JP2003517483A

JP2003517483A - 血中ヘリコバクターピロリ菌抗原

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Publication number: JP2003517483A
Application number: JP2001545852A
Authority: JP
Inventors: イー，チン，スー，エー; ハン，チュン・ホー
Original assignee: パニオンアンドビーエフラボラトリーエルティーディー
Priority date: 1999-12-14
Filing date: 2000-12-14
Publication date: 2003-05-27
Also published as: DE60016275T2; DE60016275D1; US7270982B2; TWI237695B; US20050009108A1; EP1238279A1; WO2001044815A1; EP1238279B1; ATE283482T1; US6794153B2; AU2261001A; US20020090660A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、感染者の血液中のヘリコバクターピロリ菌（H. pylori）抗原の発見及び検出に関するものである。ピロリ菌抗原は、ピロリ菌細胞の構成要素であり、それにはＤＮＡ、ＲＮＡおよびヌクレオチド、タンパクまたはペプチドのフラグメントなどがあるがこれらに限定されるものではない。ピロリ菌ＤＮＡ、ＲＮＡおよびヌクレオチドのフラグメントは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、ＤＮＡハイブリッド形成法またはその他の増幅法によって検出可能である。ピロリ菌タンパクまたはペプチド、あるいはその他の抗原性成分は、抗ピロリ菌抗体、好ましくはアフィニティーカラムにより精製された抗体を使用した免疫測定法または免疫ブロット法により検出可能である。本発明は、さらに免疫測定法、診断キット、および血清サンプル中のピロリ菌抗原の検出用イムノクロマトグラフィー分析装置を提供するものである。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】

本発明は、全血、血漿および血清を含む血液中におけるヘリコバクターピロリ
菌（H. pylori）抗原、ならびにその抗原性フラグメントの発見に関するもので
ある。血液中に見いだされるピロリ菌抗原には、ピロリ菌ＤＮＡ、ＲＮＡまたは
それらのフラグメント、あるいは、ピロリ菌タンパク／ペプチドまたはその他の
抗原性成分があるが、これらに限定されるものではない。ピロリ菌ＤＮＡまたは
そのフラグメントは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（Ｌ
ＣＲ）、ＤＮＡハイブリッド形成、分岐型ＤＮＡシグナル増幅法、またはその他
のシグナル増幅法によって検出される。ピロリ菌ＲＮＡはＰＣＲ、ハイブリッド
形成、またはその他のシグナル増幅法によって検出される。ピロリ菌タンパク、
ピロリ菌ペプチドまたはその他の抗原性成分は、ピロリ菌に対するアフィニティ
ー精製抗体を用いて免疫測定法（immunoassay）、免疫ブロット法(immunoblotti
ng)によって検出される。本発明はまた、血液中のピロリ菌抗原の検出によるピ
ロリ菌感染の診断にも関する。

【０００２】

【従来の技術】

ヘリコバクターピロリ（H. pylori）は、胃粘膜に感染し、ほとんどの消化性
潰瘍疾患（ＰＵＤ）の原因となるグラム陰性菌である。最近まで、潰瘍およびそ
の他の消化不良症状は、ストレスレベルまたは食習慣に関係があると考えられて
いた。最近になって、医学界では、ピロリ菌が潰瘍や胃癌などのある種の胃痛の
原因物質であることが確認された。ピロリ菌の根絶は、潰瘍の治癒を促進し、癌
やＰＵＤの発生率を著しく減少させる。

【０００３】ピロリ菌は消化性潰瘍疾患（ＰＵＤ）だけでなく多くの胃潰瘍、十二指腸潰瘍
の原因となる。ピロリ菌とＰＵＤの関係は、１９８４年に初めて、オーストラリ
ア人の医師WarrenとMarshallによって発見、発表された（Lancet I: 1311-1344
）。ピロリ菌感染は、現在、胃炎の最も一般的な原因と考えられており、胃潰瘍
、十二指腸潰瘍、胃腺癌、一次性Ｂ細胞リンパ腫と因果関係がある。

【０００４】ＰＵＤの治癒はかなり容易であることが証明されている。ほとんどのＰＵＤの
原因は、ピロリ菌による感染である。しかしながら、ピロリ菌感染は日常的には
診断されていない。それは、おそらくピロリ菌感染の検査方法（すなわち侵襲性
生体検査）が医師、特に初期治療を行う医師にとって満足できるものではないた
めである。そのため、初期治療を行う医師は、感染兆候がある患者を抗分泌剤で
治療する傾向がある。

【０００５】医師は、患者をいつ治療すべきか、いつ胃腸科専門医に見せるべきかを知るた
めに、ピロリ菌感染に対する単純で正確、かつ安価な診断方法を必要としている
。しかしながら、現在行うことのできるピロリ菌検査は、侵襲性検査および非侵
襲性検査に分類されるもので、完全に満足のいくものではない。侵襲性検査には、内視鏡の使用に続いて生体検査が必要である。生体検査によ
って得られる組織標本を、その後、培養検査、組織学的検査、または急速ウレア
ーゼ試験により分析することが可能である。

【０００６】生体標本の培養により、ピロリ菌検査で最も信頼できる結果が得られるが、成
功率は優秀な研究所でも７０〜８０％との報告がある（Han, S.W., et al., Eur
. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. （1995）, 14:349-352）。特殊な着色生
体標本の組織検査により、急性または慢性炎症粘膜細胞および障害の直接の証拠
が得られる。しかしながら、それには、内視鏡検査技師と病理学者の協力が必要
である（Genta, R.M., et al., Hum. Pathol. （1994）, 25:221-226）。急速ウ
レアーゼ試験では、尿素をアンモニアと二酸化炭素に分割するピロリ菌ウレアー
ゼにより生成したアンモニアから、ｐＨ値の上昇を検出する。しかしながら、そ
れには高密度の細菌と、偽陰性を生じるかもしれない細菌の負荷を減少させるも
のが必要である（Cutler, A.F., Am. J. Med. （1996）, 100:35S-39S）。

【０００７】多くの非侵襲性検査が、１９９０年以来、ピロリ菌感染を検出するために開発
されてきた。例えば、尿素呼気試験は、^１３Ｃまたは^１４Ｃでラベルした尿素を
非放射性^１３ＣＯ_２または放射性^１４ＣＯ_２に分割する、生物のウレアーゼ活性
に基づいている。尿素呼気試験は、治療から４週間後にピロリ菌根絶の確認する
のに広く推奨されている。

【０００８】米国特許第５，７１６，７９１号、第５，８７１，９４２号および第５，９３
２，４３０号には、ピロリ菌細胞（すなわちＡＴＣＣ菌株４３５０４）の感作動
物から得たポリクローナル抗体を使用して、糞便検体中のピロリ菌抗原を検出す
るための免疫測定法が開示されている。抗体は、ＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチ
ルセルロース）カラムによって精製される。糞便抗原試験は、満足できるもので
あると報告されてはいるが、糞便検体の採取および処理過程は困難で気分が悪い
。多くの患者は、悪臭と、簡便な便採取器がないことが理由で、便のサンプルを
医師に提供するのを嫌がる。

【０００９】ＥＬＩＳＡを使用した血清ピロリ菌抗体の血清反応も、広く使用されている試
験方法である。最近の技術例は、米国特許第５，２６２，１５６号およびヨーロ
ッパ特許第０３２９５７０号に見られる。ピロリ菌抗体の検出における免疫測定
法において、確認及び使用されたいくつかの主要な抗原があった。しかしながら
、これらの試験方法では、血清学的診断において望まれる特異性や感受性が示さ
れなかった（Newell, D.G., et al., Serodian. immunother. Infec. Dis., （1
989）, 3:1-6）。問題の一つは交差反応に由来する。それは、ピロリ菌の優性抗
原（例：分子量６０Ｄａを有する推定べん毛タンパク質）がピロリ菌に特異的で
はないからである。このような抗原のいくつかは、C. jeuniやC. coliなど、他
の細菌にも見られる。ピロリ菌の免疫測定法の設計における第二の問題は、菌株
の変異である。異なるピロリ菌株において、抗原の実質的な差異が認められてい
る。これらの問題は、単一抗原の使用に関連する試験法の設計の妨げとなる。ピ
ロリ菌の抗体免疫測定法の特異性及び選択性を改善するために行われた試みの一
つは、異なるピロリ菌株から得た抗原を混合して、特定の抗原フラグメントで強
化された混合物を使用することである。血清中のピロリ菌抗体を検出するＥＬＩ
ＳＡは、商業上利用可能である。本方法は、細菌の全細胞溶解物を抗原として使
用する。

【００１０】血清中のピロリ菌抗体の存在を検出するために、抗原を用いたＥＬＩＳＡを採
用した際の不利な点は他にもある。特に、ヒトの血清中の抗体価は、感染症の治
療後長時間にわたって高いままである。従って、このＥＬＩＳＡを用いた陽性検
査は、必ずしも、患者が現在も感染しており、ピロリ菌感染の治療が必要である
ことを意味しない。ＥＬＩＳＡで陽性の結果がでると、治療をする医師はしばし
ば細菌の存在を確認するため、抗生物質療法を行う前に胃の生体検査を行う。ゆ
えに、抗原に基づくＥＬＩＳＡは、侵襲的操作の必要性を除去するものではない
。

【００１１】従って、本発明の目的は、ピロリ菌感染の非侵襲的で高精度な診断方法を設計
することである。検査の過程において、血液中にピロリ菌抗原が見出されるが、
それはＤＮＡまたはそのフラグメント、あるいはタンパク／ペプチドまたはその
他の抗原性成分の形で、全血、血漿、血清などの血液中に存在する。このような
ピロリ菌抗原を検出するための特別な方法は、ピロリ菌の抗原性フラグメントが
血液中に存在するという証拠を提供するよう設計される。これらの方法には、ピ
ロリ菌および／またはピロリ菌株由来のＤＮＡプローブに特異的なプライマーあ
るいはオリゴヌクレオチドを用いて、ピロリ菌の核酸フラグメントを検出するポ
リメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、ＤＮＡハイブ
リッド形成などがあるが、これらに限定されるものではない。また、ピロリ菌に
対するアフィニティー精製抗体を用いて、ピロリ菌タンパク／ペプチドまたは抗
原性成分を検出する免疫測定法および免疫ブロット法も開発されている。

【００１２】現時点では、血液中のピロリ菌抗原の存在に関する報告はなされていない。本
発明は、ピロリ菌抗原が血液中に存在するだけでなく、以下に記載の方法により
検出可能であることを初めて証明するものになるだろう。

【００１３】

【発明の要約】

本発明は、患者の血液中に存在し、且つポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、
リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、ＤＮＡハイブリッド形成、ＲＮＡハイブリッド
形成、分岐型ＤＮＡ試験法、免疫ブロット法ならびに免疫測定により検出可能な
ピロリ菌抗原を提供する。本発明はまた、血液中のピロリ菌抗原を検出すること
によるピロリ菌感染の診断方法を提供する。

【００１４】本発明で使用される「抗原」という言葉は、適当な状況下で特異的免疫反応を
引き起こし、その反応生成物、すなわち特異的抗体、特異的に感作されたＴ−リ
ンパ球、あるいはその両方と反応する可能性が直接的または間接的にある、あら
ゆる物質を広く対象としたものである。これらの物質の例をあげると、タンパク／ペプチド、多糖類、脂質およびポリ
ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドなどがあるが、これらに限定されるもの
ではない。

【００１５】血液中に検出されるピロリ菌抗原には、二種類の特殊なものがある。一つは、
ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドに関連するもので、これらはピロリ
菌からの染色体ＤＮＡ、ＲＮＡまたはそのフラグメントである。この種のピロリ
菌は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、ハイブ
リッド形成法（好ましくはスポットＤＮＡハイブリッド形成）またはその他の増
幅法によって検出できる。

【００１６】本発明のＰＣＲ法は、ピロリ菌の検出に特異的な一対のプライマーを使用する
必要がある。ここで使用される「プライマー」という言葉は、天然又は合成のオ
リゴヌクレオチドであって、核酸鎖に対し相補的なプライマー産物の合成が起こ
る状況下に置かれたとき、すなわち適温で適当な酵素と４種の異なるヌクレオチ
ド三リン酸が存在する条件下で、核酸合成の開始点として機能することができる
オリゴヌクレオチドのことをいう。ここで使用される「オリゴヌクレオチド」と
いう言葉は、二つ以上、好ましくは三つ以上のデオキシリボヌクレオチドおよび
／またはリボヌクレオチドからなる分子と定義される。その正確な大きさは、多
くの要因、オリゴヌクレオチドの根本的な機能または使用性に依存する。オリゴ
ヌクレオチドは合成品でもクローニングによるものでもよい。

【００１７】プライマーは、ＡＴＣＣ菌株４３５０４、４３５７１、４３６２９、４９０５
３などのピロリ菌株の共通フラグメントに見られる保存配列に基づいて作成され
る。好ましいプライマーの範囲は、１５〜２５塩基配列（ｂｐｓ）で、最も好ま
しくは長さ約２０ｂｐｓである。両プライマー（前方向プライマーと逆方向プラ
イマー）が同じ長さで、おおよそ同じヌクレオチド組成を持つ場合、よりよい増
幅が得られる。ＰＣＲ用の好ましい血液サンプルは血漿である。

【００１８】本発明のＬＣＲ法には、ＤＮＡリガーゼおよびピロリ菌に特異的な二組のオリ
ゴヌクレオチドの使用が必要である。好ましいＤＮＡリガーゼは、ＰｆｕＤＮ
Ａリガーゼであるが、それはPyrococcus furiosusから分離した熱安定性ＤＮＡ
リガーゼであり、商業上利用可能である。ＬＣＲ用の二組のオリゴヌクレオチド
は、ＰＣＲ用のプライマーより長いほうが好ましい。ＰＣＲプライマーと同様、
ＬＣＲオリゴヌクレオチドは、ＡＴＣＣ菌株４３５０４、４３５７１、４３６２
９、４９０５３などのピロリ菌株の共通フラグメントの保存配列に由来する。

【００１９】ＬＣＲは、標的配列を含むＤＮＡテンプレートを熱変性し、二つの隣接したオ
リゴヌクレオチドプローブからなる一組を独特の方法で標的ＤＮＡ配列にアニー
リングし、相補的なオリゴヌクレオチドプローブのもう一組を標的ＤＮＡ配列に
対向する配列にハイブリッド形成する、というサイクルを繰り返すことによって
行われる。ここで使用される「標的配列」という言葉は、血液サンプルに見られ
る「染色体ＤＮＡまたはそのフラグメント」のことをいう。その後、ＤＮＡリガ
ーゼは与えられた隣接プローブの各対を共有結合で結合することができ、２つの
隣接プローブの接点は完全に相補的である。

【００２０】ハイブリッド形成法は、ピロリ菌のＤＮＡプローブの作成を必要とする。ピロ
リ菌ＤＮＡプローブは、アガロースゲル電気泳動後、ピロリ菌核酸抽出物からＤ
ＮＡフラグメントを切り離し、抽出することにより作成される。プローブは、通
常少なくとも約２５の塩基、たいていの場合は少なくとも約３０の塩基を有して
おり、約１０，０００以上の場合もあるが、普通は５，０００以下である。この
ＤＮＡフラグメントは、その後、制限エンドヌクレアーゼで消化され、真核また
は原核宿主細胞に移入することができる組み替えプラスミド構造形成のためにベ
クターと結合される。ＤＮＡフラグメントは、宿主細胞内で増殖し、再分離する
ことができる。増殖したＤＮＡフラグメントは、その後、放射性同位元素（^３２Ｐ、^３Ｈ、^１４Ｃなど）または蛍光（蛍光検出法と合わせたジゴキシゲニンおよ
びビオチンラベル付きＤＮＡプローブの使用など）によってラベルされ、ＤＮＡ
プローブとして用いることができる。

【００２１】ハイブリッド形成法は、血液、好ましくは血清からの核酸サンプルを、ニトロ
セルロース膜などの固相担体上で、ＤＮＡを変性させる変性剤で処理することに
よって行われる。好ましい変性剤には、アルカリ溶液、高温度、有機試薬（例：
アルコール、アミド、アミン、尿素、フェノール、スルホキシド）、またはある
種の無機イオン（例：チオシアン酸塩、過塩素酸塩）があるが、これらに限定さ
れるものではない。ラベルされたＤＮＡプローブは、その後、変性ＤＮＡがスポ
ットされた膜に添加される。その後、ラベルの性質を帯びたＤＮＡハイブリッド
の存在について膜を分析する。ラベルが放射性である場合、膜はＸ線フィルムに
露光することができる。ラベルが蛍光の場合は、蛍光顕微鏡を使用して膜を直接
見ることができる。

【００２２】２つめの抗原は、血液中のピロリ菌タンパクおよび／またはペプチド、あるい
は抗原エピトープを含むあらゆる物質に関連し、これらは免疫ブロット法または
免疫測定法（ピロリ菌抗原に対するアフィニティー精製抗体を使用するのが好ま
しい）により検出できる。一次および二次抗体ともに、検出方法の種類に応じて
、血液中のピロリ菌抗原を検出または測定するために要してよい。一次抗体は抗
原（本発明ではピロリ菌抗原）に対して出現する抗体である。二次抗体は、一次
抗体産生種の免疫グロブリン（ヤギの抗ウサギＩｇＧなど）に対する抗体である
。検出に好適な血液サンプルは血清である。

【００２３】免疫ブロット法は、まずＳＤＳ−ＰＡＧＥで血液サンプルを分析することから
はじまる。電気泳動後、タンパク／ペプチドバンドを、ニトロセルロース膜へ移
し、その後膜を充分な量の抗ピロリ菌抗体で培養する。抗ピロリ菌を産生する動
物種の免疫グロブリンに対する酵素複合二次抗体を、ニトロセルロース膜に添加
することができる。この方法に好適な酵素の一つはアルカリフォスファターゼで
あり、その反応は５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルフォスフェート（5-
bromo-4-chloro-3-indolylphosphate）を加えることにより検出可能である。こ
の方法で用いられる別の好ましい酵素マーカーは、ホースラディッシュペルオキ
シダーゼであるが、この場合は、４−クロロ−１−ナフトール、テトラメチルベ
ンジジンまたは３，３’−ジアミノベンジジンを加えて目に見えるよう着色不溶
性物質を生成させることで検出可能である。

【００２４】免疫測定法には、ベーシック・サンドウィッチ法、トリプル・サンドウィッチ
法およびイムノクロマトグラフィー法等があるが、これらに限定されるものでは
ない。ベーシック・サンドウィッチ法では、一次抗体が２つ必要であり、一つは固形
担体に固定され、もう一つは検出剤によりラベルされる。トリプル・サンドウィ
ッチ法では、ピロリ菌に対する２つの一次抗体（すなわち第一抗体と第二抗体）
とともに一つの二次抗体の使用が必要である。このとき一次抗体のうち一つだけ
が固形担体に固定される。二次抗体は、非固定一次抗体を産生する動物種のＩｇ
Ｇに対する二次抗体であり、抗体−抗原−抗体複合体に対する複合体を形成する
。二次抗体は、検出剤によりラベルされる。

【００２５】サンドウィッチ法の固形担体には、プラスチック・ビーズ、ポリエチレン、ポ
リスチレン、ポリプロピレンなどがある。検出剤は、酵素マーカー（アルカリフ
ォスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ等）、蛍光剤または発光
剤（フルオレセイン、ローダミン、ユーロピウム、ルミノール、アクリジウム(a
cridium）等)、放射性同位元素ラベル（Ｉ^１２５等）、着色粒子（金、銀、青色
ラテックス、セレン等）であることが可能である。

【００２６】ベーシックおよびトリプル・サンドウィッチ免疫測定法では、ピロリ菌に対す
る第一の一次抗体の相互作用により抗原−抗体複合体を形成し、次いでこの抗原
−抗体複合体がピロリ菌に対する第二抗体に接触することが必要である。

【００２７】イムノクロマトグラフィー法でも、ピロリ菌に対する２つの一次抗体の併用が
必要である。ベーシックおよびトリプル・サンドウィッチ法とは異なり、第一抗
体（すなわち最初に生物学的試料に接触する抗体）は着色粒子によりラベルされ
る。第二抗体は、ニトロセルロース（またはニトロセルロース誘導体）膜、ナイ
ロン膜、ポリエステル膜、ろ紙、アガロースまたはセファデックスゲルなどの固
形担体に固定される。イムノクロマトグラフィー法の好適な固形担体は、ニトロ
セルロース膜である。さらに、第一抗体を産生する動物種に対する二次抗体を、
サンプル添加側とは反対のクロマトグラフィーストリップ（chromatographic st
rip）の末端近くで固形担体に添加および／または固定してもよい。この二次抗
体は、クロマトグラフィーの流れの末端で非固定着色粒子を捕捉するためのコン
トロールとして使用される。従って、サンプルがピロリ菌抗原を含んでいない場
合は、抗体−抗原−抗体複合体が形成されないため、第一抗体にラベルされた着
色粒子は結合せずに第二抗体を通り抜ける。しかしながら、二次抗体は第一抗体
産生動物のＩｇＧに対するので、第一抗体がサンプルとともに複合体を形成する
か否かにかかわらず、第一抗体が通過するときに二次抗体が第一抗体に結合する
。第一抗体と二次抗体との結合は、イムノクロマトグラフィーの流れの終わりを
表す。

【００２８】血清サンプルの処理における問題の一つは、ピロリ菌感染患者が血清内に患者
自身のピロリ菌抗体を保有していることがよくあることである。これらの血清ピ
ロリ菌抗体は、血清ピロリ菌抗原と免疫複合体を形成することができ、本発明の
免疫測定法の精度に影響を及ぼすことがある。ピロリ菌免疫複合体を解離する方
法には、解離試薬の使用またはサンプル解離条件で複合体の解離を行う方法があ
るが、これらに限定されるものではない。

【００２９】解離試薬の例をあげると、高塩分（例：少なくもと１ＭのＮａＣｌまたはＫＣ
ｌ）、界面活性剤（例：少なくとも１％のＳＤＳ、Ｔｗｅｅｎ２０、オクチルグ
ルコシド、デオキシコレート、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）、カオトロピック剤
（例：グアニジンＨＣｌ、尿素、ＫＳＣＮ）、有機溶媒（例：ジオキサンまたは
エチレングリコール）、酵素（例：プロテアーゼ（トリプシン、キモトリプシン
、ペプシン、Ｖ８プロテアーゼ、ズブチリシンなど）、リパーゼ（牛乳から得ら
れるリポタンパク質リパーゼ、Candida Rugosaから得られるリパーゼなど）があ
るが、これらに限定されるものではない。サンプル解離条件の例をあげると、高
ｐＨ（例えばｐＨ≧９）または低ｐＨ（例えばｐＨ≦３）、および／または高温
（５０℃以上）があるが、これらに限定されるものではない。

【００３０】さらに、解離処理をした血清サンプルは、交差反応を最小限にするためにタン
パク質ベースの試薬で処理することができる。好適なタンパク質ベースの試薬に
は、タンパク質、ウシノ胎仔血清、ブタ血清、正常ヤギ血清、ウマ血清、カゼイ
ン、アルブミン、ゼラチン、ウシ血清アルブミンのうち少なくとも一つのタンパ
ク質が含まれる。

【００３１】

【発明の実施の形態】

ピロリ菌感染患者において、定量的および定性的測定の試みが数多く報告され
てきたが、血液サンプル中のピロリ菌の検査に直結するものはない。その主たる
理由は、ピロリ菌抗原が血流内にあると仮定する研究者がいなかったからである
。しかしながら、後述の実施例９（表１）および実施例１１（表２および３）に
記載の表（表１〜３）において、ピロリ菌感染患者の血清サンプル中にピロリ菌
抗原が存在し、それが見出し得るという証拠が示されている。

【００３２】このような知見に基づき、本発明は、ピロリ菌感染の診断手段として、血液中
の検出可能なピロリ菌抗原を利用することを目的とする。本診断方法は、異種の
ピロリ菌抗原を検出するのに用いることが可能であり、ポリメラーゼ連鎖反応（
ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、分岐ＤＮＡ増幅法、ハイブリッド形成
法、免疫ブロット法、免疫沈降、フローサイトメトリー、免疫電気泳動法、免疫
測定法（例：酵素結合イムノソルベント検定法［ＥＬＩＳＡ］）、放射線免疫検
定法[ＲＩＡ]、イムノクロマトグラフィー）があるが、これらに限定されるもの
ではない。

【００３３】ＰＣＲは特定のＤＮＡ配列を非常に効率よく増幅する技術である。変性、プラ
イマーのアニーリング、ポリメラーゼ（例えば、耐熱性酵素Ｔａｑポリメラーゼ
）による伸張というサイクルの繰り返しにより、所望のＤＮＡ配列の濃度が急激
に上昇する。各ＤＮＡ配列は、アガロースゲル電気泳動により分離し、核酸の配
列決定を行うことができる。ＰＣＲに好適な血液サンプルは、血漿である。それ
は、溶血反応が起こった場合、赤血球に含まれるヘモグロビンからのヘム分子が
ＰＣＲ増幅と相互作用するかもしれないからである。

【００３４】リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）は、痕跡レベルの既知核酸配列の検出のために使
用することができるＤＮＡ増幅技術である。ＬＣＲは、（１）二本鎖の標的ＤＮ
Ａをほどいて一本鎖にする高温融解段階と（２）二組の隣接した相補的オリゴヌ
クレオチドを一本鎖の標的分子にアニーリングし、ＤＮＡリガーゼで連結させる
冷却段階の２段階の周期的反応を含む。１サイクルから得られる結合産物は、次
のサイクルの連結反応のテンプレートの役目を果たす。ＬＣＲの結果、ＰＣＲ反
応におけるテンプレートの急激な増幅のように、連結産物の急激な増幅をもたら
す。

【００３５】ＰＣＲもＬＣＲも、核酸連鎖反応をおこさせるために、ピロリ菌特異的プライ
マーまたはオリゴヌクレオチドの発見が必要である。ピロリ菌株は遺伝子レベル
で非常に多種多様であり（Fujimoto et al., J. Clin. Microbiol., （1994）,
32:331-334）、一つ以上の菌株が感染することがあるため、さまざまなピロリ菌
株にみられる共通フラグメントの保存配列に基づいて、プライマーまたはオリゴ
ヌクレオチドを設計するのがよい。

【００３６】ＡＴＣＣ菌株４３５０４のピロリ菌細胞は、糞便サンプル内の抗ピロリ菌に対
する一次抗体を作成するのに特に有用であることが認められている（米国特許第
５，７１６，７９１号参照）。それは、菌株４３５０４の細胞を用いた感作で生
成する抗体が、地域や食事に関係なく生物を検出することができるからである。
ＡＴＣＣ４３５７１、４３６２９、４９０５３などの他のピロリ菌株も、同様の
抗原性を有する。従って、これらの菌株間の共通フラグメントを見つけることは
価値がある。これは、上記のピロリ菌株から抽出した核酸を同じ制限エンドヌク
レアーゼで消化し、その後消化されたピロリ菌核酸フラグメントをアガロースゲ
ル電気泳動にかけることにより行うことができる。共通フラグメントは切り離し
、抽出することができる。共通フラグメントのヌクレオチド配列は分析可能であ
る。共通フラグメントの保存配列は、ＰＣＲまたはＬＣＲのためのプライマーま
たはオリゴヌクレオチドの設計に使用することができる。

【００３７】ＰＣＲまたはＬＣＲの他に、核酸ハイブリッド形成プローブを使用して、血液
サンプル中のピロリ菌抗原の存在を検出してもよい。好適な核酸ハイブリッド形
成プローブは、約５，０００塩基以下である。プローブ配列は、ピロリ菌株間の
共通フラグメントのヌクレオチド配列に対し、少なくとも実質的に相補的である
ことが好適である。プローブは、さまざまなピロリ菌株にみられる共通フラグメ
ントの他に、メッセンジャーＲＮＡから、あるいは逆転写酵素を使用したメッセ
ンジャーＲＮＡの逆転写またはゲノムの開裂によって得られるｃＤＮＡから得て
もよい。所望のプローブの分離および特性づけの後、宿主細胞内でプローブのＤ
ＮＡフラグメントのクローンを作って増殖させてよい。増殖したプローブは、最
も一般的には放射性核種を使用して、原子または無機ラジカルによりラベルされ
るが、重金属または蛍光を使用して行われることもある。ピロリ菌抗原の一本鎖
ＤＮＡにハイブリッド形成したプローブと特異的に結合する抗体を使用すること
も可能である。この場合、抗体は、検出可能となるようラベルされる。プローブ
に使用されるのと同じタイプのラベルを、公知の技術に従って抗体に結合してよ
い。

【００３８】 ^３２Ｐ、^３Ｈ、^１４Ｃなどの放射性ラベルは、プローブのラベルに使用される
が、十分な半減期を有する適当なシグナルを与える限りは、他の放射性ラベルも
使用することができる。他のラベルとして、ラベルされた抗体蛍光剤に特異的な
結合子として機能できる配位子、化学発光剤、酵素、ラベルされた配位子に特異
的な結合子として機能できる抗体などが挙げられる。免疫測定法で使用されるさ
まざまなラベルも使用できる。ラベルの選択は、ハイブリッド形成率およびプロ
ーブのサンプルＤＮＡへの結合に対するラベルの影響により決定される。ラベル
には、ハイブリッド形成に利用できるＤＮＡ量を検出するために、充分な感度が
必要である。他の検討材料としては、プローブ合成の容易さ、容易に使用可能な
計測器、自動化可能性、利便性などがある。

【００３９】ラベルをプローブに結合する方法は、ラベルの性質により変わる。放射性ラベ
ルには、幅広くさまざまな技術を採用することができる。一般的に採用されてい
るのは、α−^３２Ｐ−ｄＮＴＰを用いたニックトランスレーション法、または、
アルカリフォスファターゼを用いた端末リン酸加水分解後、γ−^３２Ｐ−ＮＴＰ
およびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを使用して放射性^３２Ｐでラベルする方法
である。あるいは、一つ以上の要素が放射性同位元素で交換された、例えば、水
素が三重水素で交換されたヌクレオチドを合成することも可能である。

【００４０】ラベルとして重要な酵素には、加水分解酵素、特にエステラーゼおよびグリコ
シダーゼ、またはオキシドレダクターゼ、特にペルオキシターゼなどがある。蛍
光化合物には、フルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体
、ダンシル、ウンベリフェロンなどがある。化学発光剤には、ルシフェリン、お
よび、例えばルミノールなどの２，３−ジヒドロフタラジンジオンなどがある。

【００４１】ハイブリッド形成は、通常、水不溶性の多孔質支持体に付着したＤＮＡサンプ
ルに対してプローブを使用することにより行われる。ＤＮＡサンプルは変性され
て、一本鎖核酸が付着する。溶解には、化学溶解が便利で、それは通常希アルカ
リ水溶液（例えば０．１〜１ＭＮａＯＨ）である。アルカリはまた、ＤＮＡを
変性する役目も果たす。その他の変性剤としては、高温度、アルコール、アミド
、アミン、ウレアーゼ、フェノール、スルホキシドなどの有機試薬、またはチオ
シアン酸塩、過塩素酸塩などのある種の無機イオンがあるが、これらに限定され
るものではない。

【００４２】血中ピロリ菌抗原は、ピロリ菌に対するアフィニティー精製抗体を使用し、免
疫ブロット法および免疫測定法（例えばベーシック・サンドウィッチ免疫測定、
トリプル・サンドウィッチ免疫測定、イムノクロマトグラフィー）などの免疫学
的方法によって検出することもできる。好適な血液サンプルは血清である。

【００４３】免疫ブロット法では、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で血液サンプルを分離
し、次いで分離したそれぞれのタンパク／ペプチドバンドをニトロセルロース膜
に移すことが必要である。分離したそれぞれのタンパク／ペプチドバンドは、ピ
ロリ菌に対する一次抗体との相互作用により抗原−抗体複合体を形成する。次に
、検出剤によりラベルされた、一次抗体に対する二次抗体を加えると、検出反応
を示す。

【００４４】ベーシックおよびトリプル・サンドウィッチ免疫測定法では、ピロリ菌抗原に
対する第一抗体、ピロリ菌抗原に対する第二抗体および試験サンプル（すなわち
血清サンプル）の少なくとも３つの要素が必要である。第一および第二抗体（すなわちピロリ菌抗原に対する抗体）は、ポリクローナ
ル抗体であることが好適である。この抗体は、ウサギまたは、ヤギ、牛など他の
哺乳動物にピロリ菌細胞、好ましくは超音波処理によって破壊されている細胞、
を注射することにより得られ、複合抗原部位を呈する。

【００４５】一般的に、抗体は、最初の注射に引き続き、追加免疫注射を行って反応を最大
化することにより生成される。抗体を生成するために、抗原はフロインドアジュ
バント（Freund adjuvant）などの動物に免疫を与えるアジュバントと結合して
、免疫反応を増幅させる。注射される抗原の量は、検出に十分な量の抗体を誘導
するのに十分な量でなければならない。複合的な注射は、抗体産生を最大限に活
用できるよう一定の間隔で行うことができる。注射スケジュールは、使用する動
物により異なる。動物は放血し、まず試験放血(test bleeds)により抗体産生を
測定する。抗体産生は、試用放血（trial bleed）および酵素免疫測定（ＥＩＡ
）を用いて確認される。抗体はクロマトグラフィー、好ましくはアフィニティー
カラムクロマトグラフィーにより精製される。

【００４６】ベーシック・サンドウィッチ法においては、第一抗体が固形担体に固定されて
いる場合、第二抗体は検出剤でラベルされなければならないが、検出剤は既知の
免疫学的分析で使用されているラベルであればよい。例えば、酵素マーカー（ア
ルカリフォスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼなど）、蛍光性
、発光性あるいは放射性ラベル（フルオレセイン、ローダミン、ユーロピウム、
ルミノール、アクリジウム、放射性同位元素Ｉ^１２５など）、またはコロイド粒
子（金、セレンなど）は、免疫測定法で使用できるラベルである。これらのラベ
ルの中で最も一般的なものの一つは、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（Ｈ
ＲＰ）またはアルカリフォスファターゼなどの酵素マーカーである。特に、ＨＲ
Ｐラベルは、ＨＲＰをジアミノベンジジン、テトラメチルベンジジン、４−クロ
ロ−１−ナフトールと反応させるか、またはその他の化学反応により比色分析法
で検出することができる。比色反応産物を、プレートリーダー、スキャナ、デン
シトメータで検出するか、あるいは目視で観察することができる。ピロリ菌の量
を、サンプル測定値を既知量の抗原を含む標品と比較して決定することができる
。試験サンプルのラベル濃度をひとまとめに取り扱う（blacket）ために、いく
つかの標品を使用することが好ましい。^１２５Ｉヨウ素などの放射性同位元素、
または^１４Ｃ炭素などのβ−エミッタも、一般に使用されているラベルであり、
ガンマカウンタまたはシンチレーションカウンタによって検出することができる
。蛍光ラベルも、蛍光分析による検出のためのラベル抗体に使用することが可能
である。

【００４７】固形担体は、免疫測定法に使用されることが知られている固形支持体であれば
何れも使用できる。固形担体は、ＥＬＩＳＡ用多穴プレートなどの支持体である
ことも可能であり、これはプレートリーダーで読み取ればよい。あるいは、固形
担体は、液体または移動相中で可溶性のサンプルをクロマトグラフィー分析する
ことが可能なものでもよい。このような支持体の例としては、ニトロセルロース
のような膜またはカラムクロマトグラフィーの媒質などが挙げられる。以下、血液中のピロリ菌抗原の検出の説明のためにの実施例をあげるが、これ
らに限定されるものではない。

【００４８】実施例１ピロリ菌抗原および核酸の作成ＡＴＣＣ菌株４３５０４、４３５７１、４３６２９および４９０５３のピロリ
菌種株を、それぞれ室温で解凍し、５ｍｌのブルセラ培養液で希釈した。希釈後
すぐに、希釈細菌懸濁液０．２ｍｌをトリプチカーゼ大豆血液寒天培地プレート
上に塗布し、５％ヒツジ血を添加した。細菌が生育するように、微好気条件下で
プレートを培養した。培養後、コロニーをプレートから切除し、ＰＢＳで二回洗
浄した。その後、洗浄したペレットをＰＢＳに懸濁した。

【００４９】各ピロリ菌株から抗原を集めるために、氷冷した容器にピロリ菌細胞を移し、
１０分間Microson XL200超音波細胞破砕器で超音波処理した。超音波処理した細
菌懸濁液を、２〜８℃で３０分間、２５，０００ｘｇで遠心分離機した。ピロリ
菌抗体産生用免疫源（immunogen）として使用するため、上清はとっておいた。

【００５０】各ピロリ菌株から核酸を収集するために、１％ＳＤＳを含む１００ｍＭトリス
塩酸（ｐＨ８．８）を用いてピロリ菌細胞を溶解することができる。溶解物を同
量のフェノール／クロロホルムで一回抽出した後、同量のフェノール／クロロホ
ルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１）で二回抽出することができる。
クロロホルム−フェノール抽出後、染色体ＤＮＡを０．６倍量のイソプロパノー
ルを用い室温で沈降させることができる。１３，０００ｘｇで１５分間遠心分離
を行った後、核酸ペレットを７０％エタノールで洗浄し、１０ｍＭトリス塩酸お
よび１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８．０に溶解することができる。

【００５１】実施例２ＰＣＲ増幅を用いた血液中のピロリ菌ＤＮＡの検出ピロリ菌株から得られたＤＮＡを、制限エンドヌクレアーゼで消化することが
できる。最適な制限エンドヌクレアーゼとしては、HindIII、EcoRI、BamHI、Cla
IおよびXbaIがあげられるが、これらに限定されるものではない。得られたフラ
グメントは、トリス−酢酸塩−ＥＤＴＡ緩衝液中、アガロースゲル電気泳動にか
けることができる。Boehringer Mannheim社（ドイツ）から購入したアガロース
ゲル抽出キットを用いて、ＤＮＡフラグメントをアガロースゲルから抽出するこ
とができる。ピロリ菌株は、遺伝子レベルで非常に多種多様であるため、共通フ
ラグメントを見つけるために、各ピロリ菌株から得たＤＮＡフラグメントを比較
するのは有益である。

【００５２】共通フラグメントのＤＮＡ配列は、二本鎖ＤＮＡテンプレートおよびSangerら
（Proc. Natol. Acad. Sci. USA（71:1342-1346, 1977））のジデオキシ法（did
eoxy chain termination procedure）を用いて、両ストランドにおいて決定する
ことができる。共通フラグメントの保存配列に基づき、製造メーカーのプロトコ
ルに従ってＤＮＡシンセサイザを用いて、オリゴヌクレオチドプライマーを合成
することができる。ＰＣＲ用のプライマーは通常長さ約２０ｂｐであり、好適な
範囲は１５〜２０ｂｐである。両プライマーが同じ長さで、かつおおよそ同じヌ
クレオチド組成である場合、よりよい増幅が得られる。増幅があるということが
、ピロリ菌に特異的なヌクレオチド配列があるということを示すので、抗原に特
異的な核酸とのみハイブリッド形成するＰＣＲプライマーが好ましい。

【００５３】抗原性フラグメントをエンコードするＤＮＡは、熟練技術者が標本核酸を得る
手順に従い、常法および通常の実験量により得ることができる。ＰＣＲ増幅は、テンプレートとしての血漿ＤＮＡ抽出物、ピロリ菌抗原プライ
マー、Dynazyme緩衝液（Finnzymes社、フィンランド，エスポーから購入可）、
全四種のデオキシヌクレオチドの混合物、およびDynazymeを含む反応混合物中で
行うことができる。抽出物をMicrocon 100フィルターに通す追加工程を最後に行
うこと以外は、ピロリ菌細胞の核酸抽出と同じ方法で血漿ＤＮＡが抽出される。
この最後の工程は、複合多糖類と同様に、ＰＣＲ阻害能力を有することがわかっ
ている非生物学的阻害物質の残留物を除去するための処置であり、これによりＤ
ＮＡ沈降物がエリミネーション（eliminaiton）できる。

【００５４】 Perkin-Elmer ＤＮＡサーマルサイクラー（Norwalk社、米国コネチカット州）
でＰＣＲサイクルを始める前に、反応物を鉱油で覆い、９４℃に１０分間加熱す
ることができる。最初の５サイクルのパラメータは、９４℃で２分間変性、４２
℃で１分間アニーリング、７２℃で１分間伸張とすることができる。この後、次
のようなパラメータ：９４℃で２分間変性、５９℃で１分間アニーリング、７２
℃で１分間伸張、というパラメータで３０サイクルＰＣＲを行うことができる。
最後のサイクルでは、１０分間伸張を行うことができる。ＰＣＲ反応を４℃で停
止し、ＰＣＲ産物をアガロースゲルで分析することができる。ＰＣＲ産物の大き
さを測定し、ピロリ菌株に見られる共通フラグメントと比較することができる。

【００５５】大きさが共通フラグメントと同じ場合は、陽性の結果と考えられる。共通フラ
グメントから増幅され、^３２ＰＣＴＰによりラベルされたＤＮＡプローブでサ
ザンブロットハイブリッド形成を行うことにより、ＰＣＲ産物がピロリ菌の配列
であることを確認することができる。あるいは、ＰＣＲ産物および共通フラグメ
ントをAluI、HinfI、HaeIIIなどの制限酵素で消化し、アガロースゲル電気泳動
により消化物の消化パターンを分析することができる。同一のパターンは、ＰＣ
Ｒ産物がピロリ菌配列から生じることを示している。

【００５６】実施例３ＬＣＲ増幅を用いた血液中のピロリ菌ＤＮＡの検出リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）分析では、２つのオリゴヌクレオチド２組と、Ｄ
ＮＡリガーゼが必要である。一組目のオリゴヌクレオチド（オリゴＡとオリゴＢ
）は互いに連続的であり、標的ＤＮＡ二重螺施の一つの鎖と相補的である。二組
目のオリゴヌクレオチド（オリゴＣおよびオリゴＤ）は第一組に対し相補的であ
り、よって、標的ＤＮＡの２番目の鎖上の隣接部位を占める。全４種のオリゴヌ
クレオチドは、ピロリ菌株の保存配列に従って設計され、Applied Biosystems社
（カリフォルニア州フォスターシティ）のオリゴヌクレオチドシンセサイザで合
成し、ＰＡＧＥで精製することが可能である。オリゴＡとオリゴＤは、５０ｍＭ
トリス塩酸（ｐＨ７．５）、７ｍＭＭｇＣｌ_２、および１ｍＭジチオスレイト
ール中、アデノシン５’（γ−^３２Ｐ）三リン酸とポリヌクレオチドキナーゼ存
在下、３７℃で３０分間培養することにより、その５’末端に放射性ラベルする
ことができる。その後、７０℃で加熱してポリヌクレオチドキナーゼを不活性化
する。放射性ラベルされた同量のオリゴヌクレオチドプローブＡおよびＤと、オ
リゴヌクレオチドプローブＢおよびＣとを、それぞれ血清サンプルから抽出され
たＤＮＡテンプレートと一緒にエッペンドルフ型管に加えることができる。各管
には、ｐＨ６．５の５０ｍＭビス−トリス、１０ｍＭＭｇＣｌ_２、１０ｍＭ
ＮＨ_４Ｃｌ、１０ｍＭＫＣｌ、１ｍＭジチオスレイトール、および１ｍＭＮ
ＡＤからなる反応緩衝液が入っている。次に適量の鉱油で管内を覆い、管を３分
間１００℃に加熱し、次いで８５℃に１分間冷却し、ＤＮＡリガーゼを加えて５
５℃を保つことができる。好適なＤＮＡリガーゼは、Pyrococcus furiosus由来
のＰｆｕＤＮＡリガーゼである。反応管をＤＮＡサーモサイクラー（RoboCycl
er、Stratagene）に設置し、８５〜５０℃で各１分間ずつ、２０回、３０回また
は４０回サイクラーにかけることができる。その後、各反応の一定量を９５％ホ
ルムアミド停止色素と１：１の割合で希釈することができる。希釈したサンプル
はアクリルアミドゲル上で分析することができる。

【００５７】実施例４ピロリ菌ＤＮＡプローブの作成ピロリ菌株から得られるピロリ菌ＤＮＡフラグメント（通常、少なくとも２５
塩基、一般的には少なくとも約３０塩基を有し、約１０，０００以上を有する場
合もあるが、普通は５，０００以下である）は、電気泳動法を行った後切り離し
、アガロースゲルから抽出することができる。このＤＮＡフラグメントを制限エ
ンドヌクレアーゼで消化し、ベクターと結合して組み替えプラスミド構造を形成
することができる。例えば、ＤＮＡフラグメントをＣｌａＩで消化し、ＣｌａＩ
で消化したＰｅｖ−Ｖｒｆ発現ベクターに結合させることができる（Crowl et a
l., Gene （1985）, 38:31-38）。その後、組み替えプラスミドは、E. Coli RRI
などの原核細胞、またはNIH 3T3細胞、HeLa細胞などの真核細胞のような宿主細
胞をトランスフォームすることができる。組み替えプラスミドは宿主細胞内での
複製により増殖することができる。増殖した組み替えプラスミドを、Soらの方法
（Infect, Immun.(1978), 21:405-411）に従って分離することができる。ピロリ
菌からのＤＮＡフラグメントを、同じ制限エンドヌクレアーゼで消化することに
よりプラスミドから遊離させることができる。遊離したピロリ菌ＤＮＡフラグメ
ントを、アガロースゲルまたはポリアクリルアミド電気泳動法によって確認する
ことができる。増殖したＤＮＡフラグメントを、放射性同位元素（^３２Ｐ、^３Ｈ
、^１４Ｃなど）または蛍光（蛍光検出法と合わせてジゴキシゲニン−およびビオ
チン−ラベルＤＮＡプローブを使用するなど）でラベルし、ＤＮＡプローブとし
て使用することができる。

【００５８】実施例５ピロリ菌ＤＮＡプローブを使用したスポットハイブリッド形成の作成ニトロセルロース膜を煮沸殺菌または加圧滅菌することができる。無菌膜を一
つ寒天培地の表面に取り付け、ＤＮＡが遊離(liberate)するように処理された血
清でスポットすることができる。例えば、血清サンプルを希アルカリ水溶液（０
．１〜１ＭＮａＯＨなど）で溶解することができる。アルカリはＤＮＡを変性
する役目も果たすことができる。その他の変性剤としては、高温度、有機試薬（
アルコール、アミド、アミン、尿素、フェノール、スルホキシドなど）、または
ある種の無機イオン（チオシアン酸塩、過塩素酸塩など）があるが、これらに限
定されるものではない。

【００５９】サンプルを変性させた後、一般的にはｐＨ約６〜８、通常ｐＨ７の水性緩衝液
で膜を洗浄することができる。溶解、変性、洗浄の後、膜上にサンプルＤＮＡを
固定するために、高温、一般的には約５０〜７０℃でサンプルＤＮＡをスポット
した膜を乾燥させることができる。

【００６０】膜を完全に濡らすために、やや高温で十分な時間、プローブなしのハイブリッ
ド形成溶液で膜を培養する。さまざまなハイブリッド形成溶液が使用できるが、
例えば、２０〜６０容量％、好ましくは３０容量％の不活性極性有機溶媒が挙げ
られる。通常のハイブリッド形成溶液には、約５０％ホルムアミド、約０．５〜
１Ｍ塩化ナトリウム、約０．０５〜０．１Ｎクエン酸ナトリウム、約０．０５〜
０．２％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、少量のＥＤＴＡ、フィコール（約
３００〜５００ｋｄａｌ）、ポリビニールピロリドン（約２５０〜５００ｋｄａ
ｌ）、血清アルブミンを使用する。また、ハイブリッド形成溶液には、約０．５
〜５ｍｇ／ｍｌの超音波処理変性ＤＮＡ（例えば、仔ウシ胸腺またはサケの***
）を含んでもよく、約０．５〜２ｗｔ／ｖｏｌ％のグリシンも任意に含有される
。また、約１００〜１０００ｋｄａｌの硫酸デキストランおよび約８〜１５ｗｔ
％のハイブリッド形成液などの他の添加剤も含んでよい。ラベルされたＤＮＡプローブの量は、ラベルの性質の他、膜に合理的に結合で
きるかどうかや、ハイブリッド形成のストリンゲンシー(stringency)に依存して
、広く変化する。一般的に、プローブの化学量論以上の実質的な過剰量を使用し
て、固定されたサンプルＤＮＡへのプローブの結合率を高めるべきである。

【００６１】ハイブリッド形成溶液中の塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウムおよびＳＤＳ
と類似した濃度を有する第二の溶液を用いて、室温で膜を洗浄処理した後、二重
螺施の存在を調べるために、ラベルの性質に従って膜を分析してもよい。ラベル
が放射性である場合は、膜を乾燥させＸ線フィルムに露光する。ラベルが蛍光で
ある場合は、蛍光顕微鏡を使用することで直接観察できる。

【００６２】プローブは、ハイブリッド形成を行う配列に対して完全に相補的である必要は
なく、３０％以上の不一致な対があってもよい。ＤＮＡハイブリッドの形成に影
響を与える条件はよく知られており、Crosa et al., J. Bact. (1973), 115(3):
904-911に詳しく記載されている。

【００６３】実施例６ピロリ菌に対するウサギポリクローナル抗体の生成まず、ニュージーランド白色ウサギに、ピロリ菌抗原０．５〜１．０ｍｇを含
む完全フロイントアジュバント（Complete Freund' Adjuvant)を筋肉注射するこ
とにより感作し、４週間ごとに同抗原を１．５〜１．０ｍｇ含む不完全フロイン
トアジュバント（Incomplete Freund' Adjuvant)を注射した。３回目の注射の後
、分析のため試験放血を採った。抗体価が望ましいレベルである約１０^６に達し
たらすぐに、産生放血を開始した。

【００６４】各放血はまずＰＢＳで１×１０^６にそれぞれ希釈した。希釈したウサギの血清
１００μｌをピロリ菌抗原を被覆した穴に加えた。室温で１時間培養した後、プ
レートをＰＢＳで４回洗浄し、ヤギの抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ結合体１００μｌ
を加えた。プレートをさらに３０分間室温で培養した。ＰＢＳで４回洗浄した後
、発色のためにテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質１００μｌを各穴へ加え
、マイクロウェルリーダーを用いて４５０／６５０ｎｍで各穴の色彩強度（colo
r intensity）を測定した。ＯＤ４５０／６５０は、抗体産生における使用に適
するためには、１．０以上でなければならない。

【００６５】実施例７抗体−ＨＲＰ酵素結合体の作成抗ピロリ菌抗体と結合させるために、酵素ホースラディッシュペルオキシダー
ゼ（ＨＲＰ）を選択した。抗体−ＨＲＰ酵素結合体の産生は、修正ナカネ法（Na
kane et al, 1978: In immunoflorescence and related staining techniques,
Knapp, et al., eds., p215-220, Elsivier/North-Holland Biomedical Press,
Amsterdam）によった。

【００６６】簡単に説明すると、最初に、ＨＲＰをｍ−過ヨウ素酸ナトリウムで酸化処理を
した。この酸化により、炭水化物側鎖上にアルデヒド基が生成する。その後、抗
体をこの酸化ＨＲＰとアルカリｐＨで混合し、抗体上のアミノ基とＨＲＰ上のア
ルデヒド基との反応によりシッフ塩基を形成させ、抗体とＨＲＰの共有結合に還
元した。そして、sephacryl-300カラムでゲル濾過して、抗体−ＨＲＰ結合体を
精製した。ＨＲＰは、ピロリ菌に対するウサギの抗体などの一次抗体、またはウサギＩｇ
Ｇ抗体に対するヤギ抗体などの二次抗体に結合することができる。

【００６７】実施例８ゲル電気泳動および免疫ブロット分析血清サンプルはＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析することができる。電気泳動後、ゲル
を固定し、Oakley らの修正銀染色法（Anal. Biochem.,(1980), 105:361-363）
によりタンパク質を分解することができる。

【００６８】あるいは、１ａｍｐで１時間、エレクトロブロッティングを行うことにより、
タンパク質をニトロセルロース紙に移すことができる。空いている結合部位をＴ
ｗｅｅｎ−２０や脱脂乳などのブロッキング剤でブロッキングしたのち、前記実
施例６記載のように十分な量のピロリ菌抗体をニトロセルロース紙に加える。ニ
トロセルロース紙はその後１時間室温で培養することができる。最後に、抗ピロ
リ菌抗体産生動物種の免疫グロブリンに対する二次抗体（ヤギの抗ウサギＩｇＧ
など）のアルカリフォスファターゼ結合体を、ニトロセルロース紙に加える。５
−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルフォスフェート（ＢＣＩＰ）／ニトロブ
ルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）を加えることにより、反応を検出することができ
る。

【００６９】実施例９遊離型血清ヘリコバクターピロリ菌抗原の作成血清ピロリ菌抗原は、遊離型および免疫複合体の両方の形で存在するかもしれ
ない。遊離型のピロリ菌抗原は、免疫測定法あるいは他の抗原検出法により容易
に検出できる。血清中のピロリ菌抗体と免疫複合している抗原は、免疫複合体か
ら解離した後でしか検出することができない。血清ピロリ菌抗原が遊離型、免疫複合体の両方で存在し、遊離型のピロリ菌抗
原は本発明のＥＬＩＳＡにより容易に検出されるが、免疫複合体は同じ方法では
容易に検出できないということは、表１に示されている。

【００７０】表１は、血清ピロリ菌のスパイキング試験（spiking study）の結果である。
どの試験サンプルにもピロリ菌抗原は含まれていない。しかしながら、血清中に
ピロリ菌抗原が存在しないにもかかわらず、血清サンプルにピロリ菌抗体が含ま
れていることがあった（「抗体陽性サンプル」）。これは、おそらくは以前に感
染したことによると思われ、ピロリ菌抗体が含まれていなかった血清サンプル（
すなわち「抗体陰性サンプル」）とは対照的である。スパイキング群においては
、細菌細胞全体中または細胞溶解物中のピロリ菌抗原の既知量（１×１０^５細菌
／ｍｌ）を、「抗体陰性」および「抗体陽性」血清サンプルの両方に添加した。
「非スパイクキング」群においては、ピロリ菌抗原を添加しなかった。

【００７１】表１の結果から、「抗体陰性」サンプルにおいて、ピロリ菌添加によりＯＤ_４ _{５０／６５０} 値が上昇したことがわかる。一方、「抗体陽性」サンプルへのピロ
リ菌抗原の添加によって、「抗体陰性」サンプルと同レベルまでＯＤ_{４５０／６} _５０値が上昇することはなかった。これに対する一つの合理的な説明は、添加し
たピロリ菌抗原が血清ピロリ菌抗体と免疫複合体を形成し、これがＥＬＩＳＡ測
定を阻害したということである。

【００７２】

【表１】血清ピロリ菌抗原のスパイキング試験１×１０^５細菌／ｍｌ非スパイキング試料ＯＤ_{４５０／６５０} ＯＤ_{４５０／６５０} 緩衝液３．８６６０．００７Ａｂ陰性サンプル１３．９７３０．０９６Ａｂ陽性サンプル１０．３３６０．１２０Ａｂ陽性サンプル２０．３９００．０８２

【００７３】血清ピロリ菌抗原の免疫複合体を解離するために、解離試薬を用いるかサンプ
ル解離条件で血清サンプルを処理することができる。免疫複合体の解離に有効な
解離試薬は主に４種類ある。一つ目の解離試薬は、ＮａＣｌまたはＫＣｌの高濃
度塩水溶液である。好適な塩濃度は少なくとも１Ｍである。好適な塩はＫＣｌで
ある。二つ目の解離試薬は、ＳＤＳ、Ｔｗｅｅｎ２０、オクチルグルコシド、デ
オキシコレート、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００などの界面活性剤を含む溶液である
。これらの界面活性剤は単独または組み合わせて使用することができる。界面活
性剤の好適な濃度は１％より高い。三つ目の解離試薬は、グアニジンＨＣｌ、尿
素、チオシアン酸カリウム（ＫＳＣＮ）などのカオトロピック剤を含む溶液であ
る。これらのカオトロピック剤の濃度は、２Ｍより高くなければならない。四つ
目の解離試薬は、１０％ジオキサン、４０％エチレングリコールなどの有機溶媒
を含む溶液である。

【００７４】あるいは、高ｐＨまたは低ｐＨの何れかの条件あるいは高温のサンプル解離条
件で血清サンプルを処理することができる。好適な高ｐＨ値は９以上である。好
適な低ｐＨ値は３以下である。好適な温度は５０℃以上である。さらに、交差反応を最小限に抑えるために、解離処理をおこなった血清サンプ
ルをタンパク質ベースの試薬で処理することができる。好適なタンパク質ベース
の試薬には、以下のタンパク質：ウシ胎仔血清、ブタ血清、正常ヤギ血清、ウマ
血清、カゼイン、アルブミン、ゼラチンおよびウシ血清アルブミンのうち少なく
とも一つを含む。

【００７５】実施例１０ウサギの抗ピロリ菌抗体のアフィニティー精製Ａ．アフィニティーカラムの作成１〜５グラムのピロリ菌細胞ペーストを、オクチルグルコシドを含むＰＢＳ緩
衝液、０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．１５ＭＮａＣｌｐＨ７．２に懸濁し
、室温で３０分間攪拌した。その後、アイスバスの中で、１分ごとに超音波処理
と中断を繰り返して、１０分間最大出力で懸濁液を超音波処理した。超音波処理
後、２５，０００ｇで３０分間遠心分離を行い、不溶性物質を除去した。上清を
とっておき、タンパク質濃度をＰＢＳで１〜３ｍｇ／ｍｌに調整した。プレ平衡
Aminolinkカップリングゲル（Pierce社製）を含むＰＢＳを、充填ゲル１ｍｌあ
たりタンパク質１〜１０ｍｇの割合で上清に加え、次に充填ゲル１ｍｌ当たり５
Ｍシアノ水素化ホウ素ナトリウム水１０〜４０μｌを加えた。反応スラリーを４
℃で一晩（少なくとも６時間）穏やかにかき混ぜながら培養した。培養後、ゲル
スラリーを適当な大きさのクロマトグラフィーカラムに注入し、余分な液体を排
出させた。カラムを、カラム２倍量のカップリング緩衝液、次いでカラム２倍分
の１Ｍトリス塩酸ｐＨ７．４で溶出した。洗浄したゲルをカラムと同量の１Ｍト
リスＨＣｌ緩衝液ｐＨ７．４中に再懸濁した。再懸濁後、５Ｍシアノ水素化ホウ
素ナトリウムを充填ゲル１ｍｌ当たり１０〜４０μｌ加えた。得られた懸濁液を
穏やかに攪拌しながら、１時間室温で培養した。カラムから液体を排出させ、Ｐ
ＢＳで十分にわたって洗浄し、カラム内の非複合抗原を除去した。

【００７６】Ｂ：アフィニティーカラムによる抗体の精製ウサギの抗体を精製するために、同量のウサギ血清に同量の飽和硫酸アンモニ
ウム溶液を徐々に加え、ピロリ菌抗体を沈降させた。室温で３０分間攪拌後、３
０分間遠心分離を行い、沈降物を収集し、ＰＢＳで再溶解後、１００倍以上のＰ
ＢＳで透析を行った。透析後、溶液を０．２μｍの膜で濾過し、アフィニティー
カラム上にのせた。その後、溶離液がベースラインに達するまで、ＰＢＳでカラ
ムを十分に洗浄した。カラム内の抗ピロリ菌特異抗体を３ＭＫＳＣＮ水溶液で
溶出した。免疫グロブリンを含む画分を集めて、過剰なＫＳＣＮを除去するため
に最小限の２つの交換でＰＢＳ透析をおこなった。精製した抗体を約１．０〜２
．０ｍｇ／ｍｌまで濃縮し、−２０℃で保存した。

【００７７】実施例１１血清抗原ＥＬＩＳＡ試験血清を常法により全血から分離した。遊離型血清サンプルを実施例１に従って
集めた。アフィニティー精製抗体を、リン酸緩衝液により２０〜１．０μｇ／ｍ
ｌの間で連続的に希釈した。各希釈溶液０．１ｍｌをCostar EIAストリッププレ
ートに加え、ふたをして室温で一晩培養した。プレートをＰＢＳで一回洗浄し、
１％ＢＳＡを含むＰＢＳで、室温で４時間ブロックした。ＢＳＡ溶液の除去後、
抗体を被覆したマイクロウェルストリッププレートに０．１ｍｌの遊離型血清サ
ンプルを加え、ふたをして室温で２時間培養した。プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅ
ｎで５回洗浄した。その後、ホースラディッシュペルオキシダーゼに接合したウ
サギ抗ピロリ菌を０．１ｍｌ各マイクロウェルに加え、ふたをして室温で１時間
培養した。再びプレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで５回洗浄し、その後室温で１０
分間テトラメチルベンジジン０．１ｍｌで発色させた。発色を４５０ｎｍで測定
した。反応は、１ＮＨ_２ＳＯ_４０．１ｍｌで停止した。最大光学濃度（optica
l density）および最低バックグラウンドが得られた希釈溶液を最適希釈溶液と
して選択した。

【００７８】表２および３は、異なる患者の血清で、異なる時間に行われた２つの実験を示
すものである。これらの実験は、ピロリ菌に対する血清ＥＬＩＳＡ試験結果を表
している。第一実験（表２）の被験者は５人である。第二実験（表３）の被験者
は３人である。結果はＯＤ_{４５０／６５０}で表す。ピロリ菌抗原の存在および量
を４５０ｎｍ波長で測定することができる（６５０ｎｍはバックグラウンド（す
なわちプレート）を検出する波長である）。ＯＤ_{４５０／６５０}は、ＯＤ_６５０の測定値を差し引いたＯＤ_４５０の測定値を示す。ＯＤ_{４５０／６５０}≦０．１
のサンプルは陰性結果（すなわちピロリ菌非感染）を示している。

【００７９】

【表２】血清ＥＬＩＳＡ試験（実験１）ＯＤ_{４５０／６５０} 結果陽性サンプル＃１０．７１２陽性陽性サンプル＃２０．４８７陽性陽性サンプル＃３０．１８７陽性陰性サンプル＃４０．０７６陰性陰性サンプル＃５０．０４８陰性

【００８０】

【表３】血清ＥＬＩＳＡ試験（実験２）ＯＤ_{４５０／６５０} 結果陽性サンプル＃６０．３１１陽性陽性サンプル＃７３．８４６陽性陰性サンプル＃８０．０８３陰性緩衝液０．０９７陰性

【００８１】実施例１２免疫測定法におけるアフィニティー精製およびＤＥＡＥ精製ピロリ菌抗体の比較試験表４は、ＥＬＩＳＡにおいて、アフィニティーカラム精製ピロリ菌抗体および
ＤＥＡＥカラム精製ピロリ菌を使用したときの比較試験を表すものである。アフィニティーカラムによるピロリ菌抗体の精製は、前記実施例５に記載され
ている。ＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチルセルロース）カラムについて、以下に
説明する。

【００８２】ＤＥＡＥカラムは０．０１７５Ｍのリン酸カリウム（ｐＨ６．５）で室温で平
衡にした。ピロリ菌抗体を含む上清をカラムにかけ、流出画分を集めた。タンパ
ク質濃度（ＯＤ_２８０）を調べ、０．２００より高い全ての画分を集めた。

【００８３】アフィニティー精製抗体およびＤＥＡＥ精製抗体を、リン酸緩衝液で２０〜０
．２ｕｇ／ｍｌの間で連続的に希釈した。各希釈溶液０．１ｍｌをCostar EIAス
トリッププレートへ加えて、ふたをして室温で一晩培養した。プレートをＰＢＳ
で一回洗浄し、１％ＢＳＡを含むＰＢＳで室温で４時間遮断した。いくつかの陽
性および陰性試料を、サンプル希釈剤（ＰＢＳ：ＢＳＡ）で１：５に希釈した。
各サンプル（０．１ｍｌ）を、ＤＥＡＥ抗体で被覆したストリップ穴またはアフ
ィニティー精製抗体で被覆したストリップ穴（コントロールの役割をする）に加
え、予め許容されたＤＥＡＥおよび／またはアフィニティー精製ウサギ抗ピロリ
菌−ホースラディッシュ酵素結合体０．１ｍｌと同時に培養した（表４参照）。
室温で６０分間培養した後、固定されていないサンプルおよび酵素ラベル抗体を
除去するために、サンプルを完全に洗浄した。テトラメチルベンジジン基質を加
えて、室温で１０分間培養した。発色を１Ｎ硫酸０．１ｍｌで停止し、各サンプ
ルの反応度を決定するために穴をＯＤ_{４５０／６５０}ｎｍで分光光度的に読み取
った。

【００８４】

【表４】ＤＥＡＥおよびアフィニティー精製抗体の比較試験１試験２試験３試験４プレートアフィニティーアフィニティーＤＥＡＥＤＥＡＥ複合体アフィニティーＤＥＡＥＤＥＡＥＤＥＡＥ（強度１／２）陰性コントロール０．００９０．２２３０．２１２０．０８５陽性コントロール１．３２０１．３６６１．１１１０．８７９陽性サンプル１２．３６４２．８１３１．２５９０．７６６陰性サンプル２０．０１３０．１５４０．１１４０．０４９陰性サンプル３０．０２４０．３２３０．２４５０．１１２陽性サンプル４０．３５４０．３９８０．１５８０．０８４

【００８５】表４から、アフィニティー精製抗体およびアフィニティー精製複合体では、低
いバックグラウンド測定値および高い（高感受性の）陽性サンプル測定値の点か
ら、最高の結果が得られたことがわかる。アフィニティー精製抗体を標準試料と
して、プレートと複合体の両方で使用した（試験１）。その他の試験を標準試料
と比較した。標準試料と比較すると、ＤＥＡＥプレートおよびＤＥＡＥ複合体は
、バックグラウンドの上昇（すなわち陰性サンプルに対する高いＯＤ）により偽
陽性結果を示し、陽性サンプルのＯＤは低下した（試験３）。ＤＥＡＥプレート
をアフィニティープレートに変えると、陽性シグナルは出るが、高バックグラウ
ンドはそのままで、偽陽性結果を与えた（試験２）。ＤＥＡＥ複合体濃度をもと
の５０％に低下させることにより、バックグラウンドは低下したが、陽性シグナ
ルもまた低下し、偽陰性結果を示した（試験４）。

【００８６】実施例１３イムノクロマトグラフィー分析イムノクロマトグラフィー分析装置には、「サンプル添加ウインドウ」および
「結果確認ウインドウ」の２つのウインドウを持つ外側のプラスチックカセット
がある。「サンプル添加ウインドウ」には移動相が添加されるが、「ラベルパッ
ド（label pad）」、またはイムノゴールド(immuno-gold)などの検出剤でラベル
した第二抗体を入れる貯蔵槽も備えている。パッドはサンプル添加スポットと「
結果確認ウインドウ」の下端の間に設置した。「結果確認ウインドウ」は固定相
の上にあり、結果確認ウインドウは、第一一次抗体でスポットしたテストライン
、および第二一次抗体に対する抗体でスポットしたコントロールラインを含んで
いた。テストラインはサンプル添加ウインドウとコントロールラインの間であっ
た。

【００８７】試験を行うために、４〜６滴の血清をカセットのサンプルエリアに加えた。サ
ンプルは、赤色イムノゴールドまたはその他のラベルに結合した精製ピロリ菌抗
体を含むラベルパッドを通って流れた。サンプルは、ラベルされた抗体を含んで
、テストストリップを進み、最初にテストラインを、次にコントロールラインを
通過した。サンプルにピロリ菌抗原が含まれている場合は、抗体は赤色イムノゴ
ールドに結合した抗原に結合し、ニトロセルロース膜に線状にスポット（固定）
されたピロリ菌抗体に結合する。ピロリ菌抗体−抗原−抗体複合体が捕捉される
と、赤色テストラインを結果ウインドウから目視観測できる（膜抗体：抗原：抗
体赤色イムノゴールド）。コントロールラインはヤギの抗ウサギ抗体をスポット
した。サンプルが流れ出したときに、ピロリ菌イムノゴールド抗体をヤギの抗ウ
サギラインで捕捉され、処理が正しく行われたことが確認された（モノクローナ
ル抗体を着色粒子との結合に使用した場合、コントロールラインはヤギの抗マウ
スでスポットされるべきである。）

【００８８】サンプル液は、追加の移動相を含んでもよく、サンプル液は下部から上部へと
移動し（クロマトグラフィー効果）、過剰な液体は最上部にある吸着パッドによ
りカセットの上部へと誘導された。サンプルに抗原が含まれていない場合、試験
終了時にコントロールラインのみが見える。抗原があった場合は、テストライン
が見える。好適な実施例を挙げて本発明を詳細に説明してきたが、クレームに定義された
本発明の範囲を逸脱することなく、修飾および変形が可能であることは本技術分
野の当業者には明らかである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０１Ｎ 33/543 ５４５Ｇ０１Ｎ 33/543 ５４５Ｓ５７５５７５ 33/545 33/545 Ａ 33/553 33/553 33/569 33/569 Ｆ // Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者イー，チン，スー，エーアメリカ合衆国、94010、カリフォルニア州、バーリンゲーム、コーワンロード 837 (72)発明者ハン，チュン・ホーアメリカ合衆国、94010、カリフォルニア州、バーリンゲーム、コーワンロード 837 Ｆターム(参考） 2G054 AB04 CA21 CA22 EA03 GA04 4B024 AA13 CA04 DA06 EA04 GA11 HA14 4B063 QA01 QQ06 QR32 QR33 QS34 4H045 AA11 AA30 CA11 DA86 EA52 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ヘリコバクターピロリ菌（H. pylori）検出に特異的な一対
のプライマーを使用したポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により血液中で検出さ
れる、ヘリコバクターピロリ菌抗原。
【請求項２】前記血液が血漿である、請求項１記載のピロリ菌抗原。
【請求項３】前記の一対のプライマーが、ＡＴＣＣ菌株４３５０４、４３
５７１、４３６２９および４９０５３のピロリ菌株からの共通ヌクレオチド配列
を含む、請求項１記載のピロリ菌抗原。
【請求項４】ピロリ菌検出に特異的なオリゴヌクレオチドの第一組および
第二組を使用したリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）によって血液中で検出され、第一
組のオリゴヌクレオチドが互いに連続的であり、第二組が第一組に相補的であり
、第二組のオリゴヌクレオチドが互いに連続的である、ピロリ菌抗原。
【請求項５】前記第一および第二組オリゴヌクレオチドが、ＡＴＣＣ菌株
４３５０４、４３５７１、４３６２９および４９０５３のピロリ菌株からの共通
ヌクレオチド配列を含む請求項４記載のピロリ菌抗原。
【請求項６】前記ＬＣＲがＰｆｕＤＮＡリガーゼを使用して行われる、
請求項４記載のピロリ菌抗原。
【請求項７】ピロリ菌のＤＮＡプローブを使用したＤＮＡハイブリッド形
成によって血液中で検出される、ピロリ菌抗原。
【請求項８】前記血液が、全血、血清および血漿を含む、請求項７記載の
ピロリ菌抗原。
【請求項９】前記ＤＮＡプローブが放射性同位元素または蛍光によってラ
ベルされている、請求項７記載のピロリ菌抗原。
【請求項１０】前記ＤＮＡハイブリッド形成が、ニトロセルロース膜上で
作成されるスポットＤＮＡハイブリッド形成である、請求項７記載のピロリ菌抗
原。
【請求項１１】免疫測定または免疫ブロット法分析を用い、ピロリ菌に対
する抗体によって血液中で検出される、ピロリ菌抗原。
【請求項１２】前記抗ピロリ菌抗原に対する抗体がアフィニティー精製抗
体である、請求項１１記載のピロリ菌抗原。
【請求項１３】前記免疫測定が、ベーシック・サンドウィッチ法、トリプ
ル・サンドウィッチ法またはイムノクロマトグラフィー分析を含む、請求項１１
記載のピロリ菌抗原。
【請求項１４】前記血清が解離試薬またはサンプル解離条件で処理されて
いる、請求項１１記載のピロリ菌抗原。
【請求項１５】前記解離試薬が、容量モル濃度が少なくとも１ＭのＮａＣ
ｌまたはＫＣｌ溶液を含む、請求項１４記載のピロリ菌抗原。
【請求項１６】前記解離試薬が、ＳＤＳ、Ｔｗｅｅｎ２０、オクチルグル
コシド、デオキシコレートおよびＴｒｉｔｏｎＸ−１００からなる群から選択
される少なくとも一つを含有する界面活性剤を含む、請求項１４記載のピロリ菌
抗原。
【請求項１７】前記解離試薬が、ジオキサンおよびエチレングリコールか
らなる群から選択される少なくとも一つを含有する有機溶媒を含む、請求項１４
記載のピロリ菌抗原。
【請求項１８】前記解離試薬が、グアニジンＨＣｌ、尿素およびチオシア
ン酸カリウムからなる群から選択されるカオトロピック剤を含む、請求項１４記
載のピロリ菌抗原。
【請求項１９】前記解離試薬が、プロテアーゼおよびリパーゼからなる群
から選択される少なくとも一つの酵素を含む、請求項１４記載のピロリ菌抗原。
【請求項２０】前記サンプル解離条件が、前記血清ｐＨを９以上または３
以下に調整することを含む、請求項１４記載のピロリ菌抗原。
【請求項２１】前記サンプル解離条件が、前記血清温度を５０℃以上に調
整することを含む、請求項１４記載のピロリ菌抗原。
【請求項２２】請求項１記載の血液中ピロリ菌抗原を検出することを備え
る、ピロリ菌感染の診断方法。
【請求項２３】請求項４記載の血液中ピロリ菌抗原を検出することを備え
る、ピロリ菌感染の診断方法。
【請求項２４】請求項７記載の血液中ピロリ菌抗原を検出することを備え
る、ピロリ菌感染の診断方法。
【請求項２５】請求項１１記載の血清中ピロリ菌抗原を検出することを備
える、ピロリ菌感染の診断方法。
【請求項２６】血清サンプル作成工程と、ヘリコバクターピロリ菌に対する第一抗体をアフィニティーカラムで精製する
、該第一抗体の作成工程と、第一複合体の形成のために、前記血清サンプルを前記第一抗体に接触させる工
程と、ヘリコバクターピロリ菌に対する第二抗体をアフィニティーカラムで精製する
、該第二抗体の作成工程と、第二複合体の形成のために、前記第一複合体を前記第二抗体に接触させる工程
と、前記血清サンプル中のヘリコバクターピロリ菌の存在を検出する工程と、を備える、血清サンプル中のヘリコバクターピロリ菌抗原の検出方法。
【請求項２７】第一抗体および第二抗体のうちの一つが固形担体に固定さ
れており、他方が検出剤でラベルされている、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】前記固形担体が、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリプロ
ピレンまたはニトロセルロースの膜である、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】前記検出剤が、酵素マーカー、蛍光剤または発光剤、放射
性ラベルおよび着色粒子からなる群から選択される少なくとも一つを含む、請求
項２７記載の方法。
【請求項３０】酵素マーカーが、アルカリフォスファターゼまたはホース
ラディッシュペルオキシダーゼを含む、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】前記蛍光剤または発光剤が、フルオレセイン、ローダミン
、ユーロピウム、ルミノールおよびアクリジウムからなる群から選択される少な
くとも一つを含む、請求項２９記載の方法。
【請求項３２】前記着色粒子が、金、銀、青色ラテックスおよびセレンの
少なくとも一つを含む、請求項２９記載の方法。
【請求項３３】前記第一抗体が前記固形担体に固定されており、前記第二
抗体が前記酵素マーカーによってラベルされている、請求項２９記載の方法。
【請求項３４】前記第一抗体が前記着色粒子によってラベルされ、前記第
二抗体が前記固形担体に固定されている、請求項３２記載の方法。
【請求項３５】さらに、前記血清サンプルを解離試薬またはサンプル解離
条件で処理する工程を含む、請求項２６記載の方法。
【請求項３６】前記解離試薬が、容量モル濃度が少なくとも１ＭのＮａＣ
ｌまたはＫＣｌ溶液を含む、請求項３５記載の方法。
【請求項３７】前記解離試薬が、ＳＤＳ、Ｔｗｅｅｎ２０、オクチルグ
ルコシド、デオキシコレートおよびＴｒｉｔｏｎＸ−１００からなる群から選
択される少なくとも一つを含有する界面活性剤を含む、請求項３５記載の方法。
【請求項３８】前記解離試薬が、ジオキサンおよびエチレングリコールか
らなる群から選択される少なくとも一つを含有する有機溶媒を含む、請求項３５
記載の方法。
【請求項３９】前記解離試薬が、グアニジンＨＣｌ、尿素およびチオシア
ン酸カリウムからなる群から選択されるカオトロピック剤を含む、請求項３５記
載の方法。
【請求項４０】前記解離試薬が、プロテアーゼおよびリパーゼからなる群
から選択される少なくとも一つの酵素を含む、請求項３５記載の方法。
【請求項４１】前記サンプル解離条件が、前記血清サンプルのｐＨを９以
上または３以下に調整することを含む、請求項３５記載の方法。
【請求項４２】前記サンプル解離条件が、前記血清サンプルの温度を５０
℃以上に上昇させることを含む、請求項３５記載の方法。
【請求項４３】さらに、前記血清サンプルがタンパクベースの試薬と反応
することを含む、請求項３５記載の方法。
【請求項４４】前記タンパクベース試薬が、ウシ胎仔血清、ブタ血清、正
常ヤギ血清、ウマ血清、カゼイン、アルブミン、ゼラチンおよびウシ血清アルブ
ミンからなる群から選択される少なくとも一つを含む、請求項４３記載の方法。
【請求項４５】さらに、前記第二抗体用の抗体産生動物種に対する二次抗
体を作成する工程と、第三複合体の形成のために、前記第二複合体を前記二次抗体に接触させる工程
と、を備える、請求項２６記載の方法。
【請求項４６】前記二次抗体が、酵素マーカー、蛍光剤または発光剤、放
射性ラベルおよび着色粒子からなる群から選択される少なくとも一つを含む検出
剤によってラベルされている、請求項４５記載の方法。
【請求項４７】アフィニティーカラムによって精製され、固形担体に固定
された第一抗体と、アフィニティーカラムによって精製され、検出剤でラベルされたヘリコバクタ
ーピロリ菌に対する第二抗体と、前記検出剤の検出または増幅が可能な試薬とを含む、血清サンプル中のヘリコ
バクターピロリ菌を検出するための診断キット。
【請求項４８】さらに、ウシ胎仔血清、ブタ血清、正常ヤギ血清、ウマ血
清、カゼイン、アルブミン、ゼラチンおよびウシ血清アルブミンから選択される
少なくとも一つを含有するタンパクベース試薬を含む、請求項４７記載の診断キ
ット。
【請求項４９】さらに、少なくとも１ＭのＮａＣｌ、少なくとも１ＭのＫ
Ｃｌ、グアニジンＨＣｌ、尿素、チオシアン酸カリウム、ＳＤＳ、Ｔｗｅｅｎ２
０、オクチルグルコシド、デオキシコレート、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、ジオ
キサン、エチレングリコール、プロテアーゼおよびリパーゼからなる群から選択
される少なくとも一つを含有する解離試薬を含む、請求項４７記載の診断キット
。
【請求項５０】前記検出剤がホースラディッシュペルオキシダーゼであり
、前記試薬がテトラメチルベンジジン基質である、請求項４７記載の診断キット
。
【請求項５１】ヘリコバクターピロリ菌に対する第一抗体と、ヘリコバクターピロリ菌に対する第二抗体と、前記第二抗体用の抗体産生動物種に対する二次抗体であって、酵素マーカー、
蛍光剤または発光剤、放射性ラベルおよび着色粒子からなる群から選択される少
なくとも一つを含む検出剤でラベルされた二次抗体と、前記検出剤の検出または増幅が可能な試薬とを含み、前記第一抗体および前記第二抗体がアフィニティーカラムで精製されている、
血清サンプル中のヘリコバクターピロリ菌を検出するための診断キット。
【請求項５２】前記検出剤がホースラディッシュペルオキシダーゼであり
、且つ前記試薬がテトラメチルベンジン溶液である、請求項５１記載の方法。
【請求項５３】サンプル添加部および結果観察部を有し、前記サンプル添
加部に血清サンプルが添加される固形担体と、着色粒子によりラベルされ、前記サンプル添加部と前記結果観察部の間につな
がれた、ヘリコバクターピロリ菌に対する第一抗体と、前記結果観察部においてイムノクロマトグラフ媒質に固定されている、ヘリコ
バクターピロリ菌に対する第二抗体とを含み、前記第一抗体および第二抗体がアフィニティーカラムによって精製されている
、血清サンプル中のヘリコバクターピロリ菌を検出するためのイムノクロマトグ
ラフィー分析装置。
【請求項５４】前記固形担体が、ニトロセルロース膜、ポリエステル膜、
またはナイロン膜である、請求項５３記載のイムノクロマトグラフィー分析装置
。
【請求項５５】前記着色粒子が、金、銀、青色ラテックスおよびセレンか
らなる群から選択される、請求項５３記載のイムノクロマトグラフィー分析装置
。
【請求項５６】さらに、前記第一抗体用の抗体産生動物種に対する二次抗
体を含み、前記二次抗体が前記第二抗体よりもサンプル添加部から離れた結果観
察部の末端に固定されている、請求項５３記載のイムノクロマトグラフィー分析
装置。