JP2003518359A - Regulation of cell proliferation, methods and reagents - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、細胞周期チェックポイントを回避できるポリペプチドに関する。そのようなポリペプチド（例えば、マクロファージ遊走阻止因子）を使用して細胞増殖を誘発する特異的施用が記載されている。   (57) [Summary] The present invention relates to polypeptides that can avoid cell cycle checkpoints. Specific applications using such polypeptides (eg, macrophage migration inhibitory factor) to induce cell proliferation have been described.

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】基金 ここに記載された発明は、国立衛生研究所補助金（National Institutes of H
ealth Grant）により援助された。合衆国政府は、本発明に特定の権利を有する
。The Foundation The invention described here is the National Institutes of Health Grant.
ealth Grant). The United States Government has certain rights in this invention.

【０００２】発明の背景 細胞が有糸***に入ると、特徴として、例えば細胞骨格の再配列、核膜および
仁の分解、および染色質の染色体中への縮合を含む、協調した同時に起こる発生
を伴う。細胞周期のチェックポイントを通って真核生物の細胞を増殖させる過程
は、有糸***が適切な時に起こることを保証する調節タンパク質の配列によって
制御される。これらの調節タンパク質は、例えばゲノムDNAのあるパーセントの
分画が複製されないままである場合にS期から細胞が出るのを防ぐことができる(
Dasso et al.(1990)Cell 61:811-823)および全ての染色体が赤道板上に整合され
るまで有糸***が後期へ進むのを妨げることができる(Rieder et al.(1990)J.Ce
ll Biol.110:81-95)、非常に敏感なフィードバック制御された回路を提供できる
。[0002] When the background cell of the invention enter mitosis, as a feature, for example, cytoskeletal rearrangement, degradation of the nuclear membrane and nucleolus, and a condensation of chromatin into chromosomes, a generation that occurs coordinated simultaneously Accompany. The process of growing eukaryotic cells through cell cycle checkpoints is controlled by sequences of regulatory proteins that ensure that mitosis occurs at the appropriate time. These regulatory proteins can prevent cells from exiting S phase when, for example, a certain percentage of the genomic DNA remains unreplicated (
Dasso et al. (1990) Cell 61: 811-823) and can prevent mitosis from progressing late until all chromosomes are aligned on the equatorial plate (Rieder et al. (1990) J. Ce
ll Biol. 110: 81-95), which can provide a very sensitive feedback controlled circuit.

【０００３】 細胞周期のチェックポイントは、細胞周期の移行の段階とタイミングを調節し
DNA複製および染色体分離のような臨界のイベントが高い正確性で終了されるこ
とを保証する調節経路である。さらに、チェックポイントは、修復に時間を提供
するための細胞周期の停止および修復を容易にする遺伝子の転写の誘発による損
傷に応答する。チェックポイントの損失はゲノムを不安定にし、正常細胞の癌細
胞への進化に関係する。最近の進歩は、DNA損傷、複製ブロック、および紡垂体
損傷に応じてチェックポイントシグナルを伝達するシグナル変換経路を示してき
た。チェックポイント経路は、全ての真核生物の間で共有される構成要素を有し
、細胞周期調節機構の保存性を強調する。Cell cycle checkpoints regulate the stages and timing of cell cycle transitions.
It is a regulatory pathway that ensures that critical events such as DNA replication and chromosome segregation are terminated with high accuracy. In addition, checkpoints respond to cell cycle arrest to provide time for repair and damage induced by transcription of genes that facilitate repair. Loss of checkpoints destabilizes the genome and is associated with the evolution of normal cells into cancer cells. Recent advances have shown signal transduction pathways that transduce checkpoint signals in response to DNA damage, replication blocks, and mitotic spindle damage. The checkpoint pathway has components shared among all eukaryotes, highlighting the conservation of cell cycle regulatory machinery.

【０００４】 例えば、細胞周期の経過におけるネガティブコントロールを、発生、分化、老
化、および細胞死の間働かせた。これらのネガティブコントロールは、腫瘍形成
の防止において重要な役割を果たすかもしれない。多くの場合、細胞増殖の停止
は、ゲノムの完全性が傷つけられる環境下で生じ、増殖を停止しないと癌細胞に
進化し得る非常に不安定なゲノムを有する細胞が放出されるだろう。そのような
環境は、例えば(i)末端小粒が失われるまたは短くなり、不安定な二動原体の染
色体が形成される老化；(ii)DNA分解ヌクレアーゼが解放される「プログラムさ
れた細胞死」またはアポトーシス；(iii)必須の免疫グロブリンおよびT細胞レセ
プター遺伝子の再配列が二本鎖DNAの切断を必要とする免疫細胞の発生を含んで
もよい。これらは全て、増殖の停止を含み得るプログラムされた発生である。For example, negative controls on the course of the cell cycle worked during development, differentiation, senescence, and cell death. These negative controls may play an important role in preventing tumor formation. In many cases, arrest of cell growth will occur in an environment where genomic integrity is compromised, releasing cells with highly unstable genomes that can evolve into cancer cells if growth is not arrested. Such environments include, for example, (i) senescence in which terminal granules are lost or shortened and unstable dicentric chromosomes are formed; (ii) DNA degrading nucleases are released "programmed cell death. Or (iii) the rearrangement of essential immunoglobulin and T cell receptor genes may involve the development of immune cells in which double-stranded DNA cleavage is required. These are all programmed outbreaks that can include arrest of growth.

【０００５】 DNA複製または紡垂体の集合の抑制因子または物理的にDNAに損傷を与える物質
にさらされるような、プログラムされていない外因性のイベントによって損傷が
誘発される場合、細胞は、細胞周期の進行を停止する能力も有する。これらの状
態は、特定の段階において細胞周期の進行を停止する。例えば、DNAの複製がヒ
ドロキシ尿素によって停止される場合、細胞は初期のS期において停止し、有糸
***を受けない。DNA複製の完成前の有糸***のこの依存性は、特定の遺伝子産
物の作用による。突然変異によるこれらの遺伝子の不活性化は細胞からこの依存
性を軽減し、そのような突然変異体は不完全に複製されたDNAを有して有糸***
に入るであろう。細胞周期において依存性を確立する遺伝子は、チェックポイン
トを構成する。When damage is induced by an unprogrammed exogenous event, such as exposure to a suppressor of DNA replication or assembly of mitotic bodies or a substance that physically damages DNA, the cell may enter the cell cycle. It also has the ability to stop the progression of. These conditions arrest cell cycle progression at certain stages. For example, when DNA replication is arrested by hydroxyurea, cells are arrested in early S phase and do not undergo mitosis. This dependence of mitosis prior to completion of DNA replication is due to the action of specific gene products. Inactivation of these genes by mutations relieves this dependency from the cell, and such mutants will have incompletely replicated DNA and enter mitosis. Genes that establish dependence in the cell cycle constitute checkpoints.

【０００６】 細胞死は、例えばプログラムされた細胞死および壊死を含む多様な工程により
起こる。「アポトーシス」という用語は、自己再生組織中の細胞の定常状態レベ
ルを維持する原因である、プログラムされた細胞死の過程を受ける細胞の形態学
的特徴をさす。正常状態のもとでは、アポトーシスは、組織中で死ぬ細胞の数が
新しく産生される細胞の数とほぼ等しいことを保証する。しかしながら、様々な
病気の状態においてまたは組織への傷害の結果として、アポトーシスの過程の調
節異常が起こり得る。同様に、様々な病気の状態は、アポトーシス以外の過程に
よる細胞死の増加したレベルと関係する。Cell death occurs by a variety of processes including, for example, programmed cell death and necrosis. The term "apoptosis" refers to the morphological characteristics of cells undergoing a process of programmed cell death that is responsible for maintaining steady-state levels of cells in self-renewing tissues. Under normal conditions, apoptosis ensures that the number of cells dying in the tissue is approximately equal to the number of newly produced cells. However, dysregulation of the apoptotic process can occur in various disease states or as a result of injury to tissues. Similarly, various disease states are associated with increased levels of cell death by processes other than apoptosis.

【０００７】 例えばアルツハイマー病、パーキンソン病、ハンティングトン舞踏病、てんか
ん、筋萎縮側索硬化、発作、虚血性心臓病、脊髄損傷および多くのウイルス性感
染においては、異常に高いレベルの細胞死が起こる。これらの病気の少なくとも
いくつかにおいては、アポトーシスと一致する機構を通して過度の細胞死が起こ
る証拠がある。これらの中には、１）軸索が切断されることにより細胞の生存力
を維持するために必要な神経栄養因子がニューロンから奪われる、脊髄損傷；２
）虚血による壊死性細胞死の第一期の後、死んだ細胞の破裂が近接する健康なニ
ューロン中のアポトーシスを刺激するグルタメートおよび酸素フリーラジカルを
放出する、発作； および３）Tリンパ球のアポトーシスを誘発する、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)感
染がある。High levels of cell death occur in, for example, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Huntington's chorea, epilepsy, amyotrophic lateral sclerosis, stroke, ischemic heart disease, spinal cord injury and many viral infections. . There is evidence that excessive cell death occurs in at least some of these diseases through a mechanism consistent with apoptosis. Among these are: 1) Spinal cord injury, in which neuronal trophic factors required to maintain cell viability are deprived of neurons by axonal cleavage; 2
3) After the first phase of ischemic necrotic cell death, the rupture of dead cells releases glutamate and oxygen free radicals that stimulate apoptosis in nearby healthy neurons; There is a human immunodeficiency virus (HIV) infection that induces apoptosis.

【０００８】 対照的に、癌細胞中ではアポトーシスのレベルが増加され、対応する正常細胞
より癌細胞を長生きさせる。生き残る癌細胞の数の増加の結果として、癌細胞の
倍化時間が増加しなくても腫瘍の塊が増加し得る。さらに、アポトーシスおよび
、ときには壊死性の細胞死の調節に関係するbcl-2遺伝子の癌細胞における発現
の高いレベルは、癌細胞を化学治療薬および放射線治療に対して相対的に耐性の
あるものにする。[0008] In contrast, the level of apoptosis is increased in cancer cells, making them outlive the corresponding normal cells. As a result of the increased number of surviving cancer cells, tumor mass may increase without an increase in cancer cell doubling time. Furthermore, the high level of expression in cancer cells of the bcl-2 gene, which is involved in the regulation of apoptosis and sometimes necrotic cell death, makes cancer cells relatively resistant to chemotherapeutic agents and radiotherapy. To do.

【０００９】 p53腫瘍サプレッサタンパク質(p53)、例えばチェックポイント遺伝子は、アポ
トーシスの過程に関係するタンパク質の１つの例である。野生型p53タンパク質
は細胞中でアポトーシスを誘発するのに対し、突然変異体p53タンパク質はアポ
トーシスを誘発しない。多くの癌はp53をコードする遺伝子中に突然変異体を有
し、従って、いかなるp53タンパク質も発現しないまたは突然変異体p53タンパク
質を発現する。従って、癌細胞中に野生型p53腫瘍サプレッサがないことも、癌
細胞中で起こるアポトーシスのレベルを低下させる一因となり得る。The p53 tumor suppressor protein (p53), eg the checkpoint gene, is one example of a protein involved in the process of apoptosis. Wild-type p53 protein induces apoptosis in cells, whereas mutant p53 protein does not. Many cancers have a mutation in the gene encoding p53 and therefore either do not express any p53 protein or express a mutant p53 protein. Therefore, the lack of wild-type p53 tumor suppressor in cancer cells may also contribute to reducing the level of apoptosis that occurs in cancer cells.

【００１０】 細胞死に関係する遺伝子が調節される機構を操作できることにより、異常なレ
ベルの細胞死により特徴付けられる病気の作用の改善を目的とする治療への潜在
的な目標を有する医師が提供され、また例えば細胞中のアポトーシスを有効に調
節できる薬を同定する方法の開発が見込まれるであろう。しかしながら、細胞中
でこれらの遺伝子が調節される機構は、今まで記載されていない。従って、アポ
トーシスに関係する遺伝子についての調節因子を操作する方法を同定する必要が
ある。The ability to manipulate the mechanisms by which genes involved in cell death are regulated provides physicians with potential goals for treatment aimed at improving the action of diseases characterized by abnormal levels of cell death. Also, for example, the development of methods for identifying drugs that can effectively regulate apoptosis in cells will be expected. However, the mechanism by which these genes are regulated in cells has not been described until now. Therefore, there is a need to identify ways to engineer regulators of genes involved in apoptosis.

【００１１】 培養中の正常な哺乳類の二倍体細胞は有限の増殖寿命を有し老化と称される細
胞***しない状態に入るが、これは変化された遺伝子発現により特徴付けられる
(Hayflick et al. (1961) Exp.Cell Res.25:585;Wright et al.(1989)Mol.Cell. Biol. 9:3088;Goldstein,(1990)Science249:112;Campisi,(1996)Cell 84:497;Cam
pisi(1997)Eur.J.Cancer33:703;Faragher et al.(1997)Drug Discovery Today2:
64)。複製の老化は、累積する細胞***に依存するが生活時間または代謝時間に
は依存せず、これは増殖が「有糸***時計」によって制限されることを示す(Del
l’Orco et al.(1973)Exp.Cell Res.77:356;Hadey et al. (1978) J.Cell.Physi ol. 97:509)。早老症候群を有する年をとったドナーおよび患者からの細胞の増殖
能力の減少(Martin et al.(1970)Lab.Invest23:86;Schneider et al.(1976)PNAS 73:3584;Schneider et al. (1972) Proc.Soc.Exp.Biol.Med.141:1092;Elmore et
al.(1976)Cell Physiol.87:229)、および変化した遺伝子発現のパターンを有す
る老化細胞のインビボにおける蓄積(Stanulis-Praeger et al.(1987)Mech.Agein g Dev. 38:1;およびDimri et al.(1995)PNAS92:9363)は、細胞の老化を老化およ
び寿命に関する病理学に含む((Hayflick et al.(1961)Exp.Cell Res.25:585;Wri
ght et al. (1989) Mol.Cell.Biol.9:3088;Goldstein,(1990)Science249:112;Ca
mpisi,(1996)Cell 84:497;Campisi(1997)Eur.J.Cancer33:703;Faragher et al.(
1997)Drug Discovery Today2:64)。Normal mammalian diploid cells in culture have a finite proliferative lifespan and enter a non-mitotic state called senescence, which is characterized by altered gene expression.
(Hayflick et al. (1961) Exp. Cell Res. 25: 585; Wright et al. (1989) Mol. Cell. Biol. 9: 3088; Goldstein, (1990) Science 249: 112; Campisi, (1996) Cell 84: 497; Cam
pisi (1997) Eur . J. Cancer 33: 703; Faragher et al. (1997) Drug Discovery Today 2:
64). Replicative senescence is dependent on cumulative cell division but not life or metabolic time, indicating that proliferation is limited by the "mitotic clock" (Del
l'Orco et al. (1973) Exp. Cell Res. 77: 356; Hadey et al. (1978) J. Cell . Physiol . 97: 509). Decreased proliferative capacity of cells from elderly donors and patients with progeria syndrome (Martin et al. (1970) Lab . Invest 23:86 ; Schneider et al. (1976) PNAS 73: 3584; Schneider et al. (1972) Proc.Soc.Exp.Biol.Med. 141: 1092; Elmore et
(1976) Cell Physiol. 87: 229) and in vivo accumulation of senescent cells with altered pattern of gene expression (Stanulis-Praeger et al. (1987) Mech . Ageing Dev. 38: 1; and Dimri. et al. (1995) PNAS 92: 9363) include cell senescence in the pathology of senescence and longevity ((Hayflick et al. (1961) Exp. Cell Res. 25: 585; Wri.
ght et al. (1989) Mol. Cell. Biol. 9: 3088; Goldstein, (1990) Science 249: 112; Ca
mpisi, (1996) Cell 84: 497; Campisi (1997) Eur . J. Cancer 33: 703; Faragher et al.
1997) Drug Discovery Today 2:64).

【００１２】 細胞老化は、原則としてインサイチュにおける細胞の寿命の延長により治療で
きる中高年層の多発性の病気の原因になると考えられている。実施例は、皮膚の
繊維芽細胞中の細胞外基質ホメオスタシスの喪失による皮膚の萎縮；RPE細胞中
におけるリポフスチンの蓄積およびニューロンの生存因子のダウンレギュレーシ
ョンにより引き起こされる老化に関係する黄斑変性；および内皮細胞中における
増殖能力の喪失と高血圧および血栓因子の過発現により引き起こされるアテロー
ム硬化症を含む。Cellular aging is believed to cause multiple illnesses in the middle-aged and older, which in principle can be treated by prolonging the life of cells in situ. Examples are atrophy of the skin due to loss of extracellular matrix homeostasis in skin fibroblasts; macular degeneration associated with senescence caused by lipofuscin accumulation in RPE cells and down-regulation of neuronal survival factors; and endothelial cells. And atherosclerosis caused by hypertension and overexpression of thrombotic factors.

【００１３】 寿命を延長された細胞はまた、半ビボにおける潜在的な施用を有する。クロー
ン化された正常な二倍体の細胞は、増殖および分化の生化学的および生理学的態
様の研究において確立した腫瘍細胞系を置換できる；長命の正常なヒト細胞は、
正常なまたは処理された生物工学産物を産生するために使用できる；および正常
なまたは遺伝的に処理された新生された細胞の拡大された母集団は、自系のまた
は同種異系の細胞および遺伝子の治療に使用できる。従って、若い正常な細胞に
独特な二倍体状態、増殖特性、および遺伝子発現パターンを維持しながら細胞の
寿命を延長できることは、生物学的研究、製薬産業、および医学に重要な関係を
有する。Cells with extended lifespan also have potential application ex vivo. Cloned normal diploid cells can replace tumor cell lines established in studies of biochemical and physiological aspects of proliferation and differentiation; long-lived normal human cells
Can be used to produce normal or processed biotechnology products; and an expanded population of normal or genetically processed neoplastic cells can be used to produce autologous or allogeneic cells and genes Can be used to treat Thus, the ability to prolong cell life while maintaining the diploid state, growth characteristics, and gene expression patterns unique to young normal cells has important implications in biological research, the pharmaceutical industry, and medicine.

【００１４】発明の概要 本発明の１つの態様は、細胞の寿命、例えば有糸***の数を拡大させるための
方法および試薬に関する。 SUMMARY OF THE INVENTION One aspect of the present invention relates to methods and reagents for expanding the life span of cells, such as the number of mitosis.

【００１５】 本発明の別の態様は、p53チェックポイントのMIF誘発されたバイパスを抑制す
ることによる増殖障害の治療に関する。Another aspect of the invention relates to the treatment of proliferative disorders by inhibiting MIF-induced bypass of the p53 checkpoint.

【００１６】 ある態様において、本発明は、細胞周期チェックポイントを回避できるポリペ
プチドを同定する方法であって、 (a) 細胞の増殖停止を起こすように細胞周期チェックポイント遺伝子を過発
現させる細胞を産生し、 (b) ポリペプチド産物をコードする核酸を異所的に発現させ、 (c) 核酸のポリペプチド産物がチェックポイント媒介増殖停止を回避する
か否かを測定する、 各工程を含むことを特徴とする方法を提供する。[0016] In one aspect, the invention provides a method of identifying a polypeptide capable of circumventing a cell cycle checkpoint, comprising the steps of: (a) selecting a cell that overexpresses a cell cycle checkpoint gene to cause cell growth arrest. Producing, (b) ectopically expressing the nucleic acid encoding the polypeptide product, and (c) determining whether the polypeptide product of the nucleic acid avoids checkpoint-mediated growth arrest. Is provided.

【００１７】 この方法は、細胞周期チェックポイントがp53およびp53様腫瘍サプレッサ、In
k4遺伝子産物、およびCIP/KIP遺伝子産物からなる群より選択されることを特徴
とする細胞を使用して実施できる。This method uses cell cycle checkpoints p53 and p53-like tumor suppressors, In
It can be carried out using cells characterized by being selected from the group consisting of the k4 gene product and the CIP / KIP gene product.

【００１８】 本発明の別の態様は、例えばチェックポイント媒介増殖停止を回避できる上述
の方法により同定されるような、精製されたおよび/または組換え型のポリペプ
チドまたはその相同体の製剤を提供する。ある実施の形態においては、ポリペプ
チドは可溶性の細胞外ポリペプチドである。本発明はまた、そのようなポリペプ
チドをコードする核酸を意図する。Another aspect of the invention provides a formulation of purified and / or recombinant polypeptide or a homologue thereof, as identified by the above method, which is capable of avoiding checkpoint mediated growth arrest, for example. To do. In certain embodiments, the polypeptide is a soluble extracellular polypeptide. The present invention also contemplates nucleic acids encoding such polypeptides.

【００１９】 本発明の別の態様は、インビトロまたはインビボで、細胞を、例えば細胞増殖
を誘発する本発明の方法により同定されたそのようなポリペプチドのある量と接
触させる工程を含む細胞増殖を誘発する方法である。Another aspect of the invention is cell growth comprising contacting the cells in vitro or in vivo with an amount of such a polypeptide identified by, eg, the method of the invention that induces cell growth. It is a method to induce.

【００２０】 ある実施の形態において、本発明の方法は、インビトロまたはインビボで、細
胞を、細胞増殖を誘発するマクロファージ遊走阻止因子(MIF)またはその相同体
のある量と接触させる工程を含む細胞増殖を誘発する方法である。この方法は、
例えば、配列番号２またはその一部に同一または相同のMIFアミノ酸配列を含む
ポリペプチドまたはそのペプチド擬態物（peptidemimetics）を使用して実施で
きる。In one embodiment, the method of the invention comprises contacting a cell in vitro or in vivo with an amount of macrophage migration inhibitory factor (MIF) or a homologue thereof that induces cell proliferation. Is a method of inducing. This method
For example, it can be carried out using a polypeptide containing a MIF amino acid sequence that is the same or homologous to SEQ ID NO: 2 or a part thereof, or peptidomimetics thereof.

【００２１】 本発明の別の態様は、細胞が受ける有糸***の数を増加させる方法であって、
細胞の増殖を促進するのに十分な量で、配列番号２またはその一部に同一または
相同のMIFアミノ酸配列を含むポリペプチドに細胞を接触させる工程を含む方法
である。Another aspect of the invention is a method of increasing the number of mitotic cells undergoing by a cell, comprising:
A method comprising contacting a cell with a polypeptide comprising a MIF amino acid sequence identical or homologous to SEQ ID NO: 2 or a portion thereof in an amount sufficient to promote cell growth.

【００２２】 本発明のさらに別の態様は、化学治療薬に対する癌細胞の化学感受性を改良す
る方法であって、十分な量でおよび細胞がp53依存性細胞死を受ける条件下で細
胞をMIFポリペプチドに接触させる工程を含む方法である。Yet another aspect of the invention is a method of improving the chemosensitivity of cancer cells to chemotherapeutic agents, wherein the cells are treated with MIF poly at a sufficient amount and under conditions that the cells undergo p53-dependent cell death. It is a method including a step of contacting with a peptide.

【００２３】 好ましい実施の形態においては、MIFポリペプチドを利用する上述の方法は、
ストリンジェントな条件下で配列番号１にハイブリッド形成する核酸によりコー
ドされるMIFポリペプチドを使用して実施される。In a preferred embodiment, the above method utilizing a MIF polypeptide comprises
It is performed using a MIF polypeptide encoded by a nucleic acid that hybridizes to SEQ ID NO: 1 under stringent conditions.

【００２４】 本発明の方法は、例えば幹細胞または始原細胞の増殖能力を増加させるために
使用できる。そのような細胞は、神経細胞、造血細胞、膵細胞、および肝の幹細
胞および始原細胞からなる群より選択できる。The method of the invention can be used, for example, to increase the proliferative capacity of stem cells or progenitor cells. Such cells can be selected from the group consisting of neural cells, hematopoietic cells, pancreatic cells, and hepatic stem cells and progenitor cells.

【００２５】 好ましい実施の形態において、本発明の方法は、皮膚または他の上皮の細胞 の治療の一部として使用できる。[0025]   In a preferred embodiment, the method of the present invention comprises the use of skin or other epithelial cells. Can be used as part of treatment.

【００２６】 別の好ましい実施の形態において、本発明の方法は、間葉細胞の治療の一部と
して使用できる。In another preferred embodiment, the method of the invention can be used as part of a treatment of mesenchymal cells.

【００２７】 さらに別の好ましい実施の形態において、本発明の方法は、軟骨細胞または骨
細胞の治療の一部として使用できる。In yet another preferred embodiment, the method of the invention can be used as part of a treatment of chondrocytes or osteocytes.

【００２８】 ここに記載されるように、治療される細胞は、培養物または移植組織中で、ま
たは例えばインビボにおける動物への投与により治療できる。As described herein, the cells to be treated can be treated in culture or in transplanted tissue or by administration to animals, eg, in vivo.

【００２９】 本発明の別の態様は、配列番号２またはその一部に同一または相同のMIFアミ
ノ酸配列を含むポリペプチドを活性成分として含む薬剤、および薬学的基準に合
う賦形剤である。Another aspect of the present invention is a drug containing as an active ingredient a polypeptide comprising a MIF amino acid sequence identical or homologous to SEQ ID NO: 2 or a part thereof, and an excipient meeting pharmaceutical standards.

【００３０】 本発明のさらに別の態様は、局所施用される際に皮膚層の細胞の増殖を促進す
るのに適切な量で配列番号２またはその一部に同一または相同のMIFアミノ酸配
列を含むポリペプチドを活性成分として含む化粧品、および局所施用のための薬
学的基準に合う賦形剤に関する。Yet another aspect of the invention comprises a MIF amino acid sequence identical or homologous to SEQ ID NO: 2 or a portion thereof in an amount suitable to promote proliferation of cells of the skin layer when applied topically. The present invention relates to cosmetics containing a polypeptide as an active ingredient, and excipients meeting pharmaceutical standards for topical application.

【００３１】 本発明はまた、創傷の治癒を促進する方法であって、細胞増殖を誘発するのに
十分な量で、配列番号２またはその一部に同一または相同のMIFアミノ酸配列を
含むポリペプチドまたはそのペプチド擬態物のある量に患者の創傷部位を接触さ
せる工程を含む方法を提供する。例えば、この方法は、創傷部位が上皮組織を含
み、MIFポリペプチドが上皮組織の増殖を促進する場合に使用できる。本発明の
方法はまた、手術、熱傷、炎症または刺激から生じる創傷に使用できる。本発明
の方法はまた、例えば静脈病（静脈うっ血性潰瘍）、過圧力（褥瘡性潰瘍）また
は動脈潰瘍から生じる皮膚潰瘍の治療に使用できる。The present invention is also a method of promoting wound healing, comprising a polypeptide comprising a MIF amino acid sequence identical or homologous to SEQ ID NO: 2 or a portion thereof in an amount sufficient to induce cell proliferation. Alternatively, a method is provided that comprises contacting a wound site of a patient with an amount of the peptidomimetic thereof. For example, this method can be used where the wound site comprises epithelial tissue and the MIF polypeptide promotes epithelial tissue proliferation. The method of the invention can also be used on wounds resulting from surgery, burns, inflammation or irritation. The method of the invention can also be used for the treatment of skin ulcers resulting from, for example, venous disease (venous stasis ulcers), overpressure (decubitus ulcers) or arterial ulcers.

【００３２】 本発明の方法は、例えば皮膚、毛および/または爪の組織再生過程を強めるた
めに、例えば化粧品の形態で、MIFポリペプチドを予防的に施用する場合に実施
できる。The method of the invention can be carried out when the MIF polypeptide is applied prophylactically, for example in the form of a cosmetic product, to enhance the process of tissue regeneration of the skin, hair and / or nails.

【００３３】 本発明の別の態様は、p53のMIF媒介バイパスを含む表現型を使用して細胞の増
殖を抑制する方法であって、細胞をp53のMIF媒介バイパスを抑制する物質と接触
させる工程を含む方法を提供する。Another aspect of the invention is a method of inhibiting cell proliferation using a phenotype involving MIF-mediated bypass of p53, the method comprising contacting the cell with an agent that inhibits MIF-mediated bypass of p53. A method including is provided.

【００３４】 本発明はまた、(a)請求項１９の製剤、および(b)栄養因子、屈性因子、および
/または例えば、ブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファンのよ
うなアルキルスルホネート；ベンゾデパ(benzpdepa)、カルボクオン(carboquone
)、メチャーデパ(meturedepa)およびウレデパ(uredepa)のようなアジリジン(azi
ridines)；アルトレトアミン(altretamine)、トリエチレンメラミン、トリエチ
レンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミドおよびトリメチロメラミ
ンのようなエチレンイミンおよびメチルメラミン；クロラムブシル、クロルナフ
ァジン(chlornaphazine)、クロホスファミド(chclophosphamide)、エストラムス
チン、イフォスファミド(ifosfamide)、メクロレタミン、塩酸メクロレタミン、
メルファラン、ノベンビチン(novembichin)、フェネステリン(phenesterine)、
プレドニムスチン(prednimustine)、トロフォスファミド(trofosfamide)および
ウラシルマスタードのようなナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロ
ゾトシン、フォレムスチン(foremustine)、ロムスチン、ニムスチンおよびラニ
ムスチン(ranimustine)のようなニトロソ尿素類；ダカルバジン；マンノムスチ
ン；ミトブロニトル(mitobronitol)；ミトラクトール(mitolactol)；およびピポ
ブロマンからなる群より選択されるような化学治療薬を含む合同投与のためのキ
ットを提供する。The invention also comprises (a) the formulation of claim 19 and (b) a trophic factor, a tropic factor, and
/ Or Alkyl sulfonates, such as, for example, busulfan, improsulfan and piposulfan; benzpdepa, carboquone
), Aziridine (azide) such as meturedepa and uredepa.
ridines); altretamine, triethylenemelamine, triethylenephosphoramide, ethyleneimine such as triethylenethiophosphoramide and trimethylolmelamine and methylmelamine; chlorambucil, chlornaphazine, clofosfamide chclophosphamide), estramustine, ifosfamide, mechlorethamine, mechlorethamine hydrochloride,
Melphalan, Novembichin, phenesterine,
Nitrogen mustards such as prednimustine, trofosfamide and uracil mustard; nitrosoureas such as carmustine, chlorozotocin, foremustine, lomustine, nimustine and ranimustine; dacarbazine; mancarbazin; A kit for joint administration comprising a chemotherapeutic agent as selected from the group consisting of mitobronitol; mitolactol; and pipobroman.

【００３５】 本発明はまた、細胞の増殖能力を増加させる方法であって、p53チェックポイ
ントを可逆的に回避する薬を細胞内へ供給する工程を含む方法に関する。The present invention also relates to a method of increasing the proliferative capacity of cells, which comprises the step of providing intracellularly a drug that reversibly bypasses the p53 checkpoint.

【００３６】 本発明の実施には、別記しない限り、当業者に知られている、細胞生物学、細
胞培養、分子細胞学、遺伝子導入生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、および免疫
学の従来の技法が用いられる。そのような技法は文献に記載されている。例えば
、Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed., ed. by Sambrook, Frits
ch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Pres: 1989); DNA Cloning,
Volumes I and II (D.N.Glover ed., 1985); Oligonucleotide Synthesis (M.J
.Gait ed., 1984); Mullis et al. U.S.Patnet No.4,683,195; Nulceic Acid Hy
bridization (B.D.Hames & S.J.Higgins eds. 1984); Transcription And Trans
lation (B.D.Hames & S.J.Higgins eds. 1984); Culture Of Animal Cells (R.I
.Freshney, Alan R.Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL
Press, 1986); B.Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); t
he treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Gene Tr
ansfer Vectors For Mammalian Cells (J.H.Miller and M.P.Calos eds., 1987,
Cold Spring Harbor Laboratory); Methods In Enzymology, Vols. 154 and 15
5 (Wu et al. eds.), Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology
(Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Handbook Of Exp
erimental Immunology, Volumes I-IV (D.M.Weir and C.C.Blackwell, eds., 19
86); Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press
, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986)を参照のこと。The practice of the present invention, unless otherwise indicated, is conventional in cell biology, cell culture, molecular cytology, gene transfer biology, microbiology, recombinant DNA, and immunology, as is known to those skilled in the art. Is used. Such techniques are described in the literature. For example, Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed., Ed. By Sambrook, Frits
ch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Pres: 1989); DNA Cloning,
Volumes I and II (DNGlover ed., 1985); Oligonucleotide Synthesis (MJ
.Gait ed., 1984); Mullis et al. USPatnet No. 4,683,195; Nulceic Acid Hy
bridization (BDHames & SJHiggins eds. 1984); Transcription And Trans
lation (BDHames & SJHiggins eds. 1984); Culture Of Animal Cells (RI
.Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL
Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); t
he treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., NY); Gene Tr
ansfer Vectors For Mammalian Cells (JHMiller and MPCalos eds., 1987,
Cold Spring Harbor Laboratory); Methods In Enzymology, Vols. 154 and 15
5 (Wu et al. Eds.), Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology
(Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Handbook Of Exp
erimental Immunology, Volumes I-IV (DMWeir and CCBlackwell, eds., 19
86); Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press
, Cold Spring Harbor, NY, 1986).

【００３７】発明の詳細な説明 (i) 概観 p53タンパク質は、細胞増殖の負の制御、ゲノム安定性の維持および形質転換
と腫瘍形成の抑制において重要な役割を有する。p53遺伝子産物は、DNA損傷に続
く細胞周期の停止またはアポトーシスを誘発することにより有害性突然変異の蓄
積を防ぐ作用をする。腫瘍抑制におけるp53の重要性は、p53中の突然変異がヒト
腫瘍中で最も一般的な遺伝子交代であることの観察により強調される。p53は、
突然変異から独立した機構により機能的に不活性化することもできる。腫瘍の一
部においては、野生型p53は、異常な非細胞局在または安定性の減少により不活
性化される。 Detailed Description of the Invention (i) Overview The p53 protein plays an important role in negative regulation of cell growth, maintenance of genomic stability and suppression of transformation and tumorigenesis. The p53 gene product acts to prevent the accumulation of deleterious mutations by inducing cell cycle arrest or apoptosis following DNA damage. The importance of p53 in tumor suppression is highlighted by the observation that mutations in p53 are the most common gene alternation in human tumors. p53 is
It can also be functionally inactivated by a mutation-independent mechanism. In some tumors, wild-type p53 is inactivated due to aberrant non-cellular localization or decreased stability.

【００３８】 p53活性の調節因子を同定するために、発現されるとp53媒介成長停止を回避で
きる遺伝子を同定するためのスクリーニングを行った。図２および米国特許出願
第08/820931号参照。簡単に言えば、内因性のp53遺伝子を欠失しているマウス胚
繊維芽細胞(MEF)（p53ノックアウトマウスから）を、蛍光標識されたp53タンパ
ク質(GFP- p53)を条件付きで発現するように処理した。活性化されると、蛍光の
p53は核に限局化され、細胞周期の停止を強める。cDNAライブラリによってコー
ドされるp53活性の負の調節因子を同定するために、表現型に基づくスクリーニ
ングにおいてこの細胞系を使用した。p53誘発によりもはや抑制されなかった細
胞は、コロニーを生じた。p53停止を回避できたcDNAを単離し、塩基配列を分析
した。繰り返し発生したクローンは、マクロファージ遊走阻止因子(MIF)であっ
た。配列番号１（核酸）および配列番号２（タンパク質）を参照。To identify modulators of p53 activity, a screen was performed to identify genes that, when expressed, could evade p53-mediated growth arrest. See FIG. 2 and US patent application Ser. No. 08/820931. Briefly, mouse embryonic fibroblasts (MEFs) lacking the endogenous p53 gene (from p53 knockout mice) were conditionally expressed with fluorescently labeled p53 protein (GFP-p53). Processed. When activated,
p53 is localized to the nucleus and enhances cell cycle arrest. This cell line was used in a phenotype-based screen to identify negative regulators of p53 activity encoded by the cDNA library. Cells that were no longer suppressed by p53 induction gave rise to colonies. A cDNA that could avoid p53 termination was isolated and analyzed for its nucleotide sequence. The recurrent clone was macrophage migration inhibitory factor (MIF). See SEQ ID NO: 1 (nucleic acid) and SEQ ID NO: 2 (protein).

【００３９】 多くの刊行物に、推定MIF分子の単離および同定が報告されてきた。例えば、M
IF-1は、F5と称されるヒトT細胞ハイブリドーマクローンの血清のない培養の上
澄みから均質に精製された(Oki et al.(1991)Lymphokine Cytokine Res. 10:273
-80)。また、MIF-1より疎水性であるMIF-2は、同じクローンから均質に精製され
た(Hirose et al.(1991)Microbiol.Immunol.35:235-45)。リンパ球遊走阻止因子
(LyMIF)もまた同定された(Masayuma et al.(1984)Cell Immunol 85:154-67)。MI
Fは、抗原、マイトジェン等により刺激されるとリンパ球および単球またはマク
ロファージにより分泌される生物学的に活性のある可溶性のポリペプチドを含む
、リンフォカインと称される群に属する。当該技術の既知の状態によると、ヒト
MIFは、マクロファージの遊走能力を抑制するポリペプチドの一群からなる。ヒ
トMIFは、活性化されたリンパ球、T細胞およびB細胞、並びに例えば増殖中の繊
維芽細胞およびある腫瘍細胞のような非リンパ球様細胞によって分泌される。MI
Fは、γ−インターフェロン、マクロファージ活性化因子(MAF)および他のリンフ
ォカインとはっきり区別できる。Many publications have reported the isolation and identification of putative MIF molecules. For example, M
IF-1 was homogeneously purified from the serum-free culture supernatant of a human T cell hybridoma clone designated F5 (Oki et al. (1991) Lymphokine Cytokine Res. 10: 273 .
-80). In addition, MIF-2, which is more hydrophobic than MIF-1, was purified to homogeneity from the same clone (Hirose et al. (1991) Microbiol. Immunol . 35: 235-45). Lymphocyte migration inhibitory factor
(LyMIF) has also been identified (Masayuma et al. (1984) Cell Immunol 85: 154-67). MI
F belongs to the group called lymphokines, which comprises soluble, biologically active polypeptides secreted by lymphocytes and monocytes or macrophages when stimulated by antigens, mitogens and the like. According to the known state of the art, humans
MIF consists of a group of polypeptides that suppress the migration ability of macrophages. Human MIF is secreted by activated lymphocytes, T cells and B cells, and non-lymphoid cells such as proliferating fibroblasts and certain tumor cells. MI
F is clearly distinguishable from γ-interferon, macrophage activating factor (MAF) and other lymphokines.

【００４０】 ヒトMIFは、炎症反応の初期に非常に重要な役割を果たす（「遅延型過敏症反
応」）。これは、炎症性マクロファージを成熟させるために単球と静態組織マク
ロファージの分化を誘発する。従って、ヒトMIFおよび関連タンパク質は、炎症
性の状態に対し重要な標識である。Human MIF plays a very important role early in the inflammatory response (“delayed hypersensitivity reaction”). This induces monocyte and static tissue macrophage differentiation to mature inflammatory macrophages. Therefore, human MIF and related proteins are important markers for inflammatory conditions.

【００４１】 MIFは当初サイトカインとして同定されたので、途中で（in trans.）加えられ
た際に機能する能力についてテストした。使用された特定の分析法は、p53の機
能、つまり始原繊維芽細胞の寿命を延長する能力の標準的な分析法である。MIF
の供給源として、マルトース結合タンパク質-MIF融合(MBP-MIF)を作成し、E.Col
i中で発現させ、該融合タンパク質を親和力により精製し、MIFポリペプチド鎖を
放出するように開裂した。後期継代（ちょうど前老化を示した）のマウスの繊維
芽細胞の培養物を、２００ng/mlの組換え型MIFの存在下または非存在下で新しい
培養プレート中に分配し、１５日間増殖させた。組織培養培地は、３日毎に新し
い培地（適切にMIFを含有する）と取り替えた。非常に多くのコロニーが、培地
中にMIFを含有するプレート上で形成されたのに対し、MIFの非存在下で増殖した
細胞についてはコロニーは観察されなかった。図３参照。Since MIF was originally identified as a cytokine, it was tested for its ability to function when added in trans. The particular assay used is a standard assay for p53 function, the ability to prolong the life of primordial fibroblasts. MIF
As a source of E.Col, a maltose-binding protein-MIF fusion (MBP-MIF) was created.
Expressed in i, the fusion protein was affinity purified and cleaved to release the MIF polypeptide chain. Cultures of mouse fibroblasts at late passage (just showing pre-senescence) were distributed in new culture plates in the presence or absence of 200 ng / ml recombinant MIF and grown for 15 days. It was The tissue culture medium was replaced with fresh medium (appropriately containing MIF) every 3 days. Very large numbers of colonies were formed on plates containing MIF in the medium, whereas no colonies were observed for cells grown in the absence of MIF. See FIG.

【００４２】 始原MEFSの寿命を延長するための容量反応を、0ng, 25ng, 50ng, 75ng, 100ng
, 150ng, 200ng, 300ng, 400ng, 600ngのMIF/ml培地を使用する実験において分
析した。これらの条件下で、150ng/mlが最適濃度であることがわかった。The dose response for prolonging the life of primordial MEFS was adjusted to 0ng, 25ng, 50ng, 75ng, 100ng.
, 150 ng, 200 ng, 300 ng, 400 ng, 600 ng of MIF / ml medium were analyzed in experiments. Under these conditions, 150 ng / ml was found to be the optimal concentration.

【００４３】 本発明は、途中での腫瘍抑制因子の増殖停止表現型を機能的に不活性化できる
天然タンパク質の最初の実施例であることを、本出願人は理解している。さらに
、本出願人が知る限りでは、本発明は、途中で始原細胞の寿命を延長できる分子
の最初の実施例である。さらに、MIFは全身的におよび局所的に前炎症性の役割
を有すると同定されたので、本発明の観察は、炎症の分野と腫瘍生物学との間を
つなぐ。Applicants understand that the present invention is the first example of a native protein capable of functionally inactivating the growth arrest phenotype of a tumor suppressor in the middle. Moreover, to the knowledge of the Applicant, the present invention is the first example of a molecule that can prolong the life of progenitor cells along the way. Furthermore, since MIF has been identified to have a proinflammatory role systemically and locally, the observations of the present invention bridge the field of inflammation and tumor biology.

【００４４】 本発明の１つの態様は、細胞の寿命、例えば有糸***の数、を延長させる方法
および試薬に関する。通常、本発明の方法は、MIFタンパク質、生物活性フラグ
メントまたはそのペプチド擬態物の異所性発現または施用、または以下に示され
る他の「MIF治療」に依存する。「異所性発現」とは、例えば異種または内因性
の遺伝子の発現により、細胞が通常特定の起始表現型について発現するMIFの正
常なレベルより高く、細胞にMIFを発現させることを意味する。本発明の方法は
、インビボ、半ビボおよびインサイチュの全てにおいて有用である。単に説明の
ための、実施例としての使用には、幹細胞または始原細胞の培養物または移植組
織の増殖、皮膚または他の上皮細胞の培養物または移植組織の増殖、間葉細胞の
培養物または移植組織の増殖、および軟骨細胞または骨細胞の培養物または移植
組織の増殖が含まれる。本発明の方法により増殖できる例としての幹細胞および
始原細胞には、神経細胞、造血細胞、膵細胞、および肝の幹細胞および始原細胞
が含まれる。本発明の方法およびMIFの組成物は、美容上も使用できる。One aspect of the invention pertains to methods and reagents that prolong the lifespan of cells, eg, the number of mitosis. Generally, the methods of the invention rely on ectopic expression or application of MIF proteins, bioactive fragments or peptidomimetics thereof, or other "MIF treatments" as described below. By "ectopic expression" is meant causing a cell to express MIF above the normal level of MIF that a cell normally expresses for a particular origin phenotype, for example by expression of a heterologous or endogenous gene. . The methods of the invention are useful in vivo, ex vivo and in situ. Merely by way of example, use is made of stem cell or progenitor cell cultures or transplant tissue growth, skin or other epithelial cell culture or transplant tissue growth, mesenchymal cell cultures or transplants. Includes tissue growth and growth of chondrocyte or osteocyte cultures or transplants. Exemplary stem cells and progenitor cells that can be expanded by the methods of the invention include neural cells, hematopoietic cells, pancreatic cells, and hepatic stem cells and progenitor cells. The method of the invention and the composition of MIF can also be used cosmetically.

【００４５】 本発明のMIF治療は、これらの状態で苦しめられるヒトおよび動物被験者のど
ちらでも有効である。本発明を適用できる動物被験者は、ペットとしてまたは商
業目的のために育てられた、家庭の動物および家畜にまで広がる。実施例は、イ
ヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタおよびヤギである。The MIF treatments of this invention are effective in both human and animal subjects afflicted with these conditions. Animal subjects to which the present invention is applicable extend to domestic animals and livestock raised as pets or for commercial purposes. Examples are dogs, cats, cows, horses, sheep, pigs and goats.

【００４６】 (ii)定義 都合上、ここで用いた特定の用語を以下のように定義する。[0046] (ii) Definition   For convenience, the specific terms used herein are defined as follows.

【００４７】 ここで用いたように、「核酸」という用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）
、および適切な場合には、リボ核酸（ＲＮＡ）のようなポリヌクレオチドを称す
る。この用語は、等価物として、ヌクレオチド類似体から生成されたＲＮＡまた
はＤＮＡの類似体、並びに、説明されている実施の形態に適用できるように、一
本鎖（センスまたはアンチセンスのような）および二本鎖ポリヌクレオチドを含
むものと理解すべきである。As used herein, the term “nucleic acid” refers to deoxyribonucleic acid (DNA)
, And, where appropriate, polynucleotides such as ribonucleic acid (RNA). The term is equivalent to RNA or DNA analogs produced from nucleotide analogs, as well as single-stranded (such as sense or antisense) and, as applicable to the described embodiments. It should be understood to include double-stranded polynucleotides.

【００４８】 ここで用いたように、「遺伝子」または「組換え遺伝子」という用語は、エク
ソン配列および（必要に応じて）イントロン配列の両方を含む、ポリペプチドを
コードするオープンリーディングフレームを含む核酸を称する。本発明のMIFタ
ンパク質をコードする例示の組換え遺伝子が配列番号１により示される。As used herein, the term “gene” or “recombinant gene” refers to a nucleic acid containing an open reading frame encoding a polypeptide that includes both exon sequences and (optionally) intron sequences. Is called. An exemplary recombinant gene encoding a MIF protein of the invention is shown by SEQ ID NO: 1.

【００４９】 ここで用いたように、「トランスフェクション」という用語は、核酸媒介遺伝
子転移により、異種核酸、例えば、発現ベクターの受容体細胞中への導入を意味
する。「トランスフォーメーション」は、転移された核酸に関してここに用いた
ように、外因性ＤＮＡまたはＲＮＡの細胞取込みの結果として、細胞の遺伝子型
が変わり、かつ、例えば、トランスフォーメーションされた細胞が本発明のMIF
ポリペプチドの組換え形態を発現する過程を称する。As used herein, the term “transfection” means the introduction of a heterologous nucleic acid, eg, an expression vector, into a recipient cell by nucleic acid-mediated gene transfer. "Transformation", as used herein with respect to transferred nucleic acids, changes the genotype of the cell as a result of cellular uptake of exogenous DNA or RNA, and, for example, transformed cells are referred to in the present invention. MIF
Refers to the process of expressing a recombinant form of a polypeptide.

【００５０】 「発現ベクター」は、所望のタンパク質をコードし、mRNA中に転写されタンパ
ク質に翻訳される所望のタンパク質（この場合、本発明のMIFタンパク質）をコ
ードするDNA配列(2)に機能できるように結合した、遺伝子発現において調節の役
割を有する遺伝要素(1)、例えば、プロモータ、オペレータ、またはエンハンサ
ー、および(3)適切な転写および翻訳の開始並びに終了配列のアセンブリを含む
転写ユニットを含むDNAを発現するのに用いられる複製可能なDNA構成物を称する
。プロモータおよび他の調節要素の選択は、一般的に、意図する宿主細胞に従っ
て異なる。一般的に、組換えDNA技法において役立つ発現ベクターは、しばしば
、それらのベクター形態においては染色体に結合していない環状二本鎖ＤＮＡル
ープを称する「プラスミド」の形態にある。本明細書においては、「プラスミド
」および「ベクター」は、プラスミドが最も日常的に用いられているベクターの
形態であるので、互換で用いられる。しかしながら、本発明は、同等の機能を果
たし、これまで当該技術において知られた発現ベクターの他の形態を含むことも
意図している。An “expression vector” is capable of functioning with a DNA sequence (2) that encodes the desired protein and encodes the desired protein (in this case, the MIF protein of the invention) that is transcribed into mRNA and translated into the protein. A genetic element having a regulatory role in gene expression, such as a promoter, an operator, or an enhancer, and (3) a transcription unit containing an assembly of appropriate transcription and translation initiation and termination sequences. Refers to the replicable DNA construct used to express DNA. The choice of promoter and other regulatory elements generally depends on the intended host cell. In general, expression vectors useful in recombinant DNA technology are often in the form of "plasmids" which refer to circular double stranded DNA loops which in their vector form are not bound to the chromosome. In the present specification, "plasmid" and "vector" are used interchangeably as the plasmid is the most commonly used form of vector. However, the present invention is also intended to include other forms of expression vectors that serve equivalent functions and are heretofore known in the art.

【００５１】 発現ベクターにおいて、転写または翻訳を制御する調節要素は一般的に、ほ乳
類、微生物、ウイルスまたは昆虫の遺伝子由来であって差し支えない。通常複製
の起点(origin)により与えられる、宿主中で複製する能力、および形質転換体の
認識を促進させる選択遺伝子が、追加に含まれていてもよい。レトロウイルス、
アデノウイルス等のようなウイルス由来のベクターを用いてもよい。In the expression vectors, the regulatory elements that control transcription or translation may generally be derived from mammalian, microbial, viral or insect genes. The ability to replicate in a host, usually conferred by an origin of replication, and a selection gene that facilitates recognition of transformants may additionally be included. Retrovirus,
A virus-derived vector such as adenovirus may be used.

【００５２】 「転写調節配列」は、機能できるように結合したタンパク質暗号配列の転写を
誘発または制御する、開始シグナル、エンハンサー、およびプロモータ等のよう
なDNA配列を称するために本明細書全体に亘り用いられている遺伝用語である。
好ましい実施の形態において、MIF遺伝子の転写は、発現が意図された細胞の種
類中における組換え遺伝子の発現を制御するプロモータ配列（または他の転写調
節配列）の制御下にある。組換え遺伝子は、MIFタンパク質の天然に存在する形
態の内の１つの転写を制御するそれらの配列と同じかまたは異なる転写調節配列
の制御下にあっても差し支えないことも理解されよう。“Transcriptional regulatory sequence” is used throughout the specification to refer to DNA sequences, such as initiation signals, enhancers, promoters, etc., that induce or control transcription of an operably linked protein coding sequence. It is a genetic term used.
In a preferred embodiment, transcription of the MIF gene is under the control of a promoter sequence (or other transcriptional regulatory sequence) that controls expression of the recombinant gene in the cell type for which it is intended. It will also be appreciated that the recombinant gene may be under the control of transcriptional regulatory sequences that are the same or different from those sequences that control transcription of one of the naturally occurring forms of the MIF protein.

【００５３】 ここで用いたように、「組織特異的プロモータ」という用語は、プロモータと
して機能する、すなわち、該プロモータに機能できるように結合した選択された
ＤＮＡ配列の発現を調節し、かつ、尿生殖器起源の細胞、例えば、腎細胞、また
は神経起源の細胞、例えば、神経細胞のような、ある組織の特定の細胞中の選択
されたＤＮＡ配列の発現を行うＤＮＡ配列を意味する。この用語はまた、主に１
つの組織中において選択されたＤＮＡの発現を調節するが、同様に他の組織にお
いては発現を生じるいわゆる「漏出性」プロモータも包含する。As used herein, the term “tissue-specific promoter” functions as a promoter, that is, regulates the expression of a selected DNA sequence operably linked to the promoter, and By a DNA sequence that effects the expression of a selected DNA sequence in a particular cell of a tissue, such as cells of genital origin, eg, kidney cells, or cells of neural origin, eg, neurons. This term is also mainly 1
Also included are so-called "leaky" promoters that regulate expression of selected DNA in one tissue, but likewise cause expression in other tissues.

【００５４】 「機能できるように結合した」とは、２つのＤＮＡ領域の間の関係を説明する
ときに、それらの領域が互いに機能的に関連していることを意味する。例えば、
プロモータまたは他の転写調節配列は、それがある暗号配列の転写を制御する場
合には、その暗号配列に機能できるように結合している。By "operably linked" is meant, when describing the relationship between two DNA regions, those regions being functionally related to each other. For example,
A promoter or other transcriptional regulatory sequence is operably linked to a coding sequence if it controls the transcription of the coding sequence.

【００５５】 「MIFタンパク質」および「MIFポリペプチド」という用語は、ここに記載され
るような生物活性を有する関連ポリペプチドの系統群を称する。例としてのMIF
タンパク質は、配列番号１の核酸、またはそれに対してハイブリッド形成する核
酸によりコードされる。したがって、本発明の方法に有用なMIFタンパク質は、
配列番号２のヒトMIF、または宿主細胞（ヒト細胞のような）中のテロメラーゼ
伸長酵素を再構成するその断片に対して、少なくとも60％、65％、70％、75％、
80％、85％、90％、または少なくとも95％も同一であり得る。例えば、配列番号
１に対して配列および／または長さが異なってもよい、特定のMIFポリペプチド
の活性を評価するための様々な異なる技法が当該技術において利用できる。The terms “MIF protein” and “MIF polypeptide” refer to a family of related polypeptides that have biological activity as described herein. MIF as an example
The protein is encoded by the nucleic acid of SEQ ID NO: 1 or a nucleic acid that hybridizes thereto. Thus, MIF proteins useful in the methods of the invention include:
At least 60%, 65%, 70%, 75%, relative to human MIF of SEQ ID NO: 2 or a fragment thereof that reconstitutes telomerase elongase in a host cell (such as a human cell),
It can also be 80%, 85%, 90%, or at least 95% identical. A variety of different techniques are available in the art for assessing the activity of a particular MIF polypeptide, which may vary in sequence and / or length with respect to SEQ ID NO: 1, for example.

【００５６】 ここで用いたように、「融合タンパク質」という用語は、当該技術において認
識されており、２つ以上の異なるタンパク質から由来したアミノ酸配列を含む一
本鎖タンパク質として少なくとも最初に発現されたキメラタンパク質を称する。
例えば、融合タンパク質は融合遺伝子の遺伝子産物である。As used herein, the term “fusion protein” is art-recognized and initially expressed at least initially as a single chain protein that comprises amino acid sequences derived from two or more different proteins. Refers to a chimeric protein.
For example, a fusion protein is the gene product of a fusion gene.

【００５７】 「MIF治療薬」という用語は、p53チェックポイントのMIFに誘発されるバイパ
スを模倣または強化できる（作用薬）またはp53のMIFに誘発されるバイパスを抑
制できる（拮抗薬）タンパク質、ペプチド、小さい有機分子、核酸等のような因
子を称する。The term “MIF therapeutic agent” refers to a protein, peptide capable of mimicking or enhancing MIF-induced bypass of the p53 checkpoint (agonist) or inhibiting MIF-induced bypass of p53 (antagonist). , Small organic molecules, nucleic acids, etc.

【００５８】 「始原細胞」という用語は、次に、分化された、または分化可能な娘細胞を産
生できる多数の母細胞を産生する能力を有するより始原の細胞を産生している、
増殖できる未分化細胞を称する。ここに用いたように、「始原細胞」という用語
は、当該技術分野において「幹細胞」と称されることもある細胞を包含すること
も意図している。好ましい実施の形態において、「始原細胞」という用語は、胚
細胞および組織の進行性多様化において生じるように、その子孫（後代）が、し
ばしば異なる方向に、分化により、例えば、完全に個別の特徴を得ることにより
、特殊化(specialize)する一般化された母細胞を称する。The term “progenitor cell” is then producing a more progenitor cell that is capable of producing a large number of mother cells capable of producing differentiated or differentiable daughter cells,
Refers to undifferentiated cells that can proliferate. As used herein, the term "progenitor cell" is also intended to include cells that are sometimes referred to in the art as "stem cells." In a preferred embodiment, the term "progenitor cell" refers to the fact that its progeny (progeny), often in different directions, due to differentiation, eg, completely distinct characteristics, as occurs in the progressive diversification of germ cells and tissues. By obtaining, we refer to a generalized mother cell that is specialized.

【００５９】 ここに用いたように、始原細胞に関して、「実質的に純粋」という用語は、全
細胞個体群を構成する始原細胞に関して、少なくとも約75％、好ましくは、少な
くとも約85％、より好ましくは、少なくとも約90％、最も好ましくは、少なくと
も約95％純粋な始原細胞の個体群を称する。言い換えれば、「実質的に純粋」と
いう用語は、後の培養および増幅前の元の増幅されていない単離された個体群に
おいて、約20％より少ない、より好ましくは、約10％より少ない、最も好ましく
は約５％より少ない系列の関連した（lineage committed）細胞を含有する本発
明の始原細胞の個体群を称する。As used herein, with respect to progenitor cells, the term “substantially pure” refers to progenitor cells that make up the total cell population, at least about 75%, preferably at least about 85%, more preferably Refers to a population of progenitor cells that is at least about 90%, and most preferably at least about 95% pure. In other words, the term "substantially pure" means less than about 20%, more preferably less than about 10% in the original unamplified isolated population prior to culture and amplification. Most preferably it refers to a population of progenitor cells of the invention which contains less than about 5% of lineage committed cells.

【００６０】 「化粧品」という用語は、局所投与のために配合された製剤調製物の形態を称
する。The term “cosmetics” refers to the form of pharmaceutical preparations formulated for topical administration.

【００６１】 ここで用いたように、「細胞組成物」という用語は細胞の調製物を称し、この
調製物は、細胞に加えて、細胞培養培地のような非細胞成分、例えば、タンパク
質、アミノ酸、核酸、ヌクレオチド、補酵素、抗酸化剤、金属等を含んでもよい
。さらに、細胞組成物は、細胞成分の増殖または生存度に影響を与えないが、細
胞を特定の形式で、例えば、被包のためのポリマーマトリクスまたは製剤調製物
として提供するのに用いられる成分を有していても差し支えない。As used herein, the term “cellular composition” refers to a preparation of cells that includes, in addition to cells, non-cellular components such as cell culture media, such as proteins, amino acids. , Nucleic acids, nucleotides, coenzymes, antioxidants, metals and the like. In addition, the cell composition does not affect the growth or viability of the cellular components, but does include components used to provide the cells in a particular format, for example, as a polymeric matrix for encapsulation or as a pharmaceutical preparation. You can have it.

【００６２】 「上皮の」、「上皮に関する」および「上皮」という用語は、腺およびそれか
ら由来する他の構造、例えば、角膜、食道、表皮、および毛包の上皮細胞を含む
、内外の体表面（皮膚、粘液および漿液）の細胞被覆を称する。他の例としての
上皮組織としては：鼻腔の嗅覚領域を覆い、嗅覚の受容体を含有する多列上皮で
ある嗅上皮；分泌細胞からなる上皮を称する腺上皮；平坦板状細胞からなる上皮
を称する扁平上皮が挙げられる。この上皮という用語は、収縮および拡張のため
に大きな機械的変化にさらされる内層中空器官であることが特徴的に分かった移
行上皮、例えば、重層扁平上皮と円柱上皮との間で移行する組織を称することも
ある。The terms “epithelial,” “with respect to epithelium,” and “epithelial” refer to internal and external body surfaces, including epithelial cells of the glands and other structures derived therefrom, such as the cornea, esophagus, epidermis, and hair follicles. Refers to the cell coating (skin, mucus and serum). Other examples of epithelial tissues are: the olfactory epithelium, which is a multi-row epithelium that covers the olfactory region of the nasal cavity and contains olfactory receptors; the glandular epithelium, which refers to the epithelium of secretory cells; the epithelium of flat plate cells. The squamous epithelium referred to is mentioned. The term epithelium refers to transitional epithelium that has been shown to be an inner lining hollow organ that is subject to large mechanical changes due to contraction and expansion, such as tissue transitioning between stratified squamous epithelium and columnar epithelium. Sometimes called.

【００６３】 「上皮形成」という用語は、表皮剥脱表面の上に上皮細胞が増殖することによ
り治癒されることを称する。The term “epithelialization” refers to healing by the growth of epithelial cells on the exfoliated surface.

【００６４】 「皮膚」という用語は、真皮および表皮からなる、体の外側の保護被覆を称し
、汗腺および皮脂腺、並びに毛包構造を含むと理解されている。本出願全体に亘
り、形容詞の「皮膚の」を用いてもよく、これは一般的に、その用語が用いられ
る文脈に適切であるように、皮膚の属性を称する。The term “skin” refers to a protective coating on the outside of the body consisting of the dermis and epidermis and is understood to include sweat glands and sebaceous glands, as well as hair follicle structures. Throughout this application, the adjective “skin” may be used, which generally refers to the attribute of skin as appropriate to the context in which the term is used.

【００６５】 「表皮」という用語は、胚体外胚葉由来の、0.07mmから1.4ｍｍまでの厚さで
変動する皮下の最も外側にある血管のない層を称する。手掌側面および足底側面
において、表皮は、外側に向かって、垂直に配置された円柱細胞からなる基底層
；短い突起または棘を有する平坦多面細胞からなる有棘細胞層または棘層；平坦
顆粒細胞からなる顆粒層；核が識別されないか含まれない透き通った透明細胞の
いくつかの層からなる透明層；および平坦な角質の非有核細胞からなる角質層か
らなる。一般的な体表面の表皮において、透明層は通常ない。The term “epidermis” refers to the subcutaneous outermost, avascular layer, derived from ectoderm, varying in thickness from 0.07 mm to 1.4 mm. On the palmar and plantar sides, the epidermis is the basal layer consisting of columnar cells arranged vertically toward the outside; spinous cell layer or spinous layer consisting of flat multifaceted cells with short processes or spines; flat granule cells Consists of several layers of clear, transparent cells in which the nuclei are not discerned or contained; and a stratum corneum composed of flat, horny, non-nucleated cells. In common body surface epidermis there is usually no transparent layer.

【００６６】 「真皮」は、血管が繋がった組織の密な層からなり、神経および感覚の末端器
官を含有する表皮までの深さの皮膚の層を称する。毛根、および皮脂腺と汗腺は
、真皮内に深く埋め込まれた表皮の構造である。“Dermis” refers to the layer of skin that consists of a dense layer of connected tissue, deep into the epidermis containing nerve and sensory end organs. The hair roots, and the sebaceous and sweat glands are structures of the epidermis that are deeply embedded within the dermis.

【００６７】 「爪」という用語は、指または足指の末端の背面上の角質皮膚板を称する。[0067]   The term "nail" refers to the keratinous skin plate on the dorsal surface of the end of the finger or toe.

【００６８】 「表皮腺」という用語は、表皮と結合し通常の代謝要求に関連しない物質を分
泌し排出するよう分化した細胞の集合を称する。例えば、「皮脂腺」は、油性物
質および皮脂を分泌する真皮中の全分泌腺である。「汗腺」という用語は、真皮
または皮下組織中に配置され、体表面上の管を開くことにより汗を分泌する腺を
称する。The term “epidermal gland” refers to a population of cells that have differentiated to secrete and excrete substances that are associated with the epidermis and are not associated with normal metabolic demand. For example, "sebum glands" are all glands in the dermis that secrete oily substances and sebum. The term "sweat glands" refers to glands that are located in the dermis or subcutaneous tissue and secrete sweat by opening ducts on the body surface.

【００６９】 「髪」という用語は、糸状構造、特に、ほ乳類のみにより生成され、その群の
動物に特徴的な、真皮内に埋没された毛乳頭から発生し、ケラチンからなる特殊
な表皮構造を称する。また、そのような髪の集まりも称する。「毛包」は、髪が
そこから成長する、髪を包囲する表皮の管状陥入を称し、「毛包表皮細胞」は、
毛包中の真皮毛乳頭を囲む表皮細胞、例えば、幹細胞、外根有鞘細胞、基質細胞
、および内根有鞘細胞を称する。そのような細胞は、正常な非悪性細胞、または
形質転換／非致死細胞であってもよい。The term “hair” refers to a filamentous structure, in particular a special epidermal structure composed of keratin, originating from the dermal papilla buried in the dermis, which is characteristic of the group of animals and which is characteristic of the group of animals. To call. Also, such a collection of hair is referred to. "Hair follicle" refers to the tubular invagination of the epidermis that surrounds the hair from which hair grows, and "hair follicle epidermal cells" are
It refers to the epidermal cells that surround the dermal papilla in the hair follicle, such as stem cells, outer root sheath cells, stroma cells, and inner root sheath cells. Such cells may be normal non-malignant cells or transformed / non-lethal cells.

【００７０】 「切除創傷」としては、皮膚の上皮層における断裂、擦過傷、切断、穿刺また
は破傷が挙げられ、真皮層中に、さらに皮下脂肪中かそれより深く延在していて
もよい。切除創傷は、外科処置または皮膚の偶発の穿通から生じることがある。“Excisional wounds” include tears, abrasions, cuts, punctures or ruptures in the epithelial layer of the skin, which may extend into the dermis layer and further into or below the subcutaneous fat. Excisional wounds may result from surgical procedures or accidental penetration of the skin.

【００７１】 「熱傷」は、熱および／または化学試薬のために個体から大きな表面積の皮膚
が除去されたかまたは失われた場合を称する。“Burn” refers to the case where a large surface area of skin has been removed or lost from an individual due to heat and / or chemical reagents.

【００７２】 「皮膚潰瘍」は、通常は炎症による、組織の表在損失により生じた皮膚の外傷
を称する。本発明の方法により治療できる皮膚潰瘍としては、褥瘡性潰瘍、糖尿
病性潰瘍、静脈鬱血性潰瘍および動脈性潰瘍が挙げられる。褥瘡性創傷は、長期
間に亘りある区域の皮膚に加えられた圧力から生じる慢性潰瘍を称する。この種
類の創傷はしばしば、床ずれまたは圧潰瘍(pressure sore)と称される。静脈鬱
血性潰瘍は、血液または欠損静脈からの他の流体の鬱血から生じる。動脈潰瘍は
、血流が乏しい動脈の周りの区域の壊死皮膚を称する。“Skin ulcer” refers to a trauma to the skin caused by the superficial loss of tissue, usually due to inflammation. Skin ulcers treatable by the method of the present invention include decubitus ulcers, diabetic ulcers, venous stasis ulcers and arterial ulcers. Pressure ulcers refer to chronic ulcers that result from pressure exerted on the skin of an area for an extended period of time. Wounds of this type are often referred to as pressure sores or pressure sores. Venous stasis ulcers result from congestion of blood or other fluids from defective veins. Arterial ulcer refers to necrotic skin in the area around an artery with poor blood flow.

【００７３】 「眼組織に対する創傷」は、厳しいドライアイ症候群、角膜潰瘍および擦過傷
並びに眼科手術の創傷を称する。“Wounds on ocular tissue” refers to severe dry eye syndrome, corneal ulcers and abrasions and ophthalmic surgical wounds.

【００７４】 本出願全体に亘り、「増殖性皮膚障害」という用語は、所望でないまたは異常
な皮膚組織の増殖により示される皮膚の任意の病気/障害を称する。これらの状
態は、通常表皮細胞の増殖または不完全な細胞分化により特徴付けられ、例えば
X染色体性魚鱗癬、乾癬、アトピー性皮膚炎、アレルギー性接触性皮膚炎、表皮
剥離性角化症、および脂漏性皮膚炎を含む。例えば、表皮異形成は、表皮の不完
全な成長の形態である。別の例は「表皮剥離」であり、これは自発的にまたは外
傷の部位に小気胞および水疱を有する表皮の弛緩状態を称する。Throughout this application, the term “proliferative skin disorder” refers to any disease / disorder of the skin that is manifested by unwanted or abnormal growth of skin tissue. These conditions are usually characterized by epidermal cell proliferation or incomplete cell differentiation, eg
Includes chromosomal ichthyosis, psoriasis, atopic dermatitis, allergic contact dermatitis, epidermolytic keratoses, and seborrheic dermatitis. For example, epidermal dysplasia is a form of incomplete growth of the epidermis. Another example is "epidermabrasion", which refers to a laxative state of the epidermis that has small vesicles and blisters spontaneously or at the site of trauma.

【００７５】 「癌」という用語は、周りの組織を浸潤させ転移を起こす傾向にある上皮細胞
から形成される悪性の新増殖を称する。例としての癌は、ほとんど転移せずに、
局所侵入および破壊の可能性を有する、皮膚の上皮腫瘍である「基底細胞癌」；
扁平上皮から発生し立方細胞を有する癌を称する「扁平上皮癌」；癌性および肉
腫性組織からなる悪性腫瘍を含む「癌肉腫」；乳腺と唾液腺、および気道の粘液
腺中で生じる、小さい上皮細胞の巣または帯により分離されるまたは囲まれるヒ
アリンまたは粘液性支質の円柱または帯によって示される癌である「腺分泌細胞
癌」；表皮の癌性細胞と同じように分化する傾向にある、すなわち有棘細胞を形
成し角質化を受ける傾向にある癌性細胞を称する「類表皮癌」；鼻の後ろの空間
の上皮内層中に発生する悪性腫瘍を称する「鼻咽頭癌」；および様々の配置の管
状細胞からなる腎実質の癌を称する「腎細胞癌」を含む。別の癌性上皮増殖は、
上皮に由来し原因因子として乳頭腫ウイルスを有する良性腫瘍を称する「乳頭腫
」；および神経溝の閉鎖時における外胚葉エレメントの封入により形成される脳
腫瘍または脳脊髄膜腫瘍を称する「エピデルモイドマス（epidermoidomas）」で
ある。The term “cancer” refers to a malignant new growth made up of epithelial cells tending to infiltrate the surrounding tissues and give rise to metastases. Cancer as an example, with almost no metastases,
"Basal cell carcinoma", an epithelial tumor of the skin with the potential for local invasion and destruction;
“Squamous cell carcinoma”, which refers to cancer that originates from squamous epithelium and has cubic cells; “carcinosarcoma”, which includes malignant tumors composed of cancerous and sarcomatous tissues; small epithelium that occurs in the mammary glands and salivary glands, and mucus glands of the respiratory tract "Adenosecretory cell carcinoma", a cancer represented by hyaline or mucous stroma casts or bands separated or surrounded by a nest or band of cells; prone to differentiate in the same way as cancerous cells of the epidermis, "Epidermoid carcinoma", which refers to cancerous cells that form spiny cells and tend to undergo keratinization; "nasopharyngeal carcinoma", which refers to a malignant tumor that develops in the epithelial lining of the space behind the nose; and various Includes "renal cell carcinoma", which refers to cancer of the renal parenchyma that consists of arranged tubular cells. Another cancerous epithelial growth is
"Papilloma", which refers to a benign tumor that is derived from epithelium and has papilloma virus as a causative factor; and "epidermoid mass (cerebral or cerebrospinal membrane tumor, which is formed by encapsulation of ectodermal elements during nerve groove closure). epidermoidomas) ".

【００７６】 ここで用いたように、「乾癬」という用語は、皮膚の調節機構を変化させる超
増殖性皮膚障害を称する。特に、表皮増殖における第１および第２の変化、皮膚
の炎症性反応、およびリンフォカインと炎症性因子のような調節分子の発現を含
む外傷が形成される。乾癬性の皮膚は、形態学的には、表皮細胞の代謝回転の増
加、厚い表皮、異常な角質化、真皮層中への炎症性細胞の浸潤および基礎細胞周
期を増加させる表皮層中への多形核球の浸潤により特徴付けられる。さらに、過
角化および錯角化細胞が存在する。As used herein, the term “psoriasis” refers to a hyperproliferative skin disorder that alters the skin's regulatory mechanisms. In particular, lesions are formed that include first and second changes in epidermal proliferation, inflammatory reactions of the skin, and expression of regulatory molecules such as lymphokines and inflammatory factors. Psoriatic skin is morphologically characterized by increased epidermal cell turnover, thick epidermis, abnormal keratinization, infiltration of inflammatory cells into the dermal layer, and increased basal cell cycle into the epidermal layer. Characterized by infiltration of polymorphonuclear cells. In addition, there are hyperkeratotic and parakeratotic cells.

【００７７】 「角化症」という用語は、表皮の角質層の過形成により特徴付けられる増殖性
皮膚障害を称する。例としての角化性障害は、毛包性角化症、掌側および足底の
角化症、咽頭角化症、毛髪角化症、および光線性角化症を含む。The term “keratosis” refers to a proliferative skin disorder characterized by hyperplasia of the stratum corneum of the epidermis. Exemplary keratosis disorders include follicular keratoses, volar and plantar keratoses, pharyngeal keratoses, hair keratoses, and actinic keratoses.

【００７８】 ここで用いたように、「増殖している」および「増殖」とは、有糸***を受け
ている細胞を称する。As used herein, “proliferating” and “proliferation” refer to cells undergoing mitosis.

【００７９】 ここで用いたように、「形質転換された細胞」とは、非制限増殖の状態に自発
的に変化した、すなわち培養中の不定数の***を通して増殖する能力を獲得した
細胞を称する。形質転換された細胞は、増殖制御の喪失に関して、新生、退生お
よび/または増殖性のような用語により特徴付けられてもよい。As used herein, “transformed cell” refers to a cell that has spontaneously transformed into a state of unrestricted growth, ie, has acquired the ability to grow through an indefinite number of divisions in culture. . Transformed cells may be characterized by terms such as neoplastic, regenerative and / or proliferative with respect to loss of growth control.

【００８０】 ここで用いたように、「不朽化細胞」とは、細胞が培養中に不定数の***を通
して増殖する能力を有するように科学的および/または組換え方法によって変化
された細胞を称する。As used herein, “immortalized cell” refers to a cell that has been altered by scientific and / or recombinant methods so that the cell has the ability to proliferate in culture through an indefinite number of divisions. .

【００８１】 ここで用いたように、「動物」という用語は、ほ乳類、好ましくは、ヒトのよ
うなほ乳類を称する。同様に、本発明の方法により治療すべき「患者」または「
被験者」は、ヒトまたはヒト以外の動物のいずれをも意味することができる。As used herein, the term “animal” refers to mammals, preferably mammals such as humans. Similarly, a "patient" or "to be treated by the methods of the invention
"Subject" can mean either a human or a non-human animal.

【００８２】 細胞の「増殖状態」とは、細胞の増殖率および細胞の分化状態を称する。[0082]   The “proliferation state” of a cell refers to the proliferation rate of the cell and the differentiation state of the cell.

【００８３】 「相同性」および「同一性」とは、それぞれ、より厳密な比較である同一性を
有する、２つのポリペプチド配列の間の類似する配列を称する。相同性および同
一性はそれぞれ、比較の目的のために整合されるそれぞれの配列中の位置を比較
することにより測定されてもよい。比較された配列中の位置が同じアミノ酸残基
により占められている場合、ポリペプチドはその位置で同一であるということが
できる；相当する部位が同じアミノ酸（例えば同一の）または類似するアミノ酸
（例えば立体配置のおよび/または電子の性質において同様の）により占められ
ている場合、分子はその位置で相同であるということができる。配列間の相同性
または同一性のパーセンテージは、配列により共有される一致するまたは相同の
位置の数の相関関係である。「関連のない」または「非相同性の」配列は、本発
明のAR配列と４０％未満の同一性、好ましくは２５％未満の同一性を共有する。“Homology” and “identity” refer to similar sequences between two polypeptide sequences, each with a more strict comparison of identity. Homology and identity, respectively, may be measured by comparing the position in each sequence that is aligned for purposes of comparison. Polypeptides can be said to be identical at that position if the positions in the compared sequences are occupied by the same amino acid residue; the corresponding sites are the same amino acid (eg, identical) or similar amino acids (eg, Molecules can be said to be homologous at that position if they are occupied by a configuration and / or similar in electronic nature. The percentage of homology or identity between sequences is a function of the number of matching or homologous positions shared by the sequences. "Unrelated" or "heterologous" sequences share less than 40% identity with the AR sequences of the invention, preferably less than 25%.

【００８４】 (iii) 例としての用途 本発明の方法は、インビボ、インビトロおよび半ビボプロトコルの一部として
細胞の増殖能力および/または寿命を増大させるために使用することができる。
本発明の方法は任意の正常な細胞の種類に適用できるが、この方法は、好ましく
は、p53チェックポイントまたは他のチェックポイントを活性化する環境刺激に
遭った、またはこれから遭う正常な細胞を用いて実施する。本発明の目的に関し
て、「正常」という用語は、腫瘍細胞、癌細胞、または形質転換された細胞以外
の細胞を称する。例としての細胞は、Thomson et al. (1998) Science 282:1145
およびShamblott et al. (1998) PNAS 95:13726に開示されているような胚の幹
細胞である。本発明の方法に使用するのに特に好ましい細胞としては、任意の器
官の胚、胎児、新生児、および成人の幹細胞、並びに成人の多能性造血幹細胞が
挙げられる。(Iii) Example Uses The methods of the invention can be used to increase the proliferative capacity and / or longevity of cells as part of in vivo, in vitro and ex vivo protocols.
Although the method of the invention is applicable to any normal cell type, the method preferably uses normal cells that have been or will be subjected to environmental stimuli that activate the p53 checkpoint or other checkpoints. To implement. For the purposes of the present invention, the term "normal" refers to cells other than tumor cells, cancer cells, or transformed cells. Exemplary cells are described in Thomson et al. (1998) Science 282: 1145.
And embryonic stem cells as disclosed in Shamblott et al. (1998) PNAS 95: 13726. Particularly preferred cells for use in the methods of the invention include embryonic, fetal, neonatal, and adult stem cells of any organ, as well as adult pluripotent hematopoietic stem cells.

【００８５】 ある実施の形態において、前記細胞は幹および／または始原細胞である。これ
らの細胞としては、例えば、骨髄、可動化末梢血細胞、または臍帯血から由来す
る、造血幹細胞が挙げられる。他の実施の形態において、その細胞は、膵組織、
肝組織、または原腸由来の他の組織に関する始原細胞である。さらに他の実施の
形態において、前記幹細胞は、神経細胞または平滑筋細胞を形成するのに用いる
ことのできる神経冠のような神経幹細胞である。In one embodiment, the cells are stem and / or progenitor cells. These cells include, for example, hematopoietic stem cells derived from bone marrow, mobilized peripheral blood cells, or cord blood. In other embodiments, the cells are pancreatic tissue,
Progenitor cells for liver tissue, or other tissue of gastrointestinal origin. In yet another embodiment, the stem cells are neural stem cells, such as neural crests, that can be used to form neural cells or smooth muscle cells.

【００８６】 他の実施の形態において、前記細胞は幹細胞または始原細胞ではない。例えば
、それら細胞は、ほんの２，３の例を挙げると、膵β細胞、平滑筋細胞（または
筋細胞）、繊維芽細胞、リンパ球細胞、例えば、ＢまたはＴ細胞、骨細胞または
軟骨細胞のような関連した(committed)細胞である。In another embodiment, the cells are not stem cells or progenitor cells. For example, those cells include pancreatic β-cells, smooth muscle cells (or muscle cells), fibroblasts, lymphocytes, such as B or T cells, osteocytes or chondrocytes, to name but a few. Such committed cells.

【００８７】 本発明の方法はインビトロまたはインビボで用いても差し支えないが、本発明
は、半ビボでの細胞の培養に特別な用途があり、細胞が半ビボで培養され、次い
で、宿主に再導入される治療法に特に重要な利益を提供する。例えば、本発明の
方法は、採集されるかまたは培地中で他の様式で単離された細胞であって、患者
に移植すべき細胞の増殖能力を伸ばすのに用いることができる。Although the methods of the invention can be used in vitro or in vivo, the invention has particular application in culturing cells ex vivo, where the cells are cultured ex vivo and then re-introduced into the host. It provides particularly important benefits to the treatments introduced. For example, the methods of the invention can be used to enhance the proliferative capacity of cells that are harvested or otherwise isolated in culture and that are to be transplanted into a patient.

【００８８】 そのようなプロトコルは、骨髄または単離された造血始原細胞が、チェックポ
イントのバイパスが移植の前または直後に野生型表現型に戻される、本発明にし
たがって処理される骨髄移植に用途が見出されている。Such a protocol finds use in bone marrow transplants treated according to the invention wherein bone marrow or isolated hematopoietic progenitor cells are returned to a wild-type phenotype before or immediately after checkpoint bypass with transplantation. Have been found.

【００８９】 本発明の方法は、ＨＩＶまたはダウン症患者のＴ細胞の寿命を延ばすのに用い
ることもできる。The methods of the invention can also be used to extend the life of T cells in HIV or Down's syndrome patients.

【００９０】 本発明の方法には、例えば、幹細胞または関連細胞由来の、補綴装置のような
人工組織を形成するプロトコルにも用途がある。例としての組織としては、膵、
肝、神経、筋細胞、軟骨および骨の組織が挙げられる。The methods of the invention also have application in protocols for forming artificial tissues, such as prosthetic devices, from stem cells or related cells, for example. Examples of tissues include pancreas,
Includes liver, nerve, muscle cells, cartilage and bone tissue.

【００９１】 ある実施の形態においては、本発明の方法は、造血細胞および造血幹／始原細
胞の増殖能力を広げるのに用いることができる。ここで用いた「造血細胞」とい
う用語は、赤血球細胞、巨核球、単核細胞、顆粒細胞、および好酸球のような完
全に分化した骨髄性細胞、並びにＢリンパ球およびＴリンパ球のような完全に分
化したリンパ球系細胞を称する。したがって、造血幹／始原細胞の例としては、
ＢＦＵ−Ｅ（バースト形成単位赤血球：burst-forming units-erythroid）、Ｃ
ＦＵ−Ｅ（コロニー形成単位赤血球：colony forming unit-erythroid）、ＣＦ
Ｕ−Ｍｅｇ（コロニー形成単位巨核球：colony forming unit-megakaryocyte）
、ＣＦＵ−ＧＭ（コロニー形成単位顆粒細胞−単核細胞：colony forming unit-
granulocyte-monocyte）、ＣＦＵ−Ｅｏ（コロニー形成単位好酸球：colony for
ming unit-eosinophil）、およびＣＦＵ−ＧＥＭＭ（コロニー形成単位顆粒細胞
−赤血球−巨核球−単核細胞：colony forming unit-granulocyte-erythrocyte-
megakaryocyte-monocyte）のような、これらの分化細胞がそこから発生する様々
な造血前駆体細胞が挙げられる。In some embodiments, the methods of the invention can be used to expand the proliferative capacity of hematopoietic cells and hematopoietic stem / progenitor cells. The term "hematopoietic cell" as used herein refers to fully differentiated myeloid cells such as red blood cells, megakaryocytes, mononuclear cells, granulocytes, and eosinophils, as well as B and T lymphocytes. Fully differentiated lymphoid cells. Therefore, examples of hematopoietic stem / progenitor cells are:
BFU-E (burst-forming units-erythroid), C
FU-E (colony forming unit-erythroid), CF
U-Meg (colony forming unit-megakaryocyte)
, CFU-GM (colony forming unit-
granulocyte-monocyte), CFU-Eo (colony forming unit eosinophil: colony for
ming unit-eosinophil), and CFU-GEMM (colony forming unit-granulocyte-erythrocyte-).
various differentiated cells, such as megakaryocyte-monocyte), from which various hematopoietic progenitor cells originate.

【００９２】 別の実施の形態において、本発明の方法は、膵細胞および膵幹／始原細胞の増
殖能力を広げるのに用いることができる。「膵始原細胞」という用語は、膵系列
の細胞、例えば、膵細胞により通常産生されるホルモンまたは酵素を産生できる
細胞に分化できる細胞を称する。例えば、膵始原細胞は、少なくとも部分的に、
α、β、δ、またはφ膵島細胞、または外分泌運命の細胞に分化させられてもよ
い。本発明の膵始原細胞はまた、細胞の増殖および分化を促進させる条件下で被
験者に投与する前に培養できる。これらの条件は、細胞を培養して、偽膵島状凝
集体またはクラスターを形成し、インシュリン、グルカゴン、およびソマトスタ
チンを分泌するように細胞を産生できる時間で増殖および合流をインビトロで行
わせる工程を含む。In another embodiment, the methods of the invention can be used to expand the proliferative capacity of pancreatic cells and pancreatic stem / progenitor cells. The term "pancreatic progenitor cell" refers to a cell of the pancreatic lineage, eg, a cell that is capable of differentiating into a cell capable of producing the hormone or enzyme normally produced by a pancreatic cell. For example, pancreatic progenitor cells are, at least in part,
It may be differentiated into α, β, δ, or φ pancreatic islet cells, or cells of exocrine fate. The pancreatic progenitor cells of the invention can also be cultured prior to administration to a subject under conditions that promote cell proliferation and differentiation. These conditions include the step of culturing the cells to form pseudoislet aggregates or clusters and allowing them to proliferate and join in vitro for a time that allows the cells to produce so that they secrete insulin, glucagon, and somatostatin. .

【００９３】 膵臓の内分泌部分は、ランゲルハンスの膵島からなる。ランゲルハンスの島は
、外分泌膵臓内に埋め込まれる細胞の丸いクラスターとして現れる。４つの異な
る種類の細胞、α、β、δ、およびφがその膵島の中に同定される。α細胞は、
膵島中に見られる細胞の約20％を構成し、ホルモンのグルカゴンを産生する。グ
ルカゴンは、栄養補給の間の間隔で利用できるエネルギーを生成するためにいく
つかの組織に作用する。肝臓において、グルカゴンは、グリコーゲンを分解し、
アミノ酸前駆体からのグルコース新生を促進させる。δ細胞は、膵臓中で、グル
カゴンの放出を阻害し、膵外分泌を減少させるように機能するソマトスタチンを
産生する。ホルモンの膵ペプチドは、φ細胞中で産生される。このホルモンは、
重炭酸塩および酵素の膵外分泌を阻害し、胆嚢を弛緩させ、胆汁分泌を減少させ
る。前記細胞の60-80％を構成する、前記膵島内で最も豊富な細胞は、インシュ
リンを産生するβ細胞である。インシュリンは、栄養補給中またはその直後に行
われる過剰な栄養供給源を貯蔵することが知られている。インシュリンの主な標
的器官は、肝臓、筋肉、およびエネルギーの貯蔵に特化された脂肪器官である。The endocrine part of the pancreas consists of islets of Langerhans. Langerhans islets appear as round clusters of cells embedded within the exocrine pancreas. Four different cell types, α, β, δ, and φ, are identified within the islet. α cells are
It makes up about 20% of the cells found in the islets and produces the hormone glucagon. Glucagon acts on some tissues to produce energy available during the intervals between nutritional supplements. In the liver, glucagon breaks down glycogen,
Promotes gluconeogenesis from amino acid precursors. Delta cells produce somatostatin, which functions in the pancreas to inhibit glucagon release and reduce pancreatic exocrine secretion. The hormone pancreatic peptide is produced in φ cells. This hormone is
It inhibits pancreatic exocrine secretion of bicarbonates and enzymes, relaxes the gallbladder and reduces bile secretion. The most abundant cells in the islets, which make up 60-80% of the cells, are insulin-producing β-cells. Insulin is known to store excess nutrient sources that occur during or shortly after feeding. The insulin's main target organs are the liver, muscles, and the fatty organs, which are specialized for energy storage.

【００９４】 ある実施の形態において、本発明の薬は、移植された膵細胞、例えば、移植さ
れたβ膵島細胞の増殖能力を広げるのに用いられる。最近、治療に対する組織操
作アプローチが、通常、免疫拒絶を避けるために膜内に被包された、膵島の移植
に焦点を当ててきた。細胞を被包する多くの方法が当該技術において知られてい
る。例えば、インシュリンを産生するβ膵島細胞の供給源が、移植可能な中空繊
維内に被包される。そのような繊維は、予め紡ぎ、次いで、β膵島細胞を充填す
ることができる（Aebischer et al. 米国特許第4,892,538号; Aebischer et al.
米国特許第5,106,627号; Hoffman et al. (1990) Expt.Neurobiol. 110:39-44;
Jaeger et al. (1990) Prog.Brain Res. 82:41-46; and Aebischer et al. (19
91) J.Biomech.Eng. 113:178-183）、またはβ膵島細胞の周りにポリマーコート
を形成するように機能するポリマーとともに押し出すことができる（Lim 米国特
許第4,391,909号; Sefton 米国特許第4,353,888号; Sugamori et al. (1989) Tr
ans.Am.Artif.Intern.Organs 35:791-799; Sefton et al. (1987) Biotehnol.Bi
oeng. 29:1135-1143; and Aebischer et al. (1991) Biomaterials 12:50-55）
。In certain embodiments, the agents of the invention are used to expand the proliferative capacity of transplanted pancreatic cells, eg, transplanted β islet cells. Recently, tissue engineering approaches to therapy have focused on transplantation of islets, usually encapsulated in a membrane to avoid immune rejection. Many methods for encapsulating cells are known in the art. For example, a source of β-islet cells that produce insulin is encapsulated within implantable hollow fibers. Such fibers can be pre-spun and then loaded with β islet cells (Aebischer et al. US Pat. No. 4,892,538; Aebischer et al.
U.S. Pat.No. 5,106,627; Hoffman et al. (1990) Expt. Neurobiol. 110: 39-44;
Jaeger et al. (1990) Prog. Brain Res. 82: 41-46; and Aebischer et al. (19
91) J. Biomech. Eng. 113: 178-183), or can be extruded with a polymer that functions to form a polymer coat around β islet cells (Lim US Pat. No. 4,391,909; Sefton US Pat. No. 4,353,888). Issue; Sugamori et al. (1989) Tr
ans.Am.Artif.Intern.Organs 35: 791-799; Sefton et al. (1987) Biotehnol.Bi
oeng. 29: 1135-1143; and Aebischer et al. (1991) Biomaterials 12: 50-55).
.

【００９５】 上述した実施の形態のいずれにおいても、膵細胞は、半ビボでの本発明の方法
により処理できる、および／または装置が埋め込まれた動物に例えばMIF治療薬
をその後投与することによって本発明の方法により処理できる。そのような細胞
は、膵系列の細胞、例えば、β膵島細胞に分化できる能力を有するので、糖尿病
の治療に用いることができる。本発明の膵細胞は、さらにこれらの細胞の成熟膵
細胞への分化を誘発する条件下でインビトロで培養できる、または被験者中に一
度導入されたらインビボで分化を経験できる。In any of the embodiments described above, the pancreatic cells can be treated by the method of the invention ex vivo and / or by the subsequent administration of eg MIF therapeutic agent to the device-implanted animal. It can be processed by the method of the invention. Such cells have the ability to differentiate into cells of the pancreatic lineage, eg, β pancreatic islet cells, and thus can be used in the treatment of diabetes. The pancreatic cells of the invention can be further cultured in vitro under conditions that induce the differentiation of these cells into mature pancreatic cells, or they can undergo differentiation in vivo once introduced into a subject.

【００９６】 さらに、始原細胞の個体群またその分化した後代のいずれかの形態で、移植可
能な細胞の供給源を提供することに加えて、本発明の方法は、分泌された因子の
産生および精製用の培地を産生するために使用される正常な膵細胞の増殖能力を
広げるのに用いることができる。例えば、培養された細胞は、インシュリンの供
給源として提供することができる。同様に、外分泌培養物は、パンクレアチンの
供給源として提供することができる。Furthermore, in addition to providing a source of transplantable cells, either in the form of a population of progenitor cells or their differentiated progeny, the method of the invention provides for the production of secreted factors and It can be used to expand the proliferative capacity of normal pancreatic cells used to produce the medium for purification. For example, cultured cells can serve as a source of insulin. Similarly, exocrine cultures can serve as a source of pancreatin.

【００９７】 さらに別の実施の形態において、本発明の方法は、肝細胞および肝幹細胞の増
殖能力を広げるのに用いることができる。ここで用いた「肝始原細胞」という用
語は、肝実質細胞、例えば、肝細胞のような肝系列の細胞に分化できる細胞を称
する。肝細胞は、体内で最も多目的な細胞の内のいくつかである。肝細胞は、内
分泌機能および外分泌機能の両方を有し、ある物質を合成し、蓄積し、他の物質
を解毒し、他の物質を分泌して、酵素的活性、輸送活性、またはホルモン性活性
を果たす。肝細胞の主な活性としては、胆汁分泌、炭水化物、脂質、およびタン
パク質代謝の調節、代謝に重要な物質の貯蔵、ホルモンの分解と分泌、並びに薬
物と毒素の形質転換および排出が挙げられる。本発明の方法は、インビトロまた
は移植後のいずれかに、肝細胞および肝始原細胞の長期間の培養を促進させるの
に用いることができる。In yet another embodiment, the methods of the invention can be used to expand the proliferative capacity of hepatocytes and hepatic stem cells. The term "liver progenitor cell" as used herein refers to a hepatocyte, for example, a cell that can differentiate into a cell of the hepatic lineage, such as hepatocyte. Hepatocytes are some of the most versatile cells in the body. Hepatocytes have both endocrine and exocrine functions, synthesizing and accumulating certain substances, detoxifying other substances, secreting other substances, and causing enzymatic activity, transport activity, or hormonal activity. Fulfill. The major activities of hepatocytes include bile secretion, regulation of carbohydrate, lipid, and protein metabolism, storage of substances important for metabolism, hormone degradation and secretion, and drug and toxin transformation and excretion. The methods of the invention can be used to promote long term culture of hepatocytes and hepatic progenitor cells, either in vitro or after transplantation.

【００９８】 さらに別の実施の形態において、本発明の方法は、細胞共培養(co-culture)の
ための「栄養補給」細胞層の増殖能力を広げるのに用いることができる。In yet another embodiment, the methods of the invention can be used to extend the growth potential of “nutrition” cell layers for cell co-culture.

【００９９】 別の実施の形態において、本発明の方法は、核輸送のために活性的に***する
胎児繊維芽細胞の存在を向上させることにより、例えば、ヒトではない動物の大
規模なクローニングを向上させるのに用いることができる。In another embodiment, the method of the present invention improves the presence of fetal fibroblasts that actively divide for nuclear transport, thus allowing, for example, large-scale cloning of non-human animals. It can be used to improve.

【０１００】 核移植における従来の研究により、供与体細胞の細胞周期段階が、核輸送後の
胎芽の発達の程度に影響を与えることが示された。供与体細胞が、減数***にお
ける第２中期で拘束される受容体卵母細胞に融合されるときに、核エンベロープ
が壊れ、卵母細胞が活性化されるまで染色体が凝縮する。この凝縮相は、ＤＮＡ
合成を経験している受容体細胞内の染色体欠陥を生じることが示された。しかし
ながら、細胞周期のＧ1相（ＤＮＡ合成の前）にある受容体細胞は、正常に凝縮
し、高速の初期発達を支持する。Previous studies in nuclear transfer have shown that the cell cycle stage of donor cells influences the degree of embryo development following nuclear transport. When a donor cell is fused to a second metaphase-restricted recipient oocyte in meiosis, the nuclear envelope is broken and the chromosomes are condensed until the oocyte is activated. This condensed phase is DNA
It has been shown to result in chromosomal defects within the recipient cell undergoing synthesis. However, receptor cells in the G1 phase of the cell cycle (prior to DNA synthesis) are normally condensed and support rapid early development.

【０１０１】 核移植のための最適な供与体細胞を選択する際の本発明者の理論的根拠は、前
記細胞は、比較的未分化な状態の指標として、初期の胎芽発達中に生じる急速な
細胞***と矛盾しないために、***をやめていないはずであるが（Ｇ0の場合）
、活発に***していることであった。細胞は、その細胞周期を人工的に拘束する
か、または固有に長いＧ1相を有する細胞の種類を選択することのいずれにより
、Ｇ1内にあるはずである。Our rationale in selecting the optimal donor cells for nuclear transfer is that they are a rapid indicator of a relatively undifferentiated state, resulting in rapid development during early embryonic development. It should not have stopped because it is consistent with cell division (in the case of G0)
, Was actively dividing. Cells should be within G1 either by artificially arresting their cell cycle or by selecting cell types that have an inherently long G1 phase.

【０１０２】 本発明の方法は、一般的な細胞培養技法にも適用できる。例えば、本発明の方
法は、ヒトＢリンパ球と骨髄腫との間のハイブリッドのような不死ヒト細胞と致
死ヒト細胞との間のハイブリッドの複製能力を増大させるのに、例えば、ヒトハ
イブリドーマを産生する抗体の複製能力を増大させるのに用いることができる。The method of the present invention can also be applied to general cell culture techniques. For example, the methods of the invention increase the replicative capacity of hybrids between immortal and lethal human cells, such as the hybrid between human B lymphocytes and myeloma, to produce, for example, human hybridomas. Can be used to increase the replicative capacity of the antibody.

【０１０３】 より一般的に、本発明の方法は、組換えタンパク質を産生するように操作され
た、培養されている細胞の複製能力を増大させるのに用いることができる。実際
に、本発明の方法により、組換え細胞として「正常な」細胞を用いることができ
、したがって、不死細胞の使用に関して生じるかもしれない問題（翻訳後修飾に
おける差のような）が、特に分泌タンパク質の産生に関して避けることができる
。More generally, the methods of the invention can be used to increase the replicative capacity of cells in culture that have been engineered to produce recombinant proteins. In fact, the method of the present invention allows the use of "normal" cells as recombinant cells, thus the problems that may arise with the use of immortal cells (such as differences in post-translational modifications) are particularly secreted. It can be avoided with respect to protein production.

【０１０４】 さらに別の実施の形態において、本発明の方法は、細胞共培養(co-culture)の
ための「栄養補給」細胞層の寿命を延ばすのに用いることができる。In yet another embodiment, the methods of the invention can be used to prolong the life of a “nutrition” cell layer for cell co-culture.

【０１０５】 別の態様において、本発明は、活性成分として、MIF治療薬を使用する、上
皮由来組織の増殖を制御するための、薬剤および方法を提供する。本発明はまた
、本発明の薬剤を使用した上皮由来組織の増殖を制御する方法にも関する。これ
を説明するために、本発明のMIF治療薬を、皮膚と皮膚器官；角膜、水晶体およ
び他の眼組織；粘膜；および歯周上皮のような上皮組織の疾患の治療、もしくは
外科または美容修復における養生法の一部として用いてもよい。ここに開示した
方法および組成物は、様々な損傷した上皮組織および粘膜組織の治療および予防
のために提供される。例えば、本発明の方法は、皮膚手術または歯周手術からの
ような、上皮組織を含む任意の手術に関して望ましいように、創傷治癒過程を制
御するのに用いることができる。MIF治療薬を使用することが治療の候補として
挙げられている例としての手術修復としては、重症の熱傷および皮膚の再生、皮
膚の移植、褥瘡、皮膚潰瘍、裂裂、手術後瘢痕の減少、および潰瘍性大腸炎が挙
げられる。In another aspect, the present invention provides agents and methods for controlling the growth of epithelial-derived tissues using MIF therapeutics as the active ingredient. The present invention also relates to methods of controlling the growth of epithelial-derived tissue using the agents of the present invention. To illustrate this, the MIF therapeutic agents of the present invention are used to treat skin and skin organs; corneas, lenses and other ocular tissues; mucous membranes; and diseases of epithelial tissues such as periodontal epithelium, or surgical or cosmetic repair. May be used as part of the regimen in. The methods and compositions disclosed herein are provided for the treatment and prevention of various injured epithelial and mucosal tissues. For example, the methods of the invention can be used to control the wound healing process as desired with respect to any surgery involving epithelial tissue, such as from skin surgery or periodontal surgery. Examples of surgical repairs in which the use of MIF therapeutics are listed as candidates for treatment include severe burns and skin regeneration, skin grafts, pressure ulcers, skin ulcers, tears, reduction of postoperative scarring, And ulcerative colitis.

【０１０６】 本発明の方法には、上皮組織を患わす疾患の治療または予防、並びに美容への
使用に幅広い用途がある。一般的に、本発明の方法は、細胞をインビトロまたは
インビボで、治療される上皮組織の寿命を変更するのに十分な量のMIF治療薬に
接触させる工程を含むものとして特徴付けることができる。インビボ用途に関し
て、投与様式および供与量の処方は、治療すべき上皮組織により異なる。例えば
、治療される組織が真皮組織または粘膜組織のような上皮組織の場合には、局所
用配合物が好ましい。The methods of the present invention have broad application in the treatment or prevention of diseases affecting epithelial tissues, as well as cosmetic use. In general, the methods of the invention can be characterized as comprising the step of contacting cells in vitro or in vivo with a MIF therapeutic agent in an amount sufficient to modify the lifespan of the epithelial tissue being treated. For in vivo use, the mode of administration and the dosage regimen will depend on the epithelial tissue to be treated. For example, topical formulations are preferred when the tissue to be treated is epithelial tissue such as dermal tissue or mucosal tissue.

【０１０７】 「創傷の治癒を促進させる」方法により、治療の結果として、治療しない場合
の同様の創傷の治癒よりもずっと早く創傷が治癒される。「創傷治癒の促進」は
、前記方法により、特に、ケラチノサイトの増殖相および成長相が延長されるこ
と、または、創傷が、瘢痕が少なく、創傷の収縮が小さく、コラーゲンの堆積が
少なく、表在表面積が小さい状態で治癒することも意味することがある。ある場
合には、「創傷治癒の促進」は、創傷治癒のある方法が、本発明の方法とともに
用いた場合、成功率（例えば、皮膚移植の生着率）が改善されたことを意味する
こともある。The “promoting wound healing” method results in healing of the wound as a result of treatment much faster than healing of similar wounds without treatment. By "promoting wound healing" is meant, in particular, that the proliferation and growth phases of keratinocytes are extended by the above-mentioned method, or that the wound has less scarring, less wound contraction, less collagen deposition and superficial expression. It may also mean healing with low surface area. In some cases, "promoting wound healing" means that certain methods of wound healing have improved success rates (eg, skin graft survival) when used with the methods of the invention. There is also.

【０１０８】 完全には治癒しておらず、開いたままになっている創傷には、常に合併症の危
険がある。ほとんどの創傷は治療せずとも迅速に治癒するが、ある種類の創傷は
治癒に抵抗を示す。大きな表面積を覆う創傷は、長期間に亘り開いたままとなる
。本発明のある実施の形態において、本発明は、手術、熱傷、炎症または過敏か
ら生じるもののような、上皮組織を含む創傷の治癒を向上させる、および／また
はその他の様式で加速させるのに用いることができる。本発明のMIF治療薬は、
例えば、皮膚、髪および／または爪の組織の再生過程を向上させるために、化粧
品の形態のように、予防的に適用することができる。Wounds that have not completely healed and remain open are always at risk of complications. Most wounds heal quickly without treatment, but some types of wounds resist healing. Wounds covering large surface areas remain open for extended periods of time. In one embodiment of the invention, the invention is used to improve and / or otherwise accelerate healing of wounds containing epithelial tissue, such as those resulting from surgery, burns, inflammation or irritation. You can The MIF therapeutic agent of the present invention is
For example, it may be applied prophylactically, such as in cosmetic form, in order to enhance the process of regrowth of skin, hair and / or nail tissue.

【０１０９】 完全なまたは部分的な厚さの熱傷は、しばしば大きな表面積を覆う創傷の種類
の例であり、したがって、治癒するのに長期間が必要である。その結果、感染お
よび体液の損傷のような命にかかわる合併症が生じることが多い。さらに、熱傷
における治癒はしばしば無秩序であり、その結果、瘢痕が生じたり、醜くなって
しまう。ある場合には、過剰のコラーゲンの堆積による創傷の収縮により、その
創傷の近傍にある筋肉の移動性が減少してしまう。本発明の組成物および方法は
、熱傷の治癒を向上させ、美容の成果がより望ましく、創傷の収縮と瘢痕が少な
くなるように治癒過程を促進させるのに用いることができる。Full or partial thickness burns are often an example of a type of wound that covers a large surface area, and thus requires a long time to heal. The result is often life-threatening complications such as infection and fluid damage. Furthermore, healing in burns is often chaotic, resulting in scarring and ugliness. In some cases, contraction of the wound due to excess collagen deposition reduces the mobility of muscles in the vicinity of the wound. The compositions and methods of the present invention can be used to enhance the healing of burns and promote the healing process so that cosmetic outcomes are more desirable and wound contraction and scarring are reduced.

【０１１０】 大面積を覆う酷い熱傷はしばしば、患者の体の損傷を受けていない区域からと
られた皮膚の自己移植により治療される。本発明の方法は、皮膚の移植とともに
用いて、移植片の性能および培養中の寿命を改善し、移植された皮膚および移植
片に近接した患者の皮膚の両方の増殖を加速させることにより、移植片の生着率
を改善することもできる。Severe burns over large areas are often treated by autografting skin taken from undamaged areas of the patient's body. The method of the present invention is used in conjunction with skin grafts to improve the performance and longevity of the grafts in culture, and by accelerating the growth of both the grafted skin and the patient's skin in close proximity to the graft. It is also possible to improve the survival rate of the pieces.

【０１１１】 真皮腫瘍は、例えば、その腫瘍を治療し、および／または潰瘍が慢性創傷にな
るのを防ぐために、本発明の方法により治療しやすい創傷のさらに別の例である
。例えば、糖尿病を患った患者７人毎に１人が、感染しやすい四肢に真皮腫瘍を
発症する。糖尿病性腫瘍に感染した患者にはしばしば、入院、集中治療、高価な
抗生物質、およびある場合には、切断が必要である。静脈疾患（静脈鬱血性潰瘍
）、過剰圧力（褥瘡性潰瘍）および動脈潰瘍から生じるような真皮潰瘍も、治癒
に抵抗を示す。従来の治療は、一般的に、創傷を保護すること、感染さいないこ
と、そしてある場合には、血管手術により血流を回復させることに限られている
。本発明の方法によれば、皮膚の病気の区域を、創傷の上皮形成を促進させる、
例えば、皮膚腫瘍の治癒速度を加速させるMIF治療薬を含む療法により治療する
ことができる。Dermal tumors are yet another example of wounds that are amenable to treatment by the methods of the invention, eg, to treat the tumor and / or prevent the ulcer from becoming a chronic wound. For example, one out of every seven patients with diabetes develops a dermal tumor in the extremities that are susceptible to infection. Patients infected with diabetic tumors often require hospitalization, intensive care, expensive antibiotics, and in some cases amputation. Dermal ulcers, such as those resulting from venous disease (venous stasis ulcers), overpressure (decubitus ulcers) and arterial ulcers also resist healing. Conventional treatments are generally limited to protecting the wound, not getting infected, and in some cases restoring blood flow by vascular surgery. According to the method of the present invention, the diseased area of the skin is promoted to promote epithelialization of the wound,
For example, it can be treated with a therapy that includes a MIF therapeutic that accelerates the healing rate of skin tumors.

【０１１２】 別の実施の形態において、消化器系統の病気を治療または予防する本発明の方
法を提供する。手短に言えば、化学療法誘発のおよび放射線療法誘発の腸炎（す
なわち、腸管毒性）および粘液性大腸炎(mucositis)、消化性潰瘍疾患、胃腸炎
および大腸炎、絨毛萎縮性疾患等を含む、様々な病気が胃腸の上皮または絨毛の
分断に関連している。例えば、骨髄移植および癌の治療に用いられる化学治療薬
および放射線療法は、造血組織および小腸両方の内部にある細胞を増殖させるの
に急速に影響を与え、厳しく、しばしば投与量の制限された毒性に導かれる。小
腸の粘膜バリアが損傷を受けると、出血や敗血症の重大な合併症が生じてしまう
。本発明の方法は、胃腸上皮の増殖を促進させ、それによって、放射線および化
学治療薬の許容される供与量が増加させるために用いることができる。消化器系
統の病気の効果的な治療は、腸炎スコア、当該技術においてよく知られた他の試
験を含むいくつかの基準により決定されるであろう。In another embodiment, there is provided a method of the invention for treating or preventing a gastrointestinal tract disorder. Briefly, various, including chemotherapy- and radiotherapy-induced enteritis (ie, enterotoxicity) and mucositis, peptic ulcer disease, gastroenteritis and colitis, villous atrophic disease, etc. Diseases are associated with disruption of the gastrointestinal epithelium or villi. For example, chemotherapeutic agents and radiation therapy used in the treatment of bone marrow transplants and cancer rapidly affect the proliferation of cells within both hematopoietic tissues and the small intestine, with severe, often dose-limiting toxicity. Be led to. Damage to the mucosal barrier of the small intestine can lead to significant complications of bleeding and sepsis. The methods of the invention can be used to promote gastrointestinal epithelial proliferation, thereby increasing the acceptable dose of radiation and chemotherapeutic agents. Effective treatment of diseases of the digestive system will be determined by several criteria, including the enteritis score, other tests well known in the art.

【０１１３】 年齢と共に、表皮は薄くなり、皮膚付属物は萎縮する。髪は少なくなり、皮脂
の分泌が減少し、その結果、乾燥し、ひび割れ、および割れ目が生じやすくなる
。真皮は、弾性のコラーゲン繊維が失われるとともに減少する。さらに、ケラチ
ノサイトの増殖（皮膚の厚さおよび皮膚の増殖能力を表す）は年齢と共に減少す
る。ケラチノサイトの増殖の増大、または持続性の速度が、皮膚の老化、すなわ
ち、しわ、厚さ、弾性および修復を和らげると考えられる。本発明によれば、MI
F治療薬は、治療的または美容的のいずれかに用いて、皮膚の老化の影響を少な
くとも一時的に和らげることができる。With age, the epidermis becomes thin and the skin appendages atrophy. Hair is reduced and sebum secretion is reduced, resulting in dryness, cracking, and cracking. The dermis diminishes with the loss of elastic collagen fibers. Moreover, keratinocyte proliferation, which represents skin thickness and skin proliferative capacity, decreases with age. It is believed that the increased or sustained rate of keratinocyte proliferation moderates skin aging, ie wrinkles, thickness, elasticity and repair. According to the invention MI
The F therapeutic can be used either therapeutically or cosmetically to at least temporarily alleviate the effects of skin aging.

【０１１４】 本発明の方法は、癌組織に対する創傷の治療に用いることができる。一般的に
、病気、手術または障害のいずれによる角膜組織に対する損傷は、創傷の性質に
依存して、上皮細胞および／または内皮細胞に影響を与えることがある。角膜上
皮細胞は、角膜の外面を覆う非ケラチン化上皮細胞であり、外部環境に対する保
護バリアを提供する。角質創傷の治癒は、臨床医および研究者の両方にとって関
心を集めている。眼科医はしばしば、持続性で頻発する上皮侵食となり、永久的
な内皮損失に至ることも多い、角膜異栄養症および問題となる障害に直面する。
MIF治療薬をこれらの例に用いて、冒された角膜組織の上皮形成を促進させるこ
とができる。さらに説明するために、一般的に目の中の上皮細胞損傷に関連し、
本発明の方法がそのために有益な治療を提供できる特定の病気としては、持続性
角膜上皮欠陥、頻発侵食、向神経性角膜腫瘍、乾性角結膜炎、微生物角膜腫瘍、
ウイルス性角膜腫瘍等が挙げられる。さらに、切屑、表面侵食、炎症等のような
表在性創傷により、上皮細胞が損失することがある。本発明によれば、角膜上皮
を、創傷を適切に治癒するために角膜上皮細胞の増殖を向上させるのに効果的な
量のMIF治療薬に接触させる。The methods of the invention can be used to treat wounds on cancerous tissue. In general, damage to corneal tissue, whether due to disease, surgery or injury, can affect epithelial cells and / or endothelial cells depending on the nature of the wound. Corneal epithelial cells are non-keratinized epithelial cells that line the outer surface of the cornea and provide a protective barrier to the external environment. The healing of keratinous wounds is of interest to both clinicians and researchers. Ophthalmologists often face corneal dystrophy and a problematic disorder that often results in persistent and frequent epithelial erosion, often leading to permanent endothelial loss.
MIF therapeutics can be used in these cases to promote epithelialization of the affected corneal tissue. To further explain, commonly associated with epithelial cell damage in the eye,
Specific diseases for which the method of the present invention may provide beneficial treatments include persistent corneal epithelial defect, frequent erosion, neurotropic corneal tumor, keratoconjunctivitis sicca, microbial corneal tumor
Examples thereof include viral corneal tumors. In addition, superficial wounds such as chips, surface erosion, inflammation and the like can result in loss of epithelial cells. According to the present invention, the corneal epithelium is contacted with an amount of a MIF therapeutic agent effective to enhance the proliferation of corneal epithelial cells for proper wound healing.

【０１１５】 組織および器官の半ビボでのメンテナンスも、とても望まれている。組織の置
換療法は、ヒトの病気の治療において十分に確立されている。例えば、1996年に
は、40,000以上の角膜移植が米国で行われた。ヒトの表皮細胞は、インビトロで
増殖させ、熱傷部位および慢性皮膚腫瘍並びに他の皮膚創傷に移植するのに使用
することができる。本発明の方法は、上皮組織の寿命をインビトロで向上させ、
並びに、培養した上皮組織を動物の宿主に移植することを向上させるために使用
することができる。Ex vivo maintenance of tissues and organs is also highly desirable. Tissue replacement therapy is well established in the treatment of human disease. For example, in 1996, over 40,000 corneal transplants were performed in the United States. Human epidermal cells can be grown in vitro and used to implant burn sites and chronic skin tumors as well as other skin wounds. The method of the invention improves the lifespan of epithelial tissues in vitro,
And can be used to enhance the transplantation of cultured epithelial tissues into animal hosts.

【０１１６】 本発明の方法は、皮膚移植片の「生着率」を改善するために使用することがで
きる。移植片の生着する期間が長すぎる場合には、上皮組織の移植片は水膨れに
なったり、ひび割れたりして、自己移植片が「生着」、すなわち、創傷に付着し
、下にある顆粒組織と基底膜を形成する傾向が減少する。生着率は、本発明の方
法により、ケラチノサイトの増殖を向上させることによって増加させることがで
きる。生着率を増加させる方法は、皮膚の自己移植片を、上述したような、創傷
の治癒を促進させる方法、およびケラチノサイトの成長および増殖を促進させる
方法に記載された、創傷の治癒に効果的な量のMIF治療薬に接触させる工程を含
む。The method of the present invention can be used to improve the "engraftment rate" of skin grafts. If the graft takes too long, the epithelial graft may blister or crack and the autograft is "engrafted," that is, attached to the wound and underneath. The tendency to form granular tissue and basement membrane is reduced. The engraftment rate can be increased by improving the proliferation of keratinocytes by the method of the present invention. A method of increasing the rate of engraftment is effective for wound healing as described in skin autografts for promoting wound healing and for promoting keratinocyte growth and proliferation, as described above. Contacting with a different amount of the MIF therapeutic agent.

【０１１７】 皮膚の同等物には、皮膚移植用のヒトまたは動物の皮膚の置換としてだけでな
く、皮膚上の治療物質および化粧品の効果を決定する試験用皮膚としての多くの
用途がある。製薬物学、化学および化粧用の試験における主な難点は、皮膚への
製品の効能および安全性を決定するのが難しいことである。本発明の皮膚同等物
の利点の１つは、試験皮膚上でのインビトロの試験によりそのような物質により
生じる効果の指標としての用途である。Skin equivalents have many uses, not only as a replacement for human or animal skin for skin grafts, but also as a test skin to determine the effects of therapeutic agents and cosmetics on the skin. A major difficulty in pharmaceutical, chemical and cosmetic testing is the difficulty of determining the efficacy and safety of the product on the skin. One of the advantages of the skin equivalents of the invention is their use as an indicator of the effect produced by such substances by in vitro tests on test skin.

【０１１８】 したがって、本発明の方法は、ある実施の形態において、例えば、剥脱された
区域、肉芽損傷および熱傷の皮膚移植のプロトコルの一部として用いることがで
きる。MIF治療薬を使用することにより、中間層皮自己移植および表皮自己移植
（培養された自己ケラチノサイト）並びに表皮同種移植（培養された同種ケラチ
ノサイト）のような移植技法を向上させることができる。同種移植の例において
、培養による皮膚同等物の形成を向上させるために本発明の方法を使用すること
は、患者が、永久的な治癒が生じることのできる材料により一回の工程で被覆さ
れるように、そのような移植片（例えば、組織バンク中の）の容易な供給を提供
する／維持するのに役立つ。Accordingly, the methods of the present invention can be used in certain embodiments, for example, as part of a protocol for skin grafting of exfoliated areas, granulation lesions and burns. The use of MIF therapeutics can improve transplantation techniques such as interstitial and epidermal autografts (cultured autologous keratinocytes) and epidermal allografts (cultured allogeneic keratinocytes). In the allograft example, using the method of the invention to enhance the formation of skin equivalents by culture is such that the patient is coated in one step with a material capable of permanent healing. Thus, it serves to provide / maintain an easy delivery of such implants (eg, in a tissue bank).

【０１１９】 この点に関して、本発明は、MIF治療薬の存在下で拡張された培養ケラチノサ
イト細胞の表皮層を含む複合体の生きている皮膚同等物にも関する。本発明の方
法は、複合体の生きている皮膚同等物を調製する方法の一部として使用すること
ができる。ある実施の形態において、そのような方法は、皮膚の試料を得て；該
皮膚試料を酵素的に処理して、真皮から表皮を分離し；該表皮を酵素的に処理し
て、ケラチノサイト細胞を放出させ；MIF治療薬の存在下で、並行してまたは別
々に、融合する(confluence)まで表皮ケラチノサイトを培養し；前記真皮を酵素
的に処理して、繊維芽細胞を放出させ；該繊維芽細胞をほぼ融合する(sub-confl
uence)まで培養し；該培養した繊維芽細胞を多孔質の架橋性コラーゲン海綿膜に
接種し；接種されたコラーゲン海綿をその表面上でインキュベートして、該コラ
ーゲン海綿全体に亘り前記繊維芽細胞を増殖させ；次いで、該海綿に培養したケ
ラチノサイト細胞を接種し；前記細胞の寿命を向上させるテロメラーゼ活性化治
療薬の存在下で複合体の皮膚同等物コンプレックスをインキュベートする各工程
を含む。In this regard, the present invention also relates to a living skin equivalent of a complex comprising the epidermal layer of cultured keratinocyte cells expanded in the presence of the MIF therapeutic agent. The method of the present invention can be used as part of a method of preparing a complex live skin equivalent. In one embodiment, such a method comprises obtaining a sample of skin; enzymatically treating the skin sample to separate the epidermis from the dermis; enzymatically treating the epidermis to remove keratinocyte cells. Release; culturing epidermal keratinocytes in the presence of a MIF therapeutic agent in parallel or separately until confluence; enzymatically treating the dermis to release fibroblasts; Cells are almost fused (sub-confl
uence); inoculating the cultured fibroblasts on a porous, cross-linkable collagen sponge membrane; inoculating the inoculated collagen sponge on its surface to disperse the fibroblasts throughout the collagen sponge Proliferating; then inoculating the sponges with cultured keratinocyte cells; incubating the skin equivalent complex of the complex in the presence of a telomerase activating therapeutic agent that enhances the life span of said cells.

【０１２０】 他の実施の形態において、上皮層および間葉層の両方を含有する皮膚シートを
培地中で単離し、MIF治療薬が補われた培地により拡張されることができる。In another embodiment, skin sheets containing both epithelial and mesenchymal layers can be isolated in medium and expanded with medium supplemented with MIF therapeutics.

【０１２１】 細胞培養技法を行える任意の皮膚試料を本発明に用いても差し支えない。この
皮膚試料は自己または同種のものであってもよい。Any skin sample that is capable of cell culture techniques can be used in the present invention. The skin sample may be autologous or homologous.

【０１２２】 本発明の別の態様において、本発明の方法を、歯周組織内またはその周りの上
皮細胞の増殖を制御することが望ましい様々な歯周工程と共に使用することがで
きる。ある実施の形態において、MIF治療の増殖形態を用いて、例えば、歯肉組
織の形成を促進させるために、天然の歯および義歯の周りの再上皮形成(reepith
elialization)を向上させることができる。In another aspect of the invention, the methods of the invention can be used with various periodontal steps where it is desirable to control the proliferation of epithelial cells in or around the periodontal tissue. In certain embodiments, a proliferative form of MIF treatment is used to reepitheliate around natural teeth and dentures, for example, to promote the formation of gingival tissue.
elialization) can be improved.

【０１２３】 さらに別の態様において、本発明の方法は、生体吸収性(bioresorptable)材料
と共に用いたような場合に、誘導された組織の再生の制御を補助するのに使用す
ることができる。例えば、義歯のような歯周インプラントを組み込むことが、本
発明の方法により促進することができる。歯の再付着には、結合組織繊維の形成
および歯嚢の上皮形成の両方が含まれる。本発明の方法による治療を用いて、創
傷の治癒過程において基底上皮細胞の有糸***能力を制御することにより、組織
の再付着を向上させることができる。In yet another embodiment, the methods of the invention can be used to help control induced tissue regeneration, such as with a bioresorptable material. For example, the incorporation of periodontal implants such as dentures can be facilitated by the method of the invention. Tooth reattachment includes both the formation of connective tissue fibers and epithelialization of the dental follicle. Treatment according to the methods of the invention can be used to improve tissue reattachment by controlling the mitotic capacity of basal epithelial cells during the wound healing process.

【０１２４】 本発明の別の態様において、MIF治療薬は、例えば毛の増殖を強める脱毛症の
治療において、または例えば毛の成長を抑制する毛の美容除去（脱毛）において
、毛の増殖を変化させるのに使用できる。In another embodiment of the present invention, a MIF therapeutic agent alters hair growth, for example in the treatment of alopecia that enhances hair growth, or in cosmetic removal of hair (hair loss), which inhibits hair growth. Can be used to

【０１２５】 ある実施の形態において、本発明の組成物は、上皮由来組織の増殖を促進する
よりも抑制するのに使用できる。例えば、ここに開示されるある組成物は、様々
の過形成または新形成の病気を治療または予防するために施用してもよい。この
方法は、例えば、乾癬；角化症；座瘡；面皰形成性外傷；毛嚢炎および偽性毛嚢
炎；角化棘細胞腫；胼胝；ダリエ病；魚鱗癬；扁平苔癬；軟属腫伝染病；黒皮症
；フォーダイス病；およびケロイドまたは過形成性瘢痕の治療または予防のため
に施用できる。本発明のある製剤はまた、例えば、アフタ性潰瘍、尋常性天疱瘡
、落葉状天疱瘡、増殖性天疱瘡または紅斑性天疱瘡のような天疱瘡、表皮剥離、
外傷性狼瘡または剥離性外傷のための治療の一部として、障害の増殖性症状発現
を治癒するための自己免疫疾患における治療養生の一部として使用してもよい。In certain embodiments, the compositions of the invention can be used to inhibit rather than promote proliferation of epithelial-derived tissue. For example, certain compositions disclosed herein may be applied to treat or prevent various hyperplastic or neoplastic conditions. This method includes, for example, psoriasis; keratoses; acne; comedogenic trauma; folliculitis and pseudofolliculitis; keratoacanthoma; callus; Darier's disease; ichthyosis; lichen planus; It can be applied for the treatment or prevention of diseases; melasma; Fordyce's disease; and keloids or hyperplastic scars. Certain formulations of the present invention also include, for example, pemphigus such as aphthous ulcer, pemphigus vulgaris, pemphigus foliaceus, proliferative pemphigus or erythematous pemphigus, epidermolysis,
It may be used as part of a treatment for traumatic lupus or exfoliative trauma, as part of a therapeutic regimen in autoimmune disease to cure the proliferative manifestations of the disorder.

【０１２６】 本発明のさらに別の実施の形態において、MIF治療薬は、例えば抑制（避妊薬
として）または増進（雄性***誘発剤）する、***形成を調節するのに使用でき
る。In yet another embodiment of the invention, MIF therapeutics can be used to modulate spermatogenesis, eg, suppressing (as a contraceptive) or enhancing (male fertility).

【０１２７】 ここにおける観察から、MIFは腫瘍形成において、例えば腫瘍の不朽化および/
または維持の過程において、ある役割を果たすかもしれないことが現在明らかで
ある。従って、p53のMIFに誘発されるバイパスの抑制因子は、例えば好ましくは
p53＋表現型による増殖性障害の治療において、化学治療薬として使用できる。From the observations herein, MIF is implicated in tumorigenesis, eg tumor immortalization and / or
It is now clear that it may play a role in the maintenance process. Thus, inhibitors of p53 MIF-induced bypass are, for example, preferably
It can be used as a chemotherapeutic agent in the treatment of proliferative disorders with the p53 + phenotype.

【０１２８】 さらに、癌治療において使用される大部分の薬はこの過程により細胞死を誘発
するので、アポトーシスは抗腫瘍化学療法の有効性の主要な決定因子である。多
くの実施例において、この機構はp53媒介アポトーシスによる（例えばp53＋腫瘍
において）。例えば、ゲニステイン(genistein)に対する化学的感受性は、細胞p
53含量に依存するようである。同様に、細胞中のp21^waf1（p53の転写標的）の誘
発は、誘発されていない細胞と比較して、ドキソルビシン、ツムデックス(tumud
ex)およびメトトレキセートに対する細胞の感受性を増加する；この状態は、ア
ポトーシスと関連する。従って、例えば腫瘍を浸潤するマクロファージにより産
生されるMIFから生じるような、天然MIF誘発p53バイパスの抑制因子は、例えばp
53媒介アポトーシスにより効力を増す少なくとも１つの化学治療薬に対する癌細
胞の化学的感受性を改良するのを助けるために使用できる。Furthermore, apoptosis is a major determinant of the efficacy of antitumor chemotherapy, as most drugs used in cancer therapy induce cell death by this process. In many examples, this mechanism is via p53-mediated apoptosis (eg, in p53 + tumors). For example, chemosensitivity to genistein results in cell p
53 It seems to depend on the content. Similarly, ^induction of p21 ^waf1 (a transcriptional target of p53) in cells was compared with uninduced cells in doxorubicin, tumud (tumud).
ex) and methotrexate increase the sensitivity of cells; this condition is associated with apoptosis. Thus, suppressors of native MIF-induced p53 bypass, such as those resulting from MIF produced by macrophages invading tumors, are for example p
It can be used to help improve the chemosensitivity of cancer cells to at least one chemotherapeutic agent that increases efficacy through 53-mediated apoptosis.

【０１２９】 従って、MIF拮抗薬は、ブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルフ
ァンのようなアルキルスルホネート；ベンゾデパ、カルボクワン、メツレデパお
よびウレデパのようなアジリジン；アルトレトアミン、トリエチレンメラミン、
トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミドおよびトリメチ
ロメラミンのようなエチレンイミンおよびメチルメラミン；クロラムブシル、ク
ロルナファジン、ククロフォスファミド、エストラムスチン、イフォスファミド
、メクロレタミン、塩酸メクロレタミン、メルファラン、ノベンビチン、フェネ
ステリン、プレドニムスチン、トロフォスファミドおよびウラシルマスタードの
ようなナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、フォアムス
チン、ロムスチン、ニムスチンおよびラニムスチンのようなニトロソ尿素類；お
よびダカルバジン、マンノムスチン、ミトブロニトール、ミトラクトールおよび
ピポブロマンのような他のものを含む、アルキル化薬のような化学治療薬と合同
に供給できる。Accordingly, MIF antagonists include alkyl sulfonates such as busulfan, improsulfan and piposulfan; aziridines such as benzodepa, carboquone, metredepa and uredepa; altretoamine, triethylenemelamine,
Ethyleneimine and methylmelamine such as triethylenephosphoramide, triethylenethiophosphoramide and trimethylolmelamine; chlorambucil, chlornafazine, cuclofosfamide, estramustine, ifosfamide, mechlorethamine, mechlorethamine hydrochloride, melphalan, Nitrogen mustards such as nobenbitin, phenesterine, prednimustine, trofosfamide and uracil mustard; nitrosoureas such as carmustine, chlorozotocin, foamustine, lomustine, nimustine and ranimustine; and dacarbazine, mannomustine, mitobronitol, mithracnitol and mithracutin, poitone and poitone. Can be jointly supplied with a chemotherapeutic drug, such as an alkylating drug, including others.

【０１３０】 ある実施の形態において、治療される細胞は、例えば脂肪または脂肪前駆体細
胞から生じる、脂肪細胞系の過増殖性細胞である。例えば、本発明の方法は、脂
肪細胞腫瘍の増殖を防止するために実施できる。脂肪腫瘍細胞は、脂肪肉腫のも
のでもよい。「脂肪肉腫」という用語は当業者により認識され、ときに正常な脂
肪細胞の病巣を有する、大きい退生脂肪芽細胞により特徴付けられる悪性腫瘍を
称する。本発明により治療できる例としての脂肪肉腫の種類は、よく分化した/
脱分化の、粘液様/円形細胞および多形性を含むがそれに限定されない（Sreekan
taiah,C.et al.,(1994)supraに記載されている）。In certain embodiments, the cells to be treated are adipocyte lineage hyperproliferative cells, such as those arising from fat or preadipocyte cells. For example, the methods of the invention can be practiced to prevent the growth of adipocyte tumors. The lipoma cells may be of liposarcoma. The term "liposarcoma" is recognized by those of skill in the art and refers to a malignant tumor characterized by large, degenerated lipoblasts, sometimes with normal foci of adipocytes. Examples of types of liposarcoma that can be treated by the present invention are well differentiated /
Dedifferentiated, including but not limited to myxoid / round cells and polymorphism (Sreekan
taiah, C. et al., (1994) supra).

【０１３１】 本発明の方法により治療され得る別の脂肪細胞腫瘍は、例えば通常は成熟脂肪
細胞からなる良性脂肪腫瘍のような脂肪腫を含む。同様に、本発明の方法は、脂
肪軟骨腫、脂肪繊維腫および脂肪肉芽腫の治療および/または予防に使用できる
。脂肪軟骨腫は、成熟脂肪腫性および軟骨性要素からなる腫瘍である；脂肪繊維
腫は、繊維症の部分を含有する脂肪腫である；および脂肪肉芽腫は、肉芽性炎と
関連するリポイド物質の小節により特徴付けられる。Other adipocyte tumors that can be treated by the methods of the invention include lipomas, such as benign lipomas, which usually consist of mature adipocytes. Similarly, the methods of the invention can be used to treat and / or prevent lipochondromas, lipofibromas and lipogranulomas. Lipochondroma is a tumor composed of mature lipomatous and chondrogenic elements; lipofibroma is a lipoma containing a portion of fibrosis; and lipogranulomas are lipoid substances associated with granulomatosis It is characterized by the measure of.

【０１３２】 本発明の方法はまた、例えば骨髄性、リンパ球系または赤血球系の系列、また
はその前駆体細胞から生じる、造血供給源の増殖性/腫瘍性細胞の増殖を抑制す
るのに使用できる。例えば、本発明は、急性前骨髄性白血病(APML)、急性骨髄性
白血病(AML)および慢性骨髄性白血病(CML)を含むがそれに限定されない様々の骨
髄性障害の治療を考慮している（Vaickus,L.(1991)Crit Rev.in Oncol./Hemotol
.11:267-97に記載されている）。本発明の方法により治療され得るリンパ球系悪
性疾患は、B系列ALLおよびT系列ALLを含む急性リンパ芽球性白血病(ALL)、慢性
リンパ球性白血病(CLL)、前リンパ球性白血病(PLL)、毛様細胞性白血病(HLL)お
よびヴァルデンストレームマクログロブリン血症(WM)を含むがそれに限定されな
い。本発明の治療方法により考慮される悪性リンパ腫のさらなる形態は、非ホジ
キンリンパ腫およびその変種、末梢T細胞リンパ腫、成人T細胞白血病/リンパ腫(
ATL)、皮膚T細胞リンパ腫(CTCL)、大顆粒リンパ性白血病(LGF)およびホジキン病
を含むがそれに限定されない。The methods of the invention can also be used to inhibit the proliferation of proliferative / neoplastic cells of hematopoietic source resulting, for example, from myeloid, lymphoid or erythroid lineages, or precursor cells thereof. . For example, the invention contemplates the treatment of various myelogenous disorders including, but not limited to, acute promyelocytic leukemia (APML), acute myelogenous leukemia (AML) and chronic myelogenous leukemia (CML) (Vaickus , L. (1991) Crit Rev. in Oncol./Hemotol
.11: 267-97). Lymphocytic malignancies that can be treated by the methods of the invention include acute lymphoblastic leukemia (ALL), including B-series ALL and T-series ALL, chronic lymphocytic leukemia (CLL), prolymphocytic leukemia (PLL). ), Hairy cell leukemia (HLL) and Waldenström macroglobulinemia (WM). Further forms of malignant lymphoma contemplated by the methods of treatment of the present invention are non-Hodgkin's lymphoma and variants thereof, peripheral T-cell lymphoma, adult T-cell leukemia / lymphoma (
ATL), cutaneous T-cell lymphoma (CTCL), large granular lymphocytic leukemia (LGF) and Hodgkin's disease.

【０１３３】 別の実施の形態においては、本発明の方法は、種々の癌の治療に使用できる。
例としての実施の形態において、MIF抑制因子は、ある乳がんの治療に使用でき
る。同様に、MIF拮抗薬は、悪性黒色腫の治療のための治療法において使用でき
る。さらに別の実施の形態において、本発明の方法は例えば骨肉種またはカポー
ジ肉腫のような肉腫の治療に使用できる。In another embodiment, the methods of this invention can be used to treat a variety of cancers.
In an exemplary embodiment, MIF inhibitors can be used to treat certain breast cancers. Similarly, MIF antagonists can be used in therapeutics for the treatment of malignant melanoma. In yet another embodiment, the methods of the invention can be used to treat sarcomas such as osteosarcoma or Kaposi's sarcoma.

【０１３４】 本発明の方法は、例えば平滑筋過形成（アテローム硬化症のような）またはレ
スチノシス(restinosis)のような過増殖性血管障害、並びに例えば慢性関節リウ
マチ、インシュリン依存性真性糖尿病、糸球体腎炎、肝硬変、および強皮症のよ
うな繊維症により特徴付けられる他の障害の治療において使用できる。例えば、
レスチノシスの場合において、MIF抑制因子は、例えば経皮経管転移により供給
できる(Mazur et al.(1994)Tex Heart Inst J21:104-111)。The methods of the present invention include hyperproliferative vascular disorders such as smooth muscle hyperplasia (such as atherosclerosis) or restinosis, as well as rheumatoid arthritis, insulin-dependent diabetes mellitus, glomeruli. It can be used in the treatment of nephritis, cirrhosis, and other disorders characterized by fibrosis such as scleroderma. For example,
In the case of restinosis, MIF inhibitors can be delivered, for example, by transcutaneous transluminal transfer (Mazur et al. (1994) Tex Heart Inst J21: 104-111).

【０１３５】 (iv)例としてのMIF治療および製剤 本発明の方法のMIF治療組成物は、天然発生タンパク質、組換えにより産生さ
れるタンパク質および合成化学物質の精製を含む、種々の技術のいずれによって
も産生できる。MIF治療薬のポリペプチド形態は好ましくは、例えば脊椎動物の
器官からの天然発生MIFタンパク質またはその断片に一致する配列を有する、脊
椎動物のMIFタンパク質に由来する。しかしながら、MIFポリペプチドは、任意の
後生動物の器官中で発生するMIFタンパク質（またはその断片）に一致してもよ
いことが認められるであろう。(Iv) Exemplary MIF Therapeutics and Formulations The MIF therapeutic compositions of the methods of the invention can be prepared by any of a variety of techniques including purification of naturally occurring proteins, recombinantly produced proteins and synthetic chemicals. Can also be produced. The polypeptide form of the MIF therapeutic is preferably derived from a vertebrate MIF protein having a sequence that corresponds to, for example, a naturally occurring MIF protein or a fragment thereof from a vertebrate organ. However, it will be appreciated that the MIF polypeptide may correspond to the MIF protein (or fragment thereof) that occurs in any metazoan organ.

【０１３６】 本発明の治療薬が由来する種々の天然発生MIFタンパク質は、当該技術におい
てよく特徴付けられている。例えば、GenBankアクセス番号M25639、U62326、U20
999、M95776、U88035およびSWISS-PROTアクセス番号P80177、P34884、S32394参
照のこと。MIFタンパク質は、明らかな分泌シグナルペプチドを有していないが
、通常は分泌されると理解されている。Various naturally occurring MIF proteins from which the therapeutic agents of the invention are derived are well characterized in the art. For example, GenBank access number M25639, U62326, U20
See 999, M95776, U88035 and SWISS-PROT accession numbers P80177, P34884, S32394. The MIF protein has no apparent secretory signal peptide, but is understood to be normally secreted.

【０１３７】 さらに、例えば治療または予防の効力、または安定性（例えば半ビボの貯蔵寿
命およびインビボにおけるタンパク質分解に対する抵抗性）、または拮抗薬（例
えば優性陰性変異体）の産生を高める等の目的のために、突然変異誘発を、修飾
されたMIFポリペプチドを作成するのに使用できる。そのような修飾ペプチドは
、例えばアミノ酸の置換、欠失、または付加により産生できる。修飾MIFポリペ
プチドはまた、例えば糖鎖形成、コレステロール形成、プレニル化等が変化した
、天然発生MIFタンパク質に関して翻訳後プロセシングが変化したものを含んで
もよい。In addition, for purposes such as for example therapeutic or prophylactic efficacy, or stability (eg, ex vivo shelf life and resistance to proteolytic degradation in vivo), or increased production of antagonists (eg, dominant negative mutants). Thus, mutagenesis can be used to create modified MIF polypeptides. Such modified peptides can be produced, for example, by amino acid substitution, deletion, or addition. Modified MIF polypeptides may also include altered post-translational processing with respect to naturally-occurring MIF proteins, eg altered glycosylation, cholesterol formation, prenylation, etc.

【０１３８】 ある実施の形態において、MIF治療薬は、ストリンジェントな条件下で配列番
号１に示されるMIF暗号配列にハイブリッド形成するヌクレオチド配列によるコ
ードが可能なポリペプチドである。例えば、約４５℃で６．０×塩化ナトリウム
/クエン酸ナトリウム(SSC)、続いて５０℃における２．０×SSCの洗浄のような
、DNAハイブリッド形成を促進する適切なストリンジェンシーの条件は、当業者
に知られているまたはCurrent Protocols in Molecular Biology,John Wiley&So
ns,N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6で見ることができる。例えば、洗浄工程における塩
濃度は、５０℃において約２．０×SSCの低ストリンジェンシーから５０℃にお
いて約０．２×SSCの高ストリンジェンシーまでから選択できる。さらに、洗浄
工程における温度は、室温、約２２℃における低ストリンジェンシーの条件から
約６５℃における高ストリンジェンシーの条件まで高くすることができる。In certain embodiments, a MIF therapeutic agent is a polypeptide capable of being encoded by a nucleotide sequence that hybridizes to the MIF coding sequence shown in SEQ ID NO: 1 under stringent conditions. For example, 6.0 x sodium chloride at about 45 ° C
Suitable stringency conditions that promote DNA hybridization are known to those of skill in the art or Current Protocols in Molecular, such as washing of sodium citrate (SSC) followed by 2.0 × SSC at 50 ° C. Biology, John Wiley & So
ns, NY (1989), 6.3.1-6.3.6. For example, the salt concentration in the washing step can be selected from low stringency of about 2.0 × SSC at 50 ° C. to high stringency of about 0.2 × SSC at 50 ° C. Further, the temperature in the washing step can be increased from room temperature, low stringency conditions at about 22 ° C to high stringency conditions at about 65 ° C.

【０１３９】 文献に記載されているように、例えば他の動物からの他のMIFタンパク質につ
いての遺伝子は、当該技術においてよく知られる技術を使用してmRNAまたはゲノ
ムDNA試料から得られる。例えば、MIFタンパク質をコードするcDNAは、例えば哺
乳類細胞、例えばヒト細胞のような、胚細胞を含む細胞からトータルmRNAを単離
することにより得られる。次に二本鎖cDNAをトータルmRNAから調製し、続いて多
くの既知の技術のいずれか１つを使用して適切なプラスミドまたはバクテリオフ
ァージ中に挿入することができる。MIFタンパク質をコードする遺伝子はまた、
確立されたポリメラーゼ連鎖反応技術を使用してクローン化できる。Genes for other MIF proteins, eg, from other animals, as described in the literature, are obtained from mRNA or genomic DNA samples using techniques well known in the art. For example, a cDNA encoding a MIF protein can be obtained by isolating total mRNA from cells, including embryonic cells, such as mammalian cells, eg, human cells. Double-stranded cDNA can then be prepared from total mRNA and subsequently inserted into a suitable plasmid or bacteriophage using any one of many known techniques. The gene encoding the MIF protein is also
It can be cloned using established polymerase chain reaction techniques.

【０１４０】 好ましい核酸は、配列番号２のアミノ酸配列に少なくとも６０％相同または同
一、より好ましくは７０％相同または同一、および最も好ましくは８０％相同ま
たは同一であるアミノ酸配列を含むMIFポリペプチドをコードする。配列番号８
から配列番号１４までの１つに示されているアミノ酸配列と少なくとも約９０％
、より好ましくは少なくとも約９５％、および最も好ましくは少なくとも約９８
％から約９９％まで相同または同一のポリペプチドをコードする核酸もまた、本
発明の範囲内である。A preferred nucleic acid encodes a MIF polypeptide comprising an amino acid sequence that is at least 60% homologous or identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, more preferably 70% homologous or identical, and most preferably 80% homologous or identical. To do. Sequence number 8
To at least about 90% of the amino acid sequence set forth in one of SEQ ID NO: 14 to SEQ ID NO: 14.
, More preferably at least about 95%, and most preferably at least about 98%.
Nucleic acids encoding polypeptides from% to about 99% homologous or identical are also within the scope of the invention.

【０１４１】 天然のMIFタンパク質に加えて、本発明による好ましいMIFポリペプチドは、配
列番号２により示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％相同または同一、より
好ましくは７０％相同または同一および最も好ましくは８０％相同または同一で
ある。配列番号２の配列と少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％
、および最も好ましくは少なくとも約９８％から約９９％まで相同または同一で
あるポリペプチドもまた、本発明の範囲内である。In addition to the native MIF protein, preferred MIF polypeptides according to the invention have at least 60% homology or identity with the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 2, more preferably 70% homology or identity and most preferably 80%. Homologous or identical. At least 90% with the sequence of SEQ ID NO: 2, more preferably at least 95%
, And most preferably at least about 98% to about 99% homologous or identical polypeptides are also within the scope of the invention.

【０１４２】 「組換えタンパク質」という用語は、通常、MIFポリペプチドをコードするDNA
を適切な発現ベクター内に挿入し次にこれを宿主細胞を形質転換して異種タンパ
ク質を産生するために使用する、組換えDNA技術により産生される本発明のポリ
ペプチドを称する。さらに、組換えMIF遺伝子に関する「に由来する」というフ
レーズは、天然MIFタンパク質のアミノ酸配列、またはそれに類似する、タンパ
ク質の天然発生形態の置換および欠失（切形を含む）を含む突然変異により産生
されるアミノ酸配列を有するタンパク質である「組換えタンパク質」の意味の範
囲を含む。The term “recombinant protein” usually refers to DNA encoding a MIF polypeptide.
Refers to a polypeptide of the invention produced by recombinant DNA technology, which is used to transform a host cell into a suitable expression vector, which is then used to produce a heterologous protein. Furthermore, the phrase "derived from" with respect to a recombinant MIF gene is produced by mutations that include substitutions and deletions (including truncations) of naturally occurring forms of the protein, or amino acid sequences similar to the native MIF protein. Included within the meaning of "recombinant protein" is a protein having the amino acid sequence shown.

【０１４３】 本発明の方法はまた、天然発生MIFポリペプチドの突然変異形態、例えば突然
変異体を使用して実施できる。The methods of the invention can also be practiced using mutated forms of naturally occurring MIF polypeptides, eg, mutants.

【０１４４】 当該技術において知られているように、MIFポリペプチドは、標準生物学的技
術によりまたは化学的合成により産生できる。例えば、本発明のポリペプチドを
コードするヌクレオチド配列の発現を指示する核酸ベクターでトランスフェクシ
ョンされた宿主細胞は、ペプチドを発現させるのに適切な条件下で培養できる。
ポリペプチドのMIFは、細胞および組換えMIFポリペプチドを含有する培地の混合
物から分泌され単離されてもよい。あるいは、組換えMIF遺伝子からシグナルペ
プチド配列を除去することによりペプチドの細胞質を維持してもよく、細胞を採
集し、溶解してタンパク質を単離する。この細胞の培養物は宿主細胞、培地およ
び他の副産物を含む。細胞培養に適切な培地は、当該技術においてよく知られて
いる。組換えMIFポリペプチドは、イオン交換クロマトグラフィ、ゲルろ過クロ
マトグラフィ、限外ろ過、電気泳動、およびそのようなペプチドに特異的な抗体
を使用する免疫親和力精製を含むタンパク質を精製するための当該技術において
知られる技術を使用して細胞培養培地、宿主細胞、または両方から単離できる。
好ましい実施の形態において、組換えMIFポリペプチドは、MIF/GST融合タンパク
質のような精製を容易にする領域を含有する融合タンパク質である。宿主細胞は
、原核細胞または真核細胞のどちらでもよい。As is known in the art, MIF polypeptides can be produced by standard biological techniques or by chemical synthesis. For example, host cells transfected with a nucleic acid vector that directs expression of a nucleotide sequence encoding a polypeptide of the invention can be cultured under conditions suitable for expressing the peptide.
The polypeptide MIF may be secreted and isolated from a mixture of cells and medium containing the recombinant MIF polypeptide. Alternatively, the peptide cytoplasm may be maintained by removing the signal peptide sequence from the recombinant MIF gene and the cells harvested, lysed and the protein isolated. The culture of cells comprises host cells, medium and other by-products. Suitable media for cell culture are well known in the art. Recombinant MIF polypeptides are known in the art for purifying proteins including ion exchange chromatography, gel filtration chromatography, ultrafiltration, electrophoresis, and immunoaffinity purification using antibodies specific for such peptides. It can be isolated from cell culture medium, host cells, or both using techniques that are used.
In a preferred embodiment, the recombinant MIF polypeptide is a fusion protein containing a region that facilitates purification, such as a MIF / GST fusion protein. Host cells can be either prokaryotic or eukaryotic cells.

【０１４５】 組換えMIF遺伝子は、MIFタンパク質またはその一部をコードする核酸を、原核
細胞、真核細胞、または両方における発現に適切なベクター中にライゲーション
することにより産生できる。本発明のMIFポリペプチドの組換え形態の産生のた
めの発現ベクターは、プラスミドおよび他のベクターを含む。例えば、MIFポリ
ペプチドの発現に適切なベクターは、E.coliのような原核細胞中の発現のために
pBR322由来プラスミド、pEMBL由来プラスミド、pEX由来プラスミド、pBTac由来
プラスミドおよびpUC由来プラスミドという種類のプラスミドを含む。A recombinant MIF gene can be produced by ligating a nucleic acid encoding a MIF protein or a portion thereof into a vector suitable for expression in prokaryotic cells, eukaryotic cells, or both. Expression vectors for the production of recombinant forms of MIF polypeptides of the invention include plasmids and other vectors. For example, a vector suitable for expression of a MIF polypeptide is suitable for expression in prokaryotic cells such as E. coli.
It includes pBR322-derived plasmids, pEMBL-derived plasmids, pEX-derived plasmids, pBTac-derived plasmids and pUC-derived plasmids.

【０１４６】 酵母中の組換えタンパク質の発現のために多くのベクターが存在する。例えば
、YEP24、YIP5、YEP51、YEP52、pYES2、およびYRP17は、遺伝子構成物のストレ
プトミセスセレビシアエ(S.cerevisiae)中への導入に有用なクローニングおよび
発現媒体である（例えば、ここに引用されるBroach et al.(1983)in Experiment
al Manipulation of Gene Expression,ed.M.Inouye Academic Press,P.83参照）
。これらのベクターは、pBR322 oriの存在によりE.coli中で、および酵母の２ミ
クロンのプラスミドの複製決定因子によりストレプトミセスセレビシアエ中で複
製できる。さらに、アンピシリンのような薬剤耐性標識を使用できる。説明のた
めの実施の形態において、MIFポリペプチドは、配列番号１に示されるヒトMIF遺
伝子の暗号配列をサブクローニングすることにより産生される発現ベクターを利
用して組換えにより産生される。Many vectors exist for the expression of recombinant proteins in yeast. For example, YEP24, YIP5, YEP51, YEP52, pYES2, and YRP17 are useful cloning and expression vehicles for the introduction of genetic constructs into S. cerevisiae (e.g., cited herein). Broach et al. (1983) in Experiment
(See al Manipulation of Gene Expression, ed.M. Inouye Academic Press, P.83)
. These vectors are able to replicate in E. coli due to the presence of pBR322 ori and in Streptomyces cerevisiae due to the replication determinant of the yeast 2 micron plasmid. In addition, drug resistance labels such as ampicillin can be used. In an illustrative embodiment, the MIF polypeptide is recombinantly produced utilizing an expression vector produced by subcloning the coding sequence of the human MIF gene set forth in SEQ ID NO: 1.

【０１４７】 好ましい哺乳類の発現ベクターは、細菌中のベクターの増殖を促進するために
原核配列、および真核細胞中で発現される１つ以上の真核転写単位の両方を含有
する。ｐcDNAI/amp、pcDNAI/neo、pRc/CMV、pSV2gpt、pSV2neo、pSV2-dhfr、pTk
2、pRSVneo、pMSG、pSVT7、pko-neoおよびpHyg由来ベクターは、真核細胞のトラ
ンスフェクションに適切な哺乳類発現ベクターの例である。これらのベクターの
いくつかは、pBR322のような細菌プラスミドからの配列で修飾されて、原核細胞
および真核細胞の両方における複製および薬剤耐性の選択を容易にする。あるい
は、ウシ乳頭腫ウイルス(BPV-1)、またはエプステイン−バーウイルス（pHEBo、
pREP由来およびp205）のようなウイルスの誘導体を、真核細胞におけるタンパク
質の一過性発現に使用してもよい。宿主生体のプラスミドおよび形質転換の調製
において使用される種々の方法は、当該技術においてよく知られている。原核細
胞および真核細胞の両方に適切な他の発現系、並びに通常の組換え法については
、Molecular Cloning A Laboratory Manual,2nd Ed.,ed.by Sambrook,Fritsch a
nd Maniatis(Cold Spring Harbor Laboratory Press:1989)Chapters 16 and 17
を参照。Preferred mammalian expression vectors contain both prokaryotic sequences to promote the growth of the vector in bacteria, and one or more eukaryotic transcription units that are expressed in eukaryotic cells. pcDNAI / amp, pcDNAI / neo, pRc / CMV, pSV2gpt, pSV2neo, pSV2-dhfr, pTk
2, pRSVneo, pMSG, pSVT7, pko-neo and pHyg derived vectors are examples of mammalian expression vectors suitable for transfection of eukaryotic cells. Some of these vectors have been modified with sequences from bacterial plasmids such as pBR322 to facilitate selection of replication and drug resistance in both prokaryotic and eukaryotic cells. Alternatively, bovine papilloma virus (BPV-1), or Epstein-Barr virus (pHEBo,
Derivatives of pREP and viruses such as p205) may be used for transient expression of proteins in eukaryotic cells. The various methods used in the preparation of host organism plasmids and transformations are well known in the art. For other expression systems suitable for both prokaryotic and eukaryotic cells, as well as common recombination methods, see Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed., Ed. By Sambrook, Fritsch a.
nd Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989) Chapters 16 and 17
See.

【０１４８】 いくつかの例において、バキュロウイルス発現系の使用により組換えMIFポリ
ペプチドを発現するのが所望であるかもしれない。そのようなバキュロウイルス
発現系の例には、pVL由来ベクター（pVL1392、pVL1393、およびpVL941のような
）、pAcUW由来ベクター（pAcUW1のような）、およびpBlueBac由来ベクター（β-
gal含有pBlueBac IIIのような）が含まれる。In some instances, it may be desirable to express recombinant MIF polypeptide by use of a baculovirus expression system. Examples of such baculovirus expression systems include pVL-derived vectors (such as pVL1392, pVL1393, and pVL941), pAcUW-derived vectors (such as pAcUW1), and pBlueBac-derived vectors (β-
gal-containing pBlueBac III).

【０１４９】 N末端の一部を欠失する形態、すなわちシグナルペプチドを欠失する切形突然
変異体のような、MIFタンパク質の一部のみの発現が所望である場合、開始コド
ン(ATG)を、発現される所望の配列を含有するオリゴヌクレオチド断片に付加す
ることが必要かもしれない。N末端位置のメチオニンは、酵素メチオニンペプチ
ダーゼ(MAP)の使用により酵素開裂できることは当該技術においてよく知られて
いる。MAPは、E.coli（Ben-Bassat et al.(1987)J.Bateriol.169:751-757）およ
びネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)からクローニングされ、そのインビ
トロにおける活性が組換えタンパク質上で示された(Miller et al.(1987)PNAS 8
4:2718-1722)。従って、所望なら、MAPを産生する宿主（例えばE.coliまたはCM8
9またはストレプトミセスセレビシアエ）中のMIF由来ポリペプチドの発現により
インビボで、または精製されたMAP（例えばMiller et al.,supraの方法）の使用
によりインビトロで、N末端メチオニンを除去できる。If expression of only a portion of the MIF protein is desired, such as a form that lacks a portion of the N-terminus, ie a truncated mutant that lacks the signal peptide, an initiation codon (ATG) was added. , It may be necessary to add to the oligonucleotide fragment containing the desired sequence to be expressed. It is well known in the art that methionine at the N-terminal position can be enzymatically cleaved by using the enzyme methionine peptidase (MAP). MAP was cloned from E. coli (Ben-Bassat et al. (1987) J. Bateriol. 169: 751-757) and Salmonella typhimurium and its in vitro activity was demonstrated on recombinant proteins. (Miller et al. (1987) PNAS 8
4: 2718-1722). Thus, if desired, a host that produces MAP (eg, E. coli or CM8
9 or Streptomyces cerevisiae) can be used to remove the N-terminal methionine in vivo by expression of the MIF-derived polypeptide or in vitro by use of purified MAP (eg, the method of Miller et al., Supra).

【０１５０】 あるいは、ポリペプチドに対する暗号配列を、異なるポリペプチドをコードす
るヌクレオチド配列を含む融合遺伝子の一部として取り込んでもよい。融合タン
パク質もまたタンパク質の発現を促進でき、従って本発明のMIFポリペプチドの
発現に使用できることが広く認識されている。例えば、MIFポリペプチドは、グ
ルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST-融合）タンパク質として産生できる。
そのようなGST-融合タンパク質は、例えばグルタチオン誘導基質の使用により、
MIFポリペプチドの容易な精製を可能にする（例えば、Current Protocols in Mo
lecular Biology,eds.Ausubel et al.(N.Y.:John Wiley & Sons,1991)参照）。
別の実施の形態においては、ポリ-(His)/エンテロキナーゼ開裂部位配列のよう
な、精製リーダー配列をコードする融合遺伝子は、Ni^2＋金属樹脂を使用するア
フィニティクロマトグラフィによりポリ(His)-MIFタンパク質を精製するために
、（例えば代用形(pro-form)の）MIFタンパク質のN末端において天然に発生する
シグナル配列を置換するのに使用できる。その後精製リーダー配列は、エンテロ
キナーゼで処理することにより除去できる（例えば、Hochuli et al.(1987)J.Ch
romatography 411:177;and Janknecht et al.PNAS88:8972）。Alternatively, the coding sequence for a polypeptide may be incorporated as part of a fusion gene that comprises nucleotide sequences encoding different polypeptides. It is widely recognized that fusion proteins can also promote expression of proteins and thus can be used to express MIF polypeptides of the invention. For example, the MIF polypeptide can be produced as a glutathione-S-transferase (GST-fusion) protein.
Such GST-fusion proteins can be prepared, for example, by use of glutathione-derived substrates,
Allows easy purification of MIF polypeptides (eg, Current Protocols in Mo
lecular Biology, eds. Ausubel et al. (NY: John Wiley & Sons, 1991)).
In another embodiment, the fusion gene encoding a purified leader sequence, such as the poly- (His) / enterokinase cleavage site sequence, is a poly (His) -MIF protein by affinity chromatography using Ni ²⁺ metal resin. Can be used to replace the naturally occurring signal sequence at the N-terminus of the MIF protein (eg in pro-form). The purified leader sequence can then be removed by treatment with enterokinase (eg Hochuli et al. (1987) J. Ch.
romatography 411: 177; and Janknecht et al. PNAS88: 8972).

【０１５１】 融合遺伝子を作成する技術は、当業者に知られている。本来、異なるポリペプ
チド配列をコードする種々のDNA断片の連結は、実質的に、ライゲーション、適
切な末端を提供するための制限酵素分解、適切な相補末端の充填、所望でない連
結を防止するためのアルカリホスファターゼ処理、および酵素によるライゲーシ
ョンのための平滑末端または粘着末端を使用する、従来技術に従って行われる。
別の実施の形態において、融合遺伝子は、DNA自動合成装置を含む従来技術によ
り合成できる。あるいは、アニーリングしてキメラの遺伝子配列を産生できる２
つの続発性遺伝子断片の間の相補的オーバーハングを生じるアンカープライマー
を使用して、遺伝子断片のPCR増幅を行ってもよい（例えば、Current Protocols
in Molecular Biology,eds.Ausubel et al.John Wiley & Sons:1992）。Techniques for making fusion genes are known to those of skill in the art. By nature, ligation of various DNA fragments encoding different polypeptide sequences can be accomplished by essentially Alkaline phosphatase treatment and blunt or sticky ends for enzymatic ligation are used according to the prior art.
In another embodiment, the fusion gene can be synthesized by conventional techniques including automated DNA synthesizers. Alternatively, it can be annealed to produce a chimeric gene sequence 2
Anchor primers that produce complementary overhangs between two secondary gene fragments may be used to perform PCR amplification of the gene fragment (eg, Current Protocols
in Molecular Biology, eds. Ausubel et al. John Wiley & Sons: 1992).

【０１５２】 MIFポリペプチドはまた、グリコシル基、コレステロール、イソプレノイド、
脂質、ホスフェート、アセチル基等のような他の化学成分と結合する共有結合ま
たは集合体を形成することによりMIF誘導体を作成するために化学的に修飾され
てもよい。MIFタンパク質の共有結合誘導体は、タンパク質のアミノ酸側鎖上で
またはポリペプチドのN末端またはC末端において、官能基に化学成分を結合させ
ることにより調製できる。MIF polypeptides also include glycosyl groups, cholesterol, isoprenoids,
It may be chemically modified to create MIF derivatives by forming covalent bonds or aggregates that bind other chemical moieties such as lipids, phosphates, acetyl groups, etc. Covalent derivatives of MIF proteins can be prepared by attaching chemical moieties to functional groups on the amino acid side chains of proteins or at the N- or C-termini of polypeptides.

【０１５３】 好ましい実施の形態において、MIFポリペプチドは、MIFポリペプチドを有する
融合タンパク質の形態で提供されなければ、他の細胞タンパク質、特に通常はMI
Fポリペプチドと結合する他の細胞外または細胞表面結合タンパク質から単離さ
れる、またはそうでなければ実質的に有しない。「他の細胞タンパク質または細
胞外タンパク質が実質的にない」（ここで「混入タンパク質」とも称される）ま
たは「実質的に純粋な試料」または「精製された試料」という用語は、２０％未
満の（乾燥重量で）混入タンパク質、および好ましくは５％未満の混入タンパク
質を有するMIFポリペプチドの調製を含むとして定義される。「精製された」に
より、所望の分子が、他のタンパク質のような他の生物学的高分子が実質的にな
いところに存在することが意味される。ここで用いたように「精製された」とい
う用語は好ましくは、乾燥重量で少なくとも８０％、より好ましくは重量で９５
％から９９％までの範囲、および最も好ましくは重量で少なくとも９９．８％の
、同一種の生物学的高分子を意味する（しかし、水、緩衝剤、および他の小さい
分子、特に５０００未満の分子量を有する分子は存在してもよい）。ここで用い
たように「純粋な」という用語は好ましくは、すぐ上の「精製された」と同じ数
値制限を有する。In a preferred embodiment, the MIF polypeptide, unless provided in the form of a fusion protein with the MIF polypeptide, is another cellular protein, particularly a MI
Isolated or otherwise substantially free of other extracellular or cell surface binding proteins that bind the F polypeptide. The term "substantially free of other cellular or extracellular proteins" (also referred to herein as "contaminating proteins") or "substantially pure sample" or "purified sample" is less than 20% Of contaminating proteins (by dry weight) and preferably a preparation of MIF polypeptide having less than 5% contaminating proteins. By "purified" is meant that the desired molecule is present in the substantial absence of other biological macromolecules such as other proteins. The term "purified" as used herein is preferably at least 80% by dry weight, more preferably 95% by weight.
% To 99%, and most preferably at least 99.8% by weight of biological macromolecules of the same species (but water, buffers and other small molecules, especially less than 5000 Molecules having a molecular weight may be present). The term "pure" as used herein preferably has the same numerical limits as "purified" immediately above.

【０１５４】 組換えポリペプチドについて上述されるように、単離されたMIFポリペプチド
は、配列番号２に示されるアミノ酸配列の全部または一部、またはそれに相同の
配列を含んでもよい。MIFポリペプチドの生物活性断片に関して、好ましいMIF治
療薬は、MIFポリペプチドの少なくとも５０の（隣接する）アミノ酸残基、より
好ましくは１００の（隣接する）、およびさらにより好ましくは少なくとも１５
０の（隣接する）残基を含む。As described above for recombinant polypeptides, the isolated MIF polypeptide may comprise all or part of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2, or a sequence homologous thereto. For bioactive fragments of MIF polypeptides, preferred MIF therapeutic agents are at least 50 (adjacent) amino acid residues of the MIF polypeptide, more preferably 100 (adjacent), and even more preferably at least 15.
Contains 0 (adjacent) residues.

【０１５５】 MIFタンパク質の単離されたペプチジル部分は、そのようなペプチドをコード
する核酸の対応断片から組換えにより産生されるペプチドのスクリーニングによ
り得られる。さらに断片は、従来のメリフィールド固相f-Mocまたはt-Boc化学作
用のような当該技術において知られる技術を使用して化学的に合成できる。例え
ば、本発明のMIFポリペプチドは、断片のオーバーラップのない所望の長さの断
片に任意に分解される、または好ましくは所望の長さのオーバーラップする断片
に分解されてもよい。断片は、野生型（例えば「真正の」）MIFタンパク質の作
用薬または拮抗薬として作用できるペプチジル断片を同定するために産生（組換
えによりまたは化学的合成により）およびテストできる。例えば、Roman et al.
(1994)Eur J Biochem 222:65-73には、結合領域を同定するためにより長いタン
パク質から短い、オーバーラップする合成ペプチドを使用する競合結合アッセイ
の使用が記載されている。The isolated peptidyl portion of the MIF protein is obtained by screening peptides recombinantly produced from the corresponding fragment of the nucleic acid encoding such peptide. In addition, fragments can be chemically synthesized using techniques known in the art such as conventional Merrifield solid phase f-Moc or t-Boc chemistry. For example, the MIF polypeptides of the invention may optionally be cleaved into fragments of the desired length without fragment overlap, or preferably into overlapping fragments of the desired length. Fragments can be produced (recombinantly or by chemical synthesis) and tested to identify peptidyl fragments that can act as agonists or antagonists of wild-type (eg "authentic") MIF proteins. For example, Roman et al.
(1994) Eur J Biochem 222: 65-73 describes the use of competitive binding assays using synthetic overlapping peptides from longer proteins to identify binding regions.

【０１５６】 本発明の組換えMIFポリペプチドはまた、例えば潜在的な開裂配列を変えるま
たはタンパク質と関係する酵素活性を不活性化する突然変異による、タンパク質
分解開裂に抵抗性のタンパク質のバージョンのような、真正のMIFタンパク質の
相同体を含む。本発明のMIF相同体はまた、真正のタンパク質と異なる方法で翻
訳後に修飾されるタンパク質を含む。Recombinant MIF polypeptides of the invention may also be present in versions of the protein that are resistant to proteolytic cleavage, eg, by mutations that alter potential cleavage sequences or inactivate enzymatic activities associated with the protein. , Including a homologue of the authentic MIF protein. The MIF homologues of the present invention also include proteins that are post-translationally modified in a different manner than authentic proteins.

【０１５７】 本発明のMIFポリペプチドの構成物の修飾はまた、治療または予防の効力、あ
るいは安全性（例えば、半ビボにおける貯蔵寿命およびインビボにおけるタンパ
ク質分解に対する抵抗性）を高めるような目的のために使用できる。そのような
修飾されたペプチドは、タンパク質の天然発生形態の少なくとも１つの活性を保
有するように作成される場合、ここでより詳細に記載されるMIFポリペプチドの
機能等価物であるとみなされる。そのような修飾されたペプチドは、例えばアミ
ノ酸の置換、欠失、または付加により産生できる。Modifications of the MIF polypeptide constructs of the invention may also be performed for such purposes as to enhance therapeutic or prophylactic efficacy or safety (eg, ex vivo shelf life and resistance to proteolytic degradation in vivo). Can be used for Such modified peptides, when made to retain at least one activity of the naturally occurring form of the protein, are considered to be functional equivalents of the MIF polypeptides described in more detail herein. Such modified peptides can be produced, for example, by amino acid substitutions, deletions, or additions.

【０１５８】 アミノ酸のある分離置換、例えば別の関連アミノ酸によるアミノ酸残基の置換
（すなわち同配体のおよび/または等電性の突然変異）は、生じる分子の生物学
的活性に大きい変化を与えずに行えることが合理的に予想できることは当該技術
においてよく知られている。保存的置換は、側鎖において関連するアミノ酸の系
統群の中で起こる。遺伝的にコードされるアミノ酸は、４つの系統群に分けられ
る：（１）酸性＝アスパラテート、グルタメート；（２）塩基性＝リシン、アル
ギニン、ヒスチジン；（３）非極性＝アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシ
ン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；および（４）
非荷電極性＝グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレ
オニン、チロシン。フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは、と
きに芳香族アミノ酸として共に分類される。同様に、アミノ酸レパートリーは、
（１）酸性＝アスパラテート、グルタメート；（２）塩基性＝リシン、アルギニ
ン、ヒスチジン；（３）脂肪族＝グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソ
ロイシン、セリン、トレオニンで、セリンおよびトレオニンは任意に脂肪族ヒド
ロキシルとして別に分類される；（４）芳香族＝フェニルアラニン、チロシン、
トリプトファン；（５）アミド＝アスパラギン、グルタミン；および（６）硫黄
含有＝システインおよびメチオニンに分類できる（例えば、Biochemistry,2nd e
d.,Ed.by L.Stryer,WH Freeman and Co.:1981参照）。ペプチドのアミノ酸配列
における変化が機能性MIF相同体（例えば野生型形態を擬態するまたは拮抗する
作用をするという意味で機能性の）を生じるか否かは、野生型タンパク質に類似
する種類の細胞中に応答を産生する、またはそのような応答を競合的に抑制する
突然変異体ペプチドの能力を査定することにより、容易に測定できる。１つ以上
の置換がなされたポリペプチドは、同じ方法で容易にテストできる。[0158] Certain segregating substitutions of amino acids, such as substitution of amino acid residues by another related amino acid (ie isosteric and / or isoelectric mutations), can result in large changes in the biological activity of the resulting molecule. It is well known in the art that what can be reasonably expected to be done without them. Conservative substitutions occur within a family of related amino acids in their side chains. Genetically encoded amino acids are divided into four families: (1) acidic = aspartate, glutamate; (2) basic = lysine, arginine, histidine; (3) non-polar = alanine, valine, leucine. , Isoleucine, proline, phenylalanine, methionine, tryptophan; and (4)
Uncharged polarity = glycine, asparagine, glutamine, cysteine, serine, threonine, tyrosine. Phenylalanine, tryptophan, and tyrosine are sometimes co-classified as aromatic amino acids. Similarly, the amino acid repertoire is
(1) Acidic = aspartate, glutamate; (2) Basic = lysine, arginine, histidine; (3) Aliphatic = glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, serine, threonine, where serine and threonine are optionally fat. (4) aromatic = phenylalanine, tyrosine,
Tryptophan; (5) amide = asparagine, glutamine; and (6) sulfur content = classified into cysteine and methionine (eg Biochemistry, 2nd e
d., Ed. by L. Stryer, WH Freeman and Co .: 1981). Whether a change in the amino acid sequence of a peptide produces a functional MIF homologue (eg, functional in the sense of acting to mimic or antagonize the wild-type form) depends on the type of cell similar to the wild-type protein. Can be readily determined by assessing the ability of the mutant peptide to produce a response to, or competitively suppress such a response. Polypeptides with one or more substitutions can be easily tested in the same way.

【０１５９】 本発明の方法は、天然発生MIFタンパク質の相同体を使用して実施できること
が明確に予想される。ある実施の形態において、本発明は、無作為配列の突然変
異誘発により産生されるMIFポリペプチドの使用を考慮に入れる。当該技術にお
いて知られるように、そのような方法は、点突然変異体および切断突然変異体の
産生に都合がよく、天然MIFタンパク質に擬態するまたは拮抗する潜在的突然変
異体配列（例えば相同体）の同定に特に有用である。説明のために、MIF相同体
は、天然MIFタンパク質のオリゴマー複合体の機能を妨げる、例えば野生型タン
パク質の機能を弱める本発明の方法により作成できる。MIFは、生物学的活性の
少なくとも一部に重要かもしれない三量体の複合体を形成することが知られてい
る。優性陰性MIF相同体は、野生型MIFのp53バイパス活性を抑制するために使用
できる。他の実施の形態において、そのような突然変異分析は、タンパク質の種
々の活性を示すために使用できる。例えば、タンパク質のp53バイパス活性は、
タウトメラーゼ(tautomerase)活性のようなタンパク質の他の活性から分離され
てもよい。さらに、本発明の方法によるMIFのある領域の操作は、細胞外基質に
由来するおよび/または細胞外基質成分に結合する他のタンパク質の部分を取り
込むような、融合タンパク質における使用により適切な領域を提供できる。It is clearly envisaged that the method of the invention can be carried out using homologues of naturally occurring MIF proteins. In certain embodiments, the present invention allows for the use of MIF polypeptides produced by mutagenesis of random sequences. As is known in the art, such methods favor the production of point and truncation mutants, and potentially mutant sequences that mimic or antagonize the native MIF protein (eg, homologues). Is particularly useful for identifying For illustration, MIF homologues can be made by the methods of the invention that interfere with the function of the oligomeric complex of the native MIF protein, eg, weaken the function of the wild-type protein. MIF is known to form a trimeric complex that may be important for at least some of its biological activity. A dominant negative MIF homolog can be used to suppress the p53 bypass activity of wild-type MIF. In other embodiments, such mutational analysis can be used to show different activities of the protein. For example, the p53 bypass activity of a protein is
It may be separated from other activities of the protein such as tautomerase activity. Furthermore, manipulation of a region of MIF by the methods of the invention will render the region more suitable for use in fusion proteins, such as incorporating portions of other proteins that are derived from and / or bind extracellular matrix components. Can be provided.

【０１６０】 無作為配列突然変異誘発の技術の状態をさらに説明するために、Gallop et al
.(1994)J Med Chem 37:1233の記事には、１９９０年代初期の無作為配列ライブ
ラリーの技術の一般的な状態が記載されていることを示す。特に、Gallop et al
は１２３９ページで、「類似体のライブラリーのスクリーニングは、活性のある
配列の最小サイズを測定し、結合に対し臨界で置換を受けないこれらの残基の同
定を促進する」と述べる。さらに、Landner et al.の国際特許出願公開第90/028
09号、Goeddel et al.の米国特許第5,223,408号、およびMarkland et al.の国際
特許出願公開第92/15679号には、すばやくスクリーニングして、MIFポリペプチ
ドの特定の活性を保有する突然変異体/断片を同定できるMIF突然変異体のライブ
ラリを作成するために当業者が利用できる特定の技術が示されている。これらの
技術は例であり、関連する突然変異体/切断体の大きいライブラリを作成し分析
して、過度の実験をせずに特定の突然変異体を単離できることを示す。Gustin e
t al.(1993)Virology 193:653、およびBass et al.(1990)Proteins:Structure,F
unction and Genetics 8:309-314。To further explain the state of the art of random sequence mutagenesis, Gallop et al.
(1994) J Med Chem 37: 1233 shows that the general state of the art of random sequence libraries in the early 1990s was described. In particular, Gallop et al
, Page 1239, "Screening a library of analogs measures the minimum size of active sequences and facilitates the identification of those residues that are critical for binding and are not subject to substitution." Further, International Patent Application Publication No. 90/028 of Landner et al.
09, Goeddel et al., US Pat. No. 5,223,408, and Markland et al., International Patent Publication No. / Specific techniques are available to those of skill in the art for creating libraries of MIF mutants that can identify fragments. These techniques are examples and show that large libraries of related mutants / truncates can be generated and analyzed to isolate specific mutants without undue experimentation. Gustin e
t al. (1993) Virology 193: 653, and Bass et al. (1990) Proteins: Structure, F.
unction and Genetics 8: 309-314.

【０１６１】 実際には、生物学的機能に対して残基が臨界であることを前もって考えなくて
も、MIFタンパク質の大規模の突然変異誘発は、等しい生物学的活性を有する突
然変異体を広く配置するということが無作為配列の突然変異誘発から明らかであ
る。さらに、臨界残基の前もっての理解または知識の必要性を全て除去する徹底
的な分析により、数１０億の異なる突然変異体をスクリーニングすることは、無
作為配列技術の能力である。In practice, large-scale mutagenesis of MIF proteins, even without prior thinking that residues are critical for biological function, resulted in mutants with equal biological activity. Widespread placement is evident from random sequence mutagenesis. Furthermore, it is the ability of random sequence technology to screen billions of different mutants by exhaustive analysis that eliminates any prior understanding or need for knowledge of critical residues.

【０１６２】 説明のために、MIF相同体または他の関連するタンパク質の母集団についてア
ミノ酸配列を、好ましくはできるだけ最高の相同性を得るように、整合する。例
えば図１参照。そのような突然変異体の母集団は、例えば１つ以上の種からのMI
F相同体を含んでもよい。整合された配列のそれぞれの位置に現れるアミノ酸を
選択して、無作為配列の変性セットを作成する。好ましい実施の形態において、
MIF突然変異体のふ入りライブラリを、核酸レベルにおいて無作為配列突然変異
誘発により作成し、ふ入り遺伝子ライブラリによりコードする。例えば、合成オ
リゴヌクレオチドの混合物を遺伝子配列中に酵素でライゲーションすることによ
り、潜在的なMIF配列の変性セットは、個々のポリペプチドとして、あるいはMIF
配列を内部に含有するより大きい融合タンパク質のセット（例えばファージの表
示について）として発現可能である。For illustration purposes, the amino acid sequences for the MIF homologues or other related protein populations are aligned, preferably in order to obtain the highest homology possible. See, for example, FIG. The population of such mutants may be, for example, MI from one or more species.
It may include an F homolog. The amino acids that occur at each position in the aligned sequences are selected to create a degenerate set of random sequences. In a preferred embodiment,
A stuffed library of MIF mutants was generated by random sequence mutagenesis at the nucleic acid level and encoded by a stuffed gene library. For example, by enzymatically ligating a mixture of synthetic oligonucleotides into a gene sequence, a degenerate set of potential MIF sequences can be generated as individual polypeptides or as MIF.
It can be expressed as a larger set of fusion proteins (for display of phage, for example) containing the sequence internally.

【０１６３】 説明のための実施の形態において、種々の哺乳類MIFタンパク質の整合は、一
般式： MPMFXVNTNVPRASVPXGFLSELTQQLAQATGKXPQYIAVHVVPDQLMXFXGXXXPCALCSLHSIGKIGGAQ
NRXYSKLLCGLLXXRLXISPDRXYINXXDMNAAXVGWNXSTFA により示されるMIFポリペプチドの変性セットを産生するために使用でき、変性
位置“X”はそれぞれ、ヒト、マウス、ラットまたはウシMIFクローンの１つにお
ける該位置で生じるアミノ酸でよい、またはライブラリを拡大するため、それぞ
れのXは、それらの位置のそれぞれにおいて天然に発生するアミノ酸についての
保存的置換であるであろうアミノ酸残基の中から選択されてもよい。さらに大き
いライブラリにおいては、それぞれのXは任意のアミノ酸から選択されてもよい
。In an illustrative embodiment, the alignment of various mammalian MIF proteins is described by the general formula: MPMFXVNTNVPRASVPXGFLSELTQQLAQATGKXPQYIAVHVVPDQLMXFXGXXXPCALCSLHSIGKIGGAQ.
NRXYSKLLCGLLXXRLXISPDRXYINXXDMNAAXVGWNXSTFA can be used to produce a modified set of MIF polypeptides, where each modified position "X" can be an amino acid occurring at that position in one of the human, mouse, rat or bovine MIF clones, or the library For expansion, each X may be selected from among the amino acid residues that would be a conservative substitution for the naturally occurring amino acid at each of those positions. In larger libraries, each X may be selected from any amino acid.

【０１６４】 潜在的なMIF相同体のライブラリを変性オリゴヌクレオチド配列から産生でき
る多くの方法がある。変性遺伝子配列の化学的合成をDNA自動合成装置中で行う
ことができ、次に合成遺伝子を適切な発現ベクター中にライゲーションする。遺
伝子の変性セットの目的は、１つの混合物中で、潜在的なMIF配列の所望のセッ
トをコードする全ての配列を提供することである。変性オリゴヌクレオチドの合
成は、当該技術においてよく知られている（例えば、Narang,SA(1983)Tetrahedr
on 39:3;Itakura et al.(1981)Recombinant DNA,Proc 3rd Cleveland Sympos.Ma
cromolecules,ed.AG Walton,Amsterdam:Elselvier pp273-289;Itakura et al.(1
984)Annu.Rev.Biochem.53:323;Itakura et al.(1984)Science 198:1056;Ike et
al.(1983)Nucleic Acid Res.11:477参照）。そのような技術は、他のタンパク質
の定方向進化に使用されてきた（例えば、Scott et al.(1990)Science 249:386-
390;Roberts et al.(1992)PNAS 89:2429-2433;Devlin et al.(1990)Science 249
:404-406;Cwirla et al.(1990)PNAS 87:6378-6382;並びに米国特許第5,223,409
号、同第5,198,346号、および同第5,096,815号参照）。There are many ways in which a library of potential MIF homologues can be produced from degenerate oligonucleotide sequences. Chemical synthesis of degenerate gene sequences can be performed in an automated DNA synthesizer and the synthetic gene is then ligated into an appropriate expression vector. The purpose of the degenerate set of genes is to provide, in one mixture, all the sequences that encode the desired set of potential MIF sequences. Synthesis of degenerate oligonucleotides is well known in the art (eg, Narang, SA (1983) Tetrahedr.
on 39: 3; Itakura et al. (1981) Recombinant DNA, Proc 3rd Cleveland Sympos.Ma
cromolecules, ed.AG Walton, Amsterdam: Elselvier pp273-289; Itakura et al. (1
984) Annu. Rev. Biochem. 53: 323; Itakura et al. (1984) Science 198: 1056; Ike et
al. (1983) Nucleic Acid Res. 11: 477). Such techniques have been used for directed evolution of other proteins (eg, Scott et al. (1990) Science 249: 386-
390; Roberts et al. (1992) PNAS 89: 2429-2433; Devlin et al. (1990) Science 249.
: 404-406; Cwirla et al. (1990) PNAS 87: 6378-6382; and U.S. Pat.No. 5,223,409.
No. 5,198,346, and No. 5,096,815).

【０１６５】 点突然変異により作成された無作為配列ライブラリの遺伝子産物のスクリーニ
ングについて、およびある特性を有する遺伝子産物についてのcDNAライブラリの
スクリーニングについて、当該技術において広い範囲の技術が知られている。そ
のような技術は通常、MIF相同体の無作為配列突然変異誘発により作成される遺
伝子ライブラリの急速なスクリーニングに適合できるであろう。大きい遺伝子ラ
イブラリのスクリーニングに最も広く使用されている技術は、通常、遺伝子ライ
ブラリを複製可能な発現ベクター中にクローニングし、生じたベクターのライブ
ラリで適切な細胞を形質転換し、所望の活性の検出が、産物が検出された遺伝子
をコードするベクターの相対的に容易な単離を促進する条件下で、無作為配列遺
伝子を発現させる、各工程を含む。以下に記載される説明のための分析はそれぞ
れ、無作為配列突然変異誘発技術により産生される多数の変性MIF配列のスクリ
ーニングに必要であるとして高処理量分析で分析できる。A wide range of techniques are known in the art for screening gene products of random sequence libraries generated by point mutations and for screening cDNA libraries for gene products having certain properties. Such techniques would typically be compatible with the rapid screening of gene libraries generated by random sequence mutagenesis of MIF homologues. The most widely used technique for screening large gene libraries is usually to clone a gene library into a replicable expression vector, transform the appropriate cells with the resulting library of vectors, and detect the desired activity. , Expressing a random sequence gene under conditions that facilitate relatively easy isolation of the vector encoding the gene for which the product was detected. Each of the illustrative analyzes described below can be analyzed in a high-throughput assay as needed to screen a large number of degenerate MIF sequences produced by random sequence mutagenesis techniques.

【０１６６】 ある実施の形態において、無作為配列ライブラリは、上述のようにGFP-p53細
胞と共培養できる真核細胞のトランスフェクションに使用する。無作為配列ライ
ブラリを発現させる細胞により分泌される機能性MIFタンパク質は、隣接するMEF
細胞に拡散し、増殖を誘発する。増殖の検出のパターンは、勾配機能に類似し、
上皮細胞に関し増殖因子として活性のあるMIF相同体を産生する細胞を単離する
（通常は分泌の数回の反復後）。同様にMIF拮抗薬は、同様の方法で、機能性拮
抗薬を産生する細胞が培養培地に加えられる野生型MIFの効果から隣接する細胞
を保護できる（例えば増殖を抑制する）ことにより分泌できる。In one embodiment, the random sequence library is used for transfection of eukaryotic cells that can be co-cultured with GFP-p53 cells as described above. A functional MIF protein secreted by cells expressing a random sequence library is
Diffuses into cells and induces proliferation. The pattern of detection of proliferation is similar to the gradient function,
Cells that produce MIF homologues that are active as growth factors for epithelial cells are isolated (usually after several rounds of secretion). Similarly, MIF antagonists can be secreted in a similar manner by allowing the cells producing the functional antagonist to protect adjacent cells from the effects of wild-type MIF added to the culture medium (eg, suppress proliferation).

【０１６７】 説明のために、標的のFP-p53処理された細胞を、２４穴マイクロタイタープレ
ート中で培養した。他の真核細胞を、無作為配列MIF遺伝子ライブラリでトラン
スフェクションし、マイクロタイタープレートのウェルに適合できる細胞培養イ
ンサート（例えばCollaborative Biomedical Products,Catalog #40446）中で培
養する。インサート中で細胞により分泌される組換えMIF相同体が、インサート
の有孔の底部を通って拡散しマイクロタイタープレートのウェル中で標的細胞に
接触できるように、細胞培養インサートをウェル中に配置する。MIFタンパク質
の機能性形態が標的細胞中に増殖のような測定可能な反応を産生するのに十分な
時間の後、インサートを除去し、標的細胞上の突然変異体MIFタンパク質の効力
を測定する。活性に対し陽性を示す細胞に対応するインサートからの細胞を分離
しいくつかのインサート上で再び培養し、この工程を活性のあるクローンが同定
されるまで繰り返す。For illustration, target FP-p53 treated cells were cultured in 24-well microtiter plates. Other eukaryotic cells are transfected with a random sequence MIF gene library and cultured in cell culture inserts compatible with the wells of microtiter plates (eg Collaborative Biomedical Products, Catalog # 40446). Position the cell culture insert in the well so that the recombinant MIF homologue secreted by the cells in the insert diffuses through the perforated bottom of the insert and can reach the target cells in the wells of the microtiter plate. . After a time sufficient for the functional form of the MIF protein to produce a measurable response such as proliferation in the target cell, the insert is removed and the potency of the mutant MIF protein on the target cell is measured. Cells from the inserts corresponding to cells positive for activity are separated and re-cultivated on some inserts and this process is repeated until active clones are identified.

【０１６８】 無作為配列突然変異誘発は、例えば１０^２６分子のオーダーで、突然変異体タ
ンパク質の非常に大きいライブラリを産生する潜在性を有する。このサイズの無
作為配列ライブラリは、ファージ表示のような高処理量スクリーニング分析を使
用しても技術的にスクリーニングが困難かもしれない。この問題を克服するため
に、ランダムライブラリ中の非機能性タンパク質が非常に高い割合になるのを防
止し機能性タンパク質の頻度だけを高め、従って配列スペースの有用なサンプリ
ングの達成に必要とされる複雑性を減少する、回帰的集合突然変異誘発(REM)と
いう新しい技術が最近開発された。REMは、適切な選択またはスクリーニング方
法が使用されるとライブラリ中で機能性突然変異体の頻度を高めるアルゴリズム
である(Arkin and Yourvan,1992,PNAS USA 89:7811-7815;Yourvan et al.,1992,
Parallel Problem Solving from Nature,2.,In Maenner and Manderick,eds.,El
sevir Publishing Co.,Amsterdam,pp.401-410;Delgrave et al.,1993,Protein E
ngineering 6(3):327-331）。Random sequence mutagenesis has the potential to produce very large libraries of mutant proteins, for example on the order of 10 ²⁶ molecules. Random sequence libraries of this size may be technically difficult to screen using high throughput screening assays such as phage display. To overcome this problem, we prevent a very high proportion of non-functional proteins in a random library and only increase the frequency of functional proteins, and thus are needed to achieve useful sampling of sequence space. A new technique, recursive set mutagenesis (REM), has been recently developed that reduces complexity. REM is an algorithm that increases the frequency of functional mutants in libraries when appropriate selection or screening methods are used (Arkin and Yourvan, 1992, PNAS USA 89: 7811-7815; Yourvan et al., 1992). ,
Parallel Problem Solving from Nature, 2., In Maenner and Manderick, eds., El
sevir Publishing Co., Amsterdam, pp. 401-410; Delgrave et al., 1993, Protein E
ngineering 6 (3): 327-331).

【０１６９】 本発明はまた、野生型MIFを模倣または抑制する擬似体、例えばペプチドまた
は非ペプチド因子を産生するためのMIFタンパク質の整復を提供する。従って、
上述のそのような突然変異誘発性技術もまた、生物学的活性に臨界であるMIFタ
ンパク質の決定因子を位置付けるのに有用である。例えば、活性に関係する本発
明のMIFタンパク質のそれぞれのアミノ酸残基を位置付けるスキャンニング突然
変異誘発の使用により、MIF活性を模倣または抑制するペプチド擬態物化合物を
産生できる。例えば、そのような残基の加水分解できないペプチド類似物は、ベ
ンゾジアゼピン（例えば、Freidinger et al.in Peptides:Chemistry and Biolo
gy,G.R.Marshall ed.,ESCOM Publisher:Leiden,Netherlands,1988参照）、アゼ
ピン（例えば、Huffman et al.in Peptides:Chemistry and Biology,G.R.Marsha
ll ed.,ESCOM Publisher:Leiden,Netherlands,1988参照）、置換されたガマラク
タムリング（Garvey et al.in Peptides:Chemistry and Biology,G.R.Marshall
ed.,ESCOM Publisher:Leiden,Netherlands,1988）、ケト−メチレンペプチド擬
態物（Ewensin et al.(1986)J Med Chem 29:295;およびEwenson et al.in Pepti
des:Structure and Function(Proceedings of the 9thAmerican Peptide Sympos
iumPierce Chemical Co.Rockland,IL,1985）、β−ターンジペプチドコア（Naga
i et al.(1985)Tetrahedron Lett 26:647;およびSato et al.(1986)J Chem Soc
Perkin Trans 1:1231）、およびβ−アミノアルコール（Gordon et al.(1985)Bi
ochem Biophys Res Commun 126:419;およびDann et al.(1986)Biochem Biophys
Res Commun 134:71）を使用して産生できる。The present invention also provides mimicking or suppressing mimetics of wild-type MIF, eg, reduction of MIF proteins to produce peptide or non-peptide factors. Therefore,
Such mutagenic techniques described above are also useful in locating determinants of MIF proteins that are critical for biological activity. For example, the use of scanning mutagenesis to position each amino acid residue of the MIF protein of the invention that is involved in activity can produce peptidomimetic compounds that mimic or suppress MIF activity. For example, non-hydrolyzable peptidomimetics of such residues are described by benzodiazepines (eg Freidinger et al. In Peptides: Chemistry and Biolo
gy, GRMarshall ed., ESCOM Publisher: Leiden, Netherlands, 1988), azepine (for example, Huffman et al. in Peptides: Chemistry and Biology, GRMarsha.
ed., ESCOM Publisher: Leiden, Netherlands, 1988), a substituted gammalactam ring (Garvey et al. in Peptides: Chemistry and Biology, GRMarshall.
ed., ESCOM Publisher: Leiden, Netherlands, 1988), keto-methylene peptidomimetics (Ewensin et al. (1986) J Med Chem 29: 295; and Ewenson et al. in Pepti.
des: Structure and Function (Proceedings of the 9thAmerican Peptide Sympos
iumPierce Chemical Co. Rockland, IL, 1985), β-turn dipeptide core (Naga
i et al. (1985) Tetrahedron Lett 26: 647; and Sato et al. (1986) J Chem Soc.
Perkin Trans 1: 1231), and β-amino alcohol (Gordon et al. (1985) Bi
ochem Biophys Res Commun 126: 419; and Dann et al. (1986) Biochem Biophys.
Res Commun 134: 71).

【０１７０】 MIFタンパク質の組換え産生形態は、例えば、少なくとも１つの転写調節配列
に機能できるように結合されたMIFポリペプチドをコードする核酸を含有する発
現ベクターを使用して産生できる。機能できるように結合されたとは、ヌクレオ
チド配列を発現させるようにヌクレオチド配列が調節配列に結合されることを意
味する。調節配列は既知の技術であり、MIFポリペプチドを直接発現するように
選択される。従って、転写調節配列という用語は、プロモーター、エンハンサー
および他の発現制御エレメントを含む。そのような調節配列は、Goeddel;Gene E
xpression Technology:Methods in Enzymology 185,Academic Press,San Diego,
CA(1990)に記載されている。例えば、機能できるように結合されるとDNA配列の
発現を制御する配列である、様々の発現制御配列のいずれも、MIFポリペプチド
をコードするDNA配列を発現するこれらのベクター中で使用してよい。そのよう
な有用な発現制御配列は、例えば、モロニーマウス白血病ウイルスのLTRのよう
なウイルス性LTR、SV40の初期および後期プロモーター、アデノウイルスまたは
サイトメガロウイルスの即初期プロモーター、lac系、trp系、TACまたはTRC系、
T7 RNAポリメラーゼにより発現が行われるT7プロモーター、λファージの主要な
オペレーターおよびプロモーター領域、fdコートタンパク質に対するコントロー
ル領域、３−ホスホグリセレートキナーゼまたは他の解糖酵素に対するプロモー
ター、酸性ホスファターゼのプロモーター、例えばPho5、酵母α−交配因子のプ
ロモーター、バキュロウイルス系の多角体プロモーターおよび原核細胞または真
核細胞またはそのウイルスの遺伝子の発現を制御することが知られている他の配
列、およびそれらの様々の組合せを含む。発現ベクターの作成は、形質転換され
る宿主細胞の選択および/または発現されるのが所望のタンパク質の種類のよう
な因子に依存し得ることを理解すべきである。さらに、ベクターのコピー数、該
コピー数を制御する能力および抗生物質標識のようなベクターによりコードされ
る他のタンパク質の発現も考慮に入れなければならない。Recombinantly produced forms of the MIF protein can be produced, for example, using an expression vector containing a nucleic acid encoding a MIF polypeptide operably linked to at least one transcriptional regulatory sequence. Operably linked means that the nucleotide sequence is linked to regulatory sequences so that the nucleotide sequence is expressed. Regulatory sequences are well known in the art and are chosen to directly express the MIF polypeptide. Thus, the term transcriptional regulatory sequence includes promoters, enhancers and other expression control elements. Such regulatory sequences are described in Goeddel; Gene E
xpression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego,
It is described in CA (1990). Any of a variety of expression control sequences may be used in these vectors expressing a DNA sequence encoding a MIF polypeptide, eg, a sequence that, when operably linked, controls the expression of a DNA sequence. . Such useful expression control sequences include, for example, viral LTRs such as those of Moloney murine leukemia virus, early and late promoters of SV40, immediate-early promoters of adenovirus or cytomegalovirus, lac system, trp system, TAC. Or TRC system,
T7 promoter expressed by T7 RNA polymerase, major operator and promoter region of λ phage, control region for fd coat protein, promoter for 3-phosphoglycerate kinase or other glycolytic enzymes, promoter of acid phosphatase, such as Pho5 , The yeast α-mating factor promoter, the baculovirus polyhedrin promoter and other sequences known to control the expression of genes in prokaryotic or eukaryotic cells or their viruses, and various combinations thereof. Including. It should be appreciated that the construction of an expression vector may depend on such factors as the choice of host cell to be transformed and / or the type of protein desired to be expressed. In addition, the vector's copy number, the ability to control that copy number, and the expression of other proteins encoded by the vector, such as antibiotic tags, must also be considered.

【０１７１】 精製に容易なMIFポリペプチド供給源の提供に加えて、本発明の遺伝子構成物
はまた、MIFポリペプチドの作用または拮抗形態をコードする核酸を供給する遺
伝子治療方法の一部として使用できる。従って、本発明の別の態様は、特に標的
組織中でMIFポリペプチドの異所性発現を起こす細胞種中で、インビボにおけるM
IFポリペプチドのトランスフェクションをするための発現ベクターを特徴とする
。In addition to providing a source of MIF polypeptide that is easy to purify, the genetic constructs of the present invention may also be used as part of a method of gene therapy to provide a nucleic acid encoding a functional or antagonistic form of a MIF polypeptide. it can. Thus, another aspect of the invention is that M cells in vivo, particularly in cell types that cause ectopic expression of MIF polypeptides in target tissues.
It features an expression vector for transfecting an IF polypeptide.

【０１７２】 そのような発現構成物の製剤は、任意の生物学的に有効なキャリア、例えば、
インビボにおいて細胞に組換え遺伝子を効果的に供給できる任意の配合物または
組成物中に投与してもよい。アプローチとしては、組換えレトロウイルス、アデ
ノウイルス、アデノ関連ウイルス、およびＩ型単純ヘルペスウイルス、または組
換え細菌または真核プラスミドを含むウイルスベクター中のMIF暗号配列の挿入
が挙げられる。ウイルスベクターは細胞を直接的にトランスフェクションする。
プラスミドＤＮＡは、例えば、カチオン性リポソーム（リポフェクチン）または
誘導化（例えば、接合抗体）、ポリリシン接合体、グラマシジンＳ、人工ウイル
スエンベロープまたは他のそのような細胞間キャリアの助けにより、並びに遺伝
子構成物の直接の注射またはインビボで行われるCaPO₄沈殿により、供給するこ
とができる。適切な標的細胞の形質導入は遺伝子治療における重要な最初の段階
を意味するので、特定の遺伝子供給系の選択は、意図した標的の表現型および投
与の経路、例えば、局部または全身のような要因に依存することが認識されよう
。さらに、インビボにおけるMIF発現の形質導入のために提供される特定の遺伝
子構成物もまた、インビトロにおける細胞の形質導入、例えば以下に記載される
半ビボの組織培養系における使用に有用であることが認識されるであろう。Formulations of such expression constructs may be prepared using any biologically effective carrier, eg
It may be administered in any formulation or composition that can effectively supply the recombinant gene to the cells in vivo. Approaches include insertion of the MIF coding sequence in recombinant retroviruses, adenoviruses, adeno-associated viruses, and herpes simplex virus type I, or viral vectors containing recombinant bacterial or eukaryotic plasmids. Viral vectors directly transfect cells.
Plasmid DNA can be used, for example, with the aid of cationic liposomes (lipofectin) or derivatization (eg, conjugated antibodies), polylysine conjugates, gramicidin S, artificial viral envelopes or other such intracellular carriers, as well as of genetic constructs. It can be delivered by direct injection or CaPO ₄ precipitation performed in vivo. Since the transduction of appropriate target cells represents an important first step in gene therapy, the choice of a particular gene delivery system depends on factors such as the intended target phenotype and route of administration, eg local or systemic. It will be recognized that it depends on. In addition, certain genetic constructs provided for transduction of MIF expression in vivo may also be useful for transduction of cells in vitro, eg, for use in the ex vivo tissue culture system described below. Will be recognized.

【０１７３】 MIFポリペプチドをコードする核酸を細胞中に導入する好ましいアプローチは
、遺伝子産生物をコードする核酸、例えば、ｃＤＮＡを含有するウイルスベクタ
ーを使用することによるものである。細胞をウイルスベクターで感染させること
には、標的とされる細胞の大部分が核酸を受容できるという利点がある。さらに
、そのウイルスベクター内に、例えば、該ウイルスベクター内に含まれるｃＤＮ
Ａによりコードされた分子は、ウイルスベクター核酸を吸収した細胞中において
効率的に発現される。A preferred approach to introducing a nucleic acid encoding a MIF polypeptide into a cell is by using a viral vector containing a nucleic acid encoding a gene product, eg, a cDNA. Infecting cells with viral vectors has the advantage that most of the targeted cells can receive the nucleic acid. Furthermore, in the viral vector, for example, the cDNA contained in the viral vector
The molecule encoded by A is efficiently expressed in cells that have taken up the viral vector nucleic acid.

【０１７４】 レトロウイルスベクターおよびアデノ関連ウイルスベクターは一般的に、外因
性遺伝子をインビボに、特に、ヒト中に移入するための、より抜きの組換え遺伝
子供給系であると考えられている。これらのベクターは、遺伝子を細胞中に効率
的に供給し、移入された核酸は、宿主の染色体ＤＮＡ中に安定に組み込まれる。
レトロウイルスを使用するための主な必須条件は、特に野生型ウイルスが細胞個
体群中に広がる可能性に関して、それらの使用の安全性を確実にすることにある
。増殖欠陥レトロウイルスのみを産生する特殊細胞系統（「パッケージング細胞
」と称される）の発展により、遺伝子治療にレトロウイルスを利用することが多
くなり、欠陥レトロウイルスが遺伝子治療目的のための遺伝子移入に使用するた
めに明確に特徴付けられている（Miller, A.D. (1990) Blood 76:271を参照のこ
と）。したがって、レトロウイルス暗号配列の一部（ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ）
が、MIFポリペプチドをコードする核酸により置換されて、レトロウイルスが増
殖欠陥となった組換えレトロウイルスを構成することができる。次いで、この増
殖欠陥レトロウイルスは、標準的な技法によってヘルパーウイルスを使用するこ
とにより標的細胞を感染させるのに用いることができるウイルス粒子中にパッケ
ージされる。組換えレトロウイルスを産生し、そのようなウイルスで細胞をイン
ビトロまたはインビボで感染させるプロトコルが、Current Protocols in Molec
ular Biology, Ausubel, F.M. et al. (eds.) Greene Publishing Associates,
(1989), Sections 9.10-9.14および他の標準的な研究所手引き書に見ることがで
きる。適切なレトロウイルスの例としては、当業者によく知られているｐＬＪ、
ｐＺＩＰ、ｐＷＥおよびｐＥＭが挙げられる。環境栄養性レトロウイルスおよび
両栄養性レトロウイルスの両方を調製するのに適したパッケージングウイルス系
統の例としては、ΨＣｒｉｐ、ΨＣｒｅ、Ψ２およびΨＡｍが挙げられる。神経
細胞、上皮細胞、内皮細胞、リンパ球、筋芽細胞、肝細胞、骨髄細胞を含む多く
の異なる種類の細胞中にインビトロおよび／またはインビボで様々な遺伝子を導
入するのにレトロウイルスが用いられてきた（例えば、Eglitis et al. (1985)
Science 230:1395-1398; Danos and Mulligan (1988) Proc.Natl.Acad.Sci. USA
85:6460-6464; Wilson et al. (1988) Proc.Natl.Acad.Sci. USA 85:3014-3018
; Armentano et al. (1990) Proc.Natl.Acad.Sci. USA 87:6141-6145; Huber et
al. (1991) Proc.Natl.Acad.Sci. USA 88:8039-8043; Ferry et al. (1991) Pr
oc.Natl.Acad.Sci. USA 88:8377-8381; Chowdhury et al. (1991) Science 254:
1802-1805; van Beusechem et al. (1992) Proc.Natl.Acad.Sci. USA 89:7640-7
644; Kay et al. (1992) Human Gene Therapy 3:641-647; Dai et al. (1992) P
roc.Natl.Acad.Sci. USA 89:10892-10895; Hwu et al. (1993) J.Immunol. 150:
4104-4115; 米国特許第4,868,116号; 米国特許第4,980,286号; ＰＣＴ出願公開
第WO89/07136号; ＰＣＴ出願公開第WO89/02468号; ＰＣＴ出願公開第WO89/05345
号; ＰＣＴ出願公開第WO92/07573号を参照のこと）。Retroviral vectors and adeno-associated viral vectors are generally considered to be the preferred recombinant gene delivery system for the transfer of exogenous genes in vivo, particularly into humans. These vectors efficiently deliver the gene into the cell and the transferred nucleic acid is stably integrated into the chromosomal DNA of the host.
The main prerequisite for using retroviruses is to ensure the safety of their use, especially as regards the possibility of wild-type viruses spreading into the cell population. With the development of specialized cell lines that produce only growth-defective retroviruses (referred to as "packaging cells"), retroviruses are often used for gene therapy, and defective retroviruses are the genes for gene therapy purposes. It has been well characterized for use in transfer (see Miller, AD (1990) Blood 76: 271). Therefore, a part of the retrovirus coding sequence (gag, pol, env)
Can be replaced by a nucleic acid encoding a MIF polypeptide to construct a recombinant retrovirus in which the retrovirus is growth defective. This growth defective retrovirus is then packaged by standard techniques into viral particles that can be used to infect target cells by using helper viruses. Protocols that produce recombinant retroviruses and infect cells in vitro or in vivo with such viruses are described in Current Protocols in Molec.
ular Biology, Ausubel, FM et al. (eds.) Greene Publishing Associates,
(1989), Sections 9.10-9.14 and other standard laboratory handbooks. Examples of suitable retroviruses are pLJ, which is well known to those skilled in the art.
Included are pZIP, pWE and pEM. Examples of packaging virus strains suitable for preparing both ecotropic and amphotropic retroviruses include ΨCrip, ΨCre, Ψ2 and ΨAm. Retroviruses have been used to introduce various genes in vitro and / or in vivo into many different cell types including neural cells, epithelial cells, endothelial cells, lymphocytes, myoblasts, hepatocytes, bone marrow cells. (Eg Eglitis et al. (1985)
Science 230: 1395-1398; Danos and Mulligan (1988) Proc.Natl.Acad.Sci. USA
85: 6460-6464; Wilson et al. (1988) Proc.Natl.Acad.Sci. USA 85: 3014-3018.
Armentano et al. (1990) Proc.Natl.Acad.Sci. USA 87: 6141-6145; Huber et
al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 8039-8043; Ferry et al. (1991) Pr.
oc.Natl.Acad.Sci. USA 88: 8377-8381; Chowdhury et al. (1991) Science 254:
1802-1805; van Beusechem et al. (1992) Proc.Natl.Acad.Sci. USA 89: 7640-7
644; Kay et al. (1992) Human Gene Therapy 3: 641-647; Dai et al. (1992) P
roc.Natl.Acad.Sci. USA 89: 10892-10895; Hwu et al. (1993) J. Immunol. 150:
4104-4115; U.S. Patent No. 4,868,116; U.S. Patent No. 4,980,286; PCT Application Publication No. WO89 / 07136; PCT Application Publication No. WO89 / 02468; PCT Application Publication No. WO89 / 05345.
No .; see PCT Application Publication No. WO92 / 07573).

【０１７５】 本発明のMIFタンパク質の遺伝子供給系としてレトロウイルスベクターを選択
する際に、ほとんどのレトロウイルスによる標的細胞のうまくいく感染、したが
って、組換え遺伝子の安定な導入の必須条件は、標的細胞が***していなければ
ならないことであるということに留意することが重要である。一般的に、この必
要条件は、本発明のMIF遺伝子構成物を供給するためにレトロウイルスを使用す
ることへの障害にはならない。実際に、そのような感染における制限は、標的細
胞を囲む組織（例えば形質転換されない細胞）が多くの細胞***を受けずしたが
ってレトロウイルスベクターによる感染に抵抗力がある場合に有益である。In selecting a retroviral vector as the gene delivery system for the MIF protein of the present invention, the prerequisite for successful infection of the target cell by most retroviruses, and thus the stable introduction of the recombinant gene, is the target cell It is important to note that is that it must be split. In general, this requirement does not impede the use of retroviruses to supply the MIF gene constructs of the invention. Indeed, the limitation in such infections is beneficial when the tissues surrounding the target cells (eg, untransformed cells) do not undergo many cell divisions and are therefore resistant to infection by retroviral vectors.

【０１７６】 さらに、ウイルス粒子の表面上のウイルスパッケージングタンパク質を変更す
ることにより、レトロウイルスの、そしてその結果として、レトロウイルスベー
スのベクターの感染スペクトルを制限できることが示されている（例えば、ＰＣ
Ｔ出願公開第WO93/25234号、同第WO94/06920号、および同第WO94/11524号を参照
のこと）。例えば、レトロウイルスベクターの感染スペクトルを変更する戦略と
しては、ウイルスｅｎｖタンパク質に細胞表面抗原に特異的な抗体を結合させる
こと（Roux et al. (1989) PNAS 86:9079-9083; Julan et al. (1992) J.Gen Vi
rol 73:3251-3255; and Goud et al. (1983) Virology 163:251-254）；または
ウイルスｅｎｖタンパク質に細胞表面リガンドを結合させること（Neda et al.
(1991) J Biol Chem 266:14143-14146）が挙げられる。結合は、タンパク質また
は他の種類との化学的架橋の形態（例えば、ｅｎｖタンパク質をアシアログリコ
プロテインに転化させるラクトース）にあっても、並びにMIFタンパク質（例え
ば、一本鎖抗体／ｅｎｖ MIFタンパク質）の産生によっても差し支えない。この
技法は、その感染をある組織の種類に制限したり、他の方法で指示したりするの
に有用である一方で、環境栄養性ベクターを両栄養性ベクターに転化させるのに
も使用することができる。Furthermore, it has been shown that modifying the viral packaging proteins on the surface of viral particles can limit the infection spectrum of retroviruses and, consequently, of retrovirus-based vectors (eg PC.
T Application Publication Nos. WO93 / 25234, WO94 / 06920, and WO94 / 11524). For example, a strategy for altering the infection spectrum of retroviral vectors is to bind antibody specific for a cell surface antigen to the viral env protein (Roux et al. (1989) PNAS 86: 9079-9083; Julan et al. (1992) J. Gen Vi
rol 73: 3251-3255; and Goud et al. (1983) Virology 163: 251-254); or binding a cell surface ligand to the viral env protein (Neda et al.
(1991) J Biol Chem 266: 14143-14146). The binding may be in the form of chemical cross-linking with proteins or other types (eg lactose which converts env proteins to asialoglycoproteins) as well as of MIF proteins (eg single chain antibodies / env MIF proteins). It does not matter if it is produced. While this technique is useful in limiting its infection to certain tissue types and directing it in other ways, it can also be used to convert ecotropic vectors to amphotropic vectors. You can

【０１７７】 さらに、レトロウイルス遺伝子供給の用途は、レトロウイルスベクターのMIF
遺伝子の発現を制御する組織または細胞特異的転写調節配列を使用することによ
りさらに増やすことができる。In addition, the use of retroviral gene delivery is described by the retroviral vector MIF.
It can be further increased by using tissue or cell specific transcriptional regulatory sequences that control the expression of the gene.

【０１７８】 本発明に有用な別のウイルス遺伝子供給系では、アデノウイルス由来ベクター
を使用する。アデノウイルスのゲノムは、そのゲノムが関心のある遺伝子産物を
コードするが、正常な溶菌ウイルス生活周期において増殖する能力に関して不活
性であるように操作することができる（例えば、Berkner et al. (1988) Bio Te
chniques 6:616; Rosenfeld et al. (1991) Science 252:431-434; and Rosenfe
ld et al. (1992) Cell 68:143-155を参照のこと）。アデノウイルス株Ａｄタイ
プ５ ｄｌ３２４またはアデノウイルスの他の株（例えば、Ａｄ２、Ａｄ３、Ａ
ｄ７等）由来の適切なアデノウイルスベクターが当業者によく知られている。組
換えアデノウイルスは、それらが、非***細胞を感染できず、内皮細胞（Lemarc
hand et al. (1992) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:6482-6486）、および平滑筋細
胞（Quantin et al. (1992) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:2581-2584）を含む様
々な細胞の種類を感染させるのに使用できるという点で、ある環境においては有
益なことがある。さらに、ウイルス粒子は、精製および濃度に対して比較的安定
で耐性があり、前述したように、感染性のスペクトルに影響を与えるように変更
することができる。さらに、導入されたアデノウイルスＤＮＡ（およびその中に
含まれる異種ＤＮＡ）は、宿主細胞のゲノム中に組み込まれないが、エピソーム
のままであり、それによって、導入されたＤＮＡが宿主ゲノム（例えば、レトロ
ウイルスＤＮＡ）中に組み込まれる状況における挿入突然変異誘発の結果として
生じることがある潜在的な問題が避けられる。さらに、異種ＤＮＡに関するアデ
ノウイルスゲノムの運搬容量は、他の遺伝子供給ベクターに対して大きい（８キ
ロ塩基まで）（Berkner et al. 前出; Haj-Ahmand and Graham (1986) J.Virol.
57:267）。現在使用されており、したがって、本発明により好まれるほとんど
の増殖欠陥アデノウイルスベクターは、ウイルスＥ１およびＥ３遺伝子の全てま
たは一部が欠失しているが、アデノウイ ルス遺伝材料の80％ほど多くを維持している（例えば、Jones et al. (1979) Ce
ll 16:683; Berkner et al., 前出; and Graham et al. in Methods in Molecul
ar Biology, E.J.Murray, Ed. (Humana, Clifton, NJ, 1991) vol.7.pp.109-127
を参照のこと）。挿入された遺伝子の発現は、例えば、Ｅ１Ａプロモータ、主要
後期プロモータ（major late promoter: ＭＬＰ）および関連リーダー配列、Ｅ
３プロモータ、または外因的に加えられたプロモータ配列の制御下にあることが
できる。Another viral gene delivery system useful in the present invention uses adenovirus-derived vectors. The adenovirus genome can be engineered so that it encodes the gene product of interest, but is inactive with respect to its ability to grow in the normal lytic virus life cycle (eg, Berkner et al. (1988). ) Bio Te
chniques 6: 616; Rosenfeld et al. (1991) Science 252: 431-434; and Rosenfe
ld et al. (1992) Cell 68: 143-155). Adenovirus strain Ad type 5 dl324 or other strains of adenovirus (eg, Ad2, Ad3, A
Suitable adenovirus vectors derived from d7 etc.) are well known to those skilled in the art. Recombinant adenoviruses are not able to infect non-dividing cells because they are not able to infect endothelial cells (Lemarc
hand et al. (1992) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89: 6482-6486), and smooth muscle cells (Quantin et al. (1992) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89: 2581-2584) It may be beneficial in some circumstances in that it can be used to infect a variety of cell types, including Moreover, viral particles are relatively stable and resistant to purification and concentration and can be modified to affect the spectrum of infectivity, as described above. In addition, the introduced adenovirus DNA (and the heterologous DNA contained therein) does not integrate into the host cell's genome, but remains episomal, thereby allowing the introduced DNA to cross the host genome (eg, The potential problems that may arise as a result of insertional mutagenesis in the context of integration into retroviral DNA) are avoided. Furthermore, the carrying capacity of the adenovirus genome for heterologous DNA is large (up to 8 kilobases) relative to other gene delivery vectors (Berkner et al. Supra; Haj-Ahmand and Graham (1986) J. Virol.
57: 267). Most growth-defective adenovirus vectors currently in use, and thus preferred according to the invention, lack all or part of the viral E1 and E3 genes, but contain as much as 80% of the adenovirus genetic material. Maintained (eg Jones et al. (1979) Ce
ll 16: 683; Berkner et al., supra; and Graham et al. in Methods in Molecul.
ar Biology, EJMurray, Ed. (Humana, Clifton, NJ, 1991) vol.7.pp.109-127
checking). The expression of the inserted gene can be expressed, for example, by the E1A promoter, the major late promoter (MLP) and the related leader sequence, E
It can be under the control of three promoters, or an exogenously added promoter sequence.

【０１７９】 本発明のMIFポリペプチドの供給に有用なさらに別のウイルスベクター系はア
デノ関連ウイルス（ＡＡＶ）である。アデノ関連ウイルスは、効率的な増殖およ
び生産的生活周期のためのヘルパーウイルスとして、アデノウイルスまたはヘル
ペスウイルスのような別のウイルスを必要とする天然に存在する欠陥ウイルスで
ある（Muzyczka et al. Curr.Topics in Micro. and Immunol. (1992) 158:97-1
29を参照のこと）。このウイルスは、そのＤＮＡを非***細胞中に組み込むかも
しれない数少ないウイルスの内の１つであり、高い頻度の安定な組込みを示す（
例えば、Flotte et al. (1992) Am.J.Respir.Cell.Mol.Biol. 7:349-356; Samul
ski et al. (1989) J.Virol. 63:3822-3828; and McLaughlin et al. (1989) J.
Virol. 62:1963-1973を参照のこと）。300塩基対ほどの少ないＡＡＶを含有する
ベクターをパッケージングし、組み込むことができる。外因性ＤＮＡの空間は、
4.5ｋｂに制限されている。Tratschin et al. (1985) Mol.Cell.Biol. 5:3251-3
260に記載されたもののようなＡＡＶベクターを用いて、ＤＮＡを細胞中に導入
することができる。様々な核酸がＡＡＶベクターを用いて異なる種類の細胞中に
導入されてきた（例えば、Hermonat et al. (1984) Proc.Natl.Acad.Sci. USA 8
1:6466-6470; Tratschin et al. (1985) Mol.Cell.Biol. 4:2072-2081; Wondisf
ord et al. (1988) Mol.Endocrinol. 2:32-39; Tratschin et al. (1984) J.Vir
ol. 51:611-619; and Flotte et al. (1993) J.Biol.Chem. 268:3781-3790を参
照のこと）。Yet another viral vector system useful for delivery of the MIF polypeptides of the present invention is the adeno-associated virus (AAV). Adeno-associated virus is a naturally occurring defective virus that requires another virus, such as adenovirus or herpesvirus, as a helper virus for efficient growth and productive life cycle (Muzyczka et al. Curr. .Topics in Micro. And Immunol. (1992) 158: 97-1
See 29). This virus is one of the few viruses that may integrate its DNA into non-dividing cells and exhibits a high frequency of stable integration (
Flotte et al. (1992) Am.J.Respir.Cell.Mol.Biol. 7: 349-356; Samul.
ski et al. (1989) J. Virol. 63: 3822-3828; and McLaughlin et al. (1989) J.
Virol. 62: 1963-1973). Vectors containing as little as 300 base pairs of AAV can be packaged and integrated. The space of exogenous DNA is
It is limited to 4.5 kb. Tratschin et al. (1985) Mol.Cell.Biol. 5: 3251-3
AAV vectors, such as those described in 260, can be used to introduce DNA into cells. Various nucleic acids have been introduced into different cell types using AAV vectors (eg, Hermonat et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8
1: 6466-6470; Tratschin et al. (1985) Mol.Cell.Biol. 4: 2072-2081; Wondisf
ord et al. (1988) Mol. Endocrinol. 2: 32-39; Tratschin et al. (1984) J. Vir
51: 611-619; and Flotte et al. (1993) J. Biol. Chem. 268: 3781-3790).

【０１８０】 遺伝子治療に用途があるかもしれない他のウイルスベクター系が、ヘルペスウ
イルス、ワクシニアウイルス、およびいくつかのＲＮＡウイルスから由来する。
特に、ヘルペスウイルスベクターは、神経幹細胞のような中枢神経系の細胞、お
よび眼組織中の本発明のMIFタンパク質の連続発現のために独特な戦略を提供す
るであろう（Pepose et al. (1994) Invest Ophthalmol Vis Sci 35:2662-2666
）。Other viral vector systems that may have applications in gene therapy are derived from herpes virus, vaccinia virus, and some RNA viruses.
In particular, herpesvirus vectors will provide a unique strategy for continuous expression of MIF proteins of the invention in cells of the central nervous system, such as neural stem cells, and ocular tissues (Pepose et al. (1994). ) Invest Ophthalmol Vis Sci 35: 2662-2666
).

【０１８１】 上述したようなウイルス移入方法に加えて、非ウイルス方法を用いて、動物の
組織中で本発明のタンパク質の発現を行っても差し支えない。遺伝子を移入させ
るほとんどの非ウイルス方法は、高分子の吸収および細胞内輸送のためにほ乳類
細胞に用いられる正常な機構によるものである。好ましい実施の形態において、
本発明の非ウイルス遺伝子供給系は、標的細胞による遺伝子の取込みのための飲
食作用経路による。この種類の例としての遺伝子供給系としては、リポソーム由
来系、ポリリシン接合体、および人工ウイルスエンベロープが挙げられる。In addition to the viral transfer methods described above, non-viral methods can be used to effect expression of the proteins of the invention in animal tissues. Most non-viral methods of gene transfer are by the normal machinery used in mammalian cells for the uptake and intracellular transport of macromolecules. In a preferred embodiment,
The non-viral gene delivery system of the present invention relies on a dietary pathway for gene uptake by target cells. Examples of gene delivery systems of this type include liposome-derived systems, polylysine conjugates, and artificial viral envelopes.

【０１８２】 ある実施の形態において、本発明のタンパク質の内の１つをコードする遺伝子
は、それらの表面上に正の電荷を担持するリポソーム（例えば、リポフェクチン
）であって、（必要に応じて）標的組織の細胞表面抗原に対する抗体が付けられ
たリポソーム内に閉じ込められていても差し支えない（Mizuno et al. (1992) N
o Shinkei Geka 20:547-551; ＰＣＴ出願公開第WO91/06309号; 日本国特許出願
第1047381号; および欧州特許出願公開第EP-A-43075号）。例えば、神経膠腫細
胞のリポフェクション(lipofection)は、膠腫関連抗原に対するモノクローナル
抗体が付けられたリポソームを用いて行うことができる（Mizuno et al. (1992)
Neurol.Med.Chir. 32:873-876）。In one embodiment, the gene encoding one of the proteins of the invention is a liposome (eg lipofectin) carrying a positive charge on their surface, optionally ) Encapsulation in liposomes loaded with antibodies against the cell surface antigen of the target tissue is not a problem (Mizuno et al. (1992) N
Shinkei Geka 20: 547-551; PCT application publication number WO91 / 06309; Japanese patent application number 1047381; and European patent application publication number EP-A-43075). For example, lipofection of glioma cells can be performed using liposomes loaded with monoclonal antibodies against glioma-associated antigens (Mizuno et al. (1992).
Neurol.Med.Chir. 32: 873-876).

【０１８３】 さらに別の実施の形態において、遺伝子供給系は、ポリリシンのような遺伝子
結合剤により架橋された抗体または細胞表面リガンドを含む（例えば、ＰＣＴ出
願公開第WO93/04701号、同第WO92/22635号、同第WO92/20316号、同第WO92/19749
号、および同第WO92/06180号を参照のこと）。例えば、本発明の遺伝子構成物を
用いて、ポリカチオン、例えば、ポリリシンに接合されたアシアログリコプロテ
インを含む溶性ポリヌクレオチドキャリアを用いたインビボでの肝細胞の移入を
行っても差し支えない（米国特許第5,166,320号を参照のこと）。受容体媒介飲
食作用による本発明の核酸構成物の効果的な供給は、遺伝子のエンドソーム構造
からの逃避を向上させる試薬を用いて改善することができることが認識されよう
。例えば、インフルエンザＨＡ遺伝子産物のフソゲニック(fusogenic)ペプチド
または全アデノウイルスを、供給系の一部として用いて、ＤＮＡ含有エンドソー
ムの効率的な分断を誘発することができる（Mulligan et al. (1993) Science 2
60-926; Wagner et al. (1992) PNAS 89:7934; and Christiano et al. (1993)
PNAS 90:2122）。In yet another embodiment, the gene delivery system comprises an antibody or cell surface ligand cross-linked by a gene binding agent such as polylysine (eg, PCT Application Publication Nos. WO93 / 04701, WO92 / No. 22635, No. WO92 / 20316, No. WO92 / 19749
No., and WO92 / 06180). For example, the gene constructs of the present invention may be used to effect in vivo transfer of hepatocytes using a soluble polynucleotide carrier containing a polycation, eg, asialoglycoprotein conjugated to polylysine (US Pat. See No. 5,166,320). It will be appreciated that the effective delivery of the nucleic acid constructs of the invention by receptor-mediated phagocytosis can be improved with reagents that enhance the escape of genes from the endosomal structure. For example, a fusogenic peptide of the influenza HA gene product or whole adenovirus can be used as part of the delivery system to induce efficient shedding of DNA-containing endosomes (Mulligan et al. (1993) Science. 2
60-926; Wagner et al. (1992) PNAS 89: 7934; and Christiano et al. (1993)
PNAS 90: 2122).

【０１８４】 臨床の背景においては、本発明の遺伝子供給系は、それぞれが当該技術におい
てよく知られている多くの方法のいずれによっても、細胞または組織培養物、あ
るいは適切な患者中に導入できる。例えば、遺伝子供給系の薬剤は、例えば静脈
注射により全身に導入でき、遺伝子供給媒体、遺伝子の発現をコントロールする
転写調節配列による細胞型または組織型発現、またはそれらの組合せにより提供
されるトランスフェクションの特異性から、標的細胞の特異的形質導入が主とし
て起こる。他の実施の形態において、組換え遺伝子の初期供給は、完全に限局化
された動物中への導入によってより制限される。例えば、遺伝子供給媒体は、カ
テーテルにより（米国特許第5,328,470号参照）または定位挿入により（例えばC
hen et al.(1994)PNAS 91:3054-3057）または遺伝子治療ベクターの局所施用に
より導入できる。In the clinical setting, the gene delivery system of the present invention may be introduced into cell or tissue culture, or a suitable patient, by any of a number of methods well known in the art. For example, gene delivery agents can be introduced systemically, for example, by intravenous injection, and transfection provided by gene delivery vehicles, cell-type or tissue-type expression by transcriptional regulatory sequences that control gene expression, or combinations thereof. Due to the specificity, the specific transduction of target cells mainly occurs. In other embodiments, the initial supply of recombinant genes is more limited by their introduction into a fully localized animal. For example, gene delivery vehicles may be by catheter (see US Pat. No. 5,328,470) or by stereotactic insertion (eg C
hen et al. (1994) PNAS 91: 3054-3057) or by topical application of gene therapy vectors.

【０１８５】 さらに、薬剤は実質的に、許容できる希釈液中の遺伝子供給系から成ってもよ
い、または遺伝子供給媒体が内部に埋め込まれている緩効性基質を含んでもよい
。あるいは、完全な遺伝子供給系が、例えばレトロウイルスパッケージのような
組換え細胞からのタクト（tact）中で産生できる場合、薬剤は遺伝子供給系を産
生する細胞を１つ以上含んでもよい。後者の場合、ウイルスパッケージ細胞を導
入する方法は、例えば充電式または生物分解性装置により提供されてもよい。様
々の緩効性重合体装置が開発され、タンパク様の生物薬剤を含む薬のコントロー
ルされた供給について近年インビトロでテストが行われ、これは重合体の組成物
および形態の操作によるウイルス粒子の放出に適合できる。生物分解性および非
分解性重合体の両方を含む、様々の生物適合性重合体（ヒドロゲルを含む）は、
特定の標的部位に移植された細胞によるウイルス粒子の持続放出のための移植組
織の形成に使用できる。本発明のそのような実施の形態は、重合体装置中に取り
込まれた外因的に精製されたウイルスの供給に、または重合体装置中に被包され
た細胞により産生されるウイルス粒子の供給に使用できる。In addition, the drug may consist essentially of the gene delivery system in an acceptable diluent, or may comprise a slow release matrix in which the gene delivery vehicle is imbedded. Alternatively, where the complete gene delivery system can be produced in tact from recombinant cells, such as retroviral packages, the agent may include one or more cells that produce the gene delivery system. In the latter case, the method of introducing viral packaged cells may be provided by, for example, a rechargeable or biodegradable device. Various slow-release polymeric devices have been developed and recently tested in vitro for controlled delivery of drugs containing proteinaceous biopharmaceuticals, which release viral particles through manipulation of polymer composition and morphology. Can fit into. Various biocompatible polymers, including hydrogels, including both biodegradable and non-degradable polymers,
It can be used to form implants for sustained release of viral particles by cells transplanted to specific target sites. Such an embodiment of the invention provides for the supply of exogenously purified virus incorporated into a polymeric device, or for the supply of viral particles produced by cells encapsulated in a polymeric device. Can be used.

【０１８６】 単量体組成物または重合技術の選択により、水、有孔性およびその結果の浸透
性の特徴をコントロールできる。形、サイズ、重合体、および移植方法の選択は
、治療すべき障害による個体基準および個々の患者の応答に基づいて決定できる
。そのような移植組織の産生は通常、当該技術において知られている。例えば、
Concise Encyclopedia of Medical & Dental Materials,ed.by David Williams(
MIT Press:Cambridge,MA,1990)；およびSabel et al.米国特許第4,883,666号参
照。移植組織の別の実施の形態において、組換えウイルスを産生する細胞の供給
源が、移植可能な中空繊維内に被包される。そのような繊維は、予め紡ぎ、次い
で、ウイルス供給源を充填することができる（Aebischer et al.米国特許第4,89
2,538号；Aebischer et al.米国特許第5,106,627号；Hoffman et al.(1990)Expt
.Neurobiol.110:39-44；Jaeger et al.(1990)Prog.Brain Res.82:41-46；および
Aebischer et al.(1991)J.Biomech.Eng.113:178-183）、またはウイルスパッケ
ージング細胞の周りに重合体被覆を形成するように機能する重合体と共に押し出
すことができる（Lim米国特許第4,391,909号；Sefton米国特許第4,353,888号；S
ugamori et al.(1989)Trans.Am.Artif.Intern.Organs 35:791-799；Sefton et a
l.(1987)Biotechnol.Bioeng.29:1135-1143；およびAebischer et al.(1991)Biom
aterials 12:50-55）。また、重合体の操作は、ウイルス粒子を最適に放出する
ように行うこともできる。The choice of monomer composition or polymerization technique allows control of water, porosity and the resulting permeability characteristics. The choice of shape, size, polymer, and implantation method can be determined based on individual criteria and individual patient response to the disorder to be treated. The production of such transplants is generally known in the art. For example,
Concise Encyclopedia of Medical & Dental Materials, ed.by David Williams (
See MIT Press: Cambridge, MA, 1990); and Sabel et al. US Pat. No. 4,883,666. In another embodiment of the implant, the source of cells producing the recombinant virus is encapsulated within the implantable hollow fiber. Such fibers can be pre-spun and then filled with a viral source (Aebischer et al. US Pat. No. 4,89).
2,538; Aebischer et al. US Patent No. 5,106,627; Hoffman et al. (1990) Expt.
.Neurobiol. 110: 39-44; Jaeger et al. (1990) Prog. Brain Res. 82: 41-46; and
Aebischer et al. (1991) J. Biomech. Eng. 113: 178-183), or can be extruded with a polymer that functions to form a polymer coating around viral packaging cells (Lim US Pat. 4,391,909; Sefton US Pat. No. 4,353,888; S
ugamori et al. (1989) Trans.Am.Artif.Intern.Organs 35: 791-799; Sefton et a.
l. (1987) Biotechnol. Bioeng. 29: 1135-1143; and Aebischer et al. (1991) Biom.
aterials 12: 50-55). Manipulation of the polymer can also be done to provide optimal release of viral particles.

【０１８７】 さらに別の実施の形態において、MIFの異所性発現は、ゲノムＤＮＡによる相
同組換えにより、内因性MIF遺伝子の転写調節配列を変更する「遺伝子活性化」
構成物によるものであって差し支えない。例えば、遺伝子活性化構成物は、MIF
遺伝子の内因性プロモータを異種プロモータ、例えば、MIF遺伝子の構成性発現
を生じるまたは遺伝子の正常な発現パターンとは異なる条件下で遺伝子の誘発性
発現を生じるものにより置換することができる。遺伝子活性化構成物の様々な異
なる形態も利用できる。例えば、トランスカリオティックセラピーズ社(Transka
ryotic Therapies, Inc)のＰＣＴ公報第WO93/09222号、同第WO95/31560号、同第
WO96/29411号、同第WO95/31560号および同第WO94/12650号を参照のこと。[0187] In yet another embodiment, ectopic expression of MIF alters transcriptional regulatory sequences of the endogenous MIF gene by homologous recombination with genomic DNA "gene activation".
It depends on the composition. For example, the gene activation construct is MIF
The endogenous promoter of a gene can be replaced by a heterologous promoter, such as one that causes constitutive expression of the MIF gene or that causes inducible expression of the gene under conditions that differ from the normal expression pattern of the gene. A variety of different forms of gene activation constructs are also available. For example, Transkaliotherapy
ryotic Therapies, Inc) PCT Publication Nos. WO93 / 09222, WO95 / 31560 and No.
See WO96 / 29411, WO95 / 31560 and WO94 / 12650.

【０１８８】 好ましい実施の形態において、遺伝子活性化構成物として用いられるヌクレオ
チド配列は、(1)組換えを指示する内因性MIF遺伝子のいくつかの部分（エクソン
配列、イントロン配列、プロモータ配列等）からのＤＮＡおよび(2)遺伝子活性
化構成物の組換えの際にゲノムMIF遺伝子の暗号配列に機能できるように結合す
べき異種転写調節配列から構成することができる。MIF産生細胞の培養物の産生
に使用するために、この構成物は、細胞中のノックアウト(knockout)構成物を検
出するレポーター(reporter)遺伝子を含んでもよい。In a preferred embodiment, the nucleotide sequences used as gene activation constructs are (1) derived from several parts of the endogenous MIF gene that direct recombination (exon sequences, intron sequences, promoter sequences, etc.). And (2) a heterologous transcriptional regulatory sequence to be operably linked to the coding sequence of the genomic MIF gene upon recombination of the gene activation construct. For use in producing a culture of MIF-producing cells, the construct may include a reporter gene that detects a knockout construct in the cell.

【０１８９】 遺伝子活性化構成物は、細胞中に挿入され、天然のMIF遺伝子と機能できるよ
うに結合する異種調節配列を提供するような位置に細胞のゲノムＤＮＡと統合す
る。そのような挿入は、同種組換えにより生じる、すなわち、内因性MIF遺伝子
配列と相同の活性化構成物の組換え領域がゲノムＤＮＡとハイブリダイズし、該
構成物がゲノムＤＮＡの対応する位置に組み込まれるようにゲノム配列と組み換
えられる。The gene activating construct integrates with the genomic DNA of the cell at a location such that it is inserted into the cell and provides a heterologous regulatory sequence that is operably linked to the native MIF gene. Such an insertion occurs by homologous recombination, ie the recombination region of the activating construct which is homologous to the endogenous MIF gene sequence hybridizes to the genomic DNA and the construct is integrated at the corresponding position in the genomic DNA. Recombination with the genomic sequence as described above.

【０１９０】 「組換え領域」または「標的配列」という用語は、例えば、ゲノム遺伝子の５
’隣接配列を含む、ゲノム遺伝子配列と実質的に同一のまたは実質的に相補的な
配列を有する遺伝子活性化構成物のセグメント（すなわち、部分）を称し、ゲノ
ム配列と標的トランスジーン構成物との間の同種組換えを促進できる。The term “recombinant region” or “target sequence” refers to, for example, 5 of a genomic gene.
'Refers to a segment (ie, portion) of a gene activation construct that has a sequence that is substantially identical or substantially complementary to a genomic gene sequence, including flanking sequences, that The homologous recombination between the two can be promoted.

【０１９１】 ここで用いたように、「置換領域」という用語は、組換え領域とゲノム配列と
の間の同種組換え後に内因性染色***置に組み込まれるようになる活性化構成物
の一部を称する。As used herein, the term “replacement region” refers to the part of the activation construct that becomes integrated into an endogenous chromosomal location after homologous recombination between the recombination region and the genomic sequence. To call.

【０１９２】 例えば、置換領域中に提供される異種調節配列は、プロモータ（構成性または
誘発性プロモータのような）、エンハンサー、陰性調節要素、遺伝子座制御領域
、転写因子結合部位、またはそれらの組合せを含む、様々な要素の内の１つ以上
を含むことができる。インビボの標的遺伝子の発現を制御するのに使用してもよ
いプロモータ／エンハンサーとしては、限定されるものではないが、サイトメガ
ロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ／エンハンサー（Karasuyama et al., 1989, J
.Exp.Med. 169:13）、ヒトβアクチンプロモータ（Gunning et al. (1987) PNAS
84:4831-4835）、マウス乳癌ウイルス長端反復配列（ＭＭＴＶＬＴＲ）中に存
在するグルココルチコイド誘発性プロモータ（Klessig et al. (1984) Mol.Cell
Biol. 4:1354-1362）、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶＬＴＲ）（We
iss et al. (1985) RNA Tumor Viruses, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold
Spring Harbor, New York）、ＳＶ４０初期または後期領域プロモータ（Bernoi
st et al. (1981) Nature 290:304-310; Templeton et al. (1984) Mol.Cell Bi
ol., 4:817; and Sprague et al. (1983) J.Virol., 45:773）、ニワトリ肉腫ウ
イルス（ＲＳＶ）の３’長端反復配列中に含まれるプロモータ（Yamamoto et al
., 1980, Cell, 22:787-797）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナ
ーゼプロモータ／エンハンサー（Wagner et al. (1981) PNAS 82:3567-71）、お
よび単純ヘルペスウイルスＬＡＴプロモータ（Wolfe et al. (1992) Nature Gen
etics, 1:379-384）が挙げられる。For example, a heterologous regulatory sequence provided in the replacement region may be a promoter (such as a constitutive or inducible promoter), an enhancer, a negative regulatory element, a locus control region, a transcription factor binding site, or a combination thereof. Can include one or more of a variety of elements, including. Promoters / enhancers that may be used to control the expression of target genes in vivo include, but are not limited to, the cytomegalovirus (CMV) promoter / enhancer (Karasuyama et al., 1989, J.
.Exp.Med. 169: 13), human β-actin promoter (Gunning et al. (1987) PNAS
84: 4831-4835), a glucocorticoid-inducible promoter (Klessig et al. (1984) Mol. Cell, present in the mouse mammary tumor virus long terminal repeat (MMTVLTR)).
Biol. 4: 1354-1362), Moloney murine leukemia virus (MuLVLTR) (We
iss et al. (1985) RNA Tumor Viruses, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold
Spring Harbor, New York), SV40 early or late region promoter (Bernoi
st et al. (1981) Nature 290: 304-310; Templeton et al. (1984) Mol. Cell Bi
ol., 4: 817; and Sprague et al. (1983) J. Virol., 45: 773), a promoter contained in the 3 ′ long repeat of chicken sarcoma virus (RSV) (Yamamoto et al.
., 1980, Cell, 22: 787-797), herpes simplex virus (HSV) thymidine kinase promoter / enhancer (Wagner et al. (1981) PNAS 82: 3567-71), and herpes simplex virus LAT promoter (Wolfe et al. . (1992) Nature Gen
etics, 1: 379-384).

【０１９３】 さらに他の実施の形態において、置換領域は、例えば、発現を活性化させるた
めに、天然のMIF遺伝子の陰性転写制御要素を単に欠失する。In yet another embodiment, the replacement region simply lacks the negative transcriptional control element of the native MIF gene, eg, to activate expression.

【０１９４】 MIFによるようなチェックポイントバイパスの可逆性は、例えばMIFポリペプチ
ドの暗号配列のような、バイパス因子の暗号配列の発現を制御する誘発性転写調
節配列が存在するために誘発性である発現系を使用することにより生じさせるこ
とができる。誘発性プロモータは、培養条件の変化、例えば、栄養物の有無また
は温度の変化に応答してそれらの制御の元でＤＮＡから増大したレベルの転写を
開始するプロモータである。細胞を患者に移植すべき場合には、この誘発性プロ
モータは、好ましくは、小さな分子または宿主動物にとって内因性ではない他の
因子により調節されるものである。The reversibility of checkpoint bypass, such as by MIF, is inducible due to the presence of inducible transcriptional regulatory sequences that control the expression of coding sequences for bypass factors, eg, coding sequences for MIF polypeptides. It can be generated by using an expression system. Inducible promoters are promoters that initiate increased levels of transcription from DNA under their control in response to changes in culture conditions, such as the presence or absence of nutrients or changes in temperature. If cells are to be transplanted into a patient, this inducible promoter is preferably one that is regulated by a small molecule or other factor that is not endogenous to the host animal.

【０１９５】 例としての調節可能なプロモータとしては、例えば、Gossen et al. (1992) P
NAS 89:5547-5551; and Pescini et al., (1994) Biochem.Biophys.Res.Comm. 2
02:1664-1667に記載されているようなテトラサイクリン応答性プロモータが挙げ
られる。別の実施の形態において、本発明の方法では、SchreiberおよびCrabtre
eにより最初に開発された多量体化(multimerization)が用いられる。この技法に
より、転写的に活性な複合体を組み立てるために小さな分子「二量体化体(dimer
izer)」に依存するキメラ転写因子を使用することにより、内因性遺伝子または
異種遺伝子、この場合は、TRTまたはテロメラーゼ活性化物質の暗号配列の発現
を調節することができる。例えば、ＰＣＴ公報第WO96/12796号、同第WO95/05389
号、同第WO95/02684号、同第WO94/18317号、同第WO96/06097号、および同第WO96
/06110号を参照のこと。さらに、人工二量体化分子を使用することにより、転写
調節配列に内因性ＤＮＡ結合および活性化領域を動員できる多数の技法が、最近
開発された。例えば、ＰＣＴ公報第WO96/13613号を参照のこと。Exemplary regulatable promoters include, for example, Gossen et al. (1992) P
NAS 89: 5547-5551; and Pescini et al., (1994) Biochem.Biophys.Res.Comm. 2
The tetracycline-responsive promoter as described in 02: 1664-1667. In another embodiment, the method of the present invention comprises the steps of Schreiber and Crabtre.
The multimerization originally developed by e is used. This technique allows for the assembly of small molecules "dimerization" to assemble transcriptionally active complexes.
By using a chimeric transcription factor that depends on "izer", it is possible to regulate the expression of the endogenous or heterologous gene, in this case the coding sequence of the TRT or telomerase activator. For example, PCT publication Nos. WO96 / 12796 and WO95 / 05389
No. WO95 / 02684, No. WO94 / 18317, No. WO96 / 06097, and No. WO96.
See / 06110. In addition, a number of techniques have recently been developed that allow the recruitment of endogenous DNA binding and activation regions to transcriptional regulatory sequences by using artificial dimerization molecules. See, for example, PCT Publication No. WO 96/13613.

【０１９６】 別の実施の形態においては、本システムの可逆性は、国際特許出願公開第98/1
2339号に記載されているようなベクターの使用により生じる。これらのベクター
は、MIFポリペプチドの暗号配列の側面に位置する、組換え部位のような切除エ
レメントを含む。細胞を適切なレコンビナーゼと接触させた後、レコンビナーゼ
部位の間のベクター配列を切除する。好ましい実施の形態において、ベクターは
レトロウイルスベクターであり、そのレコンビナーゼ部位はプロウイルス配列の
切除が行われるような、例えばウイルスベクターが宿主細胞の染色体DNAから完
全にまたはほぼ完全に切除されるような、LTR内に位置する。[0196] In another embodiment, the reversibility of the system is described in WO 98/1.
It results from the use of a vector as described in 2339. These vectors contain excision elements, such as recombination sites, flanking the coding sequence of the MIF polypeptide. After contacting the cells with the appropriate recombinase, the vector sequence between the recombinase sites is excised. In a preferred embodiment, the vector is a retroviral vector, the recombinase site of which undergoes excision of the proviral sequence, such that the viral vector is completely or almost completely excised from the chromosomal DNA of the host cell. , Located in the LTR.

【０１９７】 他の実施の形態において、MIF発現の可逆性は、MIFの条件付きで活性な（条件
付きで不活性な）形態を使用することにより実施することができる。例えば、温
度感受性突然変異体を本発明の方法に用いることができる。細胞を動物中に移植
すべき実施の形態において、ｔｓ突然変異体は、体温（非許容的温度）で不活性
であり、それより低いか高い細胞培養温度で活性であることができる。In another embodiment, reversibility of MIF expression can be performed by using a conditionally active (conditionally inactive) form of MIF. For example, temperature sensitive mutants can be used in the methods of the invention. In embodiments in which cells are to be transplanted into an animal, the ts mutant can be inactive at body temperature (non-permissive temperature) and active at lower or higher cell culture temperatures.

【０１９８】 説明のために、関心のある遺伝子中のｔｓ突然変異体に関する調査の必要がな
い、温度感受性突然変異体を産生する戦略の１つは、移植性（portable）熱誘発
性Ｎ−デグロン(degron)に基づく。Ｎ−デグロンは、その必須決定因子がタンパ
ク質の「脱安定化(destabilizing)」Ｎ末端残基である細胞内分解シグナルであ
る。異なる脱安定化残基を含有する一連のＮ−デグロンは、Ｎ末端規則として発
現され、このことにより、タンパク質のインビボ半減期が、そのＮ末端残基の同
定に関連付けられる。真核細胞において、Ｎ−デグロンは、少なくとも２つの決
定因子：脱安定化Ｎ末端残基および基質の特異的内部Ｌｙｓ残基（複数の残基）
からなる。Ｌｙｓ残基はマルチユビキチン(multiubiquitin)鎖の付着部位である
。ユビキチンは、他のタンパク質へのその共有結合が、タンパク質分解を含む経
路を主に通って、多数の細胞過程における役割を果たすタンパク質である。MIF
または他のチェックポイントバイパス因子の条件性突然変異体を産生するために
適用できる例としての熱誘導性Ｎ−デグロンモジュールの説明に関しては、米国
特許第5,705,387号および同第5,538,862号、並びにDohmen et al. (1994) Scien
ce 263:1273-6を参照のこと。For illustration, one strategy for producing temperature-sensitive mutants that does not require investigation for ts mutants in the gene of interest is a portable heat-induced N-degron. (degron) based. N-degron is an intracellular degradation signal whose essential determinant is the "destabilizing" N-terminal residue of proteins. A series of N-degrons containing different destabilizing residues are expressed as an N-terminal rule, which correlates the in vivo half-life of the protein with the identification of its N-terminal residue. In eukaryotic cells, N-degrons have at least two determinants: a destabilizing N-terminal residue and a specific internal Lys residue (s) of the substrate.
Consists of. The Lys residue is the attachment site for the multiubiquitin chain. Ubiquitin is a protein whose covalent attachment to other proteins plays a role in many cellular processes, predominantly through pathways involving proteolysis. MIF
Or for a description of exemplary heat-inducible N-degron modules applicable to produce conditional mutants of other checkpoint bypass factors, see US Pat. Nos. 5,705,387 and 5,538,862, and Dohmen et al. al. (1994) Scien
See ce 263: 1273-6.

【０１９９】 細胞が培地中で処理される実施の形態において、MIFまたは他のチェックポイ
ントバイパス因子をコードするRNAを、例えばインビトロにおける転写により産
生されるRNAから、細胞中に直接導入できる。In embodiments in which cells are treated in culture medium, RNA encoding MIF or other checkpoint bypass factor can be introduced directly into the cell, for example, from RNA produced by transcription in vitro.

【０２００】 さらに別の実施の形態において、内因性MIF遺伝子の発現を活性化させる膜透
過性薬剤（例えば、好ましくは、小さな有機分子）を同定することができる。ゲ
ノムMIF遺伝子の有用性を考慮すると、レポーター遺伝子がMIF遺伝子の転写調節
配列に機能できるように結合しているレポーター構成物を産生することができる
。MIF調節配列によりそのレポーター構成物を活性化するための適切な細胞内機
構を有する細胞中に移入されたときに、そのような化合物を同定する細胞ベース
のアプローチに、得られた細胞を使用することができる。In yet another embodiment, membrane permeable agents (eg, preferably small organic molecules) that activate expression of the endogenous MIF gene can be identified. Given the utility of the genomic MIF gene, it is possible to produce a reporter construct in which the reporter gene is operably linked to the transcriptional regulatory sequences of the MIF gene. Use the resulting cells in a cell-based approach to identify such compounds when transferred into cells with the appropriate intracellular machinery for activation of their reporter construct by MIF regulatory sequences be able to.

【０２０１】 さらに別の実施の形態において、適切な程度まで、MIFの細胞内レベルを、そ
の自然の交代速度を抑制することにより、上方調節(upregulate)することができ
る。例えば、MIFのユビキチン依存性または独立性分解の阻害因子を用いて、細
胞中のタンパク質の濃度が人工的に上昇させられるという意味で、MIFの異所性
発現を行うことができる。In yet another embodiment, intracellular levels of MIF can be upregulated to an appropriate extent by suppressing its natural rate of turnover. For example, inhibitors of ubiquitin-dependent or independent degradation of MIF can be used to effect ectopic expression of MIF in the sense that the concentration of protein in the cell can be artificially increased.

【０２０２】 さらに別の実施の形態において、MIF活性の非ペプチド抑制因子を、MIF活性の
拮抗作用に依存する本発明の方法の実施の形態において使用してもよい。精製さ
れたおよび組換えMIFポリペプチドの有用性、並びにここに記載されるp53-バイ
パスアッセイは、特に細胞増殖および/または分化の病原における役割である、M
IFタンパク質の正常なp53-バイパス機能の作用薬または拮抗薬である、小さい有
機分子のような薬剤についてのスクリーニングに使用できるアッセイシステムの
産生を容易にする。従って、ある実施の形態において、MIF治療薬は、例えばペ
プチド、核酸、炭水化物、小さい有機分子、または天然産物抽出物（またはその
分画）でもよい。In yet another embodiment, non-peptide suppressors of MIF activity may be used in embodiments of the methods of the invention that rely on antagonism of MIF activity. The utility of purified and recombinant MIF polypeptides, as well as the p53-bypass assay described herein, has a role in the pathogenesis of cell proliferation and / or differentiation, among others.
It facilitates the production of an assay system that can be used to screen for agents such as small organic molecules that are agonists or antagonists of the normal p53-bypass function of the IF protein. Thus, in certain embodiments, the MIF therapeutic agent may be, for example, a peptide, nucleic acid, carbohydrate, small organic molecule, or natural product extract (or fraction thereof).

【０２０３】 さらに説明するために、ヒトMIFのサブユニット構成物(Sun et al.(1996)Prot ein Eng 9:631-5)およびおそらく溶液中のタンパク質の主な形態は、三量体であ
る。MIFのサブユニットの配列は腫瘍壊死因子の配列に類似しており、シグナル
の形質導入はレセプターサブユニットの三量体化を必要とするかもしれない。簡
単な競合アッセイを行って、MIF複合体の構成を破壊し、MIF治療薬のようにおそ
らく野生型MIFの拮抗薬になるであろう物質を同定できる。同様に、この機能の
証拠は、MIFのC末端が三量体構造に必要であるという概念を支持する(Mischke e
t al.(1997)FEBS Lett 414:226-32)。従って、オリゴマー化領域を含むMIFの断
片は、全長タンパク質と複合して、野生型タンパク質の生物学的活性を減少させ
る（例えば、優性陰性抑制因子または弱い作用薬のように）。[0203] To further illustrate, the subunit structure of human MIF (Sun et al (1996) Prot ein Eng 9:. 631-5) and possibly major forms of the protein in the solution is a trimer . The sequence of the subunit of MIF is similar to that of tumor necrosis factor, and signal transduction may require trimerization of the receptor subunit. A simple competition assay can be performed to identify substances that disrupt the composition of the MIF complex and are likely antagonists of wild-type MIF, such as MIF therapeutics. Similarly, evidence of this function supports the notion that the C-terminus of MIF is required for trimeric structure (Mischke e
t al. (1997) FEBS Lett 414: 226-32). Thus, fragments of MIF containing the oligomerization region complex with the full-length protein to reduce the biological activity of the wild-type protein (eg, as a dominant negative suppressor or weak agonist).

【０２０４】 本発明の別の態様は、１つ以上の他の治療薬が、MIF治療薬とともに投与され
る共同治療を提供する。そのような共同治療は、治療に用いる個々の成分の同時
の、連続した、または別々の投与により行ってもよい。例えば、MIF治療薬は、
成長因子および他の***試薬と共同して投与しても差し支えない。ここに用いた
ように、***試薬は、標的細胞個体群の増殖を刺激できる、ペプチド、タンパク
質、および糖タンパク質を含む任意の化合物または組成物を称する。例えば、MI
F治療薬は、レクチン、例えば、コンカナバリンＡまたはフィトヘマグルチニン
のようなＴ細胞***試薬と共同して投与しても差し支えない。他の***試薬の例
としては、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ
）、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、および形質転換成長因子（ＴＧＦ）の内の
あるものが挙げられる。Another aspect of the invention provides a co-therapy in which one or more other therapeutic agents are administered with a MIF therapeutic agent. Such conjoint treatment may be by simultaneous, sequential or separate administration of the individual components used in the treatment. For example, MIF drugs
It may be co-administered with growth factors and other fission reagents. As used herein, disruption reagent refers to any compound or composition comprising peptides, proteins, and glycoproteins that is capable of stimulating the growth of a target cell population. For example, MI
The F therapeutic may be administered in combination with a lectin, eg, a T cell division reagent such as concanavalin A or phytohemagglutinin. Examples of other fission reagents include insulin-like growth factor (IGF), platelet-derived growth factor (PDGF).
), Fibroblast growth factor (FGF), and some of the transforming growth factors (TGF).

【０２０５】 調製されるMIF治療薬の供給源は、薬の特定の形態に依存するであろう。小さ
い有機分子およびペプチジル断片は、化学的に合成され、薬剤/化粧品としての
使用に適切な純粋な形態で提供できる。天然抽出の産物は、当該技術において知
られる技術により精製できる。例えば、Cox et al.の米国特許第5,286,654号に
は、分泌されたタンパク質の天然発生形態を精製する方法が記載されており、MI
Fポリペプチドの精製に適合できる。MIFポリペプチドの組換え供給源もまた、上
述のように利用できる。The source of prepared MIF therapeutic will depend on the particular form of the drug. Small organic molecules and peptidyl fragments can be chemically synthesized and provided in pure form suitable for pharmaceutical / cosmetic use. The product of natural extraction can be purified by techniques known in the art. For example, Cox et al., US Pat.
It is compatible with the purification of F polypeptides. Recombinant sources of MIF polypeptides can also be utilized as described above.

【０２０６】 ヒトおよび他の動物の治療における当業者は、薬剤または化粧品に調製される
MIF治療薬の効果的な量を測定できる。Those skilled in the treatment of humans and other animals will be prepared into a pharmaceutical or cosmetic preparation.
The effective amount of MIF therapeutic can be measured.

【０２０７】 本発明の方法において使用されるMIF治療薬は、最も好ましくは適切な組成物
の形態で施用される。適切な組成物としては、全身的なまたは局所的な薬の投与
に通常使用される全ての組成物が挙げられる。薬学的に許容できるキャリアは、
活性成分と作用しないように、実質的に挿入しなければならない。適切な挿入キ
ャリアは、水、アルコールポリエチレングリコール、鉱油または石油ゲル、プロ
ピレングリコール等を含む。The MIF therapeutic used in the method of the present invention is most preferably applied in the form of a suitable composition. Suitable compositions include all compositions commonly used for systemic or topical administration of drugs. A pharmaceutically acceptable carrier is
It must be substantially inserted so that it does not interact with the active ingredient. Suitable insertion carriers include water, alcohol polyethylene glycol, mineral oil or petroleum gel, propylene glycol and the like.

【０２０８】 本発明の薬剤組成物を調製するために、活性成分としての特定のMIF治療薬の
効果的な量を、投与に所望な試料の形態に依存して多様な形態を取る、薬学的に
許容できるキャリアと化合して完全な混合物にする。これらの薬剤組成物は、特
に、経口的、直腸的、経皮的、または非経口注入による投与に適切な単一の投薬
形態であることが所望である。例えば、経口投薬形態の組成物の調製においては
、懸濁液、シロップ、エリキシルおよび溶液のような経口液状試料の場合には例
えば水、グリコール、油、アルコール等のような通常の薬剤媒質を；粉末、丸剤
、カプセル、および錠剤の場合にはデンプン、糖、カオリン、潤滑剤、結合剤、
崩壊剤等のような固体キャリアを使用してもよい。投与が容易なので、錠剤およ
びカプセルは最も利点のある経口投薬ユニット形態を示し、この場合明らかに固
体の薬剤キャリアが使用されている。非経口組成物については、例えば溶解性を
促進するために他の成分が含まれていても、キャリアは通常少なくとも大部分に
無菌水を含む。注射可能な溶液は、例えばキャリアが食塩水、グルコース溶液ま
たは食塩とグルコースの混合溶液を含むように調製してもよい。注射可能な懸濁
液を調製してもよく、この場合適切な液体キャリア、懸濁物質などを使用しても
よい。使用の直前に液体形態の薬剤に変化される固体形態の薬剤も含まれる。経
皮投与に適切な組成物においては、キャリアは任意に、皮膚上に重大な有害効果
をもたらさない性質の適切な添加物を小さい割合で任意に組み合わせた、貫入増
強薬および/または適切な加湿薬を含む。To prepare the pharmaceutical compositions of the present invention, an effective amount of a particular MIF therapeutic agent as the active ingredient may take a variety of forms depending on the form of the sample desired for administration. Combine with an acceptable carrier to form a complete mixture. Desirably, these pharmaceutical compositions are in a single dosage form suitable for administration by oral, rectal, transdermal, or parenteral injection, among others. For example, in the preparation of compositions for oral dosage forms, in the case of oral liquid samples such as suspensions, syrups, elixirs and solutions, conventional drug media such as water, glycols, oils, alcohols and the like; For powders, pills, capsules, and tablets starch, sugar, kaolin, lubricants, binders,
Solid carriers such as disintegrants and the like may be used. Because of their ease of administration, tablets and capsules represent the most advantageous oral dosage unit form in which apparently solid drug carriers have been employed. For parenteral compositions, the carrier will usually comprise sterile water, at least in large part, even though other ingredients may be included to facilitate solubility, for example. Injectable solutions may, for example, be prepared in which the carrier comprises saline solution, glucose solution or a mixture of saline and glucose. Injectable suspensions may be prepared in which case appropriate liquid carriers, suspending agents and the like may be employed. Also included are solid form drugs that are converted to liquid form drugs shortly before use. In compositions suitable for transdermal administration, the carrier optionally comprises penetration enhancers and / or suitable moisturizers, optionally in small proportions, with suitable proportions of additives having properties that do not cause a significant detrimental effect on the skin. Including drugs.

【０２０９】 薬剤の直接的な局所施用に加えて、例えば温度および/または圧力感受性媒体
中にまたは体内で可溶なフィルムまたは固体キャリア等の中に被包し、後に放出
する、好ましくは活性成分を維持しながら放出する他の方法により、局所的に投
与してもよい。In addition to direct topical application of the drug, preferably the active ingredient is encapsulated and subsequently released, for example in a temperature and / or pressure sensitive medium or in a body soluble film or solid carrier or the like. May be administered topically by other methods that release while maintaining.

【０２１０】 局所施用に適切な組成物として、例えばクリーム、ゼリー、包帯、シャンプー
、チンキ、ペースト、軟膏、軟膏剤、粉末、液体または半液体製剤等のような局
所施用治療に通常使用される全ての組成物が挙げられる。窒素二酸化炭素である
フレオンのような噴射剤を有する、またはポンプスプレーのような噴射剤、ドロ
ップ、ローション剤、またはスワブにより施用できる濃縮組成物のような半固体
を有さないエアロゾルにより、前記組成物を施用してもよい。特定の組成物にお
いては、軟膏剤、クリーム、ペースト、ゼリー、軟膏等のような半固体の組成物
が、都合よく使用されるであろう。Compositions suitable for topical application include all those commonly used for topical application treatment such as creams, jellies, bandages, shampoos, tinctures, pastes, ointments, ointments, powders, liquid or semi-liquid formulations and the like. The composition of is mentioned. Aerosols having a propellant such as Freon, which is nitrogen carbon dioxide, or a semi-solid free aerosol such as a propellant such as a pump spray, a drop, a lotion, or a concentrated composition that can be applied by swabs. You may apply a thing. In certain compositions, semi-solid compositions such as ointments, creams, pastes, jellies, ointments and the like will be conveniently used.

【０２１１】 投与の容易および投薬の均一性のために本発明の組成物を投薬ユニット形態に
調製することは、特に利点がある。本明細書および請求の範囲で使用されるよう
な投薬ユニット形態は、単位的な投薬として適切なユニットを物質的に絶やすこ
とに関し、それぞれのユニットは、必要な薬剤キャリアと共に所望の治療効果を
産生するように計画された活性成分をあらかじめ決められた量含有している。そ
のような投薬ユニット形態の例は、錠剤（溝のついたまたは被覆された錠剤を含
む）、カプセル、丸剤、粉末の小包、オブラート、注射可能な溶液または懸濁液
、茶さじ一杯、テーブルスプーン一杯等、およびそれらの別々なものの倍数であ
る。It is of particular advantage to formulate the compositions of the invention in dosage unit form for ease of administration and uniformity of dosage. Dosage unit form, as used herein and in the claims, relates to physically quenching units suitable as unitary dosages, each unit producing the desired therapeutic effect with the required drug carrier. It contains a predetermined amount of the active ingredient designed to do so. Examples of such dosage unit forms are tablets (including fluted or coated tablets), capsules, pills, powder packets, wafers, injectable solutions or suspensions, teaspoonfuls, tables. A spoonful, etc., and multiples of their separate ones.

【０２１２】 本発明の薬剤は、上述のように、美容上の使用と考慮することもできる多くの
施用に使用できる。好ましくは低アレルギー性でpHがコントロールされた、当該
技術において知られる化粧品組成物が特に好ましく、化粧水、パック、ローショ
ン、皮膚乳液または乳液状のローションを含む。製剤は、MIF治療薬のほかに、
そのような製剤中で通常使用される成分を含有する。そのような成分の例は、油
、脂肪、ロウ、界面活性剤、湿潤薬、肥厚薬、抗酸化剤、粘性安定剤、キレート
剤、緩衝剤、防腐薬、香水、染料、低級アルカノール等である。所望なら、例え
ば抗炎症薬、抗菌薬、抗真菌薬、消毒剤、ビタミン、日焼け止め、抗生物質、ま
たは他の抗座瘡薬のような、さらなる成分を組成物中に混合してもよい。The agents of the invention may be used in a number of applications, which may also be considered cosmetic use, as described above. Particularly preferred are cosmetic compositions known in the art, preferably hypoallergenic and pH-controlled, and include lotions, packs, lotions, skin emulsions or emulsions. In addition to MIF drugs,
It contains the ingredients normally used in such formulations. Examples of such ingredients are oils, fats, waxes, surfactants, humectants, thickeners, antioxidants, viscosity stabilizers, chelating agents, buffers, preservatives, perfumes, dyes, lower alkanols, etc. . If desired, further ingredients may be incorporated into the composition, for example anti-inflammatory, antibacterial, antifungal, antiseptic, vitamin, sunscreen, antibiotic or other anti-acne agents.

【０２１３】 油の例は、オリーブオイルおよび水素添加油のような脂肪および油；密ロウお
よびラノリンのようなロウ；液体パラフィン、セレシン、およびスクアレン；ス
テアリン酸およびオレイン酸のような脂肪酸；セチルアルコール、ステアリルア
ルコール、ラノリンアルコール、およびヘキサデカノールのようなアルコール；
およびミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピルおよびステアリン
酸ブチルのようなエステルを含む。界面活性剤の例としては、ステアリン酸ナト
リウム、セチル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレンラウリルエーテルホスフェ
ート、N-アシルグルタミン酸ナトリウムのような陰イオン性界面活性剤；塩化ス
テアリルジメチルベンジルアンモニウムおよび塩化ステアリルトリメチルアンモ
ニウムのような陽イオン性界面活性剤；塩酸アルキルアミノエチルグリシン溶液
およびレシチンのような両性電解質の界面活性剤；およびグリセリンモノステア
レート、ソルビタンモノステアレート、ショ糖脂肪酸エステル、プロピレングリ
コールモノステアレート、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリエチレン
グリコールモノステアレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート
、ポリオキシエチレンココナット脂肪酸モノエタノールアミド、ポリオキシプロ
ピレングリコール（例えば商標“Pluronic”の下で販売される物質）、ポリオキ
シエチレンヒマシ油、およびポリオキシエチレンラノリンのような非イオン性界
面活性剤が挙げられる。湿潤薬の例は、グリセリン、1,3-ブチレングリコール、
およびプロピレングリコールを含む；低級アルコールの例は、エタノールおよび
イソプロパノールを含む；肥厚薬の例は、キサンタンガム、ヒドキシプロピルセ
ルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ポリエチレングリコールおよびナトリ
ウムカルボキシメチルセルロースを含む；抗酸化剤の例は、ブチル化ヒドロキシ
トルエン、ブチル化ヒドロキシアニソール、没食子酸プロピル、クエン酸および
エトキシキンを含む；キレート剤の例は、エデト酸二ナトリウムおよびエタンヒ
ドロキシ二リン酸を含む；緩衝剤の例は、クエン酸、クエン酸ナトリウム、ホウ
酸、ホウ砂、およびリン酸水素二ナトリウムを含む；および防腐薬の例は、メチ
ルパラヒドロキシベンゾエート、エチルパラヒドロキシベンゾエート、デヒドロ
酢酸、サリチル酸および安息香酸である。Examples of oils are fats and oils such as olive oil and hydrogenated oils; waxes such as beeswax and lanolin; liquid paraffin, ceresin, and squalene; fatty acids such as stearic acid and oleic acid; cetyl alcohol. Alcohols such as, stearyl alcohol, lanolin alcohol, and hexadecanol;
And esters such as isopropyl myristate, isopropyl palmitate and butyl stearate. Examples of surfactants include anionic surfactants such as sodium stearate, sodium cetyl sulfate, polyoxyethylene lauryl ether phosphate, sodium N-acyl glutamate; stearyl dimethylbenzyl ammonium chloride and stearyl trimethyl ammonium chloride. Cationic surfactants; ampholyte surfactants such as alkylaminoethylglycine hydrochloride solution and lecithin; and glycerin monostearate, sorbitan monostearate, sucrose fatty acid ester, propylene glycol monostearate, polyoxy Ethylene oleyl ether, polyethylene glycol monostearate, polyoxyethylene sorbitan monopalmitate, polyoxyethylene coconut fatty acid monoethanol Bromide, (material sold under the example trademark "Pluronic") polyoxypropylene glycol, polyoxyethylene castor oil, and non-ionic surfactants such as polyoxyethylene lanolin. Examples of humectants are glycerin, 1,3-butylene glycol,
And propylene glycol; examples of lower alcohols include ethanol and isopropanol; examples of thickeners include xanthan gum, hydroxypropyl cellulose, hydroxymethyl cellulose, polyethylene glycol and sodium carboxymethyl cellulose; examples of antioxidants include Examples include butylated hydroxytoluene, butylated hydroxyanisole, propyl gallate, citric acid and ethoxyquin; examples of chelating agents include disodium edetate and ethanehydroxydiphosphate; examples of buffering agents include citric acid, citric acid. Sodium acid, boric acid, borax, and disodium hydrogen phosphate; and examples of preservatives include methylparahydroxybenzoate, ethylparahydroxybenzoate, dehydroacetic acid, salicylic acid, and salicylic acid. It is a fine-benzoic acid.

【０２１４】 軟膏、クリーム、化粧水、皮膚乳液等の調製については、通常0.01%から10%ま
で特に0.1%から5%までおよびさらに特定すると0.2%から2.5%までの活性成分、例
えばMIF治療薬を、組成物中に混合する。軟膏またはクリームにおいては、キャ
リアは例えば1%から20%まで、特に5%から15%までの湿潤薬、0.1%から10%まで特
に0.5%から5%までの肥厚薬および水からなる；または前記キャリアは、70%から9
9%まで、特に20%から95%までの界面活性剤、および0%から20%まで、特に2.5%か
ら15%までの脂肪；または80%から99.9%まで特に90%から99%までの肥厚薬；また
は5%から15%までの界面活性剤、2%から15%までの湿潤薬、0%の80%までの油、非
常に少ない(<2%)量の防腐薬、色素および/または香水、および水からなってもよ
い。化粧水においては、キャリアは例えば、2%から10%までの低級アルコール、0
.1%から10%まで特に0.5%から1%までの界面活性剤、1%から20%まで、特に3%から7
%までの湿潤薬、0%から5%までの緩衝剤、水および少量(<2%) の防腐薬、染料お
よび/または香水からなる。皮膚乳液においては、キャリアは通常、10%から50%
までの油、1%から10%までの界面活性剤、50%から80%までの水および0%から3%ま
での防腐薬および/または香水からなる。前記の製剤においては、%記号は重量パ
ーセンテージによる重量に関する。For the preparation of ointments, creams, lotions, skin emulsions, etc., usually 0.01% to 10%, especially 0.1% to 5% and more particularly 0.2% to 2.5% of the active ingredient, eg MIF therapeutic agent Are mixed into the composition. In an ointment or cream, the carrier comprises, for example, 1% to 20%, especially 5% to 15% wetting agent, 0.1% to 10% especially 0.5% to 5% thickening agent and water; or 70% to 9% carriers
Up to 9%, especially 20% to 95% surfactant, and 0% to 20%, especially 2.5% to 15% fat; or 80% to 99.9%, especially 90% to 99% thickening Medicine; or 5% to 15% surfactant, 2% to 15% wetting agent, 0% to 80% oil, very low (<2%) preservatives, pigments and / or It may consist of perfume and water. In lotions, the carrier is, for example, 2% to 10% lower alcohol, 0
.1% to 10%, especially 0.5% to 1% surfactant, 1% to 20%, especially 3% to 7
Consists of up to% humectant, 0% to 5% buffer, water and a small amount (<2%) preservative, dye and / or perfume. For skin emulsions, the carrier is usually 10% to 50%.
Up to oil, 1% to 10% surfactant, 50% to 80% water and 0% to 3% preservative and / or perfume. In the above formulations, the% symbol relates to weight by weight percentage.

【０２１５】 本発明の方法において使用するための特定の組成物は、MIF治療薬がリポソー
ム含有組成物に調製されることを特徴とするものである。リポソームは、例えば
ホスファチジルコリン、エタノールアミンおよびセリン、スフィンゴミエリン、
カルジオリピン、プラズマロゲン、ホスファチジン酸およびセレブロシドなどの
極脂質のような両親媒性分子により形成される人工小胞である。適切な両親媒性
分子が水または水溶液中で膨張して、通常、水性物質により互いに分離される多
くの二重層からなる多層構造の液体結晶を形成する場合に、リポソームが形成さ
れる（粗リポソームとも称される）。液体物質を被包する単一の二重層からなる
ことが知られているリポソームの別の種類は、単層小胞と称される。脂質の膨張
中に水溶性物質が水層に含まれていると、それらは、脂質二重層の間の水層に入
る。A particular composition for use in the method of the invention is characterized in that the MIF therapeutic agent is formulated in a liposome-containing composition. Liposomes include, for example, phosphatidylcholine, ethanolamine and serine, sphingomyelin,
It is an artificial vesicle formed by amphipathic molecules such as cardiolipin, plasmalogens, phosphatidic acid and polar lipids such as cerebroside. Liposomes are formed when suitable amphiphilic molecules swell in water or an aqueous solution to form multi-layered liquid crystals, usually composed of many bilayers separated from each other by aqueous substances (crude liposomes). Also called). Another type of liposome known to consist of a single bilayer encapsulating a liquid substance is called a unilamellar vesicle. If water-soluble substances are included in the aqueous layer during lipid swelling, they enter the aqueous layer between the lipid bilayers.

【０２１６】 例えばMIFポリペプチドの様々の塩の形態のような水溶性の活性成分は、分子
層の間の水性の空間に被包される。有機擬態物のようなMIF治療薬の脂溶性活性
成分は、極性の頭部基が層から水溶性の空間中に突き出すかもしれないが、脂質
層中に主として組み込まれる。これらの化合物の被包は、多くの方法により達成
できる。最もよく使用される方法は、有機溶媒からの蒸発によりリン脂質の厚い
フィルムをフラスコの壁面上に鋳造することを含む。このフィルムを適切な水性
媒質中に分散させると、多層リポソームが形成される。適切な音波破砕をすると
、粗リポソームは、より小さくて同様に閉じた小胞を形成する。Water-soluble active ingredients, such as various salt forms of MIF polypeptides, are encapsulated in the aqueous space between the molecular layers. The lipophilic active ingredients of MIF therapeutics such as organic mimetics are predominantly incorporated into the lipid layer, although polar head groups may project from the layer into the water-soluble space. Encapsulation of these compounds can be accomplished in a number of ways. The most commonly used method involves casting a thick film of phospholipids on the walls of a flask by evaporation from an organic solvent. When this film is dispersed in a suitable aqueous medium, multilamellar liposomes are formed. With proper sonication, the crude liposomes form smaller, similarly closed vesicles.

【０２１７】 水溶性の活性成分は通常、鋳造フィルムを化合物の水溶液とともに分散させる
ことにより組み込まれる。次に被包されない化合物を、遠心分離、クロマトグラ
フィ、透析または他の適切であると知られる方法により除去する。脂溶性の活性
成分は通常、フィルムを鋳造する前に有機溶媒中にリン脂質とともに溶解させる
ことにより組み込まれる。脂質相中の物質の溶解度を超えないまたは量が脂質の
限界量を超えない場合には、上述の方法により調製されたリポソームは通常、脂
質二重層中の物質の大部分を含有する；被包されない物質からのリポソームの分
離は必要ではない。Water-soluble active ingredients are usually incorporated by dispersing the cast film with an aqueous solution of the compound. Unencapsulated compound is then removed by centrifugation, chromatography, dialysis or other methods known to be suitable. The lipophilic active ingredient is usually incorporated by dissolving it with the phospholipid in an organic solvent prior to casting the film. If the solubility of the substance in the lipid phase is not exceeded or if the amount does not exceed the limiting amount of lipid, the liposomes prepared by the above method usually contain the majority of the substance in the lipid bilayer; Separation of liposomes from unretained material is not necessary.

【０２１８】 MIF治療薬のリポソーム製剤形態の調製に特に都合のよい方法は、ここに引用
される欧州特許第A-253,619号に記載されている方法である。この方法において
は、被包された活性成分を含有する単一の二重層化したリポソームを、脂質成分
を有機媒質中に溶解し、脂質成分の有機溶液を圧力下で水溶性成分中に注入し同
時に高速ホモジナイザまたは混合方法で有機成分と水溶性成分とを混合すること
により調製すると、リポソームが自発的に形成される。A particularly convenient method for the preparation of liposomal dosage forms of MIF therapeutic is the method described in EP-A-253,619, incorporated herein by reference. In this method, a single bilayered liposome containing an encapsulated active ingredient is prepared by dissolving a lipid component in an organic medium and injecting an organic solution of the lipid component under pressure into a water-soluble component. At the same time, when it is prepared by mixing the organic component and the water-soluble component with a high-speed homogenizer or a mixing method, liposomes are spontaneously formed.

【０２１９】 被包されたMIF治療薬を含有する単一の二重層化したリポソームは直接使用で
きる、または局所施用に適切な薬学的に許容できるキャリア中で使用できる。リ
ポソームの粘性は、例えばキサンチンガム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒ
ドロキシプロピルメチルセルロースおよびそれらの混合物のような、適切な肥厚
薬を1つ以上付加することにより増加できる。水溶性成分は、水のみからなって
もよい、または電解質、緩衝系および例えば防腐剤のような他の成分を含有して
もよい。使用できる適切な電解質は、アルカリ金属およびアルカリ土類金属塩の
ような金属塩を含む。好ましい金属塩は、塩化カルシウム、塩化ナトリウムおよ
び塩化カリウムである。電解質の濃度は、0mMから260mMまで、好ましくは5mMか
ら160mMまで変化してもよい。水溶性成分を、有機成分の注入中に大きな乱れを
もたらすことにより、均質化に適合できる適切な容器中に配置する。２つの成分
の均質化は、容器内で行うことができる、あるいは、水溶性および有機成分を、
容器外に配置された混合装置中に別々に注入してもよい。後者の場合には、リポ
ソームは混合装置中で形成され、その後採集するために別の容器に移す。The single bilayered liposomes containing the encapsulated MIF therapeutic can be used directly or in a pharmaceutically acceptable carrier suitable for topical application. The viscosity of the liposomes can be increased by the addition of one or more suitable thickening agents such as xanthine gum, hydroxypropyl cellulose, hydroxypropylmethyl cellulose and mixtures thereof. The water-soluble components may consist of water only, or may contain electrolytes, buffer systems and other components such as preservatives. Suitable electrolytes that can be used include metal salts such as alkali metal and alkaline earth metal salts. Preferred metal salts are calcium chloride, sodium chloride and potassium chloride. The concentration of the electrolyte may vary from 0 mM to 260 mM, preferably 5 mM to 160 mM. The water-soluble components are placed in a suitable container that can be adapted for homogenization by causing significant turbulence during the injection of organic components. Homogenization of the two components can be done in a container, or alternatively the water-soluble and organic components
It may be separately injected into the mixing device located outside the container. In the latter case, liposomes are formed in the mixing device and then transferred to another container for collection.

【０２２０】 有機成分は、例えばエタノール、グリセロール、プロピレングリコールおよび
ポリエチレングリコールのような適切な非毒性の薬学的に許容できる溶媒、およ
び溶媒中に溶解できる適切なリン脂質からなる。使用できる適切なリン脂質は、
例えば、レシチン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチ
ジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、リソホスファチジルコリ
ンおよびホスファチジルグリセロールを含む。リポソームの特性を選択的に修飾
するために、他のリン脂質添加物を使用してもよい。そのような他の添加物の例
は、ステアリルアミン、ホスファチジン酸、トコフェノール、コレステロールお
よびラノリン抽出物を含む。The organic component consists of a suitable non-toxic pharmaceutically acceptable solvent such as ethanol, glycerol, propylene glycol and polyethylene glycol, and a suitable phospholipid soluble in the solvent. Suitable phospholipids that can be used are
Examples include lecithin, phosphatidylcholine, phosphatidylserine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylinositol, lysophosphatidylcholine and phosphatidylglycerol. Other phospholipid additives may be used to selectively modify the properties of the liposomes. Examples of such other additives include stearylamine, phosphatidic acid, tocophenol, cholesterol and lanolin extracts.

【０２２１】 さらに、リン脂質の酸化を防止できる他の成分を、有機成分に加えてもよい。
そのような他の成分の例は、トコフェノール、ブチル化ヒドロキシアニソール、
ブチル化ヒドロキシトルエン、アスコルビルパルミテートおよびアスコルビルオ
レエートを含む。安息香酸、メチルパラベンおよびプロピルパラベンのような防
腐剤も加えてもよい。Furthermore, other components capable of preventing the oxidation of phospholipids may be added to the organic component.
Examples of such other ingredients are tocophenol, butylated hydroxyanisole,
Includes butylated hydroxytoluene, ascorbyl palmitate and ascorbyl oleate. Preservatives such as benzoic acid, methylparaben and propylparaben may also be added.

【０２２２】 上述の組成物のほかに、適切な量のMIF治療薬を含有する、例えば硬膏剤、包
帯、包帯剤、ガーゼパッド等のカバーを使用してもよい。いくつかの場合には、
治療製剤を含有する局所製剤をしみ込ませた、硬膏剤、包帯、包帯剤、ガーゼパ
ッド等を使用してもよい。In addition to the compositions described above, covers containing suitable amounts of MIF therapeutics, such as plasters, bandages, bandages, gauze pads, etc., may be used. In some cases,
Plasters, bandages, bandages, gauze pads and the like, which are soaked with a topical preparation containing a therapeutic preparation, may be used.

【０２２３】 上述した全ての文献および公報をここに引用する。[0223]   All documents and publications mentioned above are cited here.

【０２２４】 同等物 当業者には、ここに記載した特定のポリペプチド、核酸、方法、アッセイおよ
び試薬に対する数多くの同等物を認識されるかまたは日常的な実験を用いて確認
できる。そのような同等物は、本発明の範囲内にあると考えられる。Equivalents One of ordinary skill in the art will recognize or be able to ascertain using routine experimentation, numerous equivalents to the particular polypeptides, nucleic acids, methods, assays and reagents described herein. Such equivalents are considered to be within the scope of this invention.

【配列表】 [Sequence list]

【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

【図１】 コンセンサス配列（配列番号３）を有する、ヒト（配列番号２）、マウス、ラ
ットおよびウシMIFの配列整合FIG. 1 Sequence alignment of human (SEQ ID NO: 2), mouse, rat and bovine MIF with a consensus sequence (SEQ ID NO: 3).

【図２】 p53に誘発される細胞周期の停止を回避できる遺伝子を同定するための分析の
図FIG. 2. Diagram of an analysis to identify genes that can avoid p53-induced cell cycle arrest.

【図３】 培養プレートの写真[Figure 3]   Photo of culture plate

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 14/52 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｎ 5/10 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ， ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，Ｌ Ｔ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ， ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，Ｕ Ａ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ハノン，グレゴリー ジェイ アメリカ合衆国 ニューヨーク州 11743 ハンティントン サミス ストリート 92 (72)発明者 ビーチ，デイヴィッド エイチ アメリカ合衆国 ニューヨーク州 11743 ハンティントン サウンド ベイ ドラ イヴ 10 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA80 CA04 DA02 EA02 FA17 GA11 HA17 4B063 QA19 QQ43 QR08 QR32 QR36 QR42 QR56 QS25 QS34 QX02 4B065 AA90X AA91X AA91Y AB01 BA02 CA24 CA44 CA46 4C084 AA02 AA19 BA22 MA02 NA14 ZB221 ZB261 4H045 AA30 BA10 CA40 DA12 EA15 EA28 EA51 FA74 ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (51) Int.Cl. ⁷ Identification code FI theme code (reference) C07K 14/52 C12N 15/00 ZNAA C12N 5/10 A61K 37/02 C12Q 1/68 C12N 5/00 B ( 81) Designated countries EP (AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, GW, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH, GM, KE, LS, MW, SD, SZ, UG, ZW), EA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AL, AM, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BY, CA, C , CN, CU, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, GB, GD, GE, GH, GM, HR, HU, ID, IL, IN, IS, JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK , SL, TJ, TM, TR, TT, UA, UG, US, UZ, VN, YU, ZW (72) Inventor Hannon, Gregory Jay United States New York 11743 Huntington Samis Street 92 (72) Inventor Beach, David H United States New York 11743 Huntington Sound Bay Drive 10 F Term (reference) 4B024 AA01 BA80 CA04 DA02 EA02 FA17 GA11 HA17 4B063 QA19 QQ43 QR08 QR32 QR36 QR42 QR56 QS25 QS34 QX02 4B065 AA90X AA91X AA91Y AB01 BA02 CA24 CA44 CA46 4C084 AA02 AA19 BA22 MA02 NA14 ZB221 ZB261 4H045 AA30 BA10 CA40 DA12 EA15 EA28 EA51 FA74

Claims (32)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 細胞周期チェックポイントを回避できるポリペプチドを同定
する方法であって、 (a) 細胞の増殖停止を起こすように細胞周期チェックポイント遺伝子を過発
現する細胞を産生し、 (b) ポリペプチド産物をコードする核酸を異所的に発現させ、 (c) 該核酸のポリペプチド産物がチェックポイント媒介増殖停止を回避する
か否かを測定する、 各工程を含むことを特徴とする方法。1. A method for identifying a polypeptide capable of circumventing a cell cycle checkpoint, comprising: (a) producing a cell overexpressing a cell cycle checkpoint gene so as to cause cell growth arrest; (b) A method comprising the steps of: ectopically expressing a nucleic acid encoding a polypeptide product, and (c) determining whether the polypeptide product of the nucleic acid avoids checkpoint-mediated growth arrest. . 【請求項２】 前記細胞周期チェックポイントが、p53およびp53様腫瘍サプ
レッサー、Ink4遺伝子産物、およびCIP/KIP遺伝子産物からなる群より選択され
ることを特徴とする請求項１記載の方法。2. The method of claim 1, wherein the cell cycle checkpoint is selected from the group consisting of p53 and p53-like tumor suppressor, Ink4 gene product, and CIP / KIP gene product. 【請求項３】 請求項１または請求項２においてチェックポイント媒介増殖
停止を回避できると同定された、ポリペプチドの精製されたおよび/または組換
え製剤、またはその相同体。3. A purified and / or recombinant preparation of a polypeptide, or a homologue thereof, identified in claim 1 or claim 2 as being able to avoid checkpoint-mediated growth arrest. 【請求項４】 前記ポリペプチドが、可溶性の細胞外ポリペプチドであるこ
とを特徴とする請求項３記載の製剤。4. The formulation according to claim 3, wherein the polypeptide is a soluble extracellular polypeptide. 【請求項５】 請求項３記載のポリペプチドをコードする核酸。5. A nucleic acid encoding the polypeptide according to claim 3. 【請求項６】 細胞増殖を誘発する方法であって、細胞を、インビトロまた
はインビボで、細胞増殖を誘発する請求項３記載のポリペプチドのある量と接触
させる工程を含むことを特徴とする方法。6. A method of inducing cell proliferation, comprising the step of contacting cells in vitro or in vivo with an amount of the polypeptide of claim 3 which induces cell proliferation. . 【請求項７】 細胞増殖を誘発する方法であって、細胞を、インビトロまた
はインビボで、細胞増殖を誘発するマクロファージ遊走阻止因子(MIF)またはそ
の相同体のある量と接触させる工程を含むことを特徴とする方法。7. A method of inducing cell proliferation, comprising the step of contacting a cell in vitro or in vivo with an amount of macrophage migration inhibitory factor (MIF) or a homologue thereof that induces cell proliferation. How to characterize. 【請求項８】 細胞増殖を誘発する方法であって、細胞を、インビトロまた
はインビボで、細胞増殖を誘発するのに十分な量で、配列番号２またはその一部
に同一または相同のMIFアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはそのペプチド擬
態物のある量と接触させる工程を含むことを特徴とする方法。8. A method of inducing cell proliferation, wherein the cells are MIF amino acid sequence identical or homologous to SEQ ID NO: 2 or a portion thereof in vitro or in vivo in an amount sufficient to induce cell proliferation. A method comprising contacting with a certain amount of a polypeptide comprising or a peptidomimetic thereof. 【請求項９】 細胞が受けることのできる有糸***の数を増加させる方法で
あって、細胞を、細胞の増殖を促進するのに十分な量で、配列番号２またはその
一部と同一または相同のMIFアミノ酸配列を含むポリペプチドと接触させる工程
を含むことを特徴とする方法。9. A method of increasing the number of mitotic cells a cell can undergo, which is the same as SEQ ID NO: 2 or a portion thereof, in an amount sufficient to promote cell proliferation. A method comprising contacting with a polypeptide comprising a homologous MIF amino acid sequence. 【請求項１０】 化学治療薬に対する癌細胞の化学的感受性を改良する方法
であって、細胞を、十分な量でおよび細胞がp53依存性の細胞死を受ける条件下
でMIFポリペプチドと接触させる工程を含むことを特徴とする方法。10. A method of improving the chemosensitivity of cancer cells to chemotherapeutic agents, wherein the cells are contacted with a MIF polypeptide in a sufficient amount and under conditions under which the cells undergo p53-dependent cell death. A method comprising the steps of: 【請求項１１】 前記MIFポリペプチドが、ストリンジェントな条件下で配
列番号1にハイブリッド形成する核酸によりコードされることを特徴とする請求
項７または請求項８いずれか1項記載の方法。11. The method of any one of claims 7 or 8, wherein the MIF polypeptide is encoded by a nucleic acid that hybridizes to SEQ ID NO: 1 under stringent conditions. 【請求項１２】 前記方法が、幹細胞または始原細胞の寿命を延ばすことを
特徴とする請求項７記載の方法。12. The method of claim 7, wherein the method extends the life span of stem cells or progenitor cells. 【請求項１３】 寿命を延長できる前記細胞が、神経細胞、造血細胞、膵細
胞、および肝の幹細胞および始原細胞からなる群より選択されることを特徴とす
る請求項１２記載の方法。13. The method of claim 12, wherein the cells capable of extending lifespan are selected from the group consisting of neural cells, hematopoietic cells, pancreatic cells, and liver stem cells and progenitor cells. 【請求項１４】 前記方法が、皮膚または他の上皮細胞の寿命を延ばすこと
を特徴とする請求項７記載の方法。14. The method of claim 7, wherein the method extends the life span of skin or other epithelial cells. 【請求項１５】 前記方法が、間葉細胞の寿命を延ばすことを特徴とする請
求項７記載の方法。15. The method of claim 7, wherein the method prolongs the life span of mesenchymal cells. 【請求項１６】 前記方法が、軟骨細胞または骨細胞の寿命を延ばすことを
特徴とする請求項７記載の方法。16. The method of claim 7, wherein the method prolongs the life span of chondrocytes or osteocytes. 【請求項１７】 前記方法が、培養物中または移植組織中の細胞の寿命を延
ばすことを特徴とする請求項１２から１６いずれか１項記載の方法。17. The method according to claim 12, wherein the method prolongs the life span of cells in culture or in transplanted tissue. 【請求項１８】 前記方法が、インビボで細胞の寿命を延ばすことを特徴と
する請求項１２から１６いずれか１項記載の方法。18. The method according to any one of claims 12 to 16, wherein the method prolongs the life span of cells in vivo. 【請求項１９】 活性成分として、配列番号２またはその一部に同一または
相同のMIFアミノ酸配列を含むポリペプチド、および薬学的に許容できる賦形剤
を含むことを特徴とする薬剤。19. A drug comprising, as an active ingredient, a polypeptide containing a MIF amino acid sequence identical or homologous to SEQ ID NO: 2 or a part thereof, and a pharmaceutically acceptable excipient. 【請求項２０】 活性成分として、配列番号２またはその一部に同一または
相同のMIFアミノ酸配列を、局所的に施用される場合に皮膚層の細胞の増殖を促
進するのに適切な量で含むポリペプチド、および局所施用について薬学的に許容
できる賦形剤を含むことを特徴とする化粧品。20. As an active ingredient, it comprises a MIF amino acid sequence identical or homologous to SEQ ID NO: 2 or a part thereof, in an amount suitable to promote the proliferation of cells of the skin layer when applied topically. A cosmetic comprising a polypeptide and a pharmaceutically acceptable excipient for topical application. 【請求項２１】 創傷の治癒を促進する方法であって、患者の創傷部位を、
細胞増殖を誘発するのに十分な量で、配列番号２またはその一部に同一または相
同のMIFアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはそのペプチド擬態物のある量と
接触させる工程を含むことを特徴とする方法。21. A method of promoting wound healing, the method comprising:
Contacting with an amount of a polypeptide comprising a MIF amino acid sequence identical or homologous to SEQ ID NO: 2 or a portion thereof, or a peptidomimetic thereof, in an amount sufficient to induce cell proliferation. Method. 【請求項２２】 前記創傷部位が上皮組織を含み、前記ポリペプチドが上皮
組織の増殖を促進することを特徴とする請求項２１記載の方法。22. The method of claim 21, wherein the wound site comprises epithelial tissue and the polypeptide promotes epithelial tissue proliferation. 【請求項２３】 前記創傷が、手術、熱傷、炎症または過敏から生じること
を特徴とする請求項２１記載の方法。23. The method of claim 21, wherein the wound results from surgery, burns, inflammation or irritation. 【請求項２４】 前記MIFポリペプチドが、例えば皮膚、毛および/または爪
の組織再生過程を強めるために、例えば化粧品の形態で予防的に施用されること
を特徴とする請求項２１記載の方法。24. The method according to claim 21, characterized in that the MIF polypeptide is applied prophylactically, for example in the form of a cosmetic product, for example to enhance the tissue regeneration process of the skin, hair and / or nails. . 【請求項２５】 前記創傷が皮膚潰瘍であることを特徴とする請求項２１記
載の方法。25. The method of claim 21, wherein the wound is a skin ulcer. 【請求項２６】 前記皮膚潰瘍が、静脈病（静脈うっ血性潰瘍）、過圧力（
褥瘡性潰瘍）または動脈潰瘍から生じることを特徴とする請求項２５記載の方法
。26. The skin ulcers are venous diseases (venous stasis ulcers), overpressure (
27. The method according to claim 25, which results from a decubitus ulcer) or an arterial ulcer. 【請求項２７】 p53のMIF媒介バイパスを含む表現型で細胞の増殖を抑制す
る方法であって、細胞を、p53のMIF媒介バイパスを抑制する因子と接触させる工
程を含むことを特徴とする方法。27. A method of inhibiting cell growth in a phenotype comprising MIF-mediated bypass of p53, the method comprising contacting the cell with an agent that inhibits MIF-mediated bypass of p53. . 【請求項２８】 合同投与をするキットであって、(a)請求項１９記載の製
剤、および(b)栄養因子を含むことを特徴とするキット。28. A kit for joint administration, which comprises (a) the formulation according to claim 19 and (b) a nutritional factor. 【請求項２９】 合同投与をするキットであって、(a)請求項１９記載の製
剤、および(b)刺激因子を含むことを特徴とするキット。29. A kit for joint administration, which comprises (a) the formulation according to claim 19 and (b) a stimulating factor. 【請求項３０】 合同投与をするキットであって、(a)請求項１９記載の製
剤、および(b)化学治療薬を含むことを特徴とするキット。30. A kit for joint administration, comprising (a) the formulation of claim 19 and (b) a chemotherapeutic agent. 【請求項３１】 前記化学治療薬が、ブスルファン、インプロスルファンお
よびピポスルファンのようなアルキルスルホネート；ベンゾデパ、カルボクオン
、メチャーデパおよびウレデパのようなアジリジン；アルトレトアミン、トリエ
チレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミ
ドおよびトリメチロメラミンのようなエチレンイミンおよびメチルメラミン；ク
ロラムブシル、クロルナファジン、クロホスファミド、エストラムスチン、イフ
ォスファミド、メクロレタミン、塩酸メクロレタミン、メルファラン、ノベンビ
チン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロフォスファミドおよびウラシル
マスタードのようなナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン
、フォレムスチン、ロムスチン、ニムスチンおよびラニムスチンのようなニトロ
ソ尿素類；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトル；ミトラクトール；
およびピポブロマンからなる群より選択されることを特徴とする請求項１０記載
の方法または請求項３０記載のキット。31. The chemotherapeutic agent is an alkyl sulfonate such as busulfan, improsulfan and piposulfan; Ethyleneimine and methylmelamine, such as triethylenethiophosphoramide and trimethylolmelamine; chlorambucil, chlornafazine, clofosfamide, estramustine, ifosfamide, mechlorethamine, mechlorethamine hydrochloride, melphalan, nobenvitine, phenesterine, prednimustine, trofosfamim. And mustard and uracil mustard Nitrogen mustards; carmustine, chlorozotocin, foremustine, lomus Nitrosoureas such as Chin, Nimustine and Ranimustine; Dacarbazine; Mannomustine; Mitobronitor; Mitractol;
31. The method according to claim 10 or the kit according to claim 30, characterized in that it is selected from the group consisting of and pipobroman. 【請求項３２】 細胞の増殖能力を増加する方法であって、細胞中に可逆的
にp53チェックポイントを回避する因子を供給する工程を含むことを特徴とする
方法。32. A method of increasing the proliferative capacity of a cell, comprising the step of providing a factor that reversibly circumvents the p53 checkpoint into the cell.