ−ｃｏｍｐｅｔｉｔ
ｉｏｎ），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．９，９４７−９６３。

【０３１９】 ＭｃＣｏｎｋｅｙ ＥＨ（１９６７） ショ糖勾配遠心によるＲＮＡの画分化
（Ｔｈｅ ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ ｏｆ ＲＮＡ’ｓ ｂｙ ｓｕｃｒｏ
ｓｅ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ），Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１２Ａ，６２０−６３４。

【０３２０】 ＭｃＤｏｎｎｅｌｌ ＴＪ， Ｔｒｏｎｃｏｓｓｏ Ｐ，Ｂｒｉｓｂａｙ Ｓ
Ｍ ｅｔ ａｌ．（１９９２） 前立腺での前癌遺伝子ｂｃｌ−２の発現と、ア
ンドロゲン非依存前立腺癌の発生との関係（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｐｒ
ｏｔｏｏｎｃｏｇｅｎｅ ｂｃｌ−２ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｏｓｔａｔｅ ａｎ
ｄ ｉｔｓ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｅｍｅｒｇｅｎｃｅ
ｏｆ ａｎｄｒｏｇｅｎ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｔ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎ
ｃｅｒ），Ｃａｎ Ｒｅｓ ５２，６９４０−６９４４。

【０３２１】 ＭｃＬｅｌｌａｎ ＤＬ ａｎｄ ＲＷ Ｎｏｒｍａｎ（１９９５） 前立腺
癌の遺伝的観点（Ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ ｐｒｏｓｔａ
ｔｅ ｃａｎｃｅｒ），Ｃａｎ． Ｍｅｄ． Ａｓｓｏｃ． Ｊ．，１５３，８
９５−９００。

【０３２２】 Ｍｅｌｌｏｎ Ｋ，Ｔｈｏｍｓｏｎ Ｓ，Ｃｈａｒｌｔｏｎ ＲＧ ｅｔ ａ
ｌ．（１９９２） 良性および悪性前立腺でのｐ５３、ｃ−ｅｒＢ−２および上
皮増殖因子レセプター（ｐ５３，ｃ−ｅｒＢ−２ ａｎｄ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ
ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｎ ｔｈｅ ｂｅｎｉｇ
ｎ ａｎｄ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｐｒｏｓｔａｔｅ，Ｊ Ｕｒｏｌ，１４７，
４９６−４９９。

【０３２３】 Ｍｉｃｈａｌｏｖｉｔｚ Ｄ，Ｈａｌｅｖｙ Ｏ ａｎｄ Ｍ Ｏｒｅｎ（１
９９０） ｐ５３の温度感受性変異体による転写および細胞増殖の条件的抑制（
Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ
ｉｏｎ ａｎｄ ｏｆ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｂｙ ｔｅｍ
ｐｅｒａｔｕｒｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｍｕｔａｎｔ ｏｆ ｐ５３），Ｃｅ
ｌｌ ６２，６７１−６８０。

【０３２４】 Ｒｉｎａｌｄｙ Ａ，Ｄｏｄｓｏｎ ＭＬ，Ｄａｒｌｉｎｇ ＴＬ， ａｎｄ
Ｌｌｏｙｓ ＲＳ（１９８８） 差次的競合ハイブリッド形成戦略でのｃＤＮ
Ａライブラリーを用いた遺伝子クローニング：ＸＰ−Ａ関連遺伝子のクローニン
グに対する適用（Ｇｅｎｅ ｃｌｏｎｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｃＤＮＡ ｌｉｂｒ
ａｒｉｅｓ ｉ ｎ ａ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ
ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｓｔｒａｔｅｇｙ：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ
ｔｏ ｃｌｏｎｉｎｇ ＸＰ−Ａ ｒｅｌａｔｅｄ ｇｅｎｅｓ），ＤＮＡ ７
，５６３−５７０。

【０３２５】 Ｒｉｎａｌｄｙ Ａ，Ｂｅｌｌｅｗ Ｔ，Ｅｇｌｉ Ｅ， ａｎｄ Ｌｌｏｙ
ｄ ＲＳ（１９９０） ヒトゲノムＤＮＡクローンでの形質導入の後のＡ型色素
性乾皮症でのＵＶ抵抗性の増加（Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ＵＶ ｒｅｓｕｓｔａｎ
ｃｅ ｉｎ ｘｅｒｏｄｅｒｍａ ｐｉｇｍｅｎｔｏｓｕｍ ｇｒｏｕｐ Ａ
ｃｅｌｌｓ ａｆｔｅｒ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａ ｈｕ
ｍａｎ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｃｌｏｎｅ），Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａ
ｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ，８７，６８１８−６８２２。

【０３２６】 Ｓａｃｈｓ Ｌ（１９９６） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ
． ＵＳＡ ９３，４７４２−４７４９。

【０３２７】 Ｓａｃｈｓ Ｌ ａｎｄ Ｊ Ｌｏｔｅｍ （１９９５） ｉｎ Ａｐｏｐｔ
ｏｓｉｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ， ｅｄ． Ｇｒ
ｅｇｏｒｙ ＣＤ（Ｗｉｌｅｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ），ｐｐ．３７１−４０３
。

【０３２８】 Ｓａｎｄｂｅｒｇ ＡＡ（１９９２） 前立腺癌でのクロモソーム異常と関連
事象（Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｓｅ ａｎｄ ｒｅｌａ
ｔｅｄ ｅｖｅｎｔｓ ｉｎ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ），Ｈｕｍａｎ
Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２３，３６８−３８０。

【０３２９】 Ｓｈｅｒｒ Ｃ（１９９３） 哺乳動物Ｇ１サイクリン（Ｍａｍｍａｌｉａｎ
Ｇ１ ｃｙｃｌｉｎｓ），Ｃｅｌｌ ７３，１０５７−１０６５。

【０３３０】 Ｓｈｉｅｌｄｓ ＰＧ ａｎｄ ＣＣ Ｈａｒｒｉｓ（１９９１） 環境的癌
の分子疫学および遺伝学（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ａ
ｎｄ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ｃａｎ
ｃｅｒ），Ｊ． ｏｆ Ａｍ． Ｍｅｄ． Ａｓｓｏｃ．，２６６，６８１−６
８７。

【０３３１】 Ｓｉｌｖｅｒｂｅｒｇ Ｅ（１９８７） 泌尿器癌での統計学的および疫学的
データ（Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ａｎｄ ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃ ｄａ
ｔａ ｏｎ ｕｒｏｌｏｇｉｃ ｃａｎｃｅｒ）， Ｃａｎｃｅｒ，６，６９２
−７１７。

【０３３２】 Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ ＧＤ， Ｃａｒｔｅｒ ＢＳ，Ｂｅａｔｙ ＴＨ，Ｃｈ
ｉｌｄｓ Ｂ ａｎｄ ＰＣ Ｗａｌｓｈ（１９９０） 前立腺癌の家族歴およ
びリスク（Ｆａｍｉｌｙ ｈｉｓｔｏｒｙ ａｎｄ ｔｈｅ ｒｉｓｋ ｏｆ
ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ），Ｐｒｏｓｔａｔｅ，１７，３３７−３４１
。

【０３３３】 Ｓｔｅｉｎｅｒ ＭＳ ａｎｄ Ｂａｒｒａｃｋ ＥＲ（１９９２） 前立腺
癌でのトランスホーミング増殖因子−？１過剰産出：：ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉ
ｎ ｖｉｔｒｏでの増殖への効果（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ
ｆａｃｔｏｒ−？１ ｏｖｅｒｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｐｒｏｓｔａｔｅ
ｃａｎｃｅｒ：Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｇｒｏｗｔｈ ｉｎ ｖｉｖｏ ａｎ
ｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ），Ｍｏｌｅｃ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．，６，１５−２５。

【０３３４】 Ｓｔｅｉｎｅｒ ＭＳ，Ｓａｔｔｅｒｗｈｉｔｅ ＤＪ ａｎｄ ＨＬ Ｍｏ
ｓｅｓ（１９９５） 細胞周期調節の変化と尿生殖器悪性腫瘍への考察（Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ａｌｔｅｒｅｄ ｃｅｌｌ ｃｙ
ｃｌｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｇｅｎｉｔｏｕｒｉｎａｒｙ ｍａｌ
ｉｇｎａｎｃｙ），Ｕｒｏｌ． Ｉｎｃｏｌ．， １，３−１７。

【０３３５】 Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎ Ｌ，Ｋ Ａｌｄｅｒｉｎｋ ａｎｄ Ａ Ｒｉｎａｌｄ
ｙ（１９９６） ｐＸＰＡ２遺伝子による野生型ｐ５３のダウンレギュレーショ
ンとＰＣＮＡのアップレギュレーションは、ＸＰ−Ａトランスフェクタントでの
ＮＦＲの部分的矯正に関連するＤｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｐｆ ｗｉｌ
ｄ−ｔｙｐｅ ｐ５３ ａｎｄ ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＰＣＮＡ
ｂｙ ｐＸＰＡ２ ｇｅｂｅ ａｒｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔ
ｈｅ ｐａｒｔｉａｌ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＮＥＲ ｉｎ ＸＰ−Ａ
ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｎｔ），Ｐｒｏｃ． ｏｆ ｔｈｅ Ａｍ． Ａｓｓｏ
ｃ． ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，３７，４９９。

【０３３６】 Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ Ｂ， Ｆｅａｒｏｎ ＥＲ， Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｓ
Ｒ， Ｋｅｒｎ ＳＥ， Ｐｒｅｓｉｎｇｅｒ ＡＣＣ， Ｌｅｐｐｅｒｔ Ｍ
，Ｎａｋａｍｕｒａ Ｙ，Ｗｈｉｔｅ Ｒ， Ｓｍｉｔｈ ＡＭＭ ａｎｄ Ｊ
Ｌ Ｂｏｓ（１９８８） 直腸腫瘍発達の間の遺伝的変化（Ｇｅｎｅｔｉｃ ａ
ｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ ｄｕｒｉｎｇ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ−ｔｕｍｏｒ ｄ
ｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ），Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ／．３１９，５２
５−５３２。

【０３３７】 Ｗａｄｈｗａ Ｒ， Ｐｅｒｅｉｒａ−Ｓｍｉｔｈ ＯＭ，Ｒｅｄｄｅｌ Ｒ
Ｒ，Ｓｕｇｉｍｏｔｏ Ｙ，Ｍｉｔｓｕｉ Ｙ ａｎｄ Ｃ Ｋａｕｌ（１９９
５） 不死化のための相補群とモルタリン細胞内分布の間の相関（Ｃｏｒｒｅｌ
ａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｇｒｏｕｐ
ｆｏｒ ｉｍｍｏｒｔａｌｉｔｙ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｉｓ
ｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｒｔａｌｉｎ），Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．
，２１６，１０１−１０６。

【０３３８】 Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ ＩＢ（１９８７） 増殖因子、発癌遺伝子および多重段
階癌化（Ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒｓ， ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ， ａｎｄ ｍ
ｕｌｔｉｓｔａｇｅ ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ），Ｊ．ｏｆ Ｃｅｌｌ
Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３３，２１３−２２４。

【０３３９】 Ｗｅｉｌ Ｍ， ＭＤ Ｈａｃｏｂｓｏｎ， ＨＳＲ Ｃｏｌｅｓ， ＴＪ
Ｄａｃｉｅｓ，ＲＬ Ｇａｒｄｎｅｒ，ＫＤ Ｒａｆｆ ａｎｄ ＭＣ Ｒａｆ
ｆ（１９９６） プログラムされた細胞死に関する機構の構造的発現（Ｃｏｎｓ
ｔｉｔｕｔｉｖｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍａｃｈｉｎｅｒｙ
ｆｏｒ ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ），Ｔｈｅ Ｊｏｕｒ
ｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１３３，１０５２−１０５９。

【０３４０】 Ｙｏｎｉｓｈ−Ｒｏｕａｃｈ Ｅ，Ｒｅｉｔｚｋｙ Ｄ，Ｌｏｔｅｍ Ｊ，Ｓ
ａｃｈｓ Ｌ，Ｋｉｍｃｈｉ Ａ ａｎｄ Ｍ Ｏｒｅｎ（１９９１） 野生型
ｐ５３は、インターロイキン−６によって抑制される骨髄性白血病細胞のアポト
ーシスを誘導する（Ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ ｐ５３ ｉｎｄｕｃｅｄｓ ａｐｏｐ
ｔｏｓｉｓ ｏｆ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉｃ ｃｅｌｌｓ ｔｈａｔ
ｉｓ ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ ｂｙ ｉｎｔｅｒｌｅｋｉｎ−６），Ｎａｔｕｒ
ｅ （Ｌｏｎｄｏｎ），３５２，３４５−３４７。

【０３４１】 Ｙｕｓｐａ ＳＨ ａｎｄ ＭＣ Ｐｏｉｒｉｅｒ（１９８８） 化学的発癌
：１０年間での動物モデルから分子モデルまで（Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃａｒｃｉ
ｎｏｇｅｎｅｓｉｓ； ｆｏｒｍ ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌｓ ｔｏ ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ ｍｏｄｅｌｓ ｉｎ ｏｎｅ ｄｅｃａｄｅ），Ａｖｄ． Ｃａ
ｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５０，２５−７０。

【０３４２】

【配列表】 【図面の簡単な説明】

【図１】 ＡｄＲＳＶｐＨｙｄｅの構造の概略。２６６４ｂｐの挿入された
断片は、１４６７ｂｐの全長ｐＨｙｄｅ ｃＤＮＡ遺伝子（配列番号：１）及び
１１６６ｂｐの３’非翻訳下流領域を含有している。ＡｄＲＳＶｐＨｙｄｅの完
全配列は、図１０に記載されている。特に、図１の領域Ａの核酸配列は、図１０
の領域Ａに記載され、図１の領域Ｂの核酸配列は、図１０の領域Ｂに記載されて
いる。

【図２Ａ】 ＡｄＲＳＶｐＨｙｄｅによるｐＨｙｄｅの発現。ＭＯＩ＝２０
０でＡｄＲＳＶｐＨｙｄｅにより形質導入されたＤＵ１４５細胞を、ｍＲＮＡ又
はタンパク質いずれかの抽出のため感染後４８ｈ以内に収集した。（Ａ）ＤＵ１
４５細胞におけるｍＲＮＡレベルにおけるｐＨｙｄｅの発現。各試料ウェルに、
全ＲＮＡを１０ｍｇ担荷させ、１２．５％アガロースゲルで電気泳動し、ナイロ
ン膜に移し、³²Ｐ標識ｐＨｙｄｅ ｃＤＮＡとハイブリダイズさせた。ゲル担荷
を調べるため、ノーザンブロットを切り取り、ＧＡＰＤＨと再ハイブリダイズさ
せた。

【図２Ｂ】 ＡｄＲＳＶｐＨｙｄｅによるｐＨｙｄｅの発現。ＭＯＩ＝２０
０でＡｄＲＳＶｐＨｙｄｅにより形質導入されたＤＵ１４５細胞を、ｍＲＮＡ又
はタンパク質いずれかの抽出のため感染後４８ｈ以内に収集した。（Ｂ）ＤＵ１
４５細胞におけるタンパク質レベルにおけるｐＨｙｄｅの発現。タンパク質抽出
物（５０ｍｇ）を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに担荷させた。ウサギ抗ラットｐ
Ｈｙｄｅ抗体を、一次抗体として使用した。

【図３】 前立腺癌細胞増殖に対するｐＨｙｄｅの阻害効果。ＤＵ１４５細
胞（Ａ）及びＬＮＣａＰ細胞（Ｂ）を、ＭＯＩ＝１００でアデノウイルスベクタ
ーで形質導入するか、又は未処理のままにした。ウイルス形質導入後５日目に細
胞数を計数した。データは、それぞれデュプリケートで実施された２つの独立し
た実験からの結果を表している。

【図４】 ＡｄＲＳＶｐＨｙｄｅはインビボで前立腺腫瘍の増殖を阻害する
。ＤＵ１４５細胞（１．４×１０⁷細胞）をヌードマウスの側腹に皮下注射した
。腫瘍の平均体積が８０ｍｍ³に達した時点で（腫瘍細胞接種後約１ヶ月）、腫
瘍を、未処理のままにするか（対照）、又は５×１０⁹ｐｆｕの対照ウイルスＡ
ｄＲＳＶｌａｃＺ（対照ウイルス）もしくは５×１０⁹ｐｆｕのＡｄＲＳＶｐＨ
ｙｄｅ（ＡｄＲＳＶｐＨｙｄｅ）のいずれかを腫瘍内注射した（０日目）。ウイ
ルス注射後５２日目まで、定期的に、図中に示された時点で腫瘍サイズを測定し
た。

【図５】 ＡｄＲＳＶｐＨｙｄｅにより形質導入されたＤＵ１４５細胞及び
ＬＮＣａＰ細胞の形態学的変化。細胞を、ＭＯＩ＝１００で対照アデノウイルス
ＡｄＲＳＶｌａｃＺ又はＡｄＲＳＶｐＨｙｄｅにより形質導入した。未処理対照
細胞及びウイルス形質導入細胞の形態学的特徴を、ウイルス形質導入後５日目に
記録した。全ての写真が、同倍率（６６×）である。（Ａ）及び（Ｄ）：未処理
対照細胞；（Ｂ）及び（Ｅ）：ウイルス対照ＡｄＲＳＶｌａｃＺ処理細胞；（Ｃ
）及び（Ｆ）：ＡｄＲＳＶｐＨｙｄｅ処理細胞。

【図６】 ＡｄＲＳＶｐＨｙｄｅにより形質導入されたＰＣ−３細胞、ＴＳ
Ｕ細胞、及びＰＰＣ−１細胞の形態学的変化。細胞を、ＭＯＩ＝１００でＡｄＲ
ＳＶｌａｃＺ又はＡｄＲＳＶｐＨｙｄｅにより形質導入した。未処理対照細胞及
びウイルス形質導入細胞の形態学的特徴を、ウイルス形質導入後５日目に記録し
た。全ての写真が、同倍率（６６×）である。（Ａ、Ｄ、Ｇ）：未処理対照細胞
；（Ｂ、Ｅ、Ｈ）：ウイルス対照ＡｄＲＳＶｌａｃＺ処理細胞；（Ｃ、Ｆ、Ｉ）
：ＡｄＲＳＶｐＨｙｄｅ処理細胞。

【図７】 様々な前立腺癌細胞系におけるｐ５３及びＲｂのｍＲＮＡの発現
。各試料ウェルに、全ＲＮＡを１０ｍｇ担荷させ、１２．５％アガロースゲルで
電気泳動し、ナイロン膜に移し、³²Ｐ標識されたｐ５３又はＲｂのｃＤＮＡプロ
ーブとハイブリダイズさせた。ゲル担荷を規準化するため、ノーザンブロットを
切り取り、ＧＡＰＤＨと再ハイブリダイズさせた。

【図８】 ＡｄＲＳＶｐＨｙｄｅはＤＵ１４５細胞におけるｐ５３発現を誘
導した。図２Ａと同一のノーザンブロットを切り取り、³²Ｐ標識ｐ５３ ｃＤＮ
Ａと再ハイブリダイズさせた。

【図９】 ＡｄＲＳＶｐＨｙｄｅがＬＮＣａＰ細胞におけるアポトーシスを
誘導したことを示す図である。細胞を、未処理のままにするか、又はＭＯＩ＝１
００でＡｄＲＳＶｐＨｙｄｅにより形質導入し、形質導入後４８ｈで上清を収集
した。浮遊細胞から可溶性ＤＮＡを抽出し、２％アガロースゲルで電気泳動した
。

【図１０】 ＡｄＲＳＶｐＨｙｄｅの配列。

【図１１】 ヒトｐＨｙｄｅ（Ｉ）とヒトｐＨｙｄｅ４０（ＩＩ）との間の
ｐＨｙｄｅファミリー遺伝子のヌクレオチド配列の比較。

【図１２】 ヒトｐＨｙｄｅ（Ｉ）とヒトｐＨｙｄｅ４０（ＩＩ）との間の
ｐＨｙｄｅファミリー遺伝子のアミノ酸配列の比較。

【図１３Ａ】 ラットｐＨｙｄｅとヒトｐＨｙｄｅとの間のｐＨｙｄｅファ
ミリー遺伝子のヌクレオチド配列の比較。

【図１３Ｂ】 ラットｐＨｙｄｅとヒトｐＨｙｄｅとの間のｐＨｙｄｅファ
ミリー遺伝子のアミノ酸配列の比較。

【図１４】 インビトロのＤＵ１４５細胞のＴＵＮＥＬアッセイ。ＤＵ１４
５細胞を、未処理のままにするか（Ａ、Ｄ）、又はＭＯＩ＝２００で対照ウイル
ス（Ｂ、Ｅ）もしくはＡｄＲＳＶｐＨｙｄｅ（Ｃ、Ｆ）により形質導入し、形質
導入の３日後、細胞を固定し、ＴＵＮＥＬアッセイ用に処理した。次いで、蛍光
顕微鏡により細胞を可視化した。矢印は、いくつかのアポトーシス細胞を示した
。倍率：Ａ、Ｂ、Ｃ：×２０；Ｄ、Ｅ、Ｆ：４０×。

【図１５】 インビボのＤＵ１４５細胞のＴＵＮＥＬアッセイ。ヌードマウ
ス上で増殖中のＤＵ１４５異種移植腫瘍（約８０ｍｍ³）を、未処理のままにす
るか（Ａ）、又は５×１０⁹ｐｆｕのＡｄＲＳＶｐＨｙｄｅを注射した（Ｂ）。
２１日以内に腫瘍を収集した。腫瘍切片を固定し、ＴＵＮＥＬアッセイ用に処理
した。細胞核を示すため、ヨウ化プロピジウム（赤）で切片を対抗染色した。鮮
黄色に染色された細胞は、アポトーシス細胞を示していた。対照ウイルス処理Ｄ
Ｕ１４５腫瘍由来の腫瘍切片は、（Ａ）と類似の結果を示した。倍率：Ａ、Ｂ：
×２０。

【図１６】 前立腺癌細胞系ＤＵ１４５及びＬＮＣａＰの増殖に対するｐＨ
ｙｄｅの阻害効果。ＤＵ１４５細胞（Ａ）及びＬＮＣａＰ細胞（Ｂ）を、ＭＯＩ
＝１００でアデノウイルスベクター（対照ウイルス又はＡｄＲＳＶｐＨｙｄｅ）
で形質導入するか、又は未処理のままにした。ウイルス形質導入後５日目に細胞
数を計数した。データは、それぞれデュプリケートで実施された２つの独立した
実験からの結果を表している。^*いくつかのエラーバーは、図中に確認できない
ほどに小さかった。

【図１７】 様々な前立腺癌細胞系におけるＲｂ及びｐ５３の発現。様々な
前立腺癌細胞を、ｍＲＮＡレベルで内因性のＲｂ及びｐ５３の発現についてスク
リーニングした。各ウェルに全ＲＮＡを１０μｇ担荷させた。試料を１２．５％
アガロースゲルで電気泳動し、ナイロン膜へ移し、³²Ｐ標識されたＲｂ（約４．
４ｋｂの転写物を示した）又はｐ５３（約２．５ｋｂの転写物を示した）のｃＤ
ＮＡとハイブリダイズさせた。次いで、ＲＮＡの完全性及びゲル担荷を調べるた
め、ノーザンブロットを切り取り、ＧＡＰＤＨ ｃＤＮＡ（約１．２ｋｂの転写
物を示した）と再ハイブリダイズさせた。

【図１８】 前立腺癌細胞系ＰＣ−３及びＴＳＵの増殖に対するｐＨｙｄｅ
の阻害効果。ＰＣ−３細胞（Ａ）及びＴＳＵ細胞（Ｂ）を、ＭＯＩ＝１００でア
デノウイルスベクター（対照ウイルス又はＡｄＲＳＶｐＨｙｄｅ）により形質導
入するか、又は未処理のままにした。ウイルス形質導入後５日目に細胞数を計数
した。データは、それぞれデュプリケートで実施された２つの独立した実験から
の結果を表している。^*いくつかのエラーバーは、図中に確認できないほどに小
さかった。

【手続補正書】

【提出日】平成１４年２月６日（２００２．２．６）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００４０

【補正方法】変更

【補正の内容】

【００４０】 ラットｐ−Ｈｙｄｅのアミノ酸配列を配列番号：６に示す。 さらに、本発明は、アミノ酸配列をコードする単離された核酸ｔｃｃｃｔｇｇ
ｃｃａｃａｃｇｃｃｔｇｇｔｇｇｇｃｔｃｔｇｇｃｔｔｃ（配列番号：７）を提
供する。さらに、本発明は、アミノ酸配列ＡＡＰＣＶＡＹＶＬＬＳＬＶＹＬＰＧ
ＶＬＡＡＡＬＱＬＲＲＧＴＫＹＱＲＦＰＤＷＬＤＨＷＬＱＨＲＫＱＩＧＬＬＳＦ
Ｆ（配列番号：８）をコードする単離された核酸を提供する。さらに、本発明は
、アミノ酸配列ＮＦＩＲＤＶＬＱＰＹＩＲＫＤＥＮＫ（配列番号：９）をコード
する単離された核酸を提供する。

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０２７９

【補正方法】変更

【補正の内容】

【０２７９】 ＡｄＲＳＶｐＨｙｄｅの構築：ラットｐＨｙｄｅ ｃＤＮＡ遺伝子を、米国特
許明細書番号第０９／３０２，４５７号で記述したように単離した。ＥｃｏＲＩ
での消化の後、ｐＨｙｄｅ ｃＤＮＡの１４６７ｂｐ全長コード配列を含む２．
６ｋｂの断片を、切断ＲＳＶプロモーター（３９５ｂｐ）の制御下で、Ｅ１／Ｅ
３欠失アデノウイルスシャトルベクター内にサブクローン化した。得られたアデ
ノウイルスシャトルベクターを、リン酸カルシウム法にて、ｐＪＭ１７、アデノ
ウイルス５型ゲノムプラスミドとともに２３９細胞内へ共トランスフェクトした
。個々のプラークを、ＲＳＶプロモーターとｐＨｙｄｅ ｃＤＮＡ配列両方に特
異的なプライマーを用いたＰＣＲにて、組換え体ＡｄＲＳＶｐＨｙｄｅに関して
選別した。単一ウイルスクローンを２９３細胞内で増殖させた。完全細胞変性効
果（ＣＰＥ）を示している２９３細胞の培養培地を回収し、アデノウイルスを２
回のＣｓＣｌ₂勾配超遠心にて精製し、濃縮した。ウイルス滴定および導入をす
でに記述したように実施した。ＡｄＲＳＶｐＨｙｄｅの概略図を図１に示した。
ＡｄＲＳＶｐＨｙｄｅの配列（配列番号：１０および配列番号：１１）を図１０
に列記する。

【手続補正３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０３４２

【補正方法】変更

【補正の内容】

【０３４２】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> The University of Tennessee Research Corporation <120> Isolated nucleic acids of the p-hyde family, p-hyde proteins, and
methods of inducing susceptibility to induction of cell death in cancer <130> 1015318 <140> PCT/US00/11456 <141> 2000-05-01 <150> US 60/131,607 <151> 1999-04-29 <150> US 09/302,457 <151> 1999-04-29 <150> US 09/499,817 <151> 1999-11-26 <160> 11 <170> PatentIn version 3.0 <210> 1 <211> 1886 <212> DNA <213> Human <400> 1 ggggagctgc cgcggtcgct ccgagcggcg ggccgcagag ccaccaaaat gccagaagag 60 atggacaagc cactgatcag cctccacctg gtggacagcg atagtagcct tgccaaggtc 120 cccgatgagg cccccaaagt gagcatcctg ggtagcgggg actttgcccg ctccctggcc 180 acacgcctgg tgggctctgg cttcaaagtg gtggtgggga gccgcaaccc caaacgcaca 240 gccaggctgt ttccctcagc ggcccaagtg actttccaag aggaggcagt gagctccccg 300 gaggtcatct ttgtggctgt gttccgggag cactactctt cactgtgcag tctcagtgac 360 cagctggcgg gcaagatcct ggtggatgtg agcaacccta cagagcaaga gcaccttcag 420 catcgtgagt ccaatgctga gtacctggcc tccctcttcc ccacttgcac agtggtcaag 480 gccttcaatg tcatctctgc ctggaccctg caggctggcc caagggatgg taacgggcag 540 gtgcccatct gcggtgacca gccagaagcc aagcgtgctg tctcggagat ggcgctcgcc 600 atgggcttca tgcccgtgga catgggatcc ctggcgtcag cctgggaggt ggaggccatg 660 cccctgcgcc tcctcccggc ctggaaggtg cccaccctgc tggccctggg gctcttcgtc 720 tgcttctatg cctacaactt cgtccgggac gttctgcagc cctatgtgca ggaaagccag 780 aacaagttct tcaagctgcc cgtgtccgtg gtcaacacca cactgccgtg cgtggcctac 840 gtgctgctgt cactcgtgta cttgcccggc gtgctggcgg ctgccctgca gctgcggcgc 900 ggcaccaagt accagcgctt ccccgactgg ctggaccact ggctacagca ccgcaagcag 960 atcgggctgc tcagcttctt ctgcgccgcc ctgcacgccc tctacagctt ctgcttgccg 1020 ctgcgccgcg cccaccgcta cgacctggtc aacctggcag tcaagcaggt cttggccaac 1080 aagagccacc tctgggtgga ggaggtctgg cggatggaga tctacctctc cctgggagtg 1140 ctggccctcg gcacgttgtc cctgctggcc gtgacctcac tgccgtccat tgcaaactcg 1200 ctcaactgga gggagttcag cttcgttcag tcctcactgg gctttgtggc cctcgtgctg 1260 agcacactgc acacgctcac ctacggctgg acccgcgcct tcgaggagag ccgctacaag 1320 ttctacctgc ctcccacctt cacgctcacg ctgctggtgc cctgcgtcgt catcctggcc 1380 aaagccctgt ttctcctgcc ctgcatcagc cgcagactcg ccaggatccg gagaggctgg 1440 gagagggaga gcaccatcaa gttcacgctg cccacagacc acgccctggc cgagaagacg 1500 agccacgtat gaggtgcctg ccctgggctc tggaccccgg gcacacgagg gacggtgccc 1560 tgagcccgtt aggttttctt ttcttggtgg tgcaaagtgg tataactgtg tgcaaatagg 1620 aggtttgagg tccaaattcc tgggactcaa atgtatgcag tactattcag aatgatatac 1680 acacatatgt gtatatgtat ttacatatat tccacatata taacaggatt tgcaattata 1740 catagctagc taaaaagttg ggtctctgag atttcaactt gtagatttaa aaacaagtgc 1800 cgtacgttaa gagaagagca gatcatgcta ttgtgacatt tgcagagata tacacacact 1860 ttttgtacag aaaaaaaaaa aaaaaa 1886 <210> 2 <211> 487 <212> PRT <213> Human <400> 2 Met Pro Glu Glu Met Asp Lys Pro Leu Ile Ser Leu His Leu Val Asp 1 5 10 15 Ser Asp Ser Ser Leu Ala Lys Val Pro Asp Glu Ala Pro Lys Val Ser 20 25 30 Ile Leu Gly Ser Gly Asp Phe Ala Arg Ser Leu Ala Thr Arg Leu Val 35 40 45 Gly Ser Gly Phe Lys Val Val Val Gly Ser Arg Asn Pro Lys Arg Thr 50 55 60 Ala Arg Leu Phe Pro Ser Ala Ala Gln Val Thr Phe Gln Glu Glu Ala 65 70 75 80 Val Ser Ser Pro Glu Val Ile Phe Val Ala Val Phe Arg Glu His Tyr 85 90 95 Ser Ser Leu Cys Ser Leu Ser Asp Gln Leu Ala Gly Lys Ile Leu Val 100 105 110 Asp Val Ser Asn Pro Thr Glu Gln Glu His Leu Gln His Arg Glu Ser 115 120 125 Asn Ala Glu Tyr Leu Ala Ser Leu Phe Pro Thr Cys Thr Val Val Lys 130 135 140 Ala Phe Asn Val Ile Ser Ala Trp Thr Leu Gln Ala Gly Pro Arg Asp 145 150 155 160 Gly Asn Gly Gln Val Pro Ile Cys Gly Asp Gln Pro Glu Ala Lys Arg 165 170 175 Ala Val Ser Glu Met Ala Leu Ala Met Gly Phe Met Pro Val Asp Met 180 185 190 Gly Ser Leu Ala Ser Ala Trp Glu Val Glu Ala Met Pro Leu Arg Leu 195 200 205 Leu Pro Ala Trp Lys Val Pro Thr Leu Leu Ala Leu Gly Leu Phe Val 210 215 220 Cys Phe Tyr Ala Tyr Asn Phe Val Arg Asp Val Leu Gln Pro Tyr Val 225 230 235 240 Gln Glu Ser Gln Asn Lys Phe Phe Lys Leu Pro Val Ser Val Val Asn 245 250 255 Thr Thr Leu Pro Cys Val Ala Tyr Val Leu Leu Ser Leu Val Tyr Leu 260 265 270 Pro Gly Val Leu Ala Ala Ala Leu Gln Leu Arg Arg Gly Thr Lys Tyr 275 280 285 Gln Arg Phe Pro Asp Trp Leu Asp His Trp Leu Gln His Arg Lys Gln 290 295 300 Ile Gly Leu Leu Ser Phe Phe Cys Ala Ala Leu His Ala Leu Tyr Ser 305 310 315 320 Phe Cys Leu Pro Leu Arg Arg Ala His Arg Tyr Asp Leu Val Asn Leu 325 330 335 Ala Val Lys Gln Val Leu Ala Asn Lys Ser His Leu Trp Val Glu Glu 340 345 350 Val Trp Arg Met Glu Ile Tyr Leu Ser Leu Gly Val Leu Ala Leu Gly 355 360 365 Thr Leu Ser Leu Leu Ala Val Thr Ser Leu Pro Ser Ile Ala Asn Ser 370 375 380 Leu Asn Trp Arg Glu Phe Ser Phe Val Gln Ser Ser Leu Gly Phe Val 385 390 395 400 Ala Leu Val Leu Ser Thr Leu His Thr Leu Thr Tyr Gly Trp Thr Arg 405 410 415 Ala Phe Glu Glu Ser Arg Tyr Lys Phe Tyr Leu Pro Pro Thr Phe Thr 420 425 430 Leu Thr Leu Leu Val Pro Cys Val Val Ile Leu Ala Lys Ala Leu Phe 435 440 445 Leu Leu Pro Cys Ile Ser Arg Arg Leu Ala Arg Ile Arg Arg Gly Trp 450 455 460 Glu Arg Glu Ser Thr Ile Lys Phe Thr Leu Pro Thr Asp His Ala Leu 465 470 475 480 Ala Glu Lys Thr Ser His Val 485 <210> 3 <211> 2118 <212> DNA <213> Human <400> 3 ggggagctgc cgcggtcgct ccgagcggcg ggccgcagag ccaccaaaat gccagaagag 60 atggacaagc cactgatcag cctccacctg gtggacagcg atagtagcct tgccaaggtc 120 cccgatgagg cccccaaagt gagcatcctg ggtagcgggg actttgcccg ctccctggcc 180 acacgcctgg tgggctctgg cttcaaagtg gtggtgggga gccgcaaccc caaacgcaca 240 gccaggctgt ttccctcagc ggcccaagtg actttccaag aggaggcagt gagctccccg 300 gaggtcatct ttgtggctgt gttccgggag cactactctt cactgtgcag tctcagtgac 360 cagctggcgg gcaagatcct ggtggatgtg agcaacccta cagagcaaga gcaccttcag 420 catcgtgagt ccaatgctga gtacctggcc tccctcttcc ccacttgcac agtggtcaag 480 gccttcaatg tcatctctgc ctggaccctg caggctggcc caagggatgg taacgggcag 540 gtgcccatct gcggtgacca gccagaagcc aagcgtgctg tctcggagat ggcgctcgcc 600 atgggcttca tgcccgtgga catgggatcc ctggcgtcag cctgggaggt ggaggccatg 660 cccctgcgcc tcctcccggc ctggaaggtg cccaccctgc tggccctggg gctcttcgtc 720 tgcttctatg cctacaactt cgtccgggac gttctgcagc cctatgtgca ggaaagccag 780 aacaagttct tcaagctgcc cgtgtccgtg gtcaacacca cactgccgtg cgtggcctac 840 gtgctgctgt cactcgtgta cttgcccggc gtgctggcgg ctgccctgca gctgcggcgc 900 ggcaccaagt accagcgctt ccccgactgg ctggaccact ggctacagca ccgcaagcag 960 atcgggctgc tcagcttctt ctgcgccgcc ctgcacgccc tctacagctt ctgcttgccg 1020 ctgcgccgcg cccaccgcta cgacctggtc aacctggcag tcaagcaggt cttggccaac 1080 aagagccacc tctgggtgga ggaggtctgg cggatggaga tctacctctc cctgggagtg 1140 ctggccctcg gcacgttgtc cctgctggcc gtgacctcac tgccgtccat tgcaaactcg 1200 ctcaactgga gggagttcag cttcgttcag tgtgtggcaa cttccagtgc aggaaacaca 1260 ggcagtggaa cccgaagacc tgaatctcag tcccaagacc cccacttacc tgccccgcat 1320 catcagacaa gtttcctagg ccctcggagc ttctgctgct cacttgtgcc tgtgtccacc 1380 ccatatggtc atcaagagga tttgagctgg acacgttaaa tgcaggatgc gtgcagccaa 1440 cagtggcatg ctggcttttg agtcctcact gggctttgtg gccctcgtgc tgagcacact 1500 gcacacgctc acctacggct ggacccgcgc cttcgaggag agccgctaca agttctacct 1560 gcctcccacc ttcacgctca cgctgctggt gccctgcgtc gtcatcctgg ccaaagccct 1620 gtttctcctg ccctgcatca gccgcagact cgccaggatc cggagaggct gggagaggga 1680 gagcaccatc aagttcacgc tgcccacaga ccacgccctg gccgagaaga cgagccacgt 1740 atgaggtgcc tgccctgggc tctggacccc gggcacacga gggacggtgc cctgagcccg 1800 ttaggttttc ttttcttggt ggtgcaaagt ggtataactg tgtgcaaata ggaggtttga 1860 ggtccaaatt cctgggactc aaatgtatgc agtactattc agaatgatat acacacatat 1920 gtgtatatgt atttacatat attccacata tataacagga tttgcaatta tacatagcta 1980 gctaaaaagt tgggtctctg agatttcaac ttgtagattt aaaaacaagt gccgtacgtt 2040 aagagaagag cagatcatgc tattgtgaca tttgcagaga tatacacaca ctttttgtac 2100 agaaaaaaaa aaaaaaaa 2118 <210> 4 <211> 456 <212> PRT <213> Human <400> 4 Met Pro Glu Glu Met Asp Lys Pro Leu Ile Ser Leu His Leu Val Asp 1 5 10 15 Ser Asp Ser Ser Leu Ala Lys Val Pro Asp Glu Ala Pro Lys Val Ser 20 25 30 Ile Leu Gly Ser Gly Asp Phe Ala Arg Ser Leu Ala Thr Arg Leu Val 35 40 45 Gly Ser Gly Phe Lys Val Val Val Gly Ser Arg Asn Pro Lys Arg Thr 50 55 60 Ala Arg Leu Phe Pro Ser Ala Ala Gln Val Thr Phe Gln Glu Glu Ala 65 70 75 80 Val Ser Ser Pro Glu Val Ile Phe Val Ala Val Phe Arg Glu His Tyr 85 90 95 Ser Ser Leu Cys Ser Leu Ser Asp Gln Leu Ala Gly Lys Ile Leu Val 100 105 110 Asp Val Ser Asn Pro Thr Glu Gln Glu His Leu Gln His Arg Glu Ser 115 120 125 Asn Ala Glu Tyr Leu Ala Ser Leu Phe Pro Thr Cys Thr Val Val Lys 130 135 140 Ala Phe Asn Val Ile Ser Ala Trp Thr Leu Gln Ala Gly Pro Arg Asp 145 150 155 160 Gly Asn Gly Gln Val Pro Ile Cys Gly Asp Gln Pro Glu Ala Lys Arg 165 170 175 Ala Val Ser Glu Met Ala Leu Ala Met Gly Phe Met Pro Val Asp Met 180 185 190 Gly Ser Leu Ala Ser Ala Trp Glu Val Glu Ala Met Pro Leu Arg Leu 195 200 205 Leu Pro Ala Trp Lys Val Pro Thr Leu Leu Ala Leu Gly Leu Phe Val 210 215 220 Cys Phe Tyr Ala Tyr Asn Phe Val Arg Asp Val Leu Gln Pro Tyr Val 225 230 235 240 Gln Glu Ser Gln Asn Lys Phe Phe Lys Leu Pro Val Ser Val Val Asn 245 250 255 Thr Thr Leu Pro Cys Val Ala Tyr Val Leu Leu Ser Leu Val Tyr Leu 260 265 270 Pro Gly Val Leu Ala Ala Ala Leu Gln Leu Arg Arg Gly Thr Lys Tyr 275 280 285 Gln Arg Phe Pro Asp Trp Leu Asp His Trp Leu Gln His Arg Lys Gln 290 295 300 Ile Gly Leu Leu Ser Phe Phe Cys Ala Ala Leu His Ala Leu Tyr Ser 305 310 315 320 Phe Cys Leu Pro Leu Arg Arg Ala His Arg Tyr Asp Leu Val Asn Leu 325 330 335 Ala Val Lys Gln Val Leu Ala Asn Lys Ser His Leu Trp Val Glu Glu 340 345 350 Val Trp Arg Met Glu Ile Tyr Leu Ser Leu Gly Val Leu Ala Leu Gly 355 360 365 Thr Leu Ser Leu Leu Ala Val Thr Ser Leu Pro Ser Ile Ala Asn Ser 370 375 380 Leu Asn Trp Arg Glu Phe Ser Phe Val Gln Cys Val Ala Thr Ser Ser 385 390 395 400 Ala Gly Asn Thr Gly Ser Gly Thr Arg Arg Pro Glu Ser Gln Ser Gln 405 410 415 Asp Pro His Leu Pro Ala Pro His His Gln Thr Ser Phe Leu Gly Pro 420 425 430 Arg Ser Phe Cys Cys Ser Leu Val Pro Val Ser Thr Pro Tyr Gly His 435 440 445 Gln Glu Asp Leu Ser Trp Thr Arg 450 455 <210> 5 <211> 2714 <212> DNA <213> Rat <400> 5 gaattcggca cgaggctgcc gaggcactgt gatgtccggg gagatggaca aaccgctcat 60 cagtcgccgc ttggtggaca gtgatggcag tctggctgag gtccccaagg aggctcccaa 120 agtgggcatc ctgggcagcg gggattttgc ccggtccctg gccacacgcc tggtgggctc 180 tggcttcttt gtggtggtgg gaagccgtaa ccccaaacgc actgccggcc tcttcccctc 240 cttagcccaa gtgactttcc aggaggaggc cgtgagctct ccagaggtca tctttgtggc 300 cgtgttccgg gagcactact cctcactgtg cagtcttgct gaccagttgg ctggcaagat 360 cctagtggat gtaagcaacc ccacggagaa ggagcgtctt cagcaccgcc agtcgaacgc 420 cgagtacctg gcctccctct tccctgcctg cactgtggtc aaggccttca acgtcatctc 480 tgcatgggcc ctacaggctg gcccaaggga tgggaacagg caggtgctca tctgcggtga 540 ccagctggaa gccaagcaca ccgtctcaga gatggcgcgc gccatgggtt tcaccccact 600 ggacatggga tccctggcct cagcgaggga ggtagaggcc atacccctgc gcctccttcc 660 atcctggaag gtgcccaccc tcctggccct ggggctaagc acacaaagct atgcctacaa 720 cttcatccgg gacgttctac agccgtacat ccggaaagat gagaacaagt tctacaagat 780 gcccctgtct gtggtcaaca ccacgatacc ctgtgtggct tacgtgctgc tgtccctggt 840 ttacctgcct ggtgtgctgg cagctgccct tcagctgagg agggggacca agtaccagcg 900 cttcccagac tggctggacc attggctgca gcaccgcaag cagatcgggc tactcagctt 960 ttttttcgcc atgctgcacg ctctctacag cttctgcctg ccgctgcgcc gctcccaccg 1020 ctatgatctg gtcaacctgg ctgtgaagca ggtcctggcc aacaagagcc gcctctgggt 1080 tgaggaagaa gtctggcgga tggagatata cctgtccctg ggtgtgctgg ctctgggcat 1140 gctgtcactg ctggcggtta cctcgatccc ttccattgca aactcactca actggaagga 1200 gttcagcttt gtgcagtcca cgctgggctt cgtggccctg atgctgagca caatgcacac 1260 cctcacctac ggctggaccc gtgcttttga ggaaaaccac tacaagttct acctgccacc 1320 cacattcacg ctcacgctgc tcctgccctg tgtcatcatc ctggccaagg gcctcttcct 1380 cctgccctgc ctcagccaca gactcaccaa gatccgcagg ggctgggaga gggatggtgc 1440 cgtcaagttc atgctgcccg ctggccacac acagggggag aaaacaagcc acgtgtgagg 1500 ccctggaaat ggagacaggc acagcttgtg ggggccctgg gctgggttcg ggtctctttt 1560 ctgggatggt atatgcgtgg gtggccgagg tctgaatttc tgggatgcag gtgtatgccg 1620 agatactcag aatggcgtac cacacatgcg ataagtactc acatatattt catatataat 1680 aggatttact attattctta gttaaaaaaa aatagtgggt ccttatattt caacttatgc 1740 agggtcccta tatttcaact tgagcatttc agagcaaatg ccacacatta aacagcagat 1800 cccacccttg tggtagctgc agagacagac agaaacttct ggttatgaga gagactgtat 1860 tttgttggat tctaccttta atccccgttc tctacgttcc cctgttagcc acatcttaac 1920 gttggtgcag agctgggaca agagctggct ctggtgcagc ctcccccatc ccagggctag 1980 gaaacaagcc tctgatgaac agagggacca ggtctggacc ctcctgctcc cgcttccctg 2040 ggctcgagtg gggaggctca gcgggatccc ccgcaatctg tgcaggagtt ttcacaggtc 2100 tgtcctttct tccgggagcg gtctgaagcg gccccatctg atcctagctg agccgagatt 2160 gttccccact ccctgaaagt ccagagtcac cgtggagcct gcaaattgct ccttctgcga 2220 aggtgtgaag tcaccgtctc accagagcca ttaacgaacc tgatcttcag aagaagcata 2280 attgtttccc ctccattaag ttggtggtga ccctctttaa accactgtgc cttctcgcct 2340 ttcccatcac taatttgggc atctccatgg agtggactct tgtcggggca gttcaggggg 2400 gagggaagca ttagagattg cggagaataa ccatcgaagc ctcccttgga tgttcccagg 2460 cgtgccttca ttaaattggt ccctaatgag aatgacaggg gacccctgtt gcctgtatgc 2520 agagaaccag ccttctgagc acccaggaaa cacagtggcc ccacgccctt caggggggtc 2580 ccacgtcccc tttcccatgc ttttgcctcc ctccctcccg gttacaatca accataaaag 2640 tctgcaaata ttgttttttg aattcttaaa gagaccacat cctttgttat taccaaaaaa 2700 aaaaaaaaaa aaac 2714 <210> 6 <211> 488 <212> PRT <213> Rat <400> 6 Met Ser Gly Glu Met Asp Lys Pro Leu Ile Ser Arg Arg Leu Val Asp 1 5 10 15 Ser Asp Gly Ser Leu Ala Glu Val Pro Lys Glu Ala Pro Lys Val Gly 20 25 30 Ile Leu Gly Ser Gly Asp Phe Ala Arg Ser Leu Ala Thr Arg Leu Val 35 40 45 Gly Ser Gly Phe Phe Val Val Val Gly Ser Arg Asn Pro Lys Arg Thr 50 55 60 Ala Gly Leu Phe Pro Ser Leu Ala Gln Val Thr Phe Gln Glu Glu Ala 65 70 75 80 Val Ser Ser Pro Glu Val Ile Phe Val Ala Val Phe Arg Glu His Tyr 85 90 95 Ser Ser Leu Cys Ser Leu Ala Asp Gln Leu Ala Gly Lys Ile Leu Val 100 105 110 Asp Val Ser Asn Pro Thr Glu Lys Glu Arg Leu Gln His Arg Gln Ser 115 120 125 Asn Ala Glu Tyr Leu Ala Ser Leu Phe Pro Ala Cys Thr Val Val Lys 130 135 140 Ala Phe Asn Val Ile Ser Ala Trp Ala Leu Gln Ala Gly Pro Arg Asp 145 150 155 160 Gly Asn Arg Gln Val Leu Ile Cys Gly Asp Gln Leu Glu Ala Lys His 165 170 175 Thr Val Ser Glu Met Ala Arg Ala Met Gly Phe Thr Pro Leu Asp Met 180 185 190 Gly Ser Leu Ala Ser Ala Arg Glu Val Glu Ala Ile Pro Leu Arg Leu 195 200 205 Leu Pro Ser Trp Lys Val Pro Thr Leu Leu Ala Leu Gly Leu Ser Thr 210 215 220 Gln Ser Tyr Ala Tyr Asn Phe Ile Arg Asp Val Leu Gln Pro Tyr Ile 225 230 235 240 Arg Lys Asp Glu Asn Lys Phe Tyr Lys Met Pro Leu Ser Val Val Asn 245 250 255 Thr Thr Ile Pro Cys Val Ala Tyr Val Leu Leu Ser Leu Val Tyr Leu 260 265 270 Pro Gly Val Leu Ala Ala Ala Leu Gln Leu Arg Arg Gly Thr Lys Tyr 275 280 285 Gln Arg Phe Pro Asp Trp Leu Asp His Trp Leu Gln His Arg Lys Gln 290 295 300 Ile Gly Leu Leu Ser Phe Phe Phe Ala Met Leu His Ala Leu Tyr Ser 305 310 315 320 Phe Cys Leu Pro Leu Arg Arg Ser His Arg Tyr Asp Leu Val Asn Leu 325 330 335 Ala Val Lys Gln Val Leu Ala Asn Lys Ser Arg Leu Trp Val Glu Glu 340 345 350 Glu Val Trp Arg Met Glu Ile Tyr Leu Ser Leu Gly Val Leu Ala Leu 355 360 365 Gly Met Leu Ser Leu Leu Ala Val Thr Ser Ile Pro Ser Ile Ala Asn 370 375 380 Ser Leu Asn Trp Lys Glu Phe Ser Phe Val Gln Ser Thr Leu Gly Phe 385 390 395 400 Val Ala Leu Met Leu Ser Thr Met His Thr Leu Thr Tyr Gly Trp Thr 405 410 415 Arg Ala Phe Glu Glu Asn His Tyr Lys Phe Tyr Leu Pro Pro Thr Phe 420 425 430 Thr Leu Thr Leu Leu Leu Pro Cys Val Ile Ile Leu Ala Lys Gly Leu 435 440 445 Phe Leu Leu Pro Cys Leu Ser His Arg Leu Thr Lys Ile Arg Arg Gly 450 455 460 Trp Glu Arg Asp Gly Ala Val Lys Phe Met Leu Pro Ala Gly His Thr 465 470 475 480 Gln Gly Glu Lys Thr Ser His Val 485 <210> 7 <211> 33 <212> DNA <213> Human <400> 7 tccctggcca cacgcctggt gggctctggc ttc 33 <210> 8 <211> 54 <212> PRT <213> Rat <400> 8 Ala Ala Pro Cys Val Ala Tyr Val Leu Leu Ser Leu Val Tyr Leu Pro 1 5 10 15 Gly Val Leu Ala Ala Ala Leu Gln Leu Arg Arg Gly Thr Lys Tyr Gln 20 25 30 Arg Phe Pro Asp Trp Leu Asp His Trp Leu Gln His Arg Lys Gln Ile 35 40 45 Gly Leu Leu Ser Phe Phe 50 <210> 9 <211> 17 <212> PRT <213> Rat <400> 9 Asn Phe Ile Arg Asp Val Leu Gln Pro Tyr Ile Arg Lys Asp Glu Asn 1 5 10 15 Lys <210> 10 <211> 3884 <212> DNA <213> Rat <400> 10 gcggccgcca tcatcaataa tataccttat tttggattga agccaatatg ataatgaggg 60 ggtggagttt gtgacgtggc gcggggcgtg ggaacggggc gggtgacgta gtagtgtggc 120 ggaagtgtga tgttgcaagt gtggcggaac acatgtaagc gacggatgtg gcaaaagtga 180 cgtttttggt gtgcgccggt gtacacagga agtgacaatt ttcgcgcggt tttaggcgga 240 tgttgtagta aatttgggcg taaccgagta agatttggcc attttcgcgg gaaaactgaa 300 taagaggaag tgaaatctga ataattttgt gttactcata gcgcgtaata tttgtctagg 360 gccgcgggga ctttgaccgt ttacgtggag actcgcccag ggcgcgcccc gatgtacggg 420 ccagatatac gcgtatctga ggggactagg gtgtgtttag gcgaaaagcg gggcttcggt 480 tgtacgcggt taggagtccc ctcaggatat agtagtttcg cttttgcata gggaggggga 540 aatgtagtct tatgcaatac tcttgtagtc ttgcaacatg gtaacgatga gttagcaaca 600 tgccttacaa ggagagaaaa agcaccgtgc atgccgattg gtggaagtaa ggtggtacga 660 tcgtgcctta ttaggaaggc aacagacggg tctgacatgg attggacgaa ccactgaatt 720 ccgcattgca gagatattgt atttaagtgc ctagctcgat acaataaacg ccatttgacc 780 attcaccaca ttggtgtgca cctccggccc tggccactct cttccgcatc gctgtctgcg 840 ggggccagct gttgggctcg cggttgagga caaactcttc gcggtctttc cagtactctt 900 ggatcggaaa cccgtcggcc tccgaacggt actccgccgc cgagggacct gagcgagtcc 960 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ctatggacgg ccttcaacga gcgctccgtg gccgcgcacc 22140 tggcggacat cattttcccc gaacgcctgc ttaaaaccct gcaacagggt ctgccagact 22200 tcaccagtca aagcatgttg cagaacttta ggaactttat cctagagcgc tcaggaatct 22260 tgcccgccac ctgctgtgca cttcctagcg actttgtgcc cattaagtac cgcgaatgcc 22320 ctccgccgct ttggggccac tgctaccttc tgcagctagc caactacctt gcctaccact 22380 ctgacataat ggaagacgtg agcggtgacg gtctactgga gtgtcactgt cgctgcaacc 22440 tatgcacccc gcaccgctcc ctggtttgca attcgcagct gcttaacgaa agtcaaatta 22500 tcggtacctt tgagctgcag ggtccctcgc ctgacgaaaa gtccgcggct ccggggttga 22560 aactcactcc ggggctgtgg acgtcggctt accttcgcaa atttgtacct gaggactacc 22620 acgcccacga gattaggttc tacgaagacc aatcccgccc gccaaatgcg gagcttaccg 22680 cctgcgtcat tacccagggc cacattcttg gccaattgca agccatcaac aaagcccgcc 22740 aagagtttct gctacgaaag ggacgggggg tttacttgga cccccagtcc ggcgaggagc 22800 tcaacccaat ccccccgccg ccgcagccct atcagcagca gccgcgggcc cttgcttccc 22860 aggatggcac ccaaaaagaa gctgcagctg ccgccgccac ccacggacga ggaggaatac 22920 tgggacagtc aggcagagga ggttttggac gaggaggagg aggacatgat ggaagactgg 22980 gagagcctag acgaggaagc ttccgaggtc gaagaggtgt cagacgaaac accgtcaccc 23040 tcggtcgcat tcccctcgcc ggcgccccag aaatcggcaa ccggttccag catggctaca 23100 acctccgctc ctcaggcgcc gccggcactg cccgttcgcc gacccaaccg tagatgggac 23160 accactggaa ccagggccgg taagtccaag cagccgccgc cgttagccca agagcaacaa 23220 cagcgccaag gctaccgctc atggcgcggg cacaagaacg ccatagttgc ttgcttgcaa 23280 gactgtgggg gcaacatctc cttcgcccgc cgctttcttc tctaccatca cggcgtggcc 23340 ttcccccgta acatcctgca ttactaccgt catctctaca gcccatactg caccggcggc 23400 agcggcagcg gcagcaacag cagcggccac acagaagcaa aggcgaccgg atagcaagac 23460 tctgacaaag cccaagaaat ccacagcggc ggcagcagca ggaggaggag cgctgcgtct 23520 ggcgcccaac gaacccgtat cgacccgcga gcttagaaac aggatttttc ccactctgta 23580 tgctatattt caacagagca ggggccaaga acaagagctg aaaataaaaa acaggtctct 23640 gcgatccctc acccgcagct gcctgtatca caaaagcgaa gatcagcttc ggcgcacgct 23700 ggaagacgcg gaggctctct tcagtaaata ctgcgcgctg actcttaagg actagtttcg 23760 cgccctttct caaatttaag cgcgaaaact acgtcatctc cagcggccac acccggcgcc 23820 agcacctgtc gtcagcgcca ttatgagcaa ggaaattccc acgccctaca tgtggagtta 23880 ccagccacaa atgggacttg cggctggagc tgcccaagac tactcaaccc gaataaacta 23940 catgagcgcg ggaccccaca tgatatcccg ggtcaacgga atccgcgccc accgaaaccg 24000 aattctcttg gaacaggcgg ctattaccac cacacctcgt aataacctta atccccgtag 24060 ttggcccgct gccctggtgt accaggaaag tcccgctccc accactgtgg tacttcccag 24120 agacgcccag gccgaagttc agatgactaa ctcaggggcg cagcttgcgg gcggctttcg 24180 tcacagggtg cggtcgcccg ggcagggtat aactcacctg acaatcagag ggcgaggtat 24240 tcagctcaac gacgagtcgg tgagctcctc gcttggtctc cgtccggacg ggacatttca 24300 gatcggcggc gccggccgtc cttcattcac gcctcgtcag gcaatcctaa ctctgcagac 24360 ctcgtcctct gagccgcgct ctggaggcat tggaactctg caatttattg aggagtttgt 24420 gccatcggtc tactttaacc ccttctcggg acctcccggc cactatccgg atcaatttat 24480 tcctaacttt gacgcggtaa aggactcggc ggacggctac gactgaatgt taagtggaga 24540 ggcagagcaa ctgcgcctga aacacctggt ccactgtcgc cgccacaagt gctttgcccg 24600 cgactccggt gagttttgct actttgaatt gcccgaggat catatcgagg gcccggcgca 24660 cggcgtccgg cttaccgccc agggagagct tgcccgtagc ctgattcggg agtttaccca 24720 gcgccccctg ctagttgagc gggacagggg accctgtgtt ctcactgtga tttgcaactg 24780 tcctaacctt ggattacatc aagatctttg ttgccatctc tgtgctgagt ataataaata 24840 cagaaattaa aatatactgg ggctcctatc gccatcctgt aaacgccacc gtcttcaccc 24900 gcccaagcaa accaaggcga accttacctg gtacttttaa catctctccc tctgtgattt 24960 acaacagttt caacccagac ggagtgagtc tacgagagaa cctctccgag ctcagctact 25020 ccatcagaaa aaacaccacc ctccttacct gccgggaacg tacgagtgcg tcaccggccg 25080 ctgcaccaca cctaccgcct gaccgtaaac cagacttttt ccggacagac ctcaataact 25140 ctgtttacca gaacaggagg tgagcttaga aaacccttag ggtattaggc caaaggcgca 25200 gctactgtgg ggtttatgaa caattcaagc aactctacgg gctattctaa ttcaggtttc 25260 tctaatcggg gttggggtta ttctctgtct tgtgattctc tttattctta tactaacgct 25320 tctctgccta aggctcgccg cctgctgtgt gcacatttgc atttattgtc agctttttaa 25380 acgctggggt cgccacccaa gatgattagg tacataatcc taggtttact cacccttgcg 25440 tcagcccacg gtaccaccca aaaggtggat tttaaggagc cagcctgtaa tgttacattc 25500 gcagctgaag ctaatgagtg caccactctt ataaaatgca ccacagaaca tgaaaagctg 25560 cttattcgcc acaaaaacaa aattggcaag tatgctgttt atgctatttg gcagccaggt 25620 gacactacag agtataatgt tacagttttc cagggtaaaa gtcataaaac ttttatgtat 25680 acttttccat tttatgaaat gtgcgacatt accatgtaca tgagcaaaca gtataagttg 25740 tggcccccac aaaattgtgt ggaaaacact ggcactttct gctgcactgc tatgctaatt 25800 acagtgctcg ctttggtctg taccctactc tatattaaat acaaaagcag acgcagcttt 25860 attgaggaaa agaaaatgcc ttaatttact aagttacaaa gctaatgtca ccactaactg 25920 ctttactcgc tgcttgcaaa acaaattcaa aaagttagca ttataattag aataggattt 25980 aaaccccccg gtcatttcct gctcaatacc attcccctga acaattgact ctatgtggga 26040 tatgctccag cgctacaacc ttgaagtcag gcttcctgga tgtcagcatc tgactttggc 26100 cagcacctgt cccgcggatt tgttccagtc caactacagc gacccaccct aacagagatg 26160 accaacacaa ccaacgcggc cgccgctacc ggacttacat ctaccacaaa tacaccccaa 26220 gtttctgcct ttgtcaataa ctgggataac ttgggcatgt ggtggttctc catagcgctt 26280 atgtttgtat gccttattat tatgtggctc atctgctgcc taaagcgcaa acgcgcccga 26340 ccacccatct atagtcccat cattgtgcta cacccaaaca atgatggaat ccatagattg 26400 gacggactga aacacatgtt cttttctctt acagtatgat taaatgagac atgattcctc 26460 gagtttttat attactgacc cttgttgcgc ttttttgtgc gtgctccaca ttggctgcgg 26520 tttctcacat cgaagtagac tgcattccag ccttcacagt ctatttgctt tacggatttg 26580 tcaccctcac gctcatctgc agcctcatca ctgtggtcat cgcctttatc cagtgcattg 26640 actgggtctg tgtgcgcttt gcatatctca gacaccatcc ccagtacagg gacaggacta 26700 tagctgagct tcttagaaat ggacggaatt attacagagc agcgcctgct agaaagacgc 26760 agggcagcgg ccgagcaaca gcgcatgaat caagagctcc aagacatggt taacttgcac 26820 cagtgcaaaa ggggtatctt ttgtctggta aagcaggcca aagtcaccta cgacagtaat 26880 accaccggac accgccttag ctacaagttg ccaaccaagc gtcagaaatt ggtggtcatg 26940 gtgggagaaa agcccattac cataactcag cactcggtag aaaccgaagg ctgcattcac 27000 tcaccttgtc aaggacctga ggatctctgc acccttatta agaccctgtg cggtctcaaa 27060 gatcttattc cctttaacta ataaaaaaaa ataataaagc atcacttact taaaatcagt 27120 tagcaaattt ctgtccagtt tattcagcag cacctccttg ccctcctccc agctctggta 27180 ttgcagcttc ctcctggctg caaactttct ccacaatcta aatggaatgt cagtttcctc 27240 ctgttcctgt ccatccgcac ccactatctt catgttgttg cagatgaagc gcgcaagacc 27300 gtctgaagat accttcaacc ccgtgtatcc atatgacacg gaaaccggtc ctccaactgt 27360 gccttttctt actcctccct ttgtatcccc caatgggttt caagagagtc cccctggggt 27420 actctctttg cgcctatccg aacctctagt tacctccaat ggcatgcttg cgctcaaaat 27480 gggcaacggc ctctctctgg acgaggccgg caaccttacc tcccaaaatg taaccactgt 27540 gagcccacct ctcaaaaaaa ccaagtcaaa cataaacctg gaaatatctg cacccctcac 27600 agttacctca gaagccctaa ctgtggctgc cgccgcacct ctaatggtcg cgggcaacac 27660 actcaccatg caatcacagg ccccgctaac cgtgcacgac tccaaactta gcattgccac 27720 ccaaggaccc ctcacagtgt cagaaggaaa gctagccctg caaacatcag gccccctcac 27780 caccaccgat agcagtaccc ttactatcac tgcctcaccc cctctaacta ctgccactgg 27840 tagcttgggc attgacttga aagagcccat ttatacacaa aatggaaaac taggactaaa 27900 gtacggggct cctttgcatg taacagacga cctaaacact ttgaccgtag caactggtcc 27960 aggtgtgact attaataata cttccttgca aactaaagtt actggagcct tgggttttga 28020 ttcacaaggc aatatgcaac ttaatgtagc aggaggacta aggattgatt ctcaaaacag 28080 acgccttata cttgatgtta gttatccgtt tgatgctcaa aaccaactaa atctaagact 28140 aggacagggc cctcttttta taaactcagc ccacaacttg gatattaact acaacaaagg 28200 cctttacttg tttacagctt caaacaattc caaaaagctt gaggttaacc taagcactgc 28260 caaggggttg atgtttgacg ctacagccat agccattaat gcaggagatg ggcttgaatt 28320 tggttcacct aatgcaccaa acacaaatcc cctcaaaaca aaaattggcc atggcctaga 28380 atttgattca aacaaggcta tggttcctaa actaggaact ggccttagtt ttgacagcac 28440 aggtgccatt acagtaggaa acaaaaataa tgataagcta actttgtgga ccacaccagc 28500 tccatctcct aactgtagac taaatgcaga gaaagatgct aaactcactt tggtcttaac 28560 aaaatgtggc agtcaaatac ttgctacagt ttcagttttg gctgttaaag gcagtttggc 28620 tccaatatct ggaacagttc aaagtgctca tcttattata agatttgacg aaaatggagt 28680 gctactaaac aattccttcc tggacccaga atattggaac tttagaaatg gagatcttac 28740 tgaaggcaca gcctatacaa acgctgttgg atttatgcct aacctatcag cttatccaaa 28800 atctcacggt aaaactgcca aaagtaacat tgtcagtcaa gtttacttaa acggagacaa 28860 aactaaacct gtaacactaa ccattacact aaacggtaca caggaaacag gagacacaac 28920 tccaagtgca tactctatgt cattttcatg ggactggtct ggccacaact acattaatga 28980 aatatttgcc acatcctctt acactttttc atacattgcc caagaataaa gaatcgtttg 29040 tgttatgttt caacgtgttt atttttcaat tgcagaaaat ttcaagtcat ttttcattca 29100 gtagtatagc cccaccacca catagcttat acagatcacc gtaccttaat caaactcaca 29160 gaaccctagt attcaacctg ccacctccct cccaacacac agagtacaca gtcctttctc 29220 cccggctggc cttaaaaagc atcatatcat gggtaacaga catattctta ggtgttatat 29280 tccacacggt ttcctgtcga gccaaacgct catcagtgat attaataaac tccccgggca 29340 gctcacttaa gttcatgtcg ctgtccagct gctgagccac aggctgctgt ccaacttgcg 29400 gttgcttaac gggcggcgaa ggagaagtcc acgcctacat gggggtagag tcataatcgt 29460 gcatcaggat agggcggtgg tgctgcagca gcgcgcgaat aaactgctgc cgccgccgct 29520 ccgtcctgca ggaatacaac atggcagtgg tctcctcagc gatgattcgc accgcccgca 29580 gcataaggcg ccttgtcctc cgggcacagc agcgcaccct gatctcactt aaatcagcac 29640 agtaactgca gcacagcacc acaatattgt tcaaaatccc acagtgcaag gcgctgtatc 29700 caaagctcat ggcggggacc acagaaccca cgtggccatc ataccacaag cgcaggtaga 29760 ttaagtggcg acccctcata aacacgctgg acataaacat tacctctttt ggcatgttgt 29820 aattcaccac ctcccggtac catataaacc tctgattaaa catggcgcca tccaccacca 29880 tcctaaacca gctggccaaa acctgcccgc cggctataca ctgcagggaa ccgggactgg 29940 aacaatgaca gtggagagcc caggactcgt aaccatggat catcatgctc gtcatgatat 30000 caatgttggc acaacacagg cacacgtgca tacacttcct caggattaca agctcctccc 30060 gcgttagaac catatcccag ggaacaaccc attcctgaat cagcgtaaat cccacactgc 30120 agggaagacc tcgcacgtaa ctcacgttgt gcattgtcaa agtgttacat tcgggcagca 30180 gcggatgatc ctccagtatg gtagcgcggg tttctgtctc aaaaggaggt agacgatccc 30240 tactgtacgg agtgcgccga gacaaccgag atcgtgttgg tcgtagtgtc atgccaaatg 30300 gaacgccgga cgtagtcata tttcctgaag caaaaccagg tgcgggcgtg acaaacagat 30360 ctgcgtctcc ggtctcgccg cttagatcgc tctgtgtagt agttgtagta tatccactct 30420 ctcaaagcat ccaggcgccc cctggcttcg ggttctatgt aaactccttc atgcgccgct 30480 gccctgataa catccaccac cgcagaataa gccacaccca gccaacctac acattcgttc 30540 tgcgagtcac acacgggagg agcgggaaga gctggaagaa ccatgttttt ttttttattc 30600 caaaagatta tccaaaacct caaaatgaag atctattaag tgaacgcgct cccctccggt 30660 ggcgtggtca aactctacag ccaaagaaca gataatggca tttgtaagat gttgcacaat 30720 ggcttccaaa aggcaaacgg ccctcacgtc caagtggacg taaaggctaa acccttcagg 30780 gtgaatctcc tctataaaca ttccagcacc ttcaaccatg cccaaataat tctcatctcg 30840 ccaccttctc aatatatctc taagcaaatc ccgaatatta agtccggcca ttgtaaaaat 30900 ctgctccaga gcgccctcca ccttcagcct caagcagcga atcatgattg caaaaattca 30960 ggttcctcac agacctgtat aagattcaaa agcggaacat taacaaaaat accgcgatcc 31020 cgtaggtccc ttcgcagggc cagctgaaca taatcgtgca ggtctgcacg gaccagcgcg 31080 gccacttccc cgccaggaac cttgacaaaa gaacccacac tgattatgac acgcatactc 31140 ggagctatgc taaccagcgt agccccgatg taagctttgt tgcatgggcg gcgatataaa 31200 atgcaaggtg ctgctcaaaa aatcaggcaa agcctcgcgc aaaaaagaaa gcacatcgta 31260 gtcatgctca tgcagataaa ggcaggtaag ctccggaacc accacagaaa aagacaccat 31320 ttttctctca aacatgtctg cgggtttctg cataaacaca aaataaaata acaaaaaaac 31380 atttaaacat tagaagcctg tcttacaaca ggaaaaacaa cccttataag cataagacgg 31440 actacggcca tgccggcgtg accgtaaaaa aactggtcac cgtgattaaa aagcaccacc 31500 gacagctcct cggtcatgtc cggagtcata atgtaagact cggtaaacac atcaggttga 31560 ttcatcggtc agtgctaaaa agcgaccgaa atagcccggg ggaatacata cccgcaggcg 31620 tagagacaac attacagccc ccataggagg tataacaaaa ttaataggag agaaaaacac 31680 ataaacacct gaaaaaccct cctgcctagg caaaatagca ccctcccgct ccagaacaac 31740 atacagcgct tcacagcggc agcctaacag tcagccttac cagtaaaaaa gaaaacctat 31800 taaaaaaaca ccactcgaca cggcaccagc tcaatcagtc acagtgtaaa aaagggccaa 31860 gtgcagagcg agtatatata ggactaaaaa atgacgtaac ggttaaagtc cacaaaaaac 31920 acccagaaaa ccgcacgcga acctacgccc agaaacgaaa gccaaaaaac ccacaacttc 31980 ctcaaatcgt cacttccgtt ttcccacgtt acgtaacttc ccattttaag aaaactacaa 32040 ttcccaacac atacaagtta ctccgcccta aaacctacgt cacccgcccc gttcccacgc 32100 cccgcgccac gtcacaaact ccaccccctc attatcatat tggcttcaat ccaaaataag 32160 gtatat 32166 （訂正の理由１） 段落「００４０」中、「を配列番号：６に示す。」および「（配列番号：９
）」の点について 「配列表」中の対応する塩基配列およびアミノ酸配列の配列番号を明示するた
めの補正であり、誤訳訂正３の手続後においては、一般補正でも対応可能な補正
事項である。 （訂正の理由２） 段落「０２７９」中、「（配列番号：１０および配列番号：１１）」の点に
ついて 「配列表」中の対応する塩基配列およびアミノ酸配列の配列番号を明示するた
めの補正であり、誤訳訂正３の手続後においては、一般補正でも対応可能な補正
事項である。 （訂正の理由３） 段落「０３４２」中、「配列表」の点について 本件特許出願の願書に添付された明細書（以下、原文の明細書とも呼称する）
の対応する個所には、もともと「配列表」は記載されておらず、対応する塩基配
列およびアミノ酸配列が、原文の明細書の「発明の詳細な説明」の部分および図
面に分けて記載されていたところ、誤訳訂正前は、原文の明細書の翻訳文（以下
、明細書の翻訳文とも呼称する）の「発明の詳細な説明」の部分の段落「００３
５」、段落「００３６」、段落「００３７」、段落「００３８」、段落「００３
９」、段落「００４０」において、原文の明細書に記載されていた塩基配列およ
びアミノ酸配列のうちの一部を記載せず、代わりに、（配列番号：１）、（配列
番号：２）、（配列番号：３）、（配列番号：４）、（配列番号：５）、（配列
番号：６）との記載をそれぞれ設けていた。 明細書の翻訳文の「発明の詳細な説明」の部分の段落「００３５」、段落「０
０３６」、段落「００３７」、段落「００３８」、段落「００３９」、段落「０
０４０」において、長大な塩基配列およびアミノ酸配列を記載することは好まし
くないと判断し、該当箇所において、本件特許出願の国際段階で提出されている
はずの「配列表」に記載された塩基配列およびアミノ酸配列を援用しようと意図
したためである。 しかし、本件特許出願においては、国際段階で「配列表」を記録したフレキシ
ブルディスクが適式に提出されていなかったことが事後的に判明したため、本来
「配列表」が記載されるべき明細書の翻訳文の末尾に「配列表」を記載する目的
で、段落「０３４２」中に「配列表」を記載する誤訳訂正を行なう。 なお、原文の明細書においてもともと記載されていた位置に対応する、明細書
の翻訳文の「発明の詳細な説明」中の該当位置に、欠落した一部の塩基配列およ
びアミノ酸配列を記載する形で、誤訳訂正を行なうことも可能ではあるが、明細
書の翻訳文の「発明の詳細な説明」の部分の段落「００３５」、段落「００３６
」、段落「００３７」、段落「００３８」、段落「００３９」、段落「００４０
」において、長大な塩基配列およびアミノ酸配列を記載することは好ましくない
と思われるので、そのような形での誤訳訂正は行なわない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 35/00 Ｃ０７Ｋ 14/47 ４Ｃ０８４ 35/02 16/18 ４Ｃ０８７ Ｃ０７Ｋ 14/47 19/00 ４Ｈ０４５ 16/18 Ｃ１２Ｎ 1/15 19/00 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｐ 21/02 33/50 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/50 5/00 Ａ // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ａ６１Ｋ 37/02 (31)優先権主張番号 ０９／４９９，８１７ (32)優先日 平成12年２月８日(2000．2．8) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ワン，チアン アメリカ合衆国、38117 テネシー州、メ ンフィス、マグノリア・ドライブ、132 (72)発明者 リナルディー，オーガスティヌス アメリカ合衆国、38119 テネシー州、メ ンフィス、ノース・ローリング・オーク ス・ドライブ、5453 (72)発明者 メノン，レーマ アメリカ合衆国、38119 テネシー州、メ ンフィス、ウォルナット・ホール、1350、 コート・ナンバー・５ Ｆターム(参考） 2G045 AA40 BB03 BB20 CB01 CB17 CB21 DA12 DA13 DA14 DA36 DA37 FB02 FB03 4B024 AA01 AA12 BA80 CA04 CA11 CA12 DA02 DA03 EA02 HA11 HA17 4B063 QA13 QQ08 QQ43 QQ53 QR32 QR36 QR55 QR77 QS34 QX07 4B064 AG01 AG27 CA19 CC24 DA01 DA14 4B065 AA26X AA91X AA91Y AA93X AA93Y AB01 BA01 CA24 CA44 CA46 4C084 AA02 AA07 AA13 DC50 NA14 ZB261 ZB271 4C087 BC83 CA12 NA14 ZB26 ZB27 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 BA41 CA41 DA76 EA28 EA51 FA74

Claims (53)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 細胞死に対する癌細胞の感受性を誘導するｐ−Ｈｙｄｅファ
   ミリーの哺乳動物ｐ−Ｈｙｄｅタンパク質をコードし、かつ配列番号１、３、５
   、又は７に記載されたような核酸配列を含む、単離された核酸（その異型及び変
   異体を含む）。
2. 【請求項２】 配列番号：１、３、５、又は７の核酸コーディング配列との
   少なくとも８２％の類似性を有する核酸配列を有する、請求項１記載の単離され
   た核酸。
3. 【請求項３】 配列番号：１、３、５、又は７の核酸コーディング配列との
   少なくとも８５％の類似性を有する核酸配列を有する、請求項１記載の単離され
   た核酸。
4. 【請求項４】 配列番号：１、３、５、又は７の核酸コーディング配列との
   少なくとも９５％の類似性を有する核酸を有する、請求項１記載の単離された核
   酸。
5. 【請求項５】 核酸断片が配列番号：７に記載されている、請求項１記載の
   単離された核酸。
6. 【請求項６】 核酸断片が配列番号：８に記載されたようなアミノ酸断片を
   コードする、請求項１記載の単離された核酸。
7. 【請求項７】 ＤＮＡ又はＲＮＡである、請求項１記載の単離された核酸。
8. 【請求項８】 ｃＤＮＡ又はゲノミックＤＮＡである、請求項２記載の単離
   された核酸。
9. 【請求項９】 配列番号：２、４、又は６に記載されたような配列を有する
   アミノ酸配列をコードする、請求項１記載の単離された核酸。
10. 【請求項１０】 検出可能マーカーで標識されている、請求項１記載の単離
    された核酸。
11. 【請求項１１】 検出可能マーカーが、放射性マーカー、比色マーカー、発
    光マーカー、蛍光マーカー、又は金標識である、請求項１０記載の単離された核
    酸。
12. 【請求項１２】 請求項１のヒトｐ−Ｈｙｄｅをコードする核酸の配列と特
    異的にハイブリダイズすることができる少なくとも１５ヌクレオチドのオリゴヌ
    クレオチド。
13. 【請求項１３】 核酸がＤＮＡ又はＲＮＡである、請求項１２記載のオリゴ
    ヌクレオチド。
14. 【請求項１４】 検出可能マーカーで標識されている、請求項１２記載のオ
    リゴヌクレオチド。
15. 【請求項１５】 放射性マーカー、比色マーカー、発光マーカー、蛍光マー
    カー、又は金標識である、請求項１３記載のオリゴヌクレオチド。
16. 【請求項１６】 請求項１の単離された核酸の配列と相補的な配列を有する
    核酸。
17. 【請求項１７】 請求項１の単離された核酸と特異的にハイブリダイズする
    ことができるアンチセンス分子。
18. 【請求項１８】 請求項１の単離された核酸を含むベクター。
19. 【請求項１９】 さらに、機能的にＲＮＡ転写のプロモーターを含むか、又
    は核酸と連結した発現因子を含む、請求項１８記載のベクター。
20. 【請求項２０】 プロモーターが細菌、酵母、昆虫、又は哺乳動物のプロモ
    ーターを含む、請求項１８記載のベクター。
21. 【請求項２１】 プラスミド、コスミド、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、ＢＡ
    Ｃ、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、Ｐ１、バクテリオ
    ファージ、又は真核生物ウイルスＤＮＡである、請求項２０記載のベクター。
22. 【請求項２２】 複製欠損性アデノウイルス５型発現ベクターである、請求
    項２１記載のアデノウイルスベクター。
23. 【請求項２３】 ゲノムのＥ１及びＥ３領域に欠失を有し、かつｐ−Ｈｙｄ
    ｅをコードする核酸、それらの対立遺伝子、断片、又は異型の、プロモーターの
    調節下での挿入をその領域内に有するアデノウイルスゲノムを含む、請求項２２
    記載のアデノウイルスベクター。
24. 【請求項２４】 プロモーターがラウス肉腫ウイルスプロモーターである、
    請求項２３記載のベクター。
25. 【請求項２５】 適当な宿主内に請求項１８のベクターを含む、ポリペプチ
    ドの産生のための宿主ベクター系。
26. 【請求項２６】 適当な宿主が原核細胞又は真核細胞である、請求項２５記
    載の宿主ベクター系。
27. 【請求項２７】 真核細胞が、酵母、昆虫、植物、又は哺乳動物の細胞であ
    る、請求項２６記載の宿主ベクター系。
28. 【請求項２８】 ポリペプチドの産生を許容する適当な条件下で請求項１８
    の宿主ベクター系を増殖させること、及びそのようにして産生されたポリペプチ
    ドを回収することを含む、ポリペプチドを作製するための方法。
29. 【請求項２９】 （ａ）適当な宿主細胞へ請求項１８のベクターを導入する
    こと； （ｂ）ポリペプチドを産生させるため、得られた細胞を培養すること； （ｃ）工程（ｂ）において産生されたポリペプチドを回収すること；及び （ｄ）そのようにして回収されたポリペプチドを精製すること：を含む、精製さ
    れた形態でポリペプチドを得る方法。
30. 【請求項３０】 哺乳動物ｐ−Ｈｙｄｅのアミノ酸配列を含むｐ−Ｈｙｄｅ
    ファミリーポリペプチド。
31. 【請求項３１】 アミノ酸配列が配列番号：２、４、６、又は８に記載され
    ている、請求項３０記載のポリペプチド。
32. 【請求項３２】 請求項３０のポリペプチドを含む融合タンパク質又はキメ
    ラ。
33. 【請求項３３】 請求項３０のポリペプチドと特異的に結合する抗体。
34. 【請求項３４】 モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体である、請求
    項３３記載の抗体。
35. 【請求項３５】 ある量の請求項３０のポリペプチドと、薬学的に有効な担
    体又は希釈剤とを含む薬学的組成物。
36. 【請求項３６】 請求項１の単離された核酸を含むトランスジェニック非ヒ
    ト哺乳動物。
37. 【請求項３７】 （ａ）対象から適切な核酸試料を得ること；及び （ｂ）工程（ａ）からの核酸試料が、変異型ｐ−Ｈｙｄｅをコードする核酸であ
    るか、又はそれに由来するか否かを決定することにより、対象がｐ−Ｈｙｄｅ遺
    伝子の突然変異を保持するか否かを決定すること：を含む、対象がｐ−Ｈｙｄｅ
    遺伝子の突然変異を保持するか否かを決定するための方法。
38. 【請求項３８】 工程（ａ）における核酸試料が、変異型ｐ−Ｈｙｄｅをコ
    ードするＤＮＡの転写物に相当するｍＲＮＡを含み、かつ工程（ｂ）の決定が、 （ｉ）ｍＲＮＡとオリゴヌクレオチドとの結合を許容する条件下で、ｍＲＮＡを
    請求項１２のオリゴヌクレオチドと接触させ、複合体を形成させること； （ｉｉ）そのようにして形成した複合体を単離すること；及び （ｉｉｉ）単離された複合体内のｍＲＮＡを同定することにより、ｍＲＮＡが変
    異型ｐ−Ｈｙｄｅをコードする核酸であるか、又はそれに由来するか否かを決定
    すること：を含む、請求項３７記載の方法。
39. 【請求項３９】 工程（ｂ）の決定が、 （ｉ）核酸試料及び単離された核酸の、別々の区別可能な核酸片への消化を許容
    する条件下で、工程（ａ）の核酸試料及び請求項１の単離された核酸を、制限酵
    素と接触させること； （ｉｉ）核酸片を単離すること；並びに （ｉｉｉ）核酸試料に由来する核酸片を、単離された核酸に由来する核酸片と比
    較することにより、核酸試料が、変異型ｐ−Ｈｙｄｅをコードする核酸であるか
    、又はそれに由来するか否かを決定すること：を含む、請求項３８記載の方法。
40. 【請求項４０】 ヒト対象由来の腫瘍試料を、該腫瘍内のｐ−Ｈｙｄｅ遺伝
    子の体細胞性改変についてスクリーニングするための方法であって、該腫瘍試料
    由来のｐ−Ｈｙｄｅ遺伝子、該腫瘍由来のｐ−Ｈｙｄｅ ＲＮＡ、及び該腫瘍試
    料由来のｍＲＮＡから作成されたｐ−Ｈｙｄｅ ｃＤＮＡからなる群より選択さ
    れる第１の配列を、該対象の非腫瘍試料由来のｐ−Ｈｙｄｅ遺伝子、該非腫瘍試
    料由来のｐ−Ｈｙｄｅ ＲＮＡ、及び該非腫瘍試料由来のｍＲＮＡから作成され
    たｐ−Ｈｙｄｅ ｃＤＮＡからなる群より選択される第２の配列と比較し、その
    際、該腫瘍試料由来のｐ−Ｈｙｄｅ遺伝子、ｐ−Ｈｙｄｅ ＲＮＡ、又はｐ−Ｈ
    ｙｄｅ ｃＤＮＡの配列の、該非腫瘍試料由来のｐ−Ｈｙｄｅ遺伝子、ｐ−Ｈｙ
    ｄｅ ＲＮＡ、又はｐ−Ｈｙｄｅ ｃＤＮＡの配列との差違を、該腫瘍試料内の
    ｐ−Ｈｙｄｅ遺伝子の体細胞性改変の指標とすることを含む方法。
41. 【請求項４１】 ヒト対象由来の腫瘍試料を、該腫瘍内のｐ−Ｈｙｄｅ遺伝
    子の体細胞性改変の存在についてスクリーニングするための方法であって、ポリ
    ペプチド間の差違を分析するため、該対象由来の該腫瘍試料由来のｐ−Ｈｙｄｅ
    ポリペプチドを、該対象由来の非腫瘍試料由来のｐ−Ｈｙｄｅポリペプチドと比
    較し、その際、該腫瘍試料由来のｐ−Ｈｙｄｅポリペプチドの、該非腫瘍試料由
    来のｐ−Ｈｙｄｅポリペプチドとの差違を、該腫瘍試料内のｐ−Ｈｙｄｅ遺伝子
    の体細胞性改変の存在の指標とすることを含む方法であって、該比較が、（ｉ）
    各試料内の全長ポリペプチドもしくは短縮ポリペプチドのいずれかを検出するこ
    と、又は（ｉｉ）改変されたｐ−Ｈｙｄｅポリペプチドのエピトープもしくは野
    生型ｐ−Ｈｙｄｅポリペプチドのエピトープのいずれかと特異的に結合する抗体
    を各試料由来のｐ−Ｈｙｄｅポリペプチドと接触させ、抗体結合を検出すること
    、により実施される方法。
42. 【請求項４２】 （ａ）ｐ−Ｈｙｄｅと化学的化合物との結合を許容する条
    件下で、ｐ−Ｈｙｄｅを化学的化合物と接触させること； （ｂ）化学的化合物とｐ−Ｈｙｄｅとの特異的結合を検出すること；及び （ｃ）化学的化合物がｐ−Ｈｙｄｅを阻害するか否かを決定することにより、細
    胞死に対する感受性を誘導することができる化学的化合物を同定すること：を含
    む、細胞死に対する感受性を誘導することができる化学的化合物を同定するため
    の方法。
43. 【請求項４３】 細胞を得る工程、並びにゲノムのＥ１及びＥ３領域に欠失
    を有し、かつｐ−Ｈｙｄｅをコードする核酸のラウス肉腫ウイルスプロモーター
    の調節下での挿入をその領域内に有するアデノウイルスゲノムを含む複製欠損性
    アデノウイルス５型発現ベクターと、対象の細胞を接触させることにより、癌細
    胞の増殖を阻害する工程を含む、癌細胞の増殖を阻害する方法。
44. 【請求項４４】 １）対象から前立腺細胞の試料を得ること；２）ゲノムの
    Ｅ１及びＥ３領域に欠失を有し、かつｐ−Ｈｙｄｅ ｃＤＮＡのラウス肉腫ウイ
    ルスプロモーターの調節下での挿入をその領域内に有するアデノウイルスゲノム
    を含む複製欠損性アデノウイルス５型発現ベクターと、細胞を接触させること；
    並びに３）細胞を対象へ導入することにより、癌細胞の増殖を阻害すること：を
    含む、癌細胞の増殖を阻害する方法。
45. 【請求項４５】 ある量の、ｐ−Ｈｙｄｅタンパク質をコードする核酸、ｐ
    −Ｈｙｄｅタンパク質の断片をコードする核酸、又は変異型ｐ−Ｈｙｄｅタンパ
    ク質をコードする核酸を、癌細胞へ導入することにより、対象における癌細胞の
    増殖を抑制することを含む、対象における癌細胞の増殖を抑制する方法。
46. 【請求項４６】 治療に有効な量の、ｐ−Ｈｙｄｅタンパク質をコードする
    核酸、ｐ−Ｈｙｄｅタンパク質の断片をコードする核酸、又は変異型ｐ−Ｈｙｄ
    ｅタンパク質をコードする核酸と、薬学的に許容される担体又は希釈剤とを含む
    薬学的組成物を対象へ投与することにより、対象における癌細胞の増殖を抑制す
    ることを含む、対象における癌細胞の増殖を抑制する方法。
47. 【請求項４７】 ある量の、ｐ−Ｈｙｄｅタンパク質をコードする核酸、ｐ
    −Ｈｙｄｅタンパク質の断片をコードする核酸、又は変異型ｐ−Ｈｙｄｅタンパ
    ク質をコードする核酸を、癌細胞へ導入することにより、アポトーシスに対する
    感受性を誘導することを含む、対象における癌細胞のアポトーシスに対する感受
    性を誘導する方法。
48. 【請求項４８】 治療に有効な量の、ｐ−Ｈｙｄｅタンパク質をコードする
    核酸、ｐ−Ｈｙｄｅタンパク質の断片をコードする核酸、又は変異型ｐ−Ｈｙｄ
    ｅタンパク質をコードする核酸と、薬学的に許容される担体又は希釈剤とを含む
    薬学的組成物を対象へ投与することにより、アポトーシスに対する感受性を誘導
    することを含む、対象における癌細胞のアポトーシスに対する感受性を誘導する
    方法。
49. 【請求項４９】 治療的に有効な量の、ｐ−Ｈｙｄｅタンパク質をコードす
    る核酸、ｐ−Ｈｙｄｅタンパク質の断片をコードする核酸、又は変異型ｐ−Ｈｙ
    ｄｅタンパク質をコードする核酸と、薬学的に許容される担体又は希釈剤とを含
    む薬学的組成物を対象へ投与することにより、癌を有する対象を治療することを
    含む、癌を有する対象を治療する方法。
50. 【請求項５０】 １）放射線、化学療法、又はＵＶ模倣薬と組み合わせられ
    た、治療的に有効な量の、ｐ−Ｈｙｄｅタンパク質をコードする核酸、ｐ−Ｈｙ
    ｄｅタンパク質の断片をコードする核酸、又は変異型ｐ−Ｈｙｄｅタンパク質を
    コードする核酸と、２）薬学的に許容される担体又は希釈剤とを含む薬学的組成
    物を対象へ投与することにより、癌を有する対象を治療することを含む、癌を有
    する対象を治療する方法。
51. 【請求項５１】 治療に有効な量の、１）ゲノムのＥ１及びＥ３領域に欠失
    を有し、かつ全長センスｐ−ＨｙｄｅｃＤＮＡのラウス肉腫ウイルスプロモータ
    ーの調節下での挿入をその領域内に有するアデノウイルスゲノムを含む複製欠損
    性アデノウイルス５型発現ベクターと、２）適当な担体又は希釈剤とを含む薬学
    的組成物を対象へ投与することにより、癌を有する対象を治療することを含む、
    癌を有する対象を治療する方法。
52. 【請求項５２】 癌が、黒色腫；リンパ腫；白血病；及び前立腺、結腸直腸
    、膵臓、***、脳、又は胃の癌腫：からなる群より選択される、請求項４３〜５
    １記載の方法。
53. 【請求項５３】 薬学的組成物が、非経口、癌周囲、経粘膜、経皮、筋肉内
    、静脈内、皮内、皮下、腹腔内、脳室内、又は頭蓋内に投与される、請求項５０
    記載の方法。