RU2238947C2

RU2238947C2 - Human neurotrophic growth factor (enovin), isolated nucleic acid molecule encoding its, vector (variants), pharmaceutical composition (variants), antibody, method for detection of growth factor, set, method for identification of agonist or antagonist (variants)

Info

Publication number: RU2238947C2
Application number: RU2001104351A
Authority: RU
Inventors: Хюго Альфонсо ГЕРТС (BE); Хюго Альфонсо ГЕРТС; Стефан Лео Йозеф МАЗЮР (BE); Стефан Лео Йозеф МАЗЮР; Тео Франс МЕРТ (BE); Тео Франс Мерт; Мирослав ЦИК (BE); Мирослав Цик; ДОНК Люк Аугюст Лаурентиус ВЕР (BE); Донк Люк Аугюст Лаурентиус Вер
Original assignee: Янссен Фармацевтика Н.В.
Priority date: 1998-07-14
Filing date: 1999-07-14
Publication date: 2004-10-27

Abstract

FIELD: biotechnology, molecular biology, medicine, pharmacy.

SUBSTANCE: invention can be used for preparing the human neurotrophic growth factor (enovin). Isolated nucleic acid molecule is fused into the expressing vector. Vector or the growth factor (enovin) is used for preparing a pharmaceutical composition used for treatment and prophylaxis in disturbances in the nervous system. The growth factor is detected in sample using antibody that is able to bind with the growth factor. Identification of agonist or antagonist of the neurotrophic growth factor is carried out by interaction of biological material expressing the growth factor receptor with the analyzed compound in the presence of the indicated growth factor. Invention provides the development of medicinal agents used or prophylaxis and treatment of neurodegenerative diseases.

EFFECT: improved detecting and identifying methods.

26 cl, 31 dwg, 4 tbl

Description

Настоящее изобретение относится к нейротрофическому фактору, в частности к клонированию и экспрессии нового члена семейства нейротрофических факторов GDNF, получившего название "эновин" (EVN).The present invention relates to a neurotrophic factor, in particular to cloning and expression of a new member of the family of neurotrophic factors GDNF, called "Enovin" (EVN).

Предпосылки изобретенияBACKGROUND OF THE INVENTION

Нейротрофические факторы участвуют в дифференцировке, развитии и обеспечении жизнеспособности нейронов. Эти белки предотвращают дегенерацию и стимулируют выживание разных типов нервных клеток, благодаря чему они являются потенциальными лекарственными средствами для лечения нейродегенеративных заболеваний. Нейротрофический фактор, выделенный из линии глиальных клеток (GDNF), был первым членом постоянно увеличивающегося подсемейства нейротрофических факторов, отличающихся в структурном отношении от нейротрофинов. GDNF является трансформирующим фактором роста β (TGF-β), входящим в суперсемейство факторов роста, характеризующихся специфической структурой семи высококонсервативных остатков цистеина в аминокислотной последовательности (Kingsley, 1994). GDNF был первоначально выделен при помощи метода на основе способности этого фактора сохранять жизнеспособность и функциональность допаминергических нейронов желудочка среднего мозга эмбриона in vitro (Lin et al., 1993). Другие типы нервных клеток в центральной (CNS) или периферической (PNS) нервной системе также реагируют на действие GDNF, направленное на сохранение их жизнеспособности (Henderson et al., 1994, Buj-Bello et al., 1995, Mount et al., 1995, Oppenheim et al., 1995). Клетки продуцируют GDNF в неактивной проформе, которая специфически расщепляется на сайте узнавания фурина RXXR с образованием активного (зрелого) GDNF (Lin et al., 1993). Экзогенное введение GDNF оказывает сильное нейрозащитное действие в животных моделях болезни Паркинсона, общего нейродегенеративного нарушения, характеризующегося утратой до 70% допаминергических клеток в черном веществе головного мозга (Beck et al., 1995, Tomac et al., 1995, Gash et al., 1996, Choi-Lundberg et al., 1997, Bilang-Bleuel et al., 1997).Neurotrophic factors are involved in the differentiation, development and viability of neurons. These proteins prevent degeneration and stimulate the survival of different types of nerve cells, making them potential medicines for treating neurodegenerative diseases. The neurotrophic factor isolated from the glial cell line (GDNF) was the first member of an ever-increasing subfamily of neurotrophic factors that are structurally different from neurotrophins. GDNF is a transforming growth factor β (TGF-β), a member of the superfamily of growth factors characterized by the specific structure of seven highly conserved cysteine residues in the amino acid sequence (Kingsley, 1994). GDNF was initially isolated using a method based on the ability of this factor to maintain the vitality and functionality of dopaminergic neurons in the midbrain of the midbrain of the embryo in vitro (Lin et al., 1993). Other types of nerve cells in the central (CNS) or peripheral (PNS) nervous system also respond to GDNF to maintain their viability (Henderson et al., 1994, Buj-Bello et al., 1995, Mount et al., 1995 , Oppenheim et al., 1995). Cells produce GDNF in an inactive proforma that specifically cleaves on the furin recognition site RXXR to form active (mature) GDNF (Lin et al., 1993). Exogenous administration of GDNF has a strong neuroprotective effect in animal models of Parkinson's disease, a common neurodegenerative disorder characterized by the loss of up to 70% of dopaminergic cells in the black matter of the brain (Beck et al., 1995, Tomac et al., 1995, Gash et al., 1996 , Choi-Lundberg et al., 1997, Bilang-Bleuel et al., 1997).

Недавно были обнаружены новые нейротрофические факторы семейства GDNF. Нейротурин (NTN) выделен из кондиционированной среды, содержащей клетки яичника китайского хомячка (СНО), при помощи метода на основе способности этого фактора стимулировать жизнеспособность симпатических нейронов в культуре (Kotzbauer et al., 1996). Белок зрелого NTN на 57% гомологичен зрелому GDNF. Персефин (PSP) обнаружен в результате клонирования с использованием вырожденной затравки для полимеразной реакции синтеза цепи (PCR) с геномной ДНК в качестве матрицы. Зрелый PSP подобно зрелому GDNF способствует выживанию допаминергических нейронов желудочка среднего мозга и двигательных нейронов в культуре (Milbrandt et al., 1998). Гомология белка зрелого PSP со зрелым GDNF и NTN составляет приблизительно 50%. Артемин (ARTN) был обнаружен в результате скрининга базы данных ДНК и является фактором выживания сенсорных и симпатических нейронов в культуре (Baloh et al., 1998b).Recently, new neurotrophic factors of the GDNF family have been discovered. Neuroturin (NTN) was isolated from a conditioned medium containing Chinese hamster ovary (CHO) cells using a method based on the ability of this factor to stimulate the viability of sympathetic neurons in culture (Kotzbauer et al., 1996). The mature NTN protein is 57% homologous to mature GDNF. Perseffin (PSP) was detected by cloning using a degenerate seed for the polymerase chain synthesis (PCR) reaction with genomic DNA as a template. Mature PSP, like mature GDNF, promotes the survival of dopaminergic midbrain ventricular neurons and motor neurons in culture (Milbrandt et al., 1998). The homology of the mature PSP protein with mature GDNF and NTN is approximately 50%. Artemin (ARTN) was discovered by screening a DNA database and is a factor in the survival of sensory and sympathetic neurons in culture (Baloh et al., 1998b).

GDNF, NTN, PSP и ARTN требуют наличия гетеродимерного рецепторного комплекса для осуществления внутриклеточной трансдукции сигнала в нижней области. GDNF связывается с субъединицей альфа 1 семейства рецепторов GDNF (GFRα-1; GFRα; Комитет по номенклатуре, 1997), мембранным белком, связанным гликозилфосфатидилинозитолом (гликозил-PtdIns) (Jing et al., 1996, Treanor et al., 1996, Sanicola et al., 1997). Комплекс GDNF/GFRα-1 затем связывается и активирует протоонкоген cRET, мембраносвязанную тирозинкиназу (Durbec et al., 1996, Trupp et al., 1996), что вызывает фосфорилирование остатков тирозина в cRET и последующую активацию путей трансдукции сигнала в нижней области (Worby et al., 1996). Были исследованы несколько других членов семейства GFRα лигандсвязывающих рецепторов (Baloh et al., 1997, Sanicola et al., 1997, Klein et al., 1997, Buj-Bello et al., 1997, Suvanto et al., 1997). GFRα-2 и GFRα-3 (Jing et al., 1997, Masure et al., 1998, Woby et al., 1998, Naveilham et al., 1998, Baloh et al., 1998a) были идентифицированы целым рядом научно-исследовательских групп. GFRα-1 и GFRα-2 широко экспрессированы почти во всех тканях, и их экспрессию можно регулировать (Sanicola et al., 1997, Widenfalk et al., 1997).GDNF, NTN, PSP, and ARTN require a heterodimeric receptor complex to realize intracellular signal transduction in the lower region. GDNF binds to the alpha 1 subunit of the GDNF receptor family (GFRα-1; GFRα; Nomenclature Committee, 1997), a membrane protein bound by glycosylphosphatidylinositol (glycosyl-PtdIns) (Jing et al., 1996, Treanor et al., 1996, Sanicola et al., 1997). The GDNF / GFRα-1 complex then binds and activates the cRET proto-oncogen, membrane-bound tyrosine kinase (Durbec et al., 1996, Trupp et al., 1996), which causes phosphorylation of tyrosine residues in cRET and subsequent activation of signal transduction pathways in the lower region (Worby et al., 1996). Several other members of the GFRα family of ligand binding receptors have been investigated (Baloh et al., 1997, Sanicola et al., 1997, Klein et al., 1997, Buj-Bello et al., 1997, Suvanto et al., 1997). GFRα-2 and GFRα-3 (Jing et al., 1997, Masure et al., 1998, Woby et al., 1998, Naveilham et al., 1998, Baloh et al., 1998a) have been identified by a number of research groups. GFRα-1 and GFRα-2 are widely expressed in almost all tissues, and their expression can be regulated (Sanicola et al., 1997, Widenfalk et al., 1997).

GFRα-3 отсутствует в развивающейся или зрелой центральной нервной системе, но широко экспрессирован в нескольких развивающихся и зрелых сенсорных и симпатических ганглиях периферической нервной системы (Widenfalk et al., 1998, Naveilhan et al., 1998, Baloh et al., 1998a). Четвертый член этого семейства, GFRα-4, был клонирован из кДНК цыплят (Thompson et al., 1998). GFRa-l является предпочтительным рецептором для GDNF, в то время как GFRα-2 предпочтительно связывает NTN (Jing et al., 1996, Treanor et al., 1996, Klein et al., 1997). GFRα-4 цыплят образует функциональный рецепторный комплекс для PSP в сочетании с cRET (Enokido et al., 1998). Установлено, что клетки, экспрессирующие как GFRα-3, так и cRET, не реагируют на GDNF, NTN или PSP (Worby et al., 1998, Baloh et al., 1998a). Недавно установлено, что ART передает сигнал при помощи cRET, используя GFRα-3 в качестве предпочтительного лигандсвязывающего рецептора (Baloh et al., 1998b). Сообщение между нейротрофическими факторами и рецепторами GFRα возможно in vitro, так как GDNF может связываться с GFRα-2 или GFRα-3 в присутствии cRET (Sanicola et al., 1997, Trupp et al., 1998) и NTN может связываться с GFRα-1 с низкой степенью сродства (Klein et al., 1997). Коротко говоря, GDNF, NTN, PSP и ART являются частью нейротрофической сигнальной системы, при помощи которой разные лигандсвязывающие субъединицы (GFRα-1 - GFRα-4) могут взаимодействовать с субъединицей тирозинкиназы (cRET). Физиологическая значимость этих открытий, сделанных in vitro, недавно была продемонстрирована в сенсационных исследованиях, выполненных на генетическом уровне (Rosenthal, 1999), которые совершенно четко показывают, что GDNF взаимодействует с GFRα-1 in vivo, в то время как NTN является предпочтительным лигандом для GFRα-2.GFRα-3 is absent in the developing or mature central nervous system, but is widely expressed in several developing and mature sensory and sympathetic ganglia of the peripheral nervous system (Widenfalk et al., 1998, Naveilhan et al., 1998, Baloh et al., 1998a). A fourth member of this family, GFRα-4, was cloned from chick cDNA (Thompson et al., 1998). GFRa-l is the preferred receptor for GDNF, while GFRα-2 preferably binds NTN (Jing et al., 1996, Treanor et al., 1996, Klein et al., 1997). GFRα-4 chickens form a functional receptor complex for PSP in combination with cRET (Enokido et al., 1998). It was found that cells expressing both GFRα-3 and cRET do not respond to GDNF, NTN or PSP (Worby et al., 1998, Baloh et al., 1998a). It has recently been found that ART transmits a signal using cRET using GFRα-3 as the preferred ligand binding receptor (Baloh et al., 1998b). Communication between neurotrophic factors and GFRα receptors is possible in vitro, since GDNF can bind to GFRα-2 or GFRα-3 in the presence of cRET (Sanicola et al., 1997, Trupp et al., 1998) and NTN can bind to GFRα-1 with a low degree of affinity (Klein et al., 1997). In short, GDNF, NTN, PSP, and ART are part of a neurotrophic signaling system by which different ligand binding subunits (GFRα-1 - GFRα-4) can interact with a tyrosine kinase subunit (cRET). The physiological significance of these discoveries made in vitro has recently been demonstrated in sensational studies performed at the genetic level (Rosenthal, 1999), which clearly show that GDNF interacts with GFRα-1 in vivo, while NTN is the preferred ligand for GFRα-2.

Авторы настоящего изобретения идентифицировали, клонировали, экспрессировали, локализовали в хромосоме и исследовали эновин (EVN), четвертый член семейства GDNF. Представление о белке зрелого EVN было значительно расширено благодаря открытию разных функциональных и нефункциональных сплайсированных вариантов мРНК. Кроме того, авторы этого изобретения получили данные об экспрессии, связывании EVN с GFRα-3, влиянии in vitro EVN на рост аксонов и защите от вызываемой таксолом нейротоксичности в дифференцированных стауроспорином культурах клеток нейробластомы человека SH-SY5Y.The authors of the present invention identified, cloned, expressed, localized on the chromosome and examined Enovin (EVN), the fourth member of the GDNF family. The concept of mature EVN protein was significantly expanded thanks to the discovery of various functional and non-functional spliced mRNA variants. In addition, the authors of this invention obtained data on expression, EVN binding to GFRα-3, in vitro effects of EVN on axon growth and protection against taxol-induced neurotoxicity in staurosporin differentiated human neuroblastoma cell cultures SH-SY5Y.

Сущность изобретенияSUMMARY OF THE INVENTION

Объектами настоящего изобретения являются молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая новый нейротрофический фактор роста человека "эновин", экспрессирующий вектор, содержащий указанную молекулу нуклеиновой кислоты, клетка-хозяин, трансформированная указанным вектором, нейротрофический фактор роста, кодированный указанной молекулой нуклеиновой кислоты, выделенный эновин, соединения, являющиеся агонистами или антагонистами эновина, и фармацевтические композиции, содержащие эту нуклеиновую кислоту или белок эновина либо их агонисты или антагонисты.The objects of the present invention are a nucleic acid molecule encoding a new neurotrophic human growth factor "Enovin" expressing a vector containing the specified nucleic acid molecule, a host cell transformed with the specified vector, a neurotrophic growth factor encoded by the specified nucleic acid molecule, isolated enovin, compounds, being enovine agonists or antagonists, and pharmaceutical compositions containing this nucleic acid or enovin protein or agonists thereof and and antagonists.

Подробное описание изобретенияDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

Первым объектом настоящего изобретения является молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая нейротрофический фактор роста человека, именуемый здесь эновином, который имеет аминокислотную последовательность, показанную на фиг.21, или кодирующая функциональный эквивалент, производное или биологический предшественник указанного фактора роста. Указанная молекула нуклеиновой кислоты предпочтительно является ДНК и еще более предпочтительно молекулой кДНК.The first object of the present invention is a nucleic acid molecule encoding a neurotrophic human growth factor, referred to here as enovin, which has the amino acid sequence shown in Fig.21, or encoding a functional equivalent, derivative or biological precursor of the specified growth factor. The specified nucleic acid molecule is preferably DNA and even more preferably a cDNA molecule.

Нуклеиновая кислота по этому изобретению предпочтительно имеет последовательность, соответствующую положениям 81-419 в последовательности, показанной на фиг.1, более предпочтительно положениям 81-422 и еще более предпочтительно непроцессированную последовательность, показанную на фиг.1.The nucleic acid of this invention preferably has a sequence corresponding to positions 81-419 in the sequence shown in FIG. 1, more preferably positions 81-422, and even more preferably an unprocessed sequence shown in FIG.

Считается, что молекула нуклеиновой кислоты, соответствующая положениям 81-419, кодирует последовательность белка зрелого эновина после процессирования проформы этого белка на сайте процессинга RXXR, имеющемся в устойчивой проформе указанного белка эновина.It is believed that the nucleic acid molecule corresponding to the provisions of 81-419 encodes the sequence of the mature enovin protein after processing the pro forma of this protein at the RXXR processing site, which is in a stable proform of the indicated enovin protein.

Это изобретение относится также к антисмысловой молекуле, способной гибридизовать с любыми последовательностями нуклеиновых кислот по этому изобретению в очень строгих условиях, которые должны быть хорошо известны специалистам в этой области.This invention also relates to an antisense molecule capable of hybridizing with any nucleic acid sequences of this invention under very stringent conditions that should be well known to those skilled in the art.

Строгие условия гибридизации в используемом здесь значении означают условия, в которых полинуклеиновые кислоты являются устойчивыми. Стабильность гибридов выражается в температуре плавления (Tm) гибридов. Tm можно приблизительно представить формулойStringent hybridization conditions as used herein mean conditions in which polynucleic acids are stable. The stability of hybrids is expressed in the melting temperature (Tm) of the hybrids. Tm can be approximately represented by the formula

81,5°С-16,6(log10[Na⁺]+0,41(%G&C)-600/l81.5 ° C-16.6 (log10 [Na ⁺ ] +0.41 (% G & C) -600 / l

где l означает длину гибридов в нуклеотидах. Tm понижается примерно на 1-1,5°С с каждым 1% уменьшения гомологии последовательностей.where l is the length of the hybrids in nucleotides. Tm decreases by about 1-1.5 ° C with every 1% decrease in sequence homology.

Молекулу нуклеиновой кислоты по этому изобретению можно успешно использовать для экспрессии нейротрофического фактора роста человека по этому изобретению в клетке-хозяине или подобном микроорганизме с использованием приемлемого экспрессирующего вектора.The nucleic acid molecule of this invention can be successfully used to express the neurotrophic human growth factor of this invention in a host cell or similar microorganism using an acceptable expression vector.

Экспрессирующий вектор по этому изобретению представляет собой вектор, способный экспрессировать ДНК, оперативно связанную с регуляторными последовательностями, такими как промоторные области, которые способны экспрессировать такие фрагменты ДНК.The expression vector of this invention is a vector capable of expressing DNA operably linked to regulatory sequences, such as promoter regions, that are capable of expressing such DNA fragments.

Необходимыми для экспрессии регуляторными элементами являются промоторные последовательности, которые связывают полимеразу РНК и последовательности, инициирующие транскрипцию, предназначенные для связывания рибосом. Например, бактериальный экспрессирующий вектор может содержать такой промотор, как lac-промотор, последовательность Shine-Dalgarno для инициации транскрипции и инициирующий кодон AUG. Аналогичным образом, эукариотический экспрессирующий вектор может содержать гетерологичный или гомологичный промотор для полимеразы II РНК, сигнал полиаденилирования в нижней области, инициирующий кодон AUG и терминирующий кодон для отделения рибосомы. Такие векторы можно приобрести коммерческим путем или собрать из последовательностей при помощи методов, хорошо известных в этой области.Regulatory elements necessary for expression are promoter sequences that bind RNA polymerase and transcription initiation sequences designed to bind ribosomes. For example, a bacterial expression vector may contain a promoter such as a lac promoter, a Shine-Dalgarno sequence for transcription initiation, and an AUG initiation codon. Similarly, a eukaryotic expression vector may comprise a heterologous or homologous promoter for RNA polymerase II, a lower polyadenylation signal, an AUG initiation codon, and a termination codon to separate the ribosome. Such vectors can be purchased commercially or assembled from sequences using methods well known in the art.

Таким образом, экспрессирующий вектор является рекомбинантной векторной ДНК или РНК, такой как плазмида, фаг, рекомбинантный вирус или другой вектор, который при введении в приемлемую клетку-хозяина вызывает экспрессию фрагментов ДНК или РНК. Приемлемые экспрессирующие векторы хорошо известны специалистам в этой области и включают векторы, реплицирующиеся в эукариотических и/или прокариотических клетках, векторы, которые остаются эписомными, или векторы, которые внедряются в геном клетки-хозяина.Thus, the expression vector is a recombinant vector DNA or RNA, such as a plasmid, phage, recombinant virus or other vector, which, when introduced into an acceptable host cell, causes the expression of DNA or RNA fragments. Suitable expression vectors are well known to those skilled in the art and include vectors that replicate in eukaryotic and / or prokaryotic cells, vectors that remain episomal, or vectors that are introduced into the genome of the host cell.

Антисмысловую молекулу, способную гибридизовать с нуклеиновой кислотой по этому изобретению, можно использовать в качестве зонда, лекарственного средства или в фармацевтической композиции.An antisense molecule capable of hybridizing with the nucleic acid of this invention can be used as a probe, drug, or pharmaceutical composition.

Молекулы нуклеиновой кислоты по этому изобретению можно ввести в векторы, имеющие антисмысловую ориентацию, для продуцирования антисмысловой РНК. Антисмысловую РНК или другие антисмысловые нуклеиновые кислоты можно продуцировать синтетическими средствами.The nucleic acid molecules of this invention can be introduced into vectors having an antisense orientation to produce antisense RNA. Antisense RNA or other antisense nucleic acids can be produced by synthetic means.

Другим объектом этого изобретения является клетка-хозяин, трансформированная, трансфицированная или инфицированная экспрессирующим вектором по этому изобретению, которая предпочтительно является эукариотической клеткой и более предпочтительно клеткой млекопитающего.Another object of this invention is a host cell transformed, transfected or infected with an expression vector of this invention, which is preferably a eukaryotic cell and more preferably a mammalian cell.

Введение клонированной ДНК в приемлемый экспрессирующий вектор с целью последующей трансформации указанной клетки и отбора трансформированных клеток хорошо известно в этой области и описано в справочнике Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press.The introduction of cloned DNA into an acceptable expression vector for the subsequent transformation of the indicated cell and selection of the transformed cells is well known in the art and described in Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Другим объектом настоящего изобретения является молекула нуклеиновой кислоты, имеющая по крайней мере 15 нуклеотидов, предпочтительно от 15 до 50 нуклеотидов.Another object of the present invention is a nucleic acid molecule having at least 15 nucleotides, preferably from 15 to 50 nucleotides.

Эти последовательности можно успешно использовать в качестве зондов или затравок для инициации репликации или тому подобного. Такие молекулы нуклеиновой кислоты можно получить методами, хорошо известными в этой области, такими как метод рекомбинантных ДНК или метод синтеза. Их можно также использовать в диагностических наборах, устройствах или тому подобных приспособлениях для обнаружения нуклеиновой кислоты по этому изобретению. Эти испытания обычно включают контактирование зонда с образцом в условиях гибридизации и обнаружение любого дуплекса, образующегося между зондом и любой нуклеиновой кислотой в образце.These sequences can be successfully used as probes or seeds for initiating replication or the like. Such nucleic acid molecules can be obtained by methods well known in the art, such as a recombinant DNA method or a synthesis method. They can also be used in diagnostic kits, devices, or the like, for detecting a nucleic acid of the invention. These tests typically include contacting the probe with the sample under hybridization conditions and detecting any duplex that forms between the probe and any nucleic acid in the sample.

В соответствии с настоящим изобретением эти зонды могут быть связаны с твердым носителем. Они предпочтительно находятся на матрице, поэтому несколько зондов можно одновременно гибридизовать с одним биологическим образцом. Эти зонды можно наносить на матрицу или синтезировать in situ на самой матрице. (См. Lockhart et al., Nature Biotechnology, vol. 14, December 1996 "Expression monitoring by hybridisation into high density oligonucleotide arrays". Одна матрица может содержать более 100, 500 и даже 1000 разных зондов в разных местах.In accordance with the present invention, these probes may be coupled to a solid support. They are preferably located on the matrix, so several probes can be hybridized simultaneously with one biological sample. These probes can be applied to the matrix or synthesized in situ on the matrix itself. (See Lockhart et al., Nature Biotechnology, vol. 14, December 1996, “Expression monitoring by hybridization into high density oligonucleotide arrays.” A single matrix may contain more than 100, 500, and even 1000 different probes in different places.

Молекулы нуклеиновой кислоты по этому изобретению можно также продуцировать при помощи методов рекомбинантных ДНК или методов синтеза, таких как, например, механизмы клонирования при помощи полимеразной реакции синтеза цепи (PCR), которые обычно включают получение двух затравок, содержащих примерно 10-50 нуклеотидов в области гена, предназначенного для клонирования, контактирование этих затравок с мРНК, кДНК или геномной ДНК из клетки человека, выполнение полимеразной реакции синтеза цепи в условиях, обеспечивающих амплификацию целевой области, выделение амплифицированной области или фрагмента и получение амплифицированной ДНК. Такие методы хорошо известны в этой области и описаны в справочнике Sambrook et al. (Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 1989).The nucleic acid molecules of this invention can also be produced using recombinant DNA methods or synthesis methods, such as, for example, cloning mechanisms using the polymerase chain synthesis reaction (PCR), which typically involve the preparation of two seeds containing approximately 10-50 nucleotides in the region a gene intended for cloning, contacting these seeds with mRNA, cDNA, or genomic DNA from a human cell, performing the polymerase chain synthesis reaction under conditions providing amplification of the target domain, recovering the amplified region or fragment and recovering the amplified DNA. Such methods are well known in the art and are described in Sambrook et al. (Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 1989).

Нуклеиновые кислоты или олигонуклеотиды по этому изобретению могут иметь метку, облегчающую их обнаружение. Приемлемыми метками являются радиоизотопы, такие как ³²Р или ³⁵S, ферментативные метки или другие белковые метки, в частности биотиновые или флуоресцентные маркеры. Такие метки можно вводить в нуклеиновые кислоты или олигонуклеотиды по этому изобретению и детектировать при помощи известных методов.Nucleic acids or oligonucleotides of this invention may be labeled to facilitate their detection. Suitable labels are radioisotopes such as ³² P or ³⁵ S, enzymatic labels or other protein labels, in particular biotin or fluorescent markers. Such labels can be introduced into the nucleic acids or oligonucleotides of this invention and detected using known methods.

Аллельные варианты или полиморфизмы молекулы ДНК человека по этому изобретению можно успешно идентифицировать, например, путем зондирования библиотеки кДНК или геномной библиотеки, созданной с привлечением целого ряда субъектов, например разных популяций. Кроме того, нуклеиновые кислоты и зонды по этому изобретению можно использовать для секвенирования геномной ДНК у пациентов методами, хорошо известными в этой области, такими как метод терминации дидезоксицепи Сангера, при помощи которого можно успешно выявить любую предрасположенность пациента к конкретным нарушениям, обусловленным фактором роста по этому изобретению.Allelic variants or polymorphisms of the human DNA molecule according to this invention can be successfully identified, for example, by probing a cDNA library or genomic library created with the involvement of a number of subjects, for example different populations. In addition, the nucleic acids and probes of this invention can be used for sequencing genomic DNA in patients by methods well known in the art, such as the Sanger dideoxy chain termination method, which can be used to successfully identify any patient predisposition to specific disorders caused by growth factor by this invention.

Другим объектом настоящего изобретения является трансгенная клетка, ткань или организм, содержащие трансген, способный экспрессировать нейротрофический фактор человека "эновин" по этому изобретению.Another object of the present invention is a transgenic cell, tissue or organism containing a transgene capable of expressing the human neurotrophic factor "enovin" according to this invention.

Термин "трансген, способный экспрессировать" в используемом здесь значении означает любую приемлемую последовательность нуклеиновых кислот, которая вызывает экспрессию нейротрофического фактора, выполняющего ту же функцию и/или обладающего той же активностью, что и нейротрофический фактор по этому изобретению. Этот трансген может содержать, например, геномную нуклеиновую кислоту, выделенную из клеток человека, или синтетическую нуклеиновую кислоту, включая кДНК, интегрированную в хромосому или внехромосомное пространство.The term “transgene capable of expressing,” as used herein, means any suitable nucleic acid sequence that causes the expression of a neurotrophic factor that performs the same function and / or has the same activity as the neurotrophic factor of this invention. This transgene may contain, for example, genomic nucleic acid isolated from human cells, or synthetic nucleic acid, including cDNA, integrated into the chromosome or extrachromosomal space.

Трансген предпочтительно имеет вектор по этому изобретению, который содержит молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую указанный нейротрофический фактор, или функциональный фрагмент указанной молекулы нуклеиновой кислоты. "Функциональный фрагмент" указанной нуклеиновой кислоты означает фрагмент гена или кДНК, кодирующий указанный нейротрофический фактор или его функциональный эквивалент, который может быть экспрессирован с целью продуцирования функционального нейротрофического фактора роста по этому изобретению. Таким образом, фрагменты нейротрофического фактора роста по этому изобретению, которые соответствуют специфическим аминокислотным остаткам, взаимодействующим с соответствующим рецептором, также являются объектом настоящего изобретения и могут служить в качестве агонистов, активирующих соответствующий рецептор фактора роста по этому изобретению, что позволяет выявить его постоянное влияние на рост и жизнеспособность клеток. Объектом этого изобретения являются также дифференциально сплайсированные изоформы и сайты инициации транскрипции нуклеиновых кислот по этому изобретению.The transgene preferably has a vector according to this invention, which contains a nucleic acid molecule encoding the specified neurotrophic factor, or a functional fragment of the specified nucleic acid molecule. A “functional fragment” of said nucleic acid means a gene or cDNA fragment encoding said neurotrophic factor or a functional equivalent thereof that can be expressed to produce a functional neurotrophic growth factor according to this invention. Thus, fragments of the neurotrophic growth factor according to this invention, which correspond to specific amino acid residues interacting with the corresponding receptor, are also an object of the present invention and can serve as agonists activating the corresponding growth factor receptor according to this invention, which allows to reveal its constant effect on cell growth and viability. The object of this invention are also differentially spliced isoforms and nucleic acid transcription initiation sites of this invention.

В соответствии с настоящим изобретением указанная нуклеиновая кислота включает не только идентичную нуклеиновую кислоту, но и нуклеиновую кислоту с любыми незначительными изменениями оснований, включающими, в частности, замену оснований, ведущую к образованию тождественного кодона (другого кодона, определяющего тот же аминокислотный остаток), благодаря вырожденному коду в заменяемых консервативных аминокислотах. Термин молекула нуклеиновой кислоты означает также комплементарную последовательность к любой одноцепочечной последовательности, полученную в результате замены оснований.In accordance with the present invention, said nucleic acid includes not only an identical nucleic acid, but also a nucleic acid with any minor base changes, including, in particular, a base change leading to the formation of an identical codon (another codon defining the same amino acid residue), due to degenerate code in conservative amino acids being replaced. The term nucleic acid molecule also means a complementary sequence to any single-stranded sequence obtained by substitution of bases.

Другим объектом этого изобретения является выделенный нейротрофический фактор роста человека, кодированный вышеуказанной молекулой нуклеиновой кислоты. Этот фактор роста предпочтительно содержит аминокислотную последовательность, соответствующую положениям 27-139, аминокислотной последовательности, показанной на фиг.1, ее функциональный эквивалент, производное или биологический предшественник.Another object of this invention is an isolated neurotrophic human growth factor encoded by the aforementioned nucleic acid molecule. This growth factor preferably contains an amino acid sequence corresponding to the provisions of 27-139, the amino acid sequence shown in figure 1, its functional equivalent, derivative or biological precursor.

Термин "функциональный эквивалент" в используемом здесь значении означает фактор роста, который обладает всеми свойствами и функциональными признаками, характериными для фактора роста, именуемого эновином. "Производное" эновина в используемом здесь значении означает полипептид, в котором некоторые аминокислоты изменены, удалены или заменены другими аминокислотами, при этом указанный полипептид сохраняет биологическую активность эновина и/или может взаимодействовать с антителами, полученными с использованием эновина по этому изобретению в качестве стимулирующего антигена.The term “functional equivalent” as used herein means a growth factor that has all the properties and functional characteristics characteristic of a growth factor called enovin. "Derivative" enovine as used herein means a polypeptide in which certain amino acids are altered, deleted, or replaced by other amino acids, wherein said polypeptide retains the biological activity of enovin and / or can interact with antibodies produced using the enovin of this invention as a stimulating antigen .

В объем настоящего изобретения входят гибридные и модифицированные формы эновина, в том числе слитые белки и их фрагменты. Гибридные и модифицированные формы получают, модифицируя или заменяя некоторые аминокислоты, например, при помощи точковой мутации, причем указанные модификации все же позволяют получить белок, который сохраняет биологическую активность эновина по этому изобретению. Специфические последовательности нуклеиновых кислот можно изменить с получением фактора роста, обладающего такими же или практически такими же свойствами, что и эновин.Hybrid and modified forms of enovin, including fusion proteins and fragments thereof, are within the scope of the present invention. Hybrid and modified forms are obtained by modifying or replacing certain amino acids, for example, using a point mutation, and these modifications still allow you to get a protein that preserves the biological activity of enovin according to this invention. Specific nucleic acid sequences can be changed to produce a growth factor having the same or substantially the same properties as enovin.

Как известно в этой области, многие белки продуцируются in vivo при помощи (пре)сигнальной последовательности у N-конца белка. Кроме того, такие белки могут содержать еще одну пропоследовательность, которая является устойчивым предшественником зрелого белка. Такие пре- и пропоследовательности обычно не нужны для достижения биологической активности. Молекула эновина по этому изобретению содержит не только непроцессированную последовательность, показанную на фиг.21, но и последовательность, занимающую положение 27-139, которая соответствует протеолитическому сайту процессинга RXXR, имеющемуся в факторах роста этого типа, и представляет собой зрелую последовательность эновина.As is known in the art, many proteins are produced in vivo using the (pre) signal sequence at the N-terminus of the protein. In addition, such proteins may contain another sequence that is a stable precursor of a mature protein. Such pre- and pro-sequences are usually not needed to achieve biological activity. The enovin molecule of this invention contains not only the unprocessed sequence shown in FIG. 21, but also a sequence occupying position 27-139, which corresponds to the proteolytic site of RXXR processing present in growth factors of this type, and is a mature enovin sequence.

К указанным белковым, полипептидным или аминокислотным последовательностям по этому изобретению относятся не только идентичные аминокислотные последовательности, но и их изомеры, а также последовательности с незначительным изменением аминокислот, полученные из природной аминокислотной последовательности, допускающей замену консервативных аминокислот (замена аминокислотой, родственной ее боковым цепям). В объем этого изобретения входят также аминокислотные последовательности, которые отличаются от природной аминокислоты, но позволяют получить полипептид, который в иммунологическом отношении идентичен или подобен полипептиду, кодированному природной последовательностью.The indicated protein, polypeptide or amino acid sequences of this invention include not only identical amino acid sequences, but also their isomers, as well as sequences with a slight change in amino acids obtained from a natural amino acid sequence that allows the substitution of conservative amino acids (substitution with an amino acid related to its side chains) . Also included within the scope of this invention are amino acid sequences that differ from the natural amino acid but which produce a polypeptide that is immunologically identical or similar to the polypeptide encoded by the natural sequence.

Белки или полипептиды по этому изобретению далее включают варианты таких последовательностей, в том числе природные аллельные варианты, которые по существу гомологичны указанным белкам или полипептидам. В этом описании изобретения термин "существенная гомология" относится к последовательности, которая обладает по крайней мере 70%, предпочтительно 80%, 90% или 95% гомологией аминокислот с белками или полипептидами, кодированными молекулами нуклеиновых кислот по этому изобретению.The proteins or polypeptides of this invention further include variants of such sequences, including naturally occurring allelic variants that are substantially homologous to said proteins or polypeptides. In this specification, the term “substantial homology” refers to a sequence that has at least 70%, preferably 80%, 90% or 95% amino acid homology with the proteins or polypeptides encoded by the nucleic acid molecules of this invention.

Нейротрофические факторы роста, экспрессированные клетками-хозяевами по этому изобретению, также входят в объем настоящего изобретения.Neurotrophic growth factors expressed by the host cells of this invention are also included in the scope of the present invention.

Настоящее изобретение далее относится к ингибированию нейротрофического фактора роста по этому изобретению in vivo методом антисмысловых молекул. Метод антисмысловых молекул можно использовать для контроля экспрессии генов путем создания тройной спирали или антисмысловой ДНК или РНК, причем оба эти метода основаны на связывании полинуклеотида с ДНК или РНК. Например, часть последовательности ДНК, кодирующей зрелый белок по настоящему изобретению, используют для конструирования олигонуклеотида антисмысловой РНК длиной от 10 до 50 пар оснований. Олигонуклеотид ДНК конструируют так, чтобы он был комплементарен области гена, участвующего в транскрипции (тройная спираль - см. Lee et al. Nucl. Acids. Res., 6:3073 (1979); Cooney et al., Science, 241:456 (1988); and Dervan et al., Science, 251:1360 (1991), что позволяет предотвратить транскрипцию и продуцирование эновина. Олигонуклеотид антисмысловой РНК гибридизует с мРНК in vivo и блокирует трансляцию молекулы мРНК с образованием эновина.The present invention further relates to the in vivo inhibition of the neurotrophic growth factor of this invention by the antisense method. The antisense molecule method can be used to control gene expression by creating a triple helix or antisense DNA or RNA, both of which are based on binding of a polynucleotide to DNA or RNA. For example, part of the DNA sequence encoding the mature protein of the present invention is used to construct an antisense RNA oligonucleotide from 10 to 50 base pairs long. The DNA oligonucleotide is designed to be complementary to the region of the gene involved in transcription (triple helix - see Lee et al. Nucl. Acids. Res., 6: 3073 (1979); Cooney et al., Science, 241: 456 ( 1988); and Dervan et al., Science, 251: 1360 (1991), which prevents transcription and production of enovin Antisense RNA oligonucleotide hybridizes with mRNA in vivo and blocks translation of the mRNA molecule to form enovin.

Благодаря сходству последовательностей у описанного фактора роста и ранее идентифицированных факторов роста семейства GDNF, считается, что эновин также способен стимулировать жизнеспособность и рост клеток и устранять нарушения, возникающие вследствие дефектов функционирования или экспрессии указанного нейротрофического фактора.Due to the similarity of the sequences of the described growth factor and previously identified growth factors of the GDNF family, it is believed that enovin is also able to stimulate cell viability and growth and eliminate disorders resulting from defects in the functioning or expression of the specified neurotrophic factor.

Поэтому молекулы нуклеиновых кислот или нейротрофический фактор по этому изобретению можно использовать для лечения или профилактики нарушений нервной системы у нуждающегося субъекта путем введения указанному субъекту молекулы нуклеиновой кислоты или фактора роста по этому изобретению в достаточной концентрации для ослабления симптомов указанного нарушения. Таким образом, молекулы нуклеиновых кислот по этому изобретению можно использовать для сохранения и улучшения жизнеспособности нервных клеток, а также для лечения заболеваний нервной системы или нейродегенеративных нарушений, включая болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, периферическую невропатию, боковой амиотрофический склероз, травму периферической и центральной нервной системы или поражение нейротоксинами.Therefore, the nucleic acid molecules or neurotrophic factor of this invention can be used to treat or prevent nervous system disorders in a subject in need by administering to the subject a nucleic acid or growth factor molecule of this invention in a sufficient concentration to alleviate the symptoms of the disorder. Thus, the nucleic acid molecules of this invention can be used to maintain and improve the viability of nerve cells, as well as for the treatment of diseases of the nervous system or neurodegenerative disorders, including Parkinson's disease, Alzheimer's disease, peripheral neuropathy, amyotrophic lateral sclerosis, trauma to the peripheral and central nervous system or neurotoxin damage.

Нейротрофический фактор роста по этому изобретению оказывает нейротрофическое или нейрозащитное действие на нервные клетки или популяции клеток, в частности на нервные клетки или популяции клеток, подвержденные апоптозу. Нуклеиновая кислота или фактор роста, именуемый эновином, по этому изобретению можно дополнительно использовать для лечения нейродегенеративных нарушений, таких как инсульт, болезнь Хантингтона, периферическая невропатия, острое поражение мозга, опухоли нервной системы, рассеянный склероз, боковой амиотрофический склероз, травма периферической нервной системы, поражение нейротоксинами, множественная неоплазия эндокринной системы, врожденная болезнь Гиршспрунга, прионассоциированные болезни, болезнь Крейтцфельда-Якоба, путем введения нуждающемуся субъекту указанной нуклеиновой кислоты или эновина в достаточной концентрации для ослабления или профилактики симптомов описанных здесь заболеваний нервной системы.The neurotrophic growth factor of this invention has a neurotrophic or neuroprotective effect on nerve cells or cell populations, in particular nerve cells or cell populations susceptible to apoptosis. The nucleic acid or growth factor called enovin according to this invention can be additionally used to treat neurodegenerative disorders such as stroke, Huntington's disease, peripheral neuropathy, acute brain damage, tumors of the nervous system, multiple sclerosis, amyotrophic lateral sclerosis, trauma to the peripheral nervous system, neurotoxin damage, multiple endocrine neoplasia, congenital Hirschsprung disease, associated diseases, Creutzfeldt-Jakob disease, by introducing providing the subject in need of the indicated nucleic acid or enovin in sufficient concentration to alleviate or prevent the symptoms of diseases of the nervous system described herein.

Кроме того, как подробно описано в нижеследующем примере, эновин ускоряет восполнение дефицита сенсорных нейронов, что предполагает возможность его использования для лечения или облегчения болевых синдромов, обусловленных нейрогенными нарушениями периферической или центральной нервной системы, ревматических/воспалительных заболеваний, а также нарушений проводимости путем введения эновина нуждающемуся субъекту в достаточной концентрации для ослабления или профилактики симптомов этих нарушений.In addition, as described in detail in the following example, enovin accelerates the completion of sensory neuron deficiency, which suggests the possibility of using it to treat or alleviate pain syndromes caused by neurogenic disorders of the peripheral or central nervous system, rheumatic / inflammatory diseases, and conduction disorders by administering enovin the subject in need of sufficient concentration to relieve or prevent the symptoms of these disorders.

Альтернативный метод лечения вышеописанных нарушений нервной системы включает имплантацию в клетки субъекта, экспрессирующие нейротрофический фактор роста человека по этому изобретению, такие как описанные здесь трансгенные клетки.An alternative method of treating the above disorders of the nervous system involves implanting in a subject's cells expressing the neurotrophic human growth factor of the invention, such as the transgenic cells described herein.

Молекулы нуклеиновых кислот и нейротрофический фактор роста по этому изобретению могут также входить в состав фармацевтической композиции вместе с фармацевтически приемлемым носителем, разбавителем или наполнителем.The nucleic acid molecules and the neurotrophic growth factor of this invention may also be formulated with a pharmaceutically acceptable carrier, diluent or excipient.

Антитела к нейротрофическому фактору по настоящему изобретению можно получить методами, хорошо известными в этой области. Например, поликлональные антитела можно получить, инокулируя животное-хозяина, такое как мышь, фактором роста или его эпитопом, что дает иммунную сыворотку. Моноклональные антитела можно получить известными методами, в частности такими, которые описаны Kohler R. and Milstein С., Nature (1975) 256, 495-497.Antibodies to the neurotrophic factor of the present invention can be obtained by methods well known in this field. For example, polyclonal antibodies can be obtained by inoculating a host animal, such as a mouse, with a growth factor or its epitope, which provides immune serum. Monoclonal antibodies can be obtained by known methods, in particular those described by Kohler R. and Milstein C., Nature (1975) 256, 495-497.

Антитела по этому изобретению можно успешно использовать при осуществлении метода обнаружения фактора роста по этому изобретению, который включает взаимодействие антитела с образцом и идентификацию белка, связанного с указанным антителом. В объем этого изобретения входит набор для выполнения указанного метода, который включает антитело по этому изобретению и устройство для осуществления взаимодействия антитела с указанным образцом.The antibodies of this invention can be successfully used in the implementation of the detection method of the growth factor of this invention, which includes the interaction of the antibodies with the sample and the identification of the protein associated with the specified antibody. The scope of this invention includes a kit for performing the specified method, which includes the antibody of this invention and a device for interacting the antibody with the specified sample.

В объем настоящего изобретения входит также набор или устройство для обнаружения в образце нейротрофического фактора роста по этому изобретению, который включает вышеописанное антитело и приспособление для осуществления взаимодействия указанного антитела с указанным образцом.Also included within the scope of the present invention is a kit or device for detecting in a sample a neurotrophic growth factor according to this invention, which includes the antibody described above and a device for interacting said antibody with said sample.

Белки, взаимодействующие с нейротрофическим фактором по этому изобретению, например соответствующий клеточный рецептор, можно идентифицировать путем исследования белок-белкового взаимодействия, используя систему с двумя гибридными векторами, которая хорошо известна специалистам в области молекулярной биологии (Fields & Song, Nature 340:245, 1989). В основе этого метода лежит функциональное восстановление in vivo фактора транскрипции, активирующего репортерный ген. В частности, этот метод включает получение соответствующей клетки-хозяина с векторной ДНК, содержащей репортерный ген, под контролем промотора, регулируемого фактором транскрипции, имеющим ДНК-связывающий домен и активирующий домен, экспрессирующий в клетке-хозяине последовательность первой гибридной ДНК, кодирующей первое слияние фрагмента или всей последовательности нуклеиновой кислоты по этому изобретению, и указанный ДНК-связывающий домен или активирующий домен фактора транскрипции, экспрессирующий в клетке-хозяине по крайней мере одну последовательность второй гидрибной ДНК, имеющуюся в библиотеке или подобном хранилище, кодирующую предполагаемые исследуемые связывающие белки вместе с ДНК-связывающим или активирующим доменом фактора транскрипции, который не был включен в первое слияние; обнаружение связывания исследуемых белков с белком по этому изобретению путем выявления продукта репортерного гена в клетке-хозяине; необязательное выделение последовательностей второй гидрибной ДНК, кодирующей связывающий белок.Proteins interacting with the neurotrophic factor of this invention, for example, the corresponding cellular receptor, can be identified by studying protein-protein interactions using a two-hybrid vector system that is well known to those skilled in the field of molecular biology (Fields & Song, Nature 340: 245, 1989 ) The basis of this method is the functional in vivo restoration of the transcription factor activating the reporter gene. In particular, this method involves obtaining an appropriate host cell with a vector DNA containing a reporter gene under the control of a promoter regulated by a transcription factor having a DNA binding domain and an activating domain expressing in the host cell the sequence of the first hybrid DNA encoding the first fusion of a fragment or the entire nucleic acid sequence of this invention, and said DNA binding domain or an activating transcription factor domain expressing in the host cell at least at least one second fungal DNA sequence, available in a library or similar repository encoding the putative studied binding proteins together with a DNA-binding or activating domain of a transcription factor that was not included in the first fusion; detecting the binding of test proteins to the protein of this invention by detecting a reporter gene product in a host cell; optionally isolating sequences of a second fungal DNA encoding a binding protein.

Примером осуществления такого метода является использование белка GAL4 в дрожжах. GAL4 является транскрипционным активатором галактозного обмена в дрожжах и имеет отдельный домен для связывания с активаторами вверху от генов, регулирующих галактозный обмен, а также связывающий белок домен. Можно сконструировать нуклеотидные векторы, один из которых содержит нуклеотидные остатки, кодирующие ДНК-связывающий домен GAL4. Эти остатки связывающего домена могут быть слиты с образованием известной кодирующей белок последовательности, такой как, например, нуклеиновые кислоты по этому изобретению. Другой вектор содержит остатки, кодирующие связывающий белок домен GAL4. В результате слияния этих остатков получают остатки, кодирующие испытуемый белок, предпочтительно на пути трансдукции сигнала рассматриваемого позвоночного животного. Любое взаимодействие между нейротрофическим фактором, кодированным нуклеиновой кислотой по этому изобретению, и испытуемым белком активирует транскрипцию ре-портерной молекулы в дрожжевой клетке GAL-4 с транскрипционной недостаточностью, в которой векторы были трансформированы. Репортерную молекулу, такую как β-галактозидаза, предпочтительно активируют путем восстановления транскрипции генов галактозного обмена в дрожжах.An example of the implementation of this method is the use of GAL4 protein in yeast. GAL4 is a transcriptional activator of galactose metabolism in yeast and has a separate domain for binding to activators at the top of the genes that regulate galactose metabolism, as well as a protein-binding domain. Nucleotide vectors can be constructed, one of which contains nucleotide residues encoding the GAL4 DNA-binding domain. These residues of the binding domain can be fused to form a known protein coding sequence, such as, for example, the nucleic acids of this invention. Another vector contains residues encoding the GAL4 domain binding protein. As a result of the fusion of these residues, residues encoding the test protein are obtained, preferably along the signal transduction pathway of the vertebrate in question. Any interaction between the neurotrophic factor encoded by the nucleic acid of this invention and the test protein activates the transcription of the reporter molecule in the GAL-4 yeast cell with transcription deficiency in which the vectors have been transformed. A reporter molecule, such as β-galactosidase, is preferably activated by restoring the transcription of the galactose metabolism genes in yeast.

Авторы настоящего изобретения установили, что рецептором эновина является GFRα3. Поэтому можно выполнять анализы, позволяющие выявить агонистов или антагонистов эновина. Этот анализ применим также к другим нейротрофическим факторам роста и соответствующим им рецепторам. Идентифицированные соединения можно использовать для лечения или профилактики таких заболеваний, как болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, нейродегенеративные нарушения, обусловленные увеличением последовательностей полиглутамина, такие как болезнь Хантингтона, периферическая невропатия, острое поражение головного мозга, опухоли нервной системы, рассеянный склероз, боковой амиотрофический склероз, травма периферической нервной системы, поражение нейротоксинами, множественная неоплазия эндокринной системы, врожденная болезнь Гиршспрунга, прионассоциированные болезни, болезнь Крейтцфельда-Якоба, инсульт, болевые синдромы с выраженными нейрогенными нарушениями периферической или центральной нервной системы, ревматические/воспалительные заболевания, а также нарушения проводимости, путем введения нуждающемуся субъекту указанного агониста или антагониста в достаточной концентрации для профилактики или лечения указанных заболеваний нервной системы. Такие соединения могут также входить в состав фармацевтических композиций вместе с фармацевтически приемлемым носителем, разбавителем или наполнителем.The inventors have found that the enovin receptor is GFRα3. Therefore, tests can be performed to identify enovin agonists or antagonists. This assay is also applicable to other neurotrophic growth factors and their corresponding receptors. The identified compounds can be used to treat or prevent diseases such as Parkinson's disease, Alzheimer's disease, neurodegenerative disorders caused by an increase in polyglutamine sequences such as Huntington’s disease, peripheral neuropathy, acute brain damage, nervous system tumors, multiple sclerosis, amyotrophic lateral sclerosis, peripheral nervous system trauma, neurotoxin damage, multiple endocrine neoplasia, congenital disease Hirschsprung, associated diseases, Creutzfeldt-Jakob disease, stroke, pain syndromes with severe neurogenic disorders of the peripheral or central nervous system, rheumatic / inflammatory diseases, as well as conduction disorders, by introducing a needy subject to the specified agonist or antagonist in sufficient concentration to prevent or treat these diseases of the nervous system. Such compounds may also be formulated into pharmaceutical compositions together with a pharmaceutically acceptable carrier, diluent or excipient.

Агонисты или антагонисты фактора роста (такого как, например, эновин) можно идентифицировать в соответствии с одним вариантом осуществления изобретения, осуществляя контактирование клеточной ткани или организма, экспрессирующего приемлемый рецептор и cRET, с испытуемым соединением в присутствии данного фактора роста, и сравнивая степени активизации RET в указанной клетке, ткани или организме с контрольным образцом, который не подвергали контактированию с указанным испытуемым соединением.Agonists or antagonists of a growth factor (such as, for example, enovin) can be identified in accordance with one embodiment of the invention by contacting a cell tissue or organism expressing an acceptable receptor and cRET with a test compound in the presence of a given growth factor, and comparing the degrees of RET activation in the specified cell, tissue or organism with a control sample that was not subjected to contact with the specified test compound.

Альтернативный способ осуществления этого изобретения относится к способу идентификации агонистов или антагонистов нейротрофического фактора роста, который включает контактирование клеточной ткани или организма, экспрессирующего соответствующий вектор указанного фактора роста и cRET, с испытуемым соединением в присутствии указанного фактора роста, измерение степени активации сигнальной киназы на пути трансдукции сигнала, составляющим элементом которого является указанный рецептор, после добавления антитела, специфичного к указанной сигнальной киназе, конъюгированной с репортерной молекулой, и сравнение с клеточной тканью или организмом, который не подвергали контактированию с указанным соединением.An alternative embodiment of this invention relates to a method for identifying neurotrophic growth factor agonists or antagonists, which comprises contacting cell tissue or an organism expressing the corresponding vector of said growth factor and cRET with a test compound in the presence of said growth factor, measuring the degree of activation of signal kinase along the transduction pathway signal, the constituent element of which is the specified receptor, after adding antibodies specific to the specified second signal kinase conjugated to a reporter molecule, and comparison with a cell tissue or organism which has not contacted with said compound.

Другим объектом этого изобретения является использование соединения, которое, как установлено, является антагонистом по этому изобретению, для изготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения заболеваний желудочно-кишечного тракта или нарушений, обусловленных повышенной перистальтикой кишечника.Another object of this invention is the use of a compound which is found to be an antagonist of this invention for the manufacture of a medicament for the treatment of diseases of the gastrointestinal tract or disorders caused by increased intestinal motility.

Соединения, идентифицированные при выполнении анализов по настоящему изобретению, можно успешно использовать для усиления моторики желудочно-кишечного тракта, поэтому они могут быть полезны для лечения заболеваний, обусловленных затрудненным или нарушенным прохождением содержимого по желудочно-кишечному тракту.The compounds identified by the assays of the present invention can be successfully used to enhance the motility of the gastrointestinal tract, therefore they can be useful for the treatment of diseases caused by the obstructed or impaired passage of contents through the gastrointestinal tract.

Кроме того, такие соединения можно эффективно использовать для лечения теплокровных животных, включая человека, страдающих затрудненным или нарушенным опорожнением желудка и в более широком смысле затрудненным или нарушенным прохождением содержимого по желудочно-кишечному тракту. Таким образом, настоящее изобретение относится к способу лечения таких заболеваний, как гастроэзофагальный рефлюкс, диспепсия, гастропарез, послеоперационная непроходимость кишечника и псевдонепроходимость кишечника.In addition, such compounds can be effectively used to treat warm-blooded animals, including humans, having obstructed or impaired gastric emptying and, more generally, obstructed or impaired passage of contents through the gastrointestinal tract. Thus, the present invention relates to a method for treating diseases such as gastroesophageal reflux, dyspepsia, gastroparesis, postoperative bowel obstruction and intestinal pseudo-obstruction.

Диспепсия означает нарушение функции пищеварения, которое может сопровождаться симптомом первичной дисфункции желудочно-кишечного тракта, в частности дисфункции желудочно-кишечного тракта, обусловленной повышенным мышечным тонусом, или осложнением, вызванным другими нарушениями, такими как аппендицит, заболевания желчного пузыря или неправильное питание. Симптомами диспепсии являются, например, отсутствие аппетита, ощущение тяжести, быстрое насыщение, тошнота, рвота и вздутие живота.Dyspepsia means a violation of digestive function, which may be accompanied by a symptom of primary gastrointestinal dysfunction, in particular gastrointestinal dysfunction due to increased muscle tone, or a complication caused by other disorders such as appendicitis, gall bladder disease, or malnutrition. Symptoms of dyspepsia are, for example, lack of appetite, a feeling of heaviness, rapid satiety, nausea, vomiting and bloating.

Гастропарез может возникнуть в результате неправильного функционирования желудка или в виде осложения вследствие таких заболеваний, как сахарный диабет, прогрессирующий системный склероз, анорексия, повышенная нервная возбудимость и миотоническая дистрофия.Gastroparesis can occur as a result of abnormal functioning of the stomach or in the form of deposition due to diseases such as diabetes mellitus, progressive systemic sclerosis, anorexia, increased nervous irritability and myotonic dystrophy.

Послеоперационная непроходимость кишечника означает закупорку или кинетическую недостаточность перистальтики кишечника вследствие нарушения мышечного тонуса после хирургического вмешательства.Postoperative bowel obstruction means obstruction or kinetic insufficiency of intestinal motility due to impaired muscle tone after surgery.

Псевдонепроходимость кишечника означает состояние, характеризующееся запором, коликами и рвотой при отсутствии физической непроходимости.Intestinal pseudo-obstruction means a condition characterized by constipation, colic and vomiting in the absence of physical obstruction.

Соединения по настоящему изобретению можно использовать для устранения фактической причины заболевания или ослабления его симптомов.The compounds of the present invention can be used to eliminate the actual cause of the disease or to alleviate its symptoms.

Кроме того, некоторые соединения, являющиеся стимуляторами кинетической активности толстого кишечника, можно использовать для нормализации или улучшения прохождения содержимого через кишечник у субъектов с симптомами нарушения перистальтики, например уменьшения перистальтики только тонкого и толстого кишечника или в сочетании с медленным опорожнением желудка.In addition, some compounds that stimulate the kinetic activity of the large intestine can be used to normalize or improve the passage of contents through the intestines in subjects with symptoms of impaired peristalsis, for example, to reduce peristalsis of the small and large intestines only or in combination with slow gastric emptying.

С учетом способности соединений по настоящему изобретению усиливать кинетическую активность толстого кишечника объектом этого изобретения является способ лечения теплокровных животных, включая человека, страдающих нарушениями перистальтики кишечника, такими как запоры, псевдонепроходимость, атония кишечника, послеоперационная атония кишечника, синдром раздраженной толстой кишки (IBS) и вызванное лекарственными средствами медленное прохождение содержимого через кишечник.Given the ability of the compounds of the present invention to enhance the kinetic activity of the large intestine, an object of this invention is a method of treating warm-blooded animals, including humans, suffering from intestinal motility disorders, such as constipation, pseudo-obstruction, intestinal atony, postoperative intestinal atony, irritable bowel syndrome (IBS), and drug-induced slow passage of contents through the intestines.

Соединения, являющиеся антагонистами, как это установлено в результате выполнения анализов по настоящему изобретению, можно также использовать для лечения и профилактики заболеваний желудочно-кишечного тракта, возникающих вследствие повышенной перистальтики кишечника, таких как диарея (включая секреторную диарею, бактериальную диарею, холерную диарею, диарею путешественников и психогенную диарею), болезнь Крона, слизистый колит, синдром раздраженной толстой кишки (IBS), диарея, вызванная синдромом раздраженной толстой кишки, повышенная чувствительность желудочно-кишечного тракта.Antagonist compounds, as established by performing the assays of the present invention, can also be used for the treatment and prevention of diseases of the gastrointestinal tract resulting from increased intestinal motility, such as diarrhea (including secretory diarrhea, bacterial diarrhea, cholera diarrhea, diarrhea travelers and psychogenic diarrhea), Crohn’s disease, mucous colitis, irritable bowel syndrome (IBS), diarrhea caused by irritable bowel syndrome, increased I have gastrointestinal sensitivity.

Учитывая полезность соединений по этому изобретению, можно сделать вывод о том, что настоящее изобретение относится также к лечению теплокровных животных, включая человека, страдающих заболеваниями желудочно-кишечного тракта, такими как синдром раздраженной толстой кишки (IBS), в частности диарея, обусловленная IBS. Кроме того, это изобретение относится к способу облегчения симптомов у нуждающихся субъектов, страдающих такими заболеваниями, как синдром раздраженной толстой кишки (IBS), диарея, вызванная синдромом раздраженной толстой кишки, повышенная чувствительность кишечника, и болевой синдром, обусловленный повышенной чувствительностью желудочно-кишечного тракта.Given the usefulness of the compounds of this invention, it can be concluded that the present invention also relates to the treatment of warm-blooded animals, including humans, suffering from diseases of the gastrointestinal tract, such as irritable bowel syndrome (IBS), in particular IBS-related diarrhea. In addition, this invention relates to a method of alleviating symptoms in needy subjects suffering from diseases such as irritable bowel syndrome (IBS), diarrhea caused by irritable bowel syndrome, hypersensitivity of the intestine, and pain due to hypersensitivity of the gastrointestinal tract .

Соединения по настоящему изобретению можно также использовать для лечения других нарушений желудочно-кишечного тракта, например, обусловленных моторикой верхнего отдела кишечника, а также в качестве противорвотных средств, цитотоксических средств и противорвотных средств при облучении.The compounds of the present invention can also be used to treat other disorders of the gastrointestinal tract, for example, due to motility of the upper intestine, as well as antiemetics, cytotoxic drugs and antiemetics when irradiated.

К воспалительным заболеваниям кишечника относятся, например, неспецифический язвенный колит, болезнь Крона и тому подобные.Inflammatory bowel diseases include, for example, ulcerative colitis, Crohn's disease, and the like.

Другим объектом этого изобретения является способ лечения нарушения, обусловленного экспрессией эновина по настоящему изобретению, путем введения нуждающемуся субъекту антисмысловой молекулы или ее антагониста в достаточном количестве для устранения или облегчения симптомов указанного нарушения.Another object of this invention is a method of treating a disorder caused by the expression of enovin of the present invention, by introducing a sufficient amount of an antisense molecule or antagonist thereof to a needy subject to eliminate or alleviate the symptoms of said disorder.

Нарушения, обусловленные инактивацией или подавлением экспрессии эновина, можно также успешно лечить введением нуждающемуся субъекту соединения, являющегося агонистом эновина, в достаточном количестве для ослабления или устранения симптомов этого нарушения.Disorders caused by inactivation or suppression of enovin expression can also be successfully treated by administering to a needy subject an enovin agonist compound in a sufficient amount to alleviate or eliminate the symptoms of this disorder.

Другим объектом этого изобретения является способ получения фармацевтического препарата для лечения болезней, обусловленных нейротрофическим фактором роста человека "эновином", причем указанный способ включает выбор приемлемого соединения, являющегося агонистом или антагонистом эновина по этому изобретению, получение указанного соединения в необходимых количествах и введение этого соединения в фармацевтически приемлемый носитель.Another object of this invention is a method for producing a pharmaceutical preparation for the treatment of diseases caused by the neurotrophic human growth factor Enovin, said method comprising selecting an acceptable compound which is an enovin agonist or antagonist of this invention, preparing said compound in the required amounts and administering this compound into a pharmaceutically acceptable carrier.

Как будет более подробно описано в нижеследующих примерах, эновин позволяет успешно восстанавливать недостаток сенсорных нейронов, образующийся под воздействием таксола. Поэтому эновин способствует устранению болевых симптомов в случае нейрогенных нарушений периферической и центральной нервной системы, ревматических заболеваний, а также нарушений проводимости, и может модулировать процессы, происходящие в сенсорных нейронах, в результате чрескожного, местного и центрального применения (такого как эпидуральное, внутриоболочечное, ICV, внутрь сплетения, внутрь нервной клетки), обеспечиваемого пероральным, ректальным и системным введением. Поэтому аналогично другим нарушениям, обусловленным эновином, эти заболевания можно лечить и даже предотвращать путем введения антисмысловой молекулы, нуклеиновой кислоты, белка эновина, фармацевтической композиции или соединения, являющегося агонистом или антагонистом, в зависимости от потребности, по этому изобретению в достаточных количествах для облегчения или устранения симптомов указанного заболевания.As will be described in more detail in the following examples, enovin allows you to successfully restore the lack of sensory neurons that are formed under the influence of taxol. Therefore, enovin helps to eliminate pain symptoms in the case of neurogenic disorders of the peripheral and central nervous system, rheumatic diseases, as well as conduction disorders, and can modulate the processes occurring in sensory neurons as a result of percutaneous, local and central use (such as epidural, intrathecal, ICV , inside the plexus, inside the nerve cell), provided by oral, rectal and systemic administration. Therefore, similarly to other disorders caused by enovin, these diseases can be treated and even prevented by the administration of an antisense molecule, nucleic acid, enovin protein, pharmaceutical composition or compound that is an agonist or antagonist, depending on the need, of this invention in sufficient quantities to alleviate or eliminate the symptoms of this disease.

Лечебные или фармацевтические композиции по настоящему изобретению можно вводить любым приемлемым способом, известным в этой области, включая, например, внутривенное, подкожное, внутримышечное, чрескожное, внутриоболочечное или интрацеребральное введение или введение в клетки методом ех vivo. Введение может быть быстрым в виде инъекции или в течение достаточно продолжительного времени в виде медленного вливания или препарата пролонгированного действия. Для лечения тканей в центральной нервной системе соединение по этому изобретению можно вводить путем инъекции или вливания в цереброспинальную жидкость (CSF).The therapeutic or pharmaceutical compositions of the present invention may be administered by any suitable method known in the art, including, for example, intravenous, subcutaneous, intramuscular, transdermal, intrathecal or intracerebral administration or ex vivo administration to cells. The introduction can be quick in the form of an injection or for a sufficiently long time in the form of a slow infusion or a drug of prolonged action. For treating tissues in the central nervous system, a compound of this invention can be administered by injection or by infusion into cerebrospinal fluid (CSF).

Эновин может быть также связан или конъюгирован со средствами, обладающими необходимыми фармацевтическими или фармакодинамическими свойствами. Например, его можно соединить с любым веществом, которое, как известно, стимулирует проникновение или перенос через гемато-энцефалический барьер, таким как антитело к рецептору трансферина, и вводить путем внутривенной инъекции.Enovin may also be coupled or conjugated to agents having the necessary pharmaceutical or pharmacodynamic properties. For example, it can be combined with any substance that is known to stimulate the penetration or transfer through the blood-brain barrier, such as an antibody to the transferrin receptor, and administered by intravenous injection.

Эновин, антисмысловые молекулы или соединения, являющиеся агонистами или антагонистами эновина по этому изобретению, можно использовать в виде фармацевтической композиции, которая может быть получена методами, хорошо известными в этой области. Предпочтительные композиции содержат фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или наполнитель, такой как, например, физиологический раствор. Можно также использовать другие фармацевтически приемлемые носители, в том числе нетоксичные соли, стерильную воду или тому подобные. В состав композиции может также входить приемлемый буфер, позволяющий лиофилизовать данную композицию и хранить в стерильных условиях до восстановления путем добавления стерильной воды для последующего введения. Эновин можно вводить в твердую или полутвердую биологически совместимую матрицу, которую затем имплантируют в ткани, подлежащие лечению.Enovin, antisense molecules or compounds that are the enovin agonists or antagonists of this invention can be used in the form of a pharmaceutical composition that can be prepared by methods well known in the art. Preferred compositions comprise a pharmaceutically acceptable carrier, diluent or excipient, such as, for example, saline. Other pharmaceutically acceptable carriers may also be used, including non-toxic salts, sterile water or the like. An acceptable buffer may also be included in the composition, allowing the composition to be lyophilized and stored under sterile conditions until reconstituted by the addition of sterile water for subsequent administration. Enovin can be introduced into a solid or semi-solid biocompatible matrix, which is then implanted into the tissues to be treated.

Носитель может также содержать другие фармацевтически приемлемые наполнители, изменяющие такие показатели, как рН, осмотическое давление, вязкость, стерильность, липофильность, растворимость или тому подобные. Композиция может также содержать фармацевтически приемлемые наполнители, делающие возможным длительное или отсроченное высвобождение лекарственного средства.The carrier may also contain other pharmaceutically acceptable excipients that alter such indicators as pH, osmotic pressure, viscosity, sterility, lipophilicity, solubility, or the like. The composition may also contain pharmaceutically acceptable excipients, making possible a sustained or delayed release of the drug.

Белок эновина, молекулы нуклеиновой кислоты или соединения по этому изобретению можно вводить перорально. В соответствии с этим вариантом осуществления изобретения лекарственные вещества можно инкапсулировать и смешивать с приемлемыми носителями в твердых лекарственных формах, которые хорошо известны специалистам в этой области.The enovin protein, nucleic acid molecule or compound of this invention can be administered orally. According to this embodiment of the invention, the drug substances can be encapsulated and mixed with acceptable carriers in solid dosage forms that are well known to those skilled in the art.

Как хорошо известно специалистам в этой области, схему приема лекарственного средства можно определить с учетом площади поверхности или объема тела пациента и конкретного способа введения. Количество вводимой композиции, однако, должен определить лечащий врач в зависимости от таких факторов, как серьезность симптомов, форма вводимой композиции, возраст, масса и реакция нуждающегося субъекта, а также выбранный способ введения.As is well known to those skilled in the art, a medication regimen can be determined taking into account the surface area or body volume of the patient and the particular route of administration. The amount of composition administered, however, must be determined by the attending physician depending on factors such as the severity of the symptoms, the form of the composition administered, the age, weight and reaction of the subject in need, as well as the chosen route of administration.

Настоящее изобретение описано далее со ссылкой на нижеследующие примеры, имеющие только иллюстративный характер, и прилагаемые чертежи.The present invention is described further with reference to the following examples, which are illustrative only, and the accompanying drawings.

На фиг.1 показана частичная последовательность кДНК нейротрофического фактора по этому изобретению, именуемого эновином. Согласованную последовательность получают амплификацией разных кДНК и геномной ДНК при помощи PCR с использованием затравок PNHsp3 и PNHap1, после чего производят клонирование, анализ последовательности и сравнение полученных последовательностей. Предполагаемая аминокислотная последовательность, обозначенная однобуквенным кодом, показана над последовательностью ДНК. Число нуклеотидных остатков указано справа от последовательности ДНК, и число аминокислотных остатков указано справа от транслированной белковой последовательности. Предполагаемый сайт расщепления RXXR для продомена напечатан жирным шрифтом и подчеркнут. Предполагаемое начало зрелого белка обозначено стрелкой. Семь консервативных остатков цистеина, характерных для всех членов семейства TGF-β, показаны жирным шрифтом. Возможный сайт N-гликозилирования подчеркнут двумя линиями.Figure 1 shows a partial cDNA sequence of a neurotrophic factor according to this invention, called enovin. A consistent sequence is obtained by amplification of different cDNA and genomic DNA using PCR using the PNHsp3 and PNHap1 seeds, after which cloning, sequence analysis and comparison of the obtained sequences are performed. A putative amino acid sequence indicated by a single letter code is shown above the DNA sequence. The number of nucleotide residues is indicated to the right of the DNA sequence, and the number of amino acid residues is indicated to the right of the translated protein sequence. The proposed RXXR cleavage site for the domain is printed in bold and underlined. The expected start of the mature protein is indicated by an arrow. Seven conserved cysteine residues characteristic of all members of the TGF-β family are shown in bold. A possible N-glycosylation site is underlined in two lines.

На фиг.2 показан сравнительный анализ первичной структуры предполагаемых последовательностей зрелого белка GDNF, NTN, PSP и EVN человека. Эти последовательности анализируют в соответствии с программой сравнительного анализа ClustalW. Аминокислотные остатки, являющиеся консервативными во всех трех белках, расположены на участках черного цвета. Остатки, являющиеся консервативными в двух или трех последовательностях, окрашены серым цветом. Семь консервативных остатков цистеина, характерных для всех членов семейства TGF-β, отмечены звездочками над последовательностью. Число аминокислотных остатков указано справа. Пуктирными линиями обозначены разрывы, введенные в последовательность для оптимизации сравнительного анализа.Figure 2 shows a comparative analysis of the primary structure of the putative sequences of the mature human GDNF, NTN, PSP and EVN protein. These sequences are analyzed in accordance with the ClustalW benchmarking program. Amino acid residues, which are conserved in all three proteins, are located in black areas. Residues that are conserved in two or three sequences are colored gray. Seven conserved cysteine residues characteristic of all members of the TGF-β family are marked with asterisks above the sequence. The number of amino acid residues is indicated on the right. The dashed lines indicate gaps introduced into the sequence to optimize the comparative analysis.

На фиг.3 показана частичная последовательность кДНК эновина. Согласованную последовательность получают амплификацией разных кДНК при помощи PCR (первичная PCR выполнена с использованием затравок PNHsp1 и PNHap1 и вложенная PCR выполнена с использованием затравок PNHsp2 и PNHap2), после чего производят клонирование, анализ последовательности и сравнение полученных последовательностей. Транслированная аминокислотная последовательность нуклеотидов 30-284 (рамка считывания А), обозначенная однобуквенным кодом, показана над этой последовательностью, и число остатков указано справа (А1-А85). Эта рамка считывания содержит предполагаемый кодон инициации трансляции ATG. Транслированная аминокислотная последовательность нуклеотидов 334-810 (рамка считывания В), обозначенная однобуквенным кодом, показана над этой последовательностью, и число остатков указано справа (В1-В159). Эта рамка считывания содержит область гомологии с GDNF, NTN и PSP. Число нуклеотидных остатков показано справа от последовательности ДНК. Предполагаемый сайт расщепления RXXR для продомена напечатан жирным шрифтом и подчеркнут. Предполагаемое начало зрелого белка обозначено стрелкой. Семь консервативных остатков цистеина, характерных для всех членов семейства TGF-β, напечатаны жирным шрифтом. Вероятный сайт N-гликозилирования подчеркнут двумя линиями.Figure 3 shows a partial sequence of enovin cDNA. A consistent sequence is obtained by amplification of different cDNAs using PCR (primary PCR was performed using PNHsp1 and PNHap1 seeds and nested PCR was performed using PNHsp2 and PNHap2 seeds), after which cloning, sequence analysis, and comparison of the obtained sequences were performed. The translated amino acid sequence of nucleotides 30-284 (reading frame A), indicated by a single-letter code, is shown above this sequence, and the number of residues is indicated on the right (A1-A85). This reading frame contains the putative ATG translation initiation codon. The translated amino acid sequence of nucleotides 334-810 (reading frame B), indicated by a single-letter code, is shown above this sequence, and the number of residues is indicated on the right (B1-B159). This reading frame contains a region of homology with GDNF, NTN and PSP. The number of nucleotide residues is shown to the right of the DNA sequence. The proposed RXXR cleavage site for the domain is printed in bold and underlined. The expected start of the mature protein is indicated by an arrow. Seven conserved cysteine residues characteristic of all members of the TGF-β family are printed in bold. The likely N-glycosylation site is underlined by two lines.

На фиг.4 показана локализация в хромосоме эновина человека. (А) Схема результатов картирования эновина методом FISH. Каждая точка представляет собой два сигнала FISH, обнаруженных в хромосоме человека 1, область р31.3-р32. (В) Пример картирования эновина методом FISH. На левом снимке показаны сигналы FISH в хромосоме 1. На правом снимке показано то же митотическое изображение, окрашенное 4',6-диамидино-2-фенилиндолом для идентификации хромосомы 1.Figure 4 shows the localization of the human enovine on the chromosome. (A) Diagram of FISH Enovin mapping results. Each point represents two FISH signals found on human chromosome 1, region p31.3-p32. (B) An Example of Enovin Mapping by the FISH Method. The left image shows the FISH signals in chromosome 1. The right image shows the same mitotic image stained with 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole to identify chromosome 1.

На фиг.5 проиллюстрирована экспрессия эновина в разных тканях человека. (А), (В), (С) Нозерн-блоттинг экспрессии эновина в тканях. Экспрессию мРНК эновина в разных тканях человека определяют при помощи зонда, соответствующего части кодирующей области эновина (включая область, кодирующую белок зрелого эновина), анализируя блоты поли(А)-богатой РНК человека. (А) Нозерн-блот нескольких тканей (MTN); (В) блот MTN II) блот II MTN плода. На снимке (D) показаны результаты авторадиографии основного блота РНК человека, зондированного тем же фрагментом кДНК эновина. На снимке (Е) показано положение образцов мРНК из тканей человека на основном блоте РНК, изображенном на снимке (D).Figure 5 illustrates the expression of enovin in different human tissues. (A), (B), (C) Northern blotting of the expression of enovine in tissues. The expression of enovin mRNA in different human tissues is determined using a probe corresponding to a portion of the coding region of enovin (including the coding region of mature enovin protein) by analyzing blots of poly (A)-rich human RNA. (A) Northern blot of several tissues (MTN); (B) Blot MTN II) Blot II MTN fetus. Image (D) shows the results of autoradiography of the main human RNA blot probed with the same enovin cDNA fragment. Image (E) shows the position of mRNA samples from human tissues on the main RNA blot shown in image (D).

На фиг.6 графически проиллюстрирована общая выживаемость клеток SH-SY5Y после 72-часовой обработки 10-6М таксола и влияние увеличения доз эновина на выживаемость клеток, нормализованных до состояния раствора. Клетки SH-SY5Y дифференцируют в течение 5 дней 25 нМ стауроспорина до нанесения таксола. Данные получены в результате выполнения двух независимых экспериментов с использованием шести одинаковых образцов. На фиг.6 показаны средние значения и стандартные отклонения.Figure 6 graphically illustrates the overall survival of SH-SY5Y cells after 72-hour treatment with 10-6M Taxol and the effect of increasing doses of Enovin on the survival of cells normalized to the solution state. SH-SY5Y cells differentiate for 5 days 25 nM staurosporine prior to the application of taxol. The data were obtained as a result of two independent experiments using six identical samples. 6 shows mean values and standard deviations.

На фиг.7 дано графическое изображение влияния увеличения концентраций эновина в течение 48 часов на рост аксонов дифференцированных стауроспорином клеток SH-SY5Y, нормализованных до состояния раствора. Клетки SH-SY5Y дифференцируют в течение 5 дней 25 нМ стауроспорина до начала 48-часового эксперимента. В качестве положительного контрольного результата служит дифференцирующий эффект, достигаемый 25 нМ стауроспорина. Длину аксонов высчитывают, используя по крайней мере 5000 клеток. Данные получены в результате выполнения экспериментов с использованием двух одинаковых образцов. На этом чертеже показаны средние значения и стандартные отклонения.7 is a graphical depiction of the effect of an increase in enovin concentrations over 48 hours on the axon growth of differentiated staurosporin SH-SY5Y cells normalized to the solution state. SH-SY5Y cells differentiate for 5 days 25 nM staurosporine before the start of the 48-hour experiment. As a positive control result, the differentiating effect achieved by 25 nM staurosporin is used. Axon lengths are calculated using at least 5000 cells. The data obtained as a result of experiments using two identical samples. This drawing shows average values and standard deviations.

На фиг.8-18 дано графическое изображение влияния эновина на пролиферацию разных типов клеток.On Fig-18 is a graphical depiction of the effect of Enovin on the proliferation of different types of cells.

На фиг.19 дано графическое изображение результатов влияния эновина на обусловленный таксолом дефицит сенсорных нейронов, полученных методом иглоукалывания. На этой фигуре показаны средние (±1 стандартная ошибка средней) совокупные оценки, полученные на протяжении всего эксперимента, для крыс, которым после введения таксола вводят или 2 разные дозы эновина (23 или 130 мкг/мл; n=10 крыс/группа), или наполнитель/физиологический раствор (n=20 крыс). Эновин или физиологический раствор/наполнитель вводят в виде инъекции в объеме 75 мкл в подошву правой задней лапы.On Fig given a graphical representation of the effects of enovin on taxol-induced deficiency of sensory neurons obtained by acupuncture. This figure shows the average (± 1 standard error of the mean) cumulative estimates obtained throughout the experiment for rats that are given 2 different doses of Enovin after administration of Taxol (23 or 130 μg / ml; n = 10 rats / group), or excipient / saline (n = 20 rats). Enovin or saline / excipient is injected in a volume of 75 μl into the sole of the right hind paw.

На фиг.20 дано графическое изображение результатов влияния эновина на обусловленный таксолом дефицит сенсорных нейронов, полученных методом иглоукалывания. На этом чертеже показаны средние (±1 стандартная ошибка средней) совокупные оценки, полученные на протяжении всего эксперимента, для крыс, которым до введения таксола вводят или 2 разные дозы эновина (23 или 130 мкг/мл; n=10 крыс/группа), или наполнитель/физиологический раствор (n=20 крыс). Эновин или физиологический раствор/наполнитель вводят в виде инъекции в объеме 75 мкл в подошву правой задней лапы.On Fig is a graphical representation of the results of the influence of enovin on taxol-induced deficiency of sensory neurons obtained by acupuncture. This drawing shows the average (± 1 standard error of the mean) cumulative estimates obtained throughout the experiment for rats that were given 2 different doses of Enovin (23 or 130 μg / ml; n = 10 rats / group) before administration of Taxol. or excipient / saline (n = 20 rats). Enovin or saline / excipient is injected in a volume of 75 μl into the sole of the right hind paw.

На фиг.21 показана последовательность ДНК эновина. Согласованную последовательность получают амплификацией кДНК лобной доли коры головного мозга человека и геномной ДНК человека при помощи PCR с использованием затравок PNHsp5 и PNHap1, после чего производят клонирование, анализ последовательности и сравнение полученных последовательностей. Предполагаемая аминокислотная последовательность показана над последовательностью ДНК только для сплайсированного варианта, дающего после трансляции функциональный белок эновина. Число нуклеотидных остатков указано слева от последовательности ДНК, и число аминокислотных остатков указано справа от транслированной белковой последовательности. 5'- и 3'-концевые сайты сплайсинга, обнаруженные в результате сравнения фрагментов секвенированной кДНК с геномной последовательностью, обозначены вертикальными линиями, загнутыми соответственно влево или вправо, и последовательно пронумерованы. Предполагаемый сайт расщепления фурина RXXR для продомена обозначен жирным шрифтом и подчеркнут. Предполагаемое начало зрелого белка обозначено стрелкой. Семь консервативных остатков цистеина, характерных для всех членов семейства TGF-β, напечатаны жирным шрифтом. Предполагаемый N-связанный сайт гликозилирования подчеркнут двумя линиями. 5'- и 3'-концевые сайты сплайсинга пронумерованы и обведены кружком.21 shows an Enovin DNA sequence. A consistent sequence is obtained by amplification of cDNA of the frontal lobe of the human cerebral cortex and human genomic DNA using PCR using the PNHsp5 and PNHap1 primers, after which cloning, sequence analysis and comparison of the obtained sequences are performed. The putative amino acid sequence is shown above the DNA sequence only for the spliced variant, which yields functional Enovin protein after translation. The number of nucleotide residues is indicated to the left of the DNA sequence, and the number of amino acid residues is indicated to the right of the translated protein sequence. The 5'- and 3'-terminal splicing sites detected by comparing fragments of sequenced cDNA with a genomic sequence are indicated by vertical lines bent to the left or right, respectively, and sequentially numbered. The putative RXXR furin cleavage site for the prodomain is indicated in bold and underlined. The expected start of the mature protein is indicated by an arrow. Seven conserved cysteine residues characteristic of all members of the TGF-β family are printed in bold. The putative N-linked glycosylation site is underlined in two lines. The 5'- and 3'-terminal splicing sites are numbered and circled.

На фиг.22 проиллюстрирована экспрессия разных сплайсированных вариантов эновина в тканях человека. (А) Схематическое изображение сплайсированных вариантов эновина, идентифицированных при помощи RT-PCR с использованием эновинспецифических затравок на РНК, выделенной из разных тканей человека, с последующим клонированием и анализом последовательности в продуктах PCR. Верхняя линия показывает длину последовательности (в виде пар оснований). Вторая линия изображает геномную последовательность эновина. На этой линии показано положение инициирующего и терминирующего трансляцию кодона, начала кодирующей последовательности зрелого эновина и 5'- и 3'-концевых сайтов сплайсинга (см. фиг.21). С правой стороны фигуры показаны продукты PCR, полученные в результате выполнения RT-PCR в отношении РНК яичника и лобной доли коры головного мозга вместе с лэддером ДНК длиной 100 пар оснований. Положение разных вариантов мРНК показано с указанием их длины (от инициирующего до терминирующего кодона). Транслированные белки показаны с левой стороны. Прямоугольниками очерчены области, представленные в кДНК. Пунктирными линиями обозначена сплайсированная геномная ДНК. Заштрихованная область обозначает кодирующую последовательность зрелого эновина. Точечной линией отмечено начало кодирующей последовательности зрелого эновина. Два транскрипта, способные давать функциональный белок эновина, отмечены звездочкой с левой стороны. (В) Распределение по тканям основных сплайсированных вариантов. На фотографии показаны фрагменты PCR, полученные в результате выполнения RT-PCR с использованием эновинспецифических затравок в отношении разных кДНК человека. Четыре основных сплайсированных варианта (А-D) показаны стрелками с левой стороны. Длины указаны с правой стороны, при этом в качестве эталонной длины в геле принята длина лэддера ДНК, равная 100 п.о.On Fig illustrated the expression of different spliced variants of enovin in human tissues. (A) Schematic representation of spliced enovin variants identified by RT-PCR using eno-specific primers for RNA isolated from different human tissues, followed by cloning and sequence analysis in PCR products. The top line shows the length of the sequence (in the form of base pairs). The second line depicts the genomic sequence of enovin. This line shows the position of the translation initiation and termination codon, the start of the coding sequence of mature enovine and the 5'- and 3'-terminal splicing sites (see Fig. 21). The right side of the figure shows the PCR products obtained by performing RT-PCR for ovary RNA and the frontal lobe of the cerebral cortex together with a 100 DNA base ladder. The position of different mRNA variants is shown with an indication of their length (from initiating to terminating codon). Translated proteins are shown on the left side. Rectangles delineate the regions represented in cDNA. Dotted lines indicate spliced genomic DNA. The shaded area denotes the coding sequence of mature enovin. The dotted line marks the beginning of the coding sequence of mature enovin. Two transcripts capable of producing functional enovin protein are marked with an asterisk on the left side. (B) Tissue distribution of major spliced variants. The photograph shows PCR fragments obtained by performing RT-PCR using eno-specific primers for different human cDNAs. The four main spliced options (A-D) are shown by arrows on the left side. The lengths are indicated on the right side, while the DNA ladder length of 100 bp was taken as the reference length in the gel.

На фиг.23 показана предполагаемая белковая последовательность длинного сплайсированного варианта эновина, полученного сплайсированием двух интронов из последовательности ДНК, изображенной на фиг.21. Сайты сплайсинга 5'-1 и 3'-1 использованы для удаления первого интрона и сайты сплайсинга 5'-2 и 3'-3 использованы для удаления второго интрона. Это позволяет получить последовательность кДНК, имеющую открытую рамку считывания, кодирующую вышеуказанный белок, состоящий из 228 аминокислотных остатков.On Fig shows the estimated protein sequence of a long spliced variant of Enovin obtained by splicing two introns from the DNA sequence depicted in Fig.21. 5'-1 and 3'-1 splicing sites were used to remove the first intron and 5'-2 and 3'-3 splicing sites were used to remove the second intron. This allows you to get a cDNA sequence having an open reading frame encoding the above protein, consisting of 228 amino acid residues.

На фиг.24 показана предполагаемая белковая последовательность альтернативного (короткого) сплайсированного варианта эновина, полученного сплайсированием двух интронов из последовательности ДНК, изображенной на фиг.21. Сайты сплайсинга 5'-1 и 3'-2 использованы для удаления первого интрона и сайты сплайсинга 5'-2 и 3'-3 использованы для удаления второго интрона. Это позволяет получить последовательность кДНК, имеющую открытую рамку считывания, кодирующую вышеуказанный белок, состоящий из 220 аминокислотных остатков. В этой белковой последовательности отсутствуют 8 аминокислотных остатков по сравнению с последовательностью, изображенной на фиг.23.On Fig shows the putative protein sequence of an alternative (short) spliced variant of enovine obtained by splicing two introns from the DNA sequence depicted in Fig.21. The 5'-1 and 3'-2 splicing sites were used to remove the first intron, and the 5'-2 and 3'-3 splicing sites were used to remove the second intron. This allows you to get a cDNA sequence having an open reading frame encoding the above protein, consisting of 220 amino acid residues. There are no 8 amino acid residues in this protein sequence compared to the sequence shown in FIG.

На фиг.25 дано графическое изображение результатов, полученных при выполнении экспериментов по сравнению уровней экспрессии эновина в здоровой и пораженной болезнью ткани. Экспрессия эновина и GAPDH показана в ткани головного мозга, пораженной рассеянным склерозом и болезнью Альцгеймера.On Fig given a graphical representation of the results obtained by performing experiments comparing the levels of expression of enovin in healthy and diseased tissue. Enovin and GAPDH expression is indicated in brain tissue affected by multiple sclerosis and Alzheimer's disease.

На фиг.26 дано графическое изображение результатов, показывающих уровни экспрессии эновина и GAPDH в тканях, пораженных болезнью Паркинсона и раком.26 is a graphical representation of results showing expression levels of enovin and GAPDH in tissues affected by Parkinson's disease and cancer.

ДепонированиеEscrow

Плазмида EVNmat/pRSETB, включающая последовательность ДНК, кодирующую эновин, задепонирована 6 мая 1999 г. под № доступа LMBP3931 в банк данных Бельгийской координированной коллекции микробиологических культур (ВССМ) по адресу Laboratorium voor Moleculaire - Plasmidencollectie (LMBP) B9000, Ghent, Belgium, в соответствии с положениями Будапештского договора от 28 апреля 1997 г.The EVNmat / pRSETB plasmid, including the Enovin encoding DNA sequence, was donated on May 6, 1999 under accession number LMBP3931 to the Belgian Coordinated Collection of Microbiological Culture (BCCM) database at Laboratorium voor Moleculaire - Plasmidencollectie (LMBP) B9000, Ghent, Belgium, in in accordance with the provisions of the Budapest Treaty of April 28, 1997

Материалы и методыMaterials and methods

МатериалыMaterials

Нативная Taq-полимераза, ампициллин, IPTG (изопропил-β-D-тиогалактозид), X-gal (5-бром-4-хлор-3-индолил-β-D-галактопиранозид) и все рестрикционные ферменты предоставлены фирмой Boegringer Mannheim (Mannheim, Германия). Смесь 10 мМ dNTP приобретена у фирмы Life Technologies (Gaithersburg, MD, США). Набор для клонирования ТОРО-ТА приобретен у фирмы Invitrogen BV (Leek, Нидерланды). Набор для очистки плазмидной мини- или мидиДНК Qiagen, набор Qiaprep Spin Miniprep и набор для экстракции в геле Qiaquick приобретены у фирмы Qiagen GmbH (Dusseldorf, Германия). Библиотеки кДНК, наборы готовых кДНК Marathon™, панели I и II кДНК нескольких тканей человека (МТС™), нозерн-блоты нескольких тканей и набор для PCR с использованием кДНК Advantage-GC преобретены у фирмы Clontech Laboratories (Palo Alto, CA, США). Все полимеразные реакции синтеза цепи (PCR) выполнены в термоблоке 9600 системы GeneAmp PCR (Perkin Elmer, Foster City, CA, США). Среда LB (Luria-Bertani) содержит 10 г/л триптона, 5 г/л дрожжевого экстракта и 10 г/л NaCl. Планшены с двукратным объемом YT/ампициллина содержат 16 г/л триптона, 10 г/л дрожжевого экстракта, 5 г/л NaCl, 15 г/л агара и 100 мг/л ампициллина.Native Taq polymerase, ampicillin, IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactoside), X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside) and all restriction enzymes were provided by Boegringer Mannheim (Mannheim , Germany). A mixture of 10 mM dNTP was purchased from Life Technologies (Gaithersburg, MD, USA). The TOPO-TA cloning kit was purchased from Invitrogen BV (Leek, Netherlands). Qiagen plasmid minidi or midiDNA purification kit, Qiaprep Spin Miniprep kit and Qiaquick gel extraction kit were purchased from Qiagen GmbH (Dusseldorf, Germany). CDNA libraries, Marathon ™ ready-made cDNA kits, multiple human tissue cDNA panels I and II (MTS ™), multiple tissue northern blots and PCR kit using Advantage-GC cDNA were purchased from Clontech Laboratories (Palo Alto, CA, USA) . All polymerase chain synthesis reactions (PCRs) were performed in a 9600 Thermoblock GeneAmp PCR system (Perkin Elmer, Foster City, CA, USA). LB medium (Luria-Bertani) contains 10 g / L tryptone, 5 g / L yeast extract and 10 g / L NaCl. Plates with a double volume of YT / ampicillin contain 16 g / L tryptone, 10 g / L yeast extract, 5 g / L NaCl, 15 g / L agar and 100 mg / L ampicillin.

Поиск гомологичных последовательностей в базе данных и сравнение последовательностейSearch for homologous sequences in a database and sequence comparison

Поиск производят путем ежедневного обновления метки экспрессированной последовательности человека (EST) в библиотеке EMBL/GenBank и геномных базах данных, используя непроцессированный нейротрофический фактор, выделенный из линии глиальных клеток человека (GDNF; № доступа Q99748), нейротурин (NTN; № доступа Р39905), персефин (PSP; № доступа AF040962), выделенные из кДНК белковые последовательности в качестве эталонных последовательностей и устройство для выполнения сравнительного анализа первичных структур BLAST (Basic Local Alignment Search Tool; Altschul et al., 1990).The search is performed by daily updating the expressed human sequence tag (EST) in the EMBL / GenBank library and genomic databases using an unprocessed neurotrophic factor isolated from the human glial cell line (GDNF; access no. Q99748), neuroturin (NTN; access no. P39905), perseffin (PSP; accession number AF040962), protein sequences isolated from cDNA as reference sequences and a device for performing comparative analysis of primary BLAST structures (Basic Local Alignment Search Tool; Altschul et al., 1990).

Дополнительные исследования при помощи BLAST выполняют, используя геномную последовательность с № доступа АС005038 и несколько EST, имеющихся в базе данных GenBank, и ведут поиск последовательностей, гомологичных этой геномной последовательности.Additional studies using BLAST are performed using the genomic sequence with accession number AC005038 and several ESTs available in the GenBank database and search for sequences homologous to this genomic sequence.

Процентное значение идентичности и сходства между членами семейства GDNF высчитывают путем попарного сравнения последовательностей при помощи программы BESTFIT (программное обеспечение для анализа последовательностей Genetics Computer Group, версия 8.0, Висконсинский университет, Мэдисон, шт. Висконсин, США). Сравнительный анализ ДНК или белковых последовательностей выполняют при помощи программы сравнительного анализа ClustalW (EMBL, Heidelberg, Германия).The percentage value of identity and similarity between members of the GDNF family is calculated by pairwise sequence comparison using the BESTFIT program (Genetics Computer Group sequence analysis software, version 8.0, University of Wisconsin, Madison, Wisconsin, USA). Comparative analysis of DNA or protein sequences is performed using the ClustalW comparative analysis program (EMBL, Heidelberg, Germany).

Синтез олигонуклеотидов для PCR и секвенирования ДНКSynthesis of oligonucleotides for PCR and DNA sequencing

Все олигонуклеотидные затравки приобретены у фирмы Eurogentec (Seraing, Бельгия). Специфические для вставки секвенирующие затравки (15- и 16-меры) и затравки, используемые при выполнении полимеразных реакций синтеза цепи, созданы вручную. ДНК получают на анионообменных колонках Qiagen-tip 20 или -100 или центробежных колонках Qiaquick (Qiagen GmbH, Dusseldorf, Германия) и выделяют из колонок в 30 мкл ТЕ-буфер (10 мМ трис-HCl, 1 мМ EDTA (натриевая соль), рН 8,0).All oligonucleotide seeds were purchased from Eurogentec (Seraing, Belgium). Insert-specific sequencing seeds (15- and 16-measures) and the seeds used for performing polymerase chain synthesis reactions were created manually. DNA is obtained on Qiagen-tip 20 or -100 anion exchange columns or Qiaquick centrifugal columns (Qiagen GmbH, Dusseldorf, Germany) and is isolated from the columns in 30 μl TE buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA (sodium salt), pH 8.0).

Реакции секвенирования выполняют на обеих цепях, используя набор для секвенирования ABI prism BigDye Terminator Cycle, в секвенаторе Applied Biosystems 377XL (Perkin Elmer, ABI Division, Foster City, CA, США). Сборку последовательности и ручное редактирование (GeneCodes, Ann-Arbor, MI, США) выполняют при помощи программного обеспечения Sequencher™.Sequencing reactions are performed on both strands using the ABI prism BigDye Terminator Cycle sequencing kit in an Applied Biosystems 377XL sequencer (Perkin Elmer, ABI Division, Foster City, CA, USA). Sequence assembly and manual editing (GeneCodes, Ann-Arbor, MI, USA) are performed using Sequencher ™ software.

Клонирование нового гомолога GDNFCloning a new GDNF homolog

Нуклеотиды 67411-68343, охватывающие область ДНК, из базы данных EMBL под № доступа АС005038, в которых транслированная белковая последовательность гомологична зрелому NTN и PSP, используют для создания олигонуклеотидных затравок для амплификации при помощи PCR. Разные используемые затравки приведены в таблице 1.Nucleotides 67411-68343 spanning the DNA region from the EMBL database under accession number AC005038, in which the translated protein sequence is homologous to mature NTN and PSP, is used to create oligonucleotide seeds for amplification using PCR. The different seeds used are shown in table 1.

Затравки PNHsp3 и PNHap1 используют для амплификации фрагмента длиной 502 п.о. на кДНК, выделенной разных тканей человека (кДНК головного мозга плода, всего плода, предстательной железы или легкого Marathon-Ready™ (Clontech Laboratories), кДНК лобной доли коры головного мозга, гиппокампа и мозжечка), и на геномной ДНК человека. На основании геномной последовательности из базы данных EMBL/GenBank (№ доступа АС005038) установлено, что амплифицируемый фрагмент должен содержать G+C в количестве 76%. Поэтому амплификацию производят при помощи набора для PCR кДНК Advantage-GC (Clontech Laboratories, Palo Alto, CA, США), который оптимизирован для амплификации последовательностей ДНК с большим содержанием GC. Полимеразные реакции синтеза цепи выполняют в среде общим объемом 50 мкл, содержащей однократный объем реакционного буфера для PCR с GC кДНК, 0,2 мМ dNTP, 1 M GC-MELT, 200 нМ затравок PNHsp3 и PNHap1, 1 мкл полимеразной смеси Advantage KlenTaq и 1-5 мкл кДНК или 0,5 мкг геномной ДНК. Образцы нагревают до 95°С в течение 5 минут и подвергают тепловой обработке, выполняемой 45 секунд при 95°С, 1 минуту при 58°С и 40 секунд при 72°С в течение 35 циклов с конечной стадией продолжительностью 7 минут при 72°С. Наконец образцы обрабатывают 2,5 ед. нативной Taq-полимеразы ДНК с целью добавления удлиняющего сегмента А. Продукты PCR анализируют в 1% (в отношении веса к объему) агарозном геле в однократном объеме буфера ТАЕ (40 мМ трис-ацетата, 1 мМ EDTA (натриевая соль), рН 8,3). Фрагменты PCR предполагаемой длины (495 п.о.) вырезают из геля и очищают при помощи набора для экстрации в геле Qiaquick. Фрагменты PCR секвенируют, чтобы подтвердить их идентичность, и клонируют в плазмидном векторе pCR2.1-TOPO с использованием набора для клонирования ТОРО ТА в соответствии с инструкциями изготовителя. Примерно 20 нг очищенного фрагмента смешивают с 1 мкл вектора pCR2.1-TOPO в общем объеме 5 мкл. Реакционные смеси инкубируют при комнатной температуре (20°С) в течение 5 минут. Реакционную смесь (2 мкл) трансформируют в компетентных клетках TOP 1 OF' (Invitrogen BV) под действием температурного шока и культивируют на планшетах, содержащих двукратный объем YT/ампициллина с 10 мМ IPTG и 2% (в отношении веса к объему) X-gal, для скрининга сине-белых колоний. Белые колонии после выращивания в течение ночи снимают с планшетов, выращивают в 5 мл среды LB, содержащей 100 мг/л ампициллина и плазмидную ДНК, полученную при помощи набора Qiaprep Spin Miniprep. Наличие вставки предполагаемой длины подтверждают рестрикционным расщеплением при помощи EcoRI. Плазмидную вставку нескольких положительных клонов секвенируют и полученные последовательности сравнивают при помощи программы сравнительного анализа ClustalW.Seeds PNHsp3 and PNHap1 are used to amplify a 502 bp fragment. on cDNA isolated from different human tissues (cDNA of the brain of the fetus, whole fetus, prostate or lung Marathon-Ready ™ (Clontech Laboratories), cDNA of the frontal lobe of the cerebral cortex, hippocampus and cerebellum), and on human genomic DNA. Based on the genomic sequence from the EMBL / GenBank database (access no. AC005038), it was found that the amplified fragment should contain 76% G + C. Therefore, amplification is performed using the Advantage-GC cDNA kit for PCR (Clontech Laboratories, Palo Alto, CA, USA), which is optimized for amplification of DNA sequences with a high GC content. Polymerase chain synthesis reactions are performed in a medium with a total volume of 50 μl containing a single volume of PCR reaction buffer with GC cDNA, 0.2 mM dNTP, 1 M GC-MELT, 200 nM seeds PNHsp3 and PNHap1, 1 μl Advantage KlenTaq polymerase mixture and 1 -5 μl of cDNA or 0.5 μg of genomic DNA. The samples are heated to 95 ° C for 5 minutes and heat treated for 45 seconds at 95 ° C, 1 minute at 58 ° C and 40 seconds at 72 ° C for 35 cycles with a final stage of 7 minutes at 72 ° C. . Finally, the samples are treated with 2.5 units. native Taq polymerase DNA to add an extension segment A. PCR products are analyzed in 1% (in terms of weight to volume) agarose gel in a single volume of TAE buffer (40 mM Tris-acetate, 1 mM EDTA (sodium salt), pH 8, 3). PCR fragments of the estimated length (495 bp) were excised from the gel and purified using a Qiaquick gel extraction kit. PCR fragments are sequenced to confirm their identity and cloned into the pCR2.1-TOPO plasmid vector using the TOPO TA cloning kit according to the manufacturer's instructions. Approximately 20 ng of the purified fragment is mixed with 1 μl of the pCR2.1-TOPO vector in a total volume of 5 μl. The reaction mixtures were incubated at room temperature (20 ° C) for 5 minutes. The reaction mixture (2 μl) was transformed in TOP 1 OF 'competent cells (Invitrogen BV) under the influence of temperature shock and cultured on plates containing twice the volume of YT / ampicillin with 10 mM IPTG and 2% (in terms of weight to volume) X-gal , for screening blue and white colonies. White colonies after growing overnight were removed from the plates, grown in 5 ml of LB medium containing 100 mg / L ampicillin and plasmid DNA obtained using the Qiaprep Spin Miniprep kit. The presence of an insert of the intended length is confirmed by restriction digestion with EcoRI. The plasmid insert of several positive clones is sequenced and the sequences obtained are compared using the ClustalW benchmarking program.

Чтобы получить дополнительную кодирующую последовательность для нового гомолога GDNF, фрагмент предполагаемой длины, содержащий 931 п.о., высчитанный на основе последовательности из базы данных EMBL/GenBank (№ доступа АС005038), амплифицируют при помощи PCR, используя затравки PNHsp1 и PNHap1. Полимеразные реакции синтеза цепи выполняют в среде общим объемом 50 мкл, содержащей однократный объем реакционного буфера для PCR с GC кДНК, 0,2 мМ dNTP, 1 M GC-MELT™, 200 нМ затравок PNHsp1 и PNHap1, 1 мкл полимеразной смеси Advantage KlenTaq и 1-5 мкл кДНК из мозжечка, лобной доли коры головного мозга или гиппокампа или 0,5 мкг геномной ДНК. Образцы нагревают до 95°С в течение 5 минут и подвергают тепловой обработке, выполняемой 45 секунд при 95°С, 1 минуту при 58°С и 1 минуту 30 секунд при 12°С в течение 35 циклов с конечной стадией продолжительностью 7 минут при 72°С. Продукты PCR анализируют в 1% (в отношении веса к объему) агарозном геле в однократном объеме буфера ТАЕ (40 мМ трис-ацетата, 1 мМ EDTA (натриевая соль), рН 8,3). Вторую амплификацию выполняют с использованием вложенных затравок (PNHsp2 и PNHap2). Продукт первой амплификации (1 мкл) используют в среде общим объемом 50 мкл, содержащей однократный объем реакционного буфера для PCR с GC кДНК, 0,2 мМ dNTP, 1 M GC-MELT™, 200 нМ затравок PNHsp2 и PNHap2, 1 мкл полимеразной смеси Advantage KlenTaq. Образцы нагревают до 95°С в течение 5 минут и подвергают тепловой обработке, выполняемой 45 секунд при 95°С, 1 минуту при 58°С и 1 минуту 30 секунд при 72°С в течение 35 циклов с конечной стадией продолжительностью 7 минут при 72°С. Образцы анализируют в 1% (в отношении веса к объему) агарозном геле в однократном объеме буфера ТАЕ. Фрагменты PCR предполагаемой длины (870 п.о.) вырезают из геля и очищают при помощи набора для экстракции в геле Qiaquick. Фрагменты PCR секвенируют для подтверждения их идентичности, обрабатывают 2,5 ед. Taq-полимеразы и клонируют в плазмидном векторе pCR2.1-TOPO при помощи набора для клонирования ТОРО ТА в соответствии с инструкциями изготовителя. Примерно 20 нг очищенного фрагмента смешивают с 1 мкл вектора pCR2.1-TOPO в общем объеме 5 мкл. Реакционные смеси инкубируют при комнатной температуре (20°С) в течение 5 минут. Реакционные смеси (2 мкл) трансформируют в компетентных клетках TOP1OF' под действием температурного шока и культивируют на планшетах, содержащих двукратный объем YT/ампициллина с 10 мМ IPTG и 2% (в отношении веса к объему) Х-gal, для скрининга сине-белых колоний. Белые колонии после выращивания в течение ночи снимают с планшетов, выращивают в 5 мл среды LB, содержащей 100 мг/л ампициллина и плазмидную ДНК, полученную при помощи набора Qiaprep Spin Miniprep. Наличие вставки предполагаемой длины подтверждают рестрикционным расщеплением при помощи EcoRI. Плазмидную вставку нескольких положительных клонов секвенируют и полученные последовательности сравнивают при помощи программы сравнительного анализа ClustalW.In order to obtain an additional coding sequence for the new GDNF homolog, a fragment of the estimated length containing 931 bp calculated from the sequence from the EMBL / GenBank database (accession number AC005038) was amplified by PCR using the PNHsp1 and PNHap1 primers. Polymerase chain synthesis reactions are performed in a medium with a total volume of 50 μl containing a single volume of PCR reaction buffer with GC cDNA, 0.2 mM dNTP, 1 M GC-MELT ™, 200 nM seeds PNHsp1 and PNHap1, 1 μl Advantage KlenTaq polymerase mixture and 1-5 μl of cDNA from the cerebellum, frontal lobe of the cerebral cortex or hippocampus, or 0.5 μg of genomic DNA. Samples are heated to 95 ° C for 5 minutes and heat treated for 45 seconds at 95 ° C, 1 minute at 58 ° C and 1 minute 30 seconds at 12 ° C for 35 cycles with a final stage of 7 minutes at 72 ° C. PCR products are analyzed on a 1% (weight to volume) agarose gel in a single volume of TAE buffer (40 mM Tris-acetate, 1 mM EDTA (sodium salt), pH 8.3). The second amplification is performed using nested seeds (PNHsp2 and PNHap2). The first amplification product (1 μl) was used in a medium with a total volume of 50 μl containing a single volume of PCR reaction buffer with GC cDNA, 0.2 mM dNTP, 1 M GC-MELT ™, 200 nM seed PNHsp2 and PNHap2, 1 μl polymerase mixture Advantage KlenTaq. The samples are heated to 95 ° C for 5 minutes and heat treated for 45 seconds at 95 ° C, 1 minute at 58 ° C and 1 minute 30 seconds at 72 ° C for 35 cycles with a final stage of 7 minutes at 72 ° C. Samples are analyzed in 1% (in terms of weight to volume) agarose gel in a single volume of TAE buffer. PCR fragments of the estimated length (870 bp) were excised from the gel and purified using a Qiaquick gel extraction kit. PCR fragments are sequenced to confirm their identity, processed 2.5 units Taq polymerases are also cloned in the pCR2.1-TOPO plasmid vector using the TOPO TA cloning kit in accordance with the manufacturer's instructions. Approximately 20 ng of the purified fragment is mixed with 1 μl of the pCR2.1-TOPO vector in a total volume of 5 μl. The reaction mixtures were incubated at room temperature (20 ° C) for 5 minutes. The reaction mixtures (2 μl) were transformed in TOP1OF 'competent cells by temperature shock and cultured on plates containing twice the volume of YT / ampicillin with 10 mM IPTG and 2% (in terms of weight to volume) X-gal, for screening blue-white colonies. White colonies after growing overnight were removed from the plates, grown in 5 ml of LB medium containing 100 mg / L ampicillin and plasmid DNA obtained using the Qiaprep Spin Miniprep kit. The presence of an insert of the intended length is confirmed by restriction digestion with EcoRI. The plasmid insert of several positive clones is sequenced and the sequences obtained are compared using the ClustalW benchmarking program.

Анализ экспрессии гена эновина при помощи RT-PCREnovin Gene Expression Analysis by RT-PCR

Олигонуклеотидные затравки PNHsp3 и PNHap1 (см. таблицу 1) используют для специфической амплификации при помощи PCR фрагмента длиной 502 п.о., выделенного из эновина. Амплификации при помощи PCR выполняют с использованием панелей кДНК нескольких тканей человека (МТС™), нормализованных до уровней экспрессии мРНК шести разных обязательных генов. Полимеразные реакции синтеза цепи с использованием эновинспецифических затравок выполняют в среде общим объемом 50 мкл, содержащей 5 мкл кДНК, однократный объем реакционного буфера для PCR с GC кДНК, 0,2 мМ dNTP, 1 M GC-MELT TM, 400 нМ затравок PNHsp3 и PNHap1 и 1 мкл полимеразной смеси Advantage KlenTaq. Образцы нагревают до 95°С в течение 30 секунд и подвергают тепловой обработке, выполняемой 30 секунд при 95°С и 30 секунд при 68°С в течение 35 циклов. Образцы анализируют в 1,2% (в отношении веса к объему) агарозном геле в однократном объеме буфера ТАЕ (40 мМ трис-ацетат, 1 мМ EDTA (натриевая соль), рН 8,3) и получают изображения гелей, окрашенных бромидом этидия, при помощи видеосистемы Eagle Eye II (Stratagene, La Jolla, CA, США).The oligonucleotide primers PNHsp3 and PNHap1 (see table 1) are used for specific amplification using a PCR fragment of 502 bp in length isolated from enovin. PCR amplifications are performed using cDNA panels of several human tissues (MTS ™), normalized to mRNA expression levels of six different binding genes. Polymerase chain synthesis reactions using eno-specific seeds are performed in a medium with a total volume of 50 μl containing 5 μl cDNA, a single volume of PCR reaction buffer with GC cDNA, 0.2 mM dNTP, 1 M GC-MELT TM, 400 nM seeds PNHsp3 and PNHap1 and 1 μl of Advantage KlenTaq polymerase mixture. Samples are heated to 95 ° C for 30 seconds and heat treated for 30 seconds at 95 ° C and 30 seconds at 68 ° C for 35 cycles. Samples are analyzed on a 1.2% (weight to volume) agarose gel in a single volume of TAE buffer (40 mM Tris-acetate, 1 mM EDTA (sodium salt), pH 8.3) and images of gels stained with ethidium bromide are obtained. using the Eagle Eye II video system (Stratagene, La Jolla, CA, USA).

В результате поиска подобия ежедневно обновляемой базы данных EMBL/GenBank с использованием белковых последовательностей нейротурина и персефина человека получают последовательность геномной ДНК, кодирующую предполагаемый новый белок, подобный нейротрофическим факторам GDNF, NTN и PSP, который получил название "эновин" (EVN). Поиск дополнительных гомологичных последовательностей в базе данных с использованием последовательности геномной ДНК, окружающей область, кодирующую эновин, дает несколько клонов меток экспрессированных последовательностей (EST), выделенных из разных тканей человека (эпителий предстательной железы [№ доступа АА533512 (ID 1322952)], карцинома легкого [№ доступа АА931637] и опухоль паращитовидной железы [№ доступа АА844072]). Эти клоны содержат последовательность ДНК, находящуюся за пределами области гомологии с GDNF, PSP или NTN, но подтверждают, что мРНК эновина экспрессирована в здоровых и опухолевых тканях.Searching for the similarity of the daily updated EMBL / GenBank database using human neuroturin and perseffin protein sequences yields a genomic DNA sequence encoding a putative new protein, similar to the neurotrophic factors GDNF, NTN and PSP, called "Enovin" (EVN). A search for additional homologous sequences in the database using a genomic DNA sequence surrounding the enovin coding region yields several clones of expressed sequence (EST) tags isolated from different human tissues (prostate epithelium [accession number AA533512 (ID 1322952)], lung carcinoma [Accession No. AA931637] and a parathyroid tumor [Accession No. AA844072]). These clones contain a DNA sequence outside the region of homology with GDNF, PSP, or NTN, but confirm that enovin mRNA is expressed in healthy and tumor tissues.

Первоначальная ампликация при помощи PCR с использованием затравок (PNHsp3 и PNHap1) на основе геномной последовательности позволяет получить фрагмент длиной 500 п.о. из кДНК плода, головного мозга плода, предстательной железы, лобной доли коры головного мозга, гиппокампа, мозжечка и из геномной ДНК, причем этот фрагмент нельзя получить из кДНК легкого. Клонирование и анализ последовательности этих фрагментов дает последовательность ДНК длиной 474 п.о., которая транслируется в предполагаемую белковую последовательность, содержащую 139 аминокислотных остатков, включая семь консервативных остатков цистеина, характерных для всех членов семейства белков трансформирующего фактора роста β (TGF-β) (Kingsley, 1994) (фиг.1). Эта последовательность содержит также мотив RXXR для расщепления продомена (RAAR, положение аминокислот 23-26) (Barr, 1991). Подобный сайт расщепления имеется в белковых последовательностях GDNF, NTN и PSP в аналогичном положении последовательности продомена. Если предположить, что расщепление продомена эновина происходит на этом сайте in vivo, то последовательность зрелого белка EVN содержит 113 аминокислотных остатков (остатки 27-139 на фиг.1), имеет высчитанную молекулярную массу, равную 11965 Да, и изоэлектрическую точку, соответствующую 11,8. В зрелой последовательности (NST в положении аминокислот 121-123) имеется один предполагаемый сайт N-гликозилирования. Кроме того, эновин имеет также несколько областей, законсервированных в зрелых формах известных нейротрофических факторов GDNF, NTN и PSP (фиг.2). В таблице 2 показаны результаты сравнения зрелых белковых последовательностей членов семейства GDNF при помощи программы BESTFIT. В этой таблице приведены процентные значения идентичности и сходства. Зрелые последовательности GDNF, NTN, PSP и EVN, используемые в этом сравнении, начинаются с первого аминокислотного остатка, следующего за сайтом расщепления RXXR.Initial PCR amplification using primers (PNHsp3 and PNHap1) based on the genomic sequence yields a 500 bp fragment. from fetal cDNA, fetal brain, prostate, frontal lobe of the cerebral cortex, hippocampus, cerebellum and from genomic DNA, and this fragment cannot be obtained from lung cDNA. Cloning and sequence analysis of these fragments yields a 474 bp DNA sequence, which translates into a putative protein sequence containing 139 amino acid residues, including seven conserved cysteine residues that are characteristic of all members of the protein transforming growth factor β (TGF-β) family of proteins ( Kingsley, 1994) (Fig. 1). This sequence also contains the RXXR motif for cleavage of the prodomain (RAAR, amino acid position 23-26) (Barr, 1991). A similar cleavage site exists in the GDNF, NTN, and PSP protein sequences at the same position in the prodomain sequence. Assuming that the cleavage of the enovin prodomain occurs at this site in vivo, the mature EVN protein sequence contains 113 amino acid residues (residues 27-139 in FIG. 1), has a calculated molecular weight of 11,965 Da, and an isoelectric point corresponding to 11, 8. In the mature sequence (NST at amino acid position 121-123), there is one putative N-glycosylation site. In addition, enovin also has several regions conserved in mature forms of the known neurotrophic factors GDNF, NTN, and PSP (FIG. 2). Table 2 shows the results of comparing mature protein sequences of members of the GDNF family using the BESTFIT program. This table shows percentages of identity and similarity. The mature GDNF, NTN, PSP, and EVN sequences used in this comparison begin with the first amino acid residue following the RXXR cleavage site.

Эти сравнения показывают, что зрелый белок эновина находится в более тесном родстве с персефином и нейротурином, чем с GDNF.These comparisons show that mature enovin protein is more closely related to persefin and neuroturin than to GDNF.

В результате амплификации, клонирования и анализа последовательности более крупного фрагмента последовательности ДНК эновина, выделенной из кДНК лобной доли коры головного мозга с использованием затравок на основе геномной последовательности из базы данных EMBL/GenBank (№ доступа АС005038), получают последовательность, состоящую из 819 п.о. (фиг.3). Эта последовательность содержит предполагаемый инициирующий кодон ATG в положениях нуклеотидов 30-32 и дает открытую рамку считывания (рамка считывания А на фиг.3), которая доходит до терминирующего кодона в положениях нуклеотидов 285-287. Транслированная белковая последовательность этой области не обладает сходством с каким-либо известным белком в этих базах данных. Трансляция последовательности кДНК во второй рамке считывания (рамка считывания В на фиг.3) дает предполагаемую белковую последовательность, состоящую из 159 аминокислотных остатков. Эта последовательность содержит сайт расщепления RXXR (положение В43-В46; положение нуклеотидов 460-471) и последовательность, соответствующую последовательности зрелого эновина (положение В47-В159; положение нуклеотидов 472-810). Открытая рамка считывания, включающая сайт расщепления RXXR и кодирующую последовательность зрелого эновина, идет от положения нуклеотида 334 (которому предшествует находящийся в рамке терминирующий кодон) до терминирующего кодона в положении 811-813, но не содержит кодон ATG для инициирующего остатка метионина. По аналогии с персефином (Milbrandt et al., 1998) авторы этого изобретения выдвинули гипотезу о том, что в большинстве транскриптов мРНК из гена EVN имеется несплайси-рованный интрон. GDNF и NTN также имеют интрон в соответствующих кодирующих областях продомена (Matsushita et al., 1997, Heuckeroth et al., 1997).As a result of amplification, cloning and sequence analysis of a larger fragment of the enovin DNA sequence isolated from cDNA of the frontal lobe of the cerebral cortex using seeds based on the genomic sequence from the EMBL / GenBank database (access no. AC005038), a sequence consisting of 819 p. about. (figure 3). This sequence contains the putative ATG initiation codon at nucleotide positions 30-32 and gives an open reading frame (reading frame A in FIG. 3), which reaches the termination codon at nucleotide positions 285-287. The translated protein sequence of this region does not resemble any known protein in these databases. Translation of the cDNA sequence in the second reading frame (reading frame B in figure 3) gives the estimated protein sequence consisting of 159 amino acid residues. This sequence contains an RXXR cleavage site (position B43-B46; position of nucleotides 460-471) and a sequence corresponding to the sequence of mature enovine (position B47-B159; position of nucleotides 472-810). An open reading frame, including the RXXR cleavage site and the mature enovin coding sequence, runs from the position of nucleotide 334 (which is preceded by the termination codon framed) to the termination codon at position 811-813, but does not contain the ATG codon for the methionine initiating residue. By analogy with perseffin (Milbrandt et al., 1998), the authors of this invention hypothesized that in most transcripts of mRNA from the EVN gene there is an unspliced intron. GDNF and NTN also have an intron in the corresponding coding regions of the prodomain (Matsushita et al., 1997, Heuckeroth et al., 1997).

Чтобы установить наличие разных транскриптов мРНК для эновина, выполняют эксперименты на основе RT-PCR, используя затравки, расположенные у 5'-конца кодирующей последовательности эновина, 5'-конца предполагаемого верхнего инициирующего кодона ATG (затравка PNHsp5 [5' - GCA AGC TGC CTC AAC AGG AGG G - 3']), и вложенную затравку PNHsp6 [5' - GGT GGG GGA АСА GCT CAA CAA TGG -3'] и у 3'-конца (затравка PNHap1 и вложенная затравка PNHap2 [см. таблицу 1]). Эксперименты выполняют на панелях кДНК нескольких тканей человека (панели I и II Clontech МТС) с использованием библиотеки кДНК, выделенной из сердца плода (Clontech), и кДНК, выделенной из мозжечка, гиппокампа или лобной доли коры головного мозга человека (Masure et al., 1998). Первоначальные полимеразные реакции синтеза цепи выполняют, используя затравки PNHsp5 и PNHap1, в условиях с большим содержанием GC (набор Advantage GC-PCR, Clontech) в течение 30 циклов (95°С - 30 секунд, 60°С - 30 секунд, 72°С - 1 минута) в соответствии с описанием. Вложенные полимеразные реакции синтеза цепи выполняют, используя 1 мкл первичного продукта PCR, при помощи затравок PNHsp6 и PNHap2 в тех же условиях на протяжении 30 циклов. Полученные продукты PCR анализируют в 1,5% агарозном геле и распределяют по длине от ±350 п.о. до ±800 п.о. Несколько полос очищают от геля и фрагменты PCR подвергают прямому секвенированию. Некоторые очищенные продукты PCR также клонируют в векторе pCR2.1-TOPO (набор для клонирования ТОРО-ТА, Invitrogen) и затем секвенируют. Анализ последовательности подтверждает наличие других молекул мРНК, содержащих последовательность эновина. Последовательности полученных фрагментов сравнивают с геномной последовательностью эновина. Это позволяет идентифицировать несколько возможных 5'- и 3'-концевых сайтов сплайсинга в геномной последовательности (фиг.21). Все эти сайты сплайсинга соответствуют согласованным последовательностям для донорных и акцепторных сайтов сплайсинга (Senapathy, P., Shapiro, M.B. & Harris, N.L. (1990)), границ сплайсинга, сайтов акцепторных точек сплайсинга и экзонов (Sequence Statistics, Identification, and Application to Genome Project. Methods Enzymol, 183, 252-278). Разные идентифицированные сплайсированные варианты эновина и их наличие в разных тканях человека показаны на фиг.22. Только два из 5 секвенированных транскриптов дают функциональный белок эновина при трансляции из инициирующего кодона ATG. Эти два транскрипта кодируют белки 228 или 220 аминокислот, имеющих соответственно предполагаемые сигнальные пептиды, состоящие из 47 и 39 аминокислотных остатков. Предполагаемые белковые последовательности этих двух вариантов показаны на фиг.23 (длинный вариант) и на фиг.24 (короткий вариант). Длинный вариант можно вычленить из последовательности ДНК, показанной на фиг.21, сплайсируя первый интрон в положениях 5'-1 и 3'-1 и второй интрон в положениях 5'-2 и 3'-3. После трансляции открытой рамки считывания получают предполагаемую белковую последовательность, показанную на фиг.23. Более короткий вариант можно вычленить из последовательности ДНК, показанной на фиг.21, сплайсируя первый интрон в положениях 5'-1 и 3'-2 и второй интрон в положениях 5'-2 и 3'-3. После трансляции открытой рамки считывания получают предполагаемую белковую последовательность, показанную на фиг.24.To establish the presence of different mRNA transcripts for enovin, RT-PCR-based experiments were performed using seeds located at the 5 ′ end of the enovin coding sequence, the 5 ′ end of the putative upper ATG initiation codon (PNHsp5 seed [5 ′ - GCA AGC TGC CTC AAC AGG AGG G - 3 ']), and nested primer PNHsp6 [5' - GGT GGG GGA ACA GCT CAA CAA TGG -3 '] and at the 3'-end (PNHap1 primer and PNHap2 nested primer [see table 1]) . The experiments were performed on cDNA panels of several human tissues (Clontech MTS panels I and II) using a cDNA library isolated from the fetal heart (Clontech) and cDNA isolated from the cerebellum, hippocampus, or frontal lobe of the human cerebral cortex (Masure et al., 1998). The initial polymerase chain synthesis reactions were performed using primers PNHsp5 and PNHap1 under conditions with a high GC content (Advantage GC-PCR kit, Clontech) for 30 cycles (95 ° C for 30 seconds, 60 ° C for 30 seconds, 72 ° C - 1 minute) as described. Nested polymerase chain synthesis reactions are performed using 1 μl of the primary PCR product using primers PNHsp6 and PNHap2 under the same conditions for 30 cycles. The resulting PCR products were analyzed on a 1.5% agarose gel and distributed over a length of ± 350 bp. up to ± 800 bp Several bands were gel purified and PCR fragments were subjected to direct sequencing. Some purified PCR products are also cloned into pCR2.1-TOPO vector (TOPO-TA cloning kit, Invitrogen) and then sequenced. Sequence analysis confirms the presence of other mRNA molecules containing the enovin sequence. The sequences of the obtained fragments are compared with the genomic sequence of enovin. This allows you to identify several possible 5'- and 3'-terminal splicing sites in the genomic sequence (Fig.21). All these splicing sites correspond to consistent sequences for donor and acceptor splicing sites (Senapathy, P., Shapiro, MB & Harris, NL (1990)), splicing boundaries, acceptor splicing point sites and exons (Sequence Statistics, Identification, and Application to Genome Project. Methods Enzymol, 183, 252-278). Different identified spliced variants of Enovin and their presence in different human tissues are shown in Fig. 22. Only two of the 5 sequenced transcripts give functional enovin protein when translated from the ATG initiation codon. These two transcripts encode 228 or 220 amino acid proteins having respectively putative signal peptides consisting of 47 and 39 amino acid residues. The putative protein sequences of these two variants are shown in FIG. 23 (long version) and in FIG. 24 (short version). A long variant can be isolated from the DNA sequence shown in Fig.21, splicing the first intron at positions 5'-1 and 3'-1 and the second intron at positions 5'-2 and 3'-3. After translation of the open reading frame, the putative protein sequence shown in FIG. 23 is obtained. A shorter version can be isolated from the DNA sequence shown in Fig.21, splicing the first intron at positions 5'-1 and 3'-2 and the second intron at positions 5'-2 and 3'-3. After translation of the open reading frame, the putative protein sequence shown in FIG. 24 is obtained.

Самый длинный транскрипт, по-видимому, наиболее часто встречается в большинстве тканей, о чем можно судить по интенсивности полос на фиг.22В. Более короткие транскрипты вызывают сдвиги рамки считывания, что дает транслированный белок, у которого отсутствует аминокислотная последовательность зрелого эновина, гомологичная GDNF, NTN и PSP. У двух наименьших транскриптов отсутствует даже часть зрелой кодирующей последовательности, включающая два из семи высококонсервативных остатков цистеина. На фиг.22В показано распределение основных сплайсированных вариантов в разных тканях человека. Функциональная мРНК эновина экспрессирована почти во всех испытанных тканях, включая головной мозг, сердце, почку, печень, легкое, поджелудочную железу, скелетную мышцу, толстую кишку, тонкую кишку, лейкоциты периферической кровеносной системы, селезенку, тимус, предстательную железу, яичко, яичник, плаценту и сердце плода. В некоторых тканях человека (например, мозжечок, гиппокамп) при помощи PCR можно амплифицировать только нефункциональные транскрипты. Насколько известно авторам этого изобретения, присутствие нефункциональных транскриптов мРНК в таком количестве до сих пор не было описано. Необходимо изучить биологическую значимость этого открытия. Хотя экспрессия NTN и PSP в разных тканях не исследована полностью, уровни их экс-прессии, по-видимому, являются гораздо ниже, и сама экспрессия в большей степени ограничена конкретными тканями (Kotzbauer et al., 1996, Milbrandt et al., 1998).The longest transcript, apparently, is most often found in most tissues, as can be judged by the intensity of the bands in figv. Shorter transcripts cause reading frame shifts, resulting in a translated protein that lacks the mature enovin amino acid sequence homologous to GDNF, NTN, and PSP. The two smallest transcripts lack even a part of the mature coding sequence, including two of the seven highly conserved cysteine residues. On figv shows the distribution of the main spliced variants in different human tissues. Functional enovin mRNA is expressed in almost all tested tissues, including the brain, heart, kidney, liver, lung, pancreas, skeletal muscle, colon, small intestine, peripheral circulatory leukocytes, spleen, thymus, prostate gland, testicle, ovary, placenta and fetal heart. In some human tissues (e.g., cerebellum, hippocampus), only non-functional transcripts can be amplified by PCR. As far as the authors of this invention are aware, the presence of non-functional mRNA transcripts in such quantity has not yet been described. It is necessary to study the biological significance of this discovery. Although the expression of NTN and PSP in different tissues has not been fully studied, their expression levels are likely to be much lower, and the expression itself is more limited to specific tissues (Kotzbauer et al., 1996, Milbrandt et al., 1998) .

Экспрессия рекомбинантов эновина в экспрессирующей эновин плазмиде, сконструированной в Е. coliExpression of Enovin Recombinants in an Enovin Expressing Plasmid Constructed in E. coli

Фрагмент длиной 414 п.о., полученный при помощи PCR, амплифицируют из геномной ДНК человека с использованием затравок PNHsp4 и PNHap2 (таблица 1) и клонируют в векторе pCR2.1-TOPO методом ТА-клонирования (Invitrogen). Структуру последовательности вставки подтверждают анализом последовательности. Один клон, содержащий вставку с согласованной последовательностью эновина (клон 36), используют для последующего создания экспрессирующей плазмиды. Получают две затравки, содержащие соответствующие сайты рестрикции у 5'-концов. Верхняя затравка PNHexp-sp1 (5' - GC

GCT GGG GGC CCG GGC A - 3') содержит сайт рестрикции BamHI (подчеркнут), и нижняя затравка PNHexp-apl (5' - GC

CAG CCC AGG CAG CCG CAG G - 3') содержит сайт рестрикции XhoI (также подчеркнут). Используя эти затравки, из клона 36 амплифицируют фрагмент, кодирующий зрелый эновин (положение 81-422 на фиг.1). Полимеразную реакцию синтеза цепи выполняют в среде общим объемом 50 мкл, содержащей однократный объем реакционного буфера с GC кДНК, 0,2 мМ dNTP, 1 M GC-MELT™, 200 нМ затравок PNHexp-sp1 и PNHexp-ap1, 1 мкл полимеразной смеси Advantage KlenTaq и 10 нг плазмидной ДНК из клона 36. Образцы нагревают до 94°С в течение 5 минут и подвергают тепловой обработке, выполняемой 45 секунд при 94°С, 1 минуту при 58°С и 30 секунд при 72°С на протяжении 25 циклов с конечной стадией продолжительностью 7 минут при 72°С. Полученные 50 мкл продукта очищают при помощи набора для очистки продуктов PCR Qiaquick (Qiagen) и ДНК, элюированной в 30 мкл. Этот очищенный продукт (25 мкл) гидролизуют в 30 мкл реакционной смеси с 10 ед. BamHI и 10 ед. XhoI в однократном объеме буфера В (Boehringer Mannheim) в течение 1 часа при 37°С. После выполнения электрофореза в 1% (в отношении веса к объему) агарозном геле в однократном объеме буфера ТАЕ (40 мМ трис-ацетата, 1 мМ EDTA (натриевая соль), рН 8,3) искомую полосу длиной 353 п.о. вырезают из геля и очищают при помощи набора для экстракции геля Qiaquick. Полученный фрагмент лигируют с вектором pRSET В (Invitrogen) и линеаризуют при помощи BamHI и XhoI. Структуру вставки полученной конструкции на основе плазмидного вектора (hEVNmat/pRSETB) подтверждают, выполняя анализ всей последовательности. Полученная конструкция кодирует белок, состоящий из 146 аминокислот, с предполагаемой молекулярной массой 15704 Да, включая NН₂-концевую His-метку из 6 элементов, слитую в рамке с кодирующей последовательностью зрелого эновина. NH₂-концевая аминокислотная последовательность полученного белка имеет структуруA 414 bp fragment obtained by PCR was amplified from human genomic DNA using PNHsp4 and PNHap2 primers (Table 1) and cloned into pCR2.1-TOPO vector by TA cloning (Invitrogen). The sequence structure of the insert is confirmed by sequence analysis. One clone containing an insert with a consistent enovin sequence (clone 36) is used to subsequently create an expression plasmid. Get two seeds containing the corresponding restriction sites at the 5'-ends. Top seed PNHexp-sp1 (5 '- GC

GCT GGG GGC CCG GGC A - 3 ') contains the BamHI restriction site (underlined), and the lower seed PNHexp-apl (5' - GC

CAG CCC AGG CAG CCG CAG G - 3 ′) contains the XhoI restriction site (also underlined). Using these seeds, a fragment encoding mature enovin is amplified from clone 36 (position 81-422 in FIG. 1). The polymerase chain synthesis reaction is performed in a medium with a total volume of 50 μl containing a single volume of the reaction buffer with GC cDNA, 0.2 mM dNTP, 1 M GC-MELT ™, 200 nM seeds PNHexp-sp1 and PNHexp-ap1, 1 μl Advantage polymerase mixture KlenTaq and 10 ng of plasmid DNA from clone 36. The samples are heated to 94 ° C for 5 minutes and heat treated for 45 seconds at 94 ° C, 1 minute at 58 ° C and 30 seconds at 72 ° C for 25 cycles with the final stage lasting 7 minutes at 72 ° C. The resulting 50 μl of product was purified using Qiaquick PCR Product Purification Kit (Qiagen) and DNA eluted in 30 μl. This purified product (25 μl) is hydrolyzed in 30 μl of the reaction mixture with 10 units. BamHI and 10 units. XhoI in a single volume of buffer B (Boehringer Mannheim) for 1 hour at 37 ° C. After electrophoresis was performed in 1% (in terms of weight to volume) agarose gel in a single volume of TAE buffer (40 mM Tris-acetate, 1 mM EDTA (sodium salt), pH 8.3), the desired band was 353 bp long. cut out from the gel and purified using a Qiaquick gel extraction kit. The resulting fragment is ligated with the vector pRSET B (Invitrogen) and linearized using BamHI and XhoI. The insert structure of the resulting plasmid vector based construct (hEVNmat / pRSETB) is confirmed by analyzing the entire sequence. The resulting construct encodes a 146 amino acid protein with an estimated molecular weight of 15,704 Da, including a 6-element His _2- terminal His-tag fused in frame with the mature enovin coding sequence. The NH ₂ terminal amino acid sequence of the obtained protein has the structure

MRGS

GMASMTGGQQMGRDLYDDDDKDP

(последовательность зрелого эновина напечатана жирным шрифтом, и His-метка из 6 элементов подчеркнута).Mrgs

GMASMTGGQQMGRDLYDDDDKDP

(the mature enovine sequence is printed in bold and the 6-element His tag is underlined).

Экспрессия эновина в клетках BL21 (DE3) Е. coliEnovin expression in E. coli BL21 (DE3) cells

Рекомбинант белка эновина продуцируют в соответствии со способом, описанным для нейротурина Кридоном и др. (Creedon et al., 1997), в который вносят модификации. Чтобы получить рекомбинантный белок эновина, плазмиду hEVNmat/pRSETB трансформируют в штамме BL21 (DE3) Е. coli (Novagen) и выращивают в среде с двукратным объемом YT/ампициллина (16 г/л триптона, 10 г/л дрожжевого экстракта, 5 г/л NaCl и 100 мг/л ампициллина) при 30°С (225 оборотов/мин) или 37°С (300 оборотов/мин) до оптической плотности OD600, равной примерно 0,5, после чего добавляют IPTG до конечной концентрации 0,2 мМ, чтобы индуцировать экспрессию. Клеточный дебрис собирают центрифугированием после трехчасовой индукции, промывают физиологическим раствором с фосфатным буфером, центрифугируют и хранят в замороженном виде. Для очистки и повторной укладки клеточный дебрис вновь суспендируют в буфере для обработки ультразвуком (20 мМ трис-HCl, рН 8,0, 300 мМ NaCl, 1 мМ 2-меркаптоэтанола, ингибиторы протеазы (смешанные таблетки ингибитора протеазы Complete™ (Boehringer Mannheim, 1 таблетка на 50 мл буфера) и 1 мг лизоцима на 500 мг клеточного дебриса)). Клетки разрушают ультразвуком и внутриклеточные тельца собирают центрифугированием. Внутриклеточные тельца растворяют и инкубируют в буфере А (8 М мочевины, 20 мМ трис-HCl, рН 7,6, 200 мМ NaCl, 1 мМ 2-меркаптоэтанола) в течение 30 минут при 37°С и добавляют смолу Ni-NTA (никельнитрилотриуксусная кислота, Qiagen). Смесь встряхивают в течение 40 минут при 37°С, образцы промывают один раз буфером А и вводят в колонку с 5 мл Ni-NTA. Колонку последовательно промывают 10 объемами буфера А, 10 объемами буфера А при рН 7,2 и 10 объемами буфера А при рН 7,2 + 10 мМ имидазола. Эновин элюируют из колонки в 4 объема буфера А при рН 7,2 + 200 мМ имидазола.Enovin protein recombinant is produced in accordance with the method described for neuroturin Creedon and others (Creedon et al., 1997), which make modifications. To obtain a recombinant enovin protein, the hEVNmat / pRSETB plasmid was transformed into E. coli strain BL21 (DE3) (Novagen) and grown in a medium with a double volume of YT / ampicillin (16 g / l tryptone, 10 g / l yeast extract, 5 g / l of NaCl and 100 mg / l of ampicillin) at 30 ° C (225 rpm) or 37 ° C (300 rpm) to an optical density of OD600 of about 0.5, after which IPTG is added to a final concentration of 0.2 mM to induce expression. Cell debris is collected by centrifugation after three hours of induction, washed with physiological saline with phosphate buffer, centrifuged and stored frozen. For cleaning and re-stacking, cell debris is resuspended in ultrasound treatment buffer (20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 300 mM NaCl, 1 mM 2-mercaptoethanol, protease inhibitors (Complete ™ protease inhibitor mixed tablets (Boehringer Mannheim, 1 tablet per 50 ml of buffer) and 1 mg of lysozyme per 500 mg of cell debris)). Cells are destroyed by ultrasound and intracellular bodies are harvested by centrifugation. The intracellular bodies were dissolved and incubated in buffer A (8 M urea, 20 mM Tris-HCl, pH 7.6, 200 mM NaCl, 1 mM 2-mercaptoethanol) for 30 minutes at 37 ° C and Ni-NTA resin (nickel nitrile triacetic acid) was added. acid, Qiagen). The mixture was shaken for 40 minutes at 37 ° C, the samples were washed once with buffer A and introduced into a column with 5 ml of Ni-NTA. The column is washed successively with 10 volumes of buffer A, 10 volumes of buffer A at pH 7.2 and 10 volumes of buffer A at pH 7.2 + 10 mM imidazole. Enovin is eluted from the column in 4 volumes of buffer A at a pH of 7.2 + 200 mM imidazole.

Повторную укладку эновина выполняют при помощи постадийного диализа в течение ночи при 4°С в буфере для ренатурации (0,1 М фосфата натрия, 0,15 М NaCl, 3 мкМ цистеина, 0,02% Tween-20, 10% глицерина, 0,01 М трис-HCl, рН 8,3), содержащего мочевину, количество которой уменьшается на каждой стадии (от 6 М до 4 М, 3 М, 2 М, 1 М, 0,5 М и 0 М мочевины). Отбирают аликвоту очищенного белка, хранят ее при -20°С и затем используют для выполнения функциональных анализов.Enovin is re-stacked by stepwise dialysis overnight at 4 ° C in renaturation buffer (0.1 M sodium phosphate, 0.15 M NaCl, 3 μM cysteine, 0.02% Tween-20, 10% glycerol, 0 , 01 M Tris-HCl, pH 8.3) containing urea, the amount of which is reduced at each stage (from 6 M to 4 M, 3 M, 2 M, 1 M, 0.5 M and 0 M urea). An aliquot of the purified protein is taken, stored at -20 ° C and then used to perform functional analyzes.

Локализация гена эновина в хромосомахEnovin gene localization on chromosomes

Фрагмент гена эновина длиной 3,3 т.п.о. амплифицируют из кДНК мозжечка, используя затравки EVN(7)-spl (5' - ТТС GCG TGT СТА САА ACT САА СТС СС - 3') и PNHapl (5' - GCA GGA AGA GCC ACC GGT AAG G - 3'), полученные на основе последовательности EMBL с № доступа АС005038. Полимеразную реакцию синтеза цепи выполняют в среде общим объемом 50 мкл, содержащей однократный объем реакционного буфера Expand Long Template (Boehringer Mannheim), 0,5 мМ dNTP, 1 M GC-MELT (Clontech Laboratories), 400 нМ затравок EVN(7)-spl и PNHapl и 1 мкл кДНК из мозжечка. Смесь выдерживают в течение 2 минут при 94°С, добавляют 0,75 мкл полимеразы Expand Long Template (Boehringer Mannheim) и подвергают тепловой обработке, выполняемой 10 секунд при 94°С, 30 секунд при 58°С и 3 минуты при 68°С на протяжении 10 циклов. Затем выполняют еще 20 дополнительных циклов тепловой обработки, увеличивая время обработки в каждом цикле при 68°С на 20 секунд. Тепловую обработку завершают циклом продолжительностью 7 минут при 68°С. Полученный фрагмент длиной 3,3 т.п.о. очищают после электрофореза в 0,8% агарозном/ТАЕ геле и клонируют в векторе pCR2.1-ТОРО методом ТА-клонирования (Invitrogen). Анализ всей последовательности вставки длиной 3,3 т.п.о. одного клона подтверждает, что полученная последовательность кДНК соответствует геномной последовательности в базе данных ENBL (№ доступа АС005038). В результате сплайсинга кДНК, полученной из кДНК мозжечка, не были выделены интроны.Enovin gene fragment 3.3 kb in length amplified from cerebellar cDNA using the seed EVN (7) -spl (5 '- TTC GCG TGT STA CAA ACT CAA STS CC - 3') and PNHapl (5 '- GCA GGA AGA GCC ACC GGT AAG G - 3') obtained based on the EMBL sequence with access no. AC005038. The polymerase chain synthesis reaction is performed in a medium with a total volume of 50 μl containing a single volume of the Expand Long Template reaction buffer (Boehringer Mannheim), 0.5 mM dNTP, 1 M GC-MELT (Clontech Laboratories), 400 nM seed EVN (7) -spl and PNHapl and 1 μl of cerebellum cDNA. The mixture was incubated for 2 minutes at 94 ° C, 0.75 μl of Expand Long Template polymerase (Boehringer Mannheim) was added and heat treated for 10 seconds at 94 ° C, 30 seconds at 58 ° C and 3 minutes at 68 ° C. for 10 cycles. Then, 20 additional cycles of heat treatment are performed, increasing the processing time in each cycle at 68 ° C for 20 seconds. Heat treatment is completed with a cycle of 7 minutes at 68 ° C. The resulting 3.3 kb fragment. purified after electrophoresis in a 0.8% agarose / TAE gel and cloned in pCR2.1-TOPO vector by TA cloning (Invitrogen). Analysis of the entire insert sequence of 3.3 kbp one clone confirms that the obtained cDNA sequence corresponds to the genomic sequence in the ENBL database (access no. AC005038). As a result of splicing of cDNA obtained from cerebellar cDNA, no introns were isolated.

Хромосомное картирование осуществляют методом флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) (Heng et al., 1992, Heng & Tsui, 1993). Лимфоциты человека культивируют при 37°С в течение 68-72 часов и обрабатывают 0,18 мг/мл 5-бром-2'-дезоксиуридином (BrdU), чтобы синхронизировать циклы клеток в популяции клеток. Синхронизированные клетки промывают и повторно культивируют при 37°С в течение 6 часов. Клетки собирают и получают микроскопические препараты стандартными методами, такими как гипотоническая обработка, фиксация или естественная сушка. Зонд длиной 3,3 т.п.о. для эновина обрабатывают биотином и используют для детектирования методом FISH. Микроскопические препараты обжигают при 55°С в течение 1 часа, обрабатывают РНКазой, денатурируют в 70% формамиде и двукратном объеме смеси NaCl/Cit (20-кратный объем смеси NaCl/Cit содержит 3 М NaCl, 0,3 М динатрийцитрата, рН 7,0) в течение 2 минут при 70°С и дегидратируют этанолом. Зонд денатурируют и наносят на денатурированные хромосомные микроскопические препараты. Микроскопические препараты гибридизуют в течение ночи, промывают, и на фотографической пленке по отдельности регистрируют сигналы FISH и картину полос, окрашенных 4',6-диамидино-2-фенилиндолом, при этом данные картирования методом FISH совмещают с окрашенными полосами хромосом путем наложения сигналов FISH на хромосомы, окрашенные 4',6-диамино-2-фенилиндолом (Heng & Tsui, 1993). В применяемых условиях эффективность гибридизации составляет примерно 72% для этого зонда (из 100 проверенных митотических фигур сигналы в одной паре хромосом были обнаружены на 72 фигурах). Поскольку окрашивание полос 4',6-диамидино-2-фенилиндолом использовано для идентификации специфической хромосомы, было достигнуто соответствие между сигналом зонда и коротким плечом хромосомы 1. Точное положение далее определяют на основе суммирования данных, полученных на 10 фотографиях (фиг.4А). Так как в применяемых условиях методом FISH не обнаружен дополнительный локус, можно сделать вывод о том, что эновин находится в хромосоме 1 человека, область р31.3-р32. Пример результатов картирования приведен на фиг.4В.Chromosomal mapping is carried out by in situ fluorescence hybridization (FISH) (Heng et al., 1992, Heng & Tsui, 1993). Human lymphocytes were cultured at 37 ° C for 68-72 hours and treated with 0.18 mg / ml 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) to synchronize cell cycles in the cell population. The synchronized cells are washed and re-cultured at 37 ° C for 6 hours. Cells are harvested and microscopic preparations are obtained by standard methods, such as hypotonic treatment, fixation or natural drying. 3.3 kb probe for enovin, they are treated with biotin and used for detection by the FISH method. Microscopic preparations are fired at 55 ° C for 1 hour, treated with RNase, denatured in 70% formamide and twice the volume of the NaCl / Cit mixture (20-fold volume of the NaCl / Cit mixture contains 3 M NaCl, 0.3 M disodium citrate, pH 7, 0) for 2 minutes at 70 ° C and dehydrated with ethanol. The probe is denatured and applied to denatured chromosome microscopic preparations. Microscopic preparations are hybridized overnight, washed, and the FISH signals and the pattern of the bands stained with 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole are separately recorded on the photographic film, while the mapping data by the FISH method are combined with the stained chromosome bands by superimposing the FISH signals on chromosomes stained with 4 ', 6-diamino-2-phenylindole (Heng & Tsui, 1993). Under the applicable conditions, the hybridization efficiency is approximately 72% for this probe (out of 100 verified mitotic figures, signals in one pair of chromosomes were detected in 72 figures). Since the staining of the bands 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole was used to identify a specific chromosome, a match was achieved between the probe signal and the short arm of chromosome 1. The exact position is then determined based on the summation of the data obtained in 10 photographs (Fig. 4A). Since an additional locus was not detected under the FISH method under applicable conditions, it can be concluded that enovin is located on the chromosome 1 of the person, region p31.3-p32. An example of the mapping results is shown in FIG.

На основании данных генетической карты, представленных в Национальном центре биотехнологической информации (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genemap), можно заключить, что геномный клон, содержащий последовательность эновина (EMBL № доступа АС005038), находится в хромосоме 1 между маркерами D1S2843 и D1S417. Это положение соответствует хромосоме 1, область р31.1-р32.3, подтверждая данные, полученные методом FISH.Based on the genetic map data presented at the National Center for Biotechnological Information (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genemap), we can conclude that the genomic clone containing the enovine sequence (EMBL access number AC005038) is on chromosome 1 between markers D1S2843 and D1S417. This position corresponds to chromosome 1, region p31.1-p32.3, confirming the data obtained by the FISH method.

Распределение эновина в тканях, определяемое при помощи нозерн-блоттинга и дот-блоттингаTissue Enovin Distribution as Determined by Northern Blot and Dot Blot

Нозерн-блоты, содержащие 2 мкг поли(А)-богатой РНК, выделенной из разных тканей человека (Clontech Laboratories, Palo Alto, CA, США; блот MTN™, блот II MTN™ и блот II MTN™ из плода), гибридизуют в соответствии с инструкциями изготовителя с фрагментом эновина длиной 897 п.о., меченным произвольным примированием α-³²P-dCTP (набор HighPrime, Воеhringer Mannheim). Этот фрагмент получают амплификацией кДНК лобной доли коры головного мозга при помощи PCR с использованием затравок PNHsp1 и PNHap1 и последующим клонированием в векторе pCR2.1-ТОРО. Этот фрагмент содержит 897 п.о. последовательности эновина до терминирующего кодона и включает непроцессированную кодирующую последовательность для зрелого белка эновина.Northern blots containing 2 μg of poly (A)-rich RNA isolated from different human tissues (Clontech Laboratories, Palo Alto, CA, USA; MTN ™ blot, MTN ™ blot II and fetal MTN ™ blot II) hybridize in in accordance with the manufacturer's instructions with an 897 bp Enovine fragment labeled with arbitrary priming of α- ³² P-dCTP (HighPrime kit, Boehringer Mannheim). This fragment is obtained by amplification of cDNA of the frontal lobe of the cerebral cortex using PCR using primers PNHsp1 and PNHap1 and subsequent cloning in the pCR2.1-TOPO vector. This fragment contains 897 bp enovin sequences to the termination codon and includes an unprocessed coding sequence for the mature enovin protein.

мРНК эновина обнаружена в виде главного транскрипта длиной около 4,5 т. п.о. (фиг.5А-С). мРНК эновина экспрессирована в ряде тканей, при этом она наиболее часто встречается в сердце, скелетных мышцах, поджелудочной железе и предстательной железе. Некоторые транскрипты меньшей длины присутствуют, например, в плаценте (4 т.п.о., 2,4 т.п.о. и 1,6 т.п.о.) и предстательной железе (4 т.п.о. и 1,6 т.п.о.). В тканях плода выраженный транскрипт длиной 2,4 т.п.о. обнаружен в печени и в меньшей степени в легком. Другие транскрипты обнаружены также в почке, печени, легком и головном мозге плода.Enovin mRNA was detected in the form of a main transcript with a length of about 4.5 bp (figa-C). Enovin mRNA is expressed in a number of tissues, and it is most often found in the heart, skeletal muscle, pancreas and prostate gland. Some shorter transcripts are present, for example, in the placenta (4 kbp, 2.4 kbp and 1.6 kbp) and the prostate gland (4 kbp) and 1.6 kbp). In the tissues of the fetus, a pronounced transcript 2.4 kb in length found in the liver and to a lesser extent in the lung. Other transcripts are also found in the kidney, liver, lung, and brain of the fetus.

Помимо основного блота РНК (Clontech Laboratories), содержащего поли(А)-богатую РНК из разных тканей человека, с зондом эновина длиной 897 п.о. гибридизовали также ткани, находящиеся в стадии развития. Образцы поли(А)-богатой РНК, использованные для получения этого блота, нормализовали до уровней экспрессии мРНК восьми разных обязательных генов, предоставленных производителем. мРНК эновина экспрессирована во всех образцах, но самые высокие уровни мРНК обнаружены в предстательной железе, гипофизе, трахее, плаценте, легком плода, поджелудочной железе и почке (фиг.5D-E).In addition to the main RNA blot (Clontech Laboratories) containing poly (A)-rich RNA from various human tissues, with an 897 bp enovine probe tissues under development also hybridized. Samples of the poly (A)-rich RNA used to make this blot were normalized to mRNA expression levels of eight different binding genes provided by the manufacturer. Enovin mRNA is expressed in all samples, but the highest mRNA levels are found in the prostate, pituitary, trachea, placenta, fetal lung, pancreas, and kidney (Fig. 5D-E).

Конструирование векторов слияния GFRα-IgG-FcConstruction of GFRα-IgG-Fc Fusion Vectors

Области кДНК рецепторов GFRα-1, GFRα-2 и GFRα-3 (кодирующих соответственно аминокислоты 27-427, 20-431 и 28-371) за исключением последовательностей, кодирующих сигнальный пептид и СООН-концевую гидрофобную область, участвующую в связывании GPI, клонируют в рамке считывания в экспрессирующем векторе Signal pIg plus (R&D Systems Europe Ltd.). Полученные белки, экспрессированные из этих конструкций, содержат NН₂-концевой сигнальный пептид CD33, состоящий из 17 аминокислот, область белка GFRα и СООН-концевой домен слияния IgG₁-Fc человека, состоящий из 243 аминокислот. Клетки яичника китайского хомячка трансфицируют слитыми конструкциями GFRα и выбирают устойчиво трансфицированные клетки, используя 500 мкг G418. Постоянные клоны выбирают при помощи антитела против Fc. Для очистки слитых белков GFRα клетки выращивают в среде без сыворотки, которую собирают через каждые 3 дня. Среду центрифугируют и вводят в колонку с белком А (белок А "сефароза", Pharmacia Biotech). Связанный белок элюируют 0,1 М Na-цитрата, рН 3,0 и собирают в 1 М трис-буфере, рН 8,4. Концентрацию белка определяют по оптической плотности при 280 нм, используя коэффициент экстинкции, равный 1,5. Три очищенных растворимых слитых белка GFRα-1 - GFRα-3 используют в последующих исследованиях связывания.The cDNA regions of the GFRα-1, GFRα-2 and GFRα-3 receptors (encoding amino acids 27-427, 20-431 and 28-371, respectively), with the exception of the sequences encoding the signal peptide and the COOH terminal hydrophobic region involved in GPI binding, are cloned reading frame in Signal pIg plus expression vector (R&D Systems Europe Ltd.). The resulting proteins expressed from these constructs contain the NH _2- terminal signal peptide CD33, consisting of 17 amino acids, the GFRα protein region and the COOH-terminal fusion domain of human IgG ₁ -Fc, consisting of 243 amino acids. Chinese hamster ovary cells are transfected with GFRα fusion constructs and stably transfected cells are selected using 500 μg G418. Permanent clones are selected using an anti-Fc antibody. To purify GFRα fusion proteins, cells are grown in serum-free medium, which is collected every 3 days. The medium is centrifuged and introduced into a protein A column (Sepharose Protein A, Pharmacia Biotech). The bound protein is eluted with 0.1 M Na-citrate, pH 3.0, and collected in 1 M Tris buffer, pH 8.4. Protein concentration is determined by optical density at 280 nm using an extinction coefficient of 1.5. Three purified soluble GFRα-1 - GFRα-3 fusion proteins are used in subsequent binding studies.

Анализ резонанса поверхностного плазмонаSurface plasmon resonance analysis

Эксперименты по исследованию резонанса поверхностного плазмона (SPR) выполняют при 25°С в аппарате BIAcore 3000. Анализы выполняют с использованием эновина и NGF в качестве иммобилизованных лигандов. Карбоксилированную матрицу сенсорного чипа F1 сначала активируют смесью 400 мМ N-этил-N-(диметиламинопропил)карбодиимида и 100 мМ N-гидроксисукцинимида с отношением 1:1 в течение 10 минут. Затем рекомбинантный эновин и NGF наносят на активированную поверхность в 10 мМ ацетатного буфера, рН 4,5, со скоростью потока 5 мкл/мин. Незанятые реакционноспособные группы инактивируют 1 М гидрохлорида этаноламина. Для выполнения экспериментов по связыванию растворимые белки GFRα1-3-Fc подвергают сверхслиянию при концентрациях 10-100 нМ в забуференном физиологическом растворе, содержащем HEPES (150 мМ NaCl, 3,5 мМ EDTA, 0,05% Р-20, 10 мМ HEPES, pH 7,4), со скоростью потока 10 мкл/мин. Ассоциацию контролируют в течение 3 минут и диссоциацию - в течение 1 минуты, после чего осуществляют регенерацию, используя 5 мМ NaOH. Диссоциацию инициируют сверхслиянием с использованием забуференного физиологического раствора, содержащего HEPES. Скорость ассоциации (k_a), скорость диссоциации (k_d) и константы равновесной диссоциации (К_D, высчитанной как k_d/k_a) высчитывают при помощи программы BIAcore, версия 3.0.Surface plasmon resonance (SPR) experiments were performed at 25 ° C. in a BIAcore 3000 apparatus. Assays were performed using enovin and NGF as immobilized ligands. The carboxylated matrix of the F1 sensor chip is first activated with a mixture of 400 mM N-ethyl-N- (dimethylaminopropyl) carbodiimide and 100 mM N-hydroxysuccinimide with a ratio of 1: 1 for 10 minutes. Recombinant enovin and NGF are then applied to the activated surface in 10 mM acetate buffer, pH 4.5, at a flow rate of 5 μl / min. Unoccupied reactive groups inactivate 1 M ethanolamine hydrochloride. To perform binding experiments, soluble GFRα1-3-Fc proteins are superfused at concentrations of 10-100 nM in buffered saline containing HEPES (150 mM NaCl, 3.5 mM EDTA, 0.05% P-20, 10 mM HEPES, pH 7.4), with a flow rate of 10 μl / min. Association is monitored for 3 minutes and dissociation for 1 minute, after which regeneration is carried out using 5 mM NaOH. Dissociation is initiated by hyperfusion using a buffered saline solution containing HEPES. Association rate (k _a ), dissociation rate (k _d ) and equilibrium dissociation constants (K _D calculated as k _d / k _a ) are calculated using the BIAcore program, version 3.0.

Результатыresults

Резонанс поверхностного плазмона (SPR) используют для измерения связывания растворимых белков GFRα-1-3 с иммобилизованным эновином. Специфическое связывание с эновином можно обнаружить только при помощи растворимого белка GFRα3. GFRα1 и GFRα2 не связываются с иммобилизованным эновином. Наблюдаемое связывание GFRα3 является специфическим, так как не обнаружено связывание с NGF. В отдельном контрольном эксперименте обнаружено специфическое связывание TrkA-Fc (рецептор NGF) с иммобилизованным NGF при отсутствии связывания с иммобилизованным эновином.Surface plasmon resonance (SPR) is used to measure the binding of soluble GFRα-1-3 proteins to immobilized enovin. Specific binding to enovin can only be detected with soluble GFRα3 protein. GFRα1 and GFRα2 do not bind to immobilized enovin. The observed binding of GFRα3 is specific since no binding to NGF has been detected. In a separate control experiment, specific binding of TrkA-Fc (NGF receptor) to immobilized NGF was detected in the absence of binding to immobilized enovin.

На основании кривых связывания, полученных с использованием трех разных концентрацией GFRα, выведены нижеследующие константы, приведенные в таблице 3. Эти результаты показывают, что GFRα3 специфически связывается с эновином.

Based on the binding curves obtained using three different concentrations of GFRα, the following constants are shown in Table 3. These results show that GFRα3 specifically binds to enovin.

Так как GDNF, NTN и PSP способствуют сохранению и выживанию разных типов нейронов, можно предположить, что эновин оказывает такое же биологическое действие на нервные клетки и, возможно, на клетки других типов. Из вышеизложенного следует, что белок эновина может быть полезен для лечения заболеваний нервной системы, включая болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, периферическую невропатию, боковой амиотрофический склероз (ALS), болезнь Хантингтона, острое поражение головного мозга, опухоли нервной системы, рассеянный склероз, травму или повреждение периферической нервной системы и поражение нейротоксинами.Since GDNF, NTN and PSP contribute to the preservation and survival of different types of neurons, it can be assumed that enovin has the same biological effect on nerve cells and, possibly, on cells of other types. From the foregoing, enovin protein may be useful in treating diseases of the nervous system, including Parkinson's disease, Alzheimer's disease, peripheral neuropathy, amyotrophic lateral sclerosis (ALS), Huntington’s disease, acute brain damage, nervous system tumors, multiple sclerosis, trauma or damage to the peripheral nervous system and neurotoxin damage.

Эновин может быть также полезен для нейрозащиты в разных ситуациях. Учитывая его влияние на выживаемость разных популяций нейронов и удлинение аксонов в рассмотренной модели клеток SHSY5Y, можно предположить, что это соединение оказывает нейрозащитное и нейродегенеративное действие.Enovin may also be useful for neuroprotection in different situations. Given its effect on the survival of different populations of neurons and axon elongation in the considered SHSY5Y cell model, we can assume that this compound has a neuroprotective and neurodegenerative effect.

Этот вывод сделан на основе следующих наблюдений. Таксол вызывает апоптоз нейронов в NGF-дифференцированных клетках феохромоцитомы крыс PC 12 (Nuydens et al., научная работа представлена). Поэтому цитотоксичность, вызываемая таксолом, характеризуется апоптозом нейронов, о чем свидетельствует фрагментация ДНК, мечение аннексином V и защита bcl-2. На этом основании можно сделать вывод о том, что таксол вызывает апоптоз в дифференцированных клетках SHSY5Y. Установлено, что эновин способен уменьшить гибель клеток и воспрепятствовать апоптозу нейронов.This conclusion is based on the following observations. Taxol induces apoptosis of neurons in NGF-differentiated rat pheochromocytoma cells PC 12 (Nuydens et al., Scientific work presented). Therefore, the cytotoxicity caused by taxol is characterized by apoptosis of neurons, as evidenced by DNA fragmentation, annexin V labeling, and bcl-2 protection. Based on this, it can be concluded that taxol induces apoptosis in differentiated SHSY5Y cells. It has been established that enovin is able to reduce cell death and inhibit apoptosis of neurons.

Поэтому это соединение является полезным при лечении нижеследующих нейродегенеративных заболеваний, в которых наблюдается апоптоз клеток; к таким заболеваниям относятся инсульт (Hakim, 1998), болезнь Паркинсона (Marsden et al., 1998), болезнь Альцгеймера (Nagy et al., 1998), болезнь Хантингтона (Wellington et al., 1997), травма нервной системы (Smirnova et al., 1998), периферическая невропатия (Srinivisan et al., 1998).Therefore, this compound is useful in the treatment of the following neurodegenerative diseases in which cell apoptosis is observed; such diseases include stroke (Hakim, 1998), Parkinson's disease (Marsden et al., 1998), Alzheimer's disease (Nagy et al., 1998), Huntington's disease (Wellington et al., 1997), trauma to the nervous system (Smirnova et al., 1998), peripheral neuropathy (Srinivisan et al., 1998).

В качестве примера последнего клинического показания авторы этого изобретения установили, что этот нейротрофический фактор фактически защищает дифференцированные клетки SHSY5Y нейробластомы человека от токсического поражения клеток, вызванного таксолом.As an example of a recent clinical indication, the authors of this invention found that this neurotrophic factor actually protects the differentiated human SHSY5Y cells of a neuroblastoma from toxic cell damage caused by taxol.

Методика измерения жизнеспособностиViability Measurement Procedure

Жизнеспособность клеток определяют, добавляя в каждую лунку 100 мкл раствора (1 мг/мл) 2,3-бис[2-метокси-4-нитро-5-сульфофенил]-2Н-тетразолий-5-карбоксанилида (ХТТ, Sigma) в DMEM (37°С), содержащем 0,02 мМ метосульфата феназина (PMS, Sigma). Планшеты инкубируют при 37°С в течение 2,5 часов. Оптические плотности измеряют (молекулярными устройствами) при 450 нм, используя в качестве эталона оптическую плотность при 650 нм. Этот анализ с использованием ХТТ основан на превращении соли тетразолия ХТТ в продукт формазана красного цвета. Эту реакцию выполняют, используя митохондриальные ферменты.Cell viability is determined by adding to each well 100 μl of a solution (1 mg / ml) of 2,3-bis [2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl] -2H-tetrazolium-5-carboxanilide (XTT, Sigma) in DMEM (37 ° C) containing 0.02 mm phenazine methosulfate (PMS, Sigma). The plates are incubated at 37 ° C for 2.5 hours. Optical densities are measured (by molecular devices) at 450 nm using optical density at 650 nm as a reference. This XTT assay is based on the conversion of the XTT tetrazolium salt to a red formazan product. This reaction is performed using mitochondrial enzymes.

Методика дифференциации нейроновMethod of differentiation of neurons

1. Дифференциация клеток SHSY5Y нейробластомы человека1. Differentiation of human SHSY5Y neuroblastoma cells

Клетки SHSY5Y дифференцируют в течение 5 дней при помощи 25 нМ стауроспорина. Влияние эновина измеряют через 72 часа после начала эксперимента (см. Jalava et al., "Protein Kinase inhibitor staurosporine induces a nature neuronal phenotype in SHSY5Y human neuroblastoma cells through an a,b,z PKC independent pathway" Journ. cell Physiol. 155, 301-312 (1993)).SHSY5Y cells are differentiated for 5 days with 25 nM staurosporin. Enovin effect is measured 72 hours after the start of the experiment (see Jalava et al., "Protein Kinase inhibitor staurosporine induces a nature neuronal phenotype in SHSY5Y human neuroblastoma cells through an a, b, z PKC independent pathway" Journ. Cell Physiol. 155, 301-312 (1993)).

2. Измерение удлинения аксонов2. Measurement of axon elongation

Морфологические изменения нейронов определяют автоматически в количественном отношении следующим образом. Коротко этот метод можно описать так: в соответствующие периоды времени в среду добавляют глутаральдегид и оставляют на 30 минут при комнатной температуре. Это гарантирует, что морфология клеток в данный момент времени отражает действительное состояние. Клетки исследуют в режиме проходящего света под микроскопом Axiovert (Zeiss Oberkochen, Германия), оснащенным устройством сканирования Marzhauser, приводимым в действие рабочей станцией Indy (Silicon Graphics, Mountain View, США). Изображения фотографируются видеокамерой МХ5 (HCS). Было изучено 3000 клеток на 64 совмещенных изображениях, образующих квадратную матрицу изображений 8х8. Точное совмещение изображений гарантирует возможность наблюдать аксоны на следующих друг за другом изображениях. Автоматическое обнаружение удлинений аксонов, меченных поликлональным tau-антителом, выполняют, используя несмещаемый детектор криволинейных структур (Steger, 1998). Программа анализа автоматически высчитывает общую площадь клеточного тела, количество клеточных тел и общую длину аксона.Morphological changes in neurons are automatically quantified as follows. Briefly, this method can be described as follows: at appropriate times, glutaraldehyde is added to the medium and left at room temperature for 30 minutes. This ensures that the cell morphology at a given time reflects the actual state. Cells are examined in transmitted light under an Axiovert microscope (Zeiss Oberkochen, Germany) equipped with a Marzhauser scanning device powered by an Indy workstation (Silicon Graphics, Mountain View, USA). Images are photographed with an MX5 video camera (HCS). 3000 cells were studied on 64 combined images forming a square 8x8 image matrix. Exact image alignment ensures that axons can be observed in successive images. Automatic detection of axon elongations labeled with a polyclonal tau antibody is performed using an immovable detector of curvilinear structures (Steger, 1998). The analysis program automatically calculates the total area of the cell body, the number of cell bodies and the total length of the axon.

Для исследования влияния эновина на другие типы клеток было выполнено два анализа, в частности анализ синтеза ДНК и анализ хемотаксиса.To analyze the effect of enovin on other types of cells, two analyzes were performed, in particular, DNA synthesis analysis and chemotaxis analysis.

Анализ синтеза ДНКDNA synthesis analysis

Клетки, включающие фибробласты кожи человека (39SK), эндотелиальные клетки пупочной вены человека (HUVEC), клетки гладкой мышцы человека (HSMC), хондроциты человека и остеобласты крыс, выдерживают в среде DMEM, содержащей 10% FBS (39-SK, HSMC, остеобласты крыс), или в среде определенного состава (хондроциты и HUVEC) при 37°С в атмосфере с 5% СО₂ и 95% воздуха. Для анализа синтеза ДНК клетки высевают в 96-луночный планшет для культуры ткани с плотностью 5000 клеток/лунку в среде DMEM, содержащей 10% FBS, и инкубируют в течение 24 часов. Затем эту культуральную среду заменяют средой DMEM, содержащей разные концентрации эновина и 0,1% BSA (для 39-SK, остеобластов, HSMC, хондроцитов), или средой DMEM, содержащей разные концентрации эновина и 0,5% FBS (для HUVEC), и инкубируют клетки в течение 24 часов. Затем эту культуральную среду заменяют 100 мкл среды DMEM, содержащей 5% FBS и 0,1 мкCi [³H]-тимидина. Через 2 часа импульсного мечения клетки фиксируют метанолом/уксусной кислотой (3:1, в объемном отношении) в течение 1 часа при комнатной температуре. Фиксированные клетки дважды промывают 80% метанолом. Клетки солюбилизируют в 0,05% трипсина (100 мкл/лунку) в течение 30 минут и затем в 0,5% SDS (100 мкл/лунку) еще в течение 30 минут. Аликвоты клеточных лизатов (180 мкл) смешивают с 2 мл коктейля для сцинтилляционного счета и измеряют радиоактивность клеточных лизатов при помощи сцинтилляционного счетчика (Wallac 1409).Cells including human skin fibroblasts (39SK), human umbilical vein endothelial cells (HUVEC), human smooth muscle cells (HSMC), human chondrocytes and rat osteoblasts are incubated in DMEM containing 10% FBS (39-SK, HSMC, osteoblasts rats), or in an environment of a certain composition (chondrocytes and HUVEC) at 37 ° C in an atmosphere with 5% CO ₂ and 95% air. For analysis of DNA synthesis, cells are seeded in a 96-well tissue culture plate with a density of 5000 cells / well in DMEM medium containing 10% FBS and incubated for 24 hours. Then this culture medium is replaced with DMEM medium containing different concentrations of enovin and 0.1% BSA (for 39-SK, osteoblasts, HSMC, chondrocytes), or DMEM medium containing different concentrations of enovin and 0.5% FBS (for HUVEC), and cells are incubated for 24 hours. Then, this culture medium is replaced with 100 μl of DMEM medium containing 5% FBS and 0.1 μCi [ ³ H] -thymidine. After 2 hours of pulsed labeling, the cells were fixed with methanol / acetic acid (3: 1, volume ratio) for 1 hour at room temperature. Fixed cells are washed twice with 80% methanol. Cells are solubilized in 0.05% trypsin (100 μl / well) for 30 minutes and then in 0.5% SDS (100 μl / well) for another 30 minutes. Aliquots of cell lysates (180 μl) were mixed with 2 ml of scintillation cocktail and the radioactivity of cell lysates was measured using a scintillation counter (Wallac 1409).

Анализ хемотаксисаChemotaxis analysis

Клетки выдерживают так, как описано в разделе "Анализ синтеза ДНК". Хемотактическую активность эновина анализируют, используя 12-луночную камеру Бойдена (McQuillan, D.J., Handley, C.J., Campbell, M.A., Bolis, S., Milway, V.E., Herington, A.C., (1986), "Stimulation of Proteoglycan biosynthesis by serum and insulin-like growth factor-I in cultured bovine articular cartilage", Biochem. J. 240:423-430). Клетки обрабатывают 0,05% трипсина и 0,5 мМ EDTA и повторно суспендируют в DMEM. В нижние лунки камеры Бойдена добавляют аликвоты 150 мкл среды, содержащей разные концентрации эновина. Поликарбонатную мембрану (8 мкм), покрытую 0,1 мг/мл коллагена типа I, вводят сверху нижних лунок и производят подготовку верхних лунок. В верхние лунки добавляют аликвоты 100 мкл клеток (70000 клеток/мл). Клетки инкубируют в течение 6 часов, после чего аппарат разбирают. Клетки, оставшиеся на верхней стороне мембраны, удаляют. Мембрану фиксируют 10% формальдегидом в течение 15 минут и окрашивают гемотоксилином с интенсивностью по Гиллу. Клетки считают под микроскопом (250-кратное увеличение) и используют среднее значение подсчетов клеток с пяти участков каждой лунки. Каждый эксперимент повторяют по крайней мере четыре раза. Результаты выражены в виде числа, кратного контрольному образцу (среда DMEM, содержащая 0,1% BSA).Cells are incubated as described in the "DNA Synthesis Analysis" section. Enovin chemotactic activity was analyzed using a 12-well Boyden chamber (McQuillan, DJ, Handley, CJ, Campbell, MA, Bolis, S., Milway, VE, Herington, AC, (1986), "Stimulation of Proteoglycan biosynthesis by serum and insulin -like growth factor-I in cultured bovine articular cartilage ", Biochem. J. 240: 423-430). Cells were treated with 0.05% trypsin and 0.5 mM EDTA and resuspended in DMEM. Aliquots of 150 μl of medium containing various concentrations of enovin are added to the lower wells of the Boyden chamber. A polycarbonate membrane (8 μm) coated with 0.1 mg / ml type I collagen is introduced from above the lower wells and the upper wells are prepared. Aliquots of 100 μl of cells (70,000 cells / ml) are added to the upper wells. Cells are incubated for 6 hours, after which the apparatus is disassembled. Cells remaining on the upper side of the membrane are removed. The membrane is fixed with 10% formaldehyde for 15 minutes and stained with hematoxylin with Gill intensity. Cells are counted under a microscope (250x magnification) and the average of cell counts from five sections of each well is used. Each experiment is repeated at least four times. The results are expressed as a multiple of a control sample (DMEM medium containing 0.1% BSA).

Как показано на фиг.8-18, эновин не влияет на пролиферацию всех использованных типов клеток и на миграцию клеток HUVEC (фиг.14), как указано выше. При этом эновин влияет на клетки нейробластомы SHSY5Y. Это свидетельствует об избирательном воздействии эновина на нейроны.As shown in FIGS. 8-18, enovin does not affect the proliferation of all cell types used and the migration of HUVEC cells (FIG. 14), as described above. In this case, enovin affects SHSY5Y neuroblastoma cells. This indicates the selective effect of enovin on neurons.

Установлено, что GDNF и NTN передают сигнал через сигнальный комплекс, содержащий лигандсвязывающую субъединицу GFRα-1 или GFRα-2 и сигнальную субъединицу, такую как тирозинкиназа белка cRET. Предполагается, что эновин оказывает биологическое действие через подобный сигнальный комплекс, включающий GFRα-связывающий партнер (GFRα-1, GFRα-2, недавно исследованный рецептор GFRα-3 или другие еще не исследованные члены семейства GFRα) в сочетании с cRET или другой сигнальный партнер. Действительно, данные связывания, полученные авторами этого изобретения, показывают, что эновин может специфически связываться с GFRα-3.It has been found that GDNF and NTN transmit a signal through a signal complex containing a ligand-binding subunit of GFRα-1 or GFRα-2 and a signal subunit, such as tyrosine kinase of cRET protein. Enovin is thought to exert a biological effect through a similar signal complex, including a GFRα-binding partner (GFRα-1, GFRα-2, the recently studied GFRα-3 receptor, or other members of the GFRα family not yet explored) in combination with cRET or another signal partner. Indeed, the binding data obtained by the authors of this invention show that enovin can specifically bind to GFRα-3.

У человека мутации линии патогенных микроорганизмов в GDNF или cRET могут привести к возникновению нескольких фенотипов заболеваний, включая множественную неоплазию эндокринной системы и врожденную болезнь Гиршспрунга (HSCR) (Romeo et al., 1994, Edery et al., 1994, Angrist et al., 1996). Оба заболевания обусловлены плохой перистальтикой кишечника, причем болезнь Гиршспрунга является наиболее распространенной причиной врожденного стеноза кишечника у детей младшего возраста. Интересно отметить, что у мышей, которым вводили GDNF и cRET, наблюдаются аналогичные патологии, сопровождающиеся почечной недостаточностью и ганглионозом кишечника (Sanchez et al., 1996; Moore et al., 1996; Pichel et al., 1996). Эновин может иметь отношение к аналогичным заболеваниям кишечника или почек, и, поскольку эновин экспрессирован в разных тканях, он может иметь важное значение для развития других периферических органов в организме.In humans, mutations in the line of pathogens in GDNF or cRET can lead to several disease phenotypes, including multiple endocrine neoplasia and congenital Hirschsprung disease (HSCR) (Romeo et al., 1994, Edery et al., 1994, Angrist et al., 1996). Both diseases are caused by poor intestinal motility, with Hirschsprung's disease being the most common cause of congenital bowel stenosis in young children. It is interesting to note that in mice that were injected with GDNF and cRET, similar pathologies were observed, accompanied by renal failure and intestinal ganglionosis (Sanchez et al., 1996; Moore et al., 1996; Pichel et al., 1996). Enovin may be related to similar diseases of the intestines or kidneys, and since enovin is expressed in different tissues, it can be important for the development of other peripheral organs in the body.

Взаимодействие лигандов с их рецепторами обычно достигается в результате установления специфических связей между конкретными остатками в обоих белках. Фрагменты белка могут служить в качестве агонистов, активирующих рецептор, в результате чего он стимулирует рост и выживаемость клеток. Поэтому части эновина или синтетические пептиды на основе белковой последовательности эновина могут быть полезными агонистами или антагонистами, регулирующими активность рецептора GFRα3. При помощи пептидного синтеза или метода рекомбинантных ДНК можно продуцировать гибридные факторы роста, состоящие из частей GDNF, NTN, PSP или любого другого нейротрофического фактора или фактора роста с частями эновина, которые позволяют получить новый синтетический фактор роста с новыми свойствами.The interaction of ligands with their receptors is usually achieved by establishing specific bonds between specific residues in both proteins. Protein fragments can serve as receptor activating agonists, as a result of which it stimulates cell growth and survival. Therefore, portions of enovin or synthetic peptides based on the enovin protein sequence can be useful agonists or antagonists that regulate GFRα3 receptor activity. Using peptide synthesis or a recombinant DNA method, hybrid growth factors can be produced consisting of parts of GDNF, NTN, PSP or any other neurotrophic factor or growth factor with parts of enovin, which allows to obtain a new synthetic growth factor with new properties.

Были выполнены два предварительных испытания для исследования способности эновина изменять обусловленный таксолом дефицит сенсорных нейронов у крыс после инъекций в подошву лап. В первом эксперименте исследовали, может ли однократное введение эновина устранить обусловленный таксолом дефицит сенсорных нейронов, и во втором эксперименте исследовали, может ли эновин предотвратить развитие обусловленного таксолом дефицита.Two preliminary trials were performed to investigate Enovin's ability to alter taxol-induced deficiency of sensory neurons in rats after injection into the sole of the paws. In the first experiment, it was investigated whether a single administration of enovin could eliminate taxol-induced deficiency of sensory neurons, and in a second experiment, it was examined whether enovin could prevent the development of taxol-related deficiency.

Восстановление обусловленной таксолом дисфункции сенсорных нейроновTaxol Recovery of Sensory Neuron Dysfunction

МетодикаMethodology

В этом эксперименте использовали самцов крыс Sprague-Dawley массой 300-340 граммов. Животных помещали в отдельные клетки, где они получали неограниченное количество пищи и воды. Перед началом эксперимента животных помещали в стандартные клетки для наблюдения и после периода адаптации, равного 15 минутам, определяли рефлекс на иглоукалывание. Для этого подошву правой лапы животного раздражали иглой и оценивали реактивность на иглоукалывание следующим образом: наличие реактивности (оценка=1) или отсутствие реактивности (оценка=0). В ходе эксперимента эту процедуру повторяли трижды с промежутками в 1 минуту между двумя последовательными раздражениями; таким образом, испытание на иглоукалывание состояло из 3 измерений реактивности в ответ на укол иглой. В эксперименте использовали только тех крыс, у которых наблюдалась нормальная реакции на 3 иглоукалывания.In this experiment, male Sprague-Dawley rats weighing 300-340 grams were used. Animals were placed in separate cages, where they received an unlimited amount of food and water. Before the experiment, the animals were placed in standard cages for observation and after an adaptation period of 15 minutes, the acupuncture reflex was determined. For this, the sole of the animal's right paw was irritated with a needle and the reactivity to acupuncture was evaluated as follows: the presence of reactivity (score = 1) or the absence of reactivity (score = 0). During the experiment, this procedure was repeated three times at intervals of 1 minute between two consecutive irritations; thus, the acupuncture test consisted of 3 measurements of reactivity in response to a needle prick. In the experiment, only those rats were used in which a normal reaction to 3 acupuncture was observed.

Утром в течение трех последующих дней животным ежедневно инъецировали в подошву правой задней лапы 50 мкл таксола (3 мг/мл паклитаксела, растворенного в кремофоре и дегидратированном спирте с водой). На следующее утро производили повторную проверку рефлекса на иглоукалывание и отбирали животных, у которых отсутствовала реактивность на 3 раздражения. Этих животных произвольно делили на подгруппы (n=10/группу), в каждой из которых животным инъецировали в подошву правой задней лапы 75 мкл наполнителя, физиологического раствора либо 23 или 130 мкг/мл эновина. Поскольку не наблюдалось никаких различий между результатами при введении животным наполнителя и физиологического раствора, обе группы были объединены в одну (контрольная группа). На 1, 4, 5 и 7-й день после последней инъекции испытание на иглоукалывание выполняли утром (между 8:00 и 9:00 часами) и вечером (между 15:30 и 16:30 часами). На 8-й день утром выполняли последнее испытание на иглоукалывание. Для каждого животного определяли совокупную оценку, полученную в зависимости от реакции на иглоукалывание на протяжении всего эксперимента. Так как в общей сложности было выполнено 9 испытаний на иглоукалывание (каждое из которых состояло из 3 иглоукалываний) после последнего введения лекарственного средства, то максимальная оценка, которую можно было получить за все время эксперимента, равнялась 27.In the morning for the next three days, the animals were daily injected into the sole of the right hind paw 50 μl of Taxol (3 mg / ml paclitaxel dissolved in cremophor and dehydrated alcohol with water). The next morning, the acupuncture reflex was checked again and animals that were not reactive to 3 irritations were selected. These animals were randomly divided into subgroups (n = 10 / group), in each of which 75 μl of filler, saline or 23 or 130 μg / ml of enovin was injected into the sole of the right hind paw. Since there were no differences between the results when the animal was injected with a filler and physiological saline, both groups were combined into one (control group). On the 1st, 4th, 5th and 7th day after the last injection, an acupuncture test was performed in the morning (between 8:00 and 9:00 hours) and in the evening (between 15:30 and 16:30 hours). On the 8th day in the morning, the last acupuncture test was performed. For each animal, the cumulative score was determined based on the response to acupuncture throughout the experiment. Since a total of 9 acupuncture tests were performed (each of which consisted of 3 acupuncture) after the last injection of the drug, the maximum score that could be obtained for the entire duration of the experiment was 27.

Результатыresults

Повторное инъецирование таксола в подошву в течение 3 последовательных дней вызывает острую воспалительную реакцию и отсутствие реакции на раздражение иглоукалыванием у большинства животных. Инъецирование в подошву физиологического раствора или наполнителя не влияет на обусловленный таксолом дефицит нейронов. Во время первого измерения только у 4 из 20 контрольных животных наблюдалась по крайней мере 1 реакция на три иглоукалывания, и средняя оценка (±стандартная ошибка средней) у контрольных животных во время первого измерения равнялась 0,25 (±0,12); этот показатель отличается от оценки, полученной в начале эксперимента, когда средняя оценка была равна 3,0 (±0,0), так как все животные реагировали на иглоукалывание. После выполнения измерений в течение 8 дней реактивность у контрольных животных была нарушена в такой степени, что лишь 11 из 20 крыс по крайней мере один раз реагировали на укол иглой, при этом средняя оценка иглоукалывания была равна 0,75 (±0,18). В этой контрольной группе у всех крыс отсутствовала нормальная реактивность на все 3 раздражения. Совокупная оценка иглоукалывания у контрольных животных за все время эксперимента представлена на фиг.19. Так как животных испытывали 9 раз на протяжении 8 дней, то максимальная оценка, которая могла быть получена при выполнении 3 иглоукалываний в каждом испытании, равнялась 27. Как показано на графике, инъецирование физиологического раствора или наполнителя в подошву не вызывало восстановления обусловленного таксолом дефицита нейронов на протяжении всего времени эксперимента. Средняя совокупная оценка контрольных животных в конце эксперимента была равна 5,10 (±0,87); что составляет 18,9% от максимальной оценки, которая могла быть получена.Repeated injection of taxol in the sole for 3 consecutive days causes an acute inflammatory reaction and a lack of response to irritation by acupuncture in most animals. Injection of saline or excipient into the sole does not affect taxol-induced neuronal deficiency. During the first measurement, only 4 out of 20 control animals showed at least 1 response to three acupuncture, and the average score (± standard error of the mean) in the control animals during the first measurement was 0.25 (± 0.12); this indicator differs from the estimate obtained at the beginning of the experiment, when the average score was 3.0 (± 0.0), since all animals responded to acupuncture. After taking measurements for 8 days, the reactivity in the control animals was disturbed to such an extent that only 11 out of 20 rats reacted to a needle injection at least once, with an average acupuncture score of 0.75 (± 0.18). In this control group, all rats lacked normal reactivity to all 3 irritations. The total score of acupuncture in control animals for the entire experiment is presented in Fig.19. Since the animals were tested 9 times over 8 days, the maximum score that could be obtained by performing 3 acupuncture in each trial was 27. As shown in the graph, injection of saline or filler into the sole did not cause restoration of taxon-induced neuron deficiency by throughout the entire experiment. The average total score of control animals at the end of the experiment was 5.10 (± 0.87); which is 18.9% of the maximum score that could be obtained.

В результате однократного инъецирования в подошву 75 мкл раствора, содержащего 23 мкг/мл эновина, после первого измерения было установлено, что у 4 из 10 крыс наблюдается по крайней мере одна реакция, при этом средняя оценка иглоукалывания составила 0,70 (±0,33). На 8-й день все 10 животных по крайней мере один раз реагировали на иглоукалывание, и нормальная реактивность наблюдалась у 5 из 10 крыс. Средняя оценка иглоукалывания в этой группе на 8-й день была равна 2,20 (±0,29). По сравнению с контрольными животными средняя совокупная оценка в конце восьмидневного периода измерения значительно увеличилась (U-критерий Манна-Витнея, двусторонний критерий, р<0,01), при этом средняя оценка иглоукалывания была равна 14,50 (±1,96) (фиг.19). Это составляет 53,7% от максимальной оценки.As a result of a single injection of 75 μl of a solution containing 23 μg / ml Enovin into the sole, after the first measurement, it was found that 4 out of 10 rats showed at least one reaction, with an average acupuncture score of 0.70 (± 0.33 ) On day 8, all 10 animals reacted to acupuncture at least once, and normal reactivity was observed in 5 out of 10 rats. The average score for acupuncture in this group on day 8 was 2.20 (± 0.29). Compared to control animals, the average cumulative score at the end of the eight-day measurement period increased significantly (Mann-Witney U-test, bilateral test, p <0.01), while the average acupuncture score was 14.50 (± 1.96) ( Fig. 19). This is 53.7% of the maximum score.

При инъецировании в подошву 130 мкг/мл эновина также были получены лучшие результаты по сравнению с контрольными животными. Во время первого измерения после введения 130 мкг/мл эновина у 6 из 10 крыс наблюдалась по крайней мере одна реакция, и средняя оценка иглоукалывания равнялась 1,10 (±0,35). На 8-й день все 10 животных реагировали по крайней мере на один угол иглой, при этом средняя оценка была равна 2,60 (±0,22). Нормальная реактивность на 3 иглоукалывания наблюдалась у 8 из 10 крыс. Средняя совокупная общая оценка иглоукалывания в конце эксперимента в этой группе равнялась 17,20 (±1,94). Это составляет 63,7% от общей возможной оценки и представляет собой значительное улучшение по сравнению с контрольной группой (р<0,01).When injecting 130 μg / ml of enovin into the sole, better results were obtained compared to control animals. During the first measurement after administration of 130 μg / ml enovin, at least one reaction was observed in 6 out of 10 rats, and the average acupuncture score was 1.10 (± 0.35). On day 8, all 10 animals responded to at least one corner with a needle, with an average score of 2.60 (± 0.22). Normal reactivity to 3 acupuncture was observed in 8 out of 10 rats. The average total total acupuncture score at the end of the experiment in this group was 17.20 (± 1.94). This represents 63.7% of the total possible score and represents a significant improvement compared with the control group (p <0.01).

Профилактика возникновения обусловленной таксолом дисфункции сенсорных нейроновPrevention of Taxol-Induced Sensory Neuron Dysfunction

МетодикаMethodology

В этом эксперименте использовали самцов крыс Sprague-Dawley массой 300-340 граммов. Животных помещали в отдельные клетки, где они получали неограниченное количество пищи и воды. Перед началом эксперимента животных помещали в стандартные клетки для наблюдения и после периода адаптации, равного 15 минутам, определяли рефлекс на иглоукалывание. Для этого подошву правой лапы животного раздражали иглой и оценивали реактивность на иглоукалывание следующим образом: наличие реактивности (оценка=1) или отсутствие реактивности (оценка=0). В ходе эксперимента эту процедуру повторяли трижды с промежутками в 1 минуту между двумя последовательными раздражениями; это испытание на иглоукалывание состояло из 3 измерений реактивности в ответ на угол иглой. В эксперименте использовали только тех крыс, у которых наблюдалась нормальная реакции на 3 укола иглой (оценка иглоукалывания=3). После выполнения этого контрольного измерения животных произвольно делили на подгруппы (n=10/группу), в каждой из которых животным инъецировали в подошву правой задней лапы 75 мкл наполнителя, физиологического раствора либо 23 или 130 мкг/мл эновина. Поскольку не наблюдалось никаких различий между результатами при введении животным наполнителя и физиологического раствора, обе группы были объединены в одну (контрольная группа). В течение трех последующих дней животным ежедневно инъецировали в подошву правой задней лапы 50 мкл таксола (3 мг/мл паклитаксела, растворенного в кремофоре и дегидратированном спирте с водой). На 1, 4, 5 и 7-й день после инъекции таксола испытание на иглоукалывание выполняли утром (между 8:00 и 9:00 часами) и вечером (между 15:30 и 16:30 часами). На 8-й день утром выполняли последнее испытание на иглоукалывание. Для каждого животного определяли совокупную оценку, полученную в зависимости от реакции на иглоукалывание на протяжении всего эксперимента. Так как в общей сложности было выполнено 9 испытаний на иглоукалывание (каждое из которых состояло из 3 иглоукалываний) после введения таксола, то максимальная оценка, которую можно было получить за все время эксперимента, равнялась 27.In this experiment, male Sprague-Dawley rats weighing 300-340 grams were used. Animals were placed in separate cages, where they received an unlimited amount of food and water. Before the experiment, the animals were placed in standard cages for observation and after an adaptation period of 15 minutes, the acupuncture reflex was determined. For this, the sole of the animal's right paw was irritated with a needle and the reactivity to acupuncture was evaluated as follows: the presence of reactivity (score = 1) or the absence of reactivity (score = 0). During the experiment, this procedure was repeated three times at intervals of 1 minute between two consecutive irritations; this acupuncture test consisted of 3 measurements of reactivity in response to the angle of the needle. In the experiment, we used only those rats in which there was a normal reaction to 3 needle injections (acupuncture score = 3). After this control measurement, the animals were randomly divided into subgroups (n = 10 / group), in each of which 75 μl of excipient, saline or 23 or 130 μg / ml of enovin was injected into the sole of the right hind paw. Since there were no differences between the results when the animal was injected with a filler and physiological saline, both groups were combined into one (control group). Over the next three days, the animals were injected daily into the sole of the right hind paw 50 μl of Taxol (3 mg / ml paclitaxel dissolved in cremophor and dehydrated alcohol with water). On days 1, 4, 5, and 7 after taxol injection, an acupuncture test was performed in the morning (between 8:00 and 9:00 hours) and in the evening (between 15:30 and 16:30 hours). On the 8th day in the morning, the last acupuncture test was performed. For each animal, the cumulative score was determined based on the response to acupuncture throughout the experiment. Since a total of 9 acupuncture tests were performed (each of which consisted of 3 acupuncture) after the introduction of taxol, the maximum score that could be obtained for the entire duration of the experiment was 27.

Результатыresults

Инъецирование в подошву физиологического раствора или наполнителя не влияет на обусловленный таксолом дефицит нейронов при испытании на иглоукалывание. Во время первого испытания после введения таксола 8 из 20 крыс по крайней мере один раз реагировали на иглоукалывание, при этом средняя оценка иглоукалывания равналась 0,60 (±0,18). На 8-й день все еще имел место обусловленный таксолом дефицит нейронов, при этом реакция наблюдалась только у 8 из 20 животных, и средняя оценка составила 0,8 (±0,25). У двух животных имел место нормальный рефлекс на иглоукалывание. В конце экспермента совокупная оценка иглоукалывания уменьшилась, и средняя оценка была равна 6,55 (±1,08), что составляет 24,3% от максимальной оценки (фиг.20).Injection into the sole of saline or excipient does not affect taxol-induced neuronal deficiency in an acupuncture test. During the first test after administration of Taxol, 8 out of 20 rats reacted to acupuncture at least once, with an average acupuncture score of 0.60 (± 0.18). On day 8, taxol-induced neuronal deficiency still occurred, with only 8 out of 20 animals responding, and the average score was 0.8 (± 0.25). Two animals had a normal acupuncture reflex. At the end of the experiment, the total score of acupuncture decreased, and the average score was 6.55 (± 1.08), which is 24.3% of the maximum score (Fig. 20).

Предварительное инъецирование 23 мкг/мл эновина уменьшает обусловленный таксолом дефицит нейронов при испытании на иглоукалывание. В 1-й день 8 из 10 животных реагировали по крайней мере один раз, при этом средняя оценка иглоукалывания равнялась 1,70 (±0,40). На 8-й день реакция наблюдалась у всех животных, и средняя оценка составила 2,50 (±0,27). У 7 животных была обнаружена нормальная реактивность на все раздражения иглоукалыванием. Что касается совокупной реакции на протяжении всего эксперимента (фиг.20), то средняя общая оценка значительно улучшилась (р<0,01) по сравнению с контрольной группой и была равна 18,40 (±1,73); это составляет 68,1% от максимального значения.Pre-injection of 23 μg / ml enovin reduces taxol-induced neuronal deficiency in an acupuncture test. On day 1, 8 out of 10 animals reacted at least once, with an average acupuncture score of 1.70 (± 0.40). On day 8, a reaction was observed in all animals, and the average score was 2.50 (± 0.27). In 7 animals, normal reactivity to all irritations with acupuncture was detected. As for the total reaction throughout the experiment (Fig. 20), the average overall score improved significantly (p <0.01) compared with the control group and was equal to 18.40 (± 1.73); this is 68.1% of the maximum value.

Сравнимые результаты были получены после предварительного инъецирования 130 мкг/мл эновина. В данном случае у 6 из 10 животных наблюдалась реакция во время первого испытания, при этом средняя оценка иглоукалывания равнялась 1,70 (+0,31). На 8-й день все животные по крайней мере один раз реагировали на раздражение иглоукалыванием, при этом средняя оценка была равна 2,40 (+0,22), и все три реакции были нормальными у половины животных. Что касается совокупной оценки, то средняя оценка, полученная на 8-й день, равнялась 17,70 (±1,92), что составляет 65,5% от общей оценки.Comparable results were obtained after preliminary injection of 130 μg / ml enovin. In this case, 6 out of 10 animals experienced a reaction during the first test, with an average acupuncture score of 1.70 (+0.31). On day 8, all animals at least once responded to acupuncture irritation, with an average score of 2.40 (+0.22), and all three reactions were normal in half of the animals. As for the aggregate assessment, the average estimate obtained on the 8th day was 17.70 (± 1.92), which is 65.5% of the total assessment.

Данная серия экспериментов показывает, что даже одна инъекция эновина в подошву может уменьшить обусловленный таксолом дефицит сенсорных нейронов, о чем свидетельствуют результаты испытания на иглоукалывание. Улучшение наблюдается при инъецировании лекарственного средства как до, так и после введения таксола.This series of experiments shows that even a single injection of enovin into the sole can reduce the deficit of sensory neurons caused by taxol, as evidenced by the results of the acupuncture test. Improvement is observed when injecting the drug, both before and after the introduction of taxol.

Эновин является приемлемым лекарственным средством для лечения болевых синдромов, обусловленных главным образом нейрогенными нарушениями периферической и центральной нервной системы, ревматических/воспалительных заболеваний, а также нарушений проводимости и может модулировать процессы, протекающие в сенсорных нейронах, в случае чрескожного, местного, центрального (такого как эпидуральное, внутриоболочечное и тому подобное) и системного применения.Enovin is an acceptable drug for the treatment of pain syndromes, caused mainly by neurogenic disorders of the peripheral and central nervous system, rheumatic / inflammatory diseases, as well as conduction disorders, and can modulate the processes occurring in sensory neurons in the case of percutaneous, local, central (such as epidural, intracranial, and the like) and systemic use.

Кроме того, эновин можно использовать в качестве диагностического средства для исследования физиопатологических изменений в вышеуказанной области.In addition, enovin can be used as a diagnostic tool for studying physiopathological changes in the above area.

Сравнение экспрессии мРНК эновина в здоровых и пораженных болезнью тканяхComparison of Enovin mRNA expression in healthy and diseased tissues

Экспрессию мРНК эновина анализируют в количественном отношении при помощи системы обнаружения последовательностей ABI Prism 7700 (TaqMan; Perkin Elmer) в соответствии с патентованным методом, разработанным и осуществляемым фирмой Pharmagene Laboratories Ltd., Royston, Соединенное Королевство Великобритании. В этой системе использован флуорогенный зонд, генерирующий специфические для последовательности флуоресцентные сигналы во время PCR. Этот зонд представляет собой олигонуклеотид с флуоресцентным репортером, на который нанесены гасящие флуоресценцию красители, и расположен между верхней и нижней затравками для PCR. В интактном состоянии интенсивность флуоресценции репортера подавляется гасителем флуоресценции. Как только зонд становится частью реплицирующего комплекса, флуоресцентный репортер отщепляется от гасителя 5'- и 3'-концевой экзонуклеазой, имеющейся в Taq-полимеразе. Усиление сигнала флуоресцентного репортера в реакционной смеси является прямым свидетельством накопления продукта PCR. Исходное число копий последовательности-мишени мРНК (Cn) устанавливают, определяя количество циклов фракционирования PCR (Ct), когда впервые обнаруживают продукт PCR, то есть точку, в которой флуоресцентный сигнал превышает пороговое значение. Количественное определение содержания мРНК-мишени в каждом образце производят путем сравнения экспериментальных значений Ct со стандартной кривой.Enovin mRNA expression was quantified using an ABI Prism 7700 sequence detection system (TaqMan; Perkin Elmer) according to a proprietary method developed and implemented by Pharmagene Laboratories Ltd., Royston, United Kingdom of Great Britain. This system uses a fluorogenic probe that generates sequence-specific fluorescent signals during PCR. This probe is an oligonucleotide with a fluorescent reporter, which is applied extinguishing fluorescence dyes, and is located between the upper and lower primers for PCR. In an intact state, the reporter fluorescence intensity is suppressed by the fluorescence quencher. Once the probe becomes part of the replicating complex, the fluorescent reporter is cleaved from the quencher by the 5'- and 3'-terminal exonuclease present in Taq polymerase. The amplification of the fluorescent reporter signal in the reaction mixture is direct evidence of the accumulation of the PCR product. The initial number of copies of the mRNA target sequence (Cn) is determined by determining the number of PCR fractionation cycles (Ct) when the PCR product is first detected, that is, the point at which the fluorescent signal exceeds a threshold value. Quantification of the target mRNA content in each sample is performed by comparing the experimental Ct values with a standard curve.

Получение РНК и контроль качестваRNA production and quality control

Непроцессированную РНК выделяют из целой и иссеченной ткани, используя реагент Tri-Zol (Life Technologies, Gaithersburg, MD, США) в соответствии с указаниями поставщика. Контроль качества для всех образцов РНК включает оценку целостности (интактная 18S и 28S рибосомная РНК) и определение наличия транскриптов с высоким содержанием (актин) и низким содержанием (рецептор трансферрина).Unprocessed RNA was isolated from whole and excised tissue using a Tri-Zol reagent (Life Technologies, Gaithersburg, MD, USA) according to the supplier’s instructions. Quality control for all RNA samples includes integrity assessment (intact 18S and 28S ribosomal RNA) and determination of the presence of transcripts with a high content (actin) and low content (transferrin receptor).

Конструирование затравок/зондаSeed / Probe Design

Две затравки и зонд TaqMan конструируют с возможностью амплификации специфической последовательности из эновина.Two primers and a TaqMan probe are designed to amplify a specific enovin sequence.

Затравка 1: 5' ACGGTTCTCCAGGTGCTGT 3'Seed 1: 5 'ACGGTTCTCCAGGTGCTGT 3'

Затравка 3: 5' TGCTGCCGACCCACG 3'Seed 3: 5 'TGCTGCCGACCCACG 3'

Зонд 5: 5' CTACGAAGCGGTCTCCTTCATGGACG 3'Probe 5: 5 'CTACGAAGCGGTCTCCTTCATGGACG 3'

Кроме того, конструируют две затравки и зонд TaqMan, которые соединяют интрон и амплифицируют часть гена GAPDH человека.In addition, two primers and a TaqMan probe are constructed that connect the intron and amplify a portion of the human GAPDH gene.

Затравка 2: 5' CAGAGTTAAAAGCAGCCCTGGT 3'Seed 2: 5 'CAGAGTTAAAAGCAGCCCTGGT 3'

Затравка 4: 5' GAAGGTGAAGGTCGGAGTCAAC 3'Seed 4: 5 'GAAGGTGAAGGTCGGAGTCAAC 3'

Зонд 6: 5' TTTGGTCCGTATTGGGCGCCT 3'Probe 6: 5 'TTTGGTCCGTATTGGGCCCCT 3'

Зонд 5 метят флуоресцентным FAM, и зонд 6 метят флуоресцентным VIC.Probe 5 is labeled with a fluorescent FAM, and probe 6 is labeled with a fluorescent VIC.

Обработка ДНКазой непроцессированной РНКDNase treatment of unprocessed RNA

Для каждой испытуемой ткани 2,2 мкг непроцессированной РНК расщепляют 2 единицами ДНКазы, не содержащей РНКазу (Gibco BRL), в течение 15 минут при комнатной температуре в 20 мкл однократного объема буфера с ДНКазой (Gibco BRL). Реакцию прекращают, добавляя 2 мкл раствора 25 мМ EDTA. Образцы инкубируют при 65°С в течение 10 минут, чтобы инактивировать фермент.For each test tissue, 2.2 μg of unprocessed RNA is digested with 2 units of RNase-free DNase (Gibco BRL) for 15 minutes at room temperature in 20 μl of a single volume of DNase buffer (Gibco BRL). The reaction is stopped by adding 2 μl of a solution of 25 mm EDTA. Samples are incubated at 65 ° C for 10 minutes to inactivate the enzyme.

Синтез одноцепочечной кДНКSynthesis of single stranded cDNA

Для каждой испытуемой ткани 100 нг непроцессированной РНК используют в качестве матрицы для синтеза одноцепочечной кДНК. РНК в объеме 4 мл, 50 нМ затравок 1 и 2, однократный объем буфера II для PCR (Perkin Elmer) и 5 мМ MgCl₂ нагревают до 72°С в течение 5 минут и медленно охлаждают до 55°С. Добавляют все другие реагенты и 6 мл реакционной смеси инкубируют при 48°С в течение 30 минут, после чего фермент инактивируют при 90°С в течение 5 минут. Конечными условиями реакции являются: однократный объем буфера II для PCR, 5 мМ MdCl₂, 1 мМ dATP, dTTP, dGTP, dCTP, 12,5 единицы обратной транскриптазы MuLV (Gibco BRL).For each test tissue, 100 ng of unprocessed RNA is used as a template for the synthesis of single-stranded cDNA. RNA in a volume of 4 ml, 50 nM seeds 1 and 2, a single volume of PCR buffer II (Perkin Elmer) and 5 mM MgCl ₂ are heated to 72 ° C for 5 minutes and slowly cooled to 55 ° C. All other reagents are added and 6 ml of the reaction mixture are incubated at 48 ° C for 30 minutes, after which the enzyme is inactivated at 90 ° C for 5 minutes. The final reaction conditions are: a single volume of buffer II for PCR, 5 mm MdCl ₂ , 1 mm dATP, dTTP, dGTP, dCTP, 12.5 units of MuLV reverse transcriptase (Gibco BRL).

Амплификация продуктов одноцепочечной кДНК при помощи PCRAmplification of single stranded cDNA products using PCR

кДНК, выделенную из 100 нг непроцессированной РНК для каждого образца, амплифицируют, выполняя одну полимеразную реакцию синтеза цепи, чтобы идентифицировать транскриптмишень и транскрипт GAPDH. Затравки/зонд используют в нижеследующих конечных концентрациях для транскрипта-мишени: 300 нМ затравки 1, 300 нМ затравки 3 и 200 нМ зонда 5, и для транскрипта GAPDH: 20 нМ затравки 2, 20 нМ затравки 4 и 100 нМ зонда 6. Другие реагенты в реакционной смеси использованы в нижеследующей конечной концентрации: 4,5% глицерина, однократный объем буфера А с TaqMan (Perkin Elmer), 6,25 мМ MgCl₂, 430 M dATP, dUTP, dGTP, dCTP, 2,5 единицы AmpliTaq Gold. Амплификацию при помощи PCR выполняют в системе обнаружения последовательностей ABI 7700, при этом начальную стадию активации фермента осуществляют при 94°С в течение 12 минут с последующим выполнением 45 циклов при 94°С в течение 15 секунд, при 60°С в течение 1 минуты (минимальное время линейного изменения).cDNA isolated from 100 ng of unprocessed RNA for each sample was amplified by performing one polymerase chain synthesis reaction to identify the transcriptional target and the GAPDH transcript. The seed / probe is used in the following final concentrations for the target transcript: 300 nM seed 1, 300 nM seed 3 and 200 nM probe 5, and for the GAPDH transcript: 20 nM seed 2, 20 nM seed 4 and 100 nM probe 6. Other reagents in the reaction mixture used in the following final concentration: 4.5% glycerol, a single volume of buffer A with TaqMan (Perkin Elmer), 6.25 mM MgCl ₂ , 430 M dATP, dUTP, dGTP, dCTP, 2.5 units of AmpliTaq Gold. PCR amplification is performed in an ABI 7700 sequence detection system, while the initial stage of enzyme activation is carried out at 94 ° C for 12 minutes, followed by 45 cycles at 94 ° C for 15 seconds, at 60 ° C for 1 minute ( minimum ramp time).

Заболевания и испытуемые тканиDiseases and test tissues

Экспрессию мРНК эновина сравнивают в тканях, полученных у больных субъектов и здоровых контрольных субъектов (фиг.25 и 26). В нижеследующей таблице указаны заболевания и соответствующие исследованные ткани. Для каждого заболевания анализировали три пораженных болезнью образца и три контрольных образца.The expression of enovin mRNA is compared in tissues obtained from diseased subjects and healthy control subjects (FIGS. 25 and 26). The following table shows the diseases and the corresponding tissues examined. For each disease, three diseased samples and three control samples were analyzed.

Статистический анализStatistical analysis

Для каждой группы из трех тканей высчитывают среднее значение и стандартное отклонение на основании значений Ct (которые нормально распределены), после чего их преобразуют в значения Cn по формуле Cn=10^{((Ct-40,007)/-3,623}. Кроме того, выполняют дисперсионный анализ (ANOVA) значений Ct, чтобы сравнить средние уровни экспрессии мРНК эновина в здоровых и пораженных болезнью тканях.For each group of three tissues, the average value and standard deviation are calculated based on the Ct values (which are normally distributed), and then they are converted into Cn values by the formula Cn = 10 ^{((Ct-40,007) / - 3,623} . In addition, analysis of variance is performed (ANOVA) Ct values to compare mean levels of enovin mRNA expression in healthy and diseased tissues.

На фиг.25 и 26 указано среднее число копий мРНК эновина. (± стандартное отклонение; n=3) в пораженных болезнью и контрольных тканях. Результаты статистического анализа показывают значительное увеличение уровня экспрессии эновина в перивентрикулярном белом веществе субъектов, страдающих рассеянным склерозом (р=0,013). В контрольном образце внутреннего GAPDH не обнаружено существенного отличия (р=0,79). Уровень экспрессии эновина в перивентрикулярном белом веществе является довольно низким в здоровой ткани (в среднем 270 копий на 100 нг непроцессированной РНК по сравнению с 200000 копий GAPDH), и этот уровень в три раза выше (825) у субъектов, страдающих рассеянным склерозом.25 and 26 show the average number of copies of enovin mRNA. (± standard deviation; n = 3) in diseased and control tissues. The results of statistical analysis show a significant increase in the level of enovin expression in the periventricular white matter of subjects suffering from multiple sclerosis (p = 0.013). No significant differences were found in the control sample of internal GAPDH (p = 0.79). Enovin expression level in periventricular white matter is rather low in healthy tissue (an average of 270 copies per 100 ng of unprocessed RNA compared to 200,000 copies of GAPDH), and this level is three times higher (825) in subjects suffering from multiple sclerosis.

Обнаружено только одно отличие пораженной болезнью ткани от здоровой контрольной ткани: в аденокарциноме молочной железы уровень экспрессии мРНК эновина в 6 раз выше (6000 по сравнению с 1000; р=0,007), причем контрольное значение GAPDH также значительно увеличено (165000 по сравнению с 44000; р=0,03), что, вероятно, свидетельствует об общем увеличении уровней мРНК.Only one difference was found between diseased tissue and healthy control tissue: in mammary adenocarcinoma, the level of expression of enovin mRNA was 6 times higher (6000 compared to 1000; p = 0.007), and the control GAPDH value was also significantly increased (165000 compared to 44000; p = 0.03), which probably indicates a general increase in mRNA levels.

Таким образом, авторы этого изобретения обнаружили, что уровни мРНК эновина повышены в перивентрикулярном белом веществе у субъектов, страдающих рассеянным склерозом.Thus, the authors of this invention have found that enovin mRNA levels are elevated in the periventricular white matter in subjects suffering from multiple sclerosis.

Применение клеточного анализа ELISA на основе фосфоспецифического антитела для скрининга миметической формы эновина в рецепторном комплексе GFRα3/cRETThe use of a cell-based ELISA based on a phosphospecific antibody for screening the mimetic form of enovin in the GFRα3 / cRET receptor complex

Этот метод можно также использовать для идентификации агониста или антагониста других рецепторов нейротрофина, таких как GFRα1, GFRα2, GFRα4, TrkA, TrkB и TrkC.This method can also be used to identify an agonist or antagonist of other neurotrophin receptors, such as GFRα1, GFRα2, GFRα4, TrkA, TrkB and TrkC.

АнализAnalysis

При помощи этого анализа можно идентифицировать агонистические или антагонистические соединения нейротрофических факторов роста, для чего измеряют активацию основных сигнальных киназ, активированных в нейротрофическом пути, или активацию киназы рецептора cRET. Активацию измеряют, детектируя количество фосфорилированной киназы или киназы рецептора при помощи фосфоспецифических антител. С этой целью можно использовать клетки NIH 3Т3, временно или постоянно экспрессирующие TrkA, TrkB, TrkC, GFRa1/cRET, GFRa2/cRET, GFRa3/cRET или GFRa4/cRET.Using this analysis, agonistic or antagonistic compounds of neurotrophic growth factors can be identified by measuring the activation of major signal kinases activated in the neurotrophic pathway, or the activation of the cRET receptor kinase. Activation is measured by detecting the amount of phosphorylated kinase or receptor kinase using phosphospecific antibodies. For this purpose, NIH 3T3 cells expressing TrkA, TrkB, TrkC, GFRa1 / cRET, GFRa2 / cRET, GFRa3 / cRET or GFRa4 / cRET can be used temporarily or permanently.

Активацию МАР-киназы р42/р44, РКВ-киназы, c-jun, CREB, JNK/SAPK-киназы и других киназ детектируют при помощи коммерческих фосфоспецифических антител. Кроме того, cRET можно дезактивировать, используя фосфоспецифическое антитело к cRET.The activation of p42 / p44 MAP kinase, RKB kinase, c-jun, CREB, JNK / SAPK kinase and other kinases are detected using commercial phosphospecific antibodies. In addition, cRET can be deactivated using a phosphospecific anti-cRET antibody.

Этот анализ выполняют в соответствии с нижеследующей процедурой:This analysis is performed in accordance with the following procedure:

- Клетки NIH 3Т3 культивируют на 96-луночном планшете в 10% телячьей сыворотке, причем эти клетки должны быть на 80% конфлюэнтными до стимуляции.- NIH 3T3 cells are cultured on a 96-well plate in 10% calf serum, and these cells must be 80% confluent before stimulation.

- На следующий день используемую среду заменяют средой, не содержащей сыворотки, и выращивают клетки на минимальной среде в течение 18-24 часов.- The next day, the medium used is replaced with serum-free medium, and cells are grown on minimal medium for 18-24 hours.

- После выращивания на минимальной среде клетки стимулируют соединениями и нейротрофическими факторами, используемыми в качестве положительного контрольного образца (10 нг/мл для нейротрофических факторов).- After growing on minimal medium, the cells are stimulated with compounds and neurotrophic factors used as a positive control sample (10 ng / ml for neurotrophic factors).

- Клетки фиксируют 4% формальдегидом в PBS при 4°С в течение 20 минут.- Cells are fixed with 4% formaldehyde in PBS at 4 ° C for 20 minutes.

- Клетки трижды промывают 200 мкл РВS/0,1% тритона в течение 5 минут.- Cells are washed three times with 200 μl of PBS / 0.1% Triton for 5 minutes.

- Рост клеток прекращают 100 мкл 0,6% H₂O₂ в PBS/0,1% тритона в течение 20 минут.- Cell growth is terminated with 100 μl of 0.6% H ₂ O ₂ in PBS / 0.1% triton for 20 minutes.

- Клетки блокируют 100 мкл 10% фетальной телячьей сывороткой в PBS/0,1% тритона в течение 60 минут.- Cells are blocked with 100 μl of 10% fetal calf serum in PBS / 0.1% triton for 60 minutes.

- Клетки инкубируют с фосфоспецифическим антителом в 50 мкл 5% BSA//PBS/0,1% тритона в течение ночи при 4°С. Степень разведения антитела необходимо определить экспериментально в предлагаемом диапазоне 1:100-1:250.- Cells are incubated with a phosphospecific antibody in 50 μl of 5% BSA // PBS / 0.1% Triton overnight at 4 ° C. The degree of dilution of the antibody must be determined experimentally in the proposed range of 1: 100-1: 250.

- Клетки трижды промывают 200 мкл PBS/0,1% тритона в течение 5 минут.- Cells are washed three times with 200 μl of PBS / 0.1% Triton for 5 minutes.

- Клетки инкубируют со вторичным антителом, связанным пероксидазой хрена (HRP), со степенью разведения 1:100 в 50 мкл 5% BSA/PBS/0,1% тритона в течение 1 часа при комнатной температуре.- Cells are incubated with a secondary antibody bound with horseradish peroxidase (HRP), with a dilution ratio of 1: 100 in 50 μl of 5% BSA / PBS / 0.1% Triton for 1 hour at room temperature.

- Одну таблетку OPD (Sigma) растворяют в 25 мл буфера (3,65 г лимонной кислоты - Н₂О и 5,9 г Na₂HPO₄-2H₂O в 0,51 H₂O, pH 5,6) и добавляют 12,5 мкл Н₂О₂. В каждую лунку добавляют 50 мкл и инкубируют в течение 15 минут на шейкере (200 оборотов/минуту), покрытом алюминиевой фольгой.- One OPD tablet (Sigma) is dissolved in 25 ml of buffer (3.65 g of citric acid — H ₂ O and 5.9 g of Na ₂ HPO ₄ -2H ₂ O in 0.51 H ₂ O, pH 5.6) and add 12.5 μl of H ₂ About ₂ . 50 μl was added to each well and incubated for 15 minutes on a shaker (200 rpm) coated with aluminum foil.

- Реакцию прекращают 25 мкл Н₂SO₄.- The reaction is terminated with 25 μl of H ₂ SO ₄ .

- Оптическую плотность OD_490-650 измеряют в аппарате для чтения планшетов ELISA.- Optical density OD _{490-650 is} measured in an ELISA _plate reader.

Культура допаминергических нейронов среднего мозгаMidbrain dopaminergic neuron culture

Культура нейроновNeuron culture

Культуры нейронов получают из желудочка среднего мозга плода крысы ферментативным и механическим диспергированием. Ткань собирают, промывают в охлаждаемом льдом физиологическом растворе с фосфатным буфером без Са²⁺ и Mg²⁺, содержащем 0,6% глюкозы (PBSG), и инкубируют в течение 30 минут с PBSG, содержащим 0,1% трипсина, при 37°С. Клеточную взвесь культивируют с плотностью 2,5·10⁵ клеток/см² на 96-луночных планшетах для культуры ткани NUNC. Культуральные планшеты предварительно покрывают поли-L-орнитином и средой определенного химического состава (CDM), содержащей 10% фетальную телячью сыворотку. Культуры помещают в среду определенного химического состава (CDM), состоящую из смеси (1:1) модифицированной по способу Дульбекко среды Игла и питательного вещества F12, содержащего глюкозу (0,6%), глутамин (2 мМ), бикарбонат натрия (3 мМ), HEPES (5 мМ), инсулин (25 мкг/мл), трансферин человека (100 мкг/мл), путресцин (60 мкг/мл), селенит натрия (30 нМ), стрептомицин (100 мкг/мл) и пенициллин (100 м.ед/мл).Neuron cultures are obtained from the ventricle of the midbrain of the rat fetus by enzymatic and mechanical dispersion. The tissue is collected, washed in ice-cold saline with phosphate buffer without Ca ²⁺ and Mg ²⁺ containing 0.6% glucose (PBSG), and incubated for 30 minutes with PBSG containing 0.1% trypsin at 37 ° FROM. Cell suspension was cultured with a density of 2.5 · 10 ⁵ cells / cm ² in 96-well plates for tissue culture NUNC. The culture plates are precoated with poly-L-ornithine and a specific chemical composition medium (CDM) containing 10% fetal calf serum. The cultures are placed in a medium of a certain chemical composition (CDM), consisting of a mixture (1: 1) of the Eagle medium modified according to the Dulbecco method and nutrient F12 containing glucose (0.6%), glutamine (2 mm), sodium bicarbonate (3 mm ), HEPES (5 mM), insulin (25 μg / ml), human transferrin (100 μg / ml), putrescine (60 μg / ml), sodium selenite (30 nM), streptomycin (100 μg / ml) and penicillin ( 100 ppm / ml).

Обработка нейротрофическими факторамиTreatment with neurotrophic factors

Нейротрофины растворяют в 0,5% бычьем сывороточном альбумине, используемом в качестве исходного раствора. Нейротрофины добавляют через 3 часа после начала культивирования и через 5 дней нахождения в культуре. Такое же количество 0,5% бычьего сывороточного альбумина добавляют в контрольные лунки.Neurotrophins are dissolved in 0.5% bovine serum albumin, used as a stock solution. Neurotrophins are added 3 hours after the start of cultivation and after 5 days in culture. The same amount of 0.5% bovine serum albumin is added to control wells.

Поглощение высокоаффинного допаминаHigh affinity dopamine absorption

Поглощение допамина измеряют через 10 дней. Для этого клетки дважды промывают предварительно подогретым PBS, содержащим глюкозу (5 мМ), аскорбиновую кислоту (100 мМ) и паргилин (100 мМ), и предварительно инкубируют в течение 10 минут с таким же раствором. Раствор для предварительной инкубации заменяют таким же раствором, содержащим 50 нМ [³Н] DA, и продолжают инкубировать в течение 15 минут при 37°С. Поглощение прекращают тремя быстрыми промывками охлаждаемого льдом PBS. Накопленный [³Н] допамин удаляют в процессе инкубации с подкисленным этанолом в течение 30 минут при комнатной температуре. Радиоактивность определяют после добавления 4 мл сцинтилляционной жидкости (Packard ultima gold MV) при помощи сцинтилляционного счетчика. Неспецифическое поглощение определяют, добавляя 20 мкМ кокаина.Dopamine absorption is measured after 10 days. For this, the cells are washed twice with preheated PBS containing glucose (5 mM), ascorbic acid (100 mM) and pargyline (100 mM), and pre-incubated for 10 minutes with the same solution. The pre-incubation solution was replaced with the same solution containing 50 nM [ ³ H] DA and continued to incubate for 15 minutes at 37 ° C. Absorption is stopped by three quick rinses of ice-cooled PBS. The accumulated [ ³ H] dopamine is removed during incubation with acidified ethanol for 30 minutes at room temperature. Radioactivity is determined after adding 4 ml of scintillation fluid (Packard ultima gold MV) using a scintillation counter. Non-specific uptake is determined by adding 20 μM ***e.

Клетки выращивают в течение 10 дней в присутствии эновина или без него. Результаты, полученные для необработанных контрольных образцов, принимают за 100%. Эти результаты получены при выполнении 1-5 независимых экспериментов.Cells are grown for 10 days in the presence or absence of Enovin. The results obtained for untreated control samples are taken as 100%. These results were obtained when performing 1-5 independent experiments.

СсылкиReferences

Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W. & Lipman, D.J. (1990) Basic, local alignment search tool, J. Mol. Biol. 215, 403-410.Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W. & Lipman, D.J. (1990) Basic, local alignment search tool, J. Mol. Biol. 215, 403-410.

Angrist, M., Bolk, S., Halushka, M., Lapchak, P.A. & Chakravarti, A. (1996) Germline mutations in glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) and RET in a Hirschsprung disease patient. Nature Genetics 14, 341-344.Angrist, M., Bolk, S., Halushka, M., Lapchak, P.A. & Chakravarti, A. (1996) Germline mutations in glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) and RET in a Hirschsprung disease patient. Nature Genetics 14, 341-344.

Baloh, R.H., Tansey, M.G., Golden, J.P., Creedon, D.J., Heuckeroth, R.O., Keck, C.L., Zimonjic, D.B., Popescu, N.C., Johnson, E.M. & Milbrandt, J. (1997) TrnR2, a novel receptor that mediates neurturin and GDNF signaling through Ret. Neuron 18, 793-802.Baloh, R. H., Tansey, M. G., Golden, J. P., Creedon, D. J., Heuckeroth, R. O., Keck, C. L., Zimonjic, D. B., Popescu, N. C., Johnson, E. M. & Milbrandt, J. (1997) TrnR2, a novel receptor that mediates neurturin and GDNF signaling through Ret. Neuron 18, 793-802.

Baloh, R.H., Gorodinsky, A., Golden, J.P., Tansey, M.G., Keck, C.L., Popescu, N.C., Johnson, E.M. & Milbrandt, J. (1998) GFRα3 is an orphan member of the GDNF/neurturin/persephin receptor family. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 5801-5806.Baloh, R. H., Gorodinsky, A., Golden, J. P., Tansey, M. G., Keck, C. L., Popescu, N. C., Johnson, E. M. & Milbrandt, J. (1998) GFRα3 is an orphan member of the GDNF / neurturin / persephin receptor family. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 5801-5806.

Barr, P.J. (1991) Mammalian subtilisins: the long-sought dibasic processing endoproteases. Cell. 66, 1-3.Barr, P.J. (1991) Mammalian subtilisins: the long-sought dibasic processing endoproteases. Cell. 66, 1-3.

Beck, K.D., Valverde, J., Alexi, Т., Poulsen, K., Moffat, В., Vandlen, R.A., Rosenthal, A. & Hefti, F. (1995) Mesencephalic dopaminergic neurons protected by GDNF from axotomy-induced degeneration in the adult brain. Nature 373, 339-341.Beck, KD, Valverde, J., Alexi, T., Poulsen, K., Moffat, B., Vandlen, RA, Rosenthal, A. & Hefti, F. (1995) Mesencephalic dopaminergic neurons protected by GDNF from axotomy-induced degeneration in the adult brain. Nature 373, 339-341.

Bilang-Bleuel, A., Revah, F., Colin, P., Locquet, I., Robert J.J., Mallet, J. & Horellou, P. (1997) Intrastriatal injection of an adenoviral vector expressing glial-cell-line-derived neurotrophic factor prevents dopaminergic neuron degeneration and behavioral impairment in a rat model of Parkinson disease. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 8818-8823.Bilang-Bleuel, A., Revah, F., Colin, P., Locquet, I., Robert JJ, Mallet, J. & Horellou, P. (1997) Intrastriatal injection of an adenoviral vector expressing glial-cell-line- derived neurotrophic factor prevents dopaminergic neuron degeneration and behavioral impairment in a rat model of Parkinson disease. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 8818-8823.

Buj-Bello, A., Buchman, V.L., Horton, A., Rosenthal, A. & Davies A.M. (1995) GDNF is an age-specific survival factor for sensory and autonomic neurons. Neuron 15, 821-828.Buj-Bello, A., Buchman, V.L., Horton, A., Rosenthal, A. & Davies A.M. (1995) GDNF is an age-specific survival factor for sensory and autonomic neurons. Neuron 15, 821-828.

Buj-Bello, A., Adu, J., Pinon, L.G.P., Horton, A., Thompson, J., Rosenthal, A., Chinchetru, M., Buchman, V.L. & Davies, A.M. (1997) Neurturin responsiveness requires a GPI-linked receptor and the Ret receptor tyrosine kinase. Nature 387, 721-724.Buj-Bello, A., Adu, J., Pinon, L. G. P., Horton, A., Thompson, J., Rosenthal, A., Chinchetru, M., Buchman, V. L. & Davies, A.M. (1997) Neurturin responsiveness requires a GPI-linked receptor and the Ret receptor tyrosine kinase. Nature 387, 721-724.

Choi-Lundberg, D.L., Lin, Q., Chang, Y.N., Chiang, Y.L., Hay, C.M., Mohajeri, H., Davidson, B.L. & Bonn, M.C. (1997) Dopaminergic neurons protected from degeneration by GDNF gene therapy. Science. 275, 838-841.Choi-Lundberg, D.L., Lin, Q., Chang, Y.N., Chiang, Y.L., Hay, C.M., Mohajeri, H., Davidson, B.L. & Bonn, M.C. (1997) Dopaminergic neurons protected from degeneration by GDNF gene therapy. Science. 275, 838-841.

Creedon, D.J., Tansey, M.G., Baloh, R.H., Osborne, P.A., Lampe, P.A., Fahrner, T.J., Heuckeroth, R.O., Milbrandt, J. & Johnson, E.M. (1997) Neurturin shares receptors and signal transduction pathways with glial cell line-derived neurotrophic factor in sympathetic neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 7018-7023.Creedon, D.J., Tansey, M.G., Baloh, R.H., Osborne, P.A., Lampe, P.A., Fahrner, T.J., Heuckeroth, R.O., Milbrandt, J. & Johnson, E.M. (1997) Neurturin shares receptors and signal transduction pathways with glial cell line-derived neurotrophic factor in sympathetic neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 7018-7023.

Durbec, P., Marcos-Gutierrez, C.V., Kilkenny, C., Grigoriou, M., Wartiowaara, K., Suvanto, P., Smith, D., Ponder, В., Costantini, F., Saarma, M., Sariola, H. & Pachnis, V. (1996) GDNF signalling through the RET receptor tyrosine kinase. Nature 381, 789-793.Durbec, P., Marcos-Gutierrez, CV, Kilkenny, C., Grigoriou, M., Wartiowaara, K., Suvanto, P., Smith, D., Ponder, B., Costantini, F., Saarma, M. , Sariola, H. & Pachnis, V. (1996) GDNF signaling through the RET receptor tyrosine kinase. Nature 381, 789-793.

Edery, P., Lyonnet, S., Mulligan, L.M., Pelet, A., Dow, E., Abel L., Holder S., Nihoul-Fekete, C., Ponder, B.A. & Munnich, A. (1994) Mutations of the RET proto-oncogene in Hirschsprung's disease. Nature 367, 378-380.Edery, P., Lyonnet, S., Mulligan, L. M., Pelet, A., Dow, E., Abel L., Holder S., Nihoul-Fekete, C., Ponder, B.A. & Munnich, A. (1994) Mutations of the RET proton-oncogene in Hirschsprung's disease. Nature 367, 378-380.

Gash, D.M., Zhang, Z., Ovadia, A., Cass, W.A., Yi, A., Simmerman, L., Russell, D., Martin, D., Lapchak, P.A., Collins, F., Hoffer, B.J. & Gerhardt, G.A. (1996) Functional recovery in parkinsonian monkeys treated with GDNF. Nature 380, 252-255.Gash, D.M., Zhang, Z., Ovadia, A., Cass, W.A., Yi, A., Simmerman, L., Russell, D., Martin, D., Lapchak, P.A., Collins, F., Hoffer, B.J. & Gerhardt, G.A. (1996) Functional recovery in parkinsonian monkeys treated with GDNF. Nature 380, 252-255.

GFRα Nomenclature Committee (1997) Nomenclature of GPI-linked receptors for the GDNF ligand family. Neuron 19, 485.GFRα Nomenclature Committee (1997) Nomenclature of GPI-linked receptors for the GDNF ligand family. Neuron 19, 485.

Hakim A. "Ischemic penumbra: the therapeutic window." Neurology. 1998 Sep; 51 (3 Suppi 3): S44-6.Hakim A. "Ischemic penumbra: the therapeutic window." Neurology. 1998 Sep; 51 (3 Suppi 3): S44-6.

Henderson, C.E., Phillips, H.S., Pollock, R.A., Davies, A.M., Lemeulle, C., Armanini, M., Simmons, L., Moffet, В., Vandlen, R.A., Koliatsos, V.E. & Rosenthal, A. (1994) GDNF: a potent survival factor for motoneurons present in peripheral nerve and muscle. Science 266, 1062-1064.Henderson, C.E., Phillips, H.S., Pollock, R.A., Davies, A.M., Lemeulle, C., Armanini, M., Simmons, L., Moffet, B., Vandlen, R.A., Koliatsos, V.E. & Rosenthal, A. (1994) GDNF: a potent survival factor for motoneurons present in peripheral nerve and muscle. Science 266, 1062-1064.

Heng, H.H.Q., Squire, J. & Tsui, L.-С. (1992) High resolution mapping of mammalian genes by in situ hybridization to free chromatin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 9509-9513.Heng, H.H.Q., Squire, J. & Tsui, L.-S. (1992) High resolution mapping of mammalian genes by in situ hybridization to free chromatin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 9509-9513.

Heng, H.H.Q. & Tsui, L.-C. (1993) Modes of DAPI banding and simultaneous in situ hybridization. Chromosoma 102, 325-332.Heng, H.H.Q. & Tsui, L.-C. (1993) Modes of DAPI banding and simultaneous in situ hybridization. Chromosoma 102, 325-332.

Heuckeroth, R.O., Kotzbauer, P., Copeland, N.G., Gilbert, D.J., Jenkins, N.A., Zimonjic, D.B., Popescu, N.C., Johnson, E.M. & Milbrandt, J. (1997) Neurturin, a novel neurotrophic factor, is localized to mouse chromosome 17 and human chromosome 19pl3.3. Genomics 44, 137-140.Heuckeroth, R.O., Kotzbauer, P., Copeland, N.G., Gilbert, D.J., Jenkins, N.A., Zimonjic, D.B., Popescu, N.C., Johnson, E.M. & Milbrandt, J. (1997) Neurturin, a novel neurotrophic factor, is localized to mouse chromosome 17 and human chromosome 19pl3.3. Genomics 44, 137-140.

Jing, S., Wen, D., Yu, Y., Holst, P.L., Luo, Y., Fang, M., Tamir, R., Antonio, L., Hu, Z., Cupples, R., Louis, J.-C., Hu, S., Altrock, B.W. & Fox, G.M. (1996) GDNF-induced activation of the ret protein tyrosine kinase is mediated by GDNFR-a, a novel receptor for GDNF. Cell 85, 1113-1124.Jing, S., Wen, D., Yu, Y., Holst, PL, Luo, Y., Fang, M., Tamir, R., Antonio, L., Hu, Z., Cupples, R., Louis , J.-C., Hu, S., Altrock, BW & Fox, G.M. (1996) GDNF-induced activation of the ret protein tyrosine kinase is mediated by GDNFR-a, a novel receptor for GDNF. Cell 85, 1113-1124.

Jing, S., Yu, Y., Fang, M., Hu, Z., Holst, P.L., Boone, Т., Delaney, J., Schultz, H., Zhou, R. & Fox, G.M. (1997) GFRα-2 and GFRα-3 are two new receptors for ligands of the GDNF family. J. Biol. Chem. 272, 33111-33117.Jing, S., Yu, Y., Fang, M., Hu, Z., Holst, P. L., Boone, T., Delaney, J., Schultz, H., Zhou, R. & Fox, G.M. (1997) GFRα-2 and GFRα-3 are two new receptors for ligands of the GDNF family. J. Biol. Chem. 272, 33111-33117.

Kingsley, D.M. (1994) The TGF-beta superfamily: new members, new receptors, and new genetic tests of function in different organisms. Genes & Development 8, 133-146.Kingsley, D.M. (1994) The TGF-beta superfamily: new members, new receptors, and new genetic tests of function in different organisms. Genes & Development 8, 133-146.

Klein, R.D., Sherman, D., Ho, W.-H., Stone, D., Bennett, G.L., Moffat, B., Vandlen, R., Simmons, L., Gu, Q., Hongo, J.-A., Devaux, В., Poulsen, K., Armanini, M., Nozaki, C., Asai, N., Goddard, A., Phillips, H., Henderson, C.E., Takahashi, M. & Rosenthal, A. (1997) A GPI-linked protein that interacts with Ret to form a candidate neurturin receptor. Nature 387, 717-721.Klein, RD, Sherman, D., Ho, W.-H., Stone, D., Bennett, GL, Moffat, B., Vandlen, R., Simmons, L., Gu, Q., Hongo, J. -A., Devaux, B., Poulsen, K., Armanini, M., Nozaki, C., Asai, N., Goddard, A., Phillips, H., Henderson, CE, Takahashi, M. & Rosenthal, A. (1997) A GPI-linked protein that interacts with Ret to form a candidate neurturin receptor. Nature 387, 717-721.

Kotzbauer, P.Т., Lampe, P.A., Heuckeroth, P.O., Golden, J.P., Creedon, D.J., Johnson, E.M. & Milbrandt, J. (1996) Neurturin, a relative of glial-cell-line-derived neurotrophic factor. Nature 384, 467-470.Kotzbauer, P.T., Lampe, P.A., Heuckeroth, P.O., Golden, J.P., Creedon, D.J., Johnson, E.M. & Milbrandt, J. (1996) Neurturin, a relative of glial-cell-line-derived neurotrophic factor. Nature 384, 467-470.

Lin, L.-F.H., Doherty, D.H., Lile, J.D., Bektesh, S. & Collins, F. (1993) GDNF: a glial cell line-derived neurotrophic factor for midbrain dopaminergic neurons. Science 260, 1130-1132.Lin, L.-F.H., Doherty, D.H., Lile, J.D., Bektesh, S. & Collins, F. (1993) GDNF: a glial cell line-derived neurotrophic factor for midbrain dopaminergic neurons. Science 260, 1130-1132.

Mandel, R.J., Spratt, S.K., Snyder, R.O. & Leff, S.E. (1997) Midbrain injection of recombinant adeno-associated virus encoding rat glial cell line-derived neurotrophic factor protects nigral neurons in a progressive 6-hydroxydopamine-induced degeneration model of Parkinson's disease in rats. Proc. Natl. Acad. Scl. USA 94, 14083-14088.Mandel, R.J., Spratt, S.K., Snyder, R.O. & Leff, S.E. (1997) Midbrain injection of recombinant adeno-associated virus encoding rat glial cell line-derived neurotrophic factor protects nigral neurons in a progressive 6-hydroxydopamine-induced degeneration model of Parkinson's disease in rats. Proc. Natl. Acad. Scl. USA 94, 14083-14088.

Marsden et al. "The causes of Parkinson's disease are being unraveled and rational neuroprotective therapy is close to reality." Ann Neurol. 1998 Sep; 44 (3 Suppi 1): S189-96.Marsden et al. "The causes of Parkinson's disease are being unraveled and rational neuroprotective therapy is close to reality." Ann Neurol. 1998 Sep; 44 (3 Suppi 1): S189-96.

Masure, S., Cik, M., Pangalos, M.N., Bonaventure, P., Verhasselt, P., Lesage, A.S., Leysen, J.E. & Gordon R.D. (1998) Molecular cloning, expression and tissue distribution of glial-cell-line-derived neurotrophic factor family receptor α-3 (GFRα-3). Eur. J. Blochem. 251, 622-630.Masure, S., Cik, M., Pangalos, M.N., Bonaventure, P., Verhasselt, P., Lesage, A.S., Leysen, J.E. & Gordon R.D. (1998) Molecular cloning, expression and tissue distribution of glial-cell-line-derived neurotrophic factor family receptor α-3 (GFRα-3). Eur. J. Blochem. 251, 622-630.

Matsushita, N., Fujita, Y., Tanaka, M., Nagatsu, Т. & Kiuchi, K. (1997) Cloning and structural organization of the gene encoding the mouse glial cell line-derived neurotrophic factor, GDNF. Gene 203, 149-157.Matsushita, N., Fujita, Y., Tanaka, M., Nagatsu, T. & Kiuchi, K. (1997) Cloning and structural organization of the gene encoding the mouse glial cell line-derived neurotrophic factor, GDNF. Gene 203, 149-157.

Milbrandt, J., de Sauvage, F.J., Fahrner, T.J., Baloh, R.H., Leitner, M.L., Tansey, M.G., Lampe, P.A., Heuckeroth, R.O., Kotzbauer, P.Т., Simburger, K.S., Golden, J.P., Davies, J.A., Vejsada, R., Kato, A.C., Hynes, M., Sherman, D., Nishimura, M., Wang, L.C., Vandlen, R., Moffat, В., Klein, R.D., Poulsen, K., Gray, C., Garces, A., Henderson, C.E., Phillips, H.S. & Johnson, E.M. Jr. (1998) Persephin, a novel neurotrophic factor related to GDNF and neurturin. Neuron 20, 245-253.Milbrandt, J., de Sauvage, FJ, Fahrner, TJ, Baloh, RH, Leitner, ML, Tansey, MG, Lampe, PA, Heuckeroth, RO, Kotzbauer, P.T., Simburger, KS, Golden, JP, Davies , JA, Vejsada, R., Kato, AC, Hynes, M., Sherman, D., Nishimura, M., Wang, LC, Vandlen, R., Moffat, B., Klein, RD, Poulsen, K., Gray, C., Garces, A., Henderson, CE, Phillips, HS & Johnson, E.M. Jr. (1998) Persephin, a novel neurotrophic factor related to GDNF and neurturin. Neuron 20, 245-253.

Moore, M.W., Klein, R.D., Farinas, I., Sauer, H., Armanini, M., Phillips, H., Reichardt, L.F., Ryan, A.M., Carver-Moore, K. & Rosenthal, A. (1996) Renal and neuronal abnormalities in mice lacking GDNF. Nature 382, 76-79.Moore, MW, Klein, RD, Farinas, I., Sauer, H., Armanini, M., Phillips, H., Reichardt, LF, Ryan, AM, Carver-Moore, K. & Rosenthal, A. (1996) Renal and neuronal abnormalities in mice lacking GDNF. Nature 382, 76-79.

Mount, H.T., Dean, D.O., Alberch, J., Dreyfus, C.F. & Black, I.E. (1995) Glial cell line-derived neurotrophic factor promotes the survival and morphologic differentiation of Purkinje cells. Proc. Natl. Acad. Scl. USA 92, 9092-9096.Mount, H.T., Dean, D.O., Alberch, J., Dreyfus, C.F. & Black, I.E. (1995) Glial cell line-derived neurotrophic factor promotes the survival and morphologic differentiation of Purkinje cells. Proc. Natl. Acad. Scl. USA 92, 9092-9096.

Nagy Z. et al. "The cell division cycle and the pathophysiology of Alzheimer's disease." Neuroscience. 1998 Dec; 87(4): 731-9.Nagy Z. et al. "The cell division cycle and the pathophysiology of Alzheimer's disease." Neuroscience. 1998 Dec; 87 (4): 731-9.

Naveilhan, P., Baudet, C., Mikaels, A., Shen, L., Westphal, H. & Ernfors, P. (1998) Expression and regulation of GFRα3, a glial cell line-derived neurotrophic factor family receptor. Proc. Natl. Acad. Scl. USA 35, 1295-1300.Naveilhan, P., Baudet, C., Mikaels, A., Shen, L., Westphal, H. & Ernfors, P. (1998) Expression and regulation of GFRα3, a glial cell line-derived neurotrophic factor family receptor. Proc. Natl. Acad. Scl. USA 35, 1295-1300.

Nuydens R., Dispersyn G., Van den Kieboom G., De Jong M., Connors R., Ramaekers F., Borgers M., Geerts H. "Bcl-2 protects neuronal cells against taxol-induced apoptosis by inducing mutli-nucleation", submitted.Nuydens R., Dispersyn G., Van den Kieboom G., De Jong M., Connors R., Ramaekers F., Borgers M., Geerts H. "Bcl-2 protects neuronal cells against taxol-induced apoptosis by inducing mutli- nucleation ", submitted.

Oppenheim, R.W., Houenou, L.J., Johnson, J.E., Lin, L.F., Li, L., Lo, A.C., Newsome, A.L., Prevette, D.M. & Wang, S. (1995) Developing motor neurons rescued from programmed and axotomy-induced cell death by GDNF. Nature 373, 344-346.Oppenheim, R.W., Houenou, L.J., Johnson, J.E., Lin, L.F., Li, L., Lo, A.C., Newsome, A.L., Prevette, D.M. & Wang, S. (1995) Developing motor neurons rescued from programmed and axotomy-induced cell death by GDNF. Nature 373, 344-346.

Pichel, J.G., Shen, L., Sheng, H.Z., Granholm, A.C., Drago, J., Grinberg, A., Lee, E.J., Huang, S.P., Saarma, M., Hoffer, B.J., Sariola, H. & Westphal, H. (1996) Defects in enteric innervation and kidney development in mice lacking GDNF. Nature 382, 73-76.Pichel, JG, Shen, L., Sheng, HZ, Granholm, AC, Drago, J., Grinberg, A., Lee, EJ, Huang, SP, Saarma, M., Hoffer, BJ, Sariola, H. & Westphal , H. (1996) Defects in enteric innervation and kidney development in mice lacking GDNF. Nature 382, 73-76.

Romeo, G., Ronchetto, P., Luo, Y., Barone, V., Seri, M., Ceccherini, I., Pasini, В., Bocciardi, R., Lerone, M., Kaariainen, H. et al. (1994) Point mutations affecting the tyrosine kinase domain of the RET proto-oncogene in Hirsch-sprung's disease. Nature 367, 377-378.Romeo, G., Ronchetto, P., Luo, Y., Barone, V., Seri, M., Ceccherini, I., Pasini, B., Bocciardi, R., Lerone, M., Kaariainen, H. et al. (1994) Point mutations affecting the tyrosine kinase domain of the RET proton-oncogene in Hirsch-sprung's disease. Nature 367, 377-378.

Sanchez, M.P., Silos-Santiago, I., Frisen, J., He, В., Lira, S.A. & Barbacid, M. (1996) Renal agenesis and the absence of enteric neurons in mice lacking GDNF. Nature 582, 70-73.Sanchez, M.P., Silos-Santiago, I., Frisen, J., He, B., Lira, S.A. & Barbacid, M. (1996) Renal agenesis and the absence of enteric neurons in mice lacking GDNF. Nature 582, 70-73.

Sanicola, M., Hession, C., Worley, D., Carmillo, P., Ehrenfels, C., Walus, L., Robinson, S., Jaworski, G., Wei, H., Tizard, R., Whitty, A., Pepinsky, R.B. & Cate, R.L. (1997) Gliai cell line-derived neurotrophic factor-dependent RET activation can be mediated by two different cell-surface accessory proteins. Proc. Natl. Acad. Scl. USA 94, 6238-6243.Sanicola, M., Hession, C., Worley, D., Carmillo, P., Ehrenfels, C., Walus, L., Robinson, S., Jaworski, G., Wei, H., Tizard, R., Whitty, A., Pepinsky, RB & Cate, R.L. (1997) Gliai cell line-derived neurotrophic factor-dependent RET activation can be mediated by two different cell-surface accessory proteins. Proc. Natl. Acad. Scl. USA 94,6238-6243.

Smirnova et al. "Thrombin is an extracellular signal that activates intracellular death protease pathways inducing apoptosis in model motor neurons". J Neurobiol. 1998 Jul; 36(l): 64-80.Smirnova et al. "Thrombin is an extracellular signal that activates intracellular death protease pathways inducing apoptosis in model motor neurons." J Neurobiol. 1998 Jul; 36 (l): 64-80.

Srinivisan et al. "Serum from patients with type 2 diabetes with neuropathy induces complement-independent, calcium-dependent apoptosis in cultured neuronal cells." J. Clin. Invest. 1998 Oct 1; 102 (7): 1454-62.Srinivisan et al. "Serum from patients with type 2 diabetes with neuropathy induces complement-independent, calcium-dependent apoptosis in cultured neuronal cells." J. Clin. Invest. 1998 Oct 1; 102 (7): 1454-62.

Steger C. "An unbiased detector of curvilinear structures" IEEE Transactions on pattern analysis and machine intelligence, 20, 1, 113-125 (1998).Steger C. "An unbiased detector of curvilinear structures" IEEE Transactions on pattern analysis and machine intelligence, 20, 1, 113-125 (1998).

Suvanto, P., Wartiovaara, К., Lindahl, M., Arumae, U., Moshnyakov, M., Horelli-Kuitunen, N., Airaksinen, M.S., Palotie, A., Sariola, H. & Saarma, M. (1997) Cloning, mRNA distribution and chromosomal localisation of the gene for glial cell line-derived neurotrophic factor receptor β, a homologue to GDNFRa. Human Mol. Genet. 6, 1267-1273.Suvanto, P., Wartiovaara, K., Lindahl, M., Arumae, U., Moshnyakov, M., Horelli-Kuitunen, N., Airaksinen, MS, Palotie, A., Sariola, H. & Saarma, M. (1997) Cloning, mRNA distribution and chromosomal localization of the gene for glial cell line-derived neurotrophic factor receptor β, a homologue to GDNFRa. Human Mol. Genet. 6, 1267-1273.

Tomac, A., Lindqvist, E., Lin, L.F., Ogren, S.O., Young, D., Hoffer, B.J. & Olson, L. (1995) Protection and repair of the nigrostriatal dopaminergic system by GDNF in vivo. Nature 373, 335-339.Tomac, A., Lindqvist, E., Lin, L.F., Ogren, S.O., Young, D., Hoffer, B.J. & Olson, L. (1995) Protection and repair of the nigrostriatal dopaminergic system by GDNF in vivo. Nature 373, 335-339.

Treanor, J.J.S., Goodman, L., de Sauvage, F., Stone, D.M., Poulsen, K.T., Beck, C.D., Gray, C., Armanini, M.P., Pollock, R.A., Hefti, F., Phillips, H.S., Goddard, A., Moore, M.W., Buj-Bello, A., Davies, A.M., Asai, N., Takahashi, M., Vandlen, R., Henderson, C.E. & Rosenthal, A. (1996) Characterization of a multicomponent receptor for GDNF. Nature 382, 80-83.Treanor, JJS, Goodman, L., de Sauvage, F., Stone, DM, Poulsen, KT, Beck, CD, Gray, C., Armanini, MP, Pollock, RA, Hefti, F., Phillips, HS, Goddard , A., Moore, MW, Buj-Bello, A., Davies, AM, Asai, N., Takahashi, M., Vandlen, R., Henderson, CE & Rosenthal, A. (1996) Characterization of a multicomponent receptor for GDNF. Nature 382, 80-83.

Trupp, M., Arenas, E., Fainzilber, M., Nilsson, A.S., Sieber, B.A., Grigoriou, M., Kilkenny, C., SalazarGrueso, E., Pachnis, V.,

U., Sariola, H., Saarma, M. & Ibanez, C.F. (1996) Functional receptor for GDNF encoded by the c-ret proto-oncogene. Nature 381, 785-788.Trupp, M., Arenas, E., Fainzilber, M., Nilsson, AS, Sieber, BA, Grigoriou, M., Kilkenny, C., Salazar Grueso, E., Pachnis, V.,

U., Sariola, H., Saarma, M. & Ibanez, CF (1996) Functional receptor for GDNF encoded by the c-ret proto-oncogene. Nature 381, 785-788.

Wellington et al. "Toward understanding the molecular pathology of Huntington's disease." Brain Pathol. 1997 Jul; 7 (3): 979-1002.Wellington et al. "Toward understanding the molecular pathology of Huntington's disease." Brain Pathol. 1997 Jul; 7 (3): 979-1002.

Widenfalk, J., Nosrat, С., Tomac, A., Westphal, H., Hoffer, B. & Olson, L. (1997) Neurturin and glial cell line-derived neurotrophic factor receptor-β (GDNFR-α), novel proteins related to GDNF and GDNFR-α with specific cellular patterns of expression suggesting roles in the developing and adult nervous system and in peripheral organs. J. Neurosci. 27, 8506-8519.Widenfalk, J., Nosrat, C., Tomac, A., Westphal, H., Hoffer, B. & Olson, L. (1997) Neurturin and glial cell line-derived neurotrophic factor receptor-β (GDNFR-α), novel proteins related to GDNF and GDNFR-α with specific cellular patterns of expression suggesting roles in the developing and adult nervous system and in peripheral organs. J. Neurosci. 27, 8506-8519.

Widenfalk, J., Tomac, A., Lindqvist, E., Hoffer, В. & Olson, L. (1998) GFRα-3, a protein related to GFRα-1, is expressed in developing peripheral neurons and ensheathing cells. Eur. J. Neurosci. 10, 1508-1517.Widenfalk, J., Tomac, A., Lindqvist, E., Hoffer, B. & Olson, L. (1998) GFRα-3, a protein related to GFRα-1, is expressed in developing peripheral neurons and ensheathing cells. Eur. J. Neurosci. 10, 1508-1517.

Worby, C.A., Vega, Q.C., Zhao, Y., Chao, H. H.-J., Seasholtz, A.F. & Dixon, J.E. (1996) Glial cell line derived neurotrophic factor signals through the RET receptor and activates nitogen-activated protein kinase. J. Blol. Chem. 272, 23619-23622.Worby, C.A., Vega, Q.C., Zhao, Y., Chao, H. H.-J., Seasholtz, A.F. & Dixon, J.E. (1996) Glial cell line derived neurotrophic factor signals through the RET receptor and activates nitogen-activated protein kinase. J. Blol. Chem. 272, 23619-23622.

Worby, C.A., Vega, Q.C., Chao, H.H.J., Seasholtz, A.F., Thompson, R.C. & Dixon J.E. (1998) Identification and characterization of GFRα-3, a novel co-receptor belonging to the glial cell line-derived neurotrophic receptor family. J. Blol. Chem. 273, 3502-3508.Worby, C.A., Vega, Q.C., Chao, H.H.J., Seasholtz, A.F., Thompson, R.C. & Dixon J.E. (1998) Identification and characterization of GFRα-3, a novel co-receptor belonging to the glial cell line-derived neurotrophic receptor family. J. Blol. Chem. 273, 3502-3508.

Yan, Q., Matheson, C. & Lopez, O.T. (1995) In vivo neurotrophic effects of GDNF on neonatal and adult facial motor neurons. Nature 373, 341-344.Yan, Q., Matheson, C. & Lopez, O.T. (1995) In vivo neurotrophic effects of GDNF on neonatal and adult facial motor neurons. Nature 373, 341-344.

Список аббревиатурList of Abbreviations

BLAST - устройство для поиска гомологичных последовательностей при помощи локального сравнительного анализа основных первичных структурBLAST - a device for searching for homologous sequences using local comparative analysis of the main primary structures

п.о. - пары основанийby. - base pairs

кДНК - комплементарная ДНКcDNA - complementary DNA

CNS - центральная нервная системаCNS - Central Nervous System

EST - метка экспрессированной последовательностиEST - expressed sequence label

EVN - эновинEVN - Enovin

GDNF - выделенная линия глиальных клетокGDNF - dedicated glial cell line

GFRα - рецептор а семейства GDNFGFRα - a receptor a of the GDNF family

GPI - гликозилфосфатидилинозитолGPI - glycosylphosphatidylinositol

МТС - кДНК из нескольких тканейMTS - cDNA from several tissues

NTN - нейротуринNTN - Neuroturin

PCR - полимеразная реакция синтеза цепиPCR - polymerase chain synthesis reaction

PNS - периферическая нервная системаPNS - peripheral nervous system

PSP - персефинPSP - Perseffin

RT-PCR - полимеразная реакция синтеза цепи с обратной транскрипциейRT-PCR - reverse transcription polymerase synthesis reaction

TGF-β - трансформирующий фактор роста βTGF-β - transforming growth factor β

FISH - флуоресцентная гибридизация in situFISH - in situ fluorescence hybridization

MTN - нозерн-блоттинг нескольких тканейMTN - Northern Blotting of Multiple Tissues

NGF - фактор роста нервовNGF - nerve growth factor

SPR - резонанс поверхностного плазмонаSPR - surface plasmon resonance

Claims

1. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая нейротрофический фактор роста человека (эновин) и имеющая нуклеотидную последовательность, соответствующую аминокислотной последовательности, показанной на фиг. 1, или кодирующая последовательность, обладающую, по меньшей мере, 70%, а предпочтительно 80%, 90% или 95% гомологии с аминокислотной последовательностью, показанной на фиг. 1.1. An isolated nucleic acid molecule encoding a neurotrophic human growth factor (enovin) and having a nucleotide sequence corresponding to the amino acid sequence shown in FIG. 1, or a coding sequence having at least 70%, and preferably 80%, 90% or 95% homology with the amino acid sequence shown in FIG. 1.

2. Молекула нуклеиновой кислоты по п.1, которая является молекулой ДНК.2. The nucleic acid molecule according to claim 1, which is a DNA molecule.

3. Молекула нуклеиновой кислоты по п.1 или 2, которая является молекулой кДНК.3. The nucleic acid molecule according to claim 1 or 2, which is a cDNA molecule.

4. Молекула нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-3, имеющая последовательность нуклеиновой кислоты из положений 81-419 последовательности, показанной на фиг. 1.4. The nucleic acid molecule according to any one of claims 1 to 3, having a nucleic acid sequence from positions 81-419 of the sequence shown in FIG. 1.

5. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-4, имеющая последовательность нуклеиновой кислоты, соответствующую последовательности любых сплайсированных вариантов в положении от 5'-1 до 3'-1 или 3'-2 и от 5'-1 или 5'-2 до 3'-2 или 3'-3 последовательности, показанной на фиг. 21.5. The selected nucleic acid molecule according to any one of claims 1 to 4, having a nucleic acid sequence corresponding to the sequence of any spliced variants in position from 5'-1 to 3'-1 or 3'-2 and from 5'-1 or 5 '-2 to 3'-2 or 3'-3 of the sequence shown in FIG. 21.

6. Молекула нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-5, имеющая последовательность нуклеиновой кислоты, показанную на фиг. 21.6. The nucleic acid molecule according to any one of claims 1 to 5, having the nucleic acid sequence shown in FIG. 21.

7. Выделенный нейротрофический фактор роста человека, кодируемый молекулой нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-6.7. Isolated human neurotrophic growth factor encoded by a nucleic acid molecule according to any one of claims 1 to 6.

8. Фактор роста по п.7, содержащий аминокислотную последовательность из положений 27-139 аминокислотной последовательности, показанной на фиг. 1, или обладающую, по меньшей мере, 70%, а предпочтительно 80%, 90% или 95% гомологии с аминокислотной последовательностью, показанной на фиг. 1.8. The growth factor according to claim 7, comprising the amino acid sequence from positions 27-139 of the amino acid sequence shown in FIG. 1, or having at least 70%, and preferably 80%, 90%, or 95% homology with the amino acid sequence shown in FIG. 1.

9. Фактор роста по п.7 или 8, содержащий аминокислотную последовательность, показанную на фиг. 1.9. The growth factor according to claim 7 or 8, comprising the amino acid sequence shown in FIG. 1.

10. Фактор роста по п.7, содержащий аминокислотные последовательности, показанные на фиг. 23 или 24.10. The growth factor according to claim 7, comprising the amino acid sequences shown in FIG. 23 or 24.

11. Экспрессирующий вектор для экспрессии нейротрофического фактора, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по п.1, функционально связанную с регуляторными последовательностями.11. An expression vector for the expression of a neurotrophic factor, containing the nucleic acid molecule according to claim 1, operably linked to regulatory sequences.

12. Экспрессирующий вектор по п.11, содержащий дополнительную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую репортерную молекулу.12. The expression vector according to claim 11, containing an additional nucleic acid sequence encoding a reporter molecule.

13. Фактор роста по п.7, экспрессируемый клеткой, содержащей экспрессирующий вектор по п.11 или 12.13. The growth factor according to claim 7, expressed by a cell containing an expression vector according to claim 11 or 12.

14. Фармацевтическая композиция для лечения или профилактики нарушений нервной системы, содержащая экспрессирующий вектор по п.11 или 12 вместе с фармацевтически приемлемым носителем, разбавителем или наполнителем.14. A pharmaceutical composition for treating or preventing nervous system disorders, comprising the expression vector of claim 11 or 12, together with a pharmaceutically acceptable carrier, diluent or excipient.

15. Фармацевтическая композиция для лечения или профилактики нарушений нервной системы, содержащая фактор роста по любому из пп.7-10 вместе с фармацевтически приемлемым носителем, разбавителем или наполнителем.15. A pharmaceutical composition for treating or preventing nervous system disorders, comprising the growth factor according to any one of claims 7 to 10, together with a pharmaceutically acceptable carrier, diluent or excipient.

16. Антитело, полученное с помощью фактора роста по п.7.16. The antibody obtained using the growth factor according to claim 7.

17. Способ обнаружения наличия фактора роста в образце, предусматривающий взаимодействие с указанным образцом антитела, способного связываться с фактором роста по п.7, и детектирование связывания указанного антитела с указанным фактором роста.17. A method for detecting the presence of a growth factor in a sample, comprising contacting with said sample an antibody capable of binding to the growth factor according to claim 7, and detecting the binding of said antibody to said growth factor.

18. Способ по п.17, в котором указанное антитело конъюгировано с репортерной молекулой.18. The method of claim 17, wherein said antibody is conjugated to a reporter molecule.

19. Набор или устройство для обнаружения наличия нейротрофического фактора роста в образце, содержащие антитело, способное связываться с фактором роста по п.7, и приспособление для осуществления взаимодействия указанного антитела с указанным образцом.19. A kit or device for detecting the presence of a neurotrophic growth factor in a sample, comprising an antibody capable of binding to the growth factor according to claim 7, and a device for interacting said antibody with said sample.

20. Способ идентификации агониста или антагониста нейротрофического фактора роста человека по п.7, предусматривающий взаимодействие клетки, ткани или организма, экспрессирующих рецептор указанного фактора роста, с испытуемым соединением в присутствии указанного фактора роста и сравнение уровней активации белка-предшественника протоонкогенного рецептора ret тирозиновой протеинкиназы (RET) в указанной клетке, ткани или организме с контрольным образцом, который не подвергали взаимодействию с указанным испытуемым соединением.20. The method for identifying a human neurotrophic growth factor agonist or antagonist according to claim 7, comprising interacting a cell, tissue or organism expressing a growth factor receptor with a test compound in the presence of said growth factor and comparing activation levels of a tyrosine protein kinase ret protonogenic receptor protein precursor (RET) in the specified cell, tissue or organism with a control sample that was not subjected to interaction with the specified test compound.

21. Способ идентификации агонистов или антагонистов нейротрофического фактора роста человека по п.7, предусматривающий взаимодействие клетки, ткани или организма, экспрессирующих соответствующий рецептор указанного фактора роста и белка-предшественника протоонкогенного рецептора ret тирозиновой протеинкиназы (cRET), с испытуемым соединением в присутствии указанного фактора роста, измерение уровня активации сигнальной киназы в каскаде трансдукции сигнала, частью которого является указанный рецептор, после добавления антитела, специфичного к указанной сигнальной киназе и конъюгированного с репортерной молекулой, по сравнению с клеткой, тканью или организмом, которые не подвергали взаимодействию с указанным соединением.21. The method for identifying agonists or antagonists of a neurotrophic human growth factor according to claim 7, comprising contacting a cell, tissue or organism expressing an appropriate receptor of said growth factor and a proton oncogenic protein tyrosine protein kinase (cRET) precursor receptor with a test compound in the presence of said factor growth, measuring the level of activation of signal kinase in the cascade of signal transduction, of which the specified receptor is a part, after adding antibodies specific o to the specified signal kinase and conjugated to a reporter molecule, compared with a cell, tissue or organism that has not been subjected to interaction with the specified compound.

22. Способ по п.20 или 21, в котором указанный нейротрофический фактор роста является эновином.22. The method according to claim 20 or 21, wherein said neurotrophic growth factor is enovin.

23. Способ по любому из пп.20-22, в котором указанная клетка, ткань или организм является клетками NIH 3Т3.23. The method according to any one of claims 20 to 22, wherein said cell, tissue or organism is NIH 3T3 cells.

24. Способ по любому из пп.21-23, в котором указанный рецептор является GFRαl, GFRα2, GFRα3 или GFRα4.24. The method according to any one of claims 21-23, wherein said receptor is GFRαl, GFRα2, GFRα3 or GFRα4.

25. Способ по любому из пп.21-24, в котором указанное антитело является специфичным к любой из МАР-киназы р42/р44, РКВ-киназы, c-jun, CREB, JNK/SAPIC-киназы.25. The method according to any one of claims 21-24, wherein said antibody is specific for any of p42 / p44 MAP kinase, PKB kinase, c-jun, CREB, JNK / SAPIC kinase.

26. Плазмида EVNmat/pRSETB, депонированная в коллекции LMBP под номером доступа LMBP 3931, кодирующая нейротрофический фактор роста человека по п.7.26. The plasmid EVNmat / pRSETB, deposited in the LMBP collection under accession number LMBP 3931, encoding the neurotrophic human growth factor according to claim 7.