CN1351500A - 制备静脉注射用双病毒失活的免疫球蛋白的方法 - Google Patents

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Abstract

一种用于生产可静脉注射的γ球蛋白溶液的方法,通过以下步骤使该γ球蛋白溶液基本上不含污染病毒:分级分离不纯的γ球蛋白溶液,然后以任何顺序,用溶剂－去污剂处理纯化的γ球蛋白使病毒失活,以及热处理使病毒失活。然后,将由热处理产生的变性杂质、残留溶剂和凝聚物从γ球蛋白中除去。

Description

制备静脉注射用双病毒失活的免疫球蛋白的方法
发明背景
本发明涉及一种生产静脉注射用的免疫球蛋白的完整、多步的工业化生产方法。其中该免疫球蛋白包含的主要成分为IgG(γ-球蛋白)。
已知有多种从由人类血浆的科恩分级分离(Cohn fractionation)得来的起始物质中获得静脉注射用γ-球蛋白的方法。一些科恩级分(fraction)比其他的科恩级分包含有更高效价的γ-球蛋白。常用的用于制备γ-球蛋白溶液的起始物质为科恩级分II或科恩级分II+III。
尽管在现有技术中人们采用了多种分离和杀菌技术，仍需要不断探索改进方法以提高终产物的纯度、安全性和总产量。
很多工业化生产方法使用溶剂/去污剂或热处理步骤使病毒失活。到目前为止，还没有提出过以科恩级分II或科恩级分II+III糊状物为起始物质的多步方法。该多步方法包括以两种不同的病毒失活步骤作为高效、高产量的γ-球蛋白生产方法的一部分。
Kaneyama等人的美国专利第5,151,499号中提供了一种制备病毒失活的蛋白质组合物的方法，其中将该蛋白质组合物进行蛋白质组合物的溶剂/去污剂处理中的包壳病毒的病毒失活以及蛋白质组合物的的热处理中的非包壳病毒的病毒失活。美国专利第5,151,499号中指出优选使溶剂/去污剂步骤在蛋白酶抑制剂存在的情况下首先发生，接下来进行热处理，该热处理在大部分实例中为干燥的热处理。如果热处理在液态下进行，在任何热处理之前，通过将蛋白质吸附至一个离子交换柱而从溶剂/去污剂中回收。液态热处理可在糖、糖醇或氨基酸稳定剂存在的情况下进行。尽管美国专利第5,151,499号中列出了很多包含免疫球蛋白的起始蛋白质组合物，其生产实例采用了VIII因子、IX因子、凝血酶、血纤维蛋白原和纤维结合素。
Uuki等人的美国专利第5,371,196号中提供了纯化分泌性免疫球蛋白A的方法。其中描述了液态热处理或多种液态热处理与溶剂处理病毒失活相结合的方法。其中每一步之后都使用了聚乙烯乙二醇分级分离，并且总作为最终步骤。该发明没有涉及到高γ-球蛋白效价的血清免疫球蛋白。
一些现有技术中生产可静脉注射的γ-球蛋白溶液的方法描述了在山梨醇热稳定剂存在的情况下、以科恩级分II+III糊状物为起始物的多步纯化步骤进行的液态热处理的结合。Hirao等人的美国专利第4,845,199号中，使科恩级分II+III经聚乙烯乙二醇(后文中称为“PEG”)分级分离(8％w/v PEG用来沉淀杂质，接着用12％w/v PEG聚集以沉淀γ-球蛋白)，接着进行离子交换色谱分离，除去人血型抗体，然后，在作为蛋白质稳定剂的山梨醇存在的情况下进行液态热处理。另一方面，Hirao等人的美国专利第4,876,088号中的实施例1描述了从科恩级分II+III糊状物中制备可静脉注射的γ-球蛋白的方法，其中，糊状物悬浮于水中，pH值调至5.5，进行离心分离，上清液随后在33％w/v山梨醇存在的情况下进行热处理使病毒失活，接着进行PEG分级分离(6％/12％)，然后进行包括DEAE-Sephadex离子交换色谱法等的其它纯化步骤。
发明概述
本发明的目的之一是提供一种完整的、工业上可用的方法，以由科恩分级分离方法生产高纯度γ-球蛋白溶液。
本发明的另外一个目的是提供一种非常纯的可静脉注射的γ-球蛋白溶液，其不含包括各种热敏感病毒在内的包壳病毒和非包壳病毒。
本发明的再一个目的是提供一种工业上可用的γ-球蛋白方法，包括两个连续的病毒失活步骤，而不需要在第一个病毒失活步骤之后或第二个病毒失活之前回收γ-球蛋白。
本发明提供了本领域的技术人员显而易见的上述或其它目的，其中可被部分纯化、富含γ-球蛋白的乙醇科恩级分，首先经PEG分级分离，然后经过两步病毒失活处理，一步为在溶剂、优选为溶剂-去污剂混合液存在的情况下进行的病毒失活，以破坏包壳病毒，另一步为热处理病毒失活，在这两步之间不需要回收γ-球蛋白。接下来，将任何热处理形成的凝聚物从热处理和溶剂处理过的溶液中分离出来。
在本发明的一个优选实施方案中，山梨醇作为热稳定剂，三烷基磷酸盐作为溶剂。
在本发明的另外一个实施方案中，在溶剂-去污剂处理之前除去所有存在的颗粒。
在本发明的另外一个实施方案中，在病毒失活完成以后，γ-球蛋白溶液经PEG分级分离。
在本发明另外一个实施方案中，在病毒失活完成以后用阳离子交换树脂处理γ-球蛋白溶液。
在本发明的一些优选实施方案中，进行一步聚乙烯乙二醇分级分离步骤而不需要沉淀γ-球蛋白。
在本发明的另一个优选实施方案中，在热处理病毒失活之前进行溶剂-去污剂病毒失活。
在本发明的再一个实施方案中，提供了一种适用于静脉注射的热-杀菌和溶剂-去污剂杀菌的γ-球蛋白。发明详述
本发明以包含免疫球蛋白的级分作为起始物质，该级分并不局限于起源于人血浆，并且包含一种免疫球蛋白级分。所述的含免疫球蛋白级分的具体例子包括可由科恩乙醇分级分离获得的级分II+III和级分II及与其同等的含免疫球蛋白级分的糊状物。其它的起始物质为级分I+II+III和级分II+IIIw。起始物质中可含杂质，如人血型抗体，血纤维蛋白溶酶原、血纤维蛋白溶酶、激肽释放酶、激肽释放酶原活化因子、IgM、IgA、IgG聚合物(前后文均为凝聚物)等。
优选的起始物质为科恩级分II或者科恩级分II+III。当使用科恩级分糊状物II+III时，建议先经过初步的清洗步骤以形成级分II+IIIw，该级分随后用于本发明的方法。“级分II+IIIw”为经磷酸氢二钠溶液清洗过的科恩级分II+III沉淀。
级分II+IIIw可通过将级分II+III沉淀沉淀物悬浮于冷水中获得，作为注射剂，其比率为每约20体积水中含1千克的II+III糊状物。然后加入磷酸钠使磷酸钠的最终浓度为大约0.003M，以溶解脂类、脂蛋白和白蛋白。加入冷乙醇使冷乙醇的最终浓度达到20％。在乙醇的添加过程中，温度逐渐降至-5±1℃，pH值，例如通过使用醋酸盐缓冲液或氢氧化钠稀释液维持不变或调至7.2±0.1℃。将温度维持在-5±1℃时，使用离心分离和/或过滤回收所形成的级分II+IIIw沉淀沉淀物。
根据本发明的操作顺序，在进行PEG分级分离之前，可进行若干初步纯化和/或聚集-还原步骤。如：当使用级分II+IIIw糊状物时，通常含有约20％的乙醇，超过70％的蛋白质为IgG。可将级分II+IIIw糊状物悬浮于3到10体积，优选3到5体积的约0到5℃的冷水中，pH值使用pH值为4.0的醋酸缓冲液或盐酸调至4.5到6.0，优选5.0到5.5。然后搅拌混合物2到15小时，使得所有的γ-球蛋白溶于溶液之中。然后，可通过离心分离和/或过滤将不溶的蛋白如：白蛋白和α-球蛋白除去。
当使用不同的起始科恩级分时，可适当地选择起始步骤或操作步骤以进行理想的初步纯化，从而得到高IgG含量的级分以进行进一步的处理。例如：当将科恩级分II(含有95％纯的IgG)从科恩级分III中分离出来时，将科恩级分II进一步处理，初步处理可在酸性pH值为3.2到5.0，优选为3.8到4.2(如Uemura等人在美国专利第4,371,520号中所述)下进行，以使以凝聚物形式存在的免疫球蛋白分解为免疫球蛋白单体和二聚物，因为已知凝聚物具有抗互补性(ACA)。另外一种选择中，以科恩级分II+III为起始物质，可在以上所述的初步纯化之后和PEG分级分离步骤之前将Uemura等人的专利所述的低pH值处理作为一个附加步骤来进行。
PEG分级分离在病毒失活之前进行，PEG分级分离在纯化免疫球蛋白的技术领域是众所周知的方法，可使理想的IgG单体和二聚物从IgG凝聚物和自然存在于起始血浆蛋白质级分的其它杂质中分离出来。在病毒失活之前除去凝聚物和一些存在的杂质可降低在如60℃下进行10小时的热处理步骤中产生的聚集的程度和浊度。
第二级PEG分级分离步骤在热处理病毒失活之后进行，其有益于除去热处理过程中产生的变性的杂质和/或凝聚物。
可使用任何在现有技术中记载的PEG分级分离的方法。在第一级PEG分级分离中，可选择PEG浓度和pH值使得理想的IgG单体和二聚物留在溶液中，而不理想的蛋白质如凝聚物沉淀出溶液。离心分离和/或过滤以后，可调节pH以任选地增加PEG浓度，从而使得理想的IgG单体和二聚物沉淀。
例如：当级分II+IIIw糊状物作为起始物质时，PEG分级分离的第一级可在pH约为5到7.5，优选6.5到7.5下进行。当级分II+III糊状物作为起始物质时，优选pH为5.5到6.0，当级分II+IIIw糊状物作为起始物质时，PEG的浓度范围为4％到8％，优选4％到6％，或者当级分II+III糊状物作为起始物质时，PEG的浓度为6％到8％。在保持低温于0℃到2℃之间时，PEG分级分离的第一级可进行约1到8小时，之后按如上所述除去包含凝聚物的不理想蛋白质沉淀。如果希望收集纯化的免疫球蛋白，过滤液的pH值调至约8.0到9.0，优选约8.5到8.9，并且加入PEG使得其最终浓度为约10％到15％，优选为约12％。纯化的免疫球蛋白沉淀，经过滤和/或离心分离除去。
有助于本发明的实施的PEG分级分离的更详细的描述可参见上述Hirao等人的美国专利第4,876,088号和和Hirao等人的美国专利第4,845,199号。
本发明的下一个关键步骤为进行选自于热处理和溶剂或溶剂-去污剂混合物处理的第一次病毒失活步骤。于是，进行另外的未用于第一次病毒失活的热处理和溶剂或溶剂-去污剂处理的第二次病毒失活步骤。如下所述，可在热处理或溶剂/去污剂处理之前或之后的进行进一步的纯化步骤，尤其是那些涉及到使用离子交换树脂的纯化步骤。
一种特别有利的方法为在作为第一次病毒失活的溶剂-去污剂病毒失活之前进行阴离子交换处理。然后在作为第二次病毒失活的热处理病毒失活之后进行阳离子交换处理。通过该方法，可使用阴离子交换剂将一些存在于人类血浆中不需要的蛋白质物质(如激肽释放酶原活化因子、IgA、IgM和白蛋白)从IgG中除去，然后，可通过阳离子交换剂除去另外的上述物质(激肽释放酶原活化因子、IgA、IgM和白蛋白)连同PEG、由溶剂-去污剂处理产生的残留试剂以及由热处理产生的变性蛋白质。因而，在病毒失活完成后可使用阳离子交换方法代替第二级PEG分级分离，以除去变性的杂质和热处理病毒失活产生的凝聚物。
如果在整个过程中没有达到目的，应将经溶剂/去污剂处理的溶液进行处理以除去所有可包括变性蛋白质的颗粒物质。因此，优选在添加溶剂/去污剂之前使用1微米或更细的过滤器将溶液过滤。这还可以减少存在于大的颗粒中的病毒的生存可能性，从而有可能避免暴露于溶剂/去污剂。
至今，优选的用于失活包壳病毒的溶剂为三烷基磷酸盐。本发明所使用的三烷基磷酸盐不受特定的限制，但优选使用三(正-丁基)磷酸盐(后文为“TNBP”)，其它可用的三烷基磷酸盐为三(叔丁基)磷酸盐、三(正-己基)磷酸盐、三(2-乙基己基)磷酸盐等。可使用两种或更多种不同的三烷基磷酸盐的混合物。
三烷基磷酸盐的使用量为0.01到10(w/v)％，优选0.01到3(w/v)％。
三烷基磷酸盐可在去污剂或表面活性剂存在或不存在的情况下使用。优选三烷基磷酸盐和去污剂联用。去污剂可增强免疫球蛋白组合物中病毒与三烷基磷酸盐的接触。
去污剂的实例包括脂肪酸的聚氧乙烯基衍生物，无水山梨醇的一些酯如聚山梨醇酯80(商品名：Tween 80等)和聚山梨醇酯20(商品名：Tween 20等)；和非离子油浴漂洗剂如氧乙烯烷基酚(商品名：TritonX100等)。实例包括其它表面活性剂和去污剂如Zwitter离子去污剂等。
当使用去污剂时，不必以严格的量加入；如：可以其比率在约0.001％与10％之间使用，优选在越0.01％与3％之间。
本发明中，含免疫球蛋白组合物的三烷基磷酸盐的处理在大约20℃到35℃，优选25℃到30℃之间进行超过1小时，优选约5到8小时，更优选约6到7小时。
在三烷基磷酸盐的处理中，免疫球蛋白存在于约3％到8％蛋白质的水介质溶液中。
三烷基磷酸盐和任选的去污剂可直接加到来源于一级PEG分级分离的过滤液，其中，γ-球蛋白不被加入的附加PEG所沉淀，需要稀释蛋白质，否则，将沉淀的γ-球蛋白悬浮于冷水中以便注射，pH值可被调至约5.0到6.0，然后向其中加入有机溶剂和任选的去污剂。
对于热杀菌步骤，可使用从PEG分级分离或从溶剂(去污剂)步骤获得的而未经纯化的免疫球蛋白蛋白质溶液，向其中加入糖、糖醇和/或氨基酸热稳定剂。pH调至约4.5到6，优选约5.0到5.5。热稳定剂优选蔗糖、麦芽糖、山梨醇或甘露醇，最优选为山梨醇。糖或糖醇可以粉末的形式加入到免疫球蛋白溶液中，或先与小剂量的水混合然后再加入，以使最终浓度为约10到50w/w％，达饱和。
加入热稳定剂之后，混合物在约50-70℃加热约10-100小时，优选在约60℃加热10到20小时，以使热敏感病毒病毒性失活。热处理步骤不仅使病毒失活，而且通过蛋白质变性作用，可优先降低一些不必要的且通常与科恩级分II+III有关的蛋白质如激肽释放酶原活化因子、血纤维蛋白溶酶、血纤维蛋白溶酶原的数量。
热处理后，溶液可被冷却至约0℃到30℃，优选约10℃，pH值被调至约5.0到6.0之间，优选约5.0到5.5之间。
如果阴离子交换处理不在溶剂-去污剂处理之前进行，可在热处理过的免疫球蛋白上进行。优选地，病毒失活完成之后对热处理过的产品至少进行一次阳离子交换处理，并在使用溶剂-去污剂处理之前使用阴离子交换处理作为第一次病毒失活。进行离子交换处理时，免疫球蛋白溶于含水溶剂中，通常pH值为约5.0到5.5，并且有最大吸附IgG的理想离子强度。蛋白质浓度的范围通常为约1-15w/v％，更优选为约3到10w/v％。离子交换剂与所使用的同样的水溶剂平衡，并且可以采用间歇式或连续式***。例如，可以这样进行阴离子交换分批处理：混合免疫球蛋白溶液与阴离子交换剂，该阴离子交换剂的量为10到100ml每ml预先处理过的阴离子交换剂(例如：1g的DEAE SephadexA-50树脂在0.4％的氯化钠溶液中膨胀至湿重为20g)，在0℃到5℃搅拌混合物0.5到5小时，然后过滤或以6000到8000rpm的速率离心分离30分钟以回收上清液。可通过将免疫球蛋白溶液以足以将杂质吸附至离子交换剂的流速通过离子交换柱并回收未吸附的级分，来影响连续处理。
欲使用的阴离子交换剂包括如连接至一种不溶性载体的阴离子交换基团。阴离子交换基团包括二乙氨乙基(DEAE)，季胺乙基(QAE)等，不溶性载体包括琼脂糖、纤维素、右旋糖苷、聚丙烯酰胺等。
可使用的阳离子交换剂的实例为羧甲基Sephadex(CM-Sephadex)CM-纤维素、SP-Sephadex、CM-Sepharose和SP-Sepharose。将1ml的预先处理过的阳离子交换剂(如：1g的CM-Sephadex C-50树脂在0.4％的氯化纳溶液中膨胀至湿重为30-35g)与0.5到5ml的免疫球蛋白溶液混合，并在0到5℃下搅拌1-6小时。将悬浮液离心分离或过滤以回收吸附了IgG的树脂。同样，也可采用连续式操作。
当在以上所述的条件下使用阳离子交换树脂时，IgG将会被吸附，接着洗涤吸附了蛋白质的阳离子交换树脂，IgG可被洗脱掉，例如通过约1.4N的氯化钠溶液的洗涤。
经过以上所述步骤之后，IgG已被澄清，双过滤(diafiltered)并且被浓缩到所需要的程度。如需要，可加入稳定剂如D-山梨醇，并做最终的调节以产生一种pH值为5.4，包含约50mg/ml或100mg/ml的IgG和50mg/ml的D-山梨(糖)醇的组合物的溶液。然后将该溶液通过一种灭菌的细菌固位过滤器(sterilized bacterial retentive filters)进行灭菌过滤，装入小瓶中。
以下例子用于说明本发明，但并不限定本发明。
如需要，可将其它的免疫球蛋白纯化方法与所述的方法联合使用。如：可使用一种膨润土澄清步骤，其有助于减少激肽释放酶和前-激肽释放酶活化因子的水平。对该方法的说明见下面的实施例1。实施例1：溶剂-去污剂和热处理的γ-球蛋白
将685g的级分II+IIIw悬浮于约11.9kg的冷水中。向悬浮液中加入三水醋酸钠使其最终浓度为约0.04M，以选择性地溶解IgG。混合约15分钟后，使用pH值为4.0的醋酸缓冲液将悬浮液的pH值调至5.2。向悬浮液中加入冷乙醇(95％)使其最终浓度为17％，在乙醇的添加过程中，悬浮液的温度逐渐降至约-6℃。加入303g的酸洗硅藻土535(可从Celite Corporation购得)作为助滤剂至悬浮液中，使其最终浓度约为2.0％。混合1小时后，通过使用压滤机使硅藻土和包含不需要的蛋白质如血纤维蛋白溶酶、血纤维蛋白溶酶原、IgA和IgM的级分III糊状物被除去。滤液通过0.45μm和0.2μm过滤器被进一步澄清。然后通过使用1.0M碳酸氢钠将级分III的上清液的pH值调至7.0，温度降低至-7℃，同时加入冷乙醇(95％)使其最终浓度为25％。如需要，可将悬浮液pH值调至7.2，沉淀物、级分II可在温度为-7℃时通过过滤除去。
将每kg的级分II糊状物悬浮于保持在0℃到2℃下、大约1.5kg的包含0.2％白蛋白(人)和约2.0％的聚乙烯乙二醇的冷水溶液中。使用稀盐酸将pH值调节至3.7±0.2。然后使该悬浮物保持在该pH值，同时混合15小时。
保持温度为0℃到2℃时，使用稀释的氢氧化钠将溶液的pH值调节至5.3。向溶液中加入50％的聚乙烯乙二醇(PEG)3350使得PEG的终浓度为4％。所形成的沉淀物在1℃下通过过滤和离心分离除去。使用1.0N盐酸将滤液的pH值调节至4.9。加入膨润土使其最终浓度为0.25％。将膨润土悬浮液的pH值重新调节至约5.2。然后在1℃下，过滤或离心分离悬浮液以除去膨润土。使用0.25N氢氧化钠溶液将滤液的pH值调节至8.0。加入50％的PEG3350溶液使得PEG的终浓度为12％，所形成的沉淀(纯化的免疫球蛋白)在0℃到2℃下通过过滤和离心分离除去。
以上提出了用于进行PEG分级分离的典型的方法，其它的PEG分级分离方法为本领域的人员所公知。
将100g的PEG纯化免疫球蛋白糊状物悬浮于450ml冷水中做注射之用。通过添加5％的醋酸溶液将悬浮液的pH值调节至5.5。在5℃下混合悬浮液2小时后，加入33.3g的pH值为5、用0.3％氯化钠溶液预平衡的DEAE Sephadex A-50。吸附进行两小时后，通过过滤将DEAE树脂除去。
向滤液中加入三-正-丁基磷酸盐(TNBP)和聚山梨酸酯80混合物以产生最终浓度为0.3％的TNBP和1％聚山梨酸酯80的溶液。溶液在5℃下保温过夜。然后向处理过的溶液中加入D-山梨醇使其终浓度为33％，混合稳定的IgG溶液1小时，pH值调至5.5，在60℃下加热过夜。
将混合物冷却至5℃，pH值调至5.8。使用CM-Sephadex C-50按如下处理混合物以除去溶剂去污剂、PEG和山梨醇：用冷水将溶剂/去污剂处理的和热处理的溶液稀释4倍。然后将稀释的溶液分成三等分。加入氯化钠使得三份溶液中氯化钠的最终浓度分别为：0.2％、0.4％和0.6％，分别作为悬浮液a、b和c。然后使用每克蛋白质0.65g干重的CM-Sephadex C-50树脂处理每份溶液，该树脂已在pH 5.8下预平衡，并与NaCl浓度相对应。
使用树脂吸附蛋白质3±2小时后，将液体过滤除去。然后分别用0.2％、0.4％和0.6％的氯化钠溶液清洗吸附了蛋白质的树脂，以除去残留的聚山梨酸酯80、TNBP、PEG和山梨醇。然后将清洗过的吸附了蛋白质的CM-Sephadex C-50树脂重新悬浮于1.5±0.5N的氯化钠溶液2±1小时，以解吸吸附的蛋白质，然后通过过滤将树脂从解吸的蛋白质中分离出来。
正如所讨论的，12％的PEG阶段和阴离子交换树脂处理阶段是任选的步骤。另外，可使用第二级PEG分级分离步骤来代替或加上阴离子交换树脂处理。而且，热处理和溶剂(溶剂-去污剂)病毒失活步骤可以任何顺序进行。
本发明的变化对于本领域的技术人员来说是显而易见的。

Claims (25)

1.一种用于制备可静脉注射的γ球蛋白溶液的方法，包括：
(a)使不纯的γ球蛋白溶液经过聚乙烯乙二醇分级分离，以获得纯化的γ球蛋白；
(b)使用有机溶剂处理聚乙烯乙二醇纯化的γ球蛋白以使包壳病毒失活；
(c)在足以使热敏感病毒失活的时间和温度条件下热处理聚乙烯乙二醇纯化的γ球蛋白；然后
(d)除去热处理产生的凝聚物。
2.如权利要求1所述的方法，其中不纯的γ球蛋白溶液为科恩级分I+II+III、科恩级分II+III、科恩级分II+IIIw或科恩级分II。
3.如权利要求1所述的方法，其中不纯的γ球蛋白溶液在聚乙烯乙二醇分级分离步骤a前，经过至少一次纯化步骤。
4.如权利要求1所述的方法，其中热处理步骤(c)在大约50℃到70℃下进行10到100小时。
5.如权利要求4所述的方法，其中热处理步骤(c)在大约60℃下进行10小时。
6.如权利要求1所述的方法，其中通过热处理过的溶液的聚乙烯乙二醇分级分离进行步骤(d)。
7.如权利要求1所述的方法，其中步骤(b)中所使用的有机溶剂为烷基磷酸盐。
8.如权利要求6所述的方法，其中步骤(b)中所使用的有机溶剂为烷基磷酸盐。
9.如权利要求8所述的方法，其中烷基磷酸盐为三-正丁基磷酸盐。
10.如权利要求1所述的方法，其中有机溶剂包含去污剂。
11.如权利要求9所述的方法，其中有机溶剂包含去污剂。
12.如权利要求1所述的方法，其中步骤(a)后，用阴离子交换树脂和阳离子交换树脂处理γ球蛋白溶液。
13.如权利要求12所述的方法，其中步骤(b)在步骤(c)之前进行，阴离子交换树脂处理在步骤(b)之前进行，阳离子交换树脂处理在步骤(c)之后进行。
14.如权利要求1所述的方法，其中对由步骤(b)所得的免疫球蛋白有机溶剂溶液进行热处理步骤(c)，而不需要任何干涉步骤。
15.如权利要求13所述的方法，其中对由步骤(b)所得的免疫球蛋白-有机溶剂溶液进行热处理步骤(c)，而不需要任何干涉步骤。
16.如权利要求6所述的方法，其中在第一级聚乙烯乙二醇分级分离后使用膨润土澄清步骤。
17.如权利要求1所述的方法，其中通过处理用阳离子交换树脂热处理过的溶液来进行步骤(d)。
18.如权利要求1所述的方法，其中进行聚乙烯乙二醇分级分离步骤(a)而不产生γ球蛋白沉淀。
19.如权利要求6所述的方法，其中进行聚乙烯乙二醇分级分离步骤(d)的而不产生γ球蛋白沉淀。
20.如权利要求1所述的方法，其中聚乙烯乙二醇分级分离步骤(a)至少分两个阶段进行，其中在第一级聚乙烯乙二醇分级分离中杂质作为沉淀物被除去，在第二级聚乙烯乙二醇分级分离中γ球蛋白作为沉淀剂被回收。
21.如权利要求6所述的方法，其中聚乙烯乙二醇分级分离步骤(d)至少分两个阶段进行，其中在第一级聚乙烯乙二醇分级分离中杂质作为沉淀物被除去，在第二级聚乙烯乙二醇分级分离中γ球蛋白作为沉淀剂被回收。
22.如权利要求1所述的方法，其中步骤(b)在步骤(c)之前进行。
23.如权利要求1所述的方法，其中步骤(c)在步骤(b)之前进行。
24.一种由如权利要求14所述的方法生产的可静脉注射的γ球蛋白溶液。
25.一种由如权利要求15所述的方法生产的可静脉注射的γ球蛋白溶液。
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