JP2003516762A - リボ核酸を標識する方法、及びそれにより得られた標識化rna断片 - Google Patents
リボ核酸を標識する方法、及びそれにより得られた標識化rna断片Info
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Abstract
Description
に関する。
多数の方法が存在することを示す。オリゴヌクレオチドと核酸は、ポリヌクレオ
チドと称する。ポリヌクレオチドは、合成の間、又は少なくとも一の標識化ヌク
レオチドを導入することにより標識化することができる。
修飾塩基のいずれかでもよい。第2の方法は、糖に標識を付着させることを提案
しており、やはり糖は天然の糖又は修飾の糖のいずれかでもよい。第3の方法は
、ホスフェートに標識を付着させることに関する。
、塩基又は糖に標識を付着しようとする。これはより便利であり、より多くの選
択肢を与えるものである。さらに、塩基の場合、EP−A−0.329.198
、EP−A−0.302.175、EP−A−0.097.373、EP−A−
0.063.879、US−A−5,449,767、US−A−5,328,
824、WO−A−93/16094、DE−A−3.910.151及びEP
−A−0.567.841、糖の場合、EP−A−0.286.898などの多
くの文献に、記載されているものがある。これら文献の各々は、あらゆる目的で
ここに参照として取りこまれる。
ホスフェートの反応性が有機溶媒でのそれに比べて低いために、より複雑である
。
ている。これは例えば、文献EP−A−0.280.058に当てはまり、これ
はあらゆる目的で参照としてここに取りこまれるものであり、ホスフェートに標
識を付着することによりヌクレオチドの標識化を記載しており、このホスフェー
トは、、ヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチドであるとき、糖に3’及び/
又は5’の位置で付着しており、ヌクレオチドがリボヌクレオチドであるとき、
2’、3’、及び/又は5’位置で付着している。この文献は、上述の少なくと
も一の標識化ヌクレオチドを含むポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドも記
載しており、このヌクレオチドは、合成の間ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレ
オチドに取りこまれる。
略は、核酸を均一に標識化することができない。標識化ヌクレオチドのポリヌク
レオチドへの取りこみは、制御することができない。それは合成されたポリヌク
レオチドの組成物に完全に依存するものである。こうして、いくつかのポリヌク
レオチドは、多数の標識化ヌクレオチドを含むことができるが、他のものは全く
含むことができない。その結果、これらの核酸から発せられるシグナルの強度が
均一ではなくなり、したがって、核酸を検出するときに結果を解釈することが困
難となる。
りこまれる。
こまれるが、これはそれらの5’末端で標識化される核酸に関するものである。
この付着は、イミダゾールとリンカーアームを用いる。標識化と関連する断片化
はない。さらに、ホスフェートが、核酸に添加され、したがって、キナーゼはホ
スフェートを取りこむ手段として用いられ、少なくとも一の付加的生物学的工程
をもたらす。この文献は、15merのオリゴヌクレオチドの標識化を記載して
いる。オリゴヌクレオチドに代えて大きな核酸を用いるとき、この技術は5’末
端だけの標識の存在をもたらし、標識化核酸の特異的活性は低い。
れるとき、それらの相補配列に対するこれらの標識化核酸のハイブリダイゼーシ
ョンの反応速度は低く、ハイブリダイゼーション収率が低下する。これらはした
がってシグナルの定量的及び定性的損失をもたらすことになる。立体障害はこの
反応における鍵となるファクターである。
ない。断片化は、これらの構造を破壊する(又は減ずる)のを助け、こうしてハ
イブリダイゼーションを最適化する。立体障害は、高い濃度の捕捉プローブを含
む固体表面、例えば、Affymetrix Inc.社により開発されたDNAアレイ(”Acc
essing Genetic Infromation with High-Density DNA arrays”, M.Chee,ら、Sc
ience,274,610-614,1996。 ”Light-generated oligonucleotide arrays for ra
pid DNA sequence analysis”, A. Caviani Pease,ら、Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 91, 5022-5026, 1994, US−5744305,US−5445934)
へのハイブリダイゼーションの場合、特に重要な役割を演ずる。これらの各参照
文献は、あらゆる目的でここにとりこまれる。この技術において、捕捉プローブ
は、一般的にサイズが減少し、約20ヌクレオチドの長さとなる。
ゼで断片化することができる(DNA分解酵素又はRNA分解酵素)(Methods
in Enzymol.152巻、S.Berger及びA.Kimmelら、Academic Press,1987,Enzymatic
techniques and Recombinant DNA Technology,《Guide to Molecular cloning》
, p91-110, Molecular Cloning, a Laboratory Manual, J. Sambrook, E.F. Fri
tsch及びT.Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press、第2版、P.5.30-
5.95,1989)。これらの各文献はあらゆる目的でここに取りこまれる。関与する
酵素により、この反応は、それらの5’又は3’末端にヒドロキシル又はモノホ
スフェート基のいずれかを有する小さな断片又はモノマーを生成する。
アルキル化剤を用いるプリン脱離、又はピリミジン脱離は、脱塩基部位を生成し
、ついで、「β−脱離」と呼ばれる機構により塩基の存在下で断片化される(T.
Lindahlら,Rate of Chain breakage at apurinic sites in double-stranded d
eoxyribonucleic acid., Biochemistry, 11, p3618-3623, 1972)。DNAはと
りわけ酸化、アルキル化またはフリーラジカル付加機構により、断片化すること
ができる(M.Liuzziら、Characterization and damage in gamma-irradiated an
d OsO4-treated DNA using methoxyamine., Int. J. Radiat.Biol,54,p709-722,
1988)。金属カチオンは、しばしば化学的触媒として有機分子と組み合わせて用
いられ、例えばイミダゾールは、RNA‘sの断片化に用いられる(R.Breslow
及びR.Xu,Recognition and catalysis in nucleic acid chemistry, Proc. Natl
. Acad. Sci. USA. 90, p1201-1207, 1993. J. Hovinenら、Imidazole Tethered
Oligonucleotides: Synthesis and RNA cleaving activity, J. Org. Chem., 6
0, p2205-2209, 1995)。この断片化は好ましくはアルカリ媒体中で行なわれ、
3’ホスフェート末端を有する断片を生成する。これらの文献の各々は、ここに
あらゆる目的のために参照として取りこまれる。
りするものではない。
リボザイムを用いたRNAの断片化と標識化の方法を提案している。これらのリ
ボザイムによる開裂触媒は、配列特異的であり、反応は、5’末端にヒドロキシ
ル基(OH)を3’末端にモノホスフェートを有するRNA断片を生じる。標識
化は、放射性標識だけであり、ついで、GTP分子由来の添加された放射性ホス
フェートのとりこみにより行なわれる。それはこれらのリボザイムカテゴリーの
ホスホトランスフェラーゼ活性、すなわちキナーゼ活性である。放射性ホスフェ
ート付着は、5’末端でのヒドロキシル基においてだけで行なわれ、断片化で得
られるホスフェート基は、RNA断片への標識の付着のためには用いられない。
さらに、断片化はリボザイムによってのみ行なわれ、リボザイムと開裂されるタ
ーゲット核酸との間の特異性の存在を意味している。ホスフェートはついで、標
識として機能する。
能にする。特異性は存在しないので、あらゆるタイプの核酸をランダムに断片化
することができる。生成された断片の各クラスの標識収率は、その配列と組成に
全く依存していないので、このアプローチを用いて標識の強度の均一性を得るこ
とができる。こうして、我々の方法は、例えば、検出プローブを調製することを
可能にする。最後に、ホスフェートは、核酸と標識の間のリンカーアームだけで
ある。
em. Cytochem. 45: 481-491, 1997(これらの各々は、あらゆる目的のために素
の全体が参照として取りこまれる)に記載されているように、イムノアッセイ又
は核酸プローブの分野で周知であるが、標識化の間に協同した断片化は記載され
ていない。
。
のである。こうして、この方法は、一度断片化が完了すれば均一に標識化される
RNA断片を得ることを可能にする。さらに、断片化は、可能なハイブリダイゼ
ーションのために最適なサイズの断片を得ることを可能にする。ハイブリダイゼ
ーションの質が改善されれば、標識化断片のハイブリダイゼーションの後の検出
は、より迅速で効率的となるであろう。最後に、本発明は、生成されるシグナル
強度とバックグラウンドに対するシグナルの比率を増加させることにより、感度
を改善する。
する方法であって、 −上記RNAを断片化する工程、 −第1のリガンドを、上記RNAの各断片の3’末端及び/又は5’末端に位置
する末端のホスフェートに固定化する工程であって、上記末端ホスフェートは、
上記断片化の間に放出されたものである工程、 −標識化剤を上記第1のリガンドに結合する工程 を含むことを特徴とする方法に関する。
NAである。
例えば、増幅技術(例えば、Kozal M.J.ら、Nature Medicine,2(7),753-758,199
6,参照、あらゆる目的でその全体が参照として取りこまれる)、転写増幅技術、
又はTMA(転写媒介増幅)、NASBA(核酸配列ベース増幅)、3SR(セ
ルフサステインドシークエンス増幅)、Qβレプリカーゼ増幅、酵素による天然
RNA消化、及びポリリボヌクレオチド化学合成(例えば、米国特許第5,55
4,516号及び第5,766,849号及びClin. Microbiol. Rev., 5(4), p
.370-386, 1992参照、これらの各々はここにその全体が参照として取りこまれる
)を含むRNA産物をもたらす他の方法を含む。合成RNAは、少なくとも一の
修飾ヌクレオチドまたは少なくとも一の修飾ヌクレオチド内結合例えばチオフォ
スフェートを含むRNAでもある。天然RNAは、細胞からの抽出により得られ
るRNA、例えばメッセンジャーRNA(mRNA)、リボゾーマルRNA(r
RNA)、又はトランスファーRNA(tRNA)である。標識化は、検出可能
なシグナルを生成することができる標識の付着である。以下は、これらの標識の
非制限的なリストである。
ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリンホスファターゼ、β−ガラク
トシダーゼ、及びグルコース−6−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、 ・ 発色団、例えば蛍光及び発色化合物及び染料 ・ 電子顕微鏡により、又はそれらの電気特性、例えば導電性、電流測定、電圧
測定及びインピーダンスにより検出することができる電子密度を有する基 ・ 検出可能な基、例えば、その分子がそれらの物理的及び/又は化学的特性に
おける検出可能な修飾を誘導するために十分なサイズのもの、この検出は、回折
、表面プラズモン共鳴、表面変動及び接触変動の角度、又は原子力分光及びトン
ネル効果などの物理的方法の各光学的方法により、行なうことができる。 ・ 放射性分子例えば、32P、35S又は125I。 標識を含む化合物は標識化剤である。
フェート又はチオホスフェート選択的抗体は、非共有結合を創出する手段である
。実施の好適な態様によれば、固定化は、実施例に記載するような共有結合であ
る。
。共有結合を可能にする異なる反応性官能基は、当業者に周知のものであり、コ
ンジュゲーションのいくつかの例は、例えば、《Bioconjugate techniques》 He
rmanson G.T., Academic Press, San Diego, 1996に見出され、これはあらゆる
目的でその全体が参照として取りこまれる。
る。非共有結合は、例えば、イオン性又は静電相互作用、ファンデルワールス相
互作用、水素結合又は異なる相互作用の組み合わせを含む結合である。
行なわれる。第1のリガンドは、末端ホスフェートに固定化され、第1の抗リガ
ンドに結合し、上記第1のリガンドは第2のリガンドに結合し、標識化剤は、少
なくとも一の標識を有し、上記第2のリガンドに反応することができる第2の抗
リガンドである。
る2つの化合物を意味する。
み合わせは、例えば、ビオチン/ストレプタビジン、ハプテン/抗体、抗原/抗
体、ペプチド/抗体、糖/レクチン及びポリヌクレオチド/相補ポリヌクレオチ
ドからなる群より選択される。
erieux出願WO96/19729、WO94/29723、WO95/0800
0に記載されており、これらはここに参照として取りこまれる。
り、第2のリガンドはビオチンの誘導体である。
り、第1の抗リガンドは、ストレプタビジンの誘導体である。
を積み重ねることに制限はない。例えば、(第2のリガンド/第1の抗リガンド
)エンティティは、ホスフェートに固定されている第1のリガンドに結合し、つ
いで(第3のリガンド/第2の抗リガンド)エンティティは第2のリガンドに結
合し、標識化剤は少なくとも一の標識を有し、第3のリガンドに反応することが
できる第3の抗リガンドである。
各エンティティは、ホスフェートへのリガンドの固定化の後に、連続して添加す
ることができる。
の固定化は、出発RNAの3’及び/又は5’末端を構成する断片を離れて行な
われる。付加的にあるいは代替的に、RNAの各断片の5’末端への第1のリガ
ンドの固定化は、出発RNAの5’末端を構成する断片を離れて行なわれる。
の固定化が、リボースに対して、2’位置、3’位置又は環状モノホスフェート
2’−3’位置にあるホスフェートと、上記第1のリガンドに保有されている反
応性官能基との反応により行われる。
定化が、リボースに対して、2’位置、3’位置又は環状一ホスフェート2’−
3’位置にあるホスフェートと、上記第1のリガンドに保有されている求核性、
求電子性、ハライド官能基との反応により行われる。
よい金属カチオンにより行われる。
n++イオンであり、化学的触媒が、イミダゾール、置換されたアナログ、例えば
N−メチルイミダゾール、またはRNAに対して親和性を有し、イミダゾール核
又は置換されたアナログを含むあらゆる化学分子を含む。
ンドの固定化が、リボースの2’位置、3’位置又は環状モノホスフェート2’
−3’位置に結合しているホスフェートと、分子R−X(Rは上記第1のリガン
ドからなり、Xは、ヒドロキシル、アミン、ヒドラジン、アルコキシアミン、ハ
ロゲン化アルキル、ハロゲン化フェニルメチル、ヨードアセタミド又はマレイミ
ドからなる群より選ばれる反応性官能基である)との反応により行われる。好ま
しい例において、Xはハロゲン化アルキル、ハロゲン化フェニルメチル、ヨード
アセタミド、又はマレイミドである。リガンドの固定化を容易にするために、リ
ンカーアームは、リガンドと反応性官能基の間に、任意に存在する。好ましい態
様において、R−Xは、N−(ビオチノイル)−N’−(ヨードアセチル)エチ
レンジアミン、(+)−ビオチニル−ヨードアセタミジル−3,6−ジオキサオ
クタンジアミン、N−ヨードアセチル−N−ビオチニルヘキシレンジアミン、5
−(ブロモメチル)フルオレセインである。
又は5’末端に、断片化の間に放出された末端ホスフェートにおいて標識された
単一のヌクレオチドを有する。
トへのRNA断片のハイブリダイゼーションを容易にするために、好ましくは3
0乃至70ヌクレオチド、好ましくは40乃至60ヌクレオチドを含む。
クレオチドを含む。
る。
抗フルオレセイン抗体に結合したフルオレセインを有するホスフェート又はチオ
フォスフェートを3’末端に含み、上記抗体は、標識化ストレプラビジンに結合
している。
又はDNA断片を検出するためのプローブとしての使用に関する。
しての、上記RNA断片の使用に関する。 図面と実施例は特定の実施態様を示し、本発明の範囲を制限するものとして考
えられるものではない。
増幅 1.1 アンプリコンの調製 単離物から、細菌(Mycobacterium tuberculosis(ATCC-27294、Lowenstein-Je
nsen培地;3乃至5mm径;約108細菌)の1又は2の新たに増殖したコロニー
を、スパチュラの端でほぐし、1.5mlエッペンドルフチューブの250μl
の滅菌水中に、再懸濁した。細菌分散液をガラスビーズの存在下でボルテックス
で攪拌して、培地物質から、全核酸を取り出した。5μlアリコートの溶解物を
PCRに直接添加した。16超可変領域を、Micobacterium genusプライマー(M.Tu
berculosis参照配列M20940[ジーンバンク]上の位置213乃至236と394
乃至415;M.tuberculosis アンプリコンサイズは202bpである。)で、
PCR増幅した。プライマーは、それらの5’末端に、さらにバクテリオファー
ジT3又はT7プロモーター配列のいずれかを含んでいた。
gCl2、0.001%(wt/vol)ゼラチン、5%(vol/vol)ジメチルスルホキ
シド、0.5μM(各)プライマー、200μM(各)デオキシヌクレオチドト
リホスフェート、及び1.5UのTaqポリメラーゼ(AmpliTaq;Perkin-Elmer,Nor
wark,Corm,)を含む、100μlの反応容量で行なった。PCRは、Perkin Elmer
2400 サーマルサイクラーにおいて、94℃5分間の最初の変性工程と、94℃
45秒、60℃30秒、72℃30秒のサイクル条件で35サイクル、及び最後
のサイクルを72℃10分間行なった。PCR産物は、アガロースゲル電気泳動
で分析した。
ロモータータグPCRアンプリコンを用いた。反応混合物20μlは、約50n
gのPCR産物、20UのT3又はT7RNAポリメラーゼ(Promega);40mMトリスア
セテート(pH8.1;100mM Mg(アセテート)2;10mMジチオスレ
イトール;1.25mMリボヌクレオチドトリホスフェート(ATP,CTP、
GTP、及びUTP)を含む。反応は、37℃1hで行なった。
lの反応混合物)に、6μlのイミダゾール(純水中0.1M)、6μlのMn
Cl2(純水中1M)、及び2μlの5−(ブロモメチル)フルオレセイン(Mol
ecular Probes、Eugene,OR,USA,参照B1355により提供され
る5−BMF;DMSO中100mM)及び純水を最終容量100μlで添加し
た。反応性媒体は、ホモゲナイズし、65℃30分間インキュベートした。
ol., 37 (1),P.49-55,1999でA.Troeschらにより記載されたものと同じものであ
る。あらゆる目的でその全体がここに参照として取りこまれる。分析は、GeneAr
ray(登録商標)スキャナー、GeneChip(登録商標)フルイディクスステーション
、GeneChip(登録商標)分析ソフトウェアを含む、GeneChip(登録商標)器械シ
ステム(参照900228、Affymetrix,Santa Clara,CA)で行なった。
に記載されたプロトコールを用いてDNAアレイで行なった。 アレイはついで、洗浄し、300μlのMES(参照Aldrich16373-2,純水中
2M)、2.4μlのアセチル化ウシ血清アルブミン、6μlの正常ヤギIgG
、1.2μlの抗フルオレセイン抗体、及び600μlの最終溶液とする純水を
含む染色溶液を用いて、染色の第2の工程を行なった。
た。
chnologies (Rockville,MD参照15561−020)により供給した。
6)により供給した。
.01%を含む洗浄バッファーで洗浄し、300μlのMES(純水中2M)、6μl
のアセチル化BSAと6μlのストレプタビジン、R-フィトコエリトリン・コンジ
ュゲート、及び最終容量600μlとする純水として規定される第2の染色溶液
を用いてハイブリダイゼーションの第3工程を行なった。
ecular Probes(Eugene,OR.参照S-866)により供給した。
ァーを用いて流して洗浄した。
いての平均シグナル強度(相対蛍光単位RFUで表されたS)、平均バックグラウン
ド強度(RFUで表されたB)及びS/B比に関する結果は、GeneChip(登録商標)ソ
フトウェアで利用可能な機能により作成され、以下の表で示される。
及び強度レベルを改善することを示した。シグナルとバックグラウンドの比も改
善された。
の抗体染色 2.1 オリゴヌクレオチド3’−モノチオホフフェートの調製 モノホスフェート基を3’末端に有するオリゴリボヌクレオチド(ODN-p
s)(5’−CUGAACGGUAGCAUCUUGAC-3’)を、ホスホラミダイト化学を用いて、
Eurogentec (Steraing Belgium) により調製した。
を調製した。
中0.1M)、3μlのMnCl2(純水中1M)及び2μlの4標識のうちの
1つ(100mM)及び純水を最終溶液50μlになるように添加した。反応媒
体は、ホモゲナイズし、65℃30分間インキュベートした。
MSO中の100mM)(分子プローブ参照B−1591) 標識b:(+)-ビオチニル-ヨードアセタミジル-3,6−ジオキサオクタンジ
アミン(純水中100mM)(Pierce,Rockford,IL,参照21334)ヨードア
セチル-PEO−ビオチン 標識c:N−ヨードアセチル-N−ビオチニルヘキシレンジアミン(DMF中1
00mM)(Pierce,Rockford,IL,参照21333) 標識d:5−(ブロモメチル)フルオレセイン(DMSO中100mM)、シグ
ナル増幅なしの検出のコントロール
E+250μのトライトン1%+3.250mlの純水(6×SSPE 0.0
5%トライトン)をついて添加し、この溶液をボルテックスで攪拌した。 反応産物を実施例1に記載したようにハイブリダイズした。
いて実施例1.4に記載したようなDNA−チェッカーボードで行なった。標識
dについて分析を、抗体染色のさらなる工程なしに直接行なった。
化BSA,6μlのストレプタビジン、R−フィコエリトリン・コンジュゲート
(SRPhy)、及び最終容量600μlとなる純水を含む染色溶液を用いて行
なった。アセチル化ウシ血清アルブミン(BSA)溶液は、GibcoBRL Life Tech
nologies (Rockville,MD,参照15561−020)により供給した。ストレプタ
ビジン、R−フィトコエリトリン・コンジュゲートはMolecular Probes (Eugene
, OR, 参照 S-866)により供給した。
E−Tween0.01%用いて、流して洗浄した。
なった。
イリングアプローチにより、ODN−psに相補する配列を分析するようにデザ
インされる。
B)及びS/B比は以下の表に示す。
チン誘導体を用いたシグナル増幅と抗体染色は、ベースコールパーセンテージと
強度レベルに関して、よりすぐれている。
した。細胞は、37℃で対数中期まで増殖させ、遠心分離により集菌した。RNA
をRNeasyキット(Qiagen)を用いて単離した。単離されたRNAを、260nmで
の吸光度測定により定量した。
RNAを標識化した:8μgのRNA、30mMのCHES(Aldrich,参照22
403−0)、pH9−9.5、1mM 5−(ブロモメチル)フルオレセイン
(分子プローブ、ジメチルホルムアミドでの50mMストックから添加される)
、30mM塩化マンガン。成分をPCRチューブに入れ、65℃40分間加熱し
、 GeneAmp PCRシステム2400器械(Perkin Elmer
)で4℃に冷却した。ビオチンでRNAを標識するために、最終容量100μlで
、以下のものを配合した:10μgのRNA、30mMのMOPS(Aldrich参照163
77−5)、pH7.5、20mM PEO-ヨードアセチルービオチン(Pierce Ro
ckford,IL,参照:21334)、10mM塩化マグネシウム。成分をPCRチューブ
に入れ、95℃30分間加熱し、ついで25℃30分間、そして、上記のPCR装
置で4℃に冷却した。担体グリコーゲンの25μgの添加の後、標識化RNA断片
を沈澱させた。標識化の前に、対照RNAスパイク(各2フェントモル)を、E.col
iRNAに添加した。対照RNAスパイクを、直線化プラスミドテンペレートのインビ
トロ転写により生産した。
った。プローブアレイは、E.coliK-12(“The complete genome sequence of Esc
herichia coli K-12”, Blattner,F.ら,Science 277,1453-1474,1997、ここにあ
らゆる目的で参照として取りこまれる)配列に基づくものである。すべてのRN
A又はb#により示されるタンパク質コード領域についてのアレイは15プロー
ブペアを含む(Blattnerら、同じ)。これらの領域について、プローブセットは
、ネイティブRNA(センス鎖)に相補するものである。アレイは、b#領域の
間に位置する領域に対するプローブセットも含む。これらは遺伝子間領域と呼ば
れる。この場合、プローブセットは、両方向の遺伝子間領域を表す。さらに、プ
ローブアレイは、多くの対照配列のプローブセットを含む。これらの対照の多く
は、試料中にスパイクされて、陽性ハイブリダーゼーション対照として働くこと
ができる。アレイの細胞特徴サイズは、(23.5×23.5)μm2であり、
合成領域は(12.8×12.8)mm2である。
1M、Nat 20mM EDTA、0.01% (v/v)Tween 20
、0.5nM対照オリゴヌクレオチド(フルオレセイン又はビオチン標識化、R
NA試料とマッチする)、0.1mg/mLの剪断変性ニシン***DNA、及び
0.5mg/mlのアセチル化BSAを含む最終容量200μl中に、10μg
のフロオレセイン標識化RNA断片又は5μgのビオチン標識化RNA断片を含
んでいた。ハイブリダイゼーション溶液は、プローブアレイカートリッジに直接
注入し、GeneChip(登録商標)ハイブリダイゼーションオーブン(Affymetrix,Sa
nta Clara,CA)で、45℃16時間ハイブリダイズした。洗浄と染色をGeneChip
(登録商標)フルイディクスステーション(Affymetrix)で行なった。洗浄溶液
は以下の通り規定した:ストリンジェント洗浄バッファー、100mM MES
,pH6.5−7.0、0.1M Na+、0.01%(v/v)Tween20;非スト
リンジェント洗浄バッファー、6×SSPE(20×ストック、BioWhittacker
), 0.01% (v/v)Tween20、0.005%(v/v)Antifoam0-30(Sigma)
。フルオレセイン標識化RNAハイブリダイゼーションについて、プローブアレ
イをフルイディクスステーションに設置し、非ストリンジェント洗浄バッファー
(25℃2ミックス/サイクルの10サイクル)で洗浄し、その後ストリンジェ
ント洗浄バッファー(50℃で15ミックス/サイクルの4サイクル)で洗浄し
、スキャンの前に非ストリンジェント洗浄バッファーで満たした。フルオレセイ
ン標識化プローブアレイを、以下のスキャンパラメーターを用いてGeneArray(
登録商標)スキャナー(Hewlett packard)でスキャンした:3μmピクセル、
530nm波長。スキャンの後、100mM MES、pH6.5−7.0、1
M Na+,0.05%(v/v)Tween20及び0.005%(v/v)Ant
ifoam0−30中の、600μLの2μg/mLの抗フルオレセイン抗体、ビオチ
ンコンジュゲート(Ab−antiFbiot)、0.1mg/mlの正常ヤギIgG及び
2mg/mlのアセチル化BSAとアレイとを、25℃で10分間混合すること
によりフルオレセインシグナルを増幅した。抗体結合の後、100mM MES、
pH6.5−7.0、1MNa+、0.05%(v/v)Tween20、0.005%(
v/v)Antifoam0-30及び5mg/mlアセチル化BSA中の、600μLの10μg
/mLのストレプタビジン、R-フィコエリトリン(SRPhy)で、25℃10分間
アレイを染色した。ストレプタビジンフィコエリトリン染色の後、アレイを非ス
トリンジェントハイブリダイゼーションバッファーで洗浄した(30℃4ミック
ス/サイクルの10サイクル)。アレイを、3μmのピクセルと570nm波長
パラメーターを用いてスキャンした。ビオチン標識化RNAハイブリダイゼーシ
ョンについて、上述の非ストリンジェント洗浄バッファー(25℃で2ミックス
/サイクルの10サイクル)で、プローブアレイを洗浄した。アレイをついで、
上述したようにストレプタビジンフィコエリトリンで染色し、非ストリンジェン
ト洗浄バッファーで洗浄した(25℃4ミックス/サイクルの10サイクル)。
アレイのシグナルをついで、100mM MES、PH6.5−7.0、1M
Na+、0.05%(v/v)Tween 20、及び0.005%(v/v)Ant
ifoam0-30中の、600μLの3μg/ml抗ストレプタビジン抗体(ヤギ)、ビ
オチニル化(Vector Laboratories)、0.1mg/ mlの正常ヤギIgG,及び 2mg/ mlア
セチル化BSAと、アレイとを、25℃10分間混合することにより増幅した。ア
レイを再び上述のストレプタビジンフィトコエリトリンで染色し、非ストリンジ
ェント洗浄バッファーで洗浄した(30℃で4ミックス/サイクルの15サイク
ル)。すべての工程をGeneChip(登録商標)フルディクスステーションで連続し
て扱った。ついでアレイを、3μmのピクセルと570nm波長パラメーターを
用いてスキャンした。
Affymetrix)分析した。データは、デフォルトパラメーターで、Expression Ana
lysis Algorithm セットを用いて、作成した。存在するコールを、アレイ上のコ
ード配列(安定なRNAとオープンリーディングフレーム)から選択した。平均差
異を、パーフェクトマッチプローブと、コード配列を規定するために用いた16
プローブペアで平均したミスマッチプローブとの間の強度差異として規定した。
の数と平均差異値を比較することにより、フルオレセイン標識ターゲットの抗体
増幅の値は、明らかになる。この場合、抗体増幅により生成する付加的なシグナ
ルが、存在するコールの数を826から1199に増加させ、平均差異を6から
180に増加させた。ビオチン標識化RNA抗体増幅は、類似しているが、フルオ
レセイン表S期の増幅で得られたものよりやや低い平均差異シグナルを、生成し
た。ビオチン標識化試料は、フルオレセイン標識化試料の量の半分であったこと
が記されるべきである。
セイン標識化スパイク得、抗体シグナル増幅は、均差異値は非常に改善し、存在
しない又は限界のコールを存在するコールに転換した。ビオチン標識化RNAスパ
イクは、抗体シグナル増幅の後、フルオレセイン標識化スパイクと比較したとき
、12プローブセットのうち10で、より高いシグナルを生成した。
化学断片化の図を示す。
での標識化の可能性のある、可能な機構を示す図である。
Claims (28)
- 【請求項1】 リボ核酸(RNA)をシグナル増幅で標識する方法であって
、 −上記RNAを断片化する工程、 −第1のリガンドを、上記RNAの各断片の3’末端及び/又は5’末端に位置
する末端ホスフェートに固定化する工程であって、上記末端ホスフェートは、上
記断片化の間に放出されたものである工程、 −標識化剤を上記第1のリガンドに結合する工程 を含むことを特徴とする方法。 - 【請求項2】 上記第1のリガンドへの上記標識化剤の結合が間接的に行わ
れる請求項1記載の方法。 - 【請求項3】 上記第1のリガンドが第1の抗リガンドに結合し、上記第1
の抗リガンドは第2のリガンドに結合し、かつ上記標識化剤は、少なくとも一の標
識を有し、上記第2のリガンドに反応することができる第2の抗リガンドである
、請求項2記載の方法。 - 【請求項4】 第1のリガンド/第1の抗リガンド及び第2のリガンド/第
2の抗リガンドの組み合わせが、ビオチン/ストレプタビジン、ハプテン/抗体
、抗原/抗体、ペプチド/抗体、糖/レクチン及びポリヌクレオチド/相補ポリ
ヌクレオチドからなる群より選択される、請求項3記載の方法。 - 【請求項5】 上記第1と第2のリガンドが同じである請求項4記載の方法
。 - 【請求項6】 上記第1と第2のリガンドが異なる請求項4記載の方法。
- 【請求項7】 上記第1のリガンドがフルオレセインの誘導体であり、上記
第2のリガンドがビオチンの誘導体である請求項6記載の方法。 - 【請求項8】 上記第1のリガンドがビオチンの誘導体であり、上記標識化
剤又は上記第1の抗リガンドがストレプタビジンの誘導体である請求項1乃至3
のいずれか1項記載の方法。 - 【請求項9】 上記断片化と上記固定化が一工程で行われる請求項1又は2
記載の方法。 - 【請求項10】 上記断片化と上記固定化が二工程で行われる請求項1又は
2記載の方法。 - 【請求項11】 上記第1のリガンドへの上記標識化剤の結合が、共有結合
である請求項1記載の方法。 - 【請求項12】 上記第1のリガンドへの上記標識化剤の結合が、非共有結
合である請求項1記載の方法。 - 【請求項13】 RNA断片の3’末端又は5’末端への上記第1のリガン
ドの固定化が、リボースに対して、2’位置、3’位置又は環状モノホスフェー
ト2’−3’位置にあるホスフェートと、上記第1のリガンドに保有されている
反応性官能基との反応により行われる、請求項1乃至12のいずれか1項記載の
方法。 - 【請求項14】 RNA断片の3’末端又は5’末端への第1のリガンドの
断片化及び/又は固定化が、リボースに対して、2’位置、3’位置又は環状モ
ノホスフェート2’−3’位置にあるホスフェートと、上記第1のリガンドに保
有されている求核性、求電子性、ハライド官能基との反応により行われる、請求
項1乃至13のいずれか1項記載の方法。 - 【請求項15】 上記RNA断片化が、酵素的に、化学的に、又は物理的に
行われる請求項1乃至13のいずれか1項記載の方法。 - 【請求項16】 上記RNAの酵素的断片化が、ヌクレアーゼにより行われ
る請求項15記載の方法。 - 【請求項17】 上記RNAの化学的断片化が、化学的触媒と結合していて
も、結合していなくてもよい金属カチオンにより行われる請求項15記載の方法
。 - 【請求項18】 上記金属カチオンが、Mg++、Mn++、Cu++、Co++、
及び/又はZn++イオンであり、上記化学的触媒が、イミダゾール、置換された
アナログ、例えばN−メチルイミダゾール、または上記RNAに対して親和性を
有し、イミダゾール核又は置換されたアナログを含む化学分子からなる、請求項
17記載の方法。 - 【請求項19】 上記RNAの物理的断片化が、音波破砕又は放射により、
行われる請求項15記載の方法。 - 【請求項20】 RNA断片の3’末端又は5’末端への上記第1のリガン
ドの固定化が、リボースの2’位置、3’位置又は環状モノホスフェート2’−
3’位置に結合しているホスフェートと、分子R−X(Rは上記第1のリガンド
からなり、Xは、ヒドロキシル、アミン、ヒドラジン、アルコキシアミン、ハロ
ゲン化アルキル、ハロゲン化フェニルメチル、ヨードアセタミド又はマレイミド
からなる群より選ばれる反応性官能基である)との反応により行われる、請求項
1乃至19のいずれか1項記載の方法。 - 【請求項21】 R−Xが、5−(ブロモフルオレセイン)とヨードアセチ
ルビオチンの誘導体からなる群より選択される、請求項20記載の方法。 - 【請求項22】 請求項1乃至21のいずれか1項記載の方法により得られ
るRNA断片であって、該RNA断片は、3’末端又は5’末端に、上記断片化
の間に放出された末端ホスフェートで標識化されている単一のヌクレオチドを含
むものであるRNA断片。 - 【請求項23】 10乃至150のヌクレオチドを含む請求項22記載のR
NA断片。 - 【請求項24】 RNA断片が、ストレプタビジン抗体に結合したビオチン
を有する少なくとも一のチオホスフェートヌクレオチドを含む、請求項22又は
23記載のRNA断片。 - 【請求項25】 上記リガンドを有するヌクレオチドが、チオホスフェート
ヌクレオチドである請求項24記載のRNA断片。 - 【請求項26】 少なくとも一のビオチンを有する抗フルオレセイン抗体に
結合したフルオレセインを有するホスフェート又はチオフォスフェートを3’末
端に含むRNA断片。 - 【請求項27】 RNA及び/又はDNA又はRNA断片及び/又はDNA
断片を検出するためのプローブとしての、請求項22乃至26のいずれか1項記
載のRNA断片の使用。 - 【請求項28】 捕捉プローブに結合することができる標識化ターゲットと
しての請求項22乃至26のいずれか1項記載のRNA断片の使用。
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Cited By (1)
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US9110079B2 (en) | 2010-09-29 | 2015-08-18 | Biomerieux | Method and kit for establishing an in vitro prognosis on a patient exhibiting SIRS |
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Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH05504934A (ja) * | 1989-09-29 | 1993-07-29 | バイエル コーポレイション | ヒトの生物学的流体中のneu関連タンパク質の検出及び定量 |
WO1995008000A2 (fr) * | 1993-09-15 | 1995-03-23 | Bio Merieux | Reactif et procede pour la detection d'une sequence nucleotidique avec amplification de signal |
JPH11509094A (ja) * | 1995-06-29 | 1999-08-17 | アフィメトリックス,インコーポレイティド | 統合された核酸診断装置 |
JP2002517994A (ja) * | 1998-06-17 | 2002-06-25 | ベーイーオー・メリュー | リボ核酸を標識化する方法、及びそれにより得られる標識済rna断片 |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5317098A (en) * | 1986-03-17 | 1994-05-31 | Hiroaki Shizuya | Non-radioisotope tagging of fragments |
US4987071A (en) * | 1986-12-03 | 1991-01-22 | University Patents, Inc. | RNA ribozyme polymerases, dephosphorylases, restriction endoribonucleases and methods |
DE3910151A1 (de) * | 1989-03-29 | 1990-10-04 | Toni Dr Lindl | 5'-bromo-2'-desoxyuridinmarkierte dna- oder rna- sonden |
US5858650A (en) * | 1992-04-03 | 1999-01-12 | Abbott Laboratories | Methods for inactivating nucleotide sequences and metal chelates for use therein |
FR2706618B1 (fr) * | 1993-06-11 | 1995-09-01 | Bio Merieux | Dispositif pour le dosage d'haptènes et son utilisation. |
US5834198A (en) * | 1996-03-21 | 1998-11-10 | Boehringer Mamnnheim Gmbh | Selective photoinducted flavin-dependent cleavage of RNA at G-U base pairs and kits therefor |
US5905024A (en) * | 1996-12-17 | 1999-05-18 | University Of Chicago | Method for performing site-specific affinity fractionation for use in DNA sequencing |
-
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Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH05504934A (ja) * | 1989-09-29 | 1993-07-29 | バイエル コーポレイション | ヒトの生物学的流体中のneu関連タンパク質の検出及び定量 |
WO1995008000A2 (fr) * | 1993-09-15 | 1995-03-23 | Bio Merieux | Reactif et procede pour la detection d'une sequence nucleotidique avec amplification de signal |
US5695936A (en) * | 1993-09-15 | 1997-12-09 | Bio Merieux | Reagent and method for the detection of a nucleotide sequence with signal amplification |
JPH11509094A (ja) * | 1995-06-29 | 1999-08-17 | アフィメトリックス,インコーポレイティド | 統合された核酸診断装置 |
JP2002517994A (ja) * | 1998-06-17 | 2002-06-25 | ベーイーオー・メリュー | リボ核酸を標識化する方法、及びそれにより得られる標識済rna断片 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
JPN6009012459, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1993), 90, [4], p.1201−1207 * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP5296318B2 (ja) * | 2005-11-29 | 2013-09-25 | 三菱レイヨン株式会社 | 核酸の調製確認方法 |
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