JP2003507393A - Modified ciliary neurotrophic factors, methods of making them and methods of using them - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、神経学的または他の疾患または障害の処置のために有用である治療用のＣＮＴＦ関連ポリペプチドに関する。本発明の目的は、糖尿病および肥満を含むがそれらに限定されない疾患または障害の処置のための新規ＣＮＴＦ関連栄養因子を提供することである。好ましい実施形態において、ＣＮＴＦおよび関連分子は、インスリン非依存性糖尿病の処置のために利用される。糖尿病、特に非インシュリン依存性糖尿病または妊娠発症糖尿病を処置するための方法における使用のための医薬の製造における改変された毛様体神経栄養因子Ａｘ−１５の使用に関する。   (57) [Summary] The present invention relates to therapeutic CNTF-related polypeptides that are useful for treating neurological or other diseases or disorders. It is an object of the present invention to provide novel CNTF-related trophic factors for the treatment of diseases or disorders, including but not limited to diabetes and obesity. In a preferred embodiment, CNTF and related molecules are utilized for the treatment of non-insulin dependent diabetes. It relates to the use of a modified ciliary neurotrophic factor Ax-15 in the manufacture of a medicament for use in a method for treating diabetes, especially non-insulin dependent diabetes or gestational diabetes.

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】 本願は、米国シリアル番号第０９／３７３，８３４号（１９９９年８月１３日
出願）の一部継続出願であり、これは、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９９／０４
４３０（１９９９年２月２６日に出願）の一部継続出願であり、これは米国シリ
アル番号０９／０３１，６９３（１９９８年２月２７日出願）の一部継続出願で
ある。本願を通じて、種々の特許および刊行物が参照される。これらの特許およ
び刊行物は、本明細書において参考としてその全体が本願に対して援用される。This application is a continuation-in-part application of US Serial No. 09 / 373,834 (filed Aug. 13, 1999), which is PCT application number PCT / US99 / 04.
430 (filed February 26, 1999) is a continuation-in-part application of US Serial No. 09 / 031,693 (filed February 27, 1998). Throughout this application, various patents and publications are referenced. These patents and publications are incorporated herein by reference in their entirety.

【０００２】 （発明の背景） 本発明は、神経学的または他の疾患または障害の処置のために有用である治療
用のＣＮＴＦ関連ポリペプチドに関する。BACKGROUND OF THE INVENTION The present invention relates to therapeutic CNTF-related polypeptides that are useful for the treatment of neurological or other diseases or disorders.

【０００３】 毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）は、ニワトリ胚毛様体神経節ニューロンのイ
ンビトロでの生存に必要とされるタンパク質である（Ｍａｎｔｈｏｒｐｅら、１
９８０、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．３４、６９−７５）。毛様体神経節は、解剖
学的には、眼窩内に位置し、外側直筋と視神経鞘との間に存在し；これは、動眼
神経から副交感神経線維を受ける。動眼神経は、毛様体筋および瞳孔括約筋を神
経支配する。Ciliary neurotrophic factor (CNTF) is a protein required for in vitro survival of chicken embryo ciliary ganglion neurons (Manthorpe et al., 1).
980, J. Neurochem. 34, 69-75). The ciliary ganglion is anatomically located in the orbit and lies between the lateral rectus muscle and the optic nerve sheath; it receives parasympathetic fibers from the oculomotor nerve. The oculomotor nerve innervates the ciliary muscle and the pupil sphincter.

【０００４】 過去十年間にわたって、多数の生物学的効果が、毛様体神経節ニューロンの生
存を支持する能力に加えて、ＣＮＴＦに帰せられている。ＣＮＴＦは、ラット末
梢視神経および脳における両能性の神経節前駆体細胞の分化を誘導すると考えら
れている（Ｈｕｇｈｅｓら、１９８８、Ｎａｔｕｒｅ ３３５：７０−７３）。
さらに、ＣＮＴＦは、ニワトリ胚脊髄神経節感覚ニューロンの生存を促進するこ
とが観察されている（ＳｋａｐｅｒおよびＶａｒｏｎ，１９８６、Ｂｒａｉｎ
Ｒｅｓ．３８９：３９−４６）。さらに、ＣＮＴＦは、運動ニューロン、海馬ニ
ューロンおよびシナプス前脊髄ニューロンの生存および分化を支持する（Ｓｅｎ
ｄｔｎｅｒら、１９９０、Ｎａｔｕｒｅ ３４５：４４０−４４１；Ｉｐら、１
９９１、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１１：３１２４−３１３４；Ｂｌｏｔｔｎｅｒ
ら、１９８９、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．１０５：３１６−３２０）。Over the past decade, numerous biological effects have been attributed to CNTF, in addition to its ability to support survival of ciliary ganglion neurons. CNTF is believed to induce the differentiation of bipotent ganglion precursor cells in the rat peripheral optic nerve and brain (Hughes et al., 1988, Nature 335: 70-73).
Furthermore, CNTF has been observed to promote survival of chicken embryonic spinal ganglion sensory neurons (Skaper and Varon, 1986, Brain.
Res. 389: 39-46). In addition, CNTF supports survival and differentiation of motor neurons, hippocampal neurons and presynaptic spinal cord neurons (Sen
dtner et al., 1990, Nature 345: 440-441; Ip et al., 1.
991, J.I. Neurosci. 11: 3124-3134; Blottner.
Et al., 1989, Neurosci. Lett. 105: 316-320).

【０００５】 骨格筋の神経支配が筋肉の構造および機能の維持において重要な役割を果たし
ていることは長く知られている。骨格筋は、ＣＮＴＦの正の作用の標的であるこ
とが最近示されている。具体的には、ＣＮＴＦは、骨格筋の脱神経誘導萎縮（湿
重量および筋繊維の断面積の減少）および脱神経化した骨格筋の攣縮および強縮
性緊張の減少の両方を防止する。Ｈｅｌｇｒｅｎら、１９９４、Ｃｅｌｌ ７６
：４９３−５０４。このモデルにおいて、ヒトＣＮＴＦはまた、体重増加の遅延
として現れる有害効果ももたらした。この有害効果はまた、ＡＬＳの処置のため
にｒＨＣＮＴＦを用いた臨床試験においても観察されている。従って、脱神経後
の筋肉重量および動物の体重の同時測定は、それぞれ、ｒＨＣＮＴＦまたは他の
化合物の処置に対する効力および有害反応の尺度として使用され得る。これらの
測定値から得られた効力値の比を、治療指数（Ｔ．Ｉ．）と定義する。これを、
本明細書において、ＴＤ₂₅／ＥＤ₅₀と表現し、その結果、Ｔ．Ｉ．の値が高けれ
ば、その化合物は治療用量でより安全である。It has long been known that skeletal muscle innervation plays an important role in maintaining muscle structure and function. Skeletal muscle has recently been shown to be the target for the positive effects of CNTF. Specifically, CNTF prevents both denervation-induced atrophy of skeletal muscle (reduction of wet weight and muscle fiber cross-sectional area) and denervation of skeletal muscle spasms and diastolic tone. Helgren et al., 1994, Cell 76.
: 493-504. In this model, human CNTF also produced an adverse effect manifested as a delay in weight gain. This adverse effect has also been observed in clinical trials with rHCNTF for the treatment of ALS. Thus, simultaneous denervation muscle and animal body weight measurements, respectively, can be used as a measure of efficacy and adverse response to treatment with rHCNTF or other compounds. The ratio of efficacy values obtained from these measurements is defined as the therapeutic index (TI). this,
In the present specification, it is expressed as TD ₂₅ / ED _50, and as a result, T. I. The higher the value of, the safer the compound is at the therapeutic dose.

【０００６】 ＣＮＴＦは、Ｍａｓｉａｋｏｗｓｋｉら、１９９１、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．
５７：１００３−１０１２および国際公開ＷＯ９１／０４３１６（１９９１年４
月４日公開）（これらは、その全体が本明細書において参考として援用される。
）において記載されるように、細菌発現系においてクローニングされ、そして合
成されている。[0006] CNTF is described by Masakowski et al., 1991, J. Am. Neurosci.
57: 1003-1012 and International Publication WO 91/04316 (April 1991).
Published April 4), which are incorporated herein by reference in their entirety.
), And has been cloned and synthesized in a bacterial expression system.

【０００７】 ＣＮＴＦについてのレセプター（「ＣＮＴＦＲα」という）はクローニングさ
れ、配列決定され、そして発現されている（Ｄａｖｉｓら、１９９１、Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ ２５３：５９−６３を参照のこと）。白血病阻害因子（ＬＩＦ）として
知られるＣＮＴＦおよび造血因子は、ＩＬ−６シグナル伝達成分ｇｐ１３０およ
び第二のβ成分（ＬＩＦＲβとして知られる）を含む、共有されたシグナル伝達
経路を介してニューロン細胞に作用する；従って、ＣＮＴＦ／ＣＮＴＦレセプタ
ー複合体は、ＬＩＦ応答性細胞、またはｇｐ１３０およびＬＩＦＲβを有する他
の細胞におけるシグナル伝達を開始し得る（Ｉｐら、１９９２、Ｃｅｌｌ ６９
：１１２１−１１３２）。The receptor for CNTF (referred to as "CNTFRα") has been cloned, sequenced, and expressed (Davis et al., 1991, Scie).
nce 253: 59-63). Known as leukemia inhibitory factor (LIF), CNTF and hematopoietic factors act on neuronal cells via a shared signaling pathway that includes the IL-6 signaling component gp130 and a second β component (known as LIFRβ). Therefore, the CNTF / CNTF receptor complex may initiate signaling in LIF-responsive cells, or other cells with gp130 and LIFRβ (Ip et al., 1992, Cell 69).
1121-1132).

【０００８】 ヒトＣＮＴＦに加えて、対応するラット（Ｓｔｏｅｋｌｉら、１９８９、Ｎａ
ｔｕｒｅ ３４２：９２０−９２３）およびウサギ（Ｌｉｎら、１９８９、Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：８９４２−８９４７）の遺伝子がクローニングさ
れており、そして２００アミノ酸のタンパク質をコードすることが見出されてお
り、これは、ヒト遺伝子と約８０％の配列同一性を共有する。ヒトおよびラット
の両方の組換えタンパク質が例外的に高レベル（総タンパク質の７０％にもいた
る）で発現され、そしてほぼ均質にまで精製されている。In addition to human CNTF, the corresponding rat (Stoekli et al., 1989, Na
pure 342: 920-923) and rabbits (Lin et al., 1989, J. Chem.
Biol. Chem. 265: 8942-8947) has been cloned and found to encode a protein of 200 amino acids, which shares approximately 80% sequence identity with the human gene. Both human and rat recombinant proteins are expressed at exceptionally high levels (up to 70% of total protein) and are purified to near homogeneity.

【０００９】 構造的および機能的な類似性にもかかわらず、組換えのヒトおよびラットのＣ
ＮＴＦは、いくつかの点で相違する。培養物中のニワトリ胚毛様体ニューロンの
生存および神経突起の伸長を支持するにおける組換えラットＣＮＴＦの生物学的
活性は、組換えヒトＣＮＴＦのものよりも４倍良い（Ｍａｓｉａｋｏｗｓｋｉら
、１９９１、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５７：１００３−１０１２）。さらに、
ラットＣＮＴＦは、ヒトＣＮＴＦレセプターについて、ヒトＣＮＴＦよりも高い
親和性を有する。Despite structural and functional similarities, recombinant human and rat C
NTF differs in several respects. The biological activity of recombinant rat CNTF in supporting survival and neurite outgrowth of chick embryo ciliary neurons in culture is 4-fold better than that of recombinant human CNTF (Masiakowski et al., 1991, J. Neurochem. 57: 1003-1012). further,
Rat CNTF has a higher affinity for human CNTF receptor than human CNTF.

【００１０】 大きさが同一であるヒトおよびラットのＣＮＴＦの物理的特性における驚くべ
き相違は、ＳＤＳゲルにおけるそれらの異なる移動性である。この挙動の相違は
、変性状態においてでさえ維持される、２つの分子のうちの一つにおける異常な
構造的特徴の存在を示唆する（Ｍａｓｉａｋｏｗｓｋｉら、１９９１、Ｊ．Ｎｅ
ｕｒｏｃｈｅｍ．５７：１００３−１０１２）。A surprising difference in the physical properties of human and rat CNTFs that are identical in size is their different mobilities in SDS gels. This difference in behavior suggests the presence of unusual structural features in one of the two molecules that is maintained even in the denatured state (Masiakowski et al., 1991, J. Ne.
urochem. 57: 1003-1012).

【００１１】 遺伝子工学による変異誘発は、組換えタンパク質の機能的ドメインの構造的機
構を明らかにするために広汎に用いられている。いくつかの異なるアプローチが
欠失または置換変異誘発を実施することについて文献において記載されている。
最も首尾よいものは、アラニンスキャニング変異誘発（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍお
よびＷｅｌｌｓ、１９８９、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１−１０８５）お
よび相同体スキャニング変異誘発（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら、１９８９、Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ ２４３：１３３０−１３３６）であるようである。これらのアプロー
チは、成長ホルモンのレセプター結合ドメインを同定し、そしてその同族レセプ
ターに対して変更した結合特性を有するハイブリッドタンパク質を作製すること
を補助した。[0011] Genetic engineering mutagenesis has been widely used to elucidate the structural machinery of the functional domains of recombinant proteins. Several different approaches have been described in the literature for performing deletion or substitution mutagenesis.
The most successful are alanine scanning mutagenesis (Cunningham and Wells, 1989, Science 244: 1081-1085) and homolog scanning mutagenesis (Cunningham et al., 1989, Sci.
ence 243: 1330-1336). These approaches have helped to identify the receptor binding domain of growth hormone and create hybrid proteins with altered binding properties for its cognate receptor.

【００１２】 ｒＨＣＮＴＦの物理学的、生化学的および薬理学的特性をよりよく理解するた
めに、出願人は、それらの対応する組換えタンパク質の異なる生物学的および物
理的特性に基づいて、ヒトおよびラットのＣＮＴＦ遺伝子の合理的変異誘発を行
った（Ｍａｓｉａｋｏｗｓｋｉ，Ｐ．ら、１９９１、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．
５７：１００３−１０１２を参照のこと）。出願人は、６３位でのアミノ酸の性
質が、ｓＣＮＴＦＲαに対するヒトＣＮＴＦの親和性およびそのインビトロでの
生物学的効力を大いに増強し得ることを見出した（Ｐａｎａｙｏｔａｔｏｓ，Ｎ
．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９３、２６８：１９０００−１９００３；
Ｐａｎａｙｏｔａｔｏｓ，Ｎ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９４、３３
：５８１３−５８１８）。In order to better understand the physical, biochemical and pharmacological properties of rHCNTF, the Applicant was based on the different biological and physical properties of their corresponding recombinant proteins in humans. And rational mutagenesis of the rat CNTF gene was performed (Masiakowski, P. et al., 1991, J. Neurochem.
57: 1003-1012). Applicants have found that the nature of the amino acid at position 63 can greatly enhance the affinity of human CNTF for sCNTFRα and its in vitro biological potency (Panayotatos, N.
． Et al., J. Biol. Chem. 1993, 268: 19000-19003;
Panayatotos, N .; Et al., Biochemistry, 1994, 33.
: 5813-5818).

【００１３】 同時係属中の米国特許出願第０７／５７０，０６１（１９９０年８月２０日出
願、発明の名称「Ｃｉｌｉａｒｙ Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ Ｆａｃｔｏｒ」
）および国際公開ＷＯ９１／０４３１６（１９９１年４月４日公開）（これらは
、その全体が本明細書において参考として援用される。）に記載されるように、
出願人が意図するＣＮＴＦの使用の一つは、ハンティングトン病（ハンティング
トン舞踏病）の処置のためのＣＮＴＦの使用であった。ハンティングトン病（Ｈ
Ｄ）は、中枢神経系の遺伝性変性障害である。ＨＤの根底となる病理は、不随意
運動および認知活動の統制の局面を担う脳の奥底の構造体である基底核の進行性
で容赦ない変性である。ＨＤにおける症状の発症は、一般に、２０歳〜４０歳の
間の成人においてである。この疾患の特徴的な症状は、舞踏病および他の自発的
運動、痴呆、ならびに精神医学的症状である。舞踏病性の運動は、短く、非自発
的で、流れるような運動からなり、主に遠位端に影響を与える。患者は、しばし
ば、これらの運動を、その運動と自発的な行動とを混ぜ合わせることによって「
繕う」傾向がある。しかし、ＨＤ患者はまた、失調（持続性、異常***）、チッ
ク（「習慣性痙攣」）、運動失調（協調不能）および構語障害（どもりのある発
話）を含む、種々の他の神経学的異常を示す。ＨＤの痴呆は、原型的な「皮質下
」痴呆と特徴付けられる。ＨＤにおける痴呆の症状としては、精神機能の遅延お
よび集中および連続的な課題における困難性が挙げられる。ＨＤ患者における行
動障害は、多様であり、そして無関心および離脱症状のような人格の変化；動揺
、衝動、妄想症、抑鬱、攻撃的行動、妄想、精神病などが挙げられ得る。この執
拗な運動、認知および行動減退は、社会的および機能的な不能および、究極的に
は死をもたらす。Co-pending US Patent Application No. 07 / 570,061 (filed Aug. 20, 1990, title "Ciliary Neurotrophic Factor")
) And International Publication WO 91/04316 (published April 4, 1991), which are incorporated herein by reference in their entirety.
One of the applicant's intended uses of CNTF was the use of CNTF for the treatment of Huntington's disease (Huntington's chorea). Huntington's disease (H
D) is a hereditary degenerative disorder of the central nervous system. The underlying pathology of HD is the progressive and relentless degeneration of the basal ganglia, the structures underlying the brain responsible for aspects of control of involuntary movements and cognitive activity. The onset of symptoms in HD is generally in adults between the ages of 20 and 40. Characteristic symptoms of this disease are chorea and other spontaneous movements, dementia, and psychiatric symptoms. Chorea movements consist of short, involuntary, fluid movements that primarily affect the distal end. Patients often use these movements by mixing them with voluntary behavior.
Tend to patch up. However, HD patients also suffer from a variety of other neurological disorders, including ataxia (persistent, abnormal position), tics (“habitual spasms”), ataxia (incoordination) and dyslexia (sloppy speech). Indicates an abnormality. Dementia in HD is characterized as a prototypical "subcortical" dementia. Symptoms of dementia in HD include delayed and focused mental functioning and difficulty in continuous tasks. Behavioral disorders in HD patients are diverse and may include personality changes such as apathy and withdrawal symptoms; upset, impulse, delusions, depression, aggressive behavior, delusions, psychosis, and the like. This persistent movement, cognitive and behavioral decline leads to social and functional disability and ultimately death.

【００１４】 ＨＤは、常染色体で優性形質として遺伝する。米国の集団におけるその罹患率
は、１０万人あたり５〜１０人であると見積もられ、米国の集団では、２５，０
００人の総罹患数となる。しかし、症状の遅い発症に起因して、その集団におい
て「危険あり」である無症候性の個体もまた多い。ＨＤ遺伝子を有する無症候性
で危険ありの患者の罹患率は、おそらく、症候性の患者の罹患率の二倍である（
Ｗ．ＫｏｒｏｓｈｅｔｚおよびＮ．Ｗｅｘｌｅｒ、私信）。従って、新しい治療
を受けるに適格であるＨＤ患者の総数は、約７５，０００人である。HD is inherited as an autosomal dominant trait. Its prevalence in the US population is estimated to be 5-10 per 100,000, and in the US population it is 25,0.
The total number of cases is 00. However, there are also many asymptomatic individuals who are “at risk” in their population due to the late onset of symptoms. The prevalence of asymptomatic, at-risk patients with the HD gene is probably twice the prevalence of symptomatic patients (
W. Koroshetz and N.M. Wexler, personal communication). Therefore, the total number of HD patients eligible to receive the new treatment is approximately 75,000.

【００１５】 ＨＤの病原性を担うと現在考えられている遺伝子は、第４染色体の短アームの
テロメア末端に位置する。この遺伝子は、未知の機能の構造的に新規なタンパク
質をコードし、そしてその遺伝子産物とＨＤの病原性との関係は現在のところ確
定していないままである。The gene currently believed to be responsible for HD pathogenicity is located at the telomeric end of the short arm of chromosome 4. This gene encodes a structurally novel protein of unknown function, and the relationship between its gene product and HD pathogenicity remains to be determined.

【００１６】 ＨＤにおける主要な解剖損傷は、尾状核および被核のいわゆる「中程度の棘っ
ぽい」ニューロン（総称して、齧歯類において線条として知られる）の欠失から
なる。これらのニューロンは、突出系を含み、それにより、尾状核／被核は、脳
の基底核の別の場所にその出力核を突出させる。中程度の棘っぽいニューロンに
よって利用される主要な神経伝達物質は、γアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）であるが、
多くのニューロンがエンケファリンまたはサブスタンスＰのようなニューロペプ
チドもまた含有する。しかし、ＨＤにおいて、ＧＡＢＡを神経伝達物質として利
用せず、代わりにアセチルコリンおよびニューロペプチドであるソマトスタチン
もしくはニューロペプチドＹのいずれかを含有する介在ニューロンは、比較的Ｈ
Ｄにおいて損傷を受けていないことは明らかである。The major anatomical lesions in HD consist of the loss of so-called “moderate spiny” neurons of the caudate and annucleus (collectively known as striatum in rodents). These neurons contain a protruding system whereby the caudate / nucleus projects its output nucleus elsewhere in the basal ganglia of the brain. The major neurotransmitter utilized by moderate spiny neurons is γ-aminobutyric acid (GABA),
Many neurons also contain neuropeptides such as enkephalin or substance P. However, in HD, interneurons that do not utilize GABA as a neurotransmitter but instead contain acetylcholine and either of the neuropeptides somatostatin or neuropeptide Y are relatively H-rich.
It is clear that it is not damaged in D.

【００１７】 ＨＤにおいてみられるものを模倣する病理学的および神経化学的変化は、グル
タミン酸作用性アゴニスト薬物の線状体への注入によって模倣され得る。適切な
条件下でのキノリン酸の注入は、γアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）をその神経伝達物質
として利用する中程度の大きさの内因性線状体ニューロンの選択的涸渇を、大き
なコリン作用性介在ニューロンに影響することなく、もたらす。Pathological and neurochemical changes that mimic those seen in HD can be mimicked by striatal injection of glutamate agonist drugs. Infusion of quinolinic acid under the appropriate conditions causes selective depletion of medium-sized endogenous striatal neurons that utilize γ-aminobutyric acid (GABA) as its neurotransmitter, and large cholinergic interneurons. Bring without affecting.

【００１８】 ＨＤにおける症状または神経保護的処置のいずれにも臨床試験で成功していな
い。しかし、疾患の進行および患者の機能をモニターし得る、有用な認証された
評価装置および神経画像化技術が存在する。[0018] Neither the symptoms in HD nor the neuroprotective treatment have been successful in clinical trials. However, there are useful validated evaluators and neuroimaging techniques that can monitor disease progression and patient function.

【００１９】 ＣＮＴＦレセプター複合体は、３つのタンパク質を含む：特異性を決定するα
成分（これは、ＣＮＴＦに直接結合する）、ならびに２つのシグナル伝達β成分
（ＬＩＦＲβおよびｇｐ１３０）（これ自体では、ＣＮＴＦには結合し得ないが
、ＣＮＴＦに対する応答でシグナル伝達を開始するのに必要である）。ＣＮＴＦ
Ｒ複合体のβ成分は、α成分よりもさらに広汎に身体に分布している。ＣＮＴＦ
Ｒ複合体の３つの成分は、通常、細胞表面に会合していない；ＣＮＴＦは、まず
ＣＮＴＦＲαに結合し、次にｇｐ１３０を連結し、そして最後にＬＩＦＲβを補
充することによって、段階的に、完全なレセプター複合体の集合を誘発する。レ
セプター集合におけるこの最後の工程が生じる場合（β成分のヘテロ二量体化）
、細胞内シグナル伝達が、β成分と会合した非レセプターチロシンキナーゼ（Ｊ
ＡＫキナーゼ）を活性化することによって開始される。ＪＡＫキナーゼは、互い
におよびまた、レセプターの細胞質ドメイン上のチロシン残基リン酸化すること
によって応答し、ＳＴＡＴタンパク質のＳｒｃ相同性２ドメインについてのホス
ホチロシン結合（ｄｏｃｋｉｎｇ）部位を作製する。そのリン酸化後、結合した
ＳＴＡＴタンパク質は、そのレセプターから脱離し、二量体化し、そして核へと
移行し、そこで、それらはＤＮＡを結合し、そして転写を活性化する（総説：Ｆ
ｒａｎｋ Ｄ．およびＧｒｅｅｎｂｅｒｇ，Ｍ．（１９９６）Ｐｅｒｓｐｅｃｔ
ｉｖｅｓ ｏｎ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ４
：３−１８；Ｓｔａｈｌ，Ｎ．およびＹａｎｃｏｐｏｕｌｏｓ Ｇ．（１９９７
）Ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ｉｎ ｈｅａ
ｌｔｈ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ ２Ｂ，７７７−８０９）。アキソカイン（ａ
ｘｏｋｉｎｅ）は、物理的特性および化学特性が改善された変異体ＣＮＴＦ分子
であり、これは、ＣＮＴＦレセプターと相互作用し、そして活性化する能力を保
持する（Ｐａｎａｙｏｔａｔｏｓ，Ｎ．ら、（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．２６８：１９０００−１９００３）。The CNTF receptor complex contains three proteins: α, which determines specificity.
A component, which binds directly to CNTF, and two signaling β components (LIFRβ and gp130) (which, by themselves, cannot bind to CNTF but are required to initiate signaling in response to CNTF. Is). CNTF
The β component of the R complex is more widely distributed in the body than the α component. CNTF
The three components of the R complex are not normally associated with the cell surface; CNTF is stepwise completed by first binding to CNTFRα, then gp130, and finally recruiting LIFRβ. Induces the assembly of various receptor complexes. If this last step in receptor assembly occurs (β component heterodimerization)
, Intracellular signal transduction is associated with β-component non-receptor tyrosine kinase (J
It is initiated by activating AK kinase). JAK kinases respond to each other and by phosphorylating tyrosine residues on the cytoplasmic domain of the receptor, creating a phosphotyrosine docking site for the Src homology 2 domain of the STAT protein. After its phosphorylation, the bound STAT proteins detach from its receptor, dimerize and translocate to the nucleus where they bind DNA and activate transcription (Review: F
rank D.D. And Greenberg, M .; (1996) Perspect
lives on development neurobiology 4
: 3-18; Stahl, N .; And Yancopoulos G. et al. (1997
) Growth factors and cytokines in hair
lth and disease 2B, 777-809). Axocaine (a
xokine) is a mutant CNTF molecule with improved physical and chemical properties, which retains the ability to interact with and activate the CNTF receptor (Panayotatos, N. et al., (1993) J. . Biol. Che
m. 268: 19000-19003).

【００２０】 ｏｂ遺伝子の産物であるレプチンは、脂肪細胞から分泌され、そして脳への末
梢シグナルとして機能して食餌摂取およびエネルギー代謝を調節する（Ｚｈａｎ
ｇ，Ｙ．ら、（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ ３７２：４２５−４３１）。興味深い
ことに、一回膜貫通レセプターであるレプチンレセプター（ＯＢ−Ｒ）は、ｇｐ
１３０と考慮すべき配列類似性を有する（Ｔａｒｔａｇｌｉａ，Ｌ．ら（１９９
５）Ｃｅｌｌ ８３：１２６３−１２７１）、およびＣＮＴＦのように、レプチ
ンは、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路を介してシグナル伝達する（Ｂａｕｍａｎｎ，Ｈ．
ら、（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：８３
７４−８３７８；Ｇｈｉｌａｒｄｉ，Ｎ．ら、（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：６２３１−６２３５）。ＣＮＴＦおよびレ
プチンの両方の全身投与は、視床下部の満腹中枢においてｔｉｓ−１１の誘導を
生じた（Ｇｌｏａｇｕｅｎ，Ｉ．ら（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：６４５６−６４６１）およびＳＴＡＴ３（Ｖａｉｓｓ
ｅ，Ｃ．ら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎ．１４：９５−９７）。このこと
は、体重および摂食行動の調節におけるその役割を示す。実際、ＣＮＴＦのヒト
への投与によって、食餌摂取が減少し、そして体重減少がもたらされた（Ｇｒｏ
ｕｐ、Ａ．Ｃ．Ｔ．Ｓ．（１９９６）Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ４６：１２４４−１
２４９）。Leptin, a product of the ob gene, is secreted by adipocytes and functions as a peripheral signal to the brain to regulate food intake and energy metabolism (Zhan.
g, Y. Et al. (1994) Nature 372: 425-431). Interestingly, the leptin receptor (OB-R), which is a single transmembrane receptor, has a gp
It has sequence similarity to be considered to be 130 (Tartaglia, L. et al. (199
5) Like Cell 83: 1263-1271), and CNTF, leptin signals through the JAK / STAT pathway (Baumann, H .;
Et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:83
74-8378; Ghilardi, N .; Et al. (1996) Proc. Natl
． Acad. Sci. USA 93: 6231-6235). Systemic administration of both CNTF and leptin resulted in induction of tis-11 in the satiety center of the hypothalamus (Gloaguen, I. et al. (1997) Proc. Natl. Acad.
． Sci. USA 94: 6456-6461) and STAT3 (Vaiss.
e, C.I. (1996) Nature Gen. 14: 95-97). This indicates its role in the regulation of body weight and feeding behavior. In fact, administration of CNTF to humans resulted in reduced food intake and weight loss (Gro
up, A.A. C. T. S. (1996) Neurology 46: 1244-1.
249).

【００２１】 （発明の要旨） 本発明の目的は、糖尿病および肥満を含むがそれらに限定されない疾患または
障害の処置のための新規ＣＮＴＦ関連栄養因子を提供することである。好ましい
実施形態において、ＣＮＴＦおよび関連分子は、インスリン非依存性糖尿病の処
置のために利用される。SUMMARY OF THE INVENTION It is an object of the present invention to provide novel CNTF-related trophic factors for the treatment of diseases or disorders including but not limited to diabetes and obesity. In a preferred embodiment, CNTF and related molecules are utilized for the treatment of non-insulin dependent diabetes mellitus.

【００２２】 本発明のさらなる目的は、本明細書において具体的に記載したもののほかに、
治療特性を改良されたＣＮＴＦ関連因子を同定するための方法を提供することで
ある。A further object of the present invention is, in addition to what is specifically described herein,
It is to provide a method for identifying CNTF-related factors with improved therapeutic properties.

【００２３】 これらおよび他の目的は、本発明に従って達成される。ここで、ヒトＣＮＴＦ
タンパク質におけるアミノ酸置換は、その治療特性を増強する。１つの実施形態
において、電気泳動の移動度における変化を使用して、潜在的に有用な改変ＣＮ
ＴＦタンパク質を最初にスクリーニングする。These and other objects are achieved in accordance with the present invention. Where human CNTF
Amino acid substitutions in a protein enhance its therapeutic properties. In one embodiment, changes in electrophoretic mobility are used to potentially modify the modified CN.
The TF protein is screened first.

【００２４】 好ましい実施形態において、ヒトＣＮＴＦにおける６３位のアミノ酸グルタミ
ンを、アルギニン（６４Ｑ→Ｒと称する）または生物学的活性が改良された改変
ＣＮＴＦ分子を生じる別のアミノ酸に置換する。さらなる実施形態において、ｒ
ＨＣＮＴＦ改変体は、６３Ｑ→Ｒ変異と３つの他の新規の特徴を組み合わせる：
１）最後の１３個のアミノ酸残基の欠失（ΔＣ１３と称する）。これは、ｒＨＣ
ＮＴＦの可溶性の上昇をその活性を損なうことなく与える； ２）１７位の独特なシステイン残基の置換。これは、生理的緩衝液中で、生理的
ｐＨおよび温度条件下で、その活性に影響することなくｒＨＣＮＴＦの安定化を
もたらす；または ３）アミノ酸残基６４Ｗの置換。これは、ｒＨＣＮＴＦのインビトロでの生物学
的活性を変化させ、そしてそのインビボでの治療指数に７倍の改良をもたらす。In a preferred embodiment, the amino acid glutamine at position 63 in human CNTF is replaced with arginine (designated 64Q → R) or another amino acid that results in a modified CNTF molecule with improved biological activity. In a further embodiment, r
The HCNTF variant combines the 63Q → R mutation with three other novel features:
1) Deletion of the last 13 amino acid residues (designated ΔC13). This is rHC
It gives increased solubility of NTF without compromising its activity; 2) Substitution of a unique cysteine residue at position 17. This results in stabilization of rHCNTF in physiological buffer under physiological pH and temperature conditions without affecting its activity; or 3) substitution of amino acid residue 64W. This alters the biological activity of rHCNTF in vitro and results in a 7-fold improvement in its in vivo therapeutic index.

【００２５】 別の好ましい実施形態において、ＲＧ２９７（ｒＨＣＮＴＦ、１７ＣＡ６３Ｑ
ＲΔＣ１３）と称する分子は、６３Ｑ→Ｒ置換（これは、より大きな生物学的効
力を与える）と、末端の１３アミノ酸残基の欠失（これは、生理的条件下での可
溶性の上昇を与える）および１７ＣＡ置換（これは、特に３７℃での生理的条件
下での安定性を与える）とを組合せ、そして動物モデルにおけるｒＨＣＮＴＦよ
りも２〜３倍良い治療指数を示す。In another preferred embodiment, RG297 (rHCNTF, 17CA63Q
The molecule designated RΔC13) has a 63Q → R substitution, which confers greater biological potency, and a deletion of the terminal 13 amino acid residues, which confers increased solubility under physiological conditions. ) And 17CA substitution, which confers stability, especially under physiological conditions at 37 ° C., and shows a therapeutic index that is 2-3 times better than rHCNTF in animal models.

【００２６】 別の好ましい実施形態において、二重置換６３ＱＲ６４ＷＡを有するＲＧ２４
２と称する分子が記載され、これは、生物学的効力の異なるスペクトルおよび７
倍高い治療指数を生じる。In another preferred embodiment, RG24 with double substitution 63QR64WA.
A molecule designated 2 is described, which has different spectra of biological potency and 7
It produces a twice higher therapeutic index.

【００２７】 別の好ましい実施形態において、二重置換６３ＱＲΔＣ１３を有するＲＧ２９
０と称する分子が記載され、これは、生理的条件下でのより大きな可溶性を与え
る。In another preferred embodiment, RG29 having the double substitution 63QRΔC13.
A molecule designated 0 has been described, which confers greater solubility under physiological conditions.

【００２８】 （発明の詳細な説明） 本発明は、ヒトまたは動物における神経学的なまたは内分泌の疾患および障害
を処置する方法に関する。これは、一部、組換えラットＣＮＴＦが、組換えヒト
ＣＮＴＦよりヒトＣＮＴＦレセプターにより効率的に結合するという最初の知見
、引き続いて、ヒトＣＮＴＦをラットＣＮＴＦにより綿密に似せるアミノ酸置換
が、改変されたＣＮＴＦのヒトＣＮＴＦレプセターへの結合の増強および付随す
る生物学的活性の増強を生じるという発見に基づく。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention relates to methods of treating neurological or endocrine diseases and disorders in humans or animals. This is partly due to the first finding that recombinant rat CNTF binds more efficiently to human CNTF receptors than recombinant human CNTF, and subsequently the amino acid substitutions that closely resemble human CNTF to rat CNTF were modified. It is based on the finding that it results in enhanced binding of CNTF to the human CNTF repsetter and concomitant enhanced biological activity.

【００２９】 好ましい実施形態において、ヒトＣＮＴＦタンパク質の単一のアミノ酸の変更
は、このタンパク質の毛様体神経節の生存性および増殖ならびに他のニューロン
の生存性および増殖を促進する能力の有意な増強を生じる。In a preferred embodiment, a single amino acid change in the human CNTF protein results in a significant enhancement of this protein's ability to promote ciliary ganglion viability and proliferation as well as viability and proliferation of other neurons. Cause

【００３０】 組換えヒトおよびラットＣＮＴＦは、同数のアミノ酸（１９９）および類似の
質量（Ｎ末端メチオニンの除去後に、それぞれ、分子量２２，７９８および２２
，７２１）を有する。しかし、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上では、組換えヒトＣ
ＮＴＦは、分子量＝２７，５００のタンパク質として移動する一方で、ラットＣ
ＮＴＦは、予測した移動度で移動した。さらに、ヒトＣＮＴＦは、ニワトリ毛様
体神経節（ＣＧ）ニューロンに対して、ラットＣＮＴＦよりも４倍低い生物学的
活性を有し、そしてヒトタンパク質は、ラットＣＮＴＦよりはるかに低い効率で
、細胞表面上のヒトまたはラットレセプターへの結合と競合する。Recombinant human and rat CNTF had the same number of amino acids (199) and similar mass (molecular weights 22,798 and 22 respectively after removal of the N-terminal methionine).
, 721). However, on reduced SDS-PAGE gel, recombinant human C
NTF migrates as a protein with a molecular weight of 27,500 while rat C
NTF migrated at the predicted mobility. Furthermore, human CNTF has a 4-fold lower biological activity on rat ciliary ganglion (CG) neurons than rat CNTF, and human protein is much less efficient than rat CNTF on cellular cells. Competing for binding to human or rat receptors on the surface.

【００３１】 上記の観察は、これらの相違の原因であるＣＮＴＦ分子上の領域を同定するた
めのある方向性をもった取り組みを導いた。この方法は、遺伝子工学方法によっ
て、対応するラットＣＮＴＦ配列を有するヒトＣＮＴＦ配列（および逆も同様）
の一部分の交換を包含した。これを達成するために、２つのＣＮＴＦ遺伝子に共
通する制限部位およびそれらの対応する発現ベクターにおける独自の制限部位を
利用した。必要な場合は、このような部位を、同じタンパク質配列をコードする
領域において、２つの遺伝子のうちの一方または他方に操作した。このアプロー
チを用いて、発現ベクターを図１に示した改変タンパク質の各々について得た。
少なくとも６０％純粋になるまで個々のタンパク質を単離した後、ヒトおよびラ
ットＣＮＴＦのタンパク質を比較して、それらの特性を決定した。The above observations have led to a directed approach to identifying the regions on the CNTF molecule responsible for these differences. This method involves the use of genetic engineering methods to produce human CNTF sequences with corresponding rat CNTF sequences (and vice versa).
Involving the exchange of a portion of. To achieve this, the restriction sites common to the two CNTF genes and their corresponding unique restriction sites in the expression vector were utilized. If necessary, such sites were engineered into one or the other of the two genes in the region encoding the same protein sequence. Using this approach, expression vectors were obtained for each of the modified proteins shown in Figure 1.
After isolation of individual proteins to at least 60% purity, human and rat CNTF proteins were compared to characterize them.

【００３２】 ヒトおよびラットＣＮＴＦの電気泳動的移動度は有意に異なるので、各アミノ
酸置換の効果を、タンパク質の移動度に対するこのような変化の効果を決定する
ことによって最初にモニターした。本明細書中に記載されるように、電気泳動的
移動度のデータは、ラットＣＮＴＦと同じ位置に移動する改変型ヒトＣＮＴＦ分
子の全てが、単一のアミノ酸置換Ｇｌｎ６３→Ａｒｇ（Ｑ６３→Ｒ）を有したこ
とを示した。Since the electrophoretic mobilities of human and rat CNTF are significantly different, the effect of each amino acid substitution was first monitored by determining the effect of such changes on protein mobility. As described herein, electrophoretic mobility data show that all of the modified human CNTF molecules migrating to the same position as rat CNTF show a single amino acid substitution Gln63 → Arg (Q63 → R). It was shown that it had.

【００３３】 ラットＣＮＴＦ分子の電気泳動的移動度と類似する電気泳動的移動度を示した
改変型ヒトＣＮＴＦタンパク質を、生物学的活性およびレセプター結合について
引き続き試験した。Modified human CNTF proteins that displayed electrophoretic mobilities similar to those of the rat CNTF molecule were subsequently tested for biological activity and receptor binding.

【００３４】 ＣＮＴＦは、Ｅ８ニワトリ胚の解離した毛様体ニューロンの生存を助けるその
能力によって特徴づけられる。この基準によって、精製された組換えラットＣＮ
ＴＦは、ラット由来の天然のタンパク質と同じくらいに活性であるが、組換えヒ
トＣＮＴＦより４倍高く活性である［Ｍａｓｉａｋｏｗｓｋｉら、１９９１、Ｊ
．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．５７：１００３−１０１２および国際公開ＷＯ９１／０４
３１６（１９９１年４月４日公開）］。同じアッセイを利用して、上記のように
調製された改変した分子の生物学的活性を決定した。本明細書中で記載されるよ
うに、Ｑ６３→Ｒ置換を有する全ての改変型ＣＮＴＦ分子は、親ヒトＣＮＴＦタ
ンパク質と比較して、毛様体神経節ニューロンの生存を助ける能力の増加を示し
た。このような結果は、電気泳動的移動度の変化と生物学的特性の増強との間の
強い相関関係を示した。CNTF is characterized by its ability to help the survival of dissociated ciliary neurons of E8 chicken embryos. Purified recombinant rat CN by this standard
TF is as active as the native protein from rat, but 4-fold more active than recombinant human CNTF [Masiakowski et al., 1991, J.
． Neurosci. 57: 1003-1012 and International Publication WO91 / 04.
316 (published on April 4, 1991)]. The same assay was utilized to determine the biological activity of modified molecules prepared as described above. As described herein, all modified CNTF molecules with the Q63 → R substitution showed increased ability to help survival of ciliary ganglion neurons compared to the parental human CNTF protein. . These results showed a strong correlation between changes in electrophoretic mobility and enhancement of biological properties.

【００３５】 ヒトＣＮＴＦに対する改変の生物学的効果を測定することに加えて、各々の分
子の潜在的な生物学的活性の指標もまた、ＣＮＴＦレセプターに結合する分子の
能力に対する各々の改変の効果を決定することによって獲得され得る。In addition to measuring the biological effect of the modification on human CNTF, an indication of the potential biological activity of each molecule is also the effect of each modification on the ability of the molecule to bind to the CNTF receptor. Can be obtained by determining.

【００３６】 １つの実施形態において、ラット上頸神経節ニューロン（ＳＣＧ）への結合に
ついてラットＣＮＴＦと競合する、改変型ヒトＣＮＴＦタンパク質の能力を測定
する。本明細書中に記載されるように、ヒトＣＮＴＦは、これらの細胞から¹²⁵
Ｉ−標識ラットＣＮＴＦ結合と置換する際に、非標識ラットＣＮＴＦより、約９
０倍能力が低い。しかし、本明細書中に記載される改変型ヒトＣＮＴＦタンパク
質のいくつかは、ラットタンパク質と置換する際に、ヒトＣＮＴＦより強力であ
る。競合的結合能力のこのような増加を有する、本明細書中に記載されるこのよ
うな増強された競合的結合能力を有した分子の全ては、改変された電気泳動的移
動度を示す分子であった。ここで、この分子は、ラットＣＮＴＦに類似した様式
で移動した。In one embodiment, the ability of the modified human CNTF protein to compete with rat CNTF for binding to rat superior cervical ganglion neurons (SCG) is measured. As described herein, human CNTF was isolated from these cells at ¹²⁵
When displacing with I-labeled rat CNTF binding, about 9
0 times lower ability. However, some of the modified human CNTF proteins described herein are more potent than human CNTF in replacing rat proteins. All of the molecules with such enhanced competitive binding ability described herein that have such an increase in competitive binding ability are molecules that exhibit altered electrophoretic mobility. there were. Here, the molecule migrated in a manner similar to rat CNTF.

【００３７】 別の実施形態において、細胞（例えば、ＭＧ８７線維芽細胞）は、ヒトＣＮＴ
Ｆレセプターα成分を発現するように操作され、そしてこのような細胞は、ヒト
レセプターに対する改変型タンパク質の結合能力をアッセイするために使用され
る。ヒトＣＮＴＦは、ヒトＣＮＴＦレセプターへの結合について¹²⁵Ｉ標識した
ラットＣＮＴＦと競合して、ラットＣＮＴＦより約１２倍能力が低い。本明細書
中に記載されるいくつかの改変型ヒトＣＮＴＦ分子（ヒトＣＮＴＦよりむしろラ
ットＣＮＴＦに似ている電気泳動的移動度を有する分子の全てを含む）は、ヒト
ＣＮＴＦレセプターを発現する細胞に対する¹²⁵Ｉ−ラットＣＮＴＦの結合と競
合して、ヒトＣＮＴＦよりより強力である。In another embodiment, the cells (eg MG87 fibroblasts) are human CNTs.
Engineered to express the F receptor alpha component, and such cells are used to assay the binding ability of the modified protein to the human receptor. Human CNTF competes with ¹²⁵ I-labeled rat CNTF for binding to the human CNTF receptor, and is about 12 times less potent than rat CNTF. Some modified human CNTF molecules described herein, including all molecules with electrophoretic mobilities that resemble rat CNTF rather than human CNTF, are directed against cells expressing the human CNTF receptor. It is more potent than human CNTF in competing with the binding of ¹²⁵ I-rat CNTF.

【００３８】 別の実施形態において、特定の増殖の能力の指標および網膜光受容体の変性を
防ぐ他の因子を提供することにおいて実証される有用性を有する動物モデルを使
用して、本発明に従う改変型ＣＮＴＦ分子の治療的特性を評価する。実施例４に
記載されるように、ｈＣＮＴＦ（Ｇｌｎ６３→Ａｒｇ）は、組換えヒトＣＮＴＦ
より１０倍高い、網膜変性の光誘導損傷モデルにおける光受容体の変性を防ぐ能
力を有する。In another embodiment, according to the invention, an animal model is used that has demonstrated utility in providing indicators of specific proliferative capacity and other factors that prevent degeneration of retinal photoreceptors. The therapeutic properties of the modified CNTF molecule are evaluated. As described in Example 4, hCNTF (Gln63 → Arg) is a recombinant human CNTF.
It has a 10-fold higher ability to prevent photoreceptor degeneration in a light-induced damage model of retinal degeneration.

【００３９】 従って、本発明に従えば、ヒトＣＮＴＦタンパク質の特性のアミノ酸置換は、
ヒトＣＮＴＦレセプターに対して増強した結合を示す改変型ヒトＣＮＴＦタンパ
ク質を生じるため、増強された治療特性を有すると予測される。Thus, according to the invention, the characteristic amino acid substitutions of the human CNTF protein are:
It is expected to have enhanced therapeutic properties as it results in a modified human CNTF protein that exhibits enhanced binding to the human CNTF receptor.

【００４０】 本発明の実施に有用な改変型ＣＮＴＦ分子は、例えば、Ｍａｓｉａｋｏｗｓｋ
ｉら、１９９１、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．５７：１００３−１０１２および国際
公開第ＷＯ９１／０４３１６号（１９９１年４月４日公開）に記載される原核生
物発現系または真核生物発現系においてクローニングおよび発現することによっ
て調製され得る。組換えニューロトロフィン遺伝子は、任意の数の方法を利用し
て発現および精製され得る。この因子をコードする遺伝子は、例えば、ｐＣＰ１
１０のような細菌発現ベクター（これに限定されない）へサブクローニングし得
る。Modified CNTF molecules useful in the practice of the present invention are, for example, Masiakowsk.
i et al., 1991, J. Am. Neurosci. 57: 1003-1012 and WO 91/04316 (published April 4, 1991) and can be prepared by cloning and expressing in a prokaryotic or eukaryotic expression system. The recombinant neurotrophin gene can be expressed and purified using any number of methods. The gene encoding this factor is, for example, pCP1.
It can be subcloned into a bacterial expression vector such as, but not limited to 10.

【００４１】 組換え因子は、引き続き、安定な、生物学的に活性なタンパク質の形成を可能
にする任意の技術によって精製され得る。例えば、そして限定はされないが、こ
の因子は、可溶性タンパク質または封入体としてのいずれかで細胞から回収され
得る。ここから、この因子は、８Ｍグアニジン塩酸塩によって定量的に抽出され
得、そして透析され得る。さらにこの因子を精製するために、従来のイオン交換
クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフ
ィーまたはゲル濾過が使用され得る。The recombinant factor can subsequently be purified by any technique which allows the formation of stable, biologically active proteins. For example, and without limitation, the factor can be recovered from cells either as soluble protein or inclusion bodies. From here this factor can be quantitatively extracted with 8M guanidine hydrochloride and dialyzed. Conventional ion exchange chromatography, hydrophobic interaction chromatography, reverse phase chromatography or gel filtration can be used to further purify this factor.

【００４２】 本発明に従って、本明細書中に記載されるように生成された改変型ＣＮＴＦ分
子またはそれらのハイブリッドまたは変異体を使用して、ＣＮＴＦに応答性の細
胞の、インビトロまたはインビボでの分化、増殖または生存を促進し得る。この
細胞としては、ＣＮＴＦ／ＩＬ−６／ＬＩＦレセプターファミリーのレセプター
を発現する細胞、または、例えば、Ｄａｖｉｓら、１９９２、Ｃｅｌｌ ６９：
１１２１−１１３２に記載されるように適切なシグナル伝達成分を発現する任意
の細胞が挙げられる。あるいは、変異体またはハイブリッドは、細胞分化または
生存をアンタゴナイズし得る。In accordance with the present invention, modified CNTF molecules, or hybrids or variants thereof, produced as described herein are used to differentiate CNTF-responsive cells in vitro or in vivo. , Can promote proliferation or survival. The cells include cells expressing the receptors of the CNTF / IL-6 / LIF receptor family, or, for example, Davis et al., 1992, Cell 69:
Any cell expressing a suitable signaling component as described in 1121-1132. Alternatively, the variant or hybrid may antagonize cell differentiation or survival.

【００４３】 本発明を使用して、ＣＮＴＦまたはＣＮＴＦ／ＣＮＴＦレセプター複合体に応
答する任意の細胞の障害を処置し得る。本発明の好ましい実施形態において、Ｃ
ＮＴＦ／ＩＬ−６／ＬＩＦレセプターファミリーのメンバーを発現する細胞の障
害は、これらの方法に従って処置され得る。このような障害の例としては、以下
の細胞を含む障害が挙げられるが、これらに限定されない：白血病細胞、造血幹
細胞、巨核球およびそれらの前駆体、ＤＡ１細胞、破骨細胞、骨芽細胞、肝細胞
、脂肪細胞、腎臓上皮細胞、胚性幹細胞、腎臓メサンギウム細胞、Ｔ細胞、Ｂ細
胞など。The present invention may be used to treat disorders of any cell that responds to CNTF or the CNTF / CNTF receptor complex. In a preferred embodiment of the invention C
Disorders of cells expressing members of the NTF / IL-6 / LIF receptor family can be treated according to these methods. Examples of such disorders include, but are not limited to, disorders including the following cells: leukemia cells, hematopoietic stem cells, megakaryocytes and their precursors, DA1 cells, osteoclasts, osteoblasts, Hepatocytes, adipocytes, renal epithelial cells, embryonic stem cells, renal mesangial cells, T cells, B cells, etc.

【００４４】 従って、本発明は、ＣＮＴＦ関連神経学的障害または疾患、分化障害または疾
患、あるいは神経損傷に罹患している患者を、有効量の改変型ＣＮＴＦ、または
そのハイブリッドもしくは変異体で処置する方法を提供する。改変型ＣＮＴＦ分
子を利用して、Ｍａｓｉａｋｏｗｓｋｉらの国際公開第ＷＯ９１／０４３１６号
（１９９１年４月４日公開）においてＣＮＴＦについて記載される障害または疾
患、ならびにＤａｖｉｓらの国際公開第ＷＯ９１／１９００９号（１９９１年１
２月１２日公開）においてＣＮＴＦ／ＣＮＴＦＲ複合体について記載される障害
または疾患を処置し得る（これらの両方が、本明細書中にその全体が参考として
援用される）。Accordingly, the invention treats a patient suffering from a CNTF-related neurological disorder or disease, a differentiation disorder or disease, or a nerve injury with an effective amount of a modified CNTF, or a hybrid or variant thereof. Provide a way. Utilizing a modified CNTF molecule, disorders or diseases described for CNTF in International Publication No. WO 91/04316 of Masiakowski et al. (Published April 4, 1991), and International Publication No. WO 91/19909 of Davis et al. 1991
(Published February 12) can treat the disorders or diseases described for the CNTF / CNTFR complex, both of which are incorporated herein by reference in their entirety.

【００４５】 このような疾患または障害としては、変性疾患（例えば、網膜変性）、脊髄、
コリン作用性ニューロン、海馬ニューロンに関与する疾患または障害、あるいは
運動ニューロンに関与する疾患または障害（例えば、筋萎縮性側索硬化症または
顔面神経の疾患および障害（例えば、ベル麻痺）が挙げられる。処置され得る他
の疾患または障害としては、末梢神経障害、アルツハイマー病、パーキンソン病
、ハンティングトン舞踏病（ハンティングトン病またはＨＤ）または例えば、脱
神経、慢性非活動、代謝ストレス、および栄養不良から、あるいは筋ジストロフ
ィー症候群、先天性ミオパシー、筋の炎症性疾患、毒性のミオパシー、神経外傷
、末梢神経障害、薬物もしくは毒素誘導性損傷、または運動神経障害のような状
態から生じる筋萎縮症、あるいは糖尿病性肥満、または非インスリン依存性糖尿
病を含むがこれに限定されない糖尿病が挙げられる。Such diseases or disorders include degenerative diseases (eg retinal degeneration), spinal cord,
Examples include diseases or disorders involving cholinergic neurons, hippocampal neurons, or motor neurons (eg, amyotrophic lateral sclerosis or facial nerve diseases and disorders (eg, Bell's palsy)). Other diseases or disorders that may be treated include peripheral neuropathy, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Huntington's disease (Huntington's disease or HD) or, for example, from denervation, chronic inactivity, metabolic stress, and malnutrition, Or muscular atrophy resulting from conditions such as muscular dystrophy syndrome, congenital myopathy, muscular inflammatory disease, toxic myopathy, nerve trauma, peripheral neuropathy, drug or toxin-induced injury, or motor neuropathy, or diabetic obesity , Or non-insulin dependent diabetes mellitus It includes non diabetes is.

【００４６】 １つの実施形態において、本明細書中に記載されるＣＮＴＦまたはＣＮＴＦ関
連分子は、ハンティングトン病を処置するために使用される。グルタミン酸レセ
プター媒介興奮毒性は、ハンティングトン病を含む多くの神経変性疾患または傷
害においてある役割を果たすと仮説が立てられていた。ハンティングトン病の優
性の神経病理学的特徴は、線条体介在ニューロンの実質的な損失がない、中間サ
イズのγアミノ酪酸作動性の、線条体出力ニューロンの大量の変性である（Ａｃ
ｈｅｓｏｎ，Ａ．およびＲ．Ｌｉｎｄｓａｙ、１９９４、Ｓｅｍｉｎａｒｓ Ｎ
ｅｕｒｏｓｃｉ．６：３３３−３４１０）。以下の実施例７において記載される
ように、出願人は、動物モデルにおいて、ＣＮＴＦおよび本明細書中に記載され
る改変体の両方を使用して研究を続けている。ここで、ハンティングトン病で観
察された線条体出力ニューロンの優先的な損失、および生じた運動異常は、齧歯
類または霊長類モデルで模倣される。この動物モデルにおいてＮＭＤＡグルタミ
ン酸レセプターアゴニストであるキノリン酸が線条体に注射される（ＤｉＦｉｇ
ｌｉａ，Ｍ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９９０、１３：２８６−２８
９）。これらの研究において、ＣＮＴＦおよびその改変体は、キノリン酸への曝
露に対して防御を与えた。キノリン酸が損傷線条体の外観がＨＤで死んだ患者の
線条体の外観と酷似していることは、キノリン酸が、ＨＤの容赦のない、かつ比
較的緩慢な進行と矛盾して、急性かつ重篤な病変を生成することを示唆する（こ
の破壊的な神経学的障害の適切な動物モデルを構成する）。In one embodiment, the CNTF or CNTF-related molecule described herein is used to treat Huntington's disease. It has been hypothesized that glutamate receptor-mediated excitotoxicity plays a role in many neurodegenerative diseases or injuries, including Huntington's disease. The predominant neuropathological hallmark of Huntington's disease is the massive degeneration of intermediate-sized gamma-aminobutyric acid, striatal output neurons without substantial loss of striatal interneurons (Ac
heson, A .; And R.A. Lindsay, 1994, Seminars N
eurosci. 6: 333-3410). As described in Example 7 below, Applicants continue to work with both CNTF and variants described herein in animal models. Here, the preferential loss of striatal output neurons observed in Huntington's disease, and the resulting motor abnormalities, is mimicked in a rodent or primate model. The NMDA glutamate receptor agonist quinolinic acid is injected into the striatum in this animal model (DiFig
lia, M .; Trends Neurosci. 1990, 13: 286-28.
9). In these studies, CNTF and its variants provided protection against exposure to quinolinic acid. The fact that quinolinic acid closely resembles that of the striatum in patients who died of HD in the appearance of the damaged striatum is consistent with the fact that quinolinic acid is inconsistent with the relentless and relatively slow progression of HD. It is suggested to produce acute and severe lesions (constituting a suitable animal model of this destructive neurological disorder).

【００４７】 今日まで、組換えヒトＣＮＴＦ（ｒＨＣＮＴＦ）を使用したヒト臨床治験は、
このタンパク質の皮下投与を筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の進行を遅延させる
ことにおいてその有効性を試験する研究に限定されていた。このようなｒＨＣＮ
ＴＦの投与は、咳、食欲不振および体重減少を含む全身的な副作用に関連し、そ
して少なくとも１つの研究において、ｒＨＣＮＴＦを受ける患者の８０％を超え
る患者が中和抗体を発生させ、その有意性は不確定である。しかし、副作用およ
び抗体形成を有する問題にもかかわらず、ＡＬＳの初期段階の患者亜群は、これ
らの患者が類似した疾患期間でのプラシーボ処置患者と比較して、肺機能の低減
した割合を示した点において、ｒＨＣＮＴＦ投与から利点を得られたようである
。To date, human clinical trials using recombinant human CNTF (rHCNTF) have
Subcutaneous administration of this protein has been limited to studies testing its effectiveness in delaying the progression of amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Such rHCN
Administration of TF is associated with systemic side effects including cough, loss of appetite and weight loss, and in at least one study, over 80% of patients receiving rHCNTF develop neutralizing antibodies and their significance. Is indeterminate. However, despite problems with side effects and antibody formation, early-stage patient subgroups of ALS show a reduced proportion of lung function when these patients are compared to placebo-treated patients with similar disease duration. In this respect, it appears that benefits have been obtained from rHCNTF administration.

【００４８】 出願人が行った、ＣＳＦおよびＡＬＳ患者へｒＨＣＮＴＦの断続的な、区分分
けした投与を用いた予備研究は、全身的な副作用および抗体形成の証拠がないこ
とを実証した。このような研究は、標準的な技術を用いて一般的な感覚脱失下で
移植した、ＣＳＦをサンプリングするためのサイドポートを伴った、Ｍｅｄｔｒ
ｏｎｉｃ製の注入ポンプ（ＳｙｎｃｈｒｏＭｅｄ Ｍｏｄｅｌ ８６１５／シリ
ーズＤＡＡ）の使用を含む（Ｐｅｎｎら、１９８５、２：１２５−１２７）。こ
のポンプをクモ膜下カテーテルに取り付け、その先端を蛍光透視法下でＬ１レベ
ルで配置した。各週、４８時間にわたって、１時間当たり１〜８μｇのｒＨＣＮ
ＴＦの投与を、４人のＡＬＳ患者において１年までの期間、許容した。これらの
患者は、全身的なｒＨＣＮＴＦ投与でみられた範囲の有害な事象を経験しなかっ
た。この患者群における副作用は、２名の患者の坐骨神経痛および１名の患者の
頭痛から構成された。白血球およびタンパク質の上昇がＣＳＦにおいてみられた
。この研究において、ｒＨＣＮＴＦは、クモ膜下腔へ注入したバクロフェンおよ
びモルヒネのような低分子薬物に類似した分布および薬物動態学的特性を示した
。不運にも、ｒＨＣＮＴＦは、連続的なＣＮＳ注入治療または局所的デポー投与
のためにはあまりにも不安定である。なぜなら、その対形成していないシステイ
ン残基によって共有結合ダイマーを形成し、これによって、凝集形成および沈降
を導く傾向にあるからである。従って、中枢神経系に直接注射するために利用さ
れ得るＣＮＴＦの安定な調製物についての必要性が存在する。Applicant's preliminary studies with intermittent, compartmentalized administration of rHCNTF to CSF and ALS patients demonstrated no evidence of systemic side effects and antibody formation. Such studies involved Medtr, with a side port for sampling CSF, transplanted using standard techniques under general anesthesia.
Includes the use of an onic infusion pump (SynchroMed Model 8615 / series DAA) (Penne et al., 1985, 2: 125-127). The pump was attached to a subarachnoid catheter and its tip was placed at L1 level under fluoroscopy. 1-8 μg of rHCN per hour for 48 hours each week
Administration of TF was allowed for up to 1 year in 4 ALS patients. These patients did not experience the range of adverse events seen with systemic rHCNTF administration. Side effects in this patient group consisted of sciatica in 2 patients and headache in 1 patient. Elevated white blood cells and protein were found in CSF. In this study, rHCNTF exhibited similar distribution and pharmacokinetic properties to small molecule drugs such as baclofen and morphine injected into the subarachnoid space. Unfortunately, rHCNTF is too unstable for continuous CNS infusion therapy or topical depot administration. This is because the unpaired cysteine residues tend to form covalent dimers, which leads to aggregate formation and precipitation. Therefore, there is a need for stable preparations of CNTF that can be utilized for direct injection into the central nervous system.

【００４９】 Ａｅｂｉｓｃｈｅｒらとの共同研究において（結果は未公開）、出願人は、ｒ
ｈＣＮＴＦを分泌する、カプセル化されたＢＨＫ細胞を１０名のＡＬＳ患者のク
モ膜下腔へ移植した。６ｎｇ／ｍｌまでの定常状態のＣＳＦ濃度を達成した。全
ての患者が無力および疲労を訴えたが、体重減少、食欲不振および急性期応答タ
ンパク質の活性化は観察されなかった。ＣＳＦプレオサイトーシスも白血球数の
増加も、認められなかった。ＣＮＴＦは、これらの患者の末梢血において検出さ
れ得ない。今日まで、有効性測定の結果はあまりに貧弱すぎて、有効性に関する
結果を結論づけられなかった。ポンプ注入したｒＨＣＮＴＦでみられる応答と比
較して、カプセル化された細胞の移植による、合成されたｒＨＣＮＴＦを受けた
患者におけるｈＣＮＴＦに対する炎症性応答の欠失は、ｒＨＣＮＴＦのポンプ送
達後にみられる変化が、この特定のタンパク質を取り囲む処方および安定性の問
題に十分関連し得ることを示唆する。In a joint study with Aebischer et al. (Results unpublished), the applicant
Encapsulated BHK cells secreting hCNTF were transplanted into the subarachnoid space of 10 ALS patients. Steady-state CSF concentrations up to 6 ng / ml were achieved. All patients complained of powerlessness and fatigue, but no weight loss, loss of appetite and activation of acute phase response proteins were observed. Neither CSF pleocytosis nor an increase in white blood cell count was observed. CNTF cannot be detected in the peripheral blood of these patients. To date, the efficacy measurements have been too poor to conclude efficacy results. Loss of inflammatory response to hCNTF in patients receiving synthetic rHCNTF due to transplantation of encapsulated cells, compared to the response seen with pumped rHCNTF, resulted in changes seen after pumping rHCNTF. , Suggesting that it may well relate to the formulation and stability issues surrounding this particular protein.

【００５０】 従って、ＣＮＴＦの全身注射を用いて観察された副作用および抗体形成が、Ｃ
ＮＴＦもしくはその改変体をＣＮＳへ直接送達することによって避けられ得ると
いう本出願人らの発見と合わせて、ハンティングトン病の当該分野で認識された
モデルにおける線条体ニューロンの細胞外毒素損傷についての保護剤として、Ｃ
ＮＴＦおよびその改変体の有効性を実証する動物モデルデータに基づいて、本出
願人は、ハンティングトン病を処理する有用な方法を発見した。従って、本出願
人の発明は、ＣＮＴＦまたはその改変体の、ＣＮＴＦを分泌する移植細胞または
細胞様小胞（例えば、リポソーム）を介するＣＮＳへの直接送達を意図する。あ
るいは、本明細書中に記載されるＣＮＴＦ改変体（これは、ＣＮＴＦと比較して
、改善された安定性および可溶性を有する）は、例えば、上記のＣＮＳへの、浸
透圧ポンプを介するＣＮＴＦの送達のための好ましい処方物を提供する。体温で
の溶液中のｒＨＣＮＴＦの不安定性は、クモ膜下腔または脳室内注入により慢性
的に投与されるその能力を妨げるので、本明細書中に記載されるｒＨＣＮＴＦの
改変体は、それらの改善された安定性、可溶性、および減少した抗原性を考慮す
ると、そのような使用のために好ましい。Thus, the side effects and antibody formation observed with systemic injection of CNTF are
Together with Applicants' finding that NTF or its variants can be avoided by delivering them directly to the CNS, we report on extracellular toxin damage to striatal neurons in an art-recognized model of Huntington's disease. As a protective agent, C
Based on animal model data demonstrating the efficacy of NTF and its variants, Applicants have discovered a useful method of treating Huntington's disease. Accordingly, Applicants' invention contemplates the direct delivery of CNTF or variants thereof to the CNS via CNTF-secreting transplant cells or cell-like vesicles (eg, liposomes). Alternatively, the CNTF variants described herein, which have improved stability and solubility as compared to CNTF, are for example those of the CNFS via osmotic pump to the CNS described above. It provides a preferred formulation for delivery. Since the instability of rHCNTF in solution at body temperature interferes with its ability to be chronically administered by intrathecal or intracerebroventricular infusion, variants of rHCNTF described herein provide improvements in them. Given its stability, solubility, and reduced antigenicity, it is preferred for such uses.

【００５１】 従って、本発明は、治療的適用において使用され得る改善された可溶性を有す
るＣＮＴＦの改変体を意図する。この適用において、例えば、浸透圧ポンプを介
した注入が薬物送達のために用いられる。組換えヒトＣＮＴＦ（ｒＨＣＮＴＦ）
の可溶性は、生理学的緩衝液（例えば、リン酸緩衝化生理食塩水、ｐＨ７．４（
ＰＢＳ））中では非常に制限されている。さらに、少なくともｐＨ４．５〜８．
０の範囲を超える可溶性は、温度およびインキュベーションの時間に強く依存す
る。５℃では、ＰＢＳ中のｒＨＣＮＴＦの可溶性は、１ｍｇ／ｍｌであり、そし
て溶液は数時間安定であるが、３７℃では、その安定性は、２時間後にわずか０
．１ｍｇ／ｍｌであり、そして４８時間後には０．０５ｍｇ／ｍｌである。この
制限された可溶性および熱安定性は、生理学的緩衝液中のｒＨＣＮＴＦの安定な
処方を妨害する。このような処方物は、ＣＮＳへの連続投与のために特に所望さ
れる。Accordingly, the present invention contemplates variants of CNTF with improved solubility that can be used in therapeutic applications. In this application, for example, infusion via an osmotic pump is used for drug delivery. Recombinant human CNTF (rHCNTF)
Is soluble in physiological buffer (eg, phosphate buffered saline, pH 7.4 (
Very limited in PBS)). Furthermore, at least pH 4.5-8.
Solubility above the 0 range is strongly dependent on temperature and time of incubation. At 5 ° C the solubility of rHCNTF in PBS is 1 mg / ml and the solution is stable for several hours, whereas at 37 ° C its stability is only 0 after 2 hours.
． 1 mg / ml and after 48 hours 0.05 mg / ml. This limited solubility and thermostability hinders stable formulation of rHCNTF in physiological buffer. Such formulations are particularly desirable for continuous administration to the CNS.

【００５２】 カルボキシル末端から最後の１３アミノ酸残基を欠失するｒＨＣＮＴＦ（ｒＨ
ＣＮＴＦ，ΔＣ１３は、ＲＰＮ１６０またはＲＧ１６０とも呼ばれる）は十分な
生物学的活性を保持し、そして低温（５〜１０℃）で少なくとも１２ｍｇ／ｍｌ
まで可溶性であることが発見された。しかし、このはるかに大きな可溶性にもか
かわらず、ｒＨＣＮＴＦ，ΔＣ１３は、０．１ｍｇ／ｍｌほどの低濃度であって
も３７℃で数時間のインキュベーションの際に、ＰＢＳ溶液にさらに不溶になる
。RHCNTF (rH that deletes the last 13 amino acid residues from the carboxyl terminus
CNTF, ΔC13 retains sufficient biological activity for RPN160 or RG160) and at least 12 mg / ml at low temperature (5-10 ° C).
Was found to be soluble. However, despite this much greater solubility, rHCNTF, ΔC13 becomes even more insoluble in PBS solution upon incubation at 37 ° C. for several hours, even at concentrations as low as 0.1 mg / ml.

【００５３】 ｒＨＣＮＴＦおよびｒＨＣＮＴＦ，ΔＣ１３の熱不安定性が、分子間ジスルフ
ィド結合形成によって開始され、そしてタンパク質濃度および温度に強く依存し
た凝集の結果であることが決定された。ヒトＣＮＴＦの１７位の単一のシステイ
ン残基をアラニン残基で置換することによって、はるかにより大きな安定性を示
し、かつＰＢＳ中３７℃で少なくとも７日間インキュベートした後にそれらの生
物学的活性を維持するタンパク質が得られた。この特性は、ｒＨＣＮＴＦ，６３
ＱＲ改変体において維持され、この改変体は、６３位のグルタミン酸残基のアル
ギニンにへの置換に起因してより高い効力を有する。特定の例において、ｒＨＣ
ＮＴＦ，１７ＣＡ，６３ＱＲ，ΔＣ１３（ＲＧ２９７とも呼ばれる）は、６３Ｑ
Ｒ置換によって、ｒＨＣＮＴＦよりも、より高い生物学的効力を示し、ΔＣ１３
欠失のためにより高い可溶性を示し、そして１７ＣＡ置換のためにより高い安定
性を示す。It was determined that the thermal instability of rHCNTF and rHCNTF, ΔC13 was initiated by intermolecular disulfide bond formation and was the result of aggregation strongly dependent on protein concentration and temperature. Substitution of a single cysteine residue at position 17 of human CNTF with an alanine residue shows much greater stability and retains their biological activity after incubation in PBS at 37 ° C for at least 7 days. A protein was obtained. This characteristic is rHCNTF, 63
Maintained in the QR variant, this variant has higher potency due to the substitution of the glutamic acid residue at position 63 for arginine. In a particular example, rHC
NTF, 17CA, 63QR, ΔC13 (also called RG297) is 63Q
The R substitution shows a higher biological potency than rHCNTF, and ΔC13
It shows higher solubility due to the deletion and higher stability due to the 17CA substitution.

【００５４】 本発明は、本明細書中に記載するＣＮＴＦまたは改変体の治療的な有効量を用
いる、ＨＤを有する患者の処置を意図する。ＣＮＴＦまたはその改変体の有効量
は、疾患の進行の遅延を生じる量、または疾患と関連する副作用の減少を生じる
量である。処置の効力は、処置を受けないコントロールと比較して、処置の効果
を比較することによって測定され得る。ＨＤの臨床経過および天然の経歴は、広
範囲にわたって、フィールド研究において（Ｙｏｕｎｇら、１９９６、Ａｎｎ
Ｎｅｕｒｏｌ．２０：２９６〜３０３；ＰｅｎｎｅｙおよびＹｏｕｎｇ、１９９
０、Ｍｏｖｅｍｅｎｔ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ５：９３〜９９）、臨床的評価機
器の開発において（ＳｈｏｕｌｓｏｎおよびＦａｈｎ、１９７９、Ｎｅｕｒｏｌ
ｏｇｙ ２９：１〜３；Ｓｈｏｕｌｓｏｎら、１９８９、Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａ
ｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃ Ｄｅｆｉｃｉｔ、ＴＬ Ｍｕｎｓａｔ
（編）Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ ２７１〜２８４；Ｆｅｉｇｉｎら、１９９５
、Ｍｏｖｅｍｅｎｔ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ １０：２１１〜２１４）、およびコ
ンピューター化されたＸ線断層撮影法を使用する疾患の進行の放射線写真法の相
関において（Ｔｅｒｒｅｎｃｅら、１９７７、Ｎｅｕｒｏｒａｄｉｏｌｏｇｙ
１３：１７３〜１７５；Ｂａｒｒら、１９７８、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ２８：１
１９６〜１２００；Ｎｅｏｐｈｙｔｉｄｅｓら、１９７９、２３：１８５〜１９
１；Ｓｔｏｂｅｒら、１９８４、Ｎｅｕｒｏｒａｄｉｏｌｏｇｙ ２６：２５〜
２８）、磁気共鳴画像法において（Ｇｒａｆｆｏｎら、１９９２、Ａｒｃｈ．Ｎ
ｅｕｒｏｌ．４９：１１６１〜１１６７）、ならびにポジトロン放出断層撮影技
術（Ｈａｒｒｉｓら、１９９６、Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ．５３：３１６〜３２
４）において、両方が特徴付けられてきた。The present invention contemplates treatment of patients with HD with therapeutically effective amounts of the CNTF or variants described herein. An effective amount of CNTF or variant thereof is an amount that results in a delay in the progression of the disease or a decrease in the side effects associated with the disease. Efficacy of treatment can be measured by comparing the effect of treatment as compared to a control that receives no treatment. The clinical and natural history of HD has been extensively studied in field studies (Young et al., 1996, Ann.
Neurol. 20: 296-303; Penney and Young, 199.
0, Movement Disorders 5: 93-99), in the development of clinical evaluation instruments (Soulson and Fahn, 1979, Neurol.
Ogy 29: 1-3; Shoulson et al., 1989, Quantifica.
tion of Neurologic Defit, TL Munsat
(Eds.) Butterworths 271-284; Feigin et al., 1995.
, Movement Disorders 10: 211-214), and in the radiographic correlation of disease progression using computerized X-ray tomography (Terence et al., 1977, Neuroradiology).
13: 173-175; Barr et al., 1978, Neurology 28: 1.
196-1200; Neophytides et al., 1979, 23: 185-19.
1; Stober et al., 1984, Neuroradiology 26: 25-.
28) in magnetic resonance imaging (Graffon et al., 1992, Arch. N.
eurol. 49: 1161-1167), as well as positron emission tomography techniques (Harris et al., 1996, Arch. Neurol. 53: 316-32).
In 4) both have been characterized.

【００５５】 ハンティングトン病の進行の臨床的な速度は、ＳｈｏｕｌｓｏｎおよびＦａｈ
ｎ（１９７９、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ２９：１〜３）によって開発されたＨＤ機
能的容量スケール（ＨＤＦＣ）を使用して評価されてきた。十分に機能的な患者
は、このスケールにおいて１３のスコアを受け取る；０のスコアは、全体の不可
能性を反映する。Ｓｈｏｕｌｓｏｎら、１９８９、Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏ
ｎ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃ Ｄｅｆｉｃｉｔ，ＴＬ Ｍｕｎｓａｔ（編）
Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ ２７１〜２８４。このスケールを用いる、患者の進
行の平均速度は、約０．６５単位／年である。Ｓｈｏｕｌｓｏｎら、１９８９、
Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃ Ｄｅｆｉｃｉｔ
，ＴＬ Ｍｕｎｓａｔ（編）Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ ２７１〜２８４；Ｆｅ
ｉｇｉｎら、１９９５、Ｍｏｖｅｍｅｎｔ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ １０：２１１
〜２１４。このスケールが本当に直線である場合（試験されていない仮説）、こ
の進行の速度は、患者におけるＨＤの症状の平均２０年間の期間によく対応する
。ＨＤＦＣスコアは、おおざっぱには５の臨床的段階にグループ分けされ得る（
Ｓｈｏｕｌｓｏｎら、１９８９、Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｅｕ
ｒｏｌｏｇｉｃ Ｄｅｆｉｃｉｔ，ＴＬ Ｍｕｎｓａｔ（編）Ｂｕｔｔｅｒｗｏ
ｒｔｈｓ ２７１〜２８４）。The clinical rate of progression of Huntington's disease is determined by Shoulson and Fah.
n (1979, Neurology 29: 1 to 3) have been evaluated using the HD Functional Capacity Scale (HDFC). Fully functional patients receive a score of 13 on this scale; a score of 0 reflects overall impossibility. Shoulson et al., 1989, Quantificatio
no of Neurologic Deficit, TL Munsat (ed.)
Butterworths 271-284. The average rate of progression of patients using this scale is approximately 0.65 units / year. Shoulson et al., 1989,
Quantification of Neurologic Defit
, TL Munsat (ed) Butterworths 271-284; Fe
Igin et al., 1995, Movement Disorders 10: 211.
~ 214. If this scale is truly linear (an untested hypothesis), this rate of progression corresponds well to the average 20-year duration of symptoms of HD in patients. HDFC scores can be roughly grouped into 5 clinical stages (
Shoulson et al., 1989, Quantification of Neu.
rologic Deficit, TL Munsat (ed) Butterwo
rths 271-284).

【００５６】 神経画像化研究は、神経的な損失の正味の病理学的結果、および基本的な神経
節構造の結果的な萎縮に集中してきた。ＨＤが進行するにつれて、尾状核は縮み
、側方の室に、特徴的な「ボックスカー（ｂｏｘ ｃａｒ）」の外見を与える。
尾状核萎縮の程度は、「二尾状核指標（ｂｉｃａｕｄａｔｅ ｉｎｄｅｘ）」を
用いて定量され得る。Neuroimaging studies have focused on the net pathological consequences of neuronal loss, and the consequent atrophy of the underlying ganglion structure. As HD progresses, the caudate nucleus shrinks, giving the lateral chambers a characteristic "box car" appearance.
The degree of caudate atrophy can be quantified using the "bicaudate index".

【００５７】 磁気共鳴画像法は、ＣＴによって与えられるのと同様の指標を生成するために
使用され得る。しかし、比較的新しい技術であるインビボＮＭＲスペクトル測定
法は、生きている脳の中の代謝的プロセスを評価する能力を提供する。１つの予
備的な研究（Ｊｅｎｋｉｎｓら、１９９３、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ４３：２６８
９〜２６９５）は、乳酸の量の増加を検出した。これはおそらく、ＨＤ患者の脳
における中間代謝の、神経細胞の損失または欠失のいずれかを反映している。Magnetic resonance imaging can be used to generate indices similar to those given by CT. However, a relatively new technique, in vivo NMR spectroscopy, provides the ability to assess metabolic processes in the living brain. One preliminary study (Jenkins et al., 1993, Neurology 43: 268.
9-2695) detected an increase in the amount of lactic acid. This probably reflects either neuronal loss or loss of intermediary metabolism in the brain of HD patients.

【００５８】 ポジトロン放出断層撮影技術（ＰＥＴ）は、生きている患者において行われる
機能的な画像化を可能にする。代謝状態の変化は、２−デオキシグルコース（こ
れは、シナプス活性を反映する）または選択された神経の集団を標識する選択的
な放射性リガンドの使用によって評価され得る。グルコース代謝の変化の速度、
およびハンティングトン病の危険がある個人における尾状核（ｃａｕｄａｔｅ）
サイズを決定するために、Ｇｒａｆｔｏｎら（１９９２、Ａｒｃｈ Ｎｅｕｒｏ
ｌ．４９：１１６１〜１１６７）は、４２（＋／− ９）ヶ月の間隔をあけて、
２回のポジトロン放出断層撮影技術グルコース代謝研究、および２回の核磁気共
鳴画像化スキャンを用いて、ハンティングトン病の危険がある１８人の個人を評
価した。７例の個体が、ハンティングトン病遺伝子陰性であった；残りは遺伝子
試験または研究参加後の舞踏病の発症によって、遺伝子陽性であった。この遺伝
子陽性群は、遺伝子陰性群と比較して、尾状核において１年あたりグルコース代
謝速度の３．１％の有意な損失を実証した（９５％の信頼区間［ＣＩ］−４．６
４、−１．４８）。核磁気共鳴画像化法二尾状核（ｂｉｃａｕｄａｔｅ）速度に
おいて、１年あたり３．６％の増加が存在した（９５％ ＣＩ、１．８１、５．
３７）。これは、尾状核萎縮の線形測定であった。しかし、尾状核サイズの変化
の速度は、尾状核代謝の変化の速度とは相関しなかった。これは、代謝の損失お
よび萎縮は、独立して発達し得ることを示唆する。従って、連続的なポジトロン
放出断層撮影技術または磁気共鳴画像法は、臨床速度スケールにおいて観察され
る速度の損失の割合（１年あたり約５％、上記を参照のこと）とはさほど違わな
い速度の損失の割合を生じ、従って、ＨＤの危険性にある前症状的な個体におけ
る実験的な薬理的介入をモニターするための有用な手段であり得る。臨床的な試
みは、このような患者集団を組込むように設計されるべきである。Positron emission tomography technology (PET) enables functional imaging performed in living patients. Changes in metabolic status can be assessed by the use of 2-deoxyglucose, which reflects synaptic activity, or selective radioligands that label selected neuronal populations. The rate of change in glucose metabolism,
And in individuals at risk for Huntington's disease
To determine size, Grafton et al. (1992, Arch Neuro)
l. 49: 1161-1167), with an interval of 42 (+/− 9) months,
Eighteen individuals at risk for Huntington's disease were evaluated using two positron emission tomography technique glucose metabolism studies and two nuclear magnetic resonance imaging scans. Seven individuals were gene-negative for Huntington's disease; the rest were gene-positive due to onset of chorea after genetic testing or study participation. This gene-positive group demonstrated a 3.1% significant loss in glucose metabolism rate per year in the caudate compared to the gene-negative group (95% confidence interval [CI] -4.6).
4, −1.48). Nuclear Magnetic Resonance Imaging There was a 3.6% increase per year in bicaudate velocity (95% CI, 1.81, 5.
37). This was a linear measure of caudate atrophy. However, the rate of change in caudate size did not correlate with the rate of change in caudate metabolism. This suggests that metabolic loss and atrophy can develop independently. Therefore, continuous positron emission tomography or magnetic resonance imaging has a rate that is not significantly different from the rate of rate loss observed on the clinical rate scale (about 5% per year, see above). It results in a rate of loss and may therefore be a useful tool for monitoring experimental pharmacological interventions in presymptomatic individuals at risk for HD. Clinical trials should be designed to incorporate such a patient population.

【００５９】 グルコース代謝のマッピングに加えて、他の放射性リガンドがＨＤにおける線
条体完全性をモニターするために使用され得る。例えば、ＨＤにおいて失われた
固有の線条体ニューロンは、均一的にドーパミンレセプターを保有するので、ド
ーパミンレセプターについてのリガンドは、ＨＤの進行をモニターするために使
用されてきた。これらの研究は、ＨＤ患者において確かに線条体Ｄ１およびＤ２
レセプター両方の平行した減少を示す（Ｔｕｒｊａｎｓｋｉら、１９９５、Ｂｒ
ａｉｎ １１８：６８９〜６９６）。In addition to mapping glucose metabolism, other radioligands can be used to monitor striatal integrity in HD. For example, the intrinsic striatal neurons lost in HD uniformly carry dopamine receptors, so ligands for dopamine receptors have been used to monitor HD progression. These studies do indeed show striatum D1 and D2 in HD patients.
Shows a parallel decrease in both receptors (Turjanski et al., 1995, Br.
ain 118: 689-696).

【００６０】 同様の代謝的および神経化学的知見が、線条においてキノリン酸で処理した霊
長類のＰＥＴ研究において得られてきた。Ｂｒｏｗｎｅｌｌら（１９９４、Ｅｘ
ｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．１２５：４１〜５１）は、３例の非ヒト霊長類の線条体のキ
ノリン酸損傷後、ハンティングトン病の症状に類似した症状が、ドーパミンアゴ
ニスト処理によって誘導され得ることを報告した。すべての動物が、［１９Ｆ］
フルオロ−２−デオキシ−Ｄ−グルコース ポジトロン放出断層撮影技術（ＰＥ
Ｔ）による尾状核におけるグルコース利用の長期的な４０〜５０％の減少を示し
た。Ｄ１レセプターについての尾状核−被殻取り込み速度定数は、ニューロンの
損失および平均４０〜４８％の減少を反映した。ＰＥＴによって評価されたドー
パミン再取り込み部位および線維は、穏やかなニューロン損失を有する領域にお
いて一時的な減少を示し、そして重篤な破壊を有する線条体領域においては長期
の減少を示した。行動変化および死後の試験において見られる神経病理と一致し
たこれらの結果は、ハンティングトン病の患者の臨床研究において観察された結
果と類似し、そしてキノリン酸モデルをさらに評価するように作用し、そしてこ
れらの測定がヒトの臨床試験において有用であり得ることを示唆する。Similar metabolic and neurochemical findings have been obtained in PET studies of primates treated with quinolinic acid in the striatum. Brownell et al. (1994, Ex
p. Neurol. 125: 41-51) reported that after three cases of non-human primate striatal quinolinic acid damage, symptoms similar to those of Huntington's disease can be induced by dopamine agonist treatment. All animals are [19F]
Fluoro-2-deoxy-D-glucose Positron emission tomography technology (PE
T) showed a long-term 40-50% reduction in glucose utilization in the caudate. The caudate-putamen uptake rate constant for the D1 receptor reflected neuronal loss and an average 40-48% decrease. Dopamine reuptake sites and fibers assessed by PET showed a temporary decrease in areas with mild neuronal loss and a long-term decrease in striatal areas with severe destruction. These results, consistent with behavioral changes and neuropathology seen in post-mortem studies, are similar to those observed in clinical studies of patients with Huntington's disease and acted to further evaluate the quinolinic acid model, and It is suggested that these measurements may be useful in human clinical trials.

【００６１】 ＨＤにおける臨床試験は、多くは、精神医学的症状および不随意運動について
の症候性の待機的治療の評価に限定されてきた（Ｓｈｏｕｌｓｏｎら、１９８１
、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ２９：１〜３）。しかし、潜在的な神経保護剤を試験す
る１つの試みが存在した。この試みは、この薬剤が線条中の皮質の線条体末端か
らのグルタミン酸の放出を減少させ、それによってＨＤの進行を遅らせるという
理論に基づく、ＧＡＢＡ−Ｂレセプターアンタゴニストであるバクロフェンの使
用を含んだ（Ｓｈｏｕｌｓｏｎら、１９８９、Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃ Ｄｅｆｉｃｉｔ，ＴＬ Ｍｕｎｓａｔ（編）Ｂｕ
ｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ ２７１〜２８４）。この試みの結果は、バクロフェン処
理した患者が、試験の３０か月の期間にわたってコントロールよりもよくならな
かったという点で、失敗であった。それにもかかわらず、この試みは、ＨＤＦＣ
の使用および認証についての確信的な根拠を提供した。この研究の１つの重要な
結果は、この研究の患者において疾患の進行の固有の速度が、もともと研究者ら
によって見積もられた速度のわずか半分であったことである。この情報は、今や
この測定機器を使用する未来の臨床試験の設計において使用され得る。Clinical trials in HD have often been limited to the evaluation of symptomatic palliative treatment for psychiatric symptoms and involuntary movements (Shoulson et al., 1981).
, Neurology 29: 1-3). However, there has been one attempt to test potential neuroprotective agents. This approach involved the use of the GABA-B receptor antagonist baclofen, which is based on the theory that this drug reduces glutamate release from the striatal ends of the cortex in the striatum, thereby slowing the progression of HD. (Soulson et al., 1989, Quantification
of Neurologic Defit, TL Munsat (ed) Bu
tterworths 271-284). The result of this trial was a failure in that baclofen-treated patients did not outperform controls over the 30-month period of the study. Nevertheless, this attempt was
Provided a credible basis for the use and certification of. One significant result of this study was that the patient's intrinsic rate of disease progression in this study was only half the rate originally estimated by the investigators. This information can now be used in the design of future clinical trials using this measuring instrument.

【００６２】 現在、ＨＤにおける主要な進行中の臨床試験は存在しない。しかし、臨床試験
組織である、ハンティングトン病研究グループが組織され、そしてＨＤにおける
臨床試験の実行のための場所での基幹施設を有している。このグループは現在、
以下を含む種々の臨床試験オプションを研究している。１）中間代謝を増強する
ためのコエンザイムＱの使用および２）グルタミン酸アンタゴニストおよび／ま
たはグルタミン酸放出ブロッカー（Ｗ．Ｋｏｒｏｓｈｅｔｚ、個人的通信）の使
用。同目的のグループがヨーロッパで設立され、そしてこのグループは、胎児の
線条体移植物の潜在的な効力、および最終的には異種移植の移植物の使用を同様
に試験するために、ＰＥＴ方法論を使用する。Currently, there are no major ongoing clinical trials in HD. However, a clinical trials organization, the Huntington's Disease Research Group, has been organized and has a core facility in place for conducting clinical trials in HD. This group is currently
We are investigating various clinical trial options, including: 1) Use of coenzyme Q to enhance intermediary metabolism and 2) Use of glutamate antagonists and / or glutamate release blockers (W. Koroshetz, personal communication). A group of the same purpose was established in Europe, and this group was set up to test the potential efficacy of fetal striatal implants, and ultimately the use of xenograft implants, in a PET methodology. To use.

【００６３】 ＨＤにおける疾患の進行を評価するための、確認された臨床的評価機器の利用
可能性および相関する放射線画像化測定の存在は、２つの大きな組織化されたマ
ルチセンター臨床試験組織の存在と組み合わせて、ＨＤにおける臨床試験の実施
を直接的に行う。The availability of validated clinical assessment equipment and the existence of correlated radioimaging measurements to assess disease progression in HD is due to the existence of two large organized multicenter clinical trial tissues. In combination with, the clinical trials in HD will be performed directly.

【００６４】 出願人らは、Ａｘ−１３またはＡｘ−１（ｒＨＣＮＴＦ、１７ＣＡ６３ＱＲΔ
Ｃ１３と称される）として公知の改変されたＣＮＴＦ分子の産生を本明細書中に
記載する。これは、６３Ｑ→Ｒ置換（これは、より強力な生物学的能力を有する
）を、末端の１３アミノ酸残基の欠失（これは、生理学的条件下で、より高い溶
解度を有する）および１７ＣＡ置換（これは、特に３７℃の生理学的条件下で安
定性を有する）と組み合わせ、そして動物モデルにおけるｒＨＣＮＴＦよりも２
〜３倍良好な治療指標を示す。しかし、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現させた場合、産生
される発現されたタンパク質の実質的な部分は、Ｃ末端においてデカペプチドで
タグ化されている。このことにより、Ａｘ−１３の精製は困難であり、そして精
製されタグ化されていない産物の低収量を生じる。このデカペプチドタグ化は、
Ａｘ−１３が哺乳動物発現系において発現された場合には起こらないようである
。さらに、このデカペプチドタグは、分子の免疫原性の増加に寄与し得、そして
また、おそらく安定性についての問題を引き起こし得ることがあり得る。Applicants have used Ax-13 or Ax-1 (rHCNTF, 17CA63QRΔ
Described herein is the production of a modified CNTF molecule known as C13). It contains a 63Q → R substitution, which has a stronger biological potency, a deletion of the terminal 13 amino acid residues, which has a higher solubility under physiological conditions, and 17CA. Combined with substitution, which is particularly stable under physiological conditions at 37 ° C., and 2 more than rHCNTF in animal models.
~ 3 times better therapeutic index. However, E. When expressed in E. coli, a substantial portion of the expressed protein produced is C-terminally tagged with a decapeptide. This makes purification of Ax-13 difficult and results in low yields of purified untagged product. This decapeptide tagging is
It does not appear to occur when Ax-13 is expressed in a mammalian expression system. In addition, this decapeptide tag may contribute to the increased immunogenicity of the molecule and may also possibly cause problems with stability.

【００６５】 しかし、Ｅ．ｃｏｌｉ発現系の使用は、費用および有効性の見地から好ましい
。従って、出願人らは、Ａｘ−１３の改善された強度、可溶性、および安定性特
性を保持する一方、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現された場合に、デカペプチドタグ
化の問題を回避する、短縮されたＣＮＴＦ分子の開発に着手した。本明細書中に
記載されるように、出願人らはＡｘ−１５（ｒＨＣＮＴＦ、１７ＣＡ６３ＱＲΔ
Ｃ１５と称される）として公知の分子を産生することに成功した。この分子は、
Ａｘ−１３の改善された特性を保持するが、これはまた、付加されているアミノ
酸タグが減少されてＥ．ｃｏｌｉによって発現されているという追加された利点
を有する。従って、この新規な分子Ａｘ−１５は、より高い収率でより容易に精
製されるという利点を有する。さらに、細菌のアミノ酸タグ化が非常に減少して
いるので、Ａｘ−１５は、Ａｘ−１３によって起こされ得る分子の免疫原性また
は安定性に関する心配を生じない。However, E. The use of the E. coli expression system is preferred from a cost and efficacy standpoint. Thus, Applicants have retained the improved strength, solubility, and stability properties of Ax-13 while maintaining E. We have set out to develop a shortened CNTF molecule that avoids the problem of decapeptide tagging when expressed in E. coli. As described herein, Applicants have used Ax-15 (rHCNTF, 17CA63QRΔ).
We have succeeded in producing a molecule known as C15). This molecule is
Retaining the improved properties of Ax-13, this also results in E. coli with reduced added amino acid tags. It has the added advantage of being expressed by E. coli. Therefore, this novel molecule Ax-15 has the advantage of being more easily purified in higher yields. Moreover, because the bacterial amino acid tagging is greatly reduced, Ax-15 does not raise concerns about the immunogenicity or stability of the molecule that can be caused by Ax-13.

【００６６】 従って、本発明の目的は、改善された改変された毛様体神経栄養因子分子を提
供することである。特に、本発明の１つの実施形態は、Ｃｙｓ１７→Ａｌａ、Ｇ
ｌｎ６３→Ａｒｇの改変、および末端１５アミノ酸残基の欠失を有する改変され
たヒト毛様体神経栄養因子である。本発明はまた、本発明の改変されたヒト毛様
体神経栄養因子をコードする、単離された核酸分子を提供する。本発明によって
また意図されるものは、本発明の改変されたヒト毛様体神経栄養因子をコードし
、そして発現制御配列に作動可能に連結されている組換えＤＮＡ分子、ならびに
組換えＤＮＡ分子で形質転換した宿主細胞である。 この宿主細胞は、原核細胞
であってもよいし、または真核細胞であってもよく、従って、例えば、Ｅ．ｃｏ
ｌｉのような細菌、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓのような酵母細胞、Ｓｐｏ
ｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａのような昆虫細胞、またはＣＯＳもしく
はＣＨＯ細胞のような哺乳動物細胞であり得る。このような宿主細胞は、改変さ
れた毛様体神経栄養因子分子を産生する方法において使用され得る。この方法は
以下の工程を含む：（ａ）本発明の組換えＤＮＡ分子で形質転換された宿主細胞
を増殖させ、その結果、そのＤＮＡ分子が宿主細胞によって発現され、本発明の
改変された毛様体神経栄養因子分子を産生する工程、および（ｂ）その発現され
た、改変された毛様体神経栄養因子分子を単離する工程。Accordingly, it is an object of the present invention to provide improved and modified ciliary neurotrophic factor molecules. In particular, one embodiment of the present invention is Cys17 → Ala, G
It is a modified human ciliary neurotrophic factor with a modification of ln63 → Arg and a deletion of the terminal 15 amino acid residues. The invention also provides an isolated nucleic acid molecule encoding the modified human ciliary neurotrophic factor of the invention. Also contemplated by the present invention is a recombinant DNA molecule encoding the modified human ciliary neurotrophic factor of the present invention and operably linked to expression control sequences, as well as recombinant DNA molecules. It is a transformed host cell. The host cell may be prokaryotic or eukaryotic, and thus, for example, E. coli. co
bacteria such as Li, yeast cells such as Pichia pastoris, Spo
It can be an insect cell such as Doptera frugiperda, or a mammalian cell such as COS or CHO cells. Such host cells can be used in a method of producing a modified ciliary neurotrophic factor molecule. The method comprises the steps of: (a) growing a host cell transformed with a recombinant DNA molecule of the invention such that the DNA molecule is expressed by the host cell and modified hair of the invention. Producing a mitochondrial neurotrophic factor molecule, and (b) isolating the expressed, modified ciliary neurotrophic factor molecule.

【００６７】 本発明はさらに、本発明の改変された毛様体神経栄養因子分子（Ａｘ−１５）
およびキャリアを含む組成物を意図する。The invention further provides a modified ciliary neurotrophic factor molecule (Ax-15) of the invention.
And a composition comprising a carrier is contemplated.

【００６８】 本発明の別の目的は、本明細書中ではＡｘ−１５と記載される改変された毛様
体神経栄養因子を投与する工程を包含する、神経系の疾患または障害を処置する
方法を提供することである。処置される疾患または障害は、変性性疾患であり得
るか、そして／または脊髄、運動ニューロン、コリン作用性ニューロン、または
海馬の細胞を含み得る。あるいは、処置の方法は、外傷、手術、梗塞、感染、悪
性疾患、および毒性因子への暴露からなる群から選択される事象によって引き起
こされる神経系への損傷を含む、神経系の疾患または障害の処置をするためであ
り得る。本発明によってまた意図されるものは、筋萎縮を含む疾患または障害の
処置の方法であり得る。Another object of the invention is a method of treating a disease or disorder of the nervous system comprising the step of administering a modified ciliary neurotrophic factor described herein as Ax-15. Is to provide. The disease or disorder treated may be a degenerative disease and / or may include spinal cord, motor neurons, cholinergic neurons, or hippocampal cells. Alternatively, the method of treatment is for a disease or disorder of the nervous system, including damage to the nervous system caused by an event selected from the group consisting of trauma, surgery, infarction, infection, malignancy, and exposure to virulence factors. It may be for treatment. Also contemplated by the present invention may be a method of treatment of a disease or disorder involving muscle wasting.

【００６９】 本発明のさらなる目的は、変性から線条体ニューロンを保護する方法を提供す
ることであり、これは、本明細書中ではＡｘ−１５と記載される改変された毛様
体神経栄養因子の有効量でこの線条体ニューロンを処置する工程を含む。A further object of the present invention is to provide a method of protecting striatal neurons from degeneration, which is a modified ciliary neurotrophic described herein as Ax-15. Treating the striatal neurons with an effective amount of the factor.

【００７０】 本発明によってまた意図されるものは、本明細書中ではＡｘ−１５と記載され
る改変された毛様体神経栄養因子の中枢神経系への直接投与を含む、ハンティン
グトン病の処置の方法である。Also contemplated by the present invention is the treatment of Huntington's disease, which involves the direct administration to the central nervous system of a modified ciliary neurotrophic factor, described herein as Ax-15. Is the method.

【００７１】 本発明のさらなる目的は、本明細書中ではＡｘ−１５と記載される改変された
毛様体神経栄養因子の哺乳動物への投与を含む、哺乳動物における体重損失を誘
導する方法を提供することである。本発明の特定の実施形態は、ヒトにおける体
重損失を誘導する工程を含む。A further object of the present invention is a method of inducing weight loss in a mammal comprising administering to said mammal a modified ciliary neurotrophic factor, herein designated Ax-15. Is to provide. Certain embodiments of the invention include the step of inducing weight loss in humans.

【００７２】 Ａｘ−１５の投与方法は、遺伝的に決定された起源の病的な肥満または肥満の
処置において使用され得る。本明細書中で記載されるＡｘ−１５はまた、ヒトに
おける妊娠発症糖尿病または成人発症糖尿病の発生を予防／または処置する方法
において使用され得る。The method of administration of Ax-15 can be used in the treatment of morbid obesity or obesity of genetically determined origin. The Ax-15 described herein can also be used in a method of preventing / treating the development of gestational-onset diabetes or adult-onset diabetes in humans.

【００７３】 Ａｘ−１５の投与を含む上記の方法のいずれかは、静脈内、筋肉内、皮下、ク
モ膜下腔、脳室内、および実質内からなる群から選択される送達の経路を介して
、Ａｘ−１５を投与することによって実行され得る。Any of the above methods involving administration of Ax-15 is via a route of delivery selected from the group consisting of intravenous, intramuscular, subcutaneous, intrathecal, intracerebroventricular, and intraparenchymal. , Ax-15.

【００７４】 あるいは、Ａｘ−１５は、改変された毛様体神経栄養因子を放出する細胞の移
植を介して投与され得る。Alternatively, Ax-15 can be administered via implantation of cells that release modified ciliary neurotrophic factor.

【００７５】 本発明はまた、神経系への損傷から生じる疾患または障害を意図し、ここでこ
のような損傷は、外傷、手術、梗塞、感染、および悪性疾患によってか、または
、毒性因子への暴露によって引き起こされ得る。The present invention also contemplates diseases or disorders resulting from damage to the nervous system, where such damage is due to trauma, surgery, infarction, infection and malignancy, or to toxic factors. Can be caused by exposure.

【００７６】 本発明はまた、適切な薬理学的キャリアにおいて、単一の治療剤としてかまた
はＣＮＴＦレセプターとの複合体において、本明細書中に記載されるように、改
変されたＣＮＴＦ分子もしくはそのハイブリッドまたはその変異体を含む、薬学
的組成物を提供する。The present invention also provides a modified CNTF molecule or a modified CNTF molecule as described herein, either as a single therapeutic agent or in complex with a CNTF receptor, in a suitable pharmacological carrier. There is provided a pharmaceutical composition comprising a hybrid or variant thereof.

【００７７】 本明細書中に記載されるＣＮＴＦ分子または改変されたＣＮＴＦ分子を含み得
る活性成分は、任意の適切な経路（以下を含むがこれらに限定されない：実質内
、心室内または脳室内送達）によるかまたは徐放性移植物（例えば、公開出願、
１９９６年２月１日に公開されたＷＯ９６／０２６４６、１９９５年１０月２６
日に公開されたＷＯ９５／２８１６６、または１９９５年２月２３日に公開され
たＷＯ９５／５０５４５２に記載されるような、細胞または組織移植物を含む）
によるインビボでの投与のために適切な薬学的キャリア中で処方されるべきであ
る。Active ingredients that may include the CNTF molecules or modified CNTF molecules described herein may be delivered by any suitable route, including but not limited to: intraparenchymal, intraventricular or intracerebroventricular delivery. ) Or sustained release implants (eg, published applications,
WO96 / 02646, published February 1, 1996, October 26, 1995
(Including cell or tissue transplants, as described in WO 95/28166 published on Sunday, or WO 95/505452 published February 23, 1995).
Should be formulated in a suitable pharmaceutical carrier for in vivo administration according to.

【００７８】 投与の様式に依存して、活性成分は、液体キャリア（例えば、生理食塩水）中
で処方され得るか、リポソーム、マイクロカプセル、ポリマー、またはワックス
ベースでありかつ制御放出性の調製物に組込まれ得る。好ましい実施形態におい
て、改変されたＣＮＴＦ調製物は、安定であるか、または錠剤、丸薬、もしくは
カプセル形態に処方される。Depending on the mode of administration, the active ingredient can be formulated in a liquid carrier such as saline, or can be liposomes, microcapsules, polymers, or wax-based and controlled release preparations. Can be incorporated into. In a preferred embodiment, the modified CNTF preparation is stable or formulated in tablet, pill, or capsule form.

【００７９】 処方物において使用される活性成分の濃度は、必要とされる有効用量および使
用される投与の様式に依存する。使用される用量は、有効である活性成分の循環
血漿濃度を達成するに十分であるベきである。有効用量は、インビトロまたは動
物モデル試験系から誘導される用量−反応曲線から外挿され得る。有効用量は、
約．００１〜約１ｍｇ／日の範囲内にあることが予測される。The concentration of active ingredient used in the formulations depends on the effective dose required and the mode of administration used. The dose used should be sufficient to achieve a circulating plasma concentration of the active ingredient that is effective. Effective doses may be extrapolated from dose-response curves derived from in vitro or animal model test systems. The effective dose is
about. It is expected to be in the range of 001 to about 1 mg / day.

【００８０】 （実施例） （実施例１−改変ヒトＣＮＴＦ分子の電気泳動の移動度） （材料および方法） （改変ＣＮＴＦ分子の調製） （細菌株およびプラスミド） Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２ ＲＦＪ２６は、ラクトースオペロンリプレッサーを
過剰産生する株である。EXAMPLES Example 1 Electrophoretic Mobility of Modified Human CNTF Molecules Materials and Methods Preparation of Modified CNTF Molecules Bacterial Strains and Plasmids E. E. coli K-12 RFJ26 is a strain that overproduces the lactose operon repressor.

【００８１】 ヒトＣＮＴＦ遺伝子およびｐＲＰＮ１１０（これは、ラットＣＮＴＦ遺伝子を
保有する）を保有する発現ベクターｐＲＰＮ３３は、ほぼ同一である（Ｍａｓｉ
ａｋｏｗｓｋｉら、１９９１，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．５７：１００３〜１０１
２および１９９１年４月４日に公開された、国際公開番号ＷＯ ９１／０４３１
６）。The expression vector pRPN33 carrying the human CNTF gene and pRPN110, which carries the rat CNTF gene, is nearly identical (Masi).
Akowski et al., 1991, J. Am. Neurosci. 57: 1003 to 101
International Publication Number WO 91/0431, published 2 and April 4, 1991.
6).

【００８２】 プラスミドｐＲＰＮ２１９を、制限酵素Ｎｈｅ１およびＨｉｎｄ３を用いたｐ
ＲＰＮ３３の最初の消化、ならびに４，０８１ｂｐのフラグメントのゲル精製に
より構築した。第２に、ヒトＣＮＴＦ遺伝子の部分をコードする、ずっと小さい
フラグメントを、引き続き、ＲＡＴ−ＩＩＩ−ｄｎｉＨプライマー：５’ＡＣＧ
ＧＴＡＡＧＣＴＴＧＧＡＧＧＴＴＣＴＣ ３’；およびＲＡＴ−Ｎｈｅ−Ｉ−Ｍ
プライマー：５’ＴＣＴＡＴＣＴＧＧＣ ＴＡＧＣＡＡＧＧＡＡＧＡＴＴＣＧＴ
ＴＣＡ ＧＡＣＣＴＧＡＣＴＧ ＣＴＣＴＴＡＣＧ ３’を用いたラット遺伝子
からのＰＣＲ増幅により得た１６７ｂｐのＮｈｅ１−Ｈｉｎｄ３フラグメントで
置換した。The plasmid pRPN219 was ligated into the p plasmid using the restriction enzymes Nhe1 and Hind3.
It was constructed by initial digestion of RPN33, as well as gel purification of the 4,081 bp fragment. Second, a much smaller fragment encoding a portion of the human CNTF gene was subsequently added to the RAT-III-dniH primer: 5'ACG.
GTAAGCTTGGAGGGTTCTC 3 '; and RAT-Nhe-IM
Primer: 5'TCTATCTGGC TAGCAAGGAAGATTCGT
It was replaced with a 167 bp Nhe1-Hind3 fragment obtained by PCR amplification from the rat gene using TCA GACCTGACTG CTCTTACG 3 ′.

【００８３】 プラスミドｐＲＰＮ２２８は、１６７ｂｐの置換フラグメントをＤＮＡプライ
マーＲａｔ−ＩＩＩ−ｄｎｉＨ−Ｌ−Ｒ：５’ＡＡＧ ＧＴＡ ＣＧＡ ＴＡＡ
ＧＣＴ ＴＧＧ ＡＧＧ ＴＴＣ ＴＣＴ ＴＧＧ ＡＧＴ ＣＧＣ ＴＣＴ
ＧＣＣ ＴＣＡ ＧＴＣ ＡＧＣ ＴＣＡ ＣＴＣ ＣＡＡ ＣＧＡ ＴＣＡ
ＧＴＧ ３’およびＲａｔ−Ｎｈｅ−Ｉ：５’ＴＣＴ ＡＴＣ ＴＧＧ ＣＴ
Ａ ＧＣＡ ＡＧＧ ＡＡＧ ３’を用いて増幅したこと以外は、ｐＲＰＮ２１
９と同じ様式で構築した。In the plasmid pRPN228, the 167 bp substitution fragment was used as the DNA primer Rat-III-dniH-LR: 5′AAG GTA CGA TAA.
GCT TGG AGG TTC TCT TGG AGT CGC TCT
GCC TCA GTC AGC TCA CTC CAA CGA TCA
GTG 3'and Rat-Nhe-I: 5'TCT ATC TGG CT
PRPN21 except that it was amplified using A GCA AGG AAG 3 '.
It was constructed in the same manner as 9.

【００８４】 プラスミドｐＲＰＮ１８６、ｐＲＰＮ１８７、ｐＲＰＮ１８８、ｐＲＰＮ１８
９、ｐＲＰＮ１９２、ｐＲＰＮ２１８およびｐＲＰＮ２２２を、類似の方法によ
るか、または図１に示した特有の制限部位を用いるＤＮＡフラグメントの直接交
換により生成した。Plasmids pRPN186, pRPN187, pRPN188, pRPN18
9, pRPN192, pRPN218 and pRPN222 were generated by a similar method or by direct exchange of DNA fragments using the unique restriction sites shown in FIG.

【００８５】 すべてのプラスミドの同一性を、制限解析およびＤＮＡ配列決定により確認し
た。The identity of all plasmids was confirmed by restriction analysis and DNA sequencing.

【００８６】 （タンパク質精製） タンパク質合成の誘導、選択的抽出、可溶化および封入体からの精製は、ラッ
トＣＮＴＦおよびヒトＣＮＴＦについて記載された（Ｍａｓｉａｋｏｗｓｋｉら
、１９９１，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．５７：１００３〜１０１２および１９９１
年４月４日公開された国際出願番号ＷＯ９１／０４３１６）。ただし、イオン交
換クロマトグラフィーにかわって、または追加してゲル濾過を時に用いた。ある
いは、タンパク質を、他のタンパク質について記載（Ｐａｎａｙｏｔａｔｏｓら
、１９８９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１５０６６〜１５０６９）のよ
うに、ストレプトマイシンおよび硫酸アンモニウム分画、続いてカラムクロマト
グラフィーにより細胞溶解産物の上清から精製した。すべてのタンパク質を、少
なくとも６０％の純度まで単離した。Protein Purification Induction of protein synthesis, selective extraction, solubilization and purification from inclusion bodies has been described for rat CNTF and human CNTF (Masiakowski et al. 1991, J. Neurosci. 57: 1003-1012). And 1991
International application number WO91 / 04316, published April 4, 2012). However, gel filtration was sometimes used in place of or in addition to ion exchange chromatography. Alternatively, the protein is treated with streptomycin and ammonium sulphate fractions, followed by column chromatography and supernatant of cell lysates as described for other proteins (Panayotatos et al., 1989, J. Biol. Chem. 264: 15066-15069). Purified from. All proteins were isolated to a purity of at least 60%.

【００８７】 酵素反応、ＤＮＡ電気泳動、およびこれらの研究で用いられる他の技術につい
ての条件は、詳細に記載されている（Ｐａｎａｙｏｔａｔｏｓ，Ｎ．１９８７，
Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
Ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄｓ：Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏ
ａｃｈ（Ｈａｒｄｙ，Ｋ．Ｇ．編）１６３〜１７６頁、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏ
ｘｆｏｒｄ，Ｕ．Ｋ．）。Conditions for enzymatic reactions, DNA electrophoresis, and other techniques used in these studies have been described in detail (Panayotatos, N. 1987,
Engineering an Efficient Expression
System in Plastics: A practical Appro
ach (Hardy, KG, ed.) 163-176, IRL Press, O.
xford, U.S.A. K. ).

【００８８】 （結果） 還元ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにおけるヒト、ラットおよびいくつかの
キメラＣＮＴＦ分子の移動度を、図２に示す。キメラ分子ＲＰＮ１８６、ＲＰＮ
１８９、ＲＰＮ２１８およびＲＰＮ２２８は、ラットＣＮＴＦに匹敵する移動度
を示し、一方、ＲＰＮ１８７、ＲＰＮ１８８、ＲＰＮ１９２およびＲＰＮ２２２
は、ヒトＣＮＴＦに匹敵する移動度を示す。図１におけるこれらのタンパク質の
整列配列に対するこれらの結果の相互参照は、６３位（Ｒ６３）でアルギニン残
基を保有するすべてのタンパク質がラットＣＮＴＦの移動度を示すことを明らか
にする。ＲＰＮ２２８の場合、この単一アミノ酸置換（Ｑ６３−＞Ｒ）は、ヒト
ＣＮＴＦに対してラットＣＮＴＦの正常な移動度を与えるのに十分である。Results The mobilities of human, rat and some chimeric CNTF molecules on reducing SDS-polyacrylamide gels are shown in FIG. Chimeric molecule RPN186, RPN
189, RPN218 and RPN228 exhibit mobilities comparable to rat CNTF, while RPN187, RPN188, RPN192 and RPN222.
Indicates a mobility comparable to human CNTF. A cross-reference of these results to the aligned sequences of these proteins in Figure 1 reveals that all proteins harboring an arginine residue at position 63 (R63) show the mobility of rat CNTF. In the case of RPN228, this single amino acid substitution (Q63-> R) is sufficient to confer the normal mobility of rat CNTF relative to human CNTF.

【００８９】 図２はまた、異なる組換えタンパク質の純度測定を提供する。視覚的検査によ
り、純度は、ＲＰＮ１８９についての６０％からＲＰＮ２２８についての９０％
より良好まで変化する。FIG. 2 also provides a purity measure for different recombinant proteins. By visual inspection, the purity is 60% for RPN189 to 90% for RPN228.
Change to better.

【００９０】 （実施例２−改変ＣＮＴＦ分子の結合活性の測定） （材料および方法） （¹²⁵Ｉ−ＣＮＴＦの調製） ３７μｌの０．２Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ８．５中の組換えのラット
ＣＮＴＦ（２８μｇ）を、窒素の穏やかな流れのもとで乾燥された４ｍＣｉ（２
，０００Ｃｉ／ｍｍｏｌｅ；ＮＥＮ）の¹²⁵Ｉおよび試薬（Ｂｏｌｔｏｎおよび
Ｈｕｎｔｅｒ，１９７３，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．１３３：５２９〜５３９）を含
有するバイアルに移した。反応物を、０℃で４５分間、続いて室温で１５分間イ
ンキュベートし、そして３０ｍｌの０．２Ｍグリシン溶液の添加により停止した
。１５分後、０．０８％ゼラチンを含む０．２ｍｌ ＰＢＳをまた添加し、そし
てこの混合物をＳｕｐｅｒｄｅｘ−７５カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を通過さ
せ、二量体誘導体および他の多量体誘導体から標識単量体ＣＮＴＦを分離した。
組み込みのパーセンテージは、代表的には、薄層クロマトグラフィーにより決定
されたように２０％であり、そして比活性は、代表的には約１，０００Ｃｉ／ｍ
ｍｏｌｅであった。単量体¹²⁵Ｉ−ＣＮＴＦを、４℃で貯蔵し、そして調製後１
週間までに使い切った。構造的整合性および立体配置的な整合性の試験として、 ¹²⁵ Ｉ−ＣＮＴＦ（およそ、１０，０００ｃｐｍ）を５μｇの未標識のＣＮＴＦ
と混合し、そして未変性のゲル電気泳動により分析した。１つの主要なバンドが
クマシー染色またはオートラジオグラフィーのいずれかによって見られた。¹²⁵
Ｉ−ＣＮＴＦはまた、培養物中のＥ８ニワトリ毛様体（ｃｈｉｃｋ ｃｉｌｉａ
ｒｙ）ニューロンの生存の支持の際に、天然のＣＮＴＦと匹敵する活性を示した
。[0090]   (Example 2-Measurement of binding activity of modified CNTF molecule)   (Materials and methods)   (¹²⁵Preparation of I-CNTF)   Recombinant rat in 37 μl 0.2 M sodium borate buffer, pH 8.5
CNTF (28 μg) was dried with 4 mCi (2 mg) dried under a gentle stream of nitrogen.
, 1,000 Ci / mmole; NEN)¹²⁵I and reagents (Bolton and
Hunter, 1973, Biochem J. et al. 133: 529-539)
Transferred to a vial with. The reaction was incubated at 0 ° C for 45 minutes, then at room temperature for 15 minutes.
Incubated and stopped by addition of 30 ml of 0.2 M glycine solution
. After 15 minutes, 0.2 ml PBS containing 0.08% gelatin was also added, and
The leverage mixture was passed through a Superdex-75 column (Pharmacia).
The labeled monomer CNTF was separated from the dimer derivative and other multimeric derivatives.
Percentage of incorporation is typically determined by thin layer chromatography
20%, and the specific activity is typically about 1,000 Ci / m 2.
It was a mole. Monomer¹²⁵Store I-CNTF at 4 ° C. and prepare 1
Used up by week. As a test of structural integrity and conformational integrity, ¹²⁵ I-CNTF (approximately 10,000 cpm) was added to 5 μg of unlabeled CNTF.
Were mixed and analyzed by native gel electrophoresis. One major band
Seen by either Coomassie staining or autoradiography.¹²⁵
I-CNTF also induces E8 chicken ciliates in culture.
ry) showed activity comparable to native CNTF in supporting survival of neurons
.

【００９１】 （組織培養技術） 新生仔ラット由来の上頸神経節（ＳＣＧ）を、トリプシン（０．１％）で処理
し、機械的に分離し、そしてポリ−オルニチン（３０μｇ／ｍｌ）基層に置いた
。増殖培地は、１０％の熱不活化ウシ胎仔血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）含有Ｈａｍ’
ｓ栄養混合物Ｆ１２、神経増殖因子（ＮＧＦ）（１００ｎｇ／ｍｌ）、ペニシリ
ン（５０Ｕ／ｍｌ）およびストレプトマイシン（５０μｇ／ｍｌ）から構成され
た。培養物を、加湿した９５％空気／５％ＣＯ₂雰囲気下、３７℃で維持した。
神経節の非ニューロン細胞を培養の第１および３日目にａｒａＣ（１０μＭ）で
の処理により取り除いた。培養物を、３回／１週フィードし（ｆｅｅｄ）、そし
て２週間以内に結合アッセイに慣用的に用いた。Tissue Culture Techniques Superior cervical ganglia (SCG) from neonatal rats were treated with trypsin (0.1%), mechanically dissociated and poly-ornithine (30 μg / ml) substratum. placed. The growth medium was Ham 'containing 10% heat-inactivated fetal bovine serum (Hyclone).
s nutrient mixture F12, nerve growth factor (NGF) (100 ng / ml), penicillin (50 U / ml) and streptomycin (50 μg / ml). Cultures were maintained at 37 ° C. in a humidified 95% air / 5% CO ₂ atmosphere.
Non-neuronal cells of the ganglion were removed by treatment with araC (10 μM) on days 1 and 3 of culture. Cultures were fed 3 times / 1 week and routinely used for binding assays within 2 weeks.

【００９２】 ＭＧ８７／ＣＮＴＦＲは、ヒトＣＮＴＦαレセプター遺伝子で形質転換した線
維芽細胞株である（Ｓｑｕｉｎｔｏら，１９９０，Ｎｅｕｒｏｎ ５：７５７〜
７６６；Ｄａｖｉｓら，１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５３：５９〜６３）。MG87 / CNTFR is a fibroblast cell line transformed with the human CNTFα receptor gene (Squinto et al., 1990, Neuron 5: 757-.
766; Davis et al., 1991, Science 253: 59-63).

【００９３】 （結合アッセイ） 結合を、細胞単層で直接実施した。培養ウェル中の細胞を、リン酸緩衝化生理
食塩水（ＰＢＳ；ｐＨ７．４）、０．１ｍＭバシトラシン、１ｍＭ ＰＭＳＦ、
１μｇ／ｍｌロイペプチンおよび１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡからなるアッセイ緩衝液
で１回洗浄した。室温での２時間の¹²⁵Ｉ−ＣＮＴＦとのインキュベーションの
後、細胞をアッセイ緩衝液で２回すばやく洗浄し、１％ＳＤＳ含有ＰＢＳで溶解
し、そしてＰａｃｋａｒｄ Ｇａｍｍａ Ｃｏｕｎｔｅｒ中で計数した。非特異
的結合を１，０００倍過剰の未標識のＣＮＴＦの存在下で決定した。ＭＧ８７／
ＣＮＴＦＲへの特異的結合は、８０〜９０％であった。データは、ＧＲＡＰＨＰ
ＡＤプログラム（ＩＳＩ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）を用いて解析した
。Binding Assay Binding was performed directly on cell monolayers. The cells in the culture well were treated with phosphate buffered saline (PBS; pH 7.4), 0.1 mM bacitracin, 1 mM PMSF,
The cells were washed once with an assay buffer containing 1 μg / ml leupeptin and 1 mg / ml BSA. After incubation with ¹²⁵ I-CNTF for 2 hours at room temperature, cells were quickly washed twice with assay buffer, lysed with PBS containing 1% SDS and counted in a Packard Gamma Counter. Non-specific binding was determined in the presence of a 1,000-fold excess of unlabeled CNTF. MG87 /
Specific binding to CNTFR was 80-90%. The data is GRAPPHP
Analysis was performed using the AD program (ISI, Philadelphia, PA).

【００９４】 （結果） ラットＳＣＧニューロンへの結合についての¹²⁵Ｉ−ラットＣＮＴＦに対する
精製組換えヒト、ラットおよびＣＮＴＦ ＲＰＮ２１９の競合カーブを図４ａに
示す。ラットＣＮＴＦおよびヒトＣＮＴＦの両方は、ＳＣＧ神経細胞への結合に
ついて¹²⁵Ｉ−ラットＣＮＴＦと競合するが、ヒトＣＮＴＦ（ＩＣ５０＝２５ｎ
Ｍ）は、未標識ラットＣＮＴＦ（ＩＣ５０＝０．２８ｎＭ）よりも¹²⁵Ｉ−ラッ
トＣＮＴＦ結合への置換が９０倍弱い。対照的に、ＲＰＮ２１９は、ラットＣＮ
ＴＦとほぼ同等に強力であり、そしてヒトＣＮＴＦより明確により強力である（
ＩＣ５０＝０．３ｎＭ）。Results The competition curves of purified recombinant human, rat and CNTF RPN219 against ¹²⁵ I-rat CNTF for binding to rat SCG neurons are shown in Figure 4a. Both rat CNTF and human CNTF compete with ¹²⁵ I-rat CNTF for binding to SCG neurons, while human CNTF (IC50 = 25n
M) has 90-fold less displacement to ¹²⁵ I-rat CNTF binding than unlabeled rat CNTF (IC50 = 0.28 nM). In contrast, RPN219
It is nearly as potent as TF and clearly more potent than human CNTF (
IC50 = 0.3 nM).

【００９５】 同様の結果を、ヒトＣＮＴＦレセプターの発現を指向するプラスミドで形質転
換されたマウス線維芽細胞を用いた競合実験から得た（図４ｂ）。ラット、ヒト
およびＲＰＮ２２８の両方は、ＭＧ８７／ＣＮＴＦＲ細胞への結合について¹²⁵
Ｉ−ラットＣＮＴＦと競合する。ヒトＣＮＴＦ（ＩＣ５０＝３０ｎＭ）は、ラッ
トＣＮＴＦ（ＩＣ５０＝２.８ｎＭ）よりも１２倍弱いが、一方、ＲＰＮ２２８
は、ヒトタンパク質よりも明白により強力である（ＩＣ５０＝５．６ｎＭ）。Similar results were obtained from a competition experiment with mouse fibroblasts transformed with a plasmid that directs expression of the human CNTF receptor (FIG. 4b). Both rat, human and RPN228 are ¹²⁵ for binding to MG87 / CNTFR cells.
Competes with I-rat CNTF. Human CNTF (IC50 = 30 nM) is 12 times weaker than rat CNTF (IC50 = 2.8 nM), while RPN228
Is clearly more potent than the human protein (IC50 = 5.6 nM).

【００９６】 図１に示された他の改変ＣＮＴＦタンパク質を用いた競合結合実験はまた、Ｒ
６３を有するタンパク質がラットＣＮＴＦの生物学的活性を示し、一方、Ｑ６３
を有するタンパク質がヒトＣＮＴＦの結合特性を示したことを実証する（データ
示さず）。これらの結果は、単一アミノ酸置換（Ｑ６３−＞Ｒ）がヒトＣＮＴＦ
に対して、ラットＣＮＴＦの特徴であるレセプター結合特性を与えるのに十分で
あることを示す。Competitive binding experiments with other modified CNTF proteins shown in FIG.
The protein with 63 exhibits the biological activity of rat CNTF, while Q63
Demonstrate that the protein with s displayed the binding properties of human CNTF (data not shown). These results indicate that a single amino acid substitution (Q63-> R) was associated with human CNTF.
, Is sufficient to confer the receptor binding properties characteristic of rat CNTF.

【００９７】 （実施例３−改変ＣＮＴＦ分子の生物学的活性の測定） （材料および方法） 組換えＣＮＴＦを、記載されているように（Ｍａｓｉａｋｏｗｓｋｉら、１９
９１，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．５７：１００３〜１０１２および１９９１年４月
４日公開、国際公開番号 ＷＯ９１／０４３１６）、ニワトリ毛様体神経節（Ｃ
Ｇ）ニューロンの分離培養においてアッセイした。ただし、生存細胞はＭＴＴで
染色した（Ｍｏｓｍａｎｎ，Ｔ．１９８３；Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ ６５：５５〜６３）。Example 3-Measurement of Biological Activity of Modified CNTF Molecules Materials and Methods Recombinant CNTF was prepared as described (Masiakowski et al., 19).
91, J. Neurosci. 57: 1003-1012 and published April 4, 1991, International Publication No. WO91 / 04316), chicken ciliary ganglion (C
G) Assayed in separate cultures of neurons. However, viable cells were stained with MTT (Mosmann, T. 1983; J. Immunol. Method).
s 65: 55-63).

【００９８】 （結果） 図３は、精製した組換えヒト、ラットおよび改変ＣＮＴＦタンパク質ＲＰＮ２
１９およびＰＲＮ２２８についてのＥ８ニワトリ胚毛様体神経節の分離され、ニ
ューロン富化された培養物の用量反応曲線を示す。このアッセイにより、キメラ
タンパク質の生物学的活性は、精製組換えラットＣＮＴＦの活性と識別不能であ
り、そして組換えヒトＣＮＴＦの活性より明白に高い。図３の用量反応曲線の比
較はまた、ＲＰＮ２１９、ＲＰＮ２２８またはラットＣＮＴＦで得られた生存ニ
ューロンの最大レベルが、ヒトＣＮＴＦで得られたレベルより高いことを示す。
これらの結果は、ラットＣＮＴＦのようにＲＰＮ２１９およびＲＰＮ２２８がヒ
トＣＮＴＦよりもニューロンのより大きい集団に対して活性であることを示唆す
る。平行した実験において、図１に示される他の改変ＣＮＴＦタンパク質の生物
学的活性を試験した。どの場合においても、置換（Ｑ６３→Ｒ）を保有する改変
ＣＮＴＦタンパク質は、ラットＣＮＴＦの生物学的活性を示し、一方、Ｑ６３を
有するタンパク質は、ヒトＣＮＴＦの活性を示した（データ示さず）。Results FIG. 3 shows purified recombinant human, rat and modified CNTF protein RPN2.
Figure 3 shows a dose response curve of isolated, neuron-enriched cultures of E8 chicken embryo ciliary ganglia for 19 and PRN228. By this assay, the biological activity of the chimeric protein is indistinguishable from that of purified recombinant rat CNTF and is clearly higher than that of recombinant human CNTF. The comparison of the dose response curves in Figure 3 also shows that the maximum level of surviving neurons obtained with RPN219, RPN228 or rat CNTF is higher than that obtained with human CNTF.
These results suggest that RPN219 and RPN228, like rat CNTF, are more active against a larger population of neurons than human CNTF. In a parallel experiment, the biological activity of the other modified CNTF proteins shown in Figure 1 was tested. In all cases, the modified CNTF protein carrying the substitution (Q63 → R) showed the biological activity of rat CNTF, while the protein with Q63 showed the activity of human CNTF (data not shown).

【００９９】 全般に、これらの結果は、単一のアミノ酸置換（Ｑ６３→Ｒ）がヒトＣＮＴＦ
にラットＣＮＴＦの生物学的活性を与えるのに十分であることを示す。Overall, these results indicate that a single amino acid substitution (Q63 → R) is associated with human CNTF.
Is sufficient to confer the biological activity of rat CNTF.

【０１００】 （実施例４：光誘導性光受容器損傷を防ぐ改変ＣＮＴＦの使用） Ｆ３４４またはＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ系統のいずれかのアルビノラッ
トを２〜５月齢で用いた。このラットを定常光に曝露する前、９日以上、周期的
な光環境（２５ｆｔ−ｃ未満のケージ内照度で、１２時間オン：１２時間オフ）
において維持した。このラットをケージの床上６０ｃｍに吊るした白色反射板で
２つの４０ワットＧｅｎｅｒａｌ Ｅｌｅｃｔｒｉｃ「ｃｏｏｌ−ｗｈｉｔｅ」
蛍光電球により提供される１１５〜２００ｆｔ−ｃの照度レベル（ほとんどのラ
ットは１２５〜１７０ｆｔ−ｃを受けた）で定常光に１〜２週間曝露した。光曝
露の間、ラットをステンレススチールワイヤーバーカバーを備える透明なポリカ
ーボネートケージに維持した。Example 4 Use of Modified CNTF to Prevent Photoinduced Photoreceptor Injury Albino rats of either F344 or Sprague-Dawley strains were used at 2-5 months of age. Periodic light environment for 9 days or more (12 hours on: 12 hours off with an in-cage illuminance of less than 25 ft-c) before exposing this rat to constant light.
Maintained at. Two 40 watt General Electric "cool-white" white rattles hung from the rat 60 cm above the floor of the cage.
Exposure to ambient light for 1-2 weeks at an illumination level of 115-200 ft-c provided by a fluorescent bulb (most rats received 125-170 ft-c). Rats were maintained in clear polycarbonate cages with stainless steel wire bar covers during light exposure.

【０１０１】 定常光曝露の２日前、ケタミン−キシラジン混合物で麻酔したラットに１μｌ
のラットＣＮＴＦ、ヒトＣＮＴＦまたは改変ＣＮＴＦ［ｈＣＮＴＦ（Ｑ６３→Ｒ
）］（０．１〜５００ｎｇ／μｌの濃度でリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）に
溶解している）を硝子体内に注射した。この注射は、眼の鋸状縁と赤道との間の
ほぼ中心経路の強膜、脈絡膜および網膜を通じた３２ゲージの針の挿入を用いて
行った。全ての場合、注射は、眼の上位半球に行った。Two days before constant light exposure, 1 μl for rats anesthetized with ketamine-xylazine mixture.
Rat CNTF, human CNTF or modified CNTF [hCNTF (Q63 → R
)] (Dissolved in phosphate buffered saline (PBS) at a concentration of 0.1-500 ng / μl) was injected intravitreally. This injection was done using a 32-gauge needle insertion through the sclera, choroid and retina in an approximately central pathway between the serrated edge of the eye and the equator. In all cases, injections were made in the upper hemisphere of the eye.

【０１０２】 定常光の曝露直後、そのラットを二酸化炭素の過剰投与により屠殺し、直後に
混合アルデヒドを血管灌流した。眼を眼の垂直経線にそった全網膜の切片を提供
するための１μｍの厚さに切片化するためにエポキシリジンに埋め込んだ。光誘
導性網膜変性の程度を、０〜４＋の病理学スケールのレスキューによる光受容体
レスキューの程度を評価することにより定量した（ここで４＋は、最大レスキュ
ーであり、そしてほとんど正常な網膜整合性である）。同じラットにおけるコン
トロールの眼との比較に基づいて、それぞれの切片における光受容体レスキュー
の程度を、４人の個人によりスコアづけした。この方法は、ＯＮＬの厚さだけで
なく光受容器内側および外側セグメントに対するよりわずかな変性的変化ならび
に眼の内部における空間的な変性性勾配を考慮する利点を有する。３つの眼を、
用量反応曲線を生成するために、それぞれの時間点について試験した。Immediately after exposure to constant light, the rats were sacrificed by overdosing of carbon dioxide, immediately followed by vascular perfusion with mixed aldehydes. The eyes were embedded in epoxylysine for sectioning to a thickness of 1 μm to provide sections of the whole retina along the vertical meridian of the eye. The extent of light-induced retinal degeneration was quantified by assessing the extent of photoreceptor rescue by rescue on a 0-4 + pathology scale, where 4+ is maximal rescue and almost normal retinal integrity. Is). The extent of photoreceptor rescue in each section was scored by 4 individuals based on comparison to control eyes in the same rat. This method has the advantage of considering not only the thickness of the ONL but also smaller degenerative changes to the photoreceptor inner and outer segments as well as spatial degenerative gradients inside the eye. Three eyes,
Each time point was tested to generate a dose response curve.

【０１０３】 （結果） レスキューの程度を、ヒト、ラットおよびｈＣＮＴＦ（Ｑ６３→Ｒ）について
測定した。このデータは、ラットおよびｈＣＮＴＦ（Ｑ６３→Ｒ）の両方が組換
えヒトＣＮＴＦがレスキューする能力よりも、光損傷モデルにおいて光受容体を
レスキューする能力が１０倍大きいことを示した。Results The extent of rescue was measured for human, rat and hCNTF (Q63 → R). This data showed that both rat and hCNTF (Q63 → R) were 10-fold more capable of rescue photoreceptors in the photodamage model than recombinant human CNTF was rescued.

【０１０４】 好ましい特定の実施形態と組み合わせて、本発明が上記で記載されるが、その
詳細な説明および実施例は、例証を意図し、そして添付の請求の範囲の範囲によ
り規定される本発明の範囲を制限しないことが理解される。While the invention has been described above in combination with specific preferred embodiments, its detailed description and examples are intended to be illustrative and are defined by the scope of the appended claims. It is understood that the range of is not limited.

【０１０５】 （実施例５） （材料と方法） 組換えヒトＣＮＴＦ改変体を、以前に記載（Ｍａｓｉａｋｏｗｓｋｉら、１９
９１，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．５７：１００３〜１０１２および１９９１年４月
４日公開、国際公開番号ＷＯ９１／０４３１６；Ｐａｎａｙｏｔａｔｏｓら、１
９９３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１９０００〜１９００３）のように
、遺伝子的に操作し、Ｅ．ｃｏｌｉ内で発現し、そして９０％より大きい純度で
回収した。Example 5 Materials and Methods Recombinant human CNTF variants have been previously described (Masiakowski et al., 19).
91, J. Neurosci. 57: 1003-1012 and published April 4, 1991, International Publication No. WO 91/04316; Panayotatos et al., 1
993, J. Biol. Chem. 268: 190000-19003) and genetically engineered into E. It was expressed in E. coli and recovered in greater than 90% purity.

【０１０６】 以下の保存溶液を５℃でＰＢＳ中に新鮮に調製した。 ｒＨＣＮＴＦ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・０．５ｍｇ／ｍｌ ＲＧ１６０（ｒＨＣＮＴＦ、ΔＣ１３）・・・・・・・・０．５ｍｇ／ｍｌ ＲＧ１６２（ｒＨＣＮＴＦ、１７ＣＡ、ΔＣ１３）・・・０．５ｍｇ／ｍｌ ＲＧ２９０（ｒＨＣＮＴＦ、６３ＱＲ、ΔＣ１３）・・・１．２ｍｇ／ｍｌ ＲＧ２９７（ｒＨＣＮＴＦ、１７ＣＡ、６３ＱＲ、ΔＣ１３）０．４ｍｇ／ｍｌ
。The following stock solutions were prepared fresh in PBS at 5 ° C. 0.5 mg / ml RG160 (rHCNTF, ΔC13) 0.5 mg / ml RG162 (rHCNTF, 17CA) , ΔC13) ... 0.5 mg / ml RG290 (rHCNTF, 63QR, ΔC13) ... 1.2 mg / ml RG297 (rHCNTF, 17CA, 63QR, ΔC13) 0.4 mg / ml
.

【０１０７】 ３７℃での生理学的緩衝液におけるｒＨＣＮＴＦおよびいくつかの誘導体の安
定性を決定するために、保存溶液を５℃でＰＢＳに対して徹底的に透析し、０．
１ｍｇ／ｍｌまでＰＢＳで希釈し、そして濾過により滅菌した。アリコート（０
．２ｍｌ）を、０．５ｍｌ容積のポリプロピレン遠心チューブに移した。このチ
ューブを３７℃のインキュベーターに入れ、そして指示された時間で個々のチュ
ーブを取りだし、そして室温で３分間１５，０００ｒｐｍで遠心し不溶性の沈査
から可溶性のタンパク質を分離した。上清をピペットでとり、２×タンパク質ゲ
ルサンプル緩衝液の等量を含有するきれいなチューブに入れ、２分間、８５℃の
水槽に置き、混合し、そして１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析まで−２０℃で
保管した。ペレットを水の１／１０のもとの容量に再懸濁し、２×タンパク質ゲ
ルサンプル緩衝液の等量と混合し、そして上記のように処理した。To determine the stability of rHCNTF and some derivatives in physiological buffer at 37 ° C., the stock solution was exhaustively dialyzed against PBS at 5 ° C.
Diluted with PBS to 1 mg / ml and sterilized by filtration. Aliquot (0
． 2 ml) was transferred to a polypropylene centrifuge tube with a volume of 0.5 ml. The tubes were placed in a 37 ° C. incubator, and individual tubes were removed at the times indicated and centrifuged at 15,000 rpm for 3 minutes at room temperature to separate soluble proteins from insoluble precipitates. The supernatant is pipetted into a clean tube containing an equal volume of 2x protein gel sample buffer, placed in an 85 ° C water bath for 2 minutes, mixed and -20 ° C until analysis by 15% SDS-PAGE. Stored in. The pellet was resuspended in the original volume of 1/10 of water, mixed with an equal volume of 2x protein gel sample buffer and treated as above.

【０１０８】 Ｅ８ニワトリ毛様体ニューロンでの生物学的活性のアッセイのため、およびタ
ンパク質ゲル電気泳動のための方法を記載している（Ｍａｓｉａｋｏｗｓｋｉら
、１９９１，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．５７：１００３〜１０１２および１９９１
年４月４日公開、国際公開番号ＷＯ９１／０４３１６；Ｐａｎａｙｏｔａｔｏｓ
ら、１９９３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１９０００〜１９００３）。
タンパク質ゲルサンプル緩衝液（２×）は、１２．５ｍｌのＴｒｉｓＨＣｌ、ｐ
Ｈ６．８−２０ｍｌ グリセロール−４０ｍｌの１０％ＳＤＳおよび５ｍｇのブ
ロモフェノールブルー（１００ｍｌあたり）からなる。Methods for assaying biological activity in E8 chicken ciliary neurons and for protein gel electrophoresis have been described (Masiakowski et al., 1991, J. Neurosci. 57: 1003-1012 and 1991
Published April 4, 2012, International Publication Number WO91 / 04316; Panayotos
1993, J. et al. Biol. Chem. 268: 19000-19003).
Protein gel sample buffer (2x) contains 12.5 ml TrisHCl, p
H 6.8-20 ml Glycerol-40 ml consisting of 10% SDS and 5 mg bromophenol blue (per 100 ml).

【０１０９】 （結果） ｒＨＣＮＴＦの溶解度は、中性のｐＨで生理学的緩衝液においてとくに制限さ
れる。さらに、広いｐＨ範囲（４．５〜８．０）にわたる溶解度は、温度および
インキュベーション時間に強く依存する。５℃で、ＰＢＳにおけるｒＨＣＮＴＦ
の溶解度は、１．４ｍｇ／ｍｌであり、そしてタンパク質は２〜３時間溶液中に
存在する。ｒＨＣＮＴＦの制限された溶解度と明白に対照的に、改変ｒＨＣＮＴ
Ｆ、ΔＣ１３は、５℃で少なくとも１２ｍｇ／ｍｌに濃縮され得る。しかし、こ
のより大きい溶解度にかかわらず、ｒＨＣＮＴＦ、ΔＣ１３はなお、生理学的な
緩衝液、ｐＨおよび温度条件において強い不安定性を示す。３７℃でのインキュ
ベーションの際に、ｒＨＣＮＴＦ、ΔＣ１３は、最初の濃度に依存する速度で溶
液から析出する。Results The solubility of rHCNTF is particularly limited in physiological buffer at neutral pH. Furthermore, the solubility over a wide pH range (4.5-8.0) is strongly dependent on temperature and incubation time. RHCNTF in PBS at 5 ° C
Has a solubility of 1.4 mg / ml and the protein is in solution for 2-3 hours. In distinct contrast to the limited solubility of rHCNTF, modified rHCNTF
F, ΔC13 can be concentrated to at least 12 mg / ml at 5 ° C. However, despite this greater solubility, rHCNTF, ΔC13, still exhibits strong instability in physiological buffer, pH and temperature conditions. Upon incubation at 37 ° C., rHCNTF, ΔC13 precipitates out of solution at a rate that depends on the initial concentration.

【０１１０】 この不安定性の原因を決定するために、本発明者らは、平行実験において、ｒ
ＨＣＮＴＦおよびいくつかの改変体の物理的完全性を分析した。図５は、生理的
緩衝液中での、３７℃、０、２、７および１４日間のｒＨＣＮＴＦのインキュベ
ーション（それぞれ、レーン１〜４）が、上清由来のタンパク質の進行性の消失
を引き起こし、ペレットにおいて、同時の進行性の出現を伴うことを示す。さら
に、ペレット中の良好な割合のｒＨＣＮＴＦが、二量体ｒＨＣＮＴＦの大きさに
対応する４８ｋＤの種として現れた（図５、二重矢印）。より長いインキュベー
ション時間で、少ない割合のより高次の凝集体もまた、明らかになった。しかし
、同じサンプルを同じ型のゲル上ではあるが、ジスルフィド還元剤の存在下で分
析した場合、４８ｋＤの種は、単量体ｒＨＣＮＴＦに転換され、このことは、４
８ｋＤの種が、ジスルフィド結合によって共有結合的に結合するｒＨＣＮＴＦの
二量体を表すことを証明する。このような二量体は、ｒＨＣＮＴＦの唯一のシス
テイン残基を介して形成することが予期された。従って、これらの結果は、３７
℃でのｒＨＣＮＴＦの不安定性が、分子間ジスルフィド結合の形成によって引き
起こされる凝集によって生じることを示した。In order to determine the cause of this instability, we performed r in parallel experiments.
The physical integrity of HCNTF and some variants was analyzed. FIG. 5 shows that incubation of rHCNTF in physiological buffer at 37 ° C. for 0, 2, 7 and 14 days (lanes 1 to 4 respectively) caused a progressive loss of protein from the supernatant, Shown in pellets with simultaneous progressive appearance. Furthermore, a good proportion of rHCNTF in the pellet appeared as a 48 kD species corresponding to the size of the dimeric rHCNTF (Fig. 5, double arrow). At longer incubation times, a smaller proportion of higher order aggregates was also revealed. However, when the same sample was analyzed on the same type of gel but in the presence of a disulfide reducing agent, the 48 kD species was converted to monomeric rHCNTF, which indicated that
We demonstrate that the 8 kD species represents a dimer of rHCNTF bound covalently by a disulfide bond. Such dimers were expected to form via the unique cysteine residue of rHCNTF. Therefore, these results are 37
We have shown that rHCNTF instability at 0 C is caused by aggregation caused by the formation of intermolecular disulfide bonds.

【０１１１】 同様の結果を、２つのｒＨＣＮＴＦ改変体、ｒＨＣＮＴＦ，ΔＣ１３、および
ｒＨＣＮＴＦ，６３ＱＲ，ΔＣ１３を用いて得た（ｒＨＣＮＴＦ，ΔＣ１３の場
合で、ペレット中の不溶性凝集体の出現が幾分遅かったことを除く）（図５）。
ΔＣ１３欠失がｒＨＣＮＴＦに生理的緩衝液中でのより高い可溶性を与えるとい
う事実を考慮すると、ｒＨＣＮＴＦ，ΔＣ１３の改善された安定性は、おそらく
、そのより高い可溶性の間接的な結果である。Similar results were obtained with two rHCNTF variants, rHCNTF, ΔC13, and rHCNTF, 63QR, ΔC13 (in the case of rHCNTF, ΔC13, the appearance of insoluble aggregates in the pellet was somewhat slower). Except that) (Fig. 5).
Considering the fact that the ΔC13 deletion confers rHCNTF to higher solubility in physiological buffer, the improved stability of rHCNTF, ΔC13 is probably an indirect result of its higher solubility.

【０１１２】 ３７℃でのｒＨＣＮＴＦの不安定性が、分子間ジスルフィド結合の形成により
引き起こされる凝集によリ生じるという可能性をさらに試験するために、１７位
の唯一のシステイン残基を、確立された遺伝子操作方法論を使用して、アラニン
に置換した。このプロセスによって生成された、２つのｒＨＣＮＴＦ改変体、ｒ
ＨＣＮＴＦ，１７ＣＡ，ΔＣ１３およびｒＨＣＮＴＦ，１７ＣＡ，６３ＱＲ，Δ
Ｃ１３を、非還元的な１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる同じ分析に供した。図５は
、３７℃で１４日間のインキュベーション後でさえ、両方のタンパク質が、明ら
かな二量体化または凝集体形成を伴なわず、可溶性のままであったことを示す。
ペレット中に見出された少ない割合のタンパク質（それはほとんど、上清の除去
後の遠心管に残存している少量の可溶性タンパク質を示した）においてでさえ、
二量体化がほとんど明らかにならなかった。これらの結果は、ｒＨＣＮＴＦの不
安定性が、分子間ジスルフィド結合の形成によって引き起こされる凝集によって
生じるという結論を確証し、そして他のｒＨＣＮＴＦ改変体（例えば、ＲＧ２９
７）における遊離の−ＳＨ官能基の除去がまた、より高い安定性を生じることを
実証した。To further test the possibility that rHCNTF instability at 37 ° C. was caused by aggregation caused by formation of intermolecular disulfide bonds, a unique cysteine residue at position 17 was established. Alanine was replaced using a genetic engineering methodology. Two rHCNTF variants, r, produced by this process
HCNTF, 17CA, ΔC13 and rHCNTF, 17CA, 63QR, Δ
C13 was subjected to the same analysis by non-reducing 15% SDS-PAGE. Figure 5 shows that even after 14 days of incubation at 37 ° C, both proteins remained soluble with no apparent dimerization or aggregate formation.
Even in the small proportion of protein found in the pellet, which almost showed a small amount of soluble protein remaining in the centrifuge tube after removal of the supernatant,
Little dimerization was revealed. These results confirm the conclusion that instability of rHCNTF is caused by aggregation caused by the formation of intermolecular disulfide bonds, and other rHCNTF variants (eg RG29).
It was demonstrated that removal of the free --SH functional group in 7) also resulted in higher stability.

【０１１３】 ３７℃でのインキュベーション後の溶液中に残存するタンパク質が、依然生物
学的に活性であるか否かを試験するために、サンプルを、ニューロン生存活性に
ついて分析した。図６は、標準の、未処置のストック溶液、ならびに３７℃で７
日間、インキュベーションした４つのｒＨＣＮＴＦ改変体を用いて得られた、ラ
ットＣＮＴＦおよびｒＨＣＮＴＦについてのコントロール濃度の応答曲線を示す
。後者に関して、１７ＣＡ変異を有するタンパク質、ＲＧ２９７およびＲＧ１６
２を、それらの名目上の濃度でアッセイしたが、一方ＲＧ２９０およびＲＧ１６
０は、溶液中に残存するタンパク質の量に対して、それらの濃度を補正した後に
アッセイした。図６は、これらの化合物により提示された濃度応答曲線が、これ
らのタンパク質がそれらの完全な活性形態にあることから予期される曲線である
ことを示す：以前に観察された（Ｐａｎａｙｏｔａｔｏｓ，Ｎ．ら、１９９３、
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１９０００−１９００３）ように、そして図
７に示されるように、ＲＧ１６０およびＲＧ１６２は、実験的誤差内で、ｒＨＣ
ＮＴＦと同じ効力を示すが、６３ＱＲ置換を有するＲＧ２９０およびＲＧ２９７
は、ｒＨＣＮＴＦより４〜５倍高い効力を示す。従って、ｒＨＣＮＴＦおよびそ
の誘導体の３７℃で７日間のインキュベーションは、生物学的活性の損失を生じ
ず、二量体化後の沈殿によるタンパク質の損失のみを生じる。To test whether the proteins remaining in solution after incubation at 37 ° C. were still biologically active, samples were analyzed for neuronal survival activity. Figure 6 shows a standard, untreated stock solution as well as 7 at 37 ° C.
FIG. 6 shows control concentration response curves for rat CNTF and rHCNTF obtained with four rHCNTF variants incubated for days. Regarding the latter, proteins with the 17CA mutation, RG297 and RG16
2 were assayed at their nominal concentrations, while RG290 and RG16
0 was assayed for the amount of protein remaining in solution after correcting their concentration. FIG. 6 shows that the concentration response curves presented by these compounds are the ones expected from these proteins in their fully active form: previously observed (Panayotatos, N. et al. Et al., 1993,
J. Biol. Chem. 268: 19000-19003), and as shown in FIG. 7, RG160 and RG162 are within rHC within experimental error.
RG290 and RG297 show the same potency as NTF, but with 63QR substitution
Shows a 4-5 fold higher potency than rHCNTF. Therefore, incubation of rHCNTF and its derivatives for 7 days at 37 ° C. does not result in loss of biological activity, only loss of protein by precipitation after dimerization.

【０１１４】 （実施例６） （材料および方法） （タンパク質の操作および精製）−以下のｒＨＣＮＴＦ改変体をｒＨＣＮＴＦ
と比較した： ＲＧ２２８（ｒＨＣＮＴＦ，６３ＱＲ）； ＲＧ２９７（ｒＨＣＮＴＦ，１７ＣＡ，６３ＱＲ，ΔＣ１３）； ＲＧ２４２（ｒＨＣＮＴＦ，６３ＱＲ６４ＷＡ）。Example 6 Materials and Methods (Engineering and Purification of Proteins) -The following rHCNTF variants were used as rHCNTF
Compared with: RG228 (rHCNTF, 63QR); RG297 (rHCNTF, 17CA, 63QR, ΔC13); RG242 (rHCNTF, 63QR64WA).

【０１１５】 これらのタンパク質を、ｒＨＣＮＴＦについて記載された方法論（Ｍａｓｉａ
ｋｏｗｓｋｉら、１９９１、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．５７：１００３−１０１２
および１９９１年４月４日に公開された、国際公開番号ＷＯ９１／０４３１６；
Ｐａｎａｙｏｔａｔｏｓら、１９９３、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１９
０００−１９００３）によって、遺伝子的に操作して、Ｅ．ｃｏｌｉ内で発現し
、そして９０％より高い精製度で回収した。These proteins were prepared according to the methodology described for rHCNTF (Massia).
Kowski et al., 1991, J. Am. Neurosci. 57: 1003-1012
And International Publication No. WO 91/04316, published April 4, 1991;
Panayatotos et al., 1993, J. Am. Biol. Chem. 268: 19
000-19003) and genetically engineered into E. Expressed in E. coli and recovered with> 90% purity.

【０１１６】 （生物学的活性アッセイ）−Ｅ８ニワトリ毛様体ニューロンに対する生物学的
活性アッセイの方法が、記載されている（Ｐａｎａｙｏｔａｔｏｓら、１９９３
、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１９０００−１９００３）。Biological Activity Assay-A method of biological activity assay on E8 chicken ciliary neurons has been described (Panayotatos et al., 1993).
J. Biol. Chem. 268: 19000-19003).

【０１１７】 （薬物動態の決定）−ラットを、ｒＨＣＮＴＦ（ｎ＝１）およびＲＧ２４２（
ｎ＝２）を１００μｇ／ｋｇで、ならびにＲＧ２２８（ｎ＝１）を２００μｇ／
ｋｇで、静脈内（ｉ．ｖ．）に注射した。ラットをまた、ｒＨＣＮＴＦ（ｎ＝２
）、ＲＧ２４２（ｎ＝２）およびＲＧ２２８（ｎ＝１）を２００μｇ／ｋｇで、
皮下（ｓ．ｃ．）に注射した。血液試料を、投薬前および投薬後の種々の時点で
収集し、そして血漿を得るために処理した。血漿試料を、げっ歯目血漿のための
ｒＨＣＮＴＦ ＥＬＩＳＡ方法（Ｄ．Ｂ．Ｌａｋｉｎｇｓら、ＤＳＥＲ９３／Ｄ
ＭＡＰ／００６、「Ｄｏｅｓ Ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎａｌｉｔｙ ａｎｄ Ａｂ
ｓｏｌｕｔｅ Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｒＨＣＮＴＦ ｉｎ
ｔｈｅ Ｒａｔ Ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ Ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ Ａｄｍｉｎ
ｉｓｔｒａｔｉｏｎ ａｔ Ｅｉｇｈｔ Ｄｏｅｓ Ｌｅｖｅｌｓ」（Ｐｈｏｅ
ｎｉｘ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｊｅｃｔ Ｎｏ．９２０８４７）
１９９３年１１月１０日）を使用して分析した。(Pharmacokinetic determination) -Rats were treated with rHCNTF (n = 1) and RG242 (
n = 2) at 100 μg / kg and RG228 (n = 1) at 200 μg / kg
It was injected intravenously (iv) in kg. Rats were also treated with rHCNTF (n = 2
), RG242 (n = 2) and RG228 (n = 1) at 200 μg / kg,
It was injected subcutaneously (sc). Blood samples were collected before and at various times post-dose and processed to obtain plasma. Plasma samples were tested for rHCNTF ELISA method for rodent plasma (DB Lakings et al., DSER93 / D).
MAP / 006, "Does Proportionality and Ab
solution Bioavailability of rHCNTF in
the Rat Following Subcutaneous Admin
installation at Eight Does Levels "(Phoe
nix International Project No. 920847)
(November 10, 1993).

【０１１８】 血漿濃度は、非区画技術を使用して評価した。各化合物に対する標準曲線は、
各アッセイプレートについて含まれ、そしてそれを使用して、そのプレート上で
分析した試料に存在するその化合物の量を計算した。このアッセイの感度は、化
合物間で２倍未満まで変化した。Plasma concentrations were evaluated using a non-compartmental technique. The standard curve for each compound is
Included for each assay plate and used to calculate the amount of that compound present in the samples analyzed on that plate. The sensitivity of this assay varied less than 2-fold between compounds.

【０１１９】 （インビボでの効力および毒性の決定）−体重約２２０ｇの雄Ｓｐｒａｇｕｅ
−Ｄａｗｌｅｙラットを、手術前に麻酔した。右坐骨神経を、膝のレベルで切除
し、そして神経の５ｍｍのセグメントを取り出した。偽手術を、各動物の左側で
行った。手術後の朝に開始して、ラットを計量し、そしてビヒクル（ＰＢＳまた
は乳酸／リン酸／マンニトールのいずれか、ｐＨ４．５）、あるいは試験される
ｒＨＣＮＴＦ化合物（０．０１〜１．０ｍｇ／ｋｇの範囲の容量で同じビヒクル
に溶解させた）を投与した。ラットを、１週間の間、毎日計量し、そして注射し
、その時点で、ラットを屠殺して、そしてそのヒラメ筋を解剖して、そして計量
した。各動物の左ヒラメ筋（偽）に対する右ヒラメ筋（除神経した）の湿重量の
比を計算して、除神経により生じた萎縮症の程度および各化合物での処置による
それらの防止を評価した。毒性の評価に関しては、その体重を、ビヒクルで処置
したラットの体重増加のパーセントとして計算した。両方のビヒクル溶液は、萎
縮症および体重増加において同様の結果を生じた。In Vivo Efficacy and Toxicity Determination-Male Sprague weighing approximately 220 g.
-Dawley rats were anesthetized before surgery. The right sciatic nerve was excised at the knee level and a 5 mm segment of nerve was removed. Sham surgery was performed on the left side of each animal. Starting on the morning after surgery, rats are weighed and either vehicle (PBS or lactate / phosphate / mannitol, pH 4.5) or the rHCNTF compound to be tested (0.01-1.0 mg / kg). Dissolved in the same vehicle). Rats were weighed and injected daily for 1 week, at which time the rats were sacrificed and their soleus muscles dissected and weighed. The ratio of the wet weight of the right soleus muscle (denervated) to the left soleus muscle (sham) of each animal was calculated to evaluate the degree of atrophy caused by denervation and their prevention by treatment with each compound. . For assessment of toxicity, body weight was calculated as the percent weight gain of vehicle-treated rats. Both vehicle solutions produced similar results in atrophy and weight gain.

【０１２０】 （結果） （インビトロでの生物学的活性）−ｒＨＣＮＴＦのインビトロでの活性を特徴
付けるために、本発明者らは、原発性の解離したＥ８ニワトリ毛様体ニューロン
の生存の媒介に対するその効果を測定した。漸増濃度の種々のヒトＣＮＴＦ改変
体に対する応答におけるニューロン生存を、図６、７および８に示す。６３ＱＲ
置換を有する改変体ＲＧ２２８（図７）およびＲＧ２９７（図８）は、ｒＨＣＮ
ＴＦより４〜５倍のより高い効力を示したが、改変体ＲＧ２４２は、それが６３
ＱＲ置換を有しているという事実にもかかわらず、ｒＨＣＮＴＦより１０倍弱い
効力を示した。従って、ＣＮＴＦ配列の種々の位置での種々のアミノ酸側鎖の導
入は、インビトロでの原発性ニューロンの生存に対して、非常に異なる効果を有
し、それは、ｒＨＣＮＴＦと比較した、活性の大きな損失〜強い増大まで変化さ
せる。Results (In Vitro Biological Activity) -To characterize the in vitro activity of rHCNTF, we investigated its ability to mediate survival of primary dissociated E8 chicken ciliary neurons. The effect was measured. Neuronal survival in response to increasing concentrations of various human CNTF variants is shown in Figures 6, 7 and 8. 63 QR
Variants RG228 (FIG. 7) and RG297 (FIG. 8) with substitutions were labeled with rHCN.
Although showing 4-5 fold higher potency than TF, variant RG242 showed that
Despite the fact that it has a QR substitution, it showed ten times less potent than rHCNTF. Therefore, the introduction of different amino acid side chains at different positions of the CNTF sequence had a very different effect on the survival of primary neurons in vitro, which resulted in a greater loss of activity compared to rHCNTF. ~ Change to a strong increase.

【０１２１】 （薬物動態）−化合物のセットのインビトロでの生物学的効力を、それらのイ
ンビボでの薬物動態学的効力に相関させる試みの前に、同じ動物モデルでのその
絶対的なバイオアベイラビリティを決定することが有用である。以下に記載の実
験において、静脈内投与後の配置動態、ならびにＲＧ２２８およびＲＧ２４２の
皮下投与後の絶対的なバイオアベイラビリティを決定して、ｒＨＣＮＴＦのそれ
らに対して比較した。Pharmacokinetics-Before attempting to correlate the in vitro biological efficacy of a set of compounds with their in vivo pharmacokinetic efficacy, its absolute bioavailability in the same animal model. It is useful to determine In the experiments described below, the placement kinetics following intravenous administration and the absolute bioavailability following subcutaneous administration of RG228 and RG242 were determined and compared to those of rHCNTF.

【０１２２】 ｒＨＣＮＴＦ、ＲＧ２２８およびＲＧ２４２の静脈内投与後のラットにおける
平均血漿濃度時間プロフィールを、図９に示す。これらは、３つ全ての化合物に
ついて１００μｇ／ｋｇ用量に正規化されている。平均薬物動態パラメーターを
表１に要約する。The mean plasma concentration time profile in rats after intravenous administration of rHCNTF, RG228 and RG242 is shown in FIG. These have been normalized to the 100 μg / kg dose for all three compounds. Mean pharmacokinetic parameters are summarized in Table 1.

【０１２３】 ラットに対する静脈内投与後、ＲＧ２４２は、ｒＨＣＮＴＦおよびＲＧ２２８
よりも幾分速い分布相αを有した。ＲＧ２４２およびＲＧ２２８についての配置
相βは、ｒＨＣＮＴＦのそれよりも速い。従って、ＲＧ２４２は、ｒＨＣＮＴＦ
よりも幾分より迅速に体内に分布され、そして全身循環から排出されるようであ
ったが、ＲＧ２２８は、ｒＨＣＮＴＦと同じ速さで体内に分布され、そして幾分
速く全身循環から排出されるようであった。ＲＧ２４２についての濃度時間曲線
下の領域（ＡＵＣ）は、ｒＨＣＮＴＦのそれに匹敵し、これは、全身のクリアラ
ンス（Ｃｌ_T）が、２つの化合物についてほぼ同じであったことを示す。２倍大
きい領域が、ＲＧ２２８で観察された。しかし、βおよびＡＵＣの両方の関数で
ある、分布の見かけ上の容量（Ｖ_area）は、ＲＧ２２８およびＲＧ２４２の両方
について、ｒＨＣＮＴＦと比較して約２倍小さかった。これは、これらの改変体
があまり広くは分布されていないことを示唆する。これらの推測で使用された限
定数の動物は、これらの値の定量的区別を可能にしなかった。しかし、これらの
結果は、静脈内投与後のＲＧ２２８およびＲＧ２４２の分布ならびに配置動態が
、ｒＨＣＮＴＦのそれらと実質的に異ならないことを明らかに示す。After intravenous administration to rats, RG242 produces rHCNTF and RG228.
It had a distribution phase α that was somewhat faster than. The configuration phase β for RG242 and RG228 is faster than that of rHCNTF. Therefore, RG242 is
RG228 appears to be distributed in the body at the same rate as rHCNTF and to be excreted from the systemic circulation somewhat faster than rHCNTF, although it appeared to be distributed more rapidly to the body and excreted from the systemic circulation. Met. The area under the concentration-time curve for RG242 (AUC) was comparable to that of rHCNTF, indicating that the systemic clearance (Cl _T ) was about the same for the two compounds. A two-fold larger area was observed with RG228. However, the apparent volume of distribution (V _area ), which is a function of both β and AUC, was about 2-fold smaller for both RG228 and RG242 compared to rHCNTF. This suggests that these variants are not very widely distributed. The limited number of animals used in these inferences did not allow quantitative discrimination of these values. However, these results clearly indicate that the distribution and kinetics of placement of RG228 and RG242 after intravenous administration are not substantially different from those of rHCNTF.

【０１２４】 皮下投与後、ＲＧ２２８およびＲＧ２４２は、ｒＨＣＮＴＦと比較して、２〜
３倍長い吸収相（Ｋａ）を有した（図１０および表２）。ＲＧ２４２の配置相は
また、幾分長い。静脈内投与後と比較した、皮下投薬後のＲＧ２４２のより長い
明らかな末端配置相は、静脈内注入後の末端相の不完全な特徴付けに起因され得
る。全体的には、２つの以前の独立した研究において、ｒＨＣＮＴＦの絶対的な
バイオアベイラビリティは、１４．２％（ｎ＝１８）および７．５％（ｎ＝８）
であると見出されたという事実（Ｄ．Ｂ．Ｌａｋｉｎｇｓら、ＤＳＥＲ ９３／
ＤＭＡＰ／００６，「Ｄｏｅｓ Ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎａｌｉｔｙ ａｎｄ Ａ
ｂｓｏｌｕｔｅ Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｒＨＣＮＴＦ ｉｎ
ｔｈｅ Ｒａｔ Ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ Ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ Ａｄｍｉ
ｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ａｔ Ｅｉｇｈｔ Ｄｏｅｓ Ｌｅｖｅｌｓ」（Ｐｈｏ
ｅｎｉｘ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｊｅｃｔ Ｎｏ．９２０８４７
）１９９３年１１月１０日；Ｄ．Ｂ．Ｌａｋｉｎｇｓら、「Ｄｏｅｓ Ｐｒｏｐ
ｏｒｔｉｏｎａｌｉｔｙ ａｎｄ Ａｂｓｏｌｕｔｅ Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉ
ｌｉｔｙ ｏｆ ｒＨＣＮＴＦ Ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ Ｓｕｂｃｕｔａｎ
ｅｏｕｓｌｙ ｔｏ Ｒａｔｓ」、ＡＡＰＳ Ｎｉｎｔｈ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅ
ｅｔｉｎｇ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，１９９４年１１月）を考慮すると、Ｒ
Ｇ２２８の絶対的なバイオアベイラビリティ（１３．７％）およびＲＧ２４２の
絶対的なバイオアベイラビリティ（１０．９％）は、ｒＨＣＮＴＦのそれ（６．
０％）に匹敵した。従って、ｒＨＣＮＴＦ、ＲＧ２２８およびＲＧ２４２のバイ
オアベイラビリティは、実験的誤差内で有意に異ならない。Following subcutaneous administration, RG228 and RG242 show 2-
It had a 3-fold longer absorption phase (Ka) (Figure 10 and Table 2). The configuration phase of RG242 is also somewhat longer. The longer apparent terminal placement phase of RG242 after subcutaneous dosing as compared to after intravenous administration may be due to incomplete characterization of the terminal phase after intravenous infusion. Overall, in two previous independent studies, the absolute bioavailability of rHCNTF was 14.2% (n = 18) and 7.5% (n = 8).
Was found to be (DB Lakings et al., DSER 93 /
DMAP / 006, "Does Proportionality and A
bsolute Bioavailability of rHCNTF in
the Rat Following Subcutaneous Admi
"Nistration at Eight Does Levels" (Pho
enix International Project No. 920847
) Nov. 10, 1993; B. Lakings et al., “Does Prop
orientational and Absolute Bioavailabi
light of rHCNTF Administered Subcutan
euusly to Rats ", AAPS Ninth Annual Me
eting, San Diego, CA, November 1994).
The absolute bioavailability of G228 (13.7%) and the absolute bioavailability of RG242 (10.9%) are similar to those of rHCNTF (6.
0%). Therefore, the bioavailability of rHCNTF, RG228 and RG242 does not differ significantly within experimental error.

【０１２５】 （インビボでの効力および毒性）−コントロール実験において、ヒラメ筋の除
神経は、７日までに筋肉湿重量の４０％の損失を生じた。この値は、非常に正確
であり、かつ再現性がある。なぜなら、それは、独立した実験の間で、ただ３％
までしか変化しないからである。ｒＨＣＮＴＦの毎日の投与は、ＥＤ₅₀＝０．１
２ｍｇ／ｋｇで筋肉湿重量の容量依存性のレスキューを生じ、０．３ｍｇ／ｋｇ
で最大効果を生じた（図１１）。同時に、動物が、これらの実験の過程の間で体
重を増加し続けた場合でさえも、その動物は明らかに、それらのビヒクル処置し
た対照と、特に最大の有効用量で、同じくらい多く増加しなかった（ｐ＜０．０
１；図１２）。In vivo efficacy and toxicity-In a control experiment, soleus muscle denervation resulted in 40% loss of muscle wet weight by 7 days. This value is very accurate and reproducible. Because it is only 3% between independent experiments
Because it changes only until. Daily administration of rHCNTF has an ED ₅₀ = 0.1.
2 mg / kg produced a dose-dependent rescue of muscle wet weight, 0.3 mg / kg
Produced the maximum effect (Fig. 11). At the same time, even if the animals continued to gain weight during the course of these experiments, they clearly gained as much as their vehicle-treated controls, especially at the maximum effective dose. There was not (p <0.0
1; FIG. 12).

【０１２６】 ｒＨＣＮＴＦで並行して行なわれたいくつかの実験の過程において、６３ＱＲ
置換は、インビボでの効力で２倍の増加を生じた（図１１）が、また毒性におい
ても同時に２倍の増加を生じたことが決定された（図１２）。対照的に、さらな
るＣ１７ＡおよびΔＣ１３改変を有するＲＧ２９７は、ｒＨＣＮＴＦと比較して
２．６倍のより大きな効力を示すが、同じ毒性を示す。最後に、ＲＧ２４２は、
ｒＨＣＮＴＦと比較して、２．８倍の増加した効力、および２．４倍減少した毒
性を生成した。これらの結果を、表３に要約する。In the course of several experiments performed in parallel with rHCNTF, 63QR
It was determined that the substitution resulted in a 2-fold increase in potency in vivo (FIG. 11), but also a 2-fold increase in toxicity (FIG. 12). In contrast, RG297 with the additional C17A and ΔC13 modifications shows 2.6-fold greater potency compared to rHCNTF, but the same toxicity. Finally, RG242
It produced a 2.8-fold increased potency and a 2.4-fold reduced toxicity compared to rHCNTF. These results are summarized in Table 3.

【０１２７】 これらの化合物の各々に対する相対的治療的指数（Ｔ．Ｉ．）を、ＴＤ₂₅おお
びＥＤ₅₀値の比として計算し、ｒＨＣＮＴＦの値に対して正規化した。ＲＧ２２
８のＴ．Ｉ．は、ｒＨＣＮＴＦの値と等しいが、ＲＧ２９７およびＲＧ２４２の
Ｔ．Ｉは、ｒＨＣＮＴＦの値より、それぞれ、２．５倍および６．８倍優れてい
る。The relative therapeutic index (TI) for each of these compounds was calculated as the ratio of the TD ₂₅ and ED ₅₀ values and normalized to the rHCNTF values. RG22
T.8. I. Is equal to the value of rHCNTF, but the T.S. of RG297 and RG242. I is 2.5 times and 6.8 times superior to the value of rHCNTF, respectively.

【０１２８】 従って、ＲＧ２９７およびＲＧ２４２は、ｒＨＣＮＴＦより優れた薬理学的特
性を有する。これは、ヒトにおけるｒＨＣＮＴＦ処置の際に、体重の減少が観察
される臨床状況に非常に適切である。Therefore, RG297 and RG242 have superior pharmacological properties to rHCNTF. This is very relevant in clinical situations where weight loss is observed during rHCNTF treatment in humans.

【０１２９】 当業者は、ＣＮＴＦのアミノ酸配列における他の変更が、増強された特性を有
し得る生物学的に活性な分子を生じ得ることを認識する。例えば、出願人は、１
７位のシステイン残基の代わりにセリン残基を有し、そして生物学的に活性であ
る１７ＣＳ変異体を調製した。出願人はまた、生物学的に活性な、４重の変異体
、１７ＣＡ，ΔＣ１３，６３ＱＲ，６４ＷＡを調製した。さらなるＣＮＴＦ変異
体（その全てが生物学的活性を保持する）を、表４に示す。Those of skill in the art will recognize that other alterations in the amino acid sequence of CNTF can result in biologically active molecules that can have enhanced properties. For example, applicant is 1
A 17CS mutant was prepared that had a serine residue in place of the cysteine residue at position 7 and was biologically active. Applicants have also prepared a biologically active, quadruple mutant, 17CA, ΔC13,63QR, 64WA. Additional CNTF variants, all of which retain biological activity, are shown in Table 4.

【０１３０】[0130]

【表１】 [Table 1]

【０１３１】[0131]

【表２】 [Table 2]

【０１３２】[0132]

【表３】 [Table 3]

【０１３３】[0133]

【表４】 （実施例７−ハンティングトン病の動物モデルにおけるＣＮＴＦおよび改変体
の効力） （背景） グルタミン酸レセプター媒介興奮毒性は、多くの神経変性疾患（ハンティング
トン病および運動ニューロン疾患を含む）において役割を果たすことが仮定され
てきた（ＤｉＦｉｇｌｉａ，Ｍ．１９９０、Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．
１３：２８６−２８９；Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎら、１９９５，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈ
ｅｍ．６５：６４３−６５１）。ハンティングトン病の優勢な神経病理学的特徴
は、中程度のサイズのＧＡＢＡ作動性線条体出力ニューロン（ｓｔｒｉａｔａｌ
ｏｕｔｐｕｔ ｎｅｕｒｏｎ）が、線条体介在ニューロンの実質的な損失なし
に、大量に変性することである（Ａｌｂｉｎら、１９８９、Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅ
ｕｒｏｓｃｉ．１２：３６６−３７５；Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎら、１９９１、Ｊ
．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．５０：３０９）。ハンティ
ングトン病において観察される線条体出力ニューロンの優先的な損失、およびそ
の結果としての運動障害は、ＮＭＤＡグルタミン酸レセプターアゴニスト、キノ
リン酸が線条体に注射される齧歯類または霊長類モデルにおいて模倣される（Ｄ
ｉＦｉｇｌｉａ，Ｍ．１９９０，Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１３：２８
６−２８９）。[Table 4] Example 7-Efficacy of CNTF and Variants in Animal Models of Huntington's Disease Background Glutamate receptor-mediated excitotoxicity plays a role in many neurodegenerative diseases, including Huntington's and motor neuron diseases. Has been postulated (DiFiglia, M. 1990, Trends Neurosci.
13: 286-289; Rothstein et al., 1995, J. Am. Neuroch
em. 65: 643-651). The predominant neuropathological features of Huntington's disease are the moderate size GABAergic striatal output neurons.
output neuron) is a large degeneration without substantial loss of striatal interneurons (Albin et al., 1989, Trends Ne).
urosci. 12: 366-375; Harrington et al., 1991, J.
． Neuropathol. Exp. Neurol. 50: 309). The preferential loss of striatal output neurons observed in Huntington's disease, and the consequent dyskinesia, is impaired in a rodent or primate model in which the NMDA glutamate receptor agonist, quinolinic acid, is injected into the striatum. Imitated (D
iFiglia, M .; 1990, Trends Neurosci. 13:28
6-289).

【０１３４】 ＨＤについての遺伝的動物モデルの非存在下で、神経科学者は、ＨＤ表現型の
研究については、急性の病変モデルに依存し続けている。ＨＤの古典的な動物モ
デルには、ＮＭＤＡレセプタークラスのグルタミン酸アゴニストを使用するラッ
トの線条体の興奮毒性病変の産生が関与している。このような病変パラダイムに
おいて、神経毒を直接線条体に注射することは、γアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）をそ
の神経伝達物質として利用する中程度のサイズの内因性線条体ニューロンの損失
を生じ、そして神経伝達物質としてアセチルコリンまたはソマトスタチンのいず
れかおよびニューロペプチドＹを利用する２つのクラスの線条体介在ニューロン
の相対的な保存を生じる。最近の研究は、キノリン酸の線条体内注射に依存して
おり、これはＨＤ線条体の出現を最も忠実に再現するようである。In the absence of genetic animal models for HD, neuroscientists continue to rely on acute lesion models for studies of HD phenotype. The classical animal model of HD involves the production of striatal excitotoxic lesions in the rat using NMDA receptor class glutamate agonists. In such a lesion paradigm, direct injection of the neurotoxin into the striatum results in the loss of medium-sized endogenous striatal neurons that utilize γ-aminobutyric acid (GABA) as its neurotransmitter, And it results in the relative conservation of two classes of striatal interneurons that utilize either acetylcholine or somatostatin as neurotransmitters and neuropeptide Y. Recent studies have relied on intrastriatal injection of quinolinic acid, which appears to most closely replicate the appearance of the HD striatum.

【０１３５】 Ｆｉｇｕｅｒｅｄｏ−Ｃａｒｄｅｎａｓら（１９９４，Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ
１２９：３７−５６）は、キノリン酸（ＱＡ）を、成体ラットの線条体中へ注
射し、そして病変後の２〜４ヶ月目には、種々の異なる型の線条体投射ニューロ
ンおよび介在ニューロンならびに異なる線条体投射領域における線条体遠心性神
経線維の生存の相対的なパターンを探索した。全ての投射ニューロン型（線条体
淡蒼球系（ｓｔｒｉａｔｏｐａｌｌｉｄａｌ）、線条体黒質系、および線条体脚
内（ｓｔｒｉａｔｏ−ｅｎｔｏｐｅｄｕｎｃｕｌａｒ））の神経細胞形質は、コ
リン作動性介在ニューロンよりも脆弱である。投射ニューロン神経細胞形質のう
ち、異なる脆弱性の証拠が存在した。そして線条体黒質系のニューロンが最も脆
弱であるようである。線条体標的領域における免疫標識した線条体繊維の検査は
、線条体脚内繊維が、線条体内ＱＡを線条体淡蒼球系または線条体黒質系の繊維
よりも良好に生存したことを示した。この研究において投射ニューロンおよび／
またはそれらの遠心性神経線維叢の間で観察された見かけの脆弱性の順序、なら
びにコリン作動性介在ニューロンのこの研究において観察された非脆弱性は、Ｈ
Ｄにおいて観察されたものと類似している。Figueredo-Cardenas et al. (1994, Exp. Neurol.
129: 37-56) injects quinolinic acid (QA) into the striatum of adult rats, and at 2-4 months post-lesion, various different types of striatal projection neurons and intercalation We explored the relative patterns of survival of striatal efferent nerve fibers in neurons as well as in different striatal projection areas. Neuronal traits of all projection neuron types (striatopallidal, striatal substantia nigra, and striato-entropeduncular) are more vulnerable than cholinergic interneurons Is. There was evidence of different vulnerabilities in projection neuronal neuronal traits. And striatal substantia nigra neurons appear to be the most vulnerable. Examination of immunolabeled striatal fibers in the striatal target region showed that striatal intra-legal fibers had better intra-striatal QA than striatal pallidum or striatal substantia nigra fibers. It was shown to have survived. Projection neurons and / or
Or the order of the apparent fragility observed between their efferent nerve fiber plexus, as well as the non-fragility observed in this study of cholinergic interneurons
Similar to that observed in D.

【０１３６】 別の動物モデルにおいて、３−ニトロプロピオン酸（３−ＮＰ）の全身性の投
与により、ハンティングトン病（ＨＤ）において観察されるものと類似する神経
病理学的変化が導かれる。これらの動物において観察される行動機能低下は、Ｈ
Ｄのほとんどの興奮毒性のモデルにおいて観察される機能亢進とは異なるが、３
−ＮＰは、若年型の発症および進行したＨＤのよりよいモデルを提供すると考え
る者もいる。３−ＮＰの神経病理学的効果には、内因性の線条体コリン作動性ニ
ューロンの損失が含まれるが、大きなＡＣｈＥ陽性ニューロンのいくつかの保持
、ＮＡＤＰＨジアホラーゼ含有ニューロンの最小の損傷およびグリアの浸潤が含
まれる（Ｂｏｒｌｏｎｇａｎら、１９９５、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．Ｂｕｌｌ．３
６５：４９−５６）。３−ＮＰをＨＤの神経毒性モデルとして用いる比較的少数
の研究が行われてきた。その忠実さおよび効用は、依然として研究されるべきで
ある。In another animal model, systemic administration of 3-nitropropionic acid (3-NP) leads to neuropathological changes similar to those observed in Huntington's disease (HD). The behavioral decline observed in these animals is
Unlike the hyperactivity observed in most excitotoxic models of D, 3
Some believe that NPs provide a better model for juvenile onset and advanced HD. The neuropathological effects of 3-NP include the loss of endogenous striatal cholinergic neurons, but some retention of large AChE-positive neurons, minimal damage of NADPH diaphorase-containing neurons, and glial loss. Infiltration is included (Borlongan et al., 1995, Brain Res. Bull. 3).
65: 49-56). A relatively small number of studies have been conducted using 3-NP as a neurotoxicity model of HD. Its fidelity and utility should still be studied.

【０１３７】 最近の研究は、線条体における興奮毒性傷害とハンティングトン（Ｈｕｎｔｉ
ｎｇｔｉｎ）の役割との間の関係を追求し始めている。マウスにおけるキノリン
酸の線条体注射は、いくつかの残存するニューロンにおいて、ハンティングトン
（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｉｎ）についての増大した免疫反応性を誘導するが、しかし
グリア細胞においては誘導しない。この増大は、興奮毒性チャレンジ後６時間に
おける白質におけるニューロン細胞体と細胞プロセスの両方において明らかであ
る。従って、ハンティングトン（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｉｎ）は、これらのニューロ
ンにおける興奮毒性ストレスへの応答に関与され得る（Ｔａｔｔｅｒら、１９９
５、Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ ６：１１２５−１１２９）。１時間と６時間の間
の初期増加に続いて、ＩＴ１５ ｍＲＮＡレベルは、ニューロン特異的遺伝子の
群に相同なパターンで減少した。２４時間後の減少したｍＲＮＡレベルは、グリ
ア転写が神経変性または神経膠症によって活性化されないことを実証した。１時
間および２４時間のｍＲＮＡレベルは、ＩＴ１５転写が、変性ニューロンに優先
的に局在することを強力に示唆する。Ｃａｒｌｏｃｋら、１９９５、Ｎｅｕｒｏ
ｒｅｐｏｒｔ ６：１１２１−１１２４。Recent studies have shown excitotoxic injury in the striatum and Huntington (Hunti).
ngtin) role is beginning to be pursued. Striatal injection of quinolinic acid in mice induces increased immunoreactivity for Huntingtin in some surviving neurons but not in glial cells. This increase is evident in both neuronal cell bodies and cellular processes in the white matter 6 hours after excitotoxic challenge. Thus, Huntingtin may be involved in the response of these neurons to excitotoxic stress (Tatter et al., 199).
5, Neuroreport 6: 1125-1129). Following an initial increase between 1 and 6 hours, IT15 mRNA levels decreased in a pattern homologous to the group of neuron-specific genes. Decreased mRNA levels after 24 hours demonstrated that glial transcription was not activated by neurodegeneration or gliosis. MRNA levels at 1 and 24 hours strongly suggest that IT15 transcription is preferentially localized to degenerating neurons. Carlock et al., 1995, Neuro
report 6: 1121-1124.

【０１３８】 線条体に対する興奮毒性傷害はまた、ＨＤ脳において観察される細胞死の特定
の局面を模倣する（Ｂｅａｌら、１９８６、Ｎａｔｕｒｅ ３２１：１６８−１
７１）。ＨＤを有する個体の新線条体において、ＴＵＮＥＬ陽性ニューロンおよ
びグリアの分布のパターンは、神経系の正常な発達の間のアポトーシス細胞死に
おいて見られるものを思い起こさせた；同じ領域において、ふぞろいでないＤＮ
Ａ断片化が、ときどき観察された。ラットの線条体の興奮毒性傷害の後に、ヌク
レオソーム間ＤＮＡ断片化（アポトーシスの証拠）を、初期の時間間隔で観察し
、そしてランダムＤＮＡ断片化（壊死の証拠）を後の時点で観察した。さらに、
ＥＭにより、中程度の棘のあるニューロンの壊死プロフィールが、病変ラットに
おいて検出された。従って、アポトーシスは、ＨＤおよび興奮毒性動物モデルの
両方において生じる。さらに、ニューロン死のアポトーシスおよび壊死の機構は
、細胞毒性的に傷害を受けた脳における個々の死にゆく細胞において同時に生じ
得る（Ｐｏｒｔｅｒａら、１９９５、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ １５：３
７７５−３７８７）。Excitotoxic injury to the striatum also mimics certain aspects of cell death observed in the HD brain (Beal et al., 1986, Nature 321: 168-1).
71). In the neostriatum of individuals with HD, the pattern of TUNEL-positive neuronal and glial distribution was reminiscent of that seen in apoptotic cell death during normal development of the nervous system; in the same area, a non-uniform DN
A fragmentation was occasionally observed. Following excitotoxic injury of the rat striatum, internucleosome DNA fragmentation (evidence of apoptosis) was observed at early time intervals, and random DNA fragmentation (evidence of necrosis) was observed at later time points. further,
A necrotic profile of neurons with moderate spines was detected in lesioned rats by EM. Therefore, apoptosis occurs in both HD and excitotoxic animal models. Furthermore, the mechanisms of neuronal death apoptosis and necrosis can occur simultaneously in individual dying cells in the cytotoxically injured brain (Portera et al., 1995, J. Neuroscience 15: 3).
775-3787).

【０１３９】 Ｔｄｔ媒介ｄＵＴＰビオチンニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）技術は、ヒト脳の
種々の病理学的状態の予備的研究において調査されている（例えば、神経膠腫、
外傷性脳傷害、パーキンソン病、パーキンソン−アルツハイマー複合症（Ｐａｒ
ｋｉｎｓｏｎ’ｓ−Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｃｏｍｐｅｘ）、多系統萎縮症、
線条体黒質変性症）。ハンティングトン病のみが、この方法により有意かつ定常
的な標識を明らかにした（Ｔｈｏｍａｓら、１９９５、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａ
ｌ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ １３３：２６５−２７２）。ｃ−ｆｏｓ発現は、キノ
リン酸注入のすぐ後に増大し、ラット脳において広範に広がるが、しかし注射後
２４時間で実質的に存在しなくなる。しかし、ＤＮＡの断片化は、線条体に限定
され、そして注射の２４時間後に最大となる。これらの結果は、領域神経病理学
の検出のためのインサイチュニックトランスレーションの感度を実証し、そして
興奮毒性ニューロン死に対するｃ−ｆｏｓ発現の時間的および空間的関係を例示
する（Ｄｕｒｅら、１９９５、Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．１３３：２０７−２１４
）。Tdt-mediated dUTP biotin nick end labeling (TUNEL) technology has been investigated in preliminary studies of various pathological conditions in the human brain (eg glioma,
Traumatic brain injury, Parkinson's disease, Parkinson-Alzheimer's disease (Par)
Kinson's-Alzheimer's compex), multiple system atrophy,
Striatal nigra degeneration). Only Huntington's disease revealed significant and constant markers by this method (Thomas et al., 1995, Experimenta).
Neurology 133: 265-272). c-fos expression increases immediately after quinolinic acid infusion and is widespread in rat brain, but is virtually absent at 24 hours post injection. However, DNA fragmentation is restricted to the striatum and is maximal 24 hours after injection. These results demonstrate the sensitivity of in situ translation for the detection of regional neuropathology and exemplify the temporal and spatial relationship of c-fos expression to excitotoxic neuronal death (Dure et al., 1995, Exp. Neurol. 133: 207-214.
).

【０１４０】 興奮毒性病変はまた、ＨＤにおける可能な治療的手段を探索するために使用さ
れてきた。キノリン酸によって誘導される興奮毒性線条体病変は、ハンティング
トン病のモデルであり、キノリン酸病変（１５０ｎｍｏｌ）の後に、成体ラット
において線条体コリン作動性およびＧＡＢＡ作動性ニューロンに対する神経発育
因子（ＮＧＦ）の神経保護作用を試験するために使用されてきた。１週間の毎日
の線条体内ＮＧＦ投与により、コリンアセチルトランスフェラーゼメッセンジャ
ーＲＮＡの細胞内発現を、コントロールレベルの３倍増大させ、そしてＴｒｋ
ＡメッセンジャーＲＮＡ発現のレベルをコントロールレベルまで回復した。コリ
ン作動性細胞に対する保護的効果とは対照的に、ＮＧＦ処理は、グルタミン酸デ
カルボキシラーゼメッセンジャーＲＮＡレベルにおけるキノリン酸誘導性減少を
弱められなかった。従って、ハンティングトン病において変性する線条体グルタ
ミン酸デカルボキシラーゼメッセンジャーＲＮＡ発現ＧＡＢＡ作動性ニューロン
は、ＮＧＦに対して応答性ではない。Excitotoxic lesions have also been used to explore possible therapeutic approaches in HD. Quinolic acid-induced excitotoxic striatal lesions are a model of Huntington's disease, and after quinolinic acid lesions (150 nmol), neural growth factors for striatal cholinergic and GABAergic neurons in adult rats ( NGF) has been used to test the neuroprotective effect. Daily intrastriatal NGF administration for 1 week increased intracellular expression of choline acetyltransferase messenger RNA 3-fold above control levels, and Trk
The level of A messenger RNA expression was restored to control levels. In contrast to its protective effect on cholinergic cells, NGF treatment failed to attenuate the quinolinate-induced decrease in glutamate decarboxylase messenger RNA levels. Thus, striatal glutamate decarboxylase messenger RNA-expressing GABAergic neurons that degenerate in Huntington's disease are not responsive to NGF.

【０１４１】 Ｆｒｉｍら（１９９３、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７８：２６７−２７３）は
、線維芽細胞分泌ＮＧＦを、キノリン酸病変ラット線条体へと移植した。彼らは
、脳梁内に配置されたＮＧＦ分泌線維芽細胞の予備的移植が、同側性の線条体に
おける引き続く興奮毒性病変の最大断面積を、非ＮＧＦ分泌線維芽細胞移植片の
効果と比較した場合、８０％、そして移植されていない動物における興奮毒性病
変と比較した場合、８３％減少させたことを見出した（ｐ＜０．００３）。Frim et al. (1993, J. Neurosurg. 78: 267-273) transplanted fibroblast-secreted NGF into the striatum of quinolinic acid-lesioned rats. They found that pre-implantation of NGF-secreting fibroblasts placed in the corpus callosum demonstrated the maximum cross-sectional area of subsequent excitotoxic lesions in the ipsilateral striatum as an effect of non-NGF-secreting fibroblast grafts. It was found to reduce by 80% when compared and by 83% when compared to excitotoxic lesions in non-transplanted animals (p <0.003).

【０１４２】 （材料および方法） （栄養性因子） 組換えヒトＢＤＮＦ、神経発育因子（ＮＧＦ）およびＮＴ−
３、および組換えラットＣＮＴＦを、記載のように（Ｍａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅ
ら、１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１４４６−１４５１；Ｍａｓｉａｋｏ
ｗｓｋｉら、１９９１、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５７：１００３−１０１２）
Ｅ．ｃｏｌｉにおいて調製し、そして特徴づけた。アキソカイン１（Ａｘｏｋｉ
ｎｅ１）（Ａｘ１）は、以下の改変を有する組換えヒトＣＮＴＦについての命名
である：１７位のシステインのアラニンでの置換および６３位のグルタミンのア
ルギニンでの置換、１３個のＣ末端アミノ酸の欠失。このＣＮＴＦアナログは、
増大した可溶性を有し、生理学的緩衝液中で少なくとも１週間３７℃で安定であ
り、そして天然のヒトＣＮＴＦに対してインビトロで４〜５倍より大きい効力を
示す（Ｐａｎａｙｏｔａｔｏｓら、１９９３、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８
：１９０００−１９００３）。Materials and Methods Trophic Factor Recombinant Human BDNF, Nerve Growth Factor (NGF) and NT-.
3 and recombinant rat CNTF as described (Maisonpierre).
Et al., 1990, Science 247: 1446-1451; Masiako.
wski et al., 1991, J. Am. Neurochem. 57: 1003-1012).
E. prepared in E. coli and characterized. Axokine 1 (Axoki
ne1) (Ax1) is the nomenclature for recombinant human CNTF with the following modifications: substitution of cysteine at position 17 with alanine and substitution of glutamine at position 63 with arginine, lack of 13 C-terminal amino acids. Lost. This CNTF analog is
It has increased solubility, is stable at 37 ° C for at least 1 week in physiological buffer, and exhibits in vitro greater than 4-5 fold potency against native human CNTF (Panayotatos et al., 1993, J. Chem. Biol.Chem.268
: 19000-19003).

【０１４３】 （動物の処理） 全ての動物手順を、施設動物保護および用途委員会によって
承認されたプロトコルを厳格に遵守して実施した。Animal Treatment All animal procedures were performed in strict compliance with the protocols approved by the Institutional Animal Care and Use Committee.

【０１４４】 （浸透圧ポンプによる栄養性因子送達） ３０ゲージの浸透圧ポンプ注入カニ
ューレおよび２２ゲージガイドカニューレ（それぞれ、長さ５．０ｍｍおよび２
．２ｍｍ）を、２５０〜３００ｇの雄のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットの
左半球（ブレグマに対して定位固定の座標ＡＰ０．７、ＭＬ３．２；耳間線（ｉ
ｎｔｅｒａｕｒａｌ ｌｉｎｅ）の下３．３ｍｍの切歯バー）に、抱水クロラー
ル（１７０ｍｇ／ｋｇ）およびペントバルビタール（３５ｍｇ／ｋｇ）の深い麻
酔下で、平行に並べて長期的に移植した。３０日後、ラットを再び麻酔し、そし
て０．１Ｍリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．４）または組換えヒト
ＮＧＦのＰＢＳ溶液（０．９ｍｇ／ｍｌ）、ヒトＢＤＮＦ（１ｍｇ／ｍｌ）、ヒ
トＮＴ−３（１ｍｇ／ｍｌ）、ラットＣＮＴＦ（０．７８ｍｇ／ｍｌ）、または
Ａｘ１（０．４ｍｇ／ｍｌ）を含有するＡｌｚｅｔ浸透圧ミニポンプ２００２（
０．５μｌ／ｈｒの送達速度で２週間容量）を、プラスチックチューブによって
注入カニューレに連結し、そして皮下移植した（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、１９９５
，Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．３５７：２９６−３１７）。注入カニューレお
よびチューブのデッドボリュームのために、神経栄養性因子の脳への送達は、ポ
ンプ移植の約１日後に始まった。３７℃で、１２日間、浸透圧ポンプにおいて維
持されたニューロトロフィンは、バイオアッセイによって決定したところ、完全
に安定であり、そしてニューロトロフィンの有効な線条体内送達は、適切な因子
についての切片の免疫組織化学染色によって評価された（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、
１９９５、Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．３５７：２９６−３１７）。ポンプ移
植の３〜４日後、麻酔したラットに、キノリン酸の注射（１μｌリン酸緩衝液、
ｐＨ７．２中、１０分間にわたって５０ｎｍｏｌ）を、ガイドカニューレを通し
て、２８ゲージの先端が鋭くないニードルを備えた１０μｌのＨａｍｉｌｔｏｎ
シリンジを使用して与えた。Trophic Factor Delivery by Osmotic Pump A 30 gauge osmotic pump infusion cannula and a 22 gauge guide cannula (5.0 mm and 2 lengths, respectively).
． 2 mm) to the left hemisphere of male Sprague-Dawley rats weighing 250-300 g (coordinates AP0.7 stereotactic with respect to bregma, ML3.2; interaural line (i
Under a deeper anesthesia of chloral hydrate (170 mg / kg) and pentobarbital (35 mg / kg), long-term transplantation was performed in a 3.3 mm incisor bar) under the interaural line). After 30 days, the rats were re-anesthetized and 0.1 M phosphate buffered saline (PBS) (pH 7.4) or recombinant human NGF in PBS (0.9 mg / ml), human BDNF (1 mg / ml). ), Human NT-3 (1 mg / ml), rat CNTF (0.78 mg / ml), or Ax1 (0.4 mg / ml) containing Alzet osmotic minipump 2002 (
Two week volumes at a delivery rate of 0.5 μl / hr) were connected by plastic tubing to an infusion cannula and implanted subcutaneously (Anderson et al., 1995.
J. Comp. Neurol. 357: 296-317). Due to the dead volume of the infusion cannula and tubing, neurotrophic factor delivery to the brain began approximately 1 day after pump implantation. Neurotrophins maintained in osmotic pumps for 12 days at 37 ° C. were completely stable as determined by bioassay, and effective intrastriatal delivery of neurotrophins was determined by the appropriate factor. Sections were evaluated by immunohistochemical staining (Anderson et al.,
1995, J. Comp. Neurol. 357: 296-317). 3-4 days after pump implantation, anesthetized rats were injected with quinolinic acid (1 μl phosphate buffer,
50 nmol over 10 minutes in pH 7.2 through a guide cannula, 10 μl Hamilton with a 28 gauge non-sharp needle.
Given using a syringe.

【０１４５】 （毎日の注射による栄養因子送達） ２２ゲージガイドカニューレ（２．２ｍ
ｍ長）を、上記のように、麻酔したラットの左半球（定位固定の座標ＡＰ０．５
、ＭＬ３．０）へと長期的に移植した。１週間後から開始して、麻酔したラット
に、Ａｘ１（１μｌ中０．４μｇを１０分間にわたって）またはビヒクルの毎日
線条体内注射をガイドカニューレを通して、Ｈａｍｉｌｔｏｎシリンジを使用し
て与えた。Ａｘ１を、３日連続で、上記のように注射されたキノリン酸の注射１
日前および１日後に注射した。Delivery of Trophic Factors by Daily Injection 22 gauge guide cannula (2.2 m
m length) as described above, in the left hemisphere of the anesthetized rat (stereotaxic coordinates AP0.5).
, ML3.0) for a long term. Starting one week later, anesthetized rats were given daily intrastriatal injections of Ax1 (0.4 μg in 1 μl over 10 minutes) or vehicle through a guide cannula using a Hamilton syringe. Ax1 injection of quinolinic acid injected as above for 3 consecutive days 1
Injections were made before and after one day.

【０１４６】 （組織学的手順および分析） ４％パラホルムアルデヒドで還流固定した脳を
、キノリン酸注射後８または９日目に収集し、そして前頭面をチオニンで染色し
た４０ミクロン厚の切片に切り出した。各実験において、一連の、１２Ｎｉｓｓ
ｌ染色した切片のうちの１つを、処理条件を知らされていない調査員により評価
し、そして中程度のサイズの線条体ニューロンの相対的な損失を以下のスケール
で格付けした：０（ニューロン損失なし）、１（明確であるがわずかなニューロ
ンの損失）、２（中程度のニューロンの損失）、３（重篤であるが、ニューロン
の全損失ではない）、４（キノリン酸注射の範囲内での中程度のサイズのニュー
ロンの全損失）。ニューロン損失が２つの基準に対して中間であるように見える
場合、２つの最も近接するスコア間の半分のスコアが割り当てられた。ＢＤＮＦ
およびＮＴ−３を使用する実験における２つの異なる観察者によって独立して割
り当てられたニューロンの損失スコアは、４２匹のラットのうち４０のラットに
ついて互いに０〜０．５ポイント内であった（相関係数＝０．８；ｐ＝０．００
０１）。Histological Procedures and Analysis Brains that were perfusion fixed with 4% paraformaldehyde were collected 8 or 9 days after quinolinic acid injection and cut into 40 micron thick sections of the frontal surface stained with thionine. It was In each experiment, a series of 12 Niss
One of the 1-stained sections was evaluated by investigators blinded to the treatment conditions and the relative loss of medium-sized striatal neurons was rated on the following scale: 0 (neurons No loss), 1 (clear but slight loss of neurons), 2 (moderate loss of neurons), 3 (severe but not total loss of neurons), 4 (range of quinolinic acid injection) Total loss of medium-sized neurons within). If the neuronal loss appeared to be intermediate for the two criteria, then half the score between the two closest scores was assigned. BDNF
The neuronal loss scores independently assigned by two different observers in experiments using NR3 and NT-3 were within 0-0.5 points of each other for 40 of 42 rats (phase Relation number = 0.8; p = 0.00
01).

【０１４７】 ＣＮＴＦを使用する実験において、ニューロンの損失はまた、注入カニューレ
に対して０．５ｍｍ吻側で得られた切片におけるニューロンを計数することによ
って評価された。各切片について、処理された線条体内の７つの視野（０．４×
０．４ｍｍ）上に配置された１０×１０サンプリンググリッドの全ての垂直線を
横切るニューロンを計数した。第一の視野は、線条体の中心に対してわずかに外
側に、代表的なキノリン酸誘導病変の中心（すなわち、注入カニューレの先端に
対してすぐ吻側）に配置された。６個の他の視野を、第一の視野から対角線上に
、背側正中の方向および腹側正中の方向にそれぞれ２回、ならびに側背の方向お
よび腹外側の方向にそれぞれ１回、移動させることによって選択した。切片の厚
みにおける可能な変動について制御するために、等価な位置における７つの視野
を対側線条体（約６００ニューロンが７つの視野において計数された）において
サンプリングし、そしてニューロン生存を、インタクト側に対して、処理側のニ
ューロンのパーセンテージとして表した。実際のニューロン計数の結果（ＣＮＴ
Ｆ処理群およびＰＢＳ処理群のそれぞれについて、３１および６１％ニューロン
損失）は、回帰分析（Ｓｐｅａｒｍａｎランク相関係数＝０．８２、ｐ＜０．０
５）により評価したところ、ニューロン損失スコアリングシステムの結果と密接
に一致していることを示した（それぞれ、１．６７および３．２５の平均ニュー
ロン損失スコア）。In experiments using CNTF, neuronal loss was also assessed by counting neurons in sections obtained 0.5 mm rostral to the infused cannula. For each section, 7 fields of view (0.4 x
The number of neurons that crossed all the vertical lines of a 10 × 10 sampling grid located above (0.4 mm) was counted. The first visual field was placed slightly outside of the center of the striatum, in the center of a typical quinolinic acid-induced lesion (ie, just rostral to the tip of the infusion cannula). Six other visual fields are moved diagonally from the first visual field twice each in the dorsal midline and ventral midline directions, and once each in the dorsolateral and ventrolateral directions. Selected by. To control for possible variations in section thickness, 7 fields at equivalent positions were sampled in the contralateral striatum (approximately 600 neurons were counted in 7 fields), and neuronal survival on the intact side. In contrast, it was expressed as a percentage of treated neurons. Results of actual neuron counting (CNT
Regression analysis (Spearman rank correlation coefficient = 0.82, p <0.0) for the F and PBS treated groups, respectively, with 31 and 61% neuron loss.
5) showed close agreement with the results of the neuronal loss scoring system (mean neuronal loss score of 1.67 and 3.25, respectively).

【０１４８】 実験群とそれらのそれぞれのコントロール群との間の差異を、対応のないｔ検
定により評価した。Differences between experimental groups and their respective control groups were evaluated by unpaired t-test.

【０１４９】 （結果） 一連の実験において、キノリン酸（５０ｎｍｏｌ）を、浸透圧ポンプ（名目上
の送達速度：ヒトＮＧＦ、１０．８μｇ／日；ヒトＢＤＮＦまたはＮＴ−３、１
２．０μｇ／日；ラットＣＮＴＦ、９．４μｇ／日）による神経栄養因子の線条
体内注入の開始後３日目または４日目に、成体ラットの左線条体へと注射した。
キノリン酸のこの用量は、中程度のサイズの線条体出力ニューロン（これは全て
の線条体ニューロンの９０％より多くを構成する）に対して毒性であるが、なお
コリン作動性介在ニューロンおよびパルブアルブミン／ＧＡＢＡ作動性介在ニュ
ーロンの線条体集団をほとんどインタクトなまま残す（Ｑｉｎら、１９９２、Ｅ
ｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ １１５：２００−２１１；Ｆｉ
ｇｕｅｒｅｄｏ−Ｃａｒｄｅｎａｓら、１９９４、Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．１２
９：３７−５６）。キノリン酸の注入後８〜９日目に収集した脳由来のＮｉｓｓ
ｌ染色切片の顕微鏡分析は、ＢＤＮＦ−、ＮＧＦ−、またはＮＴ−３処理脳にお
ける中程度のサイズの線条体ニューロンの有意な保持を示さなかった（図１３）
。更なるセットの実験において、キノリン酸をＢＤＮＦまたはＮＧＦ注入開始の
７日後に注入したとき、ニューロンの保持は、明らかではなかった。Results In a series of experiments, quinolinic acid (50 nmol) was added to an osmotic pump (nominal delivery rate: human NGF, 10.8 μg / day; human BDNF or NT-3, 1).
2.0 μg / day; rat CNTF, 9.4 μg / day) were injected into the left striatum of adult rats 3 or 4 days after the initiation of intrastriatal infusion of neurotrophic factor.
This dose of quinolinic acid is toxic to medium-sized striatal output neurons, which make up more than 90% of all striatal neurons, but still cholinergic interneurons and The striatal population of parvalbumin / GABAergic interneurons remains almost intact (Qin et al., 1992, E.
xperimental Neurology 115: 200-211; Fi
gueredo-Cardenas et al., 1994, Exp. Neurol. 12
9: 37-56). Brain-derived Niss collected 8-9 days after injection of quinolinic acid
Microscopic analysis of 1-stained sections did not show significant retention of medium-sized striatal neurons in BDNF-, NGF-, or NT-3 treated brains (Figure 13).
. In a further set of experiments, neuronal retention was not apparent when quinolinic acid was infused 7 days after the start of BDNF or NGF infusion.

【０１５０】 著しく対照的に、ニューロンの生存は、それぞれ６９±１７および２９±１１
％の平均パーセント生存（±ＳＥＭ）を示したニューロン計数（対応のないｔ検
定、ｔ（５）＝２．１２、ｐ＝０．０４）によって決定されるように、または半
定量的ニューロン損失スコアの割り当てによって評価されるように（図１５）、
ビヒクル単独で処理されたラットと比較して、ＣＮＴＦで処理されたラットにお
いて有意により大きかった（図１４）。ＣＮＴＦ処理脳において生存しているニ
ューロンは、キノリン酸注入によって影響を及ぼされる線条体領域全体に広まっ
た。In marked contrast, neuronal survival was 69 ± 17 and 29 ± 11, respectively.
Neuron counts, which showed a mean percent survival (± SEM) of% (unpaired t-test, t (5) = 2.12, p = 0.04), or a semi-quantitative neuronal loss score. As assessed by the assignment of (Fig. 15),
It was significantly larger in rats treated with CNTF compared to rats treated with vehicle alone (Figure 14). Surviving neurons in CNTF-treated brain spread throughout the striatal area affected by quinolinic acid injection.

【０１５１】 ＣＮＴＦによって実証された有利な効果があったと仮定して、類似の実験を、
ポリペプチドＣＮＴＦレセプターアゴニスト、アキソカイン１（Ａｘ−１）を使
用して行った（２４）。ＣＮＴＦの投与後に観察されるように、Ａｘ−１（４．
８μｇ／日）の注入は、キノリン酸に曝露された中程度のサイズの線条体ニュー
ロンの有意な保持を生じた（図１５）。この結果は、ＣＮＴＦレセプター媒介機
構が、ＮＭＤＡレセプター媒介興奮毒性由来の線条体ニューロンの保護をもたら
すという結論を支持する。Similar experiments were performed assuming that there was a beneficial effect demonstrated by CNTF.
This was done using the polypeptide CNTF receptor agonist, Axokine 1 (Ax-1) (24). As observed after administration of CNTF, Ax-1 (4.
Injection (8 μg / day) resulted in significant retention of medium-sized striatal neurons exposed to quinolinic acid (FIG. 15). This result supports the conclusion that the CNTF receptor-mediated mechanism results in protection of striatal neurons from NMDA receptor-mediated excitotoxicity.

【０１５２】 ＣＮＴＦまたはＡｘ−１の神経保護効果は、例えば、体重によって示されるよ
うな、行動または健康に対して明らかな有害な効果なしに達成された。実験の最
後に測定される体重は、ＣＮＴＦまたはＡｘ−１処理によって有意には影響され
なかった（対応のないｔ検定）。ＣＮＴＦ実験における栄養因子処理群およびビ
ヒクル処理群の平均の体重（±ＳＥＭ）は、それぞれ３６９±２０ｇおよび３３
１±１５ｇであった（ｐ＝０．２１）；Ａｘ−１実験における平均体重は、それ
ぞれ４３１±２６ｇおよび４５３±１４ｇであった（ｐ＝０．４４）。The neuroprotective effects of CNTF or Ax-1 were achieved without apparent detrimental effects on behavior or health, eg as demonstrated by body weight. Body weights measured at the end of the experiment were not significantly affected by CNTF or Ax-1 treatment (unpaired t-test). Mean body weights (± SEM) of trophic factor and vehicle treated groups in the CNTF experiment were 369 ± 20 g and 33, respectively.
1 ± 15 g (p = 0.21); mean body weight in the Ax-1 experiment was 431 ± 26 g and 453 ± 14 g, respectively (p = 0.44).

【０１５３】 ＣＮＴＦレセプターリガンドの神経保護的効果が、神経栄養性因子投与の終結
後に持続可能であるか否か、および低用量の栄養性因子が断続的に送達される場
合に、処置が有効であるか否かを決定するために、２つのさらなる実験を実施し
た。第１の実験において、ラットに、Ａｘ−１（４．８μｇ／日）またはビヒク
ルを３日間線条体内に注入し、次いで浸透圧ポンプの除去によって送達を終結し
た。その後、キノリン酸を線条体内に３日間注入した（図１６Ａ）。第２の実験
において、ラットに、キノリン酸の線条体内注入の前３日間およびその後１日間
の間に毎日、Ａｘ−１（０．４μｇ／日）またはビヒクルを線条体内注入した（
図１６Ｂ）；従って、これらのラットは合計でわずか１．６μｇのＡｘ−１を投
与されたにすぎなかった。両方の実験において、Ｎｉｓｓｌ染色した切片の顕微
鏡解析により、ＣＮＴＦまたはＡｘ−１を実験の続く間連続的に注入した場合に
観察される保持（ｓｐａｒｉｎｇ）に匹敵する、Ａｘ−１処置した脳における中
程度のサイズの線条体ニューロンの有意な保持が示された（図１６）。Whether the neuroprotective effects of CNTF receptor ligands are sustainable after termination of neurotrophic factor administration, and if low doses of trophic factors are delivered intermittently, treatment is effective. Two additional experiments were performed to determine if there were. In the first experiment, rats were infused intrastriatum with Ax-1 (4.8 μg / day) or vehicle for 3 days and then terminated by removal of the osmotic pump. Then, quinolinic acid was injected into the striatum for 3 days (FIG. 16A). In a second experiment, rats were intrastriatal infused with Ax-1 (0.4 μg / day) or vehicle daily for 3 days prior to intrastriatal infusion of quinolinic acid and for 1 day thereafter (
FIG. 16B); therefore, these rats received a total of only 1.6 μg of Ax-1. In both experiments, microscopic analysis of Nissl stained sections revealed that in the Ax-1 treated brains comparable to the sparing observed when CNTF or Ax-1 were continuously infused for the duration of the experiment. Significant retention of medium-sized striatal neurons was shown (Figure 16).

【０１５４】 （考察） 線条体内の９０％を超えるニューロンが、中程度の大きさであり、ＧＡＢＡ作
動性であり、線条体黒質性であり、そして線条体淡蒼球系の（ｓｔｒｉａｔｏｐ
ａｌｌｉｄａｌ）投射路ニューロンであるので（Ｇｒａｙｂｉｅｌ，Ａ．Ｍ．、
１９９０、ＴＩＮＳ １３：２４４−２５４）、この結果は、ＣＮＴＦまたはＣ
ＮＴＦレセプターアゴニストでの処置が、興奮毒性発作に対して線条体出力ニュ
ーロン（ｏｕｔｐｕｔ ｎｅｕｒｏｎ）を保護することを示す。従って、ＣＮＴ
Ｆは、ハンティングトン病の成体動物モデルにおける薬理学的な適用後に線条体
出力ニューロンを保護することが実証された、最初の精製された栄養性因子の１
つである。特徴付けられた他の因子の中で、塩基性線維芽細胞成長因子での処置
のみが、成体ラットおよび新生児ラットでＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸塩（
ＮＭＤＡ）またはマロン酸の注入によって誘導される線条体病変の大きさを減少
することが報告されている（Ｎｏｚａｋｉら、１９９３、Ｊ．Ｃｅｒｅｂ．Ｂｌ
ｏｏｄ Ｆｌｏｗ Ｍｅｔａｂ．１３：２２１−２２８；Ｋｉｒｓｃｈｎｅｒら
、１９９５、J．Ｃｅｒｅｂ．Ｂｌｏｏｄ Ｆｌｏｗ Ｍｅｔａｂ．１５：６１
９−６２３）。ラットにおいて、線条体付近に移植されたＮＧＦ分泌線維芽細胞
が、キノリン酸から中程度の大きさの線条体ニューロンを保護することが示され
ているが（Ｆｒｉｍら、１９９３、ＮｅｕｒｏＲｅｐｏｒｔ ４：３６７−３７
０；Ｅｍｅｒｉｃｈら、１９９４、Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．１３０：１４１−１
５０）、本発明者らは、いくつかの初期の研究（Ｄａｖｉｅｓら、１９９２、Ｎ
ｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．１４０：１６１−１６４；Ｖｅｎｅｒｏら、１９９
４、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ６１：２５７−２６８；Ｋｏｒｄｏｗｅｒら、
１９９４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：９０７７−
９０８０）と一致して、精製されたＮＧＦでこれらのニューロンに対する生存促
進効果を全く得られなかった。この知見は、ＮＧＦが、ＮＧＦ分泌線維芽細胞に
よって提供される神経保護の唯一のメディエイタではないことを示唆する。しか
し、本発明者らは、大きな暗く染色する、おそらくコリン作用性の介在ニューロ
ンが、以前に報告されたように（Ｄａｖｉｅｓら、１９９２、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ
．Ｌｅｔｔ．１４０：１６１−１６４；Ｋｏｒｄｏｗｅｒら、１９９４、Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：９０７７−９０８０；Ｐｅｒ
ｅｚ−Ｎａｖａｒｒｏら、１９９４、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．６：７０
６−７１１）、ＮＧＦで処置された脳内においてより顕著であることを観察した
。高親和性ＮＧＦレセプターであるＴｒｋＡの線条体の発現は、コリン作用性の
介在ニューロンに制限され（Ｓｔｅｉｎｉｎｇｅｒら、１９９３、Ｂｒａｉｎ
Ｒｅｓ．６１２：３３０−３３５）、これはこれらのニューロンに対するＮＧＦ
の選択的作用の知見と一致するが、一方、ＢＤＮＦおよびＮＴ−３についての高
親和性レセプター（ＴｒｋＢおよびＴｒｋＣ）は、多くの中程度の大きさの線条
体ニューロンによって発現される（Ａｌｔａｒら、１９９４、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅ
ｕｒｏｓｃｉ．６：１３８９−１４０５）。ＢＤＮＦおよびＮＴ−３は（ＮＧＦ
と異なり）、胚の、ＧＡＢＡ作動性の、線条体出力ニューロンのインビトロでの
生存および表現型分化を促進する（Ｍｉｚｕｎｏら、１９９４、Ｄｅｖ．Ｂｉｏ
ｌ．１６５：２４３−２５６；Ｖｅｎｔｉｍｉｇｌｉａら、１９９５、Ｅｕｒ．
Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ）。さらに、これらのニューロトロフィンは、インビトロ
でグルタミン酸毒性から特定のニューロン集団を保護し得る（Ｌｉｎｄｈｏｌｍ
ら、１９９３、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．５：１４５５−１４６４；Ｓｈ
ｉｍｏｈａｍａら、１９９３、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．１６４：５５−５
８；Ｃｈｅｎｇら、１９９４、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．６４０：５６−６７）。そ
れにもかかわらず、ＢＤＮＦまたはＮＴ−３の注入は、インビボでのＮＭＤＡレ
セプター媒介性興奮毒性に対して線条体出力ニューロンを保護するようではない
が、同等の用量でのＢＤＮＦまたはＮＴ−３の大脳内注入は、線条体および脳内
の他の箇所において明白な生物学的効果を誘発する（Ｌｉｎｄｓａｙら、１９９
４、ＴＩＮＳ １７：１８２−１９０）。インビボ研究とインビトロ研究との間
での対照的な結果は、ニューロン型の差異（線条体対海馬、皮質または小脳）、
ニューロンの発達段階における差異（成体対胚性）、またはインビボでのグルタ
ミン酸作動性のシナプスの投入（ｉｎｐｕｔ）の存在によって説明され得る。Discussion Over 90% of the neurons in the striatum are of medium size, GABAergic, striatal substantia nigra, and striatal pallidum system ( striatop
(Graybiel, AM,
1990, TINS 13: 244-254), the result is CNTF or C.
It is shown that treatment with an NTF receptor agonist protects striatal output neurons against excitotoxic seizures. Therefore, CNT
F is one of the first purified trophic factors demonstrated to protect striatal output neurons after pharmacological application in an adult animal model of Huntington's disease.
Is one. Of the other factors characterized, only basic fibroblast growth factor treatment resulted in N-methyl-D-aspartate (in adult and neonatal rats).
NMDA) or malonic acid injections have been reported to reduce the size of striatal lesions (Nozaki et al., 1993, J. Cereb. Bl.
good Flow Metab. 13: 221-228; Kirschner et al., 1995, J. Am. Cereb. Blood Flow Metab. 15:61
9-623). In rats, NGF-secreting fibroblasts transplanted near the striatum have been shown to protect medium-sized striatal neurons from quinolinic acid (Frim et al., 1993, NeuroReport 4 :). 367-37
0; Emerich et al., 1994, Exp. Neurol. 130: 141-1
50), the inventors of some earlier studies (Davies et al., 1992, N.
eurosci. Lett. 140: 161-164; Venero et al., 199.
4, Neuroscience 61: 257-268; Kordower et al.,
1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 9077-.
9080), no purified NGF had a pro-survival effect on these neurons. This finding suggests that NGF is not the only mediator of neuroprotection provided by NGF-secreting fibroblasts. However, we have discovered that a large dark-staining, presumably cholinergic interneuron, was reported previously (Davies et al., 1992, Neurosci).
． Lett. 140: 161-164; Kordower et al., 1994, Pro.
c. Natl. Acad. Sci. USA 91: 9077-9080; Per.
ez-Navarro et al., 1994, Eur. J. Neurosci. 6:70
6-711), and was observed to be more prominent in the brain treated with NGF. Striatal expression of the high-affinity NGF receptor TrkA is restricted to cholinergic interneurons (Steininger et al., 1993, Brain).
Res. 612: 330-335), which is the NGF for these neurons.
, Which is consistent with the finding of selective action of BNF, on the other hand, the high-affinity receptors for BDNF and NT-3 (TrkB and TrkC) are expressed by many medium-sized striatal neurons (Altar et al. , 1994, Eur. J. Ne.
urosci. 6: 1389-1405). BDNF and NT-3 (NGF
Unlike,) promotes in vitro survival and phenotypic differentiation of embryonic, GABAergic, striatal output neurons (Mizuno et al., 1994, Dev. Bio).
l. 165: 243-256; Ventimiglia et al., 1995, Eur.
J. Neurosci). Furthermore, these neurotrophins may protect certain neuronal populations from glutamate toxicity in vitro (Lindholm).
Et al., 1993, Eur. J. Neurosci. 5: 1455-1464; Sh
imohama et al., 1993, Neurosci. Lett. 164: 55-5
8; Cheng et al., 1994, Brain Res. 640: 56-67). Nevertheless, infusion of BDNF or NT-3 does not appear to protect striatal output neurons against NMDA receptor-mediated excitotoxicity in vivo, but at comparable doses of BDNF or NT-3. Intracerebral injection induces overt biological effects in the striatum and elsewhere in the brain (Lindsay et al., 199).
4, TINS 17: 182-190). Contrasting results between in vivo and in vitro studies show differences in neuronal types (striatum vs hippocampus, cortex or cerebellum),
Differences in the developmental stage of neurons (adult versus embryonic) or the presence of glutamatergic synaptic input in vivo may be explained.

【０１５５】 ＣＮＴＦレセプターリガンドによって提示される神経保護効果は、中程度の大
きさの線条体ニューロン上での直接的な作用を通して生じ得る。なぜなら、線条
体には、ＣＮＴＦレセプターの成分（ＣＮＴＦＲα、ＬＩＦＲβ、ｇｐ１３０）
についてのｍＲＮＡが豊富に発現しているからである（ｌｐら、１９９３、Ｎｅ
ｕｒｏｎ １０：８９−１０２；Ｒｕｄｇｅら、１９９４、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕ
ｒｏｓｃｉ．６：６９３−７０５）。潜在的なメカニズムとしては、グルタミン
酸レセプターの発現または機能の改変（それによってグルタミン酸作動性刺激に
対するニューロンの感受性を改変する）か、または細胞質内のカルシウムイオン
濃度を調節するニューロンの能力の増強を含み得、ここにおける増加は、神経変
性プロセスを開始する重要な事象であると考えられる（Ｃｈｏｉ，Ｄ．Ｗ．１９
８８．Ｎｅｕｒｏｎ １：６２３−６３４）。ＣＮＴＦがグルタミン酸レセプタ
ーのアンタゴニストとして作用して、キノリン酸毒性をブロックする可能性は有
りそうにない。なぜなら、ＣＮＴＦは、インビトロでグルタミン酸の毒性作用を
ブロックしないからである（Ｍａｔｔｓｏｎら、１９９５、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈ
ｅｍ．６５：１７４０−１７５１）。The neuroprotective effects presented by CNTF receptor ligands can occur through direct action on medium-sized striatal neurons. Because, in the striatum, the components of the CNTF receptor (CNTFRα, LIFRβ, gp130)
Is expressed abundantly (Ip et al., 1993, Ne.
uron 10: 89-102; Rudge et al., 1994, Eur. J. Neu
rosci. 6: 693-705). Potential mechanisms may include alterations in glutamate receptor expression or function (thus altering neuronal sensitivity to glutamatergic stimuli), or enhanced neuronal ability to regulate intracellular cytoplasmic calcium ion concentrations. , The increase here is thought to be a key event initiating the neurodegenerative process (Choi, D. W. 19
88. Neuron 1: 623-634). It is unlikely that CNTF acts as an antagonist of glutamate receptors and blocks quinolinic acid toxicity. Because CNTF does not block the toxic effects of glutamate in vitro (Mattson et al., 1995, J. Neuroch.
em. 65: 1740-1751).

【０１５６】 他方で、ＣＮＴＦレセプターリガンドは、潜在的に、線条体の他の成分を介し
て間接的に作用に作用し得る。例えば、キノリン酸への曝露の前の線条体への黒
質または皮質の投入の排除は、線条体ニューロンの喪失における有意な減少を生
じ（ＤｉＦｉｇｌｉａ，Ｍ．１９９０、Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１３
：２８６−２８９；Ｂｕｉｓｓｏｎら、１９９１、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ
．１３１：２５７−２５９）、このことは、外因性毒素および内因性神経伝達物
質の組合わせ作用が細胞死を誘導するために必要とされることを示す。従って、
グルタミン酸作動性シナプスまたはドーパミン作動性シナプスのいずれかでのシ
ナプス伝達における減少が、キノリン酸の注入から線条体ニューロンを保護する
ようである。星状細胞は、通常はインビボで検出可能なＣＮＴＦＲαを発現しな
いが（ｌｐら、１９９３、Ｎｅｕｒｏｎ １０：８９−１０２）、脳損傷によっ
て活性化される場合、またはインビトロで維持される場合には、星状細胞は全て
のＣＮＴＦレセプター成分を発現する（Ｒｕｄｇｅら、１９９４、Ｅｕｒ．Ｊ．
Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．６：６９３−７０５）。さらに、ＣＮＴＦの大脳内送達は、
グリア原線維の酸性タンパク質およびそのｍＲＮＡの含量の増加によって示され
るように、曝露の１０〜４８時間後に星状細胞を活性化するようである（Ｌｅｖ
ｉｓｏｎら、１９９５、Ｓｏｃ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ａｂｓｔ．２１：４９７；
Ｗｉｎｔｅｒら、１９９５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
９２：５８６５−５８６９）。ＣＮＴＦによって間接的または直接的にのいずれ
で活性化されるにかかわらず、星状細胞は、興奮性アミノ酸の壊死巣分離の増加
を通してか、またはニューロンを保護する物質の放出によってニューロンの生存
を促進し得る。On the other hand, CNTF receptor ligands can potentially act indirectly through other components of the striatum. For example, elimination of striatal substantia nigra or cortical input prior to exposure to quinolinic acid resulted in a significant reduction in striatal neuronal loss (DiFiglia, M. 1990, Trends Neurosci. 13).
: 286-289; Buisson et al., 1991, Neurosci. Lett
． 131: 257-259), indicating that the combined action of exogenous toxin and endogenous neurotransmitter is required to induce cell death. Therefore,
A decrease in synaptic transmission at either glutamatergic or dopaminergic synapses appears to protect striatal neurons from quinolinate infusion. Astrocytes usually do not express detectable CNTFRα in vivo (lp et al., 1993, Neuron 10: 89-102), but when activated by brain injury or maintained in vitro. Astrocytes express all CNTF receptor components (Rudge et al., 1994, Eur. J. et al.
Neurosci. 6: 693-705). Furthermore, intracerebral delivery of CNTF is
It appears to activate astrocytes 10-48 hours after exposure, as shown by the increased content of glial fibrillary acidic protein and its mRNA (Lev).
ison et al., 1995, Soc. Neurosci. Abst. 21: 497;
Winter et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
92: 5865-5869). Astrocytes, whether activated indirectly or directly by CNTF, promote neuronal survival either through increased necrotic segregation of excitatory amino acids or by release of substances that protect neurons. You can

【０１５７】 本研究において、ＣＮＴＦレセプター媒介性事象によって、興奮毒性損傷から
保護される線条体ニューロンの集団は、ハンティングトン病において選択的に喪
失されるものと同じ型である（Ａｌｂｉｎら、１９８９、Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕ
ｒｏｓｃｉ．１２：３６６−３７５）。興奮毒性刺激とハンティングトン病遺伝
子の発現の増加との間の潜在的な関連が、近年示唆されてきた（Ｃａｒｌｏｃｋ
ら、１９９５、ＮｅｕｒｏＲｅｐｏｒｔ ６：１１２１−１１２４；Ｔａｔｔｅ
ｒら、１９９５、ＮｅｕｒｏＲｅｐｏｒｔ ６：１１２５−１１２９）。ハンテ
ィングトン病を導くメカニズムを同定するために、広範な研究が進行中であるが
、現存の証拠の多くは、ＮＭＤＡレセプター媒介性興奮毒性についての役割を明
らかに意味する（ＤｉＦｉｇｌｉａ，Ｍ．１９９０、Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏ
ｓｃｉ．１３：２８６−２８９）。In this study, the population of striatal neurons protected from excitotoxic damage by CNTF receptor-mediated events is of the same type that is selectively lost in Huntington's disease (Albin et al., 1989). , Trends Neu
rosci. 12: 366-375). A potential link between excitotoxic stimulation and increased expression of the Huntington's disease gene has recently been suggested (Carlock.
Et al., 1995, NeuroReport 6: 1121-1124; Tatte.
r et al., 1995, NeuroReport 6: 1125-1129). Extensive research is ongoing to identify the mechanisms leading to Huntington's disease, but much of the existing evidence clearly implicates a role for NMDA receptor-mediated excitotoxicity (DiFiglia, M. 1990, Trends Neuro
sci. 13: 286-289).

【０１５８】 （実施例８：アキソカイン（ａｘｏｋｉｎｅ）タンパク質のＰＥＧ化） タンパク質のＰＥＧ化は、安定性およびバイオアベイラビリティを増強する一
方で免疫原性を最小化することによって、それらのインビボでの効力を増強する
ことが示されている。特定のタンパク質の特性が、ポリエチレングリコール（Ｐ
ＥＧ）ポリマーの付着によって調節され得ることは公知であり、これはタンパク
質の流体力学的容積を増加して、それによって腎の濾過によるそのクリアランス
を緩徐にする（例えば、Ｃｌａｒｋ，Ｒ．ら、１９９６、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．２７１：２１９６９−２１９７７を参照のこと）。本発明者らは、Ａｘ−１
３に対してポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を共有結合的に連結することによ
って、ＰＥＧ化したアキソカインを産生した。本発明者らはまた、改変されてい
ない分子からアキソカインの異なるＰＥＧ化形態を分離するための精製方法を開
発した。ＰＥＧ化Ａｘ−１３は、ＰＥＧ化されていないＡｘ−１３よりも、生理
学的ｐＨにおいてより可溶性でありそして安定な特性を有する。ＰＥＧ化は、Ａ
ｘ−１３の薬物速度論的特性を顕著に増強することが示されており、そして他の
アキソカイン分子の特性を同様に増強することが期待される。Example 8: PEGylation of axokine proteins Protein PEGylation enhances stability and bioavailability while minimizing their immunogenicity, thereby enhancing their in vivo potency. It has been shown to enhance. The properties of a particular protein depend on polyethylene glycol (P
It is known that it can be regulated by the attachment of EG) polymers, which increases the hydrodynamic volume of the protein, thereby slowing its clearance by renal filtration (eg Clark, R. et al. 1996. , J. Biol. Che
m. 271: 21969-21977). The present inventors have found that Ax-1
A PEGylated axocaine was produced by covalently linking polyethylene glycol (PEG) to 3. We have also developed a purification method to separate different pegylated forms of axocaine from the unmodified molecule. PEGylated Ax-13 is more soluble and has stable properties at physiological pH than non-PEGylated Ax-13. PEGylation is A
It has been shown to significantly enhance the pharmacokinetic properties of x-13, and is expected to similarly enhance the properties of other axocaine molecules.

【０１５９】 Ｅ．ｃｏｌｉに由来する精製Ａｘ−１３を、これらの研究のために使用した。
２０ｋＤのｍＰＥＧ−ＳＰＡをＳｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｂｉ
ｃｉｎｅ（Ｓｉｇｍａ）から得、そしてＴｒｉｓ−グリシンの成型済みゲルをＮ
ｏｖｅｘ，ＣＡから得た。小規模の反応研究を、反応条件を決定するために組み
立てた。２０ｋＤのｍＰＥＧ ＳＰＡを、アミンを含まない緩衝液（ｐＨ８．１
）中で４℃にて、精製Ａｘ−１３（最終濃度０．６ｍｇ／ｍｌ）と反応させた。
タンパク質に対するＰＥＧのモル濃度比を変化させ、そして２つの反応時間を使
用した。大過剰の一級アミンの添加によって反応を停止した。反応産物を還元Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。主要な改変種を、約６０ｋＤの分子量で泳動
した。より高い分子量で泳動したより高次元の改変バンドもまた観察された。こ
の研究に基づいて、タンパク質に対するＰＥＧの割合が４での一晩の反応を選択
した。E. Purified Ax-13 from E. coli was used for these studies.
20kD mPEG-SPA was added to Shearwater Polymers, Bi
Cine (Sigma), and pre-cast gel of Tris-glycine.
Obtained from ovex, CA. A small reaction study was set up to determine the reaction conditions. A 20 kD mPEG SPA was added to an amine-free buffer (pH 8.1).
) At 4 ° C in purified Ax-13 (final concentration 0.6 mg / ml).
The molar ratio of PEG to protein was varied and two reaction times were used. The reaction was stopped by the addition of a large excess of primary amine. Reduction of reaction product S
Analyzed by DS-PAGE. The major variant ran at a molecular weight of approximately 60 kD. Higher order modified bands migrating at higher molecular weights were also observed. Based on this study, an overnight reaction with a PEG to protein ratio of 4 was selected.

【０１６０】 ０．６ｍｇ／ｍｌでのＡｘ−１３は、Ｂｉｃｉｎｅ緩衝液中で２０ｋＤのｍＰ
ＥＧ ＳＰＡと反応した（４℃にて一晩、ｐＨ８．１）。大過剰の一級アミンを
添加することによって、反応を停止した。この反応産物を低塩緩衝液で希釈し、
そしてイオン交換カラムにかけた。このカラムを低塩緩衝液で洗浄し、そしてＮ
ａＣｌ勾配を用いて溶出した。より高次元の形態（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で見かけ
上の分子量が６６ｋＤを超える）間での良好な分離、約６０ｋＤで泳動した明確
な改変種と改変されていないＡｘ−１３とが得られた。６０ｋＤのバンドに対応
する画分を、バイオアッセイで試験した。６０ｋＤのバンドに対応する画分にお
いて、非常にわずかな改変されていないＡｘ−１３のバンドが認められた。バイ
オアッセイの結果がこの物質によって有意に影響されていないことを確証するた
めに、６０ｋＤのバンドをサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によってさ
らに精製した。このクロマトグラフィーは、改変されていないＡｘ−１３と６０
ｋＤのバンドとの間で基線となる分離を生じた。この精製された改変Ａｘ−１３
をバイオアッセイにおいて試験した。そしてこの結果は、ＳＥＣ前の材料で得ら
れた結果と識別不可能であった。Ax-13 at 0.6 mg / ml gave 20 kD mP in Bicine buffer.
Reacted with EG SPA (4 ° C. overnight, pH 8.1). The reaction was stopped by adding a large excess of primary amine. Dilute the reaction product with low salt buffer,
Then it was applied to an ion exchange column. The column is washed with low salt buffer and N
Elute with an aCl gradient. Good separation between higher dimensional morphologies (apparent molecular weight> 66 kD on SDS-PAGE) was obtained, with distinct variants migrating at approximately 60 kD and unmodified Ax-13. The fraction corresponding to the 60 kD band was tested in the bioassay. In the fraction corresponding to the 60 kD band, a very slight unmodified Ax-13 band was observed. The 60 kD band was further purified by size exclusion chromatography (SEC) to confirm that the bioassay results were not significantly affected by this material. This chromatography was performed on unmodified Ax-13 and 60
A baseline separation occurred with the kD band. This purified modified Ax-13
Was tested in a bioassay. And this result was indistinguishable from the result obtained with the material before SEC.

【０１６１】 （実施例９：Ａｘ−１５発現プラスミドｐＲＧ６４３の構築） 発現プラスミドｐＲＧ６３２は、アンピシリン耐性およびヒトＣＮＴＦ−Ｃ１
７Ａ、Ｑ６３Ｒ、ΔＣ１３についての遺伝子（本明細書中で、Ａｘ１またはＡｘ
−１３のいずれかともいわれる）をコードし、唯一のＥａｇＩ制限酵素認識配列
を終止コドンに対して３’に有する高コピー数のプラスミドである。このプラス
ミドを使用して、ΔＣ１５変異を組み込んだ１８７ｂｐのＢｓｅＲＩ−Ｅａｇ１
ＤＮＡフラグメントをＰＣＲ増幅することにより、ヒトＣＮＴＦ変異Ｃ１７Ａ
、Ｑ６３Ｒ、ΔＣ１５（Ａｘ−１５と命名する）を構築した。５’プライマー｛
ΔＣ１５−５’（５’−ＣＣＡＧＡＴＡＧＡＧＧＡＧＴＴＡＡＴＧＡＴＡＣＴＣ
ＣＴ−３’）｝は、ＢｓｅＲＩ部位をコードし、そして３’プライマーであるΔ
Ｃ１５−３’｛（５’−ＧＣＧＴＣＧＧＣＣＧＣＧＧＡＣＣＡＣＧＣＴＣＡＴＴ
ＡＣＣＣＡＧＴＣＴＧＴＧＡＧＡＡＧＡＡＡＴＧ−３’）｝は、Ｇｌｙ１８５で
終結するＡｘ−１５遺伝子のＣ−末端と、次いで２つの終止コドンおよびＥａｇ
Ｉ制限酵素認識配列をコードする。このＤＮＡフラグメントを、ＢｓｅＲＩおよ
びＥａｇＩで消化し、そしてｐＲＧ６３２中の同じ部位に連結した。得られたプ
ラスミド（ｐＲＧ６３９）は、Ａｘ−１５（ヒトＣＮＴＦ Ｃ１７Ａ、Ｑ６３Ｒ
、ΔＣ１５）についての遺伝子をコードする。次いで、このΔＣ１５変異を、３
３９ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−ＥａｇＩ ＤＮＡフラグメントとして、ｐＲＧ４２
１内の対応部位中に転移した。このｐＲＧ４２１は、カナマイシン耐性およびヒ
トＣＮＴＦ Ｃ１７Ａ、Ｑ６３Ｒ、ΔＣ１３についての遺伝子をコードする高コ
ピー数の発現プラスミドである。得られたプラスミド（ｐＲＧ６４３）は、ｌａ
ｃＵＶ５プロモーターの転写制御下でＡｘ−１５についての遺伝子をコードし、
そしてカナマイシン耐性を付与する。このＡｘ−１５遺伝子のＤＮＡ配列を、配
列決定分析によって確認した。Example 9: Construction of Ax-15 expression plasmid pRG643 Expression plasmid pRG632 was ampicillin resistant and human CNTF-C1.
Genes for 7A, Q63R, ΔC13 (herein, Ax1 or Ax
-13), and has a unique EagI restriction enzyme recognition sequence 3 ′ to the stop codon. Using this plasmid, a 187 bp BseRI-Eag1 incorporating the ΔC15 mutation was constructed.
By PCR amplification of the DNA fragment, human CNTF mutant C17A
, Q63R, ΔC15 (named Ax-15) was constructed. 5'primer {
ΔC15-5 '(5'-CCAGATAGAGGAGGTTAATGATACTC
CT-3 ′)} encodes the BseRI site and is the 3 ′ primer Δ
C15-3 '{(5'-GCGTCGGCCGCGGACCACGCTCATT
ACCCAGTCTGTGAGAAGAAATG-3 ')} is the C-terminus of the Ax-15 gene ending at Gly185, followed by two stop codons and Eag.
Encodes an I restriction enzyme recognition sequence. This DNA fragment was digested with BseRI and EagI and ligated into the same sites in pRG632. The resulting plasmid (pRG639) was Ax-15 (human CNTF C17A, Q63R).
, ΔC15). Then, this ΔC15 mutation was changed to 3
As a 39 bp HindIII-EagI DNA fragment, pRG42
It has metastasized to the corresponding site within 1. This pRG421 is a high copy number expression plasmid encoding genes for kanamycin resistance and human CNTF C17A, Q63R, ΔC13. The resulting plasmid (pRG643) is la
encodes the gene for Ax-15 under the transcriptional control of the cUV5 promoter,
And it imparts kanamycin resistance. The DNA sequence of this Ax-15 gene was confirmed by sequencing analysis.

【０１６２】 （実施例１０：Ａｘ−１５タンパク質の小規模の発現および精製） ｐＲＧ６３９を含有するＥ．ｃｏｌｉのＲＦＪ１４１株を、ＬＢ培地中で増殖
し、そしてＡｘ−１５タンパク質の発現を、ラクトースの１％（ｗ／ｖ）までの
添加によって誘導した。誘導された細胞を遠心分離によって回収し、２０ｍＭの
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５ｍＭのＥＤＴＡ，１ｍＭのＤＴＴ中に再懸
濁し、そして１０，０００ｐｓｉでフレンチプレスセルを通過させることによっ
て溶解した。この細胞溶解物を遠心分離し、そしてペレットを８Ｍのグアニジニ
ウム−ＨＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、０．０５ｍＭのＥ
ＤＴＡ中に再懸濁し、次いで５容量の５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３
）、０．０５ｍＭのＥＤＴＡ（緩衝液Ａ）を用いて希釈し、次いで緩衝液Ａに対
して透析した。透析物を、緩衝液Ａで平衡化したＱ−セファロースカラム上にロ
ードした。Ａｘ−１５タンパク質を、１０カラム容量の緩衝液中で１ＭのＮａＣ
ｌに対する線形勾配によって溶出した。Ａｘ−１５を含有する画分をプールし、
そして固形（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄の緩徐な添加とその一方でのＮａＯＨの添加により
ｐＨを８．３に維持することによって、１Ｍの（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄にした。このプ
ールを、緩衝液Ａ中の１Ｍ（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄を用いて平衡化されたフェニル−セ
ファロースカラム上にロードした。このカラムを緩衝液Ａ中の０．５Ｍの（ＮＨ ₄ ）₂ＳＯ₄を用いて洗浄し、そしてＡｘ−１５タンパク質を、（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄濃
度を減少する線形勾配によって溶出した。Ａｘ−１５タンパク質を含有する画分
をプールし、５ｍＭのＮａＰＯ₄（ｐＨ８．３）に対して透析し、次いで限外濾
過によって濃縮した。濃縮されたプールを５ｍＭのＮａＰＯ₄（ｐＨ８．３）を
用いて平衡化されたＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−１００カラム上に分画した。[0162]     Example 10: Small-scale expression and purification of Ax-15 protein.   E. coli containing pRG639. RFJ141 strain of E. coli is grown in LB medium
Expression of Ax-15 protein up to 1% (w / v) of lactose.
Induced by addition. Induced cells were harvested by centrifugation and 20 mM
Resuspend in Tris-HCl (pH 8.3), 5 mM EDTA, 1 mM DTT.
Turbidity and by passing through a French press cell at 10,000 psi
Dissolved. The cell lysate was centrifuged and the pellet was washed with 8M guanidinium.
Um-HCl, 50 mM Tris-HCl (pH 8.3), 0.05 mM E
Resuspend in DTA, then 5 volumes of 50 mM Tris-HCl (pH 8.3).
), Diluted with 0.05 mM EDTA (buffer A) and then buffer A
And dialyzed. The dialysate was filtered on a Q-Sepharose column equilibrated with buffer A.
Read. Ax-15 protein was treated with 1 M NaC in 10 column volumes of buffer.
Elution with a linear gradient to l. Fractions containing Ax-15 were pooled,
And solid (NH_Four)₂SO_FourSlow addition and NaOH addition on the other hand
By maintaining the pH at 8.3, 1M (NH_Four)₂SO_FourI chose This program
1M (NH in buffer solution A_Four)₂SO_FourEquilibrated with phenyl-se
Loaded on a Fallose column. The column was loaded with 0.5M (NH _Four )₂SO_FourAnd washed Ax-15 protein with (NH_Four)₂SO_FourDark
Elution with a linear gradient of decreasing degree. Fraction containing Ax-15 protein
Pooled with 5 mM NaPO_FourDialyzed against (pH 8.3) then ultrafiltered
Concentrated by filtration. Concentrate the pool with 5 mM NaPO_Four(PH 8.3)
Fractionation on a Sephacryl S-100 column equilibrated with.

【０１６３】 （実施例１１：Ａｘ−１５タンパク質の大規模の発現および精製） ｌａｃプロモーターの制御下でＡｘ−１５タンパク質を発現する、組換えのカ
ナマイシン耐性Ｅ．ｃｏｌｉ ＲＦＪ１４１株（ｐＲＧ６４３）を、２０μｇ／
ｍｌのカナマイシンを含有する最少塩のグルコース培地中で、３０〜３５のＡＵ ₅₅₀ （５５０ｎＭの吸光度）の中間密度まで増殖させた。Ａｘ−１５タンパク質
の発現をＩＰＴＧ（イソプロピルチオガラクトシド）を１．０ｍＭまで添加する
ことによって誘導し、そしてさらに８時間発酵を持続した。Ａｘ−１５タンパク
質を、ＩＰＴＧ誘導後に不溶性の封入体として発現した。誘導後、細胞を回収し
、細胞のペーストを濃縮し、そしてＡＧＴ５００，０００の分子量カットオフ（
ｍｗｃｏ）の中空繊維ダイアフィルトレーション（ＡＣＧ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｉｅｓ、Ｉｎｃ．）を介して、２０ｍＭのＴｒｉｓ、１．０ｍＭのＤＴＴ，５．
０ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．５）に緩衝液交換した。連続的フローの高圧（８，
０００ｐｓｉを超える）Ｎｉｒｏ Ｓｏａｖｉホモジナイザーを通して、冷却し
た（０〜１０℃）細胞ペースト懸濁物を繰り返し通過させて破壊することによっ
て、封入体を、回収された細胞から放出した。ホモジネートを、冷却した（４〜
８℃）連続フローの高速（１７，０００×Ｇを超える）Ｓｈａｒｐｌｅｓ遠心分
離器（ｓｏｕｒｃｅ）を２回通過させて、封入体を回収した。回収された封入体
を、１．０ｍＭのＤＴＴを伴う８．０ＭのグアニジンＨＣＬ中に抽出した。Ａｘ
−１５タンパク質／グアニジン溶液を、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１．０ｍ
ＭのＤＴＴ、０．０５ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０〜８．３）中に希釈し、そし
てＡＧＴ５，０００ｍｗｃｏ中空繊維フィルター（ＡＣＧ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いて希釈緩衝液に対してダイアフィルトレーションした
。再折り畳みされたＡｘ−１５を含有する得られた溶液を、クロマトグラフィー
精製の前にＭｉｃｒｏｇｏｎの０．２２μｍ中空繊維フィルター（ＡＣＧ Ｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を通して濾過した。[0163]     Example 11: Large-scale expression and purification of Ax-15 protein.   A recombinant mosquito expressing Ax-15 protein under the control of the lac promoter.
Namycin resistant E. coli RFJ141 strain (pRG643) at 20 μg /
30-35 AU in minimal salt glucose medium containing ml kanamycin. ₅₅₀ Grows to an intermediate density (absorbance of 550 nM). Ax-15 protein
Expression of IPTG (isopropyl thiogalactoside) is added up to 1.0 mM
Induction and continued fermentation for an additional 8 hours. Ax-15 protein
Quality was expressed as insoluble inclusion bodies after IPTG induction. After induction, collect the cells
, The cell paste was concentrated, and the molecular weight cutoff of AGT 500,000 (
mwco) hollow fiber diafiltration (ACG Technology)
ies, Inc. ), 20 mM Tris, 1.0 mM DTT, 5.
The buffer was exchanged with 0 mM EDTA (pH 8.5). Continuous flow of high pressure (8,
Cool through a Niro Soavi homogenizer (> 000 psi)
By repeatedly passing through (0-10 ° C) cell paste suspension to break.
Inclusion bodies were released from the harvested cells. The homogenate was cooled (4 ~
8 ° C) continuous flow high speed (> 17,000 x G) Sharples centrifuge
The inclusion bodies were collected by passing through the source twice. Inclusion bodies recovered
Was extracted into 8.0 M guanidine HCL with 1.0 mM DTT. Ax
-15 protein / guanidine solution, 50 mM Tris-HCl, 1.0 m
Dilute in M DTT, 0.05 mM EDTA (pH 8.0-8.3) and
AGT 5,000mwco hollow fiber filter (ACG Technology
ies, Inc. ) Was used to diafilter against dilution buffer
. The resulting solution containing the refolded Ax-15 was chromatographed.
Prior to purification, Microgon's 0.22 μm hollow fiber filter (ACG Te
chnologies, Inc. ).

【０１６４】 （実施例１２−再折り畳みされたＡｘ−１５のカラムクロマトグラフィー精
製） 上記のように濾過されたＡｘ−１５溶液を、１０．９ｍｇ／ｍｌ樹脂で１６．
４ＬのＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラム上にロード
し、そして５０Ｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０〜８．３）、１．０ｍＭの
ＤＴＴ、および０．０５ｍＭのＥＤＴＡ緩衝液で洗浄した。Ａｘ−１５タンパク
質を同じＴｒｉｓ緩衝液中で、１２０ｍＭ ＮａＣｌの工程を用いてカラムから
溶出した。以前に確立した、ピークの上昇部分にある最大Ａ₂₈₀の４０％および
ピークの下降部分にある最大Ａ₂₈₀の２０％の２８０ｎＭ吸光度基準を超える溶
出物をプールし、冷凍保存（−３０℃）するかまたは精製手順の次の工程に使用
するかのいずれかを行った。プールされた溶出Ａｘ−１５タンパク質を、ｐＨを
８．０〜８．３に維持しつつ、固形化合物を段階的に添加することによって１．
０Ｍの硫酸アンモニウムへと調整した。この溶液を０．２２μｍのＳａｒｔｏｒ
ｉｏｕｓカプセルフィルターを通して濾過し、８．２４ｍｇ／ｍｌ樹脂で１２．
５ＬのフェニルＳｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラム上にロ
ードし、そして０．０５ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０〜８．３）を含む５０ｍＭ
のＴｒｉｓ緩衝液中の５５Ｌの１．０Ｍの硫酸アンモニウムを用いて洗浄した。
同じＴｒｉｓ緩衝液中の２５０ｍＭの硫酸アンモニウムを用いた１２．０Ｌの洗
浄に続いて、Ａｘ−１５タンパク質を、１２５ｍＭの硫酸アンモニウム、Ｔｒｉ
ｓ緩衝液洗浄工程を用いて溶出した。以前に確立した、ピークの上昇部分にある
最大Ａ₂₈₀の１００％およびピークの下降部分にある最大Ａ₂₈₀の２０％の２８０
ｎＭ吸光度基準を超える溶出物をプールした。溶出物を、その伝導度を減少させ
るために、塩を含まない５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０〜８．３）緩衝液中に
、１：４に同時に希釈した。プールされた物質を、冷凍保存（−３０℃）するか
、または次の工程に使用した。プールされた疎水性相互作用クロマトグラフィー
（ＨＩＣ）物質を２５Ｌに濃縮し、そして５，０００ｍｗｃｏのＡＧＴ中空繊維
フィルター（ＡＣＧ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．）を使用して、５．
０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０〜８．３）に対してダイアフィル
トレーションした。濃縮（８５％）リン酸を段階的に添加することによって、ス
ルフィル（ｓｕｌｆｙｌ）プロピル高速流（ＳＰ ＦＦ）Ｓｅｐｈａｒｏｓｅク
ロマトグラフィーの直前にｐＨを７．０〜７．２に調整した。ｐＨを調整したプ
ールされた物質を、９．０ｍｇ／ｍｌ樹脂まで７．７ＬのＳＰ ＦＦ Ｓｅｐｈ
ａｒｏｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラム上にロードし、そして最少の２５Ｌの
５．０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて洗浄した。Ａｘ−
１５タンパク質を、５．０ｍＭのリン酸ナトリウム、１３０ｍＭのＮａＣｌ（ｐ
Ｈ７．０〜７．２）の７７．０Ｌの工程で溶出した。溶出物を、その伝導度を減
少させそしてｐＨを上昇させるために、塩を含まない１０．０ｍＭのリン酸ナト
リウム（ｐＨ９．０〜９．２）緩衝液中に、１：５に同時に希釈した。ピークの
上昇部分にある最大Ａ₂₈₀の２０％およびピークの下降部分にある最大Ａ₂₈₀の２
０％を超えるピーク物質をプールした。プールしたＡｘ−１５タンパク質を、冷
凍保存（−３０℃）するか、または次の工程に使用した。プールしたＳＰ ＦＦ
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ａｘ−１５タンパク質を濃縮し、そして５，０００ｍｗ
ｃｏのＡＧＴ中空線維フィルター（ＡＣＧ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ
．）を用いて、５．０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ８．０〜８．３）緩衝液に
対してダイアフィルトレーションした。プール（２４．６６ｇ）を、５．０Ｌ以
下に濃縮した。濃縮され、ダイアフィルトレーションされたＡｘ−１５タンパク
質を５０ＬのＳ−１００ Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）サイジン
グカラム上にロードし、そして２５０Ｌの同じ５．０ｍＭのリン酸ナトリウム緩
衝液（ｐＨ８．０〜８．３）を用いて溶出した。ピークの上昇部分にある最大Ａ ₂₈₀ の４０％およびピークの下降部分にある最大Ａ₂₈₀の４０％を超えるピーク物
質をプールした。プールされたＡｘ−１５タンパク質を、Ｍｉｌｌｉｐａｋ ０
．２２μｍフィルターを通して濾過し、そして調剤または処方の前に保存（−８
０℃）した。作製されたＡｘ−１５のアミノ酸配列は、以下の通りである。ある
いは、最初のアラニンの前にメチオニン残基を含む配列を作製し得る。[0164]     Example 12-Column chromatographic purification of refolded Ax-15.
Made)   The Ax-15 solution, filtered as described above, was loaded with 10.9 mg / ml resin 16.
Load on a 4L DEAE Sepharose (Pharmacia) column
And 50 L of 50 mM Tris, pH 8.0-8.3, 1.0 mM
Wash with DTT and 0.05 mM EDTA buffer. Ax-15 protein
The quality was removed from the column using the step of 120 mM NaCl in the same Tris buffer.
It eluted. The previously established maximum A in the rising part of the peak₂₈₀40% of
Maximum A in the descending part of the peak₂₈₀20% of 280 nM absorbance
The output is pooled and stored frozen (-30 ° C) or used in the next step of the purification procedure.
You either did it. The pooled eluted Ax-15 protein was adjusted to pH
By adding solid compound stepwise while maintaining at 8.0-8.3: 1.
Adjusted to 0M ammonium sulfate. Add this solution to a 0.22 μm Sartor
Filter through an ios capsule filter, 12.24 mg / ml resin.
A 5 L phenyl Sepharose HP (Pharmacia) column
And 50 mM containing 0.05 mM EDTA (pH 8.0-8.3)
Washed with 55 L of 1.0 M ammonium sulfate in Tris buffer.
12.0 L wash with 250 mM ammonium sulfate in the same Tris buffer
Following purification, Ax-15 protein was added to 125 mM ammonium sulfate, Tri
Elution was performed using a s buffer wash step. In the rising part of the peak, established earlier
Maximum A₂₈₀100% of the maximum and the maximum A in the descending part of the peak₂₈₀20% of 280
Eluates above the nM absorbance standard were pooled. The eluate, reducing its conductivity
In salt-free 50 mM Tris (pH 8.0-8.3) buffer
, 1: 4 at the same time. Whether the pooled material should be stored frozen (-30 ° C)
, Or used in the next step. Pooled hydrophobic interaction chromatography
(HIC) material concentrated to 25 L and 5,000 mwco AGT hollow fiber
4. Using a filter (ACG Technologies, Inc.)
Diafill for 0 mM sodium phosphate buffer (pH 8.0-8.3)
I've been tractioned. By adding concentrated (85%) phosphoric acid stepwise,
Sulfyl Propyl High Speed Flow (SP FF) Sepharose
The pH was adjusted to 7.0-7.2 immediately before the chromatographic. pH adjusted
7.7 L of SP FF Seph to 9.0 mg / ml resin.
arose (Pharmacia) column and loaded with a minimum of 25 L
The cells were washed with 5.0 mM sodium phosphate buffer (pH 7.0). Ax-
15 proteins were added to 5.0 mM sodium phosphate, 130 mM NaCl (p
H7.0-7.2) was eluted in the step of 77.0L. Reduce the conductivity of the eluate
Salt-free 10.0 mM sodium phosphate to reduce and raise pH
Co-diluted 1: 5 in urium (pH 9.0-9.2) buffer. Peak
Maximum A in the ascending part₂₈₀20% of the maximum and the maximum A in the descending part of the peak₂₈₀Of 2
Greater than 0% of peak material was pooled. The pooled Ax-15 protein was chilled
It was stored frozen (-30 ° C) or used in the next step. Pooled SP FF
  Sepharose Ax-15 protein concentrated and 5,000 mw
Co AGT Hollow Fiber Filter (ACG Technologies, Inc)
． ) To a 5.0 mM sodium phosphate (pH 8.0-8.3) buffer solution.
I did diafiltration. Pool (24.66g), 5.0L or less
Concentrated below. Concentrated and diafiltered Ax-15 protein
Quality of 50L S-100 Sephacryl (Pharmacia) cydin
Load onto a column and 250 L of the same 5.0 mM sodium phosphate buffer.
Elution was performed with a buffer solution (pH 8.0 to 8.3). Maximum A in the rising part of the peak ₂₈₀ A at 40% of the peak and the descending part of the peak₂₈₀More than 40% of peaks
Quality pooled. Pooled Ax-15 protein was added to Millipak 0
． Filter through a 22 μm filter and store (−8 before formulation or formulation).
0 ° C). The amino acid sequence of the prepared Ax-15 is as follows. is there
Alternatively, a sequence can be made that contains a methionine residue before the first alanine.

【０１６５】[0165]

【化１】 （実施例１３−肥満症の処置のためのＡｘ−１５の使用） （動物モデル） （正常マウス） 正常な（８週齢）Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを、Ｔａｃｏｎｉｃから入手した。
このマウスに、ビヒクルまたはＡｘ−１５の皮下注射を毎日した。この動物を毎
日計量し、そして２４時間の食物摂取量を、３日目と４日目との間に測定した。[Chemical 1] Example 13-Use of Ax-15 for the Treatment of Obesity Animal Model Normal Mice Normal (8 weeks old) C57BL / 6J mice were obtained from Taconic.
The mice received daily subcutaneous injections of vehicle or Ax-15. The animals were weighed daily and 24-hour food intake was measured between days 3 and 4.

【０１６６】 （ｏｂ／ｏｂマウス） 第６染色体における単一遺伝子の変異の結果、ｏｂ／ｏｂマウスは、短縮され
た、非機能的遺伝子産物（レプチン）を産生する。これらのマウスは、摂食亢進
症で、高インスリン血症で、かつ明らかに肥満であった。Ob / ob Mice As a result of a single gene mutation on chromosome 6, ob / ob mice produce a truncated, non-functional gene product (leptin). These mice were hyperphagic, hyperinsulinemia, and clearly obese.

【０１６７】 Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ ｏｂ／ｏｂマウスを、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙから入手し、そして１２〜１４週齢で実験に用いた。このマウスに、ビヒク
ル、Ａｘ−１５またはレプチンの皮下注射を毎日した。対飼養（ｐａｉｒ−ｆｅ
ｄ）群に、動物をＡｘ−１５（０．３ｍｇ／ｋｇ）で処置することによって消費
される平均量（ｇ）の食物を与えた。体重を毎日入手し、そして２４時間の食物
摂取量を、３日目と４日目との間に測定した。８日目に、この動物を屠殺し、そ
して屠体分析を行った。C57BL / 6J ob / ob mice were placed in a Jackson Laboratory.
Obtained from ry and used in experiments at 12-14 weeks of age. The mice received daily subcutaneous injections of vehicle, Ax-15 or leptin. Pair feeding (pair-fe)
d) Group was fed the average amount (g) of food consumed by treating animals with Ax-15 (0.3 mg / kg). Body weight was obtained daily and 24-hour food intake was measured between days 3 and 4. On day 8, the animals were sacrificed and carcass analysis was performed.

【０１６８】 （食餌誘導性（Ｄｉｅｔ−ｉｎｄｕｃｅｄ）肥満症（ＤＩＯ）マウス） ＡＫＲ／Ｊマウスは、体脂肪含有量の増加によって、食餌誘導性肥満症に非常
に感受性であることが示された。遺伝環境（食餌）相互作用は、この種の食餌の
肥満症に関して完全には知られていないが、ヒト肥満症においても同様にこの遺
伝子型は多遺伝子性である。Diet-induced Obesity (DIO) Mice AKR / J mice have been shown to be highly susceptible to diet-induced obesity due to increased body fat content. Genetic environment (diet) interactions are not completely known for this type of diet obesity, but in human obesity this genotype is polygenic as well.

【０１６９】 ＡＫＲ／ＪマウスをＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手し、そし
て１０〜１２週齢で高脂肪食餌（４５％脂肪；Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔｓ）
を与えた。全ての実験は、高脂肪食餌の７週間後に開始した。このマウスに、ビ
ヒクル、Ａｘ−１５またはレプチンの皮下注射を毎日した。対飼養（ｐａｉｒ−
ｆｅｄ）群に、Ａｘ−１５（０．１ｍｇ／ｋｇ）で処置した動物によって消費さ
れる平均量（ｇ）の食物を与えた。この動物を毎日計量し、そして２４時間の食
物摂取量を、３日目と４日目との間に測定した。８日目に、この動物を屠殺し、
そして血清を、インスリン測定およびコルチコステロン測定のために得た。AKR / J mice were obtained from Jackson Laboratory and were fed a high fat diet (45% fat; Research Diets) at 10-12 weeks of age.
Was given. All experiments started 7 weeks after the high fat diet. The mice received daily subcutaneous injections of vehicle, Ax-15 or leptin. Pair feeding (pair-
The fed group was fed the average amount (g) of food consumed by animals treated with Ax-15 (0.1 mg / kg). The animals were weighed daily and 24-hour food intake was measured between days 3 and 4. On day 8, the animal was sacrificed,
Serum was then obtained for insulin and corticosterone measurements.

【０１７０】 （試薬：） 組換えヒトＡｘ−１５を、上記に示されるように製作し、そしてレプチンをＲ
＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから購入した。Reagents: Recombinant human Ax-15 was prepared as shown above and leptin was converted to R.
Purchased from & D Systems.

【０１７１】 （結果） （正常マウス） Ａｘ−１５は、用量依存様式で正常マウスにおいて体重を減少した。６日目に
、この動物は、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、および１ｍｇ／ｋｇで、
それぞれそれらの体重の約４％、１１％、および１６％を失った（図１７）。Results (Normal Mice) Ax-15 reduced body weight in normal mice in a dose-dependent manner. On day 6, the animals received 0.1 mg / kg, 0.3 mg / kg, and 1 mg / kg,
They lost about 4%, 11%, and 16% of their body weight, respectively (Figure 17).

【０１７２】 （ｏｂ／ｏｂマウス） ｏｂ／ｏｂマウスにおけるＡｘ−１５処置後の体重において、用量に関連した
（０．１ｍｇ／ｋｇ〜３ｍｇ／ｋｇ）減少が存在した（図１８）。０．１ｍｇ／
ｋｇ〜３ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で、体重の８％〜２５％の減少が存在した。特
定の用量のＡｘ−１５（０．３ｍｇ／ｋｇ）を対飼養動物は、この用量のＡｘ−
１５を与えられたマウスで同量の体重の減少を示した。このことは食物摂取量が
、体重減少の主な原因であることを示唆する。Ob / ob Mice There was a dose-related (0.1 mg / kg to 3 mg / kg) decrease in body weight after Ax-15 treatment in ob / ob mice (FIG. 18). 0.1 mg /
At doses ranging from kg to 3 mg / kg, there was a 8% to 25% reduction in body weight. A specific dose of Ax-15 (0.3 mg / kg) was fed to this dose of Ax-15.
Mice fed 15 showed the same amount of weight loss. This suggests that food intake is a major cause of weight loss.

【０１７３】 レプチンはまた、ｏｂ／ｏｂマウスにおける体重の減少に有効であった。１ｍ
ｇ／ｋｇでレプチンは、７日目までに６％の体重を減少し、これは０．１ｍｇ／
ｋｇでＡｘ−１５を与えた経過とほぼ同じ経過に従った（図１８）。Leptin was also effective in reducing body weight in ob / ob mice. 1m
Leptin at g / kg lost 6% body weight by day 7, which was 0.1 mg / kg.
Almost the same course of giving Ax-15 in kg was followed (Fig. 18).

【０１７４】 屠体分析は、Ａｘ−１５処置およびレプチン処置で、ならびに対飼養コントロ
ールにおいて、総体脂肪の有意な減少が存在したことを示した（表５）。ビヒク
ルコントロール動物と比較して、全ての群において、除脂肪量の少量だが有意で
はない減少が存在した。食餌制限（対飼養した）のみを受けたマウスは、ビヒク
ルコントロールと違いのない脂肪量／除脂肪量の割合を有した。このことは、そ
れらが、脂肪量および除脂肪量を等しく減少したことを示した。しかし、Ａｘ−
１５およびレプチン処置した動物は、脂肪量／除脂肪量の割合の減少によって反
映されるように体脂肪の優先的な減少を示した（表５）。Carcass analysis showed that there was a significant reduction in total body fat with Ax-15 treatment and leptin treatment, and in the paired controls (Table 5). There was a small but non-significant reduction in lean mass in all groups compared to vehicle control animals. Mice that received only dietary restriction (paired) had a fat / lean mass ratio similar to the vehicle control. This showed that they reduced fat and lean mass equally. However, Ax-
The 15 and leptin treated animals showed a preferential reduction in body fat as reflected by the reduction in fat / lean mass ratio (Table 5).

【０１７５】 （ＤＩＯマウス） Ａｘ−１５は、ＤＩＯマウスにおける体重を用量依存的に減少した。１週間以
内で、この動物は、Ａｘ−１５を０．１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、および
１ｍｇ／ｋｇで与えた場合、それぞれ、それらの体重の約１４％、約２６％、お
よび約３３％を失った（図１９）。Ａｘ−１５処置動物の効果と、対飼養コント
ロール動物の効果とを比較すると、２群の間に小さいが有意な差異が存在した。
このことは、食物摂取量の低下がおそらく主要であるが、それのみではない、Ａ
ｘ−１５処置での体重の減少の原因となることを示唆する。実際、Ａｘ−１５は
、ＤＩＯマウスにおける肥満症に関連した高インスリン血症を有意に減衰させる
が、単なる食物摂取量の減少（対飼養）は、減衰させなかった（図２０Ａ）。さ
らに、Ａｘ−１５は、食餌制限の一般的な効果であるコルチコステロンレベルの
上昇を引き起こさなかった（図２０Ｂ）。DIO Mice Ax-15 dose-dependently reduced body weight in DIO mice. Within 1 week, the animals received about 14%, 26%, and about 14% of their body weight, respectively, when given Ax-15 at 0.1 mg / kg, 0.3 mg / kg, and 1 mg / kg. Lost 33% (Figure 19). Comparing the effects of Ax-15 treated animals with those of the fed control animals, there was a small but significant difference between the two groups.
This is probably not the only major decrease in food intake, A
It is suggested that it is responsible for the weight loss with x-15 treatment. Indeed, Ax-15 significantly attenuated obesity-related hyperinsulinemia in DIO mice, but did not attenuate mere reduction of food intake (vs. feeding) (FIG. 20A). Moreover, Ax-15 did not cause elevated corticosterone levels, a general effect of dietary restriction (FIG. 20B).

【０１７６】 Ａｘ−１５を同じ用量範囲（０．１〜１ｍｇ／ｋｇ）で投与した場合、ＤＩＯ
マウスは、正常なマウスと比較した場合より２倍を超えて体重を減少したことは
興味深い（図１７を参照のこと）。食餌誘導性肥満動物のＡｘ−１５に対するこ
のより高い感受性は、肥満症が標準化された後に、Ａｘ−１５が持続的な体重減
少を引き起こさないように、肥満症がＡｘ−１５の効力を調節し得ることを示唆
する。When Ax-15 was administered in the same dose range (0.1-1 mg / kg), DIO
It is interesting that the mice lost more than 2-fold weight compared to normal mice (see Figure 17). This higher sensitivity of diet-induced obese animals to Ax-15 indicates that obesity regulates the efficacy of Ax-15 so that Ax-15 does not cause sustained weight loss after normalization of obesity. Suggest to get.

【０１７７】 ＤＩＯマウスは、レプチン耐性であり；体重減少効果は、毎日レプチンの注射
（１ｍｇ／ｋｇ；図１９）を行ったこれらの動物では観察されなかった。DIO mice are leptin resistant; weight loss effects were not observed in these animals with daily leptin injections (1 mg / kg; FIG. 19).

【０１７８】 本発明者らは、以下のように結論づける。[0178]   The present inventors conclude as follows.

【０１７９】 １．Ａｘ−１５は、用量依存様式で正常なマウスにおいて体重減少を引き起こ
した。1. Ax-15 caused weight loss in normal mice in a dose-dependent manner.

【０１８０】 ２．Ａｘ−１５は、用量依存様式でｏｂ／ｏｂマウスにおいて体重減少を誘導
した。Ａｘ−１５（０．１ｍｇ／ｋｇ）は、ｏｂ／ｏｂマウスにおいて体重減少
を引き起こす際にレプチン（１ｍｇ／ｋｇ）と同じくらい有効であった。Ａｘ−
１５処置およびレプチン処置の両方は、除脂肪量より多く総体脂肪を優先的に減
少したか、対飼養処置は、減少しなかった。2. Ax-15 induced weight loss in ob / ob mice in a dose dependent manner. Ax-15 (0.1 mg / kg) was as effective as leptin (1 mg / kg) in causing weight loss in ob / ob mice. Ax-
Both 15 and leptin treatments preferentially reduced total body fat above lean mass, or anti-fed treatments did not.

【０１８１】 ３．Ａｘ−１５は、用量依存様式で、食餌誘導性肥満症マウスにおいて体重減
少を引き起こした。一方レプチンは効果が無かった。Ａｘ−１５処置は、ＤＩＯ
マウスにおける肥満症に関連した高インスリン血症を減衰させた。この効果は、
対飼養コントロール動物においては観察されなかった。さらに、Ａｘ−１５は、
正常マウスまたはｏｂ／ｏｂマウスよりもＤＩＯマウスにおいて体重減少を誘導
する際により有効であった。ひとまとめにして考えると、本発明者らの結果は、
ＩＩ型糖尿病に関連した肥満症のようなレプチン耐性の肥満症の処置におけるＡ
ｘ−１５の特定の有用な適用を示唆する。3. Ax-15 caused weight loss in diet-induced obese mice in a dose-dependent manner. On the other hand, leptin had no effect. Ax-15 treatment is DIO
Attenuated obesity-related hyperinsulinemia in mice. This effect is
It was not observed in pair-fed control animals. Furthermore, Ax-15 is
It was more effective at inducing weight loss in DIO mice than in normal or ob / ob mice. Taken together, the results of the inventors are:
A in the treatment of leptin-resistant obesity, such as obesity associated with type II diabetes
Suggests a particular useful application of x-15.

【０１８２】 ４．レプチン耐性マウスモデルにおいて体重を減少する際のＡｘ−１５の有効
性は、Ａｘ−１５がまた、レプチンに対して耐性かまたは非応答である肥満のヒ
トにおいて体重を減少する際に有効であり得ることを示唆する。4. Efficacy of Ax-15 in losing weight in a leptin-resistant mouse model may be effective in reducing weight in obese humans in which Ax-15 is also resistant or unresponsive to leptin Suggest that.

【０１８３】 表５：ｏｂ／ｏｂマウスの屠体分析の結果[0183]   Table 5: Results of carcass analysis of ob / ob mice

【０１８４】[0184]

【表５】 （実施例１４−ＰＥＧ化Ａｘ−１５） 出願人らは、Ａｘ−１５ポリペプチド分子に対して異なる長さおよび型のポリ
エチレングリコール鎖を共有結合的に連結することによって、いくつかの異なる
ＰＥＧ化されたＡｘ−１５分子を生成した。出願人らはまた、非改変化Ａｘ−１
５分子からＡｘ−１５の異なるＰＥＧ化された形態を分離するための精製方法論
を開発した。[Table 5] Example 14-PEGylated Ax-15 Applicants have developed several different PEGylations by covalently linking polyethylene glycol chains of different lengths and types to Ax-15 polypeptide molecules. Generated Ax-15 molecules. Applicants also identified unmodified Ax-1
A purification methodology was developed to separate the different pegylated forms of Ax-15 from 5 molecules.

【０１８５】 （材料および方法） Ｅ．ｃｏｌｉ（前出）由来の精製されたＡｘ−１５を、これらの研究に用いた
。アミンに特異的な末端部分で機能化された種々の分子量のＰＥＧ鎖を、Ｓｈｅ
ａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，ＡＬから入手した。ＢｉｃｉｎｅをＳｉｇ
ｍａ，ＭＯから入手し、そしてＢｉｓ−ＴｒｉｓプレキャストゲルをＮｏｖｅｘ
，ＣＡから入手した。小スケール反応研究を準備し種々の反応条件を試験した。
異なる反応条件を用いかつ以下のように変えた： １． Ａｘ−１５タンパク質濃度：０．６ｍｇ／ｍｌ〜６．０ｍｇ／ｍｌの範囲
。 ２． ＰＥＧ／Ａｘ−１５タンパク質モル比、３０：１まで。 ３． 温度：４℃〜室温。Materials and Methods E. Purified Ax-15 from E. coli (supra) was used for these studies. PEG chains of various molecular weights functionalized with amine-specific terminal moieties were added to She
Obtained from arwater Polymers, AL. Bicine to Sig
Ma, MO, and Bis-Tris precast gels from Novex.
, CA. A small scale reaction study was set up to test various reaction conditions.
Different reaction conditions were used and varied as follows: Ax-15 protein concentration: in the range of 0.6 mg / ml to 6.0 mg / ml. 2. PEG / Ax-15 protein molar ratio up to 30: 1. 3. Temperature: 4 ° C to room temperature.

【０１８６】 さらに、例えば、アルデヒド化学を用いた場合、異なる濃度の還元剤（例えば
、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｍｉｌｗａｕｋｉｅｅ，ＷＩからナト
リウムシアノボロハイドライド）を用いてシッフ塩基を還元した。この反応を、
Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤから入
手した１Ｍ保存溶液からの大過剰のＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）の添加によ
って停止した。代表的には、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を、タ
ンパク質濃度がμＭ範囲にあったので用いる。Further, for example, when using aldehyde chemistry, the Schiff base was reduced with different concentrations of reducing agents (eg, sodium cyanoborohydride from Aldrich Chemicals, Milwaukie, WI). This reaction
It was stopped by the addition of a large excess of Tris-HCl (pH 7.5) from a 1 M stock solution obtained from Life Technologies, Gaithersburg, MD. Typically, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5) is used as the protein concentration was in the μM range.

【０１８７】 精製のために、代表的には反応生成物を低塩緩衝液で希釈し、そしてイオン交
換カラムに適用した。このカラムを低塩緩衝液で洗浄し、そしてＰｈａｒｍａｃ
ｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪより入手したＱ−ＨＰアニオン交換樹脂を充
填したカラム通じて、１５ｍＭ Ｂｉｃｉｎｅ緩衝液中の０〜３００ｍＭ Ｎａ
Ｃｌの範囲のＮａＣｌ勾配で溶出した。異なる数の結合化ＰＥＧ鎖に対応する非
改変化Ａｘ−１５とＰＥＧ化された形態との間の良好な分離が、観察された。イ
オン交換精製からの異なるプールを濃縮し、さらに標準的な分取サイズ排除クロ
マトグラフィーによって精製した。いくつかの場合では、ＰＥＧ Ａｘ−１５タ
ンパク質の２つの近い形態が、共にプールされ、そして１つのサンプルとして処
理された（例えば、ＰＥＧ ５Ｋ（３，４）−２°Ａｍｉｎｅ−Ａｘ １５とマ
ークされたサンプルは、２級アミン結合を用いて約５ＫＤ ＰＥＧ分子の３また
は４鎖と結合したＡｘ−１５分子から主に成る）。For purification, reaction products were typically diluted with low salt buffer and applied to an ion exchange column. The column was washed with low salt buffer, and Pharmac
IA, Piscataway, NJ through 0-300 mM Na in 15 mM Bicine buffer through a column packed with Q-HP anion exchange resin.
Elution with a NaCl gradient in the Cl range. Good separation between the unmodified Ax-15 and the PEGylated forms corresponding to different numbers of attached PEG chains was observed. The different pools from the ion exchange purification were concentrated and further purified by standard preparative size exclusion chromatography. In some cases, two close forms of PEG Ax-15 protein were pooled together and processed as one sample (eg, marked as PEG 5K (3,4) -2 ° Amine-Ax 15). Samples consisted primarily of Ax-15 molecules linked to 3 or 4 chains of approximately 5KD PEG molecules using secondary amine linkages).

【０１８８】 精製の実行からの反応生成物およびサンプルを、以下の標準的な方法のいずれ
かまたは全てによって分析した： １．還元条件下および非還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥ ２．分析用イオン交換クロマトグラフィー ３．分析用サイズ排除クロマトグラフィー。Reaction products and samples from purification runs were analyzed by any or all of the following standard methods: SDS-PAGE under reducing and non-reducing conditions 1. Analytical ion exchange chromatography 3. Analytical size exclusion chromatography.

【０１８９】 各Ａｘ−１５分子に結合した鎖の数をまず、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上のバンド
パターンに基づいてサンプルに割り当てた。確証を遊離アミンアッセイを用いて
公開されている技法（Ｋａｒｒ，Ｌ．Ｊ．ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙ
ｍｏｌｏｇｙ ２２８：３７７−３９０（１９９４））に基づいて、１級アミン
を検出することでか、または一連のＵＶ、ＲＩ（屈折率）およびＭＡＬＬＳ検出
器を有するＭＡＬＬＳ（多角レーザー光散乱）システムと連結した分析用サイズ
排除カラムを用いることによって得た。光散乱は、巨大分子の質量および濃度の
関数である。分子量を決定するために、このタンパク質サンプルを、ゲル濾過カ
ラムに注入し、そして溶出物をオンラインの光散乱検出器ならびに屈折率検出器
および／またはＵＶ検出器でモニタリングする。光散乱検出器は、Ｗｙａｔｔ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓａｎｔａ Ｂａｒｂａｒａ
，ＣＡ）からのＭｉｎｉＤａｗｎレーザー光散乱検出器である。この機器は、静
的光を３つの異なる角度で測定する。オンラインの屈折率検出器またはＵＶ検出
器は、タンパク質濃度を測定するために働く。Ａｓｔｒａ ４．７ Ｓｏｆｔｗ
ａｒｅ（Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎ
ｔａ Ｂａｒｂａｒａ，ＣＡ）を用いて、ｄｎ／ｄｃ（ｄｎ＝屈折率の変化；ｄ
ｃ＝濃度）か、またはタンパク質の吸光係数のいずれかに基づいてタンパク質濃
度を算出する。ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳシステムもまた用い、ＰＥＧ Ａｘ−１５調
製物の純度および分子量を検出した。The number of chains bound to each Ax-15 molecule was first assigned to the sample based on the band pattern on the SDS-PAGE gel. Confirmation has been published using a free amine assay (Karr, LJ, et al., Methods in Enzy.
228: 377-390 (1994)) or coupled with a MALLS (polygonal laser light scattering) system with a series of UV, RI (refractive index) and MALLS detectors. Obtained by using an analytical size exclusion column. Light scattering is a function of macromolecule mass and concentration. To determine the molecular weight, the protein sample is injected onto a gel filtration column and the eluate is monitored with an on-line light scattering detector and a refractive index detector and / or UV detector. Light scattering detector is Wyatt
Technology Corporation (Santa Barbara)
, MiniDawn laser light scattering detector from CA. This instrument measures static light at three different angles. An on-line refractive index detector or UV detector serves to measure protein concentration. Astra 4.7 Softw
are (Wyatt Technology Corporation, San
Ta Barbara, CA), dn / dc (dn = refractive index change; d
c = concentration) or the extinction coefficient of the protein to calculate the protein concentration. The SEC-MALLS system was also used to detect the purity and molecular weight of PEG Ax-15 preparations.

【０１９０】 種々のＰＥＧ Ａｘ−１５分子を、以下のようにインビボにおける実験で試験
した。Various PEG Ax-15 molecules were tested in in vivo experiments as follows.

【０１９１】 （実施例１５−ＰＥＧ Ａｘ−１５を用いた肥満症を処置するためのインビボ
での実験） ＡＫＲ／Ｊマウスは、体脂肪含有量の増加により食餌誘導性肥満症に対して感
受性であることが示されている。この遺伝子環境（食餌）相互作用は、この種の
食餌性肥満症に関しては完全に理解されてはいないが、ヒト肥満症の場合、遺伝
子型は多遺伝子である。以下の実験を、食餌誘導性肥満症のこの実験動物モデル
のにおいて体重および食物摂取量に対するＰＥＧ Ａｘ−１５の効果を試験する
ために行った。実験に記載されるこの特定の分子は、１−２０−ＰＥＧ Ａｘ−
１５と呼ばれ、そして上記の手順によって生成されそしてインビボ実験で試験さ
れる多くのＰＥＧ化Ａｘ−１５分子のまさに１つである。この分子は、２級アミ
ン結合を介して２０ＫＤ ＰＥＧ鎖とモノＰＥＧ化されている。表６は、種々の
ＰＥＧ化されたＡｘ−１５調製物のインビボ活性の比較を示す。Example 15-In Vivo Experiments for Treating Obesity with PEG Ax-15 AKR / J mice are susceptible to diet-induced obesity due to increased body fat content. Has been shown to be. This genetic environment (diet) interaction is not fully understood for this type of dietary obesity, but in the case of human obesity the genotype is polygenic. The following experiments were performed to test the effect of PEG Ax-15 on body weight and food intake in this experimental animal model of diet-induced obesity. This particular molecule described in the experiment is 1-20-PEG Ax-
It is just one of many PEGylated Ax-15 molecules that has been designated 15 and has been produced by the above procedure and tested in in vivo experiments. This molecule is monoPEGylated with a 20KD PEG chain via a secondary amine bond. Table 6 shows a comparison of in vivo activity of various PEGylated Ax-15 preparations.

【０１９２】[0192]

【表６】 （実験手順） 雄ＡＫＲ／Ｊマウス（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａ
ｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）に、１０週齢で始めて、高脂肪食餌（脂肪から４５ｋ
ｃａｌ％を有する）を給餌した。１７週齢までに、マウスは、通常の固形試料を
給餌したやせた同腹子の約３０％を超える重さであり、これを食餌誘導性肥満症
（ＤＩＯ）マウスと称した。６匹のＤＩＯマウスの４つの群は、ビヒクル（ＰＢ
Ｓ）、非ＰＥＧ化されたＡｘ−１５（０．７ｍｇ／ｋｇ）、または１−２０−Ｐ
ＥＧ Ａｘ−１５（０．２３または０．７ｍｇ／ｋｇ）のいずれかの皮下注射を
毎週受けた。処置期間の間の体重測定および２４時間の食物摂取量測定を毎日、
１３日間記録した。[Table 6] (Experimental procedure) Male AKR / J mouse (The Jackson Laboratory, Ba
r Harbor, ME), starting at 10 weeks of age, on a high fat diet (45k from fat)
(with cal%). By 17 weeks of age, mice weighed more than about 30% of lean littermates fed normal solid samples and were referred to as diet-induced obesity (DIO) mice. Four groups of 6 DIO mice were treated with vehicle (PB
S), non-PEGylated Ax-15 (0.7 mg / kg), or 1-20-P
Weekly subcutaneous injections of either EG Ax-15 (0.23 or 0.7 mg / kg) were received. Daily body weight measurements and 24-hour food intake measurements during the treatment period,
Recorded for 13 days.

【０１９３】 （結果） １−２０−ＰＥＧ Ａｘ−１５処置は、用量依存様式でＤＩＯマウスにおいて
体重を減少した（図２１）。０．７ｍｇ／ｋｇで、１−２０−ＰＥＧ Ａｘ−１
５はおよそ３２％体重減少を引き起こし、一方同じ用量での非ＰＥＧ化Ａｘ−１
５は体重をわずか８％減少したにすぎなかった。さらに、体重減少は、食物摂取
量の減少に密接に関連しており、最高の食欲の減退を伴うことが高用量（０．７
ｍｇ／ｋｇ １−２０−ＰＥＧ Ａｘ−１５）処置群で観察された（図２２）。
同様に食欲抑制の持続期間は、この処置群において最も長かった（図２２）。こ
れらの知見は、ＰＥＧ化がＤＩＯマウスの体重減少においてＡｘ−１５の効力を
４倍増強することを示唆する（図２１）。従って、Ａｘ−１５のＰＥＧ化は、よ
り少ない用量かつ少ない頻度の投与レジメンを可能にし得る。Results 1-20-PEG Ax-15 treatment reduced body weight in DIO mice in a dose dependent manner (Figure 21). 1-20-PEG Ax-1 at 0.7 mg / kg
5 caused approximately 32% weight loss, while non-PEGylated Ax-1 at the same dose
5 lost only 8% body weight. Furthermore, weight loss is closely associated with reduced food intake, with the highest loss of appetite being associated with high doses (0.7
It was observed in the mg / kg 1-20-PEG Ax-15) treated group (Fig. 22).
Similarly, the duration of appetite suppression was the longest in this treatment group (Figure 22). These findings suggest that PEGylation enhances the efficacy of Ax-15 4-fold in weight loss in DIO mice (Figure 21). Thus, PEGylation of Ax-15 may allow for lower doses and less frequent dosing regimens.

【０１９４】 （実施例１６：非インスリン依存性真性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）を処置するため
のＡｘ−１５の使用） （背景） 非インスリン依存性真性糖尿病（ＮＩＤＤＭまたはＩＩ型糖尿病）は、人口の
約５％が発症し、そして末梢組織におけるインスリンの作用への抵抗性に主に起
因して生じる血糖値の上昇によって特徴づけられる。ＮＩＤＤＭは、最も一般的
な代謝疾患の１つであり、そして環境因子および遺伝因子の両方によって決定さ
れる。特定のＮＩＤＤＭ感受性遺伝子の分子同一性を発見するための試みは、個
体の小さなサブセットにおける疾患に寄与し得る、いくつかの異常の同定をもた
らした。しかし、最も一般的な、遅発性のＮＩＤＤＭに関連する遺伝子の分子同
一性は、まだ同定されていない。Example 16: Use of Ax-15 to Treat Non-Insulin Dependent Diabetes Mellitus (NIDDM) (Background) Non-insulin dependent diabetes mellitus (NIDDM or type II diabetes) is about 5 in the population. % Develop and are characterized by elevated blood glucose levels that are primarily due to resistance to the action of insulin in peripheral tissues. NIDDM is one of the most common metabolic disorders and is determined by both environmental and genetic factors. Attempts to discover the molecular identity of specific NIDDM susceptibility genes have led to the identification of some abnormalities that may contribute to disease in a small subset of individuals. However, the molecular identity of the most common, late onset NIDDM-related genes has not yet been identified.

【０１９５】 Ｃ５７ＢＬ／ＫｓＪ ｄｂ／ｄｂ（ｄｂ／ｄｂ）マウスは、ＮＩＤＤＭの最も
研究された動物モデルである。これらのマウスはインスリン耐性であり、そして
また、無数の代謝異常およびホルモン（例えば、かなりの肥満症、過食症、およ
び低エネルギー消費）を示す（Ｋｏｄａｍａ，Ｈ．ら、１９９４ Ｄｉａｂｅｔ
ｏｌｏｇｉａ ３７：７３９−７４４）。ｄｂ／ｄｂ、ならびにヒトＮＩＤＤＭ
においては、経口グルコール耐性試験（ＯＧＴＴ）によって評価される場合、高
い血漿グルコースレベルならびに遅いグルコースの消失によって強調される、グ
ルコース代謝の恒常性制御の減少が存在する。毛様好中球因子（ｃｉｌｉａｒｙ
ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ）（ＣＮＴＦ）の全身投与は、機能
的レプチン（ｌｅｐｔｉｎ）を欠くマウス（ｏｂ／ｏｂマウス）またはレプチン
レセプターを欠くマウス（ｄｂ／ｄｂマウス）のいずれかにおける肥満を減少す
ることが知られている（Ｇｌｏａｇｕｅｎ，Ｉ．ら、１９９７、Ｐｒｏｃ Ｎａ
ｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ９４：６４５６−６４６１）。このモデルを用いる本
発明者らの研究は、重量の減少のみに起因し得ない、食物摂取および体重調節へ
のＡｘ−１５の劇的な効果（以下で詳細に記載される）、ならびにグルコース耐
性への劇的な効果を示した。Ａｘ−１５を用いた１０日間の動物の処置は、対飼
養およびビヒクル処置糖尿病マウスと比較した場合、用量関連様式で、経口グル
コースプロフィールを顕著に改善する（以下に詳細に記載される）。このことは
、インスリン依存性様式、インスリン非依存性様式のいずれかで、注入されたグ
ルコースボルスを処理する動物の能力の改善を示唆する。重要なことに、空腹時
の血漿グルコースおよびインスリンのレベル（以下で詳細に記載される）は、Ａ
ｘ−１５で処置されたマウスにおいて、正常な非糖尿病レベルの近くまで顕著に
減少する。ＮＩＤＤＭにおいて、強空腹時血清インスリンレベルおよびインスリ
ン耐性との間に、強い相関関係が存在するので、これらの結果は、Ａｘ−１５処
置は、この実験モデルにおけるインスリン耐性において、顕著な減少を生じるこ
とを示唆する。Ａｘ−１５処置マウスビヒクル処置コントロールｄｂ／ｄｂマウ
スにおいて、遊離脂肪酸レベルにおける顕著な減少がまた存在する（以下に詳細
に記載される）。C57BL / KsJ db / db (db / db) mice are the most studied animal model of NIDDM. These mice are insulin resistant and also exhibit a myriad of metabolic disorders and hormones, such as significant obesity, bulimia, and low energy expenditure (Kodama, H. et al., 1994 Diabet.
37: 739-744). db / db and human NIDDM
In, there is a diminished homeostatic control of glucose metabolism, accentuated by high plasma glucose levels as well as slow glucose clearance, as assessed by the oral glucose tolerance test (OGTT). Ciliary neutrophil factor
Systemic administration of a neurotrophic factor (CNTF) is known to reduce obesity in either mice lacking functional leptin (ob / ob mice) or mice lacking the leptin receptor (db / db mice). (Gloaguen, I. et al., 1997, Proc Na
tl Acad Sci 94: 6456-6461). Our study using this model showed that the dramatic effects of Ax-15 on food intake and weight regulation (described in detail below) and glucose tolerance could not be attributed solely to weight loss. Showed a dramatic effect on. Treatment of animals for 10 days with Ax-15 significantly improves the oral glucose profile in a dose-related manner when compared to pair-fed and vehicle-treated diabetic mice (described in detail below). This suggests an improvement in the animal's ability to process the infused glucose bolus in either an insulin dependent or non-insulin dependent manner. Importantly, fasting plasma glucose and insulin levels (described in detail below) were
In mice treated with x-15, there is a significant reduction to near normal non-diabetic levels. Since there is a strong correlation between strong fasting serum insulin levels and insulin resistance in NIDDM, these results indicate that Ax-15 treatment produces a significant reduction in insulin resistance in this experimental model. Suggest. There is also a significant decrease in free fatty acid levels in Ax-15 treated mouse vehicle treated control db / db mice (described in detail below).

【０１９６】 これらの組み合されたデータは、Ａｘ−１５処置が、食物摂取の減少および後
の重量減少に寄与し得ない、グルコースの処理における改善およびインスリンに
対する感受性の増加を生じることを示唆する。生化学レベルで、インスリンシグ
ナル伝達が、その細胞表面レセプターにインスリンが結合することによって開始
される事象のカスケード、続くレセプターチロシンキナーゼの自己リン酸化およ
び活性化に関与し、インスリンレセプター基質（ＩＲＳ）のチロシンリン酸化を
生じることは、公知である（Ａｖｒｕｃｈ，Ｊ．、１９９８、Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ １８２：３１−４８）。多数のインスリンの作
用が、末梢のそれのレセプターによって媒介されると考えられるが、弓状核にお
いてニューロンが、インスリンレセプターおよびＩＲＳを発現することもまた公
知である（Ｂａｓｋｉｎ，Ｄ．Ｇ．ら、１９９３、Ｒｅｇ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ
４８：２５７−２６６；Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｍ．Ｗ．ら、１９９２、Ｅｎｄｏｃ
ｒ Ｒｅｖ １３：３８７−４１４）。ｄｂ／ｄｂ動物の弓状核におけるタンパ
ク質のｐ（ｔｙｒ）（ｐＴｙｒ）染色の本発明者らの評価により、異型接合同腹
子メイト（ｄｂ／？）と比較した場合、タンパク質（おそらくＩＲＳ）の構成的
活性化が驚くほど明らかになった。この異常は、これらの実験において試験され
たＡｘ−１５の用量の両方において減じ、そしてこの領域におけるインスリンシ
グナル伝達経路への正常なシグナル伝達の回復を示唆する。These combined data suggest that Ax-15 treatment results in improvements in glucose processing and increased sensitivity to insulin that may not contribute to reduced food intake and subsequent weight loss. . At the biochemical level, insulin signaling is involved in a cascade of events initiated by the binding of insulin to its cell surface receptor, followed by autophosphorylation and activation of receptor tyrosine kinases, and of insulin receptor substrate (IRS) It is known to cause tyrosine phosphorylation (Avruch, J., 1998, Molecular).
r Cell Biochem 182: 31-48). Although many insulin actions are thought to be mediated by its receptors in the periphery, it is also known that neurons in the arcuate nucleus express insulin receptor and IRS (Baskin, DG et al., 1993, Reg Peptides
48: 257-266; Schwartz, M .; W. Et al., 1992, Endoc
r Rev 13: 387-414). Our evaluation of p (tyr) (pTyr) staining of proteins in the arcuate nuclei of db / db animals revealed that the protein (probably IRS), when compared to the heterozygous littermate (db /?) The constitutive activation was surprisingly revealed. This abnormality was reduced at both doses of Ax-15 tested in these experiments and suggests restoration of normal signaling to the insulin signaling pathway in this region.

【０１９７】 インスリンの別のよく定義された作用は、ホスホイノシチド（ＰＩ）３−キナ
ーゼの制御サブユニットへのＩＲＳの結合である。ホスホイノシチド（ＰＩ）３
−キナーゼの制御サブユニットは、多くのインスリン作用に必要であることが示
されている（グルコース輸送、タンパク質合成、およびグリコーゲン合成）（Ｓ
ｈｅｐａｒｄ，Ｐ．Ｒ．ら、１９９６、Ｊ．Ｍｏｌ Ｅｎｄｏｃｒ １７：１７
５−１８４）。インスリンによって刺激されることが現在知られているＰ１３−
キナーゼのみは、クラスＩヘテロダイマーｐ８５／ｐ１１０触媒ＰＩ３キナーゼ
である。ｐ８５サブユニットは、アダプタとして作用し、ｐ１１０触媒サブユニ
ットを適切なシグナル伝達複合体に連結させる。すべての形態のこのアダプタサ
ブユニットは、ＳＨ２ドメインを含み、このドメインは、ＩＲＳ−１、ＩＲＳ−
２のチロシンリン酸化モチーフ、および増殖因子レセプターに結合する（Ｓｈｅ
ｐａｒｄ、同書を参照のこと）。Ａｘ−１５−処置ｄｂ／ｄｂマウス由来の肝臓
組織の分析により、インスリンに応答してｐ（Ｔｙｒ）タンパク質とのｐ８５の
会合を促進する、インスリンの能力の回復を示す。これらの組み合された結果は
、Ａｘ−１５処置は、（１）グルコースを処理するｄｂ／ｄｂ動物の能力を改良
し得ることを示唆し、そして（２）個々の組織の評価は、インスリンに対する感
受性を増加することを示唆する。Another well-defined effect of insulin is the binding of IRS to the regulatory subunit of phosphoinositide (PI) 3-kinase. Phosphoinositide (PI) 3
-The regulatory subunit of the kinase has been shown to be required for many insulin actions (glucose transport, protein synthesis, and glycogen synthesis) (S
hepard, P.P. R. Et al., 1996, J. Am. Mol Endocr 17:17
5-184). P13- which is now known to be stimulated by insulin
The only kinase is the class I heterodimer p85 / p110 catalyzed PI3 kinase. The p85 subunit acts as an adapter, linking the p110 catalytic subunit to the appropriate signaling complex. All forms of this adapter subunit include the SH2 domain, which is IRS-1, IRS-
Binds to the tyrosine phosphorylation motif of 2 and growth factor receptors (She
pard, ibid.). Analysis of liver tissue from Ax-15-treated db / db mice shows restoration of insulin's ability to promote p85 association with p (Tyr) protein in response to insulin. These combined results suggest that Ax-15 treatment may (1) improve the ability of db / db animals to process glucose, and (2) individual tissue assessment indicates that insulin is not associated with insulin. Suggests increased susceptibility.

【０１９８】 この研究の目的は、Ａｘ−１５、ＮＩＤＤＭのｄｂ／ｄｂマウスモデルにおけ
る糖尿病プロフィールへの改変ＣＮＴＦの効果を特徴付けることである。The purpose of this study was to characterize the effect of modified CNTF on the diabetes profile in the db / db mouse model of Ax-15, NIDDM.

【０１９９】 （実験手順） （（１）動物） ６〜８週齢の雄性ｄｂ／ｄｂ Ｃ５７ＢＬ／ＫｓＪマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）を、１日あたり１２
時間明るい、６９−７５℃に維持された部屋に収容した。すべての動物手順は、
Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏ
ｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）に承認される手順に従って行った。１０週齢で開
始し、マウスを個別に収容し、自由に標準マウス飼料（Ｐｕｒｉｎａ Ｍｉｌｌ
ｓ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＩＮ）を与え、そして水を自由に与えた。「対飼養した
」動物に、報告されたすべての研究において、最高容量のＡｘ−１５によって摂
取された平均量と同じ量の食物を毎日与えた。Ａｘ−１５（０．１および０．３
ｍｇ／ｋｇ、皮下）およびビヒクル（１０ｍＭ リン酸ナトリウム、０．０５％
Ｔｗｅｅｎ８０、３％ ＰＥＧ ３３５０、２０％スクロース ｐＨ７．５）
を、毎日およそ同じ時間に注射した。動物の体重を、毎日記録し、そして示した
点で、血液サンプルを尾の静脈からキャピラリーチューブに収集した。経口グル
コース耐性試験（ＯＧＴＴ）について、すべての動物を、１８〜２０時間試験し
、そしてベースライン（時間０）の測定のために、およそ午前１０時の開始時に
、尾から採血した。尾の採血に続き、供給針（ｆｅｅｄｉｎｇ ｎｅｅｄｌｅ）
（ＶＷＲ，Ｐｌａｉｎｆｉｅｄｌ，ＮＪ）を介して０．２ｍｌの滅菌水に溶解し
た８９ｍｇのＤ−グルコース（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を動物に
投与（約２．２ｇ／ｋｇ体重）した。グルコースの投与後、２０、６０、および
２１０分で尾から採血した。血糖、インスリン、遊離脂肪酸、トリグリセリドの
アッセイ（Ｌｉｎｃｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，Ｓｔ Ｃ
ｈａｒｌｅｓ，ＭＯ）時まで、以前に概略が説明されたように（Ｔｏｎｒａ，Ｊ
．Ｒ．ら、１９９９、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ４８：５８８−５９４）、血清を−２
０℃に保存した。(Experimental Procedure) ((1) Animal) Male db / db C57BL / KsJ mouse (Jackson 6 to 8 weeks old)
Laboratories, Bar Harbor, ME) 12 per day
It was housed in a room maintained at 69-75 ° C, bright for hours. All animal procedures
Institutional Animal Care and Use Co
It was performed according to the procedure approved by Mmittee (IACUC). Starting at 10 weeks of age, the mice were housed individually and were fed with standard mouse chow (Purina Mill) ad libitum.
s, Richmond, IN) and water ad libitum. The "paired" animals were fed daily with the same amount of food consumed by the highest dose of Ax-15 in all reported studies. Ax-15 (0.1 and 0.3
mg / kg, subcutaneous) and vehicle (10 mM sodium phosphate, 0.05%)
Tween 80, 3% PEG 3350, 20% sucrose pH 7.5)
Was injected at approximately the same time each day. Animal body weights were recorded daily and at the indicated points blood samples were collected from the tail vein into capillary tubes. For the Oral Glucose Tolerance Test (OGTT), all animals were tested for 18-20 hours, and bled from the tail at the beginning of approximately 10 am for baseline (time 0) measurements. Following tail blood collection, a feeding needle
89 mg of D-glucose (Sigma, St. Louis, MO) dissolved in 0.2 ml of sterile water was administered to the animals via (VWR, Plainfiedl, NJ) (about 2.2 g / kg body weight). Blood was collected from the tail at 20, 60, and 210 minutes after administration of glucose. Blood glucose, insulin, free fatty acid, triglyceride assay (Linco Research Immunoassay, St C
Harles, MO) as previously outlined (Tonra, J.
． R. Et al., 1999, Diabetes 48: 588-594), serum-2.
Stored at 0 ° C.

【０２００】 （（２）組織サンプリング、ホモジネーションおよび免疫沈降） 実験の別の群において、レセプターシグナル伝達成分へのＡｘ−１５処置の効
果を試験するために、マウスを研究した。Ａｘ−１５の示された時間および用量
（上記を参照のこと）の後、肝臓組織を単離し、そして続く分析のために瞬間冷
凍した。組織サンプル（１００ｍｇ）を、緩衝液Ａ（１％ ＮＰ−４０、５０ｍ
Ｍ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、３０
ｍＭ ピロリン酸ナトリウム、５０ｍＭ フッ化ナトリウム、０．５ｍＭ オル
トバナジン酸ナトリウム、５μｇ／ｍｌ アプロチニン、５μｇ／ｍｌ ロイペ
プチン、１ｍＭ ＰＭＳＦ）中で、氷上でホモジネートし、そして１０分間１４
，０００ｇで遠心分離した。溶解タンパク質（２ｍｇ）を、４℃で、一晩、プロ
テインＡセファロース（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＮＹ）
に結合した、５μｌの抗−ｐ（ｔｙｒ）抗体（４Ｇ１０）または抗−ＩＲＳ−１
抗体のいずれかを用いて免疫沈降した。免疫沈降物を、３回緩衝液Ａを用いて洗
浄し、標準Ｌａｅｍｍｌｉサンプル緩衝液に再懸濁し、そしておよそ５分間６５
℃で加熱した。タンパク質サンプルを、６または８％のプレキャストゲル分離上
での標準ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって、そしてＴｒａｎｓ Ｂｌｏｔ ｓｙｓ
ｔｅｍ（Ｈｏｅｆｆｅｒ Ｔｒａｎｓｂｌｏｔｔｅｒ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｎ
Ｊ）を使用して、ニトロセルロース膜（Ｎｏｖｅｘ、ＣＡ）に移した。ニトロセ
ルロース膜を、５％ＢＳＡ（４Ｇ１０ブロットについて）または３％ Ｂｌｏｔ
ｔｏ／０．５％ＢＳＡを用いて、少なくとも１時間室温でブロックし、次いで、
１次抗体を用いて一晩４度でインキュベートした。使用した抗体は、抗−ｐ（ｔ
ｙｒ）４Ｇ１０（１：５０００；Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
Ｉｎｃ）；抗−ＩＲＳ−１および抗ｐ８５（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ
ｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｅｙ，ＭＡ）を含んだ。(2) Tissue Sampling, Homogenization and Immunoprecipitation In another group of experiments, mice were studied to test the effect of Ax-15 treatment on receptor signaling components. After the indicated times and doses of Ax-15 (see above), liver tissue was isolated and snap frozen for subsequent analysis. A tissue sample (100 mg) was added to buffer A (1% NP-40, 50 m
M Hepes pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 30
mM sodium pyrophosphate, 50 mM sodium fluoride, 0.5 mM sodium orthovanadate, 5 μg / ml aprotinin, 5 μg / ml leupeptin, 1 mM PMSF), homogenize on ice and for 10 min 14
Centrifuge at 1,000 g. Lysed protein (2 mg) at 4 ° C. overnight at Protein A Sepharose (Upstate Biotechnology, NY).
5 μl of anti-p (tyr) antibody (4G10) or anti-IRS-1 bound to
Immunoprecipitation with either of the antibodies. The immunoprecipitate was washed 3 times with buffer A, resuspended in standard Laemmli sample buffer, and 65 min for approximately 5 minutes.
Heated at ° C. Protein samples were analyzed by standard SDS-PAGE analysis on 6 or 8% precast gel separations and by Trans Blot sys.
tem (Hoeffer Transblotter, Pharmacia, N
J) was used to transfer to a nitrocellulose membrane (Novex, CA). Nitrocellulose membranes were loaded with 5% BSA (for 4G10 blot) or 3% Blot.
Block with to / 0.5% BSA for at least 1 hour at room temperature, then
Incubated with primary antibody at 4 ° overnight. The antibody used was anti-p (t
yr) 4G10 (1: 5000; Upstate Biotechnology)
Inc); anti-IRS-1 and anti-p85 (New England Bio).
labs, Beverley, MA).

【０２０１】 （（３）免疫組織化学） 免疫組織化学によって評価される動物を、４％パラホルムアルデヒドを用いて
、心臓内（ｔｒａｎｓｃａｒｄｉａｌｌｙ）で還流し、そして脳を除去し、そし
て処理されるまで凍結した。４０μｍ切片を、弓状核のレベルで切り出し、ＫＰ
ＢＳ（カリウム緩衝化生理食塩水、ｐＨ７．２）中で洗浄し、２０分間室温でブ
ロックした（ＫＰＢＳ／０．４％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００／１％ Ｂｏｖｉｎ
ｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ中の４％正常血清、Ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｖ、Ｓ
ｉｇｍａ）。遊離の浮遊切片を、ｐ（ｔｙｒ）タンパク質を検出するために、マ
ウス抗−ｐ（ｔｙｒ）（４Ｇ１０）と共に、１：１０００希釈で４℃で一晩イン
キュベートし、洗浄し、次いで、緩衝液（ＫＰＢＳ／０．０２％ Ｔｒｉｔｏｎ
Ｘ−１００／１．０％ ＢＳＡ）中に、１：１５００の希釈で、希釈されたビ
オチン化ウマ抗−マウス抗体と共にインキュベートし、続いてアビジン−ビオチ
ンペルオキシダーゼ（ＰＢＳ中、１：５００；Ｖｅｃｔｏｒ Ｅｌｉｔｅ Ｋｉ
ｔ，Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＣＡ）
と共にインキュベートした（両方と６０分間、室温で）。各工程の間に、ＰＢＳ
で徹底的に切片を洗浄し、そして組織に結合したペルオキシダーゼを、脱水され
たゼラチンでコーティングしたスライドおよびカバーガラス上で、ジアミノベン
ジジン（Ｓｉｇｍａ Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）反応によって可視化した。(3) Immunohistochemistry Animals evaluated by immunohistochemistry are transcardially perfused with 4% paraformaldehyde and the brains removed and frozen until processed. did. A 40 μm section was cut at the level of the arcuate nucleus and KP
It was washed in BS (potassium buffered saline, pH 7.2) and blocked for 20 minutes at room temperature (KPBS / 0.4% Triton X100 / 1% Bovin).
e Serum Albumin 4% normal serum, Fraction V, S
igma). Free floating sections were incubated with mouse anti-p (tyr) (4G10) for detection of p (tyr) protein at a dilution of 1: 1000 overnight at 4 ° C., washed, and then buffered ( KPBS / 0.02% Triton
Incubation with diluted biotinylated horse anti-mouse antibody at a dilution of 1: 1500 in X-100 / 1.0% BSA) followed by avidin-biotin peroxidase (1: 500 in PBS; Vector Elite). Ki
t, Vector Laboratories, Burlington, CA)
Incubated with (both for 60 minutes at room temperature). PBS between each process
Sections were washed extensively with and tissue-bound peroxidase was visualized by the diaminobenzidine (Sigma St Louis, MO) reaction on dehydrated gelatin-coated slides and coverslips.

【０２０２】 （結果） （（１）毎日Ａｘ−１５を用いたｄｂ／ｄｂ動物の処置は、熱量制限よりも有
意に大きな体重減少を引き起こす） ｄｂ／ｄｂマウスまたはその異型接合同腹仔マウス（ｄｂ／？）に、毎日、１
０日間、Ａｘ−１５（０．１または０．３ｍｇ／ｋｇ）またはビヒクルのいずれ
かの皮下注射を与えた。食物摂取を、最も高いＡｘ−１５処置群によって摂取さ
れた量に対して同じ量を、ヒビクル処理した動物の集団（対飼養（ｐａｉｒ−ｆ
ｅｄ））に対して制限した。図２３は、本実験の結果を示す。平均群体重＋／−
ＳＥＭ（ｎ＝１２）を、毎日記録する。Ａｘ−１５の末梢投与（１０日間０．
１および０．３ｍｇ／ｋｇ／日）は、食物摂取に有意な減少および体重（ＢＷ）
の用量依存的減少を引き起こした。試験された最も高い用量に関して、ＢＷに対
する影響は、熱量制限に起因するもの（対飼養のビヒクルのｄｂ／ｄｂ；ＰＦに
比較）よりも大きく、そして精巣上体脂肪（２５％）および肝臓（３５％）の質
量における減少と関連し、筋肉質量に影響を与えなかった。Results ((1) Daily treatment of db / db animals with Ax-15 causes significantly greater weight loss than caloric restriction) db / db mice or heterozygous littermate mice thereof ( db /?) every day, 1
Subcutaneous injections of either Ax-15 (0.1 or 0.3 mg / kg) or vehicle were given for 0 days. Food intake was the same as that consumed by the highest Ax-15 treated group, but a group of animals vehicle-treated (pair-fed).
ed)). FIG. 23 shows the result of this experiment. Average group weight +/-
SEM (n = 12) is recorded daily. Peripheral administration of Ax-15 (0.
1 and 0.3 mg / kg / day) significantly reduced food intake and body weight (BW)
Caused a dose-dependent decrease in At the highest dose tested, the effect on BW was greater than that due to thermal limitation (compared to db / db of paired vehicle; PF), and epididymal fat (25%) and liver (35%). %) Did not affect muscle mass.

【０２０３】 （（２）ｄｂ／ｄｂ動物におけるグルコース耐性に対する１０日間のＡｘ−１
５処理の効果） 経口グルコース耐性試験（ＯＧＴＴ）を、ヒビクル（白四角）、対飼養のビヒ
クル処理されたｄｂ／ｄｂ雄性マウス（黒菱形）、およびＡｘ−１５（０．１ｍ
ｇ／ｋｇ／日、白三角；０．３ｍｇ／ｋｇ／日、黒三角）処理されたｄｂ／ｄｂ
雄性マウス、ならびに年齢の一致した異型接合ｄｂ／？マウス（黒丸）に対して
実施した。図２４は、本実験の結果を示す。各点は、少なくとも１２匹の動物の
平均±ＳＥＭを示す。ビヒクル処理されたレベルと比較して、空腹時血漿グルコ
ース（６５％）、インシュリン（５３％）およびＮＥＦＡ（２３％）での減少が
存在した。経口グルコース耐性試験によって、ＰＦおよびビヒクルコントロール
とは有意に異なるカーブの下の領域を伴って、グルコース耐性における用量依存
的改善が明らかになった。((2) 10-day Ax-1 against glucose tolerance in db / db animals
5 Effect of treatment) An oral glucose tolerance test (OGTT) was performed using a vehicle (open square), a pair of vehicle-treated db / db male mice (black diamond), and Ax-15 (0.1 m).
g / kg / day, white triangle; 0.3 mg / kg / day, black triangle) treated db / db
Male mice, as well as age-matched heterozygous db /? It was performed on mice (black circles). FIG. 24 shows the result of this experiment. Each point represents the mean ± SEM of at least 12 animals. There was a reduction in fasting plasma glucose (65%), insulin (53%) and NEFA (23%) compared to vehicle treated levels. The oral glucose tolerance test revealed a dose-dependent improvement in glucose tolerance, with the area under the curve significantly different from the PF and vehicle controls.

【０２０４】 （（３）毎日低用量のＡｘ−１５を用いたｄｂ／ｄｂ動物の処置は、有意な体
重減少を引き起こす） ｄｂ／ｄｂマウスに、毎日Ａｘ−１５（０．０１２５、０．０２５、または０
．０５ｍｇ／ｋｇ）またはビヒクルのいずれかを、１０日間、皮下注射で与えた
。平均群体重＋／−ＳＥＭ（ｎ＝６）を、毎日記録する。図２３Ｃに示されるよ
うに、体重は、用量依存的様式で減少する。(3) Treatment of db / db Animals with Low Daily Doses of Ax-15 Causes Significant Weight Loss) db / db mice received Ax-15 (0.0125, 0.025) daily. , Or 0
． 05 mg / kg) or vehicle was given by subcutaneous injection for 10 days. Mean group weight +/- SEM (n = 6) is recorded daily. As shown in Figure 23C, body weight is reduced in a dose-dependent manner.

【０２０５】 （（４）ｄｂ／ｄｂ動物におけるグルコース耐性に対する１０日間、低用量Ａ
ｘ−１５処置の効果） 経口グルコース耐性試験（ＯＧＴＴ）を、ビヒクル処理されたｄｂ／ｄｂ雄性
マウス（白四角）およびＡｘ−１５（０．０１２５、０．０２５または０．０５
ｍｇ／ｋｇ）処理されたｄｂ／ｄｂ雄性マウスに対して実施した。各点は、少な
くとも６匹の動物の平均±ＳＥＭを表す。図２３Ｄに示されるように、血漿グル
コースは、用量依存的様式で減少され、０．０５ｍｇ／ｋｇ用量を用いて、血漿
グルコースは最も大きい減少を示す。((4) 10 days, low dose A for glucose tolerance in db / db animals
Effect of x-15 Treatment An oral glucose tolerance test (OGTT) was performed using vehicle-treated db / db male mice (open squares) and Ax-15 (0.0125, 0.025 or 0.05).
mg / kg) treated db / db male mice. Each point represents the mean ± SEM of at least 6 animals. As shown in FIG. 23D, plasma glucose is reduced in a dose-dependent manner, with the 0.05 mg / kg dose, plasma glucose shows the greatest reduction.

【０２０６】 （（５）Ａｘ−１５処理の効果の時間経過） ｄｂ／ｄｂ雄性マウスから、非空腹時血清血液グルコースに対するＡｘ−１５
処理（０．３ｍｇ／ｋｇ／日；黒三角）の効果の時間経過を、ヒビクル処理（白
四角）、対飼養のビヒクル処理（黒菱形）と比較した。各点は、最後の注射の１
４時間後の、少なくとも６匹の動物の平均±ＳＥＭを示す。図２４に示されるよ
うに、Ａｘ−１５は、ビヒクル処理されたマウスまたは対飼養のビヒクル処理さ
れたマウスと比較して、処理の３日目までに非空腹時血清血液グルコースを有意
に減少する。(5) Time Course of Effect of Ax-15 Treatment Ax-15 against non-fasting serum blood glucose from db / db male mice.
The time course of the effect of the treatment (0.3 mg / kg / day; black triangle) was compared with the vehicle treatment (open squares) and the paired vehicle treatment (black diamonds). Each point is 1 of the last injection
Shown is the mean ± SEM of at least 6 animals after 4 hours. As shown in Figure 24, Ax-15 significantly reduces non-fasting serum blood glucose by day 3 of treatment compared to vehicle-treated or pair-fed vehicle-treated mice. .

【０２０７】 （（６）ｄｂ／ｄｂ動物における１０日間のＡｘ−１５処理の生理学的な結果
） 図２５Ａ〜２５Ｃは、ｄｂ／ｄｂマウスに対する１０日間のＡｘ−１５処理の
生理学的な結果を評価するために設計された実験の結果をしめす。図２５Ａ：空
腹時血液グルコース濃度を、Ａｘ−１５（０．１ｍｇ／ｋｇ／日および０．３ｍ
ｇ／ｋｇ／日、斜線のバー）で１０日間処理したｄｂ／ｄｂ雄性マウスからの血
清を用いて、コントロール群（ビヒクル処理（白いバー）、対飼養のビヒクルの
処理（斜線のバー）および年齢が一致した異型接合ｄｂ／？マウス（点線））と
比較して、決定した。各バーは、少なくとも８匹の動物の平均±ＳＥＭを示す。
図２５Ｂ：空腹時インシュリン濃度を、Ａｘ−１５（０．１ｍｇ／ｋｇ／日およ
び０．３ｍｇ／ｋｇ／日、斜線のバー）で１０日間処理したｄｂ／ｄｂ雄性マウ
スからの血清を用いて、コントロール群（ビヒクル処理（白いバー）、対飼養の
ビヒクルの処理（斜線のバー）および年齢が一致した異型接合ｄｂ／？マウス（
点線））と比較して、決定した。各バーは、少なくとも８匹の動物の平均±ＳＥ
Ｍを示す。図２５Ｃ：空腹時遊離脂肪酸レベルを、Ａｘ−１５（０．１ｍｇ／ｋ
ｇ／日および０．３ｍｇ／ｋｇ／日、斜線のバー）で１０日間処理したｄｂ／ｄ
ｂ雄性マウスからの血清サンプルを用いて、コントロール群（ビヒクル処理（白
いバー）、対飼養のビヒクルの処理（斜線のバー）および年齢が一致した異型接
合ｄｂ／？マウス（点線））と比較して、決定した。各バーは、少なくとも８匹
の動物の平均±ＳＥＭを示す。(6) Physiological Outcomes of 10 Day Ax-15 Treatments in db / db Animals FIGS. 25A-25C evaluate the physiological outcomes of 10 day Ax-15 treatments on db / db mice. Here are the results of an experiment designed to: FIG. 25A: Fasting blood glucose concentration was measured using Ax-15 (0.1 mg / kg / day and 0.3 m).
Control group (vehicle treated (white bar), versus vehicle treated (hatched bar) and age with serum from db / db male mice treated with g / kg / day, shaded bar) for 10 days. Was determined by comparison with heterozygous db /? Each bar represents the mean ± SEM of at least 8 animals.
FIG. 25B: Fasting insulin concentration was determined using serum from db / db male mice treated with Ax-15 (0.1 mg / kg / day and 0.3 mg / kg / day, shaded bars) for 10 days. Control groups (vehicle treated (white bars), paired vehicle treated (hatched bars) and age-matched heterozygous db /? Mice (
It was decided by comparing with (dotted line)). Each bar is mean ± SE of at least 8 animals
M is shown. FIG. 25C: Fasting free fatty acid levels were measured as Ax-15 (0.1 mg / k).
g / day and 0.3 mg / kg / day, shaded bar) treated for 10 days db / d
b Serum samples from male mice were used to compare with control groups (vehicle treated (white bars), paired vehicle treated (hatched bars) and age-matched heterozygous db /? mice (dotted lines)). I decided. Each bar represents the mean ± SEM of at least 8 animals.

【０２０８】 （（７）ｄｂ／ｄｂマウスの弓状核におけるインシュリン刺激ｐ（ｔｙｒ）免
疫反応性に対するＡｘ−１５処理の効果） 異型接合（ｄｂ／？）マウスの免疫染色によって、ビヒクル注射されたコント
ロールレベル（図２６Ａ）と比較して、インシュリンの３０分ボーラス（頸静脈
を介して１ＩＵ）後に、弓状核のニューロンを染色するｐ（ｔｙｒ）免疫反応性
の増加が示された（図２６Ｂ）。この結果はおそらく、インシュリンレセプター
およびその基質（例えば、ＩＲＳ−１）（これらの両方は、インシュリン結合後
リン酸化される）を発現する弓状核における、ニューロンを反映する。インシュ
リン耐性／糖尿病ｄｂ／ｄｂマウス（１０日間ヒビクル処理された）の分析によ
り、恒常的に高いｐ（ｔｙｒ）免疫反応染色パターン（図２６Ｃ）が明らかにな
り、インシュリン処理後における変化は検出され得なかった（図２６Ｄ）。ｄｂ
／ｄｂマウスの１０日間のＡｘ−１５処理は、高い基底のｐ（ｔｙｒ）免疫反応
性（図２６Ｅおよび２６Ｇ）を減弱し、そしてインシュリンｐ（ｔｙｒ）応答性
を修復した（図２６Ｆおよび２６Ｈ）。(7) Effect of Ax-15 Treatment on Insulin-stimulated p (tyr) Immunoreactivity in the Arcuate Nucleus of db / db Mice Vehicle injection by immunostaining of heterozygous (db /?) Mice. An increase in p (tyr) immunoreactivity staining neurons of the arcuate nucleus was shown after a 30 minute bolus of insulin (1 IU via the jugular vein) compared to control levels (FIG. 26A) (FIG. 26B). ). This result probably reflects neurons in the arcuate nucleus that express the insulin receptor and its substrates (eg, IRS-1), both of which are phosphorylated after insulin binding. Analysis of insulin resistant / diabetic db / db mice (treated with vehicle for 10 days) revealed a constitutively high p (tyr) immunoreactive staining pattern (FIG. 26C), and changes after insulin treatment could be detected. None (FIG. 26D). db
10-day Ax-15 treatment of / db mice attenuated high basal p (tyr) immunoreactivity (FIGS. 26E and 26G) and restored insulin p (tyr) responsiveness (FIGS. 26F and 26H). .

【０２０９】 （（８）ｄｂ／ｄｂマウスの肝臓におけるインシュリン刺激シグナル伝達に対
するＡｘ−１５処理の効果） 図２７Ａ〜２７Ｂは、ｄｂ／ｄｂマウスの肝臓におけるインシュリン刺激シグ
ナル伝達に対するＡｘ−１５処理の効果を評価するために設計された実験の結果
を示す。雄性ｄｂ／ｄｂマウスを、１０日間、ビヒクル（レーン７および８）、
薬物処理レベルに対して対飼養（レーン１および２）、またはＡｘ−１５を用い
た処理（０．１ｍｇ／ｋｇ／日、レーン５および６；０．３ｍｇ／ｋｇ／日、レ
ーン４および５）のいずれかによって処理した。１１日目において、動物を、ペ
ントバルビタールを用いて麻酔し、そして門脈を介した生理食塩水（−）または
１ＩＵの定期的なインシュリン（＋）のいずれかを用いて注入した。１分後、肝
臓を取り出し、そしてタンパク質抽出物を、抗ｐ（ｔｙｒ）特異的抗体４Ｇ１０
を用いた免疫沈降に供し、続いてＰＩ３キナーゼのｐ８５調節サブユニットに対
する抗血清（ＩＲＳ−１特異的抗血清）を用いた標準的なウエスタンブロット分
析に供し（図２７Ａ）、続いて、抗ｐ（ｔｙｒ）特異的抗体（図２７Ｂ、上のパ
ネル）、およびＩＲＳ−１特異的抗血清（図２７Ｂ、下のパネル）を用いたウエ
スタンブロットに供した。非免疫コントロール免疫沈降（ＮＩ）、溶解物なし（
ＮＬ），およびｐ８５に対する３Ｔ３−Ｌ１溶解物コントロール（Ｃ）を、免疫
沈降物およびブロッティングコントロールとして泳動した。(8) Effect of Ax-15 Treatment on Insulin-stimulated Signaling in Liver of db / db Mice FIGS. 27A-27B show effects of Ax-15 treatment on insulin-stimulated signaling in liver of db / db mice. The result of the experiment designed to evaluate is shown. Male db / db mice were treated with vehicle (lanes 7 and 8) for 10 days,
Against drug treatment levels versus feeding (lanes 1 and 2) or treatment with Ax-15 (0.1 mg / kg / day, lanes 5 and 6; 0.3 mg / kg / day, lanes 4 and 5). Processed by either of. On day 11, animals were anesthetized with pentobarbital and injected with either portal vein saline (-) or 1 IU of regular insulin (+). After 1 minute, the liver was removed and the protein extract was treated with anti-p (tyr) specific antibody 4G10.
Was used for immunoprecipitation, followed by standard Western blot analysis with an antiserum to the p85 regulatory subunit of PI3 kinase (IRS-1 specific antiserum) (FIG. 27A), followed by anti-p. It was subjected to Western blotting using (tyr) specific antibody (FIG. 27B, upper panel) and IRS-1 specific antiserum (FIG. 27B, lower panel). Non-immune control immunoprecipitation (NI), no lysate (
NL), and 3T3-L1 lysate control (C) for p85 were run as immunoprecipitates and blotting controls.

【０２１０】 Ａｘ−１５処理マウス由来の末梢組織におけるインシュリン作用の分析により
、特定の基質（ＩＲＳ−１）の増強されたチロシンリン酸化（ｐｔｙｒ）および
インシュリンの急性静脈内ボーラス注射に対する増加したｐ（ｔｙｒ）関連ＰＩ
３キナーゼが示された。ＣＮＳにおける弓状核のレベルでの核免疫組織化学的評
価により、Ａｘ−１５処理が、ビヒクル処理されたｄｂ／ｄｂにおいて見出され
る上昇した基底ｐ（ｔｙｒ）レベルを減弱すること、およびインシュリン刺激の
ｐ（ｔｙｒ）を修復することが明らかになった。これらのデータによって、機能
的長期形態のレプチンレセプターを欠く動物（すなわち、ｄｂ／ｄｂ）における
Ａｘ−１５処理を用いた、末梢および中枢両方の、インシュリン依存性シグナル
伝達事象の、改善された末梢グルコース耐性および修復が示唆される。Analysis of insulin action in peripheral tissues from Ax-15 treated mice showed enhanced tyrosine phosphorylation (ptyr) of a specific substrate (IRS-1) and increased p (vs. acute iv bolus injection of insulin. tyr) Related PI
Three kinases have been shown. Nuclear immunohistochemical evaluation at the level of arcuate nuclei in the CNS showed that Ax-15 treatment attenuated the elevated basal p (tyr) levels found in vehicle-treated db / db, and of insulin stimulation. It was revealed to repair p (tyr). These data demonstrate that improved peripheral glucose of both peripheral and central insulin-dependent signaling events using Ax-15 treatment in animals lacking a functional long-term form of the leptin receptor (ie db / db). Tolerance and repair are suggested.

【０２１１】 これらの結果により、Ａｘ−１５は、体重減少単独によって引き起こされる効
果を上回る、グルコース代謝を正規化する能力を有することが示され、異常なグ
ルコース代謝（例えば、高インスリン血性、低血糖性、または糖尿病性、特に、
ＩＩ型糖尿病または非インシュリン依存型（ＮＩＤＤＭ）糖尿病）を有する患者
におけるグルコース代謝の正規化に対する、ＣＮＴＦまたはその改変体の有用性
を示唆する。These results indicate that Ax-15 has the ability to normalize glucose metabolism over the effects caused by weight loss alone, demonstrating abnormal glucose metabolism (eg hyperinsulinemia, hypoglycemia). Sex, or diabetic, especially,
It suggests the utility of CNTF or variants thereof for normalizing glucose metabolism in patients with type II diabetes or non-insulin dependent (NIDDM) diabetes).

【０２１２】 前述の本発明は、理解の明確化の目的のために、例および実施例によっていく
らか詳細に記載してきたが、特定の変更および改変が、添付の特許請求の範囲の
精神および範囲から逸脱することなく、本発明に対してなされ得ることは、本発
明の教示を考慮して当業者には容易に明らかである。Although the foregoing invention has been described in some detail by way of examples and examples for purposes of clarity of understanding, certain changes and modifications are within the spirit and scope of the appended claims. It will be readily apparent to those skilled in the art in view of the teachings of the present invention that they can be made without departing from the present invention.

【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

【図１】 ＣＮＴＦタンパク質配列の整列。 Ａ．ヒト、ラット、ウサギ、マウスおよびニワトリ（Ｌｅｕｎｇら、１９９２、
Ｎｅｕｒｏｎ ８：１０４５〜１０５３）の配列。点は、ヒト配列中に見出され
る残基を示す。 パネルＢ．ヒトＣＮＴＦアミノ酸残基（点）およびラットＣＮＴＦ（示される残
基）を示す、改変されたＣＮＴＦ分子。各配列に対応する精製された組換えタン
パク質の名前を左に示す。FIG. 1: Alignment of CNTF protein sequences. A. Human, rat, rabbit, mouse and chicken (Leung et al., 1992,
Neuron 8: 1045-1053). Dots indicate residues found in the human sequence. Panel B. A modified CNTF molecule showing human CNTF amino acid residues (dots) and rat CNTF (residues shown). The names of the purified recombinant proteins corresponding to each sequence are shown on the left.

【図２】 還元ＳＤＳ−１５％ポリアクリルアミドゲル上の、ヒト、ラットおよびいくつ
かの改変されたＣＮＴＦ分子の移動度。精製された組換えタンパク質を、示した
ように充填した。示されたＭＷのマーカーを、レーンＭに充填した。FIG. 2. Mobility of human, rat and some modified CNTF molecules on reducing SDS-15% polyacrylamide gels. Purified recombinant protein was loaded as indicated. The marker for the indicated MW is filled in lane M.

【図３】 ２つの改変されたＣＮＴＦ分子の生物学的活性。 Ａ．ヒトＣＮＴＦ（黒菱形）、ラットＣＮＴＦ（白四角）、およびＲＰＮ２１９
（黒四角）。 Ｂ．ヒトＣＮＴＦ（黒菱形）、ラットＣＮＴＦ（白四角）、およびＲＰＮ２２８
（黒四角）。２ｎｇ／ｍｌのラットＣＮＴＦ存在下で生存するニューロン数の百
分率として、示されたタンパク質濃度で生存する、解離したＥ８ニワトリ毛様体
ニューロンの用量応答。各実験の点は、３つの測定の平均を示す。FIG. 3. Biological activity of two modified CNTF molecules. A. Human CNTF (black diamond), rat CNTF (white square), and RPN219
(Black square). B. Human CNTF (black diamond), rat CNTF (white square), and RPN228
(Black square). Dose response of dissociated E8 chicken ciliary neurons surviving at the indicated protein concentrations as a percentage of the number of surviving neurons in the presence of 2 ng / ml rat CNTF. The points in each experiment represent the average of 3 measurements.

【図４】 Ａ．）ＳＣＧニューロン、およびＢ．）ＭＧ８７／ｈｕＣＮＴＦＲ線維芽細胞
に対する、競合的リガンド結合。３つの測定の平均からの標準偏差を垂直なバー
で示す。FIG. 4 A. ) SCG neurons, and B. ) Competitive ligand binding to MG87 / huCNTFR fibroblasts. The standard deviation from the mean of three measurements is shown by the vertical bar.

【図５】 ＳＤＳ−１５％ポリアクリルアミドゲル上のヒトＣＮＴＦ分子およびいくつか
の改変されたＣＮＴＦ分子の移動度。組換えヒトＣＮＴＦ（ＨＣＮＴＦと命名）
およびいくつかの改変されたＣＮＴＦタンパク質の上清（Ａ）調製物およびペレ
ット（Ｂ）調製物を、示されるように充填した。示される改変されたタンパク質
は、ΔＣ１３（ＲＧ１６０としても公知）；１７ＣＡ、ΔＣ１３（ＲＧ１６２）
；ΔＣ１３、６３ＱＲ（ＲＧ２９０）；および１７ＣＡ、ΔＣ１３、６３ＱＲ（
ＲＧ２９７）である。示されたＭＷのマーカーをレーンＭに充填した。０日目、
２日目、７日目および１４日目の３７℃での生理的緩衝液中のインキュベーショ
ンを、それぞれレーン１〜４に示す。FIG. 5: Mobility of human CNTF molecule and some modified CNTF molecules on SDS-15% polyacrylamide gel. Recombinant human CNTF (named HCNTF)
And some modified CNTF protein supernatant (A) and pellet (B) preparations were loaded as indicated. The modified proteins shown are ΔC13 (also known as RG160); 17CA, ΔC13 (RG162).
ΔC13, 63QR (RG290); and 17CA, ΔC13, 63QR (
RG297). Lanes M were filled with the indicated MW markers. Day 0,
Incubations in physiological buffer at 37 ° C on days 2, 7, and 14 are shown in lanes 1-4, respectively.

【図６】 種々のＣＮＴＦ改変体の濃度の上昇に対する応答における、解離した初代Ｅ８
ニワトリ毛様体ニューロンの生存。標準的な非処置ストック溶液を用いて、なら
びに４つのｒＨＣＮＴＦ改変体（ＲＧ２９７、ＲＧ２９０、ＲＧ１６０およびＲ
Ｇ１６２）を用いて得られる、ラットＣＮＴＦおよびｒＨＣＮＴＦについてのコ
ントロール濃度応答曲線。FIG. 6. Dissociated primary E8 in response to increasing concentrations of various CNTF variants.
Survival of chicken ciliary neurons. Using standard untreated stock solutions, as well as the four rHCNTF variants (RG297, RG290, RG160 and R).
Control concentration response curves for rat CNTF and rHCNTF obtained with G162).

【図７】 種々のＣＮＴＦ改変体の濃度の上昇に対する応答における、解離した初代Ｅ８
ニワトリ毛様体ニューロンの生存。標準的な非処置ストック溶液を用いて、なら
びにｒＨＣＮＴＦ改変体ＲＧ２２８（ＲＰＮ２２８としても公知であり、そして
変異６３ＱＲを有する）を用いて得られる、ラットＣＮＴＦおよびｒＨＣＮＴＦ
についてのコントロール濃度応答曲線。FIG. 7. Dissociated primary E8 in response to increasing concentrations of various CNTF variants.
Survival of chicken ciliary neurons. Rat CNTF and rHCNTF obtained using standard untreated stock solution and with rHCNTF variant RG228 (also known as RPN228 and having the mutation 63QR)
Concentration response curve for.

【図８】 種々のＣＮＴＦ改変体の濃度の上昇に対する応答において、解離した初代Ｅ８
ニワトリ毛様体ニューロンの生存。標準的な非処置ストック溶液を用いて、なら
びに４つのｒＨＣＮＴＦ改変体ＲＧ２４２（これは、変異６３ＱＲ、６４ＷＡを
有する。）を用いて得られる、ラットＣＮＴＦおよびｒＨＣＮＴＦについてのコ
ントロール濃度応答曲線。FIG. 8. Dissociated primary E8 in response to increasing concentrations of various CNTF variants.
Survival of chicken ciliary neurons. Control concentration response curves for rat CNTF and rHCNTF obtained with standard untreated stock solution and with four rHCNTF variants RG242, which have the mutation 63QR, 64WA.

【図９】 ラットにおいて、全ての３つの化合物について１００μｇ／ｋｇ用量に正規化
した、ｒＨＣＮＴＦ、ＲＧ２２８およびＲＧ２４２の静脈内（ｉｖ）投与後の平
均血漿濃度の時間プロフィール。FIG. 9: Time profile of mean plasma concentrations in rats after intravenous (iv) administration of rHCNTF, RG228 and RG242, normalized to a 100 μg / kg dose for all three compounds.

【図１０】 ラットにおいて、全ての３つの化合物について２００μｇ／ｋｇ用量に正規化
した、ｒＨＣＮＴＦ、ＲＧ２２８およびＲＧ２４２の皮下（ＳＣ）投与後の平均
血漿濃度の時間プロフィール。FIG. 10: Time profile of mean plasma concentrations in rats after subcutaneous (SC) administration of rHCNTF, RG228 and RG242, normalized to a 200 μg / kg dose for all three compounds.

【図１１】 （Ａ）ｈＣＮＴＦ 対 ＲＧ２２８；（Ｂ）ｈＣＮＴＦ 対 ＲＧ２９７およ
び（Ｃ）ｈＣＮＴＦ 対 ＲＧ２４２、のラット筋肉湿性重量の用量依存性レス
キューの比較。FIG. 11: Dose-dependent rescue of rat muscle wet weight of (A) hCNTF vs. RG228; (B) hCNTF vs. RG297 and (C) hCNTF vs. RG242.

【図１２】 ｈＣＮＴＦ、ＲＧ２２８、ＲＧ２４２およびＲＧ２９７についてのインビボで
の毒性の比較。FIG. 12: In vivo toxicity comparison for hCNTF, RG228, RG242 and RG297.

【図１３】 ニューロトロフィンで処置し、そしてキノリン酸を注射した脳からの代表的な
Ｎｉｓｓｌ染色切片（冠状平面）。一番上の左：インタクトな尾状の被殻（ＣＰ
ｕ）の表示。近接するパネル：ＮＧＦ、ＢＤＮＦまたはＮＴ−３で処置され、そ
してキノリン酸を注射された脳からの切片の比較表示。ニューロトロフィンで処
置された脳において、周囲の領域（白矢印で示される）は、中程度のサイズのニ
ューロンを実質的に欠く。ＣＰｕにおける２つのトラックを、注入カニューレ（
ｃ）およびキノリン酸注射針（矢印頭部）により残した。ｅｃは、外部カプセル
；ＬＶは、外側脳室。目盛りバー＝０．５ｍｍ。FIG. 13. Representative Nissl-stained sections (coronal planes) from brain treated with neurotrophin and injected with quinolinic acid. Top left: Intact caudate putamen (CP
u) display. Close panel: Comparative representation of sections from brains treated with NGF, BDNF or NT-3 and injected with quinolinic acid. In the brain treated with neurotrophin, the surrounding area (indicated by white arrows) is substantially devoid of medium-sized neurons. The two tracks on the CPu were replaced with an injection cannula (
c) and quinolinic acid needle (arrow head). ec is the external capsule; LV is the lateral ventricle. Scale bar = 0.5 mm.

【図１４】 ＣＮＴＦまたはＰＢＳで処置し、そしてキノリン酸を注射した脳からの代表的
なＮｉｓｓｌ染色切片（冠状平面）。一番上の左：未処置のインタクトな尾状の
被殻（ＣＰｕ）の表示。一番上の右：多数の中程度のサイズのニューロン（これ
らの少数を矢印で示す）を示す外側のＣＰｕのより拡大した表示。中段および一
番下の左：ＰＢＳまたはＣＮＴＦで処置し、そしてキノリン酸を注射した脳にお
ける左ＣＰｕ。ＣＰｕにおける２つのトラックは、ＰＢＳまたはＣＮＴＦ注入カ
ニューレ（Ｃ）およびキノリン酸注射針（矢印頭部）により残る；白矢印は、損
傷の内側の境界を示す。中部および一番下の右：ＰＢＳで処置した脳における中
程度のサイズの線条体ニューロンの実質的な完全な非存在（ニューロン損失スコ
ア＝４）、およびＣＮＴＦで処置した脳における多数の正常のようであるニュー
ロンの存在（いくつかの生存しているニューロンを矢印で示す；ニューロン損失
スコア＝２）を例示するカニューレの２５０μｍ外側のより拡大した表示。ｅｃ
は、外部カプセル；ＬＶは、外側の脳室。左の目盛りのバー＝０．５ｍｍ；右の
目盛りバー＝３０μｍ。FIG. 14. Representative Nissl-stained sections from brains treated with CNTF or PBS and injected with quinolinic acid (coronal plane). Top left: display of untreated intact caudate putamen (CPu). Top right: a larger view of the outer CPu showing a large number of medium sized neurons, a few of which are indicated by arrows. Middle and bottom left: left CPu in brain treated with PBS or CNTF and injected with quinolinic acid. The two tracks in CPu are left by the PBS or CNTF infusion cannula (C) and the quinolinic acid needle (arrow head); the white arrow indicates the inner border of the lesion. Middle and bottom right: Substantial complete absence of medium-sized striatal neurons in the PBS-treated brain (neuron loss score = 4), and numerous normals in the CNTF-treated brain. A more magnified representation outside the 250 μm of the cannula illustrating the presence of neurons that appear to be present (some surviving neurons are indicated by arrows; neuronal loss score = 2). ec
Is the outer capsule; LV is the outer ventricle. Left scale bar = 0.5 mm; right scale bar = 30 μm.

【図１５】 キノリン酸（ＱＡ）の線条体内注射により誘発される中程度のサイズの線条体
ニューロン損失における神経栄養因子での処置の効果。Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ。神
経栄養性因子またはＰＢＳで処置およびキノリン酸を注射され、そしてキノリン
酸で処置された群についての平均ニューロン損失スコア（±ＳＥＭ）。各々の栄
養因子で処置された群におけるラットの数は、以下の通りである：ＮＧＦ＝５；
ＢＤＮＦ＝１２；ＮＴ−３＝１０；ＣＮＴＦ＝３；Ａｘ１＝７；等価な数を、各
実験においてＰＢＳ処置したコントロール群に使用した。統計学的比較を、片側
ｔ検定によった。ＮＴ−３処置は、ＰＢＳで処置した群と比較して、有意に大き
い（＋）平均ニューロン損失スコアを生じた：ｔ（１７）＝２．７５、ｐ＝０．
０１。ＣＮＴＦまたはＡｘ１処置は、ＰＢＳで処置した群と比較して、有意によ
り低い（^*）平均ニューロン損失スコアを生じた：それぞれ、ｔ（５）＝２．７
、ｐ＝０．０４およびｔ（１３）＝４．２、Ｐ＝０．００１。FIG. 15. Effect of treatment with neurotrophic factor on the loss of medium size striatal neurons induced by intrastriatal injection of quinolinic acid (QA). A, B, C, D, E. Mean neuronal loss score (± SEM) for groups treated with neurotrophic factor or PBS and injected with quinolinic acid, and treated with quinolinic acid. The number of rats in each trophic factor treated group is as follows: NGF = 5;
BDNF = 12; NT-3 = 10; CNTF = 3; Ax1 = 7; Equivalent numbers were used for the PBS treated control group in each experiment. Statistical comparison was by one-tailed t-test. NT-3 treatment resulted in a significantly larger (+) mean neuronal loss score compared to the PBS treated group: t (17) = 2.75, p = 0.
01. CNTF or Ax1 treatment resulted in significantly lower ( ^* ) mean neuronal loss scores compared to PBS treated groups: t (5) = 2.7, respectively.
, P = 0.04 and t (13) = 4.2, P = 0.001.

【図１６】 キノリン酸（ＱＡ）の線条体内注射により誘発される中程度のサイズの線条体
ニューロン損失におけるＡｘ−１での処置の効果。各グラフの上の時間系列は、
実験計画を示す。 Ａ．浸透ポンプを、４日間だけ移植し、そしてキノリン酸の注射を、ポンプの除
去した３日後に与えたことを除いて、図１の解説に記載されたものと類似する実
験概念図においてＡｘ１（ｎ＝６）またはＰＢＳ（ｎ＝５）で処置された群につ
いての平均ニューロン損失スコア（±ＳＥＭ）。 Ｂ．キノリン酸の注射の３日前および１日後にＡ×１（ｎ＝６）またはＰＢＳ（
ｎ＝６）の線条体内注射を毎日受けている群についての平均ニューロン損失スコ
ア。^* 片側ｔ検定、Ａ：ｔ（９）＝２．５、ｐ＝０．０３；Ｂ：ｔ（１０）＝２．３
、ｐ＝０．０４。FIG. 16: Effect of treatment with Ax-1 on loss of medium-sized striatal neurons induced by intrastriatal injection of quinolinic acid (QA). The time series above each graph is
The experimental plan is shown. A. The Ax1 (n = 6) or PBS (n = 5) treated groups mean neuronal loss score (± SEM). B. Ax1 (n = 6) or PBS (3 days before and 1 day after injection of quinolinic acid
Mean neuronal loss score for the group receiving daily intrastriatal injections of n = 6). ^{* One-} tailed t-test, A: t (9) = 2.5, p = 0.03; B: t (10) = 2.3
, P = 0.04.

【図１７】 正常なマウスにおけるアキソカイン−１５（Ａｘ−１５）の効果。正常Ｃ５７
ＢＬ／６Ｊマウスに、０．１ｍｇ/ｋｇ、０．３ｍｇ/ｋｇ、または１．０ｍｇ/
ｋｇでビヒクルまたはＡｘ−１５のいずれかを、６日間毎日皮下に注射した。ビ
ヒクルで処置したコントロールに対するＡｘ−１５で処置した場合の体重の変化
の百分率を示す。FIG. 17: Effect of axocaine-15 (Ax-15) in normal mice. Normal C57
In BL / 6J mice, 0.1 mg / kg, 0.3 mg / kg, or 1.0 mg / kg
Either vehicle or Ax-15 in kg was injected subcutaneously daily for 6 days. Shows the percentage change in body weight when treated with Ax-15 relative to vehicle-treated controls.

【図１８】 ｏｂ／ｏｂマウスにおけるＡｘ−１５の効果。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ ｏｂ／ｏｂ
マウスは、ビヒクル、レプチン（１．０ｍｇ／ｋｇ）あるいは０．１ｍｇ/ｋｇ
、０．３ｍｇ/ｋｇ、または１．０ｍｇ/ｋｇのＡｘ−１５のいずれかを用いて７
日間毎日皮下に注射された。食餌制限した対飼養マウスに、０．３ｍｇ/ｋｇの
Ａｘ−１５を注射し、体重の減少における食物摂取の効果を調査した。ビヒクル
で処置したコントロールに対する、Ａｘ−１５で処置した場合およびレプチンで
処置した場合の体重変化の百分率を示す。FIG. 18. Effect of Ax-15 in ob / ob mice. C57BL / 6J ob / ob
For mice, vehicle, leptin (1.0 mg / kg) or 0.1 mg / kg
, 0.3 mg / kg, or 1.0 mg / kg of Ax-15 7
It was injected subcutaneously daily for each day. Diet-restricted pair-fed mice were injected with 0.3 mg / kg of Ax-15 to investigate the effect of food intake on weight loss. The percentage change in body weight when treated with Ax-15 and when treated with leptin relative to vehicle treated controls is shown.

【図１９】 マウスにおいて食餌で誘導した肥満におけるＡｘ−１５の効果。ＡＫＲ／Ｊマ
ウスは、ビヒクル、レプチン（１．０ｍｇ／ｋｇ）あるいは０．０３ｍｇ/ｋｇ
、０．１ｍｇ/ｋｇ、０．３ｍｇ/ｋｇ、または１．０ｍｇ/ｋｇのＡｘ−１５の
いずれかを用いる処置の前に７日間高脂肪食に置いた。食餌制限し、対飼養ＡＫ
Ｒ／Ｊマウスに、０．３ｍｇ/ｋｇのＡｘ−１５を注射し、体重の減少における
食物摂取の効果を調査した。ビヒクルで処置したコントロールに対する、Ａｘ−
１５で処置した場合およびレプチンで処置した場合の体重変化の百分率を示す。FIG. 19. Effect of Ax-15 on diet-induced obesity in mice. For AKR / J mice, vehicle, leptin (1.0 mg / kg) or 0.03 mg / kg
, 0.1 mg / kg, 0.3 mg / kg, or 1.0 mg / kg of Ax-15 were placed on a high fat diet for 7 days prior to treatment. Diet-restricted, anti-feeding AK
R / J mice were injected with 0.3 mg / kg Ax-15 and the effect of food intake on weight loss was investigated. Ax- vs. vehicle treated controls
The percentage change in body weight when treated with 15 and with leptin is shown.

【図２０】 食餌で誘導した肥満ＡＫＲ／Ｊマウスにおける血清インスリンおよびコルチコ
ステロンのレベルにおけるＡｘ−１５および食餌制限の効果。 図２０Ａ．ＡＲＫ／Ｊ食餌誘導肥満マウスにおいて、ビヒクル、食事制限および
Ａｘ−１５（０．１ｍｇ／ｋｇ）またはＡｘ−１５単独（０．１ｍｇ／ｍｌ）で
の処置し、肥満関連高インスリン血症における食餌および／またはＡｘ−１５処
置の効果を決定した後に、血清インスリンレベルを測定した。 図２０Ｂ．ＡＲＫ／Ｊ食餌誘導肥満マウスにおいて、ビヒクル、食事制限および
Ａｘ−１５（０．１ｍｇ／ｋｇ）またはＡｘ−１５単独（０．１ｍｇ／ｍｌ）で
の処置し、肥満関連高インスリン血症における食餌および／またはＡｘ−１５処
置の効果を決定した後に、血清コルチコステロンレベルを測定した。FIG. 20: Effect of Ax-15 and dietary restriction on serum insulin and corticosterone levels in diet-induced obese AKR / J mice. FIG. 20A. In ARK / J diet-induced obese mice, treated with vehicle, diet and Ax-15 (0.1 mg / kg) or Ax-15 alone (0.1 mg / ml), diet and obesity-related hyperinsulinemia Serum insulin levels were measured after determining the effect of / or Ax-15 treatment. FIG. 20B. In ARK / J diet-induced obese mice, treated with vehicle, diet and Ax-15 (0.1 mg / kg) or Ax-15 alone (0.1 mg / ml), diet and obesity-related hyperinsulinemia Serum corticosterone levels were measured after determining the effect of / or Ax-15 treatment.

【図２１】 食餌で誘導された肥満を有するマウスにおいて、１−２０−ＰＥＧ Ａｘ−１
５（モノ−２０Ｋ−ＰＥＧ−Ａｘ−１５）は、体重減少を生じる際に非ＰＥＧ化
Ａｘ−１５よりも４倍効果的であった。１３日間にわたって毎週、ＰＢＳ、Ａｘ
−１５（０．７ｍｇ／ｋｇ）、または１−２０−ＰＥＧ Ａｘ−１５（０．２３
および０．７ｍｇ／ｋｇ）のいずれかを、ＤＩＯマウスに皮下注射（^*）した。
この動物の体重を毎日測定し、そして平均体重の変化を、基準からの変化の百分
率＋／−ＳＥＭ（１群当たりｎ＝６）として表した。FIG. 21: 1-20-PEG Ax-1 in mice with diet-induced obesity
5 (mono-20K-PEG-Ax-15) was 4-fold more effective than non-PEGylated Ax-15 in producing weight loss. PBS, Ax every week for 13 days
-15 (0.7 mg / kg), or 1-20-PEG Ax-15 (0.23
And 0.7 mg / kg) were subcutaneously injected ( ^* ) into DIO mice.
The animals were weighed daily and the change in mean body weight was expressed as the percentage change from baseline +/- SEM (n = 6 per group).

【図２２】 食餌で誘導された肥満を有するマウスにおいて、１−２０−ＰＥＧ Ａｘ−１
５は、非ＰＥＧ化Ａｘ−１５よりも効果的に食物摂取を減少させた。１３日間に
わたって毎日、ＰＢＳ、非ＰＥＧ化、Ａｘ−１５（０．７ｍｇ／ｋｇ）、または
１−２０−ＰＥＧ Ａｘ−１５（０．２３および０．７ｍｇ／ｋｇ）のいずれか
を、ＤＩＯマウスに皮下注射（^*）を与えた。食物摂取を２４時間毎に記録し、
そして結果を、消費されたペレットの平均グラム体重＋／−ＳＥＭ（１群当たり
ｎ＝６）として表した。FIG. 22: 1-20-PEG Ax-1 in mice with diet-induced obesity.
5 reduced food intake more effectively than non-PEGylated Ax-15. DIO mice were treated with either PBS, non-PEGylated, Ax-15 (0.7 mg / kg), or 1-20-PEG Ax-15 (0.23 and 0.7 mg / kg) daily for 13 days. Subcutaneous injection ( ^* ) was given. Record food intake every 24 hours,
The results were then expressed as the average gram weight of pellets consumed +/− SEM (n = 6 per group).

【図２３】 図２３Ａ−毎日ｄｂ／ｄｂ動物をＡｘ−１５で処置することは、カロリー制限よ
り有意に大きな体重の減少を引き起こす。ｄｂ／ｄｂマウスまたはその異型接合
同腹仔メイト（ｄｂ／？）は、１０日間毎日、Ａｘ−１５（０．１または０．３
ｍｇ／ｋｇ）あるいはビヒクルのいずれかの注射（Ｓ．Ｃ．）を受けた。食餌摂
取を、ビヒクル処置された動物（対飼養）のコホートに対して、最も多くのＡｘ
−１５で処置された群によって摂取されたのと同じ量に制限した。平均の群の体
重＋／−ＳＥＭ（ｎ＝１２）を、毎日報告した。図２３Ｂ−１０日のｄｂ／ｄｂ
動物におけるグルコース耐性に対するのＡｘ−１５処置の効果。経口グルコース
耐性試験（ＯＧＴＴ）を、ビヒクル（白四角）、対飼養ビヒクル処置の（黒菱形
）、およびＡｘ−１５処置の（０．１ｍｇ／ｋｇ／日、白三角；０．３ｍｇ／ｋ
ｇ／日、黒三角）、ｄｂ／ｄｂ雄性マウスならびに年齢が同じ異型接合ｄｂ／？
マウス（黒丸）に対して行った。各点は、少なくとも１２匹の動物の平均＋／−
ＳＥＭを表す。図２３Ｃ−ｄｂ／ｄｂ動物に毎日低用量のＡｘ−１５を処置する
ことは、有意な体重減少を引き起こす。ｄｂ／ｄｂマウスに、１０日間毎日、Ａ
ｘ−１５（０．０１２５、０．０２５または０．０５ｍｇ／ｋｇ）あるいはビヒ
クルのいずれかの注射（Ｓ．Ｃ．）を行った。平均の群の体重＋／−ＳＥＭ（ｎ
＝６）を、毎日報告した。図２３Ｄ−ｄｂ／ｄｂ動物におけるグルコース耐性に
対する低用量のＡｘ−１５の１０日間の処置の効果。経口グルコース耐性試験（
ＯＧＴＴ）を、ビヒクル（白四角）およびＡｘ−１５処置（０．０１２５、０．
０２５、または０．０５ｍｇ／ｋｇ）のｄｂ／ｄｂ雄性マウスで行った。各点は
、少なくとも６匹の動物の平均＋／−ＳＥＭを表す。FIG. 23A-Treatment of daily db / db animals with Ax-15 results in significantly greater weight loss than caloric restriction. The db / db mouse or its heterozygous littermate (db /?) received Ax-15 (0.1 or 0.3) daily for 10 days.
(mg / kg) or vehicle (SC). Food intake was the highest in Ax vs. a cohort of vehicle-treated animals (paired).
The same amount was ingested by the -15 treated group. Mean group weight +/− SEM (n = 12) was reported daily. Figure 23B-10 day db / db
Effect of Ax-15 treatment on glucose tolerance in animals. An oral glucose tolerance test (OGTT) was performed using vehicle (open squares), versus vehicle-fed vehicle treatment (filled diamonds), and Ax-15 treatment (0.1 mg / kg / day, open triangles; 0.3 mg / k).
g / day, black triangle), db / db male mice and heterozygous db /? of the same age.
It was performed on a mouse (black circle). Each point is the mean of at least 12 animals +/-
Represents SEM. FIG. 23C-Treatment of db / db animals with low doses of Ax-15 daily causes significant weight loss. db / db mice received A daily for 10 days
Injections (SC) of either x-15 (0.0125, 0.025 or 0.05 mg / kg) or vehicle were given. Average group weight +/- SEM (n
= 6) reported daily. Figure 23D-Effect of 10 days treatment of low dose Ax-15 on glucose tolerance in db / db animals. Oral glucose tolerance test (
OGTT) was compared to vehicle (open squares) and Ax-15 treatment (0.0125, 0.
025, or 0.05 mg / kg) db / db male mice. Each point represents the mean +/- SEM of at least 6 animals.

【図２４】 図２４は、ｄｂ／ｄｂ雄性マウスにおける非空腹時血清血液グルコースに対する
ビヒクル処置（白四角）、対飼養処置（黒菱形）と比較した、Ａｘ−１５処置（
０．３ｍｇ／ｋｇ／日；黒三角）の効果の経過。各点は、最後の注射の１４時間
後の、少なくとも６匹の動物の平均＋／−ＳＥＭを示す。FIG. 24 shows Ax-15 treatment (compared to vehicle treatment (open squares), pair-fed treatment (filled diamonds) for non-fasting serum blood glucose in db / db male mice.
0.3 mg / kg / day; black triangle). Each point represents the mean +/- SEM of at least 6 animals 14 hours after the last injection.

【図２５】 ｄｂ／ｄｂ動物における１０日のＡｘ−１５処置の生理学的結果。図２５Ａ：空
腹時血液グルコース濃度を、コントロール群（ビヒクル処置（白バー）、対飼養
ビヒクル処置（陰影のついたバー）および年齢が同じ異型接合ｄｂ／？マウス（
点バー））と比較した場合の、１０日間Ａｘ−１５（０．１ｍｇ／ｋｇ／日およ
び０．３ｍｇ／ｋｇ／日、陰影のついたバー）で処置されたｄｂ／ｄｂ雄性マウ
スからの血清において決定した。各バーは、少なくとも８匹の動物の平均＋／−
ＳＥＭを示す。図２５Ｂ：空腹時インスリン濃度を、コントロール群（ビヒクル
処置（白バー）、対飼養ビヒクル処置（陰影のついたバー）および年齢が同じ異
型接合ｄｂ／？マウス（点バー））と比較した場合の、１０日間Ａｘ−１５（０
．１ｍｇ／ｋｇ／日および０．３ｍｇ／ｋｇ／日、陰影のついたバー）で処置さ
れたｄｂ／ｄｂ雄性マウスからの血清において決定した。各バーは、少なくとも
８匹の動物の平均＋／−ＳＥＭを示す。図２５Ｃ：空腹時遊離脂肪酸レベルを、
コントロール群（ビヒクル処置（白バー）、対飼養ビヒクル処置（陰影のついた
バー）および年齢が同じ異型接合ｄｂ／？マウス（点バー））と比較した場合の
、１０日間Ａｘ−１５（０．１ｍｇ／ｋｇ／日および０．３ｍｇ／ｋｇ／日、陰
影のついたバー）で処置されたｄｂ／ｄｂ雄性マウスからの血清サンプルにおい
て決定した。各バーは、少なくとも８匹の動物の平均＋／−ＳＥＭを示す。イン
スリン耐性試験のデータは、ひどく害されたビヒクル処置コントロールｄｂ／ｄ
ｂ動物からの改善されたインスリン感受性プロフィールを示す。FIG. 25. Physiological results of 10 days of Ax-15 treatment in db / db animals. FIG. 25A: Fasting blood glucose concentrations were determined in control groups (vehicle treated (white bar), vs. fed vehicle treated (shaded bar) and heterozygous db /?
Serum from db / db male mice treated with Ax-15 (0.1 mg / kg / day and 0.3 mg / kg / day, shaded bars) for 10 days as compared to (dot bars)). It was decided in. Each bar is an average of at least 8 animals +/-
SEM is shown. FIG. 25B: Fasting insulin levels compared to control groups (vehicle treated (white bars), vs vehicle-fed vehicle treatment (shaded bars) and heterozygous db /? Mice of the same age (dot bars)). 10 days Ax-15 (0
． Determined in sera from db / db male mice treated with 1 mg / kg / day and 0.3 mg / kg / day, shaded bars). Each bar represents the mean +/- SEM of at least 8 animals. Figure 25C: Fasting free fatty acid levels,
Ax-15 (0. 0) for 10 days when compared to control groups (vehicle treated (white bars), paired vehicle treated (shaded bars) and age-matched heterozygous db /? Mice (dot bars)). Determined in serum samples from db / db male mice treated with 1 mg / kg / day and 0.3 mg / kg / day, shaded bars). Each bar represents the mean +/- SEM of at least 8 animals. Insulin tolerance test data show severely compromised vehicle treated control db / d
b shows an improved insulin sensitivity profile from animals.

【図２６】 ｄｂ／ｄｂマウスの弓状核におけるインスリン刺激ホスホチロシン免疫反応性に
対するＡｘ−１５の効果。異型接合（ｄｂ／？）マウスの免疫染色は、インスリ
ン（頸静脈を介して１ＩＵ）の３０分のボーラス後に、ビヒクル注入コントロー
ルレベル（図２６Ａ）と比較した場合、弓状核のホスホチロシン免疫反応性染色
ニューロンにおいて、増加を示した（図２６Ｂ）。インスリン耐性／糖尿病のｄ
ｂ／ｄｂマウス（１０日間ビヒクル処置された）の分析は、インスリン処置（図
２６Ｄ）後に検出可能な変化を有しない、本質的に高いホスホチロシン免疫反応
性染色パターン（図２６Ｃ）を示した。ｄｂ／ｄｂマウスの１０日のＡｘ−１５
処置は、高い基礎的ホスホチロシン応答性を弱め（図２６Ｅおよび図２６Ｇ）、
そして、インスリンホスホチロシン応答性を回復する（図２６Ｆおよび図２６Ｈ
）。FIG. 26: Effect of Ax-15 on insulin-stimulated phosphotyrosine immunoreactivity in the arcuate nucleus of db / db mice. Immunostaining of heterozygous (db /?) Mice showed arcuate phosphotyrosine immunoreactivity when compared to vehicle infused control levels (Figure 26A) after a 30 minute bolus of insulin (1 IU via the jugular vein). There was an increase in stained neurons (FIG. 26B). Insulin resistance / diabetes d
Analysis of b / db mice (vehicle-treated for 10 days) showed an essentially high phosphotyrosine immunoreactive staining pattern (FIG. 26C) with no detectable changes after insulin treatment (FIG. 26D). 10-day Ax-15 in db / db mice
Treatment attenuated the high basal phosphotyrosine responsiveness (FIGS. 26E and 26G),
Then, the insulin phosphotyrosine responsiveness is restored (FIGS. 26F and 26H).
).

【図２７】 ｄｂ／ｄｂマウスの肝臓におけるインスリンで刺激されたシグナル伝達に対する
Ａｘ−１５の効果。雄性ｄｂ／ｄｂマウスを、ビヒクル（レーン７およびレーン
８）、対飼養薬物処置レベルについて（レーン１およびレーン２）またはＡｘ−
１５で処置（０．１ｍｇ／ｋｇ／日、レーン５およびレーン６；０．３ｍｇ／ｋ
ｇ／日、レーン４およびレーン５）のいずれかで１０日処置した。１１日目に、
門脈を介して生理的食塩水（−）または１ＩＵの標準インスリン（＋）を注入し
て、動物に麻酔をかけた。肝臓を取り出し、そして、そのタンパク質抽出物を、
（図２７Ａ）抗ホスホチロシン特異的抗体によって免疫沈澱させ、その後、ＰＩ
３−キナーゼのｐ８５調節サブユニットに対する抗血清を用いる標準的ウエスタ
ンブロット分析を行った、（図２７Ｂ、上パネル）ＩＲＳ−１特異的抗血清、そ
の後、抗ホスホチロシン特異的抗体を用いるウエスタンブロット分析を行った、
および、（図２７Ｂ、一番下のパネル）ＩＲＳ−１特異的抗血清。非免疫コント
ロール免疫沈澱（ＮＩ）、溶解物コントロールなし（ＮＬ）およびｐ８５に対す
る３Ｔ３−Ｌ１溶解物コントロール（Ｃ）を、免疫沈澱およびブロッティングコ
ントロールとして行った。FIG. 27: Effect of Ax-15 on insulin-stimulated signaling in the liver of db / db mice. Male db / db mice were treated with vehicle (lane 7 and lane 8), versus dietary drug treatment levels (lane 1 and lane 2) or Ax-.
Treatment with 15 (0.1 mg / kg / day, lanes 5 and 6; 0.3 mg / k
g / day, either lane 4 and lane 5) for 10 days. On the 11th day,
Animals were anesthetized by infusion of saline (-) or 1 IU of standard insulin (+) via the portal vein. The liver is removed and the protein extract is
(FIG. 27A) Immunoprecipitation with anti-phosphotyrosine specific antibody followed by PI
Standard Western blot analysis with antisera directed against the p85 regulatory subunit of 3-kinase was performed (FIG. 27B, upper panel) IRS-1 specific antisera followed by Western blot analysis with antiphosphotyrosine specific antibodies. went,
And (FIG. 27B, bottom panel) IRS-1 specific antiserum. Non-immune control immunoprecipitation (NI), no lysate control (NL) and 3T3-L1 lysate control for p85 (C) were performed as immunoprecipitation and blotting controls.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 3/10 Ａ６１Ｐ 5/00 5/00 Ａ６１Ｋ 37/02 // Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ， ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ， ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，Ｌ Ｃ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ， ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，Ｔ Ｊ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 スリーマン， マーク ダブリュー． アメリカ合衆国 ニューヨーク 10541， マホパック， レイク ドライブ 118 (72)発明者 ランバート， フィリップ ディー． アメリカ合衆国 ニューヨーク 10547， モヘガン レイク， レイク ショアー ドライブ 3318 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA20 BA63 BA80 CA06 DA06 EA04 GA11 4C076 BB13 BB15 BB16 BB21 CC21 CC30 CC41 4C084 AA02 BA01 BA22 DB59 MA24 MA35 MA37 MA38 MA56 MA66 NA10 ZA702 ZC032 ZC332 ZC352 4C087 AA01 BB33 MA67 NA10 ZA70 ZC03 ZC33 ZC35 ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (51) Int.Cl. ⁷ Identification code FI theme code (reference) A61P 3/10 A61P 5/00 5/00 A61K 37/02 // C12N 15/09 ZNA C12N 15/00 ZNAA (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ , CF, CG, CI, CM, GA, GN, GW, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH, GM, KE, LS, MW, MZ, SD, SL, SZ, TZ , UG, ZW), EA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AE, AL, AM, AT, AU, AZ, BA, BB, BG BR, BY, CA, CH, CN, CU, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, GB, GD, GE, GH, GM, HR, HU, ID, IL, IN, IS, JP, KE , KG, KP, KR, KZ, L C, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, SL, TJ, TM, TR, TT, UA, UG, US, UZ, VN, YU, ZA, ZW (72) Inventor Sleeman, Mark W .. United States New York 10541, Maho Pack, Lake Drive 118 (72) Inventor Lambert, Philip Dee. United States New York 10547, Mohegan Lake, Lake Shore Drive 3318 F-Term (reference) 4B024 AA01 AA20 BA63 BA80 CA06 DA06 EA04 GA11 4C076 BB13 BB15 BB16 BB21 CC21 CC30 CC41 4C084 AA02 BA01 BA22 DB59 MA24 MA35 MA37 ZC2 NA66 MA02 MA66 AA01 BB33 MA67 NA10 ZA70 ZC03 ZC33 ZC35

Claims (21)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 哺乳動物における糖尿病を処置する方法における使用のため
の医薬の製造における、改変された毛様体神経栄養因子Ａｘ−１５の使用。1. Use of a modified ciliary neurotrophic factor Ax-15 in the manufacture of a medicament for use in a method of treating diabetes in a mammal. 【請求項２】 前記糖尿病が非インシュリン依存性糖尿病または妊娠糖尿病
である、請求項１に記載の使用。2. The use according to claim 1, wherein the diabetes is non-insulin dependent diabetes or gestational diabetes. 【請求項３】 インシュリン耐性を減少するため、またはインシュリン感受
性を増加させるための請求項１または２に記載の使用。3. Use according to claim 1 or 2 for reducing insulin resistance or increasing insulin sensitivity. 【請求項４】 哺乳動物における無血清脂肪酸レベルを低下させる方法にお
ける使用のための医薬の製造における、改変された毛様体神経栄養因子Ａｘ−１
５の使用。4. A modified ciliary neurotrophic factor Ax-1 in the manufacture of a medicament for use in a method of reducing serum free fatty acid levels in a mammal.
Use of 5. 【請求項５】 哺乳動物における内分泌系の疾患または障害を処置する方法
における使用のための医薬の製造における、改変された毛様体神経栄養因子Ａｘ
−１５の使用。5. A modified ciliary neurotrophic factor Ax in the manufacture of a medicament for use in a method of treating an endocrine system disease or disorder in a mammal.
Use of -15. 【請求項６】 哺乳動物における妊娠糖尿病または非インシュリン依存性糖
尿病の発症を予防する方法における使用のための医薬の製造における、改変され
た毛様体神経栄養因子Ａｘ−１５の使用。6. Use of a modified ciliary neurotrophic factor Ax-15 in the manufacture of a medicament for use in a method of preventing the development of gestational diabetes or non-insulin dependent diabetes mellitus in a mammal. 【請求項７】 前記哺乳動物がヒトである、請求項１〜６のいずれか１項に
記載の使用。7. Use according to any one of claims 1 to 6, wherein the mammal is a human. 【請求項８】 静脈内、皮下、筋肉内、クモ膜下腔、脳室内、腹腔内、およ
び実質内の投与から選択される送達経路による投与のための医薬の製造における
、請求項１〜７のいずれか１項に記載の使用。8. The manufacture of a medicament for administration by a delivery route selected from intravenous, subcutaneous, intramuscular, intrathecal, intraventricular, intraperitoneal and intraparenchymal administration. The use according to any one of 1. 【請求項９】 前記投与がＡｘ−１５を放出する細胞の移植を介する、請求
項８に記載の使用。9. The use according to claim 8, wherein said administration is via transplantation of cells that release Ax-15. 【請求項１０】 前記Ａｘ−１５がペグ化されている、請求項１〜９のいず
れか１項に記載の使用。10. Use according to any one of claims 1 to 9, wherein the Ax-15 is pegylated. 【請求項１１】 キャリア中の改変された毛様体神経栄養因子Ａｘ−１５の
哺乳動物への投与を包含する、哺乳動物の糖尿病を処置する方法。11. A method of treating diabetes in a mammal comprising administering to the mammal a modified ciliary neurotrophic factor Ax-15 in a carrier. 【請求項１２】 前記糖尿病が非インシュリン依存性糖尿病または妊娠糖尿
病である、請求項１１に記載の方法。12. The method of claim 11, wherein the diabetes is non-insulin dependent diabetes or gestational diabetes. 【請求項１３】 キャリア中の改変された毛様体神経栄養因子Ａｘ−１５の
哺乳動物への投与を包含する、哺乳動物のインシュリン耐性を減少させる方法。13. A method of reducing insulin resistance in a mammal comprising administering to the mammal a modified ciliary neurotrophic factor Ax-15 in a carrier. 【請求項１４】 キャリア中の改変された毛様体神経栄養因子Ａｘ−１５の
哺乳動物への投与を包含する、哺乳動物のインシュリン感受性を増加させる方法
。14. A method of increasing insulin sensitivity in a mammal comprising administering to the mammal a modified ciliary neurotrophic factor Ax-15 in a carrier. 【請求項１５】 キャリア中の改変された毛様体神経栄養因子Ａｘ−１５の
哺乳動物への投与を包含する、哺乳動物の無血清脂肪酸レベルを低下させる方法
。15. A method of reducing serum free fatty acid levels in a mammal comprising administering to the mammal a modified ciliary neurotrophic factor Ax-15 in a carrier. 【請求項１６】 キャリア中の改変された毛様体神経栄養因子Ａｘ−１５の
哺乳動物への投与を包含する、哺乳動物の内分泌系の疾患または障害を処置する
方法。16. A method of treating a disease or disorder of the endocrine system in a mammal comprising administering to the mammal a modified ciliary neurotrophic factor Ax-15 in a carrier. 【請求項１７】 キャリア中の改変された毛様体神経栄養因子Ａｘ−１５の
哺乳動物への投与を包含する、哺乳動物の妊娠糖尿病または非インシュリン依存
性糖尿病の発症を予防する方法。17. A method for preventing the onset of gestational diabetes or non-insulin dependent diabetes mellitus in a mammal, comprising the administration of a modified ciliary neurotrophic factor Ax-15 in a carrier to the mammal. 【請求項１８】 哺乳動物における糖尿病を処置する方法における使用のた
めに、キャリア中に改変された毛様体神経栄養因子Ａｘ−１５を含有する組成物
。18. A composition containing a modified ciliary neurotrophic factor Ax-15 in a carrier for use in a method of treating diabetes in a mammal. 【請求項１９】 哺乳動物の無血清脂肪酸レベルを低下させる方法における
使用のために、キャリア中に改変された毛様体神経栄養因子Ａｘ−１５を含有す
る組成物。19. A composition comprising a modified ciliary neurotrophic factor Ax-15 in a carrier for use in a method of lowering serum free fatty acid levels in a mammal. 【請求項２０】 哺乳動物の内分泌系の疾患または障害を処置する方法にお
ける使用のために、キャリア中に改変された毛様体神経栄養因子Ａｘ−１５を含
有する組成物。20. A composition comprising a modified ciliary neurotrophic factor Ax-15 in a carrier for use in a method of treating a disease or disorder of the mammalian endocrine system. 【請求項２１】 哺乳動物の妊娠糖尿病または非インシュリン依存性糖尿病
の発症を予防する方法における使用のために、キャリア中に改変された毛様体神
経栄養因子Ａｘ−１５を含有する組成物。21. A composition comprising a modified ciliary neurotrophic factor Ax-15 in a carrier for use in a method of preventing the development of gestational diabetes or non-insulin dependent diabetes mellitus in a mammal.