JP2002530436A - Method and reagent for enhancing proliferation ability and preventing replication senescence - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、細胞の寿命を延長させる、例えば有糸***数を大きくさせるための方法及び反応体に関する。一般に、本発明の方法はテロメラーゼ活性の活性化並びにＲｂ／ｐ１６経路又はｐ５３経路の一方又は両方の阻害に頼っている。 (57) SUMMARY The present invention relates to methods and reactants for extending the life of a cell, for example, increasing the number of mitosis. In general, the methods of the invention rely on activation of telomerase activity and inhibition of one or both of the Rb / p16 or p53 pathways.

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】発明の背景 培養中でプレートされた哺乳動物の正常二倍体細胞は、有限増殖寿命を有して
おり、変異遺伝子発現を特徴とする複製老化と称される非***状態に入る〔Ｈａ
ｙｆｌｉｃｋら，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．第２５巻：５８５ページ（１９６
１年）；Ｗｒｉｇｈｔら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．第９巻：３０８８ペー
ジ（１９８９年）；Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ 第２４９巻：１１２
ページ（１９９０年）；Ｃａｍｐｉｓｉ，Ｃｅｌｌ 第８４巻：４９７ページ（
１９９６年）；Ｃａｍｐｉｓｉ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ 第３３巻：７０３
ページ（１９９７年）；Ｆａｒａｇｈｅｒら，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ 第２巻：６４ページ（１９９７年）〕。歴史的に、複製老化は、生
活時間又は代謝時間ではなく累積細胞***に依存するとみなされており、これは
、増殖が「***時計」によって制限されることを示している〔Ｄｅｌｌ’Ｏｒｃ
ｏら，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．第７７巻：３５６ページ（１９７３年）；Ｈ
ａｄｅｙら，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．第９７巻：５０９ページ（１９７
８年）〕。高齢ドナーや早期老化症候群に罹患している患者由来の細胞の増殖能
の低下〔Ｍａｒｔｉｎら，Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．第２３巻：８６ページ（１９
７０年）；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら，ＰＮＡＳ 第７３巻：３５８４ページ（１９
７６年）；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅ ｄ． 第１４１巻：１０９２ページ（１９７２年）；Ｅｌｍｏｒｅら，Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ． 第８７巻：２２９ページ（１９７６年）〕及び変異遺伝子発現
パターンを有する老化細胞の生体内蓄積〔Ｓｔａｎｕｌｉｓ−Ｐｒａｅｇｅｒら
，Ｍｅｃｈ．Ａｇｅｉｎｇ Ｄｅｖ．第３８巻：１ページ（１９８７年）；及び
Ｄｉｍｒｉら，ＰＮＡＳ 第９２巻：９３６３ページ（１９９５年）〕は、加齢
及び加齢関連病理学における細胞老化が関連している〔Ｈａｙｆｌｉｃｋら，Ｅ ｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ． 第２５巻：５８５ページ（１９６１年）；Ｗｒｉｇｈ
ｔら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．第９巻：３０８８ページ（１９８９年）；
Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ 第２４９巻：１１２ページ（１９９０年
）；Ｃａｍｐｉｓｉ，Ｃｅｌｌ 第８４巻：４９７ページ（１９９６年）；Ｃａ
ｍｐｉｓｉ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ 第３３巻：７０３ページ（１９９７年
）；Ｆａｒａｇｈｅｒら，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ 第２巻
：６４ページ（１９９７年）〕。[0001] Normal diploid cells of plates mammal in Background cultures invention has a finite growth life, enters a non-dividing state called replicative senescence, wherein the mutant gene expression [ Ha
yflick et al . , Exp. Cell Res. Volume 25: 585 pages (196
1 year); Wright et al . , Mol. Cell Biol. 9: 3088 (1989); Goldstein, Science, 249: 112.
Page (1990); Campisi, Cell 84: 497 (
1996); Campisi, Eur. J. Cancer Volume 33: 703
Faragher et al., Drug Discovery Today 2:64 (1997)]. Historically, replicative senescence has been assumed to depend on cumulative cell division rather than life time or metabolic time, indicating that proliferation is limited by the "division clock" [Dell 'Orc
o et al . , Exp. Cell Res. Volume 77: 356 pages (1973); H
adey et al . Cell Physiol. Volume 97: 509 pages (197
8 years)]. Decreased proliferation of cells from elderly donors or patients with premature aging syndrome [Martin et al . , Lab. Invest. Volume 23: 86 pages (19
70); Schneider et al., PNAS 73: 3584 (19).
76); Schneider et al . , Proc. Soc. Exp. Biol. Med . 141: 1092 (1972); Elmore et al., Cell Physiol. 87: 229 (1976)] and bioaccumulation of senescent cells with mutated gene expression patterns [Stanulis-Praeger et al . , Mech. Aging Dev. 38: 1 (1987); and Dimri et al., PNAS 92: 9363 (1995)] relate cellular senescence in aging and age-related pathology [Hayflick et al., E xp. Cell Res. Volume 25: 585 (1961); Wright
t et al . , Mol. Cell. Biol. Volume 9: 3088 pages (1989);
Goldstein, Science 249: 112 (1990); Campisi, Cell 84: 497 (1996); Ca
mpisi, Eur. J. Cancer 33: 703 (1997); Faragher et al., Drug Discovery Today 2:64 (1997)].

【０００２】 細胞老化は、おおむね現場での細胞寿命の延長により治療し得る高齢者の多発
性症状を引き起こすもととなると考えられている。細胞老化の例としては、皮膚
線維芽細胞の細胞外マトリックス恒常性の喪失による皮膚萎縮症；ＲＰＥ細胞に
おけるリポフスチンの蓄積及びニューロン生存因子のダウンレギュレーションに
起因する加齢関連筋肉変性；ならびに内皮細胞における増殖能の喪失や高血圧及
び血栓因子の過発現に起因するアテローム性動脈硬化症が含まれる。[0002] Cellular senescence is believed to cause multiple symptoms in the elderly that can be treated, largely by extending cell life in the field. Examples of cell senescence include cutaneous atrophy due to loss of extracellular matrix homeostasis of dermal fibroblasts; age-related muscle degeneration due to lipofuscin accumulation in RPE cells and down-regulation of neuronal survival factors; Includes atherosclerosis due to loss of proliferative capacity and hypertension and overexpression of thrombotic factors.

【０００３】 寿命延長された細胞も生体外で潜在的用途を有する。クローン化された正常二
倍体細胞は、成長及び分化の生化学的及び生理学的面の研究において樹立腫瘍細
胞系に取って代わることが可能である。長寿ヒト正常細胞は、正常又は改変バイ
オテクノロジー製品の生産に用いることができ、また増殖された正常又は遺伝子
改変によって若返らせた細胞集団は自己又は同種細胞及び遺伝子療法に用いるこ
とができる。したがって、若い正常細胞に特有な二倍体持続状態、増殖特性及び
遺伝子発現パターンを維持しながら、細胞の寿命を延ばす能力は、生物学的研究
、医薬品産業及び医学にとって重要な意味を有する。[0003] Extended life cells also have potential uses in vitro. Cloned normal diploid cells can replace established tumor cell lines in studies of the biochemical and physiological aspects of growth and differentiation. Long-lived human normal cells can be used for the production of normal or modified biotechnology products, and expanded normal or genetically modified cell populations can be used for autologous or allogeneic cells and gene therapy. Therefore, the ability to extend the lifespan of cells while maintaining the diploid persistence, growth characteristics and gene expression patterns characteristic of young normal cells has important implications for biological research, the pharmaceutical industry and medicine.

【０００４】 テロメアの喪失は、老化への進行を制御する１つの側面であると考えられてい
る。ヒトテロメアは、染色体末端の配列ＴＴＡＧＧＧ／ＣＣＣＴＡＡの反復から
なる。これらの反復配列は、リボ核タンパク質酵素テロメラーゼによって合成さ
れる。テロメラーゼは、生殖細胞で活性であり、ヒトでは、これらの細胞中のテ
ロメアは約１５キロベースペア（ｋｂｐ）に維持される。それに反し、ほとんど
のヒト体組織ではテロメラーゼは発現されず、テロメア長は著しく短い。細胞老
化についてのテロメア仮説は、***を繰り返す度に短くなるテロメアがテロメア
しきい値長になったときに細胞が老化状態になると主張している。[0004] Telomere loss is believed to be one aspect of controlling progression to aging. Human telomeres consist of repeats of the sequence TTAGGG / CCCTAA at the chromosome end. These repeats are synthesized by the ribonucleoprotein enzyme telomerase. Telomerase is active in germ cells, and in humans, telomeres in these cells are maintained at about 15 kilobase pairs (kbp). In contrast, telomerase is not expressed in most human body tissues and telomere length is significantly shorter. The telomere hypothesis for cell aging argues that cells become senescent when the telomeres, which become shorter with each division, reach the telomere threshold length.

【０００５】 ヒトテロメラーゼ逆転写酵素サブユニット（ｈＴＲＴ）がクローン化された。
Ｎａｋａｍｕｒａら，Ｓｃｉｅｎｃｅ 第２７７巻：９５５ページ（１９９７年
）；Ｍｅｙｅｒｓｏｎら，Ｃｅｌｌ 第９０巻：７８ページ（１９９７年）；及
びＫｉｌｉａｎら，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．第６巻：２０１１ページ（１
９９７年）を参照されたい。最近、テロメラーゼの鋳型ＲＮＡ（ｈＴＲ）成分を
発現するがｈＴＲＴは発現しないヒト正常二倍体細胞におけるｈＴＲＴの遷移発
現によりテロメラーゼ活性を再構成し得ることが論証された。例えば、Ｗａｎｇ
ら，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．第１２巻：１７６９ページ（１９９８年）；及びＷｅ
ｉｎｒｉｃｈら，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．第１７巻：４９８ページ（１９９
７年）を参照されたい。これは、テロメア長を操作して、テロメアの短縮が細胞
老化を引き起こすとする仮説をテストする機会を提供した。[0005] The human telomerase reverse transcriptase subunit (hTRT) has been cloned.
Nakamura et al., Science 277: 955 (1997); Meyerson et al., Cell 90:78 (1997); and Kilian et al . , Hum. Mol. Genet. Volume 6: 2011 pages (1
997). Recently, it has been demonstrated that telomerase activity can be reconstituted by transitional expression of hTRT in human normal diploid cells that express the template RNA (hTR) component of telomerase but not hTRT. For example, Wang
Et al., Genes Dev. 12: 1769 (1998); and We
inrich et al., Nature Genet. Volume 17: 498 pages (199
7 years). This provided an opportunity to manipulate telomere length and test the hypothesis that telomere shortening causes cellular senescence.

【０００６】 報告された結果は、テロメラーゼ不在下のテロメアの喪失は老化前の細胞の分
裂数を制御する内因性タイミングメカニズムであることを示している。これらの
細胞のテロメアの維持及び寿命に及ぼす外因性テロメラーゼ発現の長期的効果は
、より長い期間の研究で確認する必要がある。[0006] The reported results indicate that telomere loss in the absence of telomerase is an endogenous timing mechanism that controls the number of cell divisions before senescence. The long-term effects of exogenous telomerase expression on telomere maintenance and longevity in these cells need to be confirmed in longer-term studies.

【０００７】 テロメア恒常性は、活性の延長と短縮のバランスに起因するようである。極め
て低レベルのテロメラーゼ活性は、テロメア短縮の防止には明らかに不十分であ
る。これは、幹細胞が、低くても検出可能なテロメラーゼ活性を有しているのに
、寿命中テロメアの短縮を示しつづけるという観測と一致する。したがって、し
きい値レベルのテロメラーゼ活性は、寿命の延長に必要なようである。 例えば、テロメラーゼ活性を活性化させることによるテロメアの修復は、細胞
の複製能を延長するには十分であり得るが、特に活性化が長引く場合には、（例
えば、危機及びガン細胞の発現を引き起こす）形質転換事象である。[0007] Telomere homeostasis appears to be due to a balance between prolonged and shortened activity. Very low levels of telomerase activity are clearly insufficient to prevent telomere shortening. This is consistent with the observation that stem cells have low, but detectable, telomerase activity, but continue to show telomere shortening throughout life. Thus, threshold levels of telomerase activity appear to be required for prolonged life. For example, telomere repair by activating telomerase activity may be sufficient to prolong the ability of the cell to replicate, but especially when prolonged activation (eg, causes crisis and the development of cancer cells) ) Transformation event.

【０００８】発明の要旨 本発明の１つの態様は、細胞の寿命、例えば、有糸***数を延長する方法及び
試薬に関する。一般に、本発明は、テロメラーゼ活性の活性化及びＲｂ／ｐ１６
経路又はｐ５３経路の一方又は両方の阻害に依存する。[0008] One aspect of the subject matter the present invention relates to a life span of a cell, for example, relates to methods and reagents for extending the mitotic count. In general, the present invention relates to activation of telomerase activity and Rb / p16
Pathway or the inhibition of one or both of the p53 pathways.

【０００９】 本発明の方法は、生体内や生体外でも現場でも有用である。代表的な用途とし
ては、幹細胞又は前駆細胞の培養株もしくは移植組織の延長、皮膚又は他の上皮
細胞の培養株もしくは移植片の延長、間充織細胞の培養株もしくは移植片の増殖
、及び軟骨又は骨細胞の培養株もしくは移植片の増殖が含まれるが、それらは例
示に過ぎない。本発明の方法により延長し得る代表的な幹細胞及び前駆細胞とし
ては、神経細胞、造血細胞、上皮細胞、膵細胞、肝細胞、軟骨細胞ならびに骨細
胞幹細胞及び前駆細胞がある。[0009] The method of the present invention is useful in vivo, ex vivo or on site. Typical uses include extending stem or progenitor cell cultures or transplants, extending skin or other epithelial cell cultures or transplants, growing mesenchymal cell cultures or transplants, and cartilage Or growth of bone cell cultures or explants, but these are merely exemplary. Representative stem and progenitor cells that can be extended by the methods of the present invention include neurons, hematopoietic cells, epithelial cells, pancreatic cells, hepatocytes, chondrocytes, and osteocyte stem and progenitor cells.

【００１０】 本発明の方法は、損傷癒合及び他の組織修復だけでなく、化粧品用にも使用可
能である。本発明の方法は、治療用又は他の商業的に重要なタンパク質類及び製
品に使用されている正常細胞又は組織培養株の寿命延長に用いることができる。The method of the present invention can be used for cosmetic as well as wound healing and other tissue repair. The methods of the present invention can be used to extend the lifespan of normal cells or tissue cultures used in therapeutic or other commercially important proteins and products.

【００１１】 本発明の実施には、特に断りのない限り、当業の技術範囲内の慣用の細胞生物
学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えＤＮ
Ａ、及び免疫学技術が用いられる。そのような技術は、以下の文献に記載されて
いる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ及びＭａｎｉａｔｉｓによっ
て編集された、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ ｙ Ｍａｎｕａｌ ，第２版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：１９８９年）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ，第Ｉ及び
第ＩＩ巻（Ｄ．Ｎ．Ｇｏｖｅｒ編，１９８５年）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉ ｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ （Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編，１９８４年）；Ｍｕｌｌｉｓ
ら，米国特許第４，６８３，１９５号；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉ ｄｉｚａｔｉｏｎ （Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編，１９
８４年）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ
．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編，１９８４年）；Ｃｕｌｔｕ ｒｅ Ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ （Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ａｌａｎ
Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９８７年）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ （ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８６年）；Ｂ．Ｐｅｒｂ
ａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌ ｏｎｉｎｇ （１９８４年）；専門書、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏ ｇｙ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎ．Ｙ．）；Ｇｅｎｅ Ｔｒａ ｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ （Ｊ．
Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ及びＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編，１９８７年，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）：Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚ ｙｍｏｌｏｇｙ ，第１５４巻及び第１５５巻（Ｗｕら編）；Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅ ｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｃｅｌｌ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （Ｍａｙｅｒ及びＷａｌｋｅｒ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓ
ｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８７年）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅ ｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ，第Ｉ〜第ＩＶ巻（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ及びＣ．
Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編，１９８６年）；Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ
．，１９８６年）を参照されたい。The practice of the present invention will involve, unless otherwise indicated, conventional cell biology, cell culture, molecular biology, transgenic biology, microbiology, recombinant DN within the skill of the art.
A, and immunological techniques are used. Such techniques are described in the following documents. For example, Molecular Cloning: A Laboratory y Manual , Second Edition (Cold Spring Harbor Labo), edited by Sambrook, Fritsch and Maniatis.
DNA Cloning , Volumes I and II (edited by DN Gover, 1985); Oligonucleoti de Synthesis (edited by MJ Gait , 1984); Mullis
Et al., U.S. Patent No. 4,683,195; Nucleic Acid Hybridization (ed. By BD Hames & SJ Higgins, 19).
1984); Transcription And Translation (B
. D. Hames & S.M. J. Higgins, eds., 1984); Cultu re Of Animal Cells ( R.I.Freshney, Alan
R. Liss, Inc. 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); Perb
al, A Practical Guide To Molecular Cl oning (1984 years); monographs, Methods In Enzymolo gy (Academic Press , Inc.N.Y.); Gene Tra nsfer Vectors For Mammalian Cells (J.
H. Miller and M.W. P. Calos, 1987, Cold Spri
ng Harbor Laboratory): Methods In Enz ymology, Volume 154 and 155, Volume (Wu et al., eds.); Immunoche mical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds, Academic Pres
s, London, 1987); Handbook of Experimental Immunology , Volumes I-IV (DM Weir and C.W.
C. Blackwell, ed., 1986); Manipulating the Mouse Embryo (Cold Spring Harbor Lab)
laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.W. Y
. , 1986).

【００１２】発明の詳細な説明 （ｉ） 概観 種々の疾患を治療するための生体外細胞ベース療法の使用はますます一般的に
なっている。例えば、皮膚移植及び軟骨修復のための患者自身の細胞の増殖は今
や商業的に利用可能である。一次細胞を操作する能力が発展するにつれ、初期も
しくは後期糖尿病治療用のベータ島細胞の注入又はパーキンソン病などの神経変
性疾患用の神経前駆細胞の移植などの他の治療的介入が臨床実験に入っている。
当業において、先天性酵素不全症の日常的矯正術、疾患耐性の確立、又は自己免
疫疾患の場合には免疫耐性の確立に最終的に有用であるとして、患者細胞の生体
外遺伝子改変も企図されている。[0012] The use of in vitro cell-based therapies to treat Detailed Description (i) Overview various diseases of the invention have become increasingly common. For example, the proliferation of patients' own cells for skin grafting and cartilage repair is now commercially available. As the ability to manipulate primary cells develops, other therapeutic interventions such as infusion of beta islet cells for the treatment of early or late stage diabetes or transplantation of neural progenitor cells for neurodegenerative diseases such as Parkinson's disease enter clinical trials. ing.
The art also contemplates in vitro genetic modification of patient cells as ultimately useful in routine correction of congenital enzyme deficiency, establishment of disease resistance, or in the case of autoimmune diseases, establishment of immune resistance. Have been.

【００１３】 細胞ベース療法は、一次細胞集団を単離し、これらの細胞を培養中で効率的に
増殖させる能力に依存する。しかし、ヒト正常細胞は、「複製老化」と称される
不可逆性増殖停止状態に入る前に、極く限られた数の細胞***を行うことができ
る（Ｈａｙｆｌｉｃｋ，前掲）。長年の間、ヒト細胞のクローン集団を樹立する
技術は、腫瘍細胞で始めるか又は悪性トランスホーメーション相を反復する遺伝
子改変の導入を必要としていた。培養中でヒト細胞寿命を延長するための特定の
技術は、ＳＶ４０ Ｔ抗原、ヒトパピローマウイルス抗原Ｅ６及びＥ７、又はア
デノウイルスＥ１ＡもしくはＥ１Ｂ抗原などのウイルス抗原の導入を必要として
いた。[0013] Cell-based therapies rely on the ability to isolate a primary cell population and grow these cells efficiently in culture. However, normal human cells can undergo a very limited number of cell divisions before entering an irreversible growth arrest called "replication senescence" (Hayflick, supra ). For many years, techniques for establishing clonal populations of human cells have required the introduction of genetic modifications that either begin with tumor cells or repeat the malignant transformation phase. Certain techniques for extending human cell lifespan in culture have required the introduction of viral antigens such as SV40 T antigen, human papillomavirus antigens E6 and E7, or adenovirus E1A or E1B antigen.

【００１４】 上述のように、この状態は、テロメア長に関連する死の制御によって誘発させ
ることができる。確かに、テロメラーゼ酵素の再活性化により、ある種の細胞集
団の増殖能を増強することができる。例えば、Ｂｏｄｎａｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ 第２７９巻：３４９ページ（１９９８年）；及びＷａｎｇら，前掲を参照され
たい。As mentioned above, this condition can be triggered by the control of death associated with telomere length. Indeed, reactivation of telomerase enzymes can enhance the proliferative capacity of certain cell populations. See, e.g., Bodnar et al., Science 279: 349 (1998); and Wang et al., Supra .

【００１５】 しかし、以下にさらに詳細に説明するように、培養中で正常細胞を無限に延長
するには、テロメラーゼの活性化だけでなく、複合死制御の副経路を必要とする
。初期には、この介入がトランスホーメーションを促進させずに寿命を延長する
との報告があった。これに対し、本出願人らのデータ及び他のデータは、テロメ
ラーゼがＲｈ／ＩＮＫ４経路の不活化と協力して始めて細胞を不死化し得ること
を論証している。テロメアの延長による不死化には、細胞がすでに一次制御ポイ
ント、Ｍ０を回避していることが必要である。Ｍ０の自然回避は、Ｒｈ／ｐ１６
腫瘍サプレッサー経路の不活化に伴って起こる。確かに、本出願人らは、有意に
高率の腫瘍において、Ｒｂ／Ｉｎｋ４経路、特にＲｈ／ｐ１６ＩＮＫ４ａ経路の
不活化が自然突然変異によって起こることを観測した。さらに、この事象、例え
ば、Ｒｂ／Ｉｎｋ４の不活化には、テロメラーゼの活性化だけが選択される。し
たがって、テロメラーゼ活性化だけだと強度にがん誘発性（ｐｒｏ−ｏｎｃｏｇ
ｅｎｉｃ）選択であるために、テロメラーゼ活性の長期活性化のみに基づくプロ
トコルによって生体外療法用の細胞を製造することは無謀であろう。However, as will be explained in more detail below, infinite extension of normal cells in culture requires not only the activation of telomerase but also the alternative pathway of complex death control. Initially, this intervention was reported to extend lifespan without promoting transformation. In contrast, Applicants' data and other data demonstrate that telomerase can immortalize cells only in cooperation with the inactivation of the Rh / INK4 pathway. Immortalization by telomere extension requires that cells have already evaded the primary control point, M0. Natural avoidance of M0 is Rh / p16
Occurs with inactivation of the tumor suppressor pathway. Indeed, Applicants have observed that in significantly higher percentages of tumors, inactivation of the Rb / Ink4 pathway, particularly the Rh / p16INK4a pathway, is caused by spontaneous mutations. Furthermore, only telomerase activation is selected for this event, eg, inactivation of Rb / Ink4. Therefore, telomerase activation alone is strongly cancer-inducing (pro-oncog
It would be reckless to produce cells for in vitro therapy by a protocol based solely on long-term activation of telomerase activity, because of the enic) selection.

【００１６】 本発明は、１つの態様において、細胞、好ましくは正常哺乳動物細胞の増殖能
を、正常細胞の遺伝的統一性を保存するように可逆性不死化によって増強する方
法を提供する。これは、Ｍ０シグナルの可逆性不活化と、場合によって、テロメ
ラーゼ活性の可逆性活性化及び／又はアポトーシス経路の可逆性不活化を含む方
法によって達成される。改変された正常細胞を増殖させた後、正常な生存細胞集
団を産生させるために、Ｍ０制御、及び適切な場合には、テロメラーゼ活性及び
アポトーシスの制御をそれらの正常な状態に戻す。好ましい実施態様において、
細胞は少なくとも一部の処理のために培養中で分離される。The invention provides, in one aspect, a method of enhancing the proliferative potential of a cell, preferably a normal mammalian cell, by reversible immortalization so as to preserve the genetic integrity of the normal cell. This is achieved by a method comprising reversible inactivation of the M0 signal and, optionally, reversible activation of telomerase activity and / or reversible inactivation of the apoptotic pathway. After growing the modified normal cells, the M0 control and, where appropriate, the control of telomerase activity and apoptosis are returned to their normal state in order to produce a normal living cell population. In a preferred embodiment,
Cells are separated in culture for at least some processing.

【００１７】 本発明の１つの実施態様は、一般に、後世動物細胞、好ましくは哺乳動物細胞
、より好ましくは正常哺乳動物細胞の増殖能を、細胞と、細胞中のＲｂ／ＩＮＫ
４経路の抗増殖活性を不活化する物質とを接触させることにより増強する方法を
提供する。そのような物質は、本明細書では集合的に「Ｒｂインアクチベーター
」と称される。[0017] One embodiment of the present invention generally relates to the ability of progeny animal cells, preferably mammalian cells, more preferably normal mammalian cells, to proliferate cells and Rb / INK in cells.
There is provided a method for enhancing the antiproliferative activity of the four pathways by contacting the same with a substance that inactivates the antiproliferative activity. Such substances are collectively referred to herein as "Rb inactivators".

【００１８】 いくつかの実施態様において、本発明の方法は、Ｒｂ経路に関与する「Ｒｂ優
性負」型タンパク質の異所性発現に依存する。そのようなタンパク質には、Ｒｂ
経路中の優性負型のＲｂ、ｐ１６ＩＮＫ４ａ又は他のタンパク質が含まれ、Ｒｂ
経路が活性のときにはそれらの野生型対立遺伝子が増殖を阻害する。In some embodiments, the methods of the invention rely on ectopic expression of “Rb dominant negative” proteins involved in the Rb pathway. Such proteins include Rb
Dominant negative Rb in the pathway, p16INK4a or other proteins,
When the pathway is active, those wild-type alleles inhibit growth.

【００１９】 他の実施態様において、本発明の方法は、優性負型変異体を用いるのではなく
、Ｒｂ／ＩＮＫ４経路、好ましくはＲｂ／ｐ１６ＩＮＫ４ａ経路を選択的かつ可
逆的に不活化し得るタンパク質産物を、それ自身の野生型対立遺伝子との負の干
渉以外でＲｂ依存性増殖を作動させるメカニズムによって異所性発現させること
に依存する。例えば、Ｒｂをバイパスし得るそのようなタンパク質には、ＭＥＭ
２及びパピローマウイルスＥ７タンパク質が含まれる。本明細書に用いられてい
る用語「Ｒｂインアクチベーター」とは、通常、例えば、タンパク質増殖活性の
Ｒｂ依存性調節を除去するために、Ｒｂによって負に調節される増殖シグナルを
供給するタンパク質の突然変異をも指す。In another embodiment, the method of the invention does not use a dominant negative mutant, but rather a protein product capable of selectively and reversibly inactivating the Rb / INK4 pathway, preferably the Rb / p16INK4a pathway. Ectopically by a mechanism that triggers Rb-dependent growth other than negative interference with its own wild-type allele. For example, such proteins that can bypass Rb include MEM
2 and papillomavirus E7 protein. As used herein, the term “Rb inactivator” generally refers to a protein that provides a growth signal that is negatively regulated by Rb, for example, to eliminate Rb-dependent regulation of protein growth activity. Also refers to mutations.

【００２０】 ある意味では、Ｒｂインアクチベーターは、例えば、サイクリン依存性キナー
ゼ（ｃｄｋ）活性、特にｃｄｋ４又はｃｄｋ６などのＧ₁ｃｄｋのＲｂ依存性阻
害を阻止する、点変異、切断、構成性活性化などによって誘導される任意の形態
のタンパク質を指す。In one sense, the Rb inactivator is a point mutation, cleavage, constitutive activity that prevents, for example, Rb-dependent inhibition of cyclin-dependent kinase (cdk) activity, particularly G ₁ cdk such as cdk4 or cdk6. Refers to any form of protein that is induced by, for example,

【００２１】 さらに他の実施態様において、Ｒｂインアクチベーターは、アンチセンス分子
又は核酸デコイである。 他の実施態様において、ＲｂインアクチベーターはＲｂ又はｐ１６機能の小分
子阻害剤である。[0021] In yet another embodiment, the Rb inactivator is an antisense molecule or a nucleic acid decoy. In another embodiment, the Rb inactivator is a small molecule inhibitor of Rb or p16 function.

【００２２】 好ましい実施態様において、本発明の方法は、Ｒｂの不活化が一時的であり、
容易に逆にし得るように実施される。以下に詳細に説明するように、そのような
可逆性は、適切なときに、例えば、切り出し可能なベクター、誘発性転写調節成
分、誘発性Ｒｂインアクチベータータンパク質を使用するか、傍分泌形態のＲｂ
インアクチベーターを用いるか、又は小分子物質を使用することにより達成し得
る。In a preferred embodiment, the method of the present invention provides that the inactivation of Rb is transient,
Implemented so that it can be easily reversed. As will be described in detail below, such reversibility can be achieved when appropriate, for example, by using excisable vectors, inducible transcriptional regulatory elements, inducible Rb inactivator proteins, or in a paracrine form. Rb
This can be achieved by using an inactivator or by using a small molecule substance.

【００２３】 本発明の別の態様は、複製老化が、ｒａｓ依存性経路によって調節される原因
成分をさらに含み得るという本出願人の発見に関連する。したがって、本発明は
、宿主細胞ゲノムの遺伝的統一性を保存するようにｒａｓシグナリングの可逆性
不活化を含む正常細胞の増殖能を増強する方法を提供する。以下に示すように、
ｒａｓ阻害剤は、ｒａｓ／Ｒａｆ／ＭＫＫ／ＭＡＰキナーゼ経路を阻害する物質
、特に細胞培養に添加し得るものであってよい。いくつかの実施態様において、
ｒａｓ阻害剤は、例えば、ｒａｓのプレニル化を阻害するか又はｒａｓのＧＴＰ
アーゼ活性を阻害することによりｒａｓの活性化を阻害する。他の実施態様にお
いて、本発明の方法は、ｒａｆのキナーゼ活性、ＭＫＫ（Ｍａｐキナーゼキナー
ゼ）又はＭＡＰキナーゼ阻害剤を利用する。Another aspect of the present invention relates to Applicants' discovery that replicative senescence may further comprise a causal component that is regulated by a ras-dependent pathway. Thus, the present invention provides a method for enhancing the growth potential of normal cells, including the reversible inactivation of ras signaling, so as to preserve the genetic integrity of the host cell genome. As shown below,
The ras inhibitor may be a substance that inhibits the ras / Raf / MKK / MAP kinase pathway, especially one that can be added to cell culture. In some embodiments,
Ras inhibitors, for example, inhibit ras prenylation or ras GTP
Inhibits ras activation by inhibiting ase activity. In other embodiments, the methods of the invention utilize a kinase activity of raf, a MKK (Map kinase kinase) or a MAP kinase inhibitor.

【００２４】 いくつかの実施態様において、Ｒｂインアクチベーターとｒａｓ阻害剤は同一
物質である。他の実施態様において、Ｒｂインアクチベーターとｒａｓ阻害剤は
異なる物質である。 別の態様において、本発明の方法は、さらなる遺伝的突然変異を選択すること
なく培養中のほとんどのヒト細胞寿命を延長する単一の遺伝子改変が存在するこ
とを前提としてはしない。そうではなく、本発明の方法のいくつかの実施態様で
は、Ｒｂインアクチベーター及び／又はｒａｓ阻害剤と共に、細胞のテロメラー
ゼ活性を選択的かつ可逆的に活性化する物質を用いて細胞を処理する。[0024] In some embodiments, the Rb inactivator and the ras inhibitor are the same agent. In another embodiment, the Rb inactivator and the ras inhibitor are different substances. In another embodiment, the methods of the present invention do not assume that there is a single genetic modification that extends most human cell life in culture without selecting additional genetic mutations. Rather, in some embodiments of the methods of the present invention, the cells are treated with an agent that selectively and reversibly activates the telomerase activity of the cells, together with an Rb inactivator and / or a ras inhibitor. .

【００２５】 本発明の１つの態様は、細胞寿命、例えば、有糸***数を延長する方法及び試
薬に関する。好ましい実施態様において、細胞は少なくとも一部の処理のために
培養中で分離される。One aspect of the present invention relates to methods and reagents for extending cell life, eg, mitosis. In a preferred embodiment, the cells are separated in culture for at least some treatment.

【００２６】 本発明の方法は、生体内や生体外でも現場でも有用である。代表的な用途とし
ては、幹細胞又は前駆細胞の培養株もしくは移植組織の延長、皮膚又は他の上皮
細胞の培養株もしくは移植片の延長、間充織細胞の培養株もしくは移植片の延長
、及び軟骨又は骨細胞の培養株もしくは移植片の延長が含まれるが、それらは例
示に過ぎない。本発明の方法により延長し得る代表的な幹細胞及び前駆細胞には
、神経細胞、造血細胞、上皮細胞、膵細胞、ならびに肝幹細胞及び前駆細胞があ
る。The method of the present invention is useful in vivo, ex vivo, and on site. Typical applications include extending stem or progenitor cell cultures or transplants, extending skin or other epithelial cell cultures or transplants, extending mesenchymal cell cultures or transplants, and cartilage Or extension of bone cell cultures or grafts, but these are merely examples. Representative stem and progenitor cells that can be extended by the methods of the present invention include neurons, hematopoietic cells, epithelial cells, pancreatic cells, and hepatic stem and progenitor cells.

【００２７】 本発明の方法のいくつかの好ましい実施態様の重要な特徴は、（場合に応じた
）構成性不活化又は活性化というより、Ｒｂ及び／又はｒａｓ不活化の可逆性と
、テロメラーゼ活性の（任意）活性化である。例えば、ベクターを用いてＲｂイ
ンアクチベーター又はテロメラーゼアクチベーターを異所性発現させる場合、ベ
クターは細胞から切り出し可能な形態になるように設計し得る。したがって、生
体外療法では、細胞を生体外で適切なタンパク質又はアンチセンスをコードする
ベクターで処理し、移植前にベクターを切り出して、生体内構築物のさらなる組
換え発現を阻害することができる。好ましい実施態様において、ベクターは、宿
主細胞中に異種核酸配列をほとんど又は全く有さないように切り出すことができ
る。An important feature of some preferred embodiments of the method of the invention is that the reversibility of Rb and / or ras inactivation, rather than constitutive inactivation or activation (as the case may be), and telomerase activity (Optional) activation. For example, when an Rb inactivator or telomerase activator is ectopically expressed using a vector, the vector can be designed to be in a form that can be excised from cells. Thus, in vitro therapy, cells can be treated in vitro with a vector encoding the appropriate protein or antisense and the vector excised prior to transplantation to inhibit further recombinant expression of the in vivo construct. In a preferred embodiment, the vector can be excised with little or no heterologous nucleic acid sequence in the host cell.

【００２８】 したがって、１つの実施態様において、ドナー動物、好ましくはヒトから細胞
を単離し、試料中の細胞の少なくとも５０％が複製老化を回避するに十分な量、
例えば、Ｍ０を超えて増殖するのに十分な量のＲｂインアクチベーターで処理す
る。Ｒｂインアクチベーターは、好ましくは、例えば、Ｒｂ依存性老化阻害剤と
してのその活性が可逆性であるように、より好ましくは（ｉ）その発現又は細胞
中の存在が誘発性及び／もしくは可逆性である遺伝子構築物であり、（ｉｉ）Ｒ
ｂ阻害剤としてのその活性が誘発性及び／もしくは条件付けられており、及び／
又は（ｉｉｉ）培養細胞中で細胞の再移植をはるかに超えては延長されない半減
期、例えば、好ましくは、２〜２０集団倍加半減期を有するために可逆性である
ように選択される。いくつかの実施態様においては、細胞をさらにｒａｓ阻害剤
、好ましくは可逆性ｒａｓ阻害剤で処理する。ｒａｓ阻害剤は、Ｒｂインアクチ
ベーターとしても使える。いくつかの実施態様において、細胞をさらに、テロメ
ラーゼアクチベーター、好ましくは可逆性テロメラーゼアクチベーターで処理す
る。いくつかの実施態様において、細胞をさらにアポトーシス阻害剤、好ましく
は可逆性アポトーシス阻害剤で処理する。ｒａｓ阻害剤、テロメラーゼアクチベ
ーター及びアポトーシス阻害剤の添加は、Ｒｂインアクチベーターに加えて個別
に、又はそれらを種々に組合せて行ってよい。Thus, in one embodiment, cells are isolated from a donor animal, preferably a human, in an amount sufficient for at least 50% of the cells in the sample to avoid replicative senescence;
For example, treatment with a sufficient amount of Rb inactivator to grow above M0. Preferably, the Rb inactivator is (i) its expression or its presence in a cell is inducible and / or reversible, such that its activity as, for example, an Rb-dependent aging inhibitor is reversible. And (ii) R
b its activity as an inhibitor is inducible and / or conditioned, and / or
Or (iii) is selected to be reversible to have a half-life that is not extended much beyond re-implantation of the cells in cultured cells, eg, preferably from 2 to 20 population doubling half-lives. In some embodiments, the cells are further treated with a ras inhibitor, preferably a reversible ras inhibitor. Ras inhibitors can also be used as Rb inactivators. In some embodiments, the cells are further treated with a telomerase activator, preferably a reversible telomerase activator. In some embodiments, the cells are further treated with an apoptosis inhibitor, preferably a reversible apoptosis inhibitor. The addition of the ras inhibitor, telomerase activator and apoptosis inhibitor may be performed individually or in various combinations in addition to the Rb inactivator.

【００２９】 細胞は、培養中で増殖させた後、ドナー動物と同一でも異なっていてもよい宿
主動物中に導入する。移植前、又は移植直後に、適切なように、Ｒｂインアクチ
ベーター、ｒａｓ阻害剤、テロメラーゼアクチベーター及びアポトーシス阻害剤
を不活化するか、又は細胞から除去する。After the cells are grown in culture, they are introduced into a host animal, which may be the same or different from the donor animal. Prior to or immediately after transplantation, the Rb inactivator, ras inhibitor, telomerase activator and apoptosis inhibitor are inactivated or removed from the cells as appropriate.

【００３０】 本発明の別の態様は、本発明の方法で処理された細胞の試験管内製剤に関する
。そのような細胞組成物は、例えば、動物に移植するための薬剤の産生に使用で
きる。Another aspect of the present invention relates to in vitro preparations of cells treated with the method of the present invention. Such cell compositions can be used, for example, to produce a drug for implantation in an animal.

【００３１】 本発明の実施には、特に断りのない限り、当業の技術範囲内の慣用の細胞生物
学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えＤＮ
Ａ及び免疫学技術を用いる。そのような技術は以下の文献に記載されている。例
えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ及びＭａｎｉａｔｉｓによって編纂さ
れた、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａ ｎｕａｌ ，第２版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｒａｔｏｒ
ｙ Ｐｒｅｓｓ：１９８９年）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ，第Ｉ及び第ＩＩ巻（
Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編，１９８５年）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓ ｙｎｔｈｅｓｉｓ （Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編，１９８４年）；Ｍｕｌｌｉｓらに付与
された米国特許第４，６８３，１９５号；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒ ｉｄｉｚａｔｉｏｎ （Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編，１
９８４年）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（
Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編，１９８４年）；Ｃｕｌｔ ｕｒｅ Ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ （Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ａｌａ
ｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８７年）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌ ｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ （ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８６年）；Ｂ．Ｐｅ
ｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ （１９８４年）；専門書、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏ ｌｏｇｙ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ （Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ及びＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編，１９８７年，Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）：Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ，第１５４巻及び第１５５巻（Ｗｕら編）；Ｉｍｍｕｎｏ ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｃｅｌｌ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌ ａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （Ｍａｙｅｒ及びＷａｌｋｅｒ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐ
ｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８７年）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｏｆ Ｅｘｐｅｒ ｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ，第Ｉ〜第ＩＶ巻（Ｄ．Ｍ．Ｗｉｅｒ及
びＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編，１９８６年）；Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，
Ｎ．Ｙ．，１９８６年）を参照されたい。The practice of the present invention will involve, unless otherwise indicated, conventional cell biology, cell culture, molecular biology, transgenic biology, microbiology, recombinant DN within the skill of the art.
A and immunological techniques are used. Such techniques are described in the following documents. For example, Molecular Cloning: A Laboratory Manual , 2nd edition (Cold Spring Harbor Laboratory ), compiled by Sambrook, Fritsch and Maniatis.
y Press: 1989); DNA Cloning , Volumes I and II (
D. N. Glover, ed., 1985); Oligonucleotide S ynthesis (M.J.Gait ed., 1984); Mullis et al. Have been granted in US Pat. No. 4,683,195; Nucleic Acid Hybr idization (B.D.Hames & S J. Higgins, 1
984); Transcription And Translation (
B. D. Hames & S.M. J. Higgins, eds., 1984); Cult ure Of Animal Cells ( R.I.Freshney, Ala
nR. Liss, Inc. Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); Pe
rbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984 years); monographs, Methods In Enzymo logy (Academic Press , Inc., N.Y.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J.H.Miller and M.P. Calos, 1987, Cold S
pring Harbor Laboratory): Methods In Enzymology , Volume 154 and 155, Volume (Wu et al., eds.); Immuno chemical Methods In Cell And Molecul ar Biology (Mayer and Walker, eds, Academic P
ress, London, 1987 years); Handbook Of Exper imental Immunology, the first I~ the Volume IV (D.M.Wier and C.C.Blackwell, eds., 1986); Manipulating the Mouse Embryo (Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Cold Spring Harbor,
N. Y. , 1986).

【００３２】 （ｉｉ）定義 便宜のために、本明細書に用いられているいくつかの用語を以下に定義する。 本明細書に用いられている限りにおいて、用語「核酸」とは、デオキシリボ核
酸（ＤＮＡ）、また、適切な場合には、リボ核酸（ＲＮＡ）などのポリヌクレオ
チドを指す。この用語はさらに、等価物として、ヌクレオチド類似体から作られ
たＲＮＡ又はＤＮＡ類似体、及び、記載されている実施態様に適用可能なものと
して、（センス又はアンチセンスなどの）一本鎖ポリヌクレオチド及び二本鎖ポ
リヌクレオチドを含むものと理解されたい。(Ii) Definitions For convenience, some terms used herein are defined below. As used herein, the term "nucleic acid" refers to a polynucleotide such as deoxyribonucleic acid (DNA) and, where appropriate, ribonucleic acid (RNA). The term further includes, as equivalents, RNA or DNA analogs made from nucleotide analogs, and single-stranded polynucleotides (such as sense or antisense) as applicable to the described embodiment. And double-stranded polynucleotides.

【００３３】 本明細書に用いられている限りにおいて、用語「遺伝子」又は「組換え遺伝子
」とは、エクソン配列と（場合により）イントロン配列とを共に含む、ポリペプ
チドをコードする読み取り枠を含む核酸を指す。本発明によれば、遺伝子は、転
写されたＤＮＡ構築物の形態であっても直接翻訳可能なＲＮＡ構築物の形態であ
ってもよい。As used herein, the term “gene” or “recombinant gene” includes an open reading frame encoding a polypeptide, including both exon sequences and (optionally) intron sequences. Refers to nucleic acids. According to the present invention, the gene may be in the form of a transcribed DNA construct or a directly translatable RNA construct.

【００３４】 「異所性発現」とは、例えば、タンパク質の異種もしくは内因性遺伝子の発現
又はタンパク質の経細胞取り込みにより、細胞が、特定のタンパク質（又は場合
によりＲＮＡ）を、その特定の出発表現型に対して細胞が通常発現するより高い
正常レベルを超えたレベルで発現させられることを意味する。“Ectopic expression” refers to a cell that causes a particular protein (or optionally RNA) to express its specific starting expression, for example, by expression of a heterologous or endogenous gene of the protein or transcellular uptake of the protein. It means that cells can be expressed at levels above normal levels that are normally expressed for the type.

【００３５】 本明細書に用いられている限りにおいて、用語「トランスフェクション」とは
、異種核酸、例えば、発現ベクターを核酸仲介遺伝子導入により受容細胞中に導
入することを意味する。トランスフェクトされた核酸に関して本明細書に用いら
れている「トランスホーメーション」とは、細胞の遺伝子型が外来性ＤＮＡ又は
ＲＮＡの細胞取り込みの結果として変化するプロセス、及び、例えば、形質転換
された細胞が組換え形態のポリペプチドを発現するプロセスを指す。As used herein, the term “transfection” refers to the introduction of a heterologous nucleic acid, eg, an expression vector, into a recipient cell by nucleic acid-mediated gene transfer. As used herein with respect to transfected nucleic acid, "transformation" refers to the process by which a cell's genotype changes as a result of cellular uptake of exogenous DNA or RNA, and, for example, Refers to the process by which cells express a recombinant form of the polypeptide.

【００３６】 「発現ベクター」とは、所望のタンパク質をコードし、かつ転写単位を含むＤ
ＮＡの発現に用いられる複製可能なＤＮＡ構築物を指し、上記転写単位は、（１
）遺伝子発現において調節役を果たす遺伝子成分、例えば、プロモーター、オペ
レーター又はエンハンサーと、（２）それらに作動可能に結合し、ｍＲＮＡに転
写され、タンパク質に翻訳される所望タンパク質をコードするＤＮＡ配列と、（
３）適切な転写及び翻訳の開始及び終結配列との組合せを含む。プロモーター及
び他の調節成分の選択は、通常、意図する宿主細胞に応じて異なる。一般に、組
換えＤＮＡ技術に利用される発現ベクターは、ベクター形態では染色体に結合し
ない環状二本鎖ＤＮＡループを指す「プラスミド」形態であることが多い。本明
細書において、「プラスミド」と「ベクター」とは、プラスミドがベクターの最
も一般的に用いられる形態であるために交換可能に用いられる。しかし、本発明
は、同等な機能を果たし、かつその後当業で公知となったような他の形態の発現
ベクターを含むことを意図している。An “expression vector” is a DNA encoding a desired protein and containing a transcription unit.
Refers to a replicable DNA construct used for expression of NA, wherein the transcription unit is (1
A) a gene component that plays a regulatory role in gene expression, such as a promoter, operator or enhancer; and (2) a DNA sequence encoding the desired protein operably linked to them, transcribed into mRNA and translated into protein. (
3) Including combinations with appropriate transcription and translation initiation and termination sequences. The choice of promoter and other regulatory elements usually depends on the intended host cell. Generally, expression vectors utilized in recombinant DNA technology are often in "plasmid" form, which refers to a circular double-stranded DNA loop that does not attach to the chromosome in vector form. As used herein, "plasmid" and "vector" are used interchangeably as the plasmid is the most commonly used form of vector. However, the invention is intended to include other forms of expression vectors that serve equivalent functions and are subsequently known in the art.

【００３７】 発現ベクターにおいて、転写又は翻訳を調節する調節成分は、一般に、哺乳動
物、微生物、ウイルス又は昆虫の遺伝子から誘導し得る。さらに、通常複製起源
によって付与される宿主の複製能、及び形質転換細胞の認識を容易にする選択遺
伝子を組み込んでよい。レトルウイルス、アデノウイルスなどのウイルス由来の
ベクターを用いることができる。In the expression vector, the regulatory components that regulate transcription or translation can generally be derived from mammalian, microbial, viral or insect genes. In addition, one may incorporate a selection gene that facilitates the recognition of transformed cells, as well as the host's ability to replicate, usually conferred by an origin of replication. A virus-derived vector such as a retorvirus or an adenovirus can be used.

【００３８】 「転写調節配列」とは、本明細書全体に用いられている遺伝子用語であり、タ
ンパク質コード配列に作動可能に結合してこれらの配列の転写を誘発又は制御す
る開始シグナル、エンハンサー及びプロモーターなどのＤＮＡ配列を指す。好ま
しい実施態様において、遺伝子の転写は、発現させようとする細胞種における組
換え遺伝子の発現を制御するプロモーター配列（又は他の転写調節配列）の制御
下にある。組換え遺伝子は、タンパク質の天然型の１つの転写を制御する配列と
同一又は異なる転写調節配列の制御下にあってよいことも理解されよう。“Transcriptional regulatory sequence” is a gene term used throughout the present specification and refers to initiation signals, enhancers and enhancers that operably bind to protein coding sequences to trigger or regulate transcription of these sequences. Refers to a DNA sequence such as a promoter. In a preferred embodiment, transcription of the gene is under the control of a promoter sequence (or other transcription regulatory sequence) that controls the expression of the recombinant gene in the cell type to be expressed. It will also be appreciated that the recombinant gene may be under the control of a transcriptional regulatory sequence, which may be the same or different from the sequence that controls the transcription of one of the native forms of the protein.

【００３９】 本明細書に用いられている限りにおいて、用語「組織特異プロモーター」とは
、プロモーターとしての働きをする、すなわち、プロモーターに作動可能に結合
した選択されたＤＮＡ配列の発現を調節するＤＮＡ配列を意味し、組織特異プロ
モーターは、尿生殖器起源の細胞、例えば、腎細胞、又は神経起源の細胞、例え
ば、神経細胞などの組織の特定細胞において、選択されたＤＮＡ配列を発現させ
る。さらに、この用語は、主として１つの組織において選択されたＤＮＡの発現
を調節するが、他の組織中でも発現させる、いわゆる「漏出」プロモーターをも
包含する。As used herein, the term “tissue-specific promoter” refers to a DNA that acts as a promoter, ie, regulates the expression of a selected DNA sequence operably linked to the promoter. Meaning a sequence, a tissue-specific promoter causes the selected DNA sequence to be expressed in cells of tissue, such as cells of urogenital origin, eg, kidney cells, or cells of neural origin, eg, nerve cells. In addition, the term also encompasses so-called "leakage" promoters, which regulate expression of selected DNA primarily in one tissue, but also in other tissues.

【００４０】 ２つのＤＮＡ領域の関係を説明するときの「作動可能に結合した」とは、単に
機能的に互いに関連していることを意味する。例えば、プロモーター又は他の転
写調節配列は、それがコード配列の転写を制御する場合には、コード配列に作動
可能に結合している。“Operably linked” when describing the relationship between two DNA regions simply means that they are functionally related to each other. For example, a promoter or other transcription control sequence is operably linked to a coding sequence if it controls the transcription of the coding sequence.

【００４１】 本明細書に用いられている限りにおいて、用語「融合タンパク質」とは、認識
された技術であり、少なくとも初期に、２つ以上の異なるタンパク質由来のアミ
ノ酸配列からなる一本鎖タンパク質として発現されるキメラタンパク質を指し、
例えば、融合タンパク質は融合遺伝子の遺伝子産物である。As used herein, the term “fusion protein” is a recognized technique, at least initially, as a single-chain protein consisting of amino acid sequences from two or more different proteins. Refers to the chimeric protein to be expressed,
For example, a fusion protein is the gene product of a fusion gene.

【００４２】 技術用語「融合遺伝子」とは、２つ以上の遺伝子が融合し、この融合の結果と
して１つ以上のペプチド結合によって結合された２つ以上のタンパク質の読み取
り枠が生じる核酸を指す。The technical term “fusion gene” refers to a nucleic acid in which two or more genes are fused, resulting in two or more protein open reading frames joined by one or more peptide bonds.

【００４３】 用語「一致率」とは、２つのアミノ酸又は２つのヌクレオチド配列間の配列同
一性を指す。同一性は、それぞれ、比較のために整列させ得る各配列における位
置を比較することによって決定し得る。比較される配列において対応する位置を
同じ塩基又はアミノ酸が占めている場合、それらの分子はその位置では一致して
おり、対応部位が同一又は（例えば、立体的及び／又は電子的性質が類似してい
る）類似アミノ酸残基によって占められている場合、それらの分子はその位置で
は相同である（類似している）とみなされ得る。相同性／類似性又は同一性の百
分率としての表現は、比較される配列が共有する位置にある同一又は類似アミノ
酸の数の関数に関連する。ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ又はＥＮＴＲＥＺを含めた種
々のアラインメントアルゴリズム及び／又はプログラムを用いてよい。ＦＡＳＴ
Ａ及びＢＬＡＳＴは、ＧＣＧ配列分析パッケージ（ウィスコンシン州マジソン所
在のウィスコンシン大学）の一部として利用可能であり、例えば、デフォルト設
定を用いて使用することができる。ＥＮＴＲＥＺは、メリーランド州、ベセスダ
所在のＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｍｅｄ
ｉｃｉｎｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈを介
して入手し得る。１つの実施態様において、２つの配列の一致率は、ギャップの
重さを１とするＧＣＧプログラムによって測定することができ、例えば、各アミ
ノ酸ギャップは、２配列間の単一のアミノ酸又はヌクレオチドミスマッチである
かのように重みづけされる。The term “percent identity” refers to the sequence identity between two amino acids or two nucleotide sequences. Identity can each be determined by comparing the positions in each sequence that can be aligned for comparison. If the corresponding base or amino acid occupies the corresponding position in the compared sequences, the molecules are identical at that position and the corresponding site is the same or (eg, sterically and / or electronically similar). When occupied by similar amino acid residues), those molecules can be considered to be homologous (similar) at that position. Expression as a percentage of homology / similarity or identity relates to a function of the number of identical or similar amino acids at positions shared by the compared sequences. Various alignment algorithms and / or programs may be used, including FASTA, BLAST or ENTREZ. FAST
A and BLAST are available as part of the GCG sequence analysis package (University of Wisconsin, Madison, WI) and can be used, for example, with default settings. ENTREZ is a National Center for Biotechnology, Bethesda, MD
Information, National Library of Med
, available through the National Institute of Health. In one embodiment, the percent identity of two sequences can be measured by a GCG program with a gap weight of 1, for example, each amino acid gap is a single amino acid or nucleotide mismatch between the two sequences. Weighted as if it were.

【００４４】 本明細書に用いられている限りにおいて、用語「ストリンジェント条件」とは
、例えば、約１Ｍの塩中で生成した二本鎖ＤＮＡの溶融温度（Ｔ_m）を約２０〜
２７℃下回る温度に相当するハイブリダイゼーション条件を指す。好ましい実施
態様において、高ストリンジェンシー条件は、５０℃で０．２×ＳＳＣ〜６５℃
で０．１×ＳＳＣである。As used herein, the term “stringent conditions” refers to, for example, a melting temperature (T _m ) of a double-stranded DNA formed in about 1 M salt of about 20-200.
Refers to hybridization conditions corresponding to temperatures below 27 ° C. In a preferred embodiment, the high stringency conditions are 0.2 × SSC to 65 ° C. at 50 ° C.
Is 0.1 × SSC.

【００４５】 用語「小有機分子」とは、７５００ａｍｕ未満、より好ましくは２５００ａｍ
ｕ未満、さらに好ましくは７５０ａｍｕ未満の分子量を有する非ペプチド、非ヌ
クレオチド有機化合物を指す。The term “small organic molecule” means less than 7500 amu, more preferably 2500 am
refers to non-peptide, non-nucleotide organic compounds having a molecular weight of less than u, more preferably less than 750 amu.

【００４６】 用語「ＥＳＴ２タンパク質」及び「ＥＳＴ２ポリペプチド」とは、テロメラー
ゼ、好ましくは哺乳動物テロメラーゼ、より好ましくはヒトテロメラーゼの触媒
サブユニットを指す。代表的なＥＳＴ２タンパク質は、配列番号１の核酸、又は
この核酸にハイブリダイズする核酸によってコードされる。したがって、本発明
の方法に有用なＥＳＴ２タンパク質は、（ヒト細胞などの）宿主細胞中のテロメ
ラーゼ延長酵素を再構成する配列番号２のヒトＥＳＴ２又はその断片と少なくと
も６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％以上
も同一であってよい。当業において、例えば、配列番号１に関して配列及び／又
は長さが異なり得る特定のＥＳＴ２ポリペプチドの活性を評価するための多様な
異なる技術が利用可能である。The terms “EST2 protein” and “EST2 polypeptide” refer to the catalytic subunit of telomerase, preferably mammalian telomerase, more preferably human telomerase. A representative EST2 protein is encoded by the nucleic acid of SEQ ID NO: 1, or a nucleic acid that hybridizes to this nucleic acid. Thus, an EST2 protein useful in the methods of the present invention is at least 60%, 65%, 70%, at least 60%, 65%, 70% 75%, 80%, 85%, 90%, or more than 95% may be the same. A variety of different techniques are available in the art, for example, for assessing the activity of a particular EST2 polypeptide, which may vary in sequence and / or length with respect to SEQ ID NO: 1.

【００４７】 用語「テロメラーゼ活性化治療剤」とは、細胞、例えば、哺乳動物細胞中のテ
ロメラーゼ活性の活性化に用い得る任意の物質を指す。例えば、テロメラーゼ活
性化治療剤は、小数の例を挙げれば、ＥＳＴ２、ｍｙｃ、Ｅ６などをコードする
発現ベクター、そのようなポリペプチドの製剤、内因性テロメラーゼアクチベー
ター遺伝子発現小分子アクチベーター、テロメラーゼアクチベーター分解阻害剤
である。The term “telomerase-activating therapeutic agent” refers to any substance that can be used to activate telomerase activity in a cell, eg, a mammalian cell. For example, therapeutic agents for telomerase activation include expression vectors encoding EST2, myc, E6, etc., preparations of such polypeptides, endogenous telomerase activator gene-expressing small molecule activators, telomerase activators, to name a few. Beta degradation inhibitor.

【００４８】 用語「ＥＳＴ２治療剤」とは、細胞中でＥＳＴ２ポリペプチドを異所性発現さ
せるのに用い得る任意のテロメラーゼ活性化治療剤を指す。例えば、ＥＳＴ２治
療剤は、小数の例を挙げると、ＥＳＴ２発現ベクター、ＥＳＴ２ポリペプチド製
剤、及び内因性ＥＳＴ２遺伝子を発現させる小分子アクチベーターである。 「抑制解除ｍｙｃ」とは、ｍｙｃの拮抗作用に打ち克つ物質の能力、例えば、
ｍｙｃの極／大（ｍａｄ／ｍａｘ）不活化を阻止し、それによってｍｙｃを活性
化し得る物質の能力を指す。The term “EST2 therapeutic” refers to any telomerase-activating therapeutic that can be used to ectopically express an EST2 polypeptide in a cell. For example, EST2 therapeutics are EST2 expression vectors, EST2 polypeptide preparations, and small molecule activators that express the endogenous EST2 gene, to name a few. "Desuppression myc" refers to the ability of a substance to overcome the antagonism of myc, eg,
Refers to the ability of a substance to prevent max / max inactivation of myc, thereby activating myc.

【００４９】 用語「前駆細胞」とは、増殖して、分化又は分化可能な娘細胞を産生し得る多
数の母細胞を産生する能力を有するより多くの前駆細胞を生成する未分化細胞を
指す。本明細書に用いられている限りにおいて、用語「前駆細胞」は、当業にお
いて「幹細胞」と称されることがある細胞を包含することも意図している。好ま
しい実施態様において、用語「前駆細胞」とは、子孫（後代）が、しばしば異な
る方向に分化すること、例えば、胚細胞及び組織の進化分化中に発生するような
完全に個別の性質を獲得することによって特殊化される全身型母細胞を指す。The term “progenitor cell” refers to an undifferentiated cell that has proliferated to produce more progenitor cells with the ability to produce a large number of mother cells capable of producing a differentiated or differentiable daughter cell. As used herein, the term “progenitor cell” is also intended to include cells that may be referred to in the art as “stem cells”. In a preferred embodiment, the term “progenitor cell” refers to the progeny (progeny) often undergoing different directional differentiation, eg, acquiring completely distinct properties, such as occur during the evolutionary differentiation of embryonic cells and tissues. Refers to systemic mother cells that are specialized by

【００５０】 本明細書に用いられている限りにおいて、用語「細胞組成物」とは、細胞の他
に、細胞培地などの非細胞成分、例えば、タンパク質、アミノ酸、核酸、ヌクレ
オチド、補酵素、酸化防止剤、金属などを含み得る細胞製剤を指す。さらに、細
胞組成物は、細胞成分の増殖又は生存力には影響を与えないが、細胞を、特定の
フォーマットとして、例えば、細胞をカプセル封入するための高分子マトリック
ス又は医薬製剤として提供するのに用いられる成分を有していてよい。As used herein, the term “cell composition” refers to, in addition to cells, non-cellular components such as cell culture media, such as proteins, amino acids, nucleic acids, nucleotides, coenzymes, oxidants, and the like. Refers to a cell preparation that can contain inhibitors, metals and the like. Further, the cell composition does not affect the growth or viability of the cellular components, but provides the cells in a particular format, for example, as a polymeric matrix or pharmaceutical formulation for encapsulating the cells. It may have the components used.

【００５１】 本明細書に用いられている限りにおいて、前駆細胞に関する用語「実質的に純
粋」とは、全細胞集団を構成する前駆細胞に関して、少なくとも約７５％、好ま
しくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましく
は少なくとも約９５％純粋である前駆細胞集団を指す。言い換えると、用語「実
質的に純粋」とは、培養及び増幅前のもとの増幅されていない単離集団中に、約
２０％未満、より好ましくは約１０％未満、最も好ましくは約５％未満の系統関
連細胞を含む本発明の前駆細胞集団を指す。As used herein, the term “substantially pure” with respect to progenitor cells refers to at least about 75%, preferably at least about 85%, more than about progenitor cells that make up the entire cell population. Preferably, it refers to a progenitor cell population that is at least about 90%, most preferably at least about 95% pure. In other words, the term "substantially pure" refers to less than about 20%, more preferably less than about 10%, and most preferably about 5%, in the original non-amplified isolated population prior to culturing and amplification. Refers to a progenitor cell population of the invention comprising less than lineage-related cells.

【００５２】 用語「化粧品」とは、局所投与用に処方された医薬品の一形態を指す。 本明細書に用いられている限りにおいて、「増殖する」又は「増殖」とは、有
糸***を受けている細胞を指す。The term “cosmetic” refers to a form of a medicament formulated for topical administration. As used herein, "proliferating" or "proliferation" refers to cells undergoing mitosis.

【００５３】 本明細書に用いられている限りにおいて、用語「動物」とは、哺乳動物、好ま
しくはヒトなどの哺乳動物を指す。同様に、本発明の方法により治療を受ける「
患者」又は「被験者」とは、ヒト又は非ヒト動物を意味し得る。 細胞の「増殖状態」とは、細胞の増殖速度及び細胞の分化状態を指す。[0053] As used herein, the term "animal" refers to a mammal, preferably a mammal such as a human. Similarly, a subject receiving treatment by the method of the invention
"Patient" or "subject" can mean a human or non-human animal. The “proliferation state” of a cell refers to the growth rate of the cell and the state of differentiation of the cell.

【００５４】 （ｉｉｉ）Ｍ０制御の不活化 一次ヒト上皮細胞及び角化細胞は、培養中に移植されると、極く数回集団倍加
した後で、細胞がＭ０と称される増殖停止状態に入る複製寿命を有する〔Ｆｏｓ
ｔｅｒら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ 第１２巻：１７７３ページ（１９９６年）〕。多
くの意味で、Ｍ０細胞はＭ１で老化する細胞に似ている。しかし、Ｍ０はテロメ
アの喪失によって誘発されるのではない。Ｍ０前のヒト***上皮細胞（ＨＭＥＣ
）又は角化細胞のテロメラーゼを活性化してもＭ０停止は阻止されない。(Iii) Inactivation of MO Regulation Primary human epithelial cells and keratinocytes, when transplanted in culture, undergo population doubling after only a few population doublings before the cells enter a growth arrest state called MO. Has a copy life that can enter [Fos
Ter et al., Oncogene 12: 1773 (1996)]. In many ways, M0 cells resemble cells senescent at M1. However, M0 is not triggered by telomere loss. Human breast epithelial cells before M0 (HMEC
) Or activating keratinocyte telomerase does not prevent M0 arrest.

【００５５】 Ｍ０は、「選択」とも称されている。大半の一次細胞集団はＭ０で***停止す
るが、いくつかの細胞種（例えば、ＨＭＥＣ）においては、小数の細胞がＭ０を
回避して、さらに増殖し得る「正常」細胞株を産生する。したがって、Ｍ０事象
は、長い間、明確に定義されていない「培養適応」プロセスとみなされていた。
しかし、特定の腫瘍原性突然変異に対してＭ０回避が選択されることが理解され
るにつれ、この見解は変わってきている。M0 is also called “selection”. Although most primary cell populations arrest at M0, in some cell types (eg, HMEC), a small number of cells circumvent M0 and produce "normal" cell lines that can grow further. Thus, the M0 event has long been regarded as a poorly defined "culture adaptation" process.
However, this view has changed as it is understood that M0 avoidance is selected for certain oncogenic mutations.

【００５６】 Ａ．Ｒｂ／ＩＮＫ４経路の不活化 網膜芽腫遺伝子産物、Ｒｂは、正常細胞増殖成分である。Ｒｂは、低リン酸化
状態では、細胞周期の進行に必要な遺伝子の活性化を阻止する。概説としては、
例えば、Ｓｈｅｒｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ 第２７４巻：１６７２ページ（１９９
６年）を参照されたい。細胞周期のＧ１期中、２つの密接に関連するサイクリン
依存性キナーゼ、ｃｄｋ４及びｃｄｋ６によるＲｂのリン酸化により、細胞が分
裂周期中に放出される。これらのｃｄｋは、刺激性サブユニット及び抑制性サブ
ユニットとの会合により調節される。腫瘍サプレッサーｐ１６ＩＮＫ４ａなどの
ＩＮＫ４ファミリーメンバーと結合すると、キナーゼ活性が抑制され、それによ
ってリン酸化が阻止され、その結果、成長が停止する。本発明によれば、細胞、
特に培養ヒト細胞の増殖能は、そららの細胞を、Ｒｂ／ＩＮＫ４経路、好ましく
はＲｂ／ｐ１６ＩＮＫ４ａ経路を選択的かつ可逆的に不活化し得る「Ｒｂインア
クチベーター」と接触させることにより増強することができる。A. The inactivated retinoblastoma gene product of the Rb / INK4 pathway , Rb, is a normal cell growth component. Rb blocks activation of genes required for cell cycle progression in a hypophosphorylated state. In general,
See, for example, Sherr et al., Science 274: 1672 (199).
6 years). During the G1 phase of the cell cycle, phosphorylation of Rb by two closely related cyclin-dependent kinases, cdk4 and cdk6, releases cells during the division cycle. These cdks are regulated by association with stimulatory and inhibitory subunits. Binding to INK4 family members, such as the tumor suppressor p16INK4a, suppresses kinase activity, thereby blocking phosphorylation and consequently growth arrest. According to the present invention, a cell,
In particular, the proliferative potential of cultured human cells is enhanced by contacting the cells with an “Rb inactivator” that can selectively and reversibly inactivate the Rb / INK4 pathway, preferably the Rb / p16INK4a pathway. be able to.

【００５７】 １つの実施態様において、本発明の方法は、細胞中に、「Ｒｂインアクチベー
ター」をコードする発現構築物、例えば、Ｒｂ／ＩＮＫ４経路、好ましくはＲｂ
／ｐ１６ＩＮＫ４ａ経路を不活化し得るポリペプチド又は核酸を導入することを
含む。In one embodiment, the method of the present invention provides for the expression construct encoding “Rb inactivator” in a cell, eg, the Rb / INK4 pathway, preferably Rb.
/ Introducing a polypeptide or nucleic acid capable of inactivating the / p16INK4a pathway.

【００５８】 いくつかの実施態様において、上記構築物はポリペプチドをコードする。例え
ば、発現構築物は、ＭＤＭ２用のコード配列を含み得る。ＭＤＭ２腫瘍タンパク
質は、Ｒｂ／Ｅ２Ｆ機能とｐ５３腫瘍サプレッサーの両方の細胞性阻害剤である
。ある種のガンにおいて、ＭＤＭ２の増幅は一般的な事象であり、Ｒｂ及び／又
はｐ５３の不活化の一因となる。好ましいヒトＭＤＭ２配列は、ＳＷＩＳＳ−Ｐ
ＲＯＴ：遺伝子座ＭＤＭ２＿ＨＵＭＡＮ、登録番号Ｑ００９８７及びＧｅｎＢａ
ｎｋ登録番号Ｕ３３２０１で得られる。ＭＤＭ２コード配列は、ｐ５３及び／又
はＲｂ増殖抑制に対する阻害活性を保持し、例えば、配列番号４の配列と少なく
とも６０、７０、８０、８５、９０、９５もしくは９８％同一であるか、又はス
トリンジェント条件下に配列番号３にハイブリダイズする核酸によってコードさ
れるＭＤＭ２タンパク質もしくはその断片をコードし得る。例えば、本発明にお
いて有用であり得る上記ＭＤＭ２断片には、ｐ５３結合ドメインや、例えば、Ｍ
ＤＭ２のアミノ酸５０〜２２２を含む、ｐ５３不在下に基礎転写を直接抑制し得
る抑制性ドメインが含まれる。例えば、Ｔｈｕｔら，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．第１
１巻：１９７４ページ（１９９７年）を参照されたい。In some embodiments, the construct encodes a polypeptide. For example, an expression construct can include a coding sequence for MDM2. MDM2 oncoprotein is a cellular inhibitor of both Rb / E2F function and the p53 tumor suppressor. In some cancers, amplification of MDM2 is a common event and contributes to inactivation of Rb and / or p53. A preferred human MDM2 sequence is SWISS-P
ROT: locus MDM2_HUMAN, accession number Q00987 and GenBa
nk registration number U33201. The MDM2 coding sequence retains inhibitory activity against p53 and / or Rb growth inhibition and is, for example, at least 60, 70, 80, 85, 90, 95 or 98% identical to the sequence of SEQ ID NO: 4, or is stringent. Under conditions, it may encode an MDM2 protein or a fragment thereof encoded by a nucleic acid that hybridizes to SEQ ID NO: 3. For example, the MDM2 fragments that may be useful in the present invention include a p53 binding domain,
An inhibitory domain that includes amino acids 50-222 of DM2 and that can directly suppress basal transcription in the absence of p53 is included. See, eg, Thut et al., Genes Dev. First
1: 1974 (1997).

【００５９】 他の実施態様において、発現構築物は、例えば、ＩＮＫ４タンパク質、特にｐ
１６ＩＮＫ４ａを結合する能力を喪失し及び／又はこのタンパク質によって阻害
された優性負型ｃｄｋ４又はｃｄｋ６変異体をコードする。このタイプの代表的
なＣＤＫ変異体がＵＳＳＮ ０８／５８１，９１８号に記載されている。そのよ
うな形態のｃｄｋ４及びｃｄｋ６は、ｃｄｋ４変異体が黒色腫患者由来の細胞で
同定され、かつ構成的に活性化されたこと、及びそれらの活性がｐ１６ＩＮＫ４
ａとは別であったという観測に基づいている。In another embodiment, the expression construct is, for example, an INK4 protein,
Encodes a dominant negative cdk4 or cdk6 variant that has lost the ability to bind 16INK4a and / or has been inhibited by this protein. Representative CDK variants of this type are described in USSN 08 / 581,918. Such forms of cdk4 and cdk6 indicate that the cdk4 mutant was identified and constitutively activated in cells from melanoma patients and that their activity was p16INK4
Based on the observation that it was different from a.

【００６０】 ＵＳＳＮ ０８／５８１，９１８号で論証されたように、ｃｄｋ４及びｃｄｋ
６配列に対する上記及び他の突然変異は、ｐ１６ＩＮＫ４ａと変異体ｃｄｋとの
結合を阻止することにより構成的活性化を生起させることができる。例えば、こ
れらの変化を３次元構造上で視覚化すると、これらの残基が、溶剤に対して反応
性の４つのアミノ酸残基からなるクラスターを形成することは明らかであった。
これらの残基、Ｋ２２、Ｒ２４、Ｈ９５及びＤ９７は、ＡＴＰ結合部位に極めて
近接しているが、サイクリン結合部位又は基質結合部位からはずっと離れている
ｃｄｋ４の小突出部（ｌｏｂｅ）の表面を規定する。この表面は、ｃｄｋ４に（
及び相応してｃｄｋ６に）存在するｐ１６／ｐ１５認識表面の少なくとも一部を
構成するようである。したがって、ｃｄｋ４／ｃｄｋ６のｐ１６／ｐ１５阻害の
魅力的なモデルは、ＡＴＰがｃｄｋ４に結合しないか、又はリン酸供与体として
用いられるように適切には配置されないようにＣＣＲタンパク質を結合すると、
ＡＴＰ結合部位に対する閉塞又は変形作用を提供する。As demonstrated in USSN 08 / 581,918, cdk4 and cdk4
These and other mutations to the six sequences can cause constitutive activation by blocking the binding of p16INK4a to the mutant cdk. For example, when these changes were visualized on a three-dimensional structure, it was clear that these residues formed a cluster of four amino acid residues that were reactive to solvents.
These residues, K22, R24, H95 and D97, define the surface of the cdk4 small lobe very close to the ATP binding site but far away from the cyclin or substrate binding sites. I do. This surface is used for cdk4 (
And correspondingly appears to constitute at least part of the p16 / p15 recognition surface present on cdk6). Thus, an attractive model of p16 / p15 inhibition of cdk4 / cdk6 is that binding CCR proteins so that ATP does not bind to cdk4 or is not properly positioned to be used as a phosphate donor.
Provides an occlusive or deforming effect on the ATP binding site.

【００６１】 したがって、いくつかの実施態様において、本発明の方法は、配列番号６とは
１つ以上のアミノ酸が異なり、かつｐ１６ＩＮＫ４ａ依存性キナーゼ活性を有す
る、例えば、配列番号５のコード配列にハイブリダイズするコード配列を有し、
例えば、配列番号６の配列と少なくとも例えば６０、７０、８０、８５、９０、
９５又は９８％同一のアミノ酸配列を有する、ｃｄｋ４変異体をコードする発現
構築物を提供する。好ましい実施態様において、本発明のｃｄｋ４タンパク質は
、Ｋ２２、Ｒ２４、Ｈ９５及び／又はＤ９７のうち１つ以上が配列番号６と異な
るアミノ酸配列を有する。Thus, in some embodiments, the methods of the present invention hybridize to the coding sequence of, eg, SEQ ID NO: 5, wherein one or more amino acids differ from SEQ ID NO: 6 and have p16INK4a dependent kinase activity. Having a coding sequence to soy,
For example, the sequence of SEQ ID NO: 6 and at least, for example, 60, 70, 80, 85, 90,
An expression construct encoding a cdk4 variant having an amino acid sequence of 95 or 98% identity is provided. In a preferred embodiment, the cdk4 protein of the invention has an amino acid sequence in which one or more of K22, R24, H95 and / or D97 differs from SEQ ID NO: 6.

【００６２】 さらに他の実施態様において、発現構築物は、優性負型Ｒｂ変異体をコードす
る。例えば、野生型網膜芽腫タンパク質の機能は、そのＣポケット断片の発現に
より破壊することができる。例えば、Ｗｅｌｃｈら，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．第９
巻：３１〜４６ページ（１９９５年）を参照されたい。他の優性負型変異体は、
例えば、Ｍｕｔｈｕｋｋｕｍａｒら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２７１巻：５
７３３〜４０ページ（１９９６年）に記載されている。[0062] In yet another embodiment, the expression construct encodes a dominant negative Rb variant. For example, the function of a wild-type retinoblastoma protein can be disrupted by expression of its C pocket fragment. See, for example, Welch et al., Genes Dev. Ninth
Volume: pages 31-46 (1995). Other dominant negative variants are
See, for example, Muthukkumar et al . Biol. Chem. Volume 271: 5
733-40 (1996).

【００６３】 さらに他の実施態様において、発現構築物は、Ｒｂ及び／もしくはｐ５３、又
はその断片をバイパスするパピローマウイルスＥ７タンパク質又は他のウイルス
性腫瘍タンパク質をコードし得る。好ましい実施態様において、Ｅ７タンパク質
は、高リスクＨＰＶ、好ましくはＨＰＶ−１６又はＨＰＶ−１８由来である。代
表的なＥ７ポリペプチドは、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ：遺伝子座ＶＥ７＿ＨＰＶ１
８、登録番号Ｐ０６７８８、ＰＩＲ：遺伝子座Ｗ７ＷＬ１８及び配列番号７によ
って与えられる。In yet another embodiment, the expression construct may encode a papillomavirus E7 protein or other viral oncoprotein that bypasses Rb and / or p53, or a fragment thereof. In a preferred embodiment, the E7 protein is derived from high risk HPV, preferably HPV-16 or HPV-18. A representative E7 polypeptide is SWISS-PROT: locus VE7_HPV1.
8, accession number P06788, PIR: given by locus W7WL18 and SEQ ID NO: 7.

【００６４】 さらに他の実施態様において、発現構築物は、サイクリン、好ましくは、サイ
クリンＤ１又はサイクリンＥなどのＧ１期の活性であるサイクリンをコードする
。In yet another embodiment, the expression construct encodes a cyclin, preferably a cyclin that is G1-phase active, such as cyclin D1 or cyclin E.

【００６５】 さらに他の実施態様において、Ｒｂインアクチベーターは、転写リプレッサー
、又はＲｂ、（ｐ１６ＩＮＫ４ａなどの）ＩＮＫ４タンパク質もしくは他のＲｂ
抗増殖活性の他の正の調節物質の発現を阻害する転写アクチベーターの優性負型
変異体であってよい。１つの実施態様において、ＲｂインアクチベーターはＢｍ
ｉ−１遺伝子産物である。Ｊａｃｏｂｓら，Ｎａｔｕｒｅ（１９９９年）は、ｐ
１６^INK4a及びｐ１９^Arfの発現を阻害するポリコーム群の転写リプレッサーとし
てＢｍｉ−１を同定した。代表的なヒトＢｉｍ−１はＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｌ
１３６８９として得られる。In still other embodiments, the Rb inactivator is a transcriptional repressor, or Rb, an INK4 protein (such as p16INK4a) or other Rb
It may be a dominant negative mutant of a transcriptional activator that inhibits the expression of other positive regulators of antiproliferative activity. In one embodiment, the Rb inactivator is Bm
i-1 gene product. Jacobs et al., Nature (1999), p.
Bmi-1 was identified as a transcriptional repressor of the polycomb group that inhibits the expression of 16 ^INK4a and p19 ^Arf . A representative human Bim-1 is GenBank accession number L
13689.

【００６６】 さらに、当業には、変異体、例えば、Ｒｂチェックポイントのバイパスに関す
る特定の生物学的活性を保持する上記のポリペプチドのいずれかの点変異、付加
、欠失及び断片を同定する組合せ技術の例が豊富にある。タンパク質変異体ライ
ブラリーの産生及びプロセシングのための組合せ技術は、１０億を超える異なる
変異体ライブラリーに関してさえ当業においては一般的である。代表的な突然変
異誘発技術には、所与の生物学的活性についてスクリーニングし得る変異体ライ
ブラリーの創出に用い得る、アラニンスキャニング突然変異誘発など〔Ｌｏｗｍ
ａｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ 第３０巻：１０８３２〜１０８３８ページ
（１９９１年）；及びＣｕｎｎｉｎｇｈａｍら，Ｓｃｉｅｎｃｅ 第２４４巻：
１０８１〜１０８５ページ（１９８９年）〕、リンカースキャニング突然変異誘
発〔Ｂｒｏｗｎら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．第１２巻：２６４４〜２６５
２ページ（１９９２年）；ＭｃＫｎｉｇｈｔら，Ｓｃｉｅｎｃｅ 第２３２巻：
３１６ページ（１９８２年）〕、飽和突然変異誘発〔Ｍａｙｅｒら，Ｓｃｉｅｎ ｃｅ 第２３２巻：６１３ページ（１９８６年）〕、ＰＣＲ突然変異誘発〔Ｌｅ
ｕｎｇら，Ｍｅｔｈｏｄ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．第１巻：１１〜１９ペ
ージ（１９８９年）〕ならびにランダム突然変異誘発〔Ｍｉｌｌｅｒら，Ａ Ｓ ｈｏｒｔ Ｃｏｕｒｓｅ ｉｎ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ，ＣＳ
ＨＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９９２年
）〕が含まれる。Furthermore, the skilled artisan will identify variants, eg, point mutations, additions, deletions and fragments of any of the above polypeptides that retain a particular biological activity with respect to Rb checkpoint bypass. There are many examples of combination technology. Combinatorial techniques for the production and processing of protein variant libraries are common in the art, even for over one billion different variant libraries. Representative mutagenesis techniques include alanine scanning mutagenesis, which can be used to create a library of mutants that can be screened for a given biological activity [Lowm.
An et al., Biochemistry 30: 10832-10838 (1991); and Cunningham et al., Science 244:
1081-1085 (1989)], linker scanning mutagenesis [Brown et al . , Mol. Cell Biol. Volume 12: 2644-265
2 (1992); McKnight et al., Science Vol. 232:
316 pages (1982)], saturation mutagenesis [Mayer et al., Scien ce # 232 Volume: 613 pages (1986)], PCR mutagenesis [Le
ung et al., Method Cell Mol. Biol. 1: 11-19 (1989)] and random mutagenesis [Miller et al., A Short Course in Bacterial Genetics , CS].
HL Press, Cold Spring Harbor, NY (1992)].

【００６７】 さらに、Ｇａｌｌｏｐら，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．第３７巻：１２３３ページ
（１９９４年）が当業の状態を説明している。特に、Ｇａｌｌｏｐらは、類似体
ライブラリーをスクリーニングして活性配列の最小サイズを測定し、結合に重要
かつ置換に不耐の残基を同定するための組合せライブラリー技術の全般的な常態
を説明している。さらに、ＬａｄｎｅｒらのＰＣＴ公開ＷＯ９０／０２８０９号
、Ｇｏｅｄｄｅｌらに付与された米国特許第５，２２４，４０８号、及びＭａｒ
ｋｌａｎｄらのＰＣＴ公開ＷＯ９２／１５６８９号は、高速スクリーニングを行
って、当業者が、Ｒｂインアクチベーターの活性を保持する変異体／断片を同定
し得る変異体ライブラリーの生成に利用できる特定の技術を説明している。Further, Gallop et al . Med. Chem. Volume 37: page 1233 (1994) describes the state of the art. In particular, Gallop et al. Describe the general status of combinatorial library technology for screening analog libraries to determine the minimum size of active sequences and to identify residues important for binding and intolerant to substitution. are doing. In addition, Ladner et al., PCT Publication No. WO 90/02809, US Pat. No. 5,224,408 to Goeddel et al., And Mar.
PCT publication WO 92/15689 of kland et al. describes a specific technique that can be used to generate a mutant library that can perform high speed screening to identify those mutants / fragments that retain the activity of the Rb inactivator. Is explained.

【００６８】 組合せ突然変異誘発技術から、当業者が、どの残基が生物学的機能に重要であ
るかをあらかじめ考えることなく、大規模なタンパク質突然変異に従事し、等価
の生物学的活性を有する広範な変異体を産生させることが実際に日常的であるこ
とは明らかである。確かに、重要な残基についての推測的理解又は知識要件を排
除する高度な全体的分析により莫大な数の異なる変異体をスクリーニングするの
が組合せ技術の能力である。From combinatorial mutagenesis techniques, one of ordinary skill in the art can engage in large-scale protein mutations and achieve equivalent biological activity without first knowing which residues are important for biological function. Obviously, it is indeed routine to produce a wide range of variants having Indeed, it is the ability of combinatorial technology to screen a vast number of different variants by sophisticated global analysis that eliminates the a priori understanding or knowledge requirement for important residues.

【００６９】 さらに別の実施態様において、発現構築物は、ｐ１６又はＲｂの発現を阻害す
るアンチセンス分子を「コード」する。例えば、アンチセンス構築物には、スト
リンジェント条件下にｐ１６ＩＮＫ４ａ遺伝子又はＲｂ遺伝子、好ましくは哺乳
動物遺伝子、より好ましくはヒト遺伝子にハイブリダイズするヌクレオチド配列
が含まれる。好ましい実施態様において、アンチセンス構築物としては、配列番
号８のＲｂ遺伝子すなわちＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｌ４１８７０、又は配列番号
９のｐ１６ＩＮＫ４ａ遺伝子すなわちＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｌ２７２１１にハ
イブリダイズするヌクレオチド配列が含まれる。好ましい実施態様において、こ
のアンチセンス構築物はＲｂ又はｐ１６ＩＮＫ４ａ遺伝子のコード配列にハイブ
リダイズする。In yet another embodiment, the expression construct “encodes” an antisense molecule that inhibits expression of p16 or Rb. For example, an antisense construct includes a nucleotide sequence that hybridizes under stringent conditions to the p16INK4a gene or Rb gene, preferably a mammalian gene, more preferably a human gene. In a preferred embodiment, the antisense construct comprises a nucleotide sequence that hybridizes to the Rb gene of SEQ ID NO: 8, ie, GenBank Accession No. L41870, or the p16INK4a gene of SEQ ID NO: 9, ie, GenBank Accession No. L27211. In a preferred embodiment, the antisense construct hybridizes to the coding sequence of the Rb or p16INK4a gene.

【００７０】 本発明によって他のＲｂインアクチベーターが企図されている。例えば、ＰＣ
Ｔ公開ＷＯ９８／１２３３９号及び米国特許出願０９／０３１，１８５号は、Ｒ
ｂ／ｐ１６表現型などに干渉する遺伝子を検出するための技術を説明している。
例えば、Ｒｂ／ｐ１６仲介性老化をバイパスする遺伝子は、センス配向遺伝子の
過発現又は機能性ノックアウト（遺伝子サプレッサー成分の発現）によって調べ
ることができる。例示のために、（Ｒｂノックアウトマウス由来の）内因性Ｒｂ
遺伝子を欠くマウスの胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）を合成して蛍光標識したＲｂタ
ンパク質を条件付け発現させる。蛍光タンパク質は、活性化されると、細胞周期
を停止させる。停止のバイパスは、センスｃＤＮＡの発現又はＧＳＥ断片の発現
により達成し得る。そのようなスクリーニングにより、Ｒｂ分解経路成分、Ｒｂ
には作用しないがＲｂの存在下においてさえ細胞周期を進行させる遺伝子、及び
Ｒｂの局所化に作用する遺伝子を同定し得る。したがって、蛍光Ｒｂタンパク質
の使用は、バイパスメカニズムに関する情報を提供する。[0070] Other Rb inactivators are contemplated by the present invention. For example, PC
T publication WO 98/12339 and U.S. patent application Ser.
Describes techniques for detecting genes that interfere with the b / p16 phenotype and the like.
For example, genes that bypass Rb / p16-mediated senescence can be examined by overexpression of a sense orientation gene or functional knockout (expression of a gene suppressor component). For illustration, the endogenous Rb (from Rb knockout mouse)
Mouse embryonic fibroblasts (MEFs) lacking the gene are synthesized to conditionally express the fluorescently labeled Rb protein. Fluorescent proteins, when activated, arrest the cell cycle. Bypass of termination can be achieved by expression of a sense cDNA or expression of a GSE fragment. Such screening will allow the Rb degradation pathway components, Rb
One can identify genes that do not act on Rb but that allow the cell cycle to progress even in the presence of Rb, and that affect Rb localization. Thus, the use of fluorescent Rb proteins provides information about the bypass mechanism.

【００７１】 Ｒｂ／ｐ１６経路のバイパスを可能にすると同定された遺伝子又は遺伝子サプ
レッサー成分は、本発明の一部であると述べることができる。A gene or gene suppressor component identified as being capable of bypassing the Rb / p16 pathway can be stated to be part of the present invention.

【００７２】 本発明の方法によれば、当該Ｒｂインアクチベーターポリペプチド又はＲｂイ
ンアクチベーター核酸（アンチセンス、デコイなど）の発現構築物は、生物学的
に有効な担体、例えば、組換え遺伝子により細胞を試験管内又は生体内で効果的
にトランスフェクトし得る任意の製剤又は組成物中で投与し得る。方法としては
、組換えレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス及び単純ヘルペ
スウイルス−１を含めたウイルスベクター、又は組換え細菌もしくは真核生物プ
ラスミド中に当該Ｒｂインアクチベーター遺伝子を挿入することが含まれる。ウ
イルスベクターを用いて細胞を直接トランスフェクトすることができる。プラス
ミドＤＮＡは、例えば、カチオン性リポソーム（リポフェクチン）もしくは誘導
体（例えば、抗体結合体）、ポリリシン結合体、グラマシジンＳ、人工ウイルス
エンベロープ又は他のそのような細胞内担体の助けによるだけでなく、遺伝子構
築物を直接注入したり、生体内でＣａＰＯ₄沈降反応を実施することにより導入
し得る。適切な標的細胞の形質導入は遺伝子療法において重要な最初のステップ
を構成するために、特定の遺伝子デリバリーシステムの選択は、意図する標的の
表現型及び投与経路、例えば、局所又は全身投与などの要素に依存することが理
解されよう。According to the method of the present invention, the expression construct of the Rb inactivator polypeptide or Rb inactivator nucleic acid (antisense, decoy, etc.) can be obtained by using a biologically effective carrier, for example, a recombinant gene. The cells can be administered in any formulation or composition that can be effectively transfected in vitro or in vivo. Methods include inserting the Rb inactivator gene into a viral vector, including a recombinant retrovirus, adenovirus, adeno-associated virus and herpes simplex virus-1, or a recombinant bacterial or eukaryotic plasmid. It is. Cells can be directly transfected using viral vectors. Plasmid DNA can be used, for example, with the aid of cationic liposomes (lipofectin) or derivatives (eg, antibody conjugates), polylysine conjugates, gramacidin S, artificial virus envelopes or other such intracellular carriers, as well as gene constructs. Can be introduced by direct injection or by performing a CaPO ₄ precipitation reaction in vivo. Since transduction of appropriate target cells constitutes an important first step in gene therapy, the choice of a particular gene delivery system depends on the phenotype of the intended target and the route of administration, e.g., local or systemic administration. It will be appreciated that

【００７３】 Ｒｂインアクチベーターをコードする核酸を細胞に導入するための好ましい方
法は、核酸を含むウイルスベクター、例えば、遺伝子産物をコードするｃＤＮＡ
の使用による。細胞にウイルスベクターを感染させることは、大部分の標的細胞
が核酸を受容し得るという利点を有する。さらに、例えばウイルスベクター内で
、ウイルスベクターに含まれているｃＤＮＡによってコードされる分子は、ウイ
ルスベクターの核酸を取り込んだ細胞で効率的に発現する。A preferred method for introducing a nucleic acid encoding an Rb inactivator into a cell is a viral vector containing the nucleic acid, for example, a cDNA encoding a gene product.
By the use of Infecting cells with a viral vector has the advantage that most target cells can receive the nucleic acid. Further, for example, in a viral vector, the molecule encoded by the cDNA contained in the viral vector is efficiently expressed in cells that have taken up the nucleic acid of the viral vector.

【００７４】 一般に、レトロウイルスベクター及びアデノ関連ウイルスベクターは、外因性
遺伝子を生体内で、特にヒトに導入するための一般に好まれている組換え遺伝子
デリバリーシステムとみなされている。これらのベクターは、遺伝子の細胞への
効率的なデリバリーを提供し、導入された核酸は宿主の染色体ＤＮＡ中に安定に
組み込まれる。レトロウイルスの使用に関する主要件は、特に細胞集団において
野生型ウイルスが蔓延する可能性に関するレトロウイルス使用の安全性を確実に
することである。複製欠損型レトロウイルスのみを産生する（「パッケージング
細胞」と称される）特殊化細胞系の開発は遺伝子療法用のレトロウイルスの有用
性を増大させ、欠損型レトロウイルスは遺伝子療法目的のために遺伝子導入に用
いるのに十分な特性を有している〔概説に関しては、Ａ．Ｄ．Ｍｉｌｌｅｒ，Ｂ
ｌｏｏｄ 第７６巻：２７１ページ（１９９０年）を参照されたい〕。したがっ
て、レトロウイルスコード配列の一部（ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ）を例えばＲｂ
インアクチベーターポリペプチドをコードする核酸で置換して、レトロウイルス
を複製欠損体とした組換えレトロウイルスを構築することができる。次いで、複
製欠損型レトロウイルスを、標準技術によりヘルパーウイルスを用いた標的細胞
の感染に用い得るウイルス粒子中にパッケージする。組換えレトロウイルスを産
生させ、試験管内又は生体内で細胞にそのようなウイルスを感染させるためのプ
ロトコルは、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓ
ｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，第９．１０〜第９．１４節（１９８９年）及
び他の標準的な実験室マニュアルに見出すことができる。適当なレトロウイルス
の例としては、当業者には周知のｐＬＪ、ｐＺＩＰ、ｐＷＥ及びｐＥＭがある。
自己指向性及び両指向性レトロウイルス系を調製するための適当なパッケージン
グウイルス系の例としては、ΨＣｒｉｐ、ΨＣｒｅ、Ψ２及びΨＡｍがある。レ
トロウイルスは、多様な遺伝子を、神経細胞、上皮細胞、内皮細胞、リンパ球、
筋芽細胞、肝細胞、骨髄細胞を含めた多くの異なる細胞種に試験管内及び／又は
生体内導入するのに用いられている〔例えば、Ｅｇｌｉｔｉｓら，Ｓｃｉｅｎｃ ｅ 第２３０巻：１３９５〜１３９８ページ（１９８５年）；Ｄａｎｏｓ及びＭ
ｕｌｌｉｇａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ 第８５巻：
６４６０〜６４６４ページ（１９８８年）；Ｗｉｌｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ 第８５巻：３０１３〜３０１８ページ（１９８
８年）；Ａｒｍｅｎｔａｎｏら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ Ａ 第８７巻：６１４１〜６１４５ページ（１９９０年）；Ｈｕｂｅｒら，Ｐｒ ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ 第８８巻：８０３９〜８０４３ペ
ージ（１９９１年）；Ｆｅｒｒｙら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ 第８８巻：８３７７〜８３８１ページ（１９９１年）；Ｃｈｏｗｄｈｕ
ｒｙら，Ｓｃｉｅｎｃｅ 第２５４巻：１８０２〜１８０５ページ（１９９１年
）；ｖａｎ Ｂｅｕｓｅｃｈｅｍら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ 第８９巻：７６４０〜７６４４ページ（１９９２年）；Ｋａｙら，Ｈｕ ｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ 第３巻：６４１〜６４７ページ（１９９２
年）；Ｄａｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ 第８９巻：
１０８９２〜１０８９５ページ（１９９２年）；Ｈｗｕら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ． 第１５０巻：４１０４〜４１１５ページ（１９９３年）；米国特許第４，８６
８，１１６号；米国特許第４，９８０，２８６号；ＰＣＴ出願ＷＯ８９／０７１
３６号；ＰＣＴ出願ＷＯ８９／０２４６８号；ＰＣＴ出願ＷＯ８９／０５３４５
号；及びＰＣＴ出願ＷＯ９２／０７５７３号を参照されたい〕。In general, retroviral vectors and adeno-associated viral vectors are regarded as generally preferred recombinant gene delivery systems for introducing exogenous genes in vivo, especially into humans. These vectors provide for efficient delivery of the gene to the cell, and the introduced nucleic acid is stably integrated into the chromosomal DNA of the host. A major concern regarding the use of retroviruses is to ensure the safety of the use of retroviruses, especially with respect to the potential for the spread of wild-type virus in cell populations. The development of specialized cell lines that produce only replication-defective retroviruses (referred to as "packaging cells") increases the usefulness of retroviruses for gene therapy, and defective retroviruses can be used for gene therapy purposes. Have sufficient properties to be used for gene transfer [for a review, see A. et al. D. Miller, B
, Vol. 76: 271 (1990)]. Therefore, part of the retroviral coding sequence (gag, pol, env) can be
By substituting a nucleic acid encoding an inactivator polypeptide, a recombinant retrovirus in which the retrovirus has a replication defect can be constructed. The replication defective retrovirus is then packaged into virus particles that can be used to infect target cells with a helper virus by standard techniques. Protocols for producing recombinant retroviruses and infecting cells with such viruses in vitro or in vivo are described in Current Protocols in Molecular Biology , F.C. M. Ausubel et al., Greene Publis
hing Associates, Sections 9.10 to 9.14 (1989) and other standard laboratory manuals. Examples of suitable retroviruses include pLJ, pZIP, pWE and pEM well known to those skilled in the art.
Examples of suitable packaging virus systems for preparing autotrophic and amphotropic retrovirus systems include ΨCrip, ΨCre, Ψ2 and ΨAm. Retroviruses transfer various genes to nerve cells, epithelial cells, endothelial cells, lymphocytes,
Myoblasts, hepatocytes, has been used to introduce in vitro and / or in vivo in a number of different cell types, including bone marrow cells [e.g., Eglitis et al., Scienc e # 230, Volume: 1395 to 1398 Page ( 1985); Danos and M.
ulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA Volume 85:
6460-6464 (1988); Wilson et al . , Proc. Nat l. Acad. Sci. USA 85: 3013-3018 (198
8 years); Armentano et al . , Proc. Natl. Acad. Sci. US A second Vol. 87: 6141-6145 page (1990); Huber et al., Pr oc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 8039-8043 (1991); Ferry et al . , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 8377-8381 (1991); Chowdhu.
ry et al., Science 254: 1802-1805 (1991); van Beusechem et al . , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 7640-7644 (1992); Kay et al., Hu man Gene Therapy 3: 641-647 (1992).
Year); Dai et al . , Proc. Natl. Acad. Sci. USA Volume 89:
10892-10895 (1992); Hwu et al . Immunol . 150: 4104-4115 (1993); U.S. Pat.
8,116; U.S. Patent No. 4,980,286; PCT application WO 89/071.
No. 36; PCT application WO 89/02468; PCT application WO 89/05345
And PCT application WO 92/07573].

【００７５】 当該Ｒｂインアクチベータータンパク質を得るための遺伝子デリバリーシステ
ムとしてレトロウイルスベクターを選択する際に、標的細胞をほとんどのレトロ
ウイルスに首尾よく感染させるための前提条件、したがって、組換え遺伝子を安
定導入するための前提条件は、標的細胞が***中でなければならないことである
ことに留意するのが重要である。一般に、この要件は、当該遺伝子構築物のデリ
バリーにレトロウイルスベクターを使用することを妨げるものとはならないであ
ろう。In selecting a retroviral vector as a gene delivery system to obtain the Rb inactivator protein, a prerequisite for successfully infecting target cells with most retroviruses, and thus, stabilizing the recombinant gene It is important to note that a prerequisite for introduction is that the target cells must be dividing. Generally, this requirement will not preclude the use of retroviral vectors for delivery of the gene construct.

【００７６】 さらに、ウイルス粒子表面上のウイルスパッケージングタンパク質を修飾する
ことにより、レトロウイルスと、必然的に、レトロウイルスベースベクターとの
感染スペクトルを制限することが可能であると証明された〔例えば、ＰＣＴ公開
ＷＯ９３／２５２３４号；同ＷＯ９４／０６９２０号；及び同ＷＯ９４／１１５
２４号を参照されたい〕。例えば、レトロルイスベクターの感染スペクトルを変
更するための戦略には、細胞表面抗原に特異的な抗体とウイルスエンベロープタ
ンパク質との結合〔Ｒｏｕｘら，ＰＮＡＳ 第８６巻：９０７９〜９０８３ペー
ジ（１９８９年）；Ｊｕｌａｎら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．第７３巻：３２５
１〜３２５５ページ（１９９２年）；及びＧｏｕｄら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ 第１
６３巻：２５１〜２５４ページ（１９８３年）〕、又は細胞表面リガンドとウイ
ルスエンベロープタンパク質との結合〔Ｎｅｄａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． 第２６６巻：１４１４３−１４１４６ページ（１９９１年）〕が含まれる。結合
は、タンパク質又は他の変種（例えば、エンベロープタンパク質をアシアロ糖タ
ンパク質に転化させるラクトース）との化学架橋形態であってもよいし、融合タ
ンパク質（例えば、一本鎖抗体／エンベロープ融合タンパク質）の産生によるも
のであってもよい。この技術は、いくつかの組織種に対する感染を制限又は誘導
するのに有用であると同時に、自己指向性ベクターから両指向性ベクターへの変
換に用いることもできる。Furthermore, it has been demonstrated that by modifying the viral packaging proteins on the surface of the viral particles, it is possible to limit the infection spectrum of the retrovirus and, inevitably, the retrovirus-based vector [eg PCT Publication Nos. WO93 / 25234; WO94 / 06920; and WO94 / 115.
No. 24]. For example, strategies for altering the infection spectrum of retro Lewis vectors include conjugation of antibodies specific for cell surface antigens to viral envelope proteins [Roux et al., PNAS 86: 9079-9083 (1989); Julan et al . Gen. Virol. Volume 73: 325
1-355 (1992); and Good et al., Virology 1st.
63: 251-254 (1983)], or binding of cell surface ligands to viral envelope proteins [Neda et al., J. Am. Biol. Chem. 266: pp. 14143-14146 (1991)]. The linkage may be in the form of a chemical cross-link with a protein or other variant (eg, lactose that converts the envelope protein to asialoglycoprotein), or the production of a fusion protein (eg, a single-chain antibody / envelope fusion protein). May be used. This technique is useful for limiting or inducing infection of several tissue types, and can also be used for conversion of an autotrophic vector to an amphotropic vector.

【００７７】 また、レトロウイルス遺伝子デリバリーの用途は、レトロウイルスベクターの
組換え遺伝子の発現を抑制する組織又は細胞特異転写調節配列を用いることによ
ってさらに拡大することができる。The use of retroviral gene delivery can be further expanded by using a tissue or cell-specific transcriptional regulatory sequence that suppresses the expression of a recombinant gene of a retroviral vector.

【００７８】 本発明に有用な別のウイルス遺伝子輸送系は、アデノウイルス由来ベクターを
利用する。アデノウイルスのゲノムは、ｉｔｅｒＲｂ不活性化物質の遺伝子産物
をコード化するが、正常な溶解性ウイルスのライフサイクルでの複製能力に関し
ては不活性であるように操作することが可能である（例えば、Ｂｅｒｋｎｅｒ
ｅｔ ａｌ． （１９９８） ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：６１６； Ｒ
ｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：４
３１−４３４；及びＲｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｃｅｌ ｌ ６８： １４３−１５５を参照）。アデノウイルス株Ａｄ ｔｙｐｅ ５
ｄｌ３２４又は別のアデノウイルス株（例えば、Ａｄ２、Ａｄ３、Ａｄ７など）
に由来する好適なアデノウイルスベクターは、当業者に周知である。組換えアデ
ノウイルスは、非***細胞に感染し得ないために特定環境で有利になることが可
能で、内皮細胞（Ｌｅｍａｒｃｈａｎｄ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｐｒｏ ｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：６４８２−６４８６
）及び平滑筋細胞（Ｑｕａｎｔｉｎ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：２５８１−２５８４）の
ような非常に様々な細胞型の感染に用いることが可能である。その上、ウイルス
粒子は比較的安定で、精製及び濃縮が容易であり、上記のように感染性の範囲に
影響するよう修飾することが可能である。加えて、導入したアデノウイルスＤＮ
Ａ（及びそれに含有される外来ＤＮＡ）は、宿主細胞のゲノムに組み込まれずに
エピソームのままであり、そのため導入したＤＮＡが宿主ゲノム（例えば、レト
ロウイルスＤＮＡ）に組み込まれる状況では、挿入突然変異誘発の結果として起
こり得る潜在的問題が回避される。その上、外来ＤＮＡに対するアデノウイルス
ゲノムの運搬容量は、別の遺伝子輸送ベクターに比べて大きい（８キロベース程
）（Ｂｅｒｋｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， ｓｕｐｒａ； Ｈａｊ−Ａｈｍａｎｄ
ａｎｄ Ｇｒａｈａｍ （１９８６） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ５７：２６７）。
現在使用され、そのため本発明に好ましいほとんどの複製欠損型アデノウイルス
ベクターは、ウイスルＥ１及びＥ３遺伝子の全て又は一部を欠失しているが、８
０％ものアデノウイルス遺伝子材料を保持している（例えば、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ
ａｌ． （１９７９） Ｃｅｌｌ １６： ６８３； Ｂｅｒｋｎｅｒ ｅｔ
ａｌ．， ｓｕｐｒａ；及びＧｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ． ｉｎ Ｍｅｔｈｏ ｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ， Ｅ． Ｊ． Ｍｕｒｒａ
ｙ， Ｅｄ． （Ｈｕｍａｎａ， Ｃｌｉｆｔｏｎ， ＮＪ， １９９１） ｖ
ｏｌ． ７． Ｐｐ １０９−１２７を参照）。挿入された遺伝子の発現は、例
えばＥ１Ａプロモータ（主要後期プロモータ（ＭＬＰ））、及び関連のリーダー
配列であるＥ３プロモータ配列、又は外来的に付加されるプロモータ配列の制御
下におくことが可能である。Another viral gene delivery system useful in the present invention utilizes an adenovirus-derived vector. The adenovirus genome can be engineered to encode the gene product of the iterRb inactivator, but to be inactive with respect to the ability of normal lytic viruses to replicate in the life cycle (eg, Berkner
et al. (1998) BioTechniques 6: 616; R
osenfeld et al. (1991) Science 252: 4
31-434; and Rosenfeld et al. See 143-155): (1992) Cel l 68. Adenovirus strain Ad type 5
dl324 or another adenovirus strain (eg, Ad2, Ad3, Ad7, etc.)
Suitable adenoviral vectors derived from are well known to those skilled in the art. Recombinant adenoviruses can be advantageous in certain environments to not infect non-dividing cells, endothelial cells (Lemarchand et al (1992) Pro c Natl Acad Sci USA 89:..... 6482 -6486
) And smooth muscle cells (Quantin et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 2581-2584). Moreover, the virus particles are relatively stable, easy to purify and concentrate, and can be modified to affect the range of infectivity as described above. In addition, the introduced adenovirus DN
A (and the foreign DNA contained therein) remains episomal without being integrated into the host cell's genome, so in situations where the introduced DNA is integrated into the host genome (eg, retroviral DNA), insertion mutagenesis The potential problems that may arise as a result of are avoided. In addition, the carrying capacity of the adenovirus genome for foreign DNA is large (about 8 kilobases) compared to other gene transfer vectors (Berkner et al., Supra; Haj-Ahman).
and Graham (1986) J. Virol. 57: 267).
Most replication deficient adenovirus vectors currently in use and therefore preferred for the present invention lack all or part of the virus E1 and E3 genes, but have
It retains as much as 0% of adenovirus genetic material (eg, Jones et.
al. (1979) Cell 16: 683; Berkner et.
al. And supra; and Graham et al. In Methods in Molecular Biology , E. et al . J. Murra
y, Ed. (Humana, Lifton, NJ, 1991) v
ol. 7. Pp 109-127). Expression of the inserted gene can be under the control of, for example, the E1A promoter (major late promoter (MLP)), and the associated leader sequence, the E3 promoter sequence, or an exogenously added promoter sequence. .

【００７９】 主題のＲｂ活性化構造の輸送に有用な、さらに別のウイルスベクター系が、ア
デノ関連ウイスル（ＡＡＶ）である。アデノ関連ウイルスは、有効な複製及び増
殖性ライフサイクルのために、アデノウイルス又はヘルペスウイルスのような別
のウイルスをヘルパーウイルスとして要求する自然発生型欠損ウイルスである。
（レビューとしてＭｕｚｙｃｚｋａ ｅｔ ａｌ． Ｃｕｒｒ． Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏ． Ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ ． （１９９２） １５８：９
７−１２９を参照）。それは、ＤＮＡを非***細胞に組み込むことが可能な数少
ないウイルスの一つでもあり、安定な組込みを高頻度で呈する（例えば、Ｆｌｏ
ｔｔｅ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ａｍ． Ｊ． Ｒｅｓｐｉｒ． Ｃｅｌ ｌ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ ． ７：３４９−３５６； Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ
ａｌ． （１９８９） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６３：３８２２−３８２８；及
びＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．
６２：１９６３−１９７３を参照）。ＡＡＶのわずか３００ベースペアを含有す
るベクターは、パッケージング及び組み込みが可能である。外来性ＤＮＡのスペ
ースは、約４．５ｋｂに制限される。Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ． （１
９８５） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ５：３２５１−３２６０に記載
のようなＡＡＶベクターを用いて、細胞にＤＮＡを導入することが可能である。
様々な核酸が、ＡＶＶベクターを用いて異なる細胞型に導入されてきた（例えば
Ｈｅｒｍｏｎａｔ ｅｔ ａｌ． （１９８４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａ ｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１：６４６６−６４７０； Ｔｒａｔｓｃｈｉ
ｎ ｅｔ ａｌ． （１９８５） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ４：２
０７２−２０８１； Ｗｏｎｄｉｓｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ｍ ｏｌ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ ． ２：３２−３９； Ｔｒａｔｓｈｉｎ ｅｔ
ａｌ． （１９８４） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ５１：６１１−６１９； 及び
Ｆｌｏｔｔｅ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．
２６８：３７８１−３７９０を参照）。[0079] Yet another viral vector system that is useful for transporting the subject Rb-activated structures is adeno-associated virus (AAV). Adeno-associated viruses are naturally occurring deficient viruses that require an adenovirus or another virus, such as a herpes virus, as a helper virus for an efficient replication and productive life cycle.
(Reviewed by Muzyczka et al. Curr. Topics in Micro. And Immunol . (1992) 158: 9.
7-129). It is also one of the few viruses that can integrate DNA into non-dividing cells and exhibits stable integration at a high frequency (eg, Flo
tte et al. (1992) Am. J. Respir. Cell l. Mol. Biol . 7: 349-356; Samulski et.
al. (1989) J. Virol . 63: 3822-3828; and McLaughlin et al. (1989) J. Virol .
62: 1963-1973). Vectors containing only 300 base pairs of AAV can be packaged and integrated. Space for exogenous DNA is limited to about 4.5 kb. Tratschin et al. (1
985) Mol. Cell. Biol . It is possible to introduce DNA into cells using an AAV vector as described in 5: 3251-3260.
Various nucleic acids have been introduced into different cell types using AVV vectors (eg, Hermonat et al. (1984) Proc. Natl. Acad . Sci. USA 81: 6466-6470; Tratschi.
net et al. (1985) Mol. Cell. Biol . 4: 2
072-2081; Wondisford et al. (1988) M ol. Endocrinol . 2: 32-39; Trasshin et.
al. (1984) J. Amer. Virol . 51: 611- 619; and Flotte et al. (1993) J. Biol. Chem .
268: 3781-3790).

【００８０】 遺伝子治療での適用を有し得る別のウイルスベクター系は、ヘルペスウイルス
、ワクシニアウイルス、及び複数のＲＮＡウイルスに由来してきた。詳細には、
ヘルペスウイルスベクターは、神経幹細胞及び眼組織（Ｐｅｐｏｓｅ ｅｔ ａ
ｌ． （１９９４） Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ
３５； ２６６２−２６６６）のような中枢神経系の細胞で、主題のＲｂ不活性
化蛋白質を持続して発現するための独特の戦略を提供することが可能である。 上記説明のようなウイルス運搬法に加え、非ウイルス法を用いて動物組織で主
題の蛋白質を発現させてもよい。遺伝子運搬のほとんどの非ウイルス法は、巨大
分子の取り込み及び細胞内輸送のために哺乳類細胞で用いられる正常な機序に依
存している。好ましい実施態様において、本発明の非ウイルス遺伝子輸送系は、
標的細胞による遺伝子取り込みでのエンドサイトーシス経路に依存する。この型
の模範的遺伝子輸送系には、リポソーム由来系、ポリリジンコンジュゲート、及
び人口ウイルスエンベロープが挙げられる。Another viral vector system that may have applications in gene therapy has been derived from herpes virus, vaccinia virus, and multiple RNA viruses. For details,
Herpesvirus vectors are used for neural stem cells and ocular tissues (Pepose et a).
l. (1994) Invest Ophthalmol Vis Sci
35; 2662-2666) can provide a unique strategy for sustained expression of the subject Rb-inactivating protein in cells of the central nervous system. In addition to the viral delivery methods described above, non-viral methods may be used to express the subject proteins in animal tissues. Most non-viral methods of gene delivery rely on normal mechanisms used in mammalian cells for macromolecule uptake and intracellular transport. In a preferred embodiment, the non-viral gene delivery system of the invention comprises:
Depends on the endocytic pathway in gene uptake by target cells. Exemplary gene delivery systems of this type include liposome-derived systems, polylysine conjugates, and artificial viral envelopes.

【００８１】 代表的実施態様において、主題の蛋白質の一つをコード化する遺伝子は、正の
表面電荷を帯びたリポソーム（例えばリポフェクチン）に捕らえられてもよく、
（任意に）標的組織の細胞表面抗原に対する抗体が標識されている（Ｍｉｚｕｎ
ｏ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｎｏ Ｓｈｉｎｋｅｉ Ｇｅｋａ ２０：５
４７−５５１； ＰＣＴ国際特許公開第９１／０６３０９号； 日本特許出願第
１０４７３８１号、及びヨーロッパ公開特許第４３０７５号各明細書）。例えば
、神経膠腫細胞のリポフェクチンは、膠腫関連抗原に対するモノクローナル抗体
を標識したリポソームを用いて実施してもよい（Ｍｉｚｕｎｏ ｅｔ ａｌ．
（１９９２） Ｎｅｕｒｏｌ． Ｍｅｄ． Ｃｈｉｒ． ３２：８７３−８７６
）。In an exemplary embodiment, the gene encoding one of the subject proteins may be entrapped in a positively charged liposome (eg, lipofectin),
(Optional) Antibodies against cell surface antigens of the target tissue are labeled (Mizu
o et al. (1992) No Shinkei Geka 20: 5
47-551; PCT International Patent Publication No. 91/06309; Japanese Patent Application No. 1047381 and European Patent Publication No. 43075). For example, lipofectin of glioma cells may be performed using liposomes labeled with a monoclonal antibody against a glioma-associated antigen (Mizuno et al.
(1992) Neurol. Med. Chir . 32: 873-876
).

【００８２】 さらに別の例示的実施態様において、遺伝子輸送系は、ポリリジンのような遺
伝子結合剤と架橋する抗体又は細胞表面リガンドを含んでなる（例えば、ＰＣＴ
国際特許公開第９３／０４７０１号、同第９２／２２６３５号、同第９２／２０
３１６号、同第９２／１９７９４号、 及び同第９２／０６１８０号各明細書を
参照 ）。例えば、主題の遺伝子の構造を用いて、例えばポリリジンのようなポ
リカチオンにコンジュゲートしたアシアログリコプロテインを含んでなる可溶性
ポリヌクレオチド担体を用いて、インビボで肝細胞をトランスフェクトすること
が可能である（米国特許第５，１６６，３２０号明細書を参照）。レセプター仲
介エンドサイトーシスによる主題の核酸構造の効果的輸送を、エンドソーム構造
からの遺伝子エスケープを高める薬剤を用いて改善し得ることも認識されるであ
ろう。例えば、インフルエンザＨＡ遺伝子産物のアデノウイルス又は融合誘発性
ペプチド全体を輸送系の一部として用いて、ＤＮＡ含有エンドソームの有効な破
壊を誘導してもよい（Ｍｕｌｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｓｃｉ ｅｎｃｅ ２６０−９２６； Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｐ ＮＡＳ ８９：７９３４；及びＣｈｒｉｓｔｉａｎｏ ｅｔ ａｌ． （１９９
３） ＰＮＡＳ ９０：２１２２）。[0082] In yet another exemplary embodiment, the gene delivery system comprises an antibody or cell surface ligand that cross-links with a gene binding agent such as polylysine (eg, PCT).
International Patent Publication Nos. 93/04701, 92/22635 and 92/20
Nos. 316, 92/19794 and 92/06180). For example, using the structure of the subject gene, it is possible to transfect hepatocytes in vivo using a soluble polynucleotide carrier comprising asialoglycoprotein conjugated to a polycation such as polylysine. (See U.S. Patent No. 5,166,320). It will also be appreciated that the efficient transport of the subject nucleic acid structure by receptor-mediated endocytosis can be improved with agents that enhance gene escape from the endosomal structure. For example, the entire adenovirus or fusogenic peptides of the influenza HA gene product is used as part of a transport system, which may induce an effective destruction of DNA-containing endosomes (Mulligan et al. (1993) Sci ence 260- . 926; Wagner et al (1992 ) P NAS 89:. 7934; and Christiano et al (199
3) PNAS 90: 2122).

【００８３】 本発明の好ましい実施態様において、主題の方法は、細胞内のＲｂ活性を選択
的かつ可逆的に不活性化し得る遺伝子構造を、細胞中に輸送することを含んでな
る。[0083] In a preferred embodiment of the invention, the subject method comprises transporting into the cell a gene structure capable of selectively and reversibly inactivating Rb activity in the cell.

【００８４】 一実施態様において、Ｒｂ不活性化物質のためのコード配列は、誘導的手法に
より宿主細胞から一部又は完全に除去し得るベクターの一部として提供される。
例えば、ベクターは、 （ｉ）真核生物の宿主細胞の染色体ＤＮＡにベクターを組み込むための１個以上
の転移要素； （ｉｉ）Ｒｂ不活性化物質のコード配列； （ｉｉｉ）異種Ｒｂ不活性化物質の機能喪失をもたらす手法で、（除去要素を活
性化する）除去剤と細胞との接触の際に、染色体ＤＮＡからのベクターの組込ま
れた形態の全て又は少なくとも一部を除去する除去要素；を包含してもよい。In one embodiment, the coding sequence for the Rb inactivator is provided as part of a vector that can be partially or completely removed from a host cell by inductive techniques.
For example, the vector comprises: (i) one or more transposable elements for integrating the vector into the chromosomal DNA of a eukaryotic host cell; (ii) a coding sequence for an Rb inactivator; (iii) a heterologous Rb inactivation. A removal element that removes all or at least a part of the integrated form of the vector from the chromosomal DNA upon contact of the cell with a removal agent (activating the removal element) in a manner that results in a loss of function of the substance; May be included.

【００８５】 例えば、除去後にもたらされた配列が機能的活性化物質をコード化しないよう
、除去要素はコード配列の一部のみをフランキングしてもよい、又は得られた構
造がＲｂ不活性化物質を発現しないように、除去要素はＲｂ不活性化物質のため
の転写調節配列を十分に含む部分をフランキングしてもよいが、除去要素は、Ｒ
ｂ不活性化物質の少なくともコード配列をフランキングするよう、ベクターに提
供してもよい。For example, the removal element may flank only a portion of the coding sequence so that the resulting sequence after removal does not encode a functional activator, or the resulting structure may be Rb inactive. The removal element may flank a portion that contains sufficient transcriptional regulatory sequences for the Rb inactivator so that it does not express the activator,
b The vector may be provided so that at least the coding sequence of the inactivator is flanked.

【００８６】 好ましい実施態様において、除去要素は、ベクターの組込まれた形態を除去す
る際に、ベクターＤＮＡのいずれの部分も、又は実質的にいずれの部分も（例え
ば、２００、１００、又は５０ヌクレオチド未満）宿主細胞の染色体ＤＮＡに残
らないように、ベクターに配列される。好ましい実施態様において、ゲノムに残
存するベクターＤＮＡは、転写的に不活性であり、例えば近傍に位置するゲノム
配列の転写を誘導又は抑制しない。In a preferred embodiment, the removal element removes any or substantially any portion of the vector DNA (eg, 200, 100, or 50 nucleotides) in removing the integrated form of the vector. Less) is arranged in a vector such that it does not remain in the chromosomal DNA of the host cell. In a preferred embodiment, the vector DNA remaining in the genome is transcriptionally inactive and does not, for example, induce or suppress the transcription of neighboring genomic sequences.

【００８７】 好ましい実施態様において、転移要素は、ベクターが複製欠損型ウイルスであ
る場合に提供され得るようなウイルス性転移要素（例えば、レトロウイルス又は
レンチウイルス転移要素）である。In a preferred embodiment, the transposable element is a viral transposable element, such as can be provided if the vector is a replication-defective virus (eg, a retroviral or lentiviral transposable element).

【００８８】 好ましい実施態様において、除去要素は、酵素が補助する部位特異的組込み配
列を含んでなる。例えば、除去要素は、リコンビナーゼ標的部位（例えば、Ｃｒ
ｅリコンビナーゼ、Ｆｌｐリコンビナーゼ、Ｐｉｎリコンビナーゼ、λインテグ
ラーゼ、Ｇｉｎリコンビナーゼ、Ｋｗリコンビナーゼ、又はＲリコンビナーゼの
ためのリコンビナーゼ標的部位）を包含していてもよい。除去要素は、制限酵素
部位であってもよい。In a preferred embodiment, the removal element comprises an enzyme-assisted site-specific integration sequence. For example, the removal element may include a recombinase target site (eg, Cr
e recombinase, Flp recombinase, Pin recombinase, λ integrase, Gin recombinase, Kw recombinase, or recombinase target site for R recombinase). The removal element may be a restriction enzyme site.

【００８９】 好ましい実施態様において、ベクターは、プロウイルス配列の除去が起きるよ
うに（例えばウイルスベクターが、宿主細胞の染色体ＤＮＡから完全に又はほと
んど完全に除去されるように）、リコンビナーゼ部位がＬＴＲに位置するレトロ
ウイルスベクターである。In a preferred embodiment, the vector comprises a recombinase site in the LTR such that removal of the proviral sequence occurs (eg, such that the viral vector is completely or almost completely removed from the chromosomal DNA of the host cell). It is a retrovirus vector located.

【００９０】 ベクターは、テレモラーゼ活性化物質のためのコード配列の転写を指示する転
写調節配列；感染性ウイルス粒子のベクターをパッケージングするパッケージン
グシグナル：のような別の要素を包含してもよい。The vector may include other elements such as transcriptional regulatory sequences that direct transcription of the coding sequence for the telemolase activator; packaging signals that package the vector of the infectious viral particle. .

【００９１】 この種の（例えば容易に除去出来る）模範的ベクターは、添付の実施例だけで
なくＰＣＴ国際特許公開第９８／１２３３９号明細書にも記載される。有利には
、特定のこれらベクター（例えば実質的に除去され得るもの）は、方法がエクス
ビボ治療の一部であるような実施態様において、実現することが可能である。そ
のような実施態様において、細胞をベクター構造によりエクスビボで処理するこ
とが可能である。宿主内に植え付ける前に、細胞をリコンビナーゼのような薬剤
で処理すると、結果として宿主細胞のゲノムＤＮＡからベクターが除去される。
こうして、植え付けられた細胞は、もはや遺伝子操作しない。そのような実施態
様において、例えばＦＡＣＳ選別、親和性精製、又は別の技術により、ベクター
を依然として保持した細胞を同定出来るよう、ベクター上の１つ以上の検出可能
な遺伝子（マーカー）を包含することが所望な場合もある。Exemplary vectors of this type (eg, easily removable) are described in the accompanying examples as well as in PCT Publication WO 98/12339. Advantageously, certain of these vectors (eg, those that can be substantially eliminated) can be implemented in embodiments where the method is part of an ex vivo therapy. In such embodiments, the cells can be treated ex vivo with the vector construct. Treating the cells with an agent such as a recombinase prior to implantation in the host results in the removal of the vector from the host cell's genomic DNA.
Thus, the implanted cells are no longer genetically engineered. In such embodiments, including one or more detectable genes (markers) on the vector so that cells that still retain the vector can be identified, for example, by FACS sorting, affinity purification, or another technique. May be desired.

【００９２】 Ｒｂ不活性化物質のコード配列の発現を制御する誘導性転写調節配列が存在す
るために、誘導性のある発現系を用いることにより、Ｒｂ不活性化の可逆性を生
成することも可能である。誘導性プロモータは、培養条件での幾つかの変化（例
えば、栄養の有無又は温度変化）への応答を制御しながら、ＤＮＡからの高レベ
ルの転写を開始させるプロモータである。細胞が患者に移植される場合には、誘
導性プロモータは、好ましくは宿主動物に対して内生的でない小分子又は別の因
子により調節されるものである。Due to the presence of an inducible transcriptional regulatory sequence that controls the expression of the coding sequence of the Rb inactivator, the use of an inducible expression system can also produce reversibility of Rb inactivation. It is possible. An inducible promoter is a promoter that initiates high levels of transcription from DNA while controlling the response to some changes in culture conditions (eg, the presence or absence of nutrients or changes in temperature). When the cells are transplanted into a patient, the inducible promoter is preferably one that is regulated by a small molecule or another factor that is not endogenous to the host animal.

【００９３】 模範的調節プロモータは、例えばＧｏｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９９２）
ＰＮＡＳ ８９：５５４７−５５５１；及びＰｅｓｃｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，
（１９９４） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍ． ２０２：１６６４−１６６７に記載のようなテトラサイクリン応答性プロモー
タを包含する。[0093] Exemplary regulatory promoters are described, for example, in Gossen et al. (1992)
PNAS 89: 5547-5551; and Pesini et al. ,
(1994) Biochem. Biophys. Res. Comm. 202: 1664-1667.

【００９４】 別の実施態様において、主題の方法は、Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ及びＣｒａｂｔｒ
ｅｅが最初に開発した多量体化技術を利用している。この技術は、小分子「二量
体化剤（ｄｉｍｅｒｉｚｅｒｓ）」に依存するキメラ転写因子を使用して、転写
的に活性な複合体を組立てることにより、内生遺伝子又は異種遺伝子（この場合
Ｒｂ不活性化物質のためのコード配列）の発現の調節を可能にする。例えば、Ｐ
ＣＴ国際特許公開第９６１２７９６号；同第９５０５３８９号；同第９５０２６
８４号；同第９４１８３１７号；同第９６０６０９７号；及び同第９６０６１１
０号各明細書を参照されたい。その上、人口二量体化分子の使用により、転写調
節配列への内生ＤＮＡ結合及び活性化ドメインの補充を可能にする複数の技術が
、より近年になり開発されてきた。例えばＰＣＴ国際特許公開第９６１３６１３
号明細書を参照されたい。In another embodiment, the subject method comprises Schreiber and Crabtr
ee utilizes the multimerization technology first developed. This technique uses chimeric transcription factors that rely on small molecules “dimerizers” to assemble a transcriptionally active complex, thereby producing an endogenous or heterologous gene (in this case, Rb-free). (Coding sequence for activators). For example, P
CT International Patent Publication Nos. 96122796; 9505389; 95026
No. 84; No. 9418317; No. 9606097; and No. 960611
See No. 0 each specification. Moreover, several techniques have been developed more recently that allow the recruitment of endogenous DNA to transcriptional regulatory sequences and activation domains through the use of artificial dimerizing molecules. For example, PCT International Patent Publication No. 9613613
See issue specification.

【００９５】 別の実施態様において、Ｒｂ不活性化の可逆性は、Ｒｂ不活性化物質の条件的
活性化（又は条件的不活性化）形態の使用により成就することが可能である。例
えば、ｃｄｋ４変異体のようなドミナントネガティブ不活性化物質の温度感受性
変異体は、主題の方法で使用することが可能である。その細胞が動物へ移植され
るような実施態様において、ｔｓ変異体は体温で不活性であってもよく（非複製
可能温度）、より低温又はより高温の細胞培養温度で活性であってもよい。In another embodiment, reversibility of Rb inactivation can be achieved through the use of a conditionally activated (or conditionally inactivated) form of the Rb inactivator. For example, a temperature sensitive mutant of a dominant negative inactivator such as a cdk4 mutant can be used in the subject methods. In embodiments where the cells are implanted into an animal, the ts variant may be inactive at body temperature (non-replicable temperature) or active at lower or higher cell culture temperatures. .

【００９６】 説明すると、関心の遺伝子でのｔｓ突然変異を探求する必要がない温度感受性
Ｒｂ不活性化物質を生成する一戦略は、移植可能な熱誘導性Ｎ−デグロン（Ｎ−
ｄｅｇｒｏｎ）に基づいている。Ｎ−デグロンは、不可欠な決定因子が蛋白質の
「不安定化」Ｎ−末端残基であるような細胞内分解シグナルである。異なる不活
性化残基を含有する１組のＮ−デグロンは、Ｎ−末端の法則（Ｎ−ｅｎｄ ｒｕ
ｌｅ）として明示され、インビボでの蛋白質の半減期をＮ−末端残基の同一性と
関連付ける。真核生物でのＮ−デグロンは、不安定化Ｎ−末端残基及び基質の特
異的内部Ｌｙｓ残基（一つ又は複数）の、少なくとも２つの決定因子からなる。
Ｌｙｓ残基は、マルチユビキチン鎖の結合部位である。ユビキチンは、別の蛋白
質へ共有結合させたコンジュゲーションが、主に蛋白質分解に関与する経路を通
して、複数の細胞処理で一つの役割を演じるような蛋白質である。Ｒｂ不活性化
物質の条件的変異体を生じるよう適合させ得る模範的な熱誘導性Ｎ−デグロンモ
ジュールの記載として、米国特許第５，７０５，３８７号及び同第５，５３８，
８６２号各明細書ならびにＤｏｈｍｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｓｃｉ ｅｎｃｅ ２６３； １２７３−６を参照されたい。To illustrate, one strategy to generate a temperature-sensitive Rb inactivator that does not require searching for a ts mutation in the gene of interest is an implantable, heat-inducible N-degron (N-
degron). N-degron is an intracellular degradation signal such that the essential determinant is the "destabilizing" N-terminal residue of the protein. A set of N-degrons containing different inactivating residues is known as the N-end rule.
le) and associates the half-life of the protein in vivo with the identity of the N-terminal residue. N-degron in eukaryotes consists of at least two determinants, the destabilizing N-terminal residue and the specific internal Lys residue (s) of the substrate.
Lys residues are the binding sites for multiubiquitin chains. Ubiquitin is a protein in which conjugation covalently linked to another protein plays a role in multiple cell processes, mainly through pathways involved in proteolysis. For descriptions of exemplary heat-inducible N-degron modules that can be adapted to generate conditional variants of Rb inactivators, see US Pat. Nos. 5,705,387 and 5,538,
862, and Dohmen et al. See 1273-6; (1994) Sci ence 263 .

【００９７】 さらに別の実施態様において、Ｒｂ不活性化物質の異所性発現は、ゲノムＤＮ
Ａでの相同組換えにより内生Ｒｂ不活性化遺伝子の転写調節配列を変える「遺伝
子活性化」構造の方法をとってもよい。例えば、遺伝子活性化構造は、ｂｍ−１
遺伝子のようなＲｂ不活性化遺伝子の内生プロモータを、異種プロモータ（例え
ば、Ｒｂ不活性化遺伝子の構成性発現を引き起こすもの、又は遺伝子の正常な発
現様式とは異なる条件下で遺伝子の誘導性発現を引き起こすもの）に置換しても
よい。遺伝子活性化構造として、様々な異なる形式が利用可能である。例えば、
Ｔｒａｎｓｋａｒｙｏｔｉｃ Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ， ＩｎｃのＰＣＴ国際特許
公開第９３／０９２２２号、同第９５／３１５６０号、同第９６／２９４１１号
、同第９５／３１５６０号、及び同第９４／１２６５０号各明細書を参照された
い。[0097] In yet another embodiment, the ectopic expression of the Rb inactivator is genomic DN
A method of "gene activation" structure in which the transcription regulatory sequence of the endogenous Rb inactivation gene is changed by homologous recombination at A may be employed. For example, the gene activation structure is bm-1
An endogenous promoter of an Rb-inactivated gene, such as a gene, may be converted to a heterologous promoter (eg, one that causes constitutive expression of the Rb-inactivated gene or inducible of the gene under conditions that are different from the normal mode of expression of the gene). Which causes expression). A variety of different formats are available for gene activation structures. For example,
See PCT International Patent Publication Nos. 93/0922, 95/31560, 96/29411, 95/31560, and 94/12650 of Transactional Therapies, Inc. .

【００９８】 そのような実施態様は、Ｒｂ不活性化物質が野生型遺伝子である場合に有用で
ある（過剰発現の場合に、遺伝子産物がＲｂチェックポイントを無視するため）
。例えば、サイクリンＤ１、ｃｄｋ４、ｃｄｋ６、ｃｄｃ２５Ａ、又はｂｍｉ−
１の過剰発現を、Ｒｂの抗増殖活性を無視する手段として用いてもよい。[0098] Such an embodiment is useful when the Rb inactivator is a wild-type gene (because in the case of overexpression, the gene product will ignore the Rb checkpoint).
. For example, cyclin D1, cdk4, cdk6, cdc25A, or bmi-
Overexpression of 1 may be used as a means to ignore the antiproliferative activity of Rb.

【００９９】 遺伝子活性化構造は、細胞に挿入されて、例えば未変性のＲｂ不活性化遺伝子
との操作的関連において異種調節配列を提供するような位置に、細胞のゲノムＤ
ＮＡを組込む。そのような挿入は、相同組換えにより起き、即ち内生Ｒｂ不活性
化遺伝子配列に相同的な活性化構造の組換え領域が、ゲノムＤＮＡにハイブリダ
イズして、その構造がゲノムＤＮＡの対応する位置に組込まれるようなゲノム配
列と組換える。The gene activation structure is inserted into the cell and places the genome D of the cell in a position such that it provides a heterologous regulatory sequence, eg, in an operational relationship with the native Rb inactivating gene.
Incorporate NA. Such insertion occurs by homologous recombination, ie, the recombination region of the activated structure homologous to the endogenous Rb inactivating gene sequence hybridizes to the genomic DNA, and the structure corresponds to that of the genomic DNA. Recombine with the genomic sequence to be integrated into the location.

【０１００】 用語「組換え領域」又は「標的配列」は、例えばゲノム遺伝子の５’フランキ
ング配列などのゲノム配列に実質的に同一又は実質的に相補的で、ゲノム配列と
標的トランスジーン構造との相同組換えを促進し得る配列を有する遺伝子活性化
構造のセグメント（即ち部分）を意味する。The term “recombination region” or “target sequence” is substantially identical or substantially complementary to a genomic sequence, for example, the 5 ′ flanking sequence of a genomic gene, and is identical to the genomic sequence and the target transgene structure. Means a segment (ie, part) of a gene activation structure having a sequence capable of promoting homologous recombination of the gene.

【０１０１】 本明細書に用いる用語「置換領域」は、組換え領域とゲノム配列との相同組換
えの後、内生染色体の位置に組込まれる活性化構造の一部を意味する。As used herein, the term “substitution region” refers to the part of the activation structure that becomes integrated at the location of the endogenous chromosome after homologous recombination between the recombination region and the genomic sequence.

【０１０２】 （例えば置換領域に提供される）異種調節配列は、プロモータ（構成性又は誘
導性プロモータなど）、エンハンサ、陰性調節要素、遺伝子座制御領域、転写因
子結合部位、又はその組合せなどの様々な要素の一つ以上を包含していてもよい
。インビボで標的遺伝子の発現を制御するために使用し得るプロモータ／エンハ
ンサには、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ／エンハンサ（Ｋａｒａ
ｓｕｙａｎａ ｅｔ ａｌ．， １９８９， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， １
６９：１３）、ヒトβ−アクチンプロモータ（Ｇｕｎｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．
（１９８７） ＰＮＡＳ ８４： ４８３１−４８３５）、マウス哺乳類腫瘍ウ
イルスの長い末端反復配列（ＭＭＴＶ ＬＴＲ）に存在するグルココルチコイド
誘導性プロモータ（Ｋｌｅｓｓｉｇ ｅｔ ａｌ． （１９８４） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ． ４：１３５４−１３６２）、モロニーマウス白血病ウイ
ルスの長い末端反復配列（ＭｕＬＶ ＬＴＲ）（Ｗｅｉｓｓ ｅｔ ａｌ． （
１９８５） ＲＮＡ Ｔｕｍｏｒ Ｖｉｒｕｓｅｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、ＳＶ４０初期又は後期領域プロモータ（Ｂｅｒｎ
ｏｉｓｔ ｅｔ ａｌ． （１９８１） Ｎａｔｕｒｅ ２９０：３０４−３１
０； Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９８４） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ
Ｂｉｏｌ．， ４：８１７；及びＳｐｒａｇｕｅ ｅｔ ａｌ． （１９８３
） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， ４５：７７３）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）の
長い３’末端反復配列に含有するプロモータ（Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．
，１９８０， Ｃｅｌｌ， ２２：７８７−７９７）、単純ヘルペスウイルス（
ＨＳＶ）チミジンキナーゼプロモータ／エンハンサ（Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ
．， （１９８１） ＰＮＡＳ ８２：３５６７−７１）、及び単純ヘルペスウ
イルスＬＡＴプロモータ（Ｗｏｌｆｅ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｎａｔｕ ｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ， １：３７９−３８４）が挙げられるが、これに限定
されない。[0102] The heterologous regulatory sequence (eg, provided in a replacement region) can be a variety of promoters (such as constitutive or inducible promoters), enhancers, negative regulatory elements, locus control regions, transcription factor binding sites, or combinations thereof. It may include one or more of the following elements. Promoters / enhancers that can be used to control target gene expression in vivo include the cytomegalovirus (CMV) promoter / enhancer (Kara)
suyana et al. , 1989, J.A. Exp. Med. , 1
69:13), the human β-actin promoter (Gunning et al.
(1987) PNAS 84: 4831-4835), a glucocorticoid-inducible promoter present in the long terminal repeat (MMTV LTR) of the mouse mammalian tumor virus (Klessig et al. (1984) Mol. Cell Biol . 4: 1354-1362) . ), Moloney murine leukemia virus long terminal repeat (MuLV LTR) (Weiss et al.
1985) RNA Tumor Viruses , Cold Spring
Harbor Laboratory, Cold Spring Harb
or, New York), SV40 early or late region promoter (Bern)
oist et al. (1981) Nature 290: 304-31.
0; Templeton et al. (1984) Mol. Cell
Biol. , 4: 817; and Sprague et al. (1983
J.). Virol. 45: 773), a promoter containing a long 3 'terminal repeat of Rous sarcoma virus (RSV) (Yamamoto et al.
, 1980, Cell, 22: 787-797), herpes simplex virus (
HSV) thymidine kinase promoter / enhancer (Wagner et al.
. , (1981) PNAS 82: 3567-71) and the herpes simplex virus LAT promoter (Wolfe et al. (1992) Nature Genetics , 1: 379-384).

【０１０３】 さらに別の実施態様において、置換領域は、（例えば発現を活性化するために
）未変性遺伝子の陰性転写制御要素を単に欠失させる。[0103] In yet another embodiment, the replacement region simply deletes the negative transcription control element of the native gene (eg, to activate expression).

【０１０４】 さらに別の実施態様において、内生Ｒｂ不活性化遺伝子の発現を活性化する膜
透過性薬物（例えば好ましくは有機小分子）は、同定することが可能である。In yet another embodiment, a membrane permeable drug (eg, preferably a small organic molecule) that activates expression of an endogenous Rb inactivating gene can be identified.

【０１０５】 細胞が培養で処理されるような実施態様において、Ｒｂ不活性化物質をコード
化するＲＮＡは、（例えばインビトロ転写で生じたＲＮＡから）細胞内に直接導
入してもよい。好ましい実施態様において、ＲＮＡは、好ましくは内生ヌクレア
−ゼ（例えばエキソヌクレアーゼ及び／又はエンドヌクレアーゼ）に抵抗性のあ
るポリヌクレオチドで修飾されている。そのようなＲＮＡポリヌクレオチドを生
成するために使用可能な模範的核酸修飾には、核酸のホスホルアミデート、ホス
ホチオエート、及びメチルホスホエート類似体（米国特許第５，１７６，９９６
号、同第５，２６４，５６４号、及び同第５，２５６，７７５号各明細書も参照
）、又はペプチド核酸（ＰＮＡ）が挙げられる。In embodiments where the cells are treated in culture, the RNA encoding the Rb inactivator may be introduced directly into the cells (eg, from RNA generated by in vitro transcription). In a preferred embodiment, the RNA is preferably modified with a polynucleotide that is resistant to endogenous nucleases (eg, exonucleases and / or endonucleases). Exemplary nucleic acid modifications that can be used to generate such RNA polynucleotides include phosphoramidate, phosphothioate, and methyl phosphoate analogs of nucleic acids (US Pat. No. 5,176,996)
No. 5,264,564, and 5,256,775), or peptide nucleic acid (PNA).

【０１０６】 主題の方法のさらに別の実施態様において、細胞内での組換え体の発現を必要
とせずに、Ｒｂ不活性化ポリペプチドを、その蛋白質が（例えば内在する）細胞
に取り込まれる条件下で、細胞と接触させることが可能である。例えば、主題の
方法の皮膚、粘膜などへの適用では、異所的に添加された蛋白質の経細胞輸送の
ために、様々な技術が開発されてきた。[0106] In yet another embodiment of the subject method, the Rb inactivating polypeptide is treated under conditions in which the protein is taken up into a cell (eg, an endogenous) without the need for expression of the recombinant in the cell. Below, it is possible to contact the cells. For example, in applying the subject methods to skin, mucous membranes, etc., various techniques have been developed for transcellular delivery of ectopically added proteins.

【０１０７】 模範的実施態様において、Ｒｂ不活性化物質は、経粘膜又は経皮的輸送で提供
される。そのような投与では、透過されるバリアに適正な浸透剤が、ポリペプチ
ドを伴った剤型で用いられる。そのような浸透剤は、一般に当該技術分野では公
知で、例えば経粘膜投与では、胆汁酸塩及びフシジン酸誘導体が挙げられる。加
えて、洗浄剤を用いて透過を促進してもよい。経粘膜投与は、点鼻スプレー又は
坐薬を用いてもよい。異所的投与では、本発明の蛋白質を当該技術分野で一般に
公知の外用薬、軟膏、ゲル、又はクリーム中に調製してもよい。例えば、Ｃｈｉ
ｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｓｃｉ． ７８：３
７６−３８６は、ペプチド及び蛋白質薬物の直流イオン導入経皮輸送を記載して
いる。Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎ ｅｔ ａｌ．， （１９８９） Ｊ． ＯｆＰｈ ａｒｍ． Ｓｃｉ． ７８：３７０−３７５は、経皮イオン導入薬物輸送（機械
的分析及びポリペプチド輸送への適用）を記載している。ＵＳＳＮ４，９４０，
４５６号明細書を参照されたい。[0107] In an exemplary embodiment, the Rb inactivator is provided by transmucosal or transdermal delivery. In such administration, a penetrant appropriate to the barrier to be permeated is used in the dosage form with the polypeptide. Such penetrants are generally known in the art, and include, for example, for transmucosal administration, bile salts and fusidic acid derivatives. In addition, a detergent may be used to enhance permeation. For transmucosal administration, nasal sprays or suppositories may be used. For ectopic administration, the proteins of the invention may be prepared in topical, ointment, gel, or cream preparations generally known in the art. For example, Chi
en et al. (1989) J. Pharm. Sci. 78: 3
76-386 describe direct current iontophoretic transdermal delivery of peptide and protein drugs. Srinivasan et al. , (1989) J. OfPharm . Sci. 78: 370-375 describes transdermal iontophoretic drug delivery (mechanical analysis and application to polypeptide delivery). USSN4,940,
See 456.

【０１０８】 ＵＳＳＮ５，４５９，１２７号明細書は、生物学的活性分子を細胞内輸送させ
るための陽イオン脂質の使用を記載している。 ＵＳＳＮ５，１９０，７６２号明細書は、蛋白質を生きた皮膚細胞に投与する
方法を記載している。[0108] USSN 5,459,127 describes the use of cationic lipids to transport biologically active molecules into cells. USSN 5,190,762 describes a method for administering a protein to living skin cells.

【０１０９】 別の実施態様において、ポリペプチドは、治療用ポリペプチドの細胞内局在化
を促進するために、細胞膜を通過する治療用ポリペプチド配列の細胞外形態をト
ランスロケーションさせる異種ペプチド配列（「内在性ペプチド」）を包含する
キメラポリペプチドとして提供される。これに関連して、治療用ポリペプチド配
列は、腫瘍抑制ポリペプチド、転写因子などのように細胞内では活性のものであ
る。内在性ペプチドは独力で、比較的高い割合で（例えば、トランスサイトーシ
スにより）細胞膜を通過することが可能である。内在性ペプチドは、（例えば融
合蛋白質として）Ｒｂ不活性化ポリペプチドにコンジュゲートする。得られたキ
メラポリペプチドは、活性化ポリペプチドのみに比べ、高い割合で細胞内に輸送
され、それにより（例えばＲｂ不活性化ポリペプチドの異所的適用性を高めるた
めに）適用される細胞内にキメラペプチドの導入を高める手段を提供する。In another embodiment, the polypeptide is a heterologous peptide sequence that translocates the extracellular form of the therapeutic polypeptide sequence across cell membranes to promote intracellular localization of the therapeutic polypeptide ( "Endogenous peptides"). In this context, a therapeutic polypeptide sequence is one that is active within a cell, such as a tumor suppressor polypeptide, a transcription factor, and the like. Endogenous peptides are capable of crossing cell membranes on their own and at a relatively high rate (eg, by transcytosis). The endogenous peptide is conjugated to the Rb inactivating polypeptide (eg, as a fusion protein). The resulting chimeric polypeptide is transported into cells at a higher rate than the activating polypeptide alone, and is thereby applied to cells (eg, to increase the ectopic applicability of the Rb inactivating polypeptide). Within which the introduction of the chimeric peptide is enhanced.

【０１１０】 一実施態様において、内在性ペプチドは、ショウジョウバエのａｎｔｅｐｅｎ
ｎｅｐｅｄｉａ蛋白質、又はその相同物に由来する。類似蛋白質（ｈｏｍｅｏ−
ｐｒｏｔｅｉｎ）のａｎｔｅｐｅｎｎｅｐｅｄｉａの６０アミノ酸長の長いホメ
オドメインが、生物学的膜をトランスロケーションすることは実証されており、
結合される異種ポリペプチドのトランスロケーションを促進することが可能であ
る。例えばＤｅｒｏｓｓｉ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈ ｅｍ ２６９：１０４４４−１０４５０；及びＰｅｒｅｚ ｅｔ ａｌ． （１
９９２） Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ １０２：７１７−７２２を参照されたい。近
年、この蛋白質のわずか１６アミノ酸長の断片で、十分に内在させることが実証
された。Ｄｅｒｏｓｓｉ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅ ｍ ２７１：１８１８８−１８１９３を参照されたい。本発明は、Ｒｂ不活性化
ポリペプチドに比べ、キメラ蛋白質の膜透過輸送を統計学的に有意な量増加させ
るのに十分な、少なくとも１つのＲｂ不活性化ポリペプチド配列及び少なくとも
一部のａｎｔｅｐｅｎｎｅｐｅｄｉａ蛋白質（又はその相同物）を含んでなるキ
メラ蛋白質を予期する。In one embodiment, the endogenous peptide is Drosophila antepen
nepedia protein or a homolog thereof. Similar protein (homeo-
It has been demonstrated that the 60 amino acid long homeodomain of protein) antenennepedia translocates biological membranes,
It is possible to facilitate translocation of the heterologous polypeptide to be bound. See, for example, Derossi et al. (1994) J Biol Ch em 269 : 10444-10450; and Perez et al. (1
992) J Cell Sci 102: 717-722. Recently, it has been demonstrated that only a 16 amino acid long fragment of this protein is sufficiently internalized. Derossi et al. (1996) J Biol Che m 271 : 18188-18193 , which is incorporated herein by reference. The present invention provides for at least one Rb-inactivating polypeptide sequence and at least a portion of an antenopenedia sufficient to increase the transmembrane transport of the chimeric protein in a statistically significant amount relative to the Rb-inactivating polypeptide. Contemplate chimeric proteins comprising the protein (or homologs thereof).

【０１１１】 内在性ペプチドの別の例は、ＨＩＶトランスアクチベータ（ＴＡＴ）蛋白質で
ある。この蛋白質は、４つのドメインに分けられるようである（Ｋｕｐｐｕｓｗ
ａｍｙ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｎｕｃｌ． Ａｃａｄｓ Ｒｅｓ， １
７：３５５１−３５６１）。精製したＴＡＴ蛋白質は、組織培養で細胞に取り込
まれ（Ｆｒａｎｋｅｌ ａｎｄ Ｐａｂｏ， （１９８９） Ｃｅｌｌ ５５：
１１８９−１１９３）、ＴＡＴの３７〜６２番目の残基に対応する断片は、イン
ビトロで細胞に急速に取り込まれる（Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｌｏｅｗｅｎｓｔｅ
ｉｎ， （１９８９） Ｃｅｌｌ ５５：１１７９−１１８８）。高塩基性領域
は、内在化及び内在部分の核へのターゲティングを介する（Ｒｕｂｅｎ ｅｔ
ａｌ．， （１９８９） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６３：１−８）。ＧＦＴＫＡＬ
ＧＩＳＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱＧＳのような高塩基性領域に存在する配列
を包含するペプチド又は類似体は、Ｒｂ不活性化ポリペプチドにコンジュゲート
して、内在化及びそれらの蛋白質の細胞内環境へのターゲティングを援助する。[0111] Another example of an endogenous peptide is the HIV transactivator (TAT) protein. This protein appears to be divided into four domains (Kuppusw
amy et al. (1989) Nucl. Acads Res , 1
7: 3551-3561). Purified TAT protein is taken up by cells in tissue culture (Frankel and Pabo, (1989) Cell 55:
1189-1193), a fragment corresponding to residues 37-62 of TAT is rapidly taken up by cells in vitro (Green and Lowenwenste).
in, (1989) Cell 55: 1179-1188). Highly basic regions are mediated through internalization and targeting of the intrinsic moiety to the nucleus (Ruben et al.
al. , (1989) J. Virol . 63: 1-8). GFTKAL
Peptides or analogs containing sequences present in highly basic regions, such as GISYGRKKRRQRRRPPQGS, conjugate to Rb-inactivating polypeptides to aid internalization and targeting of those proteins to the intracellular environment.

【０１１２】 十分なマストパラン部分を包含する（Ｔ． Ｈｉｇａｓｈｉｋｉｍａ ｅｔ
ａｌ．， （１９９０） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６５：１４１７６
）別の模範的細胞透過性ポリペプチドを生成して、キメラ蛋白質の膜透過輸送を
増加させてもよい。Includes a sufficient mastoparan moiety (T. Higasikima et.
al. , (1990) J. Am. Biol. Chem. 265: 14176
3.) Another exemplary cell permeable polypeptide may be generated to increase transmembrane transport of the chimeric protein.

【０１１３】 いずれの特別な理論にも結び付ける意図はないが、レセプター仲介トランスサ
イトーシスにより膜を通過することが可能な輸送可能ペプチドにポリペプチドを
結合又はコンジュゲートさせることにより、親水性ポリペプチドが膜バリアを通
して生理学的に輸送し得ることは注目に値する。この種の好適な内在性ペプチド
は、例えばヒストン、インシュリン、トランスフェリン、塩基性アルブミン、プ
ロラクチン、及びインシュリン様増殖因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、インシュリン様増
殖因子ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）、又は別の増殖因子の全て又は一部を用いて、生成
することが可能である。例えば、毛細細胞上のインシュリン受容体への親和性を
示し、血糖値減少においてインシュリンよりも効果が低いインシュリン断片は、
レセプター仲介トランスサイトーシスによる膜透過輸送が可能であり、そのため
主題の細胞透過ポリペプチドのための内在性ペプチドとして作用し得ることが見
出されている。好ましい増殖因子由来内在性ペプチドには、ＣＭＨＩＥＳＬＤＳ
ＹＴＣ及びＣＭＹＩＥＡＬＤＫＹＡＣのようなＥＧＦ（上皮細胞増殖因子）由来
ペプチド；ＴＧＦ−β（形質転換増殖因子β）由来ペプチド；ＰＤＧＦ（血小板
由来増殖因子）又はＰＤＧＦ−２由来ペプチド；ＩＧＦ−Ｉ（インシュリン様増
殖因子）又はＩＧＦ−ＩＩ由来ペプチド；及びＦＧＦ（線維芽細胞増殖因子）由
来ペプチドが挙げられる。[0113] Without intending to be bound by any particular theory, by attaching or conjugating the polypeptide to a transportable peptide capable of crossing a membrane by receptor-mediated transcytosis, the hydrophilic polypeptide is It is notable that physiological transport through the membrane barrier is possible. Suitable endogenous peptides of this type include, for example, histone, insulin, transferrin, basic albumin, prolactin, and insulin-like growth factor I (IGF-I), insulin-like growth factor II (IGF-II), or another growth factor. It can be generated using all or some of the factors. For example, an insulin fragment that shows an affinity for the insulin receptor on capillary cells and is less effective than insulin in reducing blood glucose,
It has been found that transmembrane transport by receptor-mediated transcytosis is possible, and thus can act as an endogenous peptide for the subject cell-penetrating polypeptide. Preferred endogenous peptides derived from growth factors include CMHIIESLDS
EGF (epidermal cell growth factor) -derived peptides such as YTC and CMYIEALDKYAC; peptides derived from TGF-β (transforming growth factor β); peptides derived from PDGF (platelet-derived growth factor) or PDGF-2; IGF-I (insulin-like growth) Factor) or an IGF-II-derived peptide; and an FGF (fibroblast growth factor) -derived peptide.

【０１１４】 トランスロケートするペプチド／内在性ペプチドの別の種類は、ｐＨ依存性膜
結合を呈する。酸性ｐＨでらせん状コンホメーションを仮定する内在性ペプチド
では、内在性ペプチドが、両親媒性の特性を獲得している（例えば、内在性ペプ
チドが疎水性及び親水性の両界面を有する）。より明確には、約５．０〜５．５
のｐＨ範囲内で内在性ペプチドは、その部分が標的膜へ挿入されるのを促進する
αらせん両親媒性構造を形成する。αらせんが誘導する酸性ｐＨ環境は、例えば
細胞エンドソーム内に存在する低ｐＨ環境に見出される。そのような内在性ペプ
チドを用いて、エンドソーム様コンパートメントから細胞質までのエンドサイト
ーシス機序により取り込まれるＲｂ不活性化ポリペプチドの輸送を促進すること
が可能である。Another class of translocating / endogenous peptides exhibits pH-dependent membrane binding. For endogenous peptides that assume a helical conformation at acidic pH, the endogenous peptide has acquired amphiphilic properties (eg, the endogenous peptide has both hydrophobic and hydrophilic interfaces). More specifically, about 5.0 to 5.5
Within this pH range, the endogenous peptide forms an α-helical amphipathic structure that facilitates its insertion into the target membrane. The acidic pH environment induced by the alpha helix is found, for example, in a low pH environment present in cellular endosomes. Such endogenous peptides can be used to facilitate the transport of Rb-inactivating polypeptides that are taken up by endocytic mechanisms from the endosomal compartment to the cytoplasm.

【０１１５】 好ましいｐＨ依存性膜結合内在性ペプチドは、グルタミン、メチオニン、アラ
ニン、及びロイシンのようならせん形成残基を高割合で包含する。加えて、好ま
しい内在性ペプチド配列は、十分に充電されていない膜結合ドメインがｐＨ５の
ペプチド内に存在して標的細胞膜に挿入されるよう、ｐＨ５〜７の範囲内のｐＫ
ａを有するイオン化可能な残基を包含する。Preferred pH-dependent membrane-bound endogenous peptides include a high proportion of helix-forming residues such as glutamine, methionine, alanine, and leucine. In addition, preferred endogenous peptide sequences are those that have a pK in the range of pH 5-7 such that the poorly charged membrane binding domain is present in the pH 5 peptide and inserted into the target cell membrane.
Includes ionizable residues having a.

【０１１６】 これに関連して、特に好ましいｐＨ依存性膜結合内在性ペプチドは、Ｓｕｂｂ
ａｒａｏ他（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６：２９６４， １９８７）のペプ
チド配列の修飾を表すａａ１−ａａ２−ａａ３−ＥＡＡＬＡ（ＥＡＬＡ）４−Ｅ
ＡＬＥＡＬＡＡ−アミドである。このペプチド配列内では、最初のアミノ酸残基
（ａａ１）は、好ましくは内在性ペプチドの標的蛋白質コンジュゲートへの化学
的コンジュゲーションを促進する、システイン又はリジンのような独特の残基で
ある。２〜３番目のアミノ酸残基は、異なった膜に対する内在性ペプチドの親和
性を調整するように選択してもよい。例えば、２番目及び３番目の残基の両者が
、リジン又はアルギニンである場合には、内在性ペプチドは負の表面電荷を有す
る膜又は脂質断片に結合する能力を有する。２〜３番目の残基が中性アミノ酸の
場合には、内在性ペプチドは中性膜に挿入される。In this context, a particularly preferred pH-dependent membrane-bound integral peptide is Subb
aal-aa2-aa3-EAALA (EALA) 4-E representing a modification of the peptide sequence of arao et al. ( Biochemistry 26: 2964, 1987).
ALEALAA-amide. Within this peptide sequence, the first amino acid residue (aa1) is a unique residue, such as cysteine or lysine, which preferably facilitates chemical conjugation of the endogenous peptide to the target protein conjugate. The second and third amino acid residues may be selected to adjust the affinity of the endogenous peptide for different membranes. For example, if both the second and third residues are lysine or arginine, the endogenous peptide has the ability to bind to negatively charged membranes or lipid fragments. If the second and third residues are neutral amino acids, the endogenous peptide is inserted into the neutral membrane.

【０１１７】 さらに別の好ましい内在性ペプチドには、アポリポ蛋白質Ａ−１及びＢのペプ
チド；メリチン、ボンボリチン（ｂｏｍｂｏｌｉｔｔｉｎ）、デルタヘモリジン
、及びパルダキシンのようなペプチドトキシン；アラメチシンのような抗生物質
ペプチド、カルシトニン、コルチコトロフィン放出因子、βエンドルフィン、グ
ルカゴン、副甲状腺ホルモン、膵臓ポリペプチドのようなペプチドホルモン；及
び数多くの分泌蛋白質のシグナル配列に対応するペプチド、が挙げられる。加え
て、模範的内在性ペプチドは、酸性ｐＨで内在性ペプチドのαらせん性を高める
置換基の結合により修飾されていてもよい。Still other preferred endogenous peptides include peptides of apolipoproteins A-1 and B; peptide toxins such as melittin, bombolittin, deltahaemolysin, and pardaxin; antibiotic peptides such as alamethicin; Calcitonin, corticotrophin-releasing factor, β-endorphin, glucagon, parathyroid hormone, peptide hormones such as pancreatic polypeptides; and peptides corresponding to the signal sequences of a number of secreted proteins. In addition, exemplary endogenous peptides may be modified by attachment of substituents that increase the alpha-helicality of the endogenous peptide at acidic pH.

【０１１８】 本発明内での使用に好適な内在性ペプチドのさらに別の分類は、生理学的ｐＨ
では「隠れている」が、標的細胞のエンドソームの低ｐＨ環境では発現される疎
水性ドメインを包含する。ｐＨ誘導性アンフォールディング及び疎水性ドメイン
の暴露の際、その部分は脂質二重層に結合して、共有結合したポリペプチドの細
胞質へのトランスロケーションを実行する。そのような内在性ペプチドは、例え
ばシュードモナス体外毒素Ａ、クラスリン、又はジフテリア毒素で同定された配
列の後ろに設計してもよい。[0118] Yet another class of endogenous peptides suitable for use within the invention is physiological pH.
Include a hydrophobic domain that is expressed in the low pH environment of the endosome of the target cell. Upon pH-induced unfolding and exposure of the hydrophobic domain, the moiety binds to the lipid bilayer and performs translocation of the covalently bound polypeptide into the cytoplasm. Such endogenous peptides may be designed after sequences identified, for example, for Pseudomonas exotoxin A, clathrin, or diphtheria toxin.

【０１１９】 孔形成蛋白質又はペプチドを、本明細書での内在性ペプチドとして作用させて
もよい。孔形成蛋白質又はペプチドは、例えばＣ９補体蛋白質、細胞溶解性Ｔ細
胞分子、又はＮＫ細胞分子から得ても、又は由来してもよい。これらの部分は、
膜内で環状構造を形成することが可能で、それにより膜を通して細胞内部への結
合ポリペプチドの輸送を可能にする。A pore-forming protein or peptide may act as an endogenous peptide herein. The pore forming protein or peptide may be obtained or derived from, for example, a C9 complement protein, a cytolytic T cell molecule, or an NK cell molecule. These parts are
A cyclic structure can be formed within the membrane, thereby allowing transport of the binding polypeptide through the membrane and into the interior of the cell.

【０１２０】 内在性ペプチドの単なる膜挿入が、細胞膜を通したポリペプチド（例えばＲｂ
不活性化蛋白質）のトランスロケーションに十分な場合もある。しかし、トラン
スロケーションは、細胞内酵素（即ち「補助的ペプチド（ａｃｃｅｓｓｏｒｙ
ｐｅｐｔｉｄｅ）」）の基質を内在性ペプチドに結合させるにことにより改善さ
せてもよい。補助的ペプチドが、細胞膜を通して細胞質面に突出する内在性ペプ
チドの一部に結合することが好ましい。補助的ペプチドは、有利にはトランスロ
ケーション／内在性部分又は固定ペプチド（ａｎｃｈｏｒｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄ
ｅ）の一末端に結合してもよい。本発明の補助的部分は、一つ以上のアミノ酸残
基を含有してもよい。一実施態様において、補助的部分は、細胞内リン酸化の基
質を提供してもよい（例えば補助的ペプチドがチロシン残基を含有してもよい）
。[0120] Membrane insertion of an endogenous peptide simply results in the polypeptide (eg, Rb
In some cases, it may be sufficient for translocation of the inactivated protein). However, translocation does not involve intracellular enzymes (ie, "accessory peptides").
Peptides ") may be improved by coupling the substrate to an endogenous peptide. Preferably, the auxiliary peptide binds to a portion of the endogenous peptide that protrudes through the cell membrane to the cytoplasmic surface. The auxiliary peptide is advantageously a translocation / endogenous moiety or an anchoring peptide.
e) It may be attached to one terminal. The auxiliary part of the present invention may contain one or more amino acid residues. In one embodiment, the auxiliary moiety may provide a substrate for intracellular phosphorylation (eg, the auxiliary peptide may contain a tyrosine residue).
.

【０１２１】 これに関連する模範的な補助的部分は、ＧＮＡＡＡＡＲＲのようなＮ−ミリス
トイルトランスフェラーゼのペプチド基質である（Ｅｕｂａｎｋｓ ｅｔ ａｌ
．， ｉｎ ：Ｐｅｐｔｉｄｅｓ． Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏ ｇｙ ， Ｇａｒｌａｎｄ Ｍａｒｓｈａｌｌ （ｅｄ．）， ＥＳＣＯＭ， Ｌ
ｅｉｄｅｎ， １９８８， ｐｐ． ５６６−６９）。この構造では、Ｎ−末端
グリシンが補助的部分の活性に重要であるため、内在性ペプチドは補助的ペプチ
ドのＣ−末端に結合する。Ｃ−末端でのＲｂ不活性化ポリペプチドに結合する際
、このハイブリッドペプチドは、Ｎ−ミリスチル化されて、さらに標的細胞膜に
固定される（例えば、それは細胞膜でポリペプチドの局部濃度を増加させるよう
作用する）。An exemplary auxiliary moiety in this regard is the peptide substrate of an N-myristoyltransferase such as GNAAAARR (Eubanks et al.
. , In: Peptides. Chemistry and Biology, Galland Marshall (ed.), ESCOM, L
eiden, 1988, pp. 566-69). In this structure, the endogenous peptide is attached to the C-terminus of the auxiliary peptide because the N-terminal glycine is important for the activity of the auxiliary moiety. Upon binding to the Rb-inactivating polypeptide at the C-terminus, the hybrid peptide is N-myristylated and further anchored to the target cell membrane (eg, it increases the local concentration of the polypeptide at the cell membrane. Works).

【０１２２】 補助的ペプチドの使用をさらに説明すると、リン酸化可能な補助的ペプチドを
、最初に内在性ペプチドのＣ−末端に共有結合させ、その後Ｒｂ不活性化ポリペ
プチドによる融合蛋白質に組込む。融合蛋白質のペプチド成分は、標的細胞の形
質膜に挿入され、その結果補助的ペプチドが膜を通してトランスロケーションさ
れ、標的細胞の細胞質に突出する。形質膜の細胞質側では、補助的ペプチドが細
胞内キナーゼにより中性ｐＨでリン酸化される。一旦リン酸化されると、補助的
ペプチドは融合蛋白質を不可逆的に膜に固定するように作用する。細胞表面の膜
への局在化は、ポリペプチドの細胞質へのトランスロケーションを高めることが
可能である。To further illustrate the use of auxiliary peptides, a phosphorylatable auxiliary peptide is first covalently attached to the C-terminus of an endogenous peptide and then incorporated into a fusion protein with an Rb-inactivating polypeptide. The peptide component of the fusion protein is inserted into the plasma membrane of the target cell, such that the auxiliary peptide is translocated through the membrane and projects into the cytoplasm of the target cell. On the cytoplasmic side of the plasma membrane, auxiliary peptides are phosphorylated at neutral pH by intracellular kinases. Once phosphorylated, the auxiliary peptide acts to irreversibly anchor the fusion protein to the membrane. Localization of the cell surface to the membrane can enhance translocation of the polypeptide to the cytoplasm.

【０１２３】 好適な補助的ペプチドには、キナーゼ基質であるペプチド、単一の正電荷を保
有するペプチド、及び膜結合グリコトランスフェラーゼによりグリコシル化され
る配列を含有するペプチドが挙げられる。膜結合グリコトランスフェラーゼによ
りグリコシル化される補助的ペプチドは、配列ｘ−ＮＬＴ−ｘ（式中、ｘは例え
ば別のペプチド、アミノ酸、カップリング剤、又は疎水性分子であってもよい）
を包含してもよい。この疎水性トリペプチドを、ミクロソーム小胞とインキュベ
ートする場合、それが小胞膜を透過し、管腔側でグリコシル化され、その親水性
により小胞内に捕らえられる（Ｃ． Ｈｉｒｓｃｈｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，
（１９８７） Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ５６：６３−８７）。
こうして、配列ｘ−ＮＬＴ−ｘを含有する補助的ペプチドは、対応するポリペプ
チドの標的細胞での貯留を高める。Suitable auxiliary peptides include peptides that are kinase substrates, peptides that carry a single positive charge, and peptides that contain sequences that are glycosylated by membrane-bound glycotransferases. The auxiliary peptide that is glycosylated by the membrane-bound glycotransferase has the sequence x-NLT-x, where x may be, for example, another peptide, amino acid, coupling agent, or hydrophobic molecule.
May be included. When this hydrophobic tripeptide is incubated with microsomal vesicles, it penetrates the vesicle membrane, is glycosylated on the luminal side, and is trapped within the vesicle by its hydrophilicity (C. Hirschberg et al.,
(1987) Ann. Rev .. Biochem. 56: 63-87).
Thus, an auxiliary peptide containing the sequence x-NLT-x enhances the retention of the corresponding polypeptide in target cells.

【０１２４】 本発明のこの態様の別の実施態様において、補助的ペプチドを用いて、Ｒｂ不
活性化ポリペプチドの標的細胞との相互作用を高めることが可能である。これに
関連する模範的な補助的ペプチドは、配列「ＲＧＤ」を含有する細胞接着性蛋白
質に由来するペプチド、又は配列ＣＤＰＧＹＩＧＳＲＣを含有するラミニン由来
ペプチドを包含する。フィブロネクチン及びラミニンのような細胞外マトリック
ス糖蛋白質は、レセプター仲介プロセスで細胞表面に結合する。トリペプチド配
列ＲＧＤは、細胞表面受容体への結合に必要であると認められてきた。この配列
は、フィブロネクチン、ビトロネクチン、補体のＣ３ｂｉ、フォン・ウィルブラ
ンド因子、ＥＧＦ受容体、形質転換増殖因子β、Ｉ型コラーゲン、大腸菌のλ受
容体、フィブリノーゲン、及びシンドビスコート蛋白質に存在する（Ｅ． Ｒｕ
ｏｓｌａｈｔｉ， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ５７：３７５−４
１３． １９８８）。ＲＧＤ配列を認識する細胞表面受容体は、「インテグリン
」と呼ばれる関連蛋白質のスーパーファミリーに群別されてきた。細胞表面イン
テグリンへの「ＲＧＤペプチド」の結合は、ポリペプチドの細胞表面貯留及び最
終的にはトランスロケーションを促進する。In another embodiment of this aspect of the invention, an auxiliary peptide can be used to enhance the interaction of the Rb inactivating polypeptide with the target cell. Exemplary auxiliary peptides in this context include those derived from cell adhesion proteins containing the sequence "RGD" or laminin derived peptides containing the sequence CDPGYIGSRC. Extracellular matrix glycoproteins such as fibronectin and laminin bind to the cell surface in a receptor-mediated process. The tripeptide sequence RGD has been recognized as required for binding to cell surface receptors. This sequence is present in fibronectin, vitronectin, complement C3bi, von Willebrand factor, EGF receptor, transforming growth factor β, type I collagen, E. coli λ receptor, fibrinogen, and Sindbis coat protein ( E. Ru
oslahti, Ann. Rev .. Biochem . 57: 375-4
13. 1988). Cell surface receptors that recognize RGD sequences have been grouped into a superfamily of related proteins called "integrins". Binding of the "RGD peptide" to cell surface integrins promotes cell surface retention and ultimately translocation of the polypeptide.

【０１２５】 上記のように、内在性蛋白質及び補助的蛋白質は、化学的架橋又は融合蛋白質
の形態のいずれかにより、それぞれ独自にＲｂ不活性化ポリペプチドに付加して
もよい。融合蛋白質の例では、未構築のポリペプチドリンカーは、各ペプチド部
分の間に包含されてもよい。As noted above, the endogenous protein and the auxiliary protein may each be independently added to the Rb inactivating polypeptide, either by chemical crosslinking or in the form of a fusion protein. In the example of a fusion protein, an unconstructed polypeptide linker may be included between each peptide moiety.

【０１２６】 一般に、内在性ペプチドは、ポリペプチドの運搬も十分に指示する。しかし、
ＲＧＤ配列のような補助的ペプチドが提供される場合には、宿主細胞からの融合
蛋白質の運搬を指示する分泌シグナル配列を包含することが必要な場合がある。
好ましい実施態様において、分泌シグナル配列は、最後のＮ−末端に位置し、（
任意に）分泌シグナルと融合蛋白質の残り部分の間にある蛋白質分解部位により
フランキングされる。In general, endogenous peptides also sufficiently direct the delivery of a polypeptide. But,
Where an ancillary peptide such as an RGD sequence is provided, it may be necessary to include a secretory signal sequence that directs delivery of the fusion protein from the host cell.
In a preferred embodiment, the secretory signal sequence is located at the last N-terminus, (
(Optionally) flanked by proteolytic sites between the secretion signal and the rest of the fusion protein.

【０１２７】 模範的実施態様において、Ｒｂ不活性化ポリペプチドは、Ｎｄｅｌ−ＥｃｏＲ
１断片：[0127] In an exemplary embodiment, the Rb inactivating polypeptide is Ndel-EcoR.
One fragment:

【化１】 中に提供されるヌクレオチド配列によりコード化されるように、インテグリン結
合ＲＧＤペプチド／ＳＶ４０核局在化シグナルを包含して、するよう操作され（
例えば、Ｈａｒｔ ＳＬ ｅｔ ａｌ．， １９９４； Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃ
ｈｅｍ．，２６９：１２４６８−１２４７４を参照）、ＲＧＤ／ＳＶ４０ヌクレ
オチド配列：ＭＧＧＣＲＧＤＭＦＧＣＧＡＰＰ−ＫＫＫＲＫＶＡＧＦをコード化
する。別の実施態様において、その蛋白質は例えばＮｄｅｌ−ＥｃｏＲ１断片：Embedded image Engineered to include and include the integrin-binding RGD peptide / SV40 nuclear localization signal as encoded by the nucleotide sequence provided therein (
For example, Hart SL et al. J., 1994; Biol. C
hem. , 269: 12468-12474), encoding the RGD / SV40 nucleotide sequence: MGGCRGGDMFCGAPP-KKKKRKVAGF. In another embodiment, the protein is, for example, a Ndel-EcoR1 fragment:

【化２】 に提供される、ＨＩＶ−１ｔａｔ（１−７２）ポリペプチドにより操作されても
よく、ＨＩＶ−１ｔａｔ（１−７２）ペプチド配列：Embedded image The HIV-1 tat (1-72) polypeptide sequence may be engineered by the HIV-1 tat (1-72) polypeptide provided in:

【化３】 をコード化する。さらに別の実施態様において、融合蛋白質はＮｄｅｌ−Ｅｃｏ
Ｒ１断片：Embedded image Code. In yet another embodiment, the fusion protein is Ndel-Eco
R1 fragment:

【化４】 により提供されるＨＳＶ−１ ＶＰ２２ポリペプチド（Ｅｌｌｉｏｔｔ Ｇ．，
Ｏ’Ｈａｒｅ Ｐ （１９９７） Ｃｅｌｌ， ８８：２２３−２３３）を包
含し、配列：Embedded image HSV-1 VP22 polypeptide provided by (Elliott G.,
O'Hare P (1997) Cell , 88 : 223-233), and the sequence:

【化５】 を有するＨＳＶ−１ ＶＰ２２ペプチドをコード化する。 さらに別の実施態様において、融合蛋白質は例えばヌクレオチド配列（Ｎｄｅ
１−ＥｃｏＲ１断片）：Embedded image Encodes the HSV-1 VP22 peptide having In yet another embodiment, the fusion protein is, for example, a nucleotide sequence (Nde
1-EcoR1 fragment):

【化６】 からのＶＰ２２蛋白質のＣ−末端ドメインを包含し、ＶＰ２２（Ｃ−末端ドメイ
ン）ペプチド配列：ＭＤＶＤＡＡＴＡＴＲＧＲＳＡＡＳＲＰＴＥＲＰＲＡＰＡＲ
ＳＡＳＲＰＲＲＰＶＥをコード化する。Embedded image Including the C-terminal domain of the VP22 protein from VP22 (C-terminal domain) peptide sequence: MDVDAATATRGRSASARPTERPPARPAR
Encode SASRPRRPVE.

【０１２８】 さらに別の実施態様において、Ｒｂ不活性化物質は、Ｒｂ又はｐ１６機能の小
分子阻害物質である。 例えば、適切な程度まで、サイクリン又はＲｂキナーゼのような未変性Ｒｂ不
活性化物質の細胞内レベルを、自然の回転率を阻害することによりアップレギュ
レートしてもよい。例えば、蛋白質のユビキチン依存性又は独立性分解の阻害物
質を用いて、細胞内蛋白質の濃度が人口的に上昇され得る程度に、蛋白質の異所
性発現を引き起こしてもよい。（例えば、サイクリンＤ１のようなＲｂ不活性化
物質のユビキチン化（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ）の阻害物質を検出するた
めに容易に適合し得る）ユビキチン化阻害物質の検出アッセイは、例えば米国特
許第５，７４４，３４３号、同第５，８４７，０９４号、同第５，８４７，０７
６号、同第５，８３４，４８７号、同第５，８１７，４９４号、同第５，７８０
，４５４号、及び同第５，７６６，９２７号各明細書のような文献に記載されて
いる。同様に、リン酸化のような別の転写後修飾が蛋白質安定性に影響する程度
まで、本発明は適正なキナーゼ又はホスファターゼ阻害物質のような修飾の阻害
物質の使用を予測する。In yet another embodiment, the Rb inactivator is a small molecule inhibitor of Rb or p16 function. For example, to an appropriate extent, intracellular levels of a native Rb inactivator, such as cyclin or Rb kinase, may be upregulated by inhibiting natural turnover. For example, inhibitors of ubiquitin-dependent or independent degradation of the protein may be used to cause ectopic expression of the protein to the extent that intracellular protein concentrations can be increased population-wise. A detection assay for ubiquitination inhibitors (e.g., easily adaptable to detect inhibitors of ubiquitination of Rb inactivators such as cyclin D1) is described, for example, in US Pat. No. 5,744,744. No. 343, No. 5,847,094, No. 5,847,07
No. 6, No. 5,834,487, No. 5,817,494, No. 5,780
, 454, and 5,766,927. Similarly, to the extent that other post-transcriptional modifications, such as phosphorylation, affect protein stability, the present invention contemplates the use of inhibitors of the modification, such as appropriate kinase or phosphatase inhibitors.

【０１２９】 さらに別の実施態様において、主題の方法は、薬剤（例えば、Ｒｂの脱リン酸
化又は少なくともＲｂのために次亜リン酸化されたもの（ｐ１１５／ｈｙｐｏ）
の形成を阻害する有機小分子）により実践してもよい。そのような薬剤は、ホス
ファターゼ阻害物質又はキナーゼ活性化物質であってもよい。Ｒｂ活性は、特異
的蛋白質−セリン／トレオニンホスファターゼ活性により介される。ＲＢは、活
性化された１型蛋白質−セリン／トレオニンホスファターゼ活性（ＰＰ１）によ
り脱リン酸化されるようになる。Ｌｕｄｌｏｗ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １３：３６７；及びＤｕｒｆｅｅ ｅｔ ａｌ．
（１９９３） Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ ７：５５５。事実、カリキュリンＡのよ
うな特異的蛋白質−セリン／トレオニンホスファターゼ阻害物質の添加は、ｐ１
１５／ｈｙｐｏの形成を効果的に妨害することが可能である。Ａｎ ｅｔ ａｌ
． （１９９６） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５６：４３８を参照されたい。 以下にさらに詳細に記載するように、Ｒｂ不活性化物質の使用は、インビボ、
インビトロ、エクスビボで細胞を処理するために用いてもよい。In yet another embodiment, the subject method comprises treating the agent (eg, dephosphorylating Rb)
Or hypophosphorylated for at least Rb (p115 / hypo)
(A small organic molecule that inhibits the formation of). Such drugs are
It may be a fatase inhibitor or a kinase activator. Rb activity is specific
Protein-mediated by serine / threonine phosphatase activity. RB is active
Activated type 1 protein-by serine / threonine phosphatase activity (PP1)
Dephosphorylation. Ludlow et al. (1993) Mol Cell Biol 13: 367; and Durfey et al.
 (1993)Genes Dev 7: 555. In fact, it ’s Caliculin A
The addition of a specific protein-serine / threonine phosphatase inhibitor such as
It is possible to effectively prevent the formation of 15 / hypo. An et al
. (1996)Cancer Res 56: 438. As described in more detail below, the use of Rb inactivators can be used in vivo,
It may be used to treat cells in vitro, ex vivo.

【０１３０】 Ｂ．ｒａｓ時計（ｒａｓ ｃｌｏｃｋ）の不活性化 Ｍ０へのアプローチは、漸進的方法である。実際に、正常細胞は外植後直ちに
は老化せず、複製能力がなくなる前に、複数回の細胞数倍加を果たす。この間に
、ｐ１６の存在量が連続して増加する。これらの観察は、Ｍ０休止が、結局は細
胞を圧倒する累積増殖阻害のシグナリングからもたらされることを示唆している
。我々は、Ｐｂ／ｐ１６ＩＮＫ４ａ経路に加えて、腫瘍蛋白質ｒａｓが最終的に
複製老化を引き起こす累積シグナルをもたらすシグナルを提供することを測定し
た。ｒａｓ依存性老化の特定の態様は、Ｒｂ／ｐ１６ＮＫ４ａ経路とは独立して
いてもよい。B. The approach to the inactivation of the ras clock M0 is a gradual approach. In fact, normal cells do not age immediately after explantation and undergo multiple cell doublings before they lose replication competence. During this time, the abundance of p16 continuously increases. These observations suggest that M0 quiescence results from signaling of cumulative growth inhibition that ultimately overwhelms cells. We have determined that, in addition to the Pb / p16INK4a pathway, the oncoprotein ras provides a signal that ultimately results in a cumulative signal that triggers replicative senescence. Certain aspects of ras-dependent senescence may be independent of the Rb / p16NK4a pathway.

【０１３１】 したがって、上記Ｒｂ阻害物質の利用に加えて、又はその代わりに、主題の方
法がｒａｓ依存性複製老化を阻害する薬剤を利用してもよい。好ましい実施態様
において、「ｒａｓ阻害物質」は、ｒａｓ／Ｒａｆ／ＭＫＫ／ＭＡＰキナーゼ経
路の薬剤（好ましくは小分子阻害物質）である。Thus, in addition to, or in lieu of, the use of Rb inhibitors described above, the subject methods may utilize an agent that inhibits ras-dependent replication senescence. In a preferred embodiment, a "ras inhibitor" is an agent (preferably a small molecule inhibitor) of the ras / Raf / MKK / MAP kinase pathway.

【０１３２】 そのような阻害物質の利用において、有糸***を妨害する閾値濃度未満に限り
ｒａｓ依存性老化が回避されるよう、添加される阻害物質の用量を適正な濃度に
滴定する必要があると思われる。In the use of such inhibitors, the dose of added inhibitor must be titrated to the proper concentration so that ras-dependent senescence is avoided only below a threshold concentration that prevents mitosis. I think that the.

【０１３３】 特定の実施態様において、その薬剤は、（例えば、ｒａｓのプレニル化を阻害
する、又はｒａｓのＧＴＰアーゼ活性を阻害することにより）ｒａｓ活性化を阻
害する。 特定の実施態様において、主題の方法は、ｒａｓをプレニル化するプレニルト
ランスフェラーゼ活性のペプチド又はペプチド様阻害物質を用いて実践してもよ
く、好ましくは阻害物質はファルネシルトランスフェラーゼ阻害物質である。In certain embodiments, the agent inhibits ras activation (eg, by inhibiting ras prenylation or inhibiting ras GTPase activity). In certain embodiments, the subject methods may be practiced with a peptide or peptidomimetic inhibitor of prenyltransferase activity that prenylates ras, preferably the inhibitor is a farnesyltransferase inhibitor.

【０１３４】 例えば、プレニルトランスフェラーゼのペプチジル阻害物質は、一般式ＩFor example, peptidyl inhibitors of prenyltransferase have the general formula I

【化７】 （式中、 Ｘ_a、Ｘ_b、及びＸ_cはそれぞれ独自にＯ又はＨ₂を表し、） ＲはEmbedded image (Wherein, X _a , X _b , and X _c each independently represent O or H ₂ )

【化８】 を表し、 Ｒ’はＨ、低級アルキル、低級アルケニル、アリール、Embedded image R ′ represents H, lower alkyl, lower alkenyl, aryl,

【化９】 を表し、 Ｒ₇はアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、又は複素環を表し、 Ｒ₁₀は低級アルキル、低級アルケニル、低級アルキニル、アリール、アルキル
アリール、シクロアルキル、アルコキシアルキル、アルキルチオアルキル、ヒド
ロキシアルキル、アミノアルキル、カルボキシアルキル、アルコキシカルボニル
アルキル、アリールアルキル、アルキルスルホニルアルキルを表し、好ましくは
αアミノ酸残基又はその類似体の側鎖、より好ましくは直鎖、分枝鎖低級アルキ
ル、アリール、又はアリールアルキルであり、 Ｒ₁₁はＨ、カルボキシ末端ブロッキング基又は製薬学的に許容される塩を表し
、あるいは ひとまとめに考えたＲ₁₀及びＲ₁₁は５〜７員ラクトンを形成し； Ｒ’₁₁はアルキル、アルケニル、又は−（ＣＨ₂）_m−Ｒ₇を表し、 Ｒ₄₆は存在ごとに独自に、水素、低級アルキル又はアリールを表し、 Ｒ₇₀は存在ごとに独自に、Ｈ、Embedded image R ₇ represents an aryl, cycloalkyl, cycloalkenyl, or heterocyclic ring; R ₁₀ represents lower alkyl, lower alkenyl, lower alkynyl, aryl, alkylaryl, cycloalkyl, alkoxyalkyl, alkylthioalkyl, hydroxyalkyl, amino Represents an alkyl, carboxyalkyl, alkoxycarbonylalkyl, arylalkyl, alkylsulfonylalkyl, preferably a side chain of an α-amino acid residue or analog thereof, more preferably a linear, branched lower alkyl, aryl, or arylalkyl. R ₁₁ represents H, a carboxy terminal blocking group or a pharmaceutically acceptable salt, or R ₁₀ and R ₁₁ taken together form a 5- to 7-membered lactone; R ′ ₁₁ is an alkyl, alkenyl , or - (CH _{2) m} -R ₇ represents R ₄₆ independently for each occurrence hydrogen, lower alkyl or aryl; R ₇₀ independently for each occurrence H

【化１０】 の基、低級アルキル、低級アルケニル、低級アルキニル、アリール、アルキルア
リール、シクロアルキル、アルコキシアルキル、アルキルチオアルキル、ヒドロ
キシアルキル、アミノアルキル、カルボキシアルキル、アルコキシカルボニルア
ルキル、アリールアルキル、アルキルスルホニルアルキル、及びアミノ酸残基も
しくは類似体のα炭素側鎖もしくは類似体、又は別のアミノ保護基、又は製薬学
的に許容される塩、あるいは ひとまとめに考えたＲ₇₀及びＲ、又はひとまとめに考えたＲ₇₀及びＲ₇₀は４〜
８員複素環を形成し、 Ｒ₇₂及びＲ₇₃は存在ごとに独自に、Ｈ、低級アルキル、アリール、ヘテロアリ
ール、−（ＣＨ₂）_m−Ｒ₇、又はアミノ酸（例えば自然発生した又は異常なアミ
ノ酸）の側鎖を表し、 Ｒ₈₀は水素、低級アルキル、低級アルケニル、低級アルキニル、又は−（ＣＨ ₂ ）_m−Ｒ₇を表し、 Ｘは存在ごとに独自に、Ｏ又はＳを表し、 Ｘ₂はＯ又はＳを表し、 ｍ及びｎは存在ごとに独自に、０又は１〜４の整数を表す）で表してもよい。Embedded imageGroup, lower alkyl, lower alkenyl, lower alkynyl, aryl, alkyl
Reel, cycloalkyl, alkoxyalkyl, alkylthioalkyl, hydro
Xyalkyl, aminoalkyl, carboxyalkyl, alkoxycarbonyla
Alkyl, arylalkyl, alkylsulfonylalkyl, and also amino acid residues
Or the analogous α-carbon side chain or analog, or another amino protecting group, or pharmaceutical
Salts that are acceptable, or R₇₀And R, or R considered together₇₀And R₇₀Is 4 ~
Forming an 8-membered heterocycle, R₇₂And R₇₃Is unique for each occurrence, H, lower alkyl, aryl, heteroaryl
,-(CH_Two)_m-R₇Or amino acids (eg, naturally occurring or abnormal amino acids)
R) represents a side chain of₈₀Is hydrogen, lower alkyl, lower alkenyl, lower alkynyl, or-(CH _Two )_m-R₇X represents O or S independently for each existence; X_TwoRepresents O or S, and m and n each independently represent 0 or an integer of 1 to 4).

【０１３５】 好ましい実施態様において、主題の阻害物質は、式Ｉ（式中、Ｘ_a、Ｘ_b、及び
Ｘ_cはそれぞれＨ₂又はＯ、より好ましくはＯを表し、Ｒは−Ｓ−Ｒ’を表し、Ｒ
’はＨ又は低級アルキル及びより好ましくはＨを表し、Ｒ₇₂は低級アルキルアミ
ン、低級アルキルチオール、又は低級アルキル、及びより好ましくはＣＨ₂ＮＨ₂ 、ＣＨ₂ＳＨを表し、Ｒ₇₃は−（ＣＨ₂）_m−Ｒ₇を表し、ｍは１であり、Ｒ₇はア
リール、及びより好ましくはＣ６〜Ｃ１２アリール、さらに好ましくは２−ナフ
チルを表し、Ｒ₁₀は低級アルキル、より好ましくは分枝状Ｃ４〜Ｃ６低級アルキ
ル、及びより好ましくは２−メチルプロピルを表し、Ｒ₁₁はＨ又は低級アルキル
（例えばメチル）を表し、存在ごとに独自にＲ₇₀はＨである）で表される。In a preferred embodiment, the subject inhibitors are compounds of the formula I wherein X _a , X _b and X _c each represent H ₂ or O, more preferably O, and R is —S—R ′. And R
'Represents H or lower alkyl and more preferably H, R ₇₂ represents lower alkyl amine, lower alkyl thiol, or lower alkyl, and more preferably CH ₂ NH ₂ , CH ₂ SH, and R ₇₃ represents-(CH ₂₎ represents a _m -R _7, m is 1, R ₇ is aryl, and more preferably an C6~C12 aryl, more preferably 2-naphthyl, R ₁₀ is lower alkyl, more preferably branched C4~C6 lower alkyl, and more preferably represents a 2-methylpropyl, R ₁₁ represents H or lower alkyl (e.g. methyl), independently R ₇₀ for each occurrence is represented by a H).

【０１３６】 別の好ましい実施態様において、主題の阻害物質は、式Ｉ（式中、Ｘ_a、Ｘ_b、
及びＸ_cはそれぞれＨ₂又はＯ、より好ましくはＸ_a及びＸ_bがＨ₂でＸ_cがＯであり
、Ｒは−Ｓ−Ｒ’を表し、Ｒ’はＨ又は低級アルキル及びより好ましくはＨを表
し、Ｒ₇₂は低級アルキルアミン、低級アルキルチオール、又は低級アルキル、及
びより好ましくはイソプロピルを表し、Ｒ₇₃は−（ＣＨ₂）_m−Ｒ₇を表し、ｍは
１であり、Ｒ₇はアリール、及びより好ましくはＣ６〜Ｃ１２アリール、さらに
好ましくは２−ナフチルを表し、Ｒ₁₀は低級アルキル、より好ましくは枝分かれ
したＣ４〜Ｃ６低級アルキル、及びさらに好ましくは２−メチルプロピルを表し
、Ｒ₁₁はＨ又は低級アルキル（例えばメチル）を表し、Ｒ₇₀は存在ごとに独自に
Ｈである）で表される。In another preferred embodiment, the subject inhibitors are of formula I wherein X _a , X _b ,
And X _c are each H ₂ or O, more preferably X _a and X _b are H ₂ and X _c is O, R represents —SR ′, R ′ is H or lower alkyl and more preferably H, R ₇₂ represents lower alkylamine, lower alkyl thiol, or lower alkyl, and more preferably isopropyl, R ₇₃ represents — (CH ₂ ) _m —R ₇ , m is 1 and R ₇ represents aryl, and more represents preferably C6~C12 aryl, more preferably 2-naphthyl, R ₁₀ is lower alkyl, more preferably branched C4~C6 lower alkyl, and more preferably 2-methylpropyl, R ₁₁ represents H or lower alkyl (eg methyl) and R ₇₀ is independently H for each occurrence.

【０１３７】 本発明の一態様において、主題のプレニルトランスフェラーゼ阻害物質は、一
般式Ｃ−Ａ−Ａ−Ｘ（式中、各Ａは独自に脂肪族アミノ酸（例えばグリシン、ア
ラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、又はその類似体であり、あるいはＡ
−Ａは、ジペプチドと同等のスペーサを表し、Ｃはシステイン又はそれと同配性
／等電性の同等物を表し、Ｘはいずれかのアミノ酸を表すが、好ましくはそれと
同配性／等電性の同等物である）のペプチドミメティックである。主題の方法で
使用されるペプチドミメティックを生じる主な目的は、その化合物の生物学的利
用度を増加させ、及び／又は同等のペプチドに関連するペプチドミメティックの
加水分解性を低下させることである。In one embodiment of the present invention, the subject prenyltransferase inhibitors are of the general formula CAAX, wherein each A is independently an aliphatic amino acid (eg glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine Or an analogue thereof, or A
-A represents a spacer equivalent to a dipeptide, C represents cysteine or an isosteric / isoelectric equivalent thereof, and X represents any amino acid, but is preferably an isosteric / isoelectric. Is a peptidomimetic. The primary purpose of producing the peptidomimetics used in the subject method is to increase the bioavailability of the compound and / or reduce the hydrolyzability of the peptidomimetics associated with the equivalent peptide. is there.

【０１３８】 さらに例示すれば、本発明の方法に使用するために意図される一つの化合物群
は、所望のプレニルトランスフェラーゼ阻害活性を保持しながらＣ−Ａ−Ａ−Ｘ
テトラペプチドのＡ−Ａ−Ｘを非アミノ酸成分で置き換えることにより生じるペ
プチド様阻害剤である。同様に、システイン残基は、等配電子／等電子均等物に
より置き換えることができ、例えば、シアノ、ニトロ、チオカルバメート、アミ
ノ、カルバミン酸、ホスフェート、チオホスフェート、スルホキシド、カルボキ
シイミド、ウレア、スルホン、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、チ
オウレア、ジチオカルバメート、ホスホルアミドジチオエート、メチルスルホニ
ル、ホスホネート、スルファミド、ホスホルアミド、スルホネート、ジチオカル
バメート、ヒドロキシル、スルフェート、スルフィネート、スルファメート、ホ
スフィネート、カルボキシレート、ヒドロキシメート、イミダゾール又はその他
の複素環式部分のような極性部分によるスルフヒドリル基の置換である。スルフ
ヒドリル基は、例えば、Ｓ−アルキルシステイン又はその相当するスルホキシド
、スルホン、スルホネート若しくはスルフェート誘導体（更に好ましくはスルホ
キシド又はスルホンによる）を形成するように官能化することができる。To further illustrate, one group of compounds contemplated for use in the methods of the present invention are CAAX while retaining the desired prenyltransferase inhibitory activity.
It is a peptide-like inhibitor produced by replacing AAX of a tetrapeptide with a non-amino acid component. Similarly, cysteine residues can be replaced by isosteric / isoelectronic equivalents, such as cyano, nitro, thiocarbamate, amino, carbamic acid, phosphate, thiophosphate, sulfoxide, carboximide, urea, sulfone, Phosphorothioate, phosphorodithioate, thiourea, dithiocarbamate, phosphoramidodithioate, methylsulfonyl, phosphonate, sulfamide, phosphoramide, sulfonate, dithiocarbamate, hydroxyl, sulfate, sulfinate, sulfamate, phosphinate, carboxylate, hydroxymate, imidazole or Substitution of sulfhydryl groups by polar moieties such as other heterocyclic moieties. A sulfhydryl group can be functionalized to form, for example, an S-alkylcysteine or its corresponding sulfoxide, sulfone, sulfonate or sulfate derivative (more preferably with a sulfoxide or sulfone).

【０１３９】 一具体例では、Ａ−Ａ−Ｍｅｔ又はＡ−Ａ−Ｓｅｒトリペプチドが、大きさが
そのトリペプチドに本質的に相当する置換アリール又はヘテロアリール基により
置き換えられる。例えば、本発明の方法は、次式（II）：In one embodiment, the AA-Met or AA-Ser tripeptide is replaced by a substituted aryl or heteroaryl group whose size essentially corresponds to the tripeptide. For example, the method of the present invention comprises the following formula (II):

【化１１】 ［ここで、 Ａｒはアリール基（例えば、置換又は非置換の）を表わし、 Ｊは存在しない（例えば、ＮとＡｒが直接結合により結合されている）か、又
は−ＣＨ（Ｒ₇₂）−を表わし、 Ｒは次式：Embedded image [Where Ar represents an aryl group (for example, substituted or unsubstituted), J is absent (for example, N and Ar are bonded by a direct bond), or -CH (R ₇₂ )- Wherein R is the following formula:

【化１２】 （ここで、Ｒ’はＨ、低級アルキル、低級アルケニル、アリール、次式の基：Embedded image (Where R ′ is H, lower alkyl, lower alkenyl, aryl, a group of the following formula:

【化１３】 を表わす） の基を表わし、 Ｒ₇はアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル又は複素環を表わし、 Ｒ₁₀は低級アルキル、低級アルケニル、低級アルキニル、アリール、アルキル
アリール、シクロアルキル、アルコキシアルキル、アルキルチオアルキル、ヒド
ロキシアルキル、アミノアルキル、カルボキシアルキル、アルコキシカルボニル
アルキル、アリールアルキル、アルキルスルホニルアルキルを表わし、好ましく
はアミノ酸残基又はその類似体のα−炭素側鎖、更に好ましくは直鎖、分岐鎖状
のアルキル、アリール又はアリールアルキルであり、 Ｒ₁₁はＨ、カルボキシ末端ブロッキング基又は製薬上許容できる塩を表わし、
或いは Ｒ₁₀とＲ₁₁は一緒になって５〜７員のラクトンを形成し、 Ｒ'₁₁はアルキル、アルケニル又は−（ＣＨ₂）_m−Ｒ₇を表わし、 Ｒ₄₆は存在するごとに独立して水素、低級アルキニル又はアリールを表わし、 Ｒ₇₀は存在するごとに独立してＨ、次式：Embedded image R ₇ represents an aryl, cycloalkyl, cycloalkenyl or heterocyclic ring; R ₁₀ represents lower alkyl, lower alkenyl, lower alkynyl, aryl, alkylaryl, cycloalkyl, alkoxyalkyl, alkylthioalkyl, Hydroxyalkyl, aminoalkyl, carboxyalkyl, alkoxycarbonylalkyl, arylalkyl, alkylsulfonylalkyl, preferably an α-carbon side chain of an amino acid residue or an analog thereof, more preferably a straight-chain, branched-chain alkyl, R ₁₁ is H, a carboxy terminal blocking group or a pharmaceutically acceptable salt;
Or R ₁₀ and R ₁₁ form a lactone of the 5- to 7-membered together, R _'11 is alkyl, alkenyl or - (CH ₂₎ represents a _m -R _7, R ₄₆ is independently in each existing Represents hydrogen, lower alkynyl or aryl; R ₇₀ is independently H for each occurrence;

【化１４】 の基、低級アルキル、低級アルケニル、低級アルキニル、アリール、アルキルア
リール、シクロアルキル、アルコキシアルキル、アルキルチオアルキル、ヒドロ
キシアルキル、アミノアルキル、カルボキシアルキル、アルコキシカルボニルア
ルキル、アリールアルキル、アルキルスルホニルアルキル、及びアミノ酸残基又
はその類似体のα−炭素側鎖、又はその他のアミノ保護基、又は製薬上許容でき
る塩を表わし、或いは Ｒ₇₀とＲ又はＲ₇₀とＲ₇₀は一緒になって４〜８員の複素環を形成し、 Ｒ₇₁はそれぞれ独立してＨ又は低級アルキルを表わし、 Ｒ₇₂は存在するごとに独立してＨ、低級アルキル、アリール、ヘテロアリール
又は天然アミノ酸の側鎖を表わし、 Ｒ₇₅は次式：Embedded image Group, lower alkyl, lower alkenyl, lower alkynyl, aryl, alkylaryl, cycloalkyl, alkoxyalkyl, alkylthioalkyl, hydroxyalkyl, aminoalkyl, carboxyalkyl, alkoxycarbonylalkyl, arylalkyl, alkylsulfonylalkyl, and amino acid residue Or an α-carbon side chain of an analog thereof, or another amino protecting group, or a pharmaceutically acceptable salt, or R ₇₀ and R or R ₇₀ and R _{70 taken} together as a 4- to 8-membered heterocyclic ring forming a, R ₇₁ each independently represent H or lower alkyl, R ₇₂ is independently each present represents H, lower alkyl, aryl, a side chain of a heteroaryl or natural amino acids, R ₇₅ is next formula:

【化１５】 の基を表わし、 Ｒ₈₀は水素、低級アルキル、低級アルケニル、低級アルキニル又は−（ＣＨ₂
）_m−Ｒ₇を表わし、 Ｘは存在するごとに独立してＯ、Ｓ又はＨ₂を表わし、 Ｘ₂はＯ又はＳを表わし、 ｍ及びｎは存在するごとに独立して０又は１〜４の範囲の整数を表わす］ で表わされるファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤を使用して達成することが
できる。Embedded image Wherein R ₈₀ is hydrogen, lower alkyl, lower alkenyl, lower alkynyl or — (CH ₂
) Represents the _m -R _7, X is independently each present represents O, S or H _2, X ₂ represents O or S, m and n are independently 0 or 1 each time there And represents an integer in the range of 4].

【０１４０】 例えば、このペプチド様物質は、次式(IIIａ) 又は(IIIｂ) ：For example, this peptidomimetic has the formula (IIIa) or (IIIb):

【化１６】 ［ここで、 Ａｒ、Ｊ、Ｒ'、Ｒ₇₀、Ｒ₇₁及びＸは上で定義した通りであり、 Ｒ₁₀は低級アルキル、低級アルケニル、低級アルキニル、アリール、アルキル
アリール、シクロアルキル、アルコキシアルキル、アルキルチオアルキル、ヒド
ロキシアルキル、アミノアルキル、カルボキシアルキル、アルコキシカルボニル
アルキル、アリールアルキル、アルキルスルホニルアルキル、又はアミノ酸残基
又はその類似体のα−炭素側鎖を表わし、好ましくは直鎖、分岐鎖状のアルキル
、アリール又はアリールアルキルであり、 Ｒ₁₁はＨ、カルボキシ末端ブロッキング基又は製薬上許容できる塩を表わし、
或いは 式(IIIａ)において、Ｒ₁₀とＲ₁₁は一緒になって５〜７員のラクトンを形成す
る］ により表わされる構造を有することができる。Embedded image Wherein Ar, J, R ′, R ₇₀ , R ₇₁ and X are as defined above, and R ₁₀ is lower alkyl, lower alkenyl, lower alkynyl, aryl, alkylaryl, cycloalkyl, alkoxyalkyl, Alkylthioalkyl, hydroxyalkyl, aminoalkyl, carboxyalkyl, alkoxycarbonylalkyl, arylalkyl, alkylsulfonylalkyl, or an α-carbon side chain of an amino acid residue or an analog thereof, preferably a linear or branched alkyl R ₁₁ represents H, a carboxy-terminal blocking group or a pharmaceutically acceptable salt;
Alternatively, in the formula (IIIa), R ₁₀ and R ₁₁ together form a 5- to 7-membered lactone.]

【０１４１】 好ましい具体例では、Ａｒは、存在するごとに、５、６及び７員の単環式又は
１０〜１４員の二環式芳香族基よりなる群から選択されるアリール基であって、
０〜４個の複素原子を含有できるもの、例えば、ベンゼン、ピロール、フラン、
チオフェン、イミダゾール、オキサゾール、チアゾール、トリアゾール、ピラゾ
ール、ピリジン、ピラジン、ピリダジン、ピリミジン、ベンゾチオフェン、キノ
リン、キノロンなどをいう。In a preferred embodiment, Ar, when present, is an aryl group selected from the group consisting of 5, 6 and 7 membered monocyclic or 10-14 membered bicyclic aromatic groups. ,
Those that can contain 0-4 heteroatoms, such as benzene, pyrrole, furan,
Refers to thiophene, imidazole, oxazole, thiazole, triazole, pyrazole, pyridine, pyrazine, pyridazine, pyrimidine, benzothiophene, quinoline, quinolone, and the like.

【０１４２】 この群の化合物の例は、中でも米国特許第５，７０５，６８６号及びＰＣＴ公
開ＷＯ９６／２１４５６に記載された包括的構造によって見出すことができ、こ
の群は次の一般式（IVｂ）：Examples of this group of compounds can be found, inter alia, by the generic structure described in US Pat. No. 5,705,686 and PCT Publication WO 96/21456, which group has the general formula (IVb) :

【化１７】 ［ここで、Ｘ、Ｒ’、Ｒ₁₁及びＲ₇₀は式(IIIｂ) で定義したとおりであり、各Ｒ ₈₂ は存在しないか又は１個以上の置換基を表わし、それぞれは独立して低級アル
キニル、−（ＣＨ）₂−Ｒ₇又はＣＯＯＲ₁₁（Ｒ₇及びＲ₁₁は上で定義した）であ
ることができる］ の化合物を包含する。好ましい具体例では、中心のアリール構造はｐ−フェニル
ベンズアミド又はｍ−フェニルベンズアミドである。Embedded image[Where X, R ', R₁₁And R₇₀Is as defined in formula (IIIb), ₈₂ Is absent or represents one or more substituents, each of which is independently lower
Quinyl,-(CH)_Two-R₇Or COOR₁₁(R₇And R₁₁Is defined above)
Which can be referred to above. In a preferred embodiment, the central aryl structure is p-phenyl
Benzamide or m-phenylbenzamide.

【０１４３】 このようなペプチド様物質の他の例は、Lerner他によりJ. Biol. Chem. (1995
), 270: 26770並びにＰＣＴ公開ＷＯ９６／２１４５６に記載されており、それ
ぞれ次の一般式（IVａ）：Other examples of such peptidomimetics are described by Lerner et al. In J. Biol. Chem. (1995
), 270: 26770 and PCT publication WO 96/21456, each of the following general formula (IVa):

【化１８】 ［ここで、Ｒ'、Ｒ₁₀、Ｒ₁₁、Ｒ₇₀、Ｒ₇₁及びＸは式(IIIａ) で定義したとおり
であり、各Ｒ₈₂は存在しないか又は１個以上の置換基を表わし、それぞれは独立
して低級アルキニル、−（ＣＨ）₂−Ｒ₇又はＣＯＯＲ₁₁（Ｒ₇及びＲ₁₁は上で定
義した）であることができる］ で表わされるプレニルトランスフェラーゼ阻害剤を教示している。Embedded image Wherein R ′, R ₁₀ , R ₁₁ , R ₇₀ , R ₇₁ and X are as defined in formula (IIIa), and each R ₈₂ is absent or represents one or more substituents; lower alkynyl is independently, - (CH) ₂ -R ₇ or COOR ₁₁ (R ₇ and R ₁₁ are as defined above) teaches the prenyl transferase inhibitor represented by may be.

【０１４４】 式(IIIａ) の化合物に関しては、ＰＣＴ公開ＷＯ９６／２１４５６が多数のそ
の他のアリール基を記載している。しかして、例えば、アンチ剤として有用なプ
レニルトランスフェラーゼ阻害剤は、下記の一般式のいずれかで表わすことがで
きる。For the compounds of formula (IIIa), PCT publication WO 96/21456 describes a number of other aryl groups. Thus, for example, prenyltransferase inhibitors useful as anti-agents can be represented by any of the general formulas below.

【化１９】 Embedded image

【化２０】 Embedded image

【化２１】 ［これらの式で、Ｒ'、Ｒ₁₀、Ｒ₁₁、Ｒ₇₀、Ｒ₇₁、Ｒ₈₁、Ｊ及びＸは上で定義し
たとおりであり、Ｘ₃はＣ又はＮであり、Ｙ₃はＯ、Ｓ又はＮＨである］Embedded image [In these formulas, R ′, R ₁₀ , R ₁₁ , R ₇₀ , R ₇₁ , R ₈₁ , J and X are as defined above, X ₃ is C or N, Y ₃ is O, S or NH]

【０１４５】 さらに他の具体例では、本発明の方法は、米国特許第５，６２４，９３６号及
びカナダ特許出願第２，１４３，５８８号の教示から選択される化合物又はその
類似体を使用して実施することができる。例えば、本発明の方法は、次一般式（
Ｖ）：In yet another embodiment, the method of the invention uses a compound selected from the teachings of US Pat. No. 5,624,936 and Canadian Patent Application No. 2,143,588, or an analog thereof. Can be implemented. For example, the method of the present invention has the following general formula (
V):

【化２２】 ［ここで、 Ｒ、Ｒ₁₀、Ｒ₁₁、Ｒ₇₀、Ｒ₇₁、Ｒ₇₂及びＸは式（Ｉ）で定義したとおりであり
、 Ａはシクロアルキル、シクロアルケニル、アリール及び複素環よりなる群から
選択される縮合環を表わし、この縮合環はその環構造内に４〜８個の原子を含む
ことができ、 Ｒ₁₀₄は存在しないか又は１個以上の置換基を表わし、後者は低級アルキル、
アリール、複素環、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、Ｒ₁₁₀Ｏ−、Ｒ_{1 11} −Ｓ（Ｏ）_m−、Ｒ₁₁₀Ｃ（Ｏ）ＮＲ₁₁₀−、ＣＮ、Ｎ₃、（Ｒ₁₁₀）₂Ｎ−、Ｃ（
ＮＲ₁₁₀）−、Ｒ₁₁₀Ｃ（Ｏ）−、Ｒ₁₁₀ＯＣ（Ｏ）−、（Ｒ₁₁₀）₂Ｎ−若しくは
Ｒ₁₁₁ＯＣ（Ｏ）ＮＲ₁₁₀−、非置換の若しくは１個以上の置換基（これはアリー
ル、複素環、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、Ｒ₁₁₀Ｏ−、Ｒ₁₁₁−Ｓ
（Ｏ）_m−、Ｒ₁₁₀Ｃ（Ｏ）ＮＲ₁₁₀−、ＣＮ、（Ｒ₁₁₀）₂Ｎ−若しくはＲ₁₁₁ＯＣ
（Ｏ）ＮＲ₁₁₀−から選択される）からそれぞれ独立して選択され、 Ｒ₁₁₀は水素、低級アルキル、ベンジル又はアリールを表わし、 Ｒ₁₁₁は低級アルキル又はアリールであり、 ｉは１、２又は３であり、 ｐは存在するごとに独立して０、１又は２であり、 ｍは０〜２の整数である］ で表わされるプレニルトランスフェラーゼ阻害剤で処理することによって実施す
ることができる。Embedded image Wherein R, R ₁₀ , R ₁₁ , R ₇₀ , R ₇₁ , R ₇₂ and X are as defined in formula (I), and A is from the group consisting of cycloalkyl, cycloalkenyl, aryl and heterocycle Represents a selected fused ring, which may contain from 4 to 8 atoms in the ring structure, wherein R ₁₀₄ is absent or represents one or more substituents, the latter being lower alkyl,
Aryl, heterocycle, cycloalkyl, alkenyl, _{alkynyl, R 110 O-, R 1 11} -S (O) m -, R 110 C (O) NR 110 -, CN, N 3, (R 110) 2 N- , C (
_{NR 110) -, R 110 C} (O) -, R 110 OC (O) -, (R 110) 2 N- or _{R 111 OC (O) NR 110} -, unsubstituted or 1 or more substituents ( This is aryl, heterocycle, cycloalkyl, alkenyl, alkynyl, R ₁₁₀ O-, R ₁₁₁ -S
_{(O) m -, R 110} C (O) NR 110 -, CN, (R 110) 2 N- or R ₁₁₁ OC
(O) NR ₁₁₀ - are each independently selected from to) selected from, R ₁₁₀ represents hydrogen, lower alkyl, benzyl or aryl, R ₁₁₁ is lower alkyl or aryl, i is 1, 2 or 3 And p is independently 0, 1 or 2 each time it is present, and m is an integer of 0 to 2].

【０１４６】 また、カナダ特許出願第２，１４３，５８８号の教示は、プレニルトランスフ
ェラーゼの潜在的な阻害剤であり且つ本発明の方法に使用できる化合物群も示し
ている。しかして、他の具体例では、本発明の方法は、次の一般式（VI）：The teachings of Canadian Patent Application No. 2,143,588 also indicate a group of compounds that are potential inhibitors of prenyltransferase and can be used in the methods of the present invention. Thus, in another embodiment, the method of the present invention comprises the following general formula (VI):

【化２３】 ［ここで、 Ｒ、Ｒ₁₀、Ｒ₁₁、Ｒ₇₀、Ｒ₇₁、Ｒ₇₂、Ｒ₁₀₄、Ｘ及びｎは式（Ｖ）で定義した
とおりであり、 Ｙ₂は−ＣＨ₂−又は−Ｃ（Ｏ）−であり、 Ｊ、Ｋ及びＬはそれぞれ独立してＮ、ＮＲ₁₀₅、Ｏ、Ｓ又はＣＲ₁₀₆であり、た
だし、３個の基のうちの１個のみがＯ又はＳであることができ、３個の基のうち
の１個若しくは２個がＮ又はＮＲ₁₀₅であることができ、及び少なくとも１固は
ヘテロアリールを形成するように複素原子でなければならず、 Ｒ₁₀₅はＨ、低級アルキル又はフェニルアルキルを表わし、 Ｒ₁₀₆はＨ又は低級アルキルである］ で表わされる化合物により処理することによって実施することができる。Embedded image [Where R, R ₁₀ , R ₁₁ , R ₇₀ , R ₇₁ , R ₇₂ , R ₁₀₄ , X and n are as defined in formula (V), and Y ₂ is —CH ₂ — or —C ( J), K and L are each independently N, NR ₁₀₅ , O, S or CR ₁₀₆ , provided that only one of the three groups is O or S And one or two of the three groups can be N or NR ₁₀₅ , and at least one must be a heteroatom to form a heteroaryl, wherein R ₁₀₅ is H, Represents lower alkyl or phenylalkyl, wherein R ₁₀₆ is H or lower alkyl].

【０１４７】 ＥＰ出願６１８，２２１は、本発明の方法に使用するためにプレニルトランス
フェラーゼの潜在的な阻害剤であり、例えば、そのアンチ化合物は次の一般式(V
II) ：EP application 618,221 is a potential inhibitor of prenyltransferase for use in the methods of the present invention, for example, the anti-compound of the general formula (V
II):

【化２４】 ［ここで、Ｒ、Ｒ₁₀、Ｒ₁₁、Ｒ₇₀、Ｒ₇₁、Ｒ₇₂、Ｒ₁₀₄、Ｘ及びｎは式（Ｖ）で
定義したとおりであり、Ｙ₂は−ＣＨ₂−又は−Ｃ（Ｏ）−である］ により表わすことができる類似の化合物群を教示している。Embedded image [Where R, R ₁₀ , R ₁₁ , R ₇₀ , R ₇₁ , R ₇₂ , R ₁₀₄ , X and n are as defined in formula (V), and Y ₂ is —CH ₂ — or —C ( O)-are taught].

【０１４８】 また、米国特許第５，６２４，９３６号の教示は、本発明の方法で使用できる
その他の類似体を設計するためのガイダンスを提供している。さらに例示すれば
、本発明の方法は、次の一般式（VIII）：The teachings of US Pat. No. 5,624,936 also provide guidance for designing other analogs that can be used in the methods of the present invention. To further illustrate, the method of the present invention comprises the following general formula (VIII):

【化２５】 ［ここで、 Ｒ_1a及びＲ_1bは存在するごとに独立して水素、低級アルキル、アリール、複素
環、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、Ｒ₁₁₀Ｏ−、Ｒ₁₁₁−Ｓ（Ｏ）_m
−、Ｒ₁₁₀Ｃ（Ｏ）ＮＲ₁₁₀−、ＣＮ、ＮＯ₂、（Ｒ₁₁₀）₂Ｎ−Ｃ（ＮＲ₁₁₀）−、
Ｒ₁₁₀Ｃ（Ｏ）−、Ｒ₁₁₀ＯＣ（Ｏ）−、Ｎ₃、（Ｒ₁₁₀）₂Ｎ−又はＲ₁₁₁ＯＣ（Ｏ
）ＮＲ₁₁₀−、非置換の若しくは１個以上の置換基（これはアリール、複素環、
シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、Ｒ₁₁₀Ｏ−、Ｒ₁₁₁−Ｓ（Ｏ）_m−、
Ｒ₁₁₀Ｃ（Ｏ）ＮＲ₁₁₀−、ＣＮ、（Ｒ₁₁₀）₂Ｎ−若しくはＲ₁₁₁ＯＣ（Ｏ）ＮＲ_{1 10} −から選択される）で置換された低級アルキルから選択され、 Ｒ₁₀₂及びＲ₁₀₃は独立して天然アミノ酸の側鎖から選択され、又は低級アルキ
ル、低級アルケニル、シクロアルキル、アリール又は複素環式基であり、或いは Ｒ₁₀₂及びＲ₁₀₃は一緒になってシクロアルキルを形成し、或いは Ｒ₁₀₂は隣接のＮと共に複素環を形成し、 Ｒ₁₀₄は存在しないか又はＱに対する１個以上の置換基を表わし、後者は低級
アルキル、アリール、複素環、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、Ｒ_{11 0} Ｏ−、Ｒ₁₁₁−Ｓ（Ｏ）_m−、Ｒ₁₁₀Ｃ（Ｏ）ＮＲ₁₁₀−、ＣＮ、Ｎ₃、（Ｒ₁₁₀）₂ Ｎ−Ｃ（ＮＲ₁₁₀）−、Ｒ₁₁₀Ｃ（Ｏ）−、Ｒ₁₁₀ＯＣ（Ｏ）−、（Ｒ₁₁₀）₂Ｎ−
若しくはＲ₁₁₁ＯＣ（Ｏ）ＮＲ₁₁₀−、非置換の若しくは１個以上の置換基（これ
はアリール、複素環、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、Ｒ₁₁₀Ｏ−、
Ｒ₁₁₁−Ｓ（Ｏ）_m−、Ｒ₁₁₀Ｃ（Ｏ）ＮＲ₁₁₀−、ＣＮ、（Ｒ₁₁₀）₂Ｎ−若しくは
Ｒ₁₁₁ＯＣ（Ｏ）ＮＲ₁₁₀−から選択される）で置換された低級アルキルからそれ
ぞれ独立して選択され、 Ｒ_105a及びＲ_105bは独立して天然アミノ酸の側鎖から、或いは直鎖若しくは分
岐鎖状のアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール又は複
素環から選択され、 Ｒ₁₀₆は水素又は低級アルキルを表わし、 Ｒ₁₀₈及びＲ₁₀₉は独立して水素、アルキル、アリール、複素環、シクロアルキ
ル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、Ｒ₁₁₀Ｏ−、Ｒ₁₁₁−Ｓ（Ｏ）_m−、Ｒ_{1 10} Ｃ（Ｏ）ＮＲ₁₁₀−、ＣＮ、Ｎ₃、（Ｒ₁₁₀）₂Ｎ−Ｃ（ＮＲ₁₁₀）−、Ｒ₁₁₀Ｃ（
Ｏ）−、Ｒ₁₁₀ＯＣ（Ｏ）−、（Ｒ₁₁₀）₂Ｎ−若しくはＲ₁₁₁ＯＣ（Ｏ）ＮＲ₁₁₀
−、非置換の若しくは１個以上の置換基（これはアリール、複素環、シクロアル
キル、アルケニル、アルキニル、Ｒ₁₁₀Ｏ−、Ｒ₁₁₁−Ｓ（Ｏ）_m−、Ｒ₁₁₀Ｃ（Ｏ
）ＮＲ₁₁₀−、ＣＮ、（Ｒ₁₁₀）₂Ｎ−若しくはＲ₁₁₁ＯＣ（Ｏ）ＮＲ₁₁₀−から選
択される）で置換された低級アルキルを表わし、 Ｒ₁₁₀は水素、低級アルキル、ベンジル又はアリールを表わし、 Ｒ₁₁₁は低級アルキル又はアリールであり、 Ｑは置換又は非置換の窒素含有二環式環系であり、 Ｖは水素、低級アルキル、低級アルケニル、アリール又は複素環を表わし、 Ｗは複素環であり、 Ｘ、Ｙ及びＺは独立してＯ、Ｓ又はＨ₂であり、 ｍは０、１又は２であり、 ｎ及びｐは独立して０、１、２、３又は４であり、 ｒは０〜５の範囲の整数である］ で表わされる化合物により処理することによって実施することができる（この群
のプレニルトランスフェラーゼ阻害剤における追加の構造式については、ＰＣＴ
出願ＷＯ９７／３８６６４を参照）。Embedded image [Wherein R _1a and R _1b each independently represent hydrogen, lower alkyl, aryl, heterocycle, cycloalkyl, alkenyl, alkynyl, R ₁₁₀ O-, R ₁₁₁ -S (O) _{m
-, R 110 C (O)} NR 110 -, CN, NO 2, (R 110) 2 N-C (NR 110) -,
_{R 110 C (O) -,} R 110 OC (O) -, N 3, (R 110) 2 N- or R ₁₁₁ OC (O
) NR _110- , unsubstituted or one or more substituents, which are aryl, heterocyclic,
Cycloalkyl, alkenyl, _{alkynyl, R 110 O-, R 111 -S} (O) m -,
_{R 110 C (O) NR 110} -, CN, (R 110) 2 N- or _{R 111 OC (O) NR 1} 10 - is selected from lower alkyl substituted with chosen from), R ₁₀₂ and R ₁₀₃ Is independently selected from the side chains of natural amino acids, or is a lower alkyl, lower alkenyl, cycloalkyl, aryl or heterocyclic group; orR ₁₀₂ and R ₁₀₃ together form a cycloalkyl; or R ₁₀₂ forms a heterocycle with adjacent N, R ₁₀₄ is absent or represents one or more substituents on Q, the latter being lower alkyl, aryl, heterocycle, cycloalkyl, alkenyl, alkynyl, R _{11 0 O-, R 111 -S (O} ) m -, R 110 C (O) NR 110 -, CN, N 3, (R 110) 2 N-C (NR 110) -, R 110 C (O) - _{, R 110 OC (O) -} , (R 110) 2 N-
Or R ₁₁₁ OC (O) NR ₁₁₀ —, unsubstituted or one or more substituents, which are aryl, heterocyclic, cycloalkyl, alkenyl, alkynyl, R ₁₁₀ O—,
_{R 111 -S (O) m -} , R 110 C (O) NR 110 -, CN, (R 110) 2 N- or _{R 111 OC (O) NR 110} - substituted with to) selected from lower alkyl R _105a and R _105b are independently selected from the side chains of natural amino acids or from linear or branched alkyl, alkenyl, alkynyl, cycloalkyl, aryl or heterocyclic; ₁₀₆ represents hydrogen or lower alkyl; R ₁₀₈ and R ₁₀₉ independently represent hydrogen, alkyl, aryl, heterocycle, cycloalkyl, alkenyl, alkynyl, halogen, R ₁₁₀ O—, R ₁₁₁ —S (O) _m — _{, R 1 10 C (O)} NR 110 -, CN, N 3, (R 110) 2 N-C (NR 110) -, R 110 C (
_{O) -, R 110 OC (} O) -, (R 110) 2 N- or R ₁₁₁ OC (O) NR ₁₁₀
-, unsubstituted or 1 or more substituents (which aryl, heterocycle, cycloalkyl, alkenyl, _{alkynyl, R 110 O-, R 111 -S} (O) m -, R 110 C (O
_{) NR 110 -, CN, (} R 110) 2 N- or _{R 111 OC (O) NR 110} - represents a lower alkyl substituted with to) selected from, R ₁₁₀ is hydrogen, lower alkyl, benzyl or aryl R ₁₁₁ is lower alkyl or aryl; Q is a substituted or unsubstituted nitrogen-containing bicyclic ring system; V is hydrogen, lower alkyl, lower alkenyl, aryl or heterocycle; W is heterocycle in and, X, Y and Z are independently O, S or H _2, m is 0, 1 or 2, n and p is 0, 1, 2, 3 or 4 independently, r is an integer ranging from 0 to 5] (for additional structural formulas in this group of prenyltransferase inhibitors, see PCT
See application WO 97/38664).

【０１４９】 米国特許第５，４７０，８３２号及びＰＣＴ公開ＷＯ９５／２０３９６は、ペ
プチド阻害剤の骨格がそれの非加水分解性類似体で置き換えれた化合物の更に他
の具体例を見通している。従って、本発明の方法のある種の具体例では、プレニ
ルトランスフェラーゼ阻害剤は、次の一般式（IX）：US Pat. No. 5,470,832 and PCT Publication No. WO 95/20396 envision yet other embodiments of compounds in which the backbone of the peptide inhibitor has been replaced by a non-hydrolyzable analog thereof. Thus, in certain embodiments of the method of the present invention, the prenyltransferase inhibitor has the following general formula (IX):

【化２６】 ［ここで、 Ｍ₁−Ｍ₂は−ＣＨ₂−Ｏ−又は−ＣＨ＝ＣＨ−であり、 Ｊ₂及びＪ₃はそれぞれ−ＣＨ₂−又は−Ｃ（Ｘ）−であり、 Ｒは次式：Embedded image [Where M ₁ -M ₂ is —CH ₂ —O— or —CH ＝ CH—; J ₂ and J ₃ are each —CH ₂ — or —C (X) —; :

【化２７】 （ここで、Ｒ'はＨ、低級アルキル、低級アルケニル、アリール、次式：Embedded image (Where R ′ is H, lower alkyl, lower alkenyl, aryl, the following formula:

【化２８】 の基である） の基を表わし、 Ｒ₇はアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル又は複素環を表わし、 Ｒ₁₁は水素、カルボキシ末端ブロッキング基又は製薬上許容できる塩を表わし
、 Ｒ'₁₁はアルキル、アルケニル又は−（ＣＨ₂）_m−Ｒ₇を表わし、 Ｒ₄₆は存在するごとに独立して水素、低級アルキル又はアリールを表わし、 Ｒ₇₀は存在するごとに独立してＨ、次式：Embedded image R ₇ represents an aryl, cycloalkyl, cycloalkenyl or heterocyclic ring, R ₁₁ represents hydrogen, a carboxy-terminal blocking group or a pharmaceutically acceptable salt, R ′ ₁₁ represents an alkyl, Alkenyl or — (CH ₂ ) _m —R ₇ ; R ₄₆ , independently of each occurrence, independently represent hydrogen, lower alkyl or aryl; R ₇₀ , independently of each occurrence, H;

【化２９】 の基、低級アルキル、低級アルケニル、低級アルキニル、アリール、アルキルア
リール、シクロアルキル、アルコキシアルキル、アルキルチオアルキル、ヒドロ
キシアルキル、アミノアルキル、カルボキシアルキル、アルコキシカルボニルア
ルキル、アリールアルキル、アルキルスルホニルアルキル、アミノ酸残基又はそ
の類似体のα−炭素側鎖又はその他のアミノ保護基又は製薬上許容できる塩を表
わし、或いは Ｒ₇₀はＲと共に４〜８員の複素環を形成し、 Ｒ₇₁はＨ又は低級アルキルを表わし、 Ｒ₇₂は存在するごとに独立してＨ、低級アルキル、アリール、ヘテロアリール
又は天然アミノ酸の側鎖を表わし、 Ｒ₈₀は水素、低級アルキル、低級アルケニル、低級アルキニル又は−（ＣＨ₂
）_m−Ｒ₇を表わし、 Ｘは存在するごとに独立してＯ又はＳを表わし、 Ｘ₂はＯ又はＳを表わし、 ｍ及びｎは存在するごとに独立して０又は１〜４の範囲の整数を表わす］ であることができる。Embedded image Group, lower alkyl, lower alkenyl, lower alkynyl, aryl, alkylaryl, cycloalkyl, alkoxyalkyl, alkylthioalkyl, hydroxyalkyl, aminoalkyl, carboxyalkyl, alkoxycarbonylalkyl, arylalkyl, alkylsulfonylalkyl, amino acid residue or Represents the α-carbon side chain or other amino protecting group of the analog or a pharmaceutically acceptable salt, or R ₇₀ forms a 4- to 8-membered heterocycle with R, and R ₇₁ represents H or lower alkyl. R ₇₂ independently represents H, lower alkyl, aryl, heteroaryl or a side chain of a natural amino acid, and R ₈₀ represents hydrogen, lower alkyl, lower alkenyl, lower alkynyl or — (CH ₂
) Represents the _m -R _7, X represents O or S independently of each present, X ₂ represents O or S, independently 0 or 1 to 4 range each m and n are present Represents an integer of].

【０１５０】 その他の具体例では、本発明の化合物は、米国特許第５，６０２，０９８号に
記載された包括的構造式から選択でき、次の一般式（Ｘ）：In another embodiment, the compounds of the present invention can be selected from the generic structures described in US Pat. No. 5,602,098 and have the following general formula (X):

【化３０】 ［ここで、 Ｒ'は上で定義したとおりであり、 Ｘはロイシン残基又はその類似体であり、 βはｏ−、ｍ−若しくはｐ−アミノ安息香酸の残基又はアミノアルキル安息香
酸の残基である］ で表わすことができる。Embedded image Wherein R ′ is as defined above, X is a leucine residue or an analog thereof, β is a residue of o-, m- or p-aminobenzoic acid or the residue of aminoalkylbenzoic acid. Which is a group].

【０１５１】 また、プレニルトランスフェラーゼの阻害剤は、ＰＣＴ公開ＷＯ９５／２５０
８６に開示された化合物群のうちから選択でき、例えば、次の一般式（XI）：Also, inhibitors of prenyltransferase are described in PCT Publication WO 95/250.
86, for example, the following general formula (XI):

【化３１】 ［ここで、 Ｒは次式：Embedded image [Where R is the following formula:

【化３２】 （ここで、Ｒ'はＨ、低級アルキル、低級アルケニル、アリール、次式：Embedded image (Where R ′ is H, lower alkyl, lower alkenyl, aryl, the following formula:

【化３３】 の基である） の基を表わし、 Ｒ₇はアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル又は複素環を表わし、 Ｒ'₁₁はアルキル、アルケニル又は−（ＣＨ₂）_m−Ｒ₇を表わし、 Ｒ₄₆は存在するごとに独立して水素、低級アルキル又はアリールを表わし、 Ｒ₇₀は存在するごとに独立してＨ、次式：Embedded image Represents a group of a group), R ₇ represents an aryl, a cycloalkyl, a cycloalkenyl, or heterocycle, R _'11 is alkyl, alkenyl or - represents (CH _{2) m} -R _7, the R ₄₆ present Each independently represents hydrogen, lower alkyl or aryl; R ₇₀ is independently H whenever it is present;

【化３４】 の基、低級アルキル、低級アルケニル、低級アルキニル、アリール、アルキルア
リール、シクロアルキル、アルコキシアルキル、アルキルチオアルキル、ヒドロ
キシアルキル、アミノアルキル、カルボキシアルキル、アルコキシカルボニルア
ルキル、アリールアルキル、アルキルスルホニルアルキル、アミノ酸残基又はそ
の類似体のα−炭素側鎖又はその他のアミノ保護基又は製薬上許容できる塩を表
わし、或いは Ｒ₇₀はＲは一緒になって４〜８員の複素環を形成し、 Ｒ₉₂はＨ、低級アルキル、アリール、ヘテロアリール又はアミノ酸の側鎖を表
わし、 Ｒ₈₀は水素、低級アルキル、低級アルケニル、低級アルキニル又は−（ＣＨ₂
）_m−Ｒ₇を表わし、 Ｘは存在するごとに独立してＯ又はＳを表わし、 Ｘ₂はＯ又はＳを表わし、 Ｒ₉₃はＨ、低級アルキル、アリール又はヘテロアリールを表わし、 Ｒ₉₄はシクロアルキル、複素環、アリール、次式：Embedded image Group, lower alkyl, lower alkenyl, lower alkynyl, aryl, alkylaryl, cycloalkyl, alkoxyalkyl, alkylthioalkyl, hydroxyalkyl, aminoalkyl, carboxyalkyl, alkoxycarbonylalkyl, arylalkyl, alkylsulfonylalkyl, amino acid residue or Represents an α-carbon side chain or other amino protecting group of the analog or a pharmaceutically acceptable salt, or R ₇₀ is taken together to form a 4- to 8-membered heterocycle; R ₉₂ is H, R ₈₀ represents hydrogen, lower alkyl, lower alkenyl, lower alkynyl or — (CH ₂
) Represents the _m -R _7, X represents O or S independently of each present, X ₂ represents O or S, R ₉₃ represents H, lower alkyl, aryl or heteroaryl, R ₉₄ is Cycloalkyl, heterocycle, aryl, of the formula:

【化３５】 の基、−ＣＨ₂−Ｒ₉₅又は任意のその他のアミノ保護基を表わし、 Ｒ₉₅は低級アルキル、複素環、アリール、低級アルコキシ、−（ＣＨ₂）_n−Ａ
−（ＣＨ₂）_m−低級アルキル（ここで、ＡはＯ、Ｓ、ＳＯ又はＳＯ₂である）又
は天然アミノ酸の任意の他の側鎖を表わし、 Ｒ₉₆はＨ、−ＮＨ₂、−ＮＨＯＨ、複素環、アリール、−Ｎ（Ｒ₉₇）₂、−ＯＲ ₉₈ 、−Ｎ（Ｒ₉₇）ＯＲ₉₈，−ＮＨＯＲ₉₈又は任意の他のカルボキシル保護基を表
わし、 Ｒ₉₇は存在するごとに独立して低級アルキル、複素環、アルキルオキシカルボ
ニル、アリール又は任意の他のアミノ保護基を表わし、 Ｒ₉₈は存在するごとに独立してＨ、低級アルキル、アシルオキシアルキル、ア
ルキルオキシアルキル、アルコキシカルボニル又はその他のヒドロキシル−若し
くはカルボニル−保護基を表わし、 Ｙは次式：Embedded imageA group of -CH_Two-R₉₅Or any other amino protecting group;₉₅Is lower alkyl, heterocyclic, aryl, lower alkoxy,-(CH_Two)_n-A
− (CH_Two)_mLower alkyl (where A is O, S, SO or SO_TwoIs)
Represents any other side chain of a natural amino acid;₉₆Is H, -NH_Two, -NHOH, heterocycle, aryl, -N (R₉₇)_Two, -OR ₉₈ , -N (R₉₇) OR₉₈, -NHOR₉₈Or any other carboxyl protecting groups
I, R₉₇Is independently at each occurrence lower alkyl, heterocyclic, alkyloxycarbo
Rn represents aryl, aryl or any other amino protecting group;₉₈Is independently H, lower alkyl, acyloxyalkyl, a
Alkyloxyalkyl, alkoxycarbonyl or other hydroxyl-only
Y represents the following formula:

【化３６】 の基よりなる群から選択され、 Ｒ₁₀₂は存在しないか又は１個以上の置換基を表わし、後者は独立してハロゲ
ン、−ＯＨ、低級アルキル、低級アルケニル、低級アルキニル、アルコキシ、ア
シルオキシ、アシル、アリール、複素環、アルキルスルホニルオキシ、ハロアル
キルスルホニルオキシ、アリールスルホニルオキシ又はアリールオキシであり、 Ｒ₁₀₃はＨ、低級アルキル、アリール又は複素環を表わし、 Ｒ₁₀₄はＨ、低級アルキル、アリール又は複素環を表わし、 ＺはＯ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ₂又はアミンを表わし、 ｍ及びｎは存在するごとに独立して０又は１〜４の範囲の整数を表わす］ で表わすことができる。Embedded image Wherein R ₁₀₂ is absent or represents one or more substituents, the latter being independently halogen, —OH, lower alkyl, lower alkenyl, lower alkynyl, alkoxy, acyloxy, acyl, Aryl, heterocycle, alkylsulfonyloxy, haloalkylsulfonyloxy, arylsulfonyloxy or aryloxy; R ₁₀₃ represents H, lower alkyl, aryl or heterocycle; R ₁₀₄ represents H, lower alkyl, aryl or heterocycle. And Z represents O, S, SO, SO ₂ or an amine, and m and n each independently represent 0 or an integer in the range of 1 to 4].

【０１５２】 その他の具体例では、プレニルトランスフェラーゼの阻害剤は、一般式（XII
）：α−アミノ−Ｎ−［１−（２−Ｍｅｔ−２−オキソエチル）−１−アゼピン
３−イル］−Ｃｙｓ（ここで、Ｃｙｓはシステイン又はアゼピンの３−アミノ部
分によりカルボキシ末端結合されるシステイン類似体を表わし、Ｍｅｔはメチオ
ニン又はアゼピンの２−オキソエチル部分とのペプチド結合によりアミノ末端結
合されるメチオニン類似体を表わす）により表わされるアゼピンから誘導された
ペプチド様物質である。ジペプチジルアミド骨格であるアゼピン中心擬態物（mi
mics）並びにＣｙｓ、アゼピン及びＭｅｔ（又はＳｅｒ）部分は、一緒になって
一般式：Ｃｙｓ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｍｅｔ又はＣｙｓ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｓｅｒ
のペプチジル類似体を形成する。本発明のある種の具体例では、Ｃｙｓ部分は、
アミノ末端でペプチド様を更に拡張するためにメチオニンのＮ−末端にペプチジ
ル結合で結合する追加のアミノ酸残基又はペプチドを更に含むことができる。In another embodiment, the inhibitor of prenyltransferase has the general formula (XII
): Α-Amino-N- [1- (2-Met-2-oxoethyl) -1-azepin-3-yl] -Cys, wherein Cys is carboxy-terminally linked to the 3-amino moiety of cysteine or azepine. Met is a peptide-like substance derived from azepine represented by methionine or a methionine analog which is amino-terminally linked by a peptide bond to the 2-oxoethyl moiety of azepine). Azepine-centered mimetic of the dipeptidylamide skeleton (mi
mics) and the Cys, azepine and Met (or Ser) moieties together have the general formula: Cys-Xaa-Xaa-Met or Cys-Xaa-Xaa-Ser
To form a peptidyl analog of In certain embodiments of the invention, the Cys moiety comprises:
Additional amino acid residues or peptides linked by a peptidyl bond to the N-terminus of methionine to further extend the peptide like at the amino terminus can be included.

【０１５３】 一具体例では、ペプチジル−アゼピンは、次式（XIII）：In one embodiment, the peptidyl-azepine has the formula (XIII):

【化３７】 ［ここで、 Ａはシクロアルキル、シクロアルケニル、アリール及び複素環式環よりなる群
から選択される縮合環を表わし、この縮合環はその環構造内に４〜８個の原子を
含むことができ、 Ｒは次式：Embedded image [Where A represents a condensed ring selected from the group consisting of cycloalkyl, cycloalkenyl, aryl and heterocyclic ring, and this condensed ring may have 4 to 8 atoms in its ring structure. R is the following formula:

【化３８】 （ここで、 Ｒ'はＨ、低級アルキル、低級アルケニル、アリール、次式：Embedded image (Where R ′ is H, lower alkyl, lower alkenyl, aryl,

【化３９】 の基である） の基を表わし、 Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₈及びＲ₁₀は独立して水素、ハロゲン、アルキル、アルケニル、
アルキニル、ヒドロキシル、アルコキシル、シリルオキシ、アミノ、ニトロ、ス
ルフヒドリル、アルキルチオ、イミン、アミド、ホスホリル、ホスホネート、ホ
スフィン、カルボニル、カルボキシル、カルボキサアミド、アンヒドリド、シリ
ル、チオアルキル、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、セレノアルキル
、ケトン、アルデヒド、エステル、ヘテロアルキル、ニトリル、グアニジン、ア
ミジン、アセタール、ケタール、アミンオキシド、アリール、ヘテロアリール、
アジド、アジリジン、カルバメート、エポキシド、ヒドロキサム酸、イミド、オ
キシム、スルホンアミド、チオアミド、チオカルバメート、ウレア、チオウレア
又は−（ＣＨ₂）_m−Ｒ₇を表わし、 Ｒ₄及びＲ₅はそれぞれ独立して水素、低級アルキル、低級アルケニル、−（Ｃ
Ｈ₂）_m−Ｒ₇、−Ｃ（Ｏ）−低級アルキル、−Ｃ（Ｏ）−低級アルケニル、−Ｃ
（Ｏ）−（ＣＨ₂）_m−Ｒ₇又は製薬上許容できる塩の形成性イオンを表わし、或
いは Ｒ₄及びＲ₅はこれらが結合したＮ原子と共に環構造内に４〜８個の原子を有す
る複素環式環を形成し、 Ｒ₇はアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル又は複素環を表わし、 Ｒ₉は水素又は低級アルキルであり、 Ｒ₁₁は水素、カルボキシ末端ブロッキング基又は製薬上許容できる塩を表わし
、 Ｒ'₁₁はアルキル、アルケニル又は−（ＣＨ₂）_m−Ｒ₇を表わし、 Ｒ₁₂は−Ｎ（Ｒ₄）（Ｒ₅）を表わし、 Ｒ₁₃は水素又は低級アルキルを表わし、 Ｒ₁₄は存在しないか又は１個以上の置換基（これはハロゲン、低級アルキル、
低級アルコキシル、低級アルキルチオール、−ＮＯ₂、−ＣＦ₃、−ＣＮ及び−Ｏ
Ｈから選択される）を表わし、 Ｒ₄₆は存在するごとに独立して水素、低級アルキル又はアリールを表わし、 Ｒ₈₀は水素、低級アルキル、低級アルケニル、低級アルキニル又は−（ＣＨ₂
）_m−Ｒ₇を表わし、 Ｘ及びＸ₂は存在するごとにＯ又はＳを表わし、 ＺはＣ又はＮを表わし、 ｎは０であるか又は１〜６の整数であり、 ｍは０〜６の範囲の整数である］ により表わされる（この一般構造式群のプレニルトランスフェラーゼ阻害剤の多
数の例が米国特許第５，５３２，３５９号に記載されている）。Embedded image Wherein R ₁ , R ₂ , R ₈ and R ₁₀ are independently hydrogen, halogen, alkyl, alkenyl,
Alkynyl, hydroxyl, alkoxyl, silyloxy, amino, nitro, sulfhydryl, alkylthio, imine, amide, phosphoryl, phosphonate, phosphine, carbonyl, carboxyl, carboxamide, anhydride, silyl, thioalkyl, alkylsulfonyl, arylsulfonyl, selenoalkyl, ketone , Aldehyde, ester, heteroalkyl, nitrile, guanidine, amidine, acetal, ketal, amine oxide, aryl, heteroaryl,
Azide, aziridine, carbamate, epoxide, hydroxamic acid, imide, oxime, sulfonamide, thioamide, thiocarbamate, urea, thiourea or — (CH ₂ ) _m —R ₇ , wherein R ₄ and R ₅ are each independently hydrogen , Lower alkyl, lower alkenyl,-(C
_{H 2) m -R 7, -C} (O) - lower alkyl, -C (O) - lower alkenyl, -C
(O) — (CH ₂ ) _m —R ₇ or a pharmaceutically acceptable salt-forming ion; or R ₄ and R ₅ together with the N atom to which they are attached have 4-8 atoms in the ring structure. R ₇ represents aryl, cycloalkyl, cycloalkenyl or a heterocyclic ring; R ₉ is hydrogen or lower alkyl; R ₁₁ is hydrogen, a carboxy-terminal blocking group or a pharmaceutically acceptable salt. R ′ ₁₁ represents alkyl, alkenyl or — (CH ₂ ) _m —R ₇ ; R ₁₂ represents —N (R ₄ ) (R ₅ ); R ₁₃ represents hydrogen or lower alkyl; ₁₄ is absent or has one or more substituents, which are halogen, lower alkyl,
Lower alkoxyl, lower alkyl thiol, -NO _2, -CF _3, -CN and -O
R ₄₆ is independently hydrogen, lower alkyl or aryl, whenever present, R ₈₀ is hydrogen, lower alkyl, lower alkenyl, lower alkynyl or — (CH ₂
) Represents the _m -R _7, X and X ₂ represents O or S each present, Z represents C or N, n is a or is an integer from 1 to 6 0, m is 0 (Numerous examples of prenyltransferase inhibitors of this general structural group are described in US Pat. No. 5,532,359).

【０１５４】 ある種の具体例では、縮合環Ａは、ベンゼン、ピロール、フラン、チオフェン
、イミダゾール、オキサゾール、チアゾール、トリアゾール、ピラゾール、ピロ
リジン、ピリミジン、ピラジン、ピリダジン、ピリミジンなどよりなる群から選
択される。縮合環Ａは、例えば、ハロゲン、低級アルキル、低級アルコキシ、低
級アルキルチオ、−ＮＯ₂、−ＣＦ₃、−ＣＮ及び−ＯＨのいずれかにより置換さ
れていてよい。しかし、ある場合には、７位に（特に、Ａがベンゼン環である場
合に）ハロゲン又はニトロ基のような置換基を有することは、そのような置換基
がジアゼパム又はニトラゼパムのようなその他のベンゾジアゼピンにおいて鎮静
−催眠活性のために一般に要求されるので、望ましくないかもしれないことを理
解されたい。For certain embodiments, fused ring A is selected from the group consisting of benzene, pyrrole, furan, thiophene, imidazole, oxazole, thiazole, triazole, pyrazole, pyrrolidine, pyrimidine, pyrazine, pyridazine, pyrimidine, and the like. . Fused ring A is, for example, halogen, lower alkyl, lower alkoxy, lower alkylthio, -NO _2, -CF _3, may be substituted by any of -CN and -OH. However, in some cases, having a substituent such as a halogen or a nitro group at the 7 position (especially when A is a benzene ring) means that such a substituent may be in other positions such as diazepam or nitrazepam. It should be understood that benzodiazepines may be undesirable as they are generally required for sedative-hypnotic activity.

【０１５５】 同様に、更に好ましいオプションの具体例では、Ｒ₁は、特に、−（ＣＨ₂）_m
−フェニル、−（ＣＨ₂）_n−Ｓ−（ＣＨ₂）_m−フェニル、−（ＣＨ₂）_n−Ｏ−（
ＣＨ₂）_m−フェニル、−（ＣＨ₂）_m−ピリジル、−（ＣＨ₂）_n−Ｓ−（ＣＨ₂）_m −ピリジル及び−（ＣＨ₂）_n−Ｏ−（ＣＨ₂）_m−ピリジルよりなる群から選択さ
れる。更に、ベンジル及びピリジル部分のそれぞれは、ハロゲン、低級アルキル
、低級アルコキシ、低級アルキルチオ、−ＮＯ₂、−ＣＦ₃、−ＣＮ及び−ＯＨに
より１個以上の位置で置換されていてよい。アゼピンペプチド様物質のＲ₁並び
にその他の置換基の選定は、本発明の主題のペプチド様物質の溶解度並びに膜分
配に影響し得る。例えば、それらのピリジル置換の性質の結果として、ピリジル
含有Ｒ₁置換基は、類似のフェニル置換アゼピンよりも大きい水溶解度を示すこ
とができる。Similarly, in a further preferred optional embodiment, R ₁ is, in particular, — (CH ₂ ) _m
- _{phenyl, - (CH 2) n -S-} (CH 2) m - _{phenyl, - (CH 2) n -O-} (
CH _{2) m} - phenyl, - (CH _{2) m} - _{pyridyl, - (CH 2) n -S-} (CH 2) m - pyridyl and _{- (CH 2) n -O- (} CH 2) m - from pyridyl Selected from the group consisting of: Furthermore, each of the benzyl and pyridyl moiety, halogen, lower alkyl, lower alkoxy, lower alkylthio, -NO _2, -CF _3, optionally substituted with one or more positions by -CN and -OH. The choice of R ₁ as well as other substituents of the azepine peptidomimetic can affect the solubility and membrane partitioning of the peptidomimetic subject of the present invention. For example, as a result of their pyridyl-substituted nature, pyridyl-containing R ₁ substituents can exhibit greater water solubility than similar phenyl-substituted azepines.

【０１５６】 典型的な具体例において、本発明のペプチド様物質は、次の一般式XIVで表わ
されるベンゾジアゼピンである（この式の化合物の特定的な例及び代表的な合成
式については、他にもあるが特に米国特許第５５８０９７９号明細書を参照され
たい）：In a typical embodiment, the peptidomimetic of the invention is a benzodiazepine represented by the following general formula XIV (for specific examples of compounds of this formula and representative synthetic formulas, see (See especially US Pat. No. 5,580,979):

【化４０】 ［ここで、 Ｒ、Ｒ₁、Ｒ₈、Ｒ₁₀、Ｒ₁₁、Ｒ₁₂、Ｒ₁₄は式XIIIにおいて上で定義したとおり
であり、 Ｘ₁はＯ又はＳを表わし、 Ｘ₂は水素、低級アルキル、−(ＣＨ₂)_m−ＯＨ、−(ＣＨ₂)_m−Ｏ−低級アルキ
ル、カルボキシル、アミド、ニトロシル、スルフヒドリル、スルホニル又はスル
ホンアミドを表わし、 ｎは０又は１〜６の範囲の整数であり、 ｍは１〜６の範囲の整数である］。Embedded image Wherein R, R ₁ , R ₈ , R ₁₀ , R ₁₁ , R ₁₂ , R ₁₄ are as defined above in formula XIII, X ₁ represents O or S, X ₂ is hydrogen, lower _{alkyl, - (CH 2) m -OH} , - (CH 2) m -O- lower alkyl, carboxyl, amide, nitrosyl, sulfhydryl, a sulfonyl or sulfonamido, n represents an integer ranging from 0 or 1 to 6 And m is an integer in the range of 1-6.

【０１５７】 例えば、前記ペプチド様物質は、次の一般式XVで表わされる５−フェニル置換
−１，４−ジアゼピンであることができる。For example, the peptidomimetic can be a 5-phenyl-substituted-1,4-diazepine represented by the following general formula XV.

【化４１】 ［ここで、Ｒ₈、Ｒ₁₀、Ｒ₁₁、Ｒ₁₂ は式XIIIにおいて上で定義したとおりであ
る］。Embedded image [Where R ₈ , R ₁₀ , R ₁₁ , R ₁₂ are as defined above in formula XIII].

【０１５８】 プレニルトランスフェラーゼ阻害剤として選択することができる別の類のアゼ
ピン誘導様物質は、国際公開ＷＯ９７／３０９９２号パンフレットに記載されて
おり、この阻害剤は例えば次の一般式XVI、XVII、XVIII、XIXの内の１つで表わ
されることができる。Another class of azepine-derived mimetics which can be selected as prenyltransferase inhibitors is described in WO 97/30992, which has, for example, the general formula XVI, XVII, XVIII , XIX.

【化４２】 Embedded image

【化４３】 ［ここで、 ｍ及びｎは独立的に０又は１であり、 ｐは０、１又は２であり、 Ｖ、Ｗ及びＸはＯ、Ｈ₂、Ｒ₂₀₁、Ｒ₂₀₂ 又はＲ₂₀₃より成る群から選択され、 Ｆ及びＹ₄はＣＨＲ₂₀₉、ＳＯ₂、ＳＯ₃、ＣＯ、ＣＯ₂、Ｏ、ＮＲ₂₁₀、ＳＯ₂、
ＳＯ₃、ＣＯ、ＣＯ₂、Ｏ、ＮＲ₂₁₀、ＳＯ₂ＮＲ₂₁₁、ＣＯＮＲ₂₁₂、Embedded image Wherein m and n are independently 0 or 1, p is 0, 1 or 2, V, W and X are from the group consisting of O, H ₂ , R ₂₀₁ , R ₂₀₂ or R ₂₀₃ And F and Y ₄ are CHR ₂₀₉ , SO ₂ , SO ₃ , CO, CO ₂ , O, NR ₂₁₀ , SO ₂ ,
SO ₃ , CO, CO ₂ , O, NR ₂₁₀ , SO ₂ NR ₂₁₁ , CONR ₂₁₂ ,

【化４４】 より成る群から選択され、又はＦは存在しないこともでき、 Ｒ₂₀₆、Ｒ₂₀₇、Ｒ₂₀₉、Ｒ₂₁₀、Ｒ₂₁₁、Ｒ₂₁₂、Ｒ₂₁₃、Ｒ₂₁₄、Ｒ₂₁₅、Ｒ₂₁₆、
Ｒ₂₁₇、Ｒ₂₁₈、Ｒ₂₁₉、Ｒ₂₂₀、Ｒ₂₂₁、Ｒ₂₂₂、Ｒ₂₂₄、Ｒ₂₂₅、Ｒ₂₂₆、Ｒ₂₂₇、Ｒ ₂₂₈ 、Ｒ₂₂₉、Ｒ₂₃₀、Ｒ₂₃₁、Ｒ₂₃₂、Ｒ₂₃₃、Ｒ₂₃₄、Ｒ₂₃₅、Ｒ₂₃₆、Ｒ₂₃₇及びＲ ₂₃₈ は独立的にＨ、低級アルキル又はアリールより成る群から選択され、 Ｒ₂₀₄及びＲ₂₀₅はＨ、ハロゲン、ニトロ、シアノ及びＵ−Ｒ₂₂₃ より成る群
から選択され、 ＵはＳ、Ｏ、ＮＲ₂₂₄、ＣＯ、ＳＯ、ＳＯ₂、ＣＯ₂、ＮＲ₂₅ＣＯ₂、ＮＲ₂₆ＣＮ
Ｒ₂₇、ＮＲ₂₈ＳＯ₂、ＮＲ₂₉ＳＯ₂ＮＲ₃₀,、ＳＯ₂ＮＲ₃₁、ＮＲ₃₂ＣＯ、ＣＣＯＮ
Ｒ₃₃, ＰＯ₂Ｒ₃₄、ＰＯ₃Ｒ₃₅より成る群から選択されるか、又はＵは存在しない
か、であり、 Ｒ₂₀₁、Ｒ₂₀₂、Ｒ₂₀₃は存在しないか、又はそれぞれ独立的にアルキル、アル
コキシカルボニル、アルケニル、アルキニル、アルアルキル、シクロアルキル、
アリール、ヘテロ環、シアノ、カルボキシ及びカルバミルより成る群から選択さ
れ若しくは単一の窒素上に２個の置換基がある場合にはアルキル、アリール及び
アルアルキルより成る群から選択されるか、又は Ｒ₂₀₁、Ｒ₂₀₂及びＲ₂₀₃の任意の２個が一緒になってシクロアルキル若しくは
ヘテロ環を形成するか、であり、 Ｒ₂₀₈及びＲ₂₂₃はＨ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルアルキル、シ
クロアルキル、アリール及びヘテロ環より成る群から選択され、 Y₁、Y₂及びY₃は独立的に、存在しないか、又は−ＣＨ₂、−Ｃ(Ｏ)−及び−Ｃ
Ｈ(ＣＨ₂)−Ｑ−より成る群から選択されるか、であり、 ＱはＮＲ₂₃₆、Ｒ₂₃₇、ＯＲ₂₃₈ 又はＣＮであり、 Ａ、Ｂ、Ｄ及びＥはＣ、Ｏ、Ｓ又はＮであり、 但し、 (i) ｍが０である場合にはＶ及びＷが両方とも酸素であることはなく、 (ii) 式XVII及びXVIIIにおいてＦが存在しないか又はＯ、Ｏ、ＮＲ₂₁₀、ＣＨＲ ₂₀₉ 、−Ｎ(Ｒ₂₁₄)−Ｃ(Ｏ)−若しくは−Ｎ(Ｒ₂₁₅)−ＳＯ₂であるかの時だけＷ及
びＸが共に酸素であることができ、式XIX及びXXにおいてＦがＯ、ＮＲ₂₁₀、ＣＨ
Ｒ₂₀₉、−Ｎ(Ｒ₂₁₄)−Ｃ(Ｏ)−又は−Ｎ(Ｒ₂₁₅)−ＳＯ₂−である時だけＶ及びＸ
が共に酸素であることができ、 (iii) Ｒ₂₂₃は、ＵがＳＯ、ＳＯ₂、ＮＲ₂₂₅ＣＯ₂又はＮＲ₂₂₈ＳＯ₂である場合を
除いてＨ₂であることができ、 (iv) Ｒ₂₀₈はＦがＳＯ₂、ＣＯ₂、Embedded imageR can be selected from the group consisting of:₂₀₆, R₂₀₇, R₂₀₉, R₂₁₀, R₂₁₁, R₂₁₂, R₂₁₃, R₂₁₄, R₂₁₅, R₂₁₆,
R₂₁₇, R₂₁₈, R₂₁₉, R₂₂₀, R₂₂₁, R₂₂₂, R₂₂₄, R₂₂₅, R₂₂₆, R₂₂₇, R ₂₂₈ , R₂₂₉, R₂₃₀, R₂₃₁, R₂₃₂, R₂₃₃, R₂₃₄, R₂₃₅, R₂₃₆, R₂₃₇And R ₂₃₈ Is independently selected from the group consisting of H, lower alkyl or aryl;₂₀₄And R₂₀₅Is H, halogen, nitro, cyano and UR₂₂₃ Group consisting of
U is S, O, NR₂₂₄, CO, SO, SO_Two, CO_Two, NR_{twenty five}CO_Two, NR₂₆CN
R₂₇, NR₂₈SO_Two, NR₂₉SO_TwoNR₃₀,, SO_TwoNR₃₁, NR₃₂CO, CCON
R₃₃, PO_TwoR₃₄, PO_ThreeR₃₅Selected from the group consisting of or U is absent
Or R₂₀₁, R₂₀₂, R₂₀₃Are not present or are each independently alkyl,
Coxycarbonyl, alkenyl, alkynyl, aralkyl, cycloalkyl,
Selected from the group consisting of aryl, heterocycle, cyano, carboxy and carbamyl
Or if there are two substituents on a single nitrogen, alkyl, aryl and
Selected from the group consisting of aralkyl, or R₂₀₁, R₂₀₂And R₂₀₃Any two of together are cycloalkyl or
Forming a heterocycle, or₂₀₈And R₂₂₃Is H, alkyl, alkenyl, alkynyl, aralkyl,
Selected from the group consisting of chloroalkyl, aryl and heterocycles, Y₁, Y_TwoAnd Y_ThreeAre independently absent or -CH_Two, -C (O)-and -C
H (CH_Two) -Q- is selected from the group consisting of₂₃₆, R₂₃₇, OR₂₃₈ Or A, B, D and E are C, O, S or N, provided that (i) when m is 0, V and W are not both oxygen; ii) ExpressionXVIIas well asXVIIIIn which F is absent or O, O, NR₂₁₀, CHR ₂₀₉ , -N (R₂₁₄) -C (O)-or -N (R₂₁₅) -SO_TwoW only if it is
And X can both be oxygen, with the formulaXIXas well asXXIn which F is O, NR₂₁₀, CH
R₂₀₉, -N (R₂₁₄) -C (O)-or -N (R₂₁₅) -SO_TwoV and X only when-
Can both be oxygen; (iii) R₂₂₃Is that U is SO, SO_Two, NR₂₂₅CO_TwoOr NR₂₂₈SO_TwoIf
Except H_Two(Iv) R₂₀₈Is F is SO_Two, CO_Two,

【化４５】 である場合を除いてＨであることができる］。Embedded image Can be H except where

【０１５９】 さらに別の具体例において、主題のプレニルトランスフェラーゼ阻害剤は、次
の式の内の１つによって表わされる。最初に、主題の化合物は、式XXで表わされ
るレトロＮ−アルキルオリゴグリシンペプトイド（Simonら、Proc. Natl. Acad.
Sci.、USA 1992、89、9367; Zuckermannら、J. Med. Chem. 1994、37、2678）
であることができる。In yet another embodiment, a subject prenyltransferase inhibitor is represented by one of the following formulae: First, the subject compound is a retro N-alkyl oligoglycine peptoid of formula XX (Simon et al., Proc. Natl. Acad.
Sci., USA 1992, 89, 9367; Zuckermann et al., J. Med. Chem. 1994, 37, 2678).
Can be

【化４６】 ［ここで、 Ｒはそれぞれの場合について独立的にＨ、Ｍｅ、低級アルキル、アリール、ア
ルアルキル、ヘテロアルキル又はヘテロアリールを表わし、 Ｒ'はそれぞれの場合について独立的にＭｅ、低級アルキル、アリール、アル
アルキル、ヘテロアルキル又はヘテロアリールを表わし、 Ｒ₄₀₀はＳ−Ｒ又はＯ−Ｒを表わし、ここでＲは上で定義したとおりであり、 ＺはＨ、Ｍｅ、低級アルキル、アリール、アルアルキル、ヘテロアルキル、ヘ
テロアリール、アシル、スルホニル、−Ｃ(Ｏ)ＯＲ又は−Ｃ(Ｏ)Ｎ(Ｒ)₂ を表
わし、 ｎはそれぞれの場合について独立的に１〜３の範囲の整数を表わす］。Embedded image [Wherein, R independently represents H, Me, lower alkyl, aryl, aralkyl, heteroalkyl or heteroaryl in each case, and R ′ independently represents Me, lower alkyl, aryl, R ₄₀₀ represents S—R or O—R, wherein R is as defined above; Z is H, Me, lower alkyl, aryl, aralkyl, Represents heteroalkyl, heteroaryl, acyl, sulfonyl, —C (O) OR or —C (O) N (R) ₂ , wherein n in each case independently represents an integer in the range 1 to 3].

【０１６０】 第二に、主題の化合物は、式XXIで表わされるＮ−アルキルオリゴグリシンペ
プトイドであることもできる。Second, the subject compounds can also be N-alkyl oligoglycine peptoids of the formula XXI.

【化４７】 ［ここで、 Ｒはそれぞれの場合について独立的にＨ、Ｍｅ、低級アルキル、アリール、ア
ルアルキル、ヘテロアルキル又はヘテロアリールを表わし、 Ｒ'はそれぞれの場合について独立的にＭｅ、低級アルキル、アリール、アル
アルキル、ヘテロアルキル又はヘテロアリールを表わし、 Ｒ₄₀₀はＳ−Ｒ又はＯ−Ｒを表わし、ここでＲは上で定義したとおりであり、 ＺはＨ、Ｍｅ、低級アルキル、アリール、アルアルキル、ヘテロアルキル、ヘ
テロアリール、アシル、スルホニル、−Ｃ(Ｏ)ＯＲ又は−Ｃ(Ｏ)Ｎ(Ｒ)₂ を表
わし、 ｎはそれぞれの場合について独立的に１〜３の範囲の整数を表わす］。Embedded image [Wherein, R independently represents H, Me, lower alkyl, aryl, aralkyl, heteroalkyl or heteroaryl in each case, and R ′ independently represents Me, lower alkyl, aryl, R ₄₀₀ represents S—R or O—R, wherein R is as defined above; Z is H, Me, lower alkyl, aryl, aralkyl, Represents heteroalkyl, heteroaryl, acyl, sulfonyl, —C (O) OR or —C (O) N (R) ₂ , wherein n in each case independently represents an integer in the range 1 to 3].

【０１６１】 前述のように、本発明のある種のペプチド様物質は、特に幾何学異性又は立体
異性形態で存在することができる。本発明は、ｃｉｓ−及びｔｒａｎｓ−異性体
、Ｒ−及びＳ−エナンチオマー、ジアステレオマー、Ｄ−異性体、Ｌ−異性体、
それらのラセミ混合物、及びそれらのその他の混合物を含めてすべてのかかる化
合物が本発明の範囲内に含まれるものとする。アルキル基のような置換基中に追
加の不斉炭素原子が存在していてもよい。すべてのかかる異性体及びそれらの混
合物は本発明に包含されるものとする。As mentioned above, certain peptidomimetics of the present invention can exist in particular geometric or stereoisomeric forms. The present invention relates to cis- and trans-isomers, R- and S-enantiomers, diastereomers, D-isomers, L-isomers,
All such compounds, including their racemic mixtures and other mixtures thereof, are intended to be included within the scope of the present invention. Additional asymmetric carbon atoms may be present in a substituent such as an alkyl group. All such isomers and mixtures thereof are intended to be included in the present invention.

【０１６２】 例えば、本発明の化合物の特定的なエナンチオマーが望まれる場合、これは不
斉合成によって又はキラル補助剤による誘導化によって調製することができ、得
られるジアステレオマー混合物は分離され、補助基は開裂されて純粋な所望のエ
ナンチオマーを提供する。別法として、分子がアミノのような塩基性官能基又は
カルボキシルのような酸性官能基を含有する場合には、好適な光学活性酸又は塩
基とのジアステレオマー塩を形成させ、次いでこうして生成したジアステレオマ
ーを当技術分野においてよく知られた分別結晶化又はクロマトグラフィー手段に
よって分割し、次いで純粋なエナンチオマーを回収することもできる。For example, if a particular enantiomer of a compound of the present invention is desired, it can be prepared by asymmetric synthesis or by derivatization with a chiral auxiliary, and the resulting diastereomeric mixture is separated, The group is cleaved to provide the pure desired enantiomer. Alternatively, if the molecule contains a basic functional group, such as amino, or an acidic functional group, such as carboxyl, a diastereomeric salt with a suitable optically active acid or base is formed and then formed. The diastereomers may be separated by fractional crystallization or chromatographic means well known in the art, and then the pure enantiomer recovered.

【０１６３】 ある種の具体例において、主題の方法のプレニルトランスフェラーゼ阻害剤は
、プレニルトランスフェラーゼの非ペプチド系阻害剤である。例えば、本発明の
方法は、プレニルジホスフェート類似体、特にファルネシルジホスフェートを用
いて実施することができる。かかる阻害剤には、非環状テルペンが包含される。
テルペンは、複数の２−メチル−１，３−ブタジエンから構成される有機化合物
である。本発明の阻害剤は、モノテルペン（ミルセニル部分のような２個のイソ
プレン単位を含有するもの）、セスキテルペン（ファルネシル部分のような３個
のかかる単位を含有するもの）又はジテルペン（ゲラニルゲラニル部分のような
４個のイソプレン亜単位を含有するもの）の類似体であることができる。[0163] In certain embodiments, the prenyltransferase inhibitor of the subject method is a non-peptide inhibitor of prenyltransferase. For example, the method of the present invention can be practiced using a prenyl diphosphate analog, particularly farnesyl diphosphate. Such inhibitors include acyclic terpenes.
Terpene is an organic compound composed of a plurality of 2-methyl-1,3-butadienes. The inhibitors of the present invention may be monoterpenes (containing two isoprene units such as a myrcenyl moiety), sesquiterpenes (containing three such units such as a farnesyl moiety) or diterpenes (of a geranylgeranyl moiety). Analogs containing four such isoprene subunits).

【０１６４】 １つの例示的な具体例において、テルペン誘導プレニルトランスフェラーゼ阻
害剤は、次の一般式（XXII）で表わされる。In one exemplary embodiment, the terpene-derived prenyltransferase inhibitor has the general formula (XXII):

【化４８】 ［ここで、 Ｒはそれぞれの場合について独立的にハロゲン又は低級アルキルを表わし、 Ｒ₁は−Ｈ、−ＯＨ、−Ｏ−アルキル、−Ｏ−アリール、−Ｏ−Ｃ(Ｏ)−Ｈ、
−Ｏ−Ｃ(Ｏ)−アルキル又は−Ｏ−Ｃ(Ｏ)−アリールを表わし、 Ｙは結合（即ち存在しない）又は −Ｓ−、−Ｏ−、−(ＣＨ₂)_m−、Embedded image [Wherein R in each case independently represents halogen or lower alkyl, R ₁ is -H, -OH, -O-alkyl, -O-aryl, -OC (O) -H,
-O-C (O) - alkyl, or -O-C (O) - aryl, Y is a bond (i.e. not present) or -S -, - O -, - (CH 2) m -,

【化４９】 を表わし、 Ｑは−Ｃ₁−Ｃ₆アルキル−Ｒ₂、−Ｃ(Ｏ)−Ｒ₂、−ＮＨ−(ＣＨ₂)_n−Ｒ₂、−
ＮＨ−Ｃ(Ｏ)−(ＣＨ₂)_n−Ｒ₂、−Ｃ(Ｏ)−ＮＨ(ＣＨ₂)−Ｒ₂を表わし、 Ｒ₂は水素、低級アルキル又はホスフェート若しくはビスホスフェート若しく
はそれらの類似体、例えばサルフェート、スルホネート、スルファモイル、スル
フィニル、スルホキシル、スルフィネート、ホスホリル、ホスホロチオアート、
ホスホルアミダイト、ホスホンアミダイト又はボロネートを表わし、 また、Ｙ及びＱは一緒になってEmbedded image Q represents -C ₁ -C ₆ alkyl-R ₂ , -C (O) -R ₂ , -NH- (CH ₂ ) _n -R ₂ ,-
NH-C (O) - ( CH 2) n -R 2, -C (O) represents _{-NH (CH 2) -R 2,} R 2 is hydrogen, lower alkyl or phosphate or bisphosphate or analogues thereof E.g., sulfate, sulfonate, sulfamoyl, sulfinyl, sulfoxyl, sulfinate, phosphoryl, phosphorothioate,
Represents phosphoramidite, phosphonamidite or boronate; and Y and Q together

【化５０】 を表わすこともでき、ここでＲ₃ は水素又は低級アルキルを表わし、Ｒ₄はそれ
ぞれの場合について独立的に水素、低級アルキル、−ＯＨ、−Ｏ−低級アルキル
又はカルボキシル保護基を表わし、 ｍはそれぞれの場合について独立的に１〜６の範囲の整数であり、 ｎはそれぞれの場合について独立的に０又は１〜６の範囲の整数であり、 Ｎは１〜３の範囲（好ましくは２まで）の整数である］。Embedded image Wherein R ₃ represents hydrogen or lower alkyl, R ₄ in each case independently represents hydrogen, lower alkyl, —OH, —O-lower alkyl or a carboxyl protecting group; In each case independently an integer in the range of 1 to 6, n is independently in each case an integer in the range of 0 or 1 to 6, and N is in the range of 1 to 3 (preferably up to 2) )].

【０１６５】 例えば、当技術分野では、哺乳類ＦＰＴアーゼ又はプレニルトランスフェラー
ゼの阻害の範疇において、様々なイソプレニルジホスフェートの類似体（例えば
生物学的に不安定なジホスフェート部分が安定な同配体である基に置き換えられ
たもの）が報告されている。当技術分野において報告されている様々な化合物及
びそれらから自明であるある種の等価物は、細胞成長の阻害について、直接的に
、又は最初に本明細書に記載されたかかる高処理量の細胞なし分析において化合
物を評価することによって、試験することができる。For example, in the art, in the category of inhibition of mammalian FPTase or prenyltransferase, various analogs of isoprenyl diphosphate (eg, a biologically unstable diphosphate moiety is a stable isotope). Replaced by certain groups). The various compounds reported in the art, and certain equivalents thereof, are useful for inhibiting cell growth, either directly or initially at such high-throughput cells as described herein. Testing can be done by evaluating the compound in a null analysis.

【０１６６】 例えば、Macchiaらは(1996) J Med Chem 39:1352に、哺乳類プレニルトランス
フェラーゼ活性の非ペプチド系阻害剤を報告している。Macchiaらによって報告
されている化合物には、一般式XXII（前記したもの）で表わされるものが包含さ
れる。For example, Macchia et al. (1996) J Med Chem 39: 1352 report non-peptide inhibitors of mammalian prenyltransferase activity. The compounds reported by Macchia et al. Include those represented by the general formula XXII (as described above).

【化５１】 ［ここで、 Ｎは２であり、 各Ｒはメチルを表わし、 Ｒ₁は水素を表わし、 Ｙは−Ｏ−を表わし、 ＱはＣ(Ｏ)−ＮＨ(ＣＨ₂)_n−Ｒ₂又は−ＮＨ−Ｃ(Ｏ)−(ＣＨ₂)₁₁−Ｒ₂ を表
わし、 Ｒ₂はスルファモイル、ホスホリル又はホスホリルアルキルを表わす］。Embedded image [Where N is 2, each R represents methyl, R ₁ represents hydrogen, Y represents -O-, and Q represents C (O) -NH (CH ₂ ) _n -R ₂ or- NH-C (O) - ( CH 2) represents ₁₁ -R _2, R ₂ represents sulfamoyl, phosphoryl or phosphoryl alkyl.

【０１６７】 Balsamoは国際公開ＷＯ９７／１９０９１号パンフレットに、主題の方法にお
いて有用であることができる別のプレニルトランスフェラーゼ阻害剤を報告して
いる。例えば、この刊行物に記載された化合物もまた前記の一般式XXIIで表わさ
れ、ここで、 Ｙは−ＣＨ₂−Ｘ−Ａ−、ＣＨ₂−ＣＨ₂又は−ＣＨ(ＯＨ)−を表わし、 Ｘは−ＯＮＨ−、−ＯＮＨ−Ｃ(Ｏ)−、−ＯＣＨ₂Ｃ(Ｏ)−、ＯＣＨ₂Ｐ(Ｏ)(
ＯＨ)−、−ＮＨＣ(Ｏ)−、−ＮＣＨ₃Ｃ(Ｏ)−、−Ｏ−ＳＯ₂−又は−ＮＨＳＯ₂ −を表わし、 Ａは−Ｃ(Ｒ')(Ｒ'')−、−Ｃ(Ｒ')ＨＣＨ₂−、ＮＨ（Ｘが−ＯＳＯ₂−若しく
は−ＮＨＳＯ₂−の時）を表わし、 Ｂは−ＯＣ(Ｏ)−、−Ｏ−、−ＯＮＨＣ(Ｏ)−、−ＮＨＣ(Ｏ)−又は−ＮＣＨ ₃ Ｃ(Ｏ)−を表わし、 Ｒ'、Ｒ''はそれぞれ独立的にＨ、ＣＨ₃又はＣＨ₂ＣＨ₃を表わす。Balsamo describes in the WO 97/19091 pamphlet the subject method.
Report another prenyltransferase inhibitor that can be useful
I have. For example, the compounds described in this publication are also of the general formulaXXIIRepresented by
Where Y is -CH_Two-XA-, CH_Two-CH_TwoOr -CH (OH)-, wherein X is -ONH-, -ONH-C (O)-, -OCH_TwoC (O)-, OCH_TwoP (O) (
OH)-, -NHC (O)-, -NCH_ThreeC (O)-, -O-SO_Two-Or-NHSO_Two A represents -C (R ') (R ")-, -C (R') HCH_Two-, NH (X is -OSO_Two-Young
Is -NHSO_TwoB represents -OC (O)-, -O-, -ONHC (O)-, -NHC (O)-or -NCH _Three R ′ and R ″ independently represent H, CH_ThreeOr CH_TwoCH_ThreeRepresents

【０１６８】 Randoは国際公開ＷＯ９４／０１１２６号パンフレットに、さらに別の類のプ
レニルトランスフェラーゼ阻害剤を教示しており、これには次の一般式で表わさ
れるものが包含される。 Ｗ−Ｙ−ＣＨ₂−Ｑ ［ここで、 Ｗはファルネシル、ゲラニルゲラニル、置換ファルネシル又は置換ゲラニルゲ
ラニルを表わし、 Ｙは−Ｓ−、−Ｏ−、−ＣＨ₂−、Rando teaches yet another class of prenyltransferase inhibitors in WO 94/01126, including those represented by the general formula: W—Y—CH ₂ —Q wherein W represents farnesyl, geranylgeranyl, substituted farnesyl or substituted geranylgeranyl, and Y represents —S—, —O—, —CH ₂ —,

【化５２】 を表わし、 ＱはEmbedded image And Q is

【化５３】 を表わし、 Ｔ₁はＨ、Ｆ又は−(ＣＨ₂)_n−Ｘ₁を表わし、 Ｔ₂は−ＮＨＣＯＣＨ₃、−ＮＨ−(ＣＨ₂)_n−Ｘ₁、−ＮＨＣ(Ｏ)−ＯＣ(ＣＨ₃) ₃ 又は２０個以下のアミノ酸を有し且つＮ末端窒素を介して炭素に結合したオリ
ゴペプチドを表わし、 Ｘ₁は−ＳＨ、−ＣＯＯＨ、ＣＯＮＨ₂を表わし、 Ｔ₃は−Ｃ(Ｏ)−Ｘ₂、−ＣＨ(Ｏ)、−Ｃ(Ｏ)−ＣＦ₃、−Ｃ(Ｏ)−ＣＦ₂−Ｘ₂
、−ＣＨ(ＯＨ)−(ＣＨ₂)_n−Ｃ(Ｏ)−Ｘ₂、−ＣＨ₂−Ｘ₂、−ＣＦ₂−Ｘ₂、Embedded imageAnd T₁Is H, F or-(CH_Two)_n-X₁And T_TwoIs -NHCOCH_Three, -NH- (CH_Two)_n-X₁, -NHC (O) -OC (CH_Three) _Three Or an orally having up to 20 amino acids and attached to the carbon via the N-terminal nitrogen
Represents a gopeptide, X₁Is -SH, -COOH, CONH_TwoAnd T_ThreeIs -C (O) -X_Two, -CH (O), -C (O) -CF_Three, -C (O) -CF_Two-X_Two
, -CH (OH)-(CH_Two)_n-C (O) -X_Two, -CH_Two-X_Two, -CF_Two-X_Two,

【化５４】 を表わし、 Ｘ₂は２０個以下のアミノ酸を有し且つＮ末端窒素を介して炭素に結合したペ
プチドを表わす］。Embedded image X ₂ represents a peptide having up to 20 amino acids and attached to the carbon via the N-terminal nitrogen].

【０１６９】 好ましい具体例において、Ｑはプレニルトランスフェラーゼの基質に似たペプ
チド又はペプチジル部分、例えばＲｈｏ１様ホスファターゼからの配列（これは
プレニルトランスフェラーゼ認識配列を包含する）である。In a preferred embodiment, Q is a peptide or peptidyl moiety resembling a substrate for prenyltransferase, such as a sequence from a Rho1-like phosphatase, including a prenyltransferase recognition sequence.

【０１７０】 Haraらは(1993) PNAS 90:2281に、プレニルトランスフェラーゼに対する活性
（及び選択性）についてスクリーンされることができるＦＴアーゼ阻害剤の非ペ
プチド阻害剤の包括的な類を報告している。かくして、本発明の方法の別の具体
例において、この阻害剤は、次の一般式で表わすことができる。[1993] Hara et al. (1993) PNAS 90: 2281 report a comprehensive class of non-peptide inhibitors of FTase inhibitors that can be screened for activity (and selectivity) on prenyltransferase. . Thus, in another embodiment of the method of the present invention, the inhibitor may be represented by the following general formula:

【化５５】 ［ここで、ＸはＯ又はＳであり、 Ｒ₃₀₁はEmbedded image [Where X is O or S, and R ₃₀₁ is

【化５６】 を表わし、 ｎは０、１又は２である］。Embedded image And n is 0, 1 or 2.].

【０１７１】 本発明の方法において有用なプレニルトランスフェラーゼ阻害剤はまた、国際
公開ＷＯ９２／２０３３６号パンフレットに記載された化合物にも見出すことが
でき、これは例えば次の構造と同様である。[0171] Prenyltransferase inhibitors useful in the methods of the invention can also be found in the compounds described in WO 92/20336, which are for example similar to the following structures:

【化５７】 Embedded image

【０１７２】 主題の方法のさらに別の具体例において、ｒａｓプレニルトランスフェラーゼ
の阻害剤は、ペプチド性状でもプレニル性状でもない小さい有機分子である。例
えば、米国特許第５７２１２３６号明細書には、哺乳類ＦＴアーゼ活性の阻害剤
として三環式カルバメート化合物等が記載されている。この特許明細書に開示さ
れた化合物の包括的な類の中に、例えば次の一般式で表わされるプレニルトラン
スフェラーゼについて選択的な阻害剤が存在することが、ここで意図される。In yet another embodiment of the subject method, the inhibitor of ras prenyl transferase is a small organic molecule that is neither peptide nor prenyl. For example, US Pat. No. 5,712,236 describes tricyclic carbamate compounds and the like as inhibitors of mammalian FTase activity. Within the generic class of compounds disclosed in this patent specification, it is contemplated herein that there are inhibitors that are selective for prenyltransferases, for example, of the general formula:

【化５８】 ［ここで、Ａ、Ｂ、Ｄ及びＥは独立的にＣ又はＮ又はＮＲ₃₀₉を表わし、 Ｙはそれぞれの場合について独立的にＯ又はＨ₂を表わし、 ＸはＮ又はＣを表わし、 ＺはＯ又はＳを表わし、 Ｒ₃₀₁は、存在しないか、又は環Iの１つ以上の、それぞれ独立的にハロゲン、
−ＣＦ₃、−ＯＲ₃₁₀、−ＣＯＲ₃₁₀、−ＳＲ₃₁₀、−Ｎ(Ｒ₃₁₀)₂、−ＮＯ₂、−Ｃ(
Ｏ)Ｒ₃₁₀、−ＣＯ₂Ｒ₃₁₀、−ＯＣＯＲ₃₁₀、ベンゾトリアゾール−１−イルオキ
シ、ＣＮ、アルキニル、アルケニル又はアルキルから選択される置換基を表わす
か、であり、 Ｒ₃₀₂は、存在しないか、又は環IIIの１つ以上の、それぞれ独立的にハロゲン
、−ＣＦ₃、−ＯＲ₃₁₀、−ＣＯＲ₃₁₀、−ＳＲ₃₁₀、−Ｎ(Ｒ₃₁₀)₂、−ＮＯ₂、−
Ｃ(Ｏ)Ｒ₃₁₀、−ＣＯ₂Ｒ₃₁₀、−ＯＣＯＲ₃₁₀、ベンゾトリアゾール−１−イルオ
キシ、ＣＮ、アルキニル、アルケニル又はアルキルから選択される置換基を表わ
すか、であり、 Ｒ₃₀₃は−ＳＲ₃₁₀、−ＯＲ₃₁₀、−Ｎ(Ｒ₃₁₀)₂又は−(ＣＨ₂)_mＲ₃₁₀を表わし、 Ｒ₃₀₅は、存在しないか、又は環IVの１つ以上の、それぞれ独立的にハロゲン
、−ＣＦ₃、アルキル又はアリールから選択される置換基を表わすか、であり、 Ｒ₃₁₀はそれぞれの場合について独立的にＨ、アルキル、シクロアルキル、ア
リール又はアルアルキルを表わし、 Ｒ₃₁₆及びＲ₃₁₈は、Ｘに対する結合が単結合であり且つＸがＣである場合には
それぞれ独立的にＨ又はＦを表わし、ＸがＮである場合にはＲ₃₁₈ は存在せず
、Ｘに対する結合が二重結合である（且つＸがＣである）場合にはＲ₃₁₆及びＲ_{3 18} は共に存在せず、 ｍは０又は１〜３の範囲の整数であり、 ｎはｌ〜３の範囲の整数である］。Embedded image Wherein A, B, D and E independently represent C or N or NR ₃₀₉ ; Y independently represents O or H ₂ in each case; X represents N or C; O or S, wherein R ₃₀₁ is absent or one or more of ring I, each independently halogen,
_{-CF 3, -OR 310, -COR 310} , -SR 310, -N (R 310) 2, -NO 2, -C (
_{O) R 310, -CO 2 R} 310, -OCOR 310, benzotriazol-1-yloxy, CN, alkynyl, or represents a substituent selected from the alkenyl or alkyl,, R ₃₀₂ is absent, or one or more of the rings III, each independently, _{halogen, -CF 3, -OR 310, -COR} 310, -SR 310, -N (R 310) 2, -NO 2, -
C (O) R ₃₁₀ , —CO ₂ R ₃₁₀ , —OCOR ₃₁₀ , represents a substituent selected from benzotriazol-1-yloxy, CN, alkynyl, alkenyl or alkyl, and R ₃₀₃ represents —SR _{310 , -OR 310, -N (R 310} ) 2 or - (CH _{2) m} represents R _310, R ₃₀₅ is absent or one or more rings IV, each independently, halogen, -CF ₃ R ₃₁₀ represents, in each case, independently H, alkyl, cycloalkyl, aryl or aralkyl; R ₃₁₆ and R ₃₁₈ represent When the bond is a single bond and X is C, each independently represents H or F; when X is N, R ₃₁₈ is absent and the bond to X is a double bond ( And X is C) Absent Both R ₃₁₆ and R _{3 18} is in, m is an integer ranging from 0 or 1 to 3, n is an integer ranging from l~3].

【０１７３】 プレニルトランスフェラーゼの別の小分子阻害剤は、ＰＣＴ公報ＷＯ９７／２
１７０１に開示されたキノリン誘導体である。本発明の方法の使用に適当な阻害
剤をこれらの化合物の中から選択することができる。例えば、一般式：Another small molecule inhibitor of prenyltransferase is described in PCT Publication WO 97/2
1701 is a quinoline derivative disclosed in US Pat. Inhibitors suitable for use in the methods of the invention can be selected from these compounds. For example, the general formula:

【化５９】 ［ここで、 ＸはＯ又はＳであり、 Ｒ₃₅₁は、Ｈ、アルキル、アリール、−（ＣＨ₂）_m−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ₃₅₉、−（
ＣＨ₂）_m−Ｓ（＝Ｏ）−Ｒ₃₅₉、−（ＣＨ₂）_m−Ｓ（＝Ｏ）₂−Ｒ₃₅₉であり、 Ｒ₃₅₂、Ｒ₃₅₃及びＲ₃₆₆は、独立にＨ、ハロ、ヒドロキシアミノ、シアノ、ア
ルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、シアノアルキ
ル、アルコキシアルキル、アルキルチアノアルキル、ヒドロキシアルキル、アミ
ノアルキル、カルボキシアルキル、アルコキシカルボニルアルキル、アリールア
ルキル、若しくはアルキルスルホニルアルキル、を示し、又は Ｒ₃₅₂及びＲ₃₅₃は、隣接する場合には一緒になって５〜８員環を形成すること
ができる。 Ｒ₃₅₄及びＲ₃₅₅は、互いに独立にＨ、ハロ、ヒドロキシアミノ、アルキル、ア
ルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、シクロアルキル、アルコ
キシアルキル、アルキルチオアルキル、ヒドロキシアルキル、アミノアルキル、
カルボキシアルキル、アルコキシカルボニルアルキル、アリールアルキル、アル
キルスルホニルアルキル、−（ＣＨ₂）_m−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ₃₅₉、−（ＣＨ₂）_m−
Ｓ（＝Ｏ）−Ｒ₃₅₉、若しくは−（ＣＨ₂）_m−Ｓ（＝Ｏ）₂−Ｒ₃₅₉であり、 Ｒ₃₅₆及びＲ₃₅₇は、互いに独立にＨ、ハロ、シアノ、アルキル、アルキルオキ
シ、アリール、アリールオキシ、アルキルチオ、アルキルアミノであり、又は Ｒ₃₅₆及びＲ₃₅₇は、隣接する場合には一緒になって５〜８員環を形成すること
ができ、 Ｒ₃₅₈は、Ｈ、ハロ、ヒドロキシルアミノ、シアノ、アルキル、アルケニル、
アルキニル、アリール、アルキルアリール、シアノアルキル、アルコキシアルキ
ル、アルキルチオアルキル、ヒドロキシアルキル、アミノアルキル、カルボキシ
アルキル、アルコキシカルボニルアルキル、アリールアルキル、アルキルスルホ
ニルアルキル、−Ｏ−Ｒ₃₆₀、−Ｓ−Ｒ₃₆₀、−Ｎ（Ｒ₃₆₁）₂であり、 （Ｒ₃₅₉は、各場合について独立に、ヒドロキシル、アルキル、アルコキシ、ア
ミノ又はアルキルアミノを示し、 Ｒ₃₆₀は、各場合について独立に、水素、アルキル、アルキルカルボニル、ア
リール、アリールアルキル、アルキルオキシカルボニルアルキル、−アルキル−
ＯＲ₃₆₁若しくは−アルキル−Ｎ（Ｒ₃₆₁）₂を示し、 Ｒ₃₆₁は、各場合について独立に、水素、アルキル、アリール、若しくはアリ
ールアルキルを示す。） Ｒ₃₆₇は、水素、ハロ、シアノ、アルキル、アルキルオキシカルボニル、若し
くはアリールであり、 Ｒ₃₆₈は、水素、ハロ、アルキル、若しくはアルキルオキシであり、 Ｒ₃₆₉は、水素若しくはアルキルであり、及び ｍは、１〜５の整数である。］ で示される構造を有するものである。Embedded image [Where X is O or S, and R ₃₅₁ is H, alkyl, aryl,-(CH ₂ ) _m -C (= O) -R ₃₅₉ ,-(
_{CH 2) m -S (= O} ) -R 359, - (CH 2) m -S (= O) is _{2 -R 359, R 352, R} 353 and R ₃₆₆ is, H independently halo, hydroxy Amino, cyano, alkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, alkylaryl, cyanoalkyl, alkoxyalkyl, alkylthianoalkyl, hydroxyalkyl, aminoalkyl, carboxyalkyl, alkoxycarbonylalkyl, arylalkyl, or alkylsulfonylalkyl, or R ₃₅₂ and R ₃₅₃ may together form a 5- to 8-membered ring when adjacent. R ₃₅₄ and R ₃₅₅ independently of one another are H, halo, hydroxyamino, alkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, alkylaryl, cycloalkyl, alkoxyalkyl, alkylthioalkyl, hydroxyalkyl, aminoalkyl,
Carboxyalkyl, alkoxycarbonylalkyl, arylalkyl, alkylsulphonyl _{alkyl, - (CH 2) m -C} (= O) -R 359, - (CH 2) m -
S (= O) -R _359, or _{- (CH 2) m -S (} = O) is ₂ -R _359, R ₃₅₆ and R ₃₅₇ are each independently H, halo, cyano, alkyl, alkyloxy, Aryl, aryloxy, alkylthio, alkylamino, or R ₃₅₆ and R ₃₅₇ can be taken together to form a 5- to 8-membered ring when adjacent; R ₃₅₈ is H, halo, hydroxyl Amino, cyano, alkyl, alkenyl,
Alkynyl, aryl, alkylaryl, cyanoalkyl, alkoxyalkyl, alkylthioalkyl, hydroxyalkyl, aminoalkyl, carboxyalkyl, alkoxycarbonylalkyl, arylalkyl, alkylsulfonylalkyl, -OR ₃₆₀ , -SR ₃₆₀ , -N (R ₃₆₁ ) ₂ ; (R ₃₅₉ independently represents hydroxyl, alkyl, alkoxy, amino or alkylamino for each case; R ₃₆₀ independently represents hydrogen, alkyl, alkylcarbonyl, aryl for each case , Arylalkyl, alkyloxycarbonylalkyl, -alkyl-
OR ₃₆₁ or -alkyl-N (R ₃₆₁ ) ₂ , wherein R ₃₆₁ independently represents hydrogen, alkyl, aryl or arylalkyl in each case. R ₃₆₇ is hydrogen, halo, cyano, alkyl, alkyloxycarbonyl, or aryl; R ₃₆₈ is hydrogen, halo, alkyl, or alkyloxy; R ₃₆₉ is hydrogen or alkyl; Is an integer of 1 to 5. ] It has a structure shown by these.

【０１７４】 プレニルトランスフェラーゼの非ペプチド小分子阻害剤のまた別のクラスは、
一般式：Another class of non-peptide small molecule inhibitors of prenyltransferases is
General formula:

【化６０】 ［ここで、 Ａｒは、アリール基（例えば、置換又は非置換の）を示し、 Ｘ_aは、各場合について独立に、Ｏ、Ｓ又はＨ₂を示し、 Ｒは、次式：Embedded image Wherein Ar represents an aryl group (eg, substituted or unsubstituted); X _a independently represents O, S or H ₂ in each case; and R represents the following formula:

【化６１】 （Ｒ’は、Ｈ、低級アルキル、低級アルケニル、アリール、次式：Embedded image (R ′ is H, lower alkyl, lower alkenyl, aryl,

【化６２】 の基を示す。） の基を表し、 Ｒ₇は、アリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、又は複素環を示し、 Ｒ’₁₁は、アルキル、アルケニル又は−（ＣＨ₂）_m−Ｒ₇を示し、 Ｒ₄₆は、各場合に独立に、水素、低級アルキル又はアリールを示し、 Ｒ₇₀は、各場合に独立にＨ、次式：Embedded image Represents a group of Represents a group of), R ₇ represents an aryl, cycloalkyl, cycloalkenyl, or a heterocycle, R _'11 is alkyl, alkenyl or - indicates _{(CH 2) m -R 7,} R 46 , each And each independently represents hydrogen, lower alkyl or aryl; R ₇₀ is independently H in each case;

【化６３】 の基、低級アルキル、低級アルケニル、低級アルキニル、アリール、アルキルア
リール、シクロアルキル、アルコキシアルキル、アルキルチオアルキル、ヒドロ
キシアルキル、アミノアルキル、カルボキシアルキル、アルコキシカルボニルア
ルキル、アリールアルキル、アルキルスルホニルアルキル、及びアミノ酸残基若
しくは類似体又は他のアミノ保護基のα−炭素側鎖、又は製薬上許容のできる塩
を示し、又は Ｒ₇₀とＲ、又はＲ７０とＲ７０は、一緒になって４〜８員環の複素環を形成し
て、 （Ｒ₈₀は、水素、低級アルキル、低級アルケニル、低級アルキニル又は−（ＣＨ ₂ ）_m−Ｒ₇を示す。） Ｒ₃₇₀は、水素、低級アルキル、低級アルケニル、低級アルキニル、−（ＣＨ₂ ）_m−Ｏ−低級アルキル、−（ＣＨ₂）_m−Ｏ−Ｒ₇、若しくは−（ＣＨ₂）_m−Ｒ₇
を示し、 （Ｘは、各場合について独立にＯ又はＳを示し、 Ｘ₂は、Ｏ又はＳを示す。） ｍ及びｎは、各場合について独立に０又は１〜４の範囲の整数を示す。］ で示される。Embedded imageGroup, lower alkyl, lower alkenyl, lower alkynyl, aryl, alkyl
Reel, cycloalkyl, alkoxyalkyl, alkylthioalkyl, hydro
Xyalkyl, aminoalkyl, carboxyalkyl, alkoxycarbonyla
Alkyl, arylalkyl, alkylsulfonylalkyl, and amino acid residues
Or an analog or other α-carbon side chain of an amino protecting group, or a pharmaceutically acceptable salt
Or R₇₀And R or R70 and R70 together form a 4- to 8-membered heterocyclic ring
And (R₈₀Is hydrogen, lower alkyl, lower alkenyl, lower alkynyl or-(CH _Two )_m-R₇Is shown. ) R₃₇₀Is hydrogen, lower alkyl, lower alkenyl, lower alkynyl,-(CH_Two )_m-O-lower alkyl,-(CH_Two)_m-OR₇Or-(CH_Two)_m-R₇
(X represents O or S independently in each case, X_TwoRepresents O or S. M and n each independently represent 0 or an integer in the range of 1-4. ].

【０１７５】 好ましい具体例では、Ｒは、−ＳＲ’、Ｒ’は、Ｈ又は低級アルキル（好まし
くはＨ）であり、ＡｒはＣ６〜Ｃ１２のアリール、Ｒ₇₀は、各々Ｈ、Ｒ₃₇₀は、
−（ＣＨ₂）₂−Ｏ−ＣＨ₃、Ｘ_aは、Ｏ、ｎは１である。[0175] In a preferred embodiment, R is, -SR ', R' is H or lower alkyl (preferably H), aryl Ar is C6-C12, R ₇₀ are each H, R ₃₇₀ is,
— (CH ₂ ) ₂ —O—CH ₃ , X _a is O, and n is 1.

【０１７６】 プレニルトランスフェラーゼの小分子阻害剤の更に別のクラスは、ＥＰ公開公
報５３７，００８で開示されているビスホスホネートである。本発明の方法での
使用のために適当な阻害剤は、これらの化合物の中から選択することができる。
例えば、一般式：Yet another class of small molecule inhibitors of prenyltransferases are the bisphosphonates disclosed in EP Publication 537,008. Suitable inhibitors for use in the method of the present invention can be selected from among these compounds.
For example, the general formula:

【化６４】 ［ここで、 Ｒ₄₀₁、Ｒ₄₀₂、Ｒ₄₀₃、及びＲ₄₀₄は、各々独立にＨ、アルキル、アリール、ア
ルキルアリール、アリールアルキル、アンモニウム、アルカリ金属又はプロドラ
ッグエステルを示す。］ で示されるものである。Embedded image [Where R ₄₀₁ , R ₄₀₂ , R ₄₀₃ , and R ₄₀₄ each independently represent H, alkyl, aryl, alkylaryl, arylalkyl, ammonium, an alkali metal, or a prodrug ester. ].

【０１７７】 プレニルトランスフェラーゼの阻害剤の別のグループは、ＰＣＴ公報ＷＯ９６
／１７６２３に開示されている。この公報の阻害剤を、一部以下の一般構造：Another group of inhibitors of prenyltransferases is described in PCT Publication WO96
/ 17623. The inhibitors of this publication have some general structures:

【化６５】 ［ここで、 Ｘ^1aは、−Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）_m−、−Ｎ（Ｒ^3a）−、−（ＣＨ₂）₂−、又は−
ＣＨＣＨ−を示し、 ｍは、０〜２の整数であり、 Ｒ^1aは、水素、低級アルキル、アラルキル、アシル、低級アルキルスルホニル
、アラルキルスルホニル、又はアリールスルホニルを示し、 Ｒ^2aは、低級アルキルを示し、 Ｒ^3aは、低級アルキル、又はアラルキルを示し、 Ｒ^4aは、メルカプト低級アルキル、低級アルキルチオ低級アルキル、低級アル
キルスルフィニル低級アルキル、低級アルキルスルホニル低級アルキル、又はヒ
ドロキシ低級アルキルを示し、 Ｒ^5aは、水素又は低級アルキルを示し、 Ｒ^4a及びＲ^5aは、一緒にＣ₂〜Ｃ₄のアルキレンを形成することができる。］ により示す。Embedded image [Where X ^1a represents —O—, —S (O) _m —, —N (R ^3a ) —, — (CH ₂ ) ₂ —, or —
M represents an integer of 0 to 2, R ^1a represents hydrogen, lower alkyl, aralkyl, acyl, lower alkylsulfonyl, aralkylsulfonyl, or arylsulfonyl; R ^2a represents lower alkyl; R ^3a represents lower alkyl or aralkyl; R ^4a represents mercapto lower alkyl, lower alkylthio lower alkyl, lower alkylsulfinyl lower alkyl, lower alkylsulfonyl lower alkyl, or hydroxy lower alkyl; R ^5a represents hydrogen; Or R ^4a and R ^5a can together form a C ₂ -C ₄ alkylene. ].

【０１７８】 本発明のプレニルトランスフェラーゼの阻害剤の製薬上許容のできる塩は、化
合物の従来の非毒性塩又は４級アンモニア塩（例えば、非毒性有機又は無機酸由
来のもの）を含む。例えば、そのような従来の非毒性塩は、無機酸（例えば、塩
化水素酸、臭化水素酸、硫酸、スルファミン酸、燐酸、硝酸等）から誘導される
塩、及び有機酸（例えば、酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、ステ
アリン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、パモ酸、マレ
イン酸、ヒドロキシマレイン酸、フェニル酢酸、グルタミン酸、安息香酸、サリ
チル酸、スルファニル酸、２−アセトキシ安息香酸、フマル酸、トルエンスルホ
ン酸、メタンスルホン酸、ジスルホン酸エタン、シュウ酸、イセチオン酸等）か
ら調製される塩を含む。Pharmaceutically acceptable salts of prenyltransferase inhibitors of the present invention include the conventional non-toxic or quaternary ammonium salts of the compounds (eg, from non-toxic organic or inorganic acids). For example, such conventional non-toxic salts include salts derived from inorganic acids (eg, hydrochloric, hydrobromic, sulfuric, sulfamic, phosphoric, nitric, etc.), and organic acids (eg, acetic acid, Propionic acid, succinic acid, glycolic acid, stearic acid, lactic acid, malic acid, tartaric acid, citric acid, ascorbic acid, pamoic acid, maleic acid, hydroxymaleic acid, phenylacetic acid, glutamic acid, benzoic acid, salicylic acid, sulfanilic acid, 2- Acetoxybenzoic acid, fumaric acid, toluenesulfonic acid, methanesulfonic acid, ethanedisulfonic acid ethane, oxalic acid, isethionic acid, etc.).

【０１７９】 本発明の製薬上許容のできる塩を、従来の化学的方法による塩基又は酸部分を
含む本発明のプレニルトランスフェラーゼの阻害剤から合成することができる。
一般に、適当な溶媒中で化学量論的な量又は過剰の所望の塩形成無機又は有機酸
若しくは塩基と、遊離の塩基又は酸を反応させることにより塩を調製する。本発
明のプレニルトランスフェラーゼの阻害剤の酸の製薬上許容のできる塩はまた、
アルカリ若しくはアルカリ土類金属（例えば、ナトリウム、カリウム、リチウム
、カルシウム又はマグネシウム）水酸化物のような塩基又は有機塩基（例えば、
アミン、ピペリジン、ピロリジン、ベンジルアミン等）、又はテトラメチル水酸
化アンモニウムのような水酸化第４アンモニウムの適量と、上記阻害剤の酸を処
理する従来の手順により容易に調製される。The pharmaceutically acceptable salts of the present invention can be synthesized from a prenyltransferase inhibitor of the present invention that contains a base or acid moiety by conventional chemical methods.
Generally, the salts are prepared by reacting the free base or acid with a stoichiometric amount or excess of the desired salt-forming inorganic or organic acid or base in a suitable solvent. Pharmaceutically acceptable salts of the acids of the inhibitors of the prenyltransferases of the present invention also include
Bases or organic bases such as alkali or alkaline earth metal (eg, sodium, potassium, lithium, calcium or magnesium) hydroxides (eg,
Amine, piperidine, pyrrolidine, benzylamine, etc.), or an appropriate amount of a quaternary ammonium hydroxide such as tetramethylammonium hydroxide, and are readily prepared by conventional procedures of treating the inhibitor acid.

【０１８０】 ここで記載された阻害剤の意図された等価物は、他の点でその阻害剤に対応し
、かつその一般的性質（例えばプレニルトランスフェラーゼを阻害する能力）を
有する。ここにおいて、そのような酵素を阻害することにおいて阻害剤の効能に
悪影響を与えない置換基の１種以上の単なるバリエーションをつくる。The intended equivalents of the inhibitors described herein otherwise correspond to the inhibitors and have their general properties (eg, the ability to inhibit prenyltransferase). Here, one or more mere variations of substituents are made that do not adversely affect the potency of the inhibitor in inhibiting such enzymes.

【０１８１】 本開示から明らかなように、ＣＡＡＭ又はＣＡＡＳの基本構造を組み込んだ他
の加水分解不可能なペプチド類似体を生成することができる。例示のために、本
発明のペプチド類似体を生成して、上記のベンゾジアゼピンのほかに、置換され
たγ−ラクトン環（Ｇａｒｖｅｙら、ｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇ．Ｒ．Ｍａｒｓｈａｌｌ編、ＥＳＣＯＭ出版社
：Ｌｅｉｄｅｎ、オランダ、１９８８年、１２３頁）、Ｃ−７模倣物（Ｈｕｆｆ
ｍａｎら、ｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇ
ｙ，Ｇ．Ｒ．Ｍａｒｓｈａｌｌ編、ＥＳＣＯＭ出版社：Ｌｅｉｄｅｎ、オランダ
、１９８８年、１０５頁）、ケト−メチレン擬蛋白質（Ｅｗｅｎｓｏｎら（１９
８６年）Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ２９：２９５；及びＥｗｅｎｓｏｎら、ｉｎ
Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ（第９回Ａ
ｍｅｒｉｋａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍの紀要）Ｐｉｅｒｃｅ
Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．Ｒｏｃｋｌａｎｄ、ＩＬ、１９８５年）、β−ターン
ジペプチドコア（Ｎａｇａｉら（１９８５年）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔ
ｔ２６：６４７；及びＳａｔｏら（１９８６年）Ｊ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｐｅｒ
ｋｉｎ Ｔｒａｎｓ １：１２３１）、β−アミノアルコール（Ｇｏｒｄｏｎら
（１９８５年）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ１２６
：４１９；及びＤａｎｎら（１９８６年）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒ
ｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ １３４：７１）、ジアミノケトン（Ｎａｔａｒａｊａｎら
（１９８４年）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ１２４
：１４１）及びメチレンアミノ変性物（Ｒｏａｒｋら ｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ：
Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇ．Ｒ．Ｍａｒｓｈａｌｌ編、
ＥＳＣＯＭ出版社：Ｌｅｉｄｅｎ、オランダ、１９８８年、１３４頁）を」用い
ることができる。Ｓｅｓｓｉｏｎ ＩＩＩ：Ａｎａｌｙｔｉｃ ａｎｄ ｓｙｎ
ｔｈｅｔｉｃ ｍｅｔｈｏｄｓ、ｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇ．Ｒ．Ｍａｒｓｈａｌｌ編、ＥＳＣＯＭ出版社：
Ｌｅｉｄｅｎ、オランダ、１９８８年も概略せよ。As will be apparent from the present disclosure, other non-hydrolyzable peptide analogs can be produced that incorporate the basic structure of CAAM or CAAS. By way of example, peptide analogs of the invention may be generated to generate, in addition to the benzodiazepines described above, a substituted γ-lactone ring (Garvey et al., In Peptide: Chemistr.
y and Biology, G .; R. Marshall, Ed., ESCOM Publisher: Leiden, The Netherlands, 1988, p. 123), C-7 mimic (Huff
man et al., in Peptide: Chemistry and Biolog.
y, G. R. Marshall, Ed., ESCOM Publisher: Leiden, The Netherlands, 1988, p. 105), keto-methylene pseudoprotein (Ewenson et al. (19)
86) J Med Chem 29: 295; and Ewenson et al., In
Peptides: Structure and Function (9th A
memoir of Merikan Peptide Symposium) Pierce
Chemical Co. Rockland, IL, 1985), β-turn dipeptide core (Nagai et al. (1985) Tetrahedron Let).
t26: 647; and Sato et al. (1986) J Chem Soc Per.
Kin Trans 1: 1231), β-amino alcohol (Gordon et al. (1985) Biochem Biophys Res Commun 126).
: 419; and Dann et al. (1986) Biochem Biophys R.
es Commun 134: 71), diaminoketone (Natrajan et al. (1984) Biochem Biophys Res Commun 124).
: 141) and methyleneamino modifications (Roark et al. In Peptide:
Chemistry and Biology, G.W. R. Marshall,
ESCOM Publisher: Leiden, The Netherlands, 1988, p. 134). Session III: Analytical and syn
thetic methods, in Peptides: Chemistry
and Biology, G .; R. Edited by Marshall, ESCOM Publisher:
See also Leiden, The Netherlands, 1988.

【０１８２】 他のｒａｓ又はＧＴＰアーゼ阻害剤が、例えば、欧州特許公報ＥＰ５２０８２
３、ＥＰ５２３８７３、ＥＰ５２８４８６、ＥＰ５３７００７、ＥＰ５３７００
８、ＥＰ６１８２２１、ＥＰ６７５１１２、ＧＢ２２６１３７４、日本国特許公
報ＪＰ８２３９３３９、ＰＣＴ公報ＷＯ９４１０１３７、ＷＯ９４１０１３８、
ＷＯ９６１７６２３、ＷＯ９６３４１１３、ＷＯ９７０５９０２、ＷＯ９７２７
８５２、ＷＯ９７３１６４１、ＷＯ９７３６５８４、ＷＯ９７３６５９２、ＷＯ
９７３６８７６、ＷＯ９７３６８７７、ＷＯ９７３６８８１、ＷＯ９７３６８８
６、ＷＯ９７３６８８８、ＷＯ９７３６８８９、ＷＯ９７３６８９１、ＷＯ９７
３６８９６、ＷＯ９７３６８９７、ＷＯ９７３６８９８、ＷＯ９７３７６７８、
ＷＯ９７３８６６４、ＷＯ９７３８６９７、並びに米国特許５，３２２，８５５
、５，３６９，１２５、５，４２０，２４５、５，４７０、８３２、５，４９８
，６２７、５，５０６，２６２、５，５６７，７２９、５，５７８，６２９、５
，６８６，４７２、５，７０３，２４１、５，７７０，７３１、５，７８０，４
８８、５，７８０，４９２、及び５，７８３、５９３に記載されている。Other ras or GTPase inhibitors are described, for example, in European Patent Publication EP52082.
3, EP523873, EP528486, EP53007, EP53700
8, EP 618221, EP 675112, GB2261374, Japanese Patent Publication JP8239339, PCT Publication WO9410137, WO9410138,
WO9617623, WO9634113, WO9705902, WO9727
852, WO9731641, WO9736584, WO9736592, WO
9736876, WO9736877, WO9736881, WO973688
6, WO9736888, WO9736889, WO9736891, WO97
36896, WO9736897, WO9736898, WO9737678,
WO9738664, WO9738697, and US Pat. No. 5,322,855
, 5,369,125, 5,420,245, 5,470,832, 5,498
, 627,5,506,262,5,567,729,5,578,629,5
, 686, 472, 5, 703, 241, 5, 770, 731, 5, 780, 4
88, 5,780,492, and 5,783,593.

【０１８３】 他の具体例において、本発明の方法は、ｒａｆ、ＭＫＫ（Ｍａｐキナーゼキナ
ーゼ）又はＭＡＰキナーゼのキナーゼ活性の阻害を利用している。「マイトジェ
ン活性蛋白質キナーゼ」、「ＭＡＰキナーゼ」及び「ＭＡＰＫ」の語は、トレオ
ニン及びチロシン上の２つの燐酸化により活性化される蛋白質キナーゼを意味し
、他のものの中にはＥＲＫ１、ＥＲＫ２，ＪＮＫ−１、ＪＮＫ−２、ＪＮＫ−３
，ＳＡＰＫ，ｐ３８、ＳＭＫ１、ＨＯＧ１、ＭＰＫ１、ＦＵＳ３／ＫＳＳ１及び
ｓｐｋ１を含む。この後者のクラスの典型的な阻害剤は、ＰＣＴ公報ＷＯ９８／
１５２７２、ＷＯ９８／２０８６８及びＷＯ９８／０６７１５、並びに米国特許
５，８４９，７３３及び５，５２５６２５に記載されている。例えば、本方法は
、ＭＡＰキナーゼの幅広いスペクトルを有する阻害剤、又は特異的な阻害剤（例
えば、ｐ３８−特異的阻害剤ＳＢ２０３５８０又はＭＥＫ−特異的阻害剤ＰＤ９
８０５９）を利用することができる。In another embodiment, the methods of the present invention utilize inhibition of the kinase activity of raf, MKK (Map kinase kinase) or MAP kinase. The terms "mitogen-activated protein kinase", "MAP kinase" and "MAPK" refer to protein kinases that are activated by two phosphorylations on threonine and tyrosine, among others ERK1, ERK2, JNK. -1, JNK-2, JNK-3
, SAPK, p38, SMK1, HOG1, MPK1, FUS3 / KSS1, and spk1. Typical inhibitors of this latter class are described in PCT Publication WO98 /
15272, WO98 / 20868 and WO98 / 06715, and U.S. Patents 5,849,733 and 5,525625. For example, the method may comprise a broad spectrum inhibitor of MAP kinase, or a specific inhibitor (eg, the p38-specific inhibitor SB203580 or the MEK-specific inhibitor PD9
8059) can be used.

【０１８４】 １つの具体例において、本発明の方法は、一般式：In one embodiment, the method of the present invention has the general formula:

【化６６】 ［ここで、 Ｒ₅₀₁は、水素、アルキル、アリール、ヘテロアリール、アリールオキシ、ヘ
テロアリールオキシ、ニトロ、アミノ、シアノ、カルボキシ、カルボキシアルコ
キシ、カルボアミド、又はハロゲンであり、 Ｒ₅₀₂は、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、ヘテロアルキル、
アルキル、シクロアルキル、又はシクロアルキルである。］ により示される阻害剤を提供する。 他の具体例において、阻害剤は、一般式：Embedded image [Where R ₅₀₁ is hydrogen, alkyl, aryl, heteroaryl, aryloxy, heteroaryloxy, nitro, amino, cyano, carboxy, carboxyalkoxy, carbamide, or halogen, and R ₅₀₂ is aryl, heteroaryl , Arylalkyl, heteroalkyl,
Alkyl, cycloalkyl, or cycloalkyl. ] It provides the inhibitor shown by these. In another embodiment, the inhibitor has the general formula:

【化６７】 ［ここで、 Ｒ₆₀₇〜Ｒ₆₁₃は、独立に水素又は−ＯＨであり、 Ｒ₆₀₁は、水素、低級アルキノイル又はアロイル（ベンゾイル若しくはナフト
イル）であり、 Ｒ₆₀₂は、水素、低級アルキル又はアリールアルキルであり、 Ｒ₆₀₃は、水素又は低級アルキルであり、 Ｒ₆₀₄は、水素若しくは低級アルキルであり、又はＸが酸素の場合には、Ｒ₆₀₄ は、Ｒ₆₀₅と一緒に−ＣＨ₂−Ｏ−となることができ、 Ｘは、単結合、−ＣＨ₂−、Ｏ又はＳであり、 Ａｒは、フェニル、ナフチル、インダニル及びテトラヒドロナフチルであり、 Ｒ₆₀₅及びＲ₆₀₆は、水素、ハライド、−ＯＨ、低級アルキル、−ＣＯＮＨ₂、
低級アルコキシ、ベンズロイ、アルキルチオ、低級アルキルスルフィニル、低級
アルキルスルホニルから個々に選択され、又はＲ₆₀₅とＲ₆₀₆は、一緒になりメチ
レンジオキシを示す。］ により示される化合物である。Embedded image [Wherein R _{607 to} R ₆₁₃ are independently hydrogen or —OH, R ₆₀₁ is hydrogen, lower alkinoyl or aroyl (benzoyl or naphthoyl), and R ₆₀₂ is hydrogen, lower alkyl or arylalkyl. R ₆₀₃ is hydrogen or lower alkyl; R ₆₀₄ is hydrogen or lower alkyl; or when X is oxygen, R ₆₀₄ together with R ₆₀₅ becomes —CH ₂ —O—. X is a single bond, —CH ₂ —, O or S; Ar is phenyl, naphthyl, indanyl and tetrahydronaphthyl; R ₆₀₅ and R ₆₀₆ are hydrogen, halide, —OH, lower alkyl, -CONH _2,
Each is independently selected from lower alkoxy, benzroy, alkylthio, lower alkylsulfinyl, lower alkylsulfonyl, or R ₆₀₅ and R ₆₀₆ together represent methylenedioxy. ] It is a compound shown by these.

【０１８５】 更に別の具体例において、本発明の阻害剤は、一般式：In yet another embodiment, the inhibitors of the present invention have the general formula:

【化６８】 ［ここで、 Ｒ₇₀₀は、Ｈ、ＮＨ₂（ＣＮＨ）−ＮＨ−Ｎ＝ＣＨ−、又はＮＨ₂（ＣＮＨ）−
ＮＨ−Ｎ＝ＣＨＣＨ₃−を示し、 Ｒ₇₀₁、Ｒ₇₀₂及びＲ₇₀₃は、独立にＮＨ₂（ＣＮＨ）−ＮＨ−Ｎ＝ＣＨ−、又は
ＮＨ₂（ＣＮＨ）−ＮＨ−Ｎ＝ＣＨＣＨ₃−を示し、 Ｑは、−ＮＨ（ＣＯ）ＮＨ−、−（Ｃ₆Ｈ₄）−、−（Ｃ₅ＮＨ₃）−、又は−Ａ
−（ＣＨ₂）_n−Ａ−を示し、 （Ａは、各場合について独立に、−ＮＨ（ＣＯ）−、−（ＣＯ）ＮＨ−、−ＮＨ
（ＣＯ）ＮＨ−、−ＮＨ−又は−Ｏ−を示し、及び ｎは、２〜１０の整数である。）］ で示される。Embedded image [Where R ₇₀₀ is H, NH ₂ (CNH) —NH—N ＝ CH—, or NH ₂ (CNH) —
NH-N = CHCH ₃ - indicates, R _701, R ₇₀₂ and R ₇₀₃ are, NH ₂ independently (CNH) -NH-N = CH- , or _{NH 2 (CNH) -NH-N} = CHCH 3 - a shows, Q is, -NH (CO) NH -, - (C 6 H 4) -, - (C 5 NH 3) -, or -A
- (CH _{2) n} -A- indicates, (A is independently in each case, -NH (CO) -, - (CO) NH -, - NH
(CO) NH-, -NH- or -O-, and n is an integer of 2 to 10. )].

【０１８６】 好ましくは、Ｒ₇₀₀が、ＮＨ₂（ＣＮＨ）−ＮＨ−Ｎ＝ＣＨ−、又はＮＨ₂（Ｃ
ＮＨ）−ＮＨ−Ｎ＝ＣＨＣＨ₃−の場合には、Ｒ₇₀₀はＲ₇₀₁に対してメタ又はパ
ラであり、Ｒ₇₀₂及びＲ₇₀₃は互いにメタ又はパラである。Preferably, R ₇₀₀ is NH ₂ (CNH) —NH—N ＝ CH—, or NH ₂ (C
_{NH) -NH-N = CHCH 3} - In the case of, R ₇₀₀ is meta or para to R _701, R ₇₀₂ and R ₇₀₃ are mutually meta or para.

【０１８７】 また別の具体例において、阻害剤は、２−（２−アミノ−３−メトキシフェニ
ル）−４−オキソ−４Ｈ−［１］ベンゾピランである。[0187] In another embodiment, the inhibitor is 2- (2-amino-3-methoxyphenyl) -4-oxo-4H- [1] benzopyran.

【０１８８】 ｒａｓ経路蛋白質のそのような小分子阻害剤の他に、本発明はまた、ｒａｓ依
存性の複製老化過程を阻害又は別の場合には遅らせることができる優性ネガティ
ブ突然変異体、アンチセンス及び他の遺伝子のサプレッサー要素の使用を意図し
ている。In addition to such small molecule inhibitors of the ras pathway protein, the present invention also provides a dominant negative mutant, antisense, which can inhibit or otherwise delay the ras-dependent replication senescence process And the use of suppressor elements of other genes.

【０１８９】 ｒａｓ発現を阻害する典型的なアンチセンス構造が提供される（Ｈａｍｉｌｔ
ｏｎら（１９９８年）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ１６：１４１７）。ｐ３８、ＪＮＫ１、
ＪＮＫ２、ＥＲＫ１及びＥＲＫ２の典型的なアンチセンスオリゴヌクレオチドの
使用と設計が、例えばＮａｇａｔａら（１９９８年）Ｂｌｏｏｄ９２：１８５９
及びＹａｎｇら（１９９８年）Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ３２：４７３により教
示されている。[0189] Exemplary antisense structures that inhibit ras expression are provided (Hamilt
on et al. (1998) Oncogene 16: 1417). p38, JNK1,
The use and design of typical antisense oligonucleotides for JNK2, ERK1 and ERK2 are described, for example, in Nagata et al. (1998) Blood 92: 1859.
And Yang et al. (1998) Hypertension 32: 473.

【０１９０】 典型的な優性ネガティブｒａｓ阻害剤は、突然変異体Ｈａ−ｒａｓ（Ｌｅｕ−
６１、Ｓｅｒ−１８６）である。例えば、Ｇａｂｏｌｉら（１９９５年）Ｊ Ｇ ＥＮ Ｖｉｒｏｌ ７６：７５１を見よ。A typical dominant negative ras inhibitor is the mutant Ha-ras (Leu-
61, Ser-186). For example, Gaboli et al. (1995) J G EN Virol 76: 751 to see.

【０１９１】 異所的に発現する場合に、ｒａｓシグナリングを阻害することができる天然の
蛋白質の例は、Ｒａｐ１蛋白質を含む。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌｅｒら（１９
９８年）ＰＮＡＳ９５：７４７５を見よ。Examples of naturally occurring proteins that can inhibit ras signaling when ectopically expressed include the Rap1 protein. See, for example, Altschuler et al.
98) See PNAS 95: 7475.

【０１９２】 また他の具体例において、ｒａｓ阻害剤は、転写リプレッサー又はｒａｓの発
現を阻害する転写活性化物質若しくは下流のｒａｓのエフェクター（例えばＭＡ
Ｐキナーゼ又はｒａｓ依存性の複製老化過程の他の正のレギュレーター）の優性
ネガティブ突然変異体とすることができる。In yet other embodiments, the ras inhibitor is a transcriptional repressor or transcriptional activator that inhibits ras expression or a downstream ras effector (eg, MA
Dominant negative mutants of P-kinase or other positive regulator of the ras-dependent replication senescence process).

【０１９３】 他の具体例において、その薬剤は、Ｒａｓ、Ｒｈｏ、Ｒａｂ、Ａｒｆ、Ｓａｒ
１、及びＲａｎファミリーからなる小さいＧ蛋白質スーパーファミリーの他のメ
ンバーを阻害することができる。In another embodiment, the agent is Ras, Rho, Rab, Arf, Sar.
1, and other members of the small G protein superfamily consisting of the Ran family.

【０１９４】 上記のように好ましい具体例において、本発明の方法は、可逆的な方法で（例
えば、ｒａｓ経路をある時間の後に通常の状態に戻すこと）そのような薬剤を用
いる。本発明の方法は、ｒａｓ経路の阻害のための遺伝子構造を用いる場合には
、上記のように、遺伝子産物の発現を誘導性のものに、構造のトランスフェクシ
ョンを可逆的なものに、及び（又は）遺伝子産物の活性を誘導性のものにする等
の属性を、その構造に提供する。In preferred embodiments as described above, the methods of the present invention employ such agents in a reversible manner (eg, returning the ras pathway to normal after some time). The method of the present invention, when using a gene structure for inhibition of the ras pathway, as described above, makes expression of the gene product inducible, transfection of the structure reversible, and ( Or) providing an attribute to the structure, such as rendering the activity of the gene product inducible.

【０１９５】 （iv）テロメラーゼ活性の活性化 全体として考慮すると、ヒト第一次培養細胞の多くにおけるライフスパンの限
度の解析から、不死の細胞ラインを確立するには、Ｍ０及びＭ１／Ｍ２の両者を
乗り越えねばならないことが解る。従って、主題の方法の好適実施態様において
は、細胞はまた、Ｒｂ／ｐ１６ＩＮＫ４ａの迂回及び／又はｒａｓの阻害、に加
えて、細胞内テロメラーゼ活性を活性化する作用因をも用いて処理される。(Iv) Activation of telomerase activity From an overall perspective, analysis of lifespan limits in many of the primary human cultured cells indicates that to establish an immortal cell line, both MO and M1 / M2 You need to get over it. Thus, in a preferred embodiment of the subject method, the cells are also treated with an agent that activates intracellular telomerase activity, in addition to bypassing Rb / p16INK4a and / or inhibiting ras.

【０１９６】 ある実施態様では、主題の方法は、テロメラーゼの触媒的サブユニットＥＳＴ
２の、又はその生物活性ある断片の、異所性の発現に依拠している。他の実施態
様では、主題の方法は、パピローマウイルスＥ６蛋白のｍｙｃ遺伝子産物のよう
なテロメラーゼ活性アクチベーター（ここでは総合的に「テロメラーゼアクチベ
ーター」と称する）の異所性発現によって実施される。テロメラーゼ又はテロメ
ラーゼアクチベーターの異所性発現が組換え遺伝子を包含している好適実施態様
においては、宿主細胞における当該遺伝子の発現は誘導可能（さもなければ条件
により制御可能）であり、かつ／又は当該遺伝子を含む遺伝子構築体は、宿主細
胞からたやすく除去可能である。In one embodiment, the subject method comprises the catalytic subunit of telomerase, EST
2 or a biologically active fragment thereof. In another embodiment, the subject method is performed by ectopic expression of a telomerase activity activator, such as the myc gene product of the papillomavirus E6 protein (collectively referred to herein as "telomerase activators"). In a preferred embodiment, wherein the ectopic expression of telomerase or telomerase activator includes a recombinant gene, expression of the gene in the host cell is inducible (otherwise conditionally controllable), and / or The gene construct containing the gene can be easily removed from the host cell.

【０１９７】 さらに別の実施態様においては、主題の方法は、当該蛋白の細胞内半減期を延
長させるために、ＥＳＴ２蛋白又はテロメラーゼアクチベーターの崩壊（ユビキ
チン依存性又は非依存性）を阻害するある作用因に当該細胞を接触させることで
実施される。例えば、当該の方法で、蛋白の細胞内半減期を延長させるため、ユ
ビキチン化を阻害する作用因を利用することが出来る。例えば、当該の方法にお
いて、ｍｙｃのユビキチン化を阻害し、それによってｍｙｃの細胞内濃度を増加
させる作用因を利用することが出来る。好適実施態様においては、そのような作
用因は小さい有機分子であって、例えば５０００ａｍｕ未満（望ましくは１００
０ａｍｕ未満）の分子量を示し、かつ膜透過性を有する。In yet another embodiment, the subject method comprises inhibiting EST2 protein or telomerase activator disruption (ubiquitin-dependent or independent) to increase the intracellular half-life of the protein. It is performed by contacting the cells with an agent. For example, an agent that inhibits ubiquitination can be used to extend the intracellular half-life of the protein in the method. For example, in the method, an agent that inhibits myc ubiquitination and thereby increases the intracellular concentration of myc can be used. In a preferred embodiment, such agents are small organic molecules, for example, less than 5000 amu (preferably 100 amu).
(Less than 0 amu) and has membrane permeability.

【０１９８】 さらに他の実施態様では、細胞の増殖能力は、ｍｙｃに誘導されたテロメラー
ゼ活性の活性化に拮抗するシグナルを解除する又は阻害する作用因に、例えば低
分子の作用因に、細胞を接触させることで増大させ得る。実例として、ｍａｄ−
ｍａｘヘテロダイマーによるｍｙｃ活性の阻害に関与する蛋白と蛋白の相互作用
を破断する作用因を利用することが出来る。 テロメラーゼの触媒性サブユニットをエンコードする酵母及び繊毛虫の遺伝子
に対応するヒトの同族体、ＥＳＴ２、を代表する遺伝子の単離が最近報告された
。Ｍｅｙｅｒｓｏｎ、ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｃｅｌｌ ９０：７８５；及び
Ｎａｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７７：９５５
を参照。In yet another embodiment, the ability of the cell to proliferate is characterized by the ability to release or inhibit a signal that antagonizes the myc-induced activation of telomerase activity, eg, to a small molecule agent. It can be increased by contact. As an example, mad-
An agent that disrupts the protein-protein interaction involved in the inhibition of myc activity by the max heterodimer can be used. The isolation of a gene representative of the human homolog, EST2, corresponding to the yeast and ciliate genes encoding the catalytic subunit of telomerase was recently reported. See Meyerson, et al. (1997) Cell 90: 785; and Nakamura et al. (1997) Science 277: 955.
See

【０１９９】 予見された１２７ｋＤａの蛋白は、ユープロテス及び酵母のテロメラーゼサブ
ユニットの全配列と広範な配列の類似性を共有し、これら蛋白のアミノ酸カルボ
キシル末端を越えて一致が広がる。ＢＬＡＳＴを用いた検索は、このような類似
が偶然に生じる確率は、それぞれ、１．３×１０^-18と３×１０^-13であることを
示す。比較のために、酵母とＥｕｐｌｏｔｅのテロメラーゼを比較した類似の確
率は、蛋白のＢＬＡＳＴ検索によれば、６．９×１０^-6である。ヒトの遺伝子は
、これらの遺伝子中で最初に記載された酵母の遺伝子との明らかな関連を反映さ
せるべく、ｈＥＳＴ２（ヒトＥＳＴ２同族体）と命名された。ＥＳＴ２の名前は
、表現型であるテロメラーゼの触媒性サブユニットが、どんどん短くなる（Ｅｖ
ｅｒ Ｓｈｏｒｔｅｎｉｎｇ Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ）ので名づけられた（Ｃｏ
ｕｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９７）上出；Ｌｉｎｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（
１９９７））The predicted 127 kDa protein shares extensive sequence similarity with the entire sequence of the euprotes and yeast telomerase subunits and extends identity beyond the amino acid carboxyl terminus of these proteins. A search using BLAST shows that the probability of such a similarity occurring by chance is 1.3 × 10 ^-18 and 3 × 10 ^-13 , respectively. For comparison, the similar probability of comparing yeast and Euplot telomerase is 6.9 × 10 ⁻⁶ according to a BLAST search for proteins. The human gene was named hEST2 (human EST2 homolog) to reflect the apparent association with the yeast gene first described in these genes. The name of EST2 is that the catalytic subunit of the phenotype telomerase is becoming shorter and shorter (Ev
er Shortening Telomerase)
unter et al. (1997) supra; Lingner et al. (
1997))

【０２００】 酵母及び繊毛虫のテロメラーゼ蛋白と同様に、ｈＥＳＴ２は逆転写酵素（ＲＴ
）という酵素のファミリーに属する。保持されている配列モチーフは７つで、こ
れら酵素のポリメラーゼドメインを規定し、それ以外では高度に分岐しているＲ
Ｔファミリーに共有されている（Ｐｏｃｈ ｅｔ ａｌ．（１９８９）ＥＭＢＯ Ｊ ８：３８６７−３８７４；Ｘｉｏｎｇ ａｎｄ Ｅｉｃｋｂｕｓｈ（１９９
０）ＥＭＢＯ Ｊ９：３３５３−３３６２）。Ｐ１２３及びＥｓｔ２ｐにおいて
は、注目すべきことに、これらのモチーフのうち６つまでを、酵母のＣＯＸ１遺
伝子の第２イントロン内にエンコードされているＲＴであるａ２−Ｓｃ酵素と共
有している（Ｋｅｎｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｃｅｌｌ１３３−１４
６）。これら６つのモチーフは、テロメラーゼの酵素機能に必要とされる不変の
アスパラギン酸残基部分を含み（Ｃｏｕｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９７）上
出；Ｌｉｎｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．上出）、予見されたｈＥＳＴ２の配列のしか
るべき位置に見出される。かくて、提唱されたヒトテロメラーゼ触媒サブユニッ
トは、酵母及び繊毛虫における対応物と同様、ＲＴという酵素スーパーファミリ
ーに属する。Like yeast and ciliate telomerase proteins, hEST2 is reverse transcriptase (RT
) Belongs to a family of enzymes. Seven retained sequence motifs, defining the polymerase domain of these enzymes, are otherwise highly branched R
T family (Poch et al. (1989) EMBO J 8: 3867-3874; Xiong and Eickbush (199).
0) EMBO J 9: 3353-3362). Notably, in P123 and Est2p, up to six of these motifs are shared with the a2-Sc enzyme, an RT encoded in the second intron of the yeast COX1 gene (Kennell). et al. (1993) Cell 133-14.
6). These six motifs contain the invariant aspartic acid residues required for the enzymatic function of telomerase (Counter et al. (1997) supra; Lingner et al. Supra) and provide a predicted hEST2 sequence. Found in the right place. Thus, the proposed human telomerase catalytic subunit belongs to the enzyme superfamily called RT, as well as its counterparts in yeast and ciliates.

【０２０１】 主題の方法において用いるべきヒトＥＳＴの典型的なコード配列及び蛋白は、
ＧｅｎＢａｎｋにおいて登録番号ＡＦ０１８１６７、ＡＦ０４３７３９、及びＡ
Ｆ０１５９５０として提供される。典型的なＥＳＴ構築体は、また、ＰＣＴ出願
の国際特許公開第９８／１４５９３号公報、及び、Ｕｌａｎｅｒ ｅｔ ａｌ．
（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ５８：４１６８−７２，Ｃｏｕｎｔｅｒ ｅ
ｔ ａｌ．（１９９８）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ１６１２１７−２２，及び、Ｖａｚｉ
ｒｉ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ８：２７９−８２．に記載
されている。好適実施態様においては、ＥＳＴ構築体は、厳密な条件下でＳＥＱ
ＩＤ Ｎｏ．１と相補的結合をなすＥＳＴコード配列、又はＧｅｎＢａｎｋに
おける登録番号ＡＦ０１８１６７、ＡＦ０４３７３９、又はＡＦ０１５９５０に
おいて開示されているコード配列を包含している。当該のＥＳＴコード配列は、
ＥＳＴ蛋白、又はテロメラーゼ活性を保持しているその断片、をエンコードする
ことが可能であり、その断片は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２又はＧｅｎＢａｎｋの
登録番号ＡＦ０１８１６７、ＡＦ０４３７３９、及びＡＦ０１５９５０の配列と
、少なくとも、例えば６０，７０，８０，８５，９０，９５、又は９８パーセン
ト同一であるか、又は以上に列挙した配列と同一である。Typical coding sequences and proteins of human EST to be used in the subject method include:
Registration numbers AF018167, AF043739, and A in GenBank
Provided as F015950. Exemplary EST constructs are also described in PCT application WO 98/14593 and Ulaner et al.
(1998) Cancer Res 58: 4168-72, Countere.
t al. (1998) Oncogene 161217-22, and Vazi
ri et al. (1998) Curr Biol 8: 279-82. It is described in. In a preferred embodiment, the EST construct has SEQ.
ID No. EST coding sequences that complementarily bind 1 or the coding sequences disclosed in GenBank under accession numbers AF018167, AF043739, or AF015950. The EST coding sequence is
An EST protein, or a fragment thereof that retains telomerase activity, can be encoded. 2 or GenBank accession numbers AF018167, AF043739, and AF015950 are at least, for example, 60, 70, 80, 85, 90, 95, or 98 percent identical, or identical to the sequences listed above.

【０２０２】 他の例示的な実施態様においては、テロメラーゼ活性化はｍｙｃ蛋白、例えば
ｃ−ｍｙｃの異所性発現、により惹起される。典型的なヒトｍｙｃのコード配列
は、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴのＭＹＣ＿ＨＵＭＡＮ部位、登録番号Ｐ０１１０６で
提供される。好適実施態様においては、ｍｙｃ構築体は、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ
のＭＹＣ＿ＨＵＭＡＮ部位、登録番号Ｐ０１１０６に開示されているコード配列
に対し厳密な条件下で相補的結合をなすｍｙｃのコード配列を包含している。当
該ｍｙｃコード配列は、ｍｙｃ蛋白、又は、テロメラーゼ活性を活性化する能力
を保持しているその断片で、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴのＭＹＣ＿ＨＵＭＡＮ部位、
登録番号Ｐ０１１０６に公開された蛋白配列と、少なくとも、例えば、６０，７
０，８０，８５，９０，９５又は９８パーセントは同一、又は同一であるもの、
をエンコードできる。[0202] In another exemplary embodiment, telomerase activation is triggered by ectopic expression of a myc protein, eg, c-myc. An exemplary human myc coding sequence is provided in the MYC_HUMAN site of SWISS-PROT, accession number P01106. In a preferred embodiment, the myc construct is a SWISS-PROT
MYC_HUMAN site, the coding sequence of myc, which forms complementary binding under stringent conditions to the coding sequence disclosed in accession number P01106. The myc coding sequence is a myc protein or a fragment thereof that retains the ability to activate telomerase activity, and the MYC_HUMAN site of SWISS-PROT,
A protein sequence published under accession number P01106 and at least, for example, 60,7
0, 80, 85, 90, 95 or 98 percent are the same, or are the same,
Can be encoded.

【０２０３】 また他の例示的な実施態様では、テロメラーゼ活性化はパピローマウイルスＥ
６蛋白、望ましくはヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）から得られたＥ６蛋白、
更に望ましくはハイリスクのＨＰＶ（例えばＨＰＶ−１６又は−１８）から得ら
れたＥ６蛋白、の発現により完遂される。ｐ５３の崩壊をもたらす能力を失う変
異を生じたＥ６蛋白を用いることは望ましいであろう。好適実施態様では、Ｅ６
構築体は、Ｅ６のコード配列を包含し、そのＥ６コード配列は、ＥＭＢＬ：Ａ０
６３２４部位、登録番号Ａ０６３２４で公開されたコード配列に対し厳密な条件
下で相補的結合を形成する。当該Ｅ６コード配列は、Ｅ６蛋白を、又はテロメラ
ーゼ活性の活性化能力を保持するその断片をエンコードできる。その断片は、Ｅ
ＭＢＬ：Ａ０６３２４部位、登録番号Ａ０６３２４で公開された蛋白配列と、少
なくとも、例えば、６０，７０，８０，８５，９０，９５又は９８パーセントは
同一、又はそれと同一である。In yet another exemplary embodiment, telomerase activation is papillomavirus E
6 proteins, preferably E6 protein obtained from human papillomavirus (HPV);
More preferably, it is accomplished by expression of an E6 protein obtained from high-risk HPV (eg, HPV-16 or -18). It may be desirable to use a mutated E6 protein that loses its ability to cause p53 disruption. In a preferred embodiment, E6
The construct includes the coding sequence for E6, the E6 coding sequence comprising EMBL: A0
Form a complementary bond under stringent conditions to the coding sequence published at site 6324, accession number A06324. The E6 coding sequence can encode an E6 protein or a fragment thereof that retains the ability to activate telomerase activity. The fragment is E
At least, for example, 60, 70, 80, 85, 90, 95 or 98 percent identical to or identical to the protein sequence published at MBL: A06324, accession number A06324.

【０２０４】 主題の方法に従って、主題のポリペプチドの発現構築体は、生物学的に有効な
キャリアーのいずれか、例えば、組換え遺伝子をイン・ビトロ又はイン・ビボで
細胞に有効に導入できる剤形又は組成のキャリアーを用いて投与できる。Ｒｂ不
活性化体について上述したように、達成法には、主題のＥＳＴ２又はテロメラー
ゼ活性化体遺伝子を、組換え性レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ類縁ウ
イルス、及びヘルペスシンプレックスウイルス−１を含むウイルス性ベクター、
又は組換え体のバクテリア性又は真核細胞性のプラスミド、によって挿入する方
法が含まれる。ウイルス性のベクターを用いれば細胞に直接移入できる；プラス
ミドＤＮＡは、実例として、カチオン性リポソーム（リポフェクチン）や、誘導
体化された（例えば抗体を共役させた）もの、ポリリジン複合体、グラミシジン
Ｓ、人工的ウイルス外皮、及びその他の細胞内キャリアー、の助けを借りて送達
されるし、また遺伝子構築体の直接注入法、又はイン・ビボで実施されるリン酸
カルシウム沈殿法もある。According to the subject method, the subject polypeptide expression constructs can be any biologically effective carrier, eg, an agent capable of effectively introducing a recombinant gene into cells in vitro or in vivo. The carrier can be administered in the form or composition. As described above for the Rb inactivator, the technique involves subjecting the subject EST2 or telomerase activator gene to viral, including recombinant retrovirus, adenovirus, adeno-associated virus, and herpes simplex virus-1. vector,
Alternatively, the method includes insertion using a recombinant bacterial or eukaryotic plasmid. Vectors can be directly transferred into cells using viral vectors; plasmid DNA illustratively includes cationic liposomes (lipofectin), derivatized (eg, conjugated to antibodies), polylysine complexes, gramicidin S, artificial It is delivered with the aid of a specific viral coat, and other intracellular carriers, and there are also methods of direct injection of the gene construct or calcium phosphate precipitation performed in vivo.

【０２０５】 テロメラーゼアクチベーターをエンコードする核酸を細胞内に導入するために
好適な達成法は、例えばｃＤＮＡのように、遺伝子産物をエンコードする核酸を
含有するウイルス性ベクターを利用することである。ウイルス性ベクターを細胞
に感染させることは、目的とする細胞の多くの割合がその核酸を受領できるとい
う利点を持つ。加えて、ウイルス性ベクター内にエンコードされる分子、例えば
、ウイルス性ベクターに含有されるｃＤＮＡにおいては、ウイルス性ベクターの
核酸を取り込んだ細胞で効率よく発現される。好適なベクターとしてはレトロウ
イルス、アデノ類縁ウイルスのベクターがある。A suitable technique for introducing a nucleic acid encoding a telomerase activator into a cell is to utilize a viral vector containing the nucleic acid encoding the gene product, such as a cDNA. Infecting cells with a viral vector has the advantage that a large proportion of the cells of interest can receive the nucleic acid. In addition, molecules encoded in viral vectors, such as cDNAs contained in viral vectors, are efficiently expressed in cells that have taken up the viral vector nucleic acid. Suitable vectors include retrovirus and adeno-associated virus vectors.

【０２０６】 テロメアの修復、例えばテロメラーゼ活性の活性化による、が細胞の複製能力
を延長させるのに充分であるが、それはまた形質転換的な事態（例えば状況の急
変に伴うがん細胞の出現）でもあり、活性化が持続する際には特にそうである。
それ故、一態様では、本発明は細胞の、望ましくは正常細胞の、増殖能力を増大
させる方法を与え、その方法は、細胞内のテロメラーゼ活性を選択的かつ可逆的
に活性化しうる遺伝子構築体を細胞内へ送達することを含む。Although telomere repair, such as by activating telomerase activity, is sufficient to prolong the cell's ability to replicate, it is also a transforming event (eg, the appearance of cancer cells with a sudden change in context). But especially when the activation persists.
Thus, in one aspect, the present invention provides a method for increasing the proliferative capacity of a cell, desirably a normal cell, comprising a gene construct capable of selectively and reversibly activating telomerase activity in a cell. To the cell.

【０２０７】 Ｒｂ不活性化体の可逆的発現のための上述した構築体類のように、ある実施態
様では、テロメラーゼアクチベーターに対するコード配列はベクターの一部分と
して与えられ、誘導可能なやりかたで宿主細胞から部分的に又は全面的に切除さ
れ得る。In some embodiments, such as the constructs described above for reversible expression of the Rb inactivated form, the coding sequence for the telomerase activator is provided as part of a vector and the host cell is inducibly manipulated. May be partially or completely resected.

【０２０８】 テロメラーゼ活性化の可逆性は、誘導可能な発現系の使用によりもたらすこと
が出来る。その発現系は、ＥＳＴ又はテロメラーゼアクチベーターのコード配列
の発現を制御する転写性調節配列に、誘導可能なものが存在するため、誘導が可
能になる。典型的な調節可能プロモーターの中には、テトラサイクリン反応性の
プロモーターがあり、実例としては、Ｇｏｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９２） ＰＮＡＳ ８９：５５４７−５５５１；及びＰｅｓｃｉｎｉ ｅｔ ａｌ．（１９
９４）Ｂｉｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２０２：１６６４−
１６６７、に記載されている。The reversibility of telomerase activation may be brought about by using an inducible expression system
Can be done. The expression system comprises a coding sequence for EST or telomerase activator.
Inducible transcriptional regulatory sequences that control the expression of
It will work. Some typical regulatable promoters include tetracycline-responsive
There are promoters, illustratively Gossen et al. (1992) PNAS 89: 5547-5551; and Pesini et al. (19
94)Bichem. Biophys. Res. Comm.202: 1664
1667.

【０２０９】 上記にさらに詳細に記載されたように、他の実施態様においては、テロメラー
ゼアクチベーターの発現は、転写的に活性を示す複合体を、低分子の「ダイマー
化体」依存性に集合させるキメラ性転写因子の制御下に置くことが出来る。 他の実施態様では、テロメラーゼ活性化の可逆性は、ＥＳＴ又はテロメラーゼ
アクチベーターで、例えば温度感受性のある変異体のような、条件的に活性を示
す（又は条件的に不活性化させ得る）形態を利用することで達成できる。上述し
た。As described in further detail above, in other embodiments, expression of the telomerase activator causes transcriptionally active complexes to be assembled in a small molecule “dimer” -dependent manner. Under the control of the chimeric transcription factor to be effected. In another embodiment, the reversibility of telomerase activation is a conditionally active (or conditionally inactivated) form of the EST or telomerase activator, eg, a temperature-sensitive mutant. Can be achieved by using. As described above.

【０２１０】 また他の実施態様では、上記に引用したマルチマー化の手法を、ＥＳＴ又はテ
ロメラーゼアクチベーターの低分子により誘導される形態を産生するのに用い得
る。例示すれば、第１の遺伝子構築体は、ｍｙｃのＤＮＡ結合ドメイン（そして
時にはオリゴマー化のドメイン）と、何か小さい有機分子に結合するリガンド結
合ドメイン、例えば、ダイマー化体に結合するドメイン、とを包含する融合蛋白
、として与えられる。第２の遺伝子構築体が、活性化ドメイン、例えば、ＶＰ１
６活性化ドメイン、及び、最初の融合蛋白にすでに結合しているダイマー化体に
さらに結合するリガンド結合ドメイン、を包含する融合蛋白をエンコードする構
築体、として同様与えられる。これら二つの融合蛋白を宿主細胞で発現させると
、ダイマー化体の不在下ではテロメラーゼを活性化しない。当該のダイマー化体
を加えると、融合蛋白同士が複合し、ｍｙｃ反応性の因子を含む遺伝子の転写を
活性化し、そしてそれがテロメラーゼの活性を活性化するのである。In yet another embodiment, the multimerization techniques cited above may be used to produce ESTs or small molecule induced forms of telomerase activators. To illustrate, a first gene construct comprises a DNA binding domain of myc (and sometimes a domain of oligomerization) and a ligand binding domain that binds to any small organic molecule, eg, a domain that binds to a dimer. As a fusion protein. A second gene construct comprises an activation domain, eg, VP1
Also provided as a construct encoding a fusion protein comprising six activation domains, and a ligand binding domain that further binds to a dimer that is already bound to the first fusion protein. When these two fusion proteins are expressed in host cells, they do not activate telomerase in the absence of the dimer. When the dimer is added, the fusion proteins complex with each other, activating transcription of a gene containing a myc-reactive factor, which activates telomerase activity.

【０２１１】 また他の実施態様では、ＥＳＴ２又はその他のテロメラーゼアクチベーターの
異所性発現は、ゲノムＤＮＡとの同族組換えによって、内在性のテロメラーゼア
クチベーター遺伝子の転写調節性配列を改変した「遺伝子活性化」構築物の一種
となり得る。例えば、当該遺伝子の活性化構築物は、ＥＳＴ２遺伝子の内在性プ
ロモーターを非同族性のプロモーター、例えば、ＥＳＴ２遺伝子の構成的な発現
を惹起させるもの、又は当該遺伝子の通常の発現パターンとは異なった条件下で
誘導性の発現を惹起させるもの、に置換することが出来る。実例として、Ｔｒａ
ｎｓｋａｒｙｏｔｉｃ Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ， Ｉｎｃ．のＰＣＴ刊行物、国際
特許公開第９３／０９２２２号公報、国際特許公開第９５／３１５６０号公報、
国際特許公開第９６／２９４１１号公報、国際特許公開第９５／３１５６０号公
報、国際特許公開第９４／１２６５０号公報を参照されたい。In yet another embodiment, the ectopic expression of EST2 or other telomerase activator is modified by homologous recombination with genomic DNA to alter the transcriptional regulatory sequence of the endogenous telomerase activator gene. It can be a type of "activation" construct. For example, the activating construct of the gene may be an EST2 gene endogenous promoter that is a non-cognate promoter, such as one that causes constitutive expression of the EST2 gene, or conditions that are different from the normal expression pattern of the gene. Those that cause inducible expression below can be substituted. As an example, Tra
nskaryotic Therapies, Inc. PCT publications, WO 93/09222, WO 95/31560,
See WO 96/29411, WO 95/31560, and WO 94/12650.

【０２１２】 ある実施態様においては、遺伝子活性化構築体は、細胞をリコンビナーゼで処
理した際、転写調節性配列を除去、又は最低限不活性化出来るようなリコンビナ
ーゼのサイトを包含している。上記同様、類似の実施態様においては、リコンビ
ナーゼサイトの代りに独自の制限酵素を採用してよい。In one embodiment, the gene activation construct includes sites for the recombinase such that transcriptional regulatory sequences can be removed or minimally inactivated when the cells are treated with the recombinase. As above, in similar embodiments, a unique restriction enzyme may be employed in place of the recombinase site.

【０２１３】 また他の実施態様においては、膜透過性の薬物（例えば、好ましくは小さい有
機分子の）が、内在性のテロメラーゼアクチベーター遺伝子、例えば、ＥＳＴ２
又はｍｙｃ遺伝子、の発現を活性化するものとして措定され得る。 ゲノム性のＥＳＴ２及びｍｙｃ遺伝子の入手しやすさを考慮すれば、リポーター
遺伝子が当該遺伝子の転写調節性配列と操作可能なように連結されたリポーター
構築体を産生することは可能である。調節性の配列を介してリポーター構築体の
活性化を行ないうる適当な細胞内小器官を有する細胞内に移入すれば、その結果
得られた細胞は、そのような化合物を同定するための細胞を基盤としたアプロー
チのために使用できる。In yet another embodiment, the membrane permeable drug (eg, preferably of a small organic molecule) is an endogenous telomerase activator gene, eg, EST2
Alternatively, it can be defined as activating the expression of the myc gene. Given the availability of genomic EST2 and myc genes, it is possible to produce a reporter construct in which a reporter gene is operably linked to a transcriptional regulatory sequence of the gene. Upon transfer into a cell having appropriate organelles capable of effecting activation of the reporter construct via a regulatory sequence, the resulting cells can be used to identify cells for identifying such compounds. Can be used for a based approach.

【０２１４】 細胞が培養状態で処理される実施態様では、ＥＳＴ２、ｍｙｃ又はその他のテ
ロメラーゼアクチベーターをエンコードするＲＮＡ、例えばイン・ビトロの転写
により産生されたＲＮＡ、を直接細胞内に導入できる。好適実施態様では、当該
ＲＮＡは、好ましくは、内在性のヌクレアーゼ、例えばエキソヌクレアーゼ及び
／又はエンドヌクレアーゼ、に抵抗性の修飾ポリヌクレオチドである。 主題の方法のさらに他の実施態様では、テロメラーゼアクチベーターポリペプ
チドは、組換え体が細胞内で発現しなくても、当該蛋白が細胞により取り込まれ
る、例えば内在化される、条件下で、細胞と接触させられる。例えば、主題の方
法を皮膚、粘膜、等々に適用する際、異所性に添加した蛋白を細胞内へ送達すべ
く種々の方法が開発された。Ｒｂ不活性化体について既に記述したように、当該
テロメラーゼアクチベーターは、粘膜を通して、又は皮膚を通して、与えられる
。他の実施態様では、当該ポリペプチドは非相同性のペプチド配列（「内在化ペ
プチド」）を含むキメラ性ポリペプチドとして与えられ、治療用のポリペプチド
配列が細胞内局在をしやすいよう、細胞外に与えた治療用ポリペプチド配列に細
胞膜を横切っての移動を行なわせる。In embodiments where the cells are treated in culture, RNA encoding EST2, myc or other telomerase activators, such as RNA produced by in vitro transcription, can be introduced directly into the cells. In a preferred embodiment, the RNA is preferably a modified polynucleotide that is resistant to an endogenous nuclease, such as an exonuclease and / or an endonuclease. In yet another embodiment of the subject method, the telomerase activator polypeptide is capable of producing a cell under conditions where the protein is taken up, eg, internalized, by the cell, even if the recombinant is not expressed in the cell. Contacted. For example, when applying the subject method to skin, mucous membranes, and the like, various methods have been developed to deliver ectopically added proteins into cells. As already described for the Rb inactivator, the telomerase activator is given through the mucous membrane or through the skin. In another embodiment, the polypeptide is provided as a chimeric polypeptide comprising a heterologous peptide sequence ("internalizing peptide"), such that the therapeutic polypeptide sequence facilitates subcellular localization. Allow the externally applied therapeutic polypeptide sequence to translocate across the cell membrane.

【０２１５】 他の実施態様では、主題の方法は小さい有機分子、例えば５０００ａｍｕ以下
の、さらに好ましくは１０００ａｍｕ以下の、さらにもっと好ましくは５００ａ
ｍｕ以下のものを採用する。さらにまた、そのような化合物は好ましくは膜透過
性であり、細胞培養中に、又は全血中の細胞に直接添加した場合、例えば、細胞
膜を越えて宿主細胞中に拡散して入り込むことが出来る。 これに関連して、当技術は、テロメラーゼ活性を活性化することが出来る作用
因を同定するための測定法の実例を与える。例えば、ＵＳ特許５，８３７，４５
３， ５，８３０，６４４， ５，８０４，３８０ 及び ５，６８６，２４５
を見られたい。In another embodiment, the subject method comprises treating a small organic molecule, eg, up to 5000 amu, more preferably up to 1000 amu, even more preferably up to 500 amu.
Mu or less is adopted. Furthermore, such compounds are preferably membrane permeable and can, for example, diffuse across cell membranes and enter host cells when added to cells in cell culture or directly to cells in whole blood. . In this context, the art provides an illustrative example of an assay for identifying agents capable of activating telomerase activity. For example, US Pat. No. 5,837,45
3, 5,830,644, 5,804,380 and 5,686,245
I want to see.

【０２１６】 まだ他の実施態様では、ＴＲＴ又はテロメラーゼアクチベーター（蛋白）の細
胞内レベルは、その本来のターンオーバー速度を阻害することにより、関与のあ
る範囲で、アップレギュレートすることが出来る。実例として、ユビキチン依存
性の、又は非依存性の、蛋白崩壊の阻害体を、細胞内の当該蛋白濃度を人為的に
上昇させられるという意味で、異所性の蛋白発現をもたらすために、使用するこ
とが出来る。ユビキチン化の阻害体を検出する測定法、例えば、ｍｙｃ又は他の
テロメラーゼアクチベーター類のユビキチン化阻害体を検出するために容易く流
用できるもの、は、たとえば合衆国特許５，７４４，３４３、５，８４７，０９
４、５，８４７，０７６、５，８３４，４８７、５，８１７，４９４、５，７８
０，４５４、及び５，７６６，９２７のような文献に記載されている。同様に、
リン酸化などのその他の翻訳後修飾が蛋白の安定性に影響する程度に応じて、本
発明は、そのような修飾の阻害体、適当なものとしてキナーゼ又はホスホキナー
ゼの阻害体を含む、の利用を意図する。In still other embodiments, the intracellular levels of TRT or telomerase activator (protein) can be up-regulated to the extent of interest by inhibiting its native turnover rate. Illustratively, ubiquitin-dependent or -independent inhibitors of proteolysis are used to produce ectopic protein expression in the sense that the protein concentration in cells can be artificially increased. You can do it. Assays for detecting inhibitors of ubiquitination, such as those that can be readily diverted to detect ubiquitination inhibitors of myc or other telomerase activators, are described, for example, in US Pat. No. 5,744,343,5,847. , 09
4, 5,847,076, 5,834,487, 5,817,494, 5,78
Nos. 0,454, and 5,766,927. Similarly,
Depending on the extent to which other post-translational modifications, such as phosphorylation, affect protein stability, the present invention relates to the use of inhibitors of such modifications, including kinases or phosphokinase inhibitors as appropriate. Intended.

【０２１７】 さらに他の実施態様として、細胞の増殖能力は、細胞をある作用因、たとえば
低分子の作用因で、ｍｙｃにより誘導されるテロメラーゼ活性の活性化に拮抗す
るシグナルを解除する又は阻害するものと接触させることで増大する。例えば、
ｍａｄ−ｍａｘヘテロダイマーによるｍｙｃ活性の阻害に際して生ずる蛋白・蛋
白相互作用を破壊するような作用因を使用することが出来る。In yet another embodiment, the proliferative capacity of the cell is such that the cell, with an agent, eg, a small molecule agent, releases or inhibits a signal that antagonizes myc-induced activation of telomerase activity. Increased by contact with things. For example,
Agents that disrupt the protein-protein interaction that occurs upon inhibition of myc activity by the mad-max heterodimer can be used.

【０２１８】 （ｖ）抗酸化剤の使用 さらに他の実施態様では、主題の方法は増殖能力を増大させるために抗酸化剤
を用いる。ある実施態様では、当該の方法は、酵素的な抗酸化系、たとえば、オ
キシドレダクターゼ分類にいう反応性酸素スカベンジャー酵素類（つまり、国際
生化学分子生物学会連合（ＩＵＢＭＢ）の推奨（１９９２）に則った酵素分類法
の下でＥ．Ｃ．１（オキシドレダクターゼ）に分類される酵素群）で、オキシド
レダクターゼをこのグループに含んでいる。(V) Use of Antioxidants In yet another embodiment, the subject method uses an antioxidant to increase the growth capacity. In one embodiment, the method involves enzymatic antioxidant systems, such as reactive oxygen scavenger enzymes in the oxidoreductase class (i.e., according to the recommendations of the International Union of Biochemical and Molecular Biology (IUBMB) (1992)). Oxidoreductase is included in this group under EC1 (oxidoreductase) under the Enzyme Classification System.

【０２１９】 以下の実例は、酵素分類（Ｅ．Ｃ．）から選んだオキシドレダクターゼ類を含
んでいる：グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ［ＮＡＤ＋］（１．１．
１．８），グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ［ＮＡＤ（Ｐ）＜＋＞］
（１．１．１．９４），グリセロール−３−リン酸 １−デヒドロゲナーゼ［Ｎ
ＡＤＰ］（１．１．１．９４），グルコースオキシダーゼ（１．１．３．４），
ヘキソースオキシダーゼ（１．１．３．５），カテコールオキシダーゼ（１．１
．３．１４），ビリルビンオキシダーゼ（１．３．３．５），アラニンデヒドロ
ゲナーゼ（１．４．１．１），グルタメートデヒドロゲナーゼ（１．４．１．２
），グルタメートデヒドロゲナーゼ［ＮＡＤ（Ｐ）＜＋＞］（１．４．１．３）
，グルタメートデヒドロゲナーゼ［ＮＡＤＰ＜＋＞］（１．４．１．４），Ｌ−
アミノ酸デヒドロゲナーゼ（１．４．１．５），セリンデヒドロゲナーゼ（１．
４．１．７），バリンデヒドロゲナーゼ［ＮＡＤＰ＜＋＞］（１．４．１．８）
，ロイシンデヒドロゲナーゼ（１．４．１．９），グリシンデヒドロゲナーゼ（
１．４．１．１０），Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ（１．４．３．２），Ｄ−アミ
ノ酸オキシダーゼ（１．４．３．３），Ｌ−グルタメートオキシダーゼ（１．４
．３．１１），プロテイン−リジン ６−オキシダーゼ（１．４．３．１３），
Ｌ−リジンオキシダーゼ（１．４．３．１４），Ｌ−アスパルテートオキシダー
ゼ（１．４．３．１６），Ｄ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ（１．４．９９．１）
，プロテインジスルフィドレダクターゼ（１．６．４．４），チオレドキシンレ
ダクターゼ（１．６．４．５），プロテインジスルフィドレダクターゼ（グルタ
チオン）（１．８．４．２），ラッカーゼ（１．１０．３．２），カタラーゼ（
１．１１．１．６），ペロキシダーゼ（１．１１．１．７），リポキシゲナーゼ
（１．１３．１１．１２），スーパーオキシドデスムターゼ（１．１５．１．１
）。The following examples include oxidoreductases selected from the Enzyme Classification (EC): Glycerol-3-phosphate dehydrogenase [NAD +] (1.1.
1.8), glycerol-3-phosphate dehydrogenase [NAD (P) <+>]
(1.1.1.94), glycerol-3-phosphate 1-dehydrogenase [N
ADP] (1.1.1.14), glucose oxidase (1.1.3.4),
Hexose oxidase (1.1.3.5), catechol oxidase (1.1
. 3.14), bilirubin oxidase (1.3.3.5), alanine dehydrogenase (1.4.1.1), glutamate dehydrogenase (1.4.1.2).
), Glutamate dehydrogenase [NAD (P) <+>] (1.4.1.3)
, Glutamate dehydrogenase [NADP <+>] (1.4.1.4), L-
Amino acid dehydrogenase (1.4.1.5), serine dehydrogenase (1.
4.1.7), valine dehydrogenase [NADP <+>] (1.4.1.8)
, Leucine dehydrogenase (1.4.1.9), glycine dehydrogenase (
1.4.10), L-amino acid oxidase (1.4.3.2), D-amino acid oxidase (1.4.3.3), L-glutamate oxidase (1.4)
. 3.11), protein-lysine 6-oxidase (1.4.3.13),
L-lysine oxidase (1.4.3.14), L-aspartate oxidase (1.4.3.16), D-amino acid dehydrogenase (1.4.9.19.1)
, Protein disulfide reductase (1.6.4.4), thioredoxin reductase (1.6.4.5), protein disulfide reductase (glutathione) (1.8.4.2), laccase (1.10.3. 2), catalase (
1.11.1.6), peroxidase (1.11.1.7), lipoxygenase (1.13.11.12), superoxide desmutase (1.15.1.1).
).

【０２２０】 好適実施態様では、当該酵素系は、スーパーオキシドデスムターゼ、カタラー
ゼ、及びグルタチオンペロキシダーゼを利用する。酵素は培養中に直接添加でき
、また、適切な方法として、組換え法を用いて培養細胞により発現される。 他の実施態様では、当該系は有機又は無機の低分子の抗酸化体を用いる。典型
的な抗酸化剤として含まれるのは、ベータカロチン、ビタミンＣ及びＥ、セレン
及びシステイン、グルタチオン、ビオフラヴァノイド、亜硫酸１ナトリウム、Ｎ
−アセチルシステイン（ＮＡＣ、細胞透過性の抗酸化剤）、ジエチルジチオカル
バメート、４−メチルチオ安息香酸、エブセレン、リポイン酸、システイン、メ
チオニン、２−メルカプトエタノール及び／又は光感受的分子、例えば過酸化水
素及びその他の酸素ラジカルを中和した作用因、である。また他の実施態様では
、作用因はジスムターゼアクチベーター又はその類似体である。そのような作用
因は、Ｍｎ（ＩＩＩ）テトラキス（４−安息香酸）ポルフィリンクロリド（Ｍｎ
ＴＢＡＰ）、細胞透過性のスーパーオキシドデスムターゼ（ＳＯＤ）類似体を含
む。[0220] In a preferred embodiment, the enzyme system utilizes superoxide desmutase, catalase, and glutathione peroxidase. Enzymes can be added directly during culture and, as appropriate, expressed by cultured cells using recombinant methods. In another embodiment, the system uses an organic or inorganic low molecular weight antioxidant. Typical antioxidants include beta-carotene, vitamins C and E, selenium and cysteine, glutathione, bioflavanoids, monosodium sulfite, N
-Acetylcysteine (NAC, a cell-permeable antioxidant), diethyldithiocarbamate, 4-methylthiobenzoic acid, ebselen, lipoic acid, cysteine, methionine, 2-mercaptoethanol and / or light-sensitive molecules such as hydrogen peroxide And other agents that neutralized oxygen radicals. In yet another embodiment, the agent is a dismutase activator or an analog thereof. Such agents include Mn (III) tetrakis (4-benzoic acid) porphyrin chloride (Mn
TBAP), a cell permeable superoxide desmutase (SOD) analog.

【０２２１】 （vi）ｐ５３経路の不活性化 他の実施態様では、主題の発明は、増殖能力を増大させる方法の一部としてｐ
５３のガン抑制活性を阻害する作用因を利用する。実例として、作用因は、ｐ５
３の発現を阻害するもの、小さい有機分子でｐ５３遺伝子の転写を阻害するよう
な、でありうる。また、ｐ５３遺伝子（又は関連するｐ６３又はｐ７３遺伝子）
の転写及び／又は翻訳を阻害するアンチセンス分子でありうる。 ある実施態様では、当該作用因は、厳密な条件下で、ＳＥ ＩＤ Ｎｏ．１０
に示されたヒトｐ５３遺伝子、又はその相補体、のコード配列と相補的結合をす
るアンチセンス核酸である。(Vi) Inactivation of the p53 Pathway In another embodiment, the subject invention provides p53 as part of a method of increasing proliferative capacity.
It utilizes an agent that inhibits the cancer inhibitory activity of 53. Illustratively, the agent is p5
3 may be such as to inhibit the expression of p53 gene with small organic molecules. Also, the p53 gene (or related p63 or p73 gene)
May be an antisense molecule that inhibits the transcription and / or translation of In some embodiments, the agent is under stringent conditions and has a SE ID No. 10
And an antisense nucleic acid that complementarily binds to the coding sequence of the human p53 gene or its complement.

【０２２２】 当該作用因は、また、例えばｐ５３−ｐ５３相互作用又はｐ５３−ＤＮＡ相互
作用に干渉することによって、ｐ５３に媒介された遺伝子発現を阻害する諸作用
因から選ぶこともできる。他の実施態様では、作用因はｐ５３のユビキチン化、
又はユビキチン依存性のｐ５３崩壊を促進するものでもあり得る。 さらに他の実施態様では、主題の方法は、優性ネガティブのｐ５３蛋白、例え
ば標的細胞中に移入された組換え構築体から発現された、又は蛋白治療体として
、例えば上述のトランスサイトーシスペプチドを利用することにより、当該細胞
に導入された、を利用する。 他の例示的な実施態様では、作用因はｐ１９（ＡＲＦ）を阻害するものであり
得る。ＩＮＫ４ａ−ＡＲＦ部位は、二つの明確な腫瘍サプレッサー、ｐ１６ＩＮ
Ｋ４ａとｐ１９（ＡＲＦ）をエンコードしている。ｐ１６ＩＮＫ４ａは網膜芽細
胞腫蛋白のリン酸化を妨げることで細胞の生育を掣肘するが、ｐ１９（ＡＲＦ）
はＭｄｍ２に媒介されるｐ５３の崩壊を制限し、それによってｐ５３を安定させ
て作用する。最近の知見では、Ｍｄｍ２が核と細胞質の間を往来し、この核・細
胞質間のＭｄｍ２の往来がＭｄｍ２のｐ５３崩壊を促進する能力に必須である。
例えば、Ｔａｏ ｅｔ ａｌ．（１９９９）ＰＮＡＳ９６：６９３７を参照され
たい。 それ故、Ｍｄｍ２が細胞質でｐ５３を崩壊へと向わせるには、ｐ５３を核から細胞
質へ移出する必要がある。ｐ１９（ＡＲＦ）の共同発現は、Ｍｄｍ２の核・細胞
質間の往来を阻止し、Ｍｄｍ２の核からの移出を妨げることでｐ５３を安定化す
る。The agent can also be selected from agents that inhibit p53-mediated gene expression, for example, by interfering with p53-p53 or p53-DNA interactions. In another embodiment, the agent is ubiquitination of p53,
Alternatively, it may promote ubiquitin-dependent p53 decay. In yet another embodiment, the subject method utilizes a dominant negative p53 protein, eg, expressed from a recombinant construct transfected into target cells, or as a protein therapeutic, eg, a transcytosis peptide as described above. To use the cells introduced into the cells. In another exemplary embodiment, the agent may be one that inhibits p19 (ARF). The INK4a-ARF site contains two distinct tumor suppressors, p16IN
K4a and p19 (ARF) are encoded. p16INK4a inhibits cell growth by preventing phosphorylation of retinoblastoma protein, whereas p19 (ARF)
Restricts Mdm2-mediated degradation of p53, thereby stabilizing and acting on p53. According to recent findings, Mdm2 travels between the nucleus and cytoplasm, and the traffic of Mdm2 between the nucleus and cytoplasm is essential for the ability of Mdm2 to promote p53 disruption.
See, for example, Tao et al. (1999) PNAS 96: 6937. Therefore, for Mdm2 to direct p53 into the cytoplasm for destruction, p53 must be exported from the nucleus to the cytoplasm. Co-expression of p19 (ARF) stabilizes p53 by blocking Mdm2 from translocating between the nucleus and cytoplasm and preventing the export of Mdm2 from the nucleus.

【０２２３】 上記のように、作用因は、例えばＳＥＱ Ｎｏ．１１、又はその相補体、に相
補結合するｐ１９（ＡＲＦ）のアンチセンス構築体のような、ｐ１９（ＡＲＦ）
の発現を阻害するものでありうる。 他の実施態様では、主題の方法は、優性ネガティブのｐ５３蛋白、例えば標
的細胞中に移入された組換え構築体から発現された、又は蛋白治療体として、例
えば上述のトランスサイトーシスペプチドを利用することにより、当該細胞に導
入された、を利用する。 さらに他の実施態様では、作用因はｐ１９依存性のｐ５３安定化を妨害する、
例えばｐ１９依存性のＭｄｍ２の核・細胞質間の往来を阻害する、分子でありう
る。これに関しては、作用因は、Ｍｄｍ２依存性のｐ５３安定化を、どのような
機作によるものであれ、阻害するものであり得る。As described above, the agent is, for example, SEQ No. P19 (ARF), such as an antisense construct of p19 (ARF), which complementarily binds to p11 (or its complement)
May inhibit the expression of In other embodiments, the subject method utilizes a transcytotic peptide expressed as a dominant negative p53 protein, eg, a recombinant construct transferred into a target cell, or as a protein therapeutic, eg, as described above. Thus, the cells introduced into the cells are used. In yet other embodiments, the agent prevents p19-dependent p53 stabilization,
For example, it may be a molecule that inhibits p19-dependent trafficking of Mdm2 between the nucleus and cytoplasm. In this regard, the agent may be any mechanism that inhibits Mdm2-dependent p53 stabilization.

【０２２４】 （vii） ＮＦ−κＢ経路の不活性化 また他の実施態様では、主題の方法は、ＮＦ−κＢに媒介される遺伝子の活性化
を利用する。 転写因子ＮＦ−κＢの薬理学的及び遺伝学的阻害は、過酸化水素によりもたら
される細胞死を防護した。過酸化水素で誘導される細胞死を媒介するというＮＦ
−κＢのこの障害的な効果は、Ｈ₂Ｏ₂の存在下、ＮＦ−κＢ依存性にアップレギ
ュレートされたｐ５３のような、死の効果をもたらす遺伝子が誘導されて発現し
たことに基づくと推定される。かくて、ＮＦ−κＢは、ｐ５３をアップレギュレ
ートするその能力と、細胞の酸化状態に見かけ上連携していることとによって、
ｐ５３依存性の複製的老化に関連してくる。 さらにその上、ＩｋＢ−αは、ＮＦ−κＢ依存性転写活性化をサイトゾル中で
阻害するが、過剰発現したとき、ｃ−Ｍｙｃ蛋白の総量は変わらないものの、仁
の中でのｃ−Ｍｙｃの量は豊かになる。かくて、ＮＦ−κＢはまた、テロメラー
ゼ活性化のネガティブなレギュレーターと判定される。 従って、ＮＦ−κＢ活性化の阻害体は、本発明においては、複製的老化を克服
するのに有用であると見なされる。例えば、主題の方法は、ＮＦ−κＢの核内へ
の局在と転写活性のＩｋＢによる阻害を増強する作用因を用いて実施され得る。
例をあげれば、当該作用因は、ＩｋＢのリン酸化を阻害するもの、ＩｋＢのユビ
キチン化を阻害するもの、又は、ＮＦ−κＢとＩｋＢの相互作用を増強するもの
、でありうる。作用因は、また、ＮＦ−κＢの核内局在を阻害するもの、又はＮ
Ｆ−κＢの転写活性化を阻害するもの、例えばＮＦ−κＢとＤＮＡ，又はＮＦ−
κＢと蛋白の相互作用を阻害することによって、でもありうる。(Vii) Inactivation of the NF-κB pathway In yet another embodiment, the subject methods utilize NF-κB mediated gene activation. Pharmacological and genetic inhibition of the transcription factor NF-κB protected cell death caused by hydrogen peroxide. NF mediates cell death induced by hydrogen peroxide
This detrimental effect of -κB is based on the induced expression of genes that cause death effects, such as NF-κB dependent up-regulated p53 in the presence of H ₂ O _2. Presumed. Thus, NF-κB, by its ability to upregulate p53 and by apparently cooperating with the oxidative state of the cell,
It is associated with p53-dependent replicative senescence. Furthermore, IkB-α inhibits NF-κB-dependent transcriptional activation in the cytosol, but when overexpressed, the total amount of c-Myc protein does not change, but c-Myc The amount of becomes rich. Thus, NF-κB is also determined to be a negative regulator of telomerase activation. Thus, inhibitors of NF-κB activation are considered useful in the present invention to overcome replicative senescence. For example, the subject method can be practiced with an agent that enhances nuclear localization of NF-κB and IkB inhibition of transcriptional activity.
For example, the agent may be one that inhibits phosphorylation of IkB, one that inhibits ubiquitination of IkB, or one that enhances the interaction between NF-κB and IkB. Agents may also inhibit nuclear localization of NF-κB, or
Those that inhibit the transcriptional activation of F-κB, such as NF-κB and DNA, or NF-κB
It could also be by inhibiting the interaction of κB with the protein.

【０２２５】 （viii） アポトーシスの可逆的不活性化 さる実施態様では、主題の方法は、アポトーシスの可逆的不活性化を包含する
であろう。広範な種類のアポトーシス阻害体が当技術に記載されている。これら
は、ＩＣＥプロテアーゼの低分子阻害体、カスパーゼの阻害体、ホスホリパーゼ
Ａ２の阻害体、などなどである。合衆国特許５，８６９，５１９は、Ｃ末端を修
飾した（ｎ置換）―２―インドリルジペプチド類を、システインプロテアーゼの
ＩＣＥ／ｃｅｄ−３ファミリーの阻害体として記載している。(Viii) Reversible Inactivation of Apoptosis In a further embodiment, the subject method will involve reversible inactivation of apoptosis. A wide variety of apoptosis inhibitors have been described in the art. These include small molecule inhibitors of ICE protease, inhibitors of caspase, inhibitors of phospholipase A2, and the like. US Patent 5,869,519 describes C-terminally modified (n-substituted) -2-indolyl dipeptides as inhibitors of the ICE / ced-3 family of cysteine proteases.

【０２２６】 （ix） 連合出願 この発明の他の側面として、一つ又はそれ以上の治療品を、Ｒｂ不活性化体又
はｒａｓ阻害体（類）と同時に投与する協同治療法が与えられる。そのような協
同治療は、当該処置の個々の成分を、同時に又は連続して又は連続させずに投与
することで達成される。例えば、テロメラーゼを活性化させる治験体は、成長因
子及び他の***促進性の作用因と協同して投与される。***促進性の作用因とは
、ここに用いられるのは、ペプチド、蛋白、及びグリコプロテインを含むいかな
る化合物、いかなる組成のものであってもよく、標的細胞集団の増殖を促進する
ことの可能なものである。実例を挙げれば、テロメラーゼを活性化する治療体を
、レクチンのようなＴ細胞の***促進性作用因で例えばコンカナバリンＡ又はフ
ィトヘマグルチニン、と協同で投与することができる。その他の典型的な細胞分
裂促進的な作用因として、インシュリン様生長因子（ＩＧＦ）、血小板由来生長
因子（ＰＤＧＦ）、繊維芽細胞生長因子（ＦＧＦ）、及び形質転換性生長因子（
ＴＧＦ）類のしかるべきもの、が含まれる。(Ix) Federated Applications In another aspect of the invention, there is provided a cooperative therapy wherein one or more therapeutics are administered simultaneously with the Rb inactivator or ras inhibitor (s). Such conjoint treatment may be achieved by way of the simultaneous or sequential or non-consecutive administration of the individual components of the treatment. For example, a subject that activates telomerase is administered in conjunction with growth factors and other mitogenic agents. A mitogenic agent, as used herein, may be any compound, including peptides, proteins, and glycoproteins, of any composition, capable of promoting the growth of a target cell population. Things. By way of example, a therapeutic that activates telomerase can be co-administered with a T cell mitogenic agent, such as lectin, for example, with concanavalin A or phytohemagglutinin. Other typical mitogenic agents include insulin-like growth factor (IGF), platelet-derived growth factor (PDGF), fibroblast growth factor (FGF), and transforming growth factor (
TGFs).

【０２２７】 ある実施態様では、主題の方法は、ＥＳＴ２レスキューの「キャッピング」阻
害を解除する作用因との協同投与を包含する。我々の知見では、ＥＳＴ２は、継
代を重ねたＨＭＥＣ細胞、及び繊維芽細胞のようないくつかの細胞ラインでは、
テロメアの長さもライフスパンも延長しない。特定の理論に拘束されることを望
まなければ、このような細胞でテロメアを伸長させられないのは、反応のキネテ
ィックスの結果かもしれない、例えば、ＴＲＦ（ＴＴＡＧＧＧ反復結合因子）の
ようなテロメア結合蛋白が、テロメア性の配列に対して豊富になった、というよ
うな。そのような蛋白へのテロメアの負荷増大が、異所性ＥＳＴ２により誘導さ
れる伸長を阻害する。テロメアに対する蛋白のそのような相対的な過剰は、例え
ば、結合性蛋白は一定の濃度で存在しテロメア性配列の数がそれに比較して減少
したのか、結合性蛋白の発現量（又は安定性）が増加したのか、それとも両者の
組み合わせか、の結果であろう。ＥＳＴ２活性のそのようなキネティックス的な
阻害を軽減するには、細胞を、テロメア結合性蛋白との結合に対しテロメアと競
合する（いわば、おとりのデコイとして）オリゴヌクレオチドで処理することが
出来る。例えば、Ｗｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．（１９９６）ＥＭＢＯ Ｊ １５
：１７３４を参照されたい。他の実施態様では、テロメア性配列と阻害的な蛋白
結合を生成するのを阻害するために、テロメア結合性蛋白の優性ネガティブの変
異体が細胞内に導入された。例えば、Ｂｉａｎｃｈｉ ｅｔ ａｌ．（１９９７
）ＥＭＢＯ Ｊ１６：１７８５−９４；Ｂｒｏｃｃｏｌｉ ｅｔ ａｌ．（１９
９７）Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ６：６９−７６；Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．
（１９９７）Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ１３：２１−２６；Ｚｈｏｎｇ ｅｔ
ａｌ．（１９９２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２：４８３４−４８４３；
Ｃｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ２７０：１６６３−１６
６；を参照されたい。さらに他の実施態様では、作用因はテロメア結合蛋白の発
現阻害体で、アンチセンス体、又は遺伝子転写の低分子性阻害体などでありうる
。まだ他の実施態様では、そのような作用因は、低分子のものは特に、テロメア
結合性蛋白を含むテロメアとの結合体形成を直接阻害する能力によって同定され
うる。In certain embodiments, the subject methods involve co-administration with an agent that releases “capping” inhibition of EST2 rescue. To our knowledge, EST2 is found in passaged HMEC cells and in some cell lines such as fibroblasts,
Neither telomere length nor lifespan is extended. Without wishing to be bound by a particular theory, the inability to elongate telomeres in such cells may be the result of the kinetics of the reaction, for example, telomeres such as TRF (TTAGGG repeat binding factor). It seems that binding proteins are enriched for telomeric sequences. Increased telomere loading of such proteins inhibits ectopic EST2-induced elongation. Such relative excess of the protein relative to telomere may be due to, for example, whether the binding protein is present at a constant concentration and the number of telomere sequences is reduced relative to it, or the expression level (or stability) of the binding protein. May have increased, or a combination of the two. To reduce such kinetic inhibition of EST2 activity, cells can be treated with an oligonucleotide that competes with telomeres for binding to telomere binding proteins (as a so-called decoy decoy). See, for example, Wright et al. (1996) EMBO J15
: 1734. In another embodiment, a dominant negative variant of a telomere binding protein has been introduced into a cell to inhibit the generation of inhibitory protein binding to a telomere sequence. See, for example, Bianchi et al. (1997
) EMBO J 16: 1785-94; Broccoli et al. (19
97) Hum Mol Genet 6: 69-76; Smith et al.
(1997) Trends Genet 13: 21-26; Zhong et.
al. (1992) Mol. Cell. Biol. 12: 4834-4843;
Chong et al. (1995) Science 270: 1663-16
6; In yet other embodiments, the agent is an inhibitor of telomere binding protein expression, such as an antisense or a small molecule inhibitor of gene transcription. In still other embodiments, such agents may be identified by their ability to directly inhibit conjugate formation with telomeres, including those of small molecules, particularly telomere binding proteins.

【０２２８】 （ｘ）典型的エクスビボ療法 本法は、インビボ、インビトロ、そして一部ではエクスビボのプロトコルで、
細胞の増殖能力を増大させるために用いることが出来る。当発明の方法は、通常
の細胞のいずれにも適用できるが、低いテロメラーゼ活性を発現している正常な
細胞において実施されるのがより好ましい。本発明の目的からして、「正常」と
いう述語は、腫瘍細胞、がん細胞、又は形質転換細胞、以外の細胞を意味する。
典型的な細胞は、Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ２
８２：１１４５、及びＳｈａｍｂｌｏｔｔ ｅｔ ａｌ．（１９９８）ＰＮＡＳ ９５：１３７２６、に公表されたように、胚性の幹細胞である。本法で用いるの
に特に好適な細胞は、胚性、胎児性、新生児性、成体性の各種器官幹細胞、成体
の多分化性造血幹細胞を含む。(X) Typical Ex Vivo Therapy The method comprises in vivo, in vitro, and in part, ex vivo protocols,
It can be used to increase the ability of cells to proliferate. The method of the present invention can be applied to any ordinary cells, but is more preferably performed in normal cells expressing low telomerase activity. For the purposes of the present invention, the term "normal" refers to cells other than tumor cells, cancer cells, or transformed cells.
Typical cells are described in Thomson et al. (1998) Science 2
82: 1145, and Shamblott et al. (1998) PNAS 95: 13726, which is an embryonic stem cell. Cells that are particularly suitable for use in the present method include embryonic, fetal, neonatal, and adult organ stem cells and adult pluripotent hematopoietic stem cells.

【０２２９】 ある実施態様では、細胞は幹細胞及び／又は始原細胞である。これらは造血幹
細胞、すなわち、骨髄、集積した末梢血、又は臍帯血に由来したものである。他
の実施態様では、細胞は膵又は肝組織、又は原腸から得た他の組織からの始原細
胞である。さらに他の実施態様では、幹は、ニューロン又は平滑筋細胞の形成に
用いられる神経冠のような神経幹細胞であった。 他の実施態様では、細胞は幹又は始原細胞ではなく、つまり方向の定まった細
胞、例えば、その一部をあげるならば、膵臓のβ細胞、平滑筋細胞（又は他のミ
オサイト性細胞）、繊維芽細胞、リンパ球細胞、つまりＢ又はＴ細胞、骨細胞又
は軟骨細胞などであった。 主題の方法はインビボでもインビトロでも用いられるが、この発明はエクスビ
ボの細胞を培養するのに特徴的な応用を有し、細胞をエクスビボで培養し次いで
宿主に再移入するという治療法において特に重要な利点を与える。例えば、主題
の方法は、収穫した、又は培養から分離した、細胞の増殖能力を、患者に移植し
た際に延長するために用いられる。 骨髄移植においては、骨髄、又は単離した造血始原細胞が本発明に則って処理
され、Ｒｂ及び／又はｒａｓを不活性化し、テロメラーゼを活性化して、移植前
、又は移植直後に野生型表現型に戻される、といったプロトコルが使用できる。[0229] In one embodiment, the cells are stem cells and / or progenitor cells. These are derived from hematopoietic stem cells, ie, bone marrow, accumulated peripheral blood, or umbilical cord blood. In other embodiments, the cells are progenitor cells from pancreatic or hepatic tissue, or other tissue obtained from the gastrum. In yet another embodiment, the stem was a neural stem cell, such as a neural crest used to form neurons or smooth muscle cells. In other embodiments, the cells are not stem or progenitor cells, ie, oriented cells, such as pancreatic β-cells, smooth muscle cells (or other myocytic cells), to name a few, They were fibroblasts, lymphocytes, ie B or T cells, osteocytes or chondrocytes. Although the subject method may be used in vivo or in vitro, the present invention has particular applications in culturing cells ex vivo, and is particularly important in therapeutics where cells are cultured ex vivo and then re-transferred to the host. Give benefits. For example, the subject methods are used to extend the proliferative potential of cells, either harvested or isolated from culture, when transplanted into a patient. In bone marrow transplantation, bone marrow or isolated hematopoietic progenitor cells are treated in accordance with the present invention to inactivate Rb and / or ras and activate telomerase to produce a wild-type phenotype before or immediately after transplantation. Can be used.

【０２３０】 主題の方法はＨＩＶ及びダウン氏病の患者においてＴ細胞の寿命を延長するに
も用いられる。 それはまた、補綴装置のような、幹細胞又は方向の定まった細胞に由来する人
工組織の形成のためのプロトコルにも応用を有する。典型的な組織としては、膵
組織、肝組織、神経組織、ミオサイト組織、軟骨組織、及び骨組織を含む。 例示するならば、主題の方法は造血細胞及び造血幹／始原細胞のライフスパン
を増加させるのに用いられる。ここでいう述語「造血細胞」は、赤血球、巨核球
、単球、顆粒球、及び好酸球のような完全に分化したミエロイド細胞、また同様
にＢリンパ球及びＴリンパ球のように完全に分化したリンフォイド細胞、を指す
。そして、造血性幹／始原細胞は、これらの分化した細胞群が途中で経る種々の
造血性前駆細胞、例えば、ＢＦＵ−Ｅ（バースト形成単位―エリトロイド）、Ｃ
ＦＵ−Ｅ（コロニー形成単位−エリトロイド）ＣＦＵ−Ｍｅｇ（コロニー形成単
位−巨核球）ＣＦＵ−ＧＭ（コロニー形成単位−顆粒球）ＣＦＵ−Ｅｏ（コロニ
ー形成単位−好酸球）ＣＦＵ−ＧＥＭＭ（コロニー形成単位−顆粒球−赤血球−
巨核球−単球）、を含むのである。The subject methods are also used to extend T cell life in patients with HIV and Down's disease. It also has applications in protocols for the formation of artificial tissue derived from stem cells or oriented cells, such as prosthetic devices. Typical tissues include pancreatic tissue, liver tissue, nerve tissue, myocyte tissue, cartilage tissue, and bone tissue. To illustrate, the subject methods are used to increase the life span of hematopoietic cells and hematopoietic stem / progenitor cells. The term "hematopoietic cells" as used herein refers to fully differentiated myeloid cells, such as erythrocytes, megakaryocytes, monocytes, granulocytes, and eosinophils, as well as fully differentiated, such as B and T lymphocytes. Refers to differentiated lymphoid cells. Hematopoietic stem / progenitor cells include various hematopoietic progenitor cells through which these differentiated cell groups pass, such as BFU-E (burst forming unit-erythroid), C
FU-E (colony forming unit-erythroid) CFU-Meg (colony forming unit-megakaryocyte) CFU-GM (colony forming unit-granulocyte) CFU-Eo (colony forming unit-eosinophil) CFU-GEMM (colony forming Unit-granulocyte-erythrocyte-
Megakaryocyte-monocyte).

【０２３１】 もう一つの実施態様では、主題の方法は膵細胞及び膵幹／始原細胞のライフス
パンを延長させるために用いうる。述語「膵始原細胞」は、膵細胞の系統に属す
る細胞に、つまり通常膵細胞によって産生されるホルモンや蛋白を産生しうる細
胞に、分化しうる細胞を指す。例えば、ある膵始原細胞は、促されれば、α、β
、δ、又はφの島細胞に、又は外分泌を定められた細胞へと、少なくとも部分的
には、分化する。本発明の膵始原細胞は、対象への投与に先立ち、細胞の増殖と
分化を促す条件下で培養される。その条件には、イン・ビトロで細胞を培養し、
細胞が増殖し集合して、しかるべき時に島に似た凝集体又は集合体を形成し、イ
ンシュリン、グルカゴン、及びソマトスタチンを分泌することを含む。In another embodiment, the subject methods can be used to extend the life span of pancreatic cells and pancreatic stem / progenitor cells. The term "pancreatic progenitor cells" refers to cells that can differentiate into cells belonging to the pancreatic cell lineage, that is, into cells that can produce hormones and proteins normally produced by pancreatic cells. For example, certain pancreatic progenitor cells, if prompted,
, Δ, or φ, or at least in part to cells that have been defined as exocrine. Prior to administration to a subject, the pancreatic progenitor cells of the present invention are cultured under conditions that promote cell proliferation and differentiation. The conditions include culturing cells in vitro,
It involves the proliferation and aggregation of cells to form islets-like aggregates or aggregates when appropriate, secreting insulin, glucagon, and somatostatin.

【０２３２】 膵の内分泌部分はランゲルハンス島で構成される。ランゲルハンス島は、細胞
の丸まった集合体が、外分泌を行なう膵細胞部分に埋め込まれて見える。α、β
、δ、又はφの４つの異なった型の細胞が島内に同定されている。α細胞は、膵
島中に見出される細胞の約２０％を占め、グルカゴンというホルモンを産出する
。グルカゴンはいくつかの組織に働き、食餌と食餌の合間にエネルギーを確保出
来るように作用する。肝臓ではグルカゴンはグリコーゲンの分解を促し、アミノ
酸前駆体からの糖新生を実行する。δ細胞はソマトスタチンを産出し、これは膵
内で作用してグルカゴンの放出を阻害し、膵の外分泌を減少させる。膵のポリペ
プチドホルモンは、φ細胞で産出される。このホルモンは、重炭酸塩と酵素の膵
からの外分泌を阻害し、胆嚢の弛緩をもたらし、胆汁の分泌を減らす。島のもっ
とも多い細胞は、６０〜８０％を占めるβ細胞で、これはインシュリンを産出す
る。インシュリンは、食餌摂取中及びその直後に生ずる栄養分の余剰の貯蔵を図
るように作用することが知られている。インシュリンの主要標的器官は、エネル
ギーの貯蔵に特化した器官である、肝臓、筋肉、脂肪組織である。The endocrine part of the pancreas is composed of islets of Langerhans. The islets of Langerhans appear to be rounded aggregates of cells embedded in the exocrine pancreatic cells. α, β
, Δ, or φ, four different types of cells have been identified within the islets. Alpha cells make up about 20% of the cells found in pancreatic islets and produce the hormone glucagon. Glucagon acts on several tissues to help secure energy between foods. In the liver, glucagon promotes glycogen breakdown and carries out gluconeogenesis from amino acid precursors. Delta cells produce somatostatin, which acts in the pancreas to inhibit glucagon release and reduces pancreatic exocrine secretion. Pancreatic polypeptide hormones are produced in φ cells. This hormone blocks excretion of bicarbonate and enzymes from the pancreas, leads to relaxation of the gall bladder, and reduces bile secretion. The most abundant cells in the islets are β-cells, which make up 60-80%, which produce insulin. Insulin is known to act to store excess nutrients that occur during and immediately after dietary intake. The primary target organs for insulin are the liver, muscle, and adipose tissue, which are specialized for energy storage.

【０２３３】 典型的な実施態様では、主題の治療作用因は、移植された膵組織、例えば移植
されたβ島細胞のライフスパンを延長させるように使用される。最近、処置に対
する組織工学的アプローチが、免疫的拒絶反応に備えて膜内に包み込んだ形の膵
島の移植に焦点を合せた。本技術においては、細胞を包み込む多くの方法が知ら
れている。例えば、インシュリンを産出しているβ島細胞が、移植可能なホロー
ファイバーに包み込まれる。そのようなファイバーをあらかじめ成形しておいて
、その後β島細胞を装填することができるし（Ａｅｂｉｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ
． 合衆国特許Ｎｏ．４，８９２，５３８；Ａｅｂｉｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．
合衆国特許Ｎｏ．５，１０６，６２７；Ｈｏｆｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９
９０）Ｅｘｐｔ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．１１０：３９-４４；Ｊａｅｇｅｒ ｅ
ｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｇ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．８２：４１−４６；及
びＡｅｂｉｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｍｅｃｈ．Ｅｎｇ ． １１３：１７８−１８３）、又は、β島細胞を包み込むポリマー性外皮となる
ようなポリマーと共成形することも可能である（Ｌｉｍ 合衆国特許Ｎｏ．４，
３９１，９０９；Ｓｅｆｔｏｎ 合衆国特許Ｎｏ．４，３５３，８８８；Ｓｕｇ
ａｍｏｒｉ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｔｒａｎｓ．Ａｍ．Ａｒｔｉｆ．Ｉｎｔ ｅｒｎ．Ｏｒｇａｎｓ ３５：７９１−７９９；Ｓｅｆｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（
１９８７）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．２９：１１３５−１１４３；
及びＡｅｂｉｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ １２：５０−５５）。In an exemplary embodiment, a subject therapeutic agent is used to extend the life span of transplanted pancreatic tissue, eg, transplanted β-islet cells. Recently, a tissue engineering approach to treatment has focused on the transplantation of islets in a membrane-encapsulated form in preparation for immunological rejection. Many techniques are known in the art for encapsulating cells. For example, β-islet cells producing insulin are encapsulated in implantable hollow fibers. Such fibers can be preformed and then loaded with beta islet cells (Aebischer et al.
. U.S. Pat. 4, 892, 538; Aebischer et al.
U.S. Pat. 5,106,627; Hoffman et al. (19
90) Expt. Neurobiol. 110: 39-44; Jaeger e
t al. (1990) Prog. Brain Res. 82: 41-46; and Aebischer et al. (1991) J. Biomech. Eng . 113: 178-183), or can be co-molded with a polymer that provides a polymeric hull encapsulating beta islet cells (Lim U.S. Pat.
391,909; Sefton U.S. Pat. 4,353,888; Sug
amori et al. (1989) Trans. Am. Artif. Int ern. Organs 35: 791-799; Sefton et al. (
1987) Biotechnol. Bioeng. 29: 1135-1143;
And Aebischer et al. (1991) Biomaterials 12: 50-55).

【０２３４】 上記の実施態様のいずれにおいても、膵細胞は主題の方法によってエクス・ビ
ボで処置されうるし、及び／又は、当該装置が植え込まれた動物への治療物を送
達することによって主題の方法で処置され得る。そのような細胞は、膵細胞の系
統に属する細胞へと、例えばβ島細胞へと分化する能力を持つので、糖尿病の処
置に用い得る。当発明における膵細胞は、これらの細胞を誘導して成熟膵細胞に
分化させるような条件下においてインビトロで培養もできるし、又はいったん対
象に導入してからインビボで分化を促すこともできる。 その上、移植可能な細胞の移植源を、分化後の後継細胞に対応する始原細胞集
団の形で、与えるのに加えて、主題の方法は、分泌される因子の産出と精製のた
めの培養に用いた正常な膵細胞の寿命を延長させるために用いられうる。例えば
、培養細胞をインシュリンの供給源として与えることが出来る。同様に、外分泌
細胞をパンクレアチンの供給源として与えることが出来る。In any of the above embodiments, pancreatic cells can be treated ex vivo by the subject method and / or by delivering a therapeutic to the animal in which the device is implanted. Can be treated. Such cells have the ability to differentiate into cells belonging to the lineage of pancreatic cells, for example into β-islet cells, and thus can be used in the treatment of diabetes. The pancreatic cells of the present invention can be cultured in vitro under conditions that induce these cells to differentiate into mature pancreatic cells, or can be induced to differentiate in vivo once introduced into a subject. In addition, in addition to providing a source of transplantable cells in the form of a progenitor cell population corresponding to post-differentiation successor cells, the subject method also involves culturing for production and purification of secreted factors. Can be used to extend the life of the normal pancreatic cells used for For example, cultured cells can be provided as a source of insulin. Similarly, exocrine cells can be provided as a source of pancreatin.

【０２３５】 さらに他の実施態様では、主題の方法は肝細胞及び肝幹細胞の寿命を延長させ
るために用いうる。述語「肝始原細胞」は、ここで使用する意味では、肝細胞の
系統に属する細胞に、いわば肝の実質細胞、たとえばヘパトサイトに、分化しう
る細胞を指す。ヘパトサイトは、生体内において最も様々なものに分化しうる可
能性を持つ細胞群の一部である。ヘパトサイトは、内分泌、外分泌の機能を有し
、しかじかの物質を産出しまた貯蔵し、他の物質を解毒し、他を分泌して、酵素
活性、物質移送、ホルモン活性を示す。肝細胞の主要な活動には、胆汁分泌、炭
水化物、脂質、蛋白質の代謝、代謝に重要な諸物質の貯蔵、ホルモンの分解と分
泌、及び薬物と毒素の変換と***がある。主題の方法は、肝細胞及び肝始原細胞
を、インビトロで、又は移植後に、長期間培養するのを容易にするために用いら
れる。 さらに他の実施態様では、主題の方法は、細胞の共培養において、「フィーダ
ー」側の細胞層の寿命を延ばすのに用いられうる。 他の実施態様では、主題の方法は、例えばヒト以外の動物から、大スケールの
クローニングを行なう際、核移転のため、***を盛んに行なっている胎児性繊維
芽細胞の存在を増強するのに用いられうる。In still other embodiments, the subject methods can be used to extend the life of hepatocytes and hepatic stem cells. The term "hepatic progenitor cell" as used herein refers to a cell that can differentiate into cells belonging to the lineage of hepatocytes, so to say, into parenchymal cells of the liver, such as hepatocytes. Hepatocytes are part of a group of cells that have the potential to differentiate into the most diverse in vivo. Hepatocytes have endocrine and exocrine functions, produce and store gnawing substances, detoxify other substances and secrete others, exhibiting enzymatic activity, mass transport, and hormonal activity. The primary activities of hepatocytes include bile secretion, metabolism of carbohydrates, lipids and proteins, storage of metabolically important substances, hormonal degradation and secretion, and conversion and excretion of drugs and toxins. The subject method is used to facilitate long-term culture of hepatocytes and hepatic progenitor cells in vitro or after transplantation. In yet another embodiment, the subject method can be used in co-culture of cells to extend the life of the cell layer on the “feeder” side. In other embodiments, the subject methods are used to enhance the presence of actively dividing fetal fibroblasts due to nuclear transfer, for example, when performing large-scale cloning from non-human animals. Can be used.

【０２３６】 核移植における事前の調査で、ドナーの細胞が細胞周期のどこにあるかが、核
移転後の胚の発達程度に影響する事が知られた。ドナーの細胞が、減数***の第
二中間期で停止された受け手側の卵母細胞に融合されると、核膜は壊れ、染色体
は凝集して卵母細胞は活性化される。この凝集期は、ＤＮＡ合成を行なっている
ドナー細胞においては、染色体の欠落を引き起こすことがしられている。しかし
、細胞周期のＧ₁相（ＤＮＡ合成の前）にあるドナー細胞なら、凝集は正常に生
じ、早期の発生が高速に起こる。Prior research into nuclear transfer has shown that where the donor cells are in the cell cycle affects the degree of embryo development after nuclear transfer. When the donor cells are fused to the recipient oocyte arrested in the second intermediate phase of meiosis, the nuclear membrane breaks down, the chromosome aggregates, and the oocyte is activated. This aggregation phase has been known to cause chromosome loss in donor cells performing DNA synthesis. However, if the donor cells in G ₁ phase of the cell cycle (before DNA synthesis), aggregation occurs normally, early generation occurs faster.

【０２３７】 核移植のための最適のドナー細胞を選択するに当っての我々の考え方は、細胞
は***を停止（これはＧ₀期に当る）していてはならず、***を積極的に行なっ
ていなくてはいけない、それが相対的に未分化の状態の指標であり、また早期の
胚の発生時に生じている急速な細胞***にも適合する、ということであった。細
胞は、また、Ｇ₁相にあらねばならないので、人為的に細胞周期を停止させるか
、又は先天的にＧ₁相が長い細胞タイプを選ぶかする。 さる実施態様では、主題の方法は、細胞のライフスパンを延長して、相同性の
組換えが培養中に実施できるような長さにまで延ばす、ために利用できる。ある
種の細胞では、複製的な老化が速やかに起こるので、相同性の組換えの有用さを
発現するに到らない。この点からは、主題の方法は、トランスジェニックな動物
、例えばノックアウト又はノックイン式組換え動物、つまりは動物畜産学、を作
り出すためのプロトコルの一部分として用いられうる。[0237] our concept of hitting To select the best of donor cells for nuclear transfer, cell should not have to stop dividing (which corresponds to G ₀ phase), actively division What had to be done was that it was an indicator of a relatively undifferentiated state and was compatible with the rapid cell division that occurred during early embryonic development. Since the cells must also be in the G ₁ phase, they either arrest the cell cycle artificially or choose a cell type with a long G ₁ phase by nature. In a further embodiment, the subject method can be used to extend the life span of the cells to such a length that homologous recombination can be performed in culture. In some cells, replicative senescence occurs rapidly and does not manifest the utility of homologous recombination. In this regard, the subject methods can be used as part of a protocol for producing transgenic animals, eg, knockout or knock-in recombinant animals, ie, animal husbandry.

【０２３８】 主題の方法は、また、一般的な細胞培養手技にも適用可能である。例えば、当
方法は、ヒトの細胞系で不死のものと寿命のあるものとを、例えばヒトＢ−リン
パ球とミエローマ細胞とを、交配したときに複製能力を高めるのに、つまり抗体
産生性のヒトハイブリドーマの複製能力を高めるのに、用いることが出来る。 さらに一般的に、主題の方法は、組換え性の蛋白を産生するように設計された細
胞の培養時の複製能力を増大させるのに用いられうる。確かに、主題の方法では
、「正常な」細胞でも組換え細胞として容認できるので、不死の細胞の使用に伴
って発生しかねない諸問題（例えば翻訳後の修飾の差異）、特に、分泌される蛋
白の産生に伴う、は避けることが出来よう。The subject method is also applicable to general cell culture procedures. For example, the method may be used to enhance the ability of human cell lines to replicate when immortal and long-lived, for example, human B-lymphocytes and myeloma cells, when crossed, i.e., to produce antibody. It can be used to enhance the replication ability of human hybridomas. More generally, the subject methods can be used to increase the ability of cells designed to produce recombinant protein to replicate in culture. Indeed, in the subject method, even "normal" cells are acceptable as recombinant cells, and the problems (eg, differences in post-translational modifications) that can arise with the use of immortal cells, especially secreted Associated with the production of certain proteins could be avoided.

【０２３９】 別の観点からは、本発明は、上皮由来の組織の増殖を制御するため、活性ある
成分として、以下のものの一つ又はそれ以上を利用する薬学的な製剤及び方法を
与える。（ｉ）Ｒｂ不活性化体、（ii）ｒａｓ阻害体、及び／又は、（iii）テロ
メラーゼを活性化する治療作用因。この発明は、また、当発明によるその薬学的
製剤の使用により、上皮由来の組織の増殖を制御するための方法にも関連する。 例示すれば、本発明のＲｂ不活性化体及びｒａｓ阻害体は、皮膚や皮膚の器官
；角膜、レンズ及びその他の眼組織；粘膜；及び歯周上皮；のごとき上皮性諸組
織、の不調の処置、又は外科的又は化粧による修復において、対処法の一つとし
て使用することが出来る。ここにおいて公開する方法と処方は、損傷した種々の
上皮組織又は粘膜組織に対する処置又は予防法を与える。例えば、主題の方法は
、負傷の回復過程を制御するのに用いることが出来、例えば、上皮組織を含む外
科施術、皮膚又は歯周における、と同調して用いるのが望ましい。Ｒｂ不活性化
体及びｒａｓ阻害体の使用が処置の候補に上るような、典型的な外科修復は、重
度の火傷及び皮膚の再生、皮膚の植皮、重圧による圧力性傷、皮膚の潰瘍、亀裂
、手術後の傷跡軽減、及び潰瘍性の大腸炎である。In another aspect, the present invention provides pharmaceutical formulations and methods that utilize one or more of the following as active ingredients to control the growth of epithelial-derived tissue: (I) a Rb inactivator, (ii) a ras inhibitor, and / or (iii) a therapeutic agent that activates telomerase. The invention also relates to a method for controlling the growth of epithelial-derived tissue by using the pharmaceutical preparation according to the invention. By way of example, the Rb inactivators and ras inhibitors of the present invention may be used in the treatment of epithelial tissues such as skin and skin organs; cornea, lenses and other ocular tissues; mucous membranes; It can be used as one of the treatments in a procedure or in a surgical or cosmetic repair. The methods and formulations disclosed herein provide a method for treating or preventing various damaged epithelial or mucosal tissues. For example, the subject methods can be used to control the healing process of the injury, and are desirably used in tandem with, for example, surgical procedures involving epithelial tissue, skin or periodontal. Typical surgical repairs, where the use of Rb inactivators and ras inhibitors are candidates for treatment, include severe burns and skin renewal, skin grafting, pressure wounds due to overpressure, skin ulcers, cracks Postoperative scar reduction, and ulcerative colitis.

【０２４０】 本発明の他の側面では、Ｒｂ不活性化体及びｒａｓ阻害体は、毛髪の生育に影
響を及ぼすために使用できる。その例として、脱毛症の処置に当っては、毛髪の
生育が強化され又は延長される。 本発明のさらに他の側面では、組織培養における上皮組織の生存期間を延長す
る方法を与える。In another aspect of the invention, Rb inactivators and ras inhibitors can be used to affect hair growth. By way of example, in the treatment of alopecia, hair growth is enhanced or prolonged. In yet another aspect of the invention, a method is provided for extending the survival of epithelial tissue in tissue culture.

【０２４１】 述語「上皮類」「上皮の」「上皮」は、体内側、体外側の身体表面にある細胞
性の被覆（表皮性、粘膜性、漿膜性）を指し、腺器官及びそれに由来するその他
の、角膜、食道、表皮、及び毛球の上皮組織を含む。その他の典型的な上皮組織
は、嗅覚器上皮：層類似構造をなした上皮が鼻腔の嗅覚器領域を覆い、嗅覚のた
めの受容体を収容している；腺上皮：分泌細胞からなる上皮を指す；扁平上皮：
扁平な平板状の細胞からなる上皮を指す。上皮という述語は、また、移行上皮を
も指すことがある。収縮と伸長に伴って著しい器械的変動をこうむる中空の器官
を覆う特徴的な上皮で、つまり、層状の扁平上皮と柱状上皮との中間移行形であ
る。 述語「上皮化」は、露出した表面を生長した上皮組織が覆って治癒に到ること
を指す。 述語「皮膚」は身体の外部を覆う保護用の被覆で、真皮と表皮とからなり、汗
腺と皮脂腺、そしてまた毛嚢構造を含むと理解されている。本申請書全てを通じ
て、「皮膚の（ｃｕｔａｎｅｏｕｓ）」の形容表現を用いるが、使用されている
文脈に応じて、一般的に皮膚に帰属するものを指す、と理解されたい。 述語「表皮」は、皮膚の最外層で血管を含まない層を指し、胚の外胚葉に由来し
、厚さは０．０７〜１．４ｍｍの範囲で様々である。手の平と足の裏の表面では
、内から外へ５層をなしている：柱状の細胞が垂直に並ぶ基底層；短い突起又は
棘を持った扁平な多面柱状の細胞からなる有棘層；扁平で顆粒の多い細胞からな
る顆粒層；核が不明確又は欠如した無色で透明な細胞が数層をなしている透明層
；扁平で角化し核を欠いた細胞からなる角皮層；である。通常の体表面の表皮で
は、普通、透明層は見られない。 述語「真皮」は、皮膚の、表皮に続く深部の部分で、血管に富み結合組織の密な
層と、神経及び感覚器の末梢器官を含んでいる。毛髪の根、皮脂腺、汗腺は、表
皮の構造であるがその根は真皮に深く埋め込まれている。 述語「毛髪」は、糸状の構造物を指すが、とりわけ、ケラチンから成る表皮に特
有の構造をいい、真皮に沈み込んでいる乳頭から発達し、哺乳類でのみ産生され
その動物群に特徴的である。また、そのような毛髪の凝集物をも指す。「毛嚢」は
、表皮の管状の陥入が毛髪を包み込み、そしてそこから毛髪が伸び出す部分を指
す。「毛嚢上皮細胞」は、毛嚢内の真皮乳頭を取り巻く上皮細胞で、幹細胞、外根
鞘細胞、基質細胞、及び内根鞘細胞から成る。これらの細胞は通常の非悪性細胞
でも、形質転換した／不死性の細胞でもありうる。 「切除創」は、皮膚の上皮層に生じた裂け傷、表皮剥脱、切り傷、刺し傷、又
は裂き傷で、真皮層にまで、又は皮下の脂肪ないしはより深部まで及ぶかもしれ
ない。 「熱創」は、皮膚の広い表面積が熱及び／又は化学薬品のためその個体から除
去され又は消失した事例を指す。 「真皮性皮膚潰瘍」は、組織の軽微な喪失にもとづく皮膚の損傷を指し、通常炎
症にもとづく。本発明の方法によって処置可能な真皮性皮膚潰瘍には、褥創、糖
尿性潰瘍、静脈性鬱血潰瘍、及び動脈性潰瘍が含まれる。褥創とは、慢性の潰瘍
で、長期にわたり皮膚の区域に加えられた圧力に基づくものである。この型の創
は、しばしば床擦れとか圧創と呼ばれる。静脈性鬱血潰瘍は、静脈の欠陥による
血液又は他の液の鬱滞に由来する。動脈性潰瘍は、血流が悪い動脈の周辺域にお
ける皮膚の壊死を指す。 「歯組織」は、口腔内の組織で上皮組織と同様なものを指す、例えば歯肉組織
。本発明の方法は、歯周病を処置するのに有用である。 「体内上皮組織」は体内の組織で皮膚における表皮層と同様の特徴を持つものを
指す。実例には、小腸の裏打ちがあげられる。本発明の方法は、ある種の体内の
創、例えば外科手術に基づく創、の治癒を促進するのに有用である。 「眼組織に対する創」は、甚だしいドライアイ症候群、角膜の潰瘍、及び表皮剥
脱、それと眼科の手術創、を指す。The terms “epithelium”, “epithelial”, and “epithelium” refer to the cellular covering (epidermal, mucosal, serosal) on the inner and outer body surface, and are derived from glandular organs and Others include the epithelium of the cornea, esophagus, epidermis, and hair bulb. Other typical epithelial tissues include the olfactory epithelium: a layer-like structure of epithelium that covers the olfactory area of the nasal cavity and contains receptors for olfaction; glandular epithelium: an epithelium consisting of secretory cells Refers to: squamous epithelium:
An epithelium consisting of flat, flat cells. The epithelium predicate may also refer to transitional epithelium. It is a characteristic epithelium that covers hollow organs that undergo significant mechanical fluctuations with contraction and elongation, that is, an intermediate transition between stratified squamous epithelium and columnar epithelium. The term "epithelialization" refers to the growth of epithelial tissue over the exposed surface leading to healing. The term "skin" is a protective covering over the body, consisting of the dermis and epidermis, and is understood to include sweat glands and sebaceous glands, and also hair follicle structures. Throughout this application, the adjective "cutaneous" will be used, but should be understood to refer generally to those belonging to the skin, depending on the context in which it is used. The term "epidermal" refers to the outermost layer of the skin, which does not contain blood vessels, is derived from the ectoderm of the embryo, and varies in thickness from 0.07 to 1.4 mm. The palms and soles have five layers from the inside to the outside: the basal layer, in which the columnar cells are arranged vertically; the spinous layer, which is composed of flat, multifaceted, columnar cells with short protrusions or spines; And a granular layer composed of cells with many granules; a transparent layer composed of several layers of colorless and transparent cells with unclear or missing nuclei; and a keratin layer composed of cells that are flat, keratinized and lack nuclei. The normal epidermis on the body surface usually does not have a transparent layer. The predicate "dermis" is the deeper part of the skin, following the epidermis, which contains a dense layer of connective tissue rich in blood vessels and peripheral organs of nerves and sensory organs. The roots, sebaceous glands, and sweat glands of the hair are epidermal structures, but the roots are deeply embedded in the dermis. The predicate "hair" refers to a thread-like structure, but in particular refers to a structure unique to the epidermis, consisting of keratin, which develops from the nipple sinking into the dermis, is produced only in mammals, and is characteristic of the animal population. is there. It also refers to such hair agglomerates. "Hair follicle" refers to the area where tubular invaginations of the epidermis wrap around the hair and from which the hair extends. "Hair follicle epithelial cells" are epithelial cells surrounding the papillary dermis in the hair follicle and are composed of stem cells, outer root sheath cells, stromal cells, and inner root sheath cells. These cells can be normal non-malignant cells or transformed / immortal cells. "Resected wound" is a tear, exfoliation, cut, stab, or tear in the epithelial layer of the skin that may extend to the dermis layer or to subcutaneous fat or deeper. "Hot wounds" refer to cases where a large surface area of the skin has been removed or lost from the individual due to heat and / or chemicals. "Dermal skin ulcer" refers to damage to the skin due to minor loss of tissue, usually based on inflammation. Dermal skin ulcers treatable by the methods of the present invention include pressure sores, diabetic ulcers, venous stasis ulcers, and arterial ulcers. Pressure sores are chronic ulcers that are based on long-term pressure on areas of the skin. This type of wound is often referred to as rubbing or pressing. Venous stasis ulcers result from stasis of blood or other fluids due to vein defects. Arterial ulcer refers to necrosis of the skin in the area around arteries with poor blood flow. “Dental tissue” refers to tissue in the oral cavity that is similar to epithelial tissue, eg, gingival tissue. The method of the present invention is useful for treating periodontal disease. "Epithelial tissue in the body" refers to tissue in the body that has characteristics similar to the epidermal layer in the skin. An example is the lining of the small intestine. The methods of the present invention are useful for promoting the healing of certain bodily wounds, such as those based on surgery. "Wounds to ocular tissue" refers to severe dry eye syndrome, corneal ulcers, and exfoliation, and surgical ophthalmic wounds.

【０２４２】 当主題の方法は、上皮組織を傷害する病変に対する治療及び予防において、ま
た、化粧のための使用においても、広範な適用可能性を有する。一般的に、本方
法は、インビボにせよインビトロにせよ、細胞をある量のテロメラーゼ活性化治
療体に接触させ、処置された上皮組織のライフスパンを変化させるに充分なだけ
、接触させる段階を含むことにより特徴づけられる。インビボの使用法では、投
与の態様、用量など処置法は、処置される上皮組織（類）により様々であろう。
例えば、処置組織が表皮組織、真皮組織とか粘膜組織とか、であれば、塗布によ
る処方が好まれるであろう。The subject methods have broad applicability in the treatment and prevention of lesions that damage epithelial tissue, as well as in cosmetic use. In general, the method includes contacting the cells, either in vivo or in vitro, with an amount of a telomerase-activating therapeutic and contacting the cells only enough to alter the life span of the treated epithelial tissue. It is characterized by: For in vivo use, the mode of administration, dosage, etc., will vary with the epithelial tissue (s) being treated.
For example, if the treated tissue is epidermal tissue, dermal tissue or mucosal tissue, a formulation by application would be preferred.

【０２４３】 「創傷の治癒を促進する」方法は、その処置の結果、その処置をしない場合に
較べ、創傷がより速やかに治癒する。「創傷治癒の促進」も、同様に、その方法
が、なかんずくケラチノサイトの、増殖と生育期の延長をもたらし、よりわずか
な傷跡、より僅かな引き攣れ、より少ないコラーゲン沈着、そしてより何事も残
らない表面を伴って、創傷が治癒する、ことを意味する。しかしまたある場合に
は、「創傷治癒の促進」は、ある創傷治癒法が、本発明の方法を共用した場合、
成功率（例えば皮膚移植の生着率）において改善されることを意味する。 合併症は、創傷がまだ完全には治癒せず、しかも開いている場合、つねに伴う
危険である。大抵の創傷は処置しなくとも速やかに治癒するが、ある種の創傷は
治癒に抵抗を示す。広い面積を占める創傷は、また、長期にわたって外界に開い
ている。本発明のある実施態様では、主題の方法を使用することにより、上皮組
織を含む創傷、例えば手術、火傷、炎症、又は刺激に由来する創傷、の治癒を増
強及び／又はさもなければ加速することができる。本発明のＲｂ不活性化体及び
ｒａｓ阻害体はまた、例えば化粧品用の剤形において、組織の、例えば皮膚、毛
髪、及び／又は指の爪の、再生過程を増強するために予防的に適用することもで
きる。The method of “promoting wound healing” results in the wound healing more quickly as a result of the treatment than without the treatment. "Promoting wound healing" is likewise a method that leads, inter alia, to keratinocytes to proliferate and proliferate, with fewer scars, less twitching, less collagen deposition, and more. It means that the wound heals, with no surface. However, also in some cases, “promoting wound healing” is when a method of wound healing shares the methods of the present invention,
It means an improvement in the success rate (eg, skin graft survival rate). Complications are an associated danger if the wound has not yet healed completely and is open. Most wounds heal quickly without treatment, but some wounds resist healing. Large wounds are also open to the outside world for a long time. In one embodiment of the invention, the use of the subject method enhances and / or otherwise accelerates the healing of wounds containing epithelial tissue, for example, wounds resulting from surgery, burns, inflammation, or irritation. Can be. The Rb inactivators and ras inhibitors of the present invention may also be applied prophylactically to enhance the regenerative process of tissues, eg, skin, hair, and / or fingernails, eg, in cosmetic dosage forms. You can also.

【０２４４】 火傷は、全面であれ部分的であれ、しばしば広い面積を覆い、そのため治癒に
長い時間を要するタイプの創傷の好例である。その結果、生命を脅かすたぐいの
合併症、例えば感染とか体液の喪失とかがしばしば生じる。加えて、火傷におけ
る治癒はしばしば無秩序であって、その結果、傷痕や変形を残す。ある場合には
、コラーゲンの過剰な沈着による創傷の引き攣れが、創傷の周辺において筋肉の
運動性を減少させる。本発明の配合と方法とが、火傷の治癒を増進させ、治癒過
程を促進することで、もっと望ましく形の整った仕上がりと、引き攣れと創痕が
より少ない結果を得ることができる。 広い範囲を覆う重篤な火傷は、しばしば、患者の身体の傷がない領域から得ら
れた皮膚の自家移植で処置される。主題の方法は、皮膚移植とともに使用して、
移植の効率性と培養時のライフスパンを改善させることが出来、また、移植され
た皮膚と、移植部位に近接した患者の皮膚と、その両者の生育を促進することに
より移植の「付き方」を改善させることが出来る。[0244] Burns are a good example of a type of wound that often covers a large area, either full or partial, and therefore requires a long time to heal. The result is often life-threatening complications, such as infections and fluid loss. In addition, the healing in burns is often chaotic, leaving scars and deformation. In some cases, spasm of the wound due to excessive deposition of collagen reduces muscle motility around the wound. The formulations and methods of the present invention can enhance burn healing and accelerate the healing process, resulting in a more desirably shaped finish and less seizures and scars. Serious burns that cover a large area are often treated with autografts of skin obtained from intact areas of the patient's body. The subject method is used in conjunction with a skin graft,
Improves the efficiency of transplantation and the life span during culture, and promotes the growth of both the transplanted skin and the patient's skin in close proximity to the transplantation site, thereby promoting the “how to attach” the transplant. Can be improved.

【０２４５】 真皮の潰瘍は、主題の方法による処置にふさわしい創傷の他の例である。つま
り、潰瘍の治癒をもたらすこと及び／又は潰瘍が慢性の創傷になるのを防ぐこと
。例えば、糖尿病患者の７名に１名は、その四肢に真皮の潰瘍を生じ、その潰瘍
は感染を起しやすい。感染した糖尿性潰瘍の個体は、病院に収容して手厚い看護
を加え、高価な抗生物質を使用し、しかも、ある場合には、四肢の切断に到る。
真皮の潰瘍は、静脈の疾患に由来するもの（静脈性鬱血潰瘍）、圧力の掛かり過
ぎに由来するもの（褥創）、及び動脈性潰瘍もまた治癒に抵抗する。従来の技術
での処置は、一般的に、創傷を保護し、感染を排除し、場合によっては血管の手
術により血行を回復させる。本方法によれば、皮膚の損傷部位に対してはＲｂ不
活性化体及び／又はｒａｓ阻害体を含む療法で、創傷の上皮化を促進し、つまり
皮膚潰瘍治癒の速度を加速させる。[0245] Dermal ulcers are another example of a wound suitable for treatment by the subject methods. That is, providing ulcer healing and / or preventing the ulcer from becoming a chronic wound. For example, one in seven diabetic patients develops a dermal ulcer on their limbs, which is susceptible to infection. Infected individuals with diabetic ulcers are admitted to hospitals, receive nursing care, use expensive antibiotics, and in some cases, lead to amputation of the extremities.
Dermal ulcers also result from venous disease (venous stasis ulcers), from overpressure (pressure sores), and arterial ulcers also resist healing. Treatment with the prior art generally protects the wound, eliminates infection, and restores blood circulation, possibly by vascular surgery. According to the present method, a treatment containing an Rb inactivator and / or a ras inhibitor at the site of skin damage promotes epithelialization of the wound, that is, accelerates the rate of skin ulcer healing.

【０２４６】 他の典型的な実施態様では、主題の方法は胃腸の疾患を処置し又は予防するよ
うに与えられた。要するに、胃腸の上皮又は繊毛の破壊には広範な種類の疾患が
伴っており、化学療法及び放射線療法に由来した腸炎（つまり小腸毒性）及び粘
膜炎、消化性潰瘍病、胃腸炎及び大腸炎、絨毛のアトロフィー性疾患、その他も
ろもろ。たとえば、骨髄移植及びがん治療において用いられる化学療法剤及び放
射線療法は、造血組織及び小腸の両者において、急速に増殖している細胞に影響
し、重篤でときにはそれ以上の療法を妨げる毒性を示す。小腸粘膜のバリアーに
対する障害は、出血及び敗血症という重篤な合併症をもたらす。主題の方法は、
胃腸上皮の増殖を促進するために使用され、その結果放射線及び化学療法の作用
因の耐量を増加させる。胃腸症の有効な処置は、回腸炎指数を含むいくつかの判
断基準で決められるが、その他のテストはその道の技術にとって周知である。In another exemplary embodiment, a subject method is provided for treating or preventing a gastrointestinal disorder. In short, destruction of the gastrointestinal epithelium or cilia is associated with a wide variety of diseases, including enteritis (ie, small bowel toxicity) and mucositis, peptic ulcer disease, gastroenteritis and colitis resulting from chemotherapy and radiation therapy. Trophoblastic disease of the villi, and more. For example, chemotherapeutic agents and radiation therapy used in bone marrow transplantation and cancer treatment affect rapidly proliferating cells in both hematopoietic tissues and small intestine, causing toxicity that is severe and sometimes prevents further therapy. Show. Impairment to the small intestinal mucosal barrier results in severe complications of bleeding and sepsis. The subject method is
Used to promote the growth of gastrointestinal epithelium, thereby increasing the tolerance of radiation and chemotherapy agents. Effective treatment of gastroenteropathy is determined by several criteria, including the ileitis index, but other tests are well known in the art.

【０２４７】 年齢と共に、外皮は薄くなり、皮膚にはアトロフィーが生じてくる。毛髪は疎
らになり、皮脂腺の分泌は衰える、その結果、乾燥状態、あかぎれ、そしてひび
が幅を利かす。真皮は減少し、エラスチン及びコラーゲン繊維が失われる。さら
に、ケラチノサイトの増殖（皮膚の厚さと皮膚の増殖能力の目安となる）は年齢
と共に減少する。ケラチノサイト増殖の増大、又は率の延長が、皮膚の老化、例
えば皺、厚さ、弾力性、及び修復、を抑える作用をすると信じられている。本発
明によれば、Ｒｂ不活性化体及びｒａｓ阻害体、及びテロメラーゼを活性化する
治療体は、治療的にも化粧品としても、老化が皮膚に及ぼす影響を、少なくとも
一時は、抑えるために使うことが出来る。With age, the outer skin becomes thinner and the skin develops atrophy. Hair becomes sparse and sebaceous glands secrete, resulting in dryness, irritations, and cracks. The dermis is reduced and elastin and collagen fibers are lost. In addition, keratinocyte proliferation, which is a measure of skin thickness and skin growth potential, decreases with age. It is believed that increased keratinocyte proliferation, or prolonged rate, acts to reduce skin aging, such as wrinkles, thickness, elasticity, and repair. According to the present invention, Rb inactivators and ras inhibitors and therapeutics that activate telomerase are used, at least temporarily, to reduce the effects of aging on the skin, both therapeutically and cosmetically. I can do it.

【０２４８】 主題の方法は、眼の組織に対する創傷の処置にも用いることが出来る。一般的
に、角膜組織への障害は、疾患、手術又は怪我によろうと、創傷の性質により、
上皮及び／又は内皮細胞に影響する。角膜上皮細胞は、非ケラチン性の上皮細胞
で、角膜の外側面を覆い、外部の環境に対する保護的なバリアーを提供する。角
膜の創傷治癒は、臨床家と研究者のいずれにとっても関心の深いものであった。
眼科医は頻繁に角膜のジストロフィー及び問題となる傷害に遭遇するが、この傷
害は、長引く、再発性の上皮糜爛をもたらし、最後には永続的な内皮細胞の喪失
に到るのである。主題の方法をこれらの例で使用すれば、害を受けた角膜組織の
上皮化を促進できるであろう。さらに例を挙げれば、眼における上皮細胞傷害と
典型的に関連する特異的な疾患で、主題の方法が良好な処置を提供できるものは
、長引く角膜上皮の欠乏、再発性糜爛、神経栄養性の角膜潰瘍、乾性角結膜炎、
微生物性角膜潰瘍、ウイルス性角膜潰瘍、その他もろもろ、である。さらに、擦
り傷、表面の糜爛、炎症等のほんのちょっとした傷害が、上皮細胞の喪失につな
がる。本発明によれば、角膜の上皮を、しかるべき量の、（ｉ）Ｒｂ不活性化体
（ii）ｒａｓ阻害体（iii）テロメラーゼを活性化する治療体のうち一つ又はそ
れ以上に接触させれば、角膜上皮細胞の増殖を増大し、適切に傷を治癒させるで
あろう。The subject methods can also be used to treat wounds on ocular tissue. In general, damage to corneal tissue, whether due to disease, surgery or injury, depends on the nature of the wound,
Affects epithelial and / or endothelial cells. Corneal epithelial cells are non-keratinous epithelial cells that cover the outer surface of the cornea and provide a protective barrier to the external environment. Corneal wound healing has been of interest to both clinicians and researchers.
Ophthalmologists frequently encounter corneal dystrophy and problematic injuries, which lead to prolonged, recurrent epithelial erosion and ultimately to permanent loss of endothelial cells. Use of the subject method in these examples could promote the epithelialization of damaged corneal tissue. By way of further example, specific diseases that are typically associated with epithelial cell injury in the eye and for which the subject method can provide good treatment include prolonged corneal epithelial deficiency, recurrent erosion, neurotrophic Corneal ulcer, keratoconjunctivitis sicca,
Microbial corneal ulcers, viral corneal ulcers, and others. In addition, even minor injuries such as abrasions, surface erosion, inflammation, etc., lead to epithelial cell loss. According to the present invention, the corneal epithelium is contacted with an appropriate amount of one or more of (i) a Rb inactivator, (ii) a ras inhibitor, and (iii) a telomerase-activating therapeutic. Would increase corneal epithelial cell proliferation and heal wounds appropriately.

【０２４９】 また、組織及び器官をエクス・ビボで保全することは非常に重要である。組織
の置換療法は、ヒト疾患の処置において確立されている。例えば、合衆国におい
ては、１９９６年、４万以上の角膜移植が行なわれている。ヒトの表皮細胞はイ
ンビトロで生育でき、火傷の部位、慢性の皮膚潰瘍、その他の真皮の負傷に植皮
されている。主題の方法は、上皮組織のライフスパンをインビトロで延長させ、
また同様に、培養した上皮組織の動物宿主への移植を延長するためにも使用でき
る。It is also very important to preserve tissues and organs ex vivo. Tissue replacement therapy has been established in the treatment of human disease. For example, in the United States in 1996, over 40,000 corneal transplants were performed. Human epidermal cells can grow in vitro and are implanted at sites of burns, chronic skin ulcers, and other dermal injuries. The subject method extends the life span of epithelial tissue in vitro,
Similarly, it can be used to extend transplantation of cultured epithelial tissue into animal hosts.

【０２５０】 本方法は、皮膚移植の「付き方」を改善するのにも使用されうる。表皮組織の
移植は、条件によっては、その自家移植片が「付く」、つまり傷に付着し、下層
にある肉芽組織と基底膜を形成する、という可能性を減少させてしまう。移着率
は、主題の方法を用いケラチノサイトの増殖を増大させることで、増加させうる
。移着率を増加させる方法は、皮膚の自家移植片に、以下の三者のうち一者又は
それ以上について、有効な創傷治癒量を接触させることである。その三者は、上
記、創傷治癒の促進法、及び、ケラチノサイトの生育及び増殖法、に記載された
（ｉ）Ｒｂ不活性化体、（ii）ｒａｓ阻害体、及び（iii）テロメラーゼ活性化
治療体である。The method can also be used to improve the “stick” of skin grafts. Transplantation of epidermal tissue, under certain conditions, reduces the likelihood that the autograft will “stick”, ie, adhere to the wound and form the underlying granulation tissue and basement membrane. Transfer rates can be increased by increasing keratinocyte proliferation using the subject methods. A method of increasing the transfer rate is to contact the skin autograft with an effective amount of wound healing for one or more of the following: The three include (i) an inactivated Rb, (ii) a ras inhibitor, and (iii) a telomerase-activating treatment described in the above-mentioned method for promoting wound healing and the method for growing and growing keratinocytes. Body.

【０２５１】 皮膚の代替物は、皮膚移植においてヒト又は動物の皮膚の代りとなるだけでな
く、薬品及び化粧品の皮膚への効果を定めるためのテスト用皮膚としても用いら
れる。薬理学的、化学的、及び化粧品のテストでの主要な困難は、その産物が皮
膚に及ぼす有効性と安全性を計測する困難さである。本発明の皮膚代替物におけ
る優位性の一つは、テスト用皮膚を用いインビトロでテストするとき、被検物の
及ぼす効果をよく指示できることにある。Skin substitutes not only replace human or animal skin in skin transplantation, but are also used as test skins to determine the effect of drugs and cosmetics on the skin. A major difficulty in pharmacological, chemical, and cosmetic testing is the difficulty in measuring the efficacy and safety of its products on the skin. One of the advantages of the skin substitute of the present invention is that the effect of the test substance can be well indicated when testing in vitro using a test skin.

【０２５２】 かくて、主題の方法の一つの実施態様は、皮膚移植のプロトコルの一部として
用いられる。皮膚の剥がれた部位、肉芽を形成している創傷、及び火傷に対して
である。主題の方法の使用は、スプリット・シックネス自家移植、表皮の自家移
植（培養した同系のケラチノサイト）及び表皮のアログラフト（培養した同種異
系のケラチノサイト）、などの移植の手技を増強させる。アログラフトの場合は
、培養による皮膚代替物の形成を増強するための主題の方法の使用は、そのよう
な移植片の容易な供給（つまり組織銀行において）を与え／維持して、患者が一
回の手続きで永続的な治癒を許す材料を入手できるようにするのに役立つ。Thus, one embodiment of the subject method is used as part of a skin grafting protocol. For areas where the skin has come off, granulated wounds, and burns. Use of the subject method enhances transplantation procedures, such as split thickness autograft, epidermal autotransplantation (cultured syngeneic keratinocytes) and epidermal allograft (cultured allogeneic keratinocytes). In the case of allografts, the use of the subject method to enhance the formation of skin substitutes by culturing may provide / maintain an easy supply of such grafts (ie, at a tissue bank) and provide a The procedure will help ensure that you have access to materials that allow for permanent healing.

【０２５３】 これに関連して、本発明はまた、培養されたケラチノサイト細胞の表皮層で、
以下の三者、（ｉ）Ｒｂ不活性化体、（ii）ｒａｓ阻害体、及び（iii）テロメ
ラーゼ活性化治療体、のうち一つ又はそれ以上の存在下で膨張させたものを含む
複合生皮代替物に関するものである。主題の方法は、複合生皮代替物の調製のた
めの過程の一部として用いられうる。例示的な実施態様では、そのような方法は
、皮膚の標本を取得し、当該標本を酵素的に処理して真皮から表皮を分離し、表
皮を酵素的に処理してケラチノサイト細胞を遊離させ、テロメラーゼ活性化治療
体の存在下でケラチノサイトを培養して集合状態に到らしめ、並行して又は別個
に真皮を酵素的に処理して繊維芽細胞を遊離させ、繊維芽細胞を培養して亜集合
状態に到らしめ、多孔性でクロスリンクしたコラーゲンのスポンジ様の膜に培養
した繊維芽細胞を接種し、接種したコラーゲンスポンジを広げて培養して繊維芽
細胞をコラーゲンスポンジの全面に生育させ、それから培養したケラチノサイト
をそこに接種し、この複合皮膚代替物コンプレックスをさらに以下の三者、（ｉ
）Ｒｂ不活性化体、（ii）ｒａｓ阻害体、及び（iii）テロメラーゼ活性化治療
体、のうちひとつ又はそれ以上の存在下で培養して細胞群のライフスパンを延長
する。In this context, the present invention also relates to the epidermal layer of cultured keratinocyte cells,
A composite rawhide comprising one that is inflated in the presence of one or more of the following three: (i) an inactivated Rb, (ii) a ras inhibitor, and (iii) a telomerase-activated therapeutic. It is about alternatives. The subject method can be used as part of a process for the preparation of a composite rawhide substitute. In an exemplary embodiment, such a method comprises obtaining a specimen of skin, enzymatically treating the specimen to separate the epidermis from the dermis, enzymatically treating the epidermis to release keratinocyte cells, The keratinocytes are cultured in the presence of the telomerase-activated therapeutic substance to reach a confluent state, and the dermis is enzymatically treated separately or concurrently to release fibroblasts, and the fibroblasts are cultured and subcultured. After reaching the assembled state, the cultured fibroblasts were inoculated on a porous and cross-linked collagen sponge-like membrane, and the inoculated collagen sponge was spread and cultured to allow the fibroblasts to grow on the entire surface of the collagen sponge. And then inoculated with cultured keratinocytes and further combining this complex skin substitute complex with the following three, (i
Cultivation in the presence of one or more of: (i) an inactivated Rb, (ii) a ras inhibitor, and (iii) a telomerase-activated therapeutic, to extend the life span of the cell population.

【０２５４】 他の実施態様では、上皮組織の層と間充織の層の両者を含む皮膚のシートを培
養状態で分離し、以下の三者、（ｉ）Ｒｂ不活性化体、（ii）ｒａｓ阻害体、及
び（iii）テロメラーゼ活性化治療体、のうちひとつ又はそれ以上を補充した培
地の存在下で膨張させることが出来る。 細胞培養手技を駆使できる皮膚の標本は、いずれも、本発明に従って使用でき
る。皮膚の標本は、同種同系でも同種異系でもよい。In another embodiment, a sheet of skin comprising both a layer of epithelial tissue and a layer of mesenchymal tissue is separated in culture and the following three components: (i) an inactivated Rb, (ii) The swelling agent can be expanded in the presence of a medium supplemented with one or more of a ras inhibitor and (iii) a telomerase-activating therapeutic agent. Any skin specimen that can utilize cell culture techniques can be used in accordance with the present invention. The skin specimen may be allogeneic or allogeneic.

【０２５５】 当発明の他の側面では、主題の方法は、歯周組織中、及び歯周組織周辺での上
皮細胞の増殖を制御することを望む場合、歯周における種々の手順と協同して使
用することが出来る。ある実施態様では、ヘッジホグの増殖型と、ピーティーシ
ー治療を使用して、自然の歯と義歯の周囲に再上皮化を、つまり歯ぎん組織の形
成促進を、増強させることが出来る。In another aspect of the invention, the subject methods cooperate with various procedures in the periodontium when it is desired to control the proliferation of epithelial cells in and around the periodontium. Can be used. In one embodiment, the proliferative form of hedgehog and PTC treatment can be used to enhance re-epithelialization around natural teeth and dentures, ie, promotion of gingival tissue formation.

【０２５６】 まだ他の側面では、主題の方法は、生体に吸収される材料と共同して用いた時
など、コントロールでガイドされる組織再生を助けるために使用できる。例えば
、歯周の移植物、義歯のような、の生着は、即時法によってやりやすくなる。歯
の再着生は、結合組織の繊維の形成及び歯孔の上皮化の両者を包含する。主題の
方法での処置は、創傷治癒の過程において、基盤の上皮細胞の***能力を制御す
ることで、組織の再着生を増強させるのに用いられうる。In still other aspects, the subject methods can be used to assist in control-guided tissue regeneration, such as when used in conjunction with materials that are absorbed by the body. For example, engraftment of periodontal implants, dentures, etc. is facilitated by an immediate method. Tooth regrowth involves both the formation of connective tissue fibers and the epithelization of the tooth hole. Treatment in the subject method can be used to enhance tissue repopulation by controlling the dividing ability of the underlying epithelial cells during wound healing.

【０２５７】 実施例 当発明の一般的な記載は行なったが、次の数例を参考にすることでより容易く
理解されるであろう。これらの例は、本発明のそれぞれの側面と実施態様を例示
する目的で含めたのであり、当発明を限定する主旨のものではない。EXAMPLES While the present invention has been described generally, it will be more readily understood by reference to the following few examples. These examples are included for the purpose of illustrating each aspect and embodiment of the present invention, and are not intended to limit the present invention.

【０２５８】 テロメアの保持は、ヒトにおける癌の発生に必須の前提条件として提案された
。テロメラーゼ酵素は、それ自身癌細胞の特異マーカーであるが、細胞新生性の
形質転換においてこの酵素を活性化する遺伝的変化は神秘に包まれたままであっ
た。オンコジーンｍｙｃの増幅は、ヒト腫瘍に普通に見受けられる。ここでは、
ｍｙｃが正常なヒト乳腺上皮細胞（ＨＭＥＣ）と、正常なヒト二倍体の繊維芽細
胞とのいずれにおいてもテロメラーゼを誘導することを示す。ｍｙｃは、ｈＥＳ
Ｔ２（ｈＥＳＴ／ＴＰ２）すなわちテロメラーゼの触媒サブユニット、の発現を
増加させる。ｈＥＳＴ２は正常細胞において酵素活性を限定しているので、ｍｙ
ｃのテロメラーゼ制御は、単にｈＥＳＴ２のレベルを調節しているだけかもしれ
ない。ｈＥＳＴ２を介したテロメラーゼの活性化は、平均的なテロメア長を伸長
して正常なヒト乳腺上皮細胞のライフスパンを延長するのに充分である。ｍｙｃ
は、これらの細胞のライフスパンをも延長するから、テロメラーゼの活性化は、
ｍｙｃが癌形成に与かる機作の一つかもしれない。Telomere retention has been proposed as an essential prerequisite for the development of cancer in humans. Although the telomerase enzyme is itself a specific marker of cancer cells, the genetic alterations that activate it in cytogenic transformation have remained mysterious. Amplification of oncogene myc is commonly found in human tumors. here,
Figure 4 shows that myc induces telomerase in both normal human mammary epithelial cells (HMEC) and normal human diploid fibroblasts. myc is hES
Increases the expression of T2 (hEST / TP2), the catalytic subunit of telomerase. Since hEST2 limits enzyme activity in normal cells,
Telomerase regulation of c may simply regulate hEST2 levels. Activation of telomerase via hEST2 is sufficient to extend the average telomere length and extend the life span of normal human mammary epithelial cells. myc
Extends the life span of these cells, so activation of telomerase
myc may be one of the mechanisms that contribute to cancer formation.

【０２５９】 テロメラーゼ活性は、インビボの体細胞及び培養された正常のヒト細胞には多
くは見られない。これらの細胞が増殖するにつれ、染色体の末端の再生が不完全
なため、テロメア中の反復は、***サイクルごとに次第に失われていく。テロメ
アの短縮は、細胞が複製のライフスパンの終点へと向う歩みを告げる細胞***時
計と見なされる。このモデルでは、染色体末端の浸食が細胞の老化をもたらす。
癌における癌抑制経路の欠落（例えばｐ５３及びＲｂ／ｐ１６）によって老化を
回避すると、連続した増殖とテロメア配列のさらなる消失が生ずる。テロメア部
分の保全なしに無制限に増殖を繰返すと、染色体はテロメアをすべて失って不安
定な状態になる。これは生存にはおそらく不適当な状態であるから、ライフスパ
ンに限定がない細胞は、テロメア保全の策を講じているに違いない。 テロメア反復の安定化は、癌化の必須条件として提案された。この概念に対す
る状況的な支持は、ヒトの後期の癌では高率にテロメラーゼが活性化されている
という観察から得られた。テロメアの保全が癌原性の表現型の必須な一環である
という可能性から、我々は既知のオンコジーンがテロメラーゼを活性化する能力
の有無を調査することにした。Telomerase activity is absent in somatic cells in vivo and normal cultured human cells. As these cells proliferate, repeats in the telomere are progressively lost with each division cycle due to incomplete regeneration of chromosomal ends. Telomere shortening is considered a cell division clock that tells cells to step towards the end of the life span of replication. In this model, erosion of chromosome ends leads to cell senescence.
Avoidance of senescence by lack of tumor suppressor pathways in cancer (eg, p53 and Rb / p16) results in continued proliferation and further loss of telomere sequences. Repeated growth indefinitely without preservation of the telomere portion causes the chromosome to lose all telomeres and become unstable. Because this is probably unsuitable for survival, cells with an unlimited lifespan must have taken telomere conservation measures. Stabilization of telomere repeats has been proposed as a prerequisite for canceration. Situational support for this concept came from the observation that telomerase is activated at a high rate in late-stage human cancers. Given the possibility that telomere conservation is an essential part of the carcinogenic phenotype, we decided to investigate the ability of known oncogenes to activate telomerase.

【０２６０】 正常ヒト乳腺上皮細胞はテロメラーゼを欠き、一方不死のＨＭＥＣ誘導株と胸
部癌細胞株は、ほぼ必ずテロメラーゼ陽性であった。ＨＭＥＣへＨＰＶ-１６
Ｅ６蛋白を導入するとテロメラーゼ活性を促進し、これらの細胞では、何か一つ
の遺伝的な事象がこの酵素を強化できる、と考えさせた（Ｆｉｇ．３）。それ故
、オンコジーンの調査対象にはＨＭＥＣを用いた。ｍｄｍ２の異所性発現におい
てテロメラーゼは誘導されなかったが、これは、テロメラーゼのＥ６による活性
化は、Ｅ６がｐ５３の崩壊を促進する能力とは分離できるという知見と矛盾がな
い（データ未発表）。他のいくつかの細胞性及びウイルス性のオンコジーンは、
Ｅ７を含むが、ｒａｓ（V12）とｃｄｃ２５アイソフォーム全てを活性化し、同
様にテロメラーゼを誘導しなかった（Ｆｉｇ．３、データ未発表）。しかし、ｃ
−ｍｙｃ発現カセットの導入は、ＨＭＥＣにおけるテロメラーゼ活性の出現をも
たらした。この酵素は、ｍｙｃ発現を導くレトロウイルスによるＨＭＥＣ導入の
１代後には検出し得た。感染細胞の薬物による選択の後、ｍｙｃを発現する集団
は、胸部カルシノーマ細胞系のランダムサンプルに見られるのにほぼ近いレベル
のテロメラーゼ活性を含んでいた（Ｆｉｇ．３；例えばＴ４７Ｄ）。Normal human mammary epithelial cells lack telomerase, whereas immortal HMEC-derived and breast cancer cell lines were almost always telomerase positive. HPV-16 to HMEC
Introducing the E6 protein promoted telomerase activity, and in these cells it was thought that some genetic event could enhance this enzyme (Fig. 3). Therefore, HMEC was used for the oncogene study. Telomerase was not induced in ectopic expression of mdm2, which is consistent with the finding that activation of telomerase by E6 can be separated from the ability of E6 to promote p53 disruption (data not shown). . Some other cellular and viral oncogenes are:
Including E7, but activated all ras (V12) and cdc25 isoforms and did not induce telomerase as well (FIG. 3, data unpublished). But c
The introduction of the -myc expression cassette resulted in the appearance of telomerase activity in HMEC. This enzyme could be detected one generation after HMEC transduction by a retrovirus leading to myc expression. After drug selection of infected cells, the myc-expressing population contained levels of telomerase activity near those found in random samples of breast carcinoma cell lines (FIG. 3; eg, T47D).

【０２６１】 Ｅ６を正常なヒトの二倍体繊維芽細胞に導入しても、テロメラーゼは活性化さ
れない（Ｆｉｇ．４）。同様の結果が、活性化したｒａｓ又は優性ネガティブの
ｐ５３アレルを移入した場合にも観察された（データ未発表）。しかし、テロメ
ラーゼはＩＭＲ−９０（Ｆｉｇ．４）又はＷＩ−３８細胞（データ未発表）にｍ
ｙｃ発現を指示するレトロウイルスを形質導入して誘導できる。ＨＭＥＣのよう
に、活性は感染後直ちに明らかで、ｍｙｃ発現集団を選択後には、テロメラーゼ
のレベルは、テロメラーゼ陽性なフィブロサルコーマ系統ＨＴ１０８０と同程度
だった（Ｆｉｇ．４）。Transduction of E6 into normal human diploid fibroblasts does not activate telomerase (FIG. 4). Similar results were observed when activated ras or dominant negative p53 alleles were transferred (data not shown). However, telomerase was not found in IMR-90 (FIG. 4) or WI-38 cells (data not shown).
It can be induced by transducing a retrovirus that directs yc expression. Like HMEC, the activity was evident immediately after infection, and after selection of the myc-expressing population, telomerase levels were comparable to telomerase-positive fibrosarcoma line HT1080 (FIG. 4).

【０２６２】 最近の報告は、Ｅ６がｍｙｃプロモーターを活性化すると示唆している。この
ことから、Ｅ６は、ｍｙｃ発現への効果を介してテロメラーゼを制御しているの
ではないか、と暗示を受けた。ＨＭＥＣでは、Ｅ６の発現はｍｙｃを誘導し、そ
のレベルは、ｍｙｃの発現を指示するレトロウイルスをＨＭＥＣに形質導入した
とき達成されるレベルの近くにまでなる（Ｆｉｇ．５Ａ）。驚くべきことに、Ｅ
６に誘導されたｍｙｃ蛋白の変化は、ｍｙｃのｍＲＮＡの量的変化を反映してい
なかった（Ｆｉｇ．５Ｂ）。つまり、Ｅ６によるｍｙｃ発現の制御は、転写以後
の段階で生じているに違いない。対照的に、ＩＭＲ−９０細胞内でｍｙｃのレベ
ルはＥ６が発現しても変らなかった。ＩＭＲ−９０細胞内ではＥ６はテロメラー
ゼを活性化出来ないのである（Ｆｉｇ．５Ａ）。この結果は、Ｅ６がＨＭＥＣに
おいて、テロメラーゼをｍｙｃの量を変えることで調節している、というモデル
に適合する。A recent report suggests that E6 activates the myc promoter. This suggested that E6 might regulate telomerase through its effect on myc expression. In HMECs, expression of E6 induces myc, levels approaching those achieved when transducing HMECs with retroviruses that direct myc expression (FIG. 5A). Surprisingly, E
6-induced changes in myc protein did not reflect the quantitative changes in myc mRNA (FIG. 5B). That is, the control of myc expression by E6 must have occurred at a stage after transcription. In contrast, myc levels in IMR-90 cells did not change with E6 expression. E6 cannot activate telomerase in IMR-90 cells (FIG. 5A). This result is consistent with the model that E6 regulates telomerase in HMEC by changing the amount of myc.

【０２６３】 ｈＥＳＴ２、すなわちテロメラーゼの触媒サブユニット、をエンコードするｍ
ＲＮＡの存在は、テロメラーゼ活性と直接に相関する。ｈＥＳＴ２のためのｍＲ
ＮＡは、正常の組織及び正常の細胞系統では検出できないが、一方ｈＥＳＴ２は
不死の及び癌由来の細胞系統に存在する。さらに、ｈＥＳＴ２の発現及びテロメ
ラーゼは、細胞が分化するように誘導されると、相伴って抑制される。予期され
るように、ｈＥＳＴ２のｍＲＮＡは、正常のＨＭＥＣには存在しなかった。しか
し、ｈＥＳＴ２は、ｍｙｃレトロウイルスによる形質導入の際には、ＨＭＥＣ細
胞内に検出された（Ｆｉｇ．６Ａ）。増大したｈＥＳＴ２の発現がｍｙｃによる
テロメラーゼ活性化を説明するのに充分かどうか検討するために、我々は、ｈＥ
ＳＴ２発現の指示を出すレトロウイルスを、ＨＭＥＣとＩＭＲ−９０とに感染さ
せた。両方の細胞タイプで、ｈＥＳＴ２の送達は明らかなテロメラーゼの誘導を
もたらした（Ｆｉｇ．６Ｂ）。併せ考えると、我々の結果は、ｍｙｃは、限定因
子であるテロメラーゼサブユニットの発現を制御することにより、テロメラーゼ
を調節していることを示している。ｍｙｃは転写因子であり、相応する遺伝子の
発現を増強できる。それゆえ、ｍｙｃはｈＥＳＴ２のプロモーターを直接刺激す
ることにより、ｈＥＳＴ２の発現を増大させられた。一方、ｈＥＳＴ２発現にお
ける変化は、ｍｙｃが他の遺伝子類を調節する能力による二次的な結果、生じた
ものであろう。M encoding hEST2, the catalytic subunit of telomerase
The presence of RNA correlates directly with telomerase activity. mR for hEST2
NA is not detectable in normal tissues and normal cell lines, whereas hEST2 is present in immortal and cancer-derived cell lines. Furthermore, hEST2 expression and telomerase are concomitantly suppressed when cells are induced to differentiate. As expected, hEST2 mRNA was absent from normal HMEC. However, hEST2 was detected in HMEC cells upon transduction with the myc retrovirus (FIG. 6A). To determine whether increased hEST2 expression is sufficient to explain telomerase activation by myc, we examined hE2 expression.
HMECs and IMR-90 were infected with a retrovirus indicating the expression of ST2. In both cell types, delivery of hEST2 resulted in apparent telomerase induction (FIG. 6B). Taken together, our results indicate that myc regulates telomerase by controlling the expression of the limiting factor, the telomerase subunit. myc is a transcription factor and can enhance the expression of the corresponding gene. Therefore, myc was able to increase hEST2 expression by directly stimulating the hEST2 promoter. On the other hand, changes in hEST2 expression may be secondary to myc's ability to regulate other genes.

【０２６４】 テロメアの長さは、二つの異なるレベルで調節される。第一に、テロメア反復
の保全には、テロメラーゼ酵素か、又はテロメア維持のための代替経路の活性化
かが必要である。第二に、テロメアの長さは、テロメア結合蛋白によって制御さ
れる。ＨＭＥＣ細胞におけるテロメラーゼの活性化が、テロメア長の安定化に充
分か否かを決めるため、我々は、ＨＭＥＣをテロメラーゼ活性の存在時及び不在
時でそれぞれ継代して、テロメア制限断片（ＴＲＦ）のサイズを追った。正常な
ＨＭＥＣでは、細胞が何回かの***を経た際、テロメア長は僅か短縮した（Ｆｉ
ｇ．６Ｃ）。ｈＥＳＴ２の発現によるテロメラーゼの活性化は、テロメアの短縮
を妨げただけでなく、平均ＴＲＦの長さを増加させて継代初期に見られたものと
比較しても上回らせた（Ｆｉｇ．６Ｃ）。 テロメア長は、細胞の複製ライフスパンを決定する計数メカニズムとして提唱
されている。継代初期、正常のＨＭＥＣでｈＥＳＴ２又はｍｙｃの発現カセット
を受けたものは、ベクターで形質導入された細胞に較べ延長したライフスパンを
示している（Ｆｉｇ．６Ｄ）。これは、細胞がその増殖能力を勘定するのに用い
る算定基準の一つがテロメア長だという説を支持する。[0264] Telomere length is regulated at two different levels. First, maintenance of telomere repeats requires telomerase enzymes or activation of alternative pathways for telomere maintenance. Second, telomere length is controlled by telomere binding proteins. To determine whether telomerase activation in HMEC cells is sufficient to stabilize telomere length, we passage HMEC in the presence and absence of telomerase activity, respectively, to reduce the presence of telomere restriction fragment (TRF). I followed the size. In normal HMEC, telomere length was slightly shortened when cells went through several divisions (Fi
g. 6C). Activation of telomerase by expression of hEST2 not only prevented telomere shortening, but also increased mean TRF length to be greater than that seen early in passage (FIG. 6C). . Telomere length has been proposed as a counting mechanism that determines the replication life span of a cell. At the beginning of the passage, normal HMECs receiving the hEST2 or myc expression cassette show a prolonged lifespan compared to cells transduced with the vector (FIG. 6D). This supports the theory that one of the metrics used to account for a cell's proliferative potential is telomere length.

【０２６５】 ここで我々は、ｍｙｃの異所性の発現が、正常な外皮細胞においても正常な繊
維芽細胞においても、テロメラーゼを誘導することが出来、かつＨＭＥＣの複製
ライフスパンを延長させられる、と示した。ｍｙｃオンコジーンは、広い範囲に
わたる様々な癌のタイプにおいて、遺伝子複製によって、また恐らく変異によっ
て、活性化される。ｍｙｃはテロメラーゼを癌細胞の系統で見られるのに近い程
度に上昇させられるから、多くの継代末期の癌でテロメラーゼが存在することは
、ｍｙｃの活性が上昇していることで説明できる。これに関連して、ニューロブ
ラストーマ１００株を調べたところ、ほぼ２０％（１６／１００）が例外的に高
いテロメラーゼ活性を示した。そのうち、１１例はＮ−ｍｙｃ座の増幅を示して
いた。したがって、この例では、テロメラーゼのレベルはｍｙｃの活性化とよく
相関していた。ｍｙｃオンコジーンがかなりの割合の癌でテロメラーゼを誘導し
ているにせよ、この酵素もまた他の経路で調節されているのである。Here we show that ectopic expression of myc can induce telomerase and extend the replication life span of HMECs in both normal dermal cells and normal fibroblasts. It was shown. The myc oncogene is activated by gene duplication, and possibly by mutation, in a wide variety of cancer types. The presence of telomerase in many late-stage cancers can be explained by increased myc activity, as myc can increase telomerase to a level close to that found in cancer cell lines. In this connection, examination of 100 neuroblastoma strains showed that almost 20% (16/100) showed exceptionally high telomerase activity. Among them, 11 cases showed amplification of the N-myc locus. Thus, in this example, telomerase levels correlated well with myc activation. Although the myc oncogene induces telomerase in a significant proportion of cancers, it is also regulated by other pathways.

【０２６６】 細胞増殖の促進と、ｍｙｃによるオンコジーン性の形質転換は、おそらく多数
の異なった標的遺伝子の誘導を必要とする。テロメアの維持が、癌細胞の長期に
わたる増殖ポテンシャルに貢献しているのだろうから、テロメラーゼの活性化こ
そが、癌形成を促進するｍｙｃの能力の不可欠な構成要素なのであろう。[0266] Promoting cell growth and oncogenic transformation with myc probably requires induction of a number of different target genes. Since telomere maintenance may contribute to the long-term growth potential of cancer cells, telomerase activation may be an essential component of myc's ability to promote cancer formation.

【０２６７】 方法 レトロウイルス性プラスミド：以下のウイルス性プラスミドが移入に用いられ
た。ｐＢａｂｅ−ｐｕｒｏ、ＭａｒＸＩＩ−ｈｙｇｒｏ、マウスｃ−ｍｙｃ／Ｍ
ａｒＸＩＩ−ｈｙｇｒｏ（Ｄｒ．Ｐ．Ｓｕｎ，ＣＳＨＬより分与）、Ｅ６／ｐＢ
ａｂｅ−ｐｕｒｏ、ｃｄｃ２５Ａ／ＭａｒＸＩＩ−ｈｙｇｒｏ。全長にわたるｈ
ＥＳＴ２ｃＤＮＡ（Ｄｒ．Ｒ．Ｗｅｉｎｂｅｒｇより分与）はＥｃｏＲＩ及びＳ
ａｌＩサイトでｐＢａｂｅ−ｐｕｒｏベクターにクローンした。 細胞培養及びレトロウイルスを介する遺伝子移入：ヒト乳腺上皮細胞（ＨＭＥ
Ｃ １８４ｓｐｉｒａｌＫ）はＤｒ．Ｍ．Ｓｔａｍｐｈｅｒから入手。正常ヒト
二倍体繊維芽細胞（ＩＭＲ９０ 及び ＷＩ ３８）及びヒト胸部癌細胞系統（
ＢＴ５４９、 Ｔ４７Ｄ 及び ＨＢＬ１００）はＡＴＣＣより入手。ＨＴ１０
８０細胞はＧ．Ｓｔａｒｋより分与（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃ Ｆｏ
ｕｎｄａｔｉｏｎ）。両栄養性パッケージング株、ｌｉｎＸ−Ａは我々の研究室
で調製（Ｌ．Ｙ．Ｘ，Ｄ．Ｂ． ａｎｄ Ｇ．Ｈ．未発表）。ＨＭＥＣは完全Ｍ
ＥＧＭ（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）。繊維芽細胞及びＬｉｎＸ−Ａ細胞はＤＭＥＭ（
ＧＩＢＣＯ）培地プラス１０％胎児牛血清（ＦＢＳ；Ｓｉｇｍａ）。ＢＴ５４９
、ＨＢＬ１００、及びＴ４７Ｄは、製造者の指示通りに維持。ＬｉｎＸ−Ａ細胞
は、レトロウイルス性プラスミド１５μｇ、及びソニケートした鮭***ＤＮＡ１
５μｇの混合物をリン酸カルシウム沈殿法で移入。移入された細胞は３７℃で２
４時間、次いで３０℃に移してウイルスを産生させる。４８時間後にウイルスを
集め、ウイルスを含む培地を濾過してパッケージング細胞を除く（０．４５μｍ
フィルター、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）。標的細胞は、４μｇ／ｍｌのポリブレンを
補充したウイルス上清と１０００ｇで１時間遠心分離、その後３０℃一夜、で感
染させる。感染細胞は感染後４８時間したら適当な薬物を用いて選択（ヒグロマ
イシン、Ｇ４１８又はプロマイシン）。Methods Retroviral Plasmids: The following viral plasmids were used for transfer. pBabe-puro, MarXII-hygro, mouse c-myc / M
arXII-hygro (distributed from Dr. P. Sun, CSHL), E6 / pB
abe-puro, cdc25A / MarXII-hygro. H over the entire length
EST2 cDNA (provided by Dr. R. Weinberg) was obtained from EcoRI and S
It was cloned into the pBabe-puro vector at the all site. Cell culture and retroviral mediated gene transfer: Human mammary epithelial cells (HME
C 184spiralK) is Dr. M. Obtained from Stampher. Normal human diploid fibroblasts (IMR90 and WI 38) and human breast cancer cell line (
BT549, T47D and HBL100) were obtained from the ATCC. HT10
80 cells are G. Stark (Cleveland Clinic Fo)
undation). An amphotropic packaging strain, linX-A, was prepared in our laboratory (LYX, DB and GH, unpublished). HMEC is complete M
EGM (Clonetics). Fibroblasts and LinX-A cells were DMEM (
GIBCO) medium plus 10% fetal bovine serum (FBS; Sigma). BT549
, HBL100, and T47D are maintained as specified by the manufacturer. LinX-A cells contained 15 μg of retroviral plasmid and sonicated salmon sperm DNA1.
5 μg of the mixture was transferred by the calcium phosphate precipitation method. The transferred cells were incubated at 37 ° C for 2 hours.
Transfer for 4 hours, then to 30 ° C. to produce virus. After 48 hours, the virus is collected, and the medium containing the virus is filtered to remove the packaging cells (0.45 μm
Filter, Millipore). Target cells are infected with the virus supernatant supplemented with 4 μg / ml polybrene at 1000 g for 1 hour and then at 30 ° C. overnight. Infected cells were selected 48 hours after infection using an appropriate drug (hygromycin, G418 or puromycin).

【０２６８】 ＴＲＡＰアッセイ。要点は、抽出物を溶解バッファー（１０ｍＭＴｒｉｓ[ｐ
Ｈ７．５]、１ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１ｍＭ ＥＧＴＡ、１０％グリセロール）中で
調製し、５０，０００ｘｇで３０分遠心分離する。１０から１０⁴の細胞に対応
する上清をアッセイにかける。テロメア反復はオリゴヌクレオチドＴＳ（５‘Ａ
ＡＴＣＣＧＴＣＧＡＧＣＡＧＡＧＴＴ３’）上で、３０℃１時間で進行する反応
で合成された。延長産物は³²Ｐ−ｄＡＴＰの存在下、ＴＳを下流アンカープライ
マー（５‘ＧＣＧＣＧＧＣＴＡＡＣＣＣＴＡＡＣＣＣＴＡＡＣＣ３’）と共に使
用しポリメラーゼチェーン反応（ＰＣＲ）で増幅された。５μｌの反応物を６％
アクリルアミド／８Ｍ尿素ゲルにかけた。[0268] TRAP assay. The point is that the extract was dissolved in lysis buffer (10 mM Tris [p
H7.5], 1 mM MgCl ₂ , 1 mM EGTA, 10% glycerol) and centrifuge at 50,000 × g for 30 minutes. Supernatants corresponding to 10 to 10 ⁴ cells are subjected to the assay. The telomere repeats are linked to the oligonucleotide TS (5'A
ATCCGTCGAGCAGAGTT3 ') at 30 ° C for 1 hour. The presence of the extension product ³² P-dATP, was amplified by polymerase chain reaction using with downstream anchor primer (5'GCGCGGCTAACCCTAACCCTAACC3 ') TS (PCR) . 5 μl reaction 6%
Run on acrylamide / 8M urea gel.

【０２６９】 ノーザン・ブロッティング：亜集合状態の培養からＴｒｉｚｏｌ試薬（ＧＩＢ
ＣＯ ＢＲＬ）を用いて全ＲＮＡを単離。１０μｇのＲＮＡを電気泳動で分離し
、製造者の指示書に従ってＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋膜に移す。ｈＥＳＴ２は、ラベル
したＳｔｕＩ断片と相補結合させた後に可視化。[0269] Northern blotting: Trizol reagent (GIB) from subassembled cultures.
Total RNA isolated using (CO BRL). 10 μg of RNA is separated by electrophoresis and transferred to Hybond-N + membrane according to the manufacturer's instructions. hEST2 was visualized after complementary binding to the labeled StuI fragment.

【０２７０】 ウェスタン・ブロッティング：細胞は冷ＰＢＳで洗浄しＬａｅｍｍｌｉのロー
ド用バッファーに溶解する。溶解物を９５℃に１０分加熱。サンプルを８％のＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥゲルにかけて分離し、ニトロセルロース膜に移す（Ｓｃｈｌｅｉ
ｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ）。ブロットはｃ-ｍｙｃウサギポリクローナル
抗体（Ｎ−２６２；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｔｚ）又はＴＦＩＩＢウサギポリクロー
ナル抗体（Ｄｒ．Ｂ．Ｔａｎｓｅｙより分与）と共にインキュベート。免疫複合
体は、¹²⁵Ｉ−プロテインＡ（ＩＣＮ）と二次インキュｂ−トして可視化。Western Blotting: Cells are washed with cold PBS and lysed in Laemmli's loading buffer. Heat the lysate to 95 ° C. for 10 minutes. Samples at 8% S
Separate on a DS-PAGE gel and transfer to a nitrocellulose membrane (Schlei
cher & Schuell). Blots were incubated with c-myc rabbit polyclonal antibody (N-262; Santa Crutz) or TFIIB rabbit polyclonal antibody (provided by Dr. B. Tansey). Immune complexes were visualized by secondary incubation with ¹²⁵ I-protein A (ICN).

【０２７１】 以上に引用した参考文献、出版物、及び出願中の特許は参考文献目録に組み込
まれている。The references, publications, and patents pending, cited above are incorporated in the bibliography.

【０２７２】 代替法 その道に習熟した者なら、ただのルーチンな実験法に過ぎないものを用いて、
ここに記載された特異なポリペプチド、核酸、方法、アッセイ、試薬に対し、多
くの代替実験法を認識するなり想到するなりするであろうが、そのような代替品
はこの発明の視野に含まれていると考える。Alternatives If you are proficient in the path, using what is just a routine experiment,
Although many alternative experimental approaches to the specific polypeptides, nucleic acids, methods, assays, and reagents described herein will be recognized or contemplated, such alternatives are within the scope of this invention. Think that it is.

【配列表】 [Sequence list]

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

【図１】 ｈＥＳＴ２は、Ｅｓｔ２ｐ及びｐ１２３のヒト同族体をコードする。ｈＥＳＴ
２の予測アミノ酸配列と、酵母Ｅｓｔ２ｐ及び正倍数体ｐ１２３同族体とのアラ
インメント。影付き及び閉鎖ブロック内のアミノ酸残基は、少なくとも２つのタ
ンパク質が同一である。ＲＴモチーフ内の同一アミノ酸は閉鎖ボックス内にあり
、テロメラーゼ特異モチーフの例は、輪郭が描かれた影付きボックス内にあり、
すべての同一アミノ酸は影付きボックス内にある。ＲＴモチーフは、他の隣接不
変体又は保存されたアミノ酸を含んでいる場合がある。発現されたタグＡＡ２８
１２９６配列には下線が付されている。FIG. 1. hEST2 encodes human homologues of Est2p and p123. hEST
2. Alignment of the predicted amino acid sequence of 2 with yeast Est2p and homologs of euploid p123. The amino acid residues in the shaded and closed blocks are identical for at least two proteins. The same amino acid in the RT motif is in a closed box, an example of a telomerase-specific motif is in a outlined shaded box,
All identical amino acids are in shaded boxes. The RT motif may include other adjacent constants or conserved amino acids. Expressed tag AA28
The 1296 sequence is underlined.

【図２】 テロメラーゼサブユニットｈＥＳＴ２、ｐ１２３及びＥｓｔ２ｐのＲＴモチー
フ１〜６と、Ｓ Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ群ＩＩイントロンでコードされるＲＴ
α２−Ｓｃ及びα１−Ｓｃとのアラインメント。各ＲＴモチーフのコンセンサス
配列が示されている（ｈ＝疎水性、ｐ＝小極性、ｃ＝帯電性）。テロメラーゼ及
びＲＴコンセンサス配列中の不変体であるアミノ酸は影付きボックス内にある。
字詰めの粗いボックス（ｏｐｅｎ ｂｏｘ）は、テロメラーゼ又は非テロメラー
ゼＲＴに特有の高度に保存された残基を明らかにしている。アスタリスクは、ポ
リメラーゼ触媒機能に必須のアミノ酸を示している。FIG. 2. RT motifs 1-6 of the telomerase subunits hEST2, p123 and Est2p and the RT encoded by the S Cerevisiae group II intron.
Alignment with α2-Sc and α1-Sc. The consensus sequence for each RT motif is shown (h = hydrophobic, p = small polarity, c = charged). Amino acids that are invariant in the telomerase and RT consensus sequences are in shaded boxes.
The open-box coarse box reveals highly conserved residues unique to telomerase or non-telomerase RT. Asterisks indicate amino acids essential for polymerase catalytic function.

【図３】 ＨＭＥＣ細胞におけるテロメラーゼのｍｙｃ活性化。継代１２の一次ＨＭＥＣ
細胞に、空のベクター（レーン１〜５）、Ｅ６（レーン６〜１０）、ｃ−ｍｙｃ
（レーン１１〜１５）又はｃｄｃ２５Ａ（レーン１６〜２０）ウイルスを感染さ
せた。比較のために、２種の乳がん細胞系ＢＴ５４９（レーン２１〜２５）及び
Ｔ４７Ｄ（レーン２６〜３０）を含めた。細胞を溶解させ、１０，０００細胞（
レーン２、６、７、１１、１２、１７、２１、２２、２６及び２７）、１，００
０細胞（レーン３、８、１３、１８、２３及び２８）、１００細胞（レーン４、
９、１４、１９、２４及び２９）、１０細胞（レーン５、１０、１５、２０、２
５及び３０）に相当する抽出物を用いてＴＲＡＰアッセイを行った。テロメラー
ゼ活性は、テロメラーゼアッセイの前にＲＮアーゼＡを添加することにより、Ｒ
Ｎアーゼ感受性になることが示された（「−」はＲＮアーゼＡを含まない；「＋
」はＲＮアーゼＡを含む）。明らかに負の溶解物中の阻害剤の存在を除外するた
めに、「ミックス」標識を付したレーン（レーン１及び１６）は、１０，０００
個の正（ｃ−ｍｙｃを発現する）細胞由来の溶解物と混合した１０，０００個の
指示細胞由来の溶解物を含むアッセイである。FIG. 3. Myc activation of telomerase in HMEC cells. Primary HMEC for passage 12
Cells were given empty vector (lanes 1-5), E6 (lanes 6-10), c-myc
(Lanes 11 to 15) or cdc25A (lanes 16 to 20). For comparison, two breast cancer cell lines, BT549 (lanes 21-25) and T47D (lanes 26-30) were included. The cells are lysed and 10,000 cells (
Lanes 2, 6, 7, 11, 12, 17, 21, 22, 26 and 27), 1,00
0 cells (lanes 3, 8, 13, 18, 23 and 28), 100 cells (lanes 4,
9, 14, 19, 24 and 29), 10 cells (lanes 5, 10, 15, 20, 2)
TRAP assays were performed using extracts corresponding to 5 and 30). Telomerase activity was determined by adding RNase A prior to telomerase assay.
Nase sensitivity was shown ("-" does not include RNase A; "+"
"Includes RNase A). Lanes labeled "mix" (lanes 1 and 16) were 10,000 in order to rule out the presence of inhibitor in apparently negative lysate.
Assays containing lysates from 10,000 indicator cells mixed with lysates from positive cells (expressing c-myc).

【図４】 ＩＭＲ９０線維芽細胞におけるテロメラーゼのｍｙｃアクチベーター。継代１
４のＩＭＲ９０細胞に、空のベクター（レーン１〜５）、ｃ−ｍｙｃ（レーン６
〜１０）及びＥ６（レーン１１〜１５）ウイルスを感染させた。比較のために、
ＨＴ１０８０細胞（レーン１５〜２０）を含めた。ＴＲＡＰアッセイは、１０，
０００細胞（レーン２、６、７、１２、１６及び１７）、１，０００細胞（レー
ン３、８、１３及び１８）、１００細胞（レーン４、９、１４及び１９）又は１
０細胞（レーン５、１０、１５及び２０）を含んでいた。テロメラーゼ活性は、
延長反応前にＲＮアーゼＡを添加することにより、ＲＮアーゼ感受性になること
が示された（「−」はＲＮアーゼＡを含まない；「＋」はＲＮアーゼＡを含む）
。「ミックス」レーン（１及び１１）は、１０，０００個の正（ｃ−ｍｙｃ発現
）細胞由来の溶解物と混合した１０，０００個の指示細胞由来の溶解物を含むア
ッセイである。FIG. 4. Myc activator of telomerase in IMR90 fibroblasts. Passage 1
4 IMR90 cells, empty vector (lanes 1-5), c-myc (lane 6)
-10) and E6 (lanes 11-15) virus. For comparison,
HT1080 cells (lanes 15-20) were included. The TRAP assay was 10,
000 cells (lanes 2, 6, 7, 12, 16 and 17), 1,000 cells (lanes 3, 8, 13, and 18), 100 cells (lanes 4, 9, 14, and 19) or 1
0 cells (lanes 5, 10, 15, and 20). Telomerase activity is
Addition of RNase A prior to the elongation reaction was shown to be RNase sensitive ("-" does not include RNase A; "+" indicates RNase A).
. "Mix" lanes (1 and 11) are assays containing lysates from 10,000 indicator cells mixed with lysates from 10,000 positive (c-myc expressing) cells.

【図５】 Ｅ６はＨＭＥＣ中のｃ−ｍｙｃタンパク質レベルを増大させる。Ａ．ポリクロ
ーナルｍｙｃ抗体を用いたウエスタンブロット法によりｍｙｃタンパク質のレベ
ルを測定した。Ｅ６（レーン１）及びベクター（レーン２）由来の細胞溶解物を
感染させたＩＭＲ９０細胞と、ｃ−ｍｙｃ（レーン３）及びＥ６（レーン４）及
びベクター（レーン５）由来の溶解物を感染させたＨＭＥＣ細胞を分析した。比
較のために、腫瘍細胞系、ＨＴ１０８０（レーン６）、ＨＢＬ１００（レーン７
）、ＢＴ５４９（レーン８）及びＴ４７Ｄ（レーン９）を含めた。負荷を規格化
するためにＴＦＩＩＢの発現を用いた。Ｂ．Ａで用いたタンパク質抽出物と平行
して調製した全ＲＮＡを用いてノーザンブロット法を実施し、ｍｙｃ ｍＲＮＡ
レベルを測定した。示されているように、等量の全ＲＮＡをヒトｃ−ｍｙｃ ｃ
ＤＮＡでプローブした。FIG. 5. E6 increases c-myc protein levels in HMEC. A. The level of myc protein was measured by Western blotting using a polyclonal myc antibody. IMR90 cells infected with cell lysates from E6 (lane 1) and vector (lane 2) were infected with lysates from c-myc (lane 3) and E6 (lane 4) and vector (lane 5). HMEC cells were analyzed. For comparison, the tumor cell lines, HT1080 (lane 6), HBL100 (lane 7)
), BT549 (lane 8) and T47D (lane 9). TFIIB expression was used to normalize loading. B. Northern blot was performed using total RNA prepared in parallel with the protein extract used in A, and myc mRNA
The level was measured. As shown, equal amounts of total RNA were converted to human c-myc c
Probed with DNA.

【図６】 テロメラーゼ活性化によるテロメア長及び細胞寿命の延長。Ａ．正常ＨＭＥＣ
及びｍｙｃレトロウイルスを感染させたＨＭＥＣから全ＲＮＡを調製した。ｈＥ
ＳＴ２ ｃＤＮＡ由来のプローブを用いて等量のＲＮＡ（１０μｇ）中でｈＥＳ
Ｔ２転写物を視覚化した。Ｂ．ＨＭＥＣ及びＩＭＲ９０細胞に、空のベクター（
レーン１〜５及び１１〜１５）又はｈＥＳＴ２（レーン６〜１０及び１６〜２０
）ウイルスを感染させた。１０，０００細胞（レーン２、６、７、１２、１６及
び１７）、１，０００細胞（レーン３、８、１３及び１８）、１００細胞（レー
ン４、９、１４及び１９）又は１０細胞（レーン５、１０、１５及び２０）に相
当する溶解物を用いてＴＲＡＰアッセイを実施した。テロメラーゼ活性は、アッ
セイ前にＲＮアーゼＡを添加することにより、ＲＮアーゼ感受性になることが示
された（「−」はＲＮアーゼＡを含まない；「＋」はＲＮアーゼＡを含む）。明
らかに負の溶解物中の阻害剤の存在を除外するために、「ミックス」標識を付し
たレーン（レーン１及び１６）は、１０，０００個の正（ＨＴ１０８０）細胞由
来の溶解物と混合した１０，０００個の指示細胞由来の溶解物を含むアッセイで
ある。Ｃ．初期継代ＨＭＥＣ（継代１２、レーン１）、後期継代ＨＭＥＣ（継代
２２、レーン２）、ＨＭＥＣ／ｈＥＳＴ２（継代１２でｈＥＳＴ２に感染させ、
その後さらに１０継代培養した細胞、レーン３）及びＨＭＥＣ／ベクター（継代
１２で空のベクターに感染させ、その後、さらに１０継代培養した細胞、レーン
４）由来のゲノムＤＮＡをＲｓａＩ及びＨｉｎｆＩで消化した。０．８％アガロ
ースゲル上で断片を分離し、プローブとして³²Ｐ−標識したヒトテロメア配列（
ＴＴＡＧＧＧ）₃を用いてテロメア制限断片を視覚化した。Ｄ．継代１２で、Ｈ
ＭＥＣ細胞に、空のベクター、ｃ−ｍｙｃ又はｈＥＳＴ２レトロウイスル（指示
されたもの）を形質導入した。これらの細胞を１００ｃｍ²当たり４〜５×１０⁵ 細胞の密度で連続して１週間に１回継代培養した。形質導入してから１２継代後
に、ベクターを感染させた細胞はこの頻度ではもはや継代培養できなくなり、古
典老化表現型として選んだ。これに反し、ｍｙｃ及びｈＥＳＴ２を発現する細胞
は、増殖し続け、集団中に老化細胞が実質的に存在しないことを示した。FIG. 6: Telomere activation increases telomere length and cell life. A. Normal HMEC
And myc retrovirus infected HMECs to prepare total RNA. hE
HES in an equal amount of RNA (10 μg) using a probe derived from ST2 cDNA
T2 transcripts were visualized. B. An empty vector (HMEC and IMR90 cells)
Lanes 1-5 and 11-15) or hEST2 (lanes 6-10 and 16-20)
) Infected virus. 10,000 cells (lanes 2, 6, 7, 12, 16 and 17), 1,000 cells (lanes 3, 8, 13 and 18), 100 cells (lanes 4, 9, 14, and 19) or 10 cells (lanes 4, 9, 14, and 19) TRAP assays were performed using lysates corresponding to lanes 5, 10, 15 and 20). Telomerase activity was shown to be RNase sensitive by adding RNase A prior to the assay ("-" does not include RNase A; "+" indicates RNase A). Lanes labeled "mix" (lanes 1 and 16) were mixed with lysate from 10,000 positive (HT1080) cells, to rule out the presence of inhibitor in apparently negative lysates. This is an assay containing lysates from 10,000 indicator cells. C. Early passage HMEC (passage 12, lane 1), late passage HMEC (passage 22, lane 2), HMEC / hEST2 (infected hEST2 at passage 12,
The genomic DNA from the further 10 passaged cells, lane 3) and the HMEC / vector (cells infected with the empty vector at passage 12, then further 10 passaged, lane 4) were digested with RsaI and HinfI. Digested. The fragments were separated on a 0.8% agarose gel and probed with ³² P-labeled human telomere sequence (
The telomere restriction fragments were visualized using (TTAGGG) ₃ . D. At passage 12, H
MEC cells were transduced with empty vector, c-myc or hEST2 retrovirus (as indicated). These cells were continuously subcultured once a week at a density of 4-5 × 10 ⁵ cells per 100 cm ² . Twelve passages after transduction, cells infected with the vector could no longer be subcultured at this frequency and were selected as the classical senescent phenotype. In contrast, cells expressing myc and hEST2 continued to proliferate, indicating that there was substantially no senescent cells in the population.

【図７】 ｈＥＳＴ２コード配列を含めたＭａｒｘＩＩベクターを示す。長い末端反復配
列（ＬＴＲ）は、図示されてはいないが、ＭａｒｘＩＩ−ｈＥＳＴ２ベクターが
組み込まれている細胞を処理するとｈＥＳＴ２コード配列を含めたプローブベク
ターが切断されるようにリコンビナーゼ部位を含んでいる。FIG. 7 shows a MarxII vector containing the hEST2 coding sequence. Although not shown, the long terminal repeat (LTR) contains a recombinase site so that when a cell into which the MarxII-hEST2 vector has been integrated is treated, the probe vector containing the hEST2 coding sequence is cleaved.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 43/00 １０５ Ａ６１Ｐ 43/00 １１１ １１１ Ａ６１Ｋ 37/24 // Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA80 CA04 CA06 DA03 EA02 GA11 HA17 4C083 AA071 CC02 EE12 EE13 4C084 AA02 AA06 AA13 AA17 BA03 CA17 CA18 CA25 DB01 NA14 ZA51 ZA81 ZB21 ZC02 4C087 AA01 AA03 BB63 CA04 NA14 ZB21 ZC02 ──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. ⁷ Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) A61P 43/00 105 A61P 43/00 111 111 A61K 37/24 // C12N 15/09 ZNA C12N 15/00 ZNAA (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ , CF, CG, CI, CM, GA, GN, GW, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH, GM, KE, LS, MW, SD, SL, SZ, TZ, UG) , ZW), EA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AE, AL, AM, AT, AU, AZ, BA BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CR, CU, CZ, DE, DK, DM, EE, ES, FI, GB, GD, GE, GH, GM, HR, HU, ID, IL , IN, IS, JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MA, MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, SL, TJ, TM, TR, TT, TZ, UA, UG, US, UZ, VN, YU, ZA, ZWF terms (reference 4B024 AA01 BA80 CA04 CA06 DA03 EA02 GA11 HA17 4C083 AA071 CC02 EE12 EE13 4C084 AA02 AA06 AA13 AA17 BA03 CA17 CA18 CA25 DB01 NA14 ZA51 ZA81 ZB21 ZC02 4C087 AA01 AA03 BB21 CA04 NA14 Z14

Claims (48)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 細胞の増殖能力を増大させる方法であって、細胞内のテロメ
ラーゼを可逆的に活性化する第１の作用因、及び、Ｒｂ／ＩＮＫ４経路又はｐ５
３経路の双方又はいずれかを可逆的に不活性化する第２の作用因を細胞に接触さ
せることを含む方法。1. A method for increasing the proliferation ability of a cell, comprising a first agent that reversibly activates telomerase in the cell, and an Rb / INK4 pathway or p5
A method comprising contacting a cell with a second agent that reversibly inactivates both or any of the three pathways. 【請求項２】 細胞の増殖能力を増大させる方法であって、細胞内のテロメ
ラーゼを可逆的に活性化する第１の作用因、及び、ｒａｓ経路を可逆的に不活性
化する第２の作用因を細胞に接触させることを含む方法。2. A method for increasing the proliferative capacity of a cell, comprising a first agent for reversibly activating telomerase in a cell and a second agent for reversibly inactivating a ras pathway. A method comprising contacting a factor with a cell. 【請求項３】 細胞の増殖能力を増大させる方法であって、Ｒｂ依存性の細
胞の老化を減少させる作用因を細胞に接触させることを含む方法。3. A method of increasing the proliferative capacity of a cell, comprising contacting the cell with an agent that reduces Rb-dependent cellular senescence. 【請求項４】 細胞の増殖能力を増大させる方法であって、ｒａｓ依存性の
細胞の老化を減少させる作用因を細胞に接触させることを含む方法。4. A method of increasing the proliferative capacity of a cell, comprising contacting the cell with an agent that reduces ras-dependent cellular senescence. 【請求項５】 当該の第２の作用因が下記のグループから選択されるポリペ
プチドである請求項１記載の方法。 ＭＤＭ２、又はその断片。 ｃｄｋ４又はｃｄｋ６の優性ネガティブの変異体、例えば、ＩＮＫ蛋白、とり
わけｐ１６ＩＮＫ４ａと結合する能力及び／又はそれにより阻害される能力を失
ったもの。 Ｒｂの優性ネガティブの変異体、例えば、Ｃポケット断片。 パピローマウイルスＥ７蛋白又はその他のウイルス由来オンコプロテインでＲ
ｂ及び／又はｐ５３を迂回するもの、又はその断片。 サイクリン、望ましくはＧ１相において活性のあるサイクリン、例えばサイク
リンＤ１又はサイクリンＥ。 及び 転写リプレッサー、又は優性ネガティブの変異体の転写アクチベーターであっ
て、Ｒｂ、ＩＮＫ４蛋白、又はその他のＲｂ抗増殖活性のポジティブな調節因子
、例えばＢｍｉ−１遺伝子産物など、の発現を阻害するもの。5. The method of claim 1, wherein said second agent is a polypeptide selected from the following group: MDM2, or a fragment thereof. Dominant negative mutants of cdk4 or cdk6, for example those that have lost the ability to bind to and / or be inhibited by INK proteins, especially p16INK4a. Dominant negative variants of Rb, eg, C pocket fragment. Papillomavirus E7 protein or other virus-derived oncoprotein
Those that bypass b and / or p53, or fragments thereof. A cyclin, preferably a cyclin active in the G1 phase, such as cyclin D1 or cyclin E. And a transcriptional activator of a transcriptional repressor or dominant negative mutant, which inhibits the expression of Rb, INK4 protein, or other positive regulators of Rb antiproliferative activity, such as the Bmi-1 gene product. thing. 【請求項６】 当該のポリペプチドが、Ｒｂ／ｐ１６経路の可逆的な不活性
化をもたらすべく、条件に応じ活性を示す形で与えられる請求項５記載の方法。6. The method of claim 5, wherein said polypeptide is provided in a conditionally active manner to effect a reversible inactivation of the Rb / p16 pathway. 【請求項７】 当該の第２の作用因が、ｐ１６又はRｂの発現を阻害するア
ンチセンス分子である請求項１記載の方法。7. The method according to claim 1, wherein the second agent is an antisense molecule that inhibits expression of p16 or Rb. 【請求項８】 当該の第２の作用因が、たとえばＲｂの脱リン酸化を阻害、
又は、少なくともリン酸化の不充分なＲｂ（ｐ１１５／ｈｙｐｏ）の生成を阻害
する低分子の有機分子などのような、Ｒｂ又はｐ１６機能の低分子性阻害体であ
る請求項１記載の方法。8. The method according to claim 1, wherein the second agent inhibits Rb dephosphorylation,
Or the method according to claim 1, which is a low molecular weight inhibitor of Rb or p16 function, such as a low molecular weight organic molecule which inhibits the production of at least insufficiently phosphorylated Rb (p115 / hypo). 【請求項９】 ｒａｓ依存性の複製的老化を阻害する作用因を細胞に接触さ
せることをさらに含む請求項１記載の方法。9. The method of claim 1, further comprising contacting the cell with an agent that inhibits ras-dependent replicative senescence. 【請求項１０】 作用因がｒａｓ／Ｒａｆ／ＭＫＫ／ＭＡＰキナーゼ経路の
阻害体である請求項９記載の方法。10. The method according to claim 9, wherein the agent is an inhibitor of the ras / Raf / MKK / MAP kinase pathway. 【請求項１１】 作用因がｒａｓのプレニル化の阻害体である請求項９記載
の方法。11. The method of claim 9, wherein the agent is an inhibitor of ras prenylation. 【請求項１２】 作用因が、優性ネガティブのｒａｓ変異体、ｒａｓ発現の
アンチセンス阻害体又は他のｒａｓの遺伝的サプレッサー因子、Ｒａｐ１蛋白又
はその断片である請求項９記載の方法。12. The method according to claim 9, wherein the agent is a dominant negative ras mutant, an antisense inhibitor of ras expression or another ras genetic suppressor factor, Rap1 protein or a fragment thereof. 【請求項１３】 第１の作用因が下記のグループから選択される請求項１記
載の方法。 （ｉ）ＥＳＴ２ポリペプチド又は他のテロメラーゼアクチベーター蛋白をエンコ
ードする発現反応構成体、（ii）内在ＥＳＴ２遺伝子の発現を増加又は活性化さ
せる作用因、（iii）細胞から細胞へ取り込めるように考案されたテロメラーゼ
アクチベーターポリペプチド、（iv）内在性のＥＳＴ２蛋白又はｍｙｃ蛋白の不
活性化を阻害する作用因、及び（ｖ）ｍｙｃを脱リプレスする作用因。13. The method according to claim 1, wherein the first agent is selected from the following group: (I) an expression reaction construct that encodes an EST2 polypeptide or other telomerase activator protein; (ii) an agent that increases or activates expression of an endogenous EST2 gene; (iii) is designed to be taken up from cell to cell. Telomerase activator polypeptide, (iv) an agent that inhibits inactivation of endogenous EST2 protein or myc protein, and (v) an agent that derepresses myc. 【請求項１４】 当該ＥＳＴ２ポリペプチドがＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２と同
一又は同種であるか、又は当該ＥＳＴ２ポリペプチドが、厳密に規定された諸条
件下でＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１と相補的に結合する核酸によってエンコードされ
る請求項１３記載の方法。14. The EST2 polypeptide according to SEQ ID No. 2 or the EST2 polypeptide is SEQ ID No. 2 under strictly defined conditions. 14. The method of claim 13, wherein the method is encoded by a nucleic acid that binds complementarily to 1. 【請求項１５】 第１の作用因がテロメラーゼアクチベーターをエンコード
するＲＮＡ分子である請求項１３記載の方法。15. The method according to claim 13, wherein the first agent is an RNA molecule encoding a telomerase activator. 【請求項１６】 第１の作用因が、内在性ＥＳＴ２蛋白又はｍｙｃ蛋白の不
活性化を、当該蛋白の翻訳後修飾を阻害、及び／又は当該蛋白の蛋白分解による
崩壊を阻害する請求項１３記載の方法。16. The method according to claim 13, wherein the first agent inhibits inactivation of endogenous EST2 protein or myc protein, inhibits post-translational modification of the protein, and / or inhibits degradation of the protein by proteolysis. The described method. 【請求項１７】 当該作用因がユビキチン媒介性のｍｙｃ分解を阻害する請
求項１６記載の方法。17. The method of claim 16, wherein said agent inhibits ubiquitin-mediated myc degradation. 【請求項１８】 当該作用因がｍａｄ依存性のｍｙｃ拮抗を抑制する請求項
１３記載の方法。18. The method of claim 13, wherein said agent suppresses mad-dependent myc antagonism. 【請求項１９】 ポリペプチドが細胞内に送達された発現反応構成体によっ
てエンコードされ、当該の発現反応構成体が下記を含むベクターである請求項５
又は１４記載の方法。 （ｉ）真核性の宿主細胞の染色体ＤＮＡへベクターを組み込むための一つ又は多
くの転位因子； （ii）当該ポリペプチドに対するコード配列；及び （iii）切除作用因との接触によりコード配列の発現を不活性化する切除因子類
。19. The polypeptide according to claim 5, wherein the polypeptide is encoded by an expression reaction construct delivered into the cell, wherein the expression reaction construct is a vector comprising:
Or the method of 14. (I) one or more transposable elements for integrating the vector into the chromosomal DNA of a eukaryotic host cell; (ii) a coding sequence for the polypeptide; and (iii) contacting the coding sequence with an excision agent. Excision factors that inactivate expression. 【請求項２０】 ベクターがレトロウイルス性又はレンチウイルス性のベク
ターである請求項１９記載の方法。20. The method according to claim 19, wherein the vector is a retroviral or lentiviral vector. 【請求項２１】 当該切除因子類がリコンビナーゼの認識サイトである請求
項１９又は２０記載の方法。21. The method according to claim 19, wherein the excision factors are recombinase recognition sites. 【請求項２２】 当該のリコンビナーゼ認識サイトが転位因子の内部に存在
し、切除作用因を細胞に接触させると、すべての、又は実質的にすべての、ベク
ターが細胞の染色体から切除される請求項２１記載の方法。22. The recombinase recognition site of interest is located within a transposable element, and exposing the excision agent to the cell removes all or substantially all of the vector from the chromosome of the cell. 21. The method of claim 21. 【請求項２３】 当該細胞が幹細胞又は始原細胞である請求項１〜４のいず
れかに記載の方法。23. The method according to claim 1, wherein the cell is a stem cell or a progenitor cell. 【請求項２４】 請求項１〜４のいずれかに記載の方法で、当該細胞が培養
状態又はエクス・ビボの外植片の状態で作用因と接触するもの。24. The method according to any one of claims 1 to 4, wherein the cells come into contact with an agent in a cultured state or in an ex vivo explant. 【請求項２５】 請求項１〜４のいずれかに記載の方法で、作用因が小さい
有機分子であるもの。25. The method according to claim 1, which is an organic molecule having a small effect. 【請求項２６】 請求項１〜４のいずれかに記載の方法で、当該細胞が幹細
胞又は始原細胞であるもの。26. The method according to claim 1, wherein the cells are stem cells or progenitor cells. 【請求項２７】 当該細胞が神経組織、造血組織、膵組織、及び肝組織の幹
細胞及び始原細胞からなるグループから選択される請求項２６記載の方法。27. The method of claim 26, wherein said cells are selected from the group consisting of stem cells and progenitor cells of neural, hematopoietic, pancreatic, and hepatic tissues. 【請求項２８】 請求項１〜４のいずれかに記載の方法で、当該細胞が上皮
細胞であるもの。28. The method according to claim 1, wherein the cells are epithelial cells. 【請求項２９】 請求項１〜４のいずれかに記載の方法で、当該細胞が間充
織細胞であるもの。29. The method according to any one of claims 1 to 4, wherein the cells are mesenchymal cells. 【請求項３０】 請求項１〜４のいずれかに記載の方法で、当該細胞が軟骨
細胞又は骨細胞であるもの。30. The method according to claim 1, wherein the cells are chondrocytes or osteocytes. 【請求項３１】 請求項１〜３０のいずれかに記載の方法で、当該細胞が培
養状態又はエクス・ビボの外植片の状態で作用因と接触するもの。31. The method according to any one of claims 1 to 30, wherein said cells are in contact with an agent in a cultured state or ex vivo explants. 【請求項３２】 請求項１〜３０のいずれかに記載の方法で、当該細胞がイ
ン・ビボで作用因と接触するもの。32. The method according to any of claims 1 to 30, wherein said cells are contacted with an agent in vivo. 【請求項３３】 作用因が哺乳類に投与される請求項３２記載の方法。33. The method of claim 32, wherein said agent is administered to a mammal. 【請求項３４】 哺乳類がヒトである請求項３３記載の方法。34. The method according to claim 33, wherein the mammal is a human. 【請求項３５】 作用因が薬学的な調製品として適用される請求項３３記載
の方法。35. The method of claim 33, wherein the agent is applied as a pharmaceutical preparation. 【請求項３６】 作用因が化粧用の調製品として適用される請求項３３記載
の方法。36. The method according to claim 33, wherein the agent is applied as a cosmetic preparation. 【請求項３７】 細胞の増殖能力を増大させるために調製された医薬品であ
って、細胞内のテロメラーゼ活性を可逆的に活性化する作用因、及び、Ｒｂ／Ｉ
ＮＫ４経路又はｐ５３経路の一方又は双方を可逆的に不活性化する作用因を含む
医薬品。37. A medicament prepared to increase the proliferation ability of a cell, which agent reversibly activates telomerase activity in the cell, and Rb / I.
A pharmaceutical comprising an agent that reversibly inactivates one or both of the NK4 pathway and the p53 pathway. 【請求項３８】 細胞の増殖能力を増大させるための医薬品の調製方法であ
って、細胞内のテロメラーゼ活性を可逆的に活性化する作用因、及び、Ｒｂ／Ｉ
ＮＫ４経路又はｐ５３経路の一方又は双方を可逆的に不活性化する作用因を混合
する方法を含む方法。38. A method for preparing a medicament for increasing the proliferation ability of a cell, comprising an agent for reversibly activating telomerase activity in a cell, and Rb / I.
A method comprising mixing an agent that reversibly inactivates one or both of the NK4 pathway and the p53 pathway. 【請求項３９】 細胞の増殖能力を増大させるためのキットであって、細胞
内のテロメラーゼ活性を可逆的に活性化する第１の作用因、及び、Ｒｂ／ＩＮＫ
４経路又はｐ５３経路の一方又は双方を可逆的に不活性化する第２の作用因を含
み、さらに、オプションとして、第１及び第２の作用因を患者に投与するための
指示書を含むキット。39. A kit for increasing the proliferation ability of a cell, comprising: a first agent that reversibly activates telomerase activity in a cell; and Rb / INK.
A kit comprising a second agent that reversibly inactivates one or both of the four or p53 pathways, and optionally, instructions for administering the first and second agents to a patient . 【請求項４０】 化粧用の調製品であって、局所投与のための薬学的に認容
できる賦形剤中に配合された有効成分として、局所的に投与したとき皮膚層の細
胞の増殖を促進するのに適当な量の、細胞内のテロメラーゼ活性を可逆的に活性
化する第１の作用因、及び、Ｒｂ／ＩＮＫ４経路又はｐ５３経路の一方又は双方
を可逆的に不活性化する第２の作用因、を含む調製品。40. A cosmetic preparation, wherein the active ingredient in a pharmaceutically acceptable excipient for topical administration, promotes the proliferation of skin layer cells when administered topically. A first agent that reversibly activates telomerase activity in the cell and a second agent that reversibly inactivates one or both of the Rb / INK4 or p53 pathways. Preparation, including agent. 【請求項４１】 連動投与するためのキットであって、（ａ）請求項３７の
調製品、請求項３９のキット、又は請求項４０の化粧用の調製品、及び（ｂ）ト
ロフィックな因子、を含むキット。41. A kit for linked administration, comprising: (a) the preparation of claim 37, the kit of claim 39, or the cosmetic preparation of claim 40, and (b) a tropic factor. A kit comprising: 【請求項４２】 連動投与するためのキットであって、（ａ）請求項３７の
調製品、請求項３９のキット、又は請求項４０の化粧用の調製品、及び（ｂ）ト
ロピックな因子、を含むキット。42. A kit for linked administration, comprising: (a) the preparation of claim 37, the kit of claim 39, or the cosmetic preparation of claim 40, and (b) a tropic factor; Kit containing. 【請求項４３】 連動投与するためのキットであって、（ａ）請求項３７の
調製品、請求項３９のキット、又は請求項４０の化粧用の調製品、及び（ｂ）細
胞***促進性の作用因、を含むキット。43. A kit for co-administration, wherein (a) the preparation of claim 37, the kit of claim 39, or the cosmetic preparation of claim 40, and (b) mitogenicity. A kit comprising: 【請求項４４】 請求項４３のキットであって、細胞***促進性の作用因が
、レクチン類、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤ
ＧＦ）、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、又は形質転換性成長因子（ＴＧＦ）で
あるキット。44. The kit of claim 43, wherein the mitogenic agents are lectins, insulin-like growth factor (IGF), platelet-derived growth factor (PD).
A kit that is GF), fibroblast growth factor (FGF), or transforming growth factor (TGF). 【請求項４５】 請求項１の方法であって、当該の第１作用因を、キャッピ
ングによるＥＳＴ２救出系の阻害を緩和する第２の作用因と共同投与する方法。45. The method of claim 1, wherein said first agent is co-administered with a second agent that reduces inhibition of the EST2 rescue system by capping. 【請求項４６】 エクス・ビボの療法であって、 （ｉ）患者に移植さるべき細胞集団を細胞培養として単離する （ii）当該細胞に、請求項３７の調製品、請求項３９のキット、又は請求項４０
の化粧用の調製品、を、当該細胞が培養時に耐忍できる有糸***の回数を増加さ
せるに充分な量で接触させる：そして （iii）細胞を患者に移植する ことを含む療法。46. An ex vivo therapy comprising: (i) isolating a cell population to be transplanted into a patient as a cell culture; (ii) preparing the cell according to claim 37, the kit according to claim 39; Or claim 40
Contacting the cosmetic preparation of the present invention in an amount sufficient to increase the number of mitosis the cells can tolerate in culture: and (iii) transplanting the cells into a patient. 【請求項４７】 請求項４６の方法であって、第１及び／又は第２の作用因
が、患者に細胞を移植する以前に細胞から除去されるか又は不活性化される方法
。47. The method of claim 46, wherein the first and / or second agent is removed or inactivated from the cells prior to transplanting the cells into a patient. 【請求項４８】 哺乳類をクローニングする方法であって、 （ｉ）ドナー用核の源泉として用いるのを所望する哺乳類の分化した細胞を取得
し、複製的老化を妨げるべく、テロメラーゼの触媒活性を可逆的に活性化し、Ｒ
ｂ／ｐ１６経路群を可逆的に不活性化する条件下でドナー細胞を培養して保持す
る （ii）所望の分化細胞又は細胞核を、ＮＴ単位の形成に適合した条件下で除核し
た卵母細胞に移植する （iii）その結果形成されたＮＴ単位を活性化する （iv）上記の活性化された核移植単位を、２細胞期発生段階を過ぎるまで培養す
る。そして （ｖ）上記の培養されたＮＴ単位を、当該ＮＴ単位が胎にまで発達するように宿
主の哺乳類に移植する ことを含む方法。48. A method of cloning a mammal, comprising: (i) obtaining a differentiated cell of the mammal that is desired to be used as a source of donor nucleus and reversing the catalytic activity of telomerase to prevent replicative senescence. Activated, R
Culture and maintain donor cells under conditions that reversibly inactivate the b / p16 pathways (ii) Oocytes from which the desired differentiated cells or cell nuclei have been enucleated under conditions compatible with the formation of NT units (Iii) Activate the resulting NT unit (iv) Incubate the activated nuclear transfer unit as described above until after the two-cell stage of development. And (v) transplanting the cultured NT unit into a host mammal such that the NT unit develops into a fetus.