JP2003512031A

JP2003512031A - 改善された特性を有するヒトパピローマウイルスウイルス様粒子の新規製造方法

Info

Publication number: JP2003512031A
Application number: JP2001531413A
Authority: JP
Inventors: チヤオ，チンチエン; ウー，シルウ; マンガー，ウオルター; ガダム，シシール
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Priority date: 1999-10-15
Filing date: 2000-10-11
Publication date: 2003-04-02
Anticipated expiration: 2020-10-11
Also published as: AU8009800A; DE60037327D1; EP1223976B1; ATE380034T1; CA2384844A1; JP4689914B2; US6436402B1; EP1223976A1; WO2001028585A1; DE60037327T2; AU772512B2; EP1223976A4

Abstract

(57)【要約】ヒトパピローマウイルスウイルス様粒子（ＶＬＰ）を、より高温でのインキュベーション、可溶性金属への暴露またはチオ−酸化を含む種々の成熟条件に付す。得られた成熟ＶＬＰは、種々のサイズを有し（図参照）、より安定である。それは、増加した貯蔵寿命およびより高い効力を有するワクチン製剤の製造に使用されうる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（発明の分野）本発明は、より大きな安定性を有するワクチン用途に適した組成物を与えるヒ
トパピローマウイルスウイルス様粒子（ＶＬＰ）を精製および加工するための新
規方法に関する。また、本発明は、この方法により製造されたＶＬＰに関する。

【０００２】（発明の背景）組換えヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）ウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、Ｌ１
タンパク質またはＬ１およびＬ２タンパク質の組合せのいずれかを含有するが、
ウイルス核酸を含有しない。それは、酵母および昆虫細胞を含む種々の宿主細胞
型において発現されることが可能であり、性器ＨＰＶ感染ならびにそれに続く性
器疣贅および／または子宮頚癌の発生を予防するためのワクチン開発の魅力的な
候補である。動物での研究においては、精製されたＶＬＰがコンホメーション型
特異的Ｌ１エピトープに対する高力価の抗体を誘導することが示されている。こ
れらの抗体はインビトロアッセイにおいて相同ビリオンを中和し、いくつかのモ
デル動物における実験的攻撃に対して防御する。

【０００３】「成熟」（すなわち、ＶＬＰの安定性、構造的明瞭性（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ
ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ）および他の特性の変化）が精製、加工および保存中に
ＶＬＰで観察されている。理論に束縛されるものではないが、これは、少なくと
も１つには、ビリオンの集合および更にはその安定化に要求される分子間ジスル
フィド結合形成における変化によるものであるらしい。

【０００４】安定であることがワクチン製剤には重要である。したがって、安定であり保存
中に免疫原性をも維持するＶＬＰを製造することが望ましいであろう。

【０００５】（発明の詳細な記載）本発明において、パピローマウイルスＬ１またはＬ１＋Ｌ２タンパク質を成熟
プロセス（過程）に付すことにより、改善された抗原性、サイズ分布および安定
性を有するウイルス様粒子が産生されることが見出された。したがって、本発明
は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）ウイルス様粒子（ＶＬＰ）の製造方法で
あって、ａ）ＨＰＶＬ１またはＬ１＋Ｌ２タンパク質を発現させること、ｂ）該タンパク質を少なくとも部分的に精製すること、ｃ）その少なくとも部分的に精製されたタンパク質を成熟工程に付すことを含
んでなる製造方法に関する。

【０００６】本発明に含まれる種々の成熟プロセスがあり、それらには、上昇した温度での
インキュベーション、グルタチオンにより促進されるチオール酸化、金属表面へ
の暴露および光への暴露が含まれる。１つの好ましい成熟プロセスは、少なくと
も部分的に精製されたタンパク質を、上昇した温度でインキュベートする工程で
ある。したがって、本発明の特定の実施形態は、ａ）ＨＰＶＬ１またはＬ１＋Ｌ２タンパク質を発現させること、ｂ）該タンパク質を少なくとも部分的に精製すること、ｃ）その少なくとも部分的に精製されたタンパク質を、上昇した温度でインキ
ュベートすることを含んでなるＨＰＶＶＬＰの製造方法でである。

【０００７】本発明の好ましい実施形態においては、該タンパク質を組換え的に産生させる
。さらに、他の好ましい実施形態においては、上昇した温度は約３０℃〜約４５
℃である。特に好ましい実施形態においては、該温度は約３７℃である。

【０００８】もう１つの実施形態においては、前記の少なくとも部分的に精製されたＶＬＰ
を、成熟工程として、グルタチオンまたは酸化型グルタチオンのいずれかで処理
する。得られる成熟ＶＬＰは加熱処理体と実質的に同じである。

【０００９】本方法により製造されたＶＬＰは、該成熟工程無しで製造されたものから区別
されうるため、本発明はまた、Ｌ１またはＬ１＋Ｌ２タンパク質を発現させ、該
タンパク質を少なくとも部分的に精製し、その少なくとも部分的に精製されたタ
ンパク質を成熟工程に付す製造方法により製造されたウイルス様粒子（ＶＬＰ）
に関する。本発明はまた、そのようにして製造されたＶＬＰを含有するワクチン
組成物に関する。

【００１０】本発明のもう１つの態様は、個体における免疫応答の誘導方法であって、成熟
工程に付されたＶＬＰを含むワクチン組成物の有効量を該個体に投与することを
含んでなる方法に関する。

【００１１】（図面の簡単な記載）図１は、ＢＩＡＣＯＲＥ分析により測定した場合の、成熟工程を加えることに
より得られた抗原性の増強を示すグラフである。ＥＩＡ／ＢＣＡ比および中和ｍ
Ａｂへの相対結合は、ＶＬＰ成熟による抗原性の増強に関する同様の増加を示し
た。数値は、同一実験における対応対照に対する成熟アーム（ａｒｍ）の相対抗
原性の割合（％）である。^＊ロット＃４からの対照アームは、成熟アームと比
較して有意な凝集を示した（すなわち、ＥＩＡ／ＢＣＡ（０．３対０．９）およ
びＢｉａｃｏｒｅ（１０対６７））。

【００１２】図２Ａおよび２Ｂは、最終産物のＶＬＰの電子顕微鏡写真である。図２Ａは、
対照プロセスを用いて製造したＶＬＰである。図２Ｂは、成熟プロセスを用いて
製造したＶＬＰであり、それは、対照より有意に均一に分布している。

【００１３】図３は、動的光散乱により分析したＶＬＰのサイズ分布を示すグラフである。

【００１４】図４Ａおよび４Ｂは、ＨＰＶ６ａＶＬＰ沈降速度の変化を示すグラフである
。図４Ａは対照プロセスである。図４Ｂ（成熟プロセス）においては、粒子サイ
ズの不均一性の減少が分析用遠心分離により示されている。

【００１５】図５Ａおよび５Ｂは、ＶＬＰの高速サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰＳＥ
Ｃ）の結果である。対応する対照プロセスと比較して、より大きなＶＬＰ集団が
単分散状態にある。図５ＡはＨＰＶ６ａＶＬＰであり、図５ＢはＨＰＶ１１
ＶＬＰである。

【００１６】図６Ａ〜Ｄは、ＨＰＶ６ａ（図６Ａおよび６Ｂ）およびＨＰＶ１１（図６Ｃお
よび６Ｄ）に関して非還元条件下のＨＰＳＥＣにより示された、成熟によりＬ１
タンパク質がより架橋していることを示すグラフである。成熟により変換が促さ
れるため、単量体含量における有意な減少が認められる。

【００１７】図７は、該プロセス中のＨＳＰ成熟によるＶＬＰのタンパク質分解活性の減少
を示すグラフである。成熟ＶＬＰのタンパク質分解活性はすべて、同じ実験にお
けるそれぞれの対照アームに対して正規化されており、基質としてカゼインを使
用してペアでアッセイしたものである。

【００１８】図８。促進された成熟によるＨＰＶ１６ＶＬＰの改善された安定性。対照（
４℃から；黒丸）ＶＬＰは４２℃の処理中に迅速に抗原性を失うことが示された
が、該処理産物（黒三角）はより良好な安定性を示した。もう１つの対照調製物
（最下方に引かれている黒丸）は、ＧＳＳＧの不存在下ではＨＰＶ１６ＶＬＰ
がインキュベーション中に抗原性を失うことを示した。

【００１９】図９。滅菌濾過産物（ＳＦＰ）のＨＰＶ１６ＶＬＰの、酸化還元処理の存在
下（ＳＦＰＢ）または不存在下（ＳＦＰＡ）の沈降プロフィール。左パネル
：両方のアームのＶＬＰは直径約４０〜６０ｎｍ（ｌｏｇｓ^＊は約１．４〜２．
４に等しい）のサイズを示す。右パネル：変性条件下、対照プロセスからのＶＬ
ＰはＬ１タンパク質（ｐ５５）に完全に変性し、一方、酸化還元により促進され
た成熟からのＶＬＰは粒子構造を保有していた。

【００２０】本明細書および特許請求の範囲の全体においては、以下の定義が適用される。

【００２１】「成熟」は、ＶＬＰの特性におけるいくつかの有益な変化をもたらす過程（プ
ロセス）を意味する。成熟工程に付されたＶＬＰは、溶液のイオン強度に感受性
ではなく、広いｐＨ範囲にわたり安定であり、室温の生理的塩およびｐＨ条件で
少なくとも１／２〜２日の半減期を有する。これに対して、成熟していないＶＬ
Ｐは、溶液のイオン強度に非常に感受性であり、狭いｐＨ範囲にわたり安定であ
るにすぎず、室温の生理的塩およびｐＨ条件において直ちに凝集する。

【００２２】ＶＬＰは、ＨＰＶのビリオンの主要カプシド成分である天然に発現された又は
組換え的に産生されたＬ１タンパク質から組立て得る。また、ＶＬＰは、Ｌ１お
よびＬ２の両方のタンパク質から製造することが可能であり、以下、それは「Ｌ
１＋Ｌ２」と称される。

【００２３】特にカプソメア間ジスルフィド結合を含むジスルフィド結合は、ＶＬＰの安定
性、そして恐らくはＶＬＰの組立てに決定的に重要であることが示されている。

【００２４】組換えＨＰＶＶＬＰを製造し精製するための一般的方法は公知である。本方
法においては、実質的に任意の血清型ＨＰＶを使用することができる。該ＶＬＰ
は最終的にはワクチン製剤の製造に使用されることになるため、疾患に関連した
血清型が用いられることが好ましい。これらの血清型には、ＨＰＶ６ａ、ＨＰＶ
６ｂ、ＨＰＶ１１、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ
３５、ＨＰＶ３９、ＨＰＶ４５、ＨＰＶ５１、ＨＰＶ５２、ＨＰＶ５６、ＨＰＶ
５８およびＨＰＶ６８が含まれる。該ワクチン製剤はまた、所望により「カクテ
ル」を形成するよう種々の血清型からのＶＬＰの混合物を含みうる。例えば、好
ましいワクチン製剤は、ＨＰＶ６ａおよび／またはＨＰＶ６ｂをＨＰＶ１１、Ｈ
ＰＶ１６およびＨＰＶ１８と共に含む。

【００２５】該組換えタンパク質は、任意の望ましい宿主細胞において産生させることがで
きる。公知の有用な宿主細胞の具体例には、酵母および昆虫細胞が含まれるが、
他の宿主細胞を使用することが可能である。好ましい実施形態においては、酵母
細胞、特にサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒ
ｅｖｉｓｃａｅ）が該宿主である。該宿主細胞を適当な遺伝的構築物で形質転換
し、ＨＰＶタンパク質を産生させる。これらにはすべて、公知方法が用いられる
。十分なＬ１またはＬ１＋Ｌ２タンパク質が産生したら、該タンパク質を集め、
精製する。本発明においては、一般には、少なくとも１つの成熟工程を含む任意
の精製方法を用いることができる。一般に用いられる方法においては、該精製方
法の前に、該細胞を凍結し、細胞スラリーとして保存する。

【００２６】ついで細胞を融解し、所望により、該細胞スラリーをバッファーで希釈するこ
とができる。この段階で用いる温度は、典型的には、約５〜２０℃である。所望
により、望ましくない核酸を分解するために、ＢＥＮＺＯＮＡＳＥ（登録商標）
のような酵素を加えることができる。クロマトグラフィー工程を含む種々の技術
を用いて、該細胞残渣からＶＬＰを分離することができる。

【００２７】本発明の１つの実施形態においては、陽イオン交換クロマトグラフィーのよう
なイオン交換クロマトグラフィー工程を用いて該ＶＬＰを分離する。この方法か
ら得られた中間産物（「ＣＥＰ」と称される）を更なる精製工程および成熟工程
に付すか、または成熟工程、ついで更なる精製工程に付すことができる。該ＣＥ
Ｐを成熟工程に付すのが一般には好ましい。

【００２８】本発明においては、多数の成熟プロセスが確認されている。成熟は、成熟プロ
セスに付されていないカプシドと比較して増強した安定性を有するＶＬＰを与え
る。成熟は、上昇した温度でのインキュベーション、グルタチオンにより促進さ
れるチオール酸化、金属表面への暴露、または光への暴露により達成されうる。

【００２９】１つの好ましい実施形態においては、該成熟工程は、上昇した温度でのインキ
ュベーションである。これは、ＣＥＰに対して又は後続の精製工程の産物に対し
て行うことができる。それは、典型的には、上昇した温度での約１０〜４８時間
、好ましくは約１５〜２０時間のインキュベーションである。典型的には、上昇
した温度は、約２５℃〜約４５℃、好ましくは約３７℃である。

【００３０】あるいは、該ＣＥＰまたは更に精製された産物をグルタチオンまたは酸化型グ
ルタチオンで処理して、それらを成熟させる。グルタチオンの絶対量は決定的に
重要なものではないらしい。それは、０．５ｍＭ〜約１０ｍＭの範囲であること
が可能であり、１ｍＭを超える量が好ましい。１ｍＭを用いる成熟プロセスと７
ｍＭを用いる成熟プロセスとの間には、ほとんど差がないようである。酸化型グ
ルタチオンを使用する場合には、該量は約０．５ｍＭ〜約２０ｍＭの範囲である
ことが可能であり、１ｍＭ〜１７ｍＭが好ましい。

【００３１】該ＣＥＰまたは更に精製された産物を、金属表面への暴露により成熟させるこ
とが可能である。これは、Ｆｅ^２＋、Ｆｅ^３＋、Ｃｕ^１＋またはＣｕ^２＋のよう
な可溶性遷移金属の存在下で生じる反応を含む。該成熟反応には、触媒量の金属
を要するにすぎない。

【００３２】該成熟産物を、望ましい他の任意の精製工程に付すことができる。好ましい方
法においては、該成熟産物をヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーカラムに
より加工（プロセス）し、ついで限外濾過に付して最終的なＶＬＰ産物を得る。
ついで該最終産物を、公知方法および所望により添加物を用いて、ワクチン組成
物に製剤化することができる。

【００３３】あるいは、該ＣＥＰを更に加工し、および／または精製し（例えば、ヒドロキ
シアパタイトカラムクロマトグラフィー法および限外濾過により）、ついで成熟
させることができる。

【００３４】本発明のワクチン製剤は、成熟したＶＬＰを他の生理的に許容される成分と共
に含む。例えば、それは、ミョウバン、非イオン界面活性剤（例えば、ポリソル
ベート誘導体、好ましくは、ポリソルベート８０またはポリソルベート２０）、
塩およびバッファーを含有しうる。好ましい実施形態においては、該ワクチンは
、ミョウバン（２００〜５５０μｇ／ｍｌミョウバン）に吸着された成熟ＶＬＰ
、０．００５〜０．５％（ｗｔ／ｖ）ポリソルベートまたは誘導体、２〜１０ｍ
Ｍバッファー、および０．１０〜０．２０ＭＮａＣｌまたはより低い食塩濃
度の製剤には０．０１〜０．０５ＮａＣｌを含む。好ましい実施形態は、約４
５０μｇ／ｍｌミョウバン、０．０３％ｗｔ／ｖポリソルベート８０また
はポリソルベート２０、５ｍＭヒスチジンバッファー、および０．１５ＭＮ
ａＣｌまたは０．３ＭＮａＣｌを含む。

【００３５】該最終製剤は、一般には、１０〜２００μｇ／ｍｌＶＬＰ、好ましくは、約
２０μｇ／ｍｌ、４０μｇ／ｍｌまたは１００μｇ／ｍｌＶＬＰを有する。典
型的な投与は０．５ｍｌの注射となろう。

【００３６】該成熟プロセスの結果として、該ＶＬＰに対する改善がもたらされる。成熟プ
ロセスにより製造されたこれらの改善されたＶＬＰは、本発明のもう１つの態様
である。改善は以下のとおりに分類されうる。

【００３７】成熟によるＨＰＶＶＬＰの抗原性の増強６ａ型に関する８つの実験室規模プロセスロットおよび１１型に関する１つの
ロットについての成熟プロセスおよびそのそれぞれの対照プロセスに由来するＣ
ＥＰに関するＥＩＡ／ＢＣＡ比は、実施例４で詳しく説明する。該成熟工程を加
えた場合には、ＥＩＡ／ＢＣＡ比が約３０〜５０％増加することが判明した。モ
ノクローナル抗体結合試験を用いた場合、抗原性における一貫した２０〜３０％
の増加が認められた。

【００３８】図１は、該成熟産物の、それらのそれぞれの対照に対する相対抗原性（％）を
示す。中和ｍＡｂを使用するＢＩＡｃｏｒｅアッセイによる相対抗原性アッセイ
は、自発的成熟による該抗原性の改善に関する同様の結果を示した（実施例４）
。ロット＃２からのＣＥＰの組合せをミョウバン上に製剤化した。また、該ミョ
ウバン吸着調製物上でのＩＶＲＰアッセイ（インビトロ放出効力アッセイ）は、
抗原性における約３０％の増強を示した。

【００３９】ＣＥＰ成熟によるＶＬＰのサイズおよび不均一性の減少より多数の分子内および分子間ジスルフィド結合を形成することによりＶＬＰ
が成熟するにつれて、該ＶＬＰは、より明瞭（ｄｅｆｉｎｅｄ）になり、したが
ってお互いに対する又は容器表面に対するその結合性が低下する。該成熟プロセ
スにより製造されたＶＬＰは、一貫して、より小さな全体サイズを示した。最も
重要なことは、該ＶＬＰの不均一性が、ＥＭ（図２Ａおよび２Ｂ）、動的光散乱
によるサイズ分布分析（図３）および速度沈降（図４Ａおよび４Ｂ）により示さ
れるとおり劇的に減少することが判明したことである。より初期のロットから得
られた観察と一致して、より後の２つのロット（ロット＃８および＃９）に関す
るＨＰＳＥＣは、同様の結果を示した。すなわち、該成熟アームは、より明瞭且
つより単分散の粒子を与えた（図５Ａおよび５Ｂ）。

【００４０】成熟後の収率の増加該ＣＥＰを成熟工程に付す非常に重要な利点の１つは、ヒドロキシアパタイト
クロマトグラフィー（ＨＡ）工程から回収される収率の増加にあった。該ＶＬＰ
の成熟は、より選択的なヒドロキシアパタイトカラム過程をもたらす。なぜなら
、ＶＬＰの、お互いに対する及び固体表面に対する非特異的な結合性が低下して
いるからである。６ａ型および１１型に関して種々の出発物質でＶＬＰの成熟を
試験したが、試験したロットの大多数については、該ＨＡ工程の収率は、該成熟
アームでは該対照アームの場合より高かった。例えば、１つの６ａ型ロットにお
いては、該ＨＡ工程の収率は該成熟アームでは３３％であったのに対して、該対
照アームでは２４％であった。同様に、１１型ロットについては、該ＨＡ工程の
収率は該成熟アームでは３５％であったのに対して、該対照では３０％であった
。

【００４１】より著しいＬ１タンパク質の架橋Ｌ１タンパク質は、ジスルフィド結合形成により隣接カプソメアからのその他
のＬ１分子と相互架橋する強力な傾向を有する。この構造的合体過程は、温度、
条件には無関係に、あるいはそれが認識されるか否かには無関係に、加工中およ
び保存中に生じるであろう。ＶＬＰの成熟は、そのようなコンホメーション探索
およびそれに続く鎖間架橋による構造的合体に有利な条件をもたらす。共有ジス
ルフィド結合を利用して該カプソメアが互いに結びつくことにより、ＶＬＰの集
合過程が完了する。インキュベーション工程を加えることにより、単量体段階に
残存するＬ１タンパク質が非常に減少したが、これは、より著しいＶＬＰ内架橋
を示すものである（図６Ａ〜Ｄ）。

【００４２】残留タンパク質分解活性の減少非特異的基質でのタンパク質分解活性アッセイは、全タンパク質分解活性が、
該成熟アームでは、それらの対応対照アームと比較して一貫して減少することを
示した（図７）。理論により束縛されるものではないが、インキュベーション中
の熱不活性化、およびＨＡカラムの、より良好な選択性が、プロテアーゼの不活
性化および／または除去をもたらしうるのであろう。実験は、３７℃での成熟後
にプロテアーゼ活性における若干の減少が生じることを示した。しかし、この減
少は、該プロテアーゼ活性における総減少のごく一部に相当するにすぎない。

【００４３】成熟によるミョウバン上のＶＬＰの改善された抗原性および安定性該成熟ロットの１つからの産物をミョウバン吸着産物に製剤化した。室温およ
び３７℃での時間「０」および３ヶ月間のストレスは、該放出ＩＶＲＰアッセイ
により、増強した抗原性および安定性を示した。

【００４４】本発明を更に詳しく例示するために、以下に非限定的な実施例を記載する。

【００４５】実施例１プロセスの説明発現された組換えＨＰＶを有する酵母細胞を、３６％含水細胞重量（ｗｃｗ
）の凍結スラリーとして−７０℃で保存した。該細胞ペーストを３０℃で２時間
かけて融解し、回収バッファー（２００ｍＭＯＰＳ，２ｍＭＭｇＣｌ_２，ｐ
Ｈ７．０）を使用して希釈して約３０％スラリーとした。融解中および融解後
、該細胞ペーストの温度は５〜１０℃の範囲に維持した。ｗｃｗ１グラム当た
り、ほぼ１：１のＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）（１μＬ／Ｌ）を加えた。該
３０％希釈細胞スラリーを１４００〜１５０００ｐｓｉｇのホモジナイザーに
２回通した。得られたライセートを４℃で一晩（約１６時間）インキュベートし
て、一連の精製における除去の改善のために核酸のサイズを減少させた。そのイ
ンキュベートしたライセートを、回収バッファー（２００ｍＭＯＰＳ，２ｍＭ
ＭｇＣｌ_２，ｐＨ７）およびクエン酸ナトリウムスパイクバッファー（１Ｍ
クエン酸ナトリウム，２００ｍＭＭＯＰＳ，ｐＨ７）の添加により更に９％
ｗｃｗにまで希釈した。接線流動（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌｆｌｏｗ）濾過法を
用いて、２５０ｍＭクエン酸ナトリウムバッファーに対する２．２５容積のダ
イアフィルトレーションを伴う０．６５ミクロン精密濾過膜を使用して、該ＶＬ
Ｐを該細胞残渣から分離した。

【００４６】該精製の大部分は、ＨＳＰＯＲＯＳ陽イオン交換クロマトグラフィー工程で
達成された。ローディングされたカラムを、５ｍＭリン酸ナトリウム、２００
ｍＭＭＯＰＳおよび８００ｍＭＮａＣｌを含有する８カラム容積（ＣＶ）の
バッファーで洗浄した。共に５ｍＭリン酸ナトリウムおよび５０ｍＭＭＯＰ
Ｓ（ｐＨ７．０）を含有する洗浄バッファー（８００ｍＭＮａＣｌ）と溶出バ
ッファー（１５００ｍＭＮａＣｌ）との間の７ＣＶの直線勾配で、該ＨＳカラ
ムから該産物を溶出した。

【００４７】上昇した温度での成熟得られた中間産物（「ＣＥＰ」と称される）を、ステンレス鋼またはガラス容
器内で３７℃で１７時間インキュベートした。該実験のいくつかにおいては、生
物負荷（ｂｉｏｂｕｒｄｅｎ）を最小限に抑えるために、３７℃での成熟工程の
前に、０．２２ミクロンＭｉｌｌｉｐａｋユニットを使用して、該ＣＥＰを滅菌
濾過した。

【００４８】該成熟工程後、該ＨＰＶ産物中の核酸およびプロテアーゼの両方のレベルを減
少させるために、該成熟ＣＥＰをヒドロキシアパタイト（ＨＡ）クロマトグラフ
ィーにより加工した。必要に応じたＢＣＡタンパク質分析に基づき、樹脂１ｍｌ
当たりタンパク質２ｍｇで該ＨＡカラムをローディングした。ローディングされ
たＨＡカラムを５ＣＶのバッファーで洗浄し、５ｍＭリン酸ナトリウムから２
００ｍＭリン酸ナトリウム（どちらのバッファーも１．２５ＭＮａＣｌ（ｐ
Ｈ７．０）を含有する）までの４ＣＶの直線リン酸勾配で溶出した。該ＨＡ産物
の、必要に応じたタンパク質分析を行って、８５０μｇ／ｍｌの標的タンパク質
濃度で限外濾過中に達成されるのに必要な濃度因子を測定した。

【００４９】１０ｋＤａ中空糸膜を使用し、２５０ｍｇ／ｓｑｆｔのロード、６０００ｓ ^−１のせん断速度、２０ｐｓｉの膜間圧および０．０３％（ｗ／ｖ）のＴｗｅｅ
ｎ標的（これは、８５０μｇ／ｍｌの最終タンパク質濃度が得られるよう後続の
限外濾過工程中での算出容積減少をもたらす）で運転する限外濾過を行った。Ｔ
ｗｅｅｎ−８０を該ＨＡ産物に加えて、ＵＦ工程（この場合、該産物が０．５Ｍ
ＮａＣｌ溶液に対してダイアフィルトレーションされる）中の凝集を妨げた。
得られたＵＦ産物のプールを滅菌濾過して、最終水性産物（ＦＰ）を得た。一連
のアッセイを用いて、該ＦＰを特徴づけした（後記を参照されたい）。

【００５０】対照として、前記と同じ方法を、該ＣＥＰの成熟無しで行った。その代わりに
、該ＣＥＰを４℃で１６時間保存し、ついで該ＨＡクロマトグラフィーにより加
工した。該対照および成熟プロセスの総プロセス時間は同一（約４８時間）であ
り、実質的には、唯一の相違は該ＨＳ産物のインキュベーション温度であった（
該対照プロセスでは４℃、該成熟プロセスでは３７℃）。

【００５１】

【表１】

【００５２】実施例２抗原のＥＩＡ定量−抗原性の測定ＨＰＶ６ａ型および１１型を定量するために、二重サンドイッチＥＬＩＳＡ
形式を用いた。該ＶＬＰはポリクローナルヤギ抗ＨＰＶ６ａおよび１１抗体によ
り捕捉された。コンホメーション感受性マウス抗ＨＰＶｍＡｂ、Ｂ１０．５（
ＨＰＶ６ａ）およびＢ２（ＨＰＶ１１）を使用して、検出用にホースラディッシ
ュペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧと共役した捕捉されたＶＬＰの量を定量
した。すべての実験は９６ウェルプレート内で行った。該ペルオキシダーゼは該
反応を触媒して、プレートリーダーにより読取られうる４５０ｎｍにおけるＯＤ
を有する産物を与える。参照体およびサンプルは、常に、並べて実施した。イン
キュベーションは、両方の型に特異的な抗体および該共役抗体の結合のために、
３７℃で行った。

【００５３】実施例３ＢｉａｃｏｒｅアッセイすべてのＢｉａｃｏｒｅアッセイは、２０℃でＣＭ５センサーチップを使用す
るＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）２０００またはＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）３０
００ユニット（Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）で行った。センサーチップＣＭ
５の表面上で、カルボキシラート基をデキストランマトリックスに導入した。ラ
ット抗マウス抗体またはαマウスＦＣγを、アミンカップリングにより該センサ
ーチップ表面のカルボキシラート基に共有的に固定化した。活性化のための０．
２ＭＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジエチルアミノプロピル）カルボジイミドおよ
び０．０５ＭＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ／ＥＤＣ）ならびに不活
性化のためのエタノールアミンを含有するアミンカップリングキットは、Ｂｉａ
ｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．（Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）からのものであった。中
和抗ＨＢｓＡｇ抗体ｍＡｂ、Ｂ１０．２（ＨＰＶ６ａ型用）およびＢ２（１１型
用）は、ＮｅｉｌＣｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ博士（ＰｅｎｎＳｔａｔｅＵｎ
ｉｖ．）がら提供された。ＨＰＶＶＬＰとｍＡｂＢ１０．５またはＢ２との
特異的相互作用を研究するための水溶液中の抗原またはｒＨＢｓＡｇの注入の前
に、該ｍＡｂをαマウスＦＣγにより該センサー表面上に捕捉した。

【００５４】

【表２】

【００５５】

【表３】

【００５６】実施例４電子顕微鏡検査該滅菌濾過産物のすべてに関する電子顕微鏡検査（ＥＭ）は、Ｅｌｋｒｉｄｇ
ｅ，ＭＤのＥＭＢＳ研究室により行われた。該サンプルを室温で４５分間融解し
、ついでチューブの穏やかな反転および回転により十分に再懸濁させた後、グリ
ス（ｇｒｉｓ）調製を行った。該分析に付した各サンプルを、２〜８の種々の希
釈度で０．５ＭＮａＣｌバッファー中で希釈した。希釈後、各サンプルを十分
に再懸濁させた。ホルムバールおよび炭素でコーティングされた３００メッシュ
の銅格子を鉗子でしっかり締め固定した。各格子を０．０１％ウシ血清アルブ
ミンでリンスし、ついで濾紙を使用して過剰の溶液を吸い取った。２％ＶＬＰ
の２μｌアリコートを別々の格子上に配置し、乾燥させた。１０分後、残留物
質を該格子から吸い取った。各サンプルを完全に風乾した後、該サンプルを固定
し、２０μｌの２％リンタングステン酸で染色し、各格子上に配置し、３０秒
間インキュベートした。過剰の染色剤を濾紙で除去した。該サンプルを、ＪＥＯ
Ｌ１２００ＥＸＴｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎＥｌｅｃｔｒｏｎＭｉｃｒ
ｏｓｃｏｐｅ（ＴＥＭ）中で高倍率で集中的に検査した。顕微鏡写真を撮る前に
、各格子からの多数の領域を十分に検査した。１００〜１５０μｇ／ｍｌの濃度
範囲のＢＣＡ中でサンプルを一貫して検査するために、１：２〜１：８で希釈し
たサンプルを調製した。結果を図２Ａおよび２Ｂに示す。

【００５７】実施例５高速サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰＳＥＣ）ＳｈｏｄｅｘＳＢ−８０５−ＨＱカラムを該ＨＰＳＥＣ分析において使用し
た。このカラムの排除限界はＲη＝６５ｎｍ（デキストラン標準）を超えるが、
Ｒη＝１１０ｎｍ（ポリアクリルアミド標準）未満である。該カラムを、使用前
に、部分的に凝集したＨＰＶ１８およびＨＰＶ１６サンプルで調整した。適切な
調整が保証されるよう、いくつかの注入の領域を比較した。いくつかのＨＰＶお
よび非ＨＰＶ（デキストラン）サイズ／参照標準をまず注入し、ついでＨＰＶ６
ａおよびＨＰＶ１１を注入した。Ｗａｔｅｒｓ２６９０ポンプ（流速：０．４
ｍＬ／分）を使用して、各サンプルを二重に注入した。該移動相は、２０ｍＭ
リン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）により緩衝化された０．７５ＭＮａＣｌであ
った。該クロマトグラフィーをＵＶ（λ＝２１４，２６０および２８０ｎｍ）お
よび蛍光（ｅｘ λ＝２８０ｎｍ、ｅｍ λ＝３４０ｎｍ）によりモニターした
。

【００５８】実施例７動的光散乱（ＤＬＳ）ＤＬＳ測定は、ＭａｌｖｅｒｎＺｅｔａｓｉｚｅｒ３０００装置を使用し
て行った。測定前に、すべてのサンプルおよび希釈剤を室温にした。モノモード
（ｍｏｎｏｍｏｄａｌ）解析アルゴリズムを使用した。５回の反復測定（それぞ
れ１０秒間の持続時間）を各サンプルについて行った。バックグラウンドバッフ
ァー組成が希釈の際に有意に改変されないよう、関心のあるサンプル用の適当な
マトリックスバッファーを使用してサンプルを希釈した。該希釈度は、該シグナ
ルの強度が１００〜５００ｋｐｃｓの範囲となるようなものであった。典型的に
は、該ＳＦＰサンプルは、約２５の希釈度を要する。

【００５９】サイズ分布に関しては、動的光散乱装置ＤｙｎａＰｒｏ−ＬＳＲ（Ｐｒｏｔｅ
ｉｎＳｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｃｈａｒｌｏｔｔｅｓｖｉｌｌｅ，ＶＡ
）を使用した。該アッセイの前に、サンプルを約２０μｇ／ｍｌの最終濃度にま
で０．５ＭＮａＣｌ中に希釈した。結果を図３に要約する。

【００６０】

【表４】

【００６１】

【表５】

【００６２】実施例７沈降速度分析用遠心分離ＢｅｃｋｍａｎＸＬ１分析用超遠心機を使用して、沈降速度実験を行った。
該沈降係数分布プロフィールを、ＨＰＶでの使用のために開発された可変性速度
沈降プロフィールに基づき、ＭｉｃｒｏｓｏｆｔＥｘｃｅｌワークシートを使
用して作製した。小容積の該サンプルをガラスセル内にローディングし、該サン
プルのサイズ分布を特徴づけるためにオンラインＵＶ検出を行いながら該サンプ
ルを非常に高速で遠心した。結果を図４Ａおよび４Ｂに要約する。

【００６３】実施例８Ｌ１タンパク質の架橋：ＨＰＳＥＣによるオリゴマーアッセイ高速サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰＳＣ）を変性かつ非還元条件下で行
うことにより、三量体、二量体および単量体の含量を定量した。ジスルフィド結
合は著しいリシャフリング（ｒｅｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）を受けることが知られて
いた。したがって、該リシャフリングを最小限に抑えるために、低いｐＨを用い
た。最終的なサンプル条件は、タンパク質濃度２００μｇ／ｍｌで、５％ナト
リウムドデシルスルホナート（ＳＤＳ）／０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ
）であった。サンプルを５秒間ボルテックスし、７５℃で１０分間（±１０秒）
加熱した。カラム上への注入の前に、サンプルを室温でせいぜい５分間静置した
。クロマトグラフィーは、ＳｈｏｄｅｘＫＷ−８０３シリカゲルカラムを使用
するＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ１１００シリーズＨＰＬＣ上で行った。
該移動相は、０．１％ＳＤＳ／１５ｍＭＮａＰｉ／１５０ｍＭＮａＣｌ（
ｐＨ３）であった。移動相バッファーは、一塩基ＮａＰｉを使用して調製し、該
ｐＨは、ＨＣｌを使用して低下させた。１００μｌのサンプル注入物を、０．２
ｍｌ／分の流速で室温で９０分間で溶出した。該溶出は２２０ｎｍでモニターし
た。結果を図５Ａ〜Ｂおよび６Ａ〜Ｄに要約する。

【００６４】実施例９タンパク質活性アッセイすべての該中間プロセスおよび最終産物サンプルを総タンパク質分解活性に関
してアッセイした。ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓからのＥｎｚＣｈｅｋキ
ットを修飾し、それを使用して、蛍光標識ペプチドの放出を招くカゼインの非特
異的切断をモニターした。

【００６５】

【表６】

【００６６】

【表７】

【００６７】

【表８】

【００６８】実施例１０グルタチオン促進成熟による精製ＨＰＶ１６の安定化：中和ｍＡｂＶ５結合
により示された抗原性の最小限度の及びより遅い喪失成熟または架橋過程を促進するために、ＨＰＶ１６の精製ＶＬＰの最終産物
（０．５ＭＮａＣｌ中、約０．８ｍｇ／ｍｌ）を酸化型グルタチオン（ＧＳＳ
Ｇ，１〜１７ｍＭ）で処理した。該混合物を、攪拌することなく３７℃で１６〜
２０時間放置した。表面プラズモン共鳴またはＢＩＡｃｏｒｅセンサーチップに
基づくアッセイにより、中和ｍＡｂ（Ｈ１６．Ｖ５）の結合により、該ＨＰＶ１
６ＶＬＰの抗原性をモニターした。該抗原性は、抗体（ｍＡｂＶ５）に対す
る抗原（ＨＰＶ１６ＶＬＰ）の比率として表されている。

【００６９】未処理対照は４２℃での熱ストレス中に不安定であることが、図８において明
らかである。それは、４２℃で約６時間のうちに抗原性を完全に喪失した（黒丸
、図８）。興味深いことに、ＧＳＳＧで処理されたＨＰＶ１６ＶＬＰは、４２
℃で２５時間後に５０％を超える抗原性を保有することが判明した（黒三角、図
８）。これらの結果は、グルタチオン処理による促進された成熟後に、ＨＰＶ１
６ＶＬＰがはるかに安定であり、熱誘発凝集に抵抗性であることを、明らかに
示している。ＧＳＳＧにより促進されるジスルフィド結合形成はタンパク質化学
においてよく知られており、それは、該分子間相互作用を強固にする、分子レベ
ルでのメカニズムの基礎であると考えられる。その結果、ＶＬＰ構造は、より明
瞭となり、その凝集傾向が低下する。

【００７０】実施例１１部分精製されたＣＥＰのプロセス段階グルタチオン促進成熟によるＨＰＶ１６
ＶＬＰの安定化：ＧＳＳＧ媒介酸化的リフォールディングの結果としてのＳＤ
Ｓ誘発変性に対する抵抗性実施例１に記載の方法と同じ方法を用いて、ＨＰＶ１６ＶＬＰを精製し、Ｖ
ＬＰを以下のとおりに成熟させた。部分精製されたＣＥＰを、１ｍＭＧＳＳＧ
、０．１ｍＭＧＳＨおよび５０μＭＦｅＣｌ_２の酸化還元カクテルバッファ
ーで２５℃で２０時間処理した。ついで該混合物を、常法どおりに、ＨＡカラム
およびそれに続く０．５ＭＮａＣｌ中へのバッファー交換のための限外濾過に
より加工（プロセス）した。比較のために、対照アームを行った。すべての実験
条件は、酸化還元バッファーを使用しないこと以外は同じであった。図９の結果
は、成熟後のＶＬＰの安定性の改善を明らかに示した。天然条件下（左パネル）
、対照産物および処理産物は共に、ＶＬＰが直径４０〜６０ｎｍのサイズを有す
ることを示した。該ＶＬＰを変性条件（１％ＳＤＳおよび加熱）に付した場合
に、酸化還元処理の効果は明らかとなる。同じ条件下、未処理対照は変性サブユ
ニット（Ｌ１タンパク質）に分解したが、該処理調製物は、該沈降プロフィール
からはウイルス様構造体として維持されている。

【図面の簡単な説明】

【図１】ＢＩＡＣＯＲＥ分析により測定した場合の、成熟工程を加えることにより得ら
れた抗原性の増強を示すグラフである。

【図２Ａ】最終産物のＶＬＰの電子顕微鏡写真であり、対照プロセスを用いて製造したＶ
ＬＰを用いた。

【図２Ｂ】最終産物のＶＬＰの電子顕微鏡写真であり、成熟プロセスを用いて製造したＶ
ＬＰを用いた。

【図３】動的光散乱により分析したＶＬＰのサイズ分布を示すグラフである。

【図４Ａ】ＨＰＶ６ａＶＬＰ沈降速度の変化を示すグラフ（対照プロセス）である。

【図４Ｂ】ＨＰＶ６ａＶＬＰ沈降速度の変化を示すグラフ（成熟プロセス）である。

【図５Ａ】ＶＬＰ（ＨＰＶ６ａＶＬＰ）の高速サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰＳ
ＥＣ）の結果を示す。

【図５Ｂ】ＶＬＰ（ＨＰＶ１１ＶＬＰ）の高速サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰＳ
ＥＣ）の結果を示す。

【図６Ａ】ＨＰＶ６ａに関して非還元条件下のＨＰＳＥＣにより示された、成熟によりＬ
１タンパク質がより架橋していることを示すグラフである。

【図６Ｂ】ＨＰＶ６ａに関して非還元条件下のＨＰＳＥＣにより示された、成熟によりＬ
１タンパク質がより架橋していることを示すグラフである。

【図６Ｃ】ＨＰＶ１１に関して非還元条件下のＨＰＳＥＣにより示された、成熟によりＬ
１タンパク質がより架橋していることを示すグラフである。

【図６Ｄ】ＨＰＶ１１に関して非還元条件下のＨＰＳＥＣにより示された、成熟によりＬ
１タンパク質がより架橋していることを示すグラフである。

【図７】このプロセス中のＨＳＰ成熟によるＶＬＰのタンパク質分解活性の減少を示す
グラフである。

【図８】促進された成熟によるＨＰＶ１６ＶＬＰの改善された安定性を示す。

【図９Ａ】滅菌濾過産物（ＳＦＰ）のＨＰＶ１６ＶＬＰの、酸化還元処理の存在下（Ｓ
ＦＰＢ）または不存在下（ＳＦＰＡ）の沈降プロフィールを示す。

【図９Ｂ】滅菌濾過産物（ＳＦＰ）のＨＰＶ１６ＶＬＰの、酸化還元処理の存在下（Ｓ
ＦＰＢ）または不存在下（ＳＦＰＡ）の沈降プロフィールを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 31/20 Ａ６１Ｐ 31/20 35/00 35/00 Ｃ１２Ｎ 7/02 Ｃ１２Ｎ 7/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ウー，シルウアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065−0907、ローウエイ、イースト・リンカーン・アベニユー・126 (72)発明者マンガー，ウオルターアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065−0907、ローウエイ、イースト・リンカーン・アベニユー・126 (72)発明者ガダム，シシールアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065−0907、ローウエイ、イースト・リンカーン・アベニユー・126 Ｆターム(参考） 4B065 AA95Y BD08 BD25 BD39 CA24 CA45 4C076 AA16 BB11 CC06 CC41 CC47 EE41 EE59 FF15 FF16 FF68 4C085 AA03 BA76 BB11 CC08 DD23 DD34 DD53 DD62 EE01

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）ウイルス様粒子（ＶＬＰ
）の製造方法であって、ａ）ＨＰＶＬ１またはＬ１＋Ｌ２タンパク質を発現させること、ｂ）該タンパク質を少なくとも部分的に精製すること、ｃ）その少なくとも部分的に精製されたタンパク質を成熟工程に付すことを含
んでなる製造方法。
【請求項２】該ＨＰＶタンパク質が、ＨＰＶ６ａ、ＨＰＶ６ｂ、ＨＰＶ１
１、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３５、ＨＰＶ３
９、ＨＰＶ４５、ＨＰＶ５１、ＨＰＶ５２、ＨＰＶ５６、ＨＰＶ５８およびＨＰ
Ｖ６８よりなる群から選ばれる、請求項１記載の製造方法。
【請求項３】工程ｃ）の前に該タンパク質を精製する、ＨＰＶＶＬＰの
製造方法。
【請求項４】該成熟工程が、上昇した温度でのインキュベーション、グル
タチオンにより促進されるチオール酸化、金属表面への暴露、光への暴露および
それらの組合せよりなる群から選ばれる、請求項２記載の製造方法。
【請求項５】ａ）ＨＰＶＬ１またはＬ１＋Ｌ２タンパク質を発現させる
こと、ｂ）該タンパク質を少なくとも部分的に精製すること、ｃ）その少なくとも部分的に精製されたタンパク質を、上昇した温度でインキ
ュベートすることを含んでなるＨＰＶＶＬＰの製造方法。
【請求項６】該温度が約３０℃〜約４５℃である、請求項５記載の製造方
法。
【請求項７】該タンパク質を、上昇した温度で約２〜約３０時間インキュ
ベートする、請求項６記載の製造方法。
【請求項８】ａ）ＨＰＶ６ａ、ＨＰＶ６ｂ、ＨＰＶ１１、ＨＰＶ１６、Ｈ
ＰＶ１８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３５、ＨＰＶ３９、ＨＰＶ４５、Ｈ
ＰＶ５１、ＨＰＶ５２、ＨＰＶ５６、ＨＰＶ５８およびＨＰＶ６８よりなる群か
ら選ばれるＨＰＶＬ１またはＬ１＋Ｌ２タンパク質を発現させること、ｂ）その発現されたタンパク質を、陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて
部分的に精製すること、ｃ）その部分的に精製されたタンパク質を、約３７℃の温度に約１５〜約２０
時間付して、成熟ＶＬＰを産生させること、ｄ）該成熟ＶＬＰをワクチン中に製剤化することを含んでなるＨＰＶワクチン
組成物の製造方法。
【請求項９】ａ）ＨＰＶＬ１またはＬ１＋Ｌ２タンパク質を発現させる
こと、ｂ）該タンパク質を少なくとも部分的に精製すること、ｃ）その少なくとも部分的に精製されたタンパク質をグルタチオンまたは酸化
型グルタチオンで処理することを含んでなるＨＰＶＶＬＰの製造方法。
【請求項１０】工程ｃ）においてグルタチオンが約０．５ｍＭ〜約１０ｍ
Ｍの濃度で存在するか、または酸化型グルタチオンが約０．５ｍＭ〜２５ｍＭの
濃度で存在する、請求項９記載の製造方法。
【請求項１１】該グルタチオンが１ｍＭ〜７ｍＭで存在するか、または酸
化型グルタチオンが１〜１７ｍＭで存在する、請求項１０記載の製造方法。
【請求項１２】請求項１記載の製造方法により製造されたＨＰＶウイルス
様粒子（ＶＬＰ）。
【請求項１３】請求項１２記載のＶＬＰを含んでなるワクチン組成物。
【請求項１４】個体における免疫応答の誘導方法であって、請求項１３記
載のワクチン組成物の有効量を該個体に投与することを含んでなる方法。