JP2003521247A - Ｎｍｄａ受容体のプロテインチロシンホスファターゼとの相互作用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、NMDA受容体（NMDA-R）サブユニットとプロテインチロシンホスファターゼ（PTP）、例えばPTPL1との間の結合の同定に関する。本発明は、NMDA-Rシグナル伝達を調整するPTPアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニングのための方法を提供する。本発明はまた、異常なNMDA-Rシグナル伝達によって媒介される、障害の治療のための方法および組成物も提供する。本発明はさらに、生物標本からPTPL1を単離するための方法も提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】関連出願の相互参照 本出願は、2000年2月1日に出願された米国仮特許出願第60/179,453号に対する
優先権を主張するものであり、その開示はその全体が参照として組み入れられる
。

【０００２】発明の分野 本発明は全般的にはN-メチル-D-アスパラギン酸（NMDA）受容体およびそのシ
グナル伝達活性に関する。本発明は、NMDA受容体シグナル伝達のアゴニストおよ
びアンタゴニストを同定するための方法、ならびにNMDA受容体によって媒介され
る生理的および病的な状態を治療するために有用な、組成物および方法を提供す
る。本発明は生物医学科学に応用される。

【０００３】発明の背景 哺乳類の興奮性シナプスの大半では、グルタミン酸（Glu）が、脳ニューロン
の表面にある3種の異なる型のグルタミン酸受容体と結合することによって、迅
速な化学的神経伝達を媒介する。グルタミン酸受容体によって媒介される細胞応
答は通常、脳内の全く同じ興奮性アミノ酸（EAA）神経伝達物質（例えば、グル
タミン酸またはアスパラギン酸）によって誘発されるが、異なる亜型のグルタミ
ン酸受容体は脳内で異なる分布パターンを有し、異なる細胞シグナル伝達事象を
媒介する。グルタミン酸受容体の主な種類の一つは、N-メチル-D-アスパラギン
酸（NMDA）と優先的に結合することから、N-メチル-D-アスパラギン酸受容体（N
MDA-R）と呼ばれる。NMDAはアスパラギン酸の化学的類似体である：NMDAは通常
は天然には存在せず、脳内に存在しない。NMDA分子がNMDA-Rを有するニューロン
と接触すると、それらはNMDA-Rを強く活性化し（すなわち、強力な受容体アゴニ
ストとして作用する）、グルタミン酸によるものと同じ型の神経興奮を引き起こ
す。NMDA-Rの過度の活性化は、数多くの重要な中枢神経系（CNS）障害において
主要な役割を果たし、一方、NMDA-Rの機能低下はいくつかの精神疾患に関与する
ことが知られている。

【０００４】 NMDA-Rは、1つのNR1サブユニットと、4種の異なるNR2サブユニット（NR2A、NR
2B、NR2CおよびNR2Dと命名）のうち少なくとも1つを含む。NMDA-Rはイオンチャ
ンネルを制御するため、「イオンチャンネル型」受容体である。これらのイオン
チャンネルにより、グルタミン酸、アスパラギン酸またはアゴニスト薬によって
受容体が活性化される場合に、イオンがニューロン内に流入し、それによってニ
ューロンを活性化する（脱分極させる）ことが可能となる。

【０００５】 タンパク質のチロシンリン酸化は、多様な細胞過程の調節に重要な役割を果た
している。タンパク質のチロシンリン酸化の調節は、プロテインチロシンキナー
ゼ（PTK）およびプロテインチロシンホスファターゼ（PTP）の相互作用によって
媒介される。NMDA-Rはプロテインチロシンキナーゼおよびプロテインチロシンホ
スファターゼによって調節される。プロテインチロシンキナーゼによるNMDA-Rの
リン酸化により、ニューロンにおけるNMDA-Rの応答性が増強される（Wangら、Na
ture 369：233〜235、1994）。NR2BおよびNR2Aは、プロテインチロシンキナーゼ
によるリン酸化が起こる主な部位であることが示されている。一方、プロテイン
チロシンホスファターゼは、ニューロンにおけるNMDA-Rの反応性に対して逆の効
果を及ぼす（Wangら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. U.S.A. 93：1721〜1725
、1996）。プロテインチロシンキナーゼのSrcファミリーのメンバーは、NMDA-R
のチロシンリン酸化を媒介すると考えられている。これに対して、NMDA-Rの逆の
脱リン酸化の原因である酵素の同定は、達成されにくい。

【０００６】発明の概要 1つの局面において、本発明は、作用物質がプロテインチロシンホスファター
ゼ（PTP）の、例えばNMDA-R基質に対するホスファターゼ活性を調整する能力、
またはPTPのNMDA-Rへの結合を調整する能力を検出することにより、N-メチル-D-
アスパラギン酸受容体（NMDA-R）シグナル伝達の修飾物質を同定するための方法
を提供する。1つの態様では、修飾物質を、それがPTPのホスファターゼ活性を調
整する能力を検出することによって同定する。もう1つの態様では、修飾物質を
、それが PTPとNMDA-Rとの結合を調整する能力を検出することによって同定する
。

【０００７】 1つの関連した局面において、本発明は、作用物質をNMDA-Rシグナル伝達の修
飾物質として同定するための方法を提供する。本方法は、（a）作用物質を、PTP
L1およびNMDA-Rを含む組成物と接触させる段階、（b）組成物中のNMDA-Rのチロ
シンリン酸化レベルを測定する段階、ならびに（c）このようにして得られたNMD
A-Rのチロシンリン酸化レベルを、作用物質の非存在下で得られた組成物中のNMD
A-Rのチロシンリン酸化レベルと比較する段階、を含む。1つの局面において、本
発明は（i）作用物質、（ii）PTPL1（またはその機能的誘導体）および（iii）N
MDA-R、NMDA-Rサブユニット（またはその機能的誘導体）を接触させる段階であ
って、ここで（ii）および（iii）の一方または両方は、実質的に純粋であるか
または組換えによって発現される段階、NMDA-R（またはその機能的誘導体）のチ
ロシンリン酸化レベルを測定する段階、ならびに作用物質の存在下におけるチロ
シンリン酸化レベルを、作用物質の非存在下におけるチロシンリン酸化レベルと
比較する段階であって、チロシンリン酸化レベルにおける差異によって作用物質
がNMDA-Rシグナル伝達の修飾物質として同定される段階によって、作用物質をNM
DA-Rシグナル伝達の修飾物質として同定するための方法を提供する。1つの態様
において、作用物質は、それがNMDA-RのPTPL1脱リン酸化を増強する能力を検出
することによって同定される。もう1つの態様において、作用物質は、それがNMD
A-RのPTPL1脱リン酸化を阻害する能力を検出することによって同定される。いく
つかの関連した態様では、作用物質を、それがPTPL1のNMDA-Rへの結合を調整す
る能力に関してスクリーニングする。1つの態様において、作用物質はこの結合
を促進または増強する。もう1つの態様において、作用物質はこの結合を阻害ま
たは抑制する。いくつかの他の態様において、NMDA-RおよびPTPL1はPTPL1/NMDA-
Rを含むタンパク質複合体中に存在する。

【０００８】 もう1つの関連した局面においては、NMDA-Rシグナル伝達を調整する核酸分子
を同定するための方法を提供する。このような方法は、遺伝子産物をコードする
核酸分子を、NMDA-RおよびPTPL1を共発現する細胞に導入する段階、核酸分子を
有する細胞を、遺伝子産物が発現される条件下で培養する段階、遺伝子産物を含
む細胞におけるNMDA-Rのチロシンリン酸化レベルを測定する段階、ならびにこの
ようにして得られたNMDA-Rのチロシンリン酸化レベルを、核酸分子を有していな
い細胞におけるNMDA-Rのチロシンリン酸化レベルと比較する段階、を含む。した
がって、本発明は、（a）NMDA-R（またはその機能的誘導体）およびPTPL1（また
はその機能的誘導体）を共発現する細胞培養物を入手する段階、（b）遺伝子産
物をコードする核酸分子を細胞の一部に導入し、それによって核酸分子を含む細
胞を作製する段階、（c）（b）において遺伝子産物が発現される条件下で細胞を
培養する段階；（d）（c）における細胞でのNMDA-Rのチロシンリン酸化レベルを
測定し、かつそのレベルを核酸分子が導入されていない対照細胞のものと比較す
る段階であり、ここでチロシンリン酸化レベルにおける差異により、核酸分子が
NMDA-Rシグナル伝達の修飾物質として同定される段階によって、NMDA-Rシグナル
伝達を調整する核酸分子を同定するための方法を提供する。

【０００９】 もう1つの局面において、本発明は、NMDA-Rのチロシンリン酸化レベルを調整
するPTPL1活性の修飾物質を投与することにより、異常なNMDA-Rシグナル伝達に
よって媒介される疾患を治療するための方法を提供する。いくつかの態様におい
て、修飾物質は、PTPL1がNMDA-Rを脱リン酸化する能力を調整する。いくつかの
関連した態様において、修飾物質は、PTPL1がNMDA-Rに結合する能力を調整する
。いくつかの特定の態様において、修飾物質はPTPL1アゴニストであり、かつ治
療しようとする疾患は過度のNMDA-Rシグナル伝達によって媒介される。いくつか
の他の態様において、修飾物質はPTPL1アンタゴニストであり、かつ治療しよう
とする疾患はNMDA-Rの機能低下によって媒介される。

【００１０】 もう1つの局面において、本発明は、PTPL1のPDZ2ドメインを含むポリペプチド
を、そのポリペプチドを含む生物標本から単離するための方法を提供する。

【００１１】 もう1つの局面において、本発明は、NMDA受容体の活性またはシグナル伝達に
よって媒介される、疾患または状態の治療における、PTPL1ホスファターゼ活性
を調整する作用物質の使用を提供する。

【００１２】 もう1つの局面において、本発明は、NMDA受容体の活性またはシグナル伝達に
よって媒介される、疾患または状態の治療のための、PTPL1ホスファターゼ活性
の修飾物質（例えば、アゴニストまたはアンタゴニスト）の使用を提供する。

【００１３】詳細な説明 本発明は、NMDA-RのNR2AまたはNR2Bサブユニットとプロテインチロシンホスフ
ァターゼPTPL1との間の、結合相互作用の発見に関する。この発見に従って、本
発明は、NMDA-Rシグナル伝達を調整するPTPL1のアゴニストおよびアンタゴニス
トを同定するため、ならびに異常なNMDA-Rシグナル伝達によって媒介される状態
を治療するための方法を提供する。以下の段落に、本発明の組成物の作製および
使用、ならびに本発明の方法の実施に関する手引きを提供する。

【００１４】 I．定義 別に特記しない限り、本明細書で用いる科学技術用語はすべて、本発明が属す
る分野の当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。以下の参
考文献は、本発明で用いる用語の多くの一般的な定義を当業者に提供する：シン
グルトン（Singleton）ら、「微生物学・分子生物学辞典（DICTIONARY OF MICRO
BIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY）」（第2版、1994）；「ケンブリッジ科学技術
辞典（THE CAMBRIDGE DICTIONARY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY）」（Walker編、
1988）；ならびにヘールおよびマーハム（HaleおよびMarham）、「ハーパーコリ
ンズ生物学辞典（HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY）」（1991）。本発明
の実践または試験においては、本明細書に記載したものと同様または同等の任意
の材料または方法を使用することができるが、好ましい方法および材料を記載す
る。以下の定義は、本発明の実践において読者を補助するために提供する。

【００１５】 本明細書で用いる「中枢神経系に対する急性傷害」という用語は、グルタミン
酸の興奮毒性によって媒介される神経障害という実質的な脅威をもたらす短期事
象を含む。これらには、虚血事象（血流不足を伴うもの、脳卒中または心停止な
ど）、低酸素事象（酸素供給不足を伴うもの、溺水、窒息または一酸化炭素中毒
など）、脳または脊髄の外傷（機械的損傷または類似した損傷の形態のもの）、
ドーモイ酸などの興奮毒性を伴うある種の食中毒、およびある種の重症てんかん
発作を含む発作性神経変性が含まれる。また、身体の他の部分に生じる外傷も、
（例えば、銃撃、刺傷または自動車事故の後で起こることがあるように）その外
傷が脳への血流を危うくするのに十分な失血に至る場合には、含まれうる。

【００１６】 「作用物質」という用語には、任意の物質、分子、エレメント、化合物、実体
またはそれらの組み合わせが含まれる。これには例えば、タンパク質、オリゴペ
プチド、有機低分子、多糖類、ポリヌクレオチドなどが含まれるが、これらに限
定されない。これは天然産物、合成化合物もしくは化合物、または2種もしくは
それ以上の物質の組み合わせであってもよい。別に特記しない限り、「作用物質
」、「物質」および「化合物」という用語は互換的に用いることができる。

【００１７】 本明細書で用いる「アゴニスト」とは、標準タンパク質（reference protein
）（例えば、PTPL1、NMDA-R）と相互作用（例えば、結合）する場合に、標準タ
ンパク質の生物学的活性の効果量または効果持続時間を増加または延長させる分
子である。これに対して、本明細書で用いる「アンタゴニスト」という用語は、
標準タンパク質（例えば、PTPL1、NMDA-R）と相互作用（例えば、結合）する場
合に、標準タンパク質の生物学的活性の効果量または効果持続時間を減少させる
分子のことを指す。アゴニストおよびアンタゴニストには、標準タンパク質の効
果を低下させるタンパク質、核酸、炭水化物、抗体または任意の他の分子が含ま
れうる。別に特記しない限り、「アゴニスト」という用語は「活性化物質」と互
換的に用いることができ、「アンタゴニスト」という用語は「阻害物質」と互換
的に用いることができる。

【００１８】 「類似体」という用語は、本明細書において、参照分子と構造的に類似してい
るが、参照分子の特定の置換基を別の置換基と置換することによって、標的とし
た様式または制御された様式で改変された分子のことを指すために用いられる。
当業者には、類似体は参照分子と比較して同じ、類似した、または改善された有
用性を示すことが予想されると考えられる。特性が改善された（特定の受容体型
で効力がより強い、または標的とする受容体型で選択性がより高い、および他の
受容体型で活性レベルがより低い、など）、公知の化合物の異型（variant）を
同定するための、類似体の合成およびスクリーニングは、製薬化学において十分
公知のアプローチである。

【００１９】 「生物標本」という用語は、インビボおよびインビトロで採取した生物試料（
後に操作を行うか否かは問わない）、ならびに合成的に調製したものを指す。生
物標本の代表的な例には、細胞、組織、溶液および体液、天然細胞または組換え
細胞の溶解産物が含まれる。

【００２０】 本明細書で用いる、天然タンパク質またはポリペプチドの「機能的誘導体」と
いう用語は、標準タンパク質またはポリペプチドのものと実質的に同様な生物活
性（機能的または構造的に）を有する、生物活性のあるアミノ酸配列異型を定義
する目的で用いられる。したがって、PTPL1の機能的誘導体は、他の活性の中で
、NMDA-Rと結合して脱リン酸化する能力を保持しなければならない。同様に、NM
DA-Rの機能的誘導体は、PTPL1に結合し、かつPTPL1によってリン酸化されること
が可能でなければならない。

【００２１】 本明細書で用いる「NMDA-Rシグナル伝達の修飾物質」という用語は、NMDA-Rシ
グナル伝達経路にかかわるNMDA-R活性を変化させる能力のある作用物質のことを
指す。修飾物質には、NMDA-Rのチロシンリン酸化の「活性化物質」および「阻害
物質」の両方が含まれるが、それらに限定されない。「活性化物質」とは、NMDA
-Rのチロシンリン酸化レベルを増強し、それによってNMDA受容体をより活性化す
る物質のことである。活性化物質の作用様式は、受容体の結合などによる直接的
なものでもよく、または他の形式でNMDA-Rと相互作用する別の分子（例えば、PT
PL1）の結合などによる間接的なものでもよい。逆に、「阻害物質」は、NMDA-R
のチロシンリン酸化を減少させ、それによってNMDA受容体の活性を低下させる。
この低下は完全なものでも部分的なものでもよい。本明細書で用いるNMDA-Rシグ
ナル伝達の修飾物質には、PTPL1のアンタゴニストおよびアゴニストが含まれる
と考えられる。

【００２２】 本明細書で用いる「調整」という用語は、生物活性（例えば、NMDA-Rのチロシ
ンリン酸化、PTPL1のチロシンホスファターゼ活性、PTPL1のNMDA-Rへの結合）の
、例えばアゴニスト作用（agonizing）による上方制御（upregulation）（すな
わち、活性化または刺激）；および例えばアンタゴニスト作用（antagonizing）
による下方制御（downregulation）（すなわち阻害または抑制）の両方を指す。

【００２３】 「NMDA-Rの機能低下」という用語は、本明細書において、CNSニューロンにお
けるNMDA-Rのシグナル伝達活性が異常に低いレベルであることを指すために用い
られる。例えば、NMDA-Rの機能低下は、異常に低いNMDA-Rのホスホチロシンレベ
ルによって生じることがある。NMDA-Rの機能低下が、薬剤誘発性現象として起こ
る可能性もある。また、これが内因性疾患過程として起こる可能性もある。

【００２４】 別に特記しない限り、本明細書で用いる「NMDA-R」または「NMDA受容体」とい
う用語は、1つのNR1サブユニットおよび少なくとも1つのNR2AまたはNR2Bサブユ
ニットを有するNMDA受容体分子のことを指す。

【００２５】 本明細書で用いる「NMDA-Rシグナル伝達」という用語は、神経発生、神経可塑
性および興奮毒性などの種々の細胞過程に関与する、中枢神経系におけるそのシ
グナル伝達活性のことを指す。NMDA-Rシグナル伝達は、ニューロンの移動、ニュ
ーロンの生存、シナプス成熟、学習および記憶ならびに神経変性を含むが、それ
らに限定されない、さまざまな過程に影響を及ぼす。

【００２６】 本明細書で用いる「PTPL1修飾物質」という用語は、NMDA-Rに対するPTPL1ホス
ファターゼ活性の「活性化物質」および「阻害物質」の両方を含む。PTPL1の「
活性化物質」とは、PTPL1をより活性化させ、かつそれによってNMDA-Rのホスホ
チロシンレベルを低下させる物質である。活性化物質の作用様式は、PTPL1の結
合などによる直接的なものでもよく、または他の形式でPTPL1と相互作用する別
の分子の結合などによる間接的なものでもよい。逆に、PTPL1の「阻害物質」は
、PTPL1の活性を低下させ、かつそれによってNMDA-Rのホスホチロシンレベルを
検出可能な程度に高める物質である。この低下は完全なものでも部分的なもので
もよく、直接効果によるものでも間接効果によるものでもよい。

【００２７】 本明細書で用いる「PTPL1のPDZ2ドメインを含むポリペプチド」という用語に
は、PTPL1、およびPTPL1のPDZ2ドメインを含む他のポリペプチド、またはNR2Aお
よび／もしくはNR2Bと結合しうるそれらの誘導体、類似体、異型または融合タン
パク質が含まれる。「NMDA-RのPTPL1結合部位を含むポリペプチド」という用語
には、NR2AもしくはNR2Bサブユニットを少なくとも1つ含むNMDA-R、NR2A、NR2B
、およびNR2AもしくはNR2BのPTPL1結合部を含む他のポリペプチド、またはPTPL1
と結合しうるそれらの誘導体、類似体、異型もしくは融合タンパク質が含まれる
。

【００２８】 本明細書で用いる「PTPL1/NMDA-Rを含むタンパク質複合体」という用語は、PT
PL1およびNMDA-Rを含む、インビトロまたはインビボで形成されたタンパク質複
合体のことを指す。PTPL1とNMDA-Rとの結合のみが関心対象である場合には、PTP
L1のPDZ2ドメインを含むポリペプチドおよびNMDA-RのPTPL1結合部位を含むポリ
ペプチドを、それぞれPTPL1およびNMDA-Rの代わりとすることもできる。しかし
、PTPL1によるNMDA-Rの脱リン酸化が関心対象である場合には、複合体中のPTPL1
およびNMDA-Rのそれぞれの代わりとなりうるのは、PTPL1の機能的誘導体およびN
MDA-Rの機能的誘導体のみである。さらに、複合体が他の成分、例えばプロテイ
ンチロシンキナーゼを含んでもよい。

【００２９】 「実質的に純粋である」または「単離された」という用語は、タンパク質およ
びポリペプチド、例えばPTPL1の断片に対して言及される場合、天然に結合する
タンパク質または他の夾雑物から分離されているポリペプチドのことを示す。タ
ンパク質またはポリペプチドは、タンパク質を含む組成物の総タンパク質含有量
の約50％より多く、典型的には総タンパク質含有量の約60％より多くをそのタン
パク質が占める場合に、実質的に純粋であるとみなされる。より典型的には、実
質的に純粋または単離されたタンパク質またはポリペプチドは、総タンパク質の
少なくとも75％、より好ましくは少なくとも90％を占めると考えられる。好まし
くは、タンパク質は、組成物中の総タンパク質の約90％より多く、より好ましく
は約95％より多くを占めると考えられる。

【００３０】 PTPL1またはNMDA-Rなどの分子の「異型」とは、分子全体またはその断片と、
構造または生物学的活性の点で実質的に同様な分子を指すことを意味する。した
がって、2つの分子が同様の活性を有するならば、一方の分子の組成または二次
、三次もしくは四次構造が他方に認められるものと同一ではなくとも、またはア
ミノ酸残基の配列が同一ではなくとも、本明細書でこの用語を用いる場合、それ
らは異型であるとみなされる。

【００３１】 本明細書で用いる「組換え」は、当技術分野における通常の意味を有しており
、合成もしくは他の形式でインビトロで操作されたポリペプチド（例えば、「組
換えポリヌクレオチド」）、細胞もしくは他の生体系において遺伝子産物を産生
するために、組換えポリヌクレオチドを用いる方法、または組換えポリヌクレオ
チドによってコードされるポリペプチド（「組換えタンパク質」）のことを指す
。

【００３２】 「機能的に結合した」という用語は、発現調節配列が第2のポリヌクレオチド
の転写および／または翻訳に影響を及ぼす、核酸発現調節配列（プロモーター、
シグナル配列または多数の転写因子結合部位）および第2のポリヌクレオチドと
の間の機能的結合のことを指す。

【００３３】 本明細書で用いる「異種配列」または「異種核酸」とは、特定の宿主細胞に対
して外来性の供給源から生じるもの、または同じ供給源に由来する場合はその本
来の形態から改変されたものである。したがって、原核宿主細胞における異種遺
伝子には、その特定の宿主細胞にとって内因性ではあるが改変がなされた遺伝子
が含まれる。異種配列の改変は、例えば、DNAを制限酵素で処理し、プロモータ
ーと機能的に結合させることが可能なDNA断片を作製することによって行える。
部位特異的変異誘発などの技術もまた、異種核酸を改変するのに有用である。

【００３４】 細胞に言及して用いる場合、「組換え」という用語は、細胞が異種核酸を複製
する、または異種核酸によってコードされるペプチドもしくはタンパク質を発現
することを示す。組換え細胞は、天然（非組換え）型の細胞内には認められない
遺伝子を含みうる。また、組換え細胞は、改変されて人工的な手段によって細胞
に導入された、天然型の細胞に認められる遺伝子も含みうる。この用語には、細
胞から核酸を取り出すことなく改変された、細胞に対して内因性の核酸を含む細
胞も含まれる。このような改変には、遺伝子置換、部位特異的変異および関連技
術によって得られるものが含まれる。

【００３５】 「組換え発現カセット」または単に「発現カセット」とは、調節エレメントに
機能的に結合した構造遺伝子の、このような配列と適合性のある宿主における発
現に影響を及ぼすことが可能な調節エレメントを有する、組換え的または合成的
に作製された核酸構築物である。発現カセットは少なくともプロモーターを含み
、選択的には転写終結シグナルも含む。一般的には、組換え発現カセットは、転
写させようとする少なくとも1つの核酸（例えば、PTPL1をコードする核酸）およ
びプロモーターを含む。発現を行わせるのに必要または有用な別の因子もまた、
本明細書の記載通りに用いることもできる。例えば、転写終結シグナル、エンハ
ンサー、および遺伝子発現に影響を及ぼす他の核酸配列を、発現カセットに含め
ることも可能である。

【００３６】 本明細書で用いる「接触」という用語はその通常の意味を有しており、2つま
たはそれ以上の作用物質（例えば、2つのタンパク質、1つのポリヌクレオチドと
1つの細胞、など）を組み合わせることを指す。接触は、インビトロ（例えば、2
つまたはそれ以上の作用物質［例えば、1つの被験化合物と1つの細胞溶解物］を
試験管または他の容器内で組み合わせる）、またはインサイチュー（例えば、2
つのポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドの、細胞内での共発現に
より、2つのポリペプチドを細胞内で接触させることができる）で、細胞溶解物
において起こりうる。

【００３７】 本明細書で言及するさまざまな生化学および分子生物学の方法は当技術分野で
公知であり、例えば、サムブルック（Sambrook）ら、「分子クローニング：実験
マニュアル（Molecular Cloning：A Laboratory Manual）」、Cold Spring Harb
or Press、N.Y.、第2版（1989）および第3版（2000）、ならびに「分子生物学に
おける最新プロトコール（Current Protocols in Molecular Biology）」（Ausu
bel, F.M.ら編）、John Wiley & Sons, Inc.、New York（1987〜1999）に記載さ
れている。

【００３８】 II．酵母ツーハイブリッドスクリーニングによるNMDA-RサブユニットのPTPL1と
の相互作用の同定 細胞内タンパク質チロシンホスファターゼPTPL1はクローニングされ、配列が
決定されている（例えば、米国特許第5,821,075号を参照）。これには5つのPDZ
ドメインがある。PDZはさまざまな膜関連シグナル伝達タンパク質で同定されて
いる、保存されたタンパク質ドメインである。PDZドメインを含むタンパク質の
総説については、ポンティング（Ponting, C. P.）ら、Bioessays 19：469〜479
、1997を参照されたい。NMDA-Rもクローニングされ、その特徴付けがされた（Ho
llmannら、Ann. Rev. Neurosci. 17：31〜108、1994；McBainら、Physiol. Rev.
74：723〜760、1994）。PTPL1、他のホスファターゼおよびNMDA受容体サブユニ
ットのアミノ酸配列および核酸配列は、公開データベース（例えば、GenBank）
および科学文献で容易に見いだせる。例えば、ヒトクローンに関する例示的な配
列には以下のGenbankアクセッション番号がある：PTPLl：X80289；NR2A：NM_000
833；NR2B：NM_000834；NR2C：NM_000835；NR2D：NT_011190；NR1：NM_000832。
ラットクローンに関する配列の例には以下のGenbankアクセッション番号がある
：NR2A：M91561；NR2B：M91562；NR2C：M91563；NR2D：D13213；NR1：X63255。
そのほかの配列情報は容易に入手可能である。さらに、関心対象のタンパク質を
コードするポリヌクレオチドを、配列情報を用いて通常の方法（例えば、配列か
ら設計したプローブまたはプライマーを用いたクローニングまたは増幅）によっ
て入手することもできる。これらのクローン、それらのホモログおよび誘導体を
本発明に用いることができる。

【００３９】 実施例で以下に詳細に述べる通り、PTPL1のPDZ2ドメインとNR2AまたはNR2Bと
の間の相互作用が、本発明に従って、酵母ツーハイブリッドスクリーニング系を
用いて同定された。この相互作用はさらに、GST融合体を用いた「プルダウン（p
ull-down）」（Harris、Methods Mol. Biol. 88：87〜99、1998）、およびPTPL1
とNMDA-Rサブユニットとの免疫共沈（実施例参照）を含む、他の手法によって説
明する。この相互作用の生理的意義を、リン酸化実験、電気生理学、および共存
アプローチによって検討した。これらの検討の結果、予想外のことに、PTPL1がN
MDA-RのNR2BおよびNR2Aサブユニットの脱リン酸化に関与することが示された。

【００４０】 III．NMDA-Rシグナル伝達の修飾物質に関するスクリーニング 本発明は、NMDA-Rシグナル伝達の修飾物質を同定するための方法を提供する。
NMDA-R修飾物質は、NMDA-Rを脱リン酸化しうるプロテインチロシンホスファター
ゼ（PTP）の活性を調整する、作用物質の能力を検出することによって同定され
る。修飾されるPTPの活性には、そのホスファターゼ活性またはNMDA-Rへのその
結合が含まれるが、それらに限定されない。

【００４１】 好ましくは、NMDA-R修飾物質のスクリーニングのために用いるPTPは、PTPL1で
ある。1つの態様では、NMDA-R修飾物質を、それがPTPL1ホスファターゼ活性を調
整する能力に関してスクリーニングする。もう1つの態様において、NMDA-R修飾
物質は、それがPTPL1とNMDA-Rとの結合を促進または抑制する能力を検出するこ
とによって同定される。

【００４２】A．PTPL1によるNMDA-Rの脱リン酸化をモニターすることによるNMDA-R修飾物質の 同定 1つの局面において、本発明のNMDA-R修飾物質は、それがPTPL1ホスファターゼ
活性を調整する能力をモニターすることによって同定される。以下に詳細に述べ
る通り、PTPL1、NMDA-R/PTPL1を含むタンパク質複合体、またはPTPL1もしくはNM
DA-R/PTPL1を含むタンパク質複合体を発現する細胞系を用いて、NMDA-Rのチロシ
ン脱リン酸化を調整するPTPL1アゴニストおよびアンタゴニストをスクリーニン
グする。PTPL1がNMDA-Rを脱リン酸化する能力を増強する作用物質は、ホスホチ
ロシンの量を正味で減少させると考えられ、一方、PTPL1がNMDA-Rを脱リン酸化
する能力を抑制する作用物質は、ホスホチロシンの量を正味で増加させると考え
られる。

【００４３】1．インビトロアッセイ法 いくつかの態様では、作用物質がPTPL1ホスファターゼ活性を増強または抑制
する能力をインビトロ系でアッセイする。一般に、インビトロアッセイ形式は、
PTPL1（またはPTPL1の機能的誘導体）およびPTPL1の基質への作用物質の添加、
ならびに基質のチロシンリン酸化レベルの測定を伴う。1つの態様では、対照と
して、被験作用物質が存在しない点を除いて同じ条件下で、基質のチロシンリン
酸化レベルも測定する。基質のチロシンリン酸化レベルを比較することにより、
PTPL1アンタゴニストまたはアゴニストを同定することができる。具体的には、P
TPL1アンタゴニストは、被験作用物質の存在により基質のチロシンリン酸化レベ
ルが上昇する場合に同定される。逆に、基質のチロシンリン酸化レベルの低下に
より、被験作用物質がPTPL1アゴニストであることが示される。本発明は、NMDA-
R活性を調整するためのこのような作用物質の使用を提供する。

【００４４】 アッセイに用いるPTPL1はさまざまな供給源から得られる。いくつかの態様で
は、アッセイに用いるPTPL1を、例えば特異抗体との免疫沈降により、細胞また
は組織の供給源から精製する。他の態様では、以下に述べる通り、PTPL1と公知
のタンパク質モチーフとの特異的相互作用、例えば、PTPL1のPDZ2ドメインとNR2
Aおよび／またはNR2Bとの相互作用を利用した親和性クロマトグラフィーによっ
てPTPL1を精製する。さらに他の態様では、PTPL1のホロ酵素またはその酵素的活
性部分を、細菌または真核生物発現系において組換えによって産生させる。組換
えによって産生されるPTPL1の異型には、それぞれ免疫親和性クロマトグラフィ
ーまたは金属キレートクロマトグラフィーを用いて、組換えにより産生されたPT
PL1の精製を容易にするために用いうる、免疫タグ（HAタグ、c-mycタグ、FLAGタ
グ）または6×Hisタグなどの、短いタンパク質タグを含むことができる。

【００４５】 アッセイではさまざまな基質が用いられる。好ましくは、基質はNMDA-R、NMDA
-Rの機能的誘導体、またはNR2AもしくはNR2Bサブユニットである。いくつかの態
様において、用いる基質は組織から精製したタンパク質（ラット脳から免疫沈降
させたNR2AまたはNR2Bなど）である。他の態様において、基質は組換えによって
発現されたタンパク質である。組換え基質の例には、大腸菌（E.coli.）、酵母
または哺乳類発現系において発現されたNR2Aおよび／またはNR2B融合タンパク質
が含まれるが、それらに限定されない。さらに他の態様において、用いる基質は
特異的キナーゼ活性、例えば、SrcまたはFynキナーゼによってチロシンリン酸化
を受ける合成ペプチドである。

【００４６】 組換えタンパク質の発現のための方法および条件は当技術分野で公知である。
例えば、サムブルック（Sambrook）、前記およびアウスユーベル（Ausubel）、
前記を参照されたい。一般的には、本発明に用いるホスファターゼおよび／また
は基質をコードするポリヌクレオチドを、発現ベクターを用いて発現させる。発
現ベクターは一般に、転写および／または翻訳調節シグナル（例えば、プロモー
ター、リボソーム結合部位およびATG開始コドン）を含む。さらに、用いる細胞
系に適したエンハンサーを含むことによって、発現効率を高めることができる。
例えば、SV40エンハンサーまたはCMVエンハンサーを用いて、哺乳類宿主細胞に
おける発現を高めることができる。一般的には、本発明のポリペプチドをコード
するDNAを、細菌（例えば、大腸菌（E.coli.）、枯草菌）、酵母（例えば、サッ
カロミセス（Saccharomyces））、昆虫（例えば、ヨトウガ（Spodoptera frugip
erda））または哺乳類細胞培養系などのインビトロ宿主細胞に、導入して発現さ
せることが可能なDNA構築物に挿入する。多くの用途には哺乳類細胞系が好まし
い。本発明のポリペプチドの発現および産生のために有用な哺乳類細胞培養系の
例には、ヒト胚腎細胞系（293；Grahamら、1977、J. Gen. Virol. 36：59）；CH
O（ATCC CCL 61およびCRL 9618）；ヒト子宮頚癌細胞（HeLa、ATCC CCL 2）；お
よび当技術分野で公知の他のものが含まれる。ポリペプチドを発現させるための
哺乳類組織細胞培養物の使用については、ウィナッカー（Winnacker）、「遺伝
子からクローンまで（FROM GENES TO CLONES）」（VCH Publishers、N.Y.、N.Y.
、1987）およびアウスユーベル（Ausubel）、前記、に一般的に考察されている
。いくつかの態様では、例えば、哺乳類細胞系における発現のために、哺乳類遺
伝子または哺乳類ウイルスに由来するプロモーターを用いる。適したプロモータ
ーは、構成的、細胞種特異的、時期特異的および／または（例えば、グルココル
チコイドなどのホルモンによって）調整可能もしくは調節可能でありうる。有用
なプロモーターには、メタロチオネインプロモーター、構成性アデノウイルス主
要後期プロモーター、デキサメタゾン誘導性MMTVプロモーター、SV40プロモータ
ー、および当技術分野で公知のプロモーター-エンハンサーの組み合わせが含ま
れるが、それらに限定されない。

【００４７】 基質はすでにチロシンリン酸化状態にあってもよく、そうでなくてもよい（La
uおよびHuganir、J. Biol. Chem.、270：20036〜20041、1995）。リン酸化され
ていない出発材料の場合には、基質は一般的に例えば、SrcまたはFynなどの外因
性チロシンキナーゼ活性を用いてリン酸化される。

【００４８】 基質のチロシンリン酸化レベルを測定するためには、当業者に公知のさまざま
な標準的手順を用いる。いくつかの態様では、ホスホチロシンを認識する抗体に
基づくアッセイ法、例えば、放射免疫アッセイ法（RIA）、酵素結合免疫吸着ア
ッセイ法（ELISA）、ならびに結合を放射された蛍光レベルから評価できる蛍光
標識抗体を用いる。例えば、米国特許第5,883,110号；メンドサ（Mendoza）ら、
Biotechniques. 27：778〜788、1999を参照されたい。他の態様では、免疫アッ
セイ法の代わりに、選択的なチロシンリン酸化を行うキナーゼを用いて、基質を
放射性リン酸基で直接標識する（Braunwalerら、Anal. Biochem. 234：23〜26、
1996）。標識された基質からの放射性標識の除去率は、液体中（例えば、クロマ
トグラフィー分離により）または固相中（ゲルまたはウエスタンブロットにおい
て）で定量化することができる。

【００４９】 2つの異なる条件下（例えば、被験作用物質の存在下および非存在下）でのチ
ロシンリン酸化レベルの比較は、第1の試料または条件におけるリン酸化レベル
を記録し、記録されたレベルを第2の部分または条件のもの（またはそれに関し
て記録されたもの）と比較する段階を時に含む。

【００５０】 本発明のいくつかの態様では、PTPL1を基質（例えば、NR2AまたはNR2B）に添
加する以外に、NMDA-R/PTPL1を含むタンパク質複合体を用いて、インビトロアッ
セイ法を行う。このようなタンパク質複合体は、NMDA-RおよびPTPL1、またはそ
れらの機能的誘導体を含む。さらに、複合体はPTKおよび他の分子を含んでもよ
い。NMDA-R/PTPL1を含むタンパク質複合体は、グラント（Grant）ら（国際公開
公報第97/46877号）に記載された免疫沈降などの、当技術分野で公知の方法を用
いて神経細胞から入手しうる。基質のチロシンリン酸化レベルは標準的なSDS-PA
GEおよび免疫ブロット分析を用いてアッセイする。

【００５１】2．インビボアッセイ法 他の態様では、本発明のNMDA-Rシグナル伝達修飾物質を、インビボアッセイ法
を用いて同定する。このようなインビボアッセイ形式は通常、PTPL1およびその
基質（例えば、NR2AまたはNR2B；例えば、組換え型のPTPL1および／またはNMDA-
Rサブユニットの基質）を共発現する細胞を培養する段階、作用物質を細胞培養
物に添加する段階、および細胞における基質のチロシンリン酸化レベルを測定す
る段階を必要とする。1つの態様では、対照として、被験作用物質に曝露されて
いない細胞における、基質のチロシンリン酸化レベルも測定または決定する。1
つの態様では、米国特許第5,958,719号に記載された方法から、インビボスクリ
ーニング系を変更する。このスクリーニング系を用いて、PTPL1およびPTPL1の基
質（例えば、NMDA-R、NR2AまたはNR2B）を発現する無傷細胞をまず処理し（例え
ば、NMDAにより）、基質リン酸化を刺激する。次に細胞を、無傷細胞内に浸透し
て基質（例えば、NMDA-R）のさらなるリン酸化（例えば、PTKによる）を選択的
に阻害する物質とともにインキュベートする。次に、基質のリン酸化の程度を、
例えば、細胞を破壊し、上記の方法に従って（例えば、標準的なSDS-PAGEおよび
免疫ブロット分析により）基質のホスホチロシンレベルを測定することによって
決定する。PTPL1の活性は、測定した基質のリン酸化の程度から決定する。作用
物質の存在下でさらに測定を行う。リン酸化の程度を比較することにより、NMDA
-Rのチロシンリン酸化を調整するPTPL1のアゴニストまたはアンタゴニストが同
定される。

【００５２】 もう1つの態様において、本発明は、NMDA-Rのチロシンリン酸化レベルを修飾
しうる遺伝子産物をコードする核酸分子を同定するための方法を提供する。1つ
の態様では、PTPL1およびNMDA-Rまたはそれらの機能的誘導体を共発現する宿主
細胞に被験核酸を導入する。組換え型または外因性の核酸を細胞に導入するため
の方法は公知であり、これには、トランスフェクション、エレクトロポレーショ
ン、裸の核酸の注入、ウイルス感染、リポソームを介した輸送が含まれるが、そ
れらに限定されない（例えば、Dzauら、1993、Trends in Biotechnology 11：20
5〜210；Sambrook、前記、Ausubel、前記を参照）。核酸分子によってコードさ
れる遺伝子産物が宿主細胞内で発現されて、PTPL1およびNMDA-Rまたはそれらの
機能的誘導体と相互作用するように細胞を培養し、その後にNMDA-Rのホスホチロ
シンレベルを測定する。NMDA-Rシグナル伝達に対する核酸の効果は、核酸分子の
存在下または非存在下で測定したNMDA-Rホスホチロシンレベルを比較することに
よって決定される。

【００５３】B．PTPL1とNMDA-Rとの結合をモニターすることによる、NMDA-R修飾物質のスクリ ーニング PTPL1とNMDA-Rとの結合の修飾が、PTPL1によるNMDA-Rにおけるチロシンリン酸
化レベルにも影響を及ぼす可能性があることは、当業者には認識されると考えら
れる。このため、上記のインビボおよびインビトロのアッセイ系を用いたスクリ
ーニングから同定される作用物質には、PTPL1とNMDA-Rとの結合を調整すること
によってNMDA-Rのチロシンリン酸化を調整する作用物質も含まれうる。本発明の
いくつかの態様において、NMDA-R修飾物質は、PTPL1とNMDA-Rとの結合を促進ま
たは抑制する作用物質を直接スクリーニングすることによって同定される。この
ようにして同定された作用物質を、上記の方法または当技術分野で公知の標準的
なアッセイ法を用いて、NMDA-Rのチロシンリン酸化を調整する能力に関してさら
に調査してもよい。

【００５４】1．ツーハイブリッドスクリーニング系に基づくアッセイ法 PTPL1のPDZ2ドメインとNR2A（またはNR2B）との間の相互作用を調整する作用
物質を同定するためには、さまざまな結合アッセイ法が有用である。いくつかの
特定の態様では、ツーハイブリッドに基づくアッセイ法を用いる。

【００５５】i）酵母ツーハイブリッドアッセイ法 NR2AまたはNR2BのC末端部分、一般には少なくとも100個、200個、400個または
600個のC末端アミノ酸残基、およびPTPL1の少なくともPDZ2ドメインをコードす
るcDNAを、それぞれDNA結合ドメインおよびDNA活性化ドメインまたはその逆をコ
ードする酵母ツーハイブリッドベクターにクローニングする。用いる酵母ツーハ
イブリッドは、酵母GAL4転写系（SongおよびFields、Nature 340：245〜246、19
89）、Sos-Ras相補系（Aronheimら、Mol. Cell. Biol. 17：3094〜3102、1997）
、細菌LexA転写系（「分子生物学における最新プロトコール（Current Protocol
s in Mol. Biol.）」、Ausubelら編、1996、New York）、または少なくとも同等
の能力がある任意の他の系に基づく。上記の転写因子のプロモーター領域に由来
する必要な調節配列を用いて、α-もしくはβ-ガラクトシダーゼ、β-ラクタマ
ーゼ、または緑色蛍光タンパク質（GFP、Tomboliniら、Methods Mol Biol. 102
：285〜98、1998；Kainら、Methods Mol Biol. 63：305〜24、1997）などのレポ
ーター遺伝子構築物を作製する。または、モジュール式シグナル伝達分子を、So
s-Ras相補性に基づく酵母ツーハイブリッド系において、NR2Aおよび／またはNR2
BとPTPL1との相互作用によって集合化するように作製する。これらの構築物を、
スクリーニングに用いる酵母株に一時的にまたは安定的に形質転換する。

【００５６】 1つの態様では、PTPL1とNMDA-Rとの結合を調整する作用物質のスクリーニング
にGAL4系を用いる。NR2AまたはNR2BのC末端部分を含むDNA結合ドメインベクター
、およびPTPL1のPDZ2ドメインを含むDNA活性化ドメインベクターを、レポーター
のうち1つを有する同じ酵母株に共形質転換する。PTPL1とNMDA-Rとの間の相互作
用によって、レポーター遺伝子の発現が活性化される。レポーター遺伝子を発現
させる酵母培養物を96穴または384穴のアッセイ用プレートに等量に分配する。
α-またはβ-ガラクトシダーゼ、β-ラクタマーゼのレベルは、オルトメチルフ
ェニルチオガラクトシド（OMTP）またはX-galなどの比色基質を用いて、その酵
素活性を定量化することによって測定し、GFPのレベルは蛍光分析によって評価
する。作用物質のプールまたは個々の作用物質をウェル内の酵母培養物に添加し
、作用物質による相互作用の阻害または促進のレベルをレポーター遺伝子活性の
レベルから決定する。レポーター遺伝子の発現を低下させる作用物質は、PTPL1
とNR2AまたはNR2Bとの間の相互作用のアンタゴニストである。これに対して、レ
ポーター遺伝子の発現を促進する作用物質は、PTPL1とNR2AまたはNR2Bとの間の
相互作用のアゴニストである。

【００５７】ii）細菌ツーハイブリッド 細菌ツーハイブリッドスクリーニング系は、cAMPにより及ぼされる正の調節を
利用する、大腸菌（Escherichia coli）cya株におけるシグナル伝達経路の再構
成に基づく（Karimovaら、Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 95：5752〜56、1998
）。PTPL1とNR2Aおよび／またはNR2Bなどのツーハイブリッドタンパク質の会合
によって、T25断片とT18断片との間の機能的相補が生じ、これがcAMP合成を招く
。次に環状AMPはラクトースまたはマルトースなどの、特徴的な表現型をもたら
す異化オペロンの転写活性化を誘発する。

【００５８】iii）哺乳類ツーハイブリッド 哺乳類ツーハイブリッドアッセイ法もまた、転写活性化に基づく。「酵母ツー
ハイブリッド系（The Yeast Two-Hybrid System）」、バーテル（Bartel）およ
びフィールズ（Fields）編、1997、Oxford、Oxford University Pressを参照の
こと。本発明では、NR2AまたはNR2Bの少なくともC末端部分およびPTPL1の少なく
ともPDZ2ドメインをコードするcDNAを、それぞれDNA結合ドメインおよびVP16DNA
活性化ドメインまたはその逆をコードする哺乳類ツーハイブリッドベクター中に
クローニングする。これらのベクター構築物を、VP16応答プロモーターの制御下
にあるレポーター遺伝子（CAT、ルシフェラーゼ、GFP、α-またはβ-ガラクトシ
ダーゼ、β-ラクタマーゼ）を有する細胞系に共にトランスフェクトする。レポ
ーター遺伝子またはその活性のレベルに反映される、細胞における転写活性化は
、NR2AまたはNR2BのC末端部分とPTPL1のPDZ2ドメインとの間の相互作用の強度に
比例する。レポーター遺伝子が発現される細胞培養物を96穴または384穴のアッ
セイプレートに等量に分配する。CAT、α-またはβ-ガラクトシダーゼ、β-ラク
タマーゼの発現レベルは、X-galなどの比色基質を用いてその酵素活性を定量化
することによって測定し、GFPまたはルシフェラーゼのレベルはそれぞれ蛍光分
析または分光光度分析によって評価する。NR2Aおよび／またはNR2BへのPTPL1の
結合を調整する作用物質を、 酵母ツーハイブリッドアッセイ法に記載したもの
と同様に同定する。

【００５９】2．他の結合アッセイ法 本発明のいくつかの態様では、PTPL1のPDZ2ドメインと高い親和性で結合する
作用物質（例えば、ペプチド）を、ファージディスプレイ、定方向ペプチドライ
ブラリー法（Songyangら、Science 275：73〜77、1997）またはlacIリプレッサ
ー系（Strickerら、Methods in Enzymology 303：451〜468、1999）によって同
定する。これらのペプチドをさらに、PTPL1とNR2AまたはNR2Bとの間の相互作用
を調整する能力に関してスクリーニングする。

【００６０】 1つの態様において、PTPL1とNR2AまたはNR2Bとの間の相互作用の修飾物質は、
それらが、PTPL1およびNMDA-Rが互いに結合（物理的に接触）するのを阻害する
、またはすでに形成されたPTPL1とNMDA-Rとの結合を妨害する能力を検出するこ
とによって同定される。阻害または妨害は完全なものでも部分的なものでもよい
。もう1つの態様では、修飾物質を、PTPL1およびNMDA-Rの互いへの結合を促進す
るか、またはすでに形成されたPTPL1とNMDA-Rとの間の結合相互作用の安定性を
増強するか、どちらかの活性に関してスクリーニングする。いずれの場合にも、
NMDA-Rのチロシンリン酸化レベルを調整する作用物質を同定するための上記のイ
ンビトロおよびインビボアッセイ系のいくつかを、NMDA-RとPTPL1との結合に対
する作用物質の効果をモニターするために直接適用してもよく、または簡単に改
変してもよい。例えば、PTPL1およびNMDA-Rまたは受容体サブユニットを共発現
し、内部で2つのタンパク質が相互作用してNMDA-R/PTPL1を含む複合体を形成す
るようにトランスフェクトした細胞を、この相互作用を阻害しうると推測される
作用物質とともにインキュベートし、相互作用に対する効果を測定する。いくつ
かの態様では、NMDA-R/PTPL1を含むタンパク質複合体において、完全なPTPL1お
よびNMDA-Rタンパク質の代わりに、それぞれPTPL1のPDZ2ドメインを含むポリペ
プチドおよびNMDA-RのPTPL1結合部位を含むポリペプチドを用いることもできる
。相互作用およびその妨害の測定には、免疫共沈などの数多くの手段のうち任意
のものを用いる。

【００６１】C．PTPL1およびNMDA-Rの機能的誘導体またはサブユニットを用いるNMDA-R修飾物 質のスクリーニング 上記のアッセイ法または方法はPTPL1およびNMDA-Rを参照しながら説明してき
たが、当業者は、PTPL1およびNMDA-Rの機能的誘導体またはサブユニットを用い
てもよいことを認識すると考えられる。例えば、さまざまな態様では、PTPL1とN
MDA-Rとの結合を調整する作用物質のスクリーニングに関するアッセイ法におい
て、完全なNMDA-Rの代わりにNR2AまたはNR2Bを用いる。関連した1つの態様では
、NMDA-Rの機能的誘導体を、NMDA-Rに対するPTPL1のホスファターゼ活性を調整
する作用物質のスクリーニングに用いる。1つの他の態様では、PTPL1のPDZ2ドメ
インを含むポリペプチドを、PTPL1とNMDA-Rとの結合を調整する作用物質のスク
リーニングに用いる。

【００６２】 さらに、さまざまな態様では、アミノ酸の欠失および／または挿入および／ま
たは置換（例えば、保存的置換）を有しながらも触媒活性および／または結合能
を維持しているPTPL1の機能的誘導体を、作用物質のスクリーニングに用いる。
同様に、チロシンリン酸化活性およびPTPL1結合活性を維持するNMDA-R変異体も
用いうる。機能的誘導体は、タンパク質分解後に当業者に公知の従来の精製手順
を行うことにより、天然に存在するまたは組換えによって発現されたPTPL1およ
びNMDA-Rから調製する。または、適した細胞内でPTPL1またはNMDA-Rの断片のみ
を発現させることにより、組換えDNA技術によって機能的誘導体を産生させる。1
つの態様では、部分的な受容体またはホスファターゼポリペプチドを融合ポリペ
プチドとして発現させる。望ましい特性を保持する、天然に存在するNMDA／PTPL
1タンパク質の変異体を調製すること、ならびに結合および／または酵素活性に
関して変異体をスクリーニングすることは、当業者の技能の範囲に十分に含まれ
る。PTPL1と結合するNMDA-RサブユニットNR2AおよびNR2Bの機能的誘導体は一般
に、これらのサブユニットの「tSXVモチーフ」を含むと考えられる。脱リン酸化
されうるNR2AおよびNR2Bの誘導体は一般に、ポリペプチドの細胞質ドメイン、例
えば、C末端の900アミノ酸またはその断片を含む。PDZ2+3のみを有するPTPL1欠
失構築物は、NR2BのC末端の400アミノ酸とインビトロで結合可能である。NMDA-R
と結合するPTPL1の機能的誘導体は、PDZ2ドメインを含む。酵素（脱リン酸化）
活性を保持する機能的誘導体は、C末端のPTPドメインを含む。

【００６３】 いくつかの態様では、これらのアッセイ法における試験のために、PTPL1およ
びNMDA-Rを発現する細胞を、粗製もしくは精製されたPTPL1および／またはNMDA-
Rの供給源として、または膜調製物において用いうる。または、生細胞または固
定細胞の全体をこのようなアッセイ法に直接用いてもよい。固定細胞または膜調
製物を調製するための方法は当技術分野で公知であり、例えば、米国特許第4,99
6,194号を参照されたい。PTPL1およびNMDA-Rを共発現するように細胞に遺伝子操
作を加えてもよい。細胞を他の組換え分子の発現用の宿主細胞として、これらの
分子を細胞内でPTPL1および／またはNMDA-Rと接触させる目的で用いてもよい。

【００６４】 IV．治療的応用および薬学的組成物 NMDA-Rのアゴニストおよびアンタゴニストを、異常なNMDA-Rシグナル伝達によ
って引き起こされる症状（例えば、中枢神経系（CNS）の急性傷害）の治療に用
いうることは当技術分野で公知である。NMDAアゴニストおよび／またはNMDAアン
タゴニストを含む薬学的組成物を用いる治療方法は、例えば、米国特許第5,902,
815号に記載されている。以下に詳細に考察する通り、本発明は、NMDA-Rのチロ
シンリン酸化を調整するPTPL1アンタゴニストおよび／またはアゴニストを含む
、薬学的組成物を提供する。このようなアゴニストおよびアンタゴニストには、
PTPL1遺伝子発現を妨げる作用物質、PTPL1がNMDA-Rに結合する能力またはNMDA-R
を脱リン酸化する能力を調整する作用物質が含まれるが、それらに限定されない
。 1つの態様では、PTPL1アンチセンスオリゴヌクレオチドを、本発明の薬学的
組成物中のPTPL1アンタゴニストとして用いる。さらに、NMDA-RのPTPL1脱リン酸
化を阻害するPTP阻害物質は、NMDA-Rシグナル伝達修飾物質として有用である（
例えば、オルトバナジン酸、Liら、Biochim. Biophys. Acta. 1405：110〜20、1
998）。

【００６５】A．本発明の治療的応用 内因性グルタミン酸によって誘発される異常なNMDA-R活性が、数多くの重要な
CNS障害に関係している。1つの局面において、本発明は、NMDA-Rのホスホチロシ
ンレベルを調整することによって、異常なNMDA-Rシグナル伝達によって媒介され
る症状を治療または軽減することができる、PTPL1の修飾物質を提供する。

【００６６】 NMDAアンタゴニスト薬の重要な用途の一つは、ニューロンに対する興奮毒性障
害を予防または軽減する能力を伴う。いくつかの態様では、NMDA-Rの脱リン酸化
を促進する本発明のPTPL1アゴニストを、過度のNMDA-Rシグナル伝達の毒性効果
を軽減する目的で用いる。他のいくつかの態様では、NMDA-Rアゴニストとして機
能する本発明のPTPL1アンタゴニストを、NMDA-Rの機能低下によって引き起こさ
れる状態、すなわち、CNSニューロンにおける異常に低いレベルのNMDA-Rシグナ
ル伝達を治療するために、治療的に用いる。NMDA-Rの機能低下は内因性疾患過程
として起こることがある。また、これはNMDAアンタゴニスト薬の投与後に薬剤誘
発性現象として起こることもある。いくつかの関連した態様において、本発明は
、例えばNMDAアンタゴニストの有害な副作用を予防するために、NMDAアンタゴニ
ストと併用する、PTPL1アンタゴニストを含む薬学的組成物を提供する。

【００６７】B．治療対象の疾患および障害の具体例 過度のグルタミン酸シグナル伝達は、虚血性発作などの中枢神経系に対する急
性傷害時の興奮毒性細胞死に、原因として関連づけられてきた（Choiら、Annu R
ev Neurosci. 13：171〜182、1990；MuirおよびLees、Stroke 26：503〜513、19
95）。NMDA受容体を介した過度のグルタミン酸シグナル伝達は、頭部外傷または
脳損傷後の深甚な結果および障害を残した回復に関与してきた（Tecomaら、Neur
on 2：1541〜1545、1989；McIntoshら、J. Neurochem. 55：1170〜1179、1990）
。NMDA受容体を介したグルタミン酸性活動亢進は、パーキンソン病（Loopuijtお
よびSchmidt、Amino Acids 14：17〜23、1998）およびハンチントン病（Chenら
、J. Neurochem. 72：1890〜1898、1999）におけるニューロンの緩徐な変性とも
関連づけられてきた。さらに、てんかんのさまざまな型におけるNMDA-Rシグナル
伝達の亢進が報告されている（ReidおよびStewart、Seizure 6：351〜359、1997
）。

【００６８】 したがって、本発明のPTPL1アゴニストは、NMDA受容体関連ホスファターゼ活
性（PTPL1のものなど）を刺激することによる、またはPTPL1のNMDA受容体複合体
への結合を促進することによる、これらの疾患または障害の治療のために用いら
れる。

【００６９】 本発明のPTPL1アゴニスト（NMDA-Rアンタゴニスト）は、緩徐な興奮毒性機構
が関係している疾患を治療するためにも用いうる（BittigauおよびIkonomidou、
J. Child. Neurol. 12：471〜485、1997）。これらの疾患には、脊髄小脳変性症
（例えば、脊髄小脳失調症）、運動ニューロン疾患（例えば、筋萎縮性側索硬化
症（ALS））、ミトコンドリア脳筋症が含まれるが、それらに限定されない。ま
た、本発明のPTPL1アゴニストを、耐性または依存を引き起こさずに神経障害性
疼痛を緩和するため、または慢性疼痛を治療するために用いることもできる（例
えば、Davarら、Brain Res. 553：327〜330、1991を参照）。

【００７０】 一方、NMDA-Rの機能低下は、精神***症状（Tamminga、Crit. Rev. Neurobiol
. 12：21〜36、1998；Carlssonら、Br. J. Psychiatry 補遺：2〜6、1999；Corb
ettら、Psychopharmacology（Berl）、120：67〜74、1995；Mohnら、Cell 98：4
27〜436、1999）、ならびに痴呆（例えば、老人性痴呆およびHIV性痴呆）および
アルツハイマー病などの、さまざまな形態の認知障害（Lipton、Annu. Rev. Pha
rmacol. Toxicol. 38：159〜177、1998；Ingramら、Ann. N. Y. Acad. Sci. 786
：348〜361、1996；Mullerら、Pharmacopsychiatry. 28：113〜124、1995）に原
因として関連づけられてきた。さらに、NMDA-Rの機能低下は精神病および薬物嗜
癖とも関連づけられている（JavittおよびZukin、Am J Psychiatry、148：1301
〜8、1991）。さらに、NMDA-Rの機能低下はエタノール感受性とも関連づけられ
ている（Wirknerら、Neurochem. Int. 35：153〜162、1999；Yagi、Biochem. Ph
armacol. 57：845〜850、1999）。

【００７１】 本明細書に記載のPTPL1アンタゴニスト（NMDA-Rアゴニスト）を用いることに
より、本発明は、NMDA-R関連PTPの活性および、特にPTPL1の活性に拮抗すること
による、またはPTPL1とNR2AもしくはNR2Bサブユニットとの間の相互作用を阻害
することによる、精神***病、精神病、認知障害、薬物嗜癖およびエタノール感
受性の治療のための方法を提供する。

【００７２】C．投与量および投与様式 本発明のPTPL1アゴニストおよびアンタゴニストは、治療しようとする宿主に
対して無菌条件下で直接投与される。しかし、活性成分のみを単独で投与するこ
とは可能であるが、それを製剤として提示することがしばしば好ましい。製剤は
一般に、少なくとも1つの活性成分を、1つまたは複数のその許容される担体とと
もに含む。各担体は、他の成分と適合性があって、かつ患者に対して有害でない
という意味で、薬学的にも生理的にも許容されるものであるべきである。例えば
、生物活性のある作用物質を、安定性または半減期などの薬理特性を向上させる
目的で、投与前に卵アルブミンまたは血清アルブミンなどの担体タンパク質と複
合体化する。さらに、本発明の治療的製剤を他の治療的作用物質と組み合わせる
、または併用する。

【００７３】 治療的製剤は、治療に用いうる任意の有効な手段によって送達する。用いる特
定のNMDA-Rアンタゴニストおよび／またはNMDA-Rアゴニストに応じて、適した手
段には、経口、直腸内、鼻腔内、肺内投与、または血流への非経口的（皮下、筋
肉内、静脈内および皮内を含む）注入が含まれるが、それらに限定されない。

【００７４】 治療的製剤は、薬学分野で公知の任意の方法によって調製される。例えば、ギ
ルマン（Gilman）ら（編）（1990）、「グッドマンおよびギルマン：治療の薬理
学的基礎（Goodman and Gilman's：The Pharmacological Bases of Therapeutic
s）（第8版）、Pergamon Press；および（1990）「レミントン薬学（Remington'
s Pharmaceutical Sciences）」（第17版）、Mack Publishing Co.、Easton、P.
a.；エイビス（Avis）ら（編）（1993）「製薬剤形：非経口薬（Pharmaceutical
Dosage Forms：Parenteral Medications）」Dekker、N.Y.；リーバーマン（Lie
berman）ら（編）（1990）「製薬剤形：錠剤（Pharmaceutical Dosage Forms：T
ablets）」Dekker、N.Y.；およびリーバーマン（Lieberman）ら（編）（1990）
「製薬剤形：分散系（Pharmaceutical Dosage Forms：Disperse Systems）」Dek
ker、N.Yを参照されたい。治療的製剤を好都合なように単位剤形として提示し、
適した治療量を投与することが可能である。PTPL1アゴニストおよび／またはア
ンタゴニストの好ましい投与量および投与様式は、治療する医師によって個別に
検討される必要があると思われる要因に応じて、患者によって異なると考えられ
る。原則として、投与するPTPL1アゴニストおよび／またはアンタゴニストの量
は、患者の状態を効果的かつ確実に予防するまたは最小限に抑える、最小の投与
量である。

【００７５】 適した用量は、最大許容量を決定するための哺乳類種に対する臨床研究、およ
び安全な投与量を決定するための正常ヒト被験者に対する臨床試験などの、任意
の公知の方法によって決定する。ヒト患者では脳組織の直接的な調査は実行不可
能であるため、幻覚、または重篤な失見当識もしくは支離滅裂などの他の精神異
常作用性症状の出現を、NMDA-Rアンタゴニストによって神経毒性障害がCNSに生
じている可能性があることを示すシグナルと見なすべきである。さらに、さまざ
まな種類の画像化技術（脳内の最大活性領域を同定するために標識された基質を
用いる、陽電子射出断層撮影法および磁気共鳴スペクトル分析法など）もまた、
NMDA-Rアンタゴニストを伴ってまたは伴わずに、本明細書に記載の通りに用いる
ための、NMDA-Rアゴニストの好ましい投与量を決定するのに有用でありうる。

【００７６】 また、帯状（cingulate）皮質および脳梁膨大後方皮質（retrosplenial cereb
ral cortices）のニューロンにおける空胞形成、ミトコンドリア障害、熱ショッ
クタンパク質の発現または他の病理形態学的変化などの脳内の細胞発現に関して
、齧歯類または霊長類を試験することが望ましい。これらの細胞変化と実験動物
の異常行動との相関を評価することもできる。

【００７７】 より多くの投与量が必要と思われる特定の状況下を除き、PTPL1アゴニストお
よび／またはアンタゴニストの好ましい投与量は通常、1日当たり約0.001mg〜約
1000mgの範囲、より一般的には約0.01mg〜約500mgの範囲であると考えられる。
実際に投与されるこのような任意の作用物質の量は、個々の患者に該当する関連
状況（治療しようとする1つまたは複数の状態、特定のPTPL1アゴニストまたは特
定のPTPL1アンタゴニストを含む投与する組成物の選択、個々の患者の年齢、体
重および反応、患者の症状の重篤度、ならびに選択した投与経路）に鑑みて、医
師によって決定されると考えられる。したがって、上記の投与量の範囲は、一般
的な手引きを提供し、本明細書の開示を裏付けることを意図し、本発明の範囲を
制限するものではない。

【００７８】 V．PTPL1の精製方法 本発明は、PTPL1タンパク質、またはPTPL1のPDZ2ドメインを含むポリペプチド
の精製のための方法を提供する。具体的には、PTPL1とNR2AまたはNR2Bとの結合
の同定により、当技術分野で公知の方法を用いた、PTPL1またはPTPL1のPDZ2ドメ
インを含むポリペプチドの親和性精製が可能となる。タンパク質の親和性精製の
ための標準的な方法については、例えば、「タンパク質精製、原理、高分解能の
方法および応用（PROTEIN PURIFICATION, PRINCIPLES, HIGH RESOLUTION METHOD
S AND APPLICATIONS）」、ヤンソン（Janson）およびライデン（Ryden）編、198
9；スコープス（Scopes, R.K.）、第3章、「タンパク質の精製、原理および実践
（PROTEIN PURIFICATION, PRINCIPLES AND PRACTICE）」、第2版、Springer-Ver
lag、New York、1987；ドイチャー（Deutscher, M.P.）、「タンパク質精製の手
引き（GUIDE TO PROTEIN PURIFICATION）」、Academic Press、1990、pp. 174〜
193を参照されたい。

【００７９】 1つの態様では、NMDA-RのPTPL1結合部位を含むポリペプチドを固体基質（例え
ば、CNBr活性化セファロース）に付着させる。基質上の残りの活性部位は適した
作用物質（例えば、BSA）によってブロックする。生物標本を基質に適用し、PTP
L1をNMDA-RのPTPL1結合部位を含む基質上のポリペプチドに結合できるようにし
た後、基質を洗浄して非特異的な結合分子を基質から除去する。次に、当技術分
野で公知の方法に従って、PTPL1またはPTPL1のPDZ2ドメインを含むポリペプチド
を基質から溶出させて回収する。

【００８０】 VI．実施例 以下の実施例は本発明をさらに例示するために提供する。これらはいかなる形
でも本発明を制限するために含まれるのではない。

【００８１】実施例1：酵母ツーハイブリッドスクリーニングを用いたNMDA-R/PTPL1結合の同
定 酵母ツーハイブリッドスクリーニングを以下の通りに行った。Y187酵母株（Cl
ontech）にあらかじめ形質転換されたpACT2ベクター中の、市販のヒト胎児脳cDN
Aライブラリーを用いた。NR2Bサブユニットの600個のC末端アミノ酸残基に対応
するcDNAを、pAS2-1ベクター（Clontech）中にクローニングすることにより、GA
L4BDと融合させた。この結果得られたGAL4BD-NR2Bプラスミド（ベイト）をY190
株（Clontech）に形質転換し、NR2BのC末端と相互作用するヒト胎児脳cDNAライ
ブラリー中のタンパク質をスクリーニングした。約50×10^６個のY187細胞を、ベ
イトベクターを有する少なくとも10倍過剰量のY190細胞と、富栄養（YPD）培地
中で20時間交雑させた。相互作用の選択のため、交雑後に酵母細胞を、ヒスチジ
ンおよびアデニンを枯渇させた固体酵母培地上に選択のために播いた。この二重
増殖選択を生き延び、β-ガラクトシダーゼアッセイ法で強い比色反応を生じた
コロニーのみに由来するADプラスミドを、DNA配列決定によってさらに分析した
。2つの酵母コロニーが、GAL4ADとインフレームで（in frame）、プロテインチ
ロシンホスファターゼPTPL1のPDZ2ドメインを隣接配列（N末端に127アミノ酸お
よびC末端に36アミノ酸）とともにコードする、同一のcDNAクローンを含んでい
た。これらの結果から、PTPL1のPDZ2ドメインがNMDA-RのNR2Bサブユニットと物
理的に相互作用することが示された。

【００８２】 NR2AのC末端の600アミノ酸をコードするcDNAをGAL4BDプラスミド（pAS2-1）に
挿入する実験で、NR2AのC末端とPTPL1のPDZ2ドメインとの間の相互作用が示され
た。このプラスミドを、PTPL1のPDZ2ドメインを含むGAL4ADプラスミド（pACT2）
とともにY187酵母細胞に形質転換した。選択培地上での増殖が観察された。この
ことは、脳内で2番目に強くチロシンリン酸化を受けるNMDA-Rサブユニットであ
るNR2Aが、PTPL1と相互作用することを示す。

【００８３】実施例2：PTPL1/NMDA-R相互作用を示す「プルダウン」実験 PTPL1/NMDA-R相互作用を示す「プルダウン」実験は以下の通りに行う。C末端
の145アミノ酸を含むNR2AおよびNR2B部分を、グルタチオン-S-トランスフェラー
ゼ（GST）との融合タンパク質として大腸菌（E.coli.）で発現させた。発現され
たタンパク質を有する25mlのLB培地からの細菌細胞を、氷上での超音波処理（10
秒）によって溶解し、超音波処理物を20分間、15,000gで遠心分離することによ
って細菌破片をペレット化する。リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中の100μlの50
％グルタチオン-セファロース-4B（Pharmacia）ビーズスラリーに上清を添加す
ることによって、発現されたタンパク質を精製し、かつ振盪しながら4℃で30分
間インキュベートする。氷冷PBSでビーズを3回洗うことにより、非特異的に付着
したタンパク質を除去する。ビーズに付着した、精製されたGST-NR2AおよびGST-
NR2Bタンパク質を、c-mycエピトープで標識して293／COS細胞内で異種的に発現
させたPTPL1タンパク質と混合し、かつ洗浄して非特異的に結合したタンパク質
を除去する。PTPL1のNR2AまたはNR2BのC末端との結合を、抗c-myc抗体（Clontec
h）を用いるウエスタンブロット法によって判断する。

【００８４】 陰性対照に関しては、C側の最末端にあるバリン残基がアラニンに変異してい
るGST-NR2B融合体を用いる。さらに、相互作用の特異性を示すために、NR2Aまた
はNR2BのC末端の9アミノ酸に対応する合成阻害ペプチド（KLSSIESDV）を濃度0.5
mMでの競合に用いる。陽性対照に関しては、異種的に発現させたシナプス後肥厚
部95（PSD95、Niethammerら、J. Neurosci. 16：2157〜63、1996を参照）を同様
の一組の実験に用いる。

【００８５】 逆の実験では、PTPL1の第2のPDZドメインとのGST融合体を大腸菌（E.coli.）
で発現させ、精製して、異種的に発現させたNR2AまたはNR2Bの両方と結合するた
めに用い、ならびにラット脳溶解物からのNR2AまたはNR2Bサブユニットを捕捉す
るために用いる。NR2AまたはNR2BのGST-PTPL1への特異的結合は、特異的な抗NR2
A抗体またはNR2B抗体（Chemicon）を用いるウエスタンブロット法によって検出
する。

【００８６】 陽性対照に関しては、相互作用の特異性を示すために、NR2AまたはNR2BのC末
端の9アミノ酸に対応する合成阻害ペプチド（KLSSIESDV）を濃度0.5mMでの競合
に用いる。

【００８７】実施例3．NMDA-R/PTPL1結合：免疫共沈 NMDA-R/PTPL1結合を示す免疫共沈実験は以下の通りに行う。

【００８８】 以下のタンパク質をコードするcDNAを含む、真核生物CMVプロモーター駆動型
発現ベクターの組み合わせを、293／COS細胞で共発現させる： 1．NR2Aおよびc-myc標識PTPL1 2．NR2Bおよびc-myc標識PTPL1 3．NR1、NR2Aおよびc-myc標識PTPL1 4．NR1、NR2Bおよびc-myc標識PTPL1 5．NR1、NR2AおよびGFP-[PTPL1のPDZ1+2] 6．NR1、NR2BおよびGFP-[PTPL1のPDZ1+2] 7．対照として、NR1、NR2AおよびGFP-[PSD95のPDZ1+2]

【００８９】 すべての実験に関して、半集密的な細胞のシャーレ1つ当たり5μgの全プラス
ミドDNAを、例えば、リン酸カルシウム沈降（Wigler Mら、Cell 16：777〜785、
1979）によってトランスフェクトすることが可能である。細胞をトランスフェク
ションの48時間後に回収し、遠心分離によって培地を除去して、細胞をリン酸緩
衝生理食塩水（PBS）中に再懸濁した上で、ウルトラツーラックス（Ultraturrax
）（JKA-Maschinenbau）によって溶解することができる。

【００９０】 それぞれの場合に、以下の抗体（通常は濃度0.5〜1μg／ml）を溶液（総容積0
.5ml）に添加する： 1．抗NR2Aまたは抗c-myc 2．抗NR2Bまたは抗c-myc 3．抗NR1または抗c-myc 4．抗NR1または抗c-myc 5．抗NR1または抗GFP 6．抗NR1または抗GFP 7．抗NR1または抗GFP

【００９１】 抗体および異種的に発現させたタンパク質をともにインキュベートした後（4
℃で少なくとも1時間）に、20μlのプロテインA-セファロース（Pharmacia）ス
ラリーを添加し、インキュベーションをさらに1時間続ける。免疫共沈したタン
パク質を決定するために、免疫複合体が結合したビーズを遠心分離によってペレ
ット化し、PBSで洗って12％SDS-PAGEによって分離することにより、プロテインA
-セファロースに結合した物質を分離する。免疫共沈したタンパク質の存在を、
上記に概要を示した特異抗体を用いるウエスタンブロット法によって立証するた
めに、ゲル上に分離されたタンパク質を膜に移行させる。

【００９２】 免疫共沈の特異性を示すために、NR2AまたはNR2BのC末端の9アミノ酸に対応す
る合成阻害ペプチド（0.5mM）（KLSSIESDV）、ならびに同じアミノ酸組成のスク
ランブルされた（scrambled）ペプチドに対応する対照ペプチドの存在下でも実
験も行う。

【００９３】実施例4．PTPL1およびNMDA-Rの共存 ラット脳におけるPTPL1発現を調査するために、アンチセンスオリゴヌクレオ
チド を用いて、インサイチューハイブリダイゼーション研究を行った。その結果、PT
PL1が成体ラット脳内の主な神経集団のすべてで発現されることが示される。こ
のように、脳内でのPTPL1およびNMDA-Rの細胞局在の間には極めて高度の重複が
ある。

【００９４】 ラット大脳皮質および海馬に由来する初代神経培養物において、組換えによっ
て発現させたPTPL1を用いて共存に関する検討を行った。このような実験では、G
FP-PTPL1融合タンパク質をコードするcDNA構築物（5μgのDNA）を有するプラス
ミドを、リポフェクションを用いて初代ニューロンにトランスフェクトした。他
の細胞からの入力の受け手として働き、NMDA-Rが局在する場所である樹状突起に
おいて、GFP-PTPL1融合体の集積が観察された。GFP-PTPL1とNMDA-Rの共存は、抗
NMDA-R抗体を用いる免疫化学法によって示すことができる。

【００９５】 細胞内での共存を示すために、「抗体（Antibodies）」、ハーロウ（Harlow）
およびレーン（Lane）編、1999に記載された通りに、脳切片（厚さ50μm〜200μ
m）に対する高分解能の免疫組織化学的な検討を行う。NR1特異抗体およびPTPL1
特異抗体を用いてニューロン内の内因性NMDA-RおよびPTPL1を標識し、異なる種
（ウサギまたはマウス；ウサギまたはヤギなど）に由来する抗体を用いることに
よって共存を検出する。異なるレポーター（例えば、異なる蛍光タグ）を有し、
かつ特定の種に由来する抗体を特異的に認識する二次抗体を用いて、NMDA-RとPT
PL1を識別する。

【００９６】実施例5．PTPL1によるNR2AまたはNR2Bのリン酸化 PTPL1がNR2AまたはNR2Bを脱リン酸化しうること、および脱リン酸化の効力が
、NR2AまたはNR2BのC末端とPTPL1のPDZ2ドメインとの間の相互作用に依存するこ
とを示すために、以下の実験を行う。

【００９７】 精製したGST-NR2AおよびGST-NR2Bタンパク質を、精製されたSrcまたはFynキナ
ーゼ（1単位、Upstate Biotechnology、50μl HEPES、20mM、pH 7.2中）により
、Mg^２＋-ATP（1mM）の存在下で、30℃で10分間インビトロでリン酸化する。精
製GSTタンパク質をNR2AまたはNR2Bに特異的なチロシンリン酸化を評価するため
の対照として用いる。チロシンリン酸化の後に、タンパク質をSDS-PAGE（12％）
によって分離し、ブロッティングを行って、西洋ワサビペルオキシダーゼレポー
ター系（Upstate Biotechnology）に結合した抗ホスホチロシン抗体をプローブ
として検索する。チロシンリン酸化のレベルを、ホスホチロシンシグナルの強度
から判定する。

【００９８】 同時に、組換えc-myc標識PTPL1を、HEK293またはCOS細胞などの異種系で発現
させる。半集密的な細胞のシャーレ（直径100mm）1つ当たり5μgの全プラスミド
DNAを、例えば、リン酸カルシウム沈降によってトランスフェクトする。細胞を
トランスフェクションの48時間後に回収し、遠心分離によって培地を除去して、
細胞をリン酸緩衝生理食塩水（PBS）中に再懸濁した上で、ウルトラツーラック
ス（Ultraturrax）（JKA-Maschinenbau）によって溶解する。核は1000g、10分間
の遠心分離によってペレット化される。

【００９９】 c-myc抗体（濃度0.5〜1μg／ml）を上清（総容積0.5ml）に添加する。抗体お
よび異種的に発現させたタンパク質をともにインキュベートした後（4℃で少な
くとも1時間）に、20μlのプロテインA-セファロース（Pharmacia）スラリーを
添加し、インキュベーションをさらに1時間続ける。

【０１００】 捕捉されたプロテインA-PTPL1免疫複合体を、キナーゼで処理した融合タンパ
ク質：GST-NR2A、GST-NR2BおよびC末端のValがAlaに変異したGST-NR2Bの脱リン
酸化の速度を検討するために用いる。これは、100μlの脱リン酸化緩衝液（25mM
イミダゾール、HClによりpH 7.2、1mg／mlウシ血清アルブミン、1mM DTT）中で
、免疫沈降させたPTPL1免疫複合体をリン酸化されたGST-NR2AまたはGST-NR2Bタ
ンパク質に添加することによって行う。部分標本を5分毎に採取し、融合タンパ
ク質をSDS-PAGE（12％）によって分離し、ニトロセルロース膜（Amersham Pharm
acia Biotech）にブロットした上で、NR2AまたはNR2BのC末端の脱リン酸化レベ
ルを、抗ホスホチロシン抗体（Upstate Biotechnology）を用いて評価する。

【０１０１】 NR2AまたはNR2BのC末端の9アミノ酸に対応する、0.5mMの合成阻害ペプチド（K
LSSIESDV）、ならびに同じアミノ酸組成のスクランブルされたペプチドに対応す
る対照ペプチドの存在下で対照実験を行う。

【０１０２】実施例6：PTPL1によるNMDA-Rシグナル伝達の調整：電気生理学分析 NMDA-Rシグナル伝達の調整におけるPTPL1の役割を決定するために以下の実験
を行う。

【０１０３】 組換え系において、NMDA-RのNR1、NR2AまたはNR2Bサブユニットをコードする
プラスミドを、PTPL1を伴ってまたは伴わずに用いて、293細胞をトランスフェク
トする。半集密的な細胞のシャーレ1つ当たり5μgの全プラスミドDNAを、例えば
、リン酸カルシウム沈降（Wigler Mら、Cell 16：777〜785、1979）によってト
ランスフェクトする。すべての構成要素を発現する細胞は、L-グルタミン酸また
はNMDAに曝露させると、NMDA-R選択的電流を伴って反応する。NMDA電流を測定す
るためには、細胞をパッチピペットで締め付け、かつさまざまな膜電位でNMDA-R
電流を記録する（KohrおよびSeeburg、J. Physiol（London）492：445〜452、19
96）。次に、パッチピペットを通して、精製されたSrcまたはFynを締め付けた細
胞の細胞質ゾルに拡散させる。再びNMDA電流を記録し、かつチロシンキナーゼに
よるNMDA-R電流の増強を、トランスフェクトしたPTPL1の存在下および非存在下
で測定する。

【０１０４】 または、精製されたSrcまたはFynを適用する代わりに、チロシンキナーゼのSr
cファミリーメンバーを活性化するペプチド、EPQ（pY）EEIPIAを用いて細胞内の
内因性キナーゼを活性化し、トランスフェクトしたPTPL1の存在下および非存在
下の両方でNMDA-R電流を測定する。

【０１０５】 NMDA-RおよびPTPL1を発現する細胞を用いるパッチクランプ実験を、NR2Aまた
はNR2BのC末端の9アミノ酸に対応する0.5mMの合成阻害ペプチド（KLSSIESDV）、
ならびに阻害ペプチドと同じアミノ酸組成の、スクランブルされたペプチドに対
応する対照ペプチドの存在下で行う。

【０１０６】実施例7．NMDA-Rシグナル伝達を調整する作用物質のスクリーニング NMDA-Rシグナル伝達を調整する作用物質をスクリーニングするためのアプロー
チの一つを以下に説明する。

【０１０７】 NR2AおよびNR2BのC末端部分を、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）
との融合タンパク質として大腸菌（E.coli.）で発現させ、グルタチオン-セファ
ロース-4Bビーズ（Pharmacia）を用いて精製する。ビーズ上の精製されたGST-NR
2AまたはGST-NR2Bタンパク質を、1mM Mg^２＋-ATPの存在下で、精製されたSrcま
たはFynキナーゼ（例えば、Upstate Biotechnology由来）と混合する。

【０１０８】 ビーズ上のリン酸化された純粋なGST-NR2AまたはNR2Bの等量を、1ウェル毎に
作用物質の1つのプールまたは1つの作用物質の存在下または非存在下において、
PTPL1またはその酵素活性誘導体を含む96穴または384穴のアッセイプレートに、
等分する。対照ウェルはPTPL1を含まない。インキュベート後に、結合緩衝液（
リン酸緩衝生理食塩水）中にある等量のホスホチロシン抗体を各ウェルに添加す
る。

【０１０９】 ホスホチロシン抗体自体に、フルオレセインまたはローダミンなどの蛍光マー
カーを組み入れることができる。または、蛍光マーカーに結合させた、ホスホチ
ロシン抗体を認識する二次抗体をこの段階で加える。

【０１１０】 対照（作用物質を添加せず）と比較した蛍光の消失速度により、PTPL1活性に
対する作用物質の影響が示される。リン酸基の除去を遅延させる作用物質は、PT
PL1アンタゴニストである。これに対して、リン酸基の除去を促進する作用物質
はPTPL1アゴニストである。

【０１１１】 同様に、放射性γ-[^３2P]ATPを用いて、ビーズ上の精製されたGST-NR2Aまたは
GST-NR2Bタンパク質を、精製されたSrcまたはFynキナーゼ（例えば、Upstate Bi
otechnologyから入手）を用いてリン酸化することができる。ビーズ上のリン酸
化された純粋なGST-NR2AまたはNR2Bを、1ウェル毎に作用物質の1つのプールまた
は1つの作用物質の存在下または非存在下において、PTPL1またはその酵素活性誘
導体を含む96穴または384穴のアッセイプレートに等分する。対照ウェルはPTPL1
を含まない。インキュベート後に、等量の部分標本を採取し、ビーズ上に保持さ
れた放射能を計測する。

【０１１２】 対照（作用物質を添加せず）と比較した放射能の消失速度により、PTPL1活性
に対する作用物質の影響が示される。リン酸基の除去を遅延させる作用物質は、
PTPL1アンタゴニストである。これに対して、リン酸基の除去を促進する作用物
質はPTPL1アゴニストである。

【０１１３】 当業者には明らかと思われるが、本発明には、その趣旨および範囲を逸脱する
ことなく、さまざまな修正および変更を行うことができる。本明細書に記載した
具体的なの態様は例示のみのためであり、いかなる形でも本発明を制限すること
は意図されない。

【０１１４】 本明細書中に引用したすべての刊行物、図、特許および特許出願は、それぞれ
が個別に示されている場合と同程度に、すべての目的に関して参照として本明細
書に明確に組み入れられる。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１３年８月２０日（２００１．８．２０）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００４４

【補正方法】変更

【補正の内容】

【００４４】 アッセイに用いるPTPL1はさまざまな供給源から得られる。いくつかの態様で
は、アッセイに用いるPTPL1を、例えば特異抗体との免疫沈降により、細胞また
は組織の供給源から精製する。他の態様では、以下に述べる通り、PTPL1と公知
のタンパク質モチーフとの特異的相互作用、例えば、PTPL1のPDZ2ドメインとNR2
Aおよび／またはNR2Bとの相互作用を利用した親和性クロマトグラフィーによっ
てPTPL1を精製する。さらに他の態様では、PTPL1のホロ酵素またはその酵素的活
性部分を、細菌または真核生物発現系において組換えによって産生させる。組換
えによって産生されるPTPL1の異型には、それぞれ免疫親和性クロマトグラフィ
ーまたは金属キレートクロマトグラフィーを用いて、組換えにより産生されたPT
PL1の精製を容易にするために用いうる、免疫タグ（HAタグ、c-mycタグ、FLAGタ
グ）または6×Hisタグ（配列番号：1）などの、短いタンパク質タグを含むこと
ができる。

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００８４

【補正方法】変更

【補正の内容】

【００８４】 陰性対照に関しては、C側の最末端にあるバリン残基がアラニンに変異してい
るGST-NR2B融合体を用いる。さらに、相互作用の特異性を示すために、NR2Aまた
はNR2BのC末端の9アミノ酸に対応する合成阻害ペプチド（KLSSIESDV；配列番号
：2）を濃度0.5mMでの競合に用いる。陽性対照に関しては、異種的に発現させた
シナプス後肥厚部95（PSD95、Niethammerら、J. Neurosci. 16：2157〜63、1996
を参照）を同様の一組の実験に用いる。

【手続補正３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００８６

【補正方法】変更

【補正の内容】

【００８６】 陽性対照に関しては、相互作用の特異性を示すために、NR2AまたはNR2BのC末
端の9アミノ酸に対応する合成阻害ペプチド（KLSSIESDV；配列番号：2）を濃度0
.5mMでの競合に用いる。

【手続補正４】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００９２

【補正方法】変更

【補正の内容】

【００９２】 免疫共沈の特異性を示すために、NR2AまたはNR2BのC末端の9アミノ酸に対応す
る合成阻害ペプチド（0.5mM）（KLSSIESDV；配列番号：2）、ならびに同じアミ
ノ酸組成のスクランブルされた（scrambled）ペプチドに対応する対照ペプチド
の存在下でも実験も行う。

【手続補正５】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００９３

【補正方法】変更

【補正の内容】

【００９３】実施例4．PTPL1およびNMDA-Rの共存 ラット脳におけるPTPL1発現を調査するために、アンチセンスオリゴヌクレオ
チド を用いて、インサイチューハイブリダイゼーション研究を行った。その結果、PT
PL1が成体ラット脳内の主な神経集団のすべてで発現されることが示される。こ
のように、脳内でのPTPL1およびNMDA-Rの細胞局在の間には極めて高度の重複が
ある。

【手続補正６】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１０１

【補正方法】変更

【補正の内容】

【０１０１】 NR2AまたはNR2BのC末端の9アミノ酸に対応する、0.5mMの合成阻害ペプチド（K
LSSIESDV；配列番号：2）、ならびに同じアミノ酸組成のスクランブルされたペ
プチドに対応する対照ペプチドの存在下で対照実験を行う。

【手続補正７】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１０４

【補正方法】変更

【補正の内容】

【０１０４】 または、精製されたSrcまたはFynを適用する代わりに、チロシンキナーゼのSr
cファミリーメンバーを活性化するペプチド、EPQ（pY）EEIPIA（配列番号：4）
を用いて細胞内の内因性キナーゼを活性化し、トランスフェクトしたPTPL1の存
在下および非存在下の両方でNMDA-R電流を測定する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 25/08 Ａ６１Ｐ 25/08 25/14 25/14 25/18 25/18 25/28 25/28 25/30 25/30 25/32 25/32 41/00 41/00 43/00 １１１ 43/00 １１１ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 33/50 33/50 Ｐ Ｚ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 2G045 AA40 FB01 FB03 4B063 QA20 QQ33 QS02 QS33 QX02 QX07 4C084 AA02 AA17 DC50 NA14 ZA011 ZA061 ZA081 ZA151 ZA161 ZA181 ZA221 ZA361 ZC192 ZC202 ZC412

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 N-メチル-D-アスパラギン酸受容体（NMDA-R）シグナル伝達
   活性の修飾物質（modulator）を同定するための方法であって、作用物質（agent
   ）が、プロテインチロシンホスファターゼ（PTP）のNMDA-R基質に対するホスフ
   ァターゼ活性を調整する（modulate）能力、またはPTPのNMDA-Rへの結合を調整
   する能力を検出し、それによって修飾物質を同定する段階を含み、PTPがNMDA-R
   を脱リン酸化できる方法。
2. 【請求項２】 PTPがPTPL1である、請求項1記載の方法。
3. 【請求項３】 修飾物質が、PTPL1のホスファターゼ活性を調整する能力を
   検出することによって同定される、請求項2記載の方法。
4. 【請求項４】 修飾物質が、PTPのNMDA-Rへの結合を調整する能力を検出す
   ることによって同定される、請求項1記載の方法。
5. 【請求項５】 作用物質をNMDA-Rシグナル伝達の修飾物質として同定するた
   めの方法であって、以下の段階を含む方法： （a） （i）作用物質、 （ii）PTPL1またはその機能的誘導体、および （iii）NMDA-Rもしくはそのサブユニットまたはその機能的誘導体 を接触させる段階であって、 （ii）および（iii）の一方または両方は実質的に純粋であるか組換えによって
   発現される段階； （b）NMDA-Rまたはサブユニットのチロシンリン酸化レベルを測定する段階； （c）作用物質の存在下におけるNMDA-Rのチロシンリン酸化レベルを、作用物質
   の非存在下におけるNMDA-Rのチロシンリン酸化レベルと比較する段階であって、
   チロシンリン酸化レベルにおける差異によって、作用物質がNMDA-Rシグナル伝達
   の修飾物質として同定される段階。
6. 【請求項６】 NMDA-RおよびPTPL1が、PTPL1/NMDA-Rを含むタンパク質複合
   体中に存在する、請求項5記載の方法。
7. 【請求項７】 作用物質が、NMDA-Rを脱リン酸化するPTPL1の能力を増強す
   る、請求項5記載の方法。
8. 【請求項８】 作用物質が、NMDA-Rを脱リン酸化するPTPL1の能力を阻害す
   る、請求項5記載の方法。
9. 【請求項９】 作用物質が、PTPL1のNMDA-Rへの結合を調整する、請求項5記
   載の方法。
10. 【請求項１０】 作用物質が結合を促進または増強する、請求項9記載の方
    法。
11. 【請求項１１】 作用物質が結合を妨害または阻害する、請求項9記載の方
    法。
12. 【請求項１２】 NMDA-Rシグナル伝達を調整する核酸分子を同定するための
    方法であって、 （a）NMDA-Rまたはその機能的誘導体、およびPTPL1またはその機能的誘導体を共
    発現する細胞培養物を入手する段階、 （b）遺伝子産物をコードする核酸分子を細胞の一部に導入し、それによって核
    酸分子を含む細胞を作製する段階、 （c）遺伝子産物が発現される条件下で（b）における細胞を培養する段階、 （d）（c）における細胞でのNMDA-Rのチロシンリン酸化レベルを測定し、かつそ
    のレベルを核酸分子が導入されていない対照細胞のものと比較する段階 を含み、チロシンリン酸化レベルにおける差異によって、核酸分子がNMDA-Rシグ
    ナル伝達の修飾物質として同定される方法。
13. 【請求項１３】 異常なNMDA-Rシグナル伝達によって媒介される疾患を治療
    するための方法であって、PTPL1活性の修飾物質を投与し、それによってNMDA-R
    のチロシンリン酸化レベルを調整する段階を含む方法。
14. 【請求項１４】 修飾物質が、NMDA-Rを脱リン酸化するPTPL1の能力を調整
    する、請求項13記載の方法。
15. 【請求項１５】 修飾物質が、NMDA-Rに結合するPTPL1の能力を調整する、
    請求項13記載の方法。
16. 【請求項１６】 修飾物質がPTPL1アゴニストであり、ここで疾患が（i）虚
    血性発作、（ii）頭部外傷または脳損傷、（iii）ハンチントン病、（iv）脊髄
    小脳変性症、（v）運動ニューロン疾患、（vi）てんかん、（vii）神経障害性疼
    痛、（viii）慢性疼痛、および（ix）耐性からなる群より選択される、請求項13
    記載の方法。
17. 【請求項１７】 修飾物質がPTPL1アンタゴニストであり、疾患が（i）精神
    ***病、（ii）アルツハイマー病、（iii）痴呆、（iv）精神病、（v）薬物嗜癖
    、および（vi）エタノール感受性からなる群より選択される、請求項13記載の方
    法。