JP2003528803A - 静注用免疫グロブリンの２回ウイルス不活化方法 - Google Patents

静注用免疫グロブリンの２回ウイルス不活化方法

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バグダサリアン アンドラニク
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Abstract

(57)【要約】 不純なガンマグロブリンの分画、そして精製されたガンマグロブリンに、どのような順序であれ、ウイルス不活化のために溶剤−界面活性剤処理し、およびウイルス不活化のため加熱処理することにより実質的にウイルスを含有しない、静注可能なガンマグロブリン溶液の製法。その後、ガンマグロブリンから変性した不純物、残存した溶媒、および加熱処理により凝集物を除去する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】発明の背景 本発明はIgG(γ−グロブリン)を主成分とする静注可能な免疫グロブリンの複
数の商業的な製造工程に必須の事項に関する。
【０００２】 ヒト血漿のコーン分画から静注可能なγ−グロブリン溶液を取得するための種
々の製法が知られている。あるコーン画分は、他よりも高力価のγ−グロブリン
を含む。通常のγ−グロブリン溶液はコーン分画IIまたはコーン分画II+IIIを出
発原料とする。
【０００３】 しかし、先行技術の製法では種々の分離および滅菌技術を採用しており、製法
改良は常に最終製品の純度、安全性および総収量の向上と考えられてきた。
【０００４】 多くの商業的な製法では、ウイルス不活化のために溶剤／界面活性剤工程また
はウイルス不活化のために加熱処理工程の両方を採用する。今まで、コーン分画
IIペーストまたはII+IIIペーストからはじめ、効果的で高収率なγ−グロブリン
の製造工程の一部として２つの異なるウイルス不活化処理を含む複数工程の製法
を先行技術では行っていなかった。
【０００５】 カメヤマらの米国特許5,151,499は、タンパク質組成物のウイルス不活化工程
の導入に関するもので、タンパク質組成物は、被膜ウイルスのウイルス不活化の
ために溶剤／界面活性剤処理され、無膜ウイルスのウイルス不活化をのために加
熱処理する。'499特許は、好ましくは溶剤／界面活性剤処理工程はプロテアーゼ
阻害在の存在下で最初に行い、殆んどの実施例は乾燥加熱処理である加熱処理を
続けて行うことを教示する。液状状態で加熱処理を行う場合には、どのような加
熱処理よりも前に、最初に溶剤／界面活性剤をイオン交換カラムで吸収し、タン
パク質を回収する。液状加熱処理は、安定化剤の糖、糖アルコールまたはアミノ
酸の存在下で行われる。'499特許は免疫グロブリンを含む多くの出発タンパク質
組成物を記載するが、その生産物の実施例には第VIII因子、第IX因子、トロンビ
ン、フィブリノゲンおよびフィブロネクチンを採用する。
【０００６】 ウウキらの米国特許5,371,196は、分泌性免疫グロブリンＡの精製法を目指す
。液状加熱処理または液状加熱処理および溶剤処理の種々の組合せによるウイル
ス不活化が述べられている。ポリエチレングリコール分画は各工程に続いて採用
され、およびいつも最終工程で採用される。この特許は、高力価γ−グロブリン
の免疫血清グロブリンに関するものではない。
【０００７】 ある静注可能なγ−グロブリン液状産物の製法に関する先行技術では、コーン
分画II+IIIペーストを出発原料とした複数の精製処理工程において、液状加熱処
理をソルビトール加熱安定化剤の存在下で行う。ヒラオらの米国特許4,845,199
は、コーン分画II+IIIペーストをポリエチレングリコール（以下「ＰＥＧ」）（
8%w/vＰＥＧは不純物および凝集物の沈殿のため、続いて行う12%w/vＰＥＧはγ
−グロブリンの沈殿のため）で分画し、そしてイオン交換クロマトグラフィー（
ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ）を行い、ヒト血液グループ抗体を除去し、ソルビ
トールをタンパク質安定化剤として存在下で液状加熱処理を行うことを主題とす
る。他方、ヒラオらの米国特許4,876,088の実施例１は、コーン分画II+IIIペー
ストからの静注可能なγ−グロブリン溶液製剤について述べるが、それはペース
トを水に懸濁し、ｐＨを5.5に調整して遠心し、上清を33%w/vのソルビトール存
在下で加熱ウイルス不活化処理し、続いてＰＥＧ分画（6%/12%）し、およびそし
てＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘイオン交換クロマトグラフィーを含む他の精製処
理工程に付される。
【０００８】発明の要約 本発明の目的は、コーン分画製造法からの高度に精製されたγ−グロブリン溶
液を生産するため商業的に可能な製造工程に必須の事項に関する。
【０００９】 本発明の他の目的は、熱に感受性のあるすべてのウイルスを含む被膜および無
膜のウイルスを含有していない大変純粋で静注可能なγ−グロブリン溶液を提供
することである。
【００１０】 本発明のさらなる目的は、２つの連続的なウイルス不活化工程を含み、最初の
ウイルス不活化工程に続く工程においてもまたは２回目のウイルス不活化工程の
前においてもγ−グロブリンの回収を要さずに、商業的γ−グロブリンの製法を
提供することにある。
【００１１】 上記および他の目的は、コーンアルコール分画の部分精製品においては、本発
明は当業者にとって自明であるかもしれないが、γ−グロブリンが豊富な場合、
すなわち最初にＰＥＧ分画を行い、およびそして２つのウイルス不活化処理、１
つは溶剤の存在下で行うウイルス不活化処理、好ましくは溶剤−界面活性剤の混
合液により被膜ウイルスのために供給し、そして他方は加熱処理によるウイルス
不活化を行い、２つのウイルス不活化処理の間にγ−グロブリンを回収すること
なく行うことは自明ではない。そして、加熱処理により形成された凝集物は、加
熱処理および溶剤処理された液体から除去される。
【００１２】 本発明の好ましい実施形態は、加熱処理の安定化剤としてソルビトールをおよ
び溶剤としてトリアルキルホスフェートを使用する。
【００１３】 本発明他の実施形態は、存在するどのような粒子も溶剤−界面活性剤処理の前
に除去することである。
【００１４】 本発明他の実施形態は、γ−グロブリン溶液はウイルス不活化を完了後に続い
てＰＥＧ分画を行うことである。
【００１５】 さらに、本発明の他の実施形態として、γ−グロブリンは陽イオン交換樹脂で
処理し、続いてウイルス不活化を完了する。
【００１６】 ある好ましい実施形態は本発明のシングルステージでのポリエチレングリコー
ル分画工程はγ−グロブリンの沈殿なしに行うことである。
【００１７】 本発明の他の好ましい実施形態は、溶剤−界面活性剤ウイルス不活化処理は加
熱ウイルス不活化処理の前に行うことである。
【００１８】 さらに本発明の他の好ましい実施形態は、加熱滅菌されおよび溶剤−界面活性
剤滅菌された静注に適したγ−グロブリンを提供することである。
【００１９】発明の詳細な説明 免疫グロブリンを含む分画を出発原料として使用する。この分画はヒト血漿由
来であり、免疫グロブリンを含む分画であれば、特に制限されるものではない。
このような免疫グロブリンを含む分画の特別の例として、分画II＋IIIおよび分
画IIや免疫グロブリンを含むこれらの均等物であるペーストがコーンエタノール
分画から入手可能である。他の出発原料は、分画I+II+III、および分画II+IIIw
である。出発原料には、例えばヒト血液グループ抗体、プラスミノゲン、プラス
ミン、カリクレイン、プレカリクレインアクチベーター、ＩｇＭ、ＩｇＡ、Ｉｇ
Ｇポリマー（以降および以前について「凝集物」）その他の不純物を含むであろ
う。
【００２０】 好ましい出発原料は、コーン分画IIまたはコーン分画II+IIIである。コーン分
画II+IIIを使用する場合、最初に分画II+IIIwからの初期の洗浄手順が推奨され
るが、それはその後本発明の製法において利用される。「分画II+IIIw」は、コ
ーン画分II+III沈殿をリン酸２ナトリウム溶液で洗浄したものである。
【００２１】 分画II+IIIwは、１ｋｇのII+IIIペーストに対し約２０倍量の水量の割合で、
冷却した注射用水に分画II+III沈殿を懸濁することにより得られる。リン酸ナト
リウム溶液は、溶解脂質、脂質タンパク質およびアルブミンに対して最終濃度が
約0.003Ｍリン酸ナトリウムとなるように加える。冷エタノールは、最終アルコ
ール濃度が約２０％になるよう加える。アルコール添加の間、温度を徐々に−５
±１℃に下げ、および例えば酢酸緩衝液または水酸化ナトリウムで希釈すること
によりｐＨは7.2±0.1となるように維持または調整する。分画II+IIIw沈殿を、
温度−５±１℃に維持されている間に、遠心分離および／またはろ過により回収
する。
【００２２】 ＰＥＧ分画の前に本発明の製造順序に従って、種々の初期段階の精製および／
または凝集物削減工程が実施される。例えば、分画II+IIIwを使用した場合、典
型的に約２０％のアルコールを含有し、そして存在するタンパク質の７０％以上
ＩｇＧであり、分画II+IIIwをｐＨ4.0の酢酸緩衝液または塩酸を用いてｐＨが4.
5から6.0、好ましくは5.0から5.5に調整した温度約０から５℃の冷水で、３から
１０倍、好ましくは３から５倍に懸濁する。混合液は、すべてのγ−グロブリン
を溶液中に含めるよう２から15時間振動させる。その後、アルブミンおよびα-
グロブリンのように不溶化タンパク質を遠心分離および／またはろ過により除去
する。
【００２３】 異なるコーン画分を採用する場合、初期工程または製造工程は適切に選択され
、高ＩｇＧ含有の分画を得るために初期段階の精製からさらに処理される。例え
ば、コーン分画II（95％以上の純ＩｇＧを含有する）をコーン分画IIIから分離
すると、米国特許4,371,520のウエムラらの記載のように、コーン分画IIを、最
初の処理は酸性ｐＨ3.2から5.0で、好ましくは3.8から4.2で処理し、免疫グロブ
リンの凝集を分解し、免疫グロブリンをモノマーからダイマーにする。凝集は抗
補体活性（ＡＣＡ）を有することが知られているからである。他の選択方法とし
て、コーン分画II+IIIを出発原料とした場合には、ウエムラらの特許、低ｐＨ処
理は、上述の初期精製工程に続く追加工程として、およびＰＥＧ分画工程の前に
行われる。
【００２４】 ＰＥＧ分画はウイルス不活化処理の前に行う。ＰＥＧ分画は免疫グロブリンの
精製処理技術において、出発血漿タンパク質分画中のＩｇＧ凝集物や自然に生じ
る他の不純物から所望のＩｇＧモノマーやダイマーを分離するために良く知られ
た手順である。ウイルス不活化前に存在する凝集物や不純物を除去すると加熱処
理、例えば60℃10時間の処理を行った場合の凝集物の程度および濁度を減少でき
る。
【００２５】 ２回目のＰＥＧ分画工程は、加熱ウイルス不活化処理の後に行い、それは加熱
処理工程で生じた変性した不純物および／または凝集物の除去に有益である。
【００２６】 先行技術として実証されたどのようなＰＥＧ工程も使用することはできる。一
般には、１工程または２工程のＰＥＧ分画が行われる。最初のＰＥＧ工程では、
ＰＥＧの濃度およびｐＨは所望のＩｇＧモノマーおよびダイマーは溶液に残り、
一方凝集物のような所望でないタンパク質は沈殿されて溶液から分離できるよう
選択する。遠心分離および／またはろ過に続いてＰＥＧ濃度およびｐＨは随意に
上昇させ、ＩｇＧモノマーおよびダイマーを沈殿させる。
【００２７】 たとえば、出発原料に分画II+IIIwペーストを使用した場合は、最初のＰＥＧ
工程はｐＨ約5.0から7.5で、好ましくは約6.5から7.5で、出発原料に分画II+III
ペーストを使用した場合は、ｐＨ約5.5から6.0で、ＰＥＧ濃度はいずれも約４か
ら８％で、出発原料に分画II+IIIwペーストを使用した場合、好ましくは４から6
％で、出発原料に分画II+IIIペーストを使用した場合、好ましくは６から８％で
行う。上述のように凝集物を含む所望でないタンパク質を含む沈殿を除去する最
初のＰＥＧ分画は温度を約０から２℃に維持し、約１〜８時間行う。精製された
所望の免疫グロブリンの回収は、ｐＨ約8.0から9.0に、好ましくはｐＨ約8.5か
ら8.9に調整してろ過し、追加のＰＥＧは最終濃度約10〜15％、好ましくは約12
％で行う。形成された沈殿、それは精製された免疫グロブリンであるが、ろ過お
よび／または遠心分離によって除く。
【００２８】 本発明に適用可能なＰＥＧ分画工程のさらなる詳細は、上述したヒラオらの米
国特許4,876,088およびヒラオらの米国特許4,845,199に見つけることができる。
【００２９】 本発明の次の本質的な工程は、最初のウイルス不活化工程に加熱処理および、
溶剤若しくは溶剤−界面活性剤処理を選択して行うことである。したがって、２
つめのウイルス不活化工程、それは加熱処理および、溶剤若しくは溶剤−界面活
性剤処理のうち最初の工程で使用しなかった他の工程を行う。以下に述べるよう
に、特にイオン交換樹脂を使用する精製を含む更なる精製工程は、溶剤−界面活
性剤処理および／または加熱処理の、前および／または後に行われる。
【００３０】 最初のウイルス不活化の溶剤−界面活性剤処理の前に、陰イオン交換処理を行
い、そして２つめのウイルス不活化処理である加熱処理後に陽イオン交換処理を
行うと特に効果的である。この工程で、ＰＥＧ処理に伴って陰イオン交換処理に
よりヒト血漿中のある所望でないタンパク質（例えば、プレカリクレインアクチ
ベーター、ＩｇＡ、ＩｇＭおよびアルブミン）をＩｇＧから除去し、陽イオン交
換処理により溶剤−界面活性剤処理の残存試薬および加熱処理の結果による変性
タンパク質（不純物および／または凝集物）を除去することができる。このよう
に、陽イオン交換工程は、加熱処理ウイルス不活化により生じた変性不純物およ
び凝集物を除去するために、ウイルス不活化処理完了後の２回目のＰＥＧ分画に
換えて採用することができる。
【００３１】 もし全工程の間に達成しなければ、溶液は変性タンパク質を含む全てを除去す
るために溶剤−界面活性剤処理を行うべきである。そのために、溶液は１ミクロ
ンまたはより細かいフィルターで溶剤−界面活性剤処理前にろ過することが好ま
しい。それは、大きい粒子で存在するウイルス様のものを減少させることができ
、それらを溶剤−界面活性剤にさらすことを避けることができるであろう。
【００３２】 今日、被膜ウイルスの不活化に使用される溶剤はトリアルキルホスフェートで
ある。トリアルキルホスフェートは、本発明では特に限定されないが、好ましく
はトリ（n-ブチル）ホスフェート（以降「ＴＮＢＰ」）が用いられる。他に使用
可能なトリアルキルホスフェートは、トリ（ter-ブチル）ホスフェート、トリ（
n-ヘキシル）ホスフェート、トリ（2-エチルヘキシル） ホスフェートなどであ
る。２つまたはそれ以上のトリアルキルホスフェートを混合して使用することも
可能である。
【００３３】 トリアルキルホスフェートは、0.01から10(w/v)％、好ましくは約0.1から3(w/
v)％の間で使用される。
【００３４】 トリアルキルホスフェートは界面活性剤（detergent）または界面活性剤（sur
factant）の存在下または非存在下で使用される。好ましくは、トリアルキルホ
スフェートは界面活性剤（detergent）との組合せで行われる。界面活性剤（det
ergent）の機能は、ウイルスと免疫グロブリン組成物中のウイルスがトリアルキ
ルホスフェートの接触を増強することである。
【００３５】 脂肪酸誘導体のポリオキシエチレンを含む界面活性剤（detergent）の例とし
て、例えばポリソルベート８０（商品名：Ｔｗｅｅｎ８０、他）およびポリソル
ベート２０（商品名：Ｔｗｅｅｎ２０、他）のような、部分エステル無水ソルビ
トール、酸化エチルアルキルフェノール（商品名：ＴｒｉｔｏｎＸ１００、他）
である非イオン性油性バスリンス剤、双イオン性界面活性剤（detergent）を含
む他の界面活性剤（surfactantおよびdetergent）があげられる。
【００３６】 界面活性剤を使用する場合、臨界量は添加せず、例えば、約0.001％と約10％
の間、好ましくは0.01と3％の間で使用すべきである。
【００３７】 本発明では、免疫グロブリン含有組成物へのトリアルキルホスフェート処理は
約20から５℃、好ましくは25から30℃であり、１時間以上、好ましくは約５〜８
時間、より好ましくは約６から７時間処理を行う。
【００３８】 トリアルキルホスフェート処理の間、免疫グロブリンは水性溶媒中に約３から
８％含まれる。
【００３９】 トリアルキルホスフェートおよび随意の界面活性剤は、１つめのＰＥＧ画分、
それはさらなるＰＥＧの添加でγ−グロブリンを沈殿させるのでないときに、直
接添加することができる。タンパク質の希釈は必要であろう。一方、沈殿したγ
−グロブリンを注射用冷水に懸濁し、ｐＨは約5.0から6.0に調整し、有機溶媒お
よび随意の界面活性剤はそこに添加する。
【００４０】 熱滅菌工程では、ＰＥＧ分画または溶剤（界面活性剤）工程からのもので精製
していない免疫グロブリンタンパク質溶液に、糖、糖アルコールおよび／または
アミノ酸を熱安定化剤として添加する。ｐＨは約4.5から6.0に、好ましくはｐＨ
約5.0から5.5に調整する。熱安定化剤は、好ましくはスークロース、マルトース
、ソルビトールまたはマンニトールであり、好ましくはソルビトールである。糖
または糖アルコールを、免疫グロブリン溶液に、粉末状または少量の水に混入し
、最終的には飽和量である約10から50w/w％まで混入する。
【００４１】 安定化剤の添加に続いて、混合物は約50から70℃で約10-100時間、好ましくは
約60℃で約10から20時間熱感受性のウイルスのウイルス不活化処理を行う。加熱
処理工程はウイルスの不活化だけでなく、タンパク質の変性を通じて、コーン分
画II+IIIと普通関係する例えばプレカリクレインアクチベーター、プラスミンお
よびプラスミノゲンのようなある所望でないタンパク質の量も優先的に減少させ
る効果もある。
【００４２】 加熱処理のあと、溶液は約0から30℃に、好ましくは約10℃に冷却し、ｐＨは
約5.0から6.0に、好ましくはｐＨ約5.0から5.5に調整する。
【００４３】 もし溶剤−界面活性剤処理の前にしていなければ陰イオン交換処理を加熱処理
した免疫グロブリンに施すことができる。好ましくは、少なくとも陽イオン交換
処理は、ウイルス不活化処理完了後の加熱処理した産物に行い、陰イオン交換処
理は溶剤−有機溶媒処理を最初のウイルス不活化として溶剤−有機溶媒処理を行
う前に行う。イオン交換処理は、溶液溶剤に溶解した免疫グロブリンについて、
ＩｇＧの最大吸着のイオン強度が低い場合には通常ｐＨ約5.0から5.5で行う。タ
ンパク質濃度は通常は約1−15w/v％で、好ましくは約3から10w/v％である。イオ
ン交換体は、使用するのと同じ溶剤で平衡化させ、バッチまたは連続システムで
行われる。例えば、陰イオン交換バッチワイズ処理は、前処理した陰イオン交換
体１ml（例えば、１グラムのＤＥＡＥ−ＳｅｐｈａｄｅｘＡ−５０樹脂を0.4％
の塩化ナトリウム溶液に膨潤させ、湿重量を約20グラムとしたもの）に対し、免
疫グロブリン溶液を約10から100mlかき混ぜながら混入し、混合液を約０−５℃
で約0.5から５時間撹拌し、ろ過または6,000から8,000rpmで10から30分間遠心分
離して上清アルコール溶液を回収する。連続的な処理は、免疫グロブリン溶液を
、不純物を吸着するのに十分な流率で陰イオン交換体のカラムに通し、非吸着画
分を回収した。
【００４４】 陰イオン交換体は、例えば、陰イオン交換グループが不溶性キャリヤーに結合
してなる。陰イオン交換グループは、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）、第四
級アミノエチル（ＱＡＥ）グループ他、および不溶性キャリヤーはアガロース、
セルロース、デキストラン、ポリアクリルアミド他を含む。
【００４５】 使用可能な陽イオン交換体は、カルボキシメチルＳｅｐｈａｄｅｘ（ＣＭ−Ｓ
ｅｐｈａｄｅｘ）、ＣＭ−セルロース、ＳＰ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ、ＣＭ−セファ
ロースおよびＳＰ−セファロースである。前処理した陽イオン交換体１ml（例え
ば１グラムのＣＭ−ＳｅｐｈａｄｅｘＣ−５０樹脂を0.4％の塩化ナトリウム溶
液に膨潤させ、湿重量を約30-35グラムとしたもの）に0.5mlから５mlの免疫グロ
ブリン溶液を混入し、０−５℃で１−６時間撹拌する。上清を遠心分離またはろ
過し、ＩｇＧを吸着した樹脂を回収する。また、連続製法も採用可能である。
【００４６】 上記詳述したコンデションは、陽イオン交換体はＩｇＧを吸着し、タンパク質
吸着陽イオン交換樹脂を洗浄したのちにＩｇＧはたとえば1.4Ｎ塩化ナトリウム
溶液で溶出される。
【００４７】 上記製造に続く工程では、ＩｇＧは清澄化され、必要な範囲まで限外ろ過され
る。もし所望であれば、50mg/mlまたは100mg/mlのＩｇＧおよび50mg/mlのＤ−ソ
ルビトールを含み、ｐＨ5.4の構成溶液を得るためにＤ−ソルビトールのような
安定化剤を加えることができる。溶液は、滅菌された細菌捕捉膜により滅菌ろ過
され、バイヤルに充填される。
【００４８】 続く実施例は、本発明を明らかにするものであるが、これらに限定されるもの
ではない。
【００４９】 所望により、他の免疫グロブリン精製工程はここに示す製法に適当に組合わせ
ることができる。例えば、カリクレインおよびプレカリクレインアクチベーター
のレベルを減少するために有効なベントナイト清澄工程を採用することができる
。その内容を以下に示す実施例１にて説明する。
【００５０】 実施例１：溶媒−界面活性剤および加熱処理したγ−グロブリン
【００５１】 650gの分画（Fr）II+IIIwペーストを約11.9kgの冷水に懸濁する。選択的にＩ
ｇＧを溶解するように、酢酸ナトリウム三水和物を懸濁液最終濃度約0.04Mとな
るように加える。15分間混和後、懸濁液のｐＨをｐＨ4.0の酢酸緩衝液にて5.2に
調整する。冷アルコール（95％）を懸濁液に加え最終濃度が17％となるようにす
る。アルコール添加の間、懸濁液の温度を徐々に下げ、−６℃にする。300およ
び３グラムのセライトコーポレーションから入手可能な酸洗浄済みＣｅｌｉｔｅ
535をフィルターエイドとして懸濁液に添加し、最終濃度約2.0％とした。１時間
混和後、Ｃｅｌｉｔｅおよび所望でないタンパク質、例えばプラスミン、プラス
ミノゲン、ＩｇＡおよびＩｇＭを含む分画IIIをフィルタープレスを利用してろ
過により除去する。ろ過液を、0.45μmおよび0.2μmのフィルターでろ過し、さ
らに清澄化する。その後分画IIIは1.0Ｍ炭酸水素ナトリウムでｐＨ7.0に調整し
、温度を−７℃に下げ、冷アルコール（95％）を最終濃度25％になるよう加える
。懸濁液のｐＨを7.2に調整し、沈殿、分画IIを−７℃でろ過により除去する。
【００５２】 各キログラムの分画IIペーストを０から２℃で、0.2％アルブミン（ヒト）お
よび2.0％ポリエチレングリコールを含むように維持した1.5kgの冷液状物質に懸
濁する。ｐＨは塩酸で3.7±0.2に調整した後、懸濁液はそのｐＨで15時間混和す
る。
【００５３】 溶液のｐＨを塩酸で5.3に調整し、温度は０から２℃に維持し、50％ポリエチ
レングリコール（ＰＥＧ）3350を溶液に加え、ＰＥＧ最終濃度４％となるように
する。そのようにして形成された沈殿物を１℃においてろ過または遠心分離によ
り除く。ろ液のｐＨを1.0Ｎの塩酸で4.9に調整し、ベントナイトを最終濃度が約
0.25％となるように添加する。ベントナイト懸濁液のｐＨは約5.2になるよう調
整し、そして懸濁液をろ過し、１℃において遠心分離により除去する。ろ液のｐ
Ｈを0.25Ｎの水酸化ナトリウムで8.0に調整し、50％ＰＥＧ3350溶液を添加し、
ＰＥＧ最終濃度を12％とする。そのようにして形成した沈殿（精製免疫グロブリ
ン）を、０から２℃で除去ろ過または遠心分離して得る。
【００５４】 上記説明したものは、ＰＥＧ分画を行う場合の典型的な製法である。その他の
ＰＥＧ分確方法も先行技術として知られている。
【００５５】 100gのＰＥＧで精製した免疫グロブリンペーストを450mlの注射用水に懸濁す
る。懸濁液のｐＨを５％の酢酸の添加で5.5に調整する。懸濁液を＋５℃で２時
間混和後、0.3％塩化ナトリウムで先に平衡化し、ｐＨ5.5のＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈ
ａｄｅｘＡ−５０を33.3g加える。２時間吸着後、ＤＥＡＥ樹脂をろ過により除
く。
【００５６】 トリ-n-ブチルフォスフェート（ＴＮＢＰ）およびポリソルベート８０混合物
を最終濃度0.3％ＴＮＢＰおよび1.0％ポリソルベート８０となるように得られた
ろ液に加える。溶液を＋５℃で一夜インキュベートする。Ｄ−ソルビトールを最
終濃度33％となるよう処理液に加え、安定化したＩｇＧ溶液を１時間混和し、ｐ
Ｈ5.5に調整し、60℃で一夜加温する。
【００５７】 混和液は＋５℃に冷却し、ｐＨを5.8に調整する。溶媒界面活性剤、ＰＥＧお
よびソルビトールを除去し、混和液をＣＭ−ＳｅｐｈａｄｅｘＣ‐５０により次
のように処理する：溶媒／界面活性剤および加熱処理溶液を冷水で４倍希釈する
。希釈された溶液を３つに分ける。塩化ナトリウムを分割したものに最終濃度を
0.2％、0.4％および0.6％となるように添加し、各々懸濁液a, bおよびcとする。
各分割したものをグラムタンパク質あたり乾燥重量0.65gのＣＭ−Ｓｅｐｈａｄ
ｅｘ Ｃ‐５０樹脂、ｐＨ5.8および対応するNaCl濃度で平衡化したもので処理す
る。
【００５８】 樹脂で３±２時間タンパク質を吸着した後、溶液をろ過で除去する。タンパク
質を吸着した樹脂を0.2％、0.4％および0.6％の塩化ナトリウムで各々洗浄し、
残存するポリソルベート８０、ＴＮＢＰ、ＰＥＧおよびソルビトールを除去する
。洗浄したタンパク質を吸着したＣＭ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｃ‐５０樹脂を、1.5
±0.5Ｎの塩化ナトリウム溶液に２±１時間再懸濁し、吸着したタンパク質を脱
着させた。樹脂は、脱着したタンパク質溶液からろ過により分離した。
【００５９】 ここで述べたように、12％ＰＥＧ工程および陰イオン樹脂処理は随意の工程で
ある。さらに、２回目のＰＥＧ分画工程は陽イオン交換樹脂処理に換えて採用す
ることができる。また、加熱処置および溶剤（溶剤−界面活性剤）ウイルス不活
化工程はどのような順序でも行うことができる。
【００６０】 本発明のバリエーションは当業者には明らかであろう。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１２年１１月２１日（２０００．１１．２１）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の名称】 静注用免疫グロブリンの２回ウイルス不活化方法
【特許請求の範囲】
【発明の詳細な説明】
【０００１】発明の背景 本発明はIgG(γ−グロブリン)を主成分とする静注可能な免疫グロブリンの複
数の商業的な製造工程に必須の事項に関する。
【０００２】 ヒト血漿のコーン分画から静注可能なγ−グロブリン溶液を取得するための種
々の製法が知られている。あるコーン画分は、他よりも高力価のγ−グロブリン
を含む。通常のγ−グロブリン溶液はコーン分画IIまたはコーン分画II+IIIを出
発原料とする。
【０００３】 しかし、先行技術の製法では種々の分離および滅菌技術を採用しており、製法
改良は常に最終製品の純度、安全性および総収量の向上と考えられてきた。
【０００４】 多くの商業的な製法では、ウイルス不活化のために溶剤／界面活性剤工程また
はウイルス不活化のために加熱処理工程の両方を採用する。今まで、コーン分画
IIペーストまたはII+IIIペーストからはじめ、効果的で高収率なγ−グロブリン
の製造工程の一部として２つの異なるウイルス不活化処理を含む複数工程の製法
を先行技術では行っていなかった。
【０００５】 カメヤマらの米国特許5,151,499は、タンパク質組成物のウイルス不活化工程
の導入に関するもので、タンパク質組成物は、被膜ウイルスのウイルス不活化の
ために溶剤／界面活性剤処理され、無膜ウイルスのウイルス不活化をのために加
熱処理する。'499特許は、好ましくは溶剤／界面活性剤処理工程はプロテアーゼ
阻害在の存在下で最初に行い、殆んどの実施例は乾燥加熱処理である加熱処理を
続けて行うことを教示する。液状状態で加熱処理を行う場合には、どのような加
熱処理よりも前に、最初に溶剤／界面活性剤をイオン交換カラムで吸収し、タン
パク質を回収する。液状加熱処理は、安定化剤の糖、糖アルコールまたはアミノ
酸の存在下で行われる。'499特許は免疫グロブリンを含む多くの出発タンパク質
組成物を記載するが、その生産物の実施例には第VIII因子、第IX因子、トロンビ
ン、フィブリノゲンおよびフィブロネクチンを採用する。
【０００６】 ウウキらの米国特許5,371,196は、分泌性免疫グロブリンＡの精製法を目指す
。液状加熱処理または液状加熱処理および溶剤処理の種々の組合せによるウイル
ス不活化が述べられている。ポリエチレングリコール分画は各工程に続いて採用
され、およびいつも最終工程で採用される。この特許は、高力価γ−グロブリン
の免疫血清グロブリンに関するものではない。
【０００７】 ある静注可能なγ−グロブリン液状産物の製法に関する先行技術では、コーン
分画II+IIIペーストを出発原料とした複数の精製処理工程において、液状加熱処
理をソルビトール加熱安定化剤の存在下で行う。ヒラオらの米国特許4,845,199
は、コーン分画II+IIIペーストをポリエチレングリコール（以下「ＰＥＧ」）（
8%w/vＰＥＧは不純物および凝集物の沈殿のため、続いて行う12%w/vＰＥＧはγ
−グロブリンの沈殿のため）で分画し、そしてイオン交換クロマトグラフィー（
ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ（Ｒ）ファルマシア、陰イオン交換体）を行い、ヒ
ト血液グループ抗体を除去し、ソルビトールをタンパク質安定化剤として存在下
で液状加熱処理を行うことを主題とする。他方、ヒラオらの米国特許4,876,088
の実施例１は、コーン分画II+IIIペーストからの静注可能なγ−グロブリン溶液
製剤について述べるが、それはペーストを水に懸濁し、ｐＨを5.5に調整して遠
心し、上清を33%w/vのソルビトール存在下で加熱ウイルス不活化処理し、続いて
ＰＥＧ分画（6%/12%）し、およびそしてＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘイオン交換
クロマトグラフィーを含む他の精製処理工程に付される。
【０００８】発明の要約 本発明の目的は、コーン分画製造法からの高度に精製されたγ−グロブリン溶
液を生産するため商業的に可能な製造工程に必須の事項に関する。
【０００９】 本発明の他の目的は、熱に感受性のあるすべてのウイルスを含む被膜および無
膜のウイルスを含有していない大変純粋で静注可能なγ−グロブリン溶液を提供
することである。
【００１０】 本発明のさらなる目的は、２つの連続的なウイルス不活化工程を含み、最初の
ウイルス不活化工程に続く工程においてもまたは２回目のウイルス不活化工程の
前においてもγ−グロブリンの回収を要さずに、商業的γ−グロブリンの製法を
提供することにある。
【００１１】 上記および他の目的は、コーンアルコール分画の部分精製品においては、本発
明は当業者にとって自明であるかもしれないが、γ−グロブリンが豊富な場合、
すなわち最初にＰＥＧ分画を行い、およびそして２つのウイルス不活化処理、１
つは溶剤の存在下で行うウイルス不活化処理、好ましくは溶剤−界面活性剤の混
合液により被膜ウイルスのために供給し、そして他方は加熱処理によるウイルス
不活化を行い、２つのウイルス不活化処理の間にγ−グロブリンを回収すること
なく行うことは自明ではない。そして、加熱処理により形成された凝集物は、加
熱処理および溶剤処理された液体から除去される。
【００１２】 本発明の好ましい実施形態は、加熱処理の安定化剤としてソルビトールをおよ
び溶剤としてトリアルキルホスフェートを使用する。
【００１３】 本発明他の実施形態は、存在するどのような粒子も溶剤−界面活性剤処理の前
に除去することである。
【００１４】 本発明他の実施形態は、γ−グロブリン溶液はウイルス不活化を完了後に続い
てＰＥＧ分画を行うことである。
【００１５】 さらに、本発明の他の実施形態として、γ−グロブリンは陽イオン交換樹脂で
処理し、続いてウイルス不活化を完了する。
【００１６】 ある好ましい実施形態は本発明のシングルステージでのポリエチレングリコー
ル分画工程はγ−グロブリンの沈殿なしに行うことである。
【００１７】 本発明の他の好ましい実施形態は、溶剤−界面活性剤ウイルス不活化処理は加
熱ウイルス不活化処理の前に行うことである。
【００１８】 さらに本発明の他の好ましい実施形態は、加熱滅菌されおよび溶剤−界面活性
剤滅菌された静注に適したγ−グロブリンを提供することである。
【００１９】発明の詳細な説明 免疫グロブリンを含む分画を出発原料として使用する。この分画はヒト血漿由
来であり、免疫グロブリンを含む分画であれば、特に制限されるものではない。
このような免疫グロブリンを含む分画の特別の例として、分画II＋IIIおよび分
画IIや免疫グロブリンを含むこれらの均等物であるペーストがコーンエタノール
分画から入手可能である。他の出発原料は、分画I+II+III、および分画II+IIIw
である。出発原料には、例えばヒト血液グループ抗体、プラスミノゲン、プラス
ミン、カリクレイン、プレカリクレインアクチベーター、ＩｇＭ、ＩｇＡ、Ｉｇ
Ｇポリマー（以降および以前について「凝集物」）その他の不純物を含むであろ
う。
【００２０】 好ましい出発原料は、コーン分画IIまたはコーン分画II+IIIである。コーン分
画II+IIIを使用する場合、最初に分画II+IIIwからの初期の洗浄手順が推奨され
るが、それはその後本発明の製法において利用される。「分画II+IIIw」は、コ
ーン画分II+III沈殿をリン酸２ナトリウム溶液で洗浄したものである。
【００２１】 分画II+IIIwは、１ｋｇのII+IIIペーストに対し約２０倍量の水量の割合で、
冷却した注射用水に分画II+III沈殿を懸濁することにより得られる。リン酸ナト
リウム溶液は、溶解脂質、脂質タンパク質およびアルブミンに対して最終濃度が
約0.003Ｍリン酸ナトリウムとなるように加える。冷エタノールは、最終アルコ
ール濃度が約２０％になるよう加える。アルコール添加の間、温度を徐々に−５
±１℃に下げ、および例えば酢酸緩衝液または水酸化ナトリウムで希釈すること
によりｐＨは7.2±0.1となるように維持または調整する。分画II+IIIw沈殿を、
温度−５±１℃に維持されている間に、遠心分離および／またはろ過により回収
する。
【００２２】 ＰＥＧ分画の前に本発明の製造順序に従って、種々の初期段階の精製および／
または凝集物削減工程が実施される。例えば、分画II+IIIwを使用した場合、典
型的に約２０％のアルコールを含有し、そして存在するタンパク質の７０％以上
ＩｇＧであり、分画II+IIIwをｐＨ4.0の酢酸緩衝液または塩酸を用いてｐＨが4.
5から6.0、好ましくは5.0から5.5に調整した温度約０から５℃の冷水で、３から
１０倍、好ましくは３から５倍に懸濁する。混合液は、すべてのγ−グロブリン
を溶液中に含めるよう２から15時間振動させる。その後、アルブミンおよびα-
グロブリンのように不溶化タンパク質を遠心分離および／またはろ過により除去
する。
【００２３】 異なるコーン画分を採用する場合、初期工程または製造工程は適切に選択され
、高ＩｇＧ含有の分画を得るために初期段階の精製からさらに処理される。例え
ば、コーン分画II（95％以上の純ＩｇＧを含有する）をコーン分画IIIから分離
すると、米国特許4,371,520のウエムラらの記載のように、コーン分画IIを、最
初の処理は酸性ｐＨ3.2から5.0で、好ましくは3.8から4.2で処理し、免疫グロブ
リンの凝集を分解し、免疫グロブリンをモノマーからダイマーにする。凝集は抗
補体活性（ＡＣＡ）を有することが知られているからである。他の選択方法とし
て、コーン分画II+IIIを出発原料とした場合には、ウエムラらの特許、低ｐＨ処
理は、上述の初期精製工程に続く追加工程として、およびＰＥＧ分画工程の前に
行われる。
【００２４】 ＰＥＧ分画はウイルス不活化処理の前に行う。ＰＥＧ分画は免疫グロブリンの
精製処理技術において、出発血漿タンパク質分画中のＩｇＧ凝集物や自然に生じ
る他の不純物から所望のＩｇＧモノマーやダイマーを分離するために良く知られ
た手順である。ウイルス不活化前に存在する凝集物や不純物を除去すると加熱処
理、例えば60℃10時間の処理を行った場合の凝集物の程度および濁度を減少でき
る。
【００２５】 ２回目のＰＥＧ分画工程は、加熱ウイルス不活化処理の後に行い、それは加熱
処理工程で生じた変性した不純物および／または凝集物の除去に有益である。
【００２６】 先行技術として実証されたどのようなＰＥＧ工程も使用することはできる。一
般には、１工程または２工程のＰＥＧ分画が行われる。最初のＰＥＧ工程では、
ＰＥＧの濃度およびｐＨは所望のＩｇＧモノマーおよびダイマーは溶液に残り、
一方凝集物のような所望でないタンパク質は沈殿されて溶液から分離できるよう
選択する。遠心分離および／またはろ過に続いてＰＥＧ濃度およびｐＨは随意に
上昇させ、ＩｇＧモノマーおよびダイマーを沈殿させる。
【００２７】 たとえば、出発原料に分画II+IIIwペーストを使用した場合は、最初のＰＥＧ
工程はｐＨ約5.0から7.5で、好ましくは約6.5から7.5で、出発原料に分画II+III
ペーストを使用した場合は、ｐＨ約5.5から6.0で、ＰＥＧ濃度はいずれも約４か
ら８％で、出発原料に分画II+IIIwペーストを使用した場合、好ましくは４から6
％で、出発原料に分画II+IIIペーストを使用した場合、好ましくは６から８％で
行う。上述のように凝集物を含む所望でないタンパク質を含む沈殿を除去する最
初のＰＥＧ分画は温度を約０から２℃に維持し、約１〜８時間行う。精製された
所望の免疫グロブリンの回収は、ｐＨ約8.0から9.0に、好ましくはｐＨ約8.5か
ら8.9に調整してろ過し、追加のＰＥＧは最終濃度約10〜15％、好ましくは約12
％で行う。形成された沈殿、それは精製された免疫グロブリンであるが、ろ過お
よび／または遠心分離によって除く。
【００２８】 本発明に適用可能なＰＥＧ分画工程のさらなる詳細は、上述したヒラオらの米
国特許4,876,088およびヒラオらの米国特許4,845,199に見つけることができる。
【００２９】 本発明の次の本質的な工程は、最初のウイルス不活化工程に加熱処理および、
溶剤若しくは溶剤−界面活性剤処理を選択して行うことである。したがって、２
つめのウイルス不活化工程、それは加熱処理および、溶剤若しくは溶剤−界面活
性剤処理のうち最初の工程で使用しなかった他の工程を行う。以下に述べるよう
に、特にイオン交換樹脂を使用する精製を含む更なる精製工程は、溶剤−界面活
性剤処理および／または加熱処理の、前および／または後に行われる。
【００３０】 最初のウイルス不活化の溶剤−界面活性剤処理の前に、陰イオン交換処理を行
い、そして２つめのウイルス不活化処理である加熱処理後に陽イオン交換処理を
行うと特に効果的である。この工程で、ＰＥＧ処理に伴って陰イオン交換処理に
よりヒト血漿中のある所望でないタンパク質（例えば、プレカリクレインアクチ
ベーター、ＩｇＡ、ＩｇＭおよびアルブミン）をＩｇＧから除去し、陽イオン交
換処理により溶剤−界面活性剤処理の残存試薬および加熱処理の結果による変性
タンパク質（不純物および／または凝集物）を除去することができる。このよう
に、陽イオン交換工程は、加熱処理ウイルス不活化により生じた変性不純物およ
び凝集物を除去するために、ウイルス不活化処理完了後の２回目のＰＥＧ分画に
換えて採用することができる。
【００３１】 もし全工程の間に達成しなければ、溶液は変性タンパク質を含む全てを除去す
るために溶剤−界面活性剤処理を行うべきである。そのために、溶液は１ミクロ
ンまたはより細かいフィルターで溶剤−界面活性剤処理前にろ過することが好ま
しい。それは、大きい粒子で存在するウイルス様のものを減少させることができ
、それらを溶剤−界面活性剤にさらすことを避けることができるであろう。
【００３２】 今日、被膜ウイルスの不活化に使用される溶剤はトリアルキルホスフェートで
ある。トリアルキルホスフェートは、本発明では特に限定されないが、好ましく
はトリ（n-ブチル）ホスフェート（以降「ＴＮＢＰ」）が用いられる。他に使用
可能なトリアルキルホスフェートは、トリ（ter-ブチル）ホスフェート、トリ（
n-ヘキシル）ホスフェート、トリ（2-エチルヘキシル） ホスフェートなどであ
る。２つまたはそれ以上のトリアルキルホスフェートを混合して使用することも
可能である。
【００３３】 トリアルキルホスフェートは、0.01から10(w/v)％、好ましくは約0.1から3(w/
v)％の間で使用される。
【００３４】 トリアルキルホスフェートは界面活性剤（detergent）または界面活性剤（sur
factant）の存在下または非存在下で使用される。好ましくは、トリアルキルホ
スフェートは界面活性剤（detergent）との組合せで行われる。界面活性剤（det
ergent）の機能は、ウイルスと免疫グロブリン組成物中のウイルスがトリアルキ
ルホスフェートの接触を増強することである。
【００３５】 脂肪酸誘導体のポリオキシエチレンを含む界面活性剤（detergent）の例とし
て、例えばポリソルベート８０（商品名：Ｔｗｅｅｎ８０、他）およびポリソル
ベート２０（商品名：Ｔｗｅｅｎ２０、他）のような、部分エステル無水ソルビ
トール、酸化エチルアルキルフェノール（商品名：ＴｒｉｔｏｎＸ１００、他）
である非イオン性油性バスリンス剤、双イオン性界面活性剤（detergent）を含
む他の界面活性剤（surfactantおよびdetergent）があげられる。
【００３６】 界面活性剤を使用する場合、臨界量は添加せず、例えば、約0.001％と約10％
の間、好ましくは0.01と3％の間で使用すべきである。
【００３７】 本発明では、免疫グロブリン含有組成物へのトリアルキルホスフェート処理は
約20から５℃、好ましくは25から30℃であり、１時間以上、好ましくは約５〜８
時間、より好ましくは約６から７時間処理を行う。
【００３８】 トリアルキルホスフェート処理の間、免疫グロブリンは水性溶媒中に約３から
８％含まれる。
【００３９】 トリアルキルホスフェートおよび随意の界面活性剤は、１つめのＰＥＧ画分、
それはさらなるＰＥＧの添加でγ−グロブリンを沈殿させるのでないときに、直
接添加することができる。タンパク質の希釈は必要であろう。一方、沈殿したγ
−グロブリンを注射用冷水に懸濁し、ｐＨは約5.0から6.0に調整し、有機溶媒お
よび随意の界面活性剤はそこに添加する。
【００４０】 熱滅菌工程では、ＰＥＧ分画または溶剤（界面活性剤）工程からのもので精製
していない免疫グロブリンタンパク質溶液に、糖、糖アルコールおよび／または
アミノ酸を熱安定化剤として添加する。ｐＨは約4.5から6.0に、好ましくはｐＨ
約5.0から5.5に調整する。熱安定化剤は、好ましくはスークロース、マルトース
、ソルビトールまたはマンニトールであり、好ましくはソルビトールである。糖
または糖アルコールを、免疫グロブリン溶液に、粉末状または少量の水に混入し
、最終的には飽和量である約10から50w/w％まで混入する。
【００４１】 安定化剤の添加に続いて、混合物は約50から70℃で約10-100時間、好ましくは
約60℃で約10から20時間熱感受性のウイルスのウイルス不活化処理を行う。加熱
処理工程はウイルスの不活化だけでなく、タンパク質の変性を通じて、コーン分
画II+IIIと普通関係する例えばプレカリクレインアクチベーター、プラスミンお
よびプラスミノゲンのようなある所望でないタンパク質の量も優先的に減少させ
る効果もある。
【００４２】 加熱処理のあと、溶液は約0から30℃に、好ましくは約10℃に冷却し、ｐＨは
約5.0から6.0に、好ましくはｐＨ約5.0から5.5に調整する。
【００４３】 もし溶剤−界面活性剤処理の前にしていなければ陰イオン交換処理を加熱処理
した免疫グロブリンに施すことができる。好ましくは、少なくとも陽イオン交換
処理は、ウイルス不活化処理完了後の加熱処理した産物に行い、陰イオン交換処
理は溶剤−有機溶媒処理を最初のウイルス不活化として溶剤−有機溶媒処理を行
う前に行う。イオン交換処理は、溶液溶剤に溶解した免疫グロブリンについて、
ＩｇＧの最大吸着のイオン強度が低い場合には通常ｐＨ約5.0から5.5で行う。タ
ンパク質濃度は通常は約1−15w/v％で、好ましくは約3から10w/v％である。イオ
ン交換体は、使用するのと同じ溶剤で平衡化させ、バッチまたは連続システムで
行われる。例えば、陰イオン交換バッチワイズ処理は、前処理した陰イオン交換
体１ml（例えば、１グラムのＤＥＡＥ−ＳｅｐｈａｄｅｘＡ−５０樹脂を0.4％
の塩化ナトリウム溶液に膨潤させ、湿重量を約20グラムとしたもの）に対し、免
疫グロブリン溶液を約10から100mlかき混ぜながら混入し、混合液を約０−５℃
で約0.5から５時間撹拌し、ろ過または6,000から8,000rpmで10から30分間遠心分
離して上清アルコール溶液を回収する。連続的な処理は、免疫グロブリン溶液を
、不純物を吸着するのに十分な流率で陰イオン交換体のカラムに通し、非吸着画
分を回収した。
【００４４】 陰イオン交換体は、例えば、陰イオン交換グループが不溶性キャリヤーに結合
してなる。陰イオン交換グループは、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）、第四
級アミノエチル（ＱＡＥ）グループ他、および不溶性キャリヤーはアガロース、
セルロース、デキストラン、ポリアクリルアミド他を含む。
【００４５】 使用可能な陽イオン交換体は、カルボキシメチルＳｅｐｈａｄｅｘ（Ｒ），フ
ァルマシア（ＣＭ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ（Ｒ），ファルマシア）、ＣＭ−セルロー
ス、ＳＰ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ（Ｒ），ファルマシア、ＣＭ−セファロースおよび
ＳＰ−セファロースである。前処理した陽イオン交換体１ml（例えば１グラムの
ＣＭ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ（Ｒ），ファルマシアＣ−５０樹脂を0.4％の塩化ナト
リウム溶液に膨潤させ、湿重量約30-35グラムとしたもの）に0.5mlから５mlの免
疫グロブリン溶液を混入し、０−５℃で１−６時間撹拌する。上清を遠心分離ま
たはろ過してＩｇＧを吸着した樹脂を回収する。また、連続的な製法も採用可能
である。
【００４６】 上記詳述したコンデションは、陽イオン交換体はＩｇＧを吸着し、タンパク質
吸着陽イオン交換樹脂を洗浄したのちにＩｇＧはたとえば1.4Ｎ塩化ナトリウム
溶液で溶出される。
【００４７】 上記製造に続く工程では、ＩｇＧは清澄化され、必要な範囲まで限外ろ過され
る。もし所望であれば、50mg/mlまたは100mg/mlのＩｇＧおよび50mg/mlのＤ−ソ
ルビトールを含み、ｐＨ5.4の構成溶液を得るためにＤ−ソルビトールのような
安定化剤を加えることができる。溶液は、滅菌された細菌捕捉膜により滅菌ろ過
され、バイヤルに充填される。
【００４８】 続く実施例は、本発明を明らかにするものであるが、これらに限定されるもの
ではない。
【００４９】 所望により、他の免疫グロブリン精製工程はここに示す製法に適当に組合わせ
ることができる。例えば、カリクレインおよびプレカリクレインアクチベーター
のレベルを減少するために有効なベントナイト清澄工程を採用することができる
。その内容を以下に示す実施例１にて説明する。
【００５０】 実施例１：溶媒−界面活性剤および加熱処理したγ−グロブリン
【００５１】 650gの分画（Fr）II+IIIwペーストを約11.9kgの冷水に懸濁する。選択的にＩ
ｇＧを溶解するように、酢酸ナトリウム三水和物を懸濁液最終濃度約0.04Mとな
るように加える。15分間混和後、懸濁液のｐＨをｐＨ4.0の酢酸緩衝液にて5.2に
調整する。冷アルコール（95％）を懸濁液に加え最終濃度が17％となるようにす
る。アルコール添加の間、懸濁液の温度を徐々に下げ、−６℃にする。300およ
び3グラムのセライトコーポレーションから入手可能な酸洗浄済み珪藻類のアー
スフィルターであるＣｅｌｉｔｅ（Ｒ）をフィルターエイドとして懸濁液に添加
し、最終濃度約2.0％とした。１時間混和後、Ｃｅｌｉｔｅおよび所望でないタ
ンパク質、例えばプラスミン、プラスミノゲン、ＩｇＡおよびＩｇＭを含む分画
IIIをフィルタープレスを利用してろ過により除去する。ろ過液を、0.45μmおよ
び0.2μmのフィルターでろ過し、さらに清澄化する。その後分画IIIは1.0Ｍ炭酸
水素ナトリウムでｐＨ7.0に調整し、温度を−７℃に下げ、冷アルコール（95％
）を最終濃度25％になるよう加える。懸濁液のｐＨを7.2に調整し、沈殿、分画I
Iを−７℃でろ過により除去する。
【００５２】 各キログラムの分画IIペーストを０から２℃で、0.2％アルブミン（ヒト）お
よび2.0％ポリエチレングリコールを含むように維持した1.5kgの冷液状物質に懸
濁する。ｐＨは塩酸で3.7±0.2に調整した後、懸濁液はそのｐＨで15時間混和す
る。
【００５３】 溶液のｐＨを塩酸で5.3に調整し、温度は０から２℃に維持し、50％ポリエチ
レングリコール（ＰＥＧ）3350を溶液に加え、ＰＥＧ最終濃度４％となるように
する。そのようにして形成された沈殿物を１℃においてろ過または遠心分離によ
り除く。ろ液のｐＨを1.0Ｎの塩酸で4.9に調整し、ベントナイトを最終濃度が約
0.25％となるように添加する。ベントナイト懸濁液のｐＨは約5.2になるよう調
整し、そして懸濁液をろ過し、１℃において遠心分離により除去する。ろ液のｐ
Ｈを0.25Ｎの水酸化ナトリウムで8.0に調整し、50％ＰＥＧ3350溶液を添加し、
ＰＥＧ最終濃度を12％とする。そのようにして形成した沈殿（精製免疫グロブリ
ン）を、０から２℃で除去ろ過または遠心分離して得る。
【００５４】 上記説明したものは、ＰＥＧ分画を行う場合の典型的な製法である。その他の
ＰＥＧ分確方法も先行技術として知られている。
【００５５】 100gのＰＥＧで精製した免疫グロブリンペーストを450mlの注射用水に懸濁す
る。懸濁液のｐＨを５％の酢酸の添加で5.5に調整する。懸濁液を＋５℃で２時
間混和後、0.3％塩化ナトリウムで先に平衡化し、ｐＨ5.5のＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈ
ａｄｅｘ（Ｒ），Ａ−５０ファルマシアを33.3g加える。２時間吸着後、ＤＥＡ
Ｅ樹脂をろ過により除く。
【００５６】 トリ-n-ブチルフォスフェート（ＴＮＢＰ）およびポリソルベート８０混合物
を最終濃度0.3％ＴＮＢＰおよび1.0％ポリソルベート８０となるように得られた
ろ液に加える。溶液を＋５℃で一夜インキュベートする。Ｄ−ソルビトールを最
終濃度33％となるよう処理液に加え、安定化したＩｇＧ溶液を１時間混和し、ｐ
Ｈ5.5に調整し、60℃で一夜加温する。
【００５７】 混和液は＋５℃に冷却し、ｐＨを5.8に調整する。溶媒界面活性剤、ＰＥＧお
よびソルビトールを除去し、混和液をＣＭ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ（Ｒ）Ｃ‐５０フ
ァルマシアにより次のように処理する：溶媒／界面活性剤および加熱処理溶液を
冷水で４倍希釈する。希釈された溶液を３つに分ける。塩化ナトリウムを分割し
たものに最終濃度を0.2％、0.4％および0.6％となるように添加し、各々懸濁液a
, bおよびcとする。各分割したものをグラムタンパク質あたり乾燥重量0.65gの
ＣＭ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ（Ｒ）Ｃ‐５０ファルマシア樹脂、ｐＨ5.8および対応
するNaCl濃度で平衡化したもので処理する。
【００５８】 樹脂で３±２時間タンパク質を吸着した後、溶液をろ過で除去する。タンパク
質を吸着した樹脂を0.2％、0.4％および0.6％の塩化ナトリウムで各々洗浄し、
残存するポリソルベート８０、ＴＮＢＰ、ＰＥＧおよびソルビトールを除去する
。洗浄したタンパク質を吸着したＣＭ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｃ‐５０樹脂を、1.5
±0.5Ｎの塩化ナトリウム溶液に２±１時間再懸濁し、吸着したタンパク質を脱
着させた。樹脂は、脱着したタンパク質溶液からろ過により分離した。
【００５９】 ここで述べたように、12％ＰＥＧ工程および陰イオン樹脂処理は随意の工程で
ある。さらに、２回目のＰＥＧ分画工程は陽イオン交換樹脂処理に換えて採用す
ることができる。また、加熱処置および溶剤（溶剤−界面活性剤）ウイルス不活
化工程はどのような順序でも行うことができる。
【００６０】 本発明のバリエーションは当業者には明らかであろう。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１３年９月２６日（２００１．９．２６）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ， ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ， ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，Ｋ Ｐ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ， ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，Ｓ Ｇ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 アンドラニク バグダサリアン アメリカ合衆国 カリフォルニア 91773 サンディマス カレーエストレラ 1227 (72)発明者 ゴルゴニオ カナベラル アメリカ合衆国 カリフォルニア 91789 ウォルナット シルバーバリィートレイ ル 608 (72)発明者 カズオ タケチ ヒラカタ−シティー ショダイオオタニ ２−チョーメ 25−１ Ｆターム(参考） 4C085 AA33 CC22 DD02 DD08 DD39 GG02 4C087 AA05 BB35 CA16 CA47 DA06 MA17 MA66 NA01

Claims (25)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 以下からなる静注可能なガンマグロブリン溶液の製造方法：
    (a)不純なガンマグロブリン溶液から精製されたガンマグロブリンを得るために
    ポリエチレングリコール分画に付し； (b)ポリエチレングリコール処理された精製ガンマグロブリンを、被膜ウイルス
    を不活化するために有機溶媒処理し； (c)ポリエチレングリコール処理された精製ガンマグロブリンを、熱感受性ウイ
    ルスを不活化するに十分な時間および温度条件で加熱処理し； そして (d)加熱処理で生じた凝集物を除去する。
  2. 【請求項２】 該不純なガンマグロブリン溶液が、コーン分画I+II+III、コ
    ーン分画II+III、コーン分画II+IIIwまたはコーン分画IIである請求項１に記載
    の製造方法。
  3. 【請求項３】 該不純なガンマグロブリン溶液が、ポリエチレングリコール
    分画工程(a)の前に少なくとも１工程の精製工程に付される請求項１に記載の製
    造方法。
  4. 【請求項４】 該加熱処理工程(c)は、約50℃から70℃で約10から100時間行
    われる請求項１に記載の製造方法。
  5. 【請求項５】 該加熱処理工程(c)は、約60℃で約10時間行われる請求項４
    に記載の製造方法。
  6. 【請求項６】 該工程(d)は、加熱処理溶液にポリエチレングリコール分画
    が行われる請求項１に記載の製造方法。
  7. 【請求項７】 工程(b)に使用する該有機溶媒がアルキルホスフェートであ
    る請求項１に記載の製造方法。
  8. 【請求項８】 工程(b)に使用する該有機溶媒がアルキルホスフェートであ
    る請求項６に記載の製造方法。
  9. 【請求項９】 該アルキルホスフェートがトリ-n-ブチルホスフェートであ
    る請求項８に記載の製造方法。
  10. 【請求項１０】 該有機溶媒に界面活性剤を含むことを特徴とする請求項１
    に記載の製造方法。
  11. 【請求項１１】 該有機溶媒に界面活性剤を含むことを特徴とする請求項９
    に記載の製造方法。
  12. 【請求項１２】 該工程(a)のあとに、ガンマグロブリンが陰イオン交換樹
    脂および陽イオン交換樹脂で処理される請求項１に記載の製造方法。
  13. 【請求項１３】 該工程(b)は、工程(c)の前に行われ、陰イオン交換樹脂処
    理は工程(b)の前に行われ、陽イオン交換樹脂処理は工程(c)の後に行われる請求
    項１２に記載の製造方法。
  14. 【請求項１４】 該加熱処理工程(c)は、工程(b)からの免疫グロブリン−有
    機溶媒溶液との間にどのような製造工程もなしに行われる請求項１に記載の製造
    方法。
  15. 【請求項１５】 該加熱処理工程(c)は、工程(b)からの免疫グロブリン−有
    機溶媒溶液との間にどのような製造工程もなしに行われる請求項１３に記載の製
    造方法。
  16. 【請求項１６】 最初のポリエチレングリコール分画工程のあとに該ベント
    ナイト清澄工程が行われる請求項６に記載の製造方法。
  17. 【請求項１７】 該工程(d)は、加熱処理溶液に陽イオン交換樹脂で処理さ
    れることによる請求項１に記載の製造方法。
  18. 【請求項１８】 該ポリエチレングリコール分画工程(a)は、ガンマグロブ
    リンを沈殿させることなく行われる請求項１に記載の製造方法。
  19. 【請求項１９】 該ポリエチレングリコール分画工程(d)は、ガンマグロブ
    リンを沈殿させることなく行われる請求項６に記載の製造方法。
  20. 【請求項２０】 該ポリエチレングリコール分画工程(a)は、少なくとも２
    つのステージで行われ、最初のポリエチレングリコール分画ステージで不純物が
    沈殿として除去され、２つ目のポリエチレングリコール分画ステージでγ−グロ
    ブリンが沈殿として回収される請求項１に記載の製造方法。
  21. 【請求項２１】 該ポリエチレングリコール分画工程(d)は、少なくとも２
    つのステージで行われ、最初のポリエチレングリコール分画ステージで不純物が
    沈殿として除去され、２つ目のポリエチレングリコール分画ステージでγ−グロ
    ブリンが沈殿として回収される請求項６に記載の製造方法。
  22. 【請求項２２】 該工程(b)は、工程(c)の前に行われる請求項１に記載の製
    造方法。
  23. 【請求項２３】 該工程(c)は、工程(b)の前に行われる請求項１に記載の製
    造方法。
  24. 【請求項２４】 請求項１４に記載の製法により産生された静注可能なガン
    マグロブリン溶液。
  25. 【請求項２５】 請求項１５に記載の製法により産生された静注可能なガン
    マグロブリン溶液。
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