JP2003516762A

JP2003516762A - リボ核酸を標識する方法、及びそれにより得られた標識化ｒｎａ断片

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Publication number: JP2003516762A
Application number: JP2001545583A
Authority: JP
Inventors: アリ・ラーヨン; デューク・ドー; チャールズ・ギャレット・ミヤダ
Original assignee: ベーイーオー・メリュー; アフィメトリックスインコーポレイテッド
Priority date: 1999-12-17
Filing date: 1999-12-17
Publication date: 2003-05-20
Also published as: CA2394392A1; EP1238115A1; ATE445713T1; CN1166784C; HK1050552A1; CA2394392C; WO2001044506A1; ES2334471T3; DE69941546D1; AU785085B2; AU1791200A; CN1391616A; EP1238115B1

Abstract

(57)【要約】本発明は、リボ核酸（ＲＮＡ）をシグナル増幅で標識する方法であって、上記ＲＮＡを断片化する工程、第１のリガンドを、上記ＲＮＡの各断片の３’末端及び／又は５’末端に位置する末端ホスフェートに固定化する工程であって、上記末端ホスフェートは、上記断片化の間に放出されたものである工程、標識化剤を上記第１のリガンドに結合する工程を含むことを特徴とする方法に関する。本発明は好ましくは医療診断の分野に適用される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】

本発明は、シグナル増幅でのリボ核酸（ＲＮＡ）の標識化のための新規な方法
に関する。

【０００２】

【従来の技術】

従来技術は、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、又は核酸の標識化のための
多数の方法が存在することを示す。オリゴヌクレオチドと核酸は、ポリヌクレオ
チドと称する。ポリヌクレオチドは、合成の間、又は少なくとも一の標識化ヌク
レオチドを導入することにより標識化することができる。

【０００３】第１の方法は、標識を、塩基に付着させることを含み、塩基は天然の塩基又は
修飾塩基のいずれかでもよい。第２の方法は、糖に標識を付着させることを提案
しており、やはり糖は天然の糖又は修飾の糖のいずれかでもよい。第３の方法は
、ホスフェートに標識を付着させることに関する。

【０００４】実際に、ヌクレオチド又はヌクレオチドアナログ又は核酸を標識する当業者は
、塩基又は糖に標識を付着しようとする。これはより便利であり、より多くの選
択肢を与えるものである。さらに、塩基の場合、ＥＰ−Ａ−０．３２９．１９８
、ＥＰ−Ａ−０．３０２．１７５、ＥＰ−Ａ−０．０９７．３７３、ＥＰ−Ａ−
０．０６３．８７９、ＵＳ−Ａ−５，４４９，７６７、ＵＳ−Ａ−５，３２８，
８２４、ＷＯ−Ａ−９３／１６０９４、ＤＥ−Ａ−３．９１０．１５１及びＥＰ
−Ａ−０．５６７．８４１、糖の場合、ＥＰ−Ａ−０．２８６．８９８などの多
くの文献に、記載されているものがある。これら文献の各々は、あらゆる目的で
ここに参照として取りこまれる。

【０００５】ホスフェートに標識を付着させる技術は、特に核酸が水溶性で、この媒体での
ホスフェートの反応性が有機溶媒でのそれに比べて低いために、より複雑である
。

【０００６】そうであっても、いくつかの文献は、ホスフェートを標識化する技術を提案し
ている。これは例えば、文献ＥＰ−Ａ−０．２８０．０５８に当てはまり、これ
はあらゆる目的で参照としてここに取りこまれるものであり、ホスフェートに標
識を付着することによりヌクレオチドの標識化を記載しており、このホスフェー
トは、、ヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチドであるとき、糖に３’及び／
又は５’の位置で付着しており、ヌクレオチドがリボヌクレオチドであるとき、
２’、３’、及び／又は５’位置で付着している。この文献は、上述の少なくと
も一の標識化ヌクレオチドを含むポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドも記
載しており、このヌクレオチドは、合成の間ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレ
オチドに取りこまれる。

【０００７】しかしながら、文献ＥＰ−Ａ−０．２８０．０５８で提案されている標識化戦
略は、核酸を均一に標識化することができない。標識化ヌクレオチドのポリヌク
レオチドへの取りこみは、制御することができない。それは合成されたポリヌク
レオチドの組成物に完全に依存するものである。こうして、いくつかのポリヌク
レオチドは、多数の標識化ヌクレオチドを含むことができるが、他のものは全く
含むことができない。その結果、これらの核酸から発せられるシグナルの強度が
均一ではなくなり、したがって、核酸を検出するときに結果を解釈することが困
難となる。

【０００８】この場合、標識化は、標識化ヌクレオチドの位置の制御なしに、生物学的に取
りこまれる。

【０００９】文献ＵＳ−Ａ−５，３１７，０９８は、あらゆる目的でここに参照として取り
こまれるが、これはそれらの５’末端で標識化される核酸に関するものである。
この付着は、イミダゾールとリンカーアームを用いる。標識化と関連する断片化
はない。さらに、ホスフェートが、核酸に添加され、したがって、キナーゼはホ
スフェートを取りこむ手段として用いられ、少なくとも一の付加的生物学的工程
をもたらす。この文献は、１５ｍｅｒのオリゴヌクレオチドの標識化を記載して
いる。オリゴヌクレオチドに代えて大きな核酸を用いるとき、この技術は５’末
端だけの標識の存在をもたらし、標識化核酸の特異的活性は低い。

【００１０】さらに、標識化が断片化工程（開裂工程ともいう）なしで大きな核酸で行なわ
れるとき、それらの相補配列に対するこれらの標識化核酸のハイブリダイゼーシ
ョンの反応速度は低く、ハイブリダイゼーション収率が低下する。これらはした
がってシグナルの定量的及び定性的損失をもたらすことになる。立体障害はこの
反応における鍵となるファクターである。

【００１１】立体障害は、核酸の長さの結果だけではなく、２次構造の存在の結果かもしれ
ない。断片化は、これらの構造を破壊する（又は減ずる）のを助け、こうしてハ
イブリダイゼーションを最適化する。立体障害は、高い濃度の捕捉プローブを含
む固体表面、例えば、Affymetrix Inc.社により開発されたＤＮＡアレイ（”Acc
essing Genetic Infromation with High-Density DNA arrays”, M.Chee,ら、Sc
ience,274,610-614,1996。 ”Light-generated oligonucleotide arrays for ra
pid DNA sequence analysis”, A. Caviani Pease,ら、Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 91, 5022-5026, 1994, ＵＳ−５７４４３０５，ＵＳ−５４４５９３４）
へのハイブリダイゼーションの場合、特に重要な役割を演ずる。これらの各参照
文献は、あらゆる目的でここにとりこまれる。この技術において、捕捉プローブ
は、一般的にサイズが減少し、約２０ヌクレオチドの長さとなる。

【００１２】従来より、核酸の断片化について多くの方法が記載されている。

【００１３】第１に、断片化は、酵素的に行なうことができ、すなわち、核酸はヌクレアー
ゼで断片化することができる（ＤＮＡ分解酵素又はＲＮＡ分解酵素）（Methods
in Enzymol.152巻、S.Berger及びA.Kimmelら、Academic Press,1987,Enzymatic
techniques and Recombinant DNA Technology,《Guide to Molecular cloning》
, p91-110, Molecular Cloning, a Laboratory Manual, J. Sambrook, E.F. Fri
tsch及びT.Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press、第２版、P.5.30-
5.95,1989）。これらの各文献はあらゆる目的でここに取りこまれる。関与する
酵素により、この反応は、それらの５’又は３’末端にヒドロキシル又はモノホ
スフェート基のいずれかを有する小さな断片又はモノマーを生成する。

【００１４】第２に、断片化は化学的に行なうことができる。例えば、ＤＮＡ配列の場合、
アルキル化剤を用いるプリン脱離、又はピリミジン脱離は、脱塩基部位を生成し
、ついで、「β−脱離」と呼ばれる機構により塩基の存在下で断片化される（T.
Lindahlら，Rate of Chain breakage at apurinic sites in double-stranded d
eoxyribonucleic acid., Biochemistry, 11, p3618-3623, 1972）。ＤＮＡはと
りわけ酸化、アルキル化またはフリーラジカル付加機構により、断片化すること
ができる（M.Liuzziら、Characterization and damage in gamma-irradiated an
d OsO4-treated DNA using methoxyamine., Int. J. Radiat.Biol,54,p709-722,
1988）。金属カチオンは、しばしば化学的触媒として有機分子と組み合わせて用
いられ、例えばイミダゾールは、ＲＮＡ‘ｓの断片化に用いられる（R.Breslow
及びR.Xu,Recognition and catalysis in nucleic acid chemistry, Proc. Natl
. Acad. Sci. USA. 90, p1201-1207, 1993. J. Hovinenら、Imidazole Tethered
Oligonucleotides: Synthesis and RNA cleaving activity, J. Org. Chem., 6
0, p2205-2209, 1995）。この断片化は好ましくはアルカリ媒体中で行なわれ、
３’ホスフェート末端を有する断片を生成する。これらの文献の各々は、ここに
あらゆる目的のために参照として取りこまれる。

【００１５】しかしながら、これらの断片化の目的は、標識化を容易にしたり、可能にした
りするものではない。

【００１６】文献ＷＯ−Ａ−８８／０４３００は、酵素特性を有するＲＮＡ分子、すなわち
リボザイムを用いたＲＮＡの断片化と標識化の方法を提案している。これらのリ
ボザイムによる開裂触媒は、配列特異的であり、反応は、５’末端にヒドロキシ
ル基（ＯＨ）を３’末端にモノホスフェートを有するＲＮＡ断片を生じる。標識
化は、放射性標識だけであり、ついで、ＧＴＰ分子由来の添加された放射性ホス
フェートのとりこみにより行なわれる。それはこれらのリボザイムカテゴリーの
ホスホトランスフェラーゼ活性、すなわちキナーゼ活性である。放射性ホスフェ
ート付着は、５’末端でのヒドロキシル基においてだけで行なわれ、断片化で得
られるホスフェート基は、ＲＮＡ断片への標識の付着のためには用いられない。
さらに、断片化はリボザイムによってのみ行なわれ、リボザイムと開裂されるタ
ーゲット核酸との間の特異性の存在を意味している。ホスフェートはついで、標
識として機能する。

【００１７】

【発明が解決しようとする課題】

我々の発明は、開裂の間放出される核酸断片のホスフェートへの標識付着を可
能にする。特異性は存在しないので、あらゆるタイプの核酸をランダムに断片化
することができる。生成された断片の各クラスの標識収率は、その配列と組成に
全く依存していないので、このアプローチを用いて標識の強度の均一性を得るこ
とができる。こうして、我々の方法は、例えば、検出プローブを調製することを
可能にする。最後に、ホスフェートは、核酸と標識の間のリンカーアームだけで
ある。

【００１８】シグナル増幅の技術は、例えば、ＷＯ９５／０８０００、又は論文J. Histoch
em. Cytochem. 45: 481-491, 1997（これらの各々は、あらゆる目的のために素
の全体が参照として取りこまれる）に記載されているように、イムノアッセイ又
は核酸プローブの分野で周知であるが、標識化の間に協同した断片化は記載され
ていない。

【００１９】シグナル増幅での標識の前の断片化の方法は、従来技術には記載されていない
。

【００２０】

【課題を解決するための手段】本発明は、したがって、これまでに言及した欠点を克服する方法を提案するも
のである。こうして、この方法は、一度断片化が完了すれば均一に標識化される
ＲＮＡ断片を得ることを可能にする。さらに、断片化は、可能なハイブリダイゼ
ーションのために最適なサイズの断片を得ることを可能にする。ハイブリダイゼ
ーションの質が改善されれば、標識化断片のハイブリダイゼーションの後の検出
は、より迅速で効率的となるであろう。最後に、本発明は、生成されるシグナル
強度とバックグラウンドに対するシグナルの比率を増加させることにより、感度
を改善する。

【００２１】こうして、本発明は合成又は天然のリボ核酸（ＲＮＡ）をシグナル増幅で標識
する方法であって、 −上記ＲＮＡを断片化する工程、 −第１のリガンドを、上記ＲＮＡの各断片の３’末端及び／又は５’末端に位置
する末端のホスフェートに固定化する工程であって、上記末端ホスフェートは、
上記断片化の間に放出されたものである工程、 −標識化剤を上記第１のリガンドに結合する工程を含むことを特徴とする方法に関する。

【００２２】

【発明の実施の形態】

本発明において、ＲＮＡ（リボ核酸又はポリリボ核酸）は、合成又は天然のＲ
ＮＡである。

【００２３】当業者は、合成ＲＮＡを得る方法を熟知しているであろう。これらの方法は、
例えば、増幅技術（例えば、Kozal M.J.ら、Nature Medicine,2(7),753-758,199
6,参照、あらゆる目的でその全体が参照として取りこまれる）、転写増幅技術、
又はＴＭＡ（転写媒介増幅）、ＮＡＳＢＡ（核酸配列ベース増幅）、３ＳＲ（セ
ルフサステインドシークエンス増幅）、Qβレプリカーゼ増幅、酵素による天然
ＲＮＡ消化、及びポリリボヌクレオチド化学合成（例えば、米国特許第５，５５
４，５１６号及び第５，７６６，８４９号及びClin. Microbiol. Rev., 5(4), p
.370-386, 1992参照、これらの各々はここにその全体が参照として取りこまれる
）を含むＲＮＡ産物をもたらす他の方法を含む。合成ＲＮＡは、少なくとも一の
修飾ヌクレオチドまたは少なくとも一の修飾ヌクレオチド内結合例えばチオフォ
スフェートを含むＲＮＡでもある。天然ＲＮＡは、細胞からの抽出により得られ
るＲＮＡ、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、リボゾーマルＲＮＡ（ｒ
ＲＮＡ）、又はトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）である。標識化は、検出可能
なシグナルを生成することができる標識の付着である。以下は、これらの標識の
非制限的なリストである。

【００２４】・検出可能なシグナルを生成する酵素、例えば、比色法、蛍光、発光、例えば
ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリンホスファターゼ、β−ガラク
トシダーゼ、及びグルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、・発色団、例えば蛍光及び発色化合物及び染料・電子顕微鏡により、又はそれらの電気特性、例えば導電性、電流測定、電圧
測定及びインピーダンスにより検出することができる電子密度を有する基・検出可能な基、例えば、その分子がそれらの物理的及び／又は化学的特性に
おける検出可能な修飾を誘導するために十分なサイズのもの、この検出は、回折
、表面プラズモン共鳴、表面変動及び接触変動の角度、又は原子力分光及びトン
ネル効果などの物理的方法の各光学的方法により、行なうことができる。・放射性分子例えば、³²Ｐ、³⁵Ｓ又は¹²⁵Ｉ。標識を含む化合物は標識化剤である。

【００２５】「固定化」なる用語は、共有又は非共有結合を創出することを意味する。ホス
フェート又はチオホスフェート選択的抗体は、非共有結合を創出する手段である
。実施の好適な態様によれば、固定化は、実施例に記載するような共有結合であ
る。

【００２６】本発明の一の態様によれば、断片化と固定化は一工程で行なわれる。

【００２７】本発明の別の態様によれば、断片化と固定化は二工程で行なわれる。

【００２８】第１の態様によれば、第１のリガンドへの標識化剤の結合は、共有結合である
。共有結合を可能にする異なる反応性官能基は、当業者に周知のものであり、コ
ンジュゲーションのいくつかの例は、例えば、《Bioconjugate techniques》 He
rmanson G.T., Academic Press, San Diego, 1996に見出され、これはあらゆる
目的でその全体が参照として取りこまれる。

【００２９】第２の態様によれば、第１のリガンドへの標識化剤の結合は、非共有結合であ
る。非共有結合は、例えば、イオン性又は静電相互作用、ファンデルワールス相
互作用、水素結合又は異なる相互作用の組み合わせを含む結合である。

【００３０】好ましい態様において、上記第１のリガンドへの標識化剤の結合は、間接的に
行なわれる。第１のリガンドは、末端ホスフェートに固定化され、第１の抗リガ
ンドに結合し、上記第１のリガンドは第２のリガンドに結合し、標識化剤は、少
なくとも一の標識を有し、上記第２のリガンドに反応することができる第２の抗
リガンドである。

【００３１】（抗リガンド／リガンド）の組み合わせは、特異的に共に反応することができ
る２つの化合物を意味する。

【００３２】第１のリガンド／第１の抗リガンドと第２のリガンド／第２の抗リガンドの組
み合わせは、例えば、ビオチン／ストレプタビジン、ハプテン／抗体、抗原／抗
体、ペプチド／抗体、糖／レクチン及びポリヌクレオチド／相補ポリヌクレオチ
ドからなる群より選択される。

【００３３】これらの異なる組み合わせ及び他の組み合わせは、周知であり、例えば、BioM
erieux出願ＷＯ９６／１９７２９、ＷＯ９４／２９７２３、ＷＯ９５／０８００
０に記載されており、これらはここに参照として取りこまれる。

【００３４】第１と第２のリガンドは同一又は異なるものである。

【００３５】実施の好適な態様において、第１のリガンドは、フルオレセインの誘導体であ
り、第２のリガンドはビオチンの誘導体である。

【００３６】実施の異なる好適な態様において、第１のリガンドは、ビオチンの誘導体であ
り、第１の抗リガンドは、ストレプタビジンの誘導体である。

【００３７】シグナル増幅を増加させるために他のエンティティ（リガンド／抗リガンド）
を積み重ねることに制限はない。例えば、（第２のリガンド／第１の抗リガンド
）エンティティは、ホスフェートに固定されている第１のリガンドに結合し、つ
いで（第３のリガンド／第２の抗リガンド）エンティティは第２のリガンドに結
合し、標識化剤は少なくとも一の標識を有し、第３のリガンドに反応することが
できる第３の抗リガンドである。

【００３８】異なるエンティティの添加は、少なくとも一の工程で行なうことができ、又は
各エンティティは、ホスフェートへのリガンドの固定化の後に、連続して添加す
ることができる。

【００３９】実施の好ましい態様によれば、ＲＮＡの各断片の３’末端への第１のリガンド
の固定化は、出発ＲＮＡの３’及び／又は５’末端を構成する断片を離れて行な
われる。付加的にあるいは代替的に、ＲＮＡの各断片の５’末端への第１のリガ
ンドの固定化は、出発ＲＮＡの５’末端を構成する断片を離れて行なわれる。

【００４０】どの態様であっても、ＲＮＡ断片の３’末端又は５’末端への第１のリガンド
の固定化が、リボースに対して、２’位置、３’位置又は環状モノホスフェート
２’−３’位置にあるホスフェートと、上記第１のリガンドに保有されている反
応性官能基との反応により行われる。

【００４１】ＲＮＡ断片の３’末端又は５’末端への第１のリガンドの断片化及び／又は固
定化が、リボースに対して、２’位置、３’位置又は環状一ホスフェート２’−
３’位置にあるホスフェートと、上記第１のリガンドに保有されている求核性、
求電子性、ハライド官能基との反応により行われる。

【００４２】ＲＮＡ断片化が酵素的に、化学的に、又は物理的に行われる。

【００４３】ＲＮＡの酵素的断片化がヌクレアーゼにより行われる。

【００４４】ＲＮＡの化学的断片化が、化学的触媒と結合していても、結合していなくても
よい金属カチオンにより行われる。

【００４５】この場合、金属カチオンが、Ｍｇ⁺⁺、Ｍｎ⁺⁺、Ｃｕ⁺⁺、Ｃｏ⁺⁺、及び／又はＺ
ｎ⁺⁺イオンであり、化学的触媒が、イミダゾール、置換されたアナログ、例えば
Ｎ−メチルイミダゾール、またはＲＮＡに対して親和性を有し、イミダゾール核
又は置換されたアナログを含むあらゆる化学分子を含む。

【００４６】ＲＮＡの物理的断片化は、音波破砕又は放射により行なわれる。

【００４７】適切なすべての例で、ＲＮＡ断片の３’末端又は５’末端への上記第１のリガ
ンドの固定化が、リボースの２’位置、３’位置又は環状モノホスフェート２’
−３’位置に結合しているホスフェートと、分子Ｒ−Ｘ（Ｒは上記第１のリガン
ドからなり、Ｘは、ヒドロキシル、アミン、ヒドラジン、アルコキシアミン、ハ
ロゲン化アルキル、ハロゲン化フェニルメチル、ヨードアセタミド又はマレイミ
ドからなる群より選ばれる反応性官能基である）との反応により行われる。好ま
しい例において、Ｘはハロゲン化アルキル、ハロゲン化フェニルメチル、ヨード
アセタミド、又はマレイミドである。リガンドの固定化を容易にするために、リ
ンカーアームは、リガンドと反応性官能基の間に、任意に存在する。好ましい態
様において、Ｒ−Ｘは、Ｎ−（ビオチノイル）−Ｎ’−（ヨードアセチル）エチ
レンジアミン、（＋）−ビオチニル−ヨードアセタミジル−３，６−ジオキサオ
クタンジアミン、Ｎ−ヨードアセチル−Ｎ−ビオチニルヘキシレンジアミン、５
−（ブロモメチル）フルオレセインである。

【００４８】本発明は、上記方法で得られたＲＮＡ断片をも含む。ＲＮＡ断片は、３’末端
又は５’末端に、断片化の間に放出された末端ホスフェートにおいて標識された
単一のヌクレオチドを有する。

【００４９】このＲＮＡ断片は１０乃至１５０ヌクレオチドを含み、プローブ又はターゲッ
トへのＲＮＡ断片のハイブリダイゼーションを容易にするために、好ましくは３
０乃至７０ヌクレオチド、好ましくは４０乃至６０ヌクレオチドを含む。

【００５０】好適な実施態様によれば、ＲＮＡ断片は、少なくとも一のチオホスフェートヌ
クレオチドを含む。

【００５１】さらに、リガンドを有するヌクレオチドはチオホスフェートヌクレオチドであ
る。

【００５２】好ましい実施態様によれば、ＲＮＡ断片は、少なくとも一のビオチンを有する
抗フルオレセイン抗体に結合したフルオレセインを有するホスフェート又はチオ
フォスフェートを３’末端に含み、上記抗体は、標識化ストレプラビジンに結合
している。

【００５３】本発明は、上記ＲＮＡ断片の、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ又はＲＮＡ断片及び／
又はＤＮＡ断片を検出するためのプローブとしての使用に関する。

【００５４】最後に、本発明は、捕捉プローブに結合することができる標識化ターゲットと
しての、上記ＲＮＡ断片の使用に関する。図面と実施例は特定の実施態様を示し、本発明の範囲を制限するものとして考
えられるものではない。

【００５５】

【実施例】

実施例１：ＲＮＡアンプリコンでのＬＤＣ（開裂の間の標識化）の間のシグナル
増幅１．１アンプリコンの調製単離物から、細菌（Mycobacterium tuberculosis(ATCC-27294、Lowenstein-Je
nsen培地；３乃至５ｍｍ径；約１０⁸細菌)の１又は２の新たに増殖したコロニー
を、スパチュラの端でほぐし、１．５ｍｌエッペンドルフチューブの２５０μｌ
の滅菌水中に、再懸濁した。細菌分散液をガラスビーズの存在下でボルテックス
で攪拌して、培地物質から、全核酸を取り出した。５μｌアリコートの溶解物を
PCRに直接添加した。１６超可変領域を、Micobacterium genusプライマー（M.Tu
berculosis参照配列M20940［ジーンバンク］上の位置２１３乃至２３６と３９４
乃至４１５；M.tuberculosis アンプリコンサイズは２０２ｂｐである。）で、
ＰＣＲ増幅した。プライマーは、それらの５’末端に、さらにバクテリオファー
ジT3又はT7プロモーター配列のいずれかを含んでいた。

【００５６】［配列１］

【００５７】ＰＣＲは、５０ｍＭ、ＫＣｌ、１０ｍＭトリス（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭＭ
ｇＣｌ₂、０．００１％（wt/vol）ゼラチン、５％（vol/vol）ジメチルスルホキ
シド、０．５μＭ（各）プライマー、２００μＭ（各）デオキシヌクレオチドト
リホスフェート、及び１．５ＵのTaqポリメラーゼ（AmpliTaq;Perkin-Elmer,Nor
wark,Corm,）を含む、１００μｌの反応容量で行なった。PCRは、Perkin Elmer
2400 サーマルサイクラーにおいて、９４℃５分間の最初の変性工程と、９４℃
４５秒、６０℃３０秒、７２℃３０秒のサイクル条件で３５サイクル、及び最後
のサイクルを７２℃１０分間行なった。ＰＣＲ産物は、アガロースゲル電気泳動
で分析した。

【００５８】インビトロ転写により、標識化一本鎖ＲＮＡターゲットを作製するために、プ
ロモータータグＰＣＲアンプリコンを用いた。反応混合物２０μｌは、約５０n
ｇのPCR産物、２０UのT3又はT7RNAポリメラーゼ（Promega）；４０ｍＭトリスア
セテート（ｐH８．１；１００ｍＭＭｇ（アセテート）₂；１０ｍＭジチオスレ
イトール；１．２５ｍＭリボヌクレオチドトリホスフェート（ＡＴＰ，ＣＴＰ、
ＧＴＰ、及びＵＴＰ）を含む。反応は、３７℃１ｈで行なった。

【００５９】１．２アンプリコンの開裂の間の標識化１．１に記載したように、ＲＮＡアンプリコンを調製した。ＲＮＡ分子（１μ
ｌの反応混合物）に、６μｌのイミダゾール（純水中０．１Ｍ）、６μｌのＭｎ
Ｃｌ₂（純水中１Ｍ）、及び２μｌの５−（ブロモメチル）フルオレセイン（Mol
ecular Probes、Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ，ＵＳＡ，参照Ｂ１３５５により提供され
る５−ＢＭＦ；ＤＭＳＯ中１００ｍＭ）及び純水を最終容量１００μｌで添加し
た。反応性媒体は、ホモゲナイズし、６５℃３０分間インキュベートした。

【００６０】１．３ＤＮＡアレイ分析のプロトコール Mycobacteriaアンプリコンの分析に用いたＤＮＡチップは、J. Clin. Microbi
ol., 37 (1),P.49-55,1999でA.Troeschらにより記載されたものと同じものであ
る。あらゆる目的でその全体がここに参照として取りこまれる。分析は、GeneAr
ray(登録商標)スキャナー、GeneChip（登録商標）フルイディクスステーション
、GeneChip（登録商標）分析ソフトウェアを含む、GeneChip（登録商標）器械シ
ステム（参照９００２２８、Affymetrix,Santa Clara,CA）で行なった。

【００６１】１．４抗体染色ハイブリダーゼーションの第１の工程は、上述の参照として取りこまれた論文
に記載されたプロトコールを用いてＤＮＡアレイで行なった。アレイはついで、洗浄し、３００μｌのＭＥＳ（参照Aldrich16373-2,純水中
２Ｍ）、２．４μｌのアセチル化ウシ血清アルブミン、６μｌの正常ヤギＩｇＧ
、１．２μｌの抗フルオレセイン抗体、及び６００μｌの最終溶液とする純水を
含む染色溶液を用いて、染色の第２の工程を行なった。

【００６２】抗フルオレセイン、ウサギＩｇＧ分画、ビオチンＸＸコンジュゲート（Ａｂ抗Ｆｂｉｏｔ）を Molecular Probes(Eugene,OR,参照Ａ−９８２)により供給し
た。

【００６３】アセチル化ウシ血清アルブミン（アセチル化ＢＳＡ）溶液をGibcoBRL Life Te
chnologies (Rockville,MD参照１５５６１−０２０)により供給した。

【００６４】ヤギＩｇＧ試薬グレードは、Sigma Chemical（St.Louis,MO. 参照Ｉ−５２５
６）により供給した。

【００６５】ハイブリダイゼーションの１０分後、アレイを洗浄し、６×ＳＳＰＥ-Tween 0
.01%を含む洗浄バッファーで洗浄し、３００μｌのMES（純水中２Ｍ）、６μｌ
のアセチル化BSAと６μｌのストレプタビジン、R-フィトコエリトリン・コンジ
ュゲート、及び最終容量６００μｌとする純水として規定される第２の染色溶液
を用いてハイブリダイゼーションの第３工程を行なった。

【００６６】ストレプタビジン、R-フィトコエリトリン・コンジュゲート（SRPhy）は、Mol
ecular Probes(Eugene,OR.参照S-866)により供給した。

【００６７】ハイブリダイゼーションの後、アレイを第２工程に規定された同じ洗浄バッフ
ァーを用いて流して洗浄した。

【００６８】ヌクレオチドベースコールパーセンテージ（BC%）、プローブアレイセルにつ
いての平均シグナル強度（相対蛍光単位RFUで表されたS）、平均バックグラウン
ド強度（RFUで表されたB）及びS/B比に関する結果は、GeneChip（登録商標）ソ
フトウェアで利用可能な機能により作成され、以下の表で示される。

【００６９】

【表１】

【００７０】上記データは、抗体染色を用いたシグナル増幅がベースコールパーセンテージ
及び強度レベルを改善することを示した。シグナルとバックグラウンドの比も改
善された。

【００７１】実施例２：標識化のモデルとしての合成されたオリゴデオキシリボヌクレオチド
の抗体染色２．１オリゴヌクレオチド３’−モノチオホフフェートの調製モノホスフェート基を３’末端に有するオリゴリボヌクレオチド（ＯＤＮ-ｐ
ｓ）（５’−CUGAACGGUAGCAUCUUGAC-3’）を、ホスホラミダイト化学を用いて、
Eurogentec (Steraing Belgium) により調製した。

【００７２】２．２オリゴヌクレオチドの開裂の間の標識化オリゴリボヌクレオチド３’−モノチオホスフェートは２.１に記載したもの
を調製した。

【００７３】このオリゴヌクレオチド（５μｌ、１nmol）に、３μｌのイミダゾール（純水
中０．１Ｍ）、３μｌのＭｎＣｌ₂（純水中１Ｍ）及び２μｌの４標識のうちの
１つ（１００ｍＭ）及び純水を最終溶液５０μｌになるように添加した。反応媒
体は、ホモゲナイズし、６５℃３０分間インキュベートした。

【００７４】異なる標識をテストした：標識ａ：Ｎ−（ビオチニル）-Ｎ’−（ヨードアセチル）エチレンジアミン（Ｄ
ＭＳＯ中の１００ｍＭ）（分子プローブ参照Ｂ−１５９１）標識ｂ：（＋）-ビオチニル-ヨードアセタミジル-３，６−ジオキサオクタンジ
アミン（純水中１００ｍＭ）（Pierce,Rockford,IL,参照２１３３４）ヨードア
セチル-ＰＥＯ−ビオチン標識ｃ：Ｎ−ヨードアセチル-Ｎ−ビオチニルヘキシレンジアミン（ＤＭＦ中１
００ｍＭ）（Pierce,Rockford,IL,参照２１３３３）標識ｄ：５−（ブロモメチル）フルオレセイン（ＤＭＳＯ中１００ｍＭ）、シグ
ナル増幅なしの検出のコントロール

【００７５】２．３ハイブリダイゼーション５００μｌのハイブリダイゼーションバッファー（１，５ｍｌ２０×ＳＳＰ
Ｅ＋２５０μのトライトン１％＋３．２５０ｍｌの純水（６×ＳＳＰＥ０．０
５％トライトン）をついて添加し、この溶液をボルテックスで攪拌した。反応産物を実施例１に記載したようにハイブリダイズした。

【００７６】２．４抗体染色ハイブリダイゼーションの別の工程を、ビオチンを有する３つの標識化剤につ
いて実施例１．４に記載したようなＤＮＡ−チェッカーボードで行なった。標識
ｄについて分析を、抗体染色のさらなる工程なしに直接行なった。

【００７７】染色のこの工程は、３００μｌのＭＥＳ（純水中２Ｍ）、６０μｌのアセチル
化ＢＳＡ，６μｌのストレプタビジン、Ｒ−フィコエリトリン・コンジュゲート
（ＳＲＰｈｙ）、及び最終容量６００μｌとなる純水を含む染色溶液を用いて行
なった。アセチル化ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液は、GibcoBRL Life Tech
nologies (Rockville,MD,参照１５５６１−０２０)により供給した。ストレプタ
ビジン、Ｒ−フィトコエリトリン・コンジュゲートはMolecular Probes (Eugene
, OR, 参照 S-866)により供給した。

【００７８】ハイブリダイゼーションの１０分後に、アレイを、洗浄バッファー６×ＳＳＰ
Ｅ−Ｔｗｅｅｎ０．０１％用いて、流して洗浄した。

【００７９】ＤＮＡ−チェッカーボードアレイで実施例１に記載したような検出と分析を行
なった。

【００８０】このＤＮＡチェッカーボードアレイは、WO9511995に記載されたような４−タ
イリングアプローチにより、ＯＤＮ−ｐｓに相補する配列を分析するようにデザ
インされる。

【００８１】分析：ベースコールパーセンテージ（BC%）、強度レベル（S）、バックグラウンド（
B）及びS/B比は以下の表に示す。

【００８２】

【表２】

【００８３】 LDC中の５−（ブロモメチル）フロオレセインでの直接標識化に代えて、ビオ
チン誘導体を用いたシグナル増幅と抗体染色は、ベースコールパーセンテージと
強度レベルに関して、よりすぐれている。

【００８４】実施例３：天然RNAでの、LDC（開裂の間の標識化）の間のシグナル増幅３．１ RNA単離 LBブロス（Teknova）で増殖したEscherichia coli株MG1655から、全RNAを単離
した。細胞は、３７℃で対数中期まで増殖させ、遠心分離により集菌した。RNA
をRNeasyキット（Qiagen）を用いて単離した。単離されたRNAを、２６０ｎｍで
の吸光度測定により定量した。

【００８５】３．２ＲＮＡ断片化と標識化最終容量１００μｌで、以下のものを配合することにより、フルオレセインで
ＲＮＡを標識化した：８μｇのＲＮＡ、３０ｍＭのＣＨＥＳ（Aldrich,参照２２
４０３−０）、ｐＨ９−９．５、１ｍＭ５−（ブロモメチル）フルオレセイン
（分子プローブ、ジメチルホルムアミドでの５０ｍＭストックから添加される）
、３０ｍＭ塩化マンガン。成分をＰＣＲチューブに入れ、６５℃４０分間加熱し
、ＧｅｎｅＡｍｐＰＣＲシステム２４００器械（ＰeｒｋｉｎＥｌｍｅｒ
）で４℃に冷却した。ビオチンでRNAを標識するために、最終容量１００μｌで
、以下のものを配合した：１０μｇのRNA、３０ｍMのMOPS（Aldrich参照１６３
７７−５）、ｐH７．５、２０ｍＭ PEO-ヨードアセチルービオチン（Pierce Ro
ckford,IL,参照：２１３３４）、１０ｍM塩化マグネシウム。成分をPCRチューブ
に入れ、９５℃３０分間加熱し、ついで２５℃３０分間、そして、上記のPCR装
置で４℃に冷却した。担体グリコーゲンの２５μｇの添加の後、標識化RNA断片
を沈澱させた。標識化の前に、対照RNAスパイク（各２フェントモル）を、E.col
iRNAに添加した。対照RNAスパイクを、直線化プラスミドテンペレートのインビ
トロ転写により生産した。

【００８６】３．３プローブアレイハイブリダイゼーションとシグナル増幅 E.coliセンスプローブアレイ（Affymetrix）でハイブリダイゼーションを行な
った。プローブアレイは、E.coliK-12(“The complete genome sequence of Esc
herichia coli K-12”, Blattner,F.ら,Science 277,1453-1474,1997、ここにあ
らゆる目的で参照として取りこまれる)配列に基づくものである。すべてのＲＮ
Ａ又はｂ＃により示されるタンパク質コード領域についてのアレイは１５プロー
ブペアを含む（Blattnerら、同じ）。これらの領域について、プローブセットは
、ネイティブＲＮＡ（センス鎖）に相補するものである。アレイは、ｂ＃領域の
間に位置する領域に対するプローブセットも含む。これらは遺伝子間領域と呼ば
れる。この場合、プローブセットは、両方向の遺伝子間領域を表す。さらに、プ
ローブアレイは、多くの対照配列のプローブセットを含む。これらの対照の多く
は、試料中にスパイクされて、陽性ハイブリダーゼーション対照として働くこと
ができる。アレイの細胞特徴サイズは、（２３．５×２３．５）μｍ²であり、
合成領域は（１２．８×１２．８）ｍｍ²である。

【００８７】ハイブリダイゼーション溶液は、１００ｍＭＭＥＳ、ｐＨ６．５−７．０、
１Ｍ、Ｎａｔ２０ｍＭＥＤＴＡ、０．０１％（ｖ/ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０
、０．５ｎＭ対照オリゴヌクレオチド（フルオレセイン又はビオチン標識化、Ｒ
ＮＡ試料とマッチする）、０．１ｍｇ/ｍＬの剪断変性ニシン***ＤＮＡ、及び
０．５ｍｇ/ｍｌのアセチル化ＢＳＡを含む最終容量２００μｌ中に、１０μｇ
のフロオレセイン標識化ＲＮＡ断片又は５μｇのビオチン標識化ＲＮＡ断片を含
んでいた。ハイブリダイゼーション溶液は、プローブアレイカートリッジに直接
注入し、GeneChip（登録商標）ハイブリダイゼーションオーブン(Affymetrix,Sa
nta Clara,CA)で、４５℃１６時間ハイブリダイズした。洗浄と染色をGeneChip
（登録商標）フルイディクスステーション（Affymetrix）で行なった。洗浄溶液
は以下の通り規定した：ストリンジェント洗浄バッファー、１００ｍＭＭＥＳ
，ｐＨ６．５−７．０、０．１ＭＮａ⁺、０．０１％（ｖ/ｖ）Tween20;非スト
リンジェント洗浄バッファー、６×ＳＳＰＥ（２０×ストック、BioWhittacker
）, 0.01% (v/v)Ｔｗｅｅｎ２０、０．００５％（ｖ/ｖ）Antifoam0-30(Sigma)
。フルオレセイン標識化ＲＮＡハイブリダイゼーションについて、プローブアレ
イをフルイディクスステーションに設置し、非ストリンジェント洗浄バッファー
（２５℃２ミックス/サイクルの１０サイクル）で洗浄し、その後ストリンジェ
ント洗浄バッファー（５０℃で１５ミックス/サイクルの４サイクル）で洗浄し
、スキャンの前に非ストリンジェント洗浄バッファーで満たした。フルオレセイ
ン標識化プローブアレイを、以下のスキャンパラメーターを用いてGeneArray（
登録商標）スキャナー（Hewlett packard）でスキャンした：３μｍピクセル、
５３０ｎｍ波長。スキャンの後、１００ｍＭＭＥＳ、ｐＨ６．５−７．０、１
ＭＮａ⁺，０．０５％（ｖ/ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０及び０．００５％（ｖ/ｖ）Ant
ifoam０−３０中の、６００μＬの２μｇ/ｍＬの抗フルオレセイン抗体、ビオチ
ンコンジュゲート（Ａｂ−antiFbiot）、０．１ｍｇ/ｍｌの正常ヤギＩｇＧ及び
２ｍｇ/ｍｌのアセチル化ＢＳＡとアレイとを、２５℃で１０分間混合すること
によりフルオレセインシグナルを増幅した。抗体結合の後、１００ｍＭ MES、
ｐH６．５−７．０、１ＭＮａ⁺、０．０５％（ｖ/ｖ）Tween20、０．００５％（
ｖ/ｖ）Antifoam0-30及び５ｍｇ/ｍｌアセチル化BSA中の、６００μLの１０μｇ
/ｍLのストレプタビジン、R-フィコエリトリン（SRPｈｙ）で、２５℃１０分間
アレイを染色した。ストレプタビジンフィコエリトリン染色の後、アレイを非ス
トリンジェントハイブリダイゼーションバッファーで洗浄した（３０℃４ミック
ス/サイクルの１０サイクル）。アレイを、３μｍのピクセルと５７０ｎｍ波長
パラメーターを用いてスキャンした。ビオチン標識化ＲＮＡハイブリダイゼーシ
ョンについて、上述の非ストリンジェント洗浄バッファー（２５℃で２ミックス
/サイクルの１０サイクル）で、プローブアレイを洗浄した。アレイをついで、
上述したようにストレプタビジンフィコエリトリンで染色し、非ストリンジェン
ト洗浄バッファーで洗浄した（２５℃４ミックス/サイクルの１０サイクル）。
アレイのシグナルをついで、１００ｍＭＭＥＳ、ＰＨ６．５−７．０、１Ｍ
Ｎａ⁺、０．０５％（ｖ/ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０、及び０．００５％（ｖ/ｖ）Ant
ifoam0-30中の、６００μＬの３μｇ/ｍｌ抗ストレプタビジン抗体（ヤギ）、ビ
オチニル化（Vector Laboratories）、0.1mg/ mlの正常ヤギIgG,及び 2mg/ mlア
セチル化BSAと、アレイとを、２５℃１０分間混合することにより増幅した。ア
レイを再び上述のストレプタビジンフィトコエリトリンで染色し、非ストリンジ
ェント洗浄バッファーで洗浄した（３０℃で４ミックス/サイクルの１５サイク
ル）。すべての工程をGeneChip（登録商標）フルディクスステーションで連続し
て扱った。ついでアレイを、３μｍのピクセルと５７０ｎｍ波長パラメーターを
用いてスキャンした。

【００８８】３．４データ分析スキャンデータを、GeneChip（登録商標）ソフトウェア（バージョン３．１、
Affymetrix）分析した。データは、デフォルトパラメーターで、Expression Ana
lysis Algorithm セットを用いて、作成した。存在するコールを、アレイ上のコ
ード配列（安定なRNAとオープンリーディングフレーム）から選択した。平均差
異を、パーフェクトマッチプローブと、コード配列を規定するために用いた１６
プローブペアで平均したミスマッチプローブとの間の強度差異として規定した。

【００８９】３．５結果：ハイブリダイゼーションの結果を以下の２つの表に要約する。

【００９０】

【表３】

【００９１】表１を、アレイ上のコード配列から得られた結果を要約する。存在するコール
の数と平均差異値を比較することにより、フルオレセイン標識ターゲットの抗体
増幅の値は、明らかになる。この場合、抗体増幅により生成する付加的なシグナ
ルが、存在するコールの数を８２６から１１９９に増加させ、平均差異を６から
１８０に増加させた。ビオチン標識化RNA抗体増幅は、類似しているが、フルオ
レセイン表S期の増幅で得られたものよりやや低い平均差異シグナルを、生成し
た。ビオチン標識化試料は、フルオレセイン標識化試料の量の半分であったこと
が記されるべきである。

【００９２】

【表４】

【００９３】表２は、RNA対照スパイクで得られたデータを要約したものである。フルオレ
セイン標識化スパイク得、抗体シグナル増幅は、均差異値は非常に改善し、存在
しない又は限界のコールを存在するコールに転換した。ビオチン標識化RNAスパ
イクは、抗体シグナル増幅の後、フルオレセイン標識化スパイクと比較したとき
、１２プローブセットのうち１０で、より高いシグナルを生成した。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、Ｍｎ⁺⁺カチオン及びイミダゾールの存在化でのＲＮＡの
化学断片化の図を示す。

【図２】図２は、ＲＮＡの断片化及び給かく性官能基を保有するリガンド
での標識化の可能性のある、可能な機構を示す図である。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１４年４月５日（２００２．４．５）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者デューク・ドーアメリカ合衆国・カリフォルニア・ 95148・サンノゼ・シンバラン・ドライブ・3206 (72)発明者チャールズ・ギャレット・ミヤダアメリカ合衆国・カリフォルニア・ 95129・サンノゼ・カントリー・レイン・ 5151 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 CA11 HA12 HA14 HA15 4B063 QA20 QQ52 QR08 QR14 QR42 QR50 QR56 QR66 QS25 QS34 QX02

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】リボ核酸（ＲＮＡ）をシグナル増幅で標識する方法であって
、 −上記ＲＮＡを断片化する工程、 −第１のリガンドを、上記ＲＮＡの各断片の３’末端及び／又は５’末端に位置
する末端ホスフェートに固定化する工程であって、上記末端ホスフェートは、上
記断片化の間に放出されたものである工程、 −標識化剤を上記第１のリガンドに結合する工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】上記第１のリガンドへの上記標識化剤の結合が間接的に行わ
れる請求項１記載の方法。
【請求項３】上記第１のリガンドが第１の抗リガンドに結合し、上記第１
の抗リガンドは第２のリガンドに結合し、かつ上記標識化剤は、少なくとも一の標
識を有し、上記第２のリガンドに反応することができる第２の抗リガンドである
、請求項２記載の方法。
【請求項４】第１のリガンド／第１の抗リガンド及び第２のリガンド／第
２の抗リガンドの組み合わせが、ビオチン／ストレプタビジン、ハプテン／抗体
、抗原／抗体、ペプチド／抗体、糖／レクチン及びポリヌクレオチド／相補ポリ
ヌクレオチドからなる群より選択される、請求項３記載の方法。
【請求項５】上記第１と第２のリガンドが同じである請求項４記載の方法
。
【請求項６】上記第１と第２のリガンドが異なる請求項４記載の方法。
【請求項７】上記第１のリガンドがフルオレセインの誘導体であり、上記
第２のリガンドがビオチンの誘導体である請求項６記載の方法。
【請求項８】上記第１のリガンドがビオチンの誘導体であり、上記標識化
剤又は上記第１の抗リガンドがストレプタビジンの誘導体である請求項１乃至３
のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】上記断片化と上記固定化が一工程で行われる請求項１又は２
記載の方法。
【請求項１０】上記断片化と上記固定化が二工程で行われる請求項１又は
２記載の方法。
【請求項１１】上記第１のリガンドへの上記標識化剤の結合が、共有結合
である請求項１記載の方法。
【請求項１２】上記第１のリガンドへの上記標識化剤の結合が、非共有結
合である請求項１記載の方法。
【請求項１３】ＲＮＡ断片の３’末端又は５’末端への上記第１のリガン
ドの固定化が、リボースに対して、２’位置、３’位置又は環状モノホスフェー
ト２’−３’位置にあるホスフェートと、上記第１のリガンドに保有されている
反応性官能基との反応により行われる、請求項１乃至１２のいずれか１項記載の
方法。
【請求項１４】ＲＮＡ断片の３’末端又は５’末端への第１のリガンドの
断片化及び／又は固定化が、リボースに対して、２’位置、３’位置又は環状モ
ノホスフェート２’−３’位置にあるホスフェートと、上記第１のリガンドに保
有されている求核性、求電子性、ハライド官能基との反応により行われる、請求
項１乃至１３のいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】上記ＲＮＡ断片化が、酵素的に、化学的に、又は物理的に
行われる請求項１乃至１３のいずれか１項記載の方法。
【請求項１６】上記ＲＮＡの酵素的断片化が、ヌクレアーゼにより行われ
る請求項１５記載の方法。
【請求項１７】上記ＲＮＡの化学的断片化が、化学的触媒と結合していて
も、結合していなくてもよい金属カチオンにより行われる請求項１５記載の方法
。
【請求項１８】上記金属カチオンが、Ｍｇ⁺⁺、Ｍｎ⁺⁺、Ｃｕ⁺⁺、Ｃｏ⁺⁺、
及び／又はＺｎ⁺⁺イオンであり、上記化学的触媒が、イミダゾール、置換された
アナログ、例えばＮ−メチルイミダゾール、または上記ＲＮＡに対して親和性を
有し、イミダゾール核又は置換されたアナログを含む化学分子からなる、請求項
１７記載の方法。
【請求項１９】上記ＲＮＡの物理的断片化が、音波破砕又は放射により、
行われる請求項１５記載の方法。
【請求項２０】ＲＮＡ断片の３’末端又は５’末端への上記第１のリガン
ドの固定化が、リボースの２’位置、３’位置又は環状モノホスフェート２’−
３’位置に結合しているホスフェートと、分子Ｒ−Ｘ（Ｒは上記第１のリガンド
からなり、Ｘは、ヒドロキシル、アミン、ヒドラジン、アルコキシアミン、ハロ
ゲン化アルキル、ハロゲン化フェニルメチル、ヨードアセタミド又はマレイミド
からなる群より選ばれる反応性官能基である）との反応により行われる、請求項
１乃至１９のいずれか１項記載の方法。
【請求項２１】Ｒ−Ｘが、５−（ブロモフルオレセイン）とヨードアセチ
ルビオチンの誘導体からなる群より選択される、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】請求項１乃至２１のいずれか１項記載の方法により得られ
るＲＮＡ断片であって、該ＲＮＡ断片は、３’末端又は５’末端に、上記断片化
の間に放出された末端ホスフェートで標識化されている単一のヌクレオチドを含
むものであるＲＮＡ断片。
【請求項２３】１０乃至１５０のヌクレオチドを含む請求項２２記載のＲ
ＮＡ断片。
【請求項２４】ＲＮＡ断片が、ストレプタビジン抗体に結合したビオチン
を有する少なくとも一のチオホスフェートヌクレオチドを含む、請求項２２又は
２３記載のＲＮＡ断片。
【請求項２５】上記リガンドを有するヌクレオチドが、チオホスフェート
ヌクレオチドである請求項２４記載のＲＮＡ断片。
【請求項２６】少なくとも一のビオチンを有する抗フルオレセイン抗体に
結合したフルオレセインを有するホスフェート又はチオフォスフェートを３’末
端に含むＲＮＡ断片。
【請求項２７】ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ又はＲＮＡ断片及び／又はＤＮＡ
断片を検出するためのプローブとしての、請求項２２乃至２６のいずれか１項記
載のＲＮＡ断片の使用。
【請求項２８】捕捉プローブに結合することができる標識化ターゲットと
しての請求項２２乃至２６のいずれか１項記載のＲＮＡ断片の使用。