JP2003525449A - 液体中に存在する標的分子の定量 - Google Patents
液体中に存在する標的分子の定量Info
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、液体中に含まれる第1のバイオポリマの検出および/または定量方法であって、以下の工程を含む方法に関する:a)検出されるべき前記第1のバイオポリマに対して特異的な親和性を有する、第2のバイオポリマでコーティングされたプラスチックからなる面を有する、電極を用意すること;b)電極を液体と接触させること;c)所定の電圧プロトコルを電極に適用することにより、前記第2のバイオポリマ上において前記第1のバイオポリマの濃縮を起こすこと;d)四酸化オスミウムおよびビピリジンを液体に添加すること、および;e)前記電極から得られるレドックスシグナルを測定すること。
Description
【0001】
本発明は、液体中に存在する標的分子の検出および/または定量プロセスに関
する。
する。
【0002】
従来技術によれば、WO 96/01836はポリヌクレオチド配列の検出の
ためのチップを開示している。多数の微細化された反応フィールドが、シリコン
基板から作製されるチップ上に設けられる。反応フィールドの各々にプローブが
接続される。検出したいポリヌクレオチド配列を含有する溶液中にチップを浸す
と、設けられたプローブのうちの1つとのハイブリダイゼーションが起こる。こ
のハイブリダイゼーションは、例えばプローブに施された蛍光体標識によって検
出することができる。
ためのチップを開示している。多数の微細化された反応フィールドが、シリコン
基板から作製されるチップ上に設けられる。反応フィールドの各々にプローブが
接続される。検出したいポリヌクレオチド配列を含有する溶液中にチップを浸す
と、設けられたプローブのうちの1つとのハイブリダイゼーションが起こる。こ
のハイブリダイゼーションは、例えばプローブに施された蛍光体標識によって検
出することができる。
【0003】
DE 198 08 884.1は、分子に結合された2つの相互作用する蛍
光基を用いた、化学物質の検出プロセスを記載している。検出したい化学物質へ
の分子の特異的な付加に際して、蛍光基間の相互作用が変更される。
光基を用いた、化学物質の検出プロセスを記載している。検出したい化学物質へ
の分子の特異的な付加に際して、蛍光基間の相互作用が変更される。
【0004】
WO 99/47700は、蛍光を用いた標的分子の検出プロセスに関する。
このプロセスにおいて、蛍光基を備えたプローブが固相に結合される。溶液中の
標的配列の存在下において、第2の蛍光基が第1の蛍光基の近傍に、2つの蛍光
基間において放射を伴わないエネルギー伝送が起こり得るように結合される。
このプロセスにおいて、蛍光基を備えたプローブが固相に結合される。溶液中の
標的配列の存在下において、第2の蛍光基が第1の蛍光基の近傍に、2つの蛍光
基間において放射を伴わないエネルギー伝送が起こり得るように結合される。
【0005】
US 5,312,572およびUS 5,871,918は、ポリヌクレオ
チド配列の電気化学的検出プロセスを記載する。これらのプロセスにおいて、ポ
リヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションに際して形成された二本鎖分子に
結合するレドックス活性分子が溶液に加えられる。このタイプの二本鎖分子の存
在により、測定可能なレドックスシグナルが引き起こされる。
チド配列の電気化学的検出プロセスを記載する。これらのプロセスにおいて、ポ
リヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションに際して形成された二本鎖分子に
結合するレドックス活性分子が溶液に加えられる。このタイプの二本鎖分子の存
在により、測定可能なレドックスシグナルが引き起こされる。
【0006】
US 5,591,578は、レドックスインジケータを用いたポリヌクレオ
チド配列の検出プロセスを記載する。このプロセスにおいて、標的ポリヌクレオ
チド配列に対して相補的なプローブが、電極に共有結合される。レドックス活性
の遷移金属錯体が、プローブに共有結合される。標的ポリヌクレオチド配列のプ
ローブとのハイブリダイゼーションに際して、レドックスシグナルが電極で測定
され得る。
チド配列の検出プロセスを記載する。このプロセスにおいて、標的ポリヌクレオ
チド配列に対して相補的なプローブが、電極に共有結合される。レドックス活性
の遷移金属錯体が、プローブに共有結合される。標的ポリヌクレオチド配列のプ
ローブとのハイブリダイゼーションに際して、レドックスシグナルが電極で測定
され得る。
【0007】
DE 196 28 171は、電極に結合された第2の分子に対して特異的
な親和性を有する、電荷を有した第1の分子の精製および濃縮プロセスを開示す
る。第1の分子を含む溶液が電極と接触すると、第1の分子が電極において濃縮
されるように電圧プログラムが稼働される。
な親和性を有する、電荷を有した第1の分子の精製および濃縮プロセスを開示す
る。第1の分子を含む溶液が電極と接触すると、第1の分子が電極において濃縮
されるように電圧プログラムが稼働される。
【0008】
E.Palecek、Bioelectrochemistry and B
ioenergetics 1985、15、275−295は、二本鎖バイオ
ポリマの検出用のレドックス活性物質としての、四酸化オスミウム化合物の使用
を開示している。
ioenergetics 1985、15、275−295は、二本鎖バイオ
ポリマの検出用のレドックス活性物質としての、四酸化オスミウム化合物の使用
を開示している。
【0009】
従来技術に開示されたプロセスは時間がかかり、不便であるか、複雑な設備を
必要とする。
必要とする。
【0010】
本発明の目的は、従来技術の不利を克服するためのものである。特に、液体
中に存在する少量の第1のバイオポリマの検出および/または定量のための、敏
感で単純かつ安価な電気化学的プロセスを示すことを目的とする。
中に存在する少量の第1のバイオポリマの検出および/または定量のための、敏
感で単純かつ安価な電気化学的プロセスを示すことを目的とする。
【0011】
この目的は、請求項1の特徴によって達成される。請求項2〜12の特徴から
、有利な実施態様が得られる。
、有利な実施態様が得られる。
【0012】
本発明によれば、液体中に存在する第1のバイオポリマの検出および/または
定量プロセスであって、以下の工程を有するプロセスの提供がなされる: a)検出されるべき第1のバイオポリマに対して特異的な親和性を有する、第
2のバイオポリマでコーティングされたプラスチックからなる面を有する、電極
を用意すること、 b)電極を液体と接触させること、 c)所定の電圧プログラムを電極に適用することにより、第2のバイオポリマ
において第1のバイオポリマの濃縮を起こすこと、 d)四酸化オスミウムおよびビピリジンを液体に添加すること、 e)電極から得られるレドックスシグナルを測定すること。
定量プロセスであって、以下の工程を有するプロセスの提供がなされる: a)検出されるべき第1のバイオポリマに対して特異的な親和性を有する、第
2のバイオポリマでコーティングされたプラスチックからなる面を有する、電極
を用意すること、 b)電極を液体と接触させること、 c)所定の電圧プログラムを電極に適用することにより、第2のバイオポリマ
において第1のバイオポリマの濃縮を起こすこと、 d)四酸化オスミウムおよびビピリジンを液体に添加すること、 e)電極から得られるレドックスシグナルを測定すること。
【0013】
本提案によるプロセスは、液体中に存在する第1のバイオポリマの敏感な検出
を可能にする。プラスチック面を有する電極の使用により、本プロセスが安価に
実行されることが可能になる。特に、本プロセスはまた、液体中における第1の
バイオポリマの定量を可能にする。
を可能にする。プラスチック面を有する電極の使用により、本プロセスが安価に
実行されることが可能になる。特に、本プロセスはまた、液体中における第1の
バイオポリマの定量を可能にする。
【0014】
本明細書において第1および第2のバイオポリマという用語は、特に、タンパ
ク質、ペプチド、DNA、RNA等を意味するものとする。第1のバイオポリマ
は特に、第2のバイオポリマに対して相補的である一本鎖のDNAまたはRNA
であり得る。
ク質、ペプチド、DNA、RNA等を意味するものとする。第1のバイオポリマ
は特に、第2のバイオポリマに対して相補的である一本鎖のDNAまたはRNA
であり得る。
【0015】
第2のバイオポリマは好ましくは、プラスチック面に共有結合される。本提案
による四酸化オスミウムおよびビピリジンの使用とあいまって、特に高い感度が
達成される。
による四酸化オスミウムおよびビピリジンの使用とあいまって、特に高い感度が
達成される。
【0016】
有利な実施態様において、プラスチックは導電性の複合材料、例えばカーボン
ファイバとポリカーボネートの複合体である。電極は、全体がプラスチックから
なることが有利である。そのような電極は、安価なプレス加工により製造可能で
ある。
ファイバとポリカーボネートの複合体である。電極は、全体がプラスチックから
なることが有利である。そのような電極は、安価なプレス加工により製造可能で
ある。
【0017】
さらに、第2のバイオポリマは、好ましくはデキストランまたはポリエチレン
グリコールで形成され電極表面に塗布された、マトリクスに結合されることが可
能である。このタイプのマトリクスの使用は、電極表面の第2のバイオポリマに
よる被覆密度を増大することを可能にする。
グリコールで形成され電極表面に塗布された、マトリクスに結合されることが可
能である。このタイプのマトリクスの使用は、電極表面の第2のバイオポリマに
よる被覆密度を増大することを可能にする。
【0018】
さらなる実施態様において、以下の測定のうちの1つがステップeにおいて実
行される:直流電圧測定、サイクリックボルタンメトリ(cyclovolta
mmetric)測定、クロノアンペロメトリ(chronoamperome
tric)測定、クロノボルタンメトリ(chronovoltammetri
c)測定。さらに、差動パルスボルタンモグラム(differential
pulse voltammogram)またはインピーダンススペクトルをス
テップeにおいて記録し得る。また、ステップeにおいて交流信号を位相敏感的
に測定してもよい。直流電圧信号を、交流信号に重畳してもよい。第1のバイオ
ポリマを定量するために、測定シグナルのピークを介して積分を実行してもよい
。利用可能な定量パラメータはピーク高さとバックグラウンドとの間の分離であ
る。
行される:直流電圧測定、サイクリックボルタンメトリ(cyclovolta
mmetric)測定、クロノアンペロメトリ(chronoamperome
tric)測定、クロノボルタンメトリ(chronovoltammetri
c)測定。さらに、差動パルスボルタンモグラム(differential
pulse voltammogram)またはインピーダンススペクトルをス
テップeにおいて記録し得る。また、ステップeにおいて交流信号を位相敏感的
に測定してもよい。直流電圧信号を、交流信号に重畳してもよい。第1のバイオ
ポリマを定量するために、測定シグナルのピークを介して積分を実行してもよい
。利用可能な定量パラメータはピーク高さとバックグラウンドとの間の分離であ
る。
【0019】
多数の測定を実行するために、電極はステップe後に洗浄あるいは加熱され得
る。電極を加熱することは、第1のバイオポリマの熱変性を容易にする。特定の
第1のバイオポリマは、所定の温度において優先的に結合する。加熱または温度
設定により、プロセスの特異性をさらに増大させることが可能になる。特異性や
ストリンジェント性はまた、液中のpHを適切に設定することによっても増大さ
れ得る。
る。電極を加熱することは、第1のバイオポリマの熱変性を容易にする。特定の
第1のバイオポリマは、所定の温度において優先的に結合する。加熱または温度
設定により、プロセスの特異性をさらに増大させることが可能になる。特異性や
ストリンジェント性はまた、液中のpHを適切に設定することによっても増大さ
れ得る。
【0020】
第1のバイオポリマは、ステップaの前にポリメラーゼ連鎖反応に供されるこ
とが有利である。これにより、特に少量の第1のバイオポリマを検出することが
可能になる。
とが有利である。これにより、特に少量の第1のバイオポリマを検出することが
可能になる。
【0021】
本プロセスを、図面および実施例を参照してより詳細に説明する。
【0022】
図1に、未コーティングの作用電極、一本鎖のオリゴヌクレオチドでコーティ
ングされた作用電極、およびハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドでコーティ
ングされた作用電極の、差動パルスボルタンモグラムを示している。各場合とも
四酸化オスミウムおよびビピリジン処理後におけるものである。作用電極はそれ
ぞれ、好ましくは30%のカーボンファイバおよび70%のポリカーボネートか
ら構成される、カーボン複合材料からなっている。5' −GCC TTC CC
A ACC ATT CCC TTA−3' の配列を含むオリゴヌクレオチドを
、標準的な方法によりカルボジイミドを用いて作用電極表面に共有結合させた。
被覆密度は15fmol/mm2 であった。オリゴヌクレオチドのハイブリダイ
ゼーションを、0.5倍のTBE(トリス、ホウ酸塩、EDTA)0.5M N
aClおよび100fmol/μlの相補オリゴヌクレオチドのバッファ液中に
おいて実行した。ハイブリダイゼーション後、作用電極をストリンジェントに洗
浄した。
ングされた作用電極、およびハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドでコーティ
ングされた作用電極の、差動パルスボルタンモグラムを示している。各場合とも
四酸化オスミウムおよびビピリジン処理後におけるものである。作用電極はそれ
ぞれ、好ましくは30%のカーボンファイバおよび70%のポリカーボネートか
ら構成される、カーボン複合材料からなっている。5' −GCC TTC CC
A ACC ATT CCC TTA−3' の配列を含むオリゴヌクレオチドを
、標準的な方法によりカルボジイミドを用いて作用電極表面に共有結合させた。
被覆密度は15fmol/mm2 であった。オリゴヌクレオチドのハイブリダイ
ゼーションを、0.5倍のTBE(トリス、ホウ酸塩、EDTA)0.5M N
aClおよび100fmol/μlの相補オリゴヌクレオチドのバッファ液中に
おいて実行した。ハイブリダイゼーション後、作用電極をストリンジェントに洗
浄した。
【0023】
この後、未処理の作用電極、一本鎖オリゴヌクレオチドでコーティングされた
作用電極、およびハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドでコーティングされた
作用電極をそれぞれ、2mM OsO4 および13mMビピリジンの溶液に30
秒間浸した。白金の対向電極およびAg/AgClの参照電極を援用し、Eco
chemie PGSTAT 10 Autolabを用いて測定を実行した。
作用電極、およびハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドでコーティングされた
作用電極をそれぞれ、2mM OsO4 および13mMビピリジンの溶液に30
秒間浸した。白金の対向電極およびAg/AgClの参照電極を援用し、Eco
chemie PGSTAT 10 Autolabを用いて測定を実行した。
【0024】
作用電極における標的オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは、電圧
の印加により促進され得る。作用電極表面のオリゴヌクレオチドの被覆密度は、
コーティング中における塩の添加または表面の塩基性前処理によって増大され得
る。例えば、10mM MgCl2 溶液中において85fmol/mm2 の被覆
密度が達成され得る。5M NaOH中3時間の表面の前処理の場合、750f
mol/mm2 の被覆密度が達成され得る。
の印加により促進され得る。作用電極表面のオリゴヌクレオチドの被覆密度は、
コーティング中における塩の添加または表面の塩基性前処理によって増大され得
る。例えば、10mM MgCl2 溶液中において85fmol/mm2 の被覆
密度が達成され得る。5M NaOH中3時間の表面の前処理の場合、750f
mol/mm2 の被覆密度が達成され得る。
【0025】
複数の測定を次々に実行する場合、ステップd後に逆電圧を電極に印加するこ
とができる。さらに、ステップe後に電極を洗浄および/または加熱することが
できる。電極の加熱は、第1のバイオポリマの熱変性を容易にする。ただし、所
定の第1のバイオポリマは特定の温度において結合するため、電極の加熱または
温度設定によりプロセスの特異性をさらに増大させることが可能になる。
とができる。さらに、ステップe後に電極を洗浄および/または加熱することが
できる。電極の加熱は、第1のバイオポリマの熱変性を容易にする。ただし、所
定の第1のバイオポリマは特定の温度において結合するため、電極の加熱または
温度設定によりプロセスの特異性をさらに増大させることが可能になる。
【図1】
作用電極の差動パルスボルタンモグラム測定結果を示す図である。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考)
G01N 27/30 G01N 27/48 A
27/48 Z
33/483 F
33/483 33/53 M
33/53 33/566
33/566 27/46 336G
386G
(81)指定国 EP(AT,BE,CH,CY,
DE,DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,I
T,LU,MC,NL,PT,SE,TR),OA(BF
,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GW,
ML,MR,NE,SN,TD,TG),AP(GH,G
M,KE,LS,MW,MZ,SD,SL,SZ,TZ
,UG,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,
MD,RU,TJ,TM),AE,AG,AL,AM,
AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BR,BY,B
Z,CA,CH,CN,CO,CR,CU,CZ,DE
,DK,DM,DZ,EE,ES,FI,GB,GD,
GE,GH,GM,HR,HU,ID,IL,IN,I
S,JP,KE,KG,KP,KR,KZ,LC,LK
,LR,LS,LT,LU,LV,MA,MD,MG,
MK,MN,MW,MX,MZ,NO,NZ,PL,P
T,RO,RU,SD,SE,SG,SI,SK,SL
,TJ,TM,TR,TT,TZ,UA,UG,US,
UZ,VN,YU,ZA,ZW
(72)発明者 シューライン ユールゲン
ドイツ連邦共和国 エルランゲン 91054
ノイエ シュトラーセ 26
(72)発明者 グラスル ビヨルン
ドイツ連邦共和国 ニュルンベルク
90411 カルル−ヤート−ヴェーク 15
(72)発明者 ハスマン イエルク
ドイツ連邦共和国 エルランゲン 91052
ホフマンシュトラーセ 118a
Fターム(参考) 2G045 AA35 BB51 DA13 FB02 FB05
2G060 AA06 AE17 AF06 AG15 KA07
4B063 QA01 QQ42 QQ52 QQ79 QR08
QR64 QS25 QS34 QS39 QX04
Claims (12)
- 【請求項1】 液体中に存在する第1のバイオポリマの検出および/または
定量プロセスであって、 a)検出されるべき前記第1のバイオポリマに対して特異的な親和性を有する
、第2のバイオポリマでコーティングされたプラスチックからなる面を有する、
電極を用意すること、 b)前記電極を前記液体と接触させること、 c)所定の電圧プログラムを電極に適用することにより、前記第2のバイオポ
リマにおいて前記第1のバイオポリマの濃縮を起こすこと、 d)四酸化オスミウムおよびビピリジンを前記液体に添加すること、 e)前記電極から得られるレドックスシグナルを測定すること。 の工程を有するプロセス。 - 【請求項2】 前記プラスチックは導電性の複合材料である、請求項1に記
載のプロセス。 - 【請求項3】 前記電極は全体がプラスチックからなる、前記請求項のいず
れかに記載のプロセス。 - 【請求項4】 前記第2のバイオポリマは、デキストランまたはポリエチレ
ングリコールで形成され電極表面に塗布されたマトリクスに結合される、前記請
求項のいずれかに記載のプロセス。 - 【請求項5】 以下の測定のうちの1つがステップeにおいて実行される、
前記請求項のいずれかに記載のプロセス:直流電圧測定、サイクリックボルタン
メトリ(cyclovoltammetric)測定、クロノアンペロメトリ(
chronoamperometric)測定、クロノボルタンメトリ(chr
onovoltammetric)測定。 - 【請求項6】 ステップeにおいて差動パルスボルタンモグラム(diff
erential pulse voltammogram)が記録される、請
求項1から3のいずれかに記載のプロセス。 - 【請求項7】 ステップeにおいてインピーダンススペクトルが記録される
、請求項1から3のいずれかに記載のプロセス。 - 【請求項8】 ステップeにおいて交流信号が位相敏感的に測定される、請
求項1から3のいずれかに記載のプロセス。 - 【請求項9】 直流電圧信号をが交流信号に重畳される、請求項5に記載の
プロセス。 - 【請求項10】 前記第1のバイオポリマを定量するために、測定シグナル
のピークを介して積分が実行される、前記請求項のいずれかに記載のプロセス。 - 【請求項11】 多数の測定のために、前記電極はステップe後に洗浄また
は加熱される、前記請求項のいずれかに記載のプロセス。 - 【請求項12】 前記第1のバイオポリマは、ステップaの前にポリメラー
ゼ連鎖反応に供される、前記請求項のいずれかに記載のプロセス。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE10009715 | 2000-03-01 | ||
DE10009715.4 | 2000-03-01 | ||
PCT/DE2001/000736 WO2001065246A1 (de) | 2000-03-01 | 2001-02-28 | Quantifizierung von in einer flüssigkeit enthaltenen zielmolekülen |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2003525449A true JP2003525449A (ja) | 2003-08-26 |
Family
ID=7632936
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2001563893A Pending JP2003525449A (ja) | 2000-03-01 | 2001-02-28 | 液体中に存在する標的分子の定量 |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
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EP (1) | EP1264172A1 (ja) |
JP (1) | JP2003525449A (ja) |
AU (1) | AU2001242274A1 (ja) |
CA (1) | CA2401830A1 (ja) |
WO (1) | WO2001065246A1 (ja) |
Families Citing this family (9)
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