JP2003524403A - 内材を充填した泡状物質 - Google Patents

内材を充填した泡状物質

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Abstract

(57)【要約】 a)マクロポアを含む重合体基盤マトリックス(細孔システム１)およびb)マクロポア内に保持された内材、可能であれば多孔体(細孔システム２)を含むマトリックス。マトリックスは、内材とマクロポアの細孔壁の間に連続的な空間が存在することを特徴とする。内材が存在するマクロポアを有する基盤マトリックスを含むマトリックスの製造方法。その方法は次のステップ：(i)マクロポアを有する基盤マトリックスを提供すること；(ii)マクロポアを内材の可溶形で満たすこと；(iii)マクロポア内部で、可溶形を不溶形に変えること；(iv)不溶形を収縮させること；および(v)その収縮形の中で物質を不可逆的に安定化すること、を含むことを特徴とする。マトリックスは、分離方法、細胞培養、有機分子の固相合成において、および (酵素反応のような) 触媒反応において使用され得、および多孔性支持体マトリックスが使用されるその他の使用において使用され得る。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、新規の種類の支持体マトリックスならびに分離方法、細胞培養、有
機分子の固相合成における、および(酵素反応のような)触媒反応における支持体
マトリックスの使用および多孔性支持体マトリックスが使用されるその他の使用
に関する。
【０００２】 背景技術 クロマトグラフィーにおいて、液体から取り除かれる構成成分を含む液体の流
れは、分離媒体を通される。その構成成分は、典型的に、分離媒体との相互作用
がそれぞれ異なり、異なる保持時間となる。構成成分は、少なくとも一部分は互
いに分離される。分離媒体の効率は、特に、溶質にとって有効な表面領域に依存
する。
【０００３】 流動液と直接接触する有効表面領域を増加させることが、一般的に望まれてい
る。その液が水性であり、分離媒体が疎水性物質を基礎としている場合には、例
えば、親水性コーティングが提供される。細孔の中を流動できる単分子膜および
より厚い膜(それぞれ、EP 221,046およびWO 9719347)から流通孔を完全に満たす
ものまで、さまざまな厚さが提唱されている。
【０００４】 「流動液(through flowing liquid)」なる用語は、対流的な物質移送を提供する
液を意味する。流動液によって接近できる表面は、それゆえ、「対流表面(convec
tive surfice)」と呼ばれる。同様に、流動液によって接近できる細孔システムは
「対流細孔システム(convective pore system)」と呼ばれる(例えば、以下に記述
する細孔システム１)。対流細孔システムの細孔サイズは、典型的に０．１μm以
上、例えば０．５μm以上であり、このことは、球形の直径がそれぞれ０．１μm
以上、０．５μm以上のものが通過できることを意味する。媒体が床に敷き詰め
られたビーズの形態である場合には、対流細孔サイズとビーズの直径の比は、典
型的に、０．０１〜０．３の間、好ましくは０．０５〜０．２の間である。０．
１μm以上、例えば０．５μm以上のサイズを有する細孔は、しばしば、マクロポ
アと呼ばれる。
【０００５】 分離媒体は、また、液および／または液中に存在する構成成分の拡散によって
接近できる細孔システムを有し得る(拡散的な物質移送)(「拡散細孔システム(dif
fusive pore system)」は例えば、ミクロポアの場合の、以下に記述する細孔シス
テム２)。拡散細孔システムは、対流細孔システムへの隙間を有することを特徴
とし、それは流動液が通過できるほどは大きくはない。細孔システム２のこれら
の隙間は、典型的に直径が０．５μm以下、例えば０．１μm以下の球形のみが通
過できる。０．５μm以下、例えば０．１μm以下のサイズを有する細孔は、しば
しば、ミクロポアと呼ばれる。
【０００６】 本発明の文脈中、細孔サイズの数値は、ＳＥＭまたはＥＳＥＭ(走査電子顕微
鏡および環境制御型走査電子顕微鏡)によって、および／またはＳＥＣ(サイズ排
除クロマトグラフィー)、例えばポリスチレンとデキストランを使用したによっ
て得られた数値を意味する。Hagel著、「Aqueous Size-Exclusion Chromatograph
y」中の「細孔サイズ拡散」 Elsevier Science Publisher B. V., Amsterdam, The
Netherlands (1998) 119-155を参照。
【０００７】 本発明の目的 ・第一の目的は、マクロポアのマトリックスの総容量を増加させることである。
・第二の目的は、分離媒体で満たされたマクロポアを含むマトリックスの貫流容
量を増加させることである。 総容量および貫流容量は、マトリックスを移動する液体中に存在する物質と相
互作用するマトリックスの能力を意味する。相互作用は、物質と、その物質に親
和性を有し支持体マトリックス上に存在するリガンド構造との間の親和結合に関
連し得る。相互作用は、その物質のサイズおよび形により立体的に制限された浸
透であり得る。
【０００８】 本発明 今回、基盤マトリックス(base matrix)のマクロポアが、内材とマクロポアの内
壁の間に連続的な空間(free volume)を残す内材を含む場合には、これらの目的
が達成され得ることが分かった。
【０００９】 本発明の第一の観点は、 a)マクロポアを有する基盤マトリックス、好ましくは重合体(細孔システム１)お
よび b)マクロポア内部に保持された、可能であれば多孔性の内材(細孔システム２) を含む支持体マトリックスである。このマトリックスの特徴的な点は、内材とマ
クロポアの内部細孔壁との間の空間である。支持体マトリックスは、充填された
もしくは流動床の形態、またはモノリスプラグの形態であり得る。好ましい変形
のひとつにおいて、連続的な空間によって、液はマトリックスを流動、好ましく
はマトリックスの両端の間を流動できる。連続的な空間の容積は、典型的に、流
動液の少なくとも１％、例えば少なくとも４％が連続的な空間中のマトリックス
を通過するように選択される。モノリスプラグの形のマトリックスでは、このこ
とは１００％の液体がマトリックスを流動したことを意味する。
【００１０】 細孔システム 内材のない空の基盤マトリックスのマクロポアのサイズは、典型的に、０．１〜
１０００μm、例えば０．５〜１０００μm、好ましくは１〜１００μmの間であ
る(細孔システム１)。基盤マトリックスは、また、１０Å〜０．５μm、例えば
１０Å〜０．１μmの間の細孔を有する一群のより少ない細孔(細孔システム３)
を含み得る。
【００１１】 細孔サイズ(細孔システム２)の上限は、細孔システム１の細孔サイズに依存す
る。細孔システム１の細孔が十分に大きい場合、細孔システム２は、マクロポア
であってもよくまたはマクロポアでなくてもよい内材を含み得る(細孔システム
４)。細孔システム２は、好ましい変形において、ミクロポアであり、つまりそ
の細孔サイズが０．５μm以下、例えば０．１μm以下である。細孔システム２お
よび４がマクロポアである場合には、それらは細孔システム１の一部であるとみ
なされ得る。
【００１２】 本発明のマトリックス中に存在する空間は、対流表面領域を増大させる。この
ことは、物質移送がより速くなり、流動液中の溶質と相互作用する貫流容積が増
大することを意味する。本発明のマトリックスの対流表面領域は、典型的に、内
材のない基盤マトリックスの少なくとも２５％、例えば少なくとも５０％または
７５％であり、内材のない基盤マトリックスの対流表面よりも大きい。
【００１３】 好ましい細孔システムは、細孔の三次元網状組織からなり、その網状組織は多
くの細孔、細孔の分枝、細孔の分岐等を含み、好ましい変形において、また、細
孔を介して互いに通じている空洞を含む。このことは、対流細孔システムを含む
マクロポアシステム、ならびにミクロポアシステムに適用される。
【００１４】 好ましい基盤マトリックスにおいて、マクロポアシステムは、球形間に連結細
孔を有する球体の形の空洞で造られる。球形の直径は、１μm〜１００μm、例え
ば１μm〜２５μmの間であり得る。連結細孔の直径は、通常は球形の直径の約１
／１０〜１／３であり、例えば０．１μm〜１０μm、例えば０．５μm〜１０μm
の間である。マトリックスがビーズ／粒子の形態である場合には、空洞は、典型
的に、粒子の直径の１／９未満の直径を有する。
【００１５】 ある好ましいひとつの変形において、内材は基盤マトリックスを形成しにくい
サイズおよび／または形態を有し、すなわち、いわゆる「閉じ込められた内材(ja
iled interior material)」である。
【００１６】 基盤マトリックス 空洞間に連結細孔を有する球形の形で作られた細孔システムを有する基盤マトリ
ックスは、先行技術から容易に入手できる。例えば、US 5,883,861(PerSeptive
Biosystems)、EP 288,310(Unilever)、WO 9719347(Amersham Pharmacia Biotech
AB)、US 5,334.310(Cornell Research Foundation)、WO 9319115(Amersham Pha
rmacia Biotech AB)等を参照。
【００１７】 基盤マトリックスは、原則として、当分野においてモノリスプラグまたは粒子
の形態でクロマトグラフ用吸着剤の製造のために、それ自体知られている物質を
基礎とし得る。それゆえ、基盤マトリックス中の主要成分は、天然ポリマー(い
わゆるバイオポリマー)および合成ポリマーのような有機ポリマーならびに無機
ポリマーを基礎とし得る。内材は、主として天然または合成の有機ポリマーを基
礎とする。
【００１８】 バイオポリマーの実例は、デキストラン、アガロース、セルロース、カラゲー
ニン、アルギネート、プルランおよび澱粉のような多糖類であり、また化学的に
修飾された形態を含んでいる。多糖類のマクロポア形態は、WO 9319115(Amersha
m Pharmacia Biotech AB)に記述された方法にしたがって最良の形態で得られる
、すなわち、最初に多糖類の物質を含む水溶液を用意し、次にそれを水と混合で
きない有機性の液体と懸濁すると、冷却によりマクロポア・ブロックを与えるエ
マルションを形成する。その方法は、マクロポア・ビーズを与えるように修飾さ
れ得る。
【００１９】 マクロポア多糖類マトリックスは、通常、マクロポアシステム(細孔システム
１)およびミクロポアシステム(細孔システム３)の両方を含む。マクロポアシス
テムの細孔サイズは、基盤マトリックスの製造工程で、有機液体の相対量を変化
させ、および基盤乳化剤を適切に選択することによって制御され得る。ミクロポ
アシステムの細孔サイズは、出発水性溶液における多糖類の濃度を変化させるこ
とによって制御され得る。マトリックスは架橋によって、例えばヒドロキシ基で
二官能的に反応する試薬を使用することによって安定化され得る。ビスエポキシ
ド、エピハロヒドリン等が、典型的な架橋試薬である。
【００２０】 合成ポリマーは、いわゆるビニルポリマー、すなわちビニルベンゼン、アクリ
ル／メタクリル酸誘導体(酸、アミド、ニトリル、エステル等)におけるような１
またはそれ以上の重合可能なアルケン基を顕在化している化合物の重合によって
得られるポリマーによって、最も良く説明される。粒子の形態の基盤マトリック
スの形成は、例えば油層中に初めから存在する単量体を用いる重合によって、o/
w型エマルションまたは懸濁液として達成される。塊状重合を利用することによ
って、モノリスプラグのマトリックスを得ることができる。ポリマーではなくモ
ノマーが可溶性である有機性の液体(ポロゲン(porogen))を包含させることによ
って、さまざまな種類の細孔構造を有する基盤マトリックスが得られる。
【００２１】 基盤マトリックスは、また、他の合成ポリマー、例えばモノマーがアミノ、ヒ
ドロキシ、カルボニル基等の中から選択された２またはそれ以上の基を顕在化す
る化合物から選択された縮合ポリマーで構成され得る。特に強調すべきモノマー
は、ポリアミノモノマー、ポリカルボニルモノマー(類似の反応性ハライド、エ
ステルおよび酸無水物を含む)、ポリヒドロキシモノマー、アミノ−カルボキシ
モノマー、アミノ−ヒドロキシモノマーおよびヒドロキシ−カルボキシモノマー
である、ここで、ポリとは２，３またはそれ以上の官能基のことを意味する。２
度反応することができる官能基を含む化合物、例えば炭酸またはホルムアルデヒ
ドは、多官能性化合物の中に含まれる。意図されたポリマーとは、典型的に、ポ
リカーボネート、ポリアミド、ポリエーテル等である。
【００２２】 マクロポアの形態で、基盤マトリックスにおいて有用であり得る無機物質の例
は、シリカ、酸化ジルコニウム、グラファイト、酸化タンタリウム等である。
【００２３】 好ましいマトリックスは、加水分解に対して不安定な基、例えばシラン、エス
テル、アミド基のないもの、およびシリカ中にこのような基が存在しないもので
ある。
【００２４】 好ましい種類の基盤マトリックスは、上記の種類の開放性連結球形空洞を含む
マクロポア構造を与える高密度内部相エマルション(ＨＩＰＥ)中の、上記の種類
のビニルポリマーの重合によって得られる。例えば、EP 288,310(Unilever)、EP
68,310(Unilever)、WO 9719347(Amersham Pharmacia Biotech AB)およびUS 5,2
00,433を参照。この方法は、以前に、内部のw/oエマルションがＨＩＰＥを含む
液滴の形態であるw/o/wエマルションに拡張されている。例えば、この種類のマ
トリックスのビーズ形を記載しているWO 9531485を参照。液体のポロゲンを包含
させることによって、ミクロポアシステム(細孔システム３)は、球形の空洞を含
むマクロポアシステムに加えて形成される。「細孔システム」の見出しを参照。
【００２５】 ある変形において、基盤マトリックスは、不可逆的に接着して凝集体を形成す
る多数の小粒子で構成され得る。小粒子間の隙間は、細孔システムの顕著な特性
である。これらの変形は、より大きな粒子(例えばビーズ)またはモノリスプラグ
の形態であり得る。流動液と直接接触して媒介している基盤マトリックスの(例
えば、細孔システム１の)表面は、疎水性または親水性であり得る。親水性表面
によって、その表面は酸素または窒素を含む多くの極性基(親水性基)を顕在化す
ることが、意図される。適当な極性基は、ヒドロキシ(アルコールおよびフェノ
ール)、カルボキシ(−ＣＯＯＨ／−ＣＯＯ−）、エステル、アミド、(例えばポ
リオキシエチレン中の)エーテル等である。「疎水性」なる用語は、上記の親水性
基がごく少数または全く存在しないことを意味する。本発明の文脈において、明
白な疎水性表面は、３０度未満の水接触角を有することをいう。
【００２６】 疎水性表面を有する基盤マトリックスは、それ自体既知の技術にしたがって、
容易に親水性化され得る。同様に、親水性表面は疎水性化され得る。明白な疎水
性表面は、５０度より大きい水接触角を有する。
【００２７】 内材(interior material) 内材は、典型的に、好ましくは多孔性であるポリマー物質である(細孔システム
２)。
【００２８】 内材は、主として基盤マトリックスにおけるマクロポアに配置され、その中で
、マクロポアは上で定義された連続的な空間を提供するのに十分なサイズを有し
ている。内材の一部には、より大きなミクロポアに配置され得、または連続的な
空間を提供するほど十分なサイズがないマクロポアに配置され得る。
【００２９】 内材は、原則として、基盤マトリックスと同一種類の材料を基礎としている。
上記参照。
【００３０】 細孔システム２の細孔サイズ分布は、クロマトグラフ用マトリックスに使用さ
れるのと同一の規則にしたがって、物質の形成の間制御され得る。 好ましい内材は、多糖類を基礎とする。
【００３１】 内材は、典型的に、基盤マトリックスのマクロポア内部で形成される。これの
ための方法は、次のステップを含む。 (i)マクロポアを内材の可溶形で満たすこと (ii)マクロポア内部で、可溶形を不溶形に変えること (iii)不溶形を収縮させること、および (iv)そのシュリンク形の中で物質を不可逆的に安定化すること。
【００３２】 この方法は、ポリヒドロキシポリマー、例えば多糖類で最も良く例示される。
天然形の、または適当に誘導体化された形の多くの多糖類の水性溶液が製造され
得る。ポリヒドロキシポリマーの水性溶液は、しばしば、温度を減少させること
によって、または化学的な誘導体化、例えば架橋によって、当分野で既知のゲル
に容易に変換される。例えば、アガロースは温水には溶解するが、温度が減少す
るとその溶液はゲル化することが知られている。
【００３３】 同様にデキストランは、水への溶解性が高いが、架橋するとゲルを形成する。
マクロポアシステムにおける上述のゲル形成は、細孔システム内部の多糖類の保
持を助ける。この種類のゲルは収縮させ得ることが知られている。マクロポアシ
ステム内にあるゲルの収縮は、その結果、上で定義した種類の連続的な空間を形
成する。適当に置換されたゲル形態のアガロースは、例えば、適切な条件下での
架橋で収縮する。同時に架橋によって、不可逆的に安定化された形態となる。例
えばWO 9738018(原文７ページ、第３パラグラフの最後)を参照。同様に、水で膨
張した架橋デキストランは、水をより極性の低い液体、例えばメタノールに代え
た場合に、収縮する。例えばビスエポキシド、エピハロヒドリンで架橋すると、
デキストランゲルの収縮形態は不可逆的に安定化される。
【００３４】 前のパラグラフで略述した一般原則は、可溶形がより少ない体積を占める不溶
形に変換(シュリンク(shrinked))され、収縮形が不可逆的にこの体積で安定化さ
れる場合には、他のポリマーの可溶形にもあてはまる。内材とマクロポアの内壁
との間の空間は、連続的な空間が存在するべきであり、好ましくは液体がマトリ
ックスを流動することを可能にすべきである。ポリマーの可溶形を水中に提供す
ることができない場合、他の液体が使用され得る。引用される可溶形は、また、
内材に対して重合できるモノマーを含む。
【００３５】 上記ステップ(ii)〜(iv)の第一の代替方法は、これらのステップを本質的に同
時に行うことを含む。上記ステップ(ii)〜(iv)の第二の代替方法は、ステップ(i
i)を行い、次にステップ(iii)および(iv)を本質的に同時に行うことを含む。上
記ステップ(ii)〜(iv)の第三の代替方法は、一つずつ順番通りに行うことを含む
。代替方法の選択は、出発可溶形に依存し、実施例に略述したように決定され得
る。
【００３６】 可溶形を不溶形に変換する(ステップ(ii))典型的な方法は、温度の減少、化学
的な誘導体化、たとえば架橋、または溶媒／液体交換を含む。収縮(ステップ(iv
))の典型的な方法は、架橋、イオン強度の変化、または液体の交換を含む。多数
の極性基を有するポリマーに関して、極性のより高い液体から極性のより低い液
体に移動させると、しばしば収縮が起きる。明白な疎水性を有するポリマーに関
しては、例えば本質的に極性基を持たない場合、収縮には、しばしば、より極性
の低い液を極性の高い液と交換することが必要とされる。安定化(ステップ(v))
の典型的な方法は、架橋を含む。
【００３７】 特に有用な変形は、適当にアリル化された多糖類、例えばアガロースを使用す
ること、および第二の代替方法にしたがってステップ(ii)を行うことである。上
で略述した水溶性ポリマー、例えばデキストランを使用する変形は、第三の代替
方法に記載のものである。
【００３８】 (ミクロポアおよび／またはマクロポアの)細孔表面は、多数のアフィニティー
リガンド、すなわち対照物に対する親和性のある構造を顕在化する。アフィニテ
ィーリガンドは、親和性のある対の個々の構成物である。アフィニティーリガン
ドは、一般に、対の他方の構成物を支持体マトリックスにアフィニティー結合(
アフィニティー吸着)させて使用される。よく知られた親和性のある対は、陽電
荷および陰電荷の基(イオン交換)、抗体および抗原／ハプテン、レクチンと炭水
化物、ＩｇＧ結合タンパクとＩｇＧ、キレート団とキレート化合物、相補的な核
酸、リガンド上およびその対照物上の疎水基などである。この種類の基は、当分
野でよく知られた技術によって、支持体マトリックス上に導入され得る。親和性
基は、特に、精製されるべきまたは液体から取り除かれるべき物質との親和性に
基づく分離方法において、本発明の新規支持体マトリックスを使用する場合に、
有益である。それらは、また、細胞培養および固相合成における支持体として、
酵素のような触媒の支持体として使用されるマトリックスに有益である。
【００３９】 上で定義した支持体マトリックスがアフィニティー吸着に使用される場合、そ
の支持体マトリックスは、上で定義した親和性のある種の対を顕在化する。この
使用は、支持体マトリックスと極性の液体、典型的には水性の液体、またはアフ
ィニティー対の他方を含む「非極性」の液体を相互に接触させることを含む。そ
の条件は、アフィニティー結合を促進するように選択され、原則として、それ自
体当分野において既知と考えられる。次に、支持体マトリックスは液体から分離
され、そして、所望により、アフィニティー吸着体は解離され、さらに処理され
得る。
【００４０】 ここで、本発明を実施例によって例示する。本発明はさらに、本明細書の一部
である特許請求の範囲の中で定義される。
【００４１】 実験の部 合成 実施例 １Ａ アガロースの制御された収縮 アガロース溶液の製造 バッチリアクター中で、３００mlの蒸留水に２０ｇのアガロースを加え、９５
℃で２時間撹拌することによって、アガロース溶液を製造した。溶液を７０℃ま
で冷却した。１．５mlの５０％ＮａＯＨ、０．０４ｇのＮａＢＨ４、４．０mlの
アリルグリシジルエーテルをアガロース溶液に加えた。反応液を７０℃で２時間
撹拌を続けた。その後、反応液を６０％酢酸および塩酸で、ｐＨ７〜８に中和し
た。
【００４２】 エマルション媒体の合成 これは、エマルションリアクター中で、４５０mlのトルエンに３５ｇのエチル
セルロース(N-50 乳化剤(ethyl cellulose, Hercules, U.S.A.))を加え、６０℃
で撹拌することによって製造した(トルエン中のN-50が溶解するのに、約２時間
を要した)。
【００４３】 エマルション アガロース溶液を、エマルション媒体に移した。撹拌は、１２０rpmに調節した
。アガロースゲル微粒子が、その結果、形成された。 アガロースビーズの所望の最大の粒子径は、１６０μmであった。アガロース
ゲルの粒子径が大きすぎる場合には、回転速度を２２０rpmまで増加させ、さら
にN-50を追加した。最大の粒子径をサンプルを採取することによって調べ、サイ
ズ目盛り内蔵の顕微鏡で分析した。１６０μmのサイズに達すると、スラリーを
冷却した。スラリーを６０℃から２５℃未満にまで約３０分で冷却した。そのゲ
ルを９９．５％エタノールおよび蒸留水で洗浄した。
【００４４】 エピクロロヒドリンとの架橋(収縮ステップ) ３２０mlのゲル(脱水済)と１３０mlの蒸留水の混合液を含むリアクターに、撹拌
下、５３ｇのＮａ２ＳＯ４を加えた。反応温度を５０℃に上げ、１時間後、７ｇ
の５０％ＮａＯＨおよび０．５ｇのＮａＢＨ４をそのスラリーに加え、ならびに
６〜８時間後に４７ｇの５０％ＮａＯＨおよび３４mlのエピクロロヒドリンを加
えた。一夜反応を続けた(約１６時間)。ゲルを、ｐＨ５〜７になるまで蒸留水と
６０％酢酸で洗浄した。
【００４５】 収縮(計算) 架橋前の体積(Ｖ０)および架橋後の体積(Ｖｃｌ)を測定し、収縮の百分率を以下
の式にしたがって計算した。
【式１】 収縮＝(１−(Ｖｃｌ／Ｖ０))ｘ１００
【００４６】 誘導体化の程度と収縮性 実施例１Ａに記載の収縮の実験を異なる量のアリルグリシジルエーテルで２度繰
り返した。結果を以下の表１に示す。
【表１】
【００４７】 実施例１Ｂ デキストランゲルの制御された収縮 セファデックス Ｇ−２００スラリーの合成 ３ｇのセファデックス Ｇ−２００(エピクロロヒドリンで架橋されたデキスト
ランゲル、Amersham Pharmacia Biotech AB, Sweden)を４００mlの蒸留水に加え
た。ゲルを、撹拌下２０〜２５℃で２４時間膨張させた。膨張後のゲルの体積(
脱水済)は、１００mlであった。
【００４８】 収縮および１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテルとの架橋 ５．５mlの脱水済デキストランゲルおよび０．５mlの蒸留水を、６．０mlのメタ
ノールが入ったリアクターに加えた。１時間後、３mlの１，４−ブタンジオール
ジグリシジルエーテルおよび０．１３mlの５０％ＮａＯＨをそのスラリーに加え
た。反応温度を５０℃に上げた。反応を一夜続けた。ゲルを蒸留水で洗浄した。
収縮(計算)。 実施例１Ａを参照。
【００４９】 メタノールの量と収縮性 実施例１Ａに記載の収縮の実験を、異なる量のメタノールで２度繰り返した。結
果を以下の表２に示す。
【表２】
【００５０】 実施例２ マクロポアの材料の製造とその親水性化 マクロポア基盤マトリックス マクロポア基盤マトリックス(ビーズ、直径４０〜５００μm、内部で連結した球
形の空洞の形態における細孔システム)を、WO 9719347(Amersham Pharmacia Bio
tech AB)の実施例１にしたがって、１０．８ｇのスチレン、１０．８ｇのジビニ
ルベンゼン(Grade 63%)、１．８ｇのＳｐａｎ(登録商標)８０(モノオレイン酸ソ
ルビタン, Fluka, Germany)、０．８ｇのＨｙｐｅｒｍｅｒ(登録商標)(ICI, Eng
land)、１３９ｇの蒸留水(ステップ１)、３２４ｇの蒸留水(ステップ２)から製
造した。５００μmより大きい粒子および４０μmより小さい粒子を、ふるいで取
り除いた。
【００５１】 ポリヒドロキシポリマーの吸着による表面の修飾 ２０ｇのフェニルデキストラン(モノサッカライド単位あたりの置換度０．２０)
を、撹拌下、１５００mlの脱水済マクロポアのマトリックスおよび５００mlの蒸
留水が入ったリアクターに加えた。反応を２時間２０〜２５℃で進行させた。ゲ
ルを蒸留水で洗浄した。
【００５２】 吸着したフェニルデキストランの架橋 １８０ｇのＮａ２ＳＯ４を、撹拌下、フェニルデキストランが吸着した１０００
mlの脱水済マクロポアのマトリックスと３００mlの蒸留水の混合物が入ったリア
クターに加えた。反応温度を５０℃に上げ、１時間後、４０ｇの５０％ＮａＯＨ
、３２mlの１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテルを、そのスラリーに加
えた。反応を一夜続けた(約１６時間)。ゲルを、ｐＨ５〜７になるまで蒸留水お
よび６０％酢酸で洗浄した。
【００５３】 実施例３ マクロポア中に空間が残っている多孔性物質を含むマクロポアのマ
トリックスの製造
【００５４】 実施例 ３Ａ アガロース溶液の製造 バッチリアクター中で、９００mlの蒸留水に１２０ｇのアガロースを加え、９
５℃で２時間撹拌することによって、アガロース溶液を製造した。溶液を７０℃
まで冷却した。
【００５５】 実施例 ３Ｂ アリル化アガロースゲルが充填されたマクロポアのマトリックスの製造 実施例２の脱水済マクロポアのマトリックス(１５０ｇ)、１．５mlの５０％Ｎａ
ＯＨ、３mlのアリルグリシジルエーテルを、実施例３Ａのアガロース溶液(１７
０ｇ)に加えた。反応を、撹拌下、７０℃で２時間続けた。その後、溶液を６０
％酢酸および塩酸でｐＨ７〜８に中和した。
【００５６】 エマルション媒体の製造 これは、エマルションリアクター中で、４５０mlのトルエンに５５ｇのエチルセ
ルロース(N-50 乳化剤)を加え、６０℃で撹拌することによって製造した(トルエ
ン中のN-50が溶解するのに、約２時間を要した)。
【００５７】 過剰のアガロースゲルの除去 アガロース／脱水済マトリックススラリーをエマルション媒体へと移した。撹拌
を１８０rpmに調節した。その結果、アガロースゲル微粒子が形成され、それら
のサイズは、スターラーの回転速度の変動およびN-50の追加によって制御できる
。アガロース床の所望の最大の粒子径は、２０μmであった。アガロースゲルの
粒子が大きすぎる場合には、回転速度を２２０rpmまで増加させ、さらにN-50を
追加することができる。最大の粒子(アガロース)サイズはサンプルを採取するこ
とによって調べ、サイズ目盛り内蔵の顕微鏡で分析した。直径２０μmのサイズ
に達すると、スラリーを６０℃から２５℃未満にまで約３０分で冷却した。その
ゲルを９９．５％エタノールおよび蒸留水で洗浄した。４０μm未満の粒子(アガ
ロースビーズ)は、ふるいで除去した。
【００５８】 エピクロロヒドリンとの架橋(収縮) ５７ｇのＮａ２ＳＯ４を、撹拌下、アガロースが充填された１２０mlのマクロポ
アの材料(実施例３Ｂから、脱水済)と５０mlの蒸留水の混合物の入ったリアクタ
ーに加えた。反応温度を５０℃に上げ、１時間後、３ｇの５０％ＮａＯＨおよび
０．２ｇのＮａＢＨ４をそのスラリーに加え、ならびに６〜８時間後に１８ｇの
５０％ＮａＯＨおよび１７mlのエピクロロヒドリンを加えた。一夜反応を続けた
(約１６時間)。ゲルを、ｐＨ５〜７になるまで蒸留水と６０％酢酸で洗浄した。
【００５９】 アリル基の不活性化 ブロモ化： ５０ｇのＮａＡｃ・３Ｈ２Ｏ(酢酸ナトリウム)を、撹拌下、１２０mlのエピクロ
ロヒドリンで架橋されたゲル(脱水済)と３５０mlの蒸留水の溶液が入ったリアク
ターに加えた。５分後、臭素−水(Ｂｒ２／Ｈ２Ｏ)を、暗黄色になるまで溶液に
加え、１分間以上維持した。反応を約１５分間続けた。その後、ギ酸ナトリウム
を加え、白色のゲルを得た。 １０ｇのＮａ２ＳＯ４を、ブロモ化されたゲルが入ったリアクターに加えた。
１時間後、３０ｇの５０％ＮａＯＨおよび０．０４ｇのＮａＢＨ４をその溶液に
加えた。反応温度を４０℃に上げ、反応を１６時間進行させた。その後、ゲルを
、ｐＨ７になるまで蒸留水で洗浄した。２５０μmより大きい粒子と４０μmより
小さい粒子を、ふるいで取り除いた。
【００６０】 デキストラン溶液の製造 １７ｇのデキストラン(Ｔ４０、分子量４０，０００、Amersham Pharmacia Biot
ech AB)を、撹拌下、１４mlの蒸留水を２０℃で加えた(水中のデキストランが溶
解するのに約４時間を要した)。
【００６１】 アガロースが充填されたマクロポアのマトリックスのエポキシ化 ６．４ｇのＮａＯＨ(５０％)を、撹拌下、４０mlのマトリックス(脱水済)と１６
mlの蒸留水の溶液が入ったリアクターに加えた。混合液を２０℃に冷却した。７
．２mlのエピクロロヒドリンを加えた。反応を２０℃で２時間続けた。その後、
酢酸でｐＨ７に中和し、活性化されたマトリックスを蒸留水で洗浄した。分析に
よって、ゲル１mlあたり１３μmolのエポキシ基が存在することが判明した。
【００６２】 デキストランのカップリング エポキシ基活性化ゲルを、デキストラン溶液の入ったリアクターに加えた。混合
液を１時間撹拌した。その後、３．２ｇのＮａＯＨ(５０％)および０．０２ｇの
ＮａＢＨ４を加え、一夜反応を続けた(約１８時間)。その後、混合液を酢酸でｐ
Ｈ６〜７に中和し、マトリックスを蒸留水で洗浄した。２５０μmより大きい粒
子と４０μmより小さい粒子を、ふるいで取り除いた。反応後のマトリックスの
デキストラン含有量は、ゲル１mlあたり１３mgであった。
【００６３】 ４級アミノエチル基(Ｑ基)の導入(アニオン交換) ３５mlの塩化グリシジルトリメチルアンモニウム(７０％)を、撹拌下、前のステ
ップからのマトリックス(２０ml)と１．２mlのＮａＯＨ(５０％)が入った溶液に
加えた。反応温度を３０℃に上げ、反応を１９時間進行させた。その後、混合液
を酢酸でｐＨ６〜７に中和し、得られたマトリックスを蒸留水、２Ｍ ＮａＣｌ
、さらにもう一度蒸留水で洗浄した。生成物の塩化物イオンのイオンキャパシテ
ィーは、ゲル１mlあたり０．１８mmolであった。
【００６４】 実施例３Ｃ 非シュリンク多孔性内材が充填されたマクロポアのマトリックス
アガロースゲルが充填されたマクロポアのマトリックスの製造 実施例２のマクロポアのマトリックス(１５０ｇ、脱水済)を、実施例３Ａのアガ
ロース溶液(１７０ｇ)に加えた。スラリーを７０℃で２時間撹拌した。
【００６５】 エマルション媒体の製造 ７０ｇのエチルセルロース(N-50 乳化剤)と４５０mlのトルエンを用い、実施例
３Ｂと同様に行った。
【００６６】 過剰のアガロースゲルの除去 実施例３Ｂと同様。同種類のマトリックスビーズ。
【００６７】 エピクロロヒドリンとの架橋 実施例３Ｂと同様。２２ｇのＮａ２ＳＯ４、１２３mlのアガロースが充填された
マトリックスビーズ、５７mlの蒸留水、２ｇの５０％ＮａＯＨ、０．２ｇのＮａ
ＢＨ４、１９ｇの５０％ＮａＯＨおよび１８mlのエピクロロヒドリンを用いた。
２５０μmより大きい粒子および４０μmより小さい粒子を、ふるいで取り除いた
。
【００６８】 デキストラン溶液の製造 実施例３Ｂと同様。１４．８ｇのデキストランと１４mlの蒸留水を用いた。
【００６９】 アガロースが充填されたマクロポアのマトリックスのエポキシ化 実施例３Ｂと同様。６．４ｇのＮａＯＨ(５０％)、４０mlのマトリックス、１６
mlの蒸留水、７．２mlのエピクロロヒドリンを用いた。分析によって、ゲル１ml
あたり２９μmolのエポキシ基が存在することが判明した。
【００７０】 デキストランのカップリング 実施例３Ｂと同様。３．２ｇのＮａＯＨ(５０％)、０．０２ｇのＮａＢＨ４を用
いた。反応後のマトリックスのデキストラン含有量は、ゲル１mlあたり１７mgで
あった。
【００７１】 ４級アミノエチル基(Ｑ基)の導入(アニオン交換) 実施例３Ｂと同様。３５mlの塩化グリシジルトリメチルアンモニウム、マトリッ
クス(２０ml)、１．２mlのＮａＯＨ(５０％)を用いた。生成物の塩化物イオンの
イオンキャパシティーは、ゲル１mlあたり０．２９mmolであった。
【００７２】 分析の方法 エポキシ基の含有量を、Radiometer VIT 90で、０．１Ｍ HCl、ｐＨ−stat終
点ｐＨ７の設定で測定した。 デキストラン含有量をデキストラン縮合体とエポキシ活性化ゲルの乾燥重量の
差を計算することによって測定した。乾燥重量は、１０５℃のオーブン内で１８
時間乾燥後測定し、ゲル１mlあたりのデキストランのmgで表す。 塩化物イオンのイオンキャパシティーを、０．１Ｍ AgNO３、Mettler DL40Gp
Memo Titratorで測定した。
【００７３】 ３００ｃｍ／ｈおよび１２００ｃｍ／ｈでのＢＳＡ(ウシ血清アルブミン)の貫
流容量ＱＢ(Ｃ／Ｃ０＝０．１) 装置： カラム： ＨＲ１０／１０(Amersham Pharmacia Biotech AB, Sweden) Ａ−緩衝液；装填緩衝液：５０mM トリス、ｐＨ８．０ Ｂ−緩衝液；溶出緩衝液：５０mM トリス中１．０M NaCl、ｐＨ８．０ タンパク：ウシ血清アルブミン(Sigma, A-7030, St Louis, MO, U.S.A.)
【００７４】 手順： 貫流容量ＱＢをＨＲ１０／１０カラム(７．５ｃｍゲルの層高)で測定した。 タンパクをＡ−緩衝液に溶解させ、約２mg／mlにした(分光光度計で２８０ｎｍ
にて測定)。カラムを最初は迂回させ、流動液をＵＶモニターに直結する。ここ
で、非吸着被験溶液の２８０ｎｍの吸収値を測定し(Ｃ０)、次に流動液の吸着被
験溶液をカラムに通した。カラムを通過した液の吸収値が吸収値Ｃ０の１０％と
なったときに試験を中断し、ゲルを洗浄し、ゲルに結合したＢＳＡをＢ−緩衝液
で溶出した。溶出液を集め、そのＢＳＡ含有量を測定し、順にゲル１mlあたりの
ＢＳＡの吸着量を得た(Ｃ／Ｃ０＝０．１の貫流容量と等しい)。 (ボイド(void)とチューブ内のＢＳＡの量は考慮されるのか？)
【００７５】
【表３】 この結果により、実施例３Ｂで製造されたマトリックスの貫流容量が上昇してい
ることが分かる。
【００７６】 環境制御型走査電子顕微鏡の結果： 実験前にビーズを部分的に架橋した。光子によって、空洞を有する破壊されたビ
ーズおよび内材のより小さいビーズが観察された。より小さいビーズは空洞の外
に落下する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ， ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ， ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，Ｋ Ｐ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ， ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，Ｓ Ｇ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B033 NA15 NA22 NB02 NB34 NB47 NB50 NB68 NC04 NC12 4G066 AC01B AC14B AC14C AC17B AC17C AE04B AE05B BA07 BA09 BA16 BA21 BA23 BA24 DA07 EA01 EA02

Claims (15)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 内材とマクロポアの細孔壁の間に連続的な空間が存在するこ
    とを特徴とする、 a)マクロポアを有する基盤マトリックス、好ましくは重合体(細孔システム１)お
    よび b)マクロポア内部に保持された、可能であれば多孔性の内材(細孔システム２) を含むマトリックス。
  2. 【請求項２】 流動液が、モノリス形態のマトリックス、または粒子の形態
    のマトリックス充填床に適用される場合、連続的な空間によって、液がマトリッ
    クスを流動、好ましくはマトリックスの両端の間を流動でき、流動液の少なくと
    も１％、例えば少なくとも４％が連続的な空間中のマトリックスを通過すること
    を特徴とする、請求項１に記載のマトリックス。
  3. 【請求項３】 a)流動液が極性、好ましくは水性で、かつ細孔システム１お
    よび／または細孔システム２の細孔壁および／または内材の外面が疎水性である
    か、 b)流動液が非極性で、かつ細孔システム１および／または細孔システム２の細孔
    壁および／または内材の外面が疎水性である ことを特徴とする、請求項２に記載のマトリックス。
  4. 【請求項４】 マトリックスがモノリスプラグの形態で、そして１００％の
    流動液がマトリックスを通して流動することを特徴とする、請求項２または３に
    記載のマトリックス。
  5. 【請求項５】 マトリックスが粒子、例えば繊維およびビーズの形態であり
    、粒子が充填床の形態である場合には、少なくとも１％、好ましくは多くとも５
    ０％、例えば４〜５０％の流動液がその粒子を通過することを特徴とする、請求
    項２から４のいずれかに記載のマトリックス。
  6. 【請求項６】 マクロポア(細孔システム１)の細孔の直径が０．１〜１００
    ０μm、好ましくは１〜１００μmの間であることを特徴とする、請求項１から５
    のいずれかに記載のマトリックス。
  7. 【請求項７】 ５〜１０００μm、例えば５０〜１０００μmまたは１００〜
    ５００μmの間の平均サイズを有する粒子(ビーズ)の形態であり、細孔システム
    １の細孔の直径と粒子の直径の比が、０．０１〜０．３、好ましくは０．０５〜
    ０．２の間であることを特徴とする、請求項１から３および５から６のいずれか
    に記載のマトリックス。
  8. 【請求項８】 基盤マトリックス内に第三の細孔システム(細孔システム３)
    が存在し、該細孔システム２および３の一方または両方が、拡散性の物質移送の
    みを可能にする連続的な空間への開口を有することを特徴とする、請求項１から
    ７のいずれかに記載のマトリックス。
  9. 【請求項９】 内材のないマクロポア(細孔システム１)が空の球形の空洞を
    含み、空の細孔が空洞よりも小さく、空洞の表面の開口を介して個々の空洞に連
    結していることを特徴とする、請求項１から８に記載のマトリックス。
  10. 【請求項１０】 内材が、主として、内材とマクロポアの内壁の間に広がる
    連続的な空間と共に、空洞に位置することを特徴とする、請求項９に記載のマト
    リックス。
  11. 【請求項１１】 基盤マトリックスおよび／または内材が無機または有機由
    来のものであり、例えば、有機物の場合、ジビニルおよびモノビニルモノマー、
    例えばジビニルおよびモノビニルベンゼンの共重合体、ならびに多糖類のような
    ポリヒドロキシポリマーから選択される親水性または疎水性ポリマーを基礎とす
    ることを特徴とする、請求項１から１０のいずれかに記載のマトリックス。
  12. 【請求項１２】 内材および／またはマクロポアの壁、および／または、も
    し存在すれば、細孔システム３の細孔の壁が親和性のある構造を有することを特
    徴とする、請求項１から１１のいずれかに記載のマトリックス。
  13. 【請求項１３】 取り除かれるべき物質を含む液がマトリックスを流動する
    ことによって分離するための、請求項１から１２のいずれかに記載の使用。
  14. 【請求項１４】 内材は、典型的に、基盤マトリックスのマクロポア内部
    で形成される。これのための方法は、 (i)マクロポアを有する基盤マトリックスを提供すること (ii)マクロポアを内材の溶解形で満たすこと (iii)マクロポア内部で、不溶形を不溶形に変えること (iv)不溶形を収縮すること、および (v)その収縮形の中で物質を不可逆的に安定化すること のステップを含むことを特徴とする、内材が存在するマクロポアを有する基盤マ
    トリックスを含むマトリックスの製造方法。
  15. 【請求項１５】 該内材がポリヒドロキシポリマー、例えば多糖類を含み、
    必要であれば、使用するための収縮特性を示すよう化学的に修飾されていること
    を特徴とする、請求項１４に記載の方法。
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