JP2003521879A - アルツハイマー病とともに分離するミトコンドリア遺伝子における一塩基多型 - Google Patents
アルツハイマー病とともに分離するミトコンドリア遺伝子における一塩基多型Info
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Abstract
(57)【要約】
ｍｔＤＮＡにおける一塩基多型またはホモプラスミーのｍｔＤＮＡ変異の決定に基づく、組成物および方法が提供され、これらは、アルツハイマー病（ＡＤ）の存在またはこれを有する危険性を検出するため、およびＡＤを処置するために適した薬剤を同定するために、有用である。サンプル中のｍｔＤＮＡは、増幅され得る。本発明はまた、薬剤がアルツハイマー病を引き起こすか、その病理に寄与するか、または悪化させる可能性があるか否かを決定する方法を提供する。
Description
【０００１】
（技術分野）
本発明は、全体的にアルツハイマー病に関し、そしてより詳細には、ミトコン
ドリアＤＮＡにおける一塩基多型（ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏ
ｌｙｍｏｒｐｈｙｓｍ）を検出することによってそのような疾患に対する疾病素
質を検出するための組成物および方法に関する。
ドリアＤＮＡにおける一塩基多型（ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏ
ｌｙｍｏｒｐｈｙｓｍ）を検出することによってそのような疾患に対する疾病素
質を検出するための組成物および方法に関する。
【０００２】
（発明の背景）
多くの変性疾患は、ミトコンドリアの機能における変化によって引き起こされ
るか、または関連するものと思われる。これらの疾患としては、アルツハイマー
病、糖尿病、パーキンソン病、ハンティングトン病、失調症、レーバー遺伝性視
神経障害、精神***病ならびに筋変性障害（例えば、「ミトコンドリア脳障害、
乳酸アシドーシスおよび発作」（ＭＥＬＡＳ）、ならびに「ミオクローヌスてん
かん赤筋線維症候群（ｍｙｏｃｌｏｎｉｃ ｅｐｉｌｅｐｓｙ ｒａｇｇｅｄ
ｒｅｄ ｆｉｂｅｒ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）」（ＭＥＲＲＦ））が挙げられる。細
胞内の変更された代謝または呼吸を含む他の疾患はまた、変更されたミトコンド
リア機能と関連する疾患として見なされ得る。
るか、または関連するものと思われる。これらの疾患としては、アルツハイマー
病、糖尿病、パーキンソン病、ハンティングトン病、失調症、レーバー遺伝性視
神経障害、精神***病ならびに筋変性障害（例えば、「ミトコンドリア脳障害、
乳酸アシドーシスおよび発作」（ＭＥＬＡＳ）、ならびに「ミオクローヌスてん
かん赤筋線維症候群（ｍｙｏｃｌｏｎｉｃ ｅｐｉｌｅｐｓｙ ｒａｇｇｅｄ
ｒｅｄ ｆｉｂｅｒ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）」（ＭＥＲＲＦ））が挙げられる。細
胞内の変更された代謝または呼吸を含む他の疾患はまた、変更されたミトコンド
リア機能と関連する疾患として見なされ得る。
【０００３】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、脳の離散性領域におけるニューロンの欠損およ
び／または萎縮によって特徴付けられ、そしてβ−アミロイドの細胞外沈着およ
び神経原線維変化の細胞内蓄積を伴う進行性の神経変性障害である。それはまた
、ヒト独特の疾患であり、世界中で１３００万人を超える人々が罹患している。
それはまた、比類無き悲劇的な疾患である。正常に生存している多くの個体（生
産性の生命）は、年をとるにつれて、ゆっくりとＡＤに襲われ、そしてその疾患
は、彼らから徐々に彼らの記憶および他の知的能力を奪う。最終的に、彼らは、
家族および愛した人々を認識することをやめ、そして彼らは、彼らが最終的に死
ぬまで、持続的な看護をしばしば必要とする。
び／または萎縮によって特徴付けられ、そしてβ−アミロイドの細胞外沈着およ
び神経原線維変化の細胞内蓄積を伴う進行性の神経変性障害である。それはまた
、ヒト独特の疾患であり、世界中で１３００万人を超える人々が罹患している。
それはまた、比類無き悲劇的な疾患である。正常に生存している多くの個体（生
産性の生命）は、年をとるにつれて、ゆっくりとＡＤに襲われ、そしてその疾患
は、彼らから徐々に彼らの記憶および他の知的能力を奪う。最終的に、彼らは、
家族および愛した人々を認識することをやめ、そして彼らは、彼らが最終的に死
ぬまで、持続的な看護をしばしば必要とする。
【０００４】
変更されたミトコンドリア機能に関連する少なくともいくつかの疾患の遺伝子
的基礎が、例えば核において見出されるミトコンドリア外ＤＮＡよりもむしろミ
トコンドリアＤＮＡに存在するということを示唆する証拠が存在する。例えば、
インシュリン非依存性真性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）は、主に、母性パターンの遺伝
を示し、そしてまた、ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）欠損に基づくことが
公知である疾患に存在する。例えば、およそ１．５％の全ての糖尿病個体は、ロ
イシル−ｔＲＮＡ（ｔＲＮＡLeu）をコードするミトコンドリア遺伝子における
ｍｔＤＮＡ３２４３位において変異が潜む。この変異は、ＭＥＬＡＳ（ミトコン
ドリア脳障害、乳酸アシドーシスおよび発作）変異として公知である（Ｇｅｒｂ
ｉｔｚら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １２７１：２５３−２
６０、１９９５）。ｍｔＤＮＡ変異と、変更されたミトコンドリア機能と関連す
る他の疾患（アルツハイマー病（ＡＤ）、ハンティングトン病（ＨＤ）、パーキ
ンソン病（ＰＤ）、失調症、レーバー遺伝性視神経障害（ＬＨＯＮ）、精神***
病ならびにミオクローヌスてんかん赤筋線維症候群（ＭＥＲＲＦ）が挙げられる
が、これらに限定されない）との間の似たような関連性について、類似の理論が
進歩してきた。そのような変異の同定およびそれらの機能的重要性は、診断薬剤
および／または治療薬剤の開発のための標的を提供し得る。
的基礎が、例えば核において見出されるミトコンドリア外ＤＮＡよりもむしろミ
トコンドリアＤＮＡに存在するということを示唆する証拠が存在する。例えば、
インシュリン非依存性真性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）は、主に、母性パターンの遺伝
を示し、そしてまた、ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）欠損に基づくことが
公知である疾患に存在する。例えば、およそ１．５％の全ての糖尿病個体は、ロ
イシル−ｔＲＮＡ（ｔＲＮＡLeu）をコードするミトコンドリア遺伝子における
ｍｔＤＮＡ３２４３位において変異が潜む。この変異は、ＭＥＬＡＳ（ミトコン
ドリア脳障害、乳酸アシドーシスおよび発作）変異として公知である（Ｇｅｒｂ
ｉｔｚら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １２７１：２５３−２
６０、１９９５）。ｍｔＤＮＡ変異と、変更されたミトコンドリア機能と関連す
る他の疾患（アルツハイマー病（ＡＤ）、ハンティングトン病（ＨＤ）、パーキ
ンソン病（ＰＤ）、失調症、レーバー遺伝性視神経障害（ＬＨＯＮ）、精神***
病ならびにミオクローヌスてんかん赤筋線維症候群（ＭＥＲＲＦ）が挙げられる
が、これらに限定されない）との間の似たような関連性について、類似の理論が
進歩してきた。そのような変異の同定およびそれらの機能的重要性は、診断薬剤
および／または治療薬剤の開発のための標的を提供し得る。
【０００５】
ミトコンドリアは、酸化的リン酸化によって、生体エネルギー論的に不可欠な
アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）を生産する非細胞小器官である。機能的ミトコン
ドリアは、ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）に位置するミトコンドリア遺伝
子によってコードされる遺伝子産物および環状のミトコンドリアゲノムに位置し
ないミトコンドリア外遺伝子によってコードされる遺伝子産物を含む。この１６
．５ｋｂ ｍｔＤＮＡは、２２個のｔＲＮＡ、２個のリボソームＲＮＡ（１２ｓ
および１６ｓ ｒＲＮＡ）および電子伝達系（ＥＴＣ）（精巧なマルチ複合体ミ
トコンドリアアセンブリ（ここで、例えば呼吸性の酸化的リン酸化が生じる））
のわずか１３個の酵素をコードする。（例えば、Ｗａｌｌａｃｅら、Ｍｉｔｏｃ
ｈｏｎｄｒｉａ＆Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃａｌｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅ
ｒａｔｉｖｅ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｍ．Ｆ．Ｂｅａｌ，Ｎ．Ｈｏｗｅｌｌおよび
Ｉ．Ｂｏｄｉｓ−Ｗｏｌｌｎｅｒ，編、１９９７ Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎ
ｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２８３−３０７頁を参照のこと、そしてそこに引用さ
れる参考文献；例えば、また、Ｓｃｈｅｆｆｌｅｒ，Ｉ．Ｅ．，Ｍｉｔｏｃｈｏ
ｎｄｒｉａ，１９９９ Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．
を参照のこと）ミトコンドリアＤＮＡは、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼの７つのサ
ブユニット（ＥＴＣ複合体Ｉ（ＮＤ１、ＮＤ２、ＮＤ３、ＮＤ４、ＮＤ４Ｌ、Ｎ
Ｄ５およびＮＤ６）としても公知である）；複合体ＩＩＩの１つのサブユニット
（ユビキノール：シトクロムｃオキシドレダクターゼ、Ｃｙｔｂ）；３つのシト
クロムｃオキシダーゼ（複合体ＩＶ）サブユニット（ＣＯＸ１、ＣＯＸ２および
ＣＯＸ３）；ならびに２つのプロトン転移ＡＴＰシンターゼ（複合体Ｖ）サブユ
ニット（ＡＴＰアーゼ６およびＡＴＰアーゼ８）を含む多数のＥＴＣ成分をコー
ドする遺伝子配列を含む。圧倒的多数のミトコンドリア構造タンパク質および機
能タンパク質が、ミトコンドリア外の遺伝子（おそらくほとんどの場合は核にお
いて）コードされる。従って、ミトコンドリア遺伝子およびミトコンドリア外遺
伝子は、遺伝子産物およびそれらの下流の中間体（代謝産物、分解産物、基質、
前駆体、コファクターなどを含む）を経て直接的にか、または間接的に相互作用
し得る。従って、ミトコンドリア機能の変化（例えば、損なわれた電子伝達活性
、不完全な酸化的リン酸化または増加したフリーラジカル産生）は、不完全なｍ
ｔＤＮＡ、不完全なミトコンドリア外ＤＮＡ、不完全なミトコンドリア遺伝子産
物もしくは不完全なミトコンドリア外遺伝子産物、不完全な下流中間体またはこ
れらおよび他の因子の組み合わせの結果として生じ得る。
アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）を生産する非細胞小器官である。機能的ミトコン
ドリアは、ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）に位置するミトコンドリア遺伝
子によってコードされる遺伝子産物および環状のミトコンドリアゲノムに位置し
ないミトコンドリア外遺伝子によってコードされる遺伝子産物を含む。この１６
．５ｋｂ ｍｔＤＮＡは、２２個のｔＲＮＡ、２個のリボソームＲＮＡ（１２ｓ
および１６ｓ ｒＲＮＡ）および電子伝達系（ＥＴＣ）（精巧なマルチ複合体ミ
トコンドリアアセンブリ（ここで、例えば呼吸性の酸化的リン酸化が生じる））
のわずか１３個の酵素をコードする。（例えば、Ｗａｌｌａｃｅら、Ｍｉｔｏｃ
ｈｏｎｄｒｉａ＆Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃａｌｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅ
ｒａｔｉｖｅ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｍ．Ｆ．Ｂｅａｌ，Ｎ．Ｈｏｗｅｌｌおよび
Ｉ．Ｂｏｄｉｓ−Ｗｏｌｌｎｅｒ，編、１９９７ Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎ
ｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２８３−３０７頁を参照のこと、そしてそこに引用さ
れる参考文献；例えば、また、Ｓｃｈｅｆｆｌｅｒ，Ｉ．Ｅ．，Ｍｉｔｏｃｈｏ
ｎｄｒｉａ，１９９９ Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．
を参照のこと）ミトコンドリアＤＮＡは、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼの７つのサ
ブユニット（ＥＴＣ複合体Ｉ（ＮＤ１、ＮＤ２、ＮＤ３、ＮＤ４、ＮＤ４Ｌ、Ｎ
Ｄ５およびＮＤ６）としても公知である）；複合体ＩＩＩの１つのサブユニット
（ユビキノール：シトクロムｃオキシドレダクターゼ、Ｃｙｔｂ）；３つのシト
クロムｃオキシダーゼ（複合体ＩＶ）サブユニット（ＣＯＸ１、ＣＯＸ２および
ＣＯＸ３）；ならびに２つのプロトン転移ＡＴＰシンターゼ（複合体Ｖ）サブユ
ニット（ＡＴＰアーゼ６およびＡＴＰアーゼ８）を含む多数のＥＴＣ成分をコー
ドする遺伝子配列を含む。圧倒的多数のミトコンドリア構造タンパク質および機
能タンパク質が、ミトコンドリア外の遺伝子（おそらくほとんどの場合は核にお
いて）コードされる。従って、ミトコンドリア遺伝子およびミトコンドリア外遺
伝子は、遺伝子産物およびそれらの下流の中間体（代謝産物、分解産物、基質、
前駆体、コファクターなどを含む）を経て直接的にか、または間接的に相互作用
し得る。従って、ミトコンドリア機能の変化（例えば、損なわれた電子伝達活性
、不完全な酸化的リン酸化または増加したフリーラジカル産生）は、不完全なｍ
ｔＤＮＡ、不完全なミトコンドリア外ＤＮＡ、不完全なミトコンドリア遺伝子産
物もしくは不完全なミトコンドリア外遺伝子産物、不完全な下流中間体またはこ
れらおよび他の因子の組み合わせの結果として生じ得る。
【０００６】
ＡＤの場合において、ｍｔＤＮＡ変異と疾患との間の関連性を実証する試みは
、代表的にｍｔＤＮＡの調製を含み、次いで、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）
または関連する分析（例えば、Ｓｈｏｆｆｎｅｒら、１９９３ Ｇｅｎｏｍｉｃ
ｓ １７：１７１；Ｐｅｔｒｕｚｚｅｌｌａら、１９９２ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂ
ｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１８６：４９１；Ｋｏｓｅｌら、１９９
４ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０３：７４５
：Ｈｕｔｃｈｉｎら、１９９５ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １８：６８９２；Ｂｒｏｗｎら、１９９６ Ａｍ Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．
６１：２８３；Ｗｒａｇｇら、１９９５ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．２０１
：１０７；Ｚｓｕｒｋａら、１９９８ Ｂｉｏｌ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ ４４
：３７１；Ｈｕｔｃｈｉｎら、１９９７ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒ
ｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２４１：２２１；Ｈａｍｂｌｅｔら、１９９７ Ｍｕｔａ
ｔ．Ｒｅｓ．３７９：２５３；Ｅｇｅｎｓｐｅｒｇｅｒら、１９９７ Ｎｅｕｒ
ｏｐａｔｈｏｌ．Ａｐｐｌ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．２３：３１５；Ｌｉｎら、１
９９２ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１８２：２
３８；Ｔａｎｎｏら、１９９８ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ｏｆ Ａｇｉｎｇ，１９
（１Ｓ）：Ｓ４７；ＷＯ９４／０９１６２を参照のこと）を行い、野生型ヒトｍ
ｔＤＮＡの配列（例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎら、１９８１ Ｎａｔｕｒｅ ２９
０：４５７）により推定されるＲＦＬＰパターンと比較する。しかし、そのよう
なアプローチは、選択された制限エンドヌクレアーゼによって生成される制限酵
素断片パターンプロフィールが変えられるような、ｍｔＤＮＡ配列内の特定の位
置における変異（例えば、ヌクレオチド置換）の出現に依存する。
、代表的にｍｔＤＮＡの調製を含み、次いで、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）
または関連する分析（例えば、Ｓｈｏｆｆｎｅｒら、１９９３ Ｇｅｎｏｍｉｃ
ｓ １７：１７１；Ｐｅｔｒｕｚｚｅｌｌａら、１９９２ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂ
ｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１８６：４９１；Ｋｏｓｅｌら、１９９
４ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０３：７４５
：Ｈｕｔｃｈｉｎら、１９９５ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １８：６８９２；Ｂｒｏｗｎら、１９９６ Ａｍ Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．
６１：２８３；Ｗｒａｇｇら、１９９５ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．２０１
：１０７；Ｚｓｕｒｋａら、１９９８ Ｂｉｏｌ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ ４４
：３７１；Ｈｕｔｃｈｉｎら、１９９７ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒ
ｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２４１：２２１；Ｈａｍｂｌｅｔら、１９９７ Ｍｕｔａ
ｔ．Ｒｅｓ．３７９：２５３；Ｅｇｅｎｓｐｅｒｇｅｒら、１９９７ Ｎｅｕｒ
ｏｐａｔｈｏｌ．Ａｐｐｌ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．２３：３１５；Ｌｉｎら、１
９９２ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１８２：２
３８；Ｔａｎｎｏら、１９９８ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ｏｆ Ａｇｉｎｇ，１９
（１Ｓ）：Ｓ４７；ＷＯ９４／０９１６２を参照のこと）を行い、野生型ヒトｍ
ｔＤＮＡの配列（例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎら、１９８１ Ｎａｔｕｒｅ ２９
０：４５７）により推定されるＲＦＬＰパターンと比較する。しかし、そのよう
なアプローチは、選択された制限エンドヌクレアーゼによって生成される制限酵
素断片パターンプロフィールが変えられるような、ｍｔＤＮＡ配列内の特定の位
置における変異（例えば、ヌクレオチド置換）の出現に依存する。
【０００７】
明らかに、ＡＤの検出のための改善された組成物および方法に対する必要性お
よびＡＤの処置において有用である治療剤を同定する必要性が存在する。ＡＤの
根底にある欠陥がミトコンドリア起源またはミトコンドリア外起源を有するか否
かに関わらず、そして変更されたミトコンドリア機能の根底にある欠陥が同定さ
れているか否かに関わらず、本発明は、ＡＤの危険性または存在を決定するため
に有用であり、かつこの疾患を処置するために適切である薬剤を同定するために
有用である方法を提供する。詳細には、本明細書中以下に詳しく述べられるよう
に、本発明は、珍しい一塩基多型またはホモプラスミック（ｈｏｍｏｐｌａｓｍ
ｉｃ）ｍｔＤＮＡ変異の同定によってＡＤを検出するための組成物および方法な
らびに他の関連する利点を提供する。
よびＡＤの処置において有用である治療剤を同定する必要性が存在する。ＡＤの
根底にある欠陥がミトコンドリア起源またはミトコンドリア外起源を有するか否
かに関わらず、そして変更されたミトコンドリア機能の根底にある欠陥が同定さ
れているか否かに関わらず、本発明は、ＡＤの危険性または存在を決定するため
に有用であり、かつこの疾患を処置するために適切である薬剤を同定するために
有用である方法を提供する。詳細には、本明細書中以下に詳しく述べられるよう
に、本発明は、珍しい一塩基多型またはホモプラスミック（ｈｏｍｏｐｌａｓｍ
ｉｃ）ｍｔＤＮＡ変異の同定によってＡＤを検出するための組成物および方法な
らびに他の関連する利点を提供する。
【０００８】
（発明の要旨）
手短にいうと、本発明は、ＡＤを検出するために有用な組成物および方法に関
し、そしてミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）における一塩基多型またはホモ
プラスミック変異の同定に関与する。従って、そのような疾患を有する疑いがあ
るか、またはそのような疾患を有する危険にある第１の被験体においてアルツハ
イマー病についての危険性または存在を決定するための方法を提供することが本
発明の１つの局面であり、その方法は、ミトコンドリアＤＮＡ、第１の被験体か
ら得られた第１の生物学的サンプルおよび変更されたミトコンドリアの機能に関
連する疾患の危険性または存在から免れていることが公知の第２の被験体から得
られた第２のサンプルを含む第１および第２の生物学的サンプルの各々において
アルツハイマー病と関連する少なくとも１つのミトコンドリアの一塩基多型の存
在または非存在を決定する工程を包含し、ここで、第１の生物学的サンプルにお
けるアルツハイマー病に関連する少なくとも１つのミトコンドリア一塩基多型の
存在および第２の生物学的サンプルにおける対応するヌクレオチドにおけるミト
コンドリア一塩基多型の非存在は、アルツハイマー病の増大した危険を示し、そ
してそれからアルツハイマー病の危険性または存在を決定する。
し、そしてミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）における一塩基多型またはホモ
プラスミック変異の同定に関与する。従って、そのような疾患を有する疑いがあ
るか、またはそのような疾患を有する危険にある第１の被験体においてアルツハ
イマー病についての危険性または存在を決定するための方法を提供することが本
発明の１つの局面であり、その方法は、ミトコンドリアＤＮＡ、第１の被験体か
ら得られた第１の生物学的サンプルおよび変更されたミトコンドリアの機能に関
連する疾患の危険性または存在から免れていることが公知の第２の被験体から得
られた第２のサンプルを含む第１および第２の生物学的サンプルの各々において
アルツハイマー病と関連する少なくとも１つのミトコンドリアの一塩基多型の存
在または非存在を決定する工程を包含し、ここで、第１の生物学的サンプルにお
けるアルツハイマー病に関連する少なくとも１つのミトコンドリア一塩基多型の
存在および第２の生物学的サンプルにおける対応するヌクレオチドにおけるミト
コンドリア一塩基多型の非存在は、アルツハイマー病の増大した危険を示し、そ
してそれからアルツハイマー病の危険性または存在を決定する。
【０００９】
関連する実施形態において、この第１のサンプルにおけるミトコンドリアＤＮ
Ａが増幅されて、そして第２のサンプルにおけるミトコンドリアＤＮＡが増幅さ
れる。別の実施形態において、決定工程は、ミトコンドリアＤＮＡにプライマー
をハイブリダイゼーションさせるのに十分な条件下および時間で、第１の生物学
的サンプルおよび第２の生物学的サンプルの各々を、第１のサンプルのミトコン
ドリアＤＮＡに存在する配列および第２のサンプルのミトコンドリアＤＮＡに存
在する配列と相補的なヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドプライマー
と接触させる工程；ならびに、第１の産物を産生するための第１のサンプルのミ
トコンドリアＤＮＡに対するプライマーのハイブリダイゼーションおよび伸長な
らびに第１の産物から識別可能な第２の産物を産生するための第２のサンプルの
ミトコンドリアＤＮＡに対するプライマーのハイブリダイゼーションおよび伸長
を検出する工程、そしてそれからアルツハイマー病に関連する少なくとも１つの
ミトコンドリア一塩基多型の存在または非存在を決定する工程を包含する。特定
の実施形態において、第１のサンプルにおけるミトコンドリアＤＮＡが増幅され
、そして第２のサンプルにおけるミトコンドリアＤＮＡが増幅される。
Ａが増幅されて、そして第２のサンプルにおけるミトコンドリアＤＮＡが増幅さ
れる。別の実施形態において、決定工程は、ミトコンドリアＤＮＡにプライマー
をハイブリダイゼーションさせるのに十分な条件下および時間で、第１の生物学
的サンプルおよび第２の生物学的サンプルの各々を、第１のサンプルのミトコン
ドリアＤＮＡに存在する配列および第２のサンプルのミトコンドリアＤＮＡに存
在する配列と相補的なヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドプライマー
と接触させる工程；ならびに、第１の産物を産生するための第１のサンプルのミ
トコンドリアＤＮＡに対するプライマーのハイブリダイゼーションおよび伸長な
らびに第１の産物から識別可能な第２の産物を産生するための第２のサンプルの
ミトコンドリアＤＮＡに対するプライマーのハイブリダイゼーションおよび伸長
を検出する工程、そしてそれからアルツハイマー病に関連する少なくとも１つの
ミトコンドリア一塩基多型の存在または非存在を決定する工程を包含する。特定
の実施形態において、第１のサンプルにおけるミトコンドリアＤＮＡが増幅され
、そして第２のサンプルにおけるミトコンドリアＤＮＡが増幅される。
【００１０】
別の実施形態において、アルツハイマー病に関連し、そして第１の生物学的サ
ンプルに存在し、かつ第２の生物学的サンプルにおいて対応するヌクレオチド配
列に存在しない、少なくとも１つのミトコンドリア一塩基多型が、Ｄ−ループ、
ミトコンドリアｔＲＮＡ遺伝子、ミトコンドリアＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ遺伝
子、ミトコンドリアｔＲＮＡ遺伝子、ミトコンドリアシトクロムｃオキシダーゼ
遺伝子、ミトコンドリアＡＴＰシンターゼ遺伝子またはミトコンドリアシトクロ
ムｂ遺伝子があるミトコンドリアＤＮＡ領域内に存在する。別の実施形態におい
て、アルツハイマー病に関連し、そして第１の生物学的サンプルに存在し、かつ
第２の生物学的サンプルにおいて対応するヌクレオチドに存在しない、少なくと
も１つのミトコンドリア一塩基多型が、Ｄ−ループ、ミトコンドリアｔＲＮＡ遺
伝子、ミトコンドリアＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ遺伝子、ミトコンドリアｔＲＮ
Ａ遺伝子、ミトコンドリアシトクロムｃオキシダーゼ遺伝子、ミトコンドリアＡ
ＴＰシンターゼ遺伝子またはミトコンドリアシトクロムｂ遺伝子があるミトコン
ドリアＤＮＡ領域内に存在する。別の実施形態において、アルツハイマー病に関
連し、そして第１の生物学的サンプルに存在し、かつ第２の生物学的サンプルに
おいて対応するヌクレオチドに存在しない、少なくとも１つのミトコンドリア一
塩基多型が、ミトコンドリアＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ遺伝子、ミトコンドリア
シトクロムｃオキシダーゼ遺伝子、ミトコンドリアＡＴＰシンターゼ遺伝子また
はミトコンドリアシトクロムｂ遺伝子があるミトコンドリアＤＮＡ領域内に存在
し、そしてその一塩基多型は、非同義ヌクレオチド置換である。別の実施形態に
おいて、アルツハイマー病に関連し、そして第１の生物学的サンプルに存在し、
かつ第２の生物学的サンプルにおいて対応するヌクレオチドに存在しない、少な
くとも１つのミトコンドリア一塩基多型が、ミトコンドリアＮＡＤＨデヒドロゲ
ナーゼ遺伝子、ミトコンドリアシトクロムｃオキシダーゼ遺伝子、ミトコンドリ
アＡＴＰシンターゼ遺伝子またはミトコンドリアシトクロムｂ遺伝子があるミト
コンドリアＤＮＡ領域内に存在し、そして一塩基多型は、同義ヌクレオチド置換
である。
ンプルに存在し、かつ第２の生物学的サンプルにおいて対応するヌクレオチド配
列に存在しない、少なくとも１つのミトコンドリア一塩基多型が、Ｄ−ループ、
ミトコンドリアｔＲＮＡ遺伝子、ミトコンドリアＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ遺伝
子、ミトコンドリアｔＲＮＡ遺伝子、ミトコンドリアシトクロムｃオキシダーゼ
遺伝子、ミトコンドリアＡＴＰシンターゼ遺伝子またはミトコンドリアシトクロ
ムｂ遺伝子があるミトコンドリアＤＮＡ領域内に存在する。別の実施形態におい
て、アルツハイマー病に関連し、そして第１の生物学的サンプルに存在し、かつ
第２の生物学的サンプルにおいて対応するヌクレオチドに存在しない、少なくと
も１つのミトコンドリア一塩基多型が、Ｄ−ループ、ミトコンドリアｔＲＮＡ遺
伝子、ミトコンドリアＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ遺伝子、ミトコンドリアｔＲＮ
Ａ遺伝子、ミトコンドリアシトクロムｃオキシダーゼ遺伝子、ミトコンドリアＡ
ＴＰシンターゼ遺伝子またはミトコンドリアシトクロムｂ遺伝子があるミトコン
ドリアＤＮＡ領域内に存在する。別の実施形態において、アルツハイマー病に関
連し、そして第１の生物学的サンプルに存在し、かつ第２の生物学的サンプルに
おいて対応するヌクレオチドに存在しない、少なくとも１つのミトコンドリア一
塩基多型が、ミトコンドリアＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ遺伝子、ミトコンドリア
シトクロムｃオキシダーゼ遺伝子、ミトコンドリアＡＴＰシンターゼ遺伝子また
はミトコンドリアシトクロムｂ遺伝子があるミトコンドリアＤＮＡ領域内に存在
し、そしてその一塩基多型は、非同義ヌクレオチド置換である。別の実施形態に
おいて、アルツハイマー病に関連し、そして第１の生物学的サンプルに存在し、
かつ第２の生物学的サンプルにおいて対応するヌクレオチドに存在しない、少な
くとも１つのミトコンドリア一塩基多型が、ミトコンドリアＮＡＤＨデヒドロゲ
ナーゼ遺伝子、ミトコンドリアシトクロムｃオキシダーゼ遺伝子、ミトコンドリ
アＡＴＰシンターゼ遺伝子またはミトコンドリアシトクロムｂ遺伝子があるミト
コンドリアＤＮＡ領域内に存在し、そして一塩基多型は、同義ヌクレオチド置換
である。
【００１１】
本発明の特定の実施形態において、アルツハイマー病に関連し、そして第１の
生物学的サンプルに存在し、かつ第２の生物学的サンプルにおいて対応するヌク
レオチドに存在しない、少なくとも１つのミトコンドリア一塩基多型は、７２位
、１１４位、１４６位、１８５位、１８９位、１９９位、２０４位、２０７位、
２２８位、２３６位、２３９位、４５６位、４６２位、４８２位、４８９位、４
９７位、５００位、５１６位、５２２位、５２３位、５４７位、５９３位、６６
９位、９６０位、１００７位、１２４３位、１３９３位、１７１９位、１８０９
位、２３５２位、２４８３位、２７０２位、２８５１位、３１９７位、３３３３
位、３３３６位、３３４８位、３３９４位、３３９８位、３４２３位、３５０５
位、３５５９位、３９１５位、３９９２位、４０２４位、４０９５位、４２１６
位、４３３６位、４５２９位、４７２７位、４７９３位、４９１７位、４９９１
位、５００４位、５０４６位、５２２８位、５３１５位、５４１８位、５４２６
位、５４６０位、５４６１位、５５１６位、５５５４位、５６３４位、５６５６
位、５７７３位、６１８２位、６２２１位、６３４１位、６３６７位、６３７１
位、６４８９位、７１８４位、７３２５位、７６２１位、７７６８位、７７８７
位、７７８９位、７８６４位、７８９５位、７９６３位、８１４９位、８２５１
位、８２６９位、８２７６位、８２８４位、８４７０位、８４８５位、８５０８
位、８６０２位、８６９７位、８７５２位、８９０１位、８９９４位、９１２３
位、９２５４位、９３６２位、９３８０位、９４７７位、９５５４位、９７０８
位、９８０４位、９８６１位、１００３４位、１００４４位、１０２３８位、１
０４６３位、１０５８９位、１０９７８位、１１０６５位、１１２５１位、１１
２５３位、１１２７２位、１１４７０位、１１５２７位、１１６１１位、１１６
７４位、１１８１２位、１１９１４位、１１９４７位、１２４１４位、１２５０
１位、１２６０９位、１２７０５位、１２９５４位、１３１１１位、１３１９４
位、１３２１２位、１３３６８位、１３６１７位、１３７８０位、１３９６６位
、１４０２０位、１４１４８位、１４１７８位、１４１７９位、１４１８２位、
１４２１２位、１４２３３位、１４４７０位、１４５８２位、１４９０５位、１
５０２８位、１５０４３位、１５１９１位、１５２９９位、１５３８０位、１５
５５３位、１５６０７位、１５７５８位、１５７９０位、１５８０８位、１５８
３３位、１５８８４位、１５９２４位、１５９２８位、１６０６９位、１６０８
６位、１６０９３位、１６１２６位、１６１２９位、１６１４５位、１６１４７
位、１６１７２位、１６１７４位、１６１８２位、１６１８３位、１６１８９位
、１６１９２位、１６１９３位、１６２２３位、１６２２４位、１６２３４位、
１６２３５位、１６２３９位、１６２４８位、１６２５６位、１６２６１位、１
６２７０位、１６２７８位、１６２９０位、１６２９２位、１６２９３位、１６
２９４位、１６２９８位、１６３００位、１６３０４位、１６３０９位、１６３
１１位、１６３２０位、１６３５５位、１６３６２位、１６３９１位、１６４８
２位または１６５２４位である配列番号１のヌクレオチド位に対応するヌクレオ
チドに位置するミトコンドリア一塩基多型である。
生物学的サンプルに存在し、かつ第２の生物学的サンプルにおいて対応するヌク
レオチドに存在しない、少なくとも１つのミトコンドリア一塩基多型は、７２位
、１１４位、１４６位、１８５位、１８９位、１９９位、２０４位、２０７位、
２２８位、２３６位、２３９位、４５６位、４６２位、４８２位、４８９位、４
９７位、５００位、５１６位、５２２位、５２３位、５４７位、５９３位、６６
９位、９６０位、１００７位、１２４３位、１３９３位、１７１９位、１８０９
位、２３５２位、２４８３位、２７０２位、２８５１位、３１９７位、３３３３
位、３３３６位、３３４８位、３３９４位、３３９８位、３４２３位、３５０５
位、３５５９位、３９１５位、３９９２位、４０２４位、４０９５位、４２１６
位、４３３６位、４５２９位、４７２７位、４７９３位、４９１７位、４９９１
位、５００４位、５０４６位、５２２８位、５３１５位、５４１８位、５４２６
位、５４６０位、５４６１位、５５１６位、５５５４位、５６３４位、５６５６
位、５７７３位、６１８２位、６２２１位、６３４１位、６３６７位、６３７１
位、６４８９位、７１８４位、７３２５位、７６２１位、７７６８位、７７８７
位、７７８９位、７８６４位、７８９５位、７９６３位、８１４９位、８２５１
位、８２６９位、８２７６位、８２８４位、８４７０位、８４８５位、８５０８
位、８６０２位、８６９７位、８７５２位、８９０１位、８９９４位、９１２３
位、９２５４位、９３６２位、９３８０位、９４７７位、９５５４位、９７０８
位、９８０４位、９８６１位、１００３４位、１００４４位、１０２３８位、１
０４６３位、１０５８９位、１０９７８位、１１０６５位、１１２５１位、１１
２５３位、１１２７２位、１１４７０位、１１５２７位、１１６１１位、１１６
７４位、１１８１２位、１１９１４位、１１９４７位、１２４１４位、１２５０
１位、１２６０９位、１２７０５位、１２９５４位、１３１１１位、１３１９４
位、１３２１２位、１３３６８位、１３６１７位、１３７８０位、１３９６６位
、１４０２０位、１４１４８位、１４１７８位、１４１７９位、１４１８２位、
１４２１２位、１４２３３位、１４４７０位、１４５８２位、１４９０５位、１
５０２８位、１５０４３位、１５１９１位、１５２９９位、１５３８０位、１５
５５３位、１５６０７位、１５７５８位、１５７９０位、１５８０８位、１５８
３３位、１５８８４位、１５９２４位、１５９２８位、１６０６９位、１６０８
６位、１６０９３位、１６１２６位、１６１２９位、１６１４５位、１６１４７
位、１６１７２位、１６１７４位、１６１８２位、１６１８３位、１６１８９位
、１６１９２位、１６１９３位、１６２２３位、１６２２４位、１６２３４位、
１６２３５位、１６２３９位、１６２４８位、１６２５６位、１６２６１位、１
６２７０位、１６２７８位、１６２９０位、１６２９２位、１６２９３位、１６
２９４位、１６２９８位、１６３００位、１６３０４位、１６３０９位、１６３
１１位、１６３２０位、１６３５５位、１６３６２位、１６３９１位、１６４８
２位または１６５２４位である配列番号１のヌクレオチド位に対応するヌクレオ
チドに位置するミトコンドリア一塩基多型である。
【００１２】
別の実施形態において、アルツハイマー病に関連し、そして第１の生物学的サ
ンプルに存在し、かつ第２の生物学的サンプルにおいて対応するヌクレオチドに
存在しない、少なくとも１つのミトコンドリア一塩基多型は、７０９位、９３０
位、９６０位、９８０位、１１８９位、１２４３位、１７００位、１７１９位、
１８０９位、１８１１位、１８８８位、２０９８位、２１５８位、２２５９．２
３５２位、３０１０位、３１９７位、６６９位、７８９位、７９３位、８７０位
、９８０位、１００７位、１２４３位、１３９３位、１７０９位、１７１９位、
２１５６位、２２９４位、２４８３位、２５８１位、２８５１位、６３６６位ま
たは１２９５４位である配列番号１のヌクレオチド位に対応するヌクレオチドに
位置するミトコンドリア一塩基多型である。
ンプルに存在し、かつ第２の生物学的サンプルにおいて対応するヌクレオチドに
存在しない、少なくとも１つのミトコンドリア一塩基多型は、７０９位、９３０
位、９６０位、９８０位、１１８９位、１２４３位、１７００位、１７１９位、
１８０９位、１８１１位、１８８８位、２０９８位、２１５８位、２２５９．２
３５２位、３０１０位、３１９７位、６６９位、７８９位、７９３位、８７０位
、９８０位、１００７位、１２４３位、１３９３位、１７０９位、１７１９位、
２１５６位、２２９４位、２４８３位、２５８１位、２８５１位、６３６６位ま
たは１２９５４位である配列番号１のヌクレオチド位に対応するヌクレオチドに
位置するミトコンドリア一塩基多型である。
【００１３】
他の特定の実施形態において、本発明は、被験体のアルツハイマー病に対する
危険性または存在を決定するための方法を提供し、その方法は、その被験体に由
来するミトコンドリアＤＮＡを含む生物学的サンプルにおけるアルツハイマー病
と関連する少なくとも１つのミトコンドリア一塩基多型の存在を決定する工程を
包含する。特定の実施形態において、アルツハイマー病に関連する少なくとも１
つのミトコンドリア一塩基多型は、Ｄ−ループ、ミトコンドリアｒＲＮＡ遺伝子
、ミトコンドリアＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ遺伝子、ミトコンドリアｔＲＮＡ遺
伝子、ミトコンドリアシトクロムｃオキシダーゼ遺伝子、ミトコンドリアＡＴＰ
シンターゼ遺伝子またはミトコンドリアシトクロムｂ遺伝子があるミトコンドリ
アＤＮＡ領域内に存在する。特定の他の実施形態において、アルツハイマー病に
関連する少なくとも１つのミトコンドリア一塩基多型は、ミトコンドリアＮＡＤ
Ｈデヒドロゲナーゼ遺伝子、ミトコンドリアシトクロムｃオキシダーゼ遺伝子、
ミトコンドリアＡＴＰシンターゼ遺伝子またはミトコンドリアシトクロムｂ遺伝
子があるミトコンドリアＤＮＡ領域内に存在し、そしてその一塩基多型は、非同
義ヌクレオチド置換である。特定の他の実施形態において、アルツハイマー病に
関連する少なくとも１つのミトコンドリア一塩基多型が、ミトコンドリアＮＡＤ
Ｈデヒドロゲナーゼ遺伝子、ミトコンドリアシトクロムｃオキシダーゼ遺伝子、
ミトコンドリアＡＴＰシンターゼ遺伝子またはミトコンドリアシトクロムｂ遺伝
子があるミトコンドリアＤＮＡ領域内に存在し、そして一塩基多型は、同義ヌク
レオチド置換である。
危険性または存在を決定するための方法を提供し、その方法は、その被験体に由
来するミトコンドリアＤＮＡを含む生物学的サンプルにおけるアルツハイマー病
と関連する少なくとも１つのミトコンドリア一塩基多型の存在を決定する工程を
包含する。特定の実施形態において、アルツハイマー病に関連する少なくとも１
つのミトコンドリア一塩基多型は、Ｄ−ループ、ミトコンドリアｒＲＮＡ遺伝子
、ミトコンドリアＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ遺伝子、ミトコンドリアｔＲＮＡ遺
伝子、ミトコンドリアシトクロムｃオキシダーゼ遺伝子、ミトコンドリアＡＴＰ
シンターゼ遺伝子またはミトコンドリアシトクロムｂ遺伝子があるミトコンドリ
アＤＮＡ領域内に存在する。特定の他の実施形態において、アルツハイマー病に
関連する少なくとも１つのミトコンドリア一塩基多型は、ミトコンドリアＮＡＤ
Ｈデヒドロゲナーゼ遺伝子、ミトコンドリアシトクロムｃオキシダーゼ遺伝子、
ミトコンドリアＡＴＰシンターゼ遺伝子またはミトコンドリアシトクロムｂ遺伝
子があるミトコンドリアＤＮＡ領域内に存在し、そしてその一塩基多型は、非同
義ヌクレオチド置換である。特定の他の実施形態において、アルツハイマー病に
関連する少なくとも１つのミトコンドリア一塩基多型が、ミトコンドリアＮＡＤ
Ｈデヒドロゲナーゼ遺伝子、ミトコンドリアシトクロムｃオキシダーゼ遺伝子、
ミトコンドリアＡＴＰシンターゼ遺伝子またはミトコンドリアシトクロムｂ遺伝
子があるミトコンドリアＤＮＡ領域内に存在し、そして一塩基多型は、同義ヌク
レオチド置換である。
【００１４】
別の実施形態において、アルツハイマー病と関連する少なくとも１つのミトコ
ンドリア一塩基多型は、７２位、１１４位、１４６位、１８５位、１８９位、１
９９位、２０４位、２０７位、２２８位、２３６位、２３９位、４５６位、４６
２位、４８２位、４８９位、４９７位、５００位、５１６位、５２２位、５２３
位、５４７位、５９３位、６６９位、９６０位、１００７位、１２４３位、１３
９３位、１７１９位、１８０９位、２３５２位、２４８３位、２７０２位、２８
５１位、３１９７位、３３３３位、３３３６位、３３４８位、３３９４位、３３
９８位、３４２３位、３５０５位、３５５９位、３９１５位、３９９２位、４０
２４位、４０９５位、４２１６位、４３３６位、４５２９位、４７２７位、４７
９３位、４９１７位、４９９１位、５００４位、５０４６位、５２２８位、５３
１５位、５４１８位、５４２６位、５４６０位、５４６１位、５５１６位、５５
５４位、５６３４位、５６５６位、５７７３位、６１８２位、６２２１位、６３
４１位、６３６７位、６３７１位、６４８９位、７１４８位、７３２５位、７６
２１位、７７６８位、７７８７位、７７８９位、７８６４位、７８９５位、７９
６３位、８１４９位、８２５１位、８２６９位、８２７６位、８２８４位、８４
７０位、８４８５位、８５０８位、８６０２位、８６９７位、８７５２位、８９
０１位、８９９４位、９１２３位、９２５４位、９３６２位、９３８０位、９４
７７位、９５５４位、９７０８位、９８０４位、９８６１位、１００３４位、１
００４４位、１０２３８位、１０４６３位、１０５８９位、１０９７８位、１１
０６５位、１１２５１位、１１２５３位、１１２７２位、１１４７０位、１１５
２７位、１１６１１位、１１６７４位、１１８１２位、１１９１４位、１１９４
７位、１２４１４位、１２５０１位、１２６０９位、１２７０５位、１２９５４
位、１３１１１位、１３１９４位、１３２１２位、１３３６８位、１３６１７位
、１３７８０位、１３９６６位、１４０２０位、１４１４８位、１４１７８位、
１４１７９位、１４１８２位、１４２１２位、１４２３３位、１４４７０位、１
４５８２位、１４９０５位、１５０２８位、１５０４３位、１５１９１位、１５
２９９位、１５３８０位、１５５５３位、１５６０７位、１５７５８位、１５７
９０位、１５８０８位、１５８３３位、１５８８４位、１５９２４位、１５９２
８位、１６０６９位、１６０８６位、１６０９３位、１６１２６位、１６１２９
位、１６１４５位、１６１４７位、１６１７２位、１６１７４位、１６１８２位
、１６１８３位、１６１８９位、１６１９２位、１６１９３位、１６２２３位、
１６２２４位、１６２３４位、１６２３５位、１６２３９位、１６２４８位、１
６２５６位、１６２６１位、１６２７０位、１６２７８位、１６２９０位、１６
２９２位、１６２９３位、１６２９４位、１６２９８位、１６３００位、１６３
０４位、１６３０９位、１６３１１位、１６３２０位、１６３５５位、１６３６
２位、１６３９１位、１６４８２位または１６５２４位である配列番号１のヌク
レオチド位に対応するヌクレオチドに位置するミトコンドリア一塩基多型である
。
ンドリア一塩基多型は、７２位、１１４位、１４６位、１８５位、１８９位、１
９９位、２０４位、２０７位、２２８位、２３６位、２３９位、４５６位、４６
２位、４８２位、４８９位、４９７位、５００位、５１６位、５２２位、５２３
位、５４７位、５９３位、６６９位、９６０位、１００７位、１２４３位、１３
９３位、１７１９位、１８０９位、２３５２位、２４８３位、２７０２位、２８
５１位、３１９７位、３３３３位、３３３６位、３３４８位、３３９４位、３３
９８位、３４２３位、３５０５位、３５５９位、３９１５位、３９９２位、４０
２４位、４０９５位、４２１６位、４３３６位、４５２９位、４７２７位、４７
９３位、４９１７位、４９９１位、５００４位、５０４６位、５２２８位、５３
１５位、５４１８位、５４２６位、５４６０位、５４６１位、５５１６位、５５
５４位、５６３４位、５６５６位、５７７３位、６１８２位、６２２１位、６３
４１位、６３６７位、６３７１位、６４８９位、７１４８位、７３２５位、７６
２１位、７７６８位、７７８７位、７７８９位、７８６４位、７８９５位、７９
６３位、８１４９位、８２５１位、８２６９位、８２７６位、８２８４位、８４
７０位、８４８５位、８５０８位、８６０２位、８６９７位、８７５２位、８９
０１位、８９９４位、９１２３位、９２５４位、９３６２位、９３８０位、９４
７７位、９５５４位、９７０８位、９８０４位、９８６１位、１００３４位、１
００４４位、１０２３８位、１０４６３位、１０５８９位、１０９７８位、１１
０６５位、１１２５１位、１１２５３位、１１２７２位、１１４７０位、１１５
２７位、１１６１１位、１１６７４位、１１８１２位、１１９１４位、１１９４
７位、１２４１４位、１２５０１位、１２６０９位、１２７０５位、１２９５４
位、１３１１１位、１３１９４位、１３２１２位、１３３６８位、１３６１７位
、１３７８０位、１３９６６位、１４０２０位、１４１４８位、１４１７８位、
１４１７９位、１４１８２位、１４２１２位、１４２３３位、１４４７０位、１
４５８２位、１４９０５位、１５０２８位、１５０４３位、１５１９１位、１５
２９９位、１５３８０位、１５５５３位、１５６０７位、１５７５８位、１５７
９０位、１５８０８位、１５８３３位、１５８８４位、１５９２４位、１５９２
８位、１６０６９位、１６０８６位、１６０９３位、１６１２６位、１６１２９
位、１６１４５位、１６１４７位、１６１７２位、１６１７４位、１６１８２位
、１６１８３位、１６１８９位、１６１９２位、１６１９３位、１６２２３位、
１６２２４位、１６２３４位、１６２３５位、１６２３９位、１６２４８位、１
６２５６位、１６２６１位、１６２７０位、１６２７８位、１６２９０位、１６
２９２位、１６２９３位、１６２９４位、１６２９８位、１６３００位、１６３
０４位、１６３０９位、１６３１１位、１６３２０位、１６３５５位、１６３６
２位、１６３９１位、１６４８２位または１６５２４位である配列番号１のヌク
レオチド位に対応するヌクレオチドに位置するミトコンドリア一塩基多型である
。
【００１５】
特定の実施形態において、アルツハイマー病と関連する少なくとも１つのミト
コンドリア一塩基多型は、７０９位、９３０位、９６０位、９８０位、１１８９
位、１２４３位、１７００位、１７１９位、１８０９位、１８１１位、１８８８
位、２０９８位、２１５８位、２２５９位、２３５２位、３０１０位、３１９７
位、６６９位、７８９位、７９３位、８７０位、９８０位、１００７位、１２４
３位、１３９３位、１７０９位、１７１９位、２１５６位、２２９４位、２４８
３位、２５８１位、２８５１位、６３６６位または１２９５４位である配列番号
１のヌクレオチド位に対応するヌクレオチドに位置するミトコンドリア一塩基多
型である。
コンドリア一塩基多型は、７０９位、９３０位、９６０位、９８０位、１１８９
位、１２４３位、１７００位、１７１９位、１８０９位、１８１１位、１８８８
位、２０９８位、２１５８位、２２５９位、２３５２位、３０１０位、３１９７
位、６６９位、７８９位、７９３位、８７０位、９８０位、１００７位、１２４
３位、１３９３位、１７０９位、１７１９位、２１５６位、２２９４位、２４８
３位、２５８１位、２８５１位、６３６６位または１２９５４位である配列番号
１のヌクレオチド位に対応するヌクレオチドに位置するミトコンドリア一塩基多
型である。
【００１６】
別の局面において、本発明は、薬剤がアルツハイマー病を引き起こすか、その
病理に寄与するか、または悪化させる可能性があるか否かを決定する方法を提供
し、この方法は、細胞を候補薬剤と接触させる工程、その薬剤と接触させた後に
、ミトコンドリア核酸が１以上の一塩基多型を含むか否かを決定するためのミト
コンドリア核酸のアッセイを実行する工程を包含し、ここで、上記核酸は、細胞
中に存在するかまたはその細胞に由来し、そして１以上の一塩基多型がアルツハ
イマー病とともに分離する。
病理に寄与するか、または悪化させる可能性があるか否かを決定する方法を提供
し、この方法は、細胞を候補薬剤と接触させる工程、その薬剤と接触させた後に
、ミトコンドリア核酸が１以上の一塩基多型を含むか否かを決定するためのミト
コンドリア核酸のアッセイを実行する工程を包含し、ここで、上記核酸は、細胞
中に存在するかまたはその細胞に由来し、そして１以上の一塩基多型がアルツハ
イマー病とともに分離する。
【００１７】
本発明の別の局面において、薬剤がアルツハイマー病を引き起こすか、その病
理に寄与するか、または悪化させる可能性があるか否かを決定する方法を提供し
、この方法は、第１の細胞を候補薬剤と接触させる工程；薬剤と接触させていな
い第２の細胞、および上記第１の細胞を、等価な条件下でインキュベートする工
程；ミトコンドリア核酸が１以上の一塩基多型を含むか否かを決定するための１
以上のミトコンドリア核酸のアッセイを実行する工程を包含し、ここで、上記核
酸は、細胞中に存在するかまたは細胞に由来し、そして一塩基多型がアルツハイ
マー病とともに分離し、ここで、第１の細胞中に存在するか、またはその第１の
細胞由来のミトコンドリア核酸中の１以上の変異の存在、および第２の細胞中に
存在するか、またはその第２の細胞由来のミトコンドリア核酸中の１以上の変異
の非存在が、その薬剤がアルツハイマー病を引き起こすか、その病理に寄与する
か、または悪化させる可能性があるか否かを示す。
理に寄与するか、または悪化させる可能性があるか否かを決定する方法を提供し
、この方法は、第１の細胞を候補薬剤と接触させる工程；薬剤と接触させていな
い第２の細胞、および上記第１の細胞を、等価な条件下でインキュベートする工
程；ミトコンドリア核酸が１以上の一塩基多型を含むか否かを決定するための１
以上のミトコンドリア核酸のアッセイを実行する工程を包含し、ここで、上記核
酸は、細胞中に存在するかまたは細胞に由来し、そして一塩基多型がアルツハイ
マー病とともに分離し、ここで、第１の細胞中に存在するか、またはその第１の
細胞由来のミトコンドリア核酸中の１以上の変異の存在、および第２の細胞中に
存在するか、またはその第２の細胞由来のミトコンドリア核酸中の１以上の変異
の非存在が、その薬剤がアルツハイマー病を引き起こすか、その病理に寄与する
か、または悪化させる可能性があるか否かを示す。
【００１８】
別の局面において、本発明は、固体支持体上に固定化された、複数の単離され
た核酸分子を含む核酸アレイを提供し、ここで、この単離された核酸分子は、配
列番号１に示される核酸配列のすべてまたは一部を含み、上記配列において、ア
ルツハイマー病と関連する少なくとも１つのミトコンドリアの一塩基多型が存在
する。特定の実施形態において、ミトコンドリアの一塩基多型が、上記に列挙さ
れた位置番号のいずれかである配列番号１のヌクレオチド位置に対応するヌクレ
オチドに位置する。他の実施形態において、決定する工程は、第１の生物学的サ
ンプルおよび第２の生物学的サンプルの各々を、プライマーのミトコンドリアＤ
ＮＡに対するハイブリダイゼーションを可能にするための条件下で、およびその
ために十分な時間の間、配列番号１に示した核酸配列のすべてまたは一部を含む
オリゴヌクレオチドプライマーと接触させる工程を包含し、上記配列において、
アルツハイマー病と関連する少なくとも１つのミトコンドリアの一塩基多型が存
在する；ならびに、第１のサンプルのミトコンドリアＤＮＡに対するオリゴヌク
レオチドプライマーのハイブリダイゼーションの量を、第２のサンプルのミトコ
ンドリアＤＮＡに対するそのプライマーのハイブリダイゼーションの量とを比較
し、それからアルツハイマー病に関連する少なくとも１つのミトコンドリアの一
塩基多型の存在または非存在を決定する工程、を包含する。特定の実施形態にお
いて、ミトコンドリアの一塩基多型は、上記に列挙された位置番号のいずれかで
ある、配列番号１のヌクレオチド位置に対応するヌクレオチドに位置する。特定
の他の実施形態において、決定する工程は、第１および第２の生物学的サンプル
の各々を、ミトコンドリアＤＮＡが、単離された核酸分子に対するハイブリダイ
ゼーションを可能にするための条件下で、およびそのために十分な時間の間、固
体支持体上に固定化された、複数の単離された核酸分子を含む核酸アレイと接触
させる工程を包含し、ここで、この単離された核酸分子は、配列番号１に示され
る核酸配列のすべてまたは一部を含み、上記配列において、アルツハイマー病と
関連する少なくとも１つのミトコンドリアの一塩基多型が存在する；ならびに、
核酸アレイに対する第１のサンプルのミトコンドリアＤＮＡのハイブリダイゼー
ションの量を、核酸アレイに対する第２のサンプルのミトコンドリアＤＮＡのハ
イブリダイゼーションの量とを比較して、それからアルツハイマー病に関連する
少なくとも１つのミトコンドリアの一塩基多型の存在または非存在を決定する工
程、を包含する。特定の実施形態において、ミトコンドリアの一塩基多型が、上
記に列挙された位置番号のいずれかである配列番号１のヌクレオチド位置に対応
するヌクレオチドに位置する。
た核酸分子を含む核酸アレイを提供し、ここで、この単離された核酸分子は、配
列番号１に示される核酸配列のすべてまたは一部を含み、上記配列において、ア
ルツハイマー病と関連する少なくとも１つのミトコンドリアの一塩基多型が存在
する。特定の実施形態において、ミトコンドリアの一塩基多型が、上記に列挙さ
れた位置番号のいずれかである配列番号１のヌクレオチド位置に対応するヌクレ
オチドに位置する。他の実施形態において、決定する工程は、第１の生物学的サ
ンプルおよび第２の生物学的サンプルの各々を、プライマーのミトコンドリアＤ
ＮＡに対するハイブリダイゼーションを可能にするための条件下で、およびその
ために十分な時間の間、配列番号１に示した核酸配列のすべてまたは一部を含む
オリゴヌクレオチドプライマーと接触させる工程を包含し、上記配列において、
アルツハイマー病と関連する少なくとも１つのミトコンドリアの一塩基多型が存
在する；ならびに、第１のサンプルのミトコンドリアＤＮＡに対するオリゴヌク
レオチドプライマーのハイブリダイゼーションの量を、第２のサンプルのミトコ
ンドリアＤＮＡに対するそのプライマーのハイブリダイゼーションの量とを比較
し、それからアルツハイマー病に関連する少なくとも１つのミトコンドリアの一
塩基多型の存在または非存在を決定する工程、を包含する。特定の実施形態にお
いて、ミトコンドリアの一塩基多型は、上記に列挙された位置番号のいずれかで
ある、配列番号１のヌクレオチド位置に対応するヌクレオチドに位置する。特定
の他の実施形態において、決定する工程は、第１および第２の生物学的サンプル
の各々を、ミトコンドリアＤＮＡが、単離された核酸分子に対するハイブリダイ
ゼーションを可能にするための条件下で、およびそのために十分な時間の間、固
体支持体上に固定化された、複数の単離された核酸分子を含む核酸アレイと接触
させる工程を包含し、ここで、この単離された核酸分子は、配列番号１に示され
る核酸配列のすべてまたは一部を含み、上記配列において、アルツハイマー病と
関連する少なくとも１つのミトコンドリアの一塩基多型が存在する；ならびに、
核酸アレイに対する第１のサンプルのミトコンドリアＤＮＡのハイブリダイゼー
ションの量を、核酸アレイに対する第２のサンプルのミトコンドリアＤＮＡのハ
イブリダイゼーションの量とを比較して、それからアルツハイマー病に関連する
少なくとも１つのミトコンドリアの一塩基多型の存在または非存在を決定する工
程、を包含する。特定の実施形態において、ミトコンドリアの一塩基多型が、上
記に列挙された位置番号のいずれかである配列番号１のヌクレオチド位置に対応
するヌクレオチドに位置する。
【００１９】
本発明のこれらおよび他の局面は、以下の詳細な説明および添付の図面を参照
して明白となる。さらに、本発明の特定の局面をより詳細に記載する種々の参考
文献が本明細書中に示され、従って、その全体が参考として援用される。
して明白となる。さらに、本発明の特定の局面をより詳細に記載する種々の参考
文献が本明細書中に示され、従って、その全体が参考として援用される。
【００２０】
（発明の詳細な説明）
本発明は、一般的に、アルツハイマー病（ＡＤ）の危険性または存在を診断す
るための組成物および方法、ならびにＡＤを処置するために適切であり得る薬剤
の同定のための組成物および方法に関する。
るための組成物および方法、ならびにＡＤを処置するために適切であり得る薬剤
の同定のための組成物および方法に関する。
【００２１】
本発明に従って、本明細書中に記載されるようなミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔ
ＤＮＡ）中の変化は、ＡＤの危険性または存在を診断するため、およびこの疾患
を処置するために適切であり得る薬剤を同定するための新規かつ有用なパラメー
ターを提供する。このような変化には、例えば、一塩基多型（ＳＮＰ）またはホ
モプラスミックｍｔＤＮＡ変異（例えば、Ｓｃｈｅｆｆｌｅｒ，Ｉ．Ｅ．、Ｍｉ
ｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ、１９９９、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙ
ｏｒｋ、２８６〜２８７頁を参照のこと）が含まれ得る。従って、本発明は、Ａ
Ｄに関連する変異に対する適切な部分に関し、これらには、特定の実施形態にお
いてｍｔＤＮＡ中の特定の位置で起こるＳＮＰまたはホモプラスミックｍｔＤＮ
Ａ変異を含むがこれらに限定されない。他の特定の実施形態において、ＳＮＰま
たはホモプラスミックｍｔＤＮＡ変異は、ＡＤを有する危険性のないことが知ら
れている被験体と比較して、ＡＤを有するか、または有する危険性にある被験体
中で、変化した頻度で起こる（例えば、統計学的に有意な様式で、増加または減
少する頻度で）か、あるいは、他の特定の実施形態において、ＳＮＰまたはホモ
プラスミックｍｔＤＮＡ変異は、ＡＤを有する危険性のないことが知られている
集団と比較して、ＡＤを有するか、または有する危険性にある患者集団中で、変
化した頻度で起こる（例えば、統計学的に有意な様式で、増加または減少する頻
度で）。
ＤＮＡ）中の変化は、ＡＤの危険性または存在を診断するため、およびこの疾患
を処置するために適切であり得る薬剤を同定するための新規かつ有用なパラメー
ターを提供する。このような変化には、例えば、一塩基多型（ＳＮＰ）またはホ
モプラスミックｍｔＤＮＡ変異（例えば、Ｓｃｈｅｆｆｌｅｒ，Ｉ．Ｅ．、Ｍｉ
ｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ、１９９９、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙ
ｏｒｋ、２８６〜２８７頁を参照のこと）が含まれ得る。従って、本発明は、Ａ
Ｄに関連する変異に対する適切な部分に関し、これらには、特定の実施形態にお
いてｍｔＤＮＡ中の特定の位置で起こるＳＮＰまたはホモプラスミックｍｔＤＮ
Ａ変異を含むがこれらに限定されない。他の特定の実施形態において、ＳＮＰま
たはホモプラスミックｍｔＤＮＡ変異は、ＡＤを有する危険性のないことが知ら
れている被験体と比較して、ＡＤを有するか、または有する危険性にある被験体
中で、変化した頻度で起こる（例えば、統計学的に有意な様式で、増加または減
少する頻度で）か、あるいは、他の特定の実施形態において、ＳＮＰまたはホモ
プラスミックｍｔＤＮＡ変異は、ＡＤを有する危険性のないことが知られている
集団と比較して、ＡＤを有するか、または有する危険性にある患者集団中で、変
化した頻度で起こる（例えば、統計学的に有意な様式で、増加または減少する頻
度で）。
【００２２】
本明細書中で提供されるような、ｍｔＤＮＡを含む、本発明に従う使用のため
の生物学的サンプルは、ミトコンドリア由来の核酸（例えば、ｍｔＤＮＡ）が存
在する任意の組織または細胞集団を含み得る。ｍｔＤＮＡを獲得および検出する
ために有用な組成物および方法が、例えば、米国特許第５，５６５，３２３号お
よび同第５，８４０，４９３号に提供される。生物学的サンプルは、血液サンプ
ル、生検試料、組織外植片、器官培養物、または被験体もしくは生物学的供給源
からの任意の他の組織もしくは細胞調製物を得ることによって提供され得る。こ
の被験体または生物学的供給源は、ヒトまたは非ヒト動物、一次細胞培養物また
は培養適用細胞株であり得、これには、染色体に組み込まれた核酸配列またはエ
ピソーム性組換え核酸配列を含み得る遺伝子操作された細胞株、不死化されたか
または不死化可能な細胞株、体細胞ハイブリッドまたは細胞質ハイブリッド「サ
イブリッド（ｃｙｂｒｉｄ）」細胞株（例えば、米国特許第５，８８８，４９８
号を参照のこと）、分化したかまたは分化可能な細胞株、形質転換した細胞株な
どが含まれるがこれらに限定されない。本発明の特定の実施形態において、被験
体または生物学的な供給源は、ミトコンドリア機能の変化（例えば、ＡＤ）と関
連する疾患を有するかまたはその疾患を有する危険性があることが疑われ得、そ
して本発明の特定の実施形態において、被験体または生物学的な供給源は、その
ような疾患の危険性がないか、またはその疾患の存在がないことが公知であり得
る。例えば、非限定的な理論に従って、特定の実施形態において、被験体または
生物学的供給源として、コントロール個体を使用することが所望され得る。この
コントロール個体は、代表的には、他の任意の数の、生物学的、生理的、免疫学
的、薬学的、病理学的、神経学的、または他の生物医学的な判断基準などによっ
て、年齢および／または性別の一致した個体、健常個体、または、ＡＤを有する
かまたはその危険性があると疑われる被験体のためのコントロールとして適切な
個体である。当業者は、臨床的相関のためのこのようなパラメーターの設計およ
び選択について精通している。例えば、特定の実施形態において、以下に記載さ
れるようなＡＤ関連の徴候および症状がないと考えられているコントロール個体
を同定することが所望され得、そして他の特定の実施形態において、コントロー
ル個体は、被験体の母親または兄弟姉妹のような、ＡＤについて危険性を有する
と疑われている被験体に対するミトコンドリアの遺伝的関連性を共有し得る（例
えば、Ｓｃｈｅｆｆｌｅｒ、１９９９、前出を参照のこと）。本発明の他の特定
の実施形態において、被験体または生物学的供給源は、少なくとも６４歳の年齢
であり、そして他の特定の実施形態において、被験体または生物学的供給源は、
少なくとも７５歳の年齢である。他の好ましい実施形態において、被験体または
生物学的供給源は、少なくとも８５歳の年齢である。
の生物学的サンプルは、ミトコンドリア由来の核酸（例えば、ｍｔＤＮＡ）が存
在する任意の組織または細胞集団を含み得る。ｍｔＤＮＡを獲得および検出する
ために有用な組成物および方法が、例えば、米国特許第５，５６５，３２３号お
よび同第５，８４０，４９３号に提供される。生物学的サンプルは、血液サンプ
ル、生検試料、組織外植片、器官培養物、または被験体もしくは生物学的供給源
からの任意の他の組織もしくは細胞調製物を得ることによって提供され得る。こ
の被験体または生物学的供給源は、ヒトまたは非ヒト動物、一次細胞培養物また
は培養適用細胞株であり得、これには、染色体に組み込まれた核酸配列またはエ
ピソーム性組換え核酸配列を含み得る遺伝子操作された細胞株、不死化されたか
または不死化可能な細胞株、体細胞ハイブリッドまたは細胞質ハイブリッド「サ
イブリッド（ｃｙｂｒｉｄ）」細胞株（例えば、米国特許第５，８８８，４９８
号を参照のこと）、分化したかまたは分化可能な細胞株、形質転換した細胞株な
どが含まれるがこれらに限定されない。本発明の特定の実施形態において、被験
体または生物学的な供給源は、ミトコンドリア機能の変化（例えば、ＡＤ）と関
連する疾患を有するかまたはその疾患を有する危険性があることが疑われ得、そ
して本発明の特定の実施形態において、被験体または生物学的な供給源は、その
ような疾患の危険性がないか、またはその疾患の存在がないことが公知であり得
る。例えば、非限定的な理論に従って、特定の実施形態において、被験体または
生物学的供給源として、コントロール個体を使用することが所望され得る。この
コントロール個体は、代表的には、他の任意の数の、生物学的、生理的、免疫学
的、薬学的、病理学的、神経学的、または他の生物医学的な判断基準などによっ
て、年齢および／または性別の一致した個体、健常個体、または、ＡＤを有する
かまたはその危険性があると疑われる被験体のためのコントロールとして適切な
個体である。当業者は、臨床的相関のためのこのようなパラメーターの設計およ
び選択について精通している。例えば、特定の実施形態において、以下に記載さ
れるようなＡＤ関連の徴候および症状がないと考えられているコントロール個体
を同定することが所望され得、そして他の特定の実施形態において、コントロー
ル個体は、被験体の母親または兄弟姉妹のような、ＡＤについて危険性を有する
と疑われている被験体に対するミトコンドリアの遺伝的関連性を共有し得る（例
えば、Ｓｃｈｅｆｆｌｅｒ、１９９９、前出を参照のこと）。本発明の他の特定
の実施形態において、被験体または生物学的供給源は、少なくとも６４歳の年齢
であり、そして他の特定の実施形態において、被験体または生物学的供給源は、
少なくとも７５歳の年齢である。他の好ましい実施形態において、被験体または
生物学的供給源は、少なくとも８５歳の年齢である。
【００２３】
特定の好ましい実施形態において、被験体または生物学的供給源が、アルツハ
イマー病（ＡＤ）の指標である臨床的パラメーターに当てはまるか否かを決定す
ることが所望され得る。当業者によって受け入れられているＡＤの徴候および症
状（例えば、ＭｃＫｈａｎｎら（Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ３４：９３９、１９８４
、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、Ｃｏｍ
ｍｕｎｉｃａｔｉｖｅ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ａｎｄ Ｓｔｒｏｋｅ ａｎｄ
Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｄｉｓｏ
ｒｄｅｒｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｃｒｉｔｅｒｉａ ｏｆ Ｐｒｏｂａｂ
ｌｅ ＡＤ、ＮＩＮＣＯＳ−ＡＤＲＤＡ）およびそこに引用されている参考文献
において言及されている臨床徴候、またはＡＤを診断するために当該分野で公知
の他の手順は、被験体または生物学的供給源をそのように指定するために使用さ
れ得る。Ａｎｄｅｒｓｏｎら（配列番号１、１９８１、Ｎａｔｕｒｅ ２９０：
４５７；Ｍａｒｚｕｋｉら、１９９１ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ８８：
１３９もまた参照のこと）によって開示されるヒトｍｔＤＮＡ配列に対応し、そ
してＡｎｄｒｅｗら（１９９９ Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２３：１４
７）に従って変更された任意のｍｔＲＮＡ配列または変異したｍｔＤＮＡ配列の
一部、またはその一部またはそのいくつかの部分は、本発明のこれらの実施形態
において有用であり得る。本発明のこれらおよび他の実施形態において有用であ
る特定のｍｔＤＮＡ配列領域に由来するヒトｍｔＤＮＡの点変異の例は、表１〜
４および表９において、野生型および変異体ｍｔＤＮＡが異なるヌクレオチド位
置に従って開示される。
イマー病（ＡＤ）の指標である臨床的パラメーターに当てはまるか否かを決定す
ることが所望され得る。当業者によって受け入れられているＡＤの徴候および症
状（例えば、ＭｃＫｈａｎｎら（Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ３４：９３９、１９８４
、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、Ｃｏｍ
ｍｕｎｉｃａｔｉｖｅ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ａｎｄ Ｓｔｒｏｋｅ ａｎｄ
Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｄｉｓｏ
ｒｄｅｒｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｃｒｉｔｅｒｉａ ｏｆ Ｐｒｏｂａｂ
ｌｅ ＡＤ、ＮＩＮＣＯＳ−ＡＤＲＤＡ）およびそこに引用されている参考文献
において言及されている臨床徴候、またはＡＤを診断するために当該分野で公知
の他の手順は、被験体または生物学的供給源をそのように指定するために使用さ
れ得る。Ａｎｄｅｒｓｏｎら（配列番号１、１９８１、Ｎａｔｕｒｅ ２９０：
４５７；Ｍａｒｚｕｋｉら、１９９１ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ８８：
１３９もまた参照のこと）によって開示されるヒトｍｔＤＮＡ配列に対応し、そ
してＡｎｄｒｅｗら（１９９９ Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２３：１４
７）に従って変更された任意のｍｔＲＮＡ配列または変異したｍｔＤＮＡ配列の
一部、またはその一部またはそのいくつかの部分は、本発明のこれらの実施形態
において有用であり得る。本発明のこれらおよび他の実施形態において有用であ
る特定のｍｔＤＮＡ配列領域に由来するヒトｍｔＤＮＡの点変異の例は、表１〜
４および表９において、野生型および変異体ｍｔＤＮＡが異なるヌクレオチド位
置に従って開示される。
【００２４】
配列番号１のｍｔＤＮＡ配列の一部、および本明細書中に提供されるような生
物学的供給源または被験体由来のサンプルｍｔＤＮＡ配列の一部は、配列番号１
に従うｍｔＤＮＡ核酸位置を番号付けするための転換に基づいて、「対応する」
核酸配列、領域、フラグメントなどと見なされる（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｎａｔ
ｕｒｅ ２９０：４５７、１９８１）。ここで、サンプルｍｔＤＮＡ配列は、配
列番号１のｍｔＤＮＡ配列とアラインされ、その結果、少なくとも２０の連続す
る配列の所定の配列においてヌクレオチドの少なくとも７０％、好ましくは少な
くとも８０％、およびより好ましくは少なくとも９０％が同一である。例えば、
ＡＤを有するかまたはＡＤを有する危険性が疑われる被験体由来のｍｔＤＮＡを
含む生物学的サンプル中のｍｔＤＮＡ配列の一部、または別の例として、本明細
書中に提供されるようなアルツハイマー病に関連した、少なくとも１つのミトコ
ンドリアの一塩基多型を含むｍｔＤＮＡにおけるｍｔＤＮＡ配列の一部（例えば
、変異ｍｔＤＮＡ）は、当業者が精通している多数のアラインメント手順および
／またはツールのいずれか（例えば、ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗ，Ｔｈｏｍｐｓｏｎら
、１９９４ Ｎｕｃｌ．Ａｃ．Ｒｅｓ．２２：４６７３：ＣＡＰ．ｗｗｗ．ｎｏ
．ｅｍｂｎｅｔ．ｏｒｇ／ｃｌｕｓｔａｗ．ｈｔｍｌ：ＦＡＳＴＡ／ＦＡＳＴＰ
，Ｐｅａｒｓｏｎ，１９９０ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８５：２４４４、Ｄ．Ｈｕｄｓｏｎ，Ｕｎｉｖ．ｏｆ Ｖｉｒｇｉｎｉａ，Ｃｈ
ａｒｌｏｔｔｅｓｖｉｌｌｅ，ＶＡから入手可能）を使用して、配列番号１のｍ
ｔＤＮＡの対応する部分とアラインされ得る。特定の好ましい実施形態において
、サンプルｍｔＤＮＡ配列は、配列番号１の対応するｍｔＤＮＡ配列に９５％よ
り多く同一である。他の特定の好ましい実施形態において、サンプルｍｔＤＮＡ
配列は、配列番号１の対応するｍｔＤＮＡ配列と同一である。配列番号１のｍｔ
ＤＮＡ配列およびサンプルｍｔＤＮＡの対応する領域中で同一である配列を有す
るオリゴヌクレオチドプローブは、ハイブリダイゼーション標的ＤＮＡ配列分析
に従って同定および選択されて、変異の非存在を確証し得る。
物学的供給源または被験体由来のサンプルｍｔＤＮＡ配列の一部は、配列番号１
に従うｍｔＤＮＡ核酸位置を番号付けするための転換に基づいて、「対応する」
核酸配列、領域、フラグメントなどと見なされる（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｎａｔ
ｕｒｅ ２９０：４５７、１９８１）。ここで、サンプルｍｔＤＮＡ配列は、配
列番号１のｍｔＤＮＡ配列とアラインされ、その結果、少なくとも２０の連続す
る配列の所定の配列においてヌクレオチドの少なくとも７０％、好ましくは少な
くとも８０％、およびより好ましくは少なくとも９０％が同一である。例えば、
ＡＤを有するかまたはＡＤを有する危険性が疑われる被験体由来のｍｔＤＮＡを
含む生物学的サンプル中のｍｔＤＮＡ配列の一部、または別の例として、本明細
書中に提供されるようなアルツハイマー病に関連した、少なくとも１つのミトコ
ンドリアの一塩基多型を含むｍｔＤＮＡにおけるｍｔＤＮＡ配列の一部（例えば
、変異ｍｔＤＮＡ）は、当業者が精通している多数のアラインメント手順および
／またはツールのいずれか（例えば、ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗ，Ｔｈｏｍｐｓｏｎら
、１９９４ Ｎｕｃｌ．Ａｃ．Ｒｅｓ．２２：４６７３：ＣＡＰ．ｗｗｗ．ｎｏ
．ｅｍｂｎｅｔ．ｏｒｇ／ｃｌｕｓｔａｗ．ｈｔｍｌ：ＦＡＳＴＡ／ＦＡＳＴＰ
，Ｐｅａｒｓｏｎ，１９９０ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８５：２４４４、Ｄ．Ｈｕｄｓｏｎ，Ｕｎｉｖ．ｏｆ Ｖｉｒｇｉｎｉａ，Ｃｈ
ａｒｌｏｔｔｅｓｖｉｌｌｅ，ＶＡから入手可能）を使用して、配列番号１のｍ
ｔＤＮＡの対応する部分とアラインされ得る。特定の好ましい実施形態において
、サンプルｍｔＤＮＡ配列は、配列番号１の対応するｍｔＤＮＡ配列に９５％よ
り多く同一である。他の特定の好ましい実施形態において、サンプルｍｔＤＮＡ
配列は、配列番号１の対応するｍｔＤＮＡ配列と同一である。配列番号１のｍｔ
ＤＮＡ配列およびサンプルｍｔＤＮＡの対応する領域中で同一である配列を有す
るオリゴヌクレオチドプローブは、ハイブリダイゼーション標的ＤＮＡ配列分析
に従って同定および選択されて、変異の非存在を確証し得る。
【００２５】
本発明に従って、および当該分野で公知のように、用語「ハプロタイプ」とは
、ミトコンドリア染色体の規定された領域中の遺伝子マーカーの特定の組み合わ
せをいう。このような遺伝子マーカーには、例えば、ＲＦＬＰおよびＳＮＰが含
まれる。ＲＥＬＰ（制限フラグメント多型）は、制限酵素として公知のＤＮＡｓ
ｅによって部位特異的様式で特異的に切断される認識部位（しばしば、パリンド
ローム）中の変化から生じる。ＳＮＰ（一塩基多型）は、目的のゲノムの領域に
おける任意の単一のヌクレオチド塩基における変化（例えば、欠失、挿入、また
は置換）である。本開示によって提供される特に好ましい実施形態において、目
的のゲノムは、ミトコンドリアゲノムである。ＳＮＰは個体から個体で異なって
いるので、これらは、ゲノムの関連を研究するための有用なマーカーである。さ
らに、それらは、ＲＦＬＰのような他のマーカーよりもより頻度が高いので、Ｓ
ＮＰの分析は、疾患関連の遺伝子マーカー分離の「高解像度の」地図を生成して
当然である（Ｗｅｉｓｓ、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．８：６９１−６９７，１９９
８；ＧｅｌｂｅｒｔおよびＧｒｅｇｇ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｏｌ．８：６６９−６７４，１９９７）。
、ミトコンドリア染色体の規定された領域中の遺伝子マーカーの特定の組み合わ
せをいう。このような遺伝子マーカーには、例えば、ＲＦＬＰおよびＳＮＰが含
まれる。ＲＥＬＰ（制限フラグメント多型）は、制限酵素として公知のＤＮＡｓ
ｅによって部位特異的様式で特異的に切断される認識部位（しばしば、パリンド
ローム）中の変化から生じる。ＳＮＰ（一塩基多型）は、目的のゲノムの領域に
おける任意の単一のヌクレオチド塩基における変化（例えば、欠失、挿入、また
は置換）である。本開示によって提供される特に好ましい実施形態において、目
的のゲノムは、ミトコンドリアゲノムである。ＳＮＰは個体から個体で異なって
いるので、これらは、ゲノムの関連を研究するための有用なマーカーである。さ
らに、それらは、ＲＦＬＰのような他のマーカーよりもより頻度が高いので、Ｓ
ＮＰの分析は、疾患関連の遺伝子マーカー分離の「高解像度の」地図を生成して
当然である（Ｗｅｉｓｓ、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．８：６９１−６９７，１９９
８；ＧｅｌｂｅｒｔおよびＧｒｅｇｇ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｏｌ．８：６６９−６７４，１９９７）。
【００２６】
用語「ハプログループ（ｈａｐｌｏｇｒｏｕｐ）」とは、互いに関連して見出
されるハプロタイプの群をいう。いくつかのミトコンドリアＤＮＡハプロタイプ
およびハプログループが当該分野で公知であり、これらには、１０のヨーロッパ
人のｍｔＤＮＡハプログループならびに別個のアジア人、ネイティブアメリカン
およびアフリカ人のｍｔＤＮＡハプログループが含まれ、各々は１以上の特異的
な制限エンドヌクレアーゼ認識部位の存在または非存在に基づいて同定された（
例えば、Ｗａｌｌａｃｅら、１９９９ Ｇｅｎｅ ２３８：２１１；Ｔｏｒｒｏ
ｎｉら、１９９６ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １４４：１８３５を参照のこと）。
されるハプロタイプの群をいう。いくつかのミトコンドリアＤＮＡハプロタイプ
およびハプログループが当該分野で公知であり、これらには、１０のヨーロッパ
人のｍｔＤＮＡハプログループならびに別個のアジア人、ネイティブアメリカン
およびアフリカ人のｍｔＤＮＡハプログループが含まれ、各々は１以上の特異的
な制限エンドヌクレアーゼ認識部位の存在または非存在に基づいて同定された（
例えば、Ｗａｌｌａｃｅら、１９９９ Ｇｅｎｅ ２３８：２１１；Ｔｏｒｒｏ
ｎｉら、１９９６ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １４４：１８３５を参照のこと）。
【００２７】
本発明の範囲内の核酸配列には、中程度または高いストリンジェンシーの条件
下でｍｔＤＮＡヌクレオチド配列（本明細書中に開示されたｍｔＤＮＡ配列また
はそのフラグメント、およびそれらの相補体を含む）と特異的にハイブリダイズ
する単離されたＤＮＡ配列およびＲＮＡ配列が含まれる。本明細書中で使用され
る場合、中程度のストリンジェンシーの条件は、当業者に公知であるように、そ
してＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、第１巻、１．１０１−１０４頁、Ｃｏｌ
ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ （１９
８９）によって定義されように、例えば、出発点の核酸が固定化されたニトロセ
ルロースフィルターについての、５×ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳ、１．０ ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ ８．０）のプレ洗浄溶液、４２℃での５０％ ホルムアミド
、６×ＳＳＣ（または他の類似のハイブリダイゼーション溶液）のハイブリダイ
ゼーション条件、および約５０〜６０℃での０．５×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ
の洗浄条件としての使用を含む。高いストリンジェンシーの条件は、上記と同様
にハイブリダイゼーション条件として定義され、そして６０〜６８℃、０．２×
ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳの洗浄を用いる。他の実施形態において、ｍｔＤＮＡ
ヌクレオチド配列とのハイブリダイゼーションは、通常のストリンジェンシーに
おいてであり得、これは、ネイティブな二重鎖のＴｍよりも約２５〜３０℃下で
ある（例えば、５×ＳＳＰＥ、０．５％ ＳＤＳ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶
液、５０％ ホルムアミド、４２℃または等価の条件）である。低いストリンジ
ェンシーのハイブリダイゼーションでは、Ｔｍよりも約４０℃下の条件を使用し
、または高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーションでは、Ｔｍよりも約
１０℃下の条件を使用する。当業者は、ハイブリダイゼーション溶液および洗浄
溶液の温度、塩濃度、およびカオトロープ（ｃｈａｏｔｒｏｐｅ）組成が、要因
（例えば、プローブの長さおよびヌクレオチド塩基の組成）に従って必要に応じ
て調整され得ることを理解する（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎ
ｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，１９８７もまた参照のこと）。従って、ハイブリダ
イゼーション条件のストリンジェンシーの所望のバリエーションは、プレハイブ
リダイゼーション工程、ハイブリダイゼーション工程、および洗浄工程のために
使用される、時間、温度、および／または溶液の濃度を変更することによって達
成され得る。従って、適切にストリンジェントな条件が、過度の実験を伴うこと
なく容易に選択され得ることが理解され、ここで、所望されるプローブの選択性
は、１以上の特定の出発点の配列にハイブリダイズするが、他の特定の出発点の
配列とはハイブリダイズしない能力に基づいて同定される。
下でｍｔＤＮＡヌクレオチド配列（本明細書中に開示されたｍｔＤＮＡ配列また
はそのフラグメント、およびそれらの相補体を含む）と特異的にハイブリダイズ
する単離されたＤＮＡ配列およびＲＮＡ配列が含まれる。本明細書中で使用され
る場合、中程度のストリンジェンシーの条件は、当業者に公知であるように、そ
してＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、第１巻、１．１０１−１０４頁、Ｃｏｌ
ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ （１９
８９）によって定義されように、例えば、出発点の核酸が固定化されたニトロセ
ルロースフィルターについての、５×ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳ、１．０ ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ ８．０）のプレ洗浄溶液、４２℃での５０％ ホルムアミド
、６×ＳＳＣ（または他の類似のハイブリダイゼーション溶液）のハイブリダイ
ゼーション条件、および約５０〜６０℃での０．５×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ
の洗浄条件としての使用を含む。高いストリンジェンシーの条件は、上記と同様
にハイブリダイゼーション条件として定義され、そして６０〜６８℃、０．２×
ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳの洗浄を用いる。他の実施形態において、ｍｔＤＮＡ
ヌクレオチド配列とのハイブリダイゼーションは、通常のストリンジェンシーに
おいてであり得、これは、ネイティブな二重鎖のＴｍよりも約２５〜３０℃下で
ある（例えば、５×ＳＳＰＥ、０．５％ ＳＤＳ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶
液、５０％ ホルムアミド、４２℃または等価の条件）である。低いストリンジ
ェンシーのハイブリダイゼーションでは、Ｔｍよりも約４０℃下の条件を使用し
、または高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーションでは、Ｔｍよりも約
１０℃下の条件を使用する。当業者は、ハイブリダイゼーション溶液および洗浄
溶液の温度、塩濃度、およびカオトロープ（ｃｈａｏｔｒｏｐｅ）組成が、要因
（例えば、プローブの長さおよびヌクレオチド塩基の組成）に従って必要に応じ
て調整され得ることを理解する（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎ
ｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，１９８７もまた参照のこと）。従って、ハイブリダ
イゼーション条件のストリンジェンシーの所望のバリエーションは、プレハイブ
リダイゼーション工程、ハイブリダイゼーション工程、および洗浄工程のために
使用される、時間、温度、および／または溶液の濃度を変更することによって達
成され得る。従って、適切にストリンジェントな条件が、過度の実験を伴うこと
なく容易に選択され得ることが理解され、ここで、所望されるプローブの選択性
は、１以上の特定の出発点の配列にハイブリダイズするが、他の特定の出発点の
配列とはハイブリダイズしない能力に基づいて同定される。
【００２８】
「単離された核酸分子」とは、別個のフラグメントの形態にあるポリヌクレオ
チド分子、または大きな核酸構築物の成分としてのポリヌクレオチド分子をいい
、これは、その供給源細胞（そこに通常存在している染色体を含む）から少なく
とも一旦、好ましくは実質的に純粋な形態で分離されている。単離された核酸分
子は、特定の開示されたヌクレオチド配列を有する核酸である得るか、またはそ
の領域、部分またはフラグメントであり得る。当業者は、本明細書中に開示され
るように適切な核酸配列情報が提供される場合、完全なヌクレオチド配列を有す
る単離された核酸分子または特定の単離された核酸分子の任意の部分の配列を調
製し得る。核酸分子は、広範なヌクレオチドから構成され得、これらには、ＤＮ
Ａ、ＲＮＡ、ヌクレオチドアナログ（例えば、ホスホロチオエートまたはペプチ
ド核酸）または当業者に周知の他のアナログ、あるいはこれらのいくつかの組み
合わせが挙げられる。
チド分子、または大きな核酸構築物の成分としてのポリヌクレオチド分子をいい
、これは、その供給源細胞（そこに通常存在している染色体を含む）から少なく
とも一旦、好ましくは実質的に純粋な形態で分離されている。単離された核酸分
子は、特定の開示されたヌクレオチド配列を有する核酸である得るか、またはそ
の領域、部分またはフラグメントであり得る。当業者は、本明細書中に開示され
るように適切な核酸配列情報が提供される場合、完全なヌクレオチド配列を有す
る単離された核酸分子または特定の単離された核酸分子の任意の部分の配列を調
製し得る。核酸分子は、広範なヌクレオチドから構成され得、これらには、ＤＮ
Ａ、ＲＮＡ、ヌクレオチドアナログ（例えば、ホスホロチオエートまたはペプチ
ド核酸）または当業者に周知の他のアナログ、あるいはこれらのいくつかの組み
合わせが挙げられる。
【００２９】
本発明は、本明細書中に記載されるように、ｍｔＤＮＡ配列および単離された
ｍｔＤＮＡ核酸分子を提供する。ｍｔＤＮＡは、周知の方法論（例えば、その全
体が参考として援用される、米国特許第５，８４０，４９３号に記載の方法論）
に従って細胞ＤＮＡから単離され得る。
ｍｔＤＮＡ核酸分子を提供する。ｍｔＤＮＡは、周知の方法論（例えば、その全
体が参考として援用される、米国特許第５，８４０，４９３号に記載の方法論）
に従って細胞ＤＮＡから単離され得る。
【００３０】
本発明に従ってオリゴヌクレオチドプライマーを使用することが有利である場
合、このようなプライマーは、１０〜６０ヌクレオチド長、好ましくは１５〜３
５ヌクレオチド長、およびなおより好ましくは１８〜３０ヌクレオチド長であり
得る。プライマーは、プライマーの標的配列に対する特異的ハイブリダイゼーシ
ョンに基づいて、サンプルに存在する特定の核酸標的配列の量を決定するために
当業者に周知の任意の種々の技術により、ｍｔＤＮＡ変異（本明細書中で提供さ
れる一塩基多型またはホモプラスミーｍｔＤＮＡ変異を含む）を定量するために
本発明において有用であり得る。必要に応じて、特定のこれらの技術において、
ハイブリダイゼーションは、テンプレートとして標的配列を含む鎖を使用するプ
ライマーのヌクレオチドポリメラーゼ触媒伸長そして／または隣接する標的配列
にハイブリダイズされるオリゴヌクレオチドの連結の前に生じ、そしてプライマ
ー伸長を用いた本発明の実施形態は特に好ましい。
合、このようなプライマーは、１０〜６０ヌクレオチド長、好ましくは１５〜３
５ヌクレオチド長、およびなおより好ましくは１８〜３０ヌクレオチド長であり
得る。プライマーは、プライマーの標的配列に対する特異的ハイブリダイゼーシ
ョンに基づいて、サンプルに存在する特定の核酸標的配列の量を決定するために
当業者に周知の任意の種々の技術により、ｍｔＤＮＡ変異（本明細書中で提供さ
れる一塩基多型またはホモプラスミーｍｔＤＮＡ変異を含む）を定量するために
本発明において有用であり得る。必要に応じて、特定のこれらの技術において、
ハイブリダイゼーションは、テンプレートとして標的配列を含む鎖を使用するプ
ライマーのヌクレオチドポリメラーゼ触媒伸長そして／または隣接する標的配列
にハイブリダイズされるオリゴヌクレオチドの連結の前に生じ、そしてプライマ
ー伸長を用いた本発明の実施形態は特に好ましい。
【００３１】
このような定量的検出技術に対する参照の例としては、野生型ｍｔＤＮＡ配列
の一部に対応するオリゴヌクレオチドプライマー標的ハイブリダイゼーション部
位付近にあるｍｔＤＮＡ配列部位の一部におけるヌクレオチド挿入、置換もしく
は欠失（Ａｎｄｅｒｓｏｎら（１９８１ Ｎａｔｕｒｅ ２９０：４５７，配列
番号１）に開示される）、または本明細書中に開示されるｍｔＤＮＡ点変異のい
ずれかにより作製され得るような変異した部位を検出するために使用され得る検
出技術が挙げられ、そしてさらにプライマー伸長を含む技術が挙げられる。全て
が参考として援用される、Ｕ．Ｓ．５，７０６，２０５号およびそこに引用され
る参考文献を参照のことのこと。例えば、Ｂｏｔｓｔｅｉｎら（Ａｍ．Ｊ．Ｈｕ
ｍ．Ｇｅｎ．３２：３１４，１９８０），Ｇｉｂｂｓら（Ｎｕｃｌ．Ａｃ．Ｒｅ
ｓ．１７：２４３７，１９８９），Ｎｅｗｔｏｎら（Ｎｕｃｌ．Ａｃ．Ｒｅｓ．
１７：２５０３，１９８９），Ｇｒｏｓｓｍａｎら（Ｎｕｃｌ．Ａｃ．Ｒｅｓ．
２２：４５２７，１９９４），およびＳａｉｋｉら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．８６：６２３０，１９８９）もまた参照のこと（これらの全ては、
参考として援用される）。この目的のために特に有用な方法は、プライマー伸長
アッセイである（両方が、その全体において参考として援用される、Ｆａｈｙら
（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３１０２，１９９７）およびＧｈｏｓ
ｈら（Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．５８：３２５，１９９６）に開示され、
Ｋｒｏｏｋら（Ｈｕｍ．Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎｅｔ．１：３９１，１９９５にもま
た開示される）。これらは、複数のヌクレオチド置換、挿入、欠失または他の変
異を検出するためにプライマー伸長反応の改変法を教示する。サンプル中の特定
の核酸標的配列の存在を定量するために有用な技術の他の例としては、以下が挙
げられるが、これらに限定されない：標的核酸をサンプルに存在する他の核酸か
ら最初に部分的に分離することを伴うか、または伴わない、標的核酸配列に対す
る標識プローブのハイブリダイゼーション。
の一部に対応するオリゴヌクレオチドプライマー標的ハイブリダイゼーション部
位付近にあるｍｔＤＮＡ配列部位の一部におけるヌクレオチド挿入、置換もしく
は欠失（Ａｎｄｅｒｓｏｎら（１９８１ Ｎａｔｕｒｅ ２９０：４５７，配列
番号１）に開示される）、または本明細書中に開示されるｍｔＤＮＡ点変異のい
ずれかにより作製され得るような変異した部位を検出するために使用され得る検
出技術が挙げられ、そしてさらにプライマー伸長を含む技術が挙げられる。全て
が参考として援用される、Ｕ．Ｓ．５，７０６，２０５号およびそこに引用され
る参考文献を参照のことのこと。例えば、Ｂｏｔｓｔｅｉｎら（Ａｍ．Ｊ．Ｈｕ
ｍ．Ｇｅｎ．３２：３１４，１９８０），Ｇｉｂｂｓら（Ｎｕｃｌ．Ａｃ．Ｒｅ
ｓ．１７：２４３７，１９８９），Ｎｅｗｔｏｎら（Ｎｕｃｌ．Ａｃ．Ｒｅｓ．
１７：２５０３，１９８９），Ｇｒｏｓｓｍａｎら（Ｎｕｃｌ．Ａｃ．Ｒｅｓ．
２２：４５２７，１９９４），およびＳａｉｋｉら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．８６：６２３０，１９８９）もまた参照のこと（これらの全ては、
参考として援用される）。この目的のために特に有用な方法は、プライマー伸長
アッセイである（両方が、その全体において参考として援用される、Ｆａｈｙら
（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３１０２，１９９７）およびＧｈｏｓ
ｈら（Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．５８：３２５，１９９６）に開示され、
Ｋｒｏｏｋら（Ｈｕｍ．Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎｅｔ．１：３９１，１９９５にもま
た開示される）。これらは、複数のヌクレオチド置換、挿入、欠失または他の変
異を検出するためにプライマー伸長反応の改変法を教示する。サンプル中の特定
の核酸標的配列の存在を定量するために有用な技術の他の例としては、以下が挙
げられるが、これらに限定されない：標的核酸をサンプルに存在する他の核酸か
ら最初に部分的に分離することを伴うか、または伴わない、標的核酸配列に対す
る標識プローブのハイブリダイゼーション。
【００３２】
サンプルに存在する特定の核酸標的配列の量を、プライマーのこの標的配列に
対するハイブリダイゼーションに基づいて決定するための他の有用な技術の例と
しては、以下が挙げられる：標的核酸配列の特異的増幅および増幅産物の定量。
この特異的増幅および増幅産物の定量としては、以下が挙げられるが、これらに
限定されない：ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ，Ｇｉｂｂｓら，Ｎｕｃｌ．Ａｃ
．Ｒｅｓ．１７：２４３７，１９８９）、転写増幅系、鎖置換増幅（ｓｔｒａｎ
ｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）および自立した
配列複製（３ＳＲ，Ｇｈｏｓｈら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏ
ｒ Ｖｉｒｕｓ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，１９９５ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓ
ｓ，ＮＹ，２８７−３１４頁）（これらに対して引用された文献は、その全体が
参考として援用される）。他の有用な技術の例としては、以下が挙げられる：リ
ガーゼ連鎖反応、単鎖コンホメーション多型分析、Ｑ−βレプリカーゼアッセイ
、制限フラグメント長多型（ＲＦＬＰ，Ｂｏｔｓｔｅｉｎら，Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ
．Ｇｅｎ．３２：３１４，１９８０）分析およびサイクルしたプローブ技術、な
らびに当業者に公知の他の有用な方法。
対するハイブリダイゼーションに基づいて決定するための他の有用な技術の例と
しては、以下が挙げられる：標的核酸配列の特異的増幅および増幅産物の定量。
この特異的増幅および増幅産物の定量としては、以下が挙げられるが、これらに
限定されない：ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ，Ｇｉｂｂｓら，Ｎｕｃｌ．Ａｃ
．Ｒｅｓ．１７：２４３７，１９８９）、転写増幅系、鎖置換増幅（ｓｔｒａｎ
ｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）および自立した
配列複製（３ＳＲ，Ｇｈｏｓｈら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏ
ｒ Ｖｉｒｕｓ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，１９９５ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓ
ｓ，ＮＹ，２８７−３１４頁）（これらに対して引用された文献は、その全体が
参考として援用される）。他の有用な技術の例としては、以下が挙げられる：リ
ガーゼ連鎖反応、単鎖コンホメーション多型分析、Ｑ−βレプリカーゼアッセイ
、制限フラグメント長多型（ＲＦＬＰ，Ｂｏｔｓｔｅｉｎら，Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ
．Ｇｅｎ．３２：３１４，１９８０）分析およびサイクルしたプローブ技術、な
らびに当業者に公知の他の有用な方法。
【００３３】
本発明の特定の好ましい実施形態において、プライマー伸長を用いて、生物学
的サンプルに存在するｍｔＤＮＡを定量する（Ｇｈｏｓｈら，Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ
．Ｇｅｎｅｔ．５８：３２５，１９９６）。この実施形態は、野生型ｍｔＤＮＡ
および変異ｍｔＤＮＡの両方を相補的な核酸標的配列にハイブリダイズし得る単
一のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて同時に定量することを可能にするこ
とにより特定の利点を提供し得る。この相補的な核酸標的配列は、野生型ｍｔＤ
ＮＡの規定された領域に存在し、そして変異したｍｔＤＮＡ配列の対応する領域
に存在する。理論に拘束されることは望まないが、野生型ｍｔＤＮＡおよび変異
したｍｔＤＮＡを定量するために単一のプライマーを使用することは、複数のプ
ライマーの相対的ハイブリダイゼーション特性において潜在的不均衡と関連した
不確実性を避けると考えられており、そして他の利点を提供し得る。このような
標的配列が変異したｍｔＤＮＡヌクレオチド配列位置（対応する野生型ｍｔＤＮ
Ａ配列位置に対するヌクレオチド置換、挿入または欠失である）に隣接して位置
する場合、プライマー伸長アッセイは、変異したｍｔＤＮＡにハイブリダイズす
るプライマーのオリゴヌクレオチド伸長産物が野生型ｍｔＤＮＡにハイブリダイ
ズするプライマーのオリゴヌクレオチド伸長産物とは異なる長さであるように、
設計され得る。従って、サンプル中の変異したｍｔＤＮＡの量およびサンプル中
の野生型ｍｔＤＮＡの量は、配列の長さまたは分子量に基づいて分離可能である
、異なる伸長産物の定量により決定され得る。
的サンプルに存在するｍｔＤＮＡを定量する（Ｇｈｏｓｈら，Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ
．Ｇｅｎｅｔ．５８：３２５，１９９６）。この実施形態は、野生型ｍｔＤＮＡ
および変異ｍｔＤＮＡの両方を相補的な核酸標的配列にハイブリダイズし得る単
一のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて同時に定量することを可能にするこ
とにより特定の利点を提供し得る。この相補的な核酸標的配列は、野生型ｍｔＤ
ＮＡの規定された領域に存在し、そして変異したｍｔＤＮＡ配列の対応する領域
に存在する。理論に拘束されることは望まないが、野生型ｍｔＤＮＡおよび変異
したｍｔＤＮＡを定量するために単一のプライマーを使用することは、複数のプ
ライマーの相対的ハイブリダイゼーション特性において潜在的不均衡と関連した
不確実性を避けると考えられており、そして他の利点を提供し得る。このような
標的配列が変異したｍｔＤＮＡヌクレオチド配列位置（対応する野生型ｍｔＤＮ
Ａ配列位置に対するヌクレオチド置換、挿入または欠失である）に隣接して位置
する場合、プライマー伸長アッセイは、変異したｍｔＤＮＡにハイブリダイズす
るプライマーのオリゴヌクレオチド伸長産物が野生型ｍｔＤＮＡにハイブリダイ
ズするプライマーのオリゴヌクレオチド伸長産物とは異なる長さであるように、
設計され得る。従って、サンプル中の変異したｍｔＤＮＡの量およびサンプル中
の野生型ｍｔＤＮＡの量は、配列の長さまたは分子量に基づいて分離可能である
、異なる伸長産物の定量により決定され得る。
【００３４】
プライマー伸長アッセイ産物の配列長または分子量は、当業者が精通している
、核酸配列のサイズを特徴付けるための任意の公知の方法を用いて決定され得る
。好ましい実施形態において、プライマー伸長産物は、ゲル電気泳動により特徴
付けられる。別の好ましい実施形態において、プライマー伸長産物は、質量分析
（ＭＳ）により特徴付けられる。質量分析は、マトリックス補助レーザー脱離イ
オン化／飛行時間（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）分析または当業者に公知の他のＭＳ技
術をさらに含み得る。例えば、Ｕ．Ｓ．５，６２２，８２４、Ｕ．Ｓ．５，６０
５，７９８およびＵ．Ｓ．５，５４７，８３５を参照のこと（これらの全ては、
その全体が参考として援用される）。別の好ましい実施形態において、プライマ
ー伸長産物は、液体クロマトグラフィーまたはガスクロマトフラフィーにより特
徴付けられる。これらのクロマトグラフィーとしては、高速液体クロマトグラフ
ィー（ＨＰＬＣ）、ガスクロマトグラフィー−質量分析（ＧＣ−ＭＳ）または他
の周知のクロマトグラフィー方法論がさらに挙げられ得る。
、核酸配列のサイズを特徴付けるための任意の公知の方法を用いて決定され得る
。好ましい実施形態において、プライマー伸長産物は、ゲル電気泳動により特徴
付けられる。別の好ましい実施形態において、プライマー伸長産物は、質量分析
（ＭＳ）により特徴付けられる。質量分析は、マトリックス補助レーザー脱離イ
オン化／飛行時間（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）分析または当業者に公知の他のＭＳ技
術をさらに含み得る。例えば、Ｕ．Ｓ．５，６２２，８２４、Ｕ．Ｓ．５，６０
５，７９８およびＵ．Ｓ．５，５４７，８３５を参照のこと（これらの全ては、
その全体が参考として援用される）。別の好ましい実施形態において、プライマ
ー伸長産物は、液体クロマトグラフィーまたはガスクロマトフラフィーにより特
徴付けられる。これらのクロマトグラフィーとしては、高速液体クロマトグラフ
ィー（ＨＰＬＣ）、ガスクロマトグラフィー−質量分析（ＧＣ−ＭＳ）または他
の周知のクロマトグラフィー方法論がさらに挙げられ得る。
【００３５】
本発明の別の特定の好ましい実施形態において、ｍｔＤＮＡを含む生物学的産
物中のＤＮＡは、当該分野で周知の方法論により最初に増幅され、その結果、こ
の増幅産物は、サンプルに存在する一塩基多型またはホモプラスミーｍｔＤＮＡ
変異を検出するための方法においてテンプレートとして使用され得る。従って、
野生型ｍｔＤＮＡおよび変異ｍｔＤＮＡにおいて同一であり、かつ共通する標的
配列に相補的なオリゴヌクレオチドプライマーを使用することが望ましい（例え
ば、Ｆａｈｙら（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２５：３１０２，１９９７
）およびＤａｖｉｓら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９４
：４５２６，１９９７；Ｈｉｒａｎｏら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．ＵＳＡ ９４：１４８９４，１９９７およびＷａｌｌａｃｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：１４９００，１９９７もまた参照のこ
と）に従って調製されるＰＣＲ増幅テンプレートおよびプライマー）。
物中のＤＮＡは、当該分野で周知の方法論により最初に増幅され、その結果、こ
の増幅産物は、サンプルに存在する一塩基多型またはホモプラスミーｍｔＤＮＡ
変異を検出するための方法においてテンプレートとして使用され得る。従って、
野生型ｍｔＤＮＡおよび変異ｍｔＤＮＡにおいて同一であり、かつ共通する標的
配列に相補的なオリゴヌクレオチドプライマーを使用することが望ましい（例え
ば、Ｆａｈｙら（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２５：３１０２，１９９７
）およびＤａｖｉｓら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９４
：４５２６，１９９７；Ｈｉｒａｎｏら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．ＵＳＡ ９４：１４８９４，１９９７およびＷａｌｌａｃｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：１４９００，１９９７もまた参照のこ
と）に従って調製されるＰＣＲ増幅テンプレートおよびプライマー）。
【００３６】
特定の他の好ましい実施形態において、ｍｔＤＮＡ変異は、複数の異なるｍｔ
ＤＮＡ、または本明細書中に提供される複数の異なるオリゴヌクレオチドプライ
マーを独立してプローブするために方向付けられたハイスループットハイブリダ
イゼーション方法論により効率的に検出され、スクリーニングされ、そして／ま
たは定量され得る。これらは、固相支持体上の核酸アレイとして固定化されてい
る。代表的には、固体支持体は、シリカ、石英またはガラスであり得るか、ある
いは当該分野で公知であり、そして本明細書中で提供される適切なハイブリダイ
ゼーション、洗浄および検出工程を可能にする様式で核酸が固定化された状態で
あり得る任意の他の材料であり得る。好ましい実施形態において、固相核酸アレ
イは、例えば、米国特許第５，８００，９９２号に記載のように、正確に間隔を
開けて特定の位置に決められる（例えば、ＷＯ９５／２１９４４；Ｓｃｈｅｎａ
ら，１９９５ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４６７−４７０，１９９５；Ｐｅａｓ
ｅら，１９９４ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：５０２
２；Ｌｉｐｓｈｕｔｚら，１９９５ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １９：４４
２−４４７もまた参照のこと）。
ＤＮＡ、または本明細書中に提供される複数の異なるオリゴヌクレオチドプライ
マーを独立してプローブするために方向付けられたハイスループットハイブリダ
イゼーション方法論により効率的に検出され、スクリーニングされ、そして／ま
たは定量され得る。これらは、固相支持体上の核酸アレイとして固定化されてい
る。代表的には、固体支持体は、シリカ、石英またはガラスであり得るか、ある
いは当該分野で公知であり、そして本明細書中で提供される適切なハイブリダイ
ゼーション、洗浄および検出工程を可能にする様式で核酸が固定化された状態で
あり得る任意の他の材料であり得る。好ましい実施形態において、固相核酸アレ
イは、例えば、米国特許第５，８００，９９２号に記載のように、正確に間隔を
開けて特定の位置に決められる（例えば、ＷＯ９５／２１９４４；Ｓｃｈｅｎａ
ら，１９９５ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４６７−４７０，１９９５；Ｐｅａｓ
ｅら，１９９４ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：５０２
２；Ｌｉｐｓｈｕｔｚら，１９９５ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １９：４４
２−４４７もまた参照のこと）。
【００３７】
核酸アレイ上にハイブリダイズした（例えば、二重鎖になった）核酸の検出は
、例えば、分光法またはポテンシオメトリ（例えば、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）により
、任意の公知の手順に従って行われ得る。特定の好ましい実施形態において、こ
のアレイは、長さが５０ｂｐ未満のオリゴヌクレオチドを含む。核酸アレイのハ
イスループットスクリーニングについて、フォーマットは、好ましくは自動化に
基づいて分析できる。例えば、本発明のハイスループットスクリーニング実施形
態に従う使用のための自動化装置は、コンピューターまたは他のプログラム可能
なコントローラの制御下であることが好ましい。このコントローラは、核酸沈着
、洗浄、ハイブリダイゼーション、検出および関連するプロセスの各工程の結果
を連続してモニターし得、そして自動的にこれらの結果に応答して試験パラダイ
ムを変化させ得る。
、例えば、分光法またはポテンシオメトリ（例えば、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）により
、任意の公知の手順に従って行われ得る。特定の好ましい実施形態において、こ
のアレイは、長さが５０ｂｐ未満のオリゴヌクレオチドを含む。核酸アレイのハ
イスループットスクリーニングについて、フォーマットは、好ましくは自動化に
基づいて分析できる。例えば、本発明のハイスループットスクリーニング実施形
態に従う使用のための自動化装置は、コンピューターまたは他のプログラム可能
なコントローラの制御下であることが好ましい。このコントローラは、核酸沈着
、洗浄、ハイブリダイゼーション、検出および関連するプロセスの各工程の結果
を連続してモニターし得、そして自動的にこれらの結果に応答して試験パラダイ
ムを変化させ得る。
【００３８】
本発明はまた、被験体または患者集団を分類および／または層別化するために
、薬理ゲノム学（ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ）において有用である組成
物および方法を提供する。このような層別化は、例えば、被験体における１つ以
上の特定の形質と（さらに、必要に応じて、特定の治療処置に対する応答性また
はこの治療処置の有効性の指標と）、本明細書中に提供される一塩基多型または
ホモプラスミーｍｔＤＮＡ変異との相関を包含する。本発明の１つの局面におい
て、被験体に由来するＡＤと分離した一塩基多型またはホモプラスミーｍｔＤＮ
Ａ変異の生物学的サンプルにおける検出は、被験体のアポリポタンパク質Ｅ（Ａ
ＰＯＥ）遺伝子型の同定と組合わされて、被験体におけるアルツハイマー病（Ａ
Ｄ）の危険性およびこの疾患の存在が決定される。アポリポタンパク質Ｅ４型対
立遺伝子（ＡＰＯＥ−ε４対立遺伝子）は、散発性ＡＤの遺伝的感受性因子であ
り、そしてＡＤについて２倍の危険性を与える（Ｃｏｒｄｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ ２６１：９２１，１９９３；「Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏ
ｎ Ａｇｉｎｇ／Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｗｏｒｋ
ｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ Ｓｔａｔｅｍｅｎｔ」，Ｌａｎｃｅ
ｔ ３４７：１０９１，１９９６およびそこで引用される参考文献もまた参照の
こと（これらの全ては、その全体が参考として援用される））。従って、本発明
の好ましい実施形態において、被験体におけるＡＤの危険性およびＡＤの存在を
、本開示に従って一塩基多型またはホモプラスミーｍｔＤＮＡ点変異を検出する
ことにより決定するための方法は、ＡＤについての危険性があると疑われる被験
体のＡＰＯＥ遺伝子型を決定する工程をさらに包含する。本明細書中に開示され
るように、ｍｔＤＮＡ点変異を決定するための方法とＡＰＯＥの遺伝子型決定に
ついて当該分野で公知の方法との組合わせを使用することにより、ＡＤについて
の相対的危険性を検出する増強した能力は、他の関連する利点とともに本発明に
より提供される。同様に、ＡＰＯＥ遺伝子型およびＡＤについての危険性が相関
している場合、本発明は、ＡＤを処置するために適切な薬剤を同定するための有
利な方法を提供し、ここで、このような薬剤の影響は、生物学的サンプルにおけ
る１つ以上の特定の一塩基多型またはホモプラスミーｍｔＤＮＡ変異の検出と相
関し得る。
、薬理ゲノム学（ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ）において有用である組成
物および方法を提供する。このような層別化は、例えば、被験体における１つ以
上の特定の形質と（さらに、必要に応じて、特定の治療処置に対する応答性また
はこの治療処置の有効性の指標と）、本明細書中に提供される一塩基多型または
ホモプラスミーｍｔＤＮＡ変異との相関を包含する。本発明の１つの局面におい
て、被験体に由来するＡＤと分離した一塩基多型またはホモプラスミーｍｔＤＮ
Ａ変異の生物学的サンプルにおける検出は、被験体のアポリポタンパク質Ｅ（Ａ
ＰＯＥ）遺伝子型の同定と組合わされて、被験体におけるアルツハイマー病（Ａ
Ｄ）の危険性およびこの疾患の存在が決定される。アポリポタンパク質Ｅ４型対
立遺伝子（ＡＰＯＥ−ε４対立遺伝子）は、散発性ＡＤの遺伝的感受性因子であ
り、そしてＡＤについて２倍の危険性を与える（Ｃｏｒｄｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ ２６１：９２１，１９９３；「Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏ
ｎ Ａｇｉｎｇ／Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｗｏｒｋ
ｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ Ｓｔａｔｅｍｅｎｔ」，Ｌａｎｃｅ
ｔ ３４７：１０９１，１９９６およびそこで引用される参考文献もまた参照の
こと（これらの全ては、その全体が参考として援用される））。従って、本発明
の好ましい実施形態において、被験体におけるＡＤの危険性およびＡＤの存在を
、本開示に従って一塩基多型またはホモプラスミーｍｔＤＮＡ点変異を検出する
ことにより決定するための方法は、ＡＤについての危険性があると疑われる被験
体のＡＰＯＥ遺伝子型を決定する工程をさらに包含する。本明細書中に開示され
るように、ｍｔＤＮＡ点変異を決定するための方法とＡＰＯＥの遺伝子型決定に
ついて当該分野で公知の方法との組合わせを使用することにより、ＡＤについて
の相対的危険性を検出する増強した能力は、他の関連する利点とともに本発明に
より提供される。同様に、ＡＰＯＥ遺伝子型およびＡＤについての危険性が相関
している場合、本発明は、ＡＤを処置するために適切な薬剤を同定するための有
利な方法を提供し、ここで、このような薬剤の影響は、生物学的サンプルにおけ
る１つ以上の特定の一塩基多型またはホモプラスミーｍｔＤＮＡ変異の検出と相
関し得る。
【００３９】
本明細書中に記載されるように、特定の一塩基多型またはホモプラスミーｍｔ
ＤＮＡ変異の決定は、ＡＤ患者集団を層別化するために使用され得る。従って、
本発明の別の好ましい実施形態において、ＡＤ被験体由来の生物学的サンプルに
おけるこのような変異の決定は、被験体についての有用な相関性の指標を提供し
得る。次いで、１つ以上の特定の変異に基づいてこのように層別化されたＡＤ被
験体は、上記で言及したＡＤ臨床パラメーターを用いてモニターされ得る。その
結果、特定のｍｔＤＮＡ変異と、ＡＤを評価するために使用される任意の筒底の
臨床スコアとの間の相関がモニターされ得る。例えば、本明細書中に提供される
少なくとも１つの一塩基多型またはホモプラスミーｍｔＤＮＡ変異に従ったＡＤ
患者集団の層別化は、ＡＤ被験体において使用されている任意の候補治療薬剤の
有効性を相関付ける有用なマーカーを提供し得る。本発明のこの局面のさらに好
ましい実施形態において、ＡＤ被験体のＡＰＯＥ遺伝子型の決定と協調した１つ
以上の特定のｍｔＤＮＡ変異は、上記のように、有用であり得る。これらおよび
関連する利点は、当業者に理解される。
ＤＮＡ変異の決定は、ＡＤ患者集団を層別化するために使用され得る。従って、
本発明の別の好ましい実施形態において、ＡＤ被験体由来の生物学的サンプルに
おけるこのような変異の決定は、被験体についての有用な相関性の指標を提供し
得る。次いで、１つ以上の特定の変異に基づいてこのように層別化されたＡＤ被
験体は、上記で言及したＡＤ臨床パラメーターを用いてモニターされ得る。その
結果、特定のｍｔＤＮＡ変異と、ＡＤを評価するために使用される任意の筒底の
臨床スコアとの間の相関がモニターされ得る。例えば、本明細書中に提供される
少なくとも１つの一塩基多型またはホモプラスミーｍｔＤＮＡ変異に従ったＡＤ
患者集団の層別化は、ＡＤ被験体において使用されている任意の候補治療薬剤の
有効性を相関付ける有用なマーカーを提供し得る。本発明のこの局面のさらに好
ましい実施形態において、ＡＤ被験体のＡＰＯＥ遺伝子型の決定と協調した１つ
以上の特定のｍｔＤＮＡ変異は、上記のように、有用であり得る。これらおよび
関連する利点は、当業者に理解される。
【００４０】
特に好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドプライマーが用いられ、
このプライマーは、表１〜４および表９において開示される一塩基多型またはホ
モプラスミーｍｔＤＮＡ点変異の特異的検出を可能にする。ここで、ミトコンド
リア遺伝子（例えば、以下が挙げられる：１２Ｓ ｒＲＮＡ、１６Ｓ ｒＲＮＡ
、いくつかのｔＲＮＡ、ＣＯＸ１、ＣＯＸ２、ＣＯＸ３、シトクロームｂ、ＡＴ
Ｐａｓｅ ８、ＡＴＰａｓｅ ６、ＮＤ１、ＮＤ２、ＮＤ４およびＮＤ５をコー
ドする遺伝子）における特定の置換および欠失変異が開示され、ｍｔＤＮＡルー
プ領域における多くの変異もまた開示される。表１〜４および表９に列挙した各
変異は、以下のように示される：（ｉ）野生型ヒトｍｔＤＮＡ配列に従う、特定
のヌクレオチド位置におけるヌクレオチド同一性（Ａｎｄｅｒｓｏｎら，１９８
１ Ｎａｔｕｒｅ ２９０：４５７；Ａｎｄｒｅｗｓら，１９９９ Ｎａｔｕｒ
ｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２３：１４７およびそこに引用される参考文献もまた参
照のこと）、（ｉｉ）Ａｎｄｅｒｓｏｎら（１９８１）の約束事に従うヌクレオ
チド位置番号および（ｉｉｉ）本明細書中に開示されるように同定された位置で
変異したヌクレオチドの同一性。従って、例えば、野生型ｍｔＤＮＡ １２Ｓ
ｒＲＮＡ遺伝子の１１８９位に位置したヌクレオチドＴ（チミン）は、ＡＤと診
断された患者の実質的な数から分析されたｍｔＤＮＡにおいてヌクレオチドＣ（
シトシン）に変異する（表１、２、４を参照のこと）。表９はまた、特定のＡＤ
関連ＳＮＰが検出されたサンプル数およびＡＤ関連ＳＮＰが最初に同定されたｍ
ｔＤＮＡサンプルドナーのミトコンドリアハプログループを表す（以下の実施例
もまた参照のこと）。
このプライマーは、表１〜４および表９において開示される一塩基多型またはホ
モプラスミーｍｔＤＮＡ点変異の特異的検出を可能にする。ここで、ミトコンド
リア遺伝子（例えば、以下が挙げられる：１２Ｓ ｒＲＮＡ、１６Ｓ ｒＲＮＡ
、いくつかのｔＲＮＡ、ＣＯＸ１、ＣＯＸ２、ＣＯＸ３、シトクロームｂ、ＡＴ
Ｐａｓｅ ８、ＡＴＰａｓｅ ６、ＮＤ１、ＮＤ２、ＮＤ４およびＮＤ５をコー
ドする遺伝子）における特定の置換および欠失変異が開示され、ｍｔＤＮＡルー
プ領域における多くの変異もまた開示される。表１〜４および表９に列挙した各
変異は、以下のように示される：（ｉ）野生型ヒトｍｔＤＮＡ配列に従う、特定
のヌクレオチド位置におけるヌクレオチド同一性（Ａｎｄｅｒｓｏｎら，１９８
１ Ｎａｔｕｒｅ ２９０：４５７；Ａｎｄｒｅｗｓら，１９９９ Ｎａｔｕｒ
ｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２３：１４７およびそこに引用される参考文献もまた参
照のこと）、（ｉｉ）Ａｎｄｅｒｓｏｎら（１９８１）の約束事に従うヌクレオ
チド位置番号および（ｉｉｉ）本明細書中に開示されるように同定された位置で
変異したヌクレオチドの同一性。従って、例えば、野生型ｍｔＤＮＡ １２Ｓ
ｒＲＮＡ遺伝子の１１８９位に位置したヌクレオチドＴ（チミン）は、ＡＤと診
断された患者の実質的な数から分析されたｍｔＤＮＡにおいてヌクレオチドＣ（
シトシン）に変異する（表１、２、４を参照のこと）。表９はまた、特定のＡＤ
関連ＳＮＰが検出されたサンプル数およびＡＤ関連ＳＮＰが最初に同定されたｍ
ｔＤＮＡサンプルドナーのミトコンドリアハプログループを表す（以下の実施例
もまた参照のこと）。
【００４１】
表２〜４に示され、そして本明細書中に開示されるように、ミトコンドリア一
塩基多型またはホモプラスミーｍｔＤＮＡ点変異（Ａｎｄｅｒｓｏｎら（１９８
１）により開示された「野生型」ヒトｍｔＤＮＡ配列（ＣＲＳ）に対してｍｔＤ
ＮＡ配列における特定の位置に位置したヌクレオチド塩基の同一性における偏差
を含む）は、以下の分類の少なくとも１つに入り得る：「エラー（ｅｒｒｏｒ）
」とは、Ａｎｄｅｒｓｏｎら（１９８１）により報告されたヒトｍｔＤＮＡ配列
における配列決定間違い（Ａｎｄｒｅｗｓら（１９９９ Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎ
ｅｔｉｃｓ ２３：１４７）により訂正された）をいう。表２〜４における「多
型」とは、特定のヒト疾患と関連しないが、ヒトｍｔＤＮＡ配列における所定の
位置に位置したヌクレオチド塩基の同一性の天然に生じる変動の結果として検出
され、そして記載されるヒトｍｔＤＮＡ配列における公知の多型をいう（例えば
、以下を参照のこと：「Ｍｉｔｏｍａｐ」，Ｅｍｏｒｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎ．ｅ
ｍｏｒｙ．ｅｄｕで利用可能）。表２〜４における「稀な多型」とは、Ａｎｄｅ
ｒｓｏｎら（１９８１）のＣａｍｂｒｉｄｇｅ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕ
ｅｎｃｅ（ＣＲＳ）における対応する位置に位置した塩基とは異なるが、複数の
被験体からのヒトｍｔＤＮＡ配列データのその後の蓄積に際して（およびＣＲＳ
を作製するためのＡｎｄｅｒｓｏｎらの単一のドナーのｍｔＤＮＡに対する信頼
性とは対照的に）、より大きなサンプル集団に対してＣＲＳドナーにおける低頻
度の対立遺伝子の存在を示唆するｍｔＤＮＡヌクレオチドをいう（Ａｎｄｒｅｗ
ｓら，１９９９ Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２３：１４７およびそこで
引用された参考文献を参照のこと）。本発明に従ってＡＤと分離した特に有用な
変異としては、以下が挙げられる：表２〜４に示されるエラーでないホモプラス
ミーｍｔＤＮＡ点変異（例えば、一塩基多型）、直前に記載された多型または稀
な多型、さらに表９に示されるホモプラスミーｍｔＤＮＡ点変異（例えば、一塩
基多型）。
塩基多型またはホモプラスミーｍｔＤＮＡ点変異（Ａｎｄｅｒｓｏｎら（１９８
１）により開示された「野生型」ヒトｍｔＤＮＡ配列（ＣＲＳ）に対してｍｔＤ
ＮＡ配列における特定の位置に位置したヌクレオチド塩基の同一性における偏差
を含む）は、以下の分類の少なくとも１つに入り得る：「エラー（ｅｒｒｏｒ）
」とは、Ａｎｄｅｒｓｏｎら（１９８１）により報告されたヒトｍｔＤＮＡ配列
における配列決定間違い（Ａｎｄｒｅｗｓら（１９９９ Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎ
ｅｔｉｃｓ ２３：１４７）により訂正された）をいう。表２〜４における「多
型」とは、特定のヒト疾患と関連しないが、ヒトｍｔＤＮＡ配列における所定の
位置に位置したヌクレオチド塩基の同一性の天然に生じる変動の結果として検出
され、そして記載されるヒトｍｔＤＮＡ配列における公知の多型をいう（例えば
、以下を参照のこと：「Ｍｉｔｏｍａｐ」，Ｅｍｏｒｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎ．ｅ
ｍｏｒｙ．ｅｄｕで利用可能）。表２〜４における「稀な多型」とは、Ａｎｄｅ
ｒｓｏｎら（１９８１）のＣａｍｂｒｉｄｇｅ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕ
ｅｎｃｅ（ＣＲＳ）における対応する位置に位置した塩基とは異なるが、複数の
被験体からのヒトｍｔＤＮＡ配列データのその後の蓄積に際して（およびＣＲＳ
を作製するためのＡｎｄｅｒｓｏｎらの単一のドナーのｍｔＤＮＡに対する信頼
性とは対照的に）、より大きなサンプル集団に対してＣＲＳドナーにおける低頻
度の対立遺伝子の存在を示唆するｍｔＤＮＡヌクレオチドをいう（Ａｎｄｒｅｗ
ｓら，１９９９ Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２３：１４７およびそこで
引用された参考文献を参照のこと）。本発明に従ってＡＤと分離した特に有用な
変異としては、以下が挙げられる：表２〜４に示されるエラーでないホモプラス
ミーｍｔＤＮＡ点変異（例えば、一塩基多型）、直前に記載された多型または稀
な多型、さらに表９に示されるホモプラスミーｍｔＤＮＡ点変異（例えば、一塩
基多型）。
【００４２】
【表１】
【００４３】
【表２】
【００４４】
【表３】
【００４５】
【表４】
以下の実施例は、例示を目的として与えられるのであり、限定の目的ではない
。
。
【００４６】
（実施例）
（実施例１）
（血液および脳のサンプルからのＤＮＡの単離）
静脈血サンプルを、ドナー個体から得、ＥＤＴＡを含むｖａｃｕｔａｉｎｅｒ
チューブに集めた。白血球画分を、２，５００ｒｐｍで４℃で３０分間の遠心分
離によって得た。白血球層を集め、５ｍｌの滅菌ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１ｍＭ ＥＤＴＡ）で希釈し、２，５００ｒｐｍで１
０分間４℃で遠心分離した。次いで、細胞ペレットを、ＴＥ緩衝液中に１％ＳＤ
Ｓおよび４００μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫを含む１０ｍｌの溶解緩衝液の添
加によって溶解させた。細胞をオービタルシェーカー中２００ｒｐｍで振盪しな
がら、４時間３７℃でインキュベートした。全ての細胞性ＤＮＡを、フェノール
／クロロホルムでの２回の抽出およびクロロホルムでの２回の抽出によって精製
した。ＤＮＡを、１／１０容積５Ｍ ＮａＣｌおよび２×容積１００％エタノー
ルを加えることによって沈澱させ、そして−２０℃に置いた。ＤＮＡを遠心分離
によってペレット化し、７０％エタノールで洗浄し、そしてＴＥ緩衝液中で再び
懸濁させた。
チューブに集めた。白血球画分を、２，５００ｒｐｍで４℃で３０分間の遠心分
離によって得た。白血球層を集め、５ｍｌの滅菌ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１ｍＭ ＥＤＴＡ）で希釈し、２，５００ｒｐｍで１
０分間４℃で遠心分離した。次いで、細胞ペレットを、ＴＥ緩衝液中に１％ＳＤ
Ｓおよび４００μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫを含む１０ｍｌの溶解緩衝液の添
加によって溶解させた。細胞をオービタルシェーカー中２００ｒｐｍで振盪しな
がら、４時間３７℃でインキュベートした。全ての細胞性ＤＮＡを、フェノール
／クロロホルムでの２回の抽出およびクロロホルムでの２回の抽出によって精製
した。ＤＮＡを、１／１０容積５Ｍ ＮａＣｌおよび２×容積１００％エタノー
ルを加えることによって沈澱させ、そして−２０℃に置いた。ＤＮＡを遠心分離
によってペレット化し、７０％エタノールで洗浄し、そしてＴＥ緩衝液中で再び
懸濁させた。
【００４７】
全ての細胞性ＤＮＡをまた、ダンス型ガラスホモジェナイザーを使用して、溶
解緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．９、１００ｍＭ ＥＤＴＡ、
０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．０３Ｍ ＤＤＴ、１％ＳＤＳ、１ｍｇ／ｍｌプロテイ
ナーゼＫ）において組織をホモジェナイズすることによって凍結した脳組織から
単離した。ホモジェナイズされた脳組織を、３０〜６０分間４５〜５０℃でイン
キュベートした。ＤＮＡをフェノール／クロロホルムでの２回の抽出およびクロ
ロホルムでの２回の抽出によって精製した。ＤＮＡを、１／１０容積５Ｍ Ｎａ
Ｃｌおよび２×容積１００％エタノールを加えることによって沈澱させ、そして
−２０℃に置いた。ＤＮＡを遠心分離によってペレット化し、７０％エタノール
で洗浄し、そしてＴＥ緩衝液中で再び懸濁させた。
解緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．９、１００ｍＭ ＥＤＴＡ、
０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．０３Ｍ ＤＤＴ、１％ＳＤＳ、１ｍｇ／ｍｌプロテイ
ナーゼＫ）において組織をホモジェナイズすることによって凍結した脳組織から
単離した。ホモジェナイズされた脳組織を、３０〜６０分間４５〜５０℃でイン
キュベートした。ＤＮＡをフェノール／クロロホルムでの２回の抽出およびクロ
ロホルムでの２回の抽出によって精製した。ＤＮＡを、１／１０容積５Ｍ Ｎａ
Ｃｌおよび２×容積１００％エタノールを加えることによって沈澱させ、そして
−２０℃に置いた。ＤＮＡを遠心分離によってペレット化し、７０％エタノール
で洗浄し、そしてＴＥ緩衝液中で再び懸濁させた。
【００４８】
全ての細胞性ＤＮＡをまた、ヒトＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫細胞から、最初
にダルベッコＰＢＳ中の０．５ｍＭ ＥＤＴＡを用いた処理によって組織培養物
フラスコから細胞を除くことによって、単離した。次いで、細胞を１０分間２，
０００ｇの遠心分離によってペレット化し、ＤＮＡを、製造業者の推奨に従って
、ＤＮＡｚｏｌ試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｉ
ｎｃ．，Ｃｌｉｎｃｉｎｎａｔｉ，ＯＨ）を用いて抽出した。
にダルベッコＰＢＳ中の０．５ｍＭ ＥＤＴＡを用いた処理によって組織培養物
フラスコから細胞を除くことによって、単離した。次いで、細胞を１０分間２，
０００ｇの遠心分離によってペレット化し、ＤＮＡを、製造業者の推奨に従って
、ＤＮＡｚｏｌ試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｉ
ｎｃ．，Ｃｌｉｎｃｉｎｎａｔｉ，ＯＨ）を用いて抽出した。
【００４９】
ＤＮＡ濃度を、２６０ｎｍのＵＶ吸収によって決定した。
【００５０】
（実施例２）
（ＰＣＲ増幅、配列決定、および配列分析）
実施例１に記載されるように、白血球、脳組織およびＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞から
調製した全ての細胞性ＤＮＡを、ｍｔＤＮＡ軽鎖ヌクレオチド配列（表５、「Ｌ
」プライマー）およびｍｔＤＮＡ重鎖ヌクレオチド配列（表５「Ｈ」）の示され
た領域に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーのセット、またはｍｔＤＮＡ
Ｄループ領域の部分に相補的なプライマーのセット（これは、ミトコンドリアＤ
ＮＡ分子の基本的に全体に渡る領域を増幅し得る（表６））を用いた増幅に使用
した（例えば、Ｗａｌｌａｃｅら、Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ ＆ Ｆｒｅｅ
Ｒａｄｉｃａｌｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ Ｄｉｓｅａｓ
ｅｓ，Ｍ．Ｆ．Ｂｅａｌ，Ｎ．ＨｏｗｅｌｌおよびＩ．Ｂｏｄｉｓ−Ｗｏｌｌｎ
ｅｒ編，１９９７ Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，２８３−３０７頁、なら
びにそこに引用される参考文献を参照のこと）。増幅を、０．５〜１．０μｇの
ＤＮＡ、それぞれ２００ｎｇのＬ鎖およびＨ鎖または順方向プライマー（表６「
Ｆ」）および逆方向プライマー（表６、「Ｒ」）、それぞれ２００μＭのｄＮＴ
Ｐ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、５０ｍＭ ＫＣＬ、２ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ2および１単位のＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ
−Ｅｌｍｅｒ、Ｎｏｒｗａｌｋ、ＣＴ）を使用する５０μｌ反応容積で行った。
Ｇｅｎｅ Ａｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９６００熱サイクラー（Ｐｅｒｋｉ
ｎ−Ｅｌｍｅｒ）を使用して、増幅を以下のように行った：９５℃、１０秒間、
３０サイクルの９５℃１分間、６０℃１分間、および７２℃１分間、ならびに１
サイクルの７２℃４分間。アンプリコンをＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉ
ｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｕｉａｇｅｎ、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ）に
よって精製した。
調製した全ての細胞性ＤＮＡを、ｍｔＤＮＡ軽鎖ヌクレオチド配列（表５、「Ｌ
」プライマー）およびｍｔＤＮＡ重鎖ヌクレオチド配列（表５「Ｈ」）の示され
た領域に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーのセット、またはｍｔＤＮＡ
Ｄループ領域の部分に相補的なプライマーのセット（これは、ミトコンドリアＤ
ＮＡ分子の基本的に全体に渡る領域を増幅し得る（表６））を用いた増幅に使用
した（例えば、Ｗａｌｌａｃｅら、Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ ＆ Ｆｒｅｅ
Ｒａｄｉｃａｌｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ Ｄｉｓｅａｓ
ｅｓ，Ｍ．Ｆ．Ｂｅａｌ，Ｎ．ＨｏｗｅｌｌおよびＩ．Ｂｏｄｉｓ−Ｗｏｌｌｎ
ｅｒ編，１９９７ Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，２８３−３０７頁、なら
びにそこに引用される参考文献を参照のこと）。増幅を、０．５〜１．０μｇの
ＤＮＡ、それぞれ２００ｎｇのＬ鎖およびＨ鎖または順方向プライマー（表６「
Ｆ」）および逆方向プライマー（表６、「Ｒ」）、それぞれ２００μＭのｄＮＴ
Ｐ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、５０ｍＭ ＫＣＬ、２ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ2および１単位のＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ
−Ｅｌｍｅｒ、Ｎｏｒｗａｌｋ、ＣＴ）を使用する５０μｌ反応容積で行った。
Ｇｅｎｅ Ａｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９６００熱サイクラー（Ｐｅｒｋｉ
ｎ−Ｅｌｍｅｒ）を使用して、増幅を以下のように行った：９５℃、１０秒間、
３０サイクルの９５℃１分間、６０℃１分間、および７２℃１分間、ならびに１
サイクルの７２℃４分間。アンプリコンをＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉ
ｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｕｉａｇｅｎ、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ）に
よって精製した。
【００５１】
【表５】
【００５２】
【表６】
精製されたＰＣＲ産物の配列決定を、増幅のために先に使用されたものと同じ
プライマーおよびＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕ
ｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔ （Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を使用して行った。配列
決定反応産物を、エタノール沈澱によってまたはＣｅｎｔｒｉＳｅｐスピンカラ
ム（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，Ａｄｅｌｐｈｉａ，ＮＪ）
を用いて精製し、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｍｏｄｅｌ ３７３
Ａ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏ
ｓｙｓｔｅｍｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｆｏｓｔｅｒ
Ｃｉｔｙ，ＣＡ）中で電気泳動した。ＣＡＰおよびＡＬＩＧＮ配列分析プログ
ラムに加えて、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｎａｖｉｇａｔｏｒ ｓｏｆｔｗａｒｅ （
Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅ
ｌｍｅｒ）を、配列データの分析のために使用し、変異を、公開されたヒトｍｔ
ＤＮＡの配列（Ａｎｄｅｒｓｏｎら，１９８１ Ｎａｔｕｒｅ ２９０：４５７
）と比較して同定した。
プライマーおよびＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕ
ｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔ （Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を使用して行った。配列
決定反応産物を、エタノール沈澱によってまたはＣｅｎｔｒｉＳｅｐスピンカラ
ム（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，Ａｄｅｌｐｈｉａ，ＮＪ）
を用いて精製し、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｍｏｄｅｌ ３７３
Ａ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏ
ｓｙｓｔｅｍｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｆｏｓｔｅｒ
Ｃｉｔｙ，ＣＡ）中で電気泳動した。ＣＡＰおよびＡＬＩＧＮ配列分析プログ
ラムに加えて、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｎａｖｉｇａｔｏｒ ｓｏｆｔｗａｒｅ （
Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅ
ｌｍｅｒ）を、配列データの分析のために使用し、変異を、公開されたヒトｍｔ
ＤＮＡの配列（Ａｎｄｅｒｓｏｎら，１９８１ Ｎａｔｕｒｅ ２９０：４５７
）と比較して同定した。
【００５３】
（実施例３）
（アルツハイマー病とともに分離するミトコンドリアリボソームＲＮＡ中の一
塩基多型（ＳＮＰ）） ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）を、実施例１および２に従って、２４の
コントロール（１２の部検確認疾患コントロール、２つの部検確認正常コントロ
ール、および１０の生存しているコントロール）ならびに３３のＡＤケース（２
０の部検確認ＡＤ、および１３の生存しているＡＤ患者）の脳サンプルおよび血
液のサンプルから単離し、そして配列決定した。変化したミトコンドリアｒＲＮ
Ａ配列を８２％のＡＤサンプル対５０％のコントロールにおいて検出した（表１
および図１）。この分析を部検確認（ａｃ）ケースのみに制限した場合、ｒＲＮ
Ａ配列の変化は、８５％のＡＤおよび４３％のコントロールサンプルにおいて検
出された。
塩基多型（ＳＮＰ）） ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）を、実施例１および２に従って、２４の
コントロール（１２の部検確認疾患コントロール、２つの部検確認正常コントロ
ール、および１０の生存しているコントロール）ならびに３３のＡＤケース（２
０の部検確認ＡＤ、および１３の生存しているＡＤ患者）の脳サンプルおよび血
液のサンプルから単離し、そして配列決定した。変化したミトコンドリアｒＲＮ
Ａ配列を８２％のＡＤサンプル対５０％のコントロールにおいて検出した（表１
および図１）。この分析を部検確認（ａｃ）ケースのみに制限した場合、ｒＲＮ
Ａ配列の変化は、８５％のＡＤおよび４３％のコントロールサンプルにおいて検
出された。
【００５４】
ｍｔＤＮＡ変化の約半分が、ハプログループＴ、Ｕ、およびＨ（家族性系統）
と関連した。しかし、ハプログループと関連しないミトコンドリアｒＲＮＡをコ
ードするｍｔＤＮＡにおける変異のみを考慮すると、４９％のＡＤ対２１％のコ
ントロールサンプルが、配列変化を保持した（表１および図１）。ミトコンドリ
アｒＲＮＡをコードするｍｔＤＮＡにおける変異に関連する非ハプログループと
ＡＤの特異的相関は、部検確認されたケースのみが含まれる場合、より高い。ミ
トコンドリアｒＲＮＡをコードするｍｔＤＮＡにおける変異を、４０％のＡＤ対
７％の部検確認コントロールケースにおいて検出する。
と関連した。しかし、ハプログループと関連しないミトコンドリアｒＲＮＡをコ
ードするｍｔＤＮＡにおける変異のみを考慮すると、４９％のＡＤ対２１％のコ
ントロールサンプルが、配列変化を保持した（表１および図１）。ミトコンドリ
アｒＲＮＡをコードするｍｔＤＮＡにおける変異に関連する非ハプログループと
ＡＤの特異的相関は、部検確認されたケースのみが含まれる場合、より高い。ミ
トコンドリアｒＲＮＡをコードするｍｔＤＮＡにおける変異を、４０％のＡＤ対
７％の部検確認コントロールケースにおいて検出する。
【００５５】
（実施例４）
（アルツハイマー病と診断された被験体のミトコンドリアＤＮＡ内のホモプラ
スミック一塩基多型） この実施例は、アルツハイマー病を有すると診断された被験体（Ｄ−１）の白
血球から得られたＤＮＡ、および同じ被験体由来の血小板誘導ｍｔＤＮＡを使用
して調製されるサイブリッド細胞株のＤＮＡにおけるｍｔＤＮＡ一塩基多型の検
出を記載する。
スミック一塩基多型） この実施例は、アルツハイマー病を有すると診断された被験体（Ｄ−１）の白
血球から得られたＤＮＡ、および同じ被験体由来の血小板誘導ｍｔＤＮＡを使用
して調製されるサイブリッド細胞株のＤＮＡにおけるｍｔＤＮＡ一塩基多型の検
出を記載する。
【００５６】
静脈血サンプルを、ＡＤを有すると診断されたヒトドナー被験体（Ｄ−１）（
ＭｃＫｈａｎｎら，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ３４：９３９，１９８４，Ｎａｔｉｏ
ｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，Ｃｏｍｍｕｎｉｃａ
ｔｉｖｅ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ａｎｄ Ｓｔｒｏｋｅ ａｎｄ Ａｌｚｈｅｉ
ｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ
Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｃｒｉｔｅｒｉａ ｏｆ Ｐｒｏｂａｂｌｅ ＡＤ，
ＮＩＮＣＤＳ−ＡＤＲＤＡ）から、ＥＤＴＡを含み、白血球画分の調製のため
に０〜４℃に維持されたか、またはクエン酸／ブドウ糖を含み、血小板画分の調
製のために室温で維持されるｖａｃｕｔａｉｎｅｒチューブ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄ
ｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）に集めた。
ＭｃＫｈａｎｎら，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ３４：９３９，１９８４，Ｎａｔｉｏ
ｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，Ｃｏｍｍｕｎｉｃａ
ｔｉｖｅ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ａｎｄ Ｓｔｒｏｋｅ ａｎｄ Ａｌｚｈｅｉ
ｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ
Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｃｒｉｔｅｒｉａ ｏｆ Ｐｒｏｂａｂｌｅ ＡＤ，
ＮＩＮＣＤＳ−ＡＤＲＤＡ）から、ＥＤＴＡを含み、白血球画分の調製のため
に０〜４℃に維持されたか、またはクエン酸／ブドウ糖を含み、血小板画分の調
製のために室温で維持されるｖａｃｕｔａｉｎｅｒチューブ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄ
ｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）に集めた。
【００５７】
白血球画分を調製するために、血液サンプルを、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ（登録
商標）−１０７７（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）上に重ね、２５００
ｒｐｍで３０分間４℃で遠心分離した。白血球細胞層を集め、５ｍｌ滅菌ＴＥ緩
衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１ｍＭ ＥＤＴＡ）で希釈し
、そして２５００ｒｐｍで１０分間４℃で遠心分離した。次いで、細胞ペレット
を１０ｍｌ溶解緩衝液（１％ＳＤＳおよび４００μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ
を含むＴＥ）の添加によって溶解し、そして２００ｒｐｍのオービタルシェーカ
ーセット内で３７℃で４時間インキュベートした。全ての細胞性ＤＮＡを、フェ
ノール／クロロホルムでの２回の抽出およびクロロホルムでの２回の抽出によっ
て精製した。ＤＮＡを、１／１０容積５Ｍ ＮａＣｌおよび２×容積１００％エ
タノールを加えることによって沈澱させ、そして−２０℃でインキュベートした
。ＤＮＡを遠心分離によってペレット化し、７０％エタノールで洗浄し、そして
ＴＥ緩衝液中で再び懸濁させた。
商標）−１０７７（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）上に重ね、２５００
ｒｐｍで３０分間４℃で遠心分離した。白血球細胞層を集め、５ｍｌ滅菌ＴＥ緩
衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１ｍＭ ＥＤＴＡ）で希釈し
、そして２５００ｒｐｍで１０分間４℃で遠心分離した。次いで、細胞ペレット
を１０ｍｌ溶解緩衝液（１％ＳＤＳおよび４００μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ
を含むＴＥ）の添加によって溶解し、そして２００ｒｐｍのオービタルシェーカ
ーセット内で３７℃で４時間インキュベートした。全ての細胞性ＤＮＡを、フェ
ノール／クロロホルムでの２回の抽出およびクロロホルムでの２回の抽出によっ
て精製した。ＤＮＡを、１／１０容積５Ｍ ＮａＣｌおよび２×容積１００％エ
タノールを加えることによって沈澱させ、そして−２０℃でインキュベートした
。ＤＮＡを遠心分離によってペレット化し、７０％エタノールで洗浄し、そして
ＴＥ緩衝液中で再び懸濁させた。
【００５８】
サイブリッド細胞株を産生するためのρ0ＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫への融
合のための、血小板の調製および血小板の使用（ｍｔＤＮＡの供給源として）は
、Ｍｉｌｌｅｒら（１９９６ Ｊ． Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．６７：１８９７−１
９０７）によって記載される通りであった。得られたサイブリッド細胞株（ＡＤ
−１）が、ミトコンドリア複合体ＩＶ（シトクロム ｃオキシダーゼ、ＣＯＸ、
ＣＯ）活性（以下に記載される）における安定な欠失を有した。ＡＤ−１サイブ
リッド細胞の増殖された培養物を、ダルベッコＰＢＳ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ、Ｇ
ｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）において０．５ｍＭ ＥＤＴＡにそれらをさら
すことによって、組織培養フラスコから取り除いた。収穫したＡＤ−１細胞を、
遠心分離（２０００×ｇ、１０分間）によってペレット化し、そして全ての細胞
性ＤＮＡを製造業者の指示に従って、ＤＮＡｚｏｌ試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｒｅｓｅａｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｃｌｉｎｃｉｎｎａｔｉ，ＯＨ）を
用いて抽出した。
合のための、血小板の調製および血小板の使用（ｍｔＤＮＡの供給源として）は
、Ｍｉｌｌｅｒら（１９９６ Ｊ． Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．６７：１８９７−１
９０７）によって記載される通りであった。得られたサイブリッド細胞株（ＡＤ
−１）が、ミトコンドリア複合体ＩＶ（シトクロム ｃオキシダーゼ、ＣＯＸ、
ＣＯ）活性（以下に記載される）における安定な欠失を有した。ＡＤ−１サイブ
リッド細胞の増殖された培養物を、ダルベッコＰＢＳ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ、Ｇ
ｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）において０．５ｍＭ ＥＤＴＡにそれらをさら
すことによって、組織培養フラスコから取り除いた。収穫したＡＤ−１細胞を、
遠心分離（２０００×ｇ、１０分間）によってペレット化し、そして全ての細胞
性ＤＮＡを製造業者の指示に従って、ＤＮＡｚｏｌ試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｒｅｓｅａｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｃｌｉｎｃｉｎｎａｔｉ，ＯＨ）を
用いて抽出した。
【００５９】
ＤＮＡ濃度を、２６０ｎｍのＵＶ吸収によって決定した。ＡＤ白血球およびＡ
Ｄサイブリッド細胞から調製された全ての細胞性ＤＮＡを、全ｍｔＤＮＡ分子に
わたるＬ鎖オリゴヌクレオチドプライマーおよびＨ鎖オリゴヌクレオチドプライ
マーのセットを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってＤＮＡ増幅のテ
ンプレートとして使用した（表７）。増幅を、０．５〜１．０μｇのテンプレー
トＤＮＡ、それぞれ２００ｎｇのＬ鎖およびＨ鎖プライマーまたは順方向および
逆方向プライマー、それぞれ２００μＭのｄＮＴＰ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ、ｐＨ８．３、５０ｍＭ ＫＣｌ、２ ＭＭ ＭｇＣｌ2および１単位のＡｍ
ｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、Ｎｏｒｗａｌ
ｋ、ＣＴ）を使用する５０μｌ反応容積で行った。Ｇｅｎｅ ＡｍｐTM ＰＣＲ
Ｓｙｓｔｅｍ ９６００熱サイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を使用し
て、増幅を以下のように行った：９５℃１分間、６０℃１分間、および７２℃１
分間、３０サイクル、続いて、１サイクルの７２℃４分間。増幅産物を、水平寒
天ゲル電気泳動、バンド切除、寒天からのＤＮＡの溶出、およびエタノール沈澱
によって精製した。あるいは、アンプリコンをＱＩＡｑｕｉｃｋTM ＰＣＲ精製
キット（Ｑｉａｇｅｎ， Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）によって精製した。
Ｄサイブリッド細胞から調製された全ての細胞性ＤＮＡを、全ｍｔＤＮＡ分子に
わたるＬ鎖オリゴヌクレオチドプライマーおよびＨ鎖オリゴヌクレオチドプライ
マーのセットを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってＤＮＡ増幅のテ
ンプレートとして使用した（表７）。増幅を、０．５〜１．０μｇのテンプレー
トＤＮＡ、それぞれ２００ｎｇのＬ鎖およびＨ鎖プライマーまたは順方向および
逆方向プライマー、それぞれ２００μＭのｄＮＴＰ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ、ｐＨ８．３、５０ｍＭ ＫＣｌ、２ ＭＭ ＭｇＣｌ2および１単位のＡｍ
ｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、Ｎｏｒｗａｌ
ｋ、ＣＴ）を使用する５０μｌ反応容積で行った。Ｇｅｎｅ ＡｍｐTM ＰＣＲ
Ｓｙｓｔｅｍ ９６００熱サイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を使用し
て、増幅を以下のように行った：９５℃１分間、６０℃１分間、および７２℃１
分間、３０サイクル、続いて、１サイクルの７２℃４分間。増幅産物を、水平寒
天ゲル電気泳動、バンド切除、寒天からのＤＮＡの溶出、およびエタノール沈澱
によって精製した。あるいは、アンプリコンをＱＩＡｑｕｉｃｋTM ＰＣＲ精製
キット（Ｑｉａｇｅｎ， Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）によって精製した。
【００６０】
ＰＣＲ産物を、ＴＡ−ＣｌｏｎｉｎｇTMキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｉ
ｎｃ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）およびＸＬ２ＢｌｕｅTMまたはＸＬ２Ｂｌ
ｕｅＭＲＦTMコンピテント細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．，Ｌａ Ｊｏ
ｌｌａ，ＣＡ）を使用してクローン化した。全て供給業者の推奨に従った。組換
えコロニーを選択し、プラスミドＤＮＡを、ＷｉｚａｒｄTM Ｓｅｒｉｅｓ ９
６００ ＤＮＡ精製システム（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗ
Ｉ）を使用して精製した。
ｎｃ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）およびＸＬ２ＢｌｕｅTMまたはＸＬ２Ｂｌ
ｕｅＭＲＦTMコンピテント細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．，Ｌａ Ｊｏ
ｌｌａ，ＣＡ）を使用してクローン化した。全て供給業者の推奨に従った。組換
えコロニーを選択し、プラスミドＤＮＡを、ＷｉｚａｒｄTM Ｓｅｒｉｅｓ ９
６００ ＤＮＡ精製システム（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗ
Ｉ）を使用して精製した。
【００６１】
【表７】
精製されたＰＣＲ産物の配列決定は、実施例２に記載されるように行い、１０
〜１２のクローンを、各クローン化ＰＣＲ産物について配列決定した。変異を、
上記のように、関連した相関を含む公開された配列との比較によって同定し、ヒ
トｍｔＤＮＡについて多型を報告した（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、１９８１ Ｎａｔ
ｕｒｅ ２９０：４５７；Ａｎｄｒｅｗｓら，１９９９ Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎ
ｅｔｉｃｓ ２３：１４７；Ｍｉｔｏｍａｐ，ｗｗｗ．ｇｅｎ．ｅｍｏｒｙ．ｅ
ｄｕ）。同一のホモプラスモンｍｔＤＮＡ変異が、Ｄ−１白血球由来のＤＮＡサ
ンプルおよびＡＤ−１サイブリッド細胞由来のＤＮＡにおいて検出された。表２
の多型に示されるように、稀な（ｒａｒｅ）多型およびＣＲＳに対する配列「エ
ラー」（上記のように）が検出された。さらに、三つの新規なホモプラスモン一
塩基多型を、ｍｔＤＮＡ変異として検出した（表２）：Ｔ１１８９Ｃを、１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子において観測し、Ｇ６３６６Ａが、ＣＯ１（ＣＯＸ１）遺伝子
中に存在し、そしてＴ１２９５４ＣをＮＤ５遺伝子中に見出した。配列分析は、
Ｇ６３６６Ａ変異が複合体ＩＶのＣＯＸ１サブユニットのアミノ酸１５５位にお
いてバリンからイソロイシンへの置換（ミスセンス）を引き起こすこと、および
対照的に、Ｔ１２９５４Ｃが、複合体ＩのＮＤ５サブユニットにおいて沈黙変異
を明かに表すことを示した。
〜１２のクローンを、各クローン化ＰＣＲ産物について配列決定した。変異を、
上記のように、関連した相関を含む公開された配列との比較によって同定し、ヒ
トｍｔＤＮＡについて多型を報告した（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、１９８１ Ｎａｔ
ｕｒｅ ２９０：４５７；Ａｎｄｒｅｗｓら，１９９９ Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎ
ｅｔｉｃｓ ２３：１４７；Ｍｉｔｏｍａｐ，ｗｗｗ．ｇｅｎ．ｅｍｏｒｙ．ｅ
ｄｕ）。同一のホモプラスモンｍｔＤＮＡ変異が、Ｄ−１白血球由来のＤＮＡサ
ンプルおよびＡＤ−１サイブリッド細胞由来のＤＮＡにおいて検出された。表２
の多型に示されるように、稀な（ｒａｒｅ）多型およびＣＲＳに対する配列「エ
ラー」（上記のように）が検出された。さらに、三つの新規なホモプラスモン一
塩基多型を、ｍｔＤＮＡ変異として検出した（表２）：Ｔ１１８９Ｃを、１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子において観測し、Ｇ６３６６Ａが、ＣＯ１（ＣＯＸ１）遺伝子
中に存在し、そしてＴ１２９５４ＣをＮＤ５遺伝子中に見出した。配列分析は、
Ｇ６３６６Ａ変異が複合体ＩＶのＣＯＸ１サブユニットのアミノ酸１５５位にお
いてバリンからイソロイシンへの置換（ミスセンス）を引き起こすこと、および
対照的に、Ｔ１２９５４Ｃが、複合体ＩのＮＤ５サブユニットにおいて沈黙変異
を明かに表すことを示した。
【００６２】
（実施例５）
（サイブリッド細胞株におけるＡＤドナー誘導ミトコンドリアＤＮＡの発現）
この実施例は、実施例４に記載されるように、ＡＤを有すると診断されたドナ
ーからｍｔＤＮＡを用いて構築されたＡＤ−１サイブリッド細胞株におけるＡＤ
ドナー誘導ｍｔＤＮＡ配列の発現を示す。
ーからｍｔＤＮＡを用いて構築されたＡＤ−１サイブリッド細胞株におけるＡＤ
ドナー誘導ｍｔＤＮＡ配列の発現を示す。
【００６３】
競合プライマー伸長アッセイを、ＡＤ−１サイブリッド細胞において検出され
るホモプラスモンＧ６３６６Ａ対変異を開発する（実施例４に記載される）以外
、基本的に（Ｆａｈｙら，１９９７ Ｎｕｃｌ．Ａｃ．Ｒｅｓ．２５：３１０２
）に記載されるように使用した。テンプレートＤＮＡを、実施例４に記載される
ように、白血球細胞およびサイブリッド細胞から調製し、また親のＳＨ−ＳＹ５
Ｙ神経芽細胞腫細胞およびプールされたコントロールサイブリッド細胞（すなわ
ち、ＡＤを有しないと診断された被験体からｍｔＤＮＡを用いて再増殖した以外
、Ｍｉｌｌｅｒら（１９９６ Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．６７：１８９７−１９
０７）の記載に従って構築されたサイブリッド細胞）から調製した。ｍｔＤＮＡ
コードＣＯＸ１（ＣＯＩ）遺伝子の発現を評価するために、全ての細胞性ＲＮＡ
を、ＴｒｉｚｏｌTM試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｇ
ａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を使用してサイブリッド細胞から単離し、そし
てｃＤＮＡを生成するために、製造業者の指示に従って、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐ
ｔTM逆転写酵素を用いて逆転写した。
るホモプラスモンＧ６３６６Ａ対変異を開発する（実施例４に記載される）以外
、基本的に（Ｆａｈｙら，１９９７ Ｎｕｃｌ．Ａｃ．Ｒｅｓ．２５：３１０２
）に記載されるように使用した。テンプレートＤＮＡを、実施例４に記載される
ように、白血球細胞およびサイブリッド細胞から調製し、また親のＳＨ−ＳＹ５
Ｙ神経芽細胞腫細胞およびプールされたコントロールサイブリッド細胞（すなわ
ち、ＡＤを有しないと診断された被験体からｍｔＤＮＡを用いて再増殖した以外
、Ｍｉｌｌｅｒら（１９９６ Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．６７：１８９７−１９
０７）の記載に従って構築されたサイブリッド細胞）から調製した。ｍｔＤＮＡ
コードＣＯＸ１（ＣＯＩ）遺伝子の発現を評価するために、全ての細胞性ＲＮＡ
を、ＴｒｉｚｏｌTM試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｇ
ａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を使用してサイブリッド細胞から単離し、そし
てｃＤＮＡを生成するために、製造業者の指示に従って、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐ
ｔTM逆転写酵素を用いて逆転写した。
【００６４】
以下の５’−ＦＡＭ標識オリゴヌクレオチドプライマーを、標準的方法に従っ
て調製した： ５’−−ＴＧＡＴＧＡＡＡＴＴＧＡＴＧＧＣＣＣＣＴＡＡＧＡＴＡＧＡＧＧＡＧ
Ａ−−３’ ［配列番号 ］。
て調製した： ５’−−ＴＧＡＴＧＡＡＡＴＴＧＡＴＧＧＣＣＣＣＴＡＡＧＡＴＡＧＡＧＧＡＧ
Ａ−−３’ ［配列番号 ］。
【００６５】
ｄＴＴＰ、ｄｄＡＴＰおよびｄｄＣＴＰを含むヌクレオチド混合物を使用し、
その結果、野生型（すなわち、ＣＲＳ）ｍｔＤＮＡテンプレートがｄｄＣ残基を
有するプライマーの伸長に指向し、一方、Ｄ−１（すなわち、ＡＤ誘導）ｍｔＤ
ＮＡテンプレートが結果的にｄＴおよびｄｄＡ残基を有するプライマーの伸長に
指向した。Ｆａｈｙら（１９９７）に記載されるように、プライマー伸長反応産
物は、示差的に伸長された（例えば、１つまたは２つのヌクレオチドによる）蛍
光プライマー産物の決定を可能にする条件下で電気泳動的に分割される。図２に
示されるように、ＡＤ−１サイブリッド細胞由来（レーン５および７）ならびに
Ｄ−１（ＡＤ）白血球由来（レーン４）のテンプレートＤＮＡまたはｃＤＮＡは
、二つのヌクレオチド残基によって伸長されるプライマー伸長産物の排他的な生
成を指向し、これらの細胞由来のｍｔＤＮＡにおけるホモプラスモンＧ６３６６
Ａ変異の存在と一致する。対照的に、プールされたコントロールのサイブリッド
由来または親のＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞由来のテンプレートＤＮＡまたはｃＤＮＡ（
レーン６、８および９）は、単一のヌクレオチド伸長を有するプライマー伸長産
物の生成のみを指向し、これらの細胞における野生型ＤＮＡの存在を示す。
その結果、野生型（すなわち、ＣＲＳ）ｍｔＤＮＡテンプレートがｄｄＣ残基を
有するプライマーの伸長に指向し、一方、Ｄ−１（すなわち、ＡＤ誘導）ｍｔＤ
ＮＡテンプレートが結果的にｄＴおよびｄｄＡ残基を有するプライマーの伸長に
指向した。Ｆａｈｙら（１９９７）に記載されるように、プライマー伸長反応産
物は、示差的に伸長された（例えば、１つまたは２つのヌクレオチドによる）蛍
光プライマー産物の決定を可能にする条件下で電気泳動的に分割される。図２に
示されるように、ＡＤ−１サイブリッド細胞由来（レーン５および７）ならびに
Ｄ−１（ＡＤ）白血球由来（レーン４）のテンプレートＤＮＡまたはｃＤＮＡは
、二つのヌクレオチド残基によって伸長されるプライマー伸長産物の排他的な生
成を指向し、これらの細胞由来のｍｔＤＮＡにおけるホモプラスモンＧ６３６６
Ａ変異の存在と一致する。対照的に、プールされたコントロールのサイブリッド
由来または親のＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞由来のテンプレートＤＮＡまたはｃＤＮＡ（
レーン６、８および９）は、単一のヌクレオチド伸長を有するプライマー伸長産
物の生成のみを指向し、これらの細胞における野生型ＤＮＡの存在を示す。
【００６６】
（実施例６）
（ＡＤ−１サイブリッド細胞におけるミトコンドリア電子輸送連鎖酵素）
本実施例は、アルツハイマー病のサイブリッド細胞モデルにおけるミトコンド
リア電子輸送連鎖酵素の発現および活性を記載する。
リア電子輸送連鎖酵素の発現および活性を記載する。
【００６７】
ＡＤ−１サイブリッド細胞を、実施例４に記載するように調製した。コントロ
ールサイブリッド細胞株を、記載されるように（Ｍｉｌｌｅｒら、１９９６ Ｊ
．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．６７：１８９７）、ρ0 ＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽細胞種
細胞と３人の年齢の一致する認識的に正常な被験体由来の血小板のＰＥＧ融合に
より構築した。コントロールサイブリッド細胞は、融合の３２〜３７日後にアッ
セイした場合（以下を参照のこと）、親ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞と比較して正常な複
合体ＩおよびＩＶの活性を有した。引き続き、各コントロールサイブリッド細胞
株由来の同数の細胞をプールし、そしてこの混合コントロール培養物を維持した
。複合体Ｉ（ＮＤ）および複合体ＩＶ（ＣＯＸ）の活性を、記載されるように（
Ｍｉｌｌｅｒら、１９９６ Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．６７：１８９７）決定し
た。そしてｍｉｎ−ｌｍｇ−１全細胞性タンパク質として報告する。反応性酸素
種（ＲＯＳ）を、ジクロロフルオレセインジアセテート（ＤＣＦ−ＤＡ）アッセ
イ（Ｍｉｌｌｅｒら、１９９６）を使用して検出した。カタラーゼ、全スーパー
オキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、Ｍｎ ＳＯＤ、Ｃｕ／Ｚｎ ＳＯＤ、グルタ
チオンペルオキシダーゼおよびグルタチオンレダクターゼの活性を、以前に記載
されるように（Ｃａｓｓａｒｉｎｏら、１９９７ Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈ
ｙｓ．Ａｃｔａ １３６２：７７）決定した。８−ヒドロキシグアノシン（８Ｏ
Ｈ−ｄＧ）レベルの決定のために、ＤＮＡサンプルを、サイブリッド細胞の低浸
透圧性溶解、続いて耐熱性アルカリンプロテアーゼを用いる９５℃におけるタン
パク質分解により調製した。このＤＮＡをエキソヌクレアーゼＰＩおよびエンド
ヌクレアーゼＩＩＩで消化し、そして電気化学的検出を使用して８ＯＨ−ｄＧに
ついて分析した。ヒドロキシルラジカルを、チオバルビツール酸を使用して（Ｓ
ａｔｔｌｅｒら、１９９８ Ｍｅｔｈｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１１０：１６７−
１９１）アッセイした。
ールサイブリッド細胞株を、記載されるように（Ｍｉｌｌｅｒら、１９９６ Ｊ
．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．６７：１８９７）、ρ0 ＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽細胞種
細胞と３人の年齢の一致する認識的に正常な被験体由来の血小板のＰＥＧ融合に
より構築した。コントロールサイブリッド細胞は、融合の３２〜３７日後にアッ
セイした場合（以下を参照のこと）、親ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞と比較して正常な複
合体ＩおよびＩＶの活性を有した。引き続き、各コントロールサイブリッド細胞
株由来の同数の細胞をプールし、そしてこの混合コントロール培養物を維持した
。複合体Ｉ（ＮＤ）および複合体ＩＶ（ＣＯＸ）の活性を、記載されるように（
Ｍｉｌｌｅｒら、１９９６ Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．６７：１８９７）決定し
た。そしてｍｉｎ−ｌｍｇ−１全細胞性タンパク質として報告する。反応性酸素
種（ＲＯＳ）を、ジクロロフルオレセインジアセテート（ＤＣＦ−ＤＡ）アッセ
イ（Ｍｉｌｌｅｒら、１９９６）を使用して検出した。カタラーゼ、全スーパー
オキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、Ｍｎ ＳＯＤ、Ｃｕ／Ｚｎ ＳＯＤ、グルタ
チオンペルオキシダーゼおよびグルタチオンレダクターゼの活性を、以前に記載
されるように（Ｃａｓｓａｒｉｎｏら、１９９７ Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈ
ｙｓ．Ａｃｔａ １３６２：７７）決定した。８−ヒドロキシグアノシン（８Ｏ
Ｈ−ｄＧ）レベルの決定のために、ＤＮＡサンプルを、サイブリッド細胞の低浸
透圧性溶解、続いて耐熱性アルカリンプロテアーゼを用いる９５℃におけるタン
パク質分解により調製した。このＤＮＡをエキソヌクレアーゼＰＩおよびエンド
ヌクレアーゼＩＩＩで消化し、そして電気化学的検出を使用して８ＯＨ−ｄＧに
ついて分析した。ヒドロキシルラジカルを、チオバルビツール酸を使用して（Ｓ
ａｔｔｌｅｒら、１９９８ Ｍｅｔｈｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１１０：１６７−
１９１）アッセイした。
【００６８】
ＡＤ−１サイブリッド細胞における複合体Ｉの活性は、混合コントロールサイ
ブリッド細胞において検出した活性と本質的に同一であった。対照的に、複合体
ＩＶ（ＣＯＸ）活性は、混合コントロールサイブリッド細胞と比較してＡＤ−１
サイブリッド細胞において顕著に抑制された。そしてこの不足は、延長された培
養期間にわたり安定に維持された（図３）。ＡＤ−１サイブリッドにおける減少
した複合体ＩＶ活性が、これらの細胞におけるＣＯＸタンパク質の減少した量（
例えば、ＣＯＸ１サブユニットにおいてＧ６３６６Ａ変異に関連する減少したＣ
ＯＸ産生）に起因し得るか否かを決定するために、ＣＯＸサブユニット１、２お
よび４の発現レベルを、ウェスタン免疫ブロット分析によりポリペプチドレベル
において比較した。確立された手順（Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒ
ｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ
Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，１９８７）に従って、ＡＤ−１サイブリッド細胞、混合
コントロールサイブリッド細胞およびＳＨ−ＳＹ５Ｙ 神経芽細胞種細胞の界面
活性剤の溶解産物を電気泳動で分離し、ニトロセルロースにブロット移行（ｂｌ
ｏｔｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ）し、そしてマウス抗ヒトＣＯＸサブユニット特異
的抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）
で検索した。供給業者の指示に従って、ブロットをＨＲＰ−接合抗マウス免疫グ
ロブリン（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｉｎｃ．，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ
，ＩＬ）およびＥＣＬ化学発光検出（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて発色した。図
４に示すように、ＡＤ−１サイブリッド細胞、混合コントロールサイブリッド細
胞および親ＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽細胞種細胞は、全て、同等のレベルのＣＯＸサ
ブユニットを発現した。理論により束縛しようとしなくても、これらの結果は、
互いに結合するかまたは適切な細胞下の位置へ局在するＣＯＸサブユニットの能
力におけるＣＯＸの触媒欠損（およびＣＯＸ生合成の減少していないレベル）が
、ＡＤ−１サイブリッド細胞のＣＯＸ１サブユニットにおけるＧ６３６６Ａ変異
の結果であり得ることを示唆する。
ブリッド細胞において検出した活性と本質的に同一であった。対照的に、複合体
ＩＶ（ＣＯＸ）活性は、混合コントロールサイブリッド細胞と比較してＡＤ−１
サイブリッド細胞において顕著に抑制された。そしてこの不足は、延長された培
養期間にわたり安定に維持された（図３）。ＡＤ−１サイブリッドにおける減少
した複合体ＩＶ活性が、これらの細胞におけるＣＯＸタンパク質の減少した量（
例えば、ＣＯＸ１サブユニットにおいてＧ６３６６Ａ変異に関連する減少したＣ
ＯＸ産生）に起因し得るか否かを決定するために、ＣＯＸサブユニット１、２お
よび４の発現レベルを、ウェスタン免疫ブロット分析によりポリペプチドレベル
において比較した。確立された手順（Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒ
ｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ
Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，１９８７）に従って、ＡＤ−１サイブリッド細胞、混合
コントロールサイブリッド細胞およびＳＨ−ＳＹ５Ｙ 神経芽細胞種細胞の界面
活性剤の溶解産物を電気泳動で分離し、ニトロセルロースにブロット移行（ｂｌ
ｏｔｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ）し、そしてマウス抗ヒトＣＯＸサブユニット特異
的抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）
で検索した。供給業者の指示に従って、ブロットをＨＲＰ−接合抗マウス免疫グ
ロブリン（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｉｎｃ．，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ
，ＩＬ）およびＥＣＬ化学発光検出（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて発色した。図
４に示すように、ＡＤ−１サイブリッド細胞、混合コントロールサイブリッド細
胞および親ＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽細胞種細胞は、全て、同等のレベルのＣＯＸサ
ブユニットを発現した。理論により束縛しようとしなくても、これらの結果は、
互いに結合するかまたは適切な細胞下の位置へ局在するＣＯＸサブユニットの能
力におけるＣＯＸの触媒欠損（およびＣＯＸ生合成の減少していないレベル）が
、ＡＤ−１サイブリッド細胞のＣＯＸ１サブユニットにおけるＧ６３６６Ａ変異
の結果であり得ることを示唆する。
【００６９】
ＡＤ−１サイブリッド細胞はまた、経時的に上昇したＲＯＳの相対レベルにお
ける見かけの漸減を伴い、混合コントロールサイブリッド細胞と比較して、反応
性酸素種（ＲＯＳ）生成物の上昇したレベルを示した（表８）。代償機構がこの
漸進的低下に関連するか否かを決定するために、ＤＣＦ−ＤＡ方法によるＲＯＳ
決定の前に、ＡＤ−１および混合コントロールサイブリッド細胞を、２時間、３
０μＭ ＤＣＦ−ＤＡでプレロードし、リンスし、次いで５０μＭ エタクリン
酸（還元型グルタチオンスカベンジャー）または２．５ｍＭ アミノトリアゾー
ル（ラジカルを捕捉する酵素カタラーゼのインヒビター）のいずれかで３０分間
処理した。図５に示すように、エタクリン酸またはアミノトリアゾールのいずれ
かを用いる処理によるラジカルスカベンジャーの干渉は、混合コントロールサイ
ブリッド細胞におけるＲＯＳレベルと比較して、ＡＤ−１細胞における上昇した
ＲＯＳレベルを生じた。複数の特定のラジカルスカベンジャー酵素の酸化的緩衝
化活性レベルはまた、混合コントロールサイブリッドと比較してＡＤ−１サイブ
リッド細胞において上昇されることを決定した（図６）。コントロールサイブリ
ッドと比較したＡＤ−１サイブリッドにおける遺伝子発現を、２種類のこれらの
酵素（Ｃｕ／Ｚｎ ＳＯＤおよびＭｎ ＳＯＤ）について調査した。図６に示す
ように、これらの酵素に関する上昇した活性レベルは、上昇した発現レベルによ
り達成された。このことは、ＡＤ−１サイブリッドにおけるみかけの酸化的欠損
と関連する可能な代償機構を示唆する。
ける見かけの漸減を伴い、混合コントロールサイブリッド細胞と比較して、反応
性酸素種（ＲＯＳ）生成物の上昇したレベルを示した（表８）。代償機構がこの
漸進的低下に関連するか否かを決定するために、ＤＣＦ−ＤＡ方法によるＲＯＳ
決定の前に、ＡＤ−１および混合コントロールサイブリッド細胞を、２時間、３
０μＭ ＤＣＦ−ＤＡでプレロードし、リンスし、次いで５０μＭ エタクリン
酸（還元型グルタチオンスカベンジャー）または２．５ｍＭ アミノトリアゾー
ル（ラジカルを捕捉する酵素カタラーゼのインヒビター）のいずれかで３０分間
処理した。図５に示すように、エタクリン酸またはアミノトリアゾールのいずれ
かを用いる処理によるラジカルスカベンジャーの干渉は、混合コントロールサイ
ブリッド細胞におけるＲＯＳレベルと比較して、ＡＤ−１細胞における上昇した
ＲＯＳレベルを生じた。複数の特定のラジカルスカベンジャー酵素の酸化的緩衝
化活性レベルはまた、混合コントロールサイブリッドと比較してＡＤ−１サイブ
リッド細胞において上昇されることを決定した（図６）。コントロールサイブリ
ッドと比較したＡＤ−１サイブリッドにおける遺伝子発現を、２種類のこれらの
酵素（Ｃｕ／Ｚｎ ＳＯＤおよびＭｎ ＳＯＤ）について調査した。図６に示す
ように、これらの酵素に関する上昇した活性レベルは、上昇した発現レベルによ
り達成された。このことは、ＡＤ−１サイブリッドにおけるみかけの酸化的欠損
と関連する可能な代償機構を示唆する。
【００７０】
【表８】
（実施例７）
（アルツハイマー病と診断された被験体のミトコンドリアＤＮＡにおけるホモ
プラスミック一塩基多型） 本実施例は、アルツハイマー病を有すると診断された第２の被験体（Ｄ−２）
の白血球から得たＤＮＡ、および同じ被験体からの血小板由来のｍｔＤＮＡを使
用して調製されたサイブリッド細胞株におけるｍｔＤＮＡ一塩基多型の検出を記
載する。材料および方法は、異なるドナー（Ｄ−２）が白血球および血小板の供
給源であることおよび第２のＡＤサイブリッド細胞株（ＡＤ−２）を構築したこ
とを除いて、実施例４に記載するものと同一である。結果を表３に示す。新たな
ホモプラスミックｍｔＤＮＡ変異を、ミトコンドリア遺伝子（Ｔ９８０Ｃ）の１
２Ｓ ｒＲＮＡコード領域において同定した。
プラスミック一塩基多型） 本実施例は、アルツハイマー病を有すると診断された第２の被験体（Ｄ−２）
の白血球から得たＤＮＡ、および同じ被験体からの血小板由来のｍｔＤＮＡを使
用して調製されたサイブリッド細胞株におけるｍｔＤＮＡ一塩基多型の検出を記
載する。材料および方法は、異なるドナー（Ｄ−２）が白血球および血小板の供
給源であることおよび第２のＡＤサイブリッド細胞株（ＡＤ−２）を構築したこ
とを除いて、実施例４に記載するものと同一である。結果を表３に示す。新たな
ホモプラスミックｍｔＤＮＡ変異を、ミトコンドリア遺伝子（Ｔ９８０Ｃ）の１
２Ｓ ｒＲＮＡコード領域において同定した。
【００７１】
（実施例８）
（ミトコンドリアリボソームＲＮＡ遺伝子における一塩基多型）
本実施例では、１２Ｓおよび１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子におけるホモプラスミッ
ク変異についてのｍｔＤＮＡ配列の分析を記載する。脳および／または血液サン
プルを、１３人の正常な生存コントロール被験体、４１人の剖検確認された通常
の神経性疾患コントロール（すなわち、非ＡＤ）被験体、１３人の生存ＡＤ被験
体ならびに４５人の剖検確認されたＡＤおよびＬＢＶ（レーヴィ小体改変体）被
験体から得た。
ク変異についてのｍｔＤＮＡ配列の分析を記載する。脳および／または血液サン
プルを、１３人の正常な生存コントロール被験体、４１人の剖検確認された通常
の神経性疾患コントロール（すなわち、非ＡＤ）被験体、１３人の生存ＡＤ被験
体ならびに４５人の剖検確認されたＡＤおよびＬＢＶ（レーヴィ小体改変体）被
験体から得た。
【００７２】
脳および血液サンプルからのＤＮＡの単離は、いくつかの脳サンプルについて
、ミトコンドリアを、Ｍｅｃｏｃｃｉら（１９９４ Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．３
６：７４７）により記載されるように、初めに生成し、そしてｍｔＤＮＡを抽出
したことを除いて、本質的には、各々実施例１および４に記載される通りである
。１２Ｓ ｒＲＮＡおよび１６ＳｒＲＮＡ遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチド
プライマーを表５および７に列挙する。これらを、上記のようにＰＣＲ増幅、ク
ローニングおよび配列決定に使用した。
、ミトコンドリアを、Ｍｅｃｏｃｃｉら（１９９４ Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．３
６：７４７）により記載されるように、初めに生成し、そしてｍｔＤＮＡを抽出
したことを除いて、本質的には、各々実施例１および４に記載される通りである
。１２Ｓ ｒＲＮＡおよび１６ＳｒＲＮＡ遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチド
プライマーを表５および７に列挙する。これらを、上記のようにＰＣＲ増幅、ク
ローニングおよび配列決定に使用した。
【００７３】
プライマーセット１１０−１１９を用いたＰＣＲ増幅により生成した１０種類
のフラグメントを、実施例１および４に記載されるように増幅し、クローニング
し、そして配列決定した。これらのｍｔＤＮＡ領域において検出されたホモプラ
スミック一塩基多型およびこれらの変異の発生の頻度を表４に示す。これは、「
多型」でも「稀な多型」でもない変異を含み、これはまた、「エラー」でもない
（これらの用語は表２〜４の文中に上記される）。これらには、Ｇ７０９Ａ、Ｇ
９３０Ａ、Ｔ９８０Ｃ、Ｔ１１８９Ｃ、Ｔ１２４３Ｃ、Ｃ１７００Ｔ、Ｇ１７１
９Ａ、Ｔ１８０９Ｃ、Ａ１８１１Ｇ、Ｇ１８８８Ａ、Ｇ２０９８Ａ、Ｔ２１５８
Ｃ、Ｃ２２５９Ｔ、Ｔ２３５２Ｃ、Ｇ３０１０Ａ、Ｔ３１９７Ｃおよび塩基９６
０の欠失が含まれ、そしてＴ６６９Ｃ、Ｔ７８９Ｃ、Ｃ８７０Ｔ、Ｔ９８０Ｃ、
Ｇ１００７Ａ、Ｔ１２４３Ｃ、Ｇ１３９３Ａ、Ｇ１７０９Ａ、Ｇ１７１９Ａ、Ｔ
２１５６Ｃ、Ａ２２９４Ｇ、Ｔ２４８３Ｃ、Ａ２５８１Ｇ、Ａ２８５１Ｇおよび
７９３位の塩基におけるＴの挿入もまた含まれる。
のフラグメントを、実施例１および４に記載されるように増幅し、クローニング
し、そして配列決定した。これらのｍｔＤＮＡ領域において検出されたホモプラ
スミック一塩基多型およびこれらの変異の発生の頻度を表４に示す。これは、「
多型」でも「稀な多型」でもない変異を含み、これはまた、「エラー」でもない
（これらの用語は表２〜４の文中に上記される）。これらには、Ｇ７０９Ａ、Ｇ
９３０Ａ、Ｔ９８０Ｃ、Ｔ１１８９Ｃ、Ｔ１２４３Ｃ、Ｃ１７００Ｔ、Ｇ１７１
９Ａ、Ｔ１８０９Ｃ、Ａ１８１１Ｇ、Ｇ１８８８Ａ、Ｇ２０９８Ａ、Ｔ２１５８
Ｃ、Ｃ２２５９Ｔ、Ｔ２３５２Ｃ、Ｇ３０１０Ａ、Ｔ３１９７Ｃおよび塩基９６
０の欠失が含まれ、そしてＴ６６９Ｃ、Ｔ７８９Ｃ、Ｃ８７０Ｔ、Ｔ９８０Ｃ、
Ｇ１００７Ａ、Ｔ１２４３Ｃ、Ｇ１３９３Ａ、Ｇ１７０９Ａ、Ｇ１７１９Ａ、Ｔ
２１５６Ｃ、Ａ２２９４Ｇ、Ｔ２４８３Ｃ、Ａ２５８１Ｇ、Ａ２８５１Ｇおよび
７９３位の塩基におけるＴの挿入もまた含まれる。
【００７４】
年齢の関数として表４に提示されるデータの分析は、研究された被検体の群に
おいて、８５歳以上のＡＤおよびコントロール被験体を比較した場合に、ｍｔＤ
ＮＡ １２Ｓ／１６Ｓ ｒＲＮＡ領域ホモプラスミック一塩基多型のロードにお
ける差異が最も明白であることを示す（図７）。コントロール被験体に対してＡ
ＤケースにおけるミトコンドリアｒＲＮＡ遺伝子における大量の一塩基多型に向
かう傾向が、分析された全ての年齢群（６４〜７４歳、７５〜８４および８５歳
以上）において検出可能であった。
おいて、８５歳以上のＡＤおよびコントロール被験体を比較した場合に、ｍｔＤ
ＮＡ １２Ｓ／１６Ｓ ｒＲＮＡ領域ホモプラスミック一塩基多型のロードにお
ける差異が最も明白であることを示す（図７）。コントロール被験体に対してＡ
ＤケースにおけるミトコンドリアｒＲＮＡ遺伝子における大量の一塩基多型に向
かう傾向が、分析された全ての年齢群（６４〜７４歳、７５〜８４および８５歳
以上）において検出可能であった。
【００７５】
（実施例９）
（アルツハイマー病を分離するミトコンドリアＤＮＡにおける一塩基多型（Ｓ
ＮＰ）） ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）を、２４のコントロールおよび２４の剖
検確認したＡＤケースの脳および血液サンプルから単離しそして配列決定した。
確認したＡＤサンプルは、１１の前頭骨サンプル、３の頭頂皮質サンプルおよび
１０の血液サンプルから構成された。コントロールサンプルは、１２の剖検確認
した脳サンプル（平均年齢７９．３歳：５の正常なコントロール、全頭骨；５の
拡散レーヴィ小体痴呆（ＤＬＢＤ）サンプル、全頭骨；２の副核上麻痺（ｐａｒ
ａｓｕｐｒａｎｕｃｌｅａｒ ｐａｌｓｙ）（ＰＳＰ）サンプル、全頭骨）およ
び健康体からの１２の血液サンプル、ＡＤの家族歴を有さない正常なボランティ
ア（平均年齢８８．８歳）から構成された。
ＮＰ）） ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）を、２４のコントロールおよび２４の剖
検確認したＡＤケースの脳および血液サンプルから単離しそして配列決定した。
確認したＡＤサンプルは、１１の前頭骨サンプル、３の頭頂皮質サンプルおよび
１０の血液サンプルから構成された。コントロールサンプルは、１２の剖検確認
した脳サンプル（平均年齢７９．３歳：５の正常なコントロール、全頭骨；５の
拡散レーヴィ小体痴呆（ＤＬＢＤ）サンプル、全頭骨；２の副核上麻痺（ｐａｒ
ａｓｕｐｒａｎｕｃｌｅａｒ ｐａｌｓｙ）（ＰＳＰ）サンプル、全頭骨）およ
び健康体からの１２の血液サンプル、ＡＤの家族歴を有さない正常なボランティ
ア（平均年齢８８．８歳）から構成された。
【００７６】
プロテイナーゼＫ／ＳＤＳ可溶化後の有機抽出によるＤＮＡの単離を、実施例
１に記載した。ＰＣＲ増幅を、表１０に示されるオリゴヌクレオチドプライマー
を使用して完全ｍｔＤＮＡ分子を架橋する６８種類のＰＣＲ産生フラグメント（
各フラグメントは、周囲の産生フラグメントと約５０％の配列重複を有する）を
生成することを除いて、実施例２に記載されるように行った。このストラテジー
は、各ヌクレオチド塩基の同定における４倍の縮退を有する順方向および逆方向
の両方における直接的なｍｔＤＮＡ配列決定を可能にし、このことは、エラーの
ない配列決定を生じる。従って、各患者サンプルについて、約６８，０００ヌク
レオチドを配列決定し、そしてホモプラスミック変異の分析を証明した。
１に記載した。ＰＣＲ増幅を、表１０に示されるオリゴヌクレオチドプライマー
を使用して完全ｍｔＤＮＡ分子を架橋する６８種類のＰＣＲ産生フラグメント（
各フラグメントは、周囲の産生フラグメントと約５０％の配列重複を有する）を
生成することを除いて、実施例２に記載されるように行った。このストラテジー
は、各ヌクレオチド塩基の同定における４倍の縮退を有する順方向および逆方向
の両方における直接的なｍｔＤＮＡ配列決定を可能にし、このことは、エラーの
ない配列決定を生じる。従って、各患者サンプルについて、約６８，０００ヌク
レオチドを配列決定し、そしてホモプラスミック変異の分析を証明した。
【００７７】
【表１０】
配列決定を、製造業者の指示に従って、９６キャピラリーアレイを備えるＰｅ
ｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｍｏｄｅｌ ３７００ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒを使
用して実施し、そしてデータ分析（実施例２に本質的に記載されるように行った
）はまた、以下を含む種々のパラメーターに従うサンプル配列の分類を含む：組
織サンプルの供給源、親の臨床状態（例えば、ＡＤまたはコントロール）、親の
ハプログループ、ｍｔＤＮＡ遺伝子領域（同定されたＳＮＰが存在する）そして
タンパク質コードｍｔＤＮＡ遺伝子（ＡＤ関連ＳＰＮが同定された）については
、ＳＮＰが同義の置換（すなわち、コードされるタンパク質のアミノ酸配列おけ
る変化を生じない）であるかそれとも非同義の置換（すなわち、コードされるタ
ンパク質において異なるアミノ酸配列を生じる）であるか。
ｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｍｏｄｅｌ ３７００ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒを使
用して実施し、そしてデータ分析（実施例２に本質的に記載されるように行った
）はまた、以下を含む種々のパラメーターに従うサンプル配列の分類を含む：組
織サンプルの供給源、親の臨床状態（例えば、ＡＤまたはコントロール）、親の
ハプログループ、ｍｔＤＮＡ遺伝子領域（同定されたＳＮＰが存在する）そして
タンパク質コードｍｔＤＮＡ遺伝子（ＡＤ関連ＳＰＮが同定された）については
、ＳＮＰが同義の置換（すなわち、コードされるタンパク質のアミノ酸配列おけ
る変化を生じない）であるかそれとも非同義の置換（すなわち、コードされるタ
ンパク質において異なるアミノ酸配列を生じる）であるか。
【００７８】
ＡＤ関連ＳＮＰを表９に示す。図８〜１４は、定量的データ分析の結果を示す
。ここで、ＡＤ関連ＳＮＰを選択したパラメーターに従って分類した。従って、
図８は、ｍｔＤＮＡハプログループに従って、本実施例において分析されたサン
プルのプロフィールを示す。図９では、ｍｔＤＮＡタンパク質コード領域に従う
非ホモプラスミックヌクレオチド置換に影響する表９からのＡＤ関連ＳＮＰ（す
なわち、遺伝子座）の分布（指示された遺伝子領域あたり１つ以上のＳＮＰを有
する分析されたサンプルのパーセンテージ）を示す。ここでＡＤ群において検出
されたＳＮＰを、全ての非ＡＤコントロール群において検出したＳＮＰと比較す
る。
。ここで、ＡＤ関連ＳＮＰを選択したパラメーターに従って分類した。従って、
図８は、ｍｔＤＮＡハプログループに従って、本実施例において分析されたサン
プルのプロフィールを示す。図９では、ｍｔＤＮＡタンパク質コード領域に従う
非ホモプラスミックヌクレオチド置換に影響する表９からのＡＤ関連ＳＮＰ（す
なわち、遺伝子座）の分布（指示された遺伝子領域あたり１つ以上のＳＮＰを有
する分析されたサンプルのパーセンテージ）を示す。ここでＡＤ群において検出
されたＳＮＰを、全ての非ＡＤコントロール群において検出したＳＮＰと比較す
る。
【００７９】
【表９】
図１０では、ｍｔＤＮＡタンパク質コード領域に従う非ホモプラスミックヌク
レオチド置換に干渉する表９からのＡＤ関連ＳＮＰ（すなわち、遺伝子座）の分
布（示された遺伝子領域あたり１つ以上のＳＮＰを有する分析されたサンプルの
パーセンテージ）を示す。ここで、ＡＤ群において検出されたＳＮＰを、正常（
すなわち、健康体）または疾患のコントロールとしてさらに分類された非ＡＤコ
ントロール群において検出したＳＮＰと比較する。
レオチド置換に干渉する表９からのＡＤ関連ＳＮＰ（すなわち、遺伝子座）の分
布（示された遺伝子領域あたり１つ以上のＳＮＰを有する分析されたサンプルの
パーセンテージ）を示す。ここで、ＡＤ群において検出されたＳＮＰを、正常（
すなわち、健康体）または疾患のコントロールとしてさらに分類された非ＡＤコ
ントロール群において検出したＳＮＰと比較する。
【００８０】
図１１は、ｍｔＤＮＡタンパク質コード領域に従うホモプラスミックヌクレオ
チド置換に干渉する表９からのＡＤ関連ＳＮＰ（すなわち、遺伝子座）の分布（
示された遺伝子領域あたり１つ以上のＳＮＰを有する分析されたサンプルのパー
センテージ）を示す。ここで、ＡＤ群において検出されたＳＮＰを、正常（すな
わち、健康体）または疾患のコントロールとしてさらに分類された非ＡＤコント
ロール群において検出されたＳＮＰと比較する。
チド置換に干渉する表９からのＡＤ関連ＳＮＰ（すなわち、遺伝子座）の分布（
示された遺伝子領域あたり１つ以上のＳＮＰを有する分析されたサンプルのパー
センテージ）を示す。ここで、ＡＤ群において検出されたＳＮＰを、正常（すな
わち、健康体）または疾患のコントロールとしてさらに分類された非ＡＤコント
ロール群において検出されたＳＮＰと比較する。
【００８１】
図１２は、各２２の公知のヒトミトコンドリアｔＲＮＡタンパク質コード領域
に従う、ミトコンドリアｔＲＮＡ遺伝子におけるヌクレオチド置換に影響する表
９からのＡＤ関連ＳＮＰ（すなわち、遺伝子座）の分布（指示された遺伝子領域
あたり１つ以上のＳＮＰを有する分析されたサンプルのパーセンテージ）を示す
。ここで、ＡＤ群において検出されたＳＮＰを、正常（すなわち、健康体）また
は疾患のコントロールとしてさらに分類された非ＡＤコントロール群において検
出されたＳＮＰと比較する。
に従う、ミトコンドリアｔＲＮＡ遺伝子におけるヌクレオチド置換に影響する表
９からのＡＤ関連ＳＮＰ（すなわち、遺伝子座）の分布（指示された遺伝子領域
あたり１つ以上のＳＮＰを有する分析されたサンプルのパーセンテージ）を示す
。ここで、ＡＤ群において検出されたＳＮＰを、正常（すなわち、健康体）また
は疾患のコントロールとしてさらに分類された非ＡＤコントロール群において検
出されたＳＮＰと比較する。
【００８２】
図１３は、示されたＤＮＡ領域におけるヌクレオチド置換に干渉する、表９か
ら、ＡＤ関連ＳＮＰの分布（示された遺伝子領域あたり１つ以上のＳＮＰを有す
る分析されたサンプルのパーセンテージ）を要約する。ここで、ＡＤ群において
検出されたＳＮＰを、正常な健康体コントロールに由来するサンプル中の対応す
るｍｔＤＮＡ領域において検出されたＳＮＰと比較する。
ら、ＡＤ関連ＳＮＰの分布（示された遺伝子領域あたり１つ以上のＳＮＰを有す
る分析されたサンプルのパーセンテージ）を要約する。ここで、ＡＤ群において
検出されたＳＮＰを、正常な健康体コントロールに由来するサンプル中の対応す
るｍｔＤＮＡ領域において検出されたＳＮＰと比較する。
【００８３】
図１４は、示されたＤＮＡ領域におけるヌクレオチド置換に干渉する、表９か
ら、ＡＤ関連ＳＮＰの分布（患者あたり検出されたＳＮＰの数）を要約する。こ
こで、ＡＤ群において検出されたＳＮＰを、正常な健康コントロールに由来する
サンプル中の対応するｍｔＤＮＡ領域において検出されたＳＮＰと比較する。
ら、ＡＤ関連ＳＮＰの分布（患者あたり検出されたＳＮＰの数）を要約する。こ
こで、ＡＤ群において検出されたＳＮＰを、正常な健康コントロールに由来する
サンプル中の対応するｍｔＤＮＡ領域において検出されたＳＮＰと比較する。
【００８４】
前記から、本発明の特定の実施形態が本明細書中に例示の目的で記載されてい
るが、種々の改変が本発明の精神および範囲から逸脱することなく為され得るこ
とは、明らかである。従って、本発明は、添付のクレームによる場合を除いて、
制限されない。
るが、種々の改変が本発明の精神および範囲から逸脱することなく為され得るこ
とは、明らかである。従って、本発明は、添付のクレームによる場合を除いて、
制限されない。
【図１】
図１は、ＡＤと関連するミトコンドリアｒＲＮＡ遺伝子変異を示す。
【図２】
図２は、ＡＤ細胞およびコントロールサイブリッド細胞から得られたオリゴヌ
クレオチドプライマー伸長反応を示す。
クレオチドプライマー伸長反応を示す。
【図３】
図３は、ＡＤ細胞およびコントロールサイブリッド細胞におけるミトコンドリ
アＥＴＣ複合体ＩＶ活性を示す。
アＥＴＣ複合体ＩＶ活性を示す。
【図４】
図４は、ＡＤ細胞およびコントロールサイブリッド細胞、ならびにＳＨ−ＳＹ
５Ｙ神経芽細胞腫細胞におけるＣＯＸサブユニットのウェスタンイムノブロット
分析を示す。
５Ｙ神経芽細胞腫細胞におけるＣＯＸサブユニットのウェスタンイムノブロット
分析を示す。
【図５】
図５は、ＡＤ細胞およびコントロールサイブリッド細胞において、ラジカル除
去酵素を妨害する薬剤のＲＯＳ産生に対する効果を例証する。
去酵素を妨害する薬剤のＲＯＳ産生に対する効果を例証する。
【図６】
図６は、混合したコントロールサイブリッド細胞と比較した、ＡＤ−１サイブ
リッド細胞におけるラジカル除去酵素を酸化的緩衝能力を示し、そしてまた、２
つの酵素、Ｃｕ／Ｚｎ ＳＯＤおよびＭｎ ＳＯＤについての遺伝子発現の相対
的レベルを示す。
リッド細胞におけるラジカル除去酵素を酸化的緩衝能力を示し、そしてまた、２
つの酵素、Ｃｕ／Ｚｎ ＳＯＤおよびＭｎ ＳＯＤについての遺伝子発現の相対
的レベルを示す。
【図７】
図７は、年齢の関数として、ミトコンドリアｒＲＮＡ遺伝子中のｍｔＤＮＡ一
塩基多型におけるＡＤとコントロール被験体との間の差異を示す。
塩基多型におけるＡＤとコントロール被験体との間の差異を示す。
【図８】
図８は、ハプログループに従う、ＡＤ関連ＳＮＰおよびコントロールＳＮＰを
示す。
示す。
【図９】
図９は、ｍｔＤＮＡ遺伝子座に従う、ＡＤ関連ＳＮＰおよびコントロール非同
義ＳＮＰを示す。ＮＤ；ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ；ＣＯ、シトクロムｃオキシ
ダーゼ；ＡＴ、ＡＴＰシンターゼ；ＣＹＢ、シトクロムｂ。
義ＳＮＰを示す。ＮＤ；ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ；ＣＯ、シトクロムｃオキシ
ダーゼ；ＡＴ、ＡＴＰシンターゼ；ＣＹＢ、シトクロムｂ。
【図１０】
図１０は、ｍｔＤＮＡ遺伝子座に従う、ＡＤ関連ＳＮＰおよびコントロール非
同義ＳＮＰを示す。図９の省略図である。
同義ＳＮＰを示す。図９の省略図である。
【図１１】
図１１は、ｍｔＤＮＡ遺伝子座に従う、ＡＤ関連ＳＮＰおよびコントロール非
同義ＳＮＰを示す。図９の省略図である。
同義ＳＮＰを示す。図９の省略図である。
【図１２】
図１２は、アミノ酸またはミトコンドリア遺伝コード特異性（Ｆ、Ｖ、ＬＵＵ
Ｒ、Ｉ、Ｑ、Ｍ、Ｗ、Ａ、Ｎ、Ｃ、Ｙ、ＳＵＣＮ、Ｄ、Ｋ、Ｇ、Ｒ、Ｈ、ＳＡＧ
Ｙ、ＬＣＵＲ、Ｅ、Ｔ、Ｐ；ミトコンドリア遺伝コードについてのさらなる情報
については、例えば、Ｓｔｅｅｌｅら、１９９６ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：５２２３およびそこに引用される参考文献を参照のこ
と）によって示されるｍｔＤＮＡの２２のミトコンドリアｔＲＮＡ遺伝子の各々
に従う、ＡＤ関連ＳＮＰおよびコントロール非同義ＳＮＰを示す。
Ｒ、Ｉ、Ｑ、Ｍ、Ｗ、Ａ、Ｎ、Ｃ、Ｙ、ＳＵＣＮ、Ｄ、Ｋ、Ｇ、Ｒ、Ｈ、ＳＡＧ
Ｙ、ＬＣＵＲ、Ｅ、Ｔ、Ｐ；ミトコンドリア遺伝コードについてのさらなる情報
については、例えば、Ｓｔｅｅｌｅら、１９９６ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：５２２３およびそこに引用される参考文献を参照のこ
と）によって示されるｍｔＤＮＡの２２のミトコンドリアｔＲＮＡ遺伝子の各々
に従う、ＡＤ関連ＳＮＰおよびコントロール非同義ＳＮＰを示す。
【図１３】
図１３は、ｍｔＤＮＡ領域に従う、ＡＤ関連ＳＮＰおよびコントロールＳＮＰ
を要約する。
を要約する。
【図１４】
図１４は、ｍｔＤＮＡ領域に従う、ＡＤ関連ＳＮＰおよびコントロールＳＮＰ
の被験体あたりの頻度を要約する。
の被験体あたりの頻度を要約する。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｇ０１Ｎ 37/00 １０２ Ａ６１Ｐ 25/28
// Ａ６１Ｋ 45/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＦ
Ａ６１Ｐ 25/28 Ｆ
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，
ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ
Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ
，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，
ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ
Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ
)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，
ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，
ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ
Ｎ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ
，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，
ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，Ｋ
Ｐ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ
，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，
ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，Ｓ
Ｇ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ
，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ
Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 CA04 CA05 CA09
CA12 HA08 HA09 HA11 HA12
HA13 HA14 HA19
4B029 AA07 BB20 CC03 FA15
4B063 QA01 QA13 QA17 QA19 QQ02
QQ03 QQ08 QQ12 QQ43 QQ44
QQ53 QQ54 QQ59 QQ61 QQ62
QQ89 QR01 QR08 QR14 QR20
QR31 QR32 QR36 QR41 QR42
QR56 QR58 QR62 QR63 QR66
QR72 QR80 QX02
4C084 AA06 AA07 AA17 NA20 ZA161
ZC781
Claims (24)
- 【請求項１】 アルツハイマー病を有すること、またはアルツハイマー病を
有する危険性があることが疑われる第１の被験体において、アルツハイマー病の
危険性または存在を決定するための方法であって、以下： ミトコンドリアＤＮＡを含有する第１および第２の生物学的サンプルの各々に
おいて、アルツハイマー病に関連する少なくとも１つのミトコンドリア一塩基多
型の存在または非存在を決定する工程であって、該第１の生物学的サンプルは、
該第１の被験体から得られ、そして該第２のサンプルは、変更したミトコンドリ
ア機能に関連する疾患の危険性も存在もないことが既知である第２の被験体から
得られる、工程であって、 ここで、該第１の生物学的サンプルにおける、アルツハイマー病に関連する少
なくとも１つのミトコンドリア一塩基多型の存在、および該第２の生物学的サン
プルにおける、対応するヌクレオチドにおけるミトコンドリア一塩基多型の非存
在が、アルツハイマー病の増加した危険性を示す、工程、ならびに 該工程から、アルツハイマー病の危険性または存在を決定する工程、 を包含する、方法。 - 【請求項２】 前記第１のサンプル中のミトコンドリアＤＮＡが増幅され、
そして前記第２のサンプル中のミトコンドリアＤＮＡが増幅される、請求項１に
記載の方法。 - 【請求項３】 前記決定する工程が、以下： 前記第１および第２の生物学的サンプルの各々を、該第１のサンプルのミトコ
ンドリアＤＮＡに存在する配列および該第２のサンプルのミトコンドリアＤＮＡ
に存在する配列に対して相補的であるヌクレオチド配列を有する、オリゴヌクレ
オチドプライマーと、該プライマーの該ミトコンドリアＤＮＡに対するハイブリ
ダイゼーションを可能にするに十分な条件下および時間で接触させる工程；なら
びに 第１産物を産生する、該第１サンプルのミトコンドリアＤＮＡに対するプライ
マーのハイブリダイゼーションおよび伸長、ならびに該第１産物と区別可能な第
２産物を産生する、該第２のサンプルのミトコンドリアＤＮＡに対するプライマ
ーのハイブリダイゼーションおよび伸長を検出する工程であって、これから、ア
ルツハイマー病に関連する少なくとも１つのミトコンドリア一塩基多型の存在ま
たは非存在を決定する、工程、 を包含する、請求項１に記載の方法。 - 【請求項４】 前記第１のサンプル中のミトコンドリアＤＮＡが増幅され、
そして前記第２のサンプル中のミトコンドリアＤＮＡが増幅される、請求項３に
記載の方法。 - 【請求項５】 アルツハイマー病に関連し、前記第１の生物学的サンプル中
に存在し、そして前記第２の生物学的サンプル中の対応するヌクレオチドには存
在しない、少なくとも１つのミトコンドリア一塩基多型が、Ｄ−ループ、ミトコ
ンドリアｒＲＮＡ遺伝子、ミトコンドリアＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ遺伝子、ミ
トコンドリアｔＲＮＡ遺伝子、ミトコンドリアシトクロムｃオキシダーゼ遺伝子
、ミトコンドリアＡＴＰシンターゼ遺伝子およびミトコンドリアシトクロムｂ遺
伝子からなる群から選択される、ミトコンドリアＤＮＡ領域に存在する、請求項
３に記載の方法。 - 【請求項６】 アルツハイマー病に関連し、前記第１の生物学的サンプル中
に存在し、そして前記第２の生物学的サンプル中の対応するヌクレオチドには存
在しない、少なくとも１つのミトコンドリア一塩基多型が、Ｄ−ループ、ミトコ
ンドリアｒＲＮＡ遺伝子、ミトコンドリアＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ遺伝子、ミ
トコンドリアｔＲＮＡ遺伝子、ミトコンドリアシトクロムｃオキシダーゼ遺伝子
、ミトコンドリアＡＴＰシンターゼ遺伝子およびミトコンドリアシトクロムｂ遺
伝子からなる群から選択される、ミトコンドリアＤＮＡ領域に存在する、請求項
１に記載の方法。 - 【請求項７】 アルツハイマー病に関連し、前記第１の生物学的サンプル中
に存在し、そして前記第２の生物学的サンプル中の対応するヌクレオチドには存
在しない、少なくとも１つのミトコンドリア一塩基多型が、ミトコンドリアＮＡ
ＤＨデヒドロゲナーゼ遺伝子、ミトコンドリアシトクロムｃオキシダーゼ遺伝子
、ミトコンドリアＡＴＰシンターゼ遺伝子およびミトコンドリアシトクロムｂ遺
伝子からなる群から選択される、ミトコンドリアＤＮＡ領域に存在し、そしてこ
こで、該一塩基多型が、非同義のヌクレオチド置換である、請求項６に記載の方
法。 - 【請求項８】 アルツハイマー病に関連し、前記第１の生物学的サンプル中
に存在し、そして前記第２の生物学的サンプル中の対応するヌクレオチドには存
在しない、少なくとも１つのミトコンドリア一塩基多型が、ミトコンドリアＮＡ
ＤＨデヒドロゲナーゼ遺伝子、ミトコンドリアシトクロムｃオキシダーゼ遺伝子
、ミトコンドリアＡＴＰシンターゼ遺伝子およびミトコンドリアシトクロムｂ遺
伝子からなる群から選択される、ミトコンドリアＤＮＡ領域に存在し、そしてこ
こで、該一塩基多型が、同義のヌクレオチド置換である、請求項６に記載の方法
。 - 【請求項９】 アルツハイマー病に関連し、前記第１の生物学的サンプル中
に存在し、そして前記第２の生物学的サンプル中の対応するヌクレオチドには存
在しない、少なくとも１つのミトコンドリア一塩基多型が、７２位、１１４位、
１４６位、１８５位、１８９位、１９９位、２０４位、２０７位、２２８位、２
３６位、２３９位、４５６位、４６２位、４８２位、４８９位、４９７位、５０
０位、５１６位、５２２位、５２３位、５４７位、５９３位、６６９位、９６０
位、１００７位、１２４３位、１３９３位、１７１９位、１８０９位、２３５２
位、２４８３位、２７０２位、２８５１位、３１９７位、３３３３位、３３３６
位、３３４８位、３３９４位、３３９８位、３４２３位、３５０５位、３５５９
位、３９１５位、３９９２位、４０２４位、４０９５位、４２１６位、４３３６
位、４５２９位、４７２７位、４７９３位、４９１７位、４９９１位、５００４
位、５０４６位、５２２８位、５３１５位、５４１８位、５４２６位、５４６０
位、５４６１位、５５１６位、５５５４位、５６３４位、５６５６位、５７７３
位、６１８２位、６２２１位、６３４１位、６３６７位、６３７１位、６４８９
位、７１８４位、７３２５位、７６２１位、７７６８位、７７８７位、７７８９
位、７８６４位、７８９５位、７９６３位、８１４９位、８２５１位、８２６９
位、８２７６〜８２８４位、８４７０位、８４８５位、８５０８位、８６０２位
、８６９７位、８７５２位、８９０１位、８９９４位、９１２３位、９２５４位
、９３６２位、９３８０位、９４７７位、９５５４位、９７０８位、９８０４位
、９８６１位、１００３４位、１００４４位、１０２３８位、１０４６３位、１
０５８９位、１０９７８位、１１０６５位、１１２５１位、１１２５３位、１１
２７２位、１１４７０位、１１５２７位、１１６１１位、１１６７４位、１１８
１２位、１１９１４位、１１９４７位、１２４１４位、１２５０１位、１２６０
９位、１２７０５位、１２９５４位、１３１１１位、１３１９４位、１３２１２
位、１３３６８位、１３６１７位、１３７８０位、１３９６６位、１４０２０位
、１４１４８位、１４１７８位、１４１７９位、１４１８２位、１４２１２位、
１４２３３位、１４４７０位、１４５８２位、１４９０５位、１５０２８位、１
５０４３位、１５１９１位、１５２９９位、１５３８０位、１５５５３位、１５
６０７位、１５７５８位、１５７９０位、１５８０８位、１５８３３位、１５８
８４位、１５９２４位、１５９２８位、１６０６９位、１６０８６位、１６０９
３位、１６１２６位、１６１２９位、１６１４５位、１６１４７位、１６１７２
位、１６１７４位、１６１８２位、１６１８３位、１６１８９位、１６１９２位
、１６１９３位、１６２２３位、１６２２４位、１６２３４位、１６２３５位、
１６２３９位、１６２４８位、１６２５６位、１６２６１位、１６２７０位、１
６２７８位、１６２９０位、１６２９２位、１６２９３位、１６２９４位、１６
２９８位、１６３００位、１６３０４位、１６３０９位、１６３１１位、１６３
２０位、１６３５５位、１６３６２位、１６３９１位、１６４８２位および１６
５２４位からなる群から選択される、配列番号１のヌクレオチド位に対応するヌ
クレオチドに位置するミトコンドリア一塩基多型である、請求項６に記載の方法
。 - 【請求項１０】 アルツハイマー病に関連し、前記第１の生物学的サンプル
中に存在し、そして前記第２の生物学的サンプル中の対応するヌクレオチドには
存在しない、少なくとも１つのミトコンドリア一塩基多型が、配列番号１のヌク
レオチド位に対応するヌクレオチドに位置するミトコンドリア一塩基多型であり
、該ヌクレオチド位が、７０９位、９３０位、９６０位、９８０位、１１８９位
、１２４３位、１７００位、１７１９位、１８０９位、１８１１位、１８８８位
、２０９８位、２１５８位、２２５９位、２３５２位、３０１０位、３１９７位
、６６９位、７８９位、７９３位、８７０位、９８０位、１００７位、１２４３
位、１３９３位、１７０９位、１７１９位、２１５６位、２２９４位、２４８３
位、２５８１位、２８５１位、６３６６位および１２９５４位からなる群から選
択される、請求項６に記載の方法。 - 【請求項１１】 被験体において、アルツハイマー病の危険性または存在を
決定するための方法であって、以下： 該被験体由来のミトコンドリアＤＮＡを含有する生物学的サンプルにおいて、
アルツハイマー病に関連する少なくとも１つのミトコンドリア一塩基多型の存在
を決定する工程、 を包含する、方法。 - 【請求項１２】 アルツハイマー病に関連する少なくとも１つのミトコンド
リア一塩基多型が、Ｄ−ループ、ミトコンドリアｒＲＮＡ遺伝子、ミトコンドリ
アＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ遺伝子、ミトコンドリアｔＲＮＡ遺伝子、ミトコン
ドリアシトクロムｃオキシダーゼ遺伝子、ミトコンドリアＡＴＰシンターゼ遺伝
子およびミトコンドリアシトクロムｂ遺伝子からなる群から選択される、ミトコ
ンドリアＤＮＡ領域に存在する、請求項１１に記載の方法。 - 【請求項１３】 アルツハイマー病に関連する少なくとも１つのミトコンド
リア一塩基多型が、ミトコンドリアＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ遺伝子、ミトコン
ドリアシトクロムｃオキシダーゼ遺伝子、ミトコンドリアＡＴＰシンターゼ遺伝
子およびミトコンドリアシトクロムｂ遺伝子からなる群から選択される、ミトコ
ンドリアＤＮＡ領域に存在し、そしてここで、該一塩基多型が、非同義のヌクレ
オチド置換である、請求項１１に記載の方法。 - 【請求項１４】 アルツハイマー病に関連する少なくとも１つのミトコンド
リア一塩基多型が、ミトコンドリアＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ遺伝子、ミトコン
ドリアシトクロムｃオキシダーゼ遺伝子、ミトコンドリアＡＴＰシンターゼ遺伝
子およびミトコンドリアシトクロムｂ遺伝子からなる群から選択される、ミトコ
ンドリアＤＮＡ領域に存在し、そしてここで、該一塩基多型が、同義のヌクレオ
チド置換である、請求項１１に記載の方法。 - 【請求項１５】 アルツハイマー病に関連する少なくとも１つのミトコンド
リア一塩基多型が、７２位、１１４位、１４６位、１８５位、１８９位、１９９
位、２０４位、２０７位、２２８位、２３６位、２３９位、４５６位、４６２位
、４８２位、４８９位、４９７位、５００位、５１６位、５２２位、５２３位、
５４７位、５９３位、６６９位、９６０位、１００７位、１２４３位、１３９３
位、１７１９位、１８０９位、２３５２位、２４８３位、２７０２位、２８５１
位、３１９７位、３３３３位、３３３６位、３３４８位、３３９４位、３３９８
位、３４２３位、３５０５位、３５５９位、３９１５位、３９９２位、４０２４
位、４０９５位、４２１６位、４３３６位、４５２９位、４７２７位、４７９３
位、４９１７位、４９９１位、５００４位、５０４６位、５２２８位、５３１５
位、５４１８位、５４２６位、５４６０位、５４６１位、５５１６位、５５５４
位、５６３４位、５６５６位、５７７３位、６１８２位、６２２１位、６３４１
位、６３６７位、６３７１位、６４８９位、７１８４位、７３２５位、７６２１
位、７７６８位、７７８７位、７７８９位、７８６４位、７８９５位、７９６３
位、８１４９位、８２５１位、８２６９位、８２７６〜８２８４位、８４７０位
、８４８５位、８５０８位、８６０２位、８６９７位、８７５２位、８９０１位
、８９９４位、９１２３位、９２５４位、９３６２位、９３８０位、９４７７位
、９５５４位、９７０８位、９８０４位、９８６１位、１００３４位、１００４
４位、１０２３８位、１０４６３位、１０５８９位、１０９７８位、１１０６５
位、１１２５１位、１１２５３位、１１２７２位、１１４７０位、１１５２７位
、１１６１１位、１１６７４位、１１８１２位、１１９１４位、１１９４７位、
１２４１４位、１２５０１位、１２６０９位、１２７０５位、１２９５４位、１
３１１１位、１３１９４位、１３２１２位、１３３６８位、１３６１７位、１３
７８０位、１３９６６位、１４０２０位、１４１４８位、１４１７８位、１４１
７９位、１４１８２位、１４２１２位、１４２３３位、１４４７０位、１４５８
２位、１４９０５位、１５０２８位、１５０４３位、１５１９１位、１５２９９
位、１５３８０位、１５５５３位、１５６０７位、１５７５８位、１５７９０位
、１５８０８位、１５８３３位、１５８８４位、１５９２４位、１５９２８位、
１６０６９位、１６０８６位、１６０９３位、１６１２６位、１６１２９位、１
６１４５位、１６１４７位、１６１７２位、１６１７４位、１６１８２位、１６
１８３位、１６１８９位、１６１９２位、１６１９３位、１６２２３位、１６２
２４位、１６２３４位、１６２３５位、１６２３９位、１６２４８位、１６２５
６位、１６２６１位、１６２７０位、１６２７８位、１６２９０位、１６２９２
位、１６２９３位、１６２９４位、１６２９８位、１６３００位、１６３０４位
、１６３０９位、１６３１１位、１６３２０位、１６３５５位、１６３６２位、
１６３９１位、１６４８２位および１６５２４位からなる群から選択される、配
列番号１のヌクレオチド位に対応するヌクレオチドに位置するミトコンドリア一
塩基多型である、請求項１１に記載の方法。 - 【請求項１６】 アルツハイマー病に関連する少なくとも１つのミトコンド
リア一塩基多型が、配列番号１のヌクレオチド位に対応するヌクレオチドに位置
するミトコンドリア一塩基多型であり、該ヌクレオチド位が、７０９位、９３０
位、９６０位、９８０位、１１８９位、１２４３位、１７００位、１７１９位、
１８０９位、１８１１位、１８８８位、２０９８位、２１５８位、２２５９位、
２３５２位、３０１０位、３１９７位、６６９位、７８９位、７９３位、８７０
位、９８０位、１００７位、１２４３位、１３９３位、１７０９位、１７１９位
、２１５６位、２２９４位、２４８３位、２５８１位、２８５１位、６３６６位
および１２９５４位からなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。 - 【請求項１７】 薬剤が、アルツハイマー病を引き起こすか、アルツハイマ
ー病の病理に寄与するか、またはアルツハイマー病を悪化させるかの見込みがあ
るか否かを決定する方法であって、細胞を含有する生物学的サンプルを候補薬剤
と接触させる工程、ミトコンドリア核酸のアッセイを実施して、該薬剤と接触さ
れた後に該ミトコンドリア核酸が１つ以上の一塩基多型を含むか否かを決定する
工程を包含し、ここで、該核酸が、該細胞に存在するか、または該細胞由来であ
り、そして該１つ以上の一塩基多型が、アルツハイマー病とともに分離する、方
法。 - 【請求項１８】 薬剤が、アルツハイマー病を引き起こすか、アルツハイマ
ー病の病理に寄与するか、またはアルツハイマー病を悪化させるかの見込みがあ
るか否かを決定する方法であって、以下の工程： （ａ）第１の細胞を候補薬剤と接触させる工程； （ｂ）該薬剤と接触されていない第２の細胞、および該第１の細胞を、同じ条
件下でインキュベートする工程； （ｃ）１つ以上のミトコンドリア核酸のアッセイを実施して、該ミトコンドリ
ア核酸が、１つ以上の一塩基多型を含むか否かを決定する工程であって、ここで
、該核酸が、該細胞に存在するか、または該細胞由来であり、そして該一塩基多
型が、アルツハイマー病とともに分離する、工程、 を包含し、 ここで、該第１の細胞に存在するか、または該第１の細胞由来の、該ミトコン
ドリア核酸における、該一塩基多型の１つ以上の存在、ならびに該第２の細胞に
存在するか、または該第２の細胞由来の、該ミトコンドリア核酸における、該一
塩基多型の１つ以上の非存在が、該薬剤がアルツハイマー病を引き起こすか、ア
ルツハイマー病の病理に寄与するか、またはアルツハイマー病を悪化させるかの
見込みがあることを示す、方法。 - 【請求項１９】 固体支持体上に固定された複数の単離された核酸分子を含
む、核酸アレイであって、ここで、該単離された核酸分子が、アルツハイマー病
に関連する少なくとも１つのミトコンドリア一塩基多型が存在する、配列番号１
に示される核酸配列の全てまたは一部を含む、核酸アレイ。 - 【請求項２０】 前記ミトコンドリア一塩基多型が、７２位、１１４位、１
４６位、１８５位、１８９位、１９９位、２０４位、２０７位、２２８位、２３
６位、２３９位、４５６位、４６２位、４８２位、４８９位、４９７位、５００
位、５１６位、５２２位、５２３位、５４７位、５９３位、６６９位、９６０位
、１００７位、１２４３位、１３９３位、１７１９位、１８０９位、２３５２位
、２４８３位、２７０２位、２８５１位、３１９７位、３３３３位、３３３６位
、３３４８位、３３９４位、３３９８位、３４２３位、３５０５位、３５５９位
、３９１５位、３９９２位、４０２４位、４０９５位、４２１６位、４３３６位
、４５２９位、４７２７位、４７９３位、４９１７位、４９９１位、５００４位
、５０４６位、５２２８位、５３１５位、５４１８位、５４２６位、５４６０位
、５４６１位、５５１６位、５５５４位、５６３４位、５６５６位、５７７３位
、６１８２位、６２２１位、６３４１位、６３６７位、６３７１位、６４８９位
、７１８４位、７３２５位、７６２１位、７７６８位、７７８７位、７７８９位
、７８６４位、７８９５位、７９６３位、８１４９位、８２５１位、８２６９位
、８２７６〜８２８４位、８４７０位、８４８５位、８５０８位、８６０２位、
８６９７位、８７５２位、８９０１位、８９９４位、９１２３位、９２５４位、
９３６２位、９３８０位、９４７７位、９５５４位、９７０８位、９８０４位、
９８６１位、１００３４位、１００４４位、１０２３８位、１０４６３位、１０
５８９位、１０９７８位、１１０６５位、１１２５１位、１１２５３位、１１２
７２位、１１４７０位、１１５２７位、１１６１１位、１１６７４位、１１８１
２位、１１９１４位、１１９４７位、１２４１４位、１２５０１位、１２６０９
位、１２７０５位、１２９５４位、１３１１１位、１３１９４位、１３２１２位
、１３３６８位、１３６１７位、１３７８０位、１３９６６位、１４０２０位、
１４１４８位、１４１７８位、１４１７９位、１４１８２位、１４２１２位、１
４２３３位、１４４７０位、１４５８２位、１４９０５位、１５０２８位、１５
０４３位、１５１９１位、１５２９９位、１５３８０位、１５５５３位、１５６
０７位、１５７５８位、１５７９０位、１５８０８位、１５８３３位、１５８８
４位、１５９２４位、１５９２８位、１６０６９位、１６０８６位、１６０９３
位、１６１２６位、１６１２９位、１６１４５位、１６１４７位、１６１７２位
、１６１７４位、１６１８２位、１６１８３位、１６１８９位、１６１９２位、
１６１９３位、１６２２３位、１６２２４位、１６２３４位、１６２３５位、１
６２３９位、１６２４８位、１６２５６位、１６２６１位、１６２７０位、１６
２７８位、１６２９０位、１６２９２位、１６２９３位、１６２９４位、１６２
９８位、１６３００位、１６３０４位、１６３０９位、１６３１１位、１６３２
０位、１６３５５位、１６３６２位、１６３９１位、１６４８２位、１６５２４
位、７０９位、９３０位、９６０位、９８０位、１１８９位、１２４３位、１７
００位、１７１９位、１８０９位、１８１１位、１８８８位、２０９８位、２１
５８位、２２５９位、２３５２位、３０１０位、３１９７位、６６９位、７８９
位、７９３位、８７０位、９８０位、１００７位、１２４３位、１３９３位、１
７０９位、１７１９位、２１５６位、２２９４位、２４８３位、２５８１位、２
８５１位、６３６６位および１２９５４位からなる群から選択される、配列番号
１のヌクレオチド位に対応するヌクレオチドに位置する、請求項１９に記載の核
酸アレイ。 - 【請求項２１】 前記決定する工程が、以下： 前記第１および第２の生物学的サンプルの各々を、アルツハイマー病に関連す
る少なくとも１つのミトコンドリア一塩基多型が存在する、配列番号１に示され
る核酸配列の全てまたは一部を含むオリゴヌクレオチドプライマーと、該プライ
マーの前記ミトコンドリアＤＮＡに対するハイブリダイゼーションを可能にする
に十分な条件下および時間で接触させる工程；ならびに 該第１のサンプルのミトコンドリアＤＮＡに対する該オリゴヌクレオチドプラ
イマーのハイブリダイゼーションの量を、該第２のサンプルのミトコンドリアＤ
ＮＡに対する該プライマーのハイブリダイゼーションの量と比較する工程であっ
て、これから、アルツハイマー病に関連する少なくとも１つのミトコンドリア一
塩基多型の存在または非存在を決定する、工程、 を包含する、請求項１に記載の方法。 - 【請求項２２】 前記ミトコンドリア一塩基多型が、７２位、１１４位、１
４６位、１８５位、１８９位、１９９位、２０４位、２０７位、２２８位、２３
６位、２３９位、４５６位、４６２位、４８２位、４８９位、４９７位、５００
位、５１６位、５２２位、５２３位、５４７位、５９３位、６６９位、９６０位
、１００７位、１２４３位、１３９３位、１７１９位、１８０９位、２３５２位
、２４８３位、２７０２位、２８５１位、３１９７位、３３３３位、３３３６位
、３３４８位、３３９４位、３３９８位、３４２３位、３５０５位、３５５９位
、３９１５位、３９９２位、４０２４位、４０９５位、４２１６位、４３３６位
、４５２９位、４７２７位、４７９３位、４９１７位、４９９１位、５００４位
、５０４６位、５２２８位、５３１５位、５４１８位、５４２６位、５４６０位
、５４６１位、５５１６位、５５５４位、５６３４位、５６５６位、５７７３位
、６１８２位、６２２１位、６３４１位、６３６７位、６３７１位、６４８９位
、７１８４位、７３２５位、７６２１位、７７６８位、７７８７位、７７８９位
、７８６４位、７８９５位、７９６３位、８１４９位、８２５１位、８２６９位
、８２７６〜８２８４位、８４７０位、８４８５位、８５０８位、８６０２位、
８６９７位、８７５２位、８９０１位、８９９４位、９１２３位、９２５４位、
９３６２位、９３８０位、９４７７位、９５５４位、９７０８位、９８０４位、
９８６１位、１００３４位、１００４４位、１０２３８位、１０４６３位、１０
５８９位、１０９７８位、１１０６５位、１１２５１位、１１２５３位、１１２
７２位、１１４７０位、１１５２７位、１１６１１位、１１６７４位、１１８１
２位、１１９１４位、１１９４７位、１２４１４位、１２５０１位、１２６０９
位、１２７０５位、１２９５４位、１３１１１位、１３１９４位、１３２１２位
、１３３６８位、１３６１７位、１３７８０位、１３９６６位、１４０２０位、
１４１４８位、１４１７８位、１４１７９位、１４１８２位、１４２１２位、１
４２３３位、１４４７０位、１４５８２位、１４９０５位、１５０２８位、１５
０４３位、１５１９１位、１５２９９位、１５３８０位、１５５５３位、１５６
０７位、１５７５８位、１５７９０位、１５８０８位、１５８３３位、１５８８
４位、１５９２４位、１５９２８位、１６０６９位、１６０８６位、１６０９３
位、１６１２６位、１６１２９位、１６１４５位、１６１４７位、１６１７２位
、１６１７４位、１６１８２位、１６１８３位、１６１８９位、１６１９２位、
１６１９３位、１６２２３位、１６２２４位、１６２３４位、１６２３５位、１
６２３９位、１６２４８位、１６２５６位、１６２６１位、１６２７０位、１６
２７８位、１６２９０位、１６２９２位、１６２９３位、１６２９４位、１６２
９８位、１６３００位、１６３０４位、１６３０９位、１６３１１位、１６３２
０位、１６３５５位、１６３６２位、１６３９１位、１６４８２位、１６５２４
位、７０９位、９３０位、９６０位、９８０位、１１８９位、１２４３位、１７
００位、１７１９位、１８０９位、１８１１位、１８８８位、２０９８位、２１
５８位、２２５９位、２３５２位、３０１０位、３１９７位、６６９位、７８９
位、７９３位、８７０位、９８０位、１００７位、１２４３位、１３９３位、１
７０９位、１７１９位、２１５６位、２２９４位、２４８３位、２５８１位、２
８５１位、６３６６位および１２９５４位からなる群から選択される、配列番号
１のヌクレオチド位に対応するヌクレオチドに位置する、請求項２１に記載の方
法。 - 【請求項２３】 前記決定する工程が、前記第１および第２の生物学的サン
プルの各々を、固体支持体上に固定された複数の単離された核酸分子を含む核酸
アレイと、ミトコンドリアＤＮＡの該単離された核酸分子に対するハイブリダイ
ゼーションを可能にするに十分な条件下および時間で接触させる工程を包含し、
ここで、該単離された核酸分子が、アルツハイマー病に関連する少なくとも１つ
のミトコンドリア一塩基多型が存在する、配列番号１に示される核酸配列の全て
または一部を含む、工程；ならびに 該第１のサンプルのミトコンドリアＤＮＡの、該核酸アレイに対するハイブリ
ダイゼーションの量を、該第２のサンプルのミトコンドリアＤＮＡの、該核酸ア
レイに対するハイブリダイゼーションの量と比較し、これから、アルツハイマー
病に関連する少なくとも１つのミトコンドリア一塩基多型の存在または非存在を
決定する工程、 を包含する、請求項１に記載の方法。 - 【請求項２４】 前記ミトコンドリア一塩基多型が、７２位、１１４位、１
４６位、１８５位、１８９位、１９９位、２０４位、２０７位、２２８位、２３
６位、２３９位、４５６位、４６２位、４８２位、４８９位、４９７位、５００
位、５１６位、５２２位、５２３位、５４７位、５９３位、６６９位、９６０位
、１００７位、１２４３位、１３９３位、１７１９位、１８０９位、２３５２位
、２４８３位、２７０２位、２８５１位、３１９７位、３３３３位、３３３６位
、３３４８位、３３９４位、３３９８位、３４２３位、３５０５位、３５５９位
、３９１５位、３９９２位、４０２４位、４０９５位、４２１６位、４３３６位
、４５２９位、４７２７位、４７９３位、４９１７位、４９９１位、５００４位
、５０４６位、５２２８位、５３１５位、５４１８位、５４２６位、５４６０位
、５４６１位、５５１６位、５５５４位、５６３４位、５６５６位、５７７３位
、６１８２位、６２２１位、６３４１位、６３６７位、６３７１位、６４８９位
、７１８４位、７３２５位、７６２１位、７７６８位、７７８７位、７７８９位
、７８６４位、７８９５位、７９６３位、８１４９位、８２５１位、８２６９位
、８２７６〜８２８４位、８４７０位、８４８５位、８５０８位、８６０２位、
８６９７位、８７５２位、８９０１位、８９９４位、９１２３位、９２５４位、
９３６２位、９３８０位、９４７７位、９５５４位、９７０８位、９８０４位、
９８６１位、１００３４位、１００４４位、１０２３８位、１０４６３位、１０
５８９位、１０９７８位、１１０６５位、１１２５１位、１１２５３位、１１２
７２位、１１４７０位、１１５２７位、１１６１１位、１１６７４位、１１８１
２位、１１９１４位、１１９４７位、１２４１４位、１２５０１位、１２６０９
位、１２７０５位、１２９５４位、１３１１１位、１３１９４位、１３２１２位
、１３３６８位、１３６１７位、１３７８０位、１３９６６位、１４０２０位、
１４１４８位、１４１７８位、１４１７９位、１４１８２位、１４２１２位、１
４２３３位、１４４７０位、１４５８２位、１４９０５位、１５０２８位、１５
０４３位、１５１９１位、１５２９９位、１５３８０位、１５５５３位、１５６
０７位、１５７５８位、１５７９０位、１５８０８位、１５８３３位、１５８８
４位、１５９２４位、１５９２８位、１６０６９位、１６０８６位、１６０９３
位、１６１２６位、１６１２９位、１６１４５位、１６１４７位、１６１７２位
、１６１７４位、１６１８２位、１６１８３位、１６１８９位、１６１９２位、
１６１９３位、１６２２３位、１６２２４位、１６２３４位、１６２３５位、１
６２３９位、１６２４８位、１６２５６位、１６２６１位、１６２７０位、１６
２７８位、１６２９０位、１６２９２位、１６２９３位、１６２９４位、１６２
９８位、１６３００位、１６３０４位、１６３０９位、１６３１１位、１６３２
０位、１６３５５位、１６３６２位、１６３９１位、１６４８２位、１６５２４
位、７０９位、９３０位、９６０位、９８０位、１１８９位、１２４３位、１７
００位、１７１９位、１８０９位、１８１１位、１８８８位、２０９８位、２１
５８位、２２５９位、２３５２位、３０１０位、３１９７位、６６９位、７８９
位、７９３位、８７０位、９８０位、１００７位、１２４３位、１３９３位、１
７０９位、１７１９位、２１５６位、２２９４位、２４８３位、２５８１位、２
８５１位、６３６６位および１２９５４位からなる群から選択される、配列番号
１のヌクレオチド位に対応するヌクレオチドに位置する、請求項２３に記載の方
法。
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