JP2003525206A - 低用量ＩＬ−１βによる網膜異形成を伴わない光受容細胞の救済を誘発する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、＜５０μg/ml、好ましくは＜１０μg/mlの低用量のＩＬ−１βが、網膜異形成や眼内炎症などのＩＬ−１βによる破壊的な後遺症を最小限に抑えながら、光受容細胞などのニューロン細胞の救済を誘発しうるという発見に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （関連出願の相互参照） 本出願は、１９９９年５月６月に出願した米国仮出願６０／１３２８５５から
優先権を主張する。これを参考としてここに記載する。

【０００２】 （連邦政府委託研究または開発に関する陳述）

【０００３】 （発明の分野） 本発明は、光受容細胞および疾患または損傷を受けやすいその他のニューロン
細胞を救済する方法に関する。

【０００４】 （発明の背景） 研究者たちは、損傷または病理学的過程によるニューロン細胞死のために発現
する多くの神経学的障害の原因の研究に長年にわたり焦点を合わせてきた。研究
分野の一つは、網膜光受容細胞（ＰＲＣ）であった。網膜光受容細胞は、極めて
特殊な細胞タイプであり、広範囲な微環境での損傷や様々な特異的な遺伝子異常
の影響を受けやすい（J.Stoneら、など）。げっ歯類およびヒトの両方において
、光受容細胞の変性に関連のある突然変異には、ＰＲＣ外部セグメントに対して
特異的な遺伝子（Allikmetsら、Bird、Kohlら、など）または隣接する網膜色素
上皮細胞（ＰＲＥ）およびブルッフ膜の支持的役割に対して重要な遺伝子（Mull
en、Chaitinら、Weberら、S.M. Stoneら、Cayouetteら、など）が関与している
ことが多い。特異的突然変異によるPRCアポトーシス（細胞死）のきっかけとな
る分子イベントは、現在のところ、完全には解明されていない（Adler、Travis
、Cideciら、Jomaryら、J. Stoneら、など）。

【０００５】 ＰＲＣ変性の原因は数多くあるものの、アポトーシス過程が効果的に改善また
は回避されるモデルはほとんど開発されていない。これらのモデルの中で注目に
値するものは、遺伝子治療が生殖細胞レベルで効果を示した形質転換マウス種で
ある（Chenら、Hafeziら、Tsangら、など）。しかしながら、形質転換法は、た
とえ効果的であっても、既存疾患を阻止する手段とはならない。

【０００６】 もう一つの方法は、外因性栄養因子の使用を検討することであった。ラット実
験では、数多くのファミリーの代表（成長因子、サイトカインおよびニューロト
ロピン）を含む様々な組換え遺伝子製品によりＰＲＣ生存率が上昇しうることが
証明された（Faktorovichら、1990年および1992年；LaVailら）。これらの中で
最も効果的であったものは、酸性線維芽細胞成長因子（αＦＧＦ）、塩基性線維
芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、毛様体神経栄
養因子（ＣＮＴＦ）およびインターロイキン−1ベータ（ＩＬ−１β）である。
現在まで、局所的損傷による外因性および内因性誘導の両方によるｂＦＧＦとＰ
ＲＣの救済の関連付けに対して、特に注目が寄せられてきた（Faktorovichら、1
990年および1992年；LaVailら；Rakoczyら、Hackettら、Wenら、Fontaineら、Ak
imotoら、など）。しかしながら、現在のところ、栄養因子の有用性は、破壊的
な副作用のため、限定されている。

【０００７】 例えば、もう一つの損傷関連メディエーターであるインターロイキン−１ベー
タ（ＩＬ−１β）は、光損傷を受けた光受容細胞の救済に関連があることが明ら
かになっている。しかしながら、多量のＩＬ−１βを投与したところ、このサイ
トカインの強力な炎症前駆作用に関連があると思われる、網膜細胞構築の広範な
破壊が生じた（LaVailら、ＩＬ−１β ０．５μg/μlを１.０μl大量硝子体内注
入）。従来技術により、ＩＬ−１βを硝子体内および眼内投与すると、マクロフ
ァージ単核／多形核白血球の増加を介して、血管血液網膜関門（ＢＲＢ）の崩壊
を伴う網膜炎症反応が生じることが明らかになった。したがって、ＩＬ−１βは
、主にヒト網膜炎の病的発生における因子であるとみなされ（Bamforthら、1997
年および1997a年）、実験的網膜炎を誘発するのに用いられている。これらの従
来技術において得られたＩＬ−１β投与による破壊的な後遺症に関する知見から
、治療効果が明らかに限定されていることを考慮し、ニューロン細胞救済の現象
におけるその役割を検討することは断念した。

【０００８】 驚くべきことであるが、ＩＬ−１βを十分に低用量で使用した場合、その神経
保護的な役割は催炎作用にまさっているという１番目の証拠をここに提示する。

【０００９】 （簡単な発明の要約） 本発明は、ＩＬ−１βを十分に低用量で使用した場合、光受容細胞の救済が誘
発され、以前に５０〜１０００倍の高用量で観察された破壊的な後遺症が最小限
に抑えられるという発見に関する。本発明では、その破壊的な後遺症を軽減また
は阻止するようにデザインされた、低用量ながら十分な細胞救済作用を示すＩＬ
−１を用いる。詳細には、本発明は、異栄養性部位における神経組織の実質的な
異形成を引き起こすことなくニューロン細胞を救済させるのに効果的である、十
分に低用量のインターロイキン−１ベータ（ＩＬ−１β）から成る組成物を、少
なくとも１つの異栄養性神経細胞部位に局所投与して、異栄養性神経細胞部位の
ニューロン細胞を救済する方法に関する。

【００１０】 （発明の詳細な説明） 本発明は、異栄養神経組織部位のニューロン細胞を救済するとともに、高用量
のＩＬ−１βの有害な副作用を阻止または最小限におさえるのに効果的な低用量
のインターロイキン−１ベータ（ＩＬ−１β）を異栄養神経組織部位に局所投与
する方法に関する。詳細には、異栄養部位の神経組織の実質的な異形成または損
傷を引き起こさずに、ニューロン細胞を救済するのに効果的な低用量のＩＬ−１
βから成る組成物を局所投与する方法に関する。異栄養神経組織部位は、異栄養
網膜、脊髄欠損または損傷、脳卒中による脳病変またはＣＮＳ内の病変部位また
は損傷部位などである。「異栄養」という用語は、損傷組織だけではなく、遺伝
的または病原的な病変組織を包括する。

【００１１】 異栄養網膜の治療の場合、低用量（＜約５０μg/ml）のＩＬ−１βを投与する
と、網膜ロゼットや網膜ひだなどの異形成および外顆粒層（ＯＮＬ）におけるそ
の他の形成異常を実質的に引き起こすことなく、そうでなければアポトーシスに
至る運命の網膜光受容細胞を救済することができる。「救済」とは、残りの機能
的ニューロン細胞の保護、すなわち、これらの細胞におけるプログラムされた細
胞死（アポトーシス）の阻止または遅延を意味する。

【００１２】 ＩＬ−１βの投与量は、好ましくは＜約５０μg/ml、より好ましくは＜約２０
μg/ml、好都合には＜１０μg/mlである。低用量ＩＬ−１βの濃度は、０．０１
〜１０μg/mlの範囲内としてもよい。これらの投与量は、ヒト組換えＩＬ−１β
（R&D Systems, USA）の特異的作用を参考にしている。投与する特殊なＩＬ−１
βの濃度特異的作用を調整することは、当業者の権限内である。

【００１３】 低用量ＩＬ−１βの眼への局所投与時には、硝子体内注入を用いてもよい。例
として、約０.１〜１０μl、好ましくは０．５〜２μlを大量投与する。脊髄治
療時には髄腔内注入、脳病変治療時には頭蓋内注入を用いてもよい。また、低用
量ＩＬ−１βの組成物は、直接的な注入または適用により、異栄養神経部位に局
所投与してもよい。代替方法として、神経組織部位またはその周辺領域への到達
時にのみ、≦５０μg/mlのＩＬ−１βが放出されるようにデザインされた経口製
剤または静注製剤などの標的を定めた薬物送達溶媒を用いることもできる。代替
方法として、本組成物の局所投与は、異栄養神経組織部位において長時間にわた
り≦５０μg/mlのＩＬ−１βを局所的に放出する徐放性の薬物送達溶媒を用いて
行うこともできる。

【００１４】 ＩＬ−１βは、単離・精製された製品または組換え製品である。必ずというわ
けではないが、使用するＩＬ−１βは治療対象と同一の動物種に由来しているこ
とが好ましい。しかしながら、本発明にしたがって哺乳類の治療を行う場合には
、どのような哺乳類のＩＬ−１βを用いてもよい。

【００１５】 一般的な神経保護剤としての低用量ＩＬ−１βの使用は、それが遺伝、変性性
、外傷後性、虚血性または毒性であるにかかわらず、中枢神経系内のニューロン
欠損に関連する症状に適用することができる。本発明の本方法による治療から利
益を得うる特異的疾患には、脳卒中、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎
縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脳外傷、脳性麻痺、様々な小脳性運動失調症および
脊髄外傷がある。また、低用量ＩＬ−１βは、一般的な手術の補助療法、特にＣ
ＮＳ腫瘍治療の補助療法として、正常ニューロン細胞の神経保護を促進して、侵
襲的措置または細胞破壊的な方法の使用よりも優れた効果を発揮する。

【００１６】 低用量ＩＬ−１βの治療の影響を受けやすい網膜異栄養症の例には、全てのタ
イプの色素性網膜炎、全ての錐体異栄養症、全ての既知または未知のＲＰＥに基
づく異栄養症、黄斑などのその他の網膜変性が含まれる。緑内障、網膜剥離およ
びその他の視神経症では、網膜神経節細胞の消失も発現する。これらの疾患も、
低用量ＩＬ−１βの局所投与により改善しうる。網膜剥離の場合、ＩＬ−１βの
投与は、網膜再剥離前あるいは網膜再剥離と同時に網膜ＰＲＣを保護するための
補助療法となるものと考えられる。

【００１７】 また、低用量ＩＬ−１βの局所投与は、ａ）破壊性炎症性の後遺症を減少させ
る補助的な治療法（細胞毒性Ｔリンパ球またはＮＫ細胞活性を選択的に阻害する
方法など）、あるいは、ｂ）神経保護作用を増強させる補助的な治療法（転写因
子ＮＦｋＢの発現、ＮＦｋＢ遺伝子産物の機能または選択的な「ダウンストリー
ム」神経保護遺伝子を直接的または間接的に操作する方法など）と併用しても有
用である。

【００１８】 また、本発明は、包装材料およびその包装材料に含まれる局所投与部位である
異栄養性神経組織部位のニューロン細胞を救済するのに効果を示すＩＬ−１βを
構成する組成物から成る工業製品も包括している。この組成物は、＜約５０μg/
mlの低用量ＩＬ−１βから構成されることが好ましい。この包装材料は、この組
成物は、その局所投与部位である異栄養性神経組織部位に残存するニューロン細
胞を救済し、投与により生じた異栄養性神経組織部位の神経組織の異形成を最低
限に抑えるために用いうることを示すラベルから構成される。網膜異栄養症の治
療を目的とする場合、この包装材料には、この組成物は、実質的な網膜異栄養症
を引き起こさずに、光受容細胞を救済するために使用するものであると記載また
は通告してもよい。

【００１９】 本発明は、以下の非限定的な実例を用いて詳細に説明する。本発明は、開示さ
れる実施例に限定されないが、請求項に記載される本発明の精神および範囲内に
属する全ての変形形態を包括する。

【００２０】 実施例Ｉ 方法材料

【００２１】 Royal College of Surgeon （ＲＣＳ）ラット：３〜４週齢の異栄養有色ラッ
ト（rdy⁻p⁺）、異栄養ピンク色眼ラット（rdy⁻p⁻）およびコンジェニックラ
ット（rdy⁺p⁻）。ＮＩＨおよびＡＲＶＯ実験動物ガイドラインにしたがって、
動物を馴化させた。ＲＣＳラットは、アポトーシスおよび光受容細胞変性による
先天性網膜異栄養症のモデルである（Ｔｓｏら）。

【００２２】 実験操作 硝子体内注入は、シグマコート（登録商標）でコーティングされた細い勾配付
きの平型のガラス製微量ピペットを用いて行った。このピペットをポリエチレン
製チューブを介して１０μlハミルトンシリンジに接続し、この器具にＰＢＳを
充填した。注入前に、ピペットにエアロックを取りつけ、濃度希釈を防止した。

【００２３】 実験例１では、３種のＲＣＳラット、すなわち、異栄養有色ラット、異栄養ア
ルビノラットまたは非異栄養コンジェニックラットを用いた。全てのラットは、
3週齢であった。

【００２４】 各動物種のそれぞれ３匹に対して、３用量（０．５、２および５μg/ml）のい
ずれか１つの用量のＩＬ−１βまたはＰＢＳを左眼硝子体に１μl大量注入した
。合計３６匹に対して投与を行った。ＩＬ−１βはマウス由来であった（R&D Sy
stems, USA）。注入４週間後、動物に過剰用量（２g/kg体重）のペントバルビタ
ールナトリウムを投与して安楽死させ、眼を摘出した。摘出眼は、４℃で１晩か
けて２％グルタルアルデヒド／１％パラホルムアルデヒド中で液浸固定した。次
に、前房部分（角膜、虹彩、水晶体など）を剥離し廃棄した。アイカップを凍結
保護のために３０％ショ糖／ＰＢＳ溶液に移し入れて１晩放置し、ＯＣＴ（Tiss
ue-Tek（登録商標））に包埋し、低温切出しのために凍結させた。視神経が存在
する眼中央部から厚さ６μmの切片を切り出し、ヘマトキシリンおよびエオシン
（H&E）で染色した。次に、スライドを観察し、光受容細胞数を計数した。

【００２５】 実験例２では、４週齢の異栄養有色ＲＣＳラットに対して、ＩＬ−１β（５μ
g/ml；n＝５）またはｂＦＧＦ（１０００μg/ml；n＝５）のいずれかを、硝子体
内注入（０．５〜５．０μl、好ましくは１.０〜２．０μlを大量注入）した。
ＩＬ−１βおよびｂＦＧＦは、ヒト組換え型であった（それぞれR&D Systems, U
SAおよびPromega）。注入４週間後、動物に過剰用量のペントバルビタールナト
リウムを投与して安楽死させ、眼を摘出した。摘出眼は、４℃で１晩かけて４％
パラホルムアルデヒド中で液浸固定した。アイカップを剥離し、凍結保護のため
に３０％ショ糖／ＰＢＳ溶液に移し入れて１晩放置し、ＯＣＴ（Tissue-Tek（登
録商標））に包埋し、低温切出しのために凍結させた。眼中央部から厚さ６μm
の切片を切出し、H&E染色し、光受容細胞数を計数した。実験例2で得られた切片
について、赤血球を除く全ての造血細胞のマーカーであるＣＤ４５の免疫染色を
行った（１：５０；Pharmingen, USA）。ＣＤ４５染色は、Ｃｙ３免疫蛍光法を
用いて視覚化した（１：１５０；Jackson、USA）。

【００２６】 ＩＬ−１β注入後の炎症反応の徴候を観察するために、さらに３週齢の異栄養
有色ＲＣＳラット３匹に対して、ＩＬ−１β（５μg/ml）を右眼硝子体内に注入
した。左眼は、時間をマッチングさせた対照とした。注入２４、４８および７２
時間目に動物を安楽死させ、眼を摘出し、４℃で１晩かけて４％パラホルムアル
デヒド中で液浸固定した。摘出眼を半側切断し、その半分はヒストレジン（Leic
a Instruments GmbH, Germany）で処理し、もう半分は低温切出しのためにＣＤ
４５免疫組織化学法により処理した。さらに、別の動物に対して、ＩＬ−１β（
５μg/ml）またはｂＦＧＦ（１０００μg/ml）を注入し、４週間後に安楽死させ
、前記の方法で眼の処理を行った。

【００２７】 計数に関するプロトコール 図１は、それぞれの網膜の光受容細胞数の計数に用いるサンプリング過程の立
体図である。光受容細胞プロファイルの数は、６つの網膜領域（上部周辺、上部
、上部中央、下部中央、下部および下部周辺）のそれぞれに対して、３つの５０
μmビンを用いて計数した。各眼について、３つの切片の分析を行った。各領域
に対して合計９サンプル、各眼に対して合計５４サンプルの分析を行った。最初
のサンプルは鼻側切片の上部領域、最後のサンプルは、側頭側切片の下部領域か
ら採取した。採取した全ての切片には、視神経が含まれており、比較的中央に位
置していた。

【００２８】 分析 光受容細胞数に対する全てのＩＬ−１β濃度および擬似注入の影響をＡＮＯＶ
Ａを用いて比較した。この統計的検討は、ｂＦＧＦに対するＩＬ−１βの影響を
比較するのにも用いた。

【００２９】 結果ＩＬ−１βによる用量依存的な光受容細胞の救済 図２Ａ−Ｂは、様々な薬剤を投与した異栄養有色ラットにおける平均光受容細
胞数を示している。図２Ａは、異栄養有色ラットから成る５つの投与群における
５０μm当たりの平均光受容細胞数を示している。ＩＬ−１β ５μg/ml投与群で
は、他の全ての投与群に比べて、光受容細胞数が有意に多かった（*＝p＜０．０
５；Student-Newman-Keuls post-hoc検定）。ＩＬ−１β ２μg/ml投与群では、
無投与群に比べて、光受容細胞数が有意に多かった（＋＝p＜０．０５；Student
-Newman-Keuls post-hoc検定）。ＩＬ−１β ０．５μg/ml投与群では、媒質投
与群または無投与群に比べて、光受容細胞数が有意に多かった（‡＝p＜０．０
５；Student-Newman-Keuls post-hoc検定）。

【００３０】 図２Ｂは、全ての投与群における網膜の各領域（上部領域から下部周辺領域）
に含まれる５０μm当たりの平均光受容細胞数を示している。各領域についてANO
VA検定を行ったところ、網膜上部周辺領域（*＝p＝０．０００９；df４、１１；
Ｆ＝１０．７４８）および下部周辺領域（＋＝ｐ＝０．００２９：df４、１１；
Ｆ＝７．９６２）では、ＩＬ−１βによる光受容細胞数の有意な増加が認められ
た。上部周辺領域については、５μg/ml投与群では、他の全ての投与群に比べて
、光受容細胞数が有意に多かった（*＝p＜０．０５；Student-Newman-Keuls pos
t-hoc検定）。下部周辺領域については、５μg/ml投与群では、無投与群、媒質
投与群およびＩＬ−１β ０．５μg/ml投与群に比べて、光受容細胞数が有意に
多かったのに対し、２μg/ml投与群では、無投与処置群に比べて光受容細胞数が
有意に多かった（*＝p＜０．０５；Student-Newman-Keuls post-hoc検定）。

【００３１】 要約すると、注入後４週間目に有色ＲＣＳラットの眼を観察したところ、ＩＬ
−１β注入眼では、生存光受容細胞数に統計学的有意差が認められた（p＜０．
０００１；Ｆ＝９．４８８；df＝４、９１；図２Ａ参照）。ＩＬ−１β高用量群
（５μg/ml）では、他の全ての投与群に比べて、光受容細胞数が有意に多かった
（有意水準５％でのStudent-Newman-Keuls post-hoc検定）。ＩＬ−１β中用量
群（２μg/ml）および低用量群（０．５μg/ml）では、無投与群に比べて、多く
の光受容細胞が救済された（Student-Newman-Keuls post-hoc検定）。また、Ｉ
Ｌ−１β低用量群でも、媒質投与群に比べて、光受容細胞数の増加が認められた
。媒質投与群では、有意な影響は認められなかった（Student-Newman-Keuls pos
t-hoc検定）。

【００３２】 これらの影響は、網膜の各領域の細胞数を比較した場合にも、依然としてある
程度顕著であった（図２Ｂ）。ＩＬ−１β高用量群（５μg/ml）では、網膜上部
および下部周囲領域の両方において、光受容細胞数が有意に多かった。２つのＩ
Ｌ−１β低用量群（０．５または２μg/ml）でも、光受容細胞の増加傾向が見ら
れ、それぞれのケースにおける程度には高用量群で見られた程度との漸増的な関
連性が認められた。しかしながら、これらの投与群のいずれにおいても、特定の
領域における有意な影響は認められなかった。

【００３３】 緩衝液のみを硝子体内注入した場合には何の影響も認められなかったことから
（有意ではなかったものの）、ピンク色眼ラットとの比較を目的として、媒質注
入眼のＰＲＣ数をベースライン値として用いた（結果については図３Ａ−Ｂ参照
）。このアプローチを用いたところ、異栄養ピンク色眼ＲＣＳラットの眼におけ
るＰＲＣ数は依然として有意であった（p＜０．０００６；Ｆ=６．５０７；df＝
３、６８；図３Ａ）。図３Ａは、異栄養アルビノラットから成る４つの投与群に
おける５０μm当たりの平均光受容細胞数を示している。ＩＬ−１β ５μg/ml投
与群では、媒質投与群またはＩＬ−１β ０．５μg/ml投与群に比べて、光受容
細胞数が有意に多かった（*＝p＜０．０５；Student-Newman-Keuls post-hoc検
定）。ＩＬ−１β ２μg/ml投与群では、媒質投与群に比べて、光受容細胞数が
有意に多かった（＋＝p＜０．０５；Student-Newman-Keuls post-hoc検定）。

【００３４】 ２つのＩＬ−１β高用量群では、両群において、媒質投与群に比べて、光受容
細胞数が有意に多かった；ＩＬ−１β最高用量群では、最低用量群に比べて、救
済された光受容細胞数が有意に多かった（Student-Newman-Keuls post-hoc検定
）。これらの影響は、網膜の各領域における違いにも反映された（図３Ｂ）。図
３Ｂは、全ての投与群における、網膜の各領域（上部領域から下部周辺領域）に
含まれる５０μm当たりの平均光受容細胞数を示している。各領域についてＡＮ
ＯＶＡ検定を行ったところ、網膜下部領域（＋＝p＝０．０２７８；df＝３、８
；Ｆ＝５．１９６）および網膜下部周囲領域（*＝p＝０．０４２５；df＝３、８
；Ｆ＝４．３６３）には、ＩＬ−１βによる光受容細胞数の有意な増加が認めら
れた。網膜下部領域および下部周辺領域の両方について、５μg/ml投与群では、
媒質投与群に比べて、光受容細胞数が有意に多かった（*および＋＝p＜０．０５
；Student-Newman-Keuls post-hoc検定）。

【００３５】 しかしながら、この場合にも、網膜領域間に傾向性が認められたものの、各領
域の分析において有意な影響が認められたのは周辺領域のみであった。詳細には
、下部領域（p＝０．０２７８；Ｆ＝５．１９６；df＝３、８）および下部周辺
領域（p＝０．０４２５；Ｆ＝４．３６３；df＝３、８）ではＩＬ−１β投与の
影響が認められ、最高用量群では、媒質投与群に比べて、光受容細胞数が有意に
多かった（Student-Newman-Keuls post-hoc検定）。

【００３６】ＩＬ−１βおよびbFGFに誘発される光受容細胞の救済の比較 図４Ａ−Ｃ（H&E染色しヒストレジン包埋した異栄養有色ＲＣＳラットの網膜
切片）に示すように、ＩＬ−１βおよびｂＦＧＦは、両方とも、顕著なＰＲＣの
救済と関連していた。図４Ａは、媒質注入４週間目における媒質注入眼の例であ
る。実質的な光受容細胞の消失が認められ、外顆粒層（ＯＮＬ）では厚さにして
細胞２〜３個の減少が認められる。図４Ｂは、最高用量（５μg/ml）のＩＬ−１
β注入後４週目の例であり、ＯＮＬの良好な保存状態が認められる。図４Ｃは、
ｂＦＧＦ注入後４週間目のｂＦＧＦ注入眼の例であり、ＩＬ−１β注入眼と同等
の救済レベルが認められる。

【００３７】 このように、ＩＬ−１β最高用量群（５μg/ml）では、緩衝液注入対照に比べ
て、有意な光受容細胞数の増加が認められた（ＡＮＯＶＡ；p＜０．０００１；
Ｆ＝２１．６４６；df＝２、７２）。さらに、６つの網膜領域全てにおいて、光
受容細胞数は多かった。また、２つの低用量群（２μg/mlおよび０．５μg/ml）
でも、ＰＲＣ救済が誘発された。

【００３８】 最大効果の観点から、ｂＦＧＦと比較すると、ＩＬ−１βは明らかな利点（p
＜０．０００１；Ｆ＝２０．６７５；df＝２、８７；データ提示せず）を示した
ものの、結果はこれらの２つの分子に対して同等であった。ここではｂＦＧＦに
ヘパリンを添加しなかった点に注意することが重要である。したがって、今回得
られたｂＦＧＦデータは、LaVailらの先の報告とは一致していない。

【００３９】 さらに、本試験では、低用量ＩＬ−１βの用量反応相関も検討した。図２およ
び３に示すように、本試験で得られたＰＲＣ救済レベルは、硝子体内投与量と正
の相関を示した。注意すべきことであるが、低用量ＩＬ−１βは、LaVailらが用
いたよりも１００〜１０００倍低い用量であったにもかかわらず、有意なＰＲＣ
救済レベルと関連があった。より重要なことであるが、本実験で用いた低用量の
ＩＬ−１βは、LaVailらが高用量のＩＬ−１βまたはｂＦＧＦを使用した後に観
察された合併症である網膜異形成（ロゼット、網膜ひだおよびその他の網膜外顆
粒層の局所的な破壊）を引き起こすことはなかった。

【００４０】ＩＬ−１β硝子体内投与による炎症反応の一時性 本試験では、最高用量（５μg/ml）のＩＬ−１βを硝子体内投与した場合の炎
症反応の程度および継続期間を調べるために、投与後期間早期に動物の観察を行
った。

【００４１】 投与後２４時間目、網膜内および注入部位周辺（上部周辺領域）の硝子体には
、かなりの白血球浸潤が認められた。この浸潤は、数多くの小さなＣＤ４５陽性
（ＣＤ４５＋）細胞から構成されていた（図５Ａ−Ｂ）。これとは対照的に、こ
の測定時点では、注入部位から離れた網膜に含まれていたＣＤ４５＋細胞は比較
的少なかった（図５Ｃ−Ｄ）。（図５は、ＩＬ−１β注入後２４時間目における
ＣＤ４５染色（ＡおよびＣ）およびH&E染色（ＢおよびＤ）した異栄養有色ＲＣ
Ｓラットの網膜低温切片を示している。白血球浸潤は、注入領域および上部周辺
領域（ＡおよびＢ）で極めて顕著に認められるが、網膜中央領域（ＣおよびＤ）
ではそれほど顕著ではない）

【００４２】 注入後４８時間までに、網膜の白血球浸潤は顕著に増加した（図６Ａ−Ｄ）。
（図６は、ＩＬ−１β注入後４８時間目におけるＣＤ４５染色（ＡおよびＣ）お
よびH&E染色（ＢおよびＤ）したＲＣＳラットの網膜低温切片を示している。白
血球浸潤は、網膜全体において高レベルに達した。網膜中央領域（ＣおよびＤ）
では、２４時間目からの最大変化が認められ、白血球数のかなりの増加が認めら
れる）

【００４３】 注入後７２時間目には、ＣＤ４５＋細胞数は落ち着きはじめた。これは、中央
領域でも認められたが、網膜周辺領域において特に顕著であった（図７Ａ−Ｄ）
。（図７は、ＩＬ−１β注入後７２時間目におけるＶＤ４５染色（ＡおよびＣ）
およびH&E染色（ＢおよびＤ）したＲＣＳラットの網膜低温切片を示している。
網膜周辺領域（ＡおよびＢ）および網膜中央領域（ＣおよびＤ）の両方では、白
血球数が減少しはじめた。しかしながら、依然として、かなり多くのＣＤ４５＋
細胞が認められる（Ａ＆Ｃ））。

【００４４】 注入後４週目には、ＩＬ−１β注入眼の硝子体または網膜に残存するＣＤ４５
＋細胞は認められなかった（図８Ｂ）。この測定時点では、ｂＦＧＦ注入眼でも
ＣＤ４５＋細胞は認められなかった（図８Ｃ）。（図８Ａ−Ｃは、ＣＤ４５染色
した異栄養有色ＲＣＳラットの網膜低温切片を示している。図８Ａは注入後４週
目の媒質注入眼、図８Ｂは注入後４週間目のＩＬ−１β注入眼、図８Ｃは注入後
４週目のｂＦＧＦ注入眼を示している。全てのケースにおいて、ＣＤ４５は低レ
ベルであり、このことは、浸潤している白血球が極めて少ないことを示している
）

【００４５】 ここに提示した結果から、外因性ＩＬ−１βおよびｂＦＧＦの両方は、ラット
において、実質的な光受容細胞の救済を誘発することがわかる。しかしながら、
これらの結果は、低用量ＩＬ−１βが、従来技術において高用量注入時に見られ
た随伴性網膜異形成を引き起こさずに、ＰＲＣを救済するということを初めて示
した結果である。「低用量」ＩＬ−１βとは、＜約５０μg/ml、好ましくは＜２
０μg/ml、好都合には＜１０μg/mlの局所投与時の濃度を指す。これらの濃度は
、ヒト組換え型ＩＬ−１β（R&D Systems, USA）の特異的作用を参考にしている
。

【００４６】 ここに記載した低用量ＩＬ−１βの投与は、ｂＦＧＦ投与時よりも１００〜１
０００倍も低い濃度で光受容細胞を救済する強力な誘発物質である（Faktorovic
hら、1990年）。

【００４７】 神経栄養因子としてのｂＦＧＦの役割（Echenstein、など）は、炎症カスケー
ドにおけるＩＬ−１βの役割（Dimarello）と同様に、十分に確立されている。
炎症前駆シグナルにより、新たなサイトカインおよび創傷修復にとって重要な栄
養因子の発現が誘発されるという機序は、解明されはじめたところである。この
流れにおいて、ＩＬ−１βは、ＣＮＳを含む様々な設定におけるｂＦＧＦの強力
な誘発物質である（Aravjoら、Riveraら）。ＩＬ−１βの存在により、グリア細
胞によるｂＦＧＦ産生は促進される。これにより、ここで観察されるように、Ｉ
Ｌ−１βは低用量であっても神経保護作用を示すということの一つの可能性のあ
る説明が得られる。

【００４８】 さらに、ＩＬ−１βまたはｂＦＧＦの硝子体内注入は、網膜における単核細胞
の発現率を増加させることが観察されている（Faktorovish、1990年；LaVailら
）。単核細胞、特に活性化マクロファージは、ＩＬ−βおよびｂＦＧＦの両方を
分泌する（Avronら、Bairdら）。また、これらの因子は、一度存在すれば、それ
自身の発現を誘発する能力があるという証拠もある（Mauvielら、Flott-Rahmeら
）。したがって、（ａ）どちらかの因子（ＩＬ−１βまたはｂＦＧＦ）を網膜周
囲領域に局所投与すると、両方の因子の濃度の増加が誘発され、（ｂ）in vivo
では、１つの因子の作用は、ある程度、もう１つの因子の存在を反映するものと
考えられる。

【００４９】 興味深いことであるが、ＩＬ−１βおよびｂＦＧＦは、両方とも、様々な動物
種に存在するものの、損傷に関連したＰＲＣの救済は、比較的軽度の微小環境で
の損傷に伴い、網膜内でｂＦＧＦの顕著な発現が起こる動物であるラットにおい
て、特に顕著である（Wenら、Caoら）。ｂＦＧＦの役割に対するケースは広範囲
に及んでおり、ＩＬ−１βの偏在性、効力および栄養因子（ｂＦＧＦを含む）を
アップレギュレートする能力から、ＩＬ−１βは低用量であったとしてもＰＲＣ
救済に顕著に寄与するものと示唆される。

【００５０】ＩＬ−１βの細胞に対する影響 サイトカインのＩＬ−１ファミリーは、ＦＧＦファミリーとかなりの配列相同
性を共有しており、両方のファミリーは共通する祖先遺伝子の複製により生じた
ものと提言されている（Zhangら）。ＩＬ−１βは、炎症カスケード早期におい
て主要な役割を果たす分泌型のＩＬ−１ファミリーメンバーである（Dinarello
）。典型的な状況下では、過剰増殖による炎症はそれ自体が組織損傷の原因であ
るものの（Geigerら、Jeohnら、Anderssonら、Theofilopoulosら）、炎症反応は
、組織再生および修復の初期過程であるとみなすこともできる。この流れにおい
ては、ＩＬ−１βの神経毒性作用と神経保護作用が矛盾していると考えなくても
よい。

【００５１】 現在まで、一連の研究では、ＩＬ−１βは神経病理学的過程に関連付けられて
きた（Jeohnら、Rothwellら、Toulmondら、Downenら、Downenら、Pearsonら）。
ＩＬ−１βは、様々な他の薬剤の破壊的な影響を増強する。特に、ＩＬ−１βと
酸化窒素（ＮＯ）の併用時には、培養ニューロンに対する細胞毒性が生じる（Ch
aoら、1996年；Huら）。数人の研究者らが、in vitro（Gahringら）およびin vi
vo（LaVail：Klusmanら；Wangら）におけるこのサイトカインのいくつかの神経
保護作用を報告しているものの、ＩＬ−１βの破壊的な影響を伴うことがわかっ
ている。これとは対照的に、今回得られた結果は、低用量のＩＬ−１βは、投与
部位である神経組織の実質的な異形成を引き起こさずに、主要な神経保護作用を
発揮することを示す初めての結果である。

【００５２】 ＩＬ−１βが神経保護作用を発揮する機序には、ＩＬ−１ＲＩ受容体（Ohtsuk
iら）、転写因子であるＮＦｋＢ（Yuら）、含蓄的にではあるが「ダウンストリ
ーム」遺伝子の発現が関与しているものと考えられる。また、興味深いことであ
るが、ＮＦｋＢは、活性化マクロファージによる数多くの炎症前駆サイトカイン
の発現にも関与しており（Kellyら）、そのいくつかは神経保護にも関与してい
た（Carlsonら、Klusmanら）。

【００５３】 したがって、ＩＬ−１βが有する多くの機能の一つは、炎症反応それ自体を含
む様々な有害な刺激に直面した時に細胞生存を促進する役割を果たす細胞の反応
である、早期警告またはストレスシグナルの機能であると考えられる（Netaら、
Leeら、Galcheva-Gargovaら、Hanら）。おそらく機能不良のためにこの保護モー
ドに入らなかった細胞は、炎症反応の増強に伴い、細胞死増加のリスクにさらさ
れたであろうと考えられる。⁷⁸中枢神経系（ＣＮＳ）のニューロン（ＰＲＣ細胞
により例示）は、置換の影響を受けにくいため、低用量ＩＬ−１βに反応し、顕
著な抗アポトーシス反応を示す。このサイトカインのその他の影響に関しては、
おそらく増幅カスケードの一環として複数の新しい遺伝子が誘発されることによ
り、保護反応が生じるものと考えられる。

【００５４】光受容細胞の救済 低用量ＩＬ−１βによるＰＲＣ生存の促進は、遺伝的エラーにより、広範な光
受容細胞アポトーシスおよび重度の視力障害を引き起こす網膜異形成症に対して
特に興味深い（Bird；Stone Jら）。

【００５５】 ここに教示した低用量ＩＬ−１β投与の有効性にとっては重大ではないものの
、観察されたＰＲＣ救済作用は既存の光受容細胞の生存延長を示していると考え
られる。参考文献

【図面の簡単な説明】

【図１】 それぞれの網膜の光受容細胞数の計数に用いるサンプリング過程
の立体図である。

【図２Ａ−Ｂ】 様々な薬剤を投与した異栄養有色ラットにおける平均光受
容細胞数を示している。

【図３Ａ−Ｂ】 様々な薬剤を投与した異栄養アルビノラットにおける平均
ＰＲＣ数を示している。

【図４Ａ−Ｄ】 H&E染色しヒストレジン包埋した異栄養有色ＲＣＳラット
の網膜切片を示している。

【図５】 ＩＬ−１β注入後２４時間目におけるＣＤ４５染色（ＡおよびＣ
）およびH&E染色（ＢおよびＤ）した異栄養有色ＲＣＳラットの網膜低温切片を
示している。

【図６Ａ−Ｄ】 ＩＬ−１β注入後４８時間目におけるＣＤ４５染色（Ａお
よびＣ）およびH&E染色（ＢおよびＤ）したＲＣＳラットの網膜低温切片を示し
ている。

【図７Ａ−Ｄ】 ＩＬ−１β注入後７２時間目におけるＣＤ４５染色（Ａお
よびＣ）およびH&E染色（ＢおよびＤ）したＲＣＳラットの網膜低温切片を示し
ている。

【図８Ａ−Ｃ】 媒質（Ａ）、ＩＬ−１β（Ｂ）またはｂＦＧＦ注入後にお
けるＣＤ４５染色した異栄養有色ＲＣＳラットの網膜低温切片を示している。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ホワイトレイ，シモン，ジェイ． アメリカ合衆国 02174 マサチューセッ ツ州 アーリントン ティール ストリー ト 48 アパートメント １ (72)発明者 ヤング，マイケル，ジェイ． アメリカ合衆国 01930 マサチューセッ ツ州 グロースター ザ ハイツ 1002 Ｆターム(参考） 4C084 AA02 BA44 DA13 MA58 NA14 ZA012 ZA332 4H045 AA30 BA10 CA40 DA03 EA20

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 異栄養性神経組織の実質的な異形成を引き起こすことなく、
   ニューロン細胞の救済に効果を示す低用量のインターロイキン１−β（ＩＬ−１
   β）から成る組成物を、少なくとも1つの異栄養性神経組織部位に局所投与する
   ことから成る、異栄養性神経組織部位におけるニューロン細胞の救済方法
2. 【請求項２】 少なくとも1つの異栄養性神経組織部位が異栄養性網膜であ
   る、請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】 前記組成物が濃度≦約５０μg/mlのＩＬ−１βから成る、請
   求項１または請求項２記載の方法。
4. 【請求項４】 前記組成物が濃度≦約２０μg/mlのＩＬ−１βから成る、請
   求項１または請求項２記載の方法。
5. 【請求項５】 前記組成物が濃度≦約１０μg/mlのＩＬ−１βから成る、請
   求項1または請求項2記載の方法。
6. 【請求項６】 前記組成物が濃度約０．１〜１０μg/mlのＩＬ−１βから成
   る、請求項１または請求項２記載の方法。
7. 【請求項７】 前記組成物が濃度≦約５０μg/mlのＩＬ−１β溶液から成り
   、前記組成物を約０．１〜１０μlの容積で硝子体内投与する、請求項２記載の
   方法。
8. 【請求項８】 前記組成物が濃度≦約２０μg/mlのＩＬ−１β溶液から成
   り、前記組成物を約０．１〜１０μlの容積で硝子体内投与する、請求項２記載
   の方法。
9. 【請求項９】 前記組成物が濃度≦約１０μg/mlのＩＬ−１β溶液から成り
   、前記組成物を約０．１〜１０μlの容積で硝子体内投与する、請求項２記載の
   方法。
10. 【請求項１０】 網膜異栄養症が、色素性網膜炎、錐状体異栄養症、網膜色
    素上皮（ＲＰＥ）に基づく異栄養症、網膜変性、黄斑変性、網膜神経節細胞消失
    、緑内障、視神経症および網膜剥離から成るグループから選択されたメンバーの
    結果である、請求項２記載の方法。
11. 【請求項１１】 前記組成物の局所投与において、神経組織部位または周辺
    領域への到達時のみに≦５０μg/mlのＩＬ−１βを局所的に放出する、標的が定
    められた薬物送達溶媒を用いる、請求項１または請求項２記載の方法。
12. 【請求項１２】 前記組成物の局所投与において、異栄養性神経組織部位に
    おいて長時間にわたり≦５０μg/mlのＩＬ−１βを局所的に放出する、徐放性の
    薬物送達溶媒を用いる、請求項１または請求項２記載の方法。
13. 【請求項１３】 包装材料および前記包装材料に含まれる組成物から成り、
    前記組成物がその局所部位である異栄養性神経組織部位のニューロン細胞の救済
    に効果を示し、前記組成物が≦約５０μg/mlの範囲における低用量のＩＬ−１β
    から成り、前記包装材料が、前記組成物はその局所投与部位である異栄養性神経
    組織部位に残存するニューロン細胞を救済し、前記投与により生じる前記部位の
    神経組織の異形成を最小限に抑えるために用いうると記載したラベルから成る、
    工業製品。
14. 【請求項１４】 前記異栄養性神経組織部位が異栄養性網膜である、請求項
    １２記載の工業製品。
15. 【請求項１５】 包装材料および前記包装材料に含まれる組成物から成り、
    前記組成物がその局所投与部位である少なくとも１つの網膜の実質的な異形成を
    引き起こすことなく、光受容細胞を救済するのに効果を示す低用量のＩＬ−1β
    から成り、前記低用量のＩＬ−１βが≦約５０μg/mlであり、前記包装材料が、
    網膜へのＩＬ−１β投与により生じる実質的な網膜異形成を最小限に抑えながら
    、異栄養性網膜内の少なくとも１個の光受容細胞を救済する方法において、異栄
    養性網膜を有する者に対して、前記組成物を投与するという指示から成る、工業
    製品。
16. 【請求項１６】 前記異栄養性網膜が、色素性網膜炎、錐状体異栄養症、網
    膜色素上皮（ＲＰＥ）に基づく異栄養症、網膜変性、黄斑変性、網膜神経節細胞
    消失、緑内障、視神経症および網膜剥離から成るグループから選択されたメンバ
    ーの結果である、請求項１４または請求項１５記載の工業製品。
17. 【請求項１７】 前記異栄養性神経部位が疾病または損傷を有する脊髄であ
    る、請求項１記載の方法。
18. 【請求項１８】 前記異栄養性神経部位が疾病または損傷を有するＣＮＳ部
    位である、請求項１記載の方法。
19. 【請求項１９】 前記異栄養性神経部位が脳病変である、請求項１記載の方
    法。