JP2003517291A - 炭素代謝およびエネルギー生産に関連するタンパク質をコードするコリネバクテリウム−グルタミカム遺伝子 - Google Patents

炭素代謝およびエネルギー生産に関連するタンパク質をコードするコリネバクテリウム−グルタミカム遺伝子

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Abstract

(57)【要約】 コリネバクテリウム−グルタミカム由来の新規のＳＭＰタンパク質をコードする単離核酸分子（ＳＭＰ核酸分子と呼ぶ）を記載する。本発明はまた、ＳＭＰ核酸分子を含むアンチセンス核酸分子、組換え発現ベクター、および発現ベクターが移入された宿主細胞を提供する。本発明は、さらに、この生物中のＳＭＰ遺伝子の遺伝子操作に基づくＣ．グルタミカム由来の所望の化合物生産改良用の単離ＳＭＰタンパク質、変異ＳＭＰタンパク質、融合タンパク質、抗原ペプチド、および方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （関連出願） 本出願は、先に提出した１９９９年６月２５日提出の米国仮特許出願６０／１
４１０３１、１９９９年７月９日提出の米国仮特許出願６０／１４３２０８、お
よび１９９９年８月３１日提出の米国仮特許出願６０／１５１５７２の優先権を
主張する。本出願はまた、先に提出された１９９９年７月８日提出のドイツ特許
出願１９９３１４１２．８、１９９９年７月８日提出のドイツ特許出願１９９３
１４１３．６、１９９９年７月８日提出のドイツ特許出願１９９３１４１９．５
、１９９９年７月８日提出のドイツ特許出願１９９３１４２０．９、１９９９年
７月８日提出のドイツ特許出願１９９３１４２４．１、１９９９年７月８日提出
のドイツ特許出願１９９３１４２８．４、１９９９年７月８日提出のドイツ特許
出願１９９３１４３１．４、１９９９年７月８日提出のドイツ特許出願１９９３
１４３３．０、１９９９年７月８日提出のドイツ特許出願１９９３１４３４．９
、１９９９年７月８日提出のドイツ特許出願１９９３１５１０．８、１９９９年
７月８日提出のドイツ特許出願１９９３１５６２．０、１９９９年７月８日提出
のドイツ特許出願１９９３１６３４．１、１９９９年７月９日提出のドイツ特許
出願１９９３２１８０．９、１９９９年７月９日提出のドイツ特許出願１９９３
２２２７．９、１９９９年７月９日提出のドイツ特許出願１９９３２２３０．９
、１９９９年７月１４日提出のドイツ特許出願１９９３２９２４．９、１９９９
年７月１４日提出のドイツ特許出願１９９３２９７３．７、１９９９年７月１４
日提出のドイツ特許出願１９９３３００５．０、１９９９年８月２７日提出のド
イツ特許出願１９９４０７６５．７、１９９９年９月３日提出のドイツ特許出願
１９９４２０７６．９、１９９９年９月３日提出のドイツ特許出願１９９４２０
７９．３、１９９９年９月３日提出のドイツ特許出願１９９４２０８６．６、１
９９９年９月３日提出のドイツ特許出願１９９４２０８７．４、１９９９年９月
３日提出のドイツ特許出願１９９４２０８８．２、１９９９年９月３日提出のド
イツ特許出願１９９４２０９５．５、１９９９年９月３日提出のドイツ特許出願
１９９４２１２３．４、および１９９９年９月３日提出のドイツ特許出願１９９
４２１２５．０の優先権を主張する。上記全出願の全ての内容は、本明細書中で
明確に参考として援用される。
【０００２】 （発明の背景） 細胞の天然に存在する代謝過程の一定の産物および副産物は、食品、飼料、化
粧品、および製薬産業を含む広範な種々の産業で有用である。これらの分子（集
合的に、「精製化学製品（ファインケミカル）」と呼ばれる）には、有機酸、タ
ンパク質生成および非タンパク質生成アミノ酸、ヌクレオチドおよびヌクレオシ
ド、脂質および脂肪酸、ジオール、炭水化物、芳香族化合物、ビタミンおよび補
因子、ならびに酵素が含まれる。その生産は、１つまたは複数の所望の分子を大
量に産生および分泌させるように開発された細菌の大量培養によって最も都合よ
く行われる。この目的の１つの特に有用な生物は、コリネバクテリウム−グルタ
ミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）（グラム陽
性、非病原性細菌）である。株の選択によって、多数の所望の化合物を産生する
多数の変異株が開発されている。しかし、特定の分子の産生用に改良された株の
選択は、時間のかかる困難な過程である。
【０００３】 （発明の要旨） 本発明は、様々に用途がある新規の細菌核酸分子を提供する。これらの用途に
は、精製化学製品の製造に使用することができる細菌の同定、Ｃ．グルタミカム
（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）または関連細菌による精製化学製品の調整、Ｃ．
グルタミカムゲノムのマッピングの基準点および形質転換のマーカーとしてのＣ
．グルタミカムまたは関連細菌の分類または同定が含まれる。これらの新規の核
酸分子は、本明細書中で糖代謝および酸化的リン酸化（ＳＭＰ）タンパク質と呼
ばれるタンパク質をコードする。
【０００４】 Ｃ．グルタミカムは、種々の精製化学製品の大量生産用、炭化水素の分解（例
えば石油流出など）、およびテルペノイドの酸化などの産業に一般に使用されて
いるグラム陽性の好気性菌である。したがって、本発明のＳＭＰ核酸分子を使用
して、例えば発酵過程による精製化学製品の生産に使用することができる細菌を
同定することができる。本発明のＳＭＰ核酸分子の発現または本発明のＳＭＰ核
酸分子配列改変を使用して、細菌由来の１つまたは複数の化学製品の生産を調整
することができる（例えば、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ）またはブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）由来の１つ
または複数の精製化学製品の生産量または生産を改良する）。
【０００５】 本発明のＳＭＰ核酸を使用して、コリネバクテリウム−グルタミカムまたはそ
の密接な関連細菌としての細菌の同定またはＣ．グルタミカムまたはその関連細
菌の混合細菌集団の存在の同定も可能である。本発明は、緊縮条件下（ストリン
ジェントな条件下）でこの生物に固有のＣ．グルタミカム遺伝子領域にかかるプ
ローブを使用した細菌の固有または混合した集団の培地からの抽出ゲノムＤＮＡ
の探索（この生物が存在するかどうかを確認することができる）による多数のＣ
．グルタミカム遺伝子の核酸配列を提供する。コリネバクテリウム−グルタミカ
ム自体が非病原性であるにもかかわらず、ヒトに病原性を示す種、例えばコリネ
バクテリウム−ジフテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｋｕｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈ
ｅｒｉａｅ）（ジフテリアの原因物質）などに関連し、このような生物の検出は
臨床的に有意に関連する。
【０００６】 本発明のＳＭＰ核酸分子はまた、Ｃ．グルタミカムゲノムまたは関連生物のゲ
ノムのマッピングにおける基準点として使用することができる。同様に、これら
の分子またはその変異型もしくは一部は、遺伝子操作コリネバクテリウムまたは
Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ種のマーカーとして使用することができる。
【０００７】 本発明の新規の核酸分子によってコードされるＳＭＰタンパク質は、例えば、
コリネバクテリウム−グルタミカムにおける過程（酸化的リン酸化など）による
糖などの炭素化合物の代謝およびエネルギー分子の生成に関連する機能を果たす
ことができる。コリネバクテリウム−グルタミカムで使用されるクローニングベ
クターの適用性（Ｓｉｎｓｋｅｙらに付与された米国特許第４，６４９、１１９
号に開示）およびＣ．グルタミカムおよび関連するＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ種（例えば、ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）の遺伝子操作技術（Ｙｏｓｈｈ
ａｍａら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１６２、５９１〜５９７、１９８５、Ｋ
ａｔｓｕｍａｔａら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１５９、３０６〜３１１（１
９８４）、およびＳａｎｔａｍａｒｉａら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．
、１３０、２２３７〜２２４６、１９８４）を考慮すれば、本発明の核酸分子を
この生物の遺伝子操作に利用して１つまたは複数の精製化学製品のより良好また
はより有効な生産が可能である。この精製化学製品の生産または生産効率の改良
は、本発明の遺伝子操作の直接的効果によるか、このような操作の間接的な効果
により得る。
【０００８】 本発明のＳＭＰタンパク質の変更によりこのような変更タンパク質が組み込ま
れたＣ．グルタミカム株由来の精製化学製品の生産量、生産、および／または生
産効率が直接影響を受け得る多数の機構が存在する。糖などの高エネルギー炭素
分子の分解およびＮＡＤＨおよびＦＡＤＨ２などの化合物の酸化的リン酸化によ
り高エネルギーリン酸結合を含む化合物への変換により、それ自体が所望の生成
化学製品（ピルビン酸、ＡＴＰ、ＮＡＤＨなど）である多数の化合物および中間
体糖化合物が得られる。さらに、これらの代謝経路によって生成されたエネルギ
ー分子（ＡＴＰなど）および還元糖化物（ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨなど）を細
胞中で利用して、エネルギー的に不利な反応を駆動させる。このような不利な反
応には、多数の生成化学製品生合成経路が含まれる。細胞の特定の糖を利用する
能力の改良により（例えば、細胞の糖の分解およびエネルギーへの変換に関連す
る酵素をコードする遺伝子の改良により）、不利であるが所望の代謝反応（所望
の精製化学製品の生合成）を利用可能なエネルギー量に増加させることができる
。
【０００９】 本発明の１つまたは複数のＳＭＰ遺伝子の変異誘発により、Ｃ．グルタミカム
由来の１つまたは複数の所望の精製化学製品の生産に間接的に影響を与える活性
を変化させたＳＭＰタンパク質を得ることもできる。例えば、１つまたは複数の
糖の利用効率の増加（糖の有用なエネルギー分子への変換）または還元糖化物の
有用なエネルギー分子への変換効率の増加（例えば、酸化的リン酸化の効率また
はＡＴＰシンターゼ活性の改良による）により、細胞が利用可能な通常不利な代
謝過程を駆動するこれらの高エネルギー化合物量を増加させることができる。こ
れらの過程には、細胞壁の構築、転写、翻訳、および細胞の増殖および***に必
要な化合物（例えば、ヌクレオチド、アミノ酸、ビタミン、脂質など）の生合成
が含まれる（Ｌｅｎｇｅｌｅｒら、１９９９、「原核生物の生物学」、Ｔｈｉｅ
ｍｅ Ｖｅｒｌａｇ：Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ、８８〜１０９、９１３〜９１８、８
７５〜８９９）。これらの操作細胞の成長および増殖の改良により、大量培養で
の生存度の増加および***速度の改良が可能であり、比較的多数の細胞が発酵槽
培養で生存することができる。少なくとも多数の生細胞の存在により生産量、生
産、または生産効率を増加させて所望の精製化学製品を生産することができる。
また、糖代謝中に生成された多数の分解生成物を、他の所望の生成物（化学物質
など）の生産における前駆体または中間体として細胞が利用する。それにより、
細胞の糖代謝能力の増大により、細胞が利用可能な他の過程用のこれらの分解生
成物数も増加するはずである。
【００１０】 本発明は、例えば、コリネバクテリウム−グルタミカムにおける過程（酸化的
リン酸化など）による糖などの炭素化合物の代謝およびエネルギー分子の生成に
関連する機能を果たし得るタンパク質（本明細書中では、「ＳＭＰタンパク質」
と呼ぶ）をコードする新規の核酸分子を提供する。ＳＭＰタンパク質をコードす
る核酸分子を、本明細書中でＳＭＰ核酸分子と呼ぶ。好ましい実施形態では、Ｓ
ＭＰタンパク質は、炭素分子およびその分解生成物の代謝過程で細胞によって利
用されるエネルギーへの変換に関与する。このようなタンパク質の例には、表１
に記載の遺伝子によってコードされるタンパク質が含まれる。
【００１１】 したがって、本発明の１つの態様は、ＳＭＰをタンパク質をコードするヌクレ
オチド配列またはその生物活性部分を含む単離核酸分子（例えば、ｃＤＮＡ、Ｄ
ＮＡ、またはＲＮＡ）ならびにＳＭＰコード核酸の検出または増幅用のプライマ
ーまたはハイブリッド形成プローブとして安定な核酸フラグメント（例えば、Ｄ
ＮＡまたはｍＲＮＡ）に関する。特に好ましい実施形態では、単離核酸分子は、
配列表の奇数の配列番号（例えば、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列
番号７．．．．）に記載のヌクレオチド配列の１つまたはこれらのヌクレオチド
配列の１つのコード領域もしくは相補物を含む。他の特に好ましい実施形態では
、本発明の単離核酸分子は、上記の配列表の奇数番号（例えば、配列番号１、配
列番号３、配列番号５、配列番号７．．．．）に記載のヌクレオチド配列にハイ
ブリッド結合するか、それに少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０
％、より好ましくは少なくとも約７０％、８０％、または９０％、さらにより好
ましくは少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以
上相同なヌクレオチド配列またはその一部を含む。他の好ましい実施形態では、
単離核酸分子は、配列表の偶数の配列番号（配列番号２、配列番号４、配列番号
６、配列番号８．．．．）に記載のアミノ酸配列の１つをコードする。本発明の
好ましいＳＭＰタンパク質はまた、本明細書中に記載の少なくとも１つのＳＭＰ
活性を有することが好ましい。
【００１２】 別の実施形態では、単離核酸分子は、タンパク質またはその一部が本発明のア
ミノ酸配列に十分に相同的な（例えば、タンパク質またはその一部がＳＭＰ活性
を維持するように本発明のアミノ酸配列に十分に相同的な）アミノ酸配列（例え
ば、配列表の偶数の配列番号を有する配列）を含むタンパク質またはその一部を
コードする。好ましくは、核酸分子によってコードされるタンパク質またはその
一部は、コリネバクテリウム−グルタミカムにおける過程（酸化的リン酸化など
）による糖などの炭素化合物の代謝およびエネルギー分子（例えば、ＡＴＰ）の
生成に関連する機能を果たす能力を維持する。１つの実施形態では、核酸分子に
よってコードされるタンパク質は、本発明のアミノ酸配列（例えば、配列表の偶
数の配列番号を有するアミノ酸から選択される全アミノ酸配列）に少なくとも約
５０％、好ましくは少なくとも約６０％、より好ましくは少なくとも約７０％、
８０％、または９０％、さらにより好ましくは少なくとも約９５％、９６％、９
７％、９８％、９９％、またはそれ以上相同である。別の好ましい実施形態では
、タンパク質は、本発明の全アミノ酸配列に実質的に相同的な全長Ｃ．グルタミ
カムタンパク質（配列表の対応する奇数の配列番号（例えば、配列番号１、配列
番号３、配列番号５、配列番号７．．．．）に示した読み取り枠によってコード
される）である。
【００１３】 別の好ましい実施形態では、単離核酸分子は、Ｃ．グルタミカム由来であり、
本発明のアミノ酸配列（例えば、配列表の偶数の配列番号の１つの配列）の１つ
に少なくとも約５０％を超えて相同的で、コリネバクテリウム−グルタミカムに
おける過程（酸化的リン酸化など）による糖などの炭素化合物の代謝およびエネ
ルギー分子（例えば、ＡＴＰ）の生成に関連する機能を果たすことができるか、
表１に記載の１つまたは複数の活性を有し、また、異種ポリペプチドまたは調節
領域をコードする異種核酸配列も含む生物活性ドメインを含むタンパク質（例え
ば、ＳＭＰ融合タンパク質）をコードする。
【００１４】 別の実施形態では、単離核酸分子は、少なくとも１５ヌクレオチド長であり、
ストリンジェントな条件下で本発明のヌクレオチド配列（例えば、配列表の奇数
の配列番号の配列）を含む核酸分子とハイブリッド形成する。好ましくは、単離
核酸分子は、天然に存在する核酸分子に対応する。より好ましくは、単離核酸は
、天然に存在するＣ．グルタミカムのＳＭＰタンパク質またはその生物活性部分
をコードする。
【００１５】 本発明の別の態様は、本発明の核酸分子を含むベクター（例えば、組換え発現
ベクター）、このようなベクターが移入される宿主細胞に関する。１つの実施形
態では、このような宿主細胞を使用して、安定な培地中での宿主細胞の培養によ
ってＳＭＰタンパク質を産生させる。次いで、ＳＭＰタンパク質を、培地または
宿主細胞から単離することができる。
【００１６】 本発明のさらに別の態様は、ＳＭＰ遺伝子が移入または変更された遺伝子変更
微生物に関する。１つの実施形態では、微生物のゲノムを、導入遺伝子として野
生型または変異ＳＭＰ配列をコードする本発明の核酸分子の移入によって変更さ
れている。別の実施形態では、微生物ゲノム中の内因性ＳＭＰ遺伝子が変更ＳＭ
Ｐ遺伝子での相同組換えによって変更されている（例えば、機能的に破壊されて
いる）。別の実施形態では、微生物中の内因性または移入ＳＭＰ遺伝子が、１つ
または複数の点変異、欠失、または逆位で変更されているが、機能的ＳＭＰタン
パク質はコードする。さらに別の実施形態では、ＳＭＰ遺伝子の発現が調節され
るように、微生物におけるＳＭＰ遺伝子の１つまたは複数の調節領域（例えば、
プロモーター、リプレッサー、またはインデューサー）が変更されている（例え
ば、欠失、短縮、逆位、または点変異による）。好ましい実施形態では、微生物
は、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｕｔｅｒｉｕｍ）属またはブレビ
バクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属するが、コリネバクテリ
ウム−グルタミカムが特に好ましい。好ましい実施形態では、微生物は、所望の
化合物（アミノ酸など）の生産にも利用されるが、リジンが特に好ましい。
【００１７】 別の態様では、本発明は、被験体におけるコリネバクテリウム−ジフテリアの
存在または活性の同定法を提供する。この方法には、本発明の被験体における１
つまたは複数の核酸またはアミノ酸配列（配列表に記載の配列番号１〜７８２の
配列）の検出による被験体におけるコリネバクテリウム−ジフテリアの存在また
は活性の検出が含まれる。
【００１８】 本発明のさらに別の態様は、単離ＳＭＰタンパク質またはその一部（例えば、
生物活性部分）に関する。好ましい実施形態では、単離ＳＭＰタンパク質または
その一部は、コリネバクテリウム−グルタミカムにおける過程（酸化的リン酸化
など）による糖などの炭素化合物の代謝およびエネルギー分子（例えば、ＡＴＰ
）の生成に関連する機能を果たすことができる。別の好ましい実施形態では、単
離ＳＭＰタンパク質またはその一部は、タンパク質またはその一部がコリネバク
テリウム−グルタミカムにおける過程（酸化的リン酸化など）による糖などの炭
素化合物の代謝およびエネルギー分子（例えば、ＡＴＰ）の生成に関連する機能
を果たす能力を維持するために本発明のアミノ酸配列（例えば、配列表の偶数の
配列番号の配列）に十分に相補的である。
【００１９】 本発明はまた、ＳＭＰタンパク質の単離調製物を提供する。好ましい実施形態
では、ＳＭＰタンパク質は、本発明のアミノ酸配列（配列表の偶数の配列番号の
配列）を含む。別の好ましい実施形態では、本発明は、本発明の全アミノ酸配列
（例えば、配列表の偶数の配列番号の配列）（配列表の対応する奇数の配列番号
に記載の読み取り枠によってコードされる）に実質的に相補的な単離全長タンパ
ク質に関する。さらに別の実施形態では、本発明の全アミノ酸配列（例えば、配
列表の偶数の配列番号の配列）に少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約
６０％、より好ましくは少なくとも約７０％、８０％、または９０％、最も好ま
しくは少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上
相同である。他の実施形態では、単離ＳＭＰタンパク質は、本発明のアミノ酸配
列の１つ（例えば、配列表の偶数の配列番号の配列）に少なくとも約５０％また
はそれ以上相補的で、コリネバクテリウム−グルタミカムにおける過程（酸化的
リン酸化など）による糖などの炭素化合物の代謝およびエネルギー分子（例えば
、ＡＴＰ）の生成に関連する機能を果たすことができるか、表１に記載の１つま
たは複数の活性を有するアミノ酸配列を含む。
【００２０】 あるいは、単離ＳＭＰタンパク質は、配列表に記載の偶数の配列番号の１つの
ヌクレオチド配列とハイブリッド形成する（例えば、ストリンジェントな条件下
でハイブリッド形成する）か、その配列に少なくとも約５０％、好ましくは少な
くとも約６０％、より好ましくは少なくとも約７０％、８０％、または９０％、
さらにより好ましくは少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、
またはそれ以上相同であるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列
を含み得る。ＳＭＰタンパク質の好ましい形態もまた本明細書中に記載のＳＭＰ
生体活性を有することも好ましい。
【００２１】 ＳＭＰポリペプチドまたはその生物活性部分を、非ＳＭＰポリペプチドに作動
可能に連結させて融合タンパク質を形成させることができる。好ましい実施形態
では、この融合タンパク質は、ＳＭＰタンパク質のみとは異なる活性を有する。
他の好ましい実施形態では、この融合タンパク質は、コリネバクテリウム−グル
タミカムにおける過程（酸化的リン酸化など）による糖などの炭素化合物の代謝
およびエネルギー分子（例えば、ＡＴＰ）の生成に関連する機能を果たす。特に
好ましい実施形態では、この融合タンパク質の宿主細胞への取り込みにより細胞
由来の所望の化合物の産生が調整される。
【００２２】 別の態様では、本発明は、ＳＭＰタンパク質自体またはＳＭＰタンパク質の結
合パートナーとの相互作用によるか、本発明のＳＭＰ核酸の転写または翻訳の調
整によってＳＭＰタンパク質の活性を調整する分子のスクリーニング法を提供す
る。
【００２３】 本発明の別の態様は、精製化学製品の生産法に関する。この方法は、精製化学
製品が生産されるように、本発明のＳＭＰ核酸分子の発現を指向するベクターを
含む細胞を培養する工程を包含する。好ましい実施形態では、本発明は、さらに
、細胞がＳＭＰ核酸の発現を指向するベクターでトランスフェクトされた、この
ようなベクターを含む細胞を獲得する工程を包含する。別の好ましい実施形態で
は、この方法は、さらに、培養物由来の精製化学製品の回収工程を包含する。特
に好ましい実施形態では、細胞はコリネバクテリウム属またはブレビバクテリウ
ム属由来であるか、表３に記載の株から選択される。
【００２４】 本発明の別の態様は、微生物由来の分子の産生の調整法に関する。このような
方法は、細胞とＳＭＰタンパク質活性またはＳＭＰ核酸発現を調整する作用因子
とを接触させることにより細胞関連活性が作用因子の非存在下でこの同一の活性
と比較して変更される工程を包含する。好ましい実施形態では、細胞は、１つま
たは複数のＣ．グルタミカム炭素代謝経路または酸化的リン酸化などの過程の夜
エネルギー生産を調整し、この微生物による所望の生成化学製品の生産量または
生産速度を改良する。ＳＭＰタンパク質活性を調整する作用因子は、ＳＭＰタン
パク質活性またはＳＭＰ核酸発現を刺激する作用因子であり得る。ＳＭＰタンパ
ク質活性またはＳＭＰ核酸発現を刺激する作用因子の例には、細胞に移入されて
いる小分子、活性ＳＭＰタンパク質、ＳＭＰタンパク質をコードする核酸が含ま
れる。ＳＭＰ活性または発現を阻害する作用因子の例には、小分子、アンチセン
スＳＭＰ核酸分子が含まれる。
【００２５】 本発明の別の態様は、細胞に野生型または変異ＳＭＰ遺伝子を移入し、個別の
プラスミドで維持されるか、宿主細胞のゲノムに取り込まれる工程を包含する、
細胞由来の所望の化合物の生産量の調整法に関する。ゲノムに取り込まれた場合
、このような取り込みはランダムであるか、天然の遺伝子が移入コピーによって
置換されるような相同組換えが起こり、調整されるべき細胞から所望の化合物を
産生することができる。好ましい実施形態では、生産量が増加する。別の好まし
い実施形態では、化合物は精製化学製品である。特に好ましい実施形態では、精
製化学製品はアミノ酸である。特に好ましい実施形態では、アミノ酸はリジンで
ある。
【００２６】 （発明の詳細な説明） 本発明は、コリネバクテリウム−グルタミカムにおける過程（酸化的リン酸化
など）による糖などの炭素化合物の代謝およびエネルギー分子の生成に関連する
ＳＭＰ核酸およびタンパク質分子を提供する。本発明の分子を、微生物（例えば
、Ｃ．グルタミカム）由来の精製化学製品の生産の直接的調整（例えば、解糖経
路タンパク質の過剰発現または至適化により改変Ｃ．グルタミカム由来の例えば
ピルビン酸の生産量、生産、および／または生産効率に影響を与える場合）に利
用することができるか、所望の化合物の生産量、生産、および／または生産効率
を増加させるような間接的影響を与えることができる（例えば、酸化的リン酸化
に関連するタンパク質の調整により、必要な代謝過程および他の細胞機能（核酸
およびタンパク質生合成および転写／翻訳など）を行うために利用可能なエネル
ギー量が変化する場合）。本発明の態様を、以下にさらに詳述する。
【００２７】 Ｉ．精製化学製品 用語「精製化学製品（ファインケミカル）」は、当該分野で認識されており、
これらに限定されないが種々の産業、例えば製薬、農業、および化粧品産業に適
用される生物によって産生される分子が含まれる。このような化合物には、有機
酸（酒石酸、イタコン酸ジアミノピメリン酸など）、タンパク質生成および非タ
ンパク質生成アミノ酸（プリンおよびピリミジン塩基）、ヌクレオシド、ヌクレ
オチド（Ｋｕｎｉｎａｋａ，Ａ．、１９９６、「ヌクレオチドおよび関連化合物
」、５６１〜６１２、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、６巻、Ｒｅｈｍら編、ＶＣ
Ｈ：Ｗｅｉｎｈｅｉｍ、および本明細書中の引例に記載）、脂質、飽和および不
飽和脂肪酸（例えば、アラキドン酸）、ジオール（例えば、プロパンジオールお
よびブタンジオール）、炭水化物（例えば、ヒアルロン酸およびトレハロース）
、芳香族化合物（例えば、芳香族アミン、バニリン、およびインディゴ）、ビタ
ミンおよび補因子（Ｕｌｌｍａｎｎ’ｓ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｉ
ｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ａ２７巻、「ビタミン」、４４３〜
６１３、１９９６、ＶＣＨ：Ｗｅｉｎｈｅｉｍ、および本明細書中の引例、およ
びＯｎｇ，Ａ．Ｓ．Ｎｉｋｉ，Ｅ．＆Ｐａｃｋｅｒ，Ｌ．、１９９５、「栄養素
、脂質、健康、および疾患」、１９９４年９月１日〜３日にマレーシアのペナン
で開催されたＵＮＥＳＣＯ／化学・工学協会およびフリーラジカル研究協会−ア
ジアの集録、ＡＯＣＳ Ｐｒｅｓｓ、１９９５に記載）、酵素、ポリケチド（Ｃ
ａｎｅら、１９９８、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８２、６３〜６８）、およびＧｕｔｃ
ｈｏ、１９８３、「発酵による化合物」、Ｎｏｙｅｓ Ｄａｔａ Ｃｏｒｐｏｒ
ａｔｉｏｎ、ＩＳＢＮ：０８１８８０５０８６および本明細書中の引例に記載の
他の全ての化合物が含まれる。これらの一定の精製化学製品の代謝および使用を
、以下にさらに詳述する。
【００２８】 Ａ．アミノ酸代謝および使用 アミノ酸は、全てのタンパク質の基本的単位を含み、そのようなものとして全
ての生物における正常な細胞機能に必須である。用語「アミノ酸」は、当該分野
で認識されている。２０種存在するタンパク質生成アミノ酸は、ペプチド結合で
連結したタンパク質の構造単位として使用される一方で、非タンパク質生成アミ
ノ酸（何百もが公知である）は通常タンパク質中に見出されない（Ｕｌｌｍａｎ
ｎ’ｓ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ、Ａ２巻、５７〜９７、ＶＣＨ：Ｗｅｉｎｈｅｉｍ、１９８５）。アミ
ノ酸は、Ｄ型またはＬ型光学配置で存在し得るが、Ｌアミノ酸は一般に、天然に
存在するタンパク質のみで見出される型である。２０種のタンパク質生成アミノ
酸それぞれの生合成および分解経路は、原核細胞および真核細胞の両方で十分に
特徴づけられている（例えば、Ｓｔｒｙｅｒ、Ｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、
第３版、５７８〜５９０、１９８８を参照のこと）。「必須」アミノ酸（ヒスチ
ジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、トレ
オニン、トリプトファン、およびバリン）は、その生合成の複雑さにより栄養素
として必要であり、簡単な生合成経路によって残りの１１種の「非必須」アミノ
酸（アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グル
タミン酸、グルタミン、グリシン、プロリン、セリン、およびチロシン）に容易
に変換されるので、そう呼ばれている。高等動物は、これらのアミノ酸のいくつ
かを合成する能力を保持しているが、正常なタンパク質合成を起こさせるために
食物から供給されなければならない。
【００２９】 タンパク質生合成機能とは別に、これらのアミノ酸はこの化合物自体が興味深
く、多数が食品、飼料、化学、化粧品、農業、および製薬産業における種々の適
用が見出されている。リジンは、ヒトのみならず家禽およびブタなどの単胃動物
の栄養素として重要なアミノ酸である。アスパラギン酸、フェニルアラニン、グ
リシン、およびシステインと同様にグルタミン酸は香料（グルタミン酸一ナトリ
ウム、ＭＳＧ）として最も一般に使用されており、食品産業で広く一般に使用さ
れている。グリシン、Ｌ−メチオニン、およびトリプトファンは、全て製薬産業
で利用されている。グルタミン、バリン、ロイシン、イソロイシン、ヒスチジン
、アルギニン、プロリン、セリン、およびアラニンは、製薬産業および化粧品産
業の両方で有用である。トレオニン、トリプトファン、およびＤ／Ｌ−メチオニ
ンは、一般的な食品添加物である。（Ｌｅｕｃｈｔｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｗ．、１
９９６、「アミノ酸−技術的生産および使用」、４６６〜５０２、Ｒｅｈｍら編
、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、６巻、第１４ａ章、ＶＣＨ：Ｗｅｉｎｈｅｉｍ
）。さらに、これらのアミノ酸は、合成アミノ酸およびペプチド（Ｎ−アセチル
システイン、Ｓ−カルボキシメチル−Ｌ−システイン、（Ｓ）−５−ヒドロキシ
トリプトファン、Ｕｌｌｍａｎｎ’ｓ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｉｎ
ｄｕｓｔｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ａ２巻、５７〜９７、ＶＣＨ：Ｗｅｉ
ｎｈｅｉｍ、１９８５に記載の他の合成アミノ酸など）の合成用前駆体として有
用であることが見出されている。
【００３０】 アミノ酸産生生物におけるこれらの天然のアミノ酸の生合成は、十分に特徴づ
けられている（細菌アミノ酸合成およびその調節についての総説については、Ｕ
ｍｂａｒｇｅｒ，Ｈ．Ｅ．、１９７８、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、４
７、５３３〜６０６を参照のこと）。グルタミン酸は、αケトグルタル酸（クエ
ン酸回路の中間物）の還元的アミノ化によって合成される。グルタミン、プロリ
ン、およびアルギニンは、それぞれグルタミン酸から引き続いて生成される。セ
リンの生合成は、３−ホスホグリセリン酸（解糖の中間物）から始まり、酸化、
アミノ基転移、および加水分解後にこのアミノ酸が得られる３段階過程である。
システインおよびグリシンはセリンから生成され、セリンヒドロキシメチラーゼ
によって触媒される反応において、前者はホモシステインのセリンとの縮合によ
り、後者はテトラヒドロ葉酸への側鎖β炭素原子の転移による。フェニルアラニ
ンおよびチロシンは、プレフェン酸合成後の最後の２段階のみが異なる９段階生
合成経路において解糖経路およびペントースリン酸経路前駆体エリトロース４−
リン酸およびホスホエノイルピルビン酸から合成される。トリプトファンはまた
、これらの２つの最初の分子から生成されるが、その合成は、１１段階の経路で
ある。チロシンもまた、フェニルアラニンヒドロキシラーゼによって触媒される
反応においてフェニルアラニンから合成可能である。アラニン、バリン、および
ロイシンは全てピルビン酸の生合成生成物（解糖の最終生成物）である。アスパ
ラギン酸は、オキサロ酢酸（クエン酸回路の中間体）から形成される。アスパラ
ギン、メチオニン、トレオニン、およびリジンは、それぞれアスパラギン酸の変
換によって生成される。複雑な９段階経路により、５−ホスホリボシル−１−ピ
ロホスフェート（活性糖）からヒスチジンが生成される。
【００３１】 細胞のタンパク質合成を超えるアミノ酸を蓄積することはできず、代わりに分
解されて細胞の主要な代謝経路の中間体が得られる（総説として、Ｓｔｒｙｅｒ
，Ｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第３版、第２１章、「アミノ酸分解および尿
素回路」、４９５〜５１６、１９８８を参照のこと）。細胞は望ましくないアミ
ノ酸を有用な代謝中間体に変換するにもかかわらず、アミノ酸生成は、合成に必
要なエネルギー、前駆体分子、および酵素の点から費用がかかる。したがって、
アミノ酸生合成はフィードバック阻害によって調節され、特定のアミノ酸の存在
によりその生成が遅延するか完全に停止することは驚くべきことではない（アミ
ノ酸生合成経路におけるフィードバック機構の総説については、Ｓｔｒｙｅｒ，
Ｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第３版、第２４章、「アミノ酸分解および尿素
回路」、５７５〜６００、１９８８を参照のこと）。任意の特定のアミノ酸の生
成量は、細胞中に存在するこのようなアミノ酸の量に制限される。
【００３２】 Ｂ．ビタミン、補因子、栄養補給物質代謝および使用 ビタミン、補因子、および栄養補給物質は、高等動物が合成能力を失っている
ので摂取しなければならない別の分子群であるにもかかわらず、これらは細菌な
どの他の生物によって容易に合成される。これらの分子は、それ自体が生体活性
物質であるか、種々の代謝経路における電子伝達体として作用し得る。その栄養
価値とは別に、これらの化合物はまた、着色剤、抗酸化剤、および触媒または他
の加工助剤として有意な産業上の価値を有する。（構造、活性、および産業上の
利用可能性の総説については、例えば、Ｕｌｌｍａｎｎ’ｓ Ｅｎｃｙｃｌｏｐ
ｅｄｉａ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ａ２７巻、「ビ
タミン」、４４３〜６１３、ＶＣＨ：Ｗｅｉｎｈｅｉｍ、１９９６を参照のこと
）。用語「ビタミン」は、当該分野で認識されており、正常な機能のために生物
に必要である、生物自体で合成できない栄養素が含まれる。ビタミン群は、補因
子および栄養補給化合物を含み得る。用語「補因子」には、正常な酵素活性の獲
得に必要な非タンパク質性化合物が含まれる。このような化合物は、有機であっ
ても無機であってもよく、本発明の補因子は有機が好ましい。用語「栄養補給物
質」には、植物および動物（特に、ヒト）の健康に有利な栄養補助食品が含まれ
る。このような分子の例には、ビタミン、酸化防止剤、および一定の脂質（例え
ば、多価不飽和脂肪酸）である。
【００３３】 細菌などのアミノ酸産生生物におけるこれらの天然のアミノ酸の生合成は、十
分に特徴づけられている（Ｕｌｌｍａｎｎ’ｓ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏ
ｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ａ２７巻、「ビタミン」、４
４３〜６１３、ＶＣＨ：Ｗｅｉｎｈｅｉｍ、１９９６、Ｍｉｃｈａｌ，Ｇ．、１
９９９、「生化学的経路：生化学および分子生物学アトラス」、Ｊｏｈｎ Ｗｉ
ｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｏｎｇ，Ａ．Ｓ．Ｎｉｋｉ，Ｅ．＆Ｐａｃｋｅｒ，Ｌ．、１
９９５、「栄養素、脂質、健康、および疾患」、１９９４年９月１日〜３日にマ
レーシアのペナンで開催されたＵＮＥＳＣＯ／化学・工学協会およびフリーラジ
カル研究協会−アジアの集録、ＡＯＣＳ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｈａｍｐａｉｇｎ、Ｉ
Ｌ Ｘ、３７４Ｓ）。
【００３４】 チアミン（ビタミンＢ１）は、ピリミジンとジアゾール部分との化学結合によ
って合成される。リボフラビン（ビタミンＢ２）は、グアノシン−５’−三リン
酸（ＧＴＰ）およびリボース−５’−リン酸から合成される。同様に、リボフラ
ビンは、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）およびフラビンアデニンジヌクレ
オチド（ＦＡＤ）の合成に利用される。集合的に「ビタミンＢ６」と呼ばれる化
合物ファミリー（例えば、ピリドキシン、ピリドキサミン、ピリドキサ−５’リ
ン酸、および商業的に使用されるピリドキシン塩酸塩）は全て、共通の構造単位
５−ヒドロキシ−６−メチルピリジンの誘導体である。パントテン酸塩（パント
テン酸、（Ｒ）−（＋）−Ｎ−（２，４−ジヒドロキシ−３，３−ジメチル−１
−オキソブチル）β−アラニン）を、化学合成または発酵のいずれかによって生
成することができる。パントテン酸塩合成の最終工程は、βアラニンおよびパン
トイン酸のＡＴＰ駆動縮合からなる。パントテン酸、βアラニン変換、およびパ
ントテン酸の縮合用の生合成工程を担う酵素は公知である。パントテン酸塩の代
謝活性形態は、補酵素Ａであり、生合成は５つの酵素工程において進行する。パ
ントテン酸塩、ピリドキサル−５’リン酸、システイン、およびＡＴＰは、補酵
素Ａの前駆体である。これらの酵素は、パントテン酸形成だけでなく、（Ｒ）−
パントテン酸、（Ｒ）−パントラクトン、（Ｒ）−パンテノール（プロビタミン
Ｂ５）、パンテテイン（およびその誘導体）、および補酵素Ａの生成を触媒する
。
【００３５】 微生物における前駆体分子ピメロイル−ＣｏＡからのビオチンの生合成は詳細
に研究されており、関連するいくつかの遺伝子が同定されている。多数の対応す
るタンパク質もまた、Ｆｃクラスター合成に関連することが見出されており、タ
ンパク質のｎｉｆＳクラスのメンバーである。リポ酸はオクタン酸由来であり、
ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体およびα−ケトグルタミン酸デヒドロゲナー
ゼ複合体の一部となる場合、エネルギー代謝における補酵素として利用される。
葉酸塩は、その全てが葉酸の誘導体であり、Ｌ−グルタミン酸、ｐ−アミノ−安
息香酸および６−メチルプテリン由来でもある。中間体グアノシン−５’三リン
酸（ＧＴＰ）、Ｌ−グルタミン酸、およびｐ−アミノ安息香酸から出発する葉酸
およびその誘導体の合成が、一定の微生物で詳細に研究されている。
【００３６】 コバラミン、特に、ビタミンＢ１２などのコリノイドおよびポルフィリンは、
テトラピロール環系によって特徴づけら得る群に属する。ビタミンＢ１２の生合
成は非常に複雑であり未だ完全に特徴づけられていないが、関与する酵素および
基質は現在公知である。ニコチン酸（ニコチン酸塩）およびニコチンアミドは「
ナイアシン」とも呼ばれるプリン誘導体である。ナイアシンは、重要な補酵素Ｎ
ＡＤ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）およびＮＡＤＰ（ニコチンアミ
ドアデニンジヌクレオチドリン酸）、およびその還元形態の前駆体である。
【００３７】 これらの化合物の大量生産は、ほとんど無細胞化学合成に依存しているにもか
かわらず、これらのいくつかの化合物（リボフラビン、ビタミンＢ６、パントテ
ン酸塩、およびビオチン）は微生物の大量培養によって産生されている。ビタミ
ンＢ１２のみは、唯一発酵で産生されているが、これはその合成の複雑さによる
。ｉｎ ｖｉｔｒｏでの方法には、相当な材料および時間の投入が必要であり、
たいてい非常に費用がかかる。
【００３８】 Ｃ．プリン、ピリミジン、ヌクレオシド、およびヌクレオチド代謝およびその
使用 プリンおよびピリミジン代謝遺伝子およびその対応するタンパク質は、腫瘍性
疾患およびウイルス感染治療用の重要な標的である。用語「プリン」または「ピ
リミジン」には、核酸、補酵素、およびヌクレオチドからなる窒素塩基が含まれ
る。用語「ヌクレオチド」には、窒素塩基、ペントース糖（ＲＮＡの場合糖はリ
ボースであり、ＤＮＡの場合糖はＤ−デオキシリボースである）、およびリン酸
から構成される核酸分子の塩基性構造単位が含まれる。用語「ヌクレオシド」に
は、ヌクレオチドの前駆体として利用されるが、ヌクレオチドが保有するリン酸
部分を欠く分子が含まれる。これらの分子の生合成または核酸分子を形成するそ
の動員の阻害によりＲＮＡおよびＤＮＡ合成の阻害が可能であり、癌細胞を標的
する様式での活性の阻害により腫瘍細胞の***および複製能力を阻害することが
できる。さらに、核酸分子を形成しないヌクレオチドが存在するが、これはむし
ろエネルギー保存物質（すなわち、ＡＭＰ）または補酵素（すなわち、ＦＡＤお
よびＮＡＤ）として利用される。
【００３９】 いくつかの刊行物では、プリンおよび／またはピリミジン代謝の影響によるこ
れらの化学製品の医学的指標としての使用が記載されている（例えば、Ｃｈｒｉ
ｓｔｏｐｈｅｒｓｏｎ，Ｒ．Ｉ．ａｎｄ Ｌｙｏｎｓ，Ｓ．Ｄ．、１９９０、「
化学療法薬としてのｄｅ ｎｏｖｏでのピリミジンおよびプリン生合成の強力な
インヒビター」、Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｒｅｖｉｅｗｓ、１０、５０５〜５４８）。
プリンおよびピリミジン代謝に関連する酵素の研究では、例えば免疫抑制剤また
は抗炎症剤として使用することができる新規の薬物開発が注目されている（Ｓｍ
ｉｔｈ，Ｊ．Ｌ．、１９９５、「ヌクレオチド合成における酵素」、Ｃｕｒｒ．
Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．、５、７５２〜７５７、１９９５、Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓａｃｔ．、２３、８７７〜９０２）。しかし、プ
リンおよびピリミジン塩基、ヌクレオシド、およびヌクレオチドは、以下の他の
有用性を有する：いくつかの精製化学製品（例えば、チアミン、Ｓ−アデノシル
メチオニン、葉酸塩、またはリボフラビン）の生合成の中間体、細胞のエネルギ
ー担体（例えば、ＡＴＰまたはＧＴＰ）として、および化学製品自体が調味料と
して（例えば、ＩＭＰまたはＧＭＰ）またはいくつかの医学的適用に使用される
（例えば、Ｋｕｎｉｎａｋａ，Ａ．、１９９６、生物工学におけるヌクレオチド
および関連化学物質、６巻、Ｒｅｈｎら編、ＶＣＨ：Ｗｅｉｎｈｅｉｍ、５６１
〜６１２を参照のこと）。また、プリン、ピリミジン、ヌクレオシド、またはヌ
クレオチド代謝に関連する酵素は標的としてますます利用されており、殺真菌薬
、除草剤、および殺虫剤を含む作物保護用の化学製品が開発されている。
【００４０】 細菌におけるこれらの化合物の代謝は特徴づけられている（総説として、例え
ば、Ｚａｌｋｉｎ，Ｈ．ａｎｄ Ｄｉｘｏｎ，Ｊ．Ｅ．、１９９２、「ｄｅ ｎ
ｏｖｏプリンヌクレオチド生合成」、Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、
第４２巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、２５９〜２８７およびＭｉｃｈａｌ
，Ｇ．、１９９９、「ヌクレオチドおよびヌクレオシド」、第８章「生化学経路
：生化学および分子生物学アトラス」、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照の
こと）。プリン代謝は、徹底した研究の主題であり、細胞の正常な機能に必須で
ある。高等動物においてプリン代謝が損なわれると例えば通風などの重篤な疾患
を発症し得る。プリンヌクレオチドは、中間体化合物イノシン−５’リン酸（Ｉ
ＭＰ）を介した一連の工程においてリボース−５’リン酸から合成され、グアノ
シン−５’一リン酸（ＧＭＰ）またはアデノシン５’一リン酸（ＡＭＰ）が生成
され、ヌクレオチドとして利用される三リン酸形態は容易に形成される。これら
の化合物をエネルギー蓄積物質としても利用し、その分解により細胞における多
数の生化学的過程のためのエネルギーが得られる。ピリミジン生合成は、リボー
ス−５−リン酸からのウリジン−５’一リン酸（ＵＭＰ）の形成によって進行す
る。ＵＭＰは、次に、シチジン−５’三リン酸（ＣＴＰ）に変換される。これら
全てのヌクレオチドのデオキシ−形態は、ヌクレオチドの二リン酸リボースから
ヌクレオチドの二リン酸デオキシリボース形態への１工程の還元反応において生
成される。リン酸化反応の際、これらの分子はＤＮＡ合成に関与し得る。
【００４１】 Ｄ．トレハロース代謝およびその使用 トレハロースは、α、α−１，１結合で結合された２つのグルコース分子から
なる。これは、一般的に、甘味料（乾燥または冷凍食品、および飲料用の添加物
）として食品産業で使用されている。しかし、製薬、化粧品、および生物工学産
業においても適用されている（例えば、１９９８年Ｎｉｓｈｉｍｏｔｏらに付与
された米国特許第５，７５９，６１０号、Ｓｉｎｇｅｒ，Ｍ．Ａ．ａｎｄ Ｌｉ
ｎｄｑｕｉｓｔ，Ｓ．、１９９８、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１６、４
６０〜４６７、Ｐａｉｖａ，Ｃ．Ｌ．Ａ．ａｎｄ Ｐａｎｅｋ，Ａ．Ｄ．、１９
９６、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ａｎｎ．Ｒｅｖ．、２、２９３〜３１４、およびＳｈｉ
ｏｓａｋａ，Ｍ．、１９９７、Ｊ．Ｊａｐａｎ、１７２、９７〜１０２を参照の
こと）。トレハロースは多くの微生物由来の酵素によって産生され、周囲の培地
に天然に放出され、当該分野に公知の方法によって回収することができる。
【００４２】 ＩＩ．糖および炭素分子の利用および酸化的リン酸化 炭素は全ての有機化合物の形成に非常に重要な元素であるので、Ｃ．グルタミ
カムの増殖および***のみでなくこの微生物由来の化合物の過剰生産にも栄養要
求性を示す。糖（単糖類、二糖類、多糖類など）は特に良好な炭素源であるので
、標準的な増殖培地には、典型的には、１つまたは複数のグルコース、フルクト
ース、マンノース、ガラクトース、リボース、ソルボース、リブロース、ラクト
ース、マルトース、スクロース、ラフィノース、デンプン、またはセルロースが
含まれる（Ｕｌｌｍａｎｎ’ｓ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｉｎｄｕｓ
ｔｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９８７、第Ａ９巻、「酵素」、ＶＣＨ：Ｗ
ｅｉｎｈｅｉｍ）。あるいは、より複雑な形態の糖（糖蜜など）または糖精製の
他の副産物を培地に利用することができる。糖以外の他の化合物を、代替炭素源
として使用することができ、これには、アルコール（例えば、エタノールまたは
メタノール）、アルカン、糖アルコール、脂肪酸、および有機酸（例えば、酢酸
または乳酸）が含まれる。炭素源および培養における微生物によるその利用の総
説として、Ｕｌｌｍａｎｎ’ｓ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｉｎｄｕｓ
ｔｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９８７、第Ａ９巻、「酵素」、ＶＣＨ：Ｗ
ｅｉｎｈｅｉｍ、Ｓｔｏｐｐｏｋ，Ｅ．ａｎｄ Ｂｕｃｈｈｏｌｚ，Ｋ．、１９
９６、「発酵用の糖ベースの原材料」、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｒｅｈｍ
，Ｈ．Ｊ．ら編、第６巻、ＶＣＨ：Ｗｅｉｎｈｅｉｍ、５〜２９、Ｒｅｈｍ，Ｈ
．Ｊ．１９８０、「産業微生物学」、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、Ｂｅｒｌｉｎ、Ｂａｒ
ｔｈｏｌｏｍｅｗ，Ｗ．Ｈ．ａｎｄ Ｒｅｉｍａｎ，Ｈ．Ｂ．、１９７９、「発
酵法の経済学」、Ｐｅｐｐｌｅｒ，Ｈ．Ｊ．ａｎｄ Ｐｅｒｌｍａｎ，Ｄ．編、
Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第２版、第２巻、第１８章、Ａｃ
ａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、およびＫｏｃｋｏｖａ−Ｋｒａ
ｔａｃｈｖｉｌｏｖａ，Ａ．、１９８１、「産業微生物学の特徴」、Ｒｅｈｎ，
Ｈ．Ｊ．ａｎｄ Ｒｅｅｄ，Ｇ．編、「生物工学ハンドブック」、第１巻、第１
章、Ｖｅｒｌａｇ Ｃｈｅｍｉｅ：Ｗｅｉｎｈｅｉｍを参照のこと。
【００４３】 取り込み後、これらのエネルギー豊富な炭素分子を、主要な糖代謝経路の１つ
によって分解することができるように処理しなければならない。このような経路
により、その後ピルビン酸塩に変換することができる有用な分解生成物（リボー
ス−５−リン酸およびホスホエノイルピルビン酸など）が直接得られる。細菌に
おける糖代謝についての最も重要な３つの経路には、エムデン・マイエルホーフ
（ＥＭＰ）経路（解糖経路またはフルクトース二リン酸経路としても公知）、ヘ
キソセ一リン酸（ＨＭＰ）経路（ペントース経路またはペントースリン酸経路と
しても公知）、およびエントナー−ドウドロフ（ＥＤ）経路（総説として、Ｍｉ
ｃｈａｌ，Ｇ．、１９９９、「生化学的経路：生化学および分子生物学アトラス
」、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ ＹｏｒｋおよびＳｔｒｙｅｒ，Ｌ．、１９８８、Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第１３〜１９章、Ｆｒｅｅｍａｎ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋな
らびにその参考文献を参照のこと）が含まれる。
【００４４】 ＥＭＰ経路は、ヘキソース分子をピルビン酸塩に変換し、この過程では、２分
子のＡＴＰおよび２分子のＮＡＤＨを生成する。グルコース−１−リン酸（培地
から直接取り込むことができるか、グリコーゲン、デンプン、またはセルロース
から生成することができる）から出発して、グルコース分子はフルクトース−６
−リン酸に異性化し、リン酸化し、３炭素分子のグリセルアルデヒド−３−リン
酸に分解される。脱水素化、リン酸化、および連続的再構成後、ピルビン酸塩が
得られる。
【００４５】 ＨＭＰ経路は、グルコースを還元糖化物（ＮＡＤＰＨなど）に変換し、多数の
他の代謝経路の中間体および前駆体として必要なペントースおよびテトロースが
生成される。ＨＭＰ経路では、２つの連続したデヒドロゲナーゼ反応（２つのＮ
ＡＤＰＨ分も放出される）およびカルボキシル化工程によってグルコース−６−
リン酸がリブロース−５−リン酸に変換される。リブロース−５−リン酸を、キ
シルロース−５−リン酸およびリボース−５−リン酸に変換することもでき、前
者はグルコース−６−リン酸への一連の生化学的工程を受けてＥＭＰ経路に入る
ことができ、後者は、一般に、細胞内の他の生合成経路の中間体として利用され
る。
【００４６】 ＥＤ経路は、グルコースまたはグルコン酸塩から出発し、その後にリン酸化お
よび脱水されて２−デヒドロ−３−デオキシ−６−Ｐ−グルコン酸を形成する。
グルクロン酸塩およびガラクツロン酸塩を、より複雑な生化学経路によって２−
ヒドロ−３−デオキシ−６−Ｐ−グルコン酸に変換することもできる。次いで、
この生成分子は、グリセルアルデヒド−３−Ｐおよびピルビン酸塩に切断され、
グリセルアルデヒド−３−Ｐは、それ自体をピルビン酸塩に変換することができ
る。
【００４７】 ＥＭＰおよびＨＭＰ経路は多くの特徴（中間体および酵素を含む）を共有する
。ＥＭＰ経路により、最も大量のＡＴＰが得られるが、リボース−５−リン酸（
例えば、核酸生合成に重要な前駆体）もアミノ酸の生合成に重要なエリスロース
−４−リン酸も生成されない。したがって、グルコース利用にＥＭＰ経路のみし
か使用することができない微生物は、唯一の炭素源としてグルコースを含む単純
な培地では増殖することができない。これらを選好性生物といい、その増殖には
複合有機化合物（酵母抽出物など）の添加が必要である。
【００４８】 それに対して、ＨＭＰ経路では、核酸およびアミノ酸生合成に必要な全ての前
駆体が生成されるが、ＥＭＰ経路で生成されるＡＴＰエネルギー量はたった半分
である。ＨＭＰ経路では、生合成経路での酸化還元反応に使用することができる
ＮＡＤＰＨもまた生成される。しかし、ＨＭＰ経路はピルビン酸塩を直接生成し
ないので、これらの微生物はまた、ＥＭＰ経路の一部を保有しなければならない
。したがって、多数の微生物、特に選好性生物は、これらの両方の経路を保有す
るように進化したことは驚くべきことではない。
【００４９】 したがって、ＥＤ経路は細菌でのみ見出されている。この経路は、前駆体形成
とは逆方向でＨＭＰ経路と部分的に繋がっているにもかかわらず、ＥＤ経路は３
−ケトデオキシ−６−ホスホグルコン酸のアルドラーゼ切断によってピルビン酸
塩を形成する。ＥＤ経路は単独で存在し、主要な厳格な好気性微生物によって利
用されている。最終的な結果は、ＨＭＰ経路に類似しているが、炭素原子が前駆
分子の代わりにピルビン酸塩に変換された場合に限り１モルのＡＴＰを形成する
ことができる。
【００５０】 任意のこれらの経路で生成したピルビン酸分子を、クレブス回路（クエン酸回
路、クエン酸塩回路、またはトリカルボン酸回路（ＴＣＡ回路）としても公知）
を介してエネルギーに容易に変換することができる。この過程では、ピルビン酸
塩が最初に脱炭酸されて１モルのＮＡＤＨ、１モルのアセチルＣｏＡ、および１
盛るのＣＯ２が生成される。次いで、アセチルＣｏＡのアセチル基は４炭素単位
のオキサロ酢酸塩と反応してクエン酸（６炭素の有機酸）が形成される。脱水お
よび２つの付加的なＣＯ２分子が放出される。最終的に、オキサロ酢酸塩が再生
されてアセチル受容体として再度利用されて回路が完結する。ＴＣＡ回路中での
中間体の酸化中に放出された電子はＮＡＤ＋に輸送されてＮＡＤＨが得られる。
【００５１】 呼吸中、ＮＡＤＨ由来の電子は、分子の酸素または他の末端電子受容体に伝達
される。この過程は、呼吸鎖（組み込み膜タンパク質および膜会合タンパク質の
両方を含む電子伝達系）によって触媒される。この系は、以下の２つの基本機能
を利用する：第１に、電子供与体からの電子を電子受容体に伝達すること、第２
に、ＡＴＰの合成によって電子伝達の間に放出されるエネルギーを保存すること
。酸化還元酵素および電子伝達タンパク質のいくつかの型がこの過程に関与する
ことが公知であり、これには、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ、フラビン含有電子伝
達体、硫化鉄タンパク質、およびシトクロムが含まれる。ＮＡＤＨデヒドロゲナ
ーゼは、原形質膜の細胞質表面に存在し、ＮＡＤＨからフラビンタンパク質に水
素を伝達し、ＮＡＤＨから電子を受け取る。フラビンタンパク質は、電子の受容
および伝達によって交互に還元および酸化されるフラビン置換基を有する電子伝
達体の群である。以下の３つのフラビンがこれらの反応に関与することが公知で
ある：リボフラビン、フラビン−アデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）およびフラ
ビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）。硫化鉄タンパク質は、鉄および硫黄原子のク
ラスターを含み、ヘム基に結合しないが脱水および再水和反応に関与し得る。コ
ハク酸デヒドロゲナーゼおよびアコニターゼは、鉄−硫黄タンパク質の例である
。その鉄−硫黄複合体は、全体的な電子伝達鎖の一部として電子を受容および伝
達に利用されている。シトクロム鉄はポルフィリン環（ヘム）を含むタンパク質
である。酸化電位の異なる多数の異なるクラスのシトクロムが存在する。機能的
には、これらのシトクロムは、電子をより正の還元電位を漸増的に有する他のシ
トクロム伝達することができる経路を形成する。非タンパク質電子伝達体のさら
なるクラスは以下が公知である：脂溶性キノン（例えば、コエンザイムＱ）。こ
の分子はまた、水素原子受容体および電子供与体として利用される。
【００５２】 呼吸鎖の作用により、細胞膜を通過してプロトン勾配が得られ、それによりプ
ロトン推進力が得られる。この力は、細胞による膜貫通酵素（ＡＴＰシンターゼ
）を介したＡＴＰ合成に利用される。この酵素は、膜を通してＨ＋分子を輸送し
て、細胞内サブユニットの物理的な回転および付随的なＡＤＰのリン酸化によっ
てＡＴＰを形成させる多タンパク質複合体である（総説として、Ｆｉｌｌｉｎｇ
ａｍｅ，Ｒ．Ｈ．ａｎｄ Ｄｉｖａｌｌ，Ｓ．、１９９９、Ｎｏｖａｒｔｉｓ
Ｆｏｕｎｄ．Ｓｙｍｐ．、２２１、２１８〜２２９、２２９〜２３４を参照のこ
と）。
【００５３】 非ヘキソース炭素基質はまた、細胞の炭素源およびエネルギー源として利用す
ることができる。このような基質を、最初に糖新生経路においてヘキソース糖に
変換することができ、そこでグルコースが細胞によって最初に合成され、分解さ
れてエネルギーが得られる。この反応の出発物質はホスホエノイルピルビン酸塩
（ＰＥＰ）であり、これは解糖系の鍵となる中間体の１つである。ＰＥＰを、糖
以外の基質（酢酸など）から、またはオキサロ酢酸（これ自体がＴＣＡ回路の中
間体）の脱炭酸によって形成することができる。解糖経路の逆転によって（元の
解糖経路とは異なる酵素カスケードを利用）、グルコース−６−リン酸を形成可
能である。ピルビン酸塩のグルコースの変換には、６つの高エネルギーリン酸結
合を利用する必要があるが、解糖では、グルコースのピルビン酸への変換によっ
て２つのＡＴＰのみが得られる。しかし、グルコースの完全な酸化（解糖、ピル
ビン酸塩のアセチルＣｏＡへの変換、クエン酸回路、および酸化的リン酸化）に
よって、３６〜３８個のＡＴＰが生成され、糖新生中に経験した高エネルギーリ
ン酸結合の最終的な損失は、グルコースの酸化によって精製されるこのような高
エネルギー分子における全体的な獲得によって相殺される。
【００５４】 ＩＩＩ．本発明の要素および方法 本発明は、少なくとも一部は、Ｃ．グルタミカムにおける糖の有用な分解生成
物およびエネルギー（例えば、ＡＴＰ）への変換に関与するか他の過程（酸化的
リン酸化など）による有用なエネルギー豊富な分子（例えば、ＡＴＰ）の生成に
関連し得る、本明細書中でＳＭＰ核酸およびタンパク質分子と呼ばれる新規の分
子の発見に基づく。１つの実施形態では、ＳＭＰ分子は、コリネバクテリウム−
グルタミカムにおける過程（酸化的リン酸化など）による糖などの炭素化合物の
代謝およびエネルギー分子（例えば、ＡＴＰ）の生成に関与する。好ましい実施
形態では、Ｃ．グルタミカムにおける炭素代謝またはエネルギー生産に寄与する
本発明のＳＭＰ分子の活性は、この生物による所望の生成化学製品の生産に影響
を与える。特に好ましい実施形態では、本発明のＳＭＰ分子は、本発明のＳＭＰ
タンパク質が関連するＣ．グルタミカム代謝およびエネルギー経路を生産量、生
産、および／または生産効率を調整し、Ｃ．グルタミカムによる所望の精製化学
製品の生産量、生産、および／または生産効率を直接的または間接的に調整する
ように活性を調整する。
【００５５】 用語「ＳＭＰタンパク質」または「ＳＭＰポリペプチド」には、コリネバクテ
リウム−グルタミカムにおける過程（酸化的リン酸化など）による糖などの炭素
化合物の代謝およびエネルギー分子（例えば、ＡＴＰ）の生成に関連する機能を
果たすことができるタンパク質が含まれる。ＳＭＰタンパク質の例には、表１お
よび偶数の配列番号に記載のＳＭＰ遺伝子によってコードされるタンパク質が含
まれる。用語「ＳＭＰ遺伝子」または「ＳＭＰ核酸配列」には、コード領域およ
び対応する非翻訳５’および３’配列領域からなるＳＭＰタンパク質をコードす
る核酸配列が含まれる。ＳＭＰ遺伝子の例には、表１に記載の遺伝子が含まれる
。用語「生産」または「生産性」は、当該分野で認識されており、所与の時間お
よび所与の発酵体積（例えば、ｋｇ産物／時間／リットル）以内で形成された発
酵産物（例えば、所望の精製化学製品）が含まれる。用語「生産効率」には、達
成すべき特定の生産レベルに必要な時間（例えば、精製化学製品の特定の速度を
達成するための細胞が要する時間）が含まれる。用語「生産量」または「産物／
炭素量」は当該分野で認識されており、炭素源の産物（すなわち、精製化学製品
）への変換効率が含まれる。これは、一般に、例えばｋｇ産物／炭素源と記載さ
れる。化合物の生産量または生産の増加により、回収された分子の量または所与
の時間に対する所与の培養量中のその化合物の有用な回収分子の量が増加する。
用語「生合成」または「生合成経路」は当該分野で認識されており、多工程で且
つ高度に調節された過程における中間体化合物からの細胞による化合物、好まし
くは有機化合物の合成が含まれる。用語「分解」または「分解経路」は当該分野
で認識されており、多工程で且つ高度に調節された過程における分解産物（一般
に、より小さいか複雑でない分子）への細胞による化合物、好ましくは有機化合
物の破壊が含まれる。用語「分解生成物」は、当該分野で認識されており、化合
物の破壊生成物を含む。このような生成物は、それ自体が細胞による他の化合物
の生合成に必要な前駆体（出発点）または中間分子として有用である。用語「代
謝」は当該分野で認識されており、生物で行われた生化学反応の全てが含まれる
。特定の化合物の代謝（例えば、グリシンなどのアミノ酸の代謝）は、細胞にお
けるこの化合物に関する全ての生合成、改変、および分解経路を含む。
【００５６】 別の実施形態では、本発明のＳＭＰ分子は、Ｃ．グルタミカムなどの微生物に
おける精製化学製品などの所望の分子の産生を調整することができる。本発明の
ＳＭＰタンパク質の変更によりこのような変更タンパク質が組み込まれたＣ．グ
ルタミカム株由来の精製化学製品の生産量、生産、および／または生産効率が直
接影響を受け得る多数の機構が存在する。酸化的リン酸化による高エネルギー炭
素分子（糖など）の分解およびＮＡＤＨおよびＦＡＤＨ２などの化合物のより有
用な形態への変換により、多数の化合物が得られ、この化合物自体が望ましい精
製化学製品である（ピルビン酸塩、ＡＴＰ、ＮＡＤＨ、および多数の中間体糖化
合物など）。さらに、これらの代謝経路で得られたエネルギー分子（ＡＴＰなど
）および得られた等価物（ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨなど）を、細胞中でエネル
ギー的に不利な反応を駆動させるために利用する。このような不利な反応には、
多数の生成化学製品生合成経路が含まれる。細胞の特定の糖を利用する能力の改
良により（例えば、細胞の糖の分解およびエネルギーへの変換に関連する酵素を
コードする遺伝子の改良により）、不利であるが所望の代謝反応（所望の精製化
学製品の生合成）を利用可能なエネルギー量に増加させることができる。
【００５７】 本発明の１つまたは複数のＳＭＰ遺伝子の変異誘発により、Ｃ．グルタミカム
由来の１つまたは複数の所望の精製化学製品の生産に間接的に影響を与える活性
を変化させたＳＭＰタンパク質を得ることもできる。例えば、１つまたは複数の
糖の利用効率の増加（糖の有用なエネルギー分子への変換）または還元糖化物の
有用なエネルギー分子への変換効率の増加（例えば、酸化的リン酸化の効率また
はＡＴＰシンターゼ活性の改良による）により、細胞が利用可能な通常不利な代
謝過程を駆動するこれらの高エネルギー化合物量を増加させることができる。こ
れらの過程には、細胞壁の構築、転写、翻訳、および細胞の増殖および***に必
要な化合物（例えば、ヌクレオチド、アミノ酸、ビタミン、脂質など）の生合成
が含まれる（Ｌｅｎｇｅｌｅｒら、１９９９、「原核生物の生物学」、Ｔｈｉｅ
ｍｅ Ｖｅｒｌａｇ：Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ、８８〜１０９、９１３〜９１８、８
７５〜８９９）。これらの操作細胞の成長および増殖の改良により、大量培養で
の生存度の増加および***速度の改良が可能であり、比較的多数の細胞が発酵槽
培養で生存することができる。少なくとも多数の生細胞の存在により生産量、生
産、または生産効率を増加させて所望の精製化学製品を生産することができる。
さらに、糖代謝中に精製された多数の分解および中間体化合物は、細胞全体の生
合成経路の必要な前駆体および中間体である。例えば、多数のアミノ酸は、解糖
系またはＴＣＡ回路に通常起因する化合物から直接合成される（例えば、セリン
は３−ホスホグリセロール（解糖の中間体）から互生される）。このように、糖
の有用なエネルギー分子への変換効率の増加によって、有用な分解生成物の量が
増加する。
【００５８】 本発明の単離核酸配列は、ＡＴＣＣ １３０３２と命名されたアメリカンタイ
プカルチャーコレクションから利用可能なコリネバクテリウム−グルタミカムの
ゲノム内に含まれる。単離Ｃ．グルタミカム ＳＭＰ ＤＮＡのヌクレオチド配
列およびＣ．グルタミカム ＳＭＰタンパク質の推定アミノ酸配列を、配列表に
それぞれ奇数の配列番号および偶数の配列番号として示す。コリネバクテリウム
−グルタミカムにおける過程（酸化的リン酸化など）による糖などの炭素化合物
の代謝およびエネルギー分子（例えば、ＡＴＰ）の生成に関する機能を有するタ
ンパク質をコードする配列としてのこれらのヌクレオチド配列を分類および／ま
たは同定するコンピュータ分析を行った。
【００５９】 本発明はまた、本発明のアミノ酸配列（例えば、配列表の偶数の配列番号の配
列）に実質的に相補的なアミノ酸配列を有するタンパク質に関する。本明細書中
に記載のように、選択アミノ酸配列に実質的に相同的なアミノ酸配列を有するタ
ンパク質は、選択されたアミノ酸配列（例えば、選択されたアミノ酸配列全体）
に少なくとも５０％相同である。選択アミノ酸配列に実質的に相同的なアミノ酸
配列を有するタンパク質はまた、選択アミノ鎖配列に約５０〜６０％、好ましく
は少なくとも約６０〜７０％、より好ましくは少なくとも約７０〜８０％、８０
〜９０％、または９０〜９５％、最も好ましくは少なくとも約９６％、９７％、
９８％、９９％、またはそれ以上相同であり得る。
【００６０】 本発明のＳＭＰタンパク質またはその生物活性部分またはフラグメントは、コ
リネバクテリウム−グルタミカムにおける過程（酸化的リン酸化など）による糖
などの炭素化合物の代謝およびエネルギー分子（例えば、ＡＴＰ）の生成に関連
するか、表１に記載の１つまたは複数の活性を有し得る。
【００６１】 本発明の種々の態様を、以下の小節でさらに詳述する。
【００６２】 Ａ．単離核酸分子 本発明の１つの態様は、ＳＭＰポリペプチドまたはその生物活性部分をコード
する単離核酸分子ならびにＳＭＰコード核酸（例えば、ＳＭＰ ＤＮＡ）の同定
または増幅用のハイブリッド形成プローブまたはプライマーとしての使用に十分
な核酸フラグメントに関する。本明細書中に記載のように、用語「核酸分子」は
、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）およびＲＮＡ分子（例え
ば、ｍＲＮＡ）ならびにヌクレオチドアナログを使用して作製したＤＮＡまたは
ＲＮＡのアナログを含むことが意図される。この用語はまた、遺伝子の３’およ
び５’コード領域に存在する非翻訳配列（コード領域の５’末端から少なくとも
約１００ヌクレオチド上流の配列および遺伝子のコード領域の３’末端から少な
くとも約２０ヌクレオチド下流）を含む。核酸分子は一本鎖または二本鎖であり
得るが、二本鎖ＤＮＡが好ましい。「単離」核酸分子は、核酸の天然の供給源に
存在する他の核酸分子から分離した分子である。好ましくは、「単離」核酸は、
核酸が由来する生物のゲノムＤＮＡ中の核酸に天然に隣接する配列（すなわち、
核酸の５’および３’末端に存在する配列）を含まない。例えば、種々の実施形
態では、ＳＭＰ核酸分子は、核酸が由来する細胞（例えば、Ｃ．グルタミカム細
胞）のゲノムＤＮＡ中の核酸に天然に隣接する約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋ
ｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂ、または０．１ｋｂ未満のヌクレオチド配列を含み得る
。さらに、「単離」核酸分子（ＤＮＡ分子など）は、他の細胞物質、組換え技術
によって産生された場合は培養培地、または化学合成された場合は化学前駆体ま
たは他の化学物質を実質的に含み得ない。
【００６３】 本発明の核酸分子（例えば、配列表の奇数の配列番号のヌクレオチド配列を有
する核酸分子）またはその一部を、標準的な分子生物学技術および本明細書中で
得られた配列情報を使用して単離することができる。例えば、Ｃ．グルタミカム
ＳＭＰ ＤＮＡを、ハイブリッド形成プローブとして配列表の奇数の配列番号
の１つの全てまたは一部および標準的なハイブリッド形成技術（例えば、Ｓａｍ
ｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｈ，Ｅ．Ｆ．、ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．
、「分子クローニング：実験マニュアル」、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
、ＮＹ、１９８９に記載）を使用してＣ．グルタミカムライブラリーから単離す
ることができる。さらに、本発明の核酸配列（例えば、奇数の配列番号）の１つ
の全てまたは一部を含む核酸分子を、この配列に基づいて設計したオリゴヌクレ
オチドプライマーを使用したポリメラーゼ連鎖反応によって単離することができ
る（例えば、本発明の核酸配列（例えば、配列表の奇数の配列番号）の１つの全
てまたは一部を含む核酸分子を、この配列に基づいて設計したオリゴヌクレオチ
ドプライマーを使用したポリメラーゼ連鎖反応によって単離することができる）
。例えば、ｍＲＮＡを、正常な内皮細胞から単離することができ（例えば、Ｃｈ
ｉｒｇｗｉｎら、１９７９、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１８、５２９４〜５２
９９のグアニジニウム−チオシアン酸塩抽出法による）、ＤＮＡを逆転写酵素（
例えば、Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤから市販のＭｏｌｏｎｅ
ｙ ＭＬＶ逆転写酵素またはＳｅｉｋａｇａｋｕ Ａｍｅｒｉｃａ，Ｉｎｃ．、
Ｓｔ．Ｐｅｔｅｒｓｂｕｒｇ、ＦＬから市販のＡＭＶ逆転写酵素）を使用して調
製することができる。ポリメラーゼ連鎖反応増幅用の合成オリゴヌクレオチドプ
ライマーを、配列表に記載のヌクレオチド配列の１つに基づいて設計することが
できる。本発明の核酸を、標準的暗ＰＣＲ増幅技術によるテンプレートおよび適
切なオリゴヌクレオチドプライマーとしてｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを使用し
て増幅することができる。このようにして増幅した核酸を、適切なベクターにク
ローン化し、ＤＮＡ配列分析によって特徴づけることができる。さらに、ＳＭＰ
ヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドを、例えば、自動化ＤＮＡ合成
機を使用した標準的技術によって調製することができる。
【００６４】 好ましい実施形態では、本発明の単離核酸分子は、配列表に記載のヌクレオチ
ド配列の１つを含む。本発明の核酸配列は、配列表に記載のように、本発明のコ
リネバクテリウム−グルタミカム ＳＭＰ ＤＮＡに対応する。このＤＮＡは、
ＳＭＰタンパク質をコードする配列（すなわち、配列表のそれぞれ奇数の配列番
号の配列中に表示の「コード領域」）ならびに配列表のそれぞれ奇数の配列番号
に表示の５’非翻訳配列および３’非翻訳配列を含む。あるいは、核酸分子は、
配列表の核酸配列中の任意の配列のコード領域のみを含む。
【００６５】 本出願の目的のために、配列表に記載の各核酸およびアミノ酸配列は、記号表
示「ＲＸＡ」、「ＲＸＮ」、または「ＲＸＳ」のあとに５桁の数字を有するＲＸ
Ａ、ＲＸＮ、またはＲＸＳ識別番号（すなわち、ＲＸＡ０１６２６、ＲＸＮ００
０４３、またはＲＸＳ０７３５）ことが理解される。各核酸配列は、以下の３つ
までの部分を含む：５’上流領域、コード領域、および下流領域。混乱をなくす
ために、これらのそれぞれ３つの領域を同一のＲＸＡ、ＲＸＮ、またはＲＸＳ記
号表示で識別する。詳述「配列表の奇数番号の配列の１つ」は、異なるＲＸＡ、
ＲＸＮ、またはＲＸＳ記号表示によって区別することもできる配列表の任意の核
酸配列をいう。これらの各配列のコード領域は、対応するアミノ酸配列に翻訳さ
れ、これはまた、偶数の配列番号（配列表に対応する核酸配列の直後）として記
載されている。例えば、ＲＸＡ０２７３５のコード領域を配列番号１に記載し、
これがコードするアミノ酸配列を配列番号２に示す。本発明の核酸分子の配列は
、容易に相関することができるようにコードされるアミノ酸分子と同一のＲＸＡ
、ＲＸＮ、またはＲＸＳ記号表示によって識別される。例えば、ＲＸＡ０００４
２と表示されたアミノ酸配列は、核酸分子ＲＸＡ０００４２のヌクレオチド配列
のコード領域の翻訳物であり、ＲＸＡ０００４３と表示されたアミノ酸配列は、
核酸分子配列ＲＸＡ０００４３のコード領域の翻訳物である。本発明のＲＸＡ、
ＲＸＮ、またはＲＸＳヌクレオチドおよびアミノ酸配列と割り当てた配列番号と
の間の対応を、表１に示す。
【００６６】 本発明のいくつかの遺伝子は、「表示遺伝子（Ｆ−ｄｅｓｉｇｎａｔｅｄ ｇ
ｅｎｅ）」である。Ｆ表示遺伝子には、ＲＸＡ記号表示の前に「Ｆ」を有する表
１に記載の遺伝子が含まれる。例えば、表１に「Ｆ ＲＸＡ０１３１２」と表示
の配列番号１１は、配列番号２９、３３、および３９のＦ表示遺伝子（それぞれ
表１に「Ｆ ＲＸＡ０２８０３」、「Ｆ ＲＸＡ０２８５４」、および「Ｆ Ｒ
ＸＡ０１３６５」として表示）である。
【００６７】 １つの実施形態では、本発明の核酸分子は、表２に集めた核酸分子を含むこと
を意図しない。ｄａｐＤ遺伝子の場合、この遺伝子の配列は、Ｗｅｈｒｍａｎｎ
，Ａ．ら、１９９８、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８０、（１２）、３１５９〜
３１６５で公開されていた。しかし、本出願の発明で得られた配列は、公開され
たものより有意に長い。公開された変形形態は不正確な開始コドンに依存するの
で実際のコード領域のフラグメントのみを示すと考えられる。
【００６８】 別の好ましい実施形態では、本発明の単離核酸分子は、本発明のヌクレオチド
配列（例えば、配列表の奇数の配列番号の配列）の１つまたはその一部の相補物
である核酸分子を含む。本発明のヌクレオチド配列の１つに相補的な核酸分子は
、本発明のヌクレオチド配列の１つとハイブリッド形成して安定な二重らせんを
形成することができるように配列表のヌクレオチド配列（例えば、奇数の配列番
号の配列）の１つに十分に相補的である分子である。
【００６９】 さらに別の好ましい実施形態では、本発明の単離核酸分子は、本発明のヌクレ
オチド配列（例えば、配列表の奇数の配列番号の配列）に少なくとも約５０％、
５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、
または６０％、好ましくは少なくとも６１％、６２％、６３％、６４％、６５％
、６６％、６７％、６８％、６９％、または７０％、より好ましくは少なくとも
７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、
または８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８
８％、８９％、または９０％、または９１％、９２％、９３％、９４％、更によ
り好ましくは少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそ
れ以上相同なヌクレオチド配列またはその一部を含む。上記範囲の中間の範囲お
よび同一値（例えば、７０〜９０％同一または８０〜９５％同一）はまた、本発
明に含まれることが意図される。例えば、上限および／下限として上記の任意の
値の組み合わせを使用した同一値の範囲が含まれることが意図される。さらに好
ましい実施形態では、本発明の単離核酸分子は、本発明のヌクレオチド配列の１
つまたはその一部とハイブリッド形成する（例えば、ストリンジェントな条件下
でハイブリッド形成する）ヌクレオチド配列を含む。
【００７０】 さらに、本発明の核酸分子は、配列表の奇数の配列番号の１つの配列領域をコ
ードする部分のみ（例えば、ＳＭＰタンパク質の生物活性部分をコードするプロ
ーブ、プライマー、またはフラグメントとして使用することができるフラグメン
ト）を含み得る。Ｃ．グルタミカム由来のＳＭＰ遺伝子のクローニングから同定
されたヌクレオチド配列により、他の細胞型および生物のＳＭＰホモログならび
にコリネバクテリアまたは関連種由来のＳＭＰホモログの同定および／またはク
ローニング用に設計されたプローブおよびプライマーを作製可能である。プロー
ブ／プライマーは、典型的には、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを含む
。オリゴヌクレオチドは、典型的には、ストリンジェントな条件下で、本発明の
ヌクレオチド配列（例えば、配列表の奇数の配列番号の配列）の１つのセンス鎖
、これらの配列のアンチセンス配列、または天然に存在するその変異体の少なく
とも約１２個、好ましくは少なくとも約２５個、より好ましくは少なくとも約４
０、５０、または７５個の連続したヌクレオチドとハイブリッド形成するヌクレ
オチド配列領域を含む。本発明のヌクレオチド配列に基づくプライマーをＰＣＲ
反応で使用して、ＳＭＰホモログをクローン化することができる。ＳＭＰヌクレ
オチド配列に基づいたプローブを使用して、同一または相同なタンパク質をコー
ドする転写物またはゲノム配列を検出することができる。好ましい実施形態では
、プローブは、これに結合した標識基をさらに含み、例えば、標識基は放射性同
位元素、蛍光化合物、酵素、または酵素補因子であり得る。このようなプローブ
を、細胞サンプル中のＳＭＰコード核酸レベルの測定（例えば、ＳＭＰ ｍＲＮ
Ａレベルの検出またはゲノムＳＭＰ遺伝子が変異または欠失しているかどうかの
同定）などによってＳＭＰタンパク質を誤発現する細胞の同定用の診断試験キッ
トの一部として使用することができる。
【００７１】 １つの実施形態では、本発明の核酸分子は、タンパク質またはその一部がコリ
ネバクテリウム−グルタミカムにおける過程（酸化的リン酸化など）による糖な
どの炭素化合物の代謝およびエネルギー分子（例えば、ＡＴＰ）の生成に関連す
る機能を果たす能力を維持するように本発明のアミノ酸配列（例えば、配列表の
偶数の配列番号の配列）に十分に相同的なアミノ酸配列含むタンパク質またはそ
の一部をコードする。本明細書中で使用されるように、「十分に相補的な」は、
タンパク質またはその一部がコリネバクテリウム−グルタミカムにおける過程（
酸化的リン酸化など）による糖などの炭素化合物の代謝およびエネルギー分子（
例えば、ＡＴＰ）の生成に関連する機能を果たすことができるように本発明のア
ミノ酸配列に同一または等価な最小数のアミノ酸残基（例えば、配列表の偶数の
配列番号の１つの配列中のアミノ酸残基として類似の側鎖を有するアミノ酸残基
）を含むアミノ酸配列を有するタンパク質またはその一部をいう。本明細書中に
記載のように、このような糖代謝経路またはエネルギー生産系のタンパク質メン
バーは、１つまたは複数の精製化学製品生産および分泌に役割をはたす。このよ
うな活性の例はまた、本明細書中に記載されている。したがって、「ＳＭＰタン
パク質の機能」は、１つまたは複数の精製化学製品の生産量、生産、および／ま
たは生産効率に直接的または間接的に寄与する。ＳＭＰタンパク質活性の例は、
表１に記載されている。
【００７２】 別の実施形態では、タンパク質は、本発明の全アミノ酸配列（例えば、配列表
の偶数の配列番号の配列）に約５０〜６０％、好ましくは少なくとも約６０〜７
０％、より好ましくは少なくとも約７０〜８０％、８０〜９０％、または９０〜
９５％、最も好ましくは少なくとも約９６％、９７％、９８％、９９％、または
それ以上相同である。
【００７３】 本発明のＳＭＰ核酸分子によってコードされるタンパク質部分は、ＳＭＰタン
パク質の１つの生物活性部分であることが好ましい。本明細書中で使用されるよ
うに、用語「ＳＭＰタンパク質の生物活性部分」は、Ｃ．グルタミカムにおける
糖などの炭素化合物の代謝またはエネルギー生産経路に関するか、表１に記載の
活性を有するＳＭＰタンパク質の一部（例えば、ドメイン／モチーフ）を含むこ
とが意図される。ＳＭＰタンパク質またはその生物活性部分が・Ｃ．グルタミカ
ムにおける炭素化合物の代謝またはエネルギー豊富な分子の生成に関連し得るか
どうかを同定するために、酵素活性アッセイをおこなうことができる。例示の実
施例８に詳述のように、このようなアッセイ法は当業者に周知である。
【００７４】 ＳＭＰタンパク質の生物活性部分をコードするさらなる核酸フラグメントを、
本発明のアミノ酸配列（配列表の偶数の配列番号の配列）の１つの一部の同定、
ＳＭＰタンパク質またはペプチドのコード部分の発現（ｉｎ ｖｉｔｒｏでの組
換え発現による）、およびＳＭＰタンパク質またはペプチドのコード部分の活性
の評価によって調製することができる。
【００７５】 本発明は、さらに、遺伝コードの縮重のために本発明のヌクレオチド配列（配
列表の奇数の配列番号の配列）の１つ（およびその一部）と異なるが本発明に記
載のヌクレオチド配列によってコードされるものと同一のＳＭＰタンパク質をコ
ードする核酸分子を含む。別の実施形態では、本発明の単離核酸分子は、配列表
に記載のアミノ酸配列（偶数の配列番号）を有するタンパク質をコードするヌク
レオチド配列を有する。なおさらなる実施形態では、本発明の核酸分子は、本発
明のアミノ酸配列（配列表の奇数の配列番号に記載の読み取り枠によってコード
される）に実施的に相同な全長Ｃ．グルタミカムタンパク質をコードする。
【００７６】 １つの実施形態では、本発明の配列は本発明の以前に利用可能であった当該分
野の配列（表２または表４に記載のＧｅｎｂａｎｋ配列など）を含むことを意味
すると当業者に理解される。１つの実施形態では、本発明は、先行技術の配列（
例えば、表２または表４に記載のＧｅｎｂａｎｋ配列（またはこのような配列に
よってコードされるタンパク質））よりも高い本発明のヌクレオチドまたはアミ
ノ酸配列に対する同一％を有するヌクレオチドよび核酸配列を含む。例えば、本
発明は、ＲＸＡ０００１４（配列番号４１）と記号表示されたヌクレオチド配列
に％を超えるおよび／または少なくとも５８％同一なヌクレオチド配列、ＲＸＡ
００１９５（配列番号３９９）と記号表示されたヌクレオチド配列に４１％を超
えるおよび／または少なくとも４１％同一なヌクレオチド配列、およびＲＸＡ０
０１９６（配列番号４０１）と記号表示されたヌクレオチド配列に４２％を超え
るおよび／または少なくとも３５％同一なヌクレオチド配列を含む。当業者は、
所与の配列についてそれぞれ３つの上位のヒットについて表４に記載のＧＡＰ計
算同一％スコアの試験および１００％から最も高いＧＡＰ計算同一％の引き算に
よって本発明の任意の所与の配列の同一％のより低い閾値を計算することができ
る。当業者はまた、このようにして計算したより低い閾値より高い同一％（例え
ば、少なくとも５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５
７％、５８％、５９％、または６０％、好ましくは少なくとも６１％、６２％、
６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、または７０％、よ
り好ましくは少なくとも７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７
７％、７８％、７９％、または８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５
％、８６％、８７％、８８％、８９％、または９０％、または９１％、９２％、
９３％、９４％、更により好ましくは少なくとも約９５％、９６％、９７％、９
８％、９９％、またはそれ以上同一）を有する核酸またはアミノ酸配列もまた本
発明に含まれることを認識する。
【００７７】 奇数の配列番号のとして配列表に記載のＣ．グルタミカム ＳＭＰヌクレオチ
ドに加えて、ＳＭＰタンパク質のアミノ酸配列を変化させるＤＮＡ配列多形が集
団（例えば、Ｃ．グルタミカム）内に存在し得ることが当業者に認識される。Ｓ
ＭＰ遺伝子におけるこのような遺伝子多形は、天然の変動による集団内の個体間
に存在し得る。本明細書中で使用される、用語「遺伝子」および「組換え遺伝子
」は、ＳＭＰタンパク質、好ましくはＣ．グルタミカム ＳＭＰタンパク質をコ
ードする読み取り枠を含む核酸分子をいう。このような天然の変動により、典型
的には、ＳＭＰ遺伝子のヌクレオチド配列が１〜５％変動し得る。天然の変動の
結果であり、ＳＭＰタンパク質の機能活性が変化していない任意および全てのこ
のようなヌクレオチドの変動および得られたＳＭＰのアミノ酸多形は、本発明の
範囲内であることが意図される。
【００７８】 天然の変異型および本発明のＣ．グルタミカム ＳＭＰ ＤＮＡの非Ｃ．グル
タミカムホモログに対応する核酸分子を、ストリンジェントなハイブリッド形成
条件下で標準的なハイブリッド形成技術のハイブリッド形成プローブとして、Ｃ
．グルタミカム ＤＮＡまたはその一部を使用して本明細書中に開示のＣ．グル
タミカム ＳＭＰ核酸に対する相同性に基づいて単離することができる。したが
って、別の態様では、本発明の単離核酸分子は、少なくとも１５ヌクレオチド長
であり、ストリンジェントな条件下で配列表の奇数の配列番号のヌクレオチド配
列を含む核酸分子とハイブリッド形成する。他の実施形態では、核酸は、少なく
とも３０、５０、１００、２５０、またはそれ以上のヌクレオチド長である。本
明細書中で使用される、用語「ストリンジェントな条件下でハイブリッド形成す
る」は、典型的には互いに少なくとも６０％相同なヌクレオチド配列が互いにハ
イブリッド結合したままであるハイブリッド形成および洗浄条件を記載すること
が意図される。好ましくは、互いに少なくとも約６５％、より好ましくは少なく
とも約７０％、更により好ましくは少なくとも約７５％、またはそれ以上の条件
の相同性で典型的に互いにハイブリッド形成を維持する。このようなストリンジ
ェントな条件は、当業者に公知であり、「現代の分子生物学プロトコール」、Ｊ
ｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．、１９８９、６．３．１〜６．３．６
に見出すことができる。ストリンジェントな条件の好ましい非限定的な例は、４
５℃での６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でのハイブリッ
ド形成後の５０〜６５℃での０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での１回または
複数回の洗浄である。好ましくは、ストリンジェントな条件下で本発明のヌクレ
オチド配列とハイブリッド形成する本発明の単離核酸分子は、天然に存在する核
酸分子に対応する。本明細書中で使用される、「天然に存在する」核酸分子は、
自然に発生するヌクレチド配列を有するＲＮＡまたはＤＮＡ分子をいう（例えば
天然のタンパク質をコードする）。１つの実施形態では、核酸は、天然のＣ．グ
ルタミカム ＳＭＰタンパク質をコードする。
【００７９】 集団中に存在し得るＳＭＰ配列の天然に存在する変異型に加えて、当業者は、
変化により変異による本発明のヌクレオチド配列が挿入され、それによりＳＭＰ
タンパク質の機能的活性を変化させることなくコードされたＳＭＰタンパク質の
アミノ酸配列を変化させることができることをさらに認識する。本発明のヌクレ
オチド配列中で、例えば、「非必須」アミノ酸残基でアミノ酸を置換させるヌク
レオチド置換を行うことができる。「非必須」アミノ酸残基は、ＳＭＰタンパク
質活性を変化させることなくＳＭＰタンパク質（例えば、配列表の偶数の配列番
号）１つの野生型配列から変化させることができる残基であるが、「必須」アミ
ノ酸残基はＳＭＰタンパク質活性に必要である。しかし、他のアミノ酸残基（例
えば、ＳＭＰ活性を有するドメイン中で変換されないか半変換のみされる残基）
は活性に必須ではないので、ＳＭＰ活性を変化させない変化に感受性を示すこと
もあり得る。
【００８０】 したがって、本発明の別の態様は、ＳＭＰ活性に必須ではないアミノ酸残基の
変化を含むＳＭＰタンパク質をコードする核酸分子に関する。このようなタンパ
ク質は、本明細書中に記載のＳＭＰ活性の少なくとも１つを依然として保持する
配列表の偶数の配列番号の配列と核酸配列が異なる。１つの実施形態では、単離
核酸分子は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、このタンパク質
は、本発明のアミノ酸配列に少なくとも約５０％相同なアミノ酸配列を含み、Ｃ
．グルタミカムにおける糖などの炭素化合物の代謝または高エネルギー化合物の
生合成に関連し得るか、表１に記載の１つまたは複数の活性を有するアミノ酸配
列を含む。好ましくは、核酸分子にコードされるタンパク質は、配列表の奇数の
配列番号の１つのアミノ酸配列に約５０〜６０％相同、より好ましくはこれらの
配列に少なくとも約６０〜７０％相同、より好ましくはこれらの配列に少なくと
も約７０〜８０％、８０〜９０％、または９０〜９５％相同、最も好ましくは本
発明のアミノ酸配列の１つに少なくとも約９６％、９７％、９８％、９９％、ま
たはそれ以上相同である。
【００８１】 ２つのアミノ酸配列（本発明のアミノ酸の１つまたはその変異体）または２つ
の核酸の相同％を同定するために、配列を最適に比較できるように整列させる（
例えば、他のタンパク質または核酸と最適に整列させるために１つのタンパク質
または核酸配列にギャップを挿入することができる）。対応するアミノ酸の位置
またはヌクレオチドの位置でアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。１つ
の配列（本発明のアミノ酸配列の１つ）中の位置は、他の配列（例えば、アミノ
酸配列の変異形態）中の対応する位置と同一のアミノ酸残基またはヌクレオチド
で占められている場合、分子はその位置で相同である（すなわち、本明細書中で
使用される、アミノ酸または核酸の「相同性」はアミノ酸または核酸の「同一性
」と等価である）。２つの配列間の相同％は、同一の位置での配列の共有数の関
数である（すなわち、相同％＝同一の位置数／全位置数×１００）。
【００８２】 本発明のタンパク質配列に相同なＳＭＰタンパク質（例えば、配列表の偶数の
配列番号の配列）をコードする単離核酸分子を、１つまたは複数のアミノ酸置換
、付加、または欠失がコードタンパク質に移入されるような１つまたは複数のヌ
クレオチドの置換、付加、または欠失の本発明のヌクレオチド配列への移入によ
って作製することができる。変異を、標準的な技術（部位特異的変異誘発および
ＰＣＲ媒介変異誘発など）によって本発明のヌクレオチド配列の１つに移入する
ことができる。好ましくは、１つまたは複数の推定非必須アミノ酸残基での保存
的アミノ酸置換を行う。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の側鎖
を有するアミノ酸残基と置換されたものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残
基ファミリーは、当該分野で定義されている。これらのファミリーには、塩基性
側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパ
ラギン酸、グルタミン酸）、無電荷極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン
、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例
えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニ
ン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン
、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、
トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が含まれる。したがって、ＳＭ
Ｐタンパク質における推定非必須アミノ酸残基を、同一の側鎖ファミリー由来の
別のアミノ酸残基と置換することが好ましい。あるいは、変異を、飽和変異誘発
などによってはコード配列の全てまたは一部に無作為に移入することができ、得
られた変異体は本明細書中に記載のＳＭＰ活性についてのスクリーニングしてＳ
ＭＰ活性を維持している変異体を同定することができる。配列表の奇数の配列番
号１つのヌクレオチド配列の変異誘発後、コードタンパク質を組換え発現させる
ことができ、タンパク質活性を、例えば本明細書中に記載のアッセイ（例示の実
施例８を参照のこと）を使用して同定することができる。
【００８３】 上記のＳＭＰタンパク質をコードする核酸分子に加えて、本発明の別の態様は
、アンチセンスである単離核酸分子に関する。「アンチセンス」核酸は、例えば
二本鎖ＤＮＡ分子のコード鎖に相補的またはｍＲＮＡ配列に相補的なタンパク質
をコードする「センス」核酸に相補的なヌクレオチド配列を含む。したがって、
アンチセンス核酸はセンス核酸に水素結合することができる。アンチセンス核酸
は、全ＳＭＰコード鎖に相補的であっても、その一部のみに相補的であっても良
い。１つの実施形態では、アンチセンス核酸分子は、ＳＭＰタンパク質をコード
するヌクレオチド配列のコード鎖の「コード領域」に対してアンチセンスである
。用語「コード領域」は、アミノ酸残基に翻訳されたコドンを含むヌクレオチド
配列（例えば、配列番号３（ＲＸＡ０１６２６）の全コード領域は１〜３４５の
ヌクレオチドを含む）をいう。別の実施形態では、アンチセンス核酸分子は、Ｓ
ＭＰをコードするヌクレオチドのコード鎖の「非コード領域」に対してアンチセ
ンスである。用語「非コード領域」は、アミノ酸に翻訳されないコード領域に隣
接した５’および３’配列をいう（すなわち、５’および３’非翻訳領域ともい
う）。
【００８４】 本明細書中に開示のＳＭＰをコードするコード鎖配列（例えば、配列表の奇数
の配列番号として記載の配列）を考慮すれば、本発明のアンチセンス核酸を、Ｗ
ａｔｓｏｎ ａｎｄ Ｃｒｉｃｋ塩基対合にしたがって設計することができる。
アンチセンス核酸分子は、ＳＭＰ ｍＲＮＡの全コード領域に相補的であり得る
が、ＳＭＰ ｍＲＮＡのコードまたは非コード領域の一部のみに対してアンチセ
ンスであるオリゴヌクレオチドであることがより好ましい。例えば、アンチセン
スオリゴヌクレオチドは、ＳＭＰ ｍＲＮＡの翻訳開始部位周囲の領域に相補的
であり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、約５、１０、１５、
２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０ヌクレオチド長であり得る。
本発明のアンチセンス核酸を、当該分野で公知の手順を使用した化学合成および
酵素ライゲーション反応を使用して構築することができる。例えば、アンチセン
ス核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）を、天然に存在するヌクレ
オチドまたは分子の生物学的安定性を増加させるかアンチセンス核酸とセンス核
酸との間で形成された二重らせんの物理的安定性を増加させるように設計された
種々の改変ヌクレオチドを使用して化学合成することができる（例えば、ホスホ
ロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドを使用することができる
）。アンチセンス核酸を作製するために使用することができる改変ヌクレオチド
の例には、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、
５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５
−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメ
チル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒド
ロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルケオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニル
アデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアミ
ン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチ
ルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウ
ラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、βーＤ−マンノシルケ
オシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２
−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ
）、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、ケオシン、２−チオシトシン、５−
メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチル
ウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢
酸（ｖ）、５−メチルー２−チオウラシル、３−（３−アミノー３−Ｎ−２−カ
ルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリン
が含まれる。あるいは、核酸がアンチセンス方向でサブクローン化される発現ベ
クターを使用して、アンチセンス核酸を生物学的に産生させることができる（す
なわち、挿入核酸から転写されたＲＮＡは目的の標的核酸に対してアンチセンス
方向である（以下の小節にさらに記載する））。
【００８５】 本発明のアンチセンス核酸は、典型的には、ＳＭＰタンパク質をコードする細
胞ｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡとハイブリッド形成するかそれに結合し
てタンパク質発現を阻害する（例えば、転写および／または翻訳の阻害による）
ように、細胞に投与されるかｉｎ ｓｉｔｕで作製される。ハイブリッド形成は
、従来のヌクレオチド相補性によって、または例えばＤＮＡ二重らせんに結合す
るアンチセンス核酸分子の場合、二重らせんの主要な溝における特異的相互作用
によって安定な二本鎖を形成することであり得る。アンチセンス分子を、例えば
アンチセンス核酸分子の細胞表面レセプターまたは抗原に結合するペプチドまた
は抗体への連結によって選択された細胞表面上に発現されるレセプターまたは抗
原に特異的に結合するように改変することができる。アンチセンス核酸分子を、
本明細書中に記載のベクターを使用して細部に送達させることもできる。アンチ
センス分子の十分な細胞内濃度を得るために、原核生物、ウイルス、または真核
生物強力プロモーターの制御下でアンチセンス核酸分子が存在するベクター構築
物が好ましい。
【００８６】 さらに別の実施形態では、本発明のアンチセンス核酸分子は、α−アノマー核
酸分子である。α−アノマー核酸分子は、通常β単位と対照的に鎖が互いに並行
である相補ＲＮＡとの特異的二本鎖ハイブリッドを形成する（Ｇａｕｌｔｉｅｒ
ら、１９８７、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．、１５、６６２５〜６６
４１）。アンチセンス核酸分子はまた、２’−ｏ−メチルリボヌクレオチド（Ｉ
ｎｏｕｅら、１９８７、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．、１５、１６３
１〜６１４８）またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡアナログ（Ｉｎｏｕｅら、１９８７
、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．、２１５、３２７〜３３０）を含み得る。
【００８７】 さらに別の実施形態では、本発明のアンチセンス核酸は、リボザイムである。
リボザイムは、相補領域を有する一本鎖核酸（ｍＲＮＡなど）を切断することが
できるリボヌクレアーゼ活性を有する触媒ＲＮＡ分子である。したがって、リボ
ザイム（例えば、ヒト化リボザイム（Ｈａｓｅｌｇｏｆｆ ａｎｄ Ｇｅｒｌａ
ｃｈ、１９８８、Ｎａｔｕｒｅ、３３４、５８５〜５９１に記載））を使用して
ＳＭＰ ｍＲＮＡ転写物を触媒反応で切断して、ＳＭＰ ｍＲＮＡの翻訳を阻害
することができる。ＳＭＰコード核酸に特異性を有するリボザイムを、本明細書
中に記載のＳＭＰ ＤＮＡ分子のヌクレオチド配列（すなわち、配列番号３（Ｒ
ＸＡ０１６２６））に基づいて設計することができる。例えば、活性部位のヌク
レオチド配列がＳＭＰコードｍＲＮＡ中で切断されるべきヌクレオチド配列に相
補的なＴｅｔｒａｈｙｍｅｎａ Ｌ−１９ ＩＶＳ ＲＮＡの誘導体を構築する
ことができる。例えば、Ｃｅｃｈらに付与された米国特許第４，９８７，０７１
号およびＣｅｃｈらに付与された同第５，１１６，７４２号を参照のこと。ある
いは、ＳＭＰ ｍＲＮＡを使用して、ＲＮＡ分子プール由来の特異的リボヌクレ
アーゼ活性を有する触媒ＲＮＡを選択することができる。例えば、Ｂａｒｔｅｌ
，Ｄ．ａｎｄ Ｓｚｏｓｔａｋ，Ｊ．Ｗ．、１９９３、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６１
、１４１１〜１４１８を参照のこと。
【００８８】 あるいは、ＳＭＰ遺伝子発現を、ＳＭＰヌクレオチド配列の調節領域（例えば
、ＳＭＰプロモーターおよび／またはエンハンサー）に相補的なヌクレオチド配
列の標的によって阻害して、標的細胞中でＳＭＰ遺伝子の転写を阻害する三重ら
せん構造を形成することができる。一般に、Ｈｅｌｅｎｅ，Ｃ．、１９９１、Ａ
ｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ．、６（６）、５６９〜８４、Ｈｅｌｅ
ｎｅ，Ｃ．ら、１９９２、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、６６０、２７
〜３６、およびＭａｈｅｒ，Ｌ．Ｊ．、１９９２、Ｂｉｏａｓｓａｙｓ、１４（
１２）、８０７〜１５を参照のこと。
【００８９】 Ｂ．組換え発現ベクターおよび宿主細胞 本発明の別の態様は、ＳＭＰタンパク質（またはその一部）をコードする核酸
を含むベクター、好ましくは発現ベクターに関する。本明細書中で使用される、
用語「ベクター」は、連結している別の核酸を輸送することができる核酸分子を
いう。ベクターの１つの型は「プラスミド」であり、さらなるセグメントをライ
ゲートすることができる環状二本鎖ＤＮＡループをいう。別の型のベクターは、
さらなるＤＮＡセグメントをウイルスゲノムにライゲートすることができるウイ
ルスベクターである。一定のベクターは、移入された宿主細胞中の自律複製する
ことができる（例えば、細菌の複製起点を含む細菌ベクターおよびエピソーム哺
乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は
、宿主細胞への移入の際に宿主細胞ゲノムに取り込まれて、宿主ゲノムと共に複
製される。さらに、一定のベクターは、作動可能に連結される遺伝子発現を指向
することができる。このようなベクターを、本明細書中では「発現ベクター」と
いう。一般に、組家ＤＮＡ技術で利用される発現ベクターは、しばしばプラスミ
ドの形態である。プラスミドが最も一般的なベクターの形態であるので、本明細
書では、「プラスミド」および「ベクター」を交換可能に使用することができる
。しかし、本発明は、等価の機能を果たすウイルスベクターなどのこのような発
現ベクターの他の形態（例えば、複製欠陥レトロウイルス、アデノウイルス、お
よびアデノ随伴ウイルス）を含むことを意図する。
【００９０】 本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞中での核酸の発現に適切な形態で本
発明の核酸を含み、これは、組換え発現ベクターには、発現されるべき核酸配列
に作動可能に連結された発現用に使用される宿主細胞に基づいて選択された１つ
または複数の調節配列が含まれることを意味する。組換え発現ベクター内で「作
動可能に連結された」は、目的のヌクレオチド配列が調節配列にヌクレオチド配
列を発現させる様式で連結されていることを意味することが意図される（例えば
、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳系中、またはベクターが宿主細胞内に移入されて
いる場合は宿主細胞中）。用語「調節配列」は、プロモーター、エンハンサー、
および他の発現調節エレメント（例えば、ポリアデニル化部位）を含むことが意
図される。このような調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ、「遺伝子発現技術
」、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、１９９０に記載されている。調節配
列には、多数の宿主細胞型でのヌクレオチド配列の構成的発現を指向する配列お
よび一定の宿主細胞中でのみヌクレオチド配列の発現を指向する配列が含まれる
。好ましい調節配列は、例えば、細菌中で使用されることが好ましいプロモータ
ー（ｃｏｓ−、ｔａｃ−、ｔｒｐ−、ｔｅｔ−、ｔｒｐ−ｔｅｔ−、ｌｐｐ−、
ｌａｃ−、ｌｐｐ−ｌａｃ−、ｌａｃＩｑ−、Ｔ７−、Ｔ５−、Ｔ３−、ｇａｌ
−、ｔｒｃ−、ａｒａ−、ＳＰ６−、ａｒｎｙ、ＳＰＯ２、λ−ＰＲ−、または
λＰＬなど）である。さらなる調節配列は、例えば、酵母および真菌由来のプロ
モーター（ＡＤＣ１、Ｍｆα、ＡＣ、Ｐ−６０、ＣＹＣ１、ＧＡＰＤＨ、ＴＥＦ
、ｒｐ２８、ＡＤＨなど）、植物由来のプロモーター（ＣａＭＶ／３５Ｓ、ＳＳ
Ｕ、ＯＣＳ、ｌｉｂ４、ｕｓｐ、ＳＴＬＳ１、Ｂ３３、ｎｏｓ、またはユビキチ
ンもしくはファゼオリンプロモーターなど）である。人工プロモーターも使用可
能である。発現ベクターの設計は形質転換すべき宿主細胞の選択、所望のタンパ
ク質発現レベルなどの要因に依存し得ることが当業者に認識される。本発明の発
現ベクターを、宿主細胞に移入して、本明細書中に記載の核酸によってコードさ
れる融合タンパク質またはペプチド（例えば、ＳＭＰタンパク質、ＳＭＰタンパ
ク質の変異形態、融合タンパク質など）を含むタンパク質またはペプチドを産生
させることができる。
【００９１】 本発明の組換え発現ベクターを、原核細胞または真核細胞中でのＳＭＰタンパ
ク質発現用に設計することができる。例えば、ＳＭＰ遺伝子を、Ｃ．グルタミカ
ムなどの細菌細胞、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを使用）、酵母お
よび他の真菌細胞（Ｒｏｍａｎｏｓ，Ｍ．Ａ．ら、１９９２、「酵母での外来遺
伝子の発現：総説」、Ｙｅａｓｔ、８、４２３〜４８８、ｖａｎ ｄｅｎ Ｈｏ
ｎｄｅｌ．Ｃ．Ａ．Ｍ．Ｊ．Ｊ．ら、１９９１、「糸状菌における異種遺伝子発
現：真菌におけるより多数の遺伝子操作」、Ｊ．Ｗ．Ｂｅｎｎｅｔ＆Ｌ．Ｌ．Ｌ
ａｓｕｒｅ編、３９６〜４２８、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉ
ｅｇｏ、ｖａｎ ｄｅｎ Ｈｏｎｄｅｌ．Ｃ．Ａ．Ｍ．Ｊ．Ｊ．＆Ｐｕｎｔ．Ｐ
．Ｊ．、１９９１、「糸状菌用の遺伝子導入系およびベクターの開発：真菌の応
用分子遺伝学」、Ｐｅｂｅｒｄｙ，Ｊ．Ｆ．ら編、１〜２８、Ｃａｍｂｒｉｄｇ
ｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅを参照のこと）、
藻類および多細胞植物細胞（Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｒ．ａｎｄ Ｗｉｌｌｍｉｔｚｅ
ｒ，Ｌ．、１９８８、「Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａの葉および
子葉移植編を介した有効性の高いＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃ
ｉｅｎｓ」、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．、５８３〜５８６を参照のこと）
、または哺乳動物細胞中で発現させることができる。適切な宿主細胞はＧｏｅｄ
ｄｅｌ、「遺伝子発現技術」、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｇｙ、１
８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、１９９０で
さらに考察されている。あるいは、例えばＴ７プロモーター調節配列およびＴ７
ポリメラーゼを使用して、組換え発現ベクターをｉｎ ｖｉｔｒｏで転写および
翻訳することができる。
【００９２】 原核生物におけるタンパク質の発現は、融合または非融合タンパク質の発現を
指向する構成性または誘導プロモーターを含むベクターを用いて最も頻繁に起こ
る。融合ベクターは、コードされるタンパク質（通常、組換えタンパク質のアミ
ノ末端であるがＣ末端にも）アミノ酸数を追加するか、タンパク質内の適切な領
域内で融合される。このような融合ベクターは、典型的には、以下の３つの目的
で利用される：１）組換えタンパク質発現の増加、２）組換えタンパク質の溶解
性の増加、および３）親和性精製におけるリガンドとしての作用による組換えタ
ンパク質精製の補助。しばしば、融合発現ベクターでは、タンパク質分解結合部
位と組換えタンパク質部分の分離を可能にするための組換えタンパク質との融合
部分の接合部に移入し、その後融合タンパク質を精製する。このような酵素およ
びその同族認識配列には、第Ｘａ因子、トロンビン、およびエンテロキナーゼが
含まれる。
【００９３】 典型的な融合発現ベクターには、組換えタンパク質に、それぞれ、グルタチオ
ンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、またはプロ
テインＡを融合するｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．
、Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｂ．ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｋ．Ｓ．、１９８８、Ｇｅｎ
ｅ、６７、３１〜４０）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ
、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）、およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃ
ａｔａｗａｙ、ＮＪ）が含まれる。１つの実施形態では、ＳＭＰタンパク質のコ
ード配列を、ｐＧＥＸ発現ベクターにクローン化して、ＧＳＴ−トロンビン切断
部位−Ｘタンパク質をＮ末端からＣ末端まで含む融合タンパク質をコードするベ
クターを作製する。融合タンパク質を、グルタチオンアガロース樹脂を使用した
親和性クロマトグラフィーによって精製することができる。ＧＳＴに融合してい
ない組換えＳＭＰタンパク質を、トロンビンとの融合タンパク質の切断によって
回収することができる。
【００９４】 適切な誘導性非融合Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターの例には、ｐＴｒｃ（Ａｍａｎ
ｎら、１９８８、Ｇｅｎｅ、６９、３０１〜３１５）、ｐＬＧ３３８、ｐＡＣＹ
Ｃ１８４、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＫＣ３０、ｐＲｅｐ４、
ｐＨＳ１、ｐＨＳ２、ｐＰＬｃ２３６、ｐＭＢＬ２４、ｐＬＧ２００、ｐＩＮ−
ＩＩＩ１１３−Ｂ１、λｇｔ１１、ｐＢｄＣ１、およびｐＥＴ １１ｄ（Ｓｔｕ
ｄｉｅｒら、「遺伝子発現技術」、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇ
ｙ、１８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ
ｏｒｎｉａ、１９９０、６０〜８９、およびＰｏｕｗｅｌｓら、１９８５、Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＩＢＳＮ
０ ４４４ ９０４０１８）が含まれる。ｐＴｒｃベクター由来の標的遺伝子
発現は、ハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃ融合プロモーターからの宿主ＲＮＡポリメ
ラーゼ転写に依存する。ｐＥＴ １１ｄベクター由来の標的遺伝子発現は、ウイ
ルスＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７ｇｎ１）の同時発現によって媒介されるＴ７ｇｎ
１−ｌａｃ融合プロモーター由来の転写に依存する。このウイルスポリメラーゼ
は、ｌａｃＵＶ５プロモーターの転写調節下でＴ７ｇｎ１遺伝子を保有する常在
性λプロファージ由来の宿主株ＢＬ２１（ＤＥ３）またはＨＭＳ１７４（ＤＥ３
）によって供給される。細菌の他の変種の形質転換のために、適切なベクターを
選択することができる。例えば、プラスミドｐＩＪ１０１、ｐＩＪ３６４、ｐＩ
Ｊ７０２、およびｐＩＪ３６１はＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓの形質転換に有用で
あり、プラスミドｐＵＢ１１０、ｐＣ１９４、またはｐＢＤ２１４は、Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ種の形質転換に適切であることが公知である。コリネバクテリウムにつ
いての遺伝情報の伝達用のいくつかのプラスミドには、ｐＨＭ１５１９、ｐＢＬ
１、ｐＳＡ７７、またはｐＡＪ６６７（Ｐｏｕｗｅｌｓら編、１９８５、Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＩＢＳＮ
０ ４４４ ９０４０１８）が含まれる。
【００９５】 組換えタンパク質発現を最大にするための１つのストラテジーは、組換えタン
パク質のタンパク質分解による切断能力を損なった宿主細菌中でタンパク質を発
現させることである（Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，Ｓ．、「遺伝子発現技術」、Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓ
ｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、１９９０、１１９〜１２８）
。別のストラテジーは、各アミノ酸の各コドンが発現用に選択された細菌（Ｃ．
グルタミカムなど）中で好ましく利用されるように発現ベクターに挿入される核
酸の核酸配列を変更することである（Ｗａｄａら、１９９２、Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２０、２１１１〜２１１８）。本発明の核酸配列のこの
ような変更を、標準的なＤＮＡ合成技術によって行うことができる。
【００９６】 別の態様では、ＳＭＰタンパク質発現ベクターは、酵母発現ベクターである。
酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける発現用のベクターの例には、ｐＹｅｐＳ
ｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉ，ら、１９８７、Ｅｍｂｏ．Ｊ．、６、２２９〜２３４
）、２μ、ｐＡＧ−１、Ｙｅｐ６、Ｙｅｐ１３、ｐＥＭＢＬＹｅ２３、ｐＭＦａ
（Ｋｕｒｊａｎ ａｎｄ Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ、１９８２、Ｃｅｌｌ、３０、
９３３〜９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚら、１９８７、Ｇｅｎｅ、５
４、１１３〜１２３）、およびｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏ
ｒａｔｉｏｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）が含まれる。糸状菌などの他の真菌
での使用に適切なベクターおよびベクターの構築法には、以下に記載のものが含
まれる：ｖａｎ ｄｅｎ Ｈｏｎｄｅｌ．Ｃ．Ａ．Ｍ．Ｊ．Ｊ．＆Ｐｕｎｔ，Ｐ
．Ｊ．、１９９１、「糸状菌の遺伝導入系およびベクターの開発、真菌の応用分
子遺伝学」、Ｊ．Ｆ．Ｐｅｂｒｄｙら編、１〜２８、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎ
ｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、およびＰｏｕｗｅｌｓら
編、１９８５、Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ、ＩＢＳＮ ０ ４４４ ９０４０１８。
【００９７】 あるいは、本発明のＳＭＰタンパク質を、バキュロウイルス発現ベクターを使
用して昆虫細胞中で発現することができる。培養昆虫細胞（例えば、ＳＦ９細胞
）中でのタンパク質発現に利用可能なバキュロウイルスベクターには、ｐＡｃ系
列（Ｓｍｉｔｈら、１９８３、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、３、２１５６〜
２１６５）、およびｐＶＬ系列（Ｌｕｃｋｌｏｗ ａｎｄ Ｓｕｍｍｅｒｓ、１
９８９、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１７０、３１〜３９）が含まれる。
【００９８】 別の実施形態では、本発明のＳＭＰタンパク質を単細胞植物細胞（藻類など）
または高糖植物由来の植物細胞（例えば、作物植物などの種子植物）中で発現さ
せることができる。植物発現ベクターの例には、以下に記載のものが含まれる：
Ｂｅｃｋｅｒ，Ｄ．，Ｋｅｍｐｅｒ，Ｅ．，Ｓｃｈｅｌｌ，Ｊ．ａｎｄ Ｍａｓ
ｔｅｒｓｏｎ，Ｒ．、１９９２、「左側の境界近くに存在する選択マーカーを有
する新規の植物に成分ベクター」、Ｐｌａｎｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２０、１
１９５〜１１９７およびＢｅｖａｎ，Ｍ．Ｗ．、１９８４、「植物形質転換用の
二成分Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍベクター」、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．
、１２、８７１１〜８７２１ならびにｐＬＧＶ２３、ｐＧＨｌａｃ＋、ｐＢＩＮ
１９、ｐＡＫ２００４、およびｐＤＨ５１（Ｐｏｕｗｅｌｓら、１９８５、Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＩＢＳＮ
０ ４４４ ９０４０１８）。
【００９９】 さらに別の実施形態では、本発明の核酸を、哺乳動物ベクターを使用して哺乳
動物細胞に発現させる。哺乳動物発現細胞の例には、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，Ｂ
．、１９８７、Ｎａｔｕｒｅ、３２９、８４０）およびｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆ
ｍａｎら、１９８７、ＥＭＢＯ Ｊ．、６、１８７、１９５）が含まれる。哺乳
動物細胞において使用される場合、発現ベクターの制御機能は、しばしばウイル
ス調節エレメントによって得られる。例えば、一般的に使用されるプロモーター
は、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス、およびシミアンウ
イルス４０由来である。原核細胞および真核細胞用の他の適切な発現系について
は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｈ，Ｅ．Ｆ．、ａｎｄ Ｍａｎｉａｔ
ｉｓ，Ｔ．、「分子クローニング：実験マニュアル」、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９の第１６章および第１７章を参照のこと。
【０１００】 別の実施形態では、組換え哺乳動物発現ベクターは、特定の細胞型で核酸の発
現を指向することができる（例えば、組織特異的調節エレメントを使用して核酸
を発現させる）。組織特異的調節エレメントは、当該分野で公知である。適切な
組織特異的プロモーターの非限定的な例には、アルブミンプロモーター（肝臓特
異的、Ｐｉｎｋｅｒｔら、１９８７、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．、１、２６８〜２７
７）、リンパ球特異的プロモーター（Ｃａｌａｍｅ ａｎｄ Ｅａｔｏｎ、１９
８８、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、４３、２３５〜２７５）、特に、Ｔ細胞レセ
プター（Ｗｉｎｏｔｏ ａｎｄ Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、１９８９、ＥＭＢＯ Ｊ
．、８、７２９〜７３３）および免疫グロブリン（Ｂａｎｅｒｊｉら、１９８３
、Ｃｅｌｌ、３３、７２９〜７４０、Ｑｕｅｅｎ ａｎｄ Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ
、１９８３、Ｃｅｌｌ、３３、７４１〜７４８）のプロモーター、ニューロン特
異的プロモーター（例えば、神経フィラメント、Ｂｙｒｎｅ ａｎｄ Ｒｕｄｄ
ｌｅ、１９８９、ＰＮＡＳ、８６、５４７３〜５４７７）、膵臓特異的プロモー
ター（Ｅｄｌｕｎｄら、１９８５、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３０、９１２〜９１６）
、および哺乳動物腺特異的プロモーター（例えば、ミルクホエイプロモーター、
米国特許第４，８７３，３１６号よび欧州特許第出願２６４，１６６号）が含ま
れる。発達調節プロモーター（例えば、マウスｈｏｘプロモーター（Ｋｅｓｓｅ
ｌ ａｎｄ Ｇｒｕｓｓ、１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９、３７４〜３７９
）およびαフェトプロテインプロモーター（Ｃａｍｐｅｓ ａｎｄ Ｔｉｌｇｈ
ｍａｎ、１９８９、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．、３、５３７〜５４６））もまた含ま
れる。
【０１０１】 本発明は、さらに、アンチセンス方向で発現ベクターにクローン化された本発
明のＤＮＡ分子を含む組換え発現ベクターを提供する。すなわち、ＤＮＡ分子は
、ＳＭＰ ｍＲＮＡに対してアンチセンスのＲＮＡ分子を発現可能な様式（ＤＮ
Ａ分子の転写による）で調節配列を作動可能に連結される。種々の細胞型におけ
るアンチセンスＲＮＡ分子の持続的発現を指向する、アンチセンス方向でクロー
ン化された核酸に作動可能に連結された調節配列を選択することができ、例えば
、アンチセンスＲＮＡの構成性、特異的、または細胞型特異的発現を指向するウ
イルスプロモーターおよび／またはエンハンサー、または調節配列を選択するこ
とができる。アンチセンス発現ベクターは、アンチセンス核酸が効率の高い調節
領域の制御下で産生され、その活性をベクターが移入された細胞型によって同定
することができる組換えプラスミド、ファージミド、または弱毒化ウイルスの形
態であり得る。アンチセンス遺伝子を使用した遺伝子発現調節の考察については
、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｈ．ら、「遺伝子分析用の分子ツールとしてのアンチセ
ンスＲＮＡ」、Ｒｅｖｉｅｗｓ−Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１（
１）巻、１９８６を参照のこと。
【０１０２】 本発明の別の態様は、本発明の組換え発現ベクターが移入されている宿主細胞
に関する。用語「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」は、本明細書では交換可
能に使用される。このような用語は、特定の本件の細胞だけでなく、このような
細胞の子孫または潜在的な子孫についてもいうことが理解される。変異または環
境の影響により継代につれて一定の改変が生じ得るので、このような子孫は、実
際は、親細胞と同一ではないが、本明細書中で使用される用語の範囲内に依然と
して含まれる。
【０１０３】 宿主細胞は、任意の原核細胞または真核細胞であり得る。例えば、ＳＭＰタン
パク質を、Ｃ．グルタミカム、昆虫細胞、酵母、または哺乳動物細胞（チャイニ
ーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはＣＯＳ細胞など）中で発現させること
ができる。他の適切な宿主細胞は、当業者に公知である。本発明の核酸およびタ
ンパク質分子の宿主細胞として都合よく使用することができるコリネバクテリウ
ム−グルタミカムに関連する微生物を、表３に記載する。
【０１０４】 ベクターＤＮＡを、従来の形質転換技術またはトランスフェクション技術によ
って原核細胞または真核細胞に移入することができる。本明細書中で使用される
、用語「形質転換」、「トランスフェクション」、「接合」、および「形質導入
」は、種々の分野で認識されている外来核酸（例えば、線状ＤＮＡまたはＲＮＡ
（例えば、ベクターを含まない線状ベクターまたは遺伝子構築物のみ）またはベ
クターの形態（例えば、プラスミド、ファージ、ファスミド、ファージミド、ト
ランスポゾン、または他のＤＮＡ）の核酸の宿主細胞への移入技術（リン酸化カ
ルシウムまたは塩化カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェ
クション、リポフェクション、天然の能力、化学薬品媒介導入、またはエレクト
ロポレーションを含む）である。適切な宿主細胞の形質転換法またはトランスフ
ェクション法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ら（「分子クローニング：実験マニュアル
」、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９）および他の実験マニ
ュアルに見出すことができる。
【０１０５】 哺乳動物細胞の安定なトランスフェクションのために、使用される発現ベクタ
ーおよびトランスフェクション技術に依存して、細胞の小さなフラクションのみ
を外来ＤＮＡのそのゲノムに取り込むことができることが公知である。この取り
込みを同定および選択するために、一般に、選択マーカーをコードする遺伝子（
抗生物質耐性など）を、目的の遺伝子と共に宿主細胞に移入する。好ましい選択
マーカーには、薬物（Ｇ４１８、ハイグロマイシン、よびメトトレキセートなど
）に耐性を付与するものが含まれる。選択マーカーをコードする核酸を、ＳＭＰ
タンパク質をコードするベクターと同一のベクターに対して宿主細胞に移入する
か、別個のベクターに移入することができる。移入核酸で安定にトランスフェク
ションされた細胞を、例えば、薬物選択によって同定することができる（例えば
、選択マーカー遺伝子を組み込まれた細胞は生存し、他の細胞は死滅する）。
【０１０６】 相同組換え微生物を作製するために、欠失、付加、置換によってＳＭＰ遺伝子
が変化した（例えば、機能破壊）ＳＭＰ遺伝子の少なくとも一部を含むベクター
を調製する。好ましくは、ＳＭＰ遺伝子はコリネバクテリウム−グルタミカムＳ
ＭＰ遺伝子であるが、関連細菌、または哺乳動物、酵母、または昆虫起源由来の
ホモログであり得る。好ましい実施形態では、相同組換えの際に内因性ＳＭＰ遺
伝子が機能的に破壊されるようなベクター（すなわち、もはや機能的タンパク質
をコードしない（「ノックアウト」ベクターともいう））を設計する。あるいは
、相同組換えの際に内因性ＳＭＰ遺伝子が変異されているか変更されているが依
然として機能性タンパク質をコードするような（例えば、上流調節領域を変更し
て内因性タンパク質発現を変更することができる）ベクターを設計することがで
きる。相同組換えベクターでは、ＳＭＰ遺伝子の変更部分はベクターが保有する
外因性ＳＭＰ遺伝子と微生物中の内因性は遺伝子との間で相同組換えが起こるよ
うにＳＭＰ遺伝子のさらなるアミノ酸がその５’および３’末端に隣接している
。さらなる隣接ＳＭＰ核酸は、内因性遺伝子との首尾の良い相同組換えに十分な
長さである。典型的には、数キロベースの隣接ＤＮＡ（５’および３’末端）を
ベクター中でインキュベートする（例えば、相同組換えベクターの説明について
は、Ｔｈｏｍａｓ，Ｋ．Ｒ．ａｎｄ Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｍ．Ｒ．、１９８７、
Ｃｅｌｌ、５１、５０３を参照のこと）。ベクターを微生物に移入し（例えば、
エレクトロポレーションによる）、移入ＳＭＰ遺伝子が内因性ＳＭＰ遺伝子と相
同組換えされた細胞を当該分野で公知の技術を使用して選択する。
【０１０７】 別の実施形態では、移入遺伝子の調節発現を可能にする選択系を含む組換え微
生物を産生させることができる。例えば、ｌａｃオペロンの制御下に置いたベク
ターへのＳＭＰ遺伝子の封入により、ＩＰＴＧの存在下のみでＳＭＰ遺伝子を発
現する。このような調節系は当該分野で周知である。
【０１０８】 別の実施形態では、宿主細胞中の内因性ＳＭＰ遺伝子を、そのタンパク質産物
が発現しないように破壊する（例えば、相同組換えまたは当該分野で公知の他の
遺伝的手段）。別の実施形態では、宿主細胞中の内因性または移入ＳＭＰ遺伝子
は、１つまたは複数の点変異、欠失、または逆位によって変化されるが、機能性
ＳＭＰタンパク質を依然としてコードする。さらに別の実施形態では、微生物中
のＳＭＰ遺伝子の１つまたは複数の調節領域（例えば、プロモーター、リプレッ
サー、またはインデューサー）を、ＳＭＰ遺伝子発現が調整されるように変更し
た（例えば、欠失、短縮、逆位、または点変異による）。当業者は、１つを超え
る所望のＳＭＰ遺伝子およびタンパク質改変を含む宿主細胞を本発明の方法を使
用して容易に産生させることができ、これは本発明に含まれることを意味するこ
とが認識される。
【０１０９】 本発明の宿主細胞（原核生物または真核生物培養細胞など）を使用して、ＳＭ
Ｐタンパク質を産生（すなわち、発現）させることができる。したがって、本発
明は、さらに、本発明の宿主細胞を使用したＳＭＰタンパク質の産生法を提供す
る。１つの実施形態では、この方法は、ＳＭＰタンパク質が産生されるまで、適
切な培地中で本発明の宿主細胞（ＳＭＰタンパク質をコードする組換え発現ベク
ターが移入されているか、ゲノムに野生型または変更ＳＭＰタンパク質をコード
する遺伝子が移入されている）を培養する工程を包含する。別の実施形態では、
この方法は、さらに、培地または宿主細胞からＳＭＰタンパク質を単離する工程
を包含する。
【０１１０】 Ｃ．単離ＳＭＰタンパク質 本発明の別の態様は、単離ＳＭＰタンパク質およびその生物活性部分に関する
。「単離」または「精製」タンパク質またはその生物活性部分は、組換えＤＮＡ
技術によって産生された細胞物質または化学合成の場合には化学物質前駆体もし
くは他の化学物質を実質的に含まない。用語「細胞物質を実質的に含まない」は
、タンパク質が天然または組換えによって産生された細胞の細胞性分から分離さ
れているＳＭＰタンパク質の調製物を含む。１つの実施形態では、用語「細胞物
質を実質的に含まない」は、約３０％（乾燥重量）未満の非ＳＭＰタンパク質（
本明細書中では「夾雑タンパク質」ともいう）、より好ましくは約２０％未満の
非ＳＭＰタンパク質、さらに好ましくは約１０％未満の非ＳＭＰタンパク質、最
も好ましくは約５％未満の非ＳＭＰタンパク質を含むＳＭＰタンパク質調製物を
含む。ＳＭＰタンパク質またはその生物活性部分が組換えによって産生された場
合、培養培地を実質的に含まないことが好ましい。すなわち、培養培地は、タン
パク質調製物の約２０％未満、より好ましくは約１０％未満、最も好ましくは約
５％未満の体積で存在する。用語「化学物質前駆体または他の化学物質を実質的
に含まない」は、タンパク質の合成に関連する化学物質前駆体または他の化学物
質からタンパク質が分離されたＳＭＰタンパク質調製物を含む。１つの実施形態
では、用語「化学物質前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」は、約３
０％（乾燥重量）未満の化学物質前駆体または非ＳＭＰタンパク質、より好まし
くは約２０％未満の化学物質前駆体または非ＳＭＰタンパク質、さらに好ましく
は約１０％未満の化学物質前駆体または非ＳＭＰタンパク質、最も好ましくは約
５％未満の化学物質前駆体または非ＳＭＰタンパク質を有するＳＭＰタンパク質
調製物を含む。好ましい実施形態では、単離タンパク質またはその生物活性部分
は、ＳＭＰタンパク質が由来する同一の生物由来の夾雑タンパク質を欠く。典型
的には、このようなタンパク質を、例えば、Ｃ．グルタミカムなどの微生物にお
けるＣ．グルタミカム ＳＭＰタンパク質の組換え発現によって産生する。
【０１１１】 本発明の単離ＳＭＰタンパク質またはその一部は、不利な代謝経路の駆動に利
用される（例えば、酸化的リン酸化）糖などの炭素化合物の代謝およびエネルギ
ー分子の生成に関連し得るか、表１に記載の１つまたは複数の活性を有する。好
ましい実施形態では、タンパク質またはその一部が、コリネバクテリウム−グル
タミカムにおける過程（酸化的リン酸化など）による糖などの炭素化合物の代謝
およびエネルギー分子の生成に関連する機能を果たす能力を維持するように、タ
ンパク質またはその一部は本発明のアミノ酸配列（例えば、配列表の偶数の配列
番号の配列）に十分に相同なアミノ酸配列を含む。タンパク質の一部は、本明細
書中に記載の生物活性部分であることが好ましい。別の好ましい実施形態では、
本発明のＳＭＰタンパク質は、配列表の偶数の配列番号として記載のアミノ酸配
列を有する。さらに別の好ましい実施形態では、ＳＭＰタンパク質は、本発明の
ヌクレオチド配列（例えば、配列表の奇数の配列番号の配列）とハイブリッド形
成する（例えば、ストリンジェントな条件下でハイブリッド形成する）ヌクレオ
チド配列によってコードされるアミノ酸を有する。さらに別の好ましい実施形態
では、ＳＭＰタンパク質は、本発明の核酸配列の１つに少なくとも約５０％、５
１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、ま
たは６０％、好ましくは少なくとも６１％、６２％、６３％、６４％、６６％、
６５％、６７％、６８％、６９％、または７０％、より好ましくは少なくとも約
７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、
または８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８
８％、８９％、または９０％、または９１％、９２％、９３％、９４％、更によ
り好ましくは少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそ
れ以上相同なヌクレオチド配列またはその一部によってコードされるアミノ酸配
列またはその一部を有する。上記範囲の中間の範囲および同一値（例えば、７０
〜９０％同一または８０〜９５％同一）はまた、本発明に含まれることが意図さ
れる。例えば、上限および／下限として上記の任意の値の組み合わせを使用した
同一値の範囲が含まれることが意図される。本発明の好ましいＳＭＰタンパク質
はまた、本明細書中に記載の少なくとも１つのは活性を有する。例えば、本発明
の好ましいＳＭＰタンパク質は、本発明のヌクレオチド配列とハイブリッド形成
し（例えば、ストリンジェントな条件下でハイブリッド形成する）、コリネバク
テリウム−グルタミカムにおける過程（酸化的リン酸化など）による糖などの炭
素化合物の代謝およびエネルギー分子（例えば、ＡＴＰ）の生成に関連する機能
を果たし得るか、表１に記載の１つまたは複数の活性を有するヌクレオチド配列
によってコードされるアミノ酸配列を含む。
【０１１２】 他の実施形態では、ＳＭＰタンパク質は、上記の小節Ｉに詳述のように、本発
明のアミノ酸配列（例えば、配列表の偶数の配列番号の配列）に実質的に相補的
であり、天然の変動または変異誘発によってアミノ酸配列が異なるが本発明の１
つまたは複数のアミノ酸配列の一部の機能的活性を保持している。したがって、
別の実施形態では、ＳＭＰタンパク質は、本発明の全アミノ酸配列に少なくとも
約５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％
、５９％、または６０％、好ましくは少なくとも６１％、６２％、６３％、６４
％、６６％、６５％、６７％、６８％、６９％、または７０％、より好ましくは
少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７
％、７８％、７９％、または８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％
、８６％、８７％、８８％、８９％、または９０％、または９１％、９２％、９
３％、９４％、更により好ましくは少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８
％、９９％、またはそれ以上相同なアミノ酸配列を含み、本明細書中に記載の少
なくとも１つのＳＭＰ活性を有するタンパク質である。上記範囲の中間の範囲お
よび同一値（例えば、７０〜９０％同一または８０〜９５％同一）はまた、本発
明に含まれることが意図される。例えば、上限および／下限として上記の任意の
値の組み合わせを使用した同一値の範囲が含まれることが意図される。別の実施
形態では、本発明は、本発明の全アミノ酸配列に実質的に相同な全長Ｃ．グルタ
ミカムタンパク質に関する。
【０１１３】 ＳＭＰタンパク質の生物活性部分には、ＳＭＰタンパク質のアミノ酸配列（例
えば、配列表の偶数の配列番号の配列）由来のアミノ酸配列、ＳＭＰタンパク質
に相補的なタンパク質のアミノ酸配列（少なくとも１つのＳＭＰタンパク質活性
を示す、全長ＳＭＰタンパク質よりも少ないアミノ酸またはＳＭＰタンパク質に
相補的な全長ＳＭＰアミノ酸を含む）が含まれる。典型的には、生物活性部分（
ペプチド、例えば、５、１０、１５、２０、３０、３５、３６、３７、３８、３
９、４０、５０、１００またはそれ以上のアミノ酸長のペプチド）は、少なくと
も１つのＳＭＰタンパク質活性を有するドメインまたはモチーフを含む。さらに
、他のタンパク質領域が欠失した他の生物活性部分を組換え技術で調整して、本
明細書中に記載の１つまたは複数の活性について評価することができる。好まし
くは、ＳＭＰタンパク質の生物活性部分には、生物活性を有する１つまたは複数
の選択ドメイン／モチーフまたはその一部が含まれる。
【０１１４】 ＳＭＰタンパク質は、好ましくは、組換えＤＮＡ技術によって産生される。例
えば、タンパク質をコードする核酸分子を、発現ベクター（上記）にクローン化
し、発現ベクターを宿主細胞（上記）に移入し、宿主細胞中でＳＭＰタンパク質
を発現させる。次いで、ＳＭＰタンパク質を、標準的な精製技術を使用した適切
な精製スキームによって細胞から単離することができる。組換え発現の代わりに
、ＳＭＰタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドを標準的にペプチド合成技
術を使用して化学合成することができる。さらに、天然のＳＭＰタンパク質を、
例えば本発明のＳＭＰタンパク質またはそのフラグメントを利用した標準的な技
術によって作製することができる抗ＳＭＰ抗体を使用して細胞（例えば、上皮細
胞）から単離することができる。
【０１１５】 本発明はまた、ＳＭＰキメラタンパク質または融合タンパク質を提供する。本
明細書中で使用される、ＳＭＰ「キメラタンパク質」または「融合タンパク質」
は、非ＳＭＰポリペプチドに作動可能に連結されたＳＭＰポリペプチドを含む。
「ＳＭＰポリペプチド」は、ＳＭＰタンパク質に対応するアミノ酸配列を有する
ポリペプチドをいい、「非ＳＭＰタンパク質」は、ＳＭＰタンパク質に実質的に
相同でないタンパク質（例えば、ＳＭＰタンパク質と異なり、且つ同一および異
なる生物由来のタンパク質）に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドをい
う。融合タンパク質では、用語「作動可能に連結された」は、ＳＭＰポリペプチ
ドおよび非ＳＭＰポリペプチドが互いにインフレームで融合していることを示す
ことが意図される。非ＳＭＰポリペプチドをＳＭＰポリペプチドのＮ末端または
Ｃ末端に融合させることができる。例えば、１つの実施形態では、融合タンパク
質は、ＳＭＰ配列がＧＳＴ配列のＣ末端に融合されたＧＳＴ−ＳＭＰ融合タンパ
ク質である。このような融合タンパク質は、組換えＳＭＰタンパク質の精製を容
易にすることができる。別の実施形態では、融合タンパク質は、そのＮ末端に異
種シグナル配列を含むＳＭＰタンパク質である。一定の宿主細胞（例えば、哺乳
動物宿主細胞）では、ＳＭＰタンパク質の発現および／または分泌を、異種シグ
ナル配列の使用によって増加させることができる。
【０１１６】 好ましくは、本発明のＳＭＰキメラタンパク質および融合タンパク質は、標準
的な組換えＤＮＡ技術で産生される。例えば、異なるポリペプチド配列をコード
するＤＮＡフラグメントを、従来技術にしたがって（例えば、ライゲーション用
のスタッガー末端または付着末端、適切な末端を得るための制限酵素消化、適切
な付着末端の充填、望ましくない連結を回避するためのる仮ホスファターゼ処理
、および酵素によるライゲーションの使用によって）インフレームで互いにライ
ゲーションする。別の実施形態では、融合遺伝子を、自動化ＤＮＡ合成機を含む
従来技術によって合成することができる。あるいは、２つの連続的遺伝子間の相
補的オーバーハングを引き起こす固着プライマーを使用して遺伝子フラグメント
のＰＣＲ増幅を行い、その後アニーリングおよび再増幅してキメラ遺伝子配列を
作製することができる（例えば、「現代の分子生物学プロトコール」、Ａｕｓｂ
ｅｌら編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、１９９２を参照のこと）。さらに
、融合部分（例えば、ＧＳＴポリペプチド）を既にコードしている多数の発現ベ
クターが市販されている。ＳＭＰコード核酸を、融合部分がＳＭＰタンパク質に
インフレームで連結するように、このような発現ベクターにクローン化すること
ができる。
【０１１７】 ＳＭＰタンパク質のホモログを、変異誘発（例えば、ＳＭＰタンパク質の点変
異または短縮）によって作製することができる。本明細書中で使用される、「ホ
モログ」は、ＳＭＰタンパク質のアゴニストまたはアンタゴニストとして作用す
るＳＭＰタンパク質の変異形態をいう。ＳＭＰタンパク質のアゴニストは、ＳＭ
Ｐタンパク質の実質的に同一またはサブセットの生物活性を保持することができ
る。ＳＭＰタンパク質のアンタゴニストは、例えば、機能的相互作用不可能にな
るようなＳＭＰタンパク質を含む生物学的カスケードの下流または上流メンバー
への競合的結合、ＳＭＰタンパク質が相互作用する標的分子への結合、またはＳ
ＭＰタンパク質への直接的結合およびその通常の活性の阻害によってＳＭＰタン
パク質の天然に存在する形態の１つまたは複数の活性を阻害することができる。
【０１１８】 別の実施形態では、ＳＭＰタンパク質のホモログを、ＳＭＰタンパク質の変異
体（例えば、短縮変異体）の組み合わせライブラリーのＳＭＰタンパク質アゴニ
ストまたはアンタゴニスト活性についてのスクリーニングによって同定すること
ができる。１つの実施形態では、ＳＭＰ変異型の雑色ライブラリーを、核酸レベ
ルでの組み合わせ変異誘発によって作製し、これは、雑色遺伝子ラブラリーによ
ってコードされる。ＳＭＰ変異型の雑色ライブラリーを、例えば、潜在的なＳＭ
Ｐ配列の縮重セットがそれぞれのポリペプチドとしてあるいはＳＭＰ配列のセッ
トを含むより大きな融合タンパク質のセット（例えば、ファージディスプレイ）
として発現可能なように、遺伝子配列への合成オリゴヌクレオチドの混合物の酵
素ライゲーションによって産生させることができる。縮重オリゴヌクレオチド配
列から潜在的なＳＭＰホモログを産生するために使用することができる種々の方
法が存在する。縮重遺伝子配列の化学合成を、自動化ＤＮＡ合成機で行うことが
でき、その後合成遺伝子を適切な発現ベクターにライゲーションする。遺伝子の
縮重セットの使用により、所望の潜在的なＳＭＰ配列のセットをコードする配列
の全てを１つの混合物から獲得可能である。縮重オリゴヌクレオチドの合成法は
、当該分野で公知である（例えば、Ｎａｒａｎｇ，Ｓ．Ａ．、１９８３、Ｔｅｔ
ｒａｈｅｄｒｏｎ、３９、３、Ｉｔａｋｕｒａら、１９８４、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ
．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、５３、３２３、Ｉｔａｋｕｒａら、１９８４、Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ、１９８、１０５６、Ｉｋｅら、１９８３、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒ
ｅｓ．、１１、４７７を参照のこと）。
【０１１９】 さらに、ＳＭＰタンパク質をコードするフラグメントのライブラリーを使用し
て、ＳＭＰタンパク質のホモログのスクリーニングおよびその後の分泌用のＳＭ
Ｐタンパク質の雑色集団を作製することができる。１つの実施形態では、コード
配列フラグメントのライブラリーを、１分子あたり１回のみニックが起こる条件
下でのヌクレアーゼでのＳＭＰコード配列の二本鎖ＰＣＲフラグメントの処理、
二本鎖ＤＮＡの変性、異なるニック産物由来のセンス／アンチセンス対を含み得
る二本鎖ＤＮＡを形成させるためのＤＮＡの再生、Ｓ１ヌクレアーゼでの処理に
よる再形成二重らせんからの一本鎖部分の除去、および得られたフラグメントラ
イブラリーの発現ベクターへのライゲーションによって作製することができる。
この方法により、発現ライブラリーは、種々のサイズのＳＭＰタンパク質のＮ末
端、Ｃ末端、内部フラグメントをコードするベクターに由来し得る。
【０１２０】 点変異または短縮によって作製される組み合わせライブラリーの遺伝子産物の
スクリーニングおよび選択された特性を有する遺伝子産物のｃＤＮＡライブラリ
ーのスクリーニング用のいくつかの技術は、当該分野で公知である。このような
技術は、ＳＭＰホモログの組み合わせ変異誘発によって作製される遺伝子ライブ
リーの迅速なスクリーニングに適用可能である。高処理分析に利用可能な巨大な
遺伝子ライブラリーのスクリーニングに最も広く使用されている技術には、典型
的には、複製可能な発現ベクターへの遺伝子ライブラリーのクローニング、得ら
れたベクターライブラリーでの適切な細胞の形質転換、および所望の活性の検出
により産物が検出される遺伝子をコードするベクターの単離を容易にする条件下
で組み合わせ遺伝子の発現が含まれる。再帰的アンサンブル変異誘発（ＲＥＭ）
（ライブラリー中の帰納的変異体の頻度を向上させる技術）を、スクリーニング
アッセイと組み合わせて使用して、ＳＭＰホモログを同定することができる（Ａ
ｒｋｉｎ ａｎｄ Ｙｏｕｒｖａｎ、１９９２、ＰＮＡＳ、８９、７８１１〜７
８１５、Ｄｅｌｇｒａｖｅら、１９９３、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉ
ｎｇ、６（３）、３２７〜３３１）。
【０１２１】 別の実施形態では、細胞ベースのアッセイを利用した、当該分野で周知の方法
の使用によって雑色ＳＭＰライブラリーを分析することができる。
【０１２２】 Ｄ．本発明の使用および用途 本明細書中に記載の核酸分子、タンパク質、タンパク質ホモログ、融合タンパ
ク質、プライマー、ベクター、および宿主細胞を、以下の１つまたは複数の方法
で使用することができる：Ｃ．グルタミカムおよび関連生物の同定、Ｃ．グルタ
ミカムに関連する生物のゲノムマッピング、目的のＣ．グルタミカム配列の同定
および局在化、進化研究、機能に必要なＳＭＰタンパク質領域の同定、ＳＭＰタ
ンパク質活性の調整、１つまたは複数の糖代謝の調整、細胞中の高エネルギー分
子生成の調整（すなわち、ＡＴＰ、ＮＡＤＰＨ）、および所望の化合物（生成化
学製品など）の細胞生産の調整。
【０１２３】 本発明のＳＭＰ核酸分子は、種々の用途がある。第１に、これを使用して、コ
リネバクテリウム−グルタミカムまたはその密接な関連生物である生物を同定す
ることができる。また、これを使用して、微生物の混合集団中のＣ．グルタミカ
ムまたはその関連生物の存在を同定することができる。本発明により、この生物
に固有のＣ．グルタミカム遺伝子領域にまたがるプローブを使用したストリンジ
ェントな条件下での微生物の固有または混合集団の培養物からの抽出ゲノムＤＮ
Ａの探索によって、多数のＣ．グルタミカム遺伝子の核酸配列が得られ、この生
物が存在するかどうかを確認することができる。コリネバクテリウム−グルタミ
カム自体は非病原性であるにもかかわらず、コリネバクテリウム ｄｉｐｈｔｈ
ｅｒｉａｅなどの病原種に関連する。コリネバクテリウム ｄｉｐｈｔｈｅｒｉ
ａｅはジフテリアの原因物質であり、局所および全身性病態を含む急速に発症す
る（急性の）熱性感染症である。この疾患では、上気道が局所的に損傷し、上皮
細胞が壊死性損傷を受け、バチルスが身体の離れた感受性組織に汎発する毒素を
分泌する。変性による変化は、これらの組織（心臓、筋肉、末梢神経、副腎、腎
臓、肝臓、および脾臓を含む）におけるタンパク質合成の阻害によって引き起こ
され、全身性疾患を引き起こす。ジフテリアは、世界の多くの地域（アフリカ、
アジア、東欧、および旧ソ連の独立国を含む）で高い発生率が維持されている。
後者の２つの地域でのジフテリアの持続的流行により、１９９０年以来少なくと
も５，０００人が死亡している。
【０１２４】 １つの実施形態では、本発明は、被験体におけるコリネバクテリウム ｄｉｐ
ｈｔｈｅｒｉａｅの存在または活性の同定法を提供する。この方法には、被験体
における本発明の１つまたは複数の核酸またはアミノ酸配列（例えば、それぞれ
、配列表の奇数または偶数の配列番号に記載の配列）の検出による被験体におけ
るコリネバクテリウム ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅの存在または活性の検出が含ま
れる。Ｃ．グルタミカムおよびＣ．ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅは関連細菌であり、
Ｃ．グルタミカム中の多数の各鎖の予備タンパク質分子がＣ．ｄｉｐｈｔｈｅｒ
ｉａｅの核酸およびタンパク質分子と相同であり、それにより被験体中のＣ．ｄ
ｉｐｈｔｈｅｒｉａｅの検出に使用することができる。
【０１２５】 本発明の核酸およびタンパク質分子はまた、ゲノムの特異的領域についてのマ
ーカーとして利用することができる。これは、ゲノムのマッピングだけでなく、
Ｃ．グルタミカムタンパク質の機能研究に有用である。例えば、特定のＣ．グル
タミカムＤＮＡ結合タンパク質に結合するゲノム領域を同定するために、Ｃ．グ
ルタミカムゲノムを消化し、フラグメントをＤＮＡ結合タンパク質とインキュベ
ートすることができる。タンパク質に結合するフラグメントを、好ましくは容易
に検出可能な標識とともに本発明の核酸分子を用いてさらに探索することができ
る。このような核酸分子のゲノムフラグメントへの結合により、Ｃ．グルタミカ
ムのゲノムマップへのフラグメントの局在化が可能であり、異なる酵素で複数回
行った場合は、タンパク質が結合する核酸配列の迅速な同定が容易になる。さら
に、本発明の核酸分子は、関連種の配列に十分に相同であり得るので、これらの
核酸分子は関連細菌（ブレビバクテリウム ラクトフェルメンタムなど）のゲノ
ムマップの構築用のマーカーとして利用することができる。
【０１２６】 本発明のＳＭＰ核酸分子はまた、進化およびタンパク質構造研究に有用である
。本発明の分子が関与する代謝およびエネルギー放出過程は、広範な種々の原核
生物および真核生物によって利用される。本発明の核酸分子配列と他の生物由来
の類似の酵素をコードする配列との比較により、生物の進化上の関連を評価する
ことができる。同様に、このような比較により、配列領域の保存の有無、酵素機
能に必須のタンパク質領域の同定を補助することができる評価を行うことが可能
である。この同定の型はタンパク質操作研究に価値があり、タンパク質が機能を
喪失することなく変異誘発に耐性を示すかどうかの指標を得ることができる。
【０１２７】 本発明のＳＭＰ核酸分子の操作により、野生型ＳＭＰタンパク質と異なる機能
を有するＳＭＰタンパク質を産生可能である。これらのタンパク質を、効率また
は活性を改良するか、細胞中に通常よりも多数の細胞を存在させるか、効率また
は活性を減少させることができる。
【０１２８】 本発明は、ＳＭＰタンパク質自体またはＳＭＰタンパク質の基質もしくは結合
パートナーとの相互作用または本発明のＳＭＰ核酸分子の転写または翻訳の調整
のいずれかによる、ＳＭＰタンパク質活性を調整する分子のスクリーニング法を
提供する。このような方法では、本発明の１つまたは複数のＳＭＰタンパク質を
発現する微生物を、１つまたは複数の試験化合物と接触させ、ＳＭＰタンパク質
の活性または発現レベルに対する各試験化合物の効果を評価する。
【０１２９】 本発明のＳＭＰタンパク質の変更によりこのような変更タンパク質が組み込ま
れたＣ．グルタミカム株由来の精製化学製品の生産量、生産、および／または生
産効率が直接影響を受け得る多数の機構が存在する。糖などの高エネルギー炭素
分子の分解およびＮＡＤＨおよびＦＡＤＨ２などの化合物の酸化的リン酸化によ
るより有用な形態の化合物への変換により、それ自体が所望の生成化学製品（ピ
ルビン酸、ＡＴＰ、ＮＡＤＨなど）である多数の化合物および中間体糖化合物が
得られる。さらに、これらの代謝経路によって生成されたエネルギー分子（ＡＴ
Ｐなど）および還元糖化物（ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨなど）を細胞中で利用し
て、エネルギー的に不利な反応を駆動させる。このような不利な反応には、多数
の生成化学製品生合成経路が含まれる。細胞の特定の糖を利用する能力の改良に
より（例えば、細胞の糖の分解およびエネルギーへの変換に関連する酵素をコー
ドする遺伝子の改良により）、不利であるが所望の代謝反応（所望の精製化学製
品の生合成）を利用可能なエネルギー量に増加させることができる。
【０１３０】 さらに、糖利用に関連する１つまたは複数の経路の調整により、糖分子内に含
まれるエネルギーの１つまたは複数の所望の生成化学製品の生産への変換の最適
化が可能である。例えば、糖新生に関連する酵素活性の減少により、所望の生化
学反応（生成化学製品生合成など）を駆動するためにより多数のＡＴＰが利用可
能である。また、細胞が各糖分子からのエネルギー生産を確実に最大にするため
に糖由来のエネルギー分子の全生成を調整することができる。非効率的な糖の利
用により、ＣＯ２およびエネルギーが過剰に生産され、代謝経路が無駄になる。
糖分子の代謝の改良により、細胞がより効率的に機能するのでより少ない炭素分
子で済むはずである。これにより、操作したＣ．グルタミカムの大量発酵槽培養
において培地に添加しなければならない糖の量を減少させることができる。
【０１３１】 本発明の１つまたは複数のＳＭＰ遺伝子の変異誘発により、Ｃ．グルタミカム
由来の１つまたは複数の所望の精製化学製品の生産に間接的に影響を与える活性
を変化させたＳＭＰタンパク質を得ることもできる。例えば、１つまたは複数の
糖の利用効率の増加（糖の有用なエネルギー分子への変換）または還元糖化物の
有用なエネルギー分子への変換効率の増加（例えば、酸化的リン酸化の効率また
はＡＴＰシンターゼ活性の改良による）により、細胞が利用可能な通常不利な代
謝過程を駆動するこれらの高エネルギー化合物量を増加させることができる。こ
れらの過程には、細胞壁の構築、転写、翻訳、および細胞の増殖および***に必
要な化合物（例えば、ヌクレオチド、アミノ酸、ビタミン、脂質など）の生合成
が含まれる（Ｌｅｎｇｅｌｅｒら、１９９９、「原核生物の生物学」、Ｔｈｉｅ
ｍｅ Ｖｅｒｌａｇ：Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ、８８〜１０９、９１３〜９１８、８
７５〜８９９）。これらの操作細胞の成長および増殖の改良により、大量培養で
の生存度の増加および***速度の改良が可能であり、比較的多数の細胞が発酵槽
培養で生存することができる。少なくとも多数の生細胞の存在により生産量、生
産、または生産効率を増加させて所望の精製化学製品を生産することができる。
【０１３２】 さらに、糖代謝中に生成される多数の分解生成物自体を他の有用な化合物（そ
のうちのいくつかは精製化学製品である）の生成用の前駆体または中間体として
細胞によって利用される。例えば、ピルビン酸は、アミノ酸のアラニンに変換さ
れ、リボース−５−リン酸は、例えば、核酸分子の不可分の一部である。次いで
、糖代謝の量および効率には、細胞中でのこれらの分解生成物の利用可能性に対
する興味深い効果がある。現存の経路の効率に関する細胞の糖の処理能力の増加
（例えば、活性が最適になるようなこれらの経路に関連する酵素の操作）による
か、このような経路に関連する酵素の利用可能性の増大（例えば、細胞中に存在
するこれらの酵素数の増加）によって、細胞での分解生成物の利用可能性を増大
させることも可能であるので、細胞中の多数の異なる他の所望の化合物の生成が
増加するはずである。
【０１３３】 Ｃ．グルタミカム由来の精製化学製品の生産量を増加させるＳＭＰタンパク質
の上記の変異誘発ストラテジーは、制限を意味しない。これらのストラテジーの
変形形態は、当業者に容易に認識される。このようなストラテジーの使および本
明細書中に開示の機構の組み込みによって、本発明の核酸およびタンパク質分子
を利用して、変異ＳＭＰ核酸およびタンパク質分子を発現するＣ．グルタミカム
または関連細菌を作製して所望の化合物の生産量、生産、および／または生産効
率を改良することができる。この所望の化合物は、Ｃ．グルタミカムによって産
生された任意の生成物であり得るが、これには、生合成経路の最終生成物および
天然に存在する代謝経路の中間物、ならびにＣ．グルタミカムの代謝において天
然では得られないが本発明のＣ．グルタミカム株によって産生される分子が含ま
れる。
【０１３４】 本発明は、以下の実施例によってさらに例示されるが、限定と解釈されるべき
ではない。本出願を通して引用された全ての引例、特許出願書類、特許、公開さ
れた特許出願書類、表、および配列表は、本明細書中で参考として援用される。
【０１３５】
【表１】
【表２】
【表３】
【表４】
【表５】
【表６】
【表７】
【表８】
【表９】
【表１０】
【表１１】
【表１２】
【表１３】
【表１４】
【表１５】
【表１６】
【表１７】
【表１８】
【表１９】
【表２０】
【表２１】
【表２２】
【表２３】
【表２４】
【表２５】
【表２６】
【表２７】
【表２８】
【表２９】
【表３０】
【表３１】
【表３２】
【表３３】
【表３４】
【表３５】
【表３６】
【表３７】
【表３８】
【表３９】
【表４０】
【表４１】
【表４２】
【表４３】
【表４４】
【表４５】
【表４６】
【表４７】
【表４８】
【表４９】
【表５０】
【表５１】
【表５２】
【表５３】
【表５４】
【表５５】
【表５６】
【表５７】
【表５８】
【表５９】
【０１３６】 実施例 実施例１：Corynebacterium glutamicum ATCC13032の全ゲノムＤＮＡの製造 Corynebacterium glutamicum (ATCC13032)の培養は、激しく攪拌したＢＨＩ媒体
（Ｄｉｆｃｏ）中で、３０℃で終夜行なわれた。細胞は遠心分離により回収され
、上澄みを処分し、細胞は、５ｍｌの緩衝液Ｉ（最初の培養容積の５％、すべて
の示された容積は、１００ｍｌの培養容積のために計算されたものである。）中
再懸濁された。緩衝液Ｉの組成は、１４０．３４ｇ／ｌのショ糖、２．４６ｇ／
ｌのＭｇＳＯ４ｘ７Ｈ２Ｏ、１０ｍｌ／ｌのＫＨ２ＰＯ４溶液（１００ｇ／ｌ、
ＫＯＨでｐＨ６．７に調整）、５０ｍｌ／ｌのＭ１２濃縮物（１０ｇ／ｌの（Ｎ
Ｈ４）２ＳＯ４、１ｇ／ｌのＮａＣｌ、２ｇ／ｌのＭｇＳＯ４ｘ７Ｈ２Ｏ、０.
２ｇ／ｌのＣａＣｌ２、０．５ｇ／ｌの酵母抽出物（Ｄｉｆｃｏ）、１０ｍｌ／
ｌのトレース−エレメンツ−ミックス（２００ｍｇ／ｌのＦｅＳＯ４ｘＨ２Ｏ、
１０ｍｇ／ｌのＺｎＳＯ４ｘ７Ｈ２Ｏ、３ｍｇ／ｌのＭｎＣｌ２ｘ４Ｈ２Ｏ、３
０ｍｇ／ｌのＨ３ＢＯ３、２０ｍｇ／ｌのＣｏＣｌ２ｘ６Ｈ２Ｏ、１ｍｇ／ｌの
ＮｉＣｌ２ｘ６Ｈ２Ｏ、３ｍｇ／ｌのＮａ２ＭｏＯ４ｘ２Ｈ２Ｏ、５００ｍｇ／
ｌの錯化剤（ＥＤＴＡまたはクエン酸）、１００ｍｌ／ｌのビタミン−ミックス
（０．２ｍｇ／ｌのビオチン、０．２ｍｇ／ｌの葉酸、２０ｍｇ／ｌのｐ−アミ
ノ安息香酸、２０ｍｇ／ｌのリボフラビン、４０ｍｇ／ｌのパントテン酸カルシ
ウム、１４０ｍｇ／ｌのニコチン酸、４０ｍｇ／ｌの塩酸ピリドキソール、２０
０ｍｇ／ｌのミオ−イノシトール）である。リゾチームを最終濃度が２．５ｍｇ
／ｍｌになるまで懸濁液に加えた。約４時間、３７℃での培養の後、細胞壁を劣
化させ得られたプロトプラストを遠心分離によって回収した。ペレットを５ｍｌ
の緩衝液Ｉで一度、５ｍｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭのトリスＨＣｌ、１ｍＭのＥ
ＤＴＡ、ｐＨ８）で一度洗浄した。ペレットを４ｍｌのＴＥ緩衝液に再懸濁し、
０．５ｍｌのＳＤＳ溶液（１０％）と０．５ｍｌのＮａＣｌ溶液（５Ｍ）を加え
た。プロテイナーゼＫを最終濃度２００μｇ／ｍｌになるまで加えた後、懸濁液
を約１８時間、３７℃で培養した。ＤＮＡを標準的な操作で、フェノール、フェ
ノール−クロロホルム−イソアミルアルコールおよびクロロホルム−イソアミル
アルコールによる抽出により精製した。それから、ＤＮＡを１／５０容積の３Ｍ
酢酸ナトリウムおよび２容積のエタノールを加えて析出させ、次いで３０分間、
−２０℃でインキュベートし、ＳＳ３４ローター（Ｓｏｒｖａｌｌ）を使用した
高速遠心分離機で１２０００ｒｐｍで遠心分離を３０分間行なった。ＤＮＡを２
０μｇ／ｍｌのＲＮアーゼＡを含む１ｍｌのＴＥ緩衝液に溶解し、４℃で、少な
くとも３時間１０００ｍｌのＴＥ緩衝液に対して透析した。この間、緩衝液を３
度交換した。透析したＤＮＡ溶液の０．４ｍｌの部分に、０．４ｍｌの２ＭＬｉ
Ｃｌと０．８ｍｌのエタノールを加えた。３０分間、−２０℃でインキュベート
した後、遠心分離（１３０００ｒｐｍ、Ｂｉｏｆｕｇｅ Ｆｒｅｓｃｏ，Ｈｅｒ
ａｅｕｓ，Ｈａｎａｕ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によりＤＮＡを集めた。ＤＮＡペレッ
トをＴＥ緩衝液に溶解した。この操作により製造されたＤＮＡは、すべての目的
、サザンブロット法またはゲノムライブラリーの構築に使用することができた。
【０１３７】 実施例２：Corynebacterium glutamicum ATCC13032のEscherichia Coliにおける
ゲノムライブラリーの構築 実施例１に記載したように製造されたＤＮＡを用いて、コスミッドおよびプラ
スミドライブラリーが、公知で、よく確立された方法に従って構築された(例え
ば、Sambrook,Jら、(1989)'Molecular Cloning:A Laboratory Manual', Cold Sp
ring Harbor Laboratory PressまたはAusubel,F.Mら(1994) 'Current Protocols
in Molecular Biology', John Wiley and Sons.を参照）。
【０１３８】 どんなプラスミドまたはコスミッドでも使用することができた。特別に、プラ
スミドpBR322（Sutcliffe, J.G.(1979) Proc.Natl.Acad.Sci.USA,75:3737-3741)
;pACYC177 (Change とCohen(1978) J.Bacteriol 134:1141-1156),pBSの系列のプ
ラスミド(pBSSK+,pBSSK-およびその他；Stratagene LaJolla,USA),またはSuperC
os1（Stratagene LaJolla,USA)、Lorist6(Gibson,T.J.,Rosenthal A.およびWate
rson,R.H.(1987) Gene 53:283-286)のコスミッドが使用された。特にC.glutamic
umにおいて使用するためのジーンライブラリーは、プラスミドpSL109( Lee,H.S.
およびA.J.Sinskey(1994) J.Microbiol.Biotechnol.4:256-263)を用いて構築す
ることができる。
【０１３９】 実施例３：ＤＮＡシーケンスとコンピューターによる機能解析 実施例２に記載されたゲノムライブラリーを標準的な方法、特にＡＢＩ３７７
シーケンスマシーンを用いた鎖成長停止反応法（例えばFleischman,R.D.ら(1995
)'Whole-genome Random Sequencing and Assembly of Haemophilus Influenzae
Rd.',Science, 269:496-512参照）に従ったＤＮＡシーケンスに使用した。以下
のヌクレオチド配列のシーケンスプライマーが使用された：5'-GGAAACAGTATGACC
ATG-3'または5'-GTAAAACGACGGCCAGT-3'。
【０１４０】 実施例４：生体内突然変異誘発 Corynebacterium glutamicumの生体内突然変異誘発が、E.coliまたは他の微生
物(例えばBacillus spp.またはSaccharomyces cerevisiaeなどの酵母）であって
その遺伝子情報の完全性を保つための能力が減じられているものを通して、プラ
スミド（または他のベクター）の通過により行なうことができる。典型的なミュ
ーテーター株は、ＤＮＡ修復システム（例えばmutHLS,mutD,mutTその他；Rupp,W
.D.(1996) DNA repair mechanisms,Escherichia coli and Salmonella,p2277-22
94,ASM:Washington参照）の遺伝子に変異を持っている。このような株は当業者
によく知られている。このような株の使用は、例えばGreener,A.およびCallahan
,M.(1994) Strategies 7:32-34に記載されている。
【０１４１】 実施例５：Escherichia coli および Corynebacterium glutamicumの間のＤＮＡ
転換 いくつかのCorynebacteriumとBrevibacterium種は自律的に複製する(例えば、
Martin, J.F.ら(1987) Biotechnology, 5:137-146参照）内因性プラスミド（例
えばpHM1519またはpBL1)を含む。Escherichia coliとCorynebacuterium glutami
cumのシャトルベクターは、E.coliの標準ベクター（Sambrook,J.et al.(1989),'
Molecular Cloning:A Laboratory Manual',Cold Spring Harbor Laboratory Pre
ssまたはAusubel,F.M.et al.(1994)'Current Protocols in Molecular Biology'
, John Wiley and Sons)を用いて、これに、開始または複製のおよび適当なCory
nebacterium glutamicum由来のマーカーを加えることで容易に構築することがで
きる。このような複製の開始点は、好ましくはCorynebacteriumとBrevibacteriu
m種から単離された内因性プラスミドからもたらされる。これらの種の形質転換
マーカーとして、カナマイシン耐性の遺伝子（Ｔｎ５またはＴｎ９０３トランス
ポゾンから誘導されたもの）またはクロラムフェニコール耐性遺伝子（Winnacke
r,E.L.(1987)'From Genes to Clones-Introduction to Gene Technology,VCH,We
inheim)が特に用いられる。E.coli とC.glutamicumの双方でおいて複製するシャ
トルベクターの広範囲の構築の文献は数多く例があり、遺伝子過剰発現を含むい
くつかの目的に使用することができる（例えば、Yoshihama,M.et al.(1985) J.B
acteriol. 162:591-597, Martin,J.F.et al.(1987) Biotechnology,5:137-146
およびEikmanns,B.J.et al.(1991) Gene, 102:93-98参照）。
【０１４２】 標準的な方法を用いて、上述のように注目の遺伝子をシャトルベクターの一つ
ヘクローンすることが可能であり、またこのようなハイブリッドベクターをCory
nebacterium glutamicum株に導入することが可能である。C.glutamicumの形質転
換を、プロトプラスト形質転換（Kastsumata,R.et al.(1984) J.Bacteriol. 159
306-311),エレクトロポレーション（Liebl,E.et al.(1989)FEMS Microbiol.Lett
ers,53:399-303)そして特別のベクターが用いられた場合には、接合（例えば Sc
haefer,A et al.(1990)J.Bacteriol.172:1663-1666に記載）によって達成するこ
とができる。C.glutamicumからのプラスミドＤＮＡの製造（周知の標準的な方法
を用いて）およびそのE.Coliへの形質転換によるC.glutamicumからE.coliへのシ
ャトルベクターの転換も可能である。この形質転換の段階は、標準的な方法を用
いて行なうことができるが、Ｍｃｒ−不足E.coli株、例えばＮＭ５２２(Gough a
nd Murray(1983)J.Mol.Biol.166:1-19)を使用することが有利である。
【０１４３】 遺伝子は、ｐＣＧ１（U.S.patent No.4617267)またはその断片、任意でＴＮ９
０３（Grindley,N.D.and Joyce,C.M.(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77(12):717
6-7180)からのカナマイシン耐性遺伝子を含むプラスミドを用いたC.glutamicum
株中に過剰発現させることができる。加えて、遺伝子は、プラスミドｐＳＬ１０
９（Lee,H.S and A.J.Sinskey(1994) J.Microbiol Biotechnol.4:256-263)を用
いてC.Glutamicum株中に過剰発現することができる。
【０１４４】 複製プラスミドに加えて、遺伝子の過剰発現は、ゲノムへの組み込みによって
達成することができる。C.glutamicum または他のCorynebacteriumまたはbrevib
acterium種における遺伝子組み込みは、周知の方法、例えばゲノム領域での相同
性組換え、制限エンドヌクレアーゼ仲介の組み込み（ＲＥＭＩ）（例えばDE pat
ent 19823834)またはトランスポゾンの使用などによって達成することができる
。調節領域（例えば、プロモーター、レプレッサー、および／またはエンハンサ
ー）を配列の修飾、挿入、サイト−ダイレクテド法（例えば相同性組換え）によ
る削除、またはランダムイベントに基づく方法（例えばトランスポゾン突然変異
誘発またはＲＥＭＩ）により変形することにより、注目遺伝子の活性を変化させ
ることもできる。転写ターミネーターとして機能する核酸配列は、本発明の一以
上の遺伝子のコード領域へ３'挿入されることもできる。このようなターミネー
ターは、周知であり、例えばWinnacker, E.L. (1987)From Genes to Clones-Int
roduction to Gene Technology. VCH: Weinheim中に記載されている。
【０１４５】 実施例６：変異タンパク質の発現の評価 形質転換された宿主細胞中の変異タンパク質の活性の観察は、変異タンパク質
が、野生種のタンパク質と類似した形態と類似した量で発現されるという事実に
基づいている。変異遺伝子（遺伝子産物に対する転写に用いられるｍＲＮＡの量
のインジケーター）の転写のレベルを確認するために有用な方法は、ノーザン・
ブロット法（Ausubel et al.(1988) Current Protocols in Molecular Bioloｇy
, Wiley: New York参照)であり、注目遺伝子に結合するように設計されたプライ
マーが、検出タグ（通常放射性または化学ルミネセンス）により、生物の培養の
総ＲＮＡを抽出し、ゲルに流し、安定マトリックスに移動させ、このプローブで
インキュベートする場合に、プローブの結合および結合の量が、この遺伝子のｍ
ＲＮＡの存在と量を示すようにラベルされている。この情報は、変異遺伝子の転
写の程度の証拠である。全部の細胞のＲＮＡは、いくつかの周知の方法、例えば
、 Bormann, E.R. et al. (1992) Mol. Microbiol. 6:317-326に記載された方法
により、Corynebacterium glutamicumから製造することができる。
【０１４６】 このｍＲＮＡから翻訳されたタンパク質の存在と比較量の評価のために、ウェ
スタン・ブロッド法などの標準的な技術が使用され得る(例えばAusubel et al.
(1988) Current Protocols in Molecular Biology, Wiley: New York参照)。こ
の方法では、全部の細胞のタンパク質は、抽出され、ゲル電気泳動により分離さ
れ、ニトロセルロースのようなマトリックスに移され、設計されたタンパク質に
特異的に結合する抗体などのプローブとともにインキュベートされる。このプロ
ーブは、一般に容易に検出可能な化学ルミネセンスまたは比色のラベルでタグが
つけられている。観察されたラベルの存在と量は、細胞中の所望の変異タンパク
質の存在と量を示す。
【０１４７】 実施例７：遺伝子的に修飾されたCorynebacteriaの成長−媒体および培養条件 遺伝子的に修飾されたCorynebacterium glutamicumは、合成または天然成長媒
体中で培養される。Corynebacteriaの異なった成長媒体の多くはどちらも知られ
ており、容易に入手可能である(Lieb et al. (1989) Appl. Microbiol. Biotech
nol., 32:205-210; von der Osten et al. (1998) Biotechnology Letters, 11:
11-16; Patent DE 4,120,867; Liebl (1992)'The Genus Corynebacterium, in:
The Procaryotes, Volume II, Balows, A. et al., eds. Spring-Verlag)。これ
らの媒体は、一種以上の炭素源、窒素源、無機塩、ビタミンおよび痕跡の要素か
らなる。好ましい炭素源は、モノ−、ジ−またはポリサッカライドなどの砂糖で
ある。例えば、グルコース、フルクトース、マンノース、ガラクトース、リボー
ス、ソルボース、リブロース、ラクトース、マルトース、スクロース、ラフィノ
ース、デンプンまたはセルロースが非常によい炭素源として働く。糖蜜または他
の砂糖精製の副生成物のような複合化合物によって媒体に砂糖を供給することも
可能である。異なった炭素源の混合物を供給することも有利である。他の可能な
炭素源は、メタノール、エタノール、酢酸、乳酸などのアルコールおよび有機酸
である。窒素源は通常有機または無機の窒素化合物か、またはこれらの化合物を
含む材料である。窒素源として例えば、アンモニアガス、アンモニウム塩（例え
ばＮＨ４Ｃｌまたは（ＮＨ４）２ＳＯ４）、ＮＨ４ＯＨ、硝酸塩、尿素、アミノ
酸、コーンスティープリカー、大豆粉、大豆タンパク質、酵母抽出物、肉抽出物
などの複合窒素源が含まれる。
【０１４８】 媒体に含まれる無機塩化合物は、クロリド−、リン酸、硫酸のカルシウム塩、
マグネシウム塩、ナトリウム塩、コバルト塩、モリブデン塩、カリウム塩、マグ
ネシウム塩、亜鉛塩、銅塩、鉄塩を含む。金属イオンを溶液中に保持するために
媒体中にキレート化合物を加えることができる。特に有用なキレート化合物は、
カテコールやプロトカテチュエートなどのジヒドロキシフェノールまたはクエン
酸などの有機酸を含む。ビタミンなどの成長因子または成長促進剤、例えばビオ
チン、リボフラビン、チアミン、葉酸、ニコチン酸、パントテン酸塩、ピリドキ
シンなどを含む媒体が典型的である。成長因子および塩はしばしば酵母抽出物、
糖蜜、コーンスティープリカーなどの複合媒体成分に由来する。正確な媒体化合
物の組成は、直接の実験に強く依存し、各々の特定の場合に個々に決定される。
媒体の最適化の情報は、テキストブックApplied Microbiol. Physiology, A Pra
ctical Approach (eds. P.M. Rhodes, P.F. Stanbury, IRL Press (1997) pp.53
-73, ISBN 019 963577 3) から入手可能である。成長媒体を市販品、例えば標準
1(Merck)またはBHI(grain heart infusion, DIFCO)などから選定することも可能
である。
【０１４９】 すべての媒体成分は、熱（１．５×１０５Ｐａ、１２１℃で２０分間）または
ろ過殺菌法のいずれかにより殺菌される。成分は、一緒に、または所望により分
割して殺菌することができる。すべての媒体成分は、成長の初期に存在させるか
、または任意に連続的にまたは回分式に加えることができる。
【０１５０】 培養条件は各々の実験のために分けて定義される。温度は、１５℃から４５℃
の範囲であるべきである。温度を一定に保つか、実験中に変えることができる。
媒体のｐＨは、５から８．５、好ましくは７．０前後の範囲であるべきであり、
媒体に緩衝液を添加することで一定に保つことができる。この目的のための緩衝
液の例は、リン酸カリウム緩衝液である。MOPS, HEPES, ACESその他の合成緩衝
液を代わりに、または同時に使用することができる。成長の間にＮａＯＨまたは
ＮＨ４ＯＨを添加することより一定の培養ｐＨを保つことも可能である。酵母抽
出物などの複合媒体成分が使用される場合、多くの複合成分は高い緩衝能力があ
るという事実によって、追加の緩衝液が必要ないかもしれない。微生物の培養に
発酵槽を使用する場合、ｐＨはアンモニアガスにより制御することもできる。
【０１５１】 インキュベート時間は通常数時間から数日の範囲である。この時間は、ブロス
の中に蓄積される生成物を最大にするように選択される。開示された成長実験は
、種々の容器、例えばミクロタイター板、ガラス管、ガラスフラスコ、または種
々のサイズのガラスまたは金属発酵槽等の中で行なうことができる。多数のクロ
ーンのスクリーニングのために、微生物をミクロタイター板、ガラス管、振とう
フラスコ中、バッフル付きで、またはなしで培養すべきである。好ましくは１０
０ｍｌの振とうフラスコを使用し、所望の成長媒体の１０容積％で満たす。フラ
スコを１００から３００ｒｐｍの速さの範囲を使用して、ロータリーシェーカー
（ふり幅２５ｍｍ）で振とうすべきである。蒸発ロスは湿潤雰囲気中に保つこと
によって少なくすることができる。代わりに、蒸発ロスの数学的補正が行なわれ
るべきである。
【０１５２】 遺伝子的に修飾されたクローンを試験した場合、修飾されていないコントロー
ルのクローンまたはいかなる挿入もなされていない基本的なプラスミドを含むコ
ントロールのクローンも試験するべきである。媒体を寒天平板上、例えばＣＭプ
レート（10g/lのグルコース、2.5g/lのNaCl、2g/lの尿素、10g/lのポリペプトン
、5g/lの酵母抽出物、5g/lの肉抽出物、22g/lの寒天、2M NaOHによるｐＨ６．８
としたもの）を３０℃でインキュベートしたもので成長させた細胞を用いて０．
５−１．５のＯＤ６００まで接種する。媒体の接種は、ＣＭプレートからのC.gl
utamicum細胞のサリーン懸濁液の導入、またはこのバクテリアの前培養液の添加
のいずれかによりなされる。
【０１５３】 実施例８：変異タンパク質の機能のインビトロ解析 酵素の活性と速度論的パラメーターの決定は、先行技術でよく確立されている。
得られた改変された酵素の活性決定のための実験は、当業者の能力の範囲内で、
野生種酵素の比活性に対して行なわれなければならない。一般に酵素についての
概要は、構造、速度論的、原理、方法、適用および多数の酵素の活性の決定例に
関する特定の詳細と同様に、例えば以下の参照に見出される：Dixon, M., and W
ebb, E.C., (1979) Enzymes. Longmans: London; Fersht, (1985) Enzyme Struc
ture and Mechanism. Freeman: New York; Walsh, (1979) Enzymatic Reaction
Mechanisms. Freeman: San Francisco; Price, N.C., Stevens, L. (1982) Fun
damentals of Enzymology. Oxford Univ. Press:Oxford; Boyer, P.D., ed(1983
) The Enzymes, 3rd ed. Academic Press: New York; Bisswanger, H., (1994)
Enzymkinetic, 2nd ed. VCH: Weinheim (ISBN 3527300325), Bergmeyer, H.U.,
Bergmeyer, J., Grassl, M., eds. (1983-1986) Methods of Enzymatic Analysi
s, 3rd ed., vol. I-XII, Verlag Chemie: Weinheim; and Ullmann's Encyclope
dia of Industrial Chemistry (1987) vol. A9, 'Enzymes'. VCH: Weinheim, p.
352-363.。
【０１５４】 ＤＮＡと結合するタンパク質の活性は、数種のよく確立された方法、例えばＤ
ＮＡバンド−シフトアッセイ（ゲル遅延アッセイとも呼ばれる）により測定する
ことができる。他の分子の発現におけるこのようなタンパク質の効果は、レポー
ター遺伝子アッセイ（例えばKolmar, H. et al. (1995) EMBO J. 14: 3895-3904
および引用文献に記載されたような） を用いて測定される。レポーター遺伝子
試験系は、周知であり、ベータ−ガラクトシダーゼ、緑蛍光性タンパク質および
その他数種の酵素を用いて、原核および真核細胞のどちらにでも適用が確立され
ている。
【０１５５】 膜輸送タンパク質の活性の決定は、例えばGennis, R.B. (1989) 'Pores, Chan
nels and Transporters', in Biomembranes, Molecular Structure and Functio
n, Springer; Heidelberg, p. 85-137; 199-234; and 270-322に記載されたよう
な技術に従って行なわれる。
【０１５６】 実施例９：所望の製造物の製造における変異タンパク質の感化の解析 所望の化合物（例えばアミノ酸）の製造におけるC.Glutamicumの遺伝子修飾の
効果は、適当な条件（例えば上述の）下の改変された微生物成長および媒体及び
／または細胞成分の増加した所望の製造物（即ちアミノ酸）の生成の解析によっ
て評価することができる。このような解析法は当業者に周知であり分光法、薄層
クロマトグラフィー、種々の染色法、酵素的および微生物学的方法、高速液体ク
ロマトグラフィーのような解析クロマトグラフィー（例えばUllman, Encycloped
ia of Industrial Chemistry, vol. A2, p. 89-90 and p. 443-613, VCH: Weinh
eim (1985); Fallon, A. et al., (1987) 'Applications of HPLC in Biochemistry 'in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, vol. 17; Rehm et al. (1993) Biotechnology, vol. 3, Chapter III:
'Product recovery and purification', page 469-714, VCH: Weinheim; Belte
r, P.A. et al. (1988) Bioseparations: downstream processing for biotechn
ology, John Wiley and Sons; Kennedy, J.F. and Cabral, J.M.S. (1992) Reco
very processes for biological materials, John Wiley and Sons; Shaeiwitz,
J.A. and Henry, J.D.(1988) Biochemical separations, in: Ullmann's Encyc
lopedia of Industrial Chemistry, vol. B3, Chapter 11, page 1-27, VCH: We
inheim; and Dechow, F.J. (1989) Separation and purification techniques i
n biotechnology, Noyes Publications参照)を含む。
【０１５７】 最終発酵生成物の測定に加えて、所望の化合物の生産に使用された代謝経路の
他の成分、例えば中間体、副生成物を、化合物の製造の全体の効率を決定するた
めに解析することもできる。解析法は、媒体中の栄養剤（例えば砂糖、炭化水素
、窒素源、ホスファートおよび他のイオン）のレベルの測定、バイオマス組成物
と成長の測定、通常の生合成経路の代謝物の製造の解析、発酵の間に生成したガ
スの測定を含む。これらの測定のための標準的な方法は、Applied Micro Physio
logy, A Practical Approach, P.M. Rhodes and P.F. Stanbury, eds., IRL Pre
ss, p. 103-129; 131-163; and 165-192 (ISBN: 0199635773) および引用文献に
概説してある。
【０１５８】 実施例１０：C.glutamicum培養からの所望の製造物の精製 C.glutamicum細胞からまたは上述の培養物の上澄みからの所望の製造物の回収
は、周知の種々の方法により行なうことができる。所望の製造物が細胞から隠さ
れていない場合、細胞を培養物から低速遠心分離により回収することができ、細
胞を機械的力または超音波のような標準的な方法で溶解することができる。細胞
の破片を遠心分離で取り除き、可溶性タンパク質を含む上澄み画分を所望の化合
物のさらなる精製のために保持する。製造物がC.glutamicum細胞から隠されてい
る場合、細胞を培養物から低速遠心分離により取り除き、上澄み画分をさらなる
精製のために保持する。
【０１５９】 双方の精製法からの上澄み画分を、適当なレジンであって、所望の分子がクロ
マトグラフィーレジンに保持され、サンプル中の多くの不純物が保持されないか
、または不純物がレジンにより保持され、サンプルが保持されないようなレジン
を用いたクロマトグラフィーで処理する。このようなクロマトグラフィーの工程
は、必要に応じて、同じまたは異なるクロマトグラフィーレジンを用いて繰り返
すことができる。当業者は、適当なクロマトグラフィーレジンの選択と、精製さ
れる特別の分子への最も効率的な適用に精通しているであろう。精製された製造
物はろ過または限外ろ過により濃縮し、製造物の安定性が最も大きくなる温度で
保存することができる。
【０１６０】 広い範囲の精製法が周知であり、前述した精製法は範囲の減縮を意味しない。
このような精製法が、例えば Bailey, J.E. & Ollis, D.F. Biochemical Engine
ering Fundamentals, McGraw-Hill: New York (1986)に記載されている。
【０１６１】 単離した化合物の同定と純度が、先行技術で標準的な方法で評価される。これ
らは、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、分光学的方法、染色法、薄層
クロマトグラフィー、ＮＩＲＳ、酵素的または微生物学的アッセイを含む。この
ような解析方法は、Petek et al. (1994) Appl. Environ. Microbiol. 60: 133-
140; Malakhova et al.(1996) Biotekhnologiya 11: 27-32; and Schmidt et al
. (1988) Bioprocess Engineer. 19: 67-70. Ulmann's Encyclopedia of Indust
rial Chemistry, (1996) vol. A27, VCH: Weinheim, p. 89-90, p. 521-540, p.
540-547, p. 559-566, 575-581 and p. 581-587; Michal, G. (1999) Biochemic
al Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley
and Sons; Fallon, A. et al. (1987) Applications of HPLC in Biochemistry
in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, vol. 17
に記載されている。
【０１６２】 実施例１１：本発明の遺伝子配列の解析 配列の比較と、２個の配列の間の相同性の百分率の決定は、公知の技術であり
、数学的アルゴリズム、例えばKarlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad.
Sci. USA. 87: 2264-68のアルゴリズムで、Karlin and Altschul (1993) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-77に記載のように変形されたものなどを使用
して行なうことができる。このようなアルゴリズムは、Altschul, et al. (1990
) J. Mol. Biol. 215: 403-10のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（
バージョン２．０）に組み入れられている。ＢＬＡＳＴヌクレオチド探索は、Ｎ
ＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、語長＝１２によって、本発明のＳＭＰ
核酸分子に対するヌクレオチド配列の相同性を得るために行なうことができる。
ＢＬＡＳＴタンパク質探索は、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、語長＝
３によって、本発明のＳＭＰタンパク質分子に対するアミノ酸配列の相同性を得
るために行なうことができる。比較の目的で、間隙のあけられたアライメントを
得るために、ギャップドＢＬＡＳＴをAltschul et al., (1997) Nucleic Acids
Res. 25(17):3389-3402に記載のように使用することができる。ＢＬＡＳＴおよ
びギャップドＢＬＡＳＴプログラムの使用に際して、当業者はプログラム（例え
ばＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のパラメーターの、解析される特定の配列
のための最適化の方法についてよく知っている。
【０１６３】 配列の比較に使用される数学的アルゴリズムの他の例は、Meyers とMiller （
(1988) Comput. Appln. Biosci. 4: 11-17）のアルゴリズムである。このような
アルゴリズムは、ＧＣＧシーケンスアライメントソフトウェアパッケージの一部
であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み入れられている。ＡＬ
ＩＧＮプログラムをアミノ酸配列の比較のために使用する場合、ＰＡＭ１２０重
量残渣表、１２のギャップ長さペナルティー、４のギャップペナルティーを使用
することができる。さらに配列解析に使用されるアルゴリズムが公知であり、Ａ
ＤＶＡＮＣＥおよびＡＤＡＭ（Torelli and Robotti (1994) Comput. Appl. Bio
sci. 10:3-5に記載）および FASTA（ Pearson and Lipman (1988) P.N.A.S. 85:
2444-8に記載）を含む。
【０１６４】 ２本のアミノ酸配列の間の相同性の百分率は、ＧＣＧソフトウェアパッケージ
中のＧＡＰプログラム（http: //www.gcg.comで入手可能）を用い、Ｂｌｏｓｕ
ｍ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、１２、１０、
８、６、または４の間隙重さ、２、３または４の長さ重さを用いて行なうことが
できる。２本の核酸配列の間の相同性の百分率は、標準的なパラメーター、例え
ば間隙重さが５０、および長さ重さが３などを用いて、ＧＣＧソフトウェアパッ
ケージ中のＧＡＰプログラムを用いて決定することができる。
【０１６５】 本発明の遺伝子配列と、遺伝子バンクに存在する配列の比較解析が先行技術に
おいて公知の技術を用いて行なわれた（例えばBexevanis and Ouellette, eds.
(1998) Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Pr
oteins. John Wiley and Sons: New York参照)。本発明の遺伝子配列が、遺伝子
バンクに存在する遺伝子と、３段階の工程で比較された。第一段階で、遺伝子バ
ンクに存在するヌクレオチド配列に対する本発明の配列の各々について、ＢＬＡ
ＳＴＮ解析（例えばローカルアライメント解析）が行なわれた。最初にヒットし
た５００個についてさらに解析が続けられた。次いでＦＡＳＴＡ探索（例えば、
結合されたローカルおよびグローバルアライメント解析で、配列の限定された領
域を整列させる）が、これらの５００個について行われた。各々の本発明の遺伝
子配列は次いで全体的に、ＦＡＳＴＡの頭の３個のヒットの各々について、ＧＣ
Ｇソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラムを用いて（標準的なパラメータ
ーを使用して）整列させられる。正しい結果を得るために、遺伝子バンクから抽
出された配列の長さは、周知の方法により質問の配列の長さに調整された。この
解析の結果は、表４にまとめられている。得られた結果は、遺伝子バンクの参照
の各々と比較した本発明の遺伝子の各々においてＧＡＰ（グローバル）解析を単
独で行なったときに得られるであろう結果と一致したが、このようなデータベー
スを広げて行なったＧＡＰ（グローバル）解析と比較して明らかに計算時間が短
縮された。切り捨て値を上回るアライメントが得られなかった本発明の配列を、
アライメントの情報なく表４に示した。表４に、'％相同性（ＧＡＰ）'の見出し
で記載されたＧＡＰアライメント相同性百分率は、'，'は小数点を表すヨーロッ
パの数の形式で、並べられているということは、当業者によってさらに理解され
るであろう。例えば、このカラム中の'４０，３４５'の値は、４０．３４５％を
表す。
【０１６６】 実施例１２：ＤＮＡマイクロアレイの構築と操作 本発明の配列を追加で、ＤＮＡマイクロアレイ（デザイン、方法論、ＤＮＡア
レイの使用は周知であり、例えばSchena, M. et al. (1995) Science 270: 467-
470; Wodicka, L. et al. (1997) Nature Biotechnology 15:1359-1367; DeSaiz
ieu, A. et al. (1998) Nature Biotechnology 16: 45-48; and DeRisi, J.L. e
t al. (1997) Science 278: 680-686に記載されている。)の構築と適用に使用す
ることができる。
【０１６７】 ＤＮＡマイクロアレイは、ニトロセルロース、ナイロン、ガラス、シリコーン
または他の材料からなる固体または柔軟性のある支持体である。核酸分子を、注
文された方法で表面に取り付けることができる。適当なラベリングのあと、他の
核酸または核酸混合物を固定された核酸分子にハイブリダイズすることができ、
限定された領域でハイブリダイズされた分子の個々の信号強度を検知し、測定す
るためにラベルを使用することができる。この方法論は、適用された核酸サンプ
ルまたは混合物中のすべてあるいは選択された核酸の相対量または絶対量を同時
に定量化することを可能にする。このためＤＮＡマイクロアレイは、並行して多
数の（６８００以上）核酸の発現を解析することを可能とする（Schena, M. (19
96) BioEssays 18(5): 427-431参照）。
【０１６８】 本発明の配列は、ポリメラーゼ連鎖反応のような核酸増幅反応によって、１種
以上のC.glutamicum遺伝子の限定された領域を増幅することができるオリゴヌク
レオチドプライマーの設計に使用することができる。５'または３'オリゴヌクレ
オチドプライマーあるいは適当なリンカーの選択と設計は、上述の支持媒体（例
えばSchena, M. et al. (1995) Science 270: 467-470にも記載されている。）
の表面に対する、得られたＰＣＲ産物の共有結合を可能とする。
【０１６９】 核酸マイクロアレイは、Wodicka,L.et al.(1997) Nature Biotechnology 15:1
359-1367に記載されたようにその場のオリゴヌクレオチド合成によっても構築す
ることができる。写真平板法により、マトリックスの正確に限定された領域が露
光される。光不安定な保護基はこれによって活性化され、ヌクレオチド付加が進
行し、一方光からマスクされた領域はいかなる修飾も進行しない。続く保護と光
活性化のサイクルは、限定された位置における異なったオリゴヌクレオチドの合
成を可能とする。小さい、限定された本発明の遺伝子の領域は、マイクロアレイ
上で、固相オリゴヌクレオチド合成により合成することができる。
【０１７０】 ヌクレオチドのサンプルまたは混合物の中に存在する本発明の核酸分子は、マ
イクロアレイに対してハイブリダイズすることができる。これらの核酸分子は標
準的な方法でラベルすることができる。要するに、核酸分子（例えば、ｍＲＮＡ
分子またはＤＮＡ分子）は、例えば、逆転写またはＤＮＡ合成の間、放射性同位
元素によりまたは蛍光によりラベルされたヌクレオチドの組み込みによりラベル
される。ラベルされた核酸のマイクロアレイに対するハイブリダイゼーションは
、例えば Schena, M. et al. (1995) supra; Wodicka, L. et al. (1997), supr
a; and DeSaizieu A. et al (1998), supraに記載されている。ハイブリダイズ
された分子の検出と定量化は、特定の組み込まれたラベルにより行なわれる。放
射性のラベルは例えばSchena, M. et al. (1995) supraに記載されたように検出
することができ、蛍光ラベルは例えばShalon et al. (1996) Genome Research 6
: 639-645の方法により検出することができる。
【０１７１】 本発明の配列のＤＮＡマイクロアレイ技術に対する適用は、上述したように、
C.glutamicumまたは他のCorynebacteriaの異なった株の比較解析を可能とする。
例えば、個々の転写の特徴に基づく内部株の変種の研究および特定するために重
要な遺伝子の同定および／または所望の株の特性、例えば病原性、生産性、およ
びストレス寛容などの同定は、核酸アレイ方法論により促進される。発酵反応の
進行の間の、本発明の遺伝子の発現の特徴の比較は、核酸アレイ技術を用いるこ
とで可能である。
【０１７２】 実施例１３：細胞タンパク質ポピュレーションの動力学的解析（プロテオミクス
） 本発明の遺伝子、組成、方法は、タンパク質のポピュレーションの相互作用お
よび動力学（プロテオミクスと定義する）の研究に適用することができる。注目
のタンパク質ポピュレーションは、C.glutamicum(例えば他の生物のタンパク質
ポピュレーションと比較して）、特定の環境または代謝条件下（例えば高いまた
は低い温度で、または高いまたは低いｐＨでの発酵の間）で活性なタンパク質ま
たは特定の成長および発達の相の間に活性なタンパク質の総タンパク質ポピュレ
ーションを含むが、これに限定されない。
【０１７３】 タンパク質ポピュレーションは、種々の周知の技術、例えばゲル電気泳動など
により解析することができる。細胞タンパク質は、例えば細胞溶解または抽出に
より得られ、種々の電気泳動技術を用いて互いに分離することができる。ドデシ
ル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）は、タ
ンパク質をその分子量に基づいて大部分分離する。等電点のポリアクリルアミド
ゲル電気泳動（ＩＥＦ−ＰＡＧＥ）は、タンパク質をその等電点（アミノ酸配列
を反映するのみならずタンパク質の後翻訳修飾も反映する）により分離する。他
の、さらに好ましいタンパク質解析の方法は、２−Ｄ−ゲル電気泳動（例えばHe
rmann et al. (1998) Electrophoresis 19: 3217-3221; Fountoulakis et al. (
1998) Electrophoresis 19: 1193-1202; Langen et al. (1997) Electrophoresi
s 18: 1184-1192; Antelmann et al. (1997) Electrophoresis 18: 1451-1463に
記載されている)として知られるＩＥＦ−ＰＡＧＥとＳＤＳ−ＰＡＧＥの連続す
る組み合わせである。他の分離技術、例えばキャピラリーゲル電気泳動などもタ
ンパク質の分離に利用することができ、このような技術は、周知である。
【０１７４】 これらの方法論により分離されたタンパク質は、標準的な技術、例えば染色ま
たはラベリングにより可視化することができる。適当な染色は公知であり、Coom
assie ブリリアントブルー、銀染色、蛍光染料、例えばＳｙｐｒｏ Ｒｕｂｙ（
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を含む。C.glutamicumの媒体中にある、放
射性物質によりラベルされたアミノ酸またはその他のタンパク質前駆体（例えば ３５ Ｓ−メチオニン、３５Ｓ−システイン、１４Ｃ−ラベルされたアミノ酸、１ ５ Ｎ−アミノ酸、１５ＮＯ３または１５ＮＨ４ ＋またはＣ１３ラベルされたアミ
ノ酸）の含有物は、分離に先立ってこれらの細胞からタンパク質をラベルするこ
とを可能とする。同様に、蛍光ラベルを使用することができる。これらのラベル
されたタンパク質は、抽出され、単離され、前述した技術に従って分離される。
【０１７５】 これらの技術により可視化されたタンパク質はさらに、使用された染料または
ラベルの量を測定することにより解析することができる。得られたタンパク質の
量は、定量的に、例えば光学的方法を用いて決定することができ、同様のゲルま
たは他のゲル中の他のタンパク質の量と比較することができる。ゲル上のタンパ
ク質の比較は、例えば光学的比較、分光学的、ゲルのイメージスキャンおよび解
析、または写真フィルムおよびスクリーンの使用を通じて行なうことができる。
このような技術は周知である。
【０１７６】 得られたタンパク質を同定するために、直接シーケンスまたは他の標準的な技
術を使用することができる。例えば、Ｎ−および／またはＣ末端アミノ酸シーケ
ンス（例えばエドマン分解）を、マススペクトロメトリー（特にＭＡＬＤＩまた
はＥＳＩ技術（例えばLangen et al. (1997) Electrophoresis 18: 1184-1192参
照））として使用することができる。ここで提供されたタンパク質配列を、これ
らの技術によりC.glutamicumタンパク質の同定のために使用することができる。
【０１７７】 これらの方法により得られた情報は、タンパク質の存在、活性、種々の生物学
的条件（例えば、異なった生物、発酵の時点、媒体条件、または異なったビオト
ープ、その他）からの異なったサンプルの間の修飾の様式の比較に使用すること
ができる。このような実験から単独で、または他の技術との組み合わせにより得
られたデータは、様々な適用、例えば与えられた（例えば代謝的）状況にある種
々の生物の挙動の比較、精密化学品を産出する株の生産性の上昇、または精密化
学品の製造の効率の上昇などに使用することができる。
【０１７８】 同等物 当業者は、わずかの型にはまった実験を用いて、ここに記載された発明の特定
の態様に対する多くの同等物を認識するか、確認することができるであろう。こ
のような同等物は、請求の範囲に含まれる。
【配列表】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｐ 13/04 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｍ 21/02 33/566 Ｃ１２Ｑ 1/68 33/569 Ｆ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｒ 1:15 33/566 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/569 Ａ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 5/00 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｒ 1:15） (31)優先権主張番号 １９９ ３１ ６３４．１ (32)優先日 平成11年７月８日(1999．7．8) (33)優先権主張国 ドイツ（ＤＥ） (31)優先権主張番号 １９９ ３１ ４１２．８ (32)優先日 平成11年７月８日(1999．7．8) (33)優先権主張国 ドイツ（ＤＥ） (31)優先権主張番号 １９９ ３１ ４１３．６ (32)優先日 平成11年７月８日(1999．7．8) (33)優先権主張国 ドイツ（ＤＥ） (31)優先権主張番号 １９９ ３１ ４１９．５ (32)優先日 平成11年７月８日(1999．7．8) (33)優先権主張国 ドイツ（ＤＥ） (31)優先権主張番号 １９９ ３１ ４２０．９ (32)優先日 平成11年７月８日(1999．7．8) (33)優先権主張国 ドイツ（ＤＥ） (31)優先権主張番号 １９９ ３１ ４２４．１ (32)優先日 平成11年７月８日(1999．7．8) (33)優先権主張国 ドイツ（ＤＥ） (31)優先権主張番号 １９９ ３１ ４２８．４ (32)優先日 平成11年７月８日(1999．7．8) (33)優先権主張国 ドイツ（ＤＥ） (31)優先権主張番号 １９９ ３１ ４３１．４ (32)優先日 平成11年７月８日(1999．7．8) (33)優先権主張国 ドイツ（ＤＥ） (31)優先権主張番号 １９９ ３１ ４３３．０ (32)優先日 平成11年７月８日(1999．7．8) (33)優先権主張国 ドイツ（ＤＥ） (31)優先権主張番号 １９９ ３１ ４３４．９ (32)優先日 平成11年７月８日(1999．7．8) (33)優先権主張国 ドイツ（ＤＥ） (31)優先権主張番号 １９９ ３１ ５１０．８ (32)優先日 平成11年７月８日(1999．7．8) (33)優先権主張国 ドイツ（ＤＥ） (31)優先権主張番号 ６０／１４３，２０８ (32)優先日 平成11年７月９日(1999．7．9) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 １９９ ３２ １８０．９ (32)優先日 平成11年７月９日(1999．7．9) (33)優先権主張国 ドイツ（ＤＥ） (31)優先権主張番号 １９９ ３２ ２２７．９ (32)優先日 平成11年７月９日(1999．7．9) (33)優先権主張国 ドイツ（ＤＥ） (31)優先権主張番号 １９９ ３２ ２３０．９ (32)優先日 平成11年７月９日(1999．7．9) (33)優先権主張国 ドイツ（ＤＥ） (31)優先権主張番号 １９９ ３３ ００５．０ (32)優先日 平成11年７月14日(1999．7．14) (33)優先権主張国 ドイツ（ＤＥ） (31)優先権主張番号 １９９ ３２ ９２４．９ (32)優先日 平成11年７月14日(1999．7．14) (33)優先権主張国 ドイツ（ＤＥ） (31)優先権主張番号 １９９ ３２ ９７３．７ (32)優先日 平成11年７月14日(1999．7．14) (33)優先権主張国 ドイツ（ＤＥ） (31)優先権主張番号 １９９ ４０ ７６５．７ (32)優先日 平成11年８月27日(1999．8．27) (33)優先権主張国 ドイツ（ＤＥ） (31)優先権主張番号 ６０／１５１，５７２ (32)優先日 平成11年８月31日(1999．8．31) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 １９９ ４２ ０７６．９ (32)優先日 平成11年９月３日(1999．9．3) (33)優先権主張国 ドイツ（ＤＥ） (31)優先権主張番号 １９９ ４２ ０７９．３ (32)優先日 平成11年９月３日(1999．9．3) (33)優先権主張国 ドイツ（ＤＥ） (31)優先権主張番号 １９９ ４２ ０８６．６ (32)優先日 平成11年９月３日(1999．9．3) (33)優先権主張国 ドイツ（ＤＥ） (31)優先権主張番号 １９９ ４２ ０８７．４ (32)優先日 平成11年９月３日(1999．9．3) (33)優先権主張国 ドイツ（ＤＥ） (31)優先権主張番号 １９９ ４２ ０８８．２ (32)優先日 平成11年９月３日(1999．9．3) (33)優先権主張国 ドイツ（ＤＥ） (31)優先権主張番号 １９９ ４２ ０９５．５ (32)優先日 平成11年９月３日(1999．9．3) (33)優先権主張国 ドイツ（ＤＥ） (31)優先権主張番号 １９９ ４２ １２３．４ (32)優先日 平成11年９月３日(1999．9．3) (33)優先権主張国 ドイツ（ＤＥ） (31)優先権主張番号 １９９ ４２ １２５．０ (32)優先日 平成11年９月３日(1999．9．3) (33)優先権主張国 ドイツ（ＤＥ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ， ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 シュレダー，ハルトヴィッヒ ドイツ、Ｄ−69226、ヌスロッホ、ゲーテ シュトラーセ、５ (72)発明者 ツェルダー，オスカル ドイツ、Ｄ−67346、シュパイァ、ロスマ ルクトシュトラーセ、27 (72)発明者 ハーバーハウエル，グレーゴル ドイツ、Ｄ−67117、リムブルガーホーフ、 モーゼルシュトラーセ、42 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA03 AA05 AA07 BA07 BA71 BA80 CA04 DA05 DA10 EA04 FA02 FA15 GA11 HA01 HA03 4B063 QA01 QA18 QA19 QQ06 QQ42 QQ52 QR08 QR42 QR55 QR62 QS25 QS34 QS36 QX02 4B064 AB01 AE03 AF01 AG01 CA02 CA19 CC24 DA01 DA10 DA11 DA16 4B065 AA22X AA24X AA24Y AB01 BA01 CA02 CA17 CA18 CA19 CA24 CA27 CA41 CA43 CA47 CA50 CA52 4H045 AA10 AA20 AA30 BA10 CA11 DA00 DA89 EA01 EA05 EA15 EA20 FA72 FA74

Claims (38)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】核酸分子が表１に記載されたＦ表示遺伝子のいずれも含まない
    、ＳＭＰタンパク質をコードするコリネバクテリウム−グルタミカムから単離さ
    れた核酸分子または一部。
  2. 【請求項２】当該核酸分子がファインケミカルの製造に関与するＳＭＰタン
    パク質をコードする請求項１に記載の単離された核酸分子。
  3. 【請求項３】核酸分子が表１に記載されたＦ表示遺伝子のいずれも含まない
    、配列表の奇数の番号付けがされた配列番号（SEQ ID NO)に示された配列からな
    る群より選択された、単離されたコリネバクテリウム−グルタミカムの核酸分子
    またはその一部。
  4. 【請求項４】核酸分子が表１に記載されたＦ表示遺伝子のいずれも含まない
    、配列表の偶数の番号付けがされた配列番号（SEQ ID NO)に示された配列からな
    る群より選択されたポリペプチド配列をコードする単離された核酸分子。
  5. 【請求項５】核酸分子が表１に記載されたＦ表示遺伝子のいずれも含まない
    、配列表の偶数の番号付けがされた配列番号（SEQ ID NO)に示された配列からな
    るアミノ酸配列の群から選択された、ポリペプチドの自然に発生する対立性変異
    体をコードする単離された核酸分子。
  6. 【請求項６】核酸分子が表１に記載されたＦ表示遺伝子のいずれも含まない
    、配列表の奇数の番号付けがされた配列番号（SEQ ID NO)に示された配列からな
    る群より選択されたヌクレオチド配列に対し、少なくとも５０％の相同性を持つ
    ヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子またはその一部。
  7. 【請求項７】核酸分子が表１に記載されたＦ表示遺伝子のいずれも含まない
    、配列表の奇数の番号付けがされた配列番号（SEQ ID NO)に示された配列からな
    る群より選択されたヌクレオチド配列を含み、少なくとも１５個のヌクレオチド
    の核酸フラグメントを含む、単離された核酸分子。
  8. 【請求項８】緊縮条件下で請求項１から７のいずれかに記載の核酸分子とハ
    イブリダイズする単離された核酸分子。
  9. 【請求項９】請求項１から８のいずれかに記載の核酸分子またはその一部、
    および異種ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸。
  10. 【請求項１０】請求項１から９のいずれかに記載の核酸分子を含むベクター
    。
  11. 【請求項１１】発現ベクターである、請求項１０に記載のベクター。
  12. 【請求項１２】請求項１１に記載の発現ベクターによりトランスフェクショ
    ンされた宿主細胞。
  13. 【請求項１３】前記細胞が微生物である請求項１２に記載の宿主細胞。
  14. 【請求項１４】前記細胞が、コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウ
    ム属に属する請求項１３に記載の宿主細胞。
  15. 【請求項１５】前記核酸分子の発現により、前記細胞からのファインケミカ
    ルの製造が調節される請求項１２に記載の宿主細胞。
  16. 【請求項１６】ファインケミカルが、有機酸、タンパク質原アミノ酸および
    非タンパク質原アミノ酸、プリンおよびピリミジン塩基、ヌクレオシド、ヌクレ
    オチド、脂質、飽和および不飽和の脂肪酸、ジオール、炭水化物、芳香族化合物
    、ビタミン、補助因子、ポリケチド、および酵素からなる群より選択される請求
    項１５に記載の宿主細胞。
  17. 【請求項１７】適当な培地中で請求項１２に記載の宿主細胞を培養し、これ
    によりポリペプチドを製造することを含む、ポリペプチドの製造方法。
  18. 【請求項１８】コリネバクテリウム−グルタミカム由来の単離されたＳＭＰ
    ポリペプチドまたはその一部。
  19. 【請求項１９】前記ポリペプチドがファインケミカルの製造に関与する、請
    求項１８に記載のポリペプチド。
  20. 【請求項２０】アミノ酸配列が、表１に記載されたＦ表示遺伝子のいずれに
    よってもコードされていない、配列表の偶数の番号付けがされた配列番号（SEQ
    ID NO)に示された配列からなる群より選択されたアミノ酸配列を含む、単離され
    たポリペプチド。
  21. 【請求項２１】アミノ酸配列が、表１に記載されたＦ表示遺伝子のいずれに
    よってもコードされていない、配列表の偶数の番号付けがされた配列番号（SEQ
    ID NO)に示された配列からなる群より選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチ
    ドの、自然に発生する対立性変異体を含む単離されたポリペプチドおよびその一
    部。
  22. 【請求項２２】さらに異種アミノ酸配列を含む、請求項１８から２１のいず
    れかに記載の単離されたポリペプチド。
  23. 【請求項２３】核酸分子が表１に記載されたＦ表示遺伝子のいずれも含まな
    い、配列表の奇数の番号付けがされた配列番号（SEQ ID NO)に示された配列から
    なる群より選択された核酸に対し、少なくとも５０％の相同性を持つヌクレオチ
    ド配列を含む核酸分子によりコードされた単離されたポリペプチド。
  24. 【請求項２４】アミノ酸配列が、表１に記載されたＦ表示遺伝子のいずれに
    よってもコードされていない、配列表の偶数の番号付けがされた配列番号（SEQ
    ID NO)に示された配列からなる群より選択されたアミノ酸配列に対し、少なくと
    も５０％の相同性を持つアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド。
  25. 【請求項２５】請求項１２に記載のベクターを含む細胞を培養してファイン
    ケミカルを製造する、ファインケミカルの製造方法。
  26. 【請求項２６】さらに培養物からファインケミカルを回収する工程を含む、
    請求項２５に記載の方法。
  27. 【請求項２７】さらに請求項１１に記載のベクターで細胞をトランスフェク
    ションし、ベクターを含む細胞を得る工程を含む請求項２５に記載の方法。
  28. 【請求項２８】細胞が、コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属
    に属する、請求項２５に記載の方法。
  29. 【請求項２９】当該細胞が、コリネバクテリウム−グルタミカム, コリネバ
    クテリウム−ヘルキュリス、コリネバクテリウム−リリウム、コリネバクテリウ
    ム−アセトアシドフィリウム、コリネバクテリウム−アセトグルタミカム、コリ
    ネバクテリウム−アセトフィリウム、コリネバクテリウム−アンモニアゲン、
    コリネバクテリウム−フジオケンス、コリネバクテリウム−ニトリロフィリウス
    、 ブレビバクテリウム−アンモニアゲン、ブレビバクテリウム−ブタニカム、
    ブレビバクテリウム−ジバリカツム、ブレビバクテリウム−フラビウム、ブレビ
    バクテリウム−ヘアリ、ブレビバクテリウム−ケトグルタミカム、ブレビバクテ
    リウム−ケトソレダクタム、ブレビバクテリウム−ラクトフェルメンツム、ブレ
    ビバクテリウム−リネンス、ブレビバクテリウム−パラフィノリツカム、および
    表３に記載の株からなる群より選択される、請求項２５に記載の方法。
  30. 【請求項３０】前記ベクターによる核酸分子の発現により、前記ファインケ
    ミカルの製造の調節される請求項２５に記載の方法。
  31. 【請求項３１】当該ファインケミカルが、有機酸、タンパク質原アミノ酸お
    よびタンパク質原アミノ酸、プリンおよびピリミジン塩基、ヌクレオシド、ヌク
    レオチド、脂質、飽和および不飽和の脂肪酸、ジオール、炭水化物、芳香族化合
    物、ビタミン、補助因子、ポリケチド、および酵素からなる群より選択される、
    請求項２５に記載の方法。
  32. 【請求項３２】ファインケミカルがアミノ酸である、請求項２５に記載の方
    法。
  33. 【請求項３３】アミノ酸が、リジン、グルタマート、グルタミン、アラニン
    、アスパルタート、グリシン、セリン、トレオニン、メチオニン、システイン、
    バリン、ロイシン、イソロイシン、アルギニン、プロリン、ヒスチジン、チロシ
    ン、フェニルアラニン、およびトリプトファンから成る群より選択される、請求
    項３２に記載の方法。
  34. 【請求項３４】請求項１から９のいずれかに記載の核酸分子の含有によって
    ゲノムＤＮＡが変異した細胞を培養する工程を含むファインケミカルの製造方法
    。
  35. 【請求項３５】配列が表１に記載のＦ−表示配列のいずれでもなく、Ｆ−表
    示配列のいずれにもコードされていない、配列表の１から７８２の配列番号（SE
    Q ID NO)の１種以上の存在を患者から検出する工程を含み、これにより患者のコ
    リネバクテリウム−ジフテリアの存在または活性を診断する、コリネバクテリウ
    ム−ジフテリアの存在または活性を診断する方法。
  36. 【請求項３６】配列表の奇数の番号付けがされた配列番号（SEQ ID NO)に示
    された核酸分子からなる群より選択される核酸分子を含み、核酸分子が混乱して
    いる宿主細胞。
  37. 【請求項３７】配列表の奇数の番号付けがされた配列番号に示された核酸分
    子からなる群より選択される核酸分子を含み、核酸分子が配列表の奇数の番号付
    けがされた配列番号に示された配列からの１個以上の核酸の修飾を含む、宿主細
    胞。
  38. 【請求項３８】配列表の奇数の番号付けがされた配列番号に示された核酸分
    子からなる群より選択される核酸分子を含み、核酸分子の調節領域が、分子の野
    生種の調節領域と関連して修飾されている、宿主細胞。
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