JP2003505707A - System for small volume laser scanning cytometry - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】 本発明は生物学的マーカ識別用に改良された統合システムを提供する。生物学的流体（１０）の中で生物学的マーカの表現のパターンを測定するために、微小体積レーザ（１１）スキャニング顕微鏡法（ＭＬＳＣ）（１６）を使用する。システムはＭＬＳＣを実行するために改良された計測器を含んでおり、また改良された粒子検出及び分析法も含む。さらにシステムは、他の医療情報と提携してＭＬＳＣから得られたデータを分析するための情報処理システム・アーキテクチャを含む。 (57) SUMMARY The present invention provides an improved integrated system for biological marker identification. Microvolume laser (11) scanning microscopy (MLSC) (16) is used to measure the pattern of expression of biological markers in biological fluid (10). The system includes an improved instrument for performing MLSC, and also includes improved particle detection and analysis methods. Further, the system includes an information processing system architecture for analyzing data obtained from the MLSC in cooperation with other medical information.
Description
【０００１】発明の技術分野
本発明は、微小体積・レーザ・スキャニング・サイトメトリ（Ｍｉｃｒｏｖｏ
ｌｕｍｅ Ｌａｓｅｒ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｃｙｔｏｍｅｔｙ）（ＭＬＳＣ）を
用いる、生物学的マーカ（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｍａｒｋｅｒ）の分析に関係
する。本発明は、ＭＬＳＣを実行するための計測器、その計測器から得られるイ
メージデータを分析するためのシステム、及び生物学的マーカ・データ及び医療
情報の統合分析を行うための情報処理システムを含む。発明の背景
遺伝子技術（ｇｅｎｏｍｉｃｓ）、組合わせ化学、及び高スループット・スク
リーニングを含む薬品発見における新しい技術革新の結果、臨床試験に利用可能
な薬品候補の数が、製薬産業の開発及び経済的許容量を超過している。１９９８
年、世界トップの薬品会社及びバイオテクノロジ会社は、研究開発に５００億ド
ル以上を費やし、そのうちの３分の１以上が、臨床開発に直接費やされた。増大
する競合、並びに管理医療組織及び他の支払人からの圧力を含む多くの要因の結
果、製薬産業は、市場に出される新薬の安全性及び効率性を含めた品質向上、並
びに臨床開発の効率の改善を求めている。[0001] Technical Field of the Invention The present invention, micro-volume laser scanning cytometry (Microvo
It concerns the analysis of biological markers using the lumen Laser Scanning Cytometry (MLSC). The present invention includes an instrument for performing MLSC, a system for analyzing image data obtained from the instrument, and an information processing system for performing integrated analysis of biological marker data and medical information. . Background of the Invention As a result of new innovations in drug discovery, including genetics, combinatorial chemistry, and high-throughput screening, the number of drug candidates available for clinical trials is driven by the pharmaceutical industry's development and economic capacity. Is exceeded. 1998
During the year, the world's top pharmaceutical and biotechnology companies spent more than $ 50 billion on research and development, more than one-third of which was spent directly on clinical development. As a result of a number of factors, including increased competition and pressure from managed healthcare organizations and other payers, the pharmaceutical industry is improving the quality and safety of new drugs on the market, as well as the efficiency of clinical development. Seeking improvement.
【０００２】
したがって、最近の薬品発見の技術革新が、臨床試験を困難にする一因となっ
た。確認されている治療ターゲット、並びに生成されている鉛化合物の数は、現
時点で実行されているような、製薬会社が臨床試験を行なう容量をはるかに越え
ている。さらに、新薬を開発する平均コストがほぼ５億ドルであると当産業が現
時点で推定しているように、可能性のある薬品候補のすべてを開発することは法
外に費用がかかる。Therefore, recent drug discovery innovations have contributed to the difficulty of clinical trials. The identified therapeutic targets, as well as the number of lead compounds being produced, are far beyond the capacity of pharmaceutical companies to conduct clinical trials, as currently practiced. Moreover, developing all of the potential drug candidates is prohibitively expensive, as the industry currently estimates that the average cost of developing a new drug is approximately $ 500 million.
【０００３】
製薬産業は、薬品開発における相応の技術改善を求めるよう迫られている。臨
床試験は非常に高価で、非常にリスクのある状態のままであり、多くの場合、意
志決定が非常に主観的な分析に基づいてなされている。その結果、薬品が最も有
効な患者母集団、所定の薬品に対する適切な服用量、及びその使用に伴う副作用
の可能性を、判定することは多くの場合困難である。このことは、臨床開発にお
いて、より多くの障害をもたらすだけでなく、不適切に服用され、処方され、あ
るいは危険な副作用を引き起こすかもしれない製品が承認されることになること
もある。それらの進行中の薬品数が増加するにつれて、製薬会社は、薬品開発工
程の初期において、薬品候補の安全性及び効能のプロフィールについての客観的
な測定値を確認する技術を必要としている。The pharmaceutical industry is under pressure to seek corresponding technological improvements in drug development. Clinical trials remain very expensive, remain at very high risk, and decision making is often based on very subjective analysis. As a result, it is often difficult to determine the patient population in which a drug is most effective, the appropriate dose for a given drug, and the potential side effects associated with its use. This may lead to more obstacles in clinical development as well as approval of products that may be inappropriately taken, prescribed or cause dangerous side effects. As the number of their on-going drugs increases, pharmaceutical companies need the technology to ascertain objective measures of the safety and efficacy profile of drug candidates early in the drug development process.
【０００４】
生物学的マーカは、測定されたり、あるいは評価される時に、通常の生物学的
なプロセス、病原性のプロセス、又は治療の介入に対する薬理学的な反応、に関
する指標として、離散関係あるいは相関を持つ特性である。治療の介入に対する
薬理学的な反応は、以下に限定されるものではないが、介入に対する一般的な反
応（例えば効能）、介入に対する服用量反応、介入による副作用のプロフィール
、並びに薬品代謝の速さ及び薬品代謝の確認といったような薬物動態学の特性、
を含む。反応は、特効があるか、又はその逆に作用する（例えば有毒な）変化の
どちらかと相関する。生物学的マーカは、病理学的なプロセスと関連して変化し
、診断値及び／又は予想値を持つ、セル又は分子のパターンを含む。生物学的マ
ーカは、セル母集団及びそれらの関係する分子のレベル、可溶性要素のレベル、
他の分子のレベル、遺伝子発現レベル、遺伝子突然変異、並びに病気の存在及び
／又は進行と相関する臨床パラメータを含む。病気の進行又は再発といったよう
な臨床エンドポイント、あるいは生活の質の測定（通常、評価に長時間を要する
）とは対照的に、生物学的マーカは、薬品の臨床的なプロフィールについてより
迅速な量的な測定を提供することができる。臨床業務及び薬品開発の両方におい
て現時点で用いられる単一の生物学的マーカは、コレステロール、前立腺の特定
抗原（「ＰＳＡ」）、ＣＤ４Ｔセル、及びウイルスＲＮＡを含む。高コレステロ
ールと心臓病との間、ＰＳＡと前立腺癌との間、及びＣＤ４プラスＴセルの減少
とエイズのウイルスＲＮＡとの間で、よく知られている相関とは異なって、他の
ほとんどの病気と相関する生物学的マーカは、まだ確認されていない。その結果
、政府機関及び製薬会社の両方が、臨床試験で使用するための生物学的マーカの
開発をますます求めているが、薬品開発における生物学的マーカの使用は、現在
まで制限されてきた。Biological markers, when measured or evaluated, are used as indicators of normal biological processes, pathogenic processes, or pharmacological responses to therapeutic intervention, in discrete relationships or It is a characteristic that has a correlation. Pharmacological responses to therapeutic interventions include, but are not limited to, general response to the intervention (eg, efficacy), dose response to the intervention, side effect profile of the intervention, and rate of drug metabolism. And pharmacokinetic properties such as confirmation of drug metabolism,
including. Responses correlate with either specific effects or vice versa (eg, toxic) changes. Biological markers include patterns of cells or molecules that change in association with pathological processes and have diagnostic and / or predictive values. Biological markers include levels of cell populations and their associated molecules, levels of soluble elements,
Includes clinical parameters that correlate with levels of other molecules, gene expression levels, gene mutations, and the presence and / or progression of disease. In contrast to clinical endpoints such as disease progression or recurrence, or quality of life measurements (which usually take a long time to evaluate), biological markers provide a more rapid assessment of a drug's clinical profile. A quantitative measurement can be provided. Single biological markers currently used in both clinical practice and drug development include cholesterol, prostate specific antigen (“PSA”), CD4 T cells, and viral RNA. Unlike most well-known correlations between high cholesterol and heart disease, between PSA and prostate cancer, and between reduced CD4 plus T cells and AIDS viral RNA, most other diseases Biological markers that correlate with have not yet been identified. As a result, both government agencies and pharmaceutical companies are increasingly demanding the development of biological markers for use in clinical trials, although the use of biological markers in drug development has been limited to date. .
【０００５】
病気、病気進行、及び治療法に対する反応、並びに生物学的マーカとの相関を
確立するために必要とされる膨大な量の情報を分類することができる生物学的マ
ーカ同定システムに対するニーズがある。そのような生物学的マーカ同定システ
ムは、１９９９年４月２６日に提出された「Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍａｒｋｅ
ｒ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（生物学的マーカ同定システ
ム）」と題された米国暫定特許出願第６０／１３１，１０５号、並びにこの出願
と同時に提出された「Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍ
ａｒｋｅｒ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（フェノタイプおよ
び生物学的マーカ同定システム）」と題され共に所有されている米国実用出願に
おいて、記述されており、それらは共に、その全体がここに参考文献として明確
に組み入れられる。この技術は、何百から何千という生物学的マーカを測定する
のに必要とされる計測器、このデータが容易にアクセスされるようにする情報処
理システム、マーカのパターンを臨床データと相関させるソフトウェア、及びそ
の結果として生じる情報を薬品開発工程内に利用する能力を含む。そのシステム
は微小体積・レーザ・スキャニング・サイトメトリ（ＭＬＳＣ）を広範囲に利用
する。The need for a biological marker identification system that can classify the vast amount of information needed to establish correlations with disease, disease progression, and treatment, and biological markers. There is. Such a biological marker identification system is described in "Biological Marke", submitted April 26, 1999.
US Provisional Patent Application No. 60 / 131,105 entitled "r Identification System" and "Phenotype and Biological M" filed concurrently with this application.
Both are described in a co-owned US utility application entitled "Arker Identification System" (Phenotype and Biological Marker Identification System), both of which are expressly incorporated herein by reference in their entireties. This technique involves measuring instruments needed to measure hundreds to thousands of biological markers, information processing systems that make this data easily accessible, and correlating marker patterns with clinical data. Includes the ability to utilize the software and the resulting information in the drug development process. The system makes extensive use of microvolume laser scanning cytometry (MLSC).
【０００６】
マーカ同定システムの望ましい実施形態では、生物学的流体を、その流体内の
特定の分子と結び付くことのできる１つ以上の蛍光標識付けされた検出分子と接
触させる。通常、その生物学的流体は血液サンプルで、検出分子は、１つ以上の
サブタイプの血液セルの上あるいは中に存在するセル会合分子に特有の蛍光染料
で標識付けされた抗体である。その後、標識付けされたサンプルが毛細管に置か
れ、その毛細管がＭＬＳＣ器具に取り付けられる。この器具は、顕微鏡の対物レ
ンズを通って血液サンプルに向けられたレーザ光を走査する。サンプルから発っ
せられる螢光は、顕微鏡の対物レンズによって収集され、各蛍光チャンネル内の
サンプルの画像が形成される一連の光電子増倍管に渡される。その後、そのシス
テムは、セルを識別するために各チャンネルからの生の画像を処理し、次に、螢
光抗体で標識付けられた各タイプのセルに対して、完全なセル数、及び相対的な
抗原密度レベルを決定する。In a preferred embodiment of the marker identification system, a biological fluid is contacted with one or more fluorescently labeled detection molecules that can associate with specific molecules within the fluid. Usually the biological fluid is a blood sample and the detection molecule is an antibody labeled with a fluorescent dye characteristic of cell-associated molecules present on or in one or more subtypes of blood cells. The labeled sample is then placed in the capillary and the capillary is attached to the MLSC instrument. The instrument scans laser light directed at a blood sample through a microscope objective. The fluorescence emanating from the sample is collected by a microscope objective and passed to a series of photomultiplier tubes where an image of the sample in each fluorescence channel is formed. The system then processes the raw image from each channel to identify the cells, then for each type of cell labeled with a fluorescent antibody, the complete cell number and relative Different antigen density levels.
【０００７】
またマーカＭＬＳＣは、生物学的流体内の可溶性要素の量を計るために、その
要素に対する蛍光標識付けされた二次抗体に加えて、その要素に対する微小球体
束縛一次抗体を用いることによって、使用されることができる。そうすることで
、その要素は、微小球体に結び付けられ、その結び付けられた要素を、二次抗体
の結合が蛍光で標識付けする。この実施形態におけるシステムは、溶性の各要素
の濃度を決定するために、血液サンプル内の各ビードに関する蛍光信号を測定す
る。複数のビード・タイプ（各々が異なる一次抗体と結合する）を用いることに
より、同じサンプル量で複数の分析を実行することが可能である。各ビード・タ
イプを識別するために、異なるビードが別個のサイズを持つか、又は異なる内部
の色を持つか、あるいは各二次抗体が異なる蛍光体で標識付けされる。[0007] The marker MLSC also uses a microsphere-bound primary antibody to the element in addition to a fluorescently labeled secondary antibody to that element to quantify the amount of soluble elements in the biological fluid. , Can be used. In doing so, the element is bound to the microsphere, and binding of the secondary antibody fluorescently labels the bound element. The system in this embodiment measures the fluorescence signal for each bead in the blood sample to determine the concentration of each soluble component. By using multiple bead types, each binding a different primary antibody, it is possible to perform multiple analyzes with the same sample volume. Different beads have different sizes, or have different internal colors, or each secondary antibody is labeled with a different fluorophore to identify each bead type.
【０００８】
本発明の望ましい実施形態は、生物学的マーカを検知するために抗体を用いる
が、特に特定の生物学的マーカに結び付くことのできる任意の他の検出分子も意
図される。例えば、様々なタイプの受容分子は、蛍光標識付けされた同系統の配
位子との相互作用を通して検知されることができる。Although the preferred embodiment of the present invention uses antibodies to detect biological markers, any other detection molecule that is capable of specifically binding to a particular biological marker is also contemplated. For example, different types of acceptor molecules can be detected through interaction with fluorescently labeled cognate ligands.
【０００９】
分析の対象であったセル母集団及び可溶性要素に関するデータを作成するため
に、ＭＬＳＣ器具からの生データが、画像分析ソフトウェアによって処理される
。その後、このデータがデータベースに転送される。生物学的マーカと病気又は
医療条件との間の相関を確立する目的で、このセル母集団及び可溶性要素のデー
タに加えて格納されることができる他のデータは、それに制限されるものではな
いが、薬品投与と薬物生体反応（身体内での薬品の濃度とその代謝の測定）、並
びに個人の年齢、性、体重、身長、体型、病歴（病的状態と同等のもの、投薬な
どを含む）、（もしあれば）病気又は医療条件の発現と分類、及び医師によって
なされた他の標準的な臨床観察を含む臨床パラメータ、を含む。また臨床パラメ
ータに含まれるものは、それに制限されるものではないが、標準ＥＬＩＳＡテス
ト、酵素活性に対する比色機能検定、及び質量分光測定を含む、個人の体液の中
に存在する特定分子の濃度を測定するための他の技術から得られる結果だけでな
く、環境的な及び家系的な履歴要素である。またデータは、レントゲン写真、脳
のスキャン、又はＭＲＩといったようなイメージ、あるいは個人の状態について
の生体組織検査、心電図、ストレステスト又は他の測定から得られる情報を含む
。Raw data from the MLSC instrument is processed by image analysis software to generate data regarding the cell population and soluble elements that were analyzed. This data is then transferred to the database. Other data that may be stored in addition to this cell population and soluble element data for the purpose of establishing a correlation between a biological marker and a disease or medical condition is not so limited. Include drug administration and drug biological reactions (measurement of drug concentration and metabolism in the body), as well as individual age, sex, weight, height, body type, medical history (equivalent to morbidity, medication, etc.) ), Clinical parameters including the manifestation and classification of disease or medical conditions (if any), and other standard clinical observations made by a physician. Also included in clinical parameters are, but are not limited to, standard ELISA tests, colorimetric functional assays for enzyme activity, and mass spectrometric measurements of the concentration of specific molecules present in an individual's body fluids. It is an environmental and family history element as well as results obtained from other techniques for measuring. The data also includes images such as radiographs, brain scans, or MRIs, or information obtained from biopsies, electrocardiograms, stress tests or other measurements of an individual's condition.
【００１０】
そうして情報処理システムは、ａ）そのデータを、（同じ個人から、病気の進
行又は治療評価目的のいずれかから）格納されているプロフィールと、及び／又
は（病気診断用の）他の個人からのプロフィールとを比較し、そしてｂ）新しい
プロフィールを引き出すためにそのデータを「調べる」。このような方法で、診
断及び前兆となる情報がデータベースから得られ、引き出されることができる。
１９９９年４月２６日に提出された米国特許出願第６０／１３１，１０５号の「
Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍａｒｋｅｒ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓ
ｔｅｍ（生物学的マーカ同定システム）」と、共通に所有される米国実用出願に
おいて、この出願と同時に提出された「Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃ
ａｌ Ｍａｒｋｅｒ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（フェノタ
イプの生物学的マーカ同定システム）」と題された出願との両方が、参考文献と
してその全体がここに組み入れられ、多くの様々なアプリケーションにおいて、
ＭＬＳＣの用途が非常に詳しく記述される。システムは、従来の技術システムが
ドナー・サンプル中の変動によって妨げられる分析であっても、強い一貫した分
析データを提供することができる。アプリケーションは、病気進行中及び治療中
の、セルタイプ母集団の変化及び可溶性要素の変化を測定するためにＭＬＳＣの
使用を含む。例えば、ＭＬＳＣは多発性硬化症及び慢性関節リウマチに対する斬
新な生物学的マーカを識別するために用いられることができる。発明の概要
本発明は微小体積・レーザ・スキャニング・サイトメトリ（ＭＬＳＣ）を実行
するために改良されたシステムを提供する。システムはＳｕｒｒｏＳｃａｎシス
テムと名付けられる。それは、可変の走査速度で動作することができ、かつ、４
つの異なる蛍光チャンネル内で同時にデータを収集することができる改良された
ＭＬＳＣ器具を含む。本発明は、ＭＬＳＣ器具から得られた生データ上でイメー
ジ処理を実行するための改良された方法、及び関連データベース内でこのデータ
を機能させる改良された方法を含む。ここで記述される改良点は、高速で多要素
からなる病気データベースの構築及び使用を大いに促進する。このデータベース
は、ユーザが、ａ）前兆となる結果又は診断に役立つ結果を得るために、レーザ
・スキャニング・サイトメータで得られた血液プロフィールを、よく知られた病
気で苦しむ個人について格納されたプロフィールと比較できるようにし、そして
ｂ）ユーザが特定の病気に対する新しい前兆及び診断に役立つプロフィールを速
やかに構築できるようにし、ｃ）生物学的マーカのパターンと任意の器官内の病
気との間の新しい関連を発見できるようにする。発明の詳細な記述 定義
ここで用いられているような用語「生物学的マーカ」又は「マーカ」あるいは
「バイオマーカ」は、通常の生物学的工程、病原性工程、又は治療の介入に対す
る薬理学的反応の、インディケータとして測定され数値を求められる特性を意味
する。治療の介入に対する薬理学的反応は、制限されるものではないが、一般的
な介入に対する反応（例えば効能）、服用量による介入に対する反応、介入の副
作用プロフィール、及び薬物動態学的特性を含む。反応は、有効であるか、又は
その逆の（例えば有毒な）変化と相関する。生物学的マーカは、病理学的工程に
関連して変化し、かつ診断及び／又は前兆となる値を持つ、セル又は分子のパタ
ーン又は集合を含む。The information processing system may then a) store the data with a stored profile (either from the same individual, either for disease progression or for therapeutic evaluation purposes) and / or (for disease diagnosis). Compare profiles from other individuals, and b) "examine" the data to derive new profiles. In this way, diagnostic and predictive information can be obtained and retrieved from the database.
U.S. Patent Application No. 60 / 131,105, filed April 26, 1999, entitled "
Biological Marker Identification Systems
tem (Biological Marker Identification System) "and" Phenotype Biological ", which were filed concurrently with this application in a commonly owned US utility
Both the application entitled “Al Marker Identification System”, which is incorporated herein by reference in its entirety, in many different applications.
The use of MLSC is described in great detail. The system can provide strong and consistent analytical data, even for assays where prior art systems are hampered by variability in donor samples. Applications include the use of MLSCs to measure changes in cell type populations and changes in soluble elements during disease progression and treatment. For example, MLSCs can be used to identify novel biological markers for multiple sclerosis and rheumatoid arthritis. SUMMARY OF THE INVENTION The present invention provides an improved system for performing microvolume laser scanning cytometry (MLSC). The system is named the SurroScan system. It can operate at variable scan speeds and 4
It includes an improved MLSC instrument that can collect data simultaneously in two different fluorescence channels. The present invention includes improved methods for performing image processing on raw data obtained from MLSC instruments, and improved methods of operating this data in associated databases. The improvements described herein greatly facilitate the construction and use of a fast, multi-component disease database. This database stores a blood profile obtained by a laser scanning cytometer for a user to obtain a) a precursory or diagnostic result, a profile stored for individuals suffering from well-known illnesses. And b) allow the user to quickly build new aura and diagnostic profiles for a particular disease, and c) a new between the pattern of biological markers and the disease in any organ. Allows you to discover relationships. DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Definitions As used herein, the term "biological marker" or "marker" or "biomarker" refers to pharmacology to normal biological processes, pathogenic processes, or therapeutic intervention. It means the characteristic of a physical reaction that can be measured and quantified as an indicator. Pharmacological responses to therapeutic interventions include, but are not limited to, general response to interventions (eg, efficacy), response to dose intervention, side effect profile of the intervention, and pharmacokinetic profile. The response correlates with an effective (or toxic) change, or vice versa. Biological markers include patterns or collections of cells or molecules that have a variable and diagnostic and / or predictive value associated with a pathological process.
【００１１】
生物学的マーカは、制限されるものではないが、病気の存在及び進行、並びに
治療に対する通常の生物学的工程及び反応と相関する、セル母集団の総数、並び
に会合分子のレベル、可溶性要素のレベル、他の分子のレベル、遺伝子発現レベ
ル、遺伝子突然変異、及び臨床パラメータを含む。臨床業務及び薬品開発の両方
において現時点で用いられる単一の生物学的マーカは、コレステロール、ＰＳＡ
、ＣＤ４Ｔセル、及びウイルスＲＮＡを含む。高コレステロールと心臓病、ＰＳ
Ａと前立腺がん、並びにＣＤ４プラスＴセル及びウイルスＲＮＡとエイズ、の間
でよく知られている相関とは異なって、他のほとんどの病気と相関する生物学的
マーカは、まだ確認されていない。その結果、政府機関及び製薬会社の両者が、
臨床試験で使用するための生物学的マーカの開発を一層求めているけれども、薬
品開発における生物学的マーカの使用は、現在のところ制限されている。Biological markers include, but are not limited to, the total number of cell populations and levels of associated molecules that correlate with the presence and progression of disease, and normal biological processes and responses to treatment. Includes levels of soluble elements, levels of other molecules, gene expression levels, gene mutations, and clinical parameters. The only biological markers currently used in both clinical practice and drug development are cholesterol, PSA
, CD4 T cells, and viral RNA. High cholesterol and heart disease, PS
Biological markers that correlate with most other diseases, unlike the well-known correlation between A and prostate cancer, and CD4 plus T cells and viral RNA and AIDS, have not yet been identified. . As a result, both government agencies and pharmaceutical companies
Although further demanding the development of biological markers for use in clinical trials, the use of biological markers in drug development is currently limited.
【００１２】
制限されるものではないが、例として、生物学的マーカは、通常の生物学的状
態、病気、又は医療条件と個々別々の関係を持つとしばしば考えられていて、例
えば、高コレステロールは心臓病の危険を増大させることに関連し、高いＰＳＡ
レベルは前立腺がんの危険を増大させることに関連し、ＣＤ４Ｔセルの減少及び
ウイルスＲＮＡの増大はエイズの存在／進行と関連する。しかしながら、様々な
病気又は医療条件に対して有効なマーカが、非常に複雑なパターンから成ること
は、かなりよくあることである。例えば、特定のセルタイプ上での１つ以上の特
定のセル表面抗原レベルの低下が、高レベルの１つ以上の溶性タンパク質、恐ら
くサイトカインと共に発見される場合、それが特定の自己免疫疾患を示すもので
あると発見されることがある。したがって、本発明の目的のために、生物学的マ
ーカは多くのインディケータのパターンを参照する。By way of example, but not limitation, biological markers are often considered to have a discrete relationship with normal biological conditions, diseases, or medical conditions, such as high cholesterol. Is associated with increased risk of heart disease and high PSA
Levels are associated with increased risk of prostate cancer and decreased CD4 T cells and increased viral RNA are associated with the presence / progress of AIDS. However, it is quite common for effective markers for various diseases or medical conditions to consist of very complex patterns. For example, if a decrease in the level of one or more particular cell surface antigens on a particular cell type is found with high levels of one or more soluble proteins, perhaps cytokines, it indicates a particular autoimmune disease. It can be found to be a thing. Therefore, for the purposes of the present invention, biological markers refer to patterns of many indicators.
【００１３】
ここで用いられる用語「生物学的マーカ同定システム」は、患者母集団から情
報を得て、データの相関関係及び生物学的マーカの識別を可能にするやり方で、
その情報を消化するためのシステムを意味する。患者母集団は任意の生物体を含
むことができる。生物学的マーカ同定システムは、複数のデータカテゴリからな
る統合データベースと、前記データカテゴリの各々に対応する複数の個人からの
データと、データカテゴリ内のデータを相互に関係づけるための処理手段とから
なり、前記病気又は医療条件を持つ個人を、前記病気又は医療条件を持たない個
人と区別することができるように、データカテゴリ又はカテゴリを識別するため
のデータカテゴリの相関分析がなされることが可能であり、また前記識別された
カテゴリ（複数可）が前記病気又は医療条件に対するマーカである。さらにマー
カは、異なる時点、例えば薬品投与の前と後で、一人の個人に対する様々なデー
タ・カテゴリ内のデータを比較することにより識別されることができる。Ｓｕｒ
ｒｏＳｃａｎシステムと名付けられた本出願であるＭＬＳＣシステムは、生物学
的マーカ同定システムの１つの例である。As used herein, the term “biological marker identification system” is a way of obtaining information from a patient population, enabling correlation of data and identification of biological markers,
It means a system for digesting that information. The patient population can include any organism. The biological marker identification system comprises an integrated database consisting of a plurality of data categories, data from a plurality of individuals corresponding to each of the data categories, and processing means for correlating the data within the data categories. Correlation analysis of the data categories to identify the data categories or the categories can be made so that an individual with the illness or medical condition can be distinguished from an individual without the illness or medical condition. And the identified category (s) are markers for the disease or medical condition. In addition, markers can be identified by comparing data in different data categories for an individual at different times, eg before and after drug administration. Sur
The present application, the MLSC system, named the roScan system, is one example of a biological marker identification system.
【００１４】
ここで用いられる用語「データ・カテゴリ」は、個人の差分を識別することが
できる測定のタイプを意味する。本発明において有用であるデータ・カテゴリの
例は、制限されるものではないが、個人の生物学的流体内での多くのそして何タ
イプものセル母集団及びそれらの関連する分子と、個人の生物学的流体内での多
くのそして何タイプもの可溶性要素と、個人の臨床パラメータに関連する情報と
、個人の生物学的流体内での１ｍｌ当たりのセルの容積測定カウントと、個人の
生物学的流体内での多くのそして何タイプもの小さな分子と、個人のＤＮＡに関
連するゲノム情報とを含む。例えば、単一のデータ・カテゴリは、個人の血液内
のＩＬ−１の濃度に相当する。さらに、あるデータ・カテゴリは、血液又は尿内
の薬品又はその代謝のレベルであってもよい。データ・カテゴリのさらなる例は
、ＣＤ４Ｔセルの確実な総数である。As used herein, the term “data category” means a type of measurement that can identify individual differences. Examples of data categories that are useful in the present invention include, but are not limited to, many and many types of cell populations and their associated molecules within an individual's biological fluid, as well as the organisms of an individual. Many and many types of soluble elements in biological fluids, information relating to the individual's clinical parameters, volumetric counts of cells per ml in the individual's biological fluid, and individual biological parameters It contains many and many types of small molecules in fluids, as well as genomic information related to the DNA of an individual. For example, a single data category corresponds to the concentration of IL-1 in the blood of an individual. In addition, one data category may be the level of drugs or their metabolism in blood or urine. A further example of a data category is a definite total number of CD4T cells.
【００１５】
ここで用いられる用語「生物学的流体」は、限定されるものではないが、血液
（全血、赤血球の溶解によって作られる白血球、周辺の血液単核セル、血しょう
、及び血清を含む）、痰、唾液、尿、***、脳脊髄液、気管支の吸引液、汗、便
、関節液、リンパ液、涙、また任意の器官から得られる柔らかくされた組織を含
む任意の生物学的物質を意味する。生物学的流体は、通常は、セルとそれらの会
合分子、可溶性要素、小分子、及び他の物質を含む。血液は、多くの理由のため
に、本発明における望ましい生物学的流体である。まず第１に、血液は容易に利
用可能で、複数回、抜き取ることができる。血液は、時間が経てば、骨髄内の前
駆（セル）から部分的に補充される。血液は抗原投与に反応し、抗原投与につい
ての記憶を保つ。血液は中心に配置され、再循環し、潜在的に身体全体にわたる
変化について伝える。血液は、表面の分子、内部の分子、及び個々のセルに関連
して分泌された分子を含む、多数のセル母集団を含む。また血液は、サイトカイ
ン、抗体、及び急性期タンパク質などのような自分自身のものと、伝染病に関す
る化学薬品及び製品のような外部からのものとの両方である、可溶性要素を含む
。The term “biological fluid” as used herein includes, but is not limited to, blood (whole blood, white blood cells made by lysis of red blood cells, surrounding blood mononuclear cells, plasma, and serum). , Sputum, saliva, urine, semen, cerebrospinal fluid, bronchial aspirate, sweat, stool, synovial fluid, lymph, tears, and any biological material including softened tissue from any organ. Means Biological fluids typically include cells and their associated molecules, soluble elements, small molecules, and other substances. Blood is a desirable biological fluid in the present invention for many reasons. First of all, blood is readily available and can be withdrawn multiple times. Blood is partially replenished over time from precursors (cells) in the bone marrow. Blood responds to challenge and retains memory about challenge. Blood is centrally located, recirculating, and potentially telling about changes throughout the body. Blood contains a large population of cells, including surface molecules, internal molecules, and secreted molecules associated with individual cells. Blood also contains soluble elements, both of its own, such as cytokines, antibodies, and acute phase proteins, and of external sources, such as infectious disease chemicals and products.
【００１６】
ここで用いられる用語「セル母集団」は、共通の特性を備えたセル一式を意味
する。その特性は、１、２、３、又はそれ以上のセル会合分子の存在及びレベル
、サイズなどを含む。１、２、又はそれ以上のセル会合分子は、セル母集団を定
義することができる。一般的には、いくつかの追加のセル会合分子が、１つのセ
ル母集団をさらにサブ組化するために使用されることができる。セル母集団は、
母集団レベルで識別されるのであって、タンパク質レベルで識別されのではない
。セル母集団は、１、２、又はそれ以上のセルによって定義されることができる
。いかなるセル母集団も潜在的なマーカである。As used herein, the term “cell population” means a set of cells with common characteristics. The characteristics include the presence and level of one, two, three, or more cell-associated molecules, size, and the like. One, two, or more cell-associated molecules can define a cell population. In general, some additional cell-associated molecules can be used to further subgroup one cell population. The cell population is
They are identified at the population level, not at the protein level. A cell population can be defined by one, two, or more cells. Any cell population is a potential marker.
【００１７】
ここで用いられる用語「セル会合分子」は、セルに関連するいかなる分子もを
意味する。これは、次のものに制限されるものではないが、１）タンパク質、糖
タンパク質、脂質、及び糖脂質のような本来備わっているセル表面分子、２）そ
の受容体に結び付くサイトカイン、Ｆｃ受容体に結び付く免疫グロブリン、Ｂセ
ル又はＴセル受容器に結び付く外部からの抗体、及び自己抗原に結び付く自己抗
体、のような外来的なセル表面分子、３）セル質のタンパク質、糖質、脂質、及
びｍＲＮＡのような本来備わっている内部分子、並びに核のタンパク質及びＤＮ
Ａ（ゲノム及び身体の核酸を含む）、４）ウイルス・タンパク質及び核酸のよう
な外来的な内部分子、を含む。望ましいセル会合分子は、通常はセル表面のタン
パク質である。一例として、白血球分化抗原（現時点でＣＤ−１６６を通してＣ
Ｄ抗原を含む）、（Ｂセル受容体及びＴセル受容体のような）抗原受容器、及び
主要組織適合複合体を含む、何百もの白血球のセル表面タンパク質又は抗原があ
る。これらの部類の各々は、莫大な数のタンパク質を包含する。The term “cell associated molecule” as used herein means any molecule associated with a cell. This includes, but is not limited to, 1) innate cell surface molecules such as proteins, glycoproteins, lipids, and glycolipids, 2) cytokines that bind to its receptor, the Fc receptor. Foreign cell surface molecules such as immunoglobulins that bind to, antibody from the outside that binds to B cell or T cell receptors, and autoantibodies that bind to autoantigens, 3) cellular proteins, carbohydrates, lipids, and Intrinsic internal molecules such as mRNA, as well as nuclear proteins and DNs
A (including genomic and body nucleic acids), 4) exogenous internal molecules such as viral proteins and nucleic acids. The preferred cell-associated molecule is usually a cell surface protein. As an example, leukocyte differentiation antigen (currently C-CD through CD-166
There are hundreds of leukocyte cell surface proteins or antigens, including the D antigen), antigen receptors (such as the B and T cell receptors), and the major histocompatibility complex. Each of these classes contains a vast number of proteins.
【００１８】
ここで用いられる用語「可溶性要素」は、生物学的流体、通常は血液内で発見
されるすべての可溶性の分子を意味する。可溶性要素は、制限されるものではな
いが、溶性タンパク質、糖質、脂質、リポタンパク質、ステロイド類、他の小分
子、並びに前述の成分の任意の複合体、例えばサイトカインと溶性受容体、抗体
と抗原、及び任意のものに複合する薬品、を含む。可溶性要素には、サイトカイ
ン、抗体、急性期タンパク質などのような自分自身のものと、伝染病の化学薬品
及び製品のような外部からのものとの両方がある。可溶性要素は、本来備わって
いるもの、つまり、個人によって作成されたものであるか、あるいはビールス、
薬品又は環境上の毒素のような外来性のものである。可溶性要素はプロスタグラ
ンディン、ビタミン、代謝物質（鉄、糖類、アミノ酸などのような）、薬品及び
薬品代謝のような小さな分子化合物でありうる。The term “soluble element” as used herein refers to all soluble molecules found in biological fluids, usually blood. Soluble elements include, but are not limited to, soluble proteins, carbohydrates, lipids, lipoproteins, steroids, other small molecules, as well as any complex of the foregoing components, such as cytokines and soluble receptors, antibodies. Includes antigens and drugs that complex to any. Soluble elements can be both self-contained, such as cytokines, antibodies, acute phase proteins, etc., as well as external, such as infectious disease chemicals and products. Soluble elements are those that are native, that is, created by an individual, or
It is an exogenous substance such as a drug or an environmental toxin. Soluble elements can be small molecular compounds such as prostaglandins, vitamins, metabolites (such as iron, sugars, amino acids, etc.), drugs and drug metabolism.
【００１９】
ここで用いられる用語「小分子」又は「器官分子」あるいは「小器官分子」は
、２〜２０００の範囲内の分子量を持つ、可溶性要素あるいはセルに関連する要
素を意味する。小分子は、制限されるものではないが、プロスタグランディン、
ビタミン、代謝物質（鉄、糖類、アミノ酸などのような）、薬品、及び薬品代謝
を含む。１つの重要な実施形態では、ＭＬＳＣシステムが、治療法制度中に他の
生物学的マーカと力を合わせて、生物学的流体内での薬品濃度及び薬品代謝の変
化を測定するために用いられる。The term “small molecule” or “organ molecule” or “organ molecule” as used herein means a soluble element or an element associated with a cell having a molecular weight in the range of 2-2000. Small molecules include, but are not limited to, prostaglandin,
Includes vitamins, metabolites (such as iron, sugars, amino acids, etc.), drugs, and drug metabolism. In one important embodiment, the MLSC system is used to work with other biological markers during the regimen to measure changes in drug concentration and drug metabolism within biological fluids. .
【００２０】
ここで用いられる用語「病気」又は「医療条件」は、任意の生体内での身体機
能、システム、あるいは器官の、障害、休止、不調又は変化を意味する。病気又
は医療条件の例は、制限されるものではないが、免疫欠乏及び炎症性の状態、癌
、心臓血管の病気、伝染病、精神医学的状態、肥満症、また他のそのような病気
を含む。図解の方法で、免疫及び炎症性の状態は、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、
多発性硬化症（ＭＳ）、糖尿病などをさらに含む自己免疫疾患を含む。As used herein, the term “disease” or “medical condition” means a disorder, cessation, upset or alteration of any in-vivo physical function, system or organ. Examples of diseases or medical conditions include, but are not limited to, immunodeficiency and inflammatory conditions, cancer, cardiovascular diseases, infectious diseases, psychiatric conditions, obesity, and other such diseases. Including. In an illustrated manner, immune and inflammatory conditions can be determined by rheumatoid arthritis (RA),
Includes autoimmune diseases further including multiple sclerosis (MS), diabetes and the like.
【００２１】
ここで用いられる用語「臨床パラメータ」は、病気又は医療条件に関連する臨
床的なセッティングにおいて得られる情報を意味する。臨床パラメータの例は、
制限されるものではないが、年齢、性、体重、身長、身体タイプ、病歴、民族性
、家族の履歴、遺伝要素、環境要因、病気又は医療条件の発現と分類、並びに、
血圧、ＭＲＩ、レントゲン写真などのような任意の臨床的な実験テストの結果を
含む。As used herein, the term “clinical parameter” means the information gained in the clinical setting associated with a disease or medical condition. Examples of clinical parameters are
Without limitation, age, sex, weight, height, body type, medical history, ethnicity, family history, genetic factors, environmental factors, manifestations and classifications of diseases or medical conditions, and
Includes the results of any clinical laboratory tests such as blood pressure, MRI, radiographs, etc.
【００２２】
ここで用いられる用語「臨床エンドポイント」は、患者がどのように感じ、機
能し、生存しているかを測定する特性又は変数を意味する。
ここで用いられる用語「微小体積・レーザ・スキャニング・サイトメトリ」又
は「ＭＬＳＣ」あるいは「ＭＬＳＣシステム」は、蛍光で標識付けされた検出分
子を用いて、サンプルを蛍光放射が記録される光学スキャニングにさらして、小
容積のサンプル内の組成の存在を検知する方法を意味する。ＭＬＳＣシステムは
、他の技術とそれの相違を示すいくつかのキーとなる特徴を持っていて、１）多
くの分析に対して、少量の血液（５−５０μｌ）だけが必要とされ、２）確実な
セル数（１μｌ当たりのセル数）が得られ、３）分析を、全血上か、又は浄化さ
れた白血球上のどちらかでダイレクトに実行することができる。この技術が実現
すれば、一回の血液採取から、数百の異なるセル母集団の測定が容易になされる
。ＭＬＳＣ技術は、米国特許第５，５４７，８４９号及び第５，５５６，７６４
号、及びディーツ等による（（１９９６年の）サイトメトリ２３：１７７−１８
６）、並びに１９９８年８月２１日に提出された「Ｌａｓｅｒ−Ｓｃａｎｎｅｒ
Ｃｏｎｆｏｃａｌ Ｔｉｍｅ−Ｒｅｓｏｌｖｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ
Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｙｓｔｅｍ（レーザ・スキャナの焦点を共有す
る時間分解蛍光分光システム）」と題された米国暫定特許出願第６０／０９７，
５０６号、及び１９９９年８月２０日に提出された「Ｎｏｖｅｌ Ｏｐｔｉｃａ
ｌ Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅｓ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｖｏｌｕｍｅ Ｌａｓｅ
ｒ−Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒｓ（微小体積・レーザスキャニング
・サイトメータのための斬新な光学アーキテクチャ）」と題された米国特許出願
第０９／３７８，２５９号に記述されており、それらの各々が、その全体がここ
に組み入れられる。微小体積毛細管を備えたレーザ・スキャニング・サイトメト
リは、全血、処理された血液、及び生物学的流体を含む他の流体内の、蛍光で標
識付けされたセル及び分子をモニタするための強力な方法を提供する。さらに本
発明は、小量の血液から複数の生物学的マーカの同時測定を行うためのＭＬＳＣ
器具の容量を向上させることにより、ＭＬＳＣ技術を向上させる。本発明の改良
されたＭＬＳＣシステムは、「ＳｕｒｒｏＳｃａｎシステム」と名付けられる。The term “clinical endpoint” as used herein refers to a characteristic or variable that measures how a patient feels, functions, and is alive. As used herein, the term "microvolume laser scanning cytometry" or "MLSC" or "MLSC system" refers to the use of fluorescently labeled detection molecules for optical scanning of a sample in which fluorescence emission is recorded. By exposure, it is meant a method of detecting the presence of a composition in a small volume of sample. The MLSC system has some key features that distinguish it from other technologies: 1) For many analyses, only small amounts of blood (5-50 μl) are needed, 2) Reliable cell numbers (cells per μl) are obtained and 3) the analysis can be performed directly on either whole blood or on cleared leukocytes. The realization of this technique facilitates the measurement of hundreds of different cell populations from a single blood sample. MLSC technology is described in US Pat. Nos. 5,547,849 and 5,556,764.
And Dietz et al. ((1996) Cytometry 23: 177-18.
6), and "Laser-Scanner" submitted on August 21, 1998.
Confocal Time-Resolved Fluorescence
US Provisional Patent Application No. 60/097 entitled "Spectroscopy System (Time-Resolved Fluorescence Spectroscopy System Sharing Focus of Laser Scanner)".
No. 506, and “Novell Optica,” submitted August 20, 1999.
l Architectures for Microvolume Lase
No. 09 / 378,259, entitled "r-Scanning Cytometers," a novel optical architecture for microvolume laser scanning cytometers, each of which is incorporated by reference in its entirety. Incorporated here. Laser scanning cytometry with microvolume capillaries is a powerful tool for monitoring fluorescently labeled cells and molecules in whole blood, processed blood, and other fluids including biological fluids. To provide a simple method. Furthermore, the present invention provides a MLSC for the simultaneous measurement of multiple biological markers from a small volume of blood.
Improve MLSC technology by increasing the instrument capacity. The improved MLSC system of the present invention is termed the "SurroScan system".
【００２３】
ここで用いられる用語「検出分子」は、重要な分子、特にタンパク質に結び付
くことができる任意の分子を意味する。望ましい検出分子は抗体である。抗体は
単クローン性又は多クローン性でありうる。As used herein, the term “detection molecule” means any molecule that can bind to a molecule of interest, especially a protein. The preferred detection molecule is an antibody. Antibodies can be monoclonal or polyclonal.
【００２４】
ここで用いられる用語「色素」、「蛍光体」、「蛍光色素」、「蛍光標識」、
又は「蛍光性のグループ」は、レーザによる励起で蛍光を発することができる分
子を意味するために、交互に用いられる。間接的なリンクもまたここで包含され
るが、色素は通常、本発明内の検出分子と直接的にリンクされる。多くの色素が
この技術分野ではよく知られている。特定の望ましい実施形態では、スペクトル
の（６００ｎｍを越える）赤い領域で起動することができる蛍光体が用いられる
。２つの赤い色素、Ｃｙ５及びＣｙ５．５が通常は用いられる。それらは、６６
５及び６９５ナノメートルの放射ピークをそれぞれ持っており、抗体に容易に連
結することができる。両方とも、ヘリウムネオンレーザでもって６３３ｎｍで起
動することができる。使用されることができる３つの赤い色素の組は、Ｃｙ５、
Ｃｙ５．５及びＣｙ７、あるいはＣｙ５、Ｃｙ５．５及びＣｙ７−ＡＰＣを含む
。また、１９９９年７月６日に提出された「Ｂｒｉｄｇｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃ
ｅｎｔ Ｄｙｅｓ、Ｔｈｅｉｒ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ
Ｕｓｅ ｉｎ Ａｓｓａｙｓ（ブリッジ蛍光色素、分析に際してのその準備及
びその使用）」と題された米国仮特許出願第６０／１４２，４７７号を参照のこ
と。As used herein, the terms “dye”, “fluorophore”, “fluorescent dye”, “fluorescent label”,
Alternatively, “fluorescent groups” are used interchangeably to mean molecules that are capable of emitting fluorescence upon excitation by a laser. Indirect links are also included herein, but the dye is usually directly linked to the detection molecule within the invention. Many dyes are well known in the art. In certain desirable embodiments, a phosphor that can be activated in the red region (above 600 nm) of the spectrum is used. Two red dyes, Cy5 and Cy5.5, are usually used. They are 66
It has emission peaks of 5 and 695 nanometers, respectively, and can be easily linked to an antibody. Both can be activated at 633 nm with a helium neon laser. The three red dye pairs that can be used are Cy5,
Cy5.5 and Cy7, or Cy5, Cy5.5 and Cy7-APC. Also, "Bridged Fluoresc" submitted on July 6, 1999.
ent Dyes, Their Preparation and Their
See U.S. Provisional Patent Application No. 60 / 142,477 entitled "Use in Assays (Bridge Fluorescent Dyes, Their Preparation and Use in Analysis)".
【００２５】
ここで用いられる用語「微粒子」は、いくつかの実施形態中で、生物学的マー
カに関する情報を得るためにＭＬＳＣによって検知される、すべての巨大分子の
構造を意味する。いくつかの実施形態では、その検知される微粒子は、セルであ
り、他の実施形態では、検知される微粒子は、抗体に標識付けされたビードであ
る。As used herein, the term “particulate” refers, in some embodiments, to the structure of all macromolecules sensed by the MLSC to obtain information about biological markers. In some embodiments, the detected microparticle is a cell, and in other embodiments the detected microparticle is a bead labeled with an antibody.
【００２６】
本発明は、ＳｕｒｒｏＳｃａｎシステム又は単にＳｕｒｒｏＳｃａｎと名付け
られた、改良された微小体積・レーザ・スキャニング・サイトメトリ（「ＭＬＳ
Ｃ」）システムを提供する。先のシステムは、米国特許第５，５４７，８４９号
及び第５，５５６，７６４号、並びに１９９９年４月２１日に提出された「Ｂｉ
ｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍａｒｋｅｒ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅ
ｍ（生物学的マーカ同定システム）」と題された米国特許出願第６０／１３１，
１０５号、１９９８年８月２１日に提出された「Ｌａｓｅｒ−Ｓｃａｎｎｅｒ
Ｃｏｎｆｏｃａｌ Ｔｉｍｅ−Ｒｅｓｏｌｖｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ
Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｙｓｔｅｍ（レーザ・スキャナの焦点を共有する
時間分解栄光分光システム）」と題された米国暫定特許出願第６０／０９７，５
０６号、ディーツ等による（（１９９６年の）サイトメトリ２３：１７７−１８
６）、及び１９９９年８月２０日に提出された「Ｎｏｖｅｌ Ｏｐｔｉｃａｌ
Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅｓ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｖｏｌｕｍｅ Ｌａｓｅｒ−
Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒｓ（微小体積・レーザスキャニング・サ
イトメータのための斬新な光学アーキテクチャ）」と題された米国特許出願第０
９／３７８，２５９号に記述されており、それらの各々が、その全体がここに組
み入れられる。バイオメトリック・イメージング（Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃ Ｉｍａ
ｇｉｎｇ）社から市販されているＩｍａｇｎ２０００システムは、従来技術のＭ
ＬＳＣシステムの例である。The present invention is an improved microvolume laser scanning cytometry (“MLS”) termed the SurroScan system or simply SurroScan.
C ") system is provided. Previous systems have been described in US Pat. Nos. 5,547,849 and 5,556,764, and "Bi" filed April 21, 1999.
logical Marker Identification System
m (Biological Marker Identification System) ", US Patent Application No. 60/131,
No. 105, filed August 21, 1998, "Laser-Scanner.
Confocal Time-Resolved Fluorescence
US Provisional Patent Application No. 60 / 097,5 entitled "Spectroscopy System".
06, Dietz et al. ((1996) Cytometry 23: 177-18)
6), and “Novel Optical submitted on August 20, 1999.
Architectures for Microvolume Laser-
US Patent Application No. 0 entitled "Scanning Cytometers (Innovative Optical Architecture for Microvolume Laser Scanning Cytometers)"
9 / 378,259, each of which is incorporated herein in its entirety. Biometric Imaging (Biometric Ima)
The Magn2000 system, commercially available from
It is an example of an LSC system.
【００２７】
本発明の改良されたＭＬＳＣシステムは、次のコンポーネントを含む、
（ａ）被検体サンプルから生データを得るための電子制御システムを含むＭＬＳ
Ｃ器具、
（ｂ）ＭＬＳＣ器具から生データを収集し向上させるための画像分析システム、
（ｃ）多重パラメータ分析設計、測定器制御、最終データ分析、及びデータ・ア
ーカイビング用の統合された情報処理システム・アーキテクチャ。The improved MLSC system of the present invention includes the following components: (a) an MLS that includes an electronic control system for obtaining raw data from an analyte sample.
C instrument, (b) Image analysis system for collecting and enhancing raw data from MLSC instrument,
(C) Integrated information handling system architecture for multi-parameter analysis design, instrument control, final data analysis, and data archiving.
【００２８】
現在の発明は、ＭＬＳＣシステムの操作のいくつかのキーとなる側面における
重要な改良、つまりａ）ＭＬＳＣ光学、ｂ）ＭＬＳＣシステム制御電子工学、ｃ
）画像表示及び分析のアルゴリズム、並びにｄ）情報処理システム・アーキテク
チャを提供する。また本発明は、業界標準であるフロー・サイトメトリ・スタン
ダード（．ＦＣＳファイル形式）に画像表示及びデータ変換するための改良され
た方法を提供する。ＭＬＳＣ計器
ＳｕｒｒｏＳｃａｎシステムは、ＭＬＳＣ器具の光学アーキテクチャにおいて
重要な改良を提供する。前のＭＬＳＣ器具は、通常は２本のチャンネルの蛍光信
号を検知することができたが、そのために、単一の実験で同時に検知することが
できる被検体の数が制限された。いくつかのアプリケーションでは、特定のセル
を識別するために、２つ以上の異なる蛍光信号を検知する必要がある。例えば、
ＣＤ４、ＣＤ４５ＲＡ及びＣＤ６２Ｌを示す単純なＴセルのようないくつかのセ
ル母集団を識別するには、３つ以上の抗原の同時測定が必要である。本発明の改
良されたＳｕｒｒｏＳｃａｎ器具は、少なくとも４つの別個の蛍光信号を検知す
ることができ、そのために、単一の実験内で少なくとも４つの別個の蛍光試薬を
使用することができる。改良された光学的構成の１つの実施形態が図１に示され
る。毛細管アレイ１０は、分析のためのサンプルを含む。望ましい実施形態では
、平行にされた励起光が、１つ以上のレーザによって提供される。特に望ましい
実施形態では、６３３ｎｍの励起光がヘリウム‐ネオン・レーザ１１によって提
供される。この波長は、生体試料の自己蛍光に関連する問題を回避する。レーザ
の出力が３〜１７ｍＷまで増大させられる。レーザ・パワーを高めると、２つの
潜在的利点、つまり感度の増大及び走査速度の増大がもたらされる。平行にされ
たレーザ光は、励起ダイクロイック・フィルタ１２によって偏光させられる。反
射して、光は検流計駆動の走査反射鏡１３上に入射する。走査反射鏡は、固定さ
れた範囲の角度上を、例えば＋／−２．５度、検流計によって急速に揺れ動かさ
れることができる。走査反射鏡は、顕微鏡の対物レンズ１６の入射瞳孔上に、そ
の走査反射鏡を映し出す２つのリレーレンズ１４及び１５の中にその入射光を反
射する。この光学的構成は、反射鏡で走査された特定の角度を、顕微鏡の対物レ
ンズの焦点での特定のフィールド・ポジションに変換する。＋／−角度の走査は
、対物レンズの焦点での１ミリメートルのスキャン幅になる。走査角度とフィー
ルド・ポジションの関係は、この構成において、及びこの範囲の角度上では、本
質的に線形である。さらに、顕微鏡の対物レンズは、入ってくる平行ビームを対
物レンズの焦点平面で１つのスポットに集束させる。光学的解像度を設定するそ
のスポットの直径は、平行ビームの直径及び対物レンズの焦点距離によって決定
される。The present invention provides significant improvements in some key aspects of the operation of MLSC systems: a) MLSC optics, b) MLSC system control electronics, c.
) Provides image display and analysis algorithms, and d) information processing system architecture. The present invention also provides an improved method for image display and data conversion to the industry standard Flow Cytometry Standard (.FCS file format). The MLSC instrument SurroScan system provides a significant improvement in the optical architecture of MLSC instruments. Previous MLSC instruments were usually able to detect fluorescence signals in two channels, but this limited the number of analytes that could be detected simultaneously in a single experiment. Some applications require the detection of two or more different fluorescent signals to identify a particular cell. For example,
Simultaneous measurement of more than two antigens is required to distinguish some cell populations, such as the simple T cells, which represent CD4, CD45RA and CD62L. The improved SurroScan instrument of the present invention is capable of detecting at least four distinct fluorescent signals, for which purpose at least four distinct fluorescent reagents can be used within a single experiment. One embodiment of the improved optical configuration is shown in FIG. The capillary array 10 contains a sample for analysis. In the preferred embodiment, the collimated excitation light is provided by one or more lasers. In a particularly preferred embodiment, 633 nm pump light is provided by the helium-neon laser 11. This wavelength avoids the problems associated with autofluorescence of biological samples. The power of the laser is increased to 3-17 mW. Increasing the laser power offers two potential benefits: increased sensitivity and increased scan speed. The collimated laser light is polarized by the excitation dichroic filter 12. The reflected light is incident on the galvanometer-driven scanning reflecting mirror 13. The scanning mirror can be swung rapidly by a galvanometer over a fixed range of angles, for example +/- 2.5 degrees. The scanning reflector reflects the incident light onto the entrance pupil of the microscope objective 16 into two relay lenses 14 and 15 which project the scanning reflector. This optical configuration translates a specific angle scanned by the mirror into a specific field position at the focus of the microscope objective. A scan of +/- angles results in a scan width of 1 millimeter at the focus of the objective. The relationship between scan angle and field position is essentially linear in this configuration and over this range of angles. Furthermore, the objective of the microscope focuses the incoming collimated beam into a spot at the focal plane of the objective. The diameter of the spot that sets the optical resolution is determined by the diameter of the collimated beam and the focal length of the objective lens.
【００２９】
走査される励起ビームの経路に置かれる蛍光サンプルは、ストークスシフトさ
れた光を発する。この光は対物レンズによって収集されコリメートされる。この
コリメートにされた光は、２つのリレーレンズ１４及び１５から、コリメートさ
れたままで現れ、走査反射鏡に突き当たり、反射鏡はそれを反射しスキャン解除
する。その後、ストークスシフトされた光は、ダイクロイック励起フィルタ（よ
り短い波長光を反映し、より長い波長光を通す）を通り抜け、そしてその後、さ
らに任意の反射された励起光を濾過する働きをする第１の長いパス・フィルタを
通過する。The fluorescent sample placed in the path of the excitation beam to be scanned emits Stokes-shifted light. This light is collected and collimated by the objective lens. This collimated light emerges from the two relay lenses 14 and 15 as it remains collimated and strikes a scanning reflector, which reflects and unscans it. The Stokes-shifted light then passes through a dichroic excitation filter (reflecting shorter wavelength light and passing longer wavelength light) and then further serves to filter any reflected excitation light. Pass a long pass filter of.
【００３０】
その後、本発明の改良された器具は、４つの異なる発光バンドにストークスシ
フトされた光を分けるために、さらに一連のダイクロイック・フィルタを用いる
。第１の蛍光ダイクロイック・フィルタ１８は、２つの最も赤い蛍光色から、２
つの最も青い蛍光色を分割する。その後、いかなる焦点の外れた蛍光信号をも著
しく減少させるために、第１の集束レンズ２０を通して、２つの最も青い色が、
第１のアパーチャ１９上に集束させられる。アパーチャを通過した後、第２の蛍
光ダイクロイック・フィルタ２１がさらに、個々の青い色を互いに分離する。そ
うして、その個々の青い色が、２つの別個の光電子増倍管２２及び２３で分析さ
れる。最も赤い２つの色は、第１の蛍光ダイクロイック・フィルタ２８によって
最も青い２色から分割された後、第２の長いパス・フィルタ２５、ミラー２６、
及び第２の集束レンズ２７を通して、第２のアパーチャ２４上に集束させられる
。アパーチャ２４を通り抜けた後に、最も赤い色は、第３の蛍光ダイクロイック
・フィルタ２８によって互いに分離される。その後、個々の赤い色が、光電子増
倍管２９及び３０で分析される。このようにして、４つの別個の蛍光信号が、毛
細管の中に保持されたサンプルから、同時に個々の光電子増倍管に伝送されるこ
とができる。この改良によって、初めて、別個の４つの被検体が同時にモニタさ
れることが可能になる。各光電子増倍管は、入ってくる蛍光光子束に応じて、電
子の流れを生成する。これらの個々の電流は、検出電子工学で、１つ以上のプリ
アンプによって個々の電圧に変換される。その電圧は、走査されたイメージに対
して、ピクセルの輝度を決定するために、アナログ・デジタル変換器によって規
則的な間隔でサンプルされる。本発明の４チャンネルは、０、１、２及び３と名
付けられる。The improved instrument of the present invention then uses a further series of dichroic filters to split the Stokes-shifted light into four different emission bands. The first fluorescent dichroic filter 18 has two
Split the two bluest fluorescent colors. Then the two bluest colors are passed through the first focusing lens 20 to significantly reduce any out-of-focus fluorescence signal.
It is focused on the first aperture 19. After passing through the aperture, the second fluorescent dichroic filter 21 further separates the individual blue colors from each other. The individual blue color is then analyzed in two separate photomultiplier tubes 22 and 23. The two reddest colors are separated from the bluest two colors by a first fluorescent dichroic filter 28, and then a second long pass filter 25, a mirror 26,
And through the second focusing lens 27 and is focused onto the second aperture 24. After passing through the aperture 24, the reddest colors are separated from each other by a third fluorescent dichroic filter 28. The individual red colors are then analyzed in photomultiplier tubes 29 and 30. In this way, four separate fluorescent signals can be transmitted from the sample held in the capillaries to individual photomultiplier tubes at the same time. For the first time, this refinement allows four separate analytes to be monitored simultaneously. Each photomultiplier tube produces a stream of electrons in response to an incoming fluorescent photon flux. These individual currents are converted in the sensing electronics into individual voltages by one or more preamplifiers. The voltage is sampled at regular intervals by the analog-to-digital converter to determine the pixel intensity for the scanned image. The four channels of the present invention are labeled 0, 1, 2 and 3.
【００３１】
意味のあるデータが、単一の励起波長、例えばヘリウム‐ネオン・レーザから
の６３３ｎｍを用いて、得られるようにするためには、単一の励起波長から励起
されることができ、オーバーラップが最小で識別可能な波長を発する、色素が必
要である。ヘリウム‐ネオン・レーザを用いる３チャンネル検出システムに対し
て、３種の色素の適切な１つの組合せは、Ｃｙ５（６７０ｎｍで放射ピーク）、
Ｃｙ５．５（６９４ｎｍで放射ピーク）、及びＣｙ７（７６７ｎｍで放射ピーク
）である。代案となる実施形態では、アロヒコシアニン（ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃ
ｙａｎｉｎ（ＡＰＣ））がＣｙ５と置換される。Ｃｙ７（７４３ｎｍ）に対する
吸収ピークが、ヘリウム‐ネオン励起レーザの波長（６３３ｎｍ）からずっと離
れているので、通常、この分野の技術を持つ者であれば、ヘリウム‐ネオン励起
システムにおいてＣｙ７が有用であるとは見なさない。しかしながら、本発明者
は、全血内の特定のセルを数え上げるために、Ｃｙ７が６３３ｎｍで十分に励起
させられることが可能であることを発見した。この励起は、おそらく長い励起テ
ールの存在に起因し、それはＭｕｊｕｍｄａｒ，Ｒ．Ｂ．、Ｌ．Ａ．Ｅｒｎｓｔ
、Ｓ．Ｒ．Ｍｕｊｕｍｄａｒ、Ｃ．Ｊ．Ｌｅｗｉｓ、及びＡ．Ｓ．Ｗａｇｇｏｎ
ｅｒによって１９９３年に「Ｃｙａｎｉｎｅ ｄｙｅ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｒｅ
ａｇｅｎｔｓ：ｓｕｌｆｏｉｎｄｏｃｙａｎｉｎｅ ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ
ｅｓｔｅｒｓ（試薬にラベルを付けるシアニン色素であるスルホインドシアニ
ン・スクシンイミディル・エステル）」と題されたＢｉｏｃｏｎｊｕｇＣｈｅｍ
．４：１０５−１１に記述されていて、その全体がここに参考文献として組み入
れられる。Ｃｙ７の励起及び検出は、レーザーパワーを増大させること、及びス
ペクトルの赤色領域に対してより敏感な検出器を用いることにより改良されるこ
とができる。In order for meaningful data to be obtained with a single excitation wavelength, eg 633 nm from a helium-neon laser, it can be excited from a single excitation wavelength, There is a need for dyes that emit discernable wavelengths with minimal overlap. For a three-channel detection system using a helium-neon laser, one suitable combination of three dyes is Cy5 (emission peak at 670 nm),
Cy5.5 (emission peak at 694 nm), and Cy7 (emission peak at 767 nm). In an alternative embodiment, allophycocine
yanin (APC)) is replaced with Cy5. The absorption peak for Cy7 (743 nm) is far away from the wavelength of the helium-neon pump laser (633 nm), so Cy7 is usually useful in a helium-neon pump system for those skilled in the art. Not considered. However, the inventors have discovered that Cy7 can be sufficiently excited at 633 nm to enumerate specific cells in whole blood. This excitation is probably due to the presence of a long excitation tail, which is described by Mujumdar, R .; B. L.,. A. Ernst
, S. R. Mujumdar, C.I. J. Lewis, and A. S. Waggon
er in 1993, "Cyanine dye labeling re.
agents: sulfoindocyanine succinimidyl
biosterjugChem entitled "esters (sulfoindocyanine succinimidyl ester, a cyanine dye that labels reagents)"
． 4: 105-11, which is incorporated herein by reference in its entirety. Excitation and detection of Cy7 can be improved by increasing the laser power and using a detector more sensitive to the red region of the spectrum.
【００３２】
他の実施形態では、ＡＰＣ励起波長で励起可能であるが、Ｃｙ７放射波長で放
射する、縦並びの色素を作るために、Ｃｙ７がＡＰＣに連結される。この縦並び
の色素は、アクセプタ（Ｃｙ７）を励起させるために、ドナー（ＡＰＣ）からの
エネルギー移動を用いるが、そのことは、Ｂｅａｖｉｓ，Ａ．Ｊ．、Ｋ．Ｊ．Ｐ
ｅｎｎｌｉｎｅによって１９９６年に「Ａｌｌｏ−７：ａ ｎｅｗ ｆｌｕｏｒ
ｅｓｃｅｎｔ ｔａｎｄｅｍ ｄｙｅ ｆｏｒ ｕｓｅ ｉｎ ｆｌｏｗ ｃｙ
ｔｏｍｅｔｒｙ（Ａｌｌｏ−７：流動セル分析において使用するための新しい蛍
光の縦並び色素）」と題されたＣｙｔｏｍｅｔｒｙ，２４：３９０−５、並びに
Ｒｏｅｄｅｒｅｒ，Ｍ．、Ａ．Ｂ．Ｋａｎｔｏｒ、Ｄ．Ｒ．Ｐａｒｋｓ、及びＬ
．Ａ．Ｈｅｒｚｅｎｂｅｒｇによって１９９６年に「Ｃｙ７ＰＥ ａｎｄ Ｃｙ
７ＡＰＣ：ｂｒｉｇｈｔ ｎｅｗ ｐｒｏｂｅｓ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｏｆｌｕ
ｏｒｅｓｃｅｎｃｅ（Ｃｙ７ＰＥ及びＣｙ７ＡＰＣ：螢光抗体法のための鮮やか
な新しいプローブ）」と題されたＣｙｔｏｍｅｔｒｙ，２４：１９１−７におい
て記述されており、その両方ともその全体がここに参考文献として組み入れられ
る。In another embodiment, Cy7 is linked to the APC to create a tandem dye that is excitable at the APC excitation wavelength but emits at the Cy7 emission wavelength. This tandem dye uses energy transfer from a donor (APC) to excite an acceptor (Cy7) as described by Beavis, A .; J. , K. J. P
Ennline in 1996, "Allo-7: a new fluor"
escent tandem dye for use in flow cy
“Tometry (Allo-7: a new fluorescent tandem dye for use in flow cell analysis)”, Cytometry, 24: 390-5, and Roederer, M .; , A. B. Kantor, D.M. R. Parks and L
． A. Herzenberg in 1996, "Cy7PE and Cy.
7APC: bright new probes for immunoflu
orence (Cy7PE and Cy7APC: a vibrant new probe for fluorescent antibody methods) ”, both of which are incorporated herein by reference in their entirety.
【００３３】
本発明のいくつかの実施形態では、１つ以上の励起波長が使用される。１つ以
上の励起波長を用いることによって、各色素が同じ励起要件を持つ必要がないよ
うに、種々様々の蛍光色素を用いることが可能である。複数の励起波長が、少な
くとも３つの方法、（１）４８８ｎｍ、５６８ｎｍ、及び６４７ｎｍの励起波長
を備えた励起光源としてＡｒ−Ｋｒレーザを用い、そのために、３つの異なる蛍
光性のグループ（例えばフルオレセイン、ローダミン、及びＴｅｘａｓ Ｒｅｄ
（登録商標））からの３種類の励起に対する使用が可能となる方法、（２）コリ
メートされた励起光の異なる波長を各々が供給する１つ以上のレーザ・ソースを
用いる方法、（３）多光子の蛍光励起用のＴｉ−Ｓレーザ（〜７００ｎｍの励起
光）又はＮｄ：ＹＬＦレーザ（１０４７ｎｍの励起光）といったようなフェムト
秒のパルスを生成することができるレーザを用いる方法、で得られる。In some embodiments of the invention, more than one excitation wavelength is used. By using more than one excitation wavelength, it is possible to use a wide variety of fluorescent dyes so that each dye need not have the same excitation requirements. A plurality of excitation wavelengths uses an Ar-Kr laser as the excitation light source with excitation wavelengths of at least three methods, (1) 488 nm, 568 nm, and 647 nm, for which three different fluorescent groups (e.g. fluorescein, Rhodamine and Texas Red
(2), and (2) using one or more laser sources, each supplying different wavelengths of the collimated excitation light, (3) many A method using a laser capable of generating femtosecond pulses, such as a Ti-S laser (~ 700 nm excitation light) or Nd: YLF laser (1047 nm excitation light) for fluorescence excitation of photons.
【００３４】
上に記述された本発明の実施形態は、別個の４本のチャンネルを用いるが、こ
こで開示される光学アーキテクチャは、より多くの偶数個のチャンネルを備えた
器具の設計を考慮に入れる。Although the embodiments of the invention described above use four separate channels, the optical architecture disclosed herein allows for the design of instruments with more even numbers of channels. Put in.
【００３５】
望ましい実施形態では、走査されるサンプルが、Ｘ、Ｙ及びＺ平面に自動翻訳
可能なステージに取り付けられる。検流計で操作される反射鏡が、Ｙ軸における
励起ビームを走査するが、その時、ステージはＸ軸においてサンプルを等速度で
移動させる。走査されたビーム速さで乗算された各アナログ・デジタル変換器の
サンプル採取間隔が、イメージのＹ軸にけるピクセル間隔を決定する。線レート
で割り算されたＸステージ走査速度は、イメージのＸ軸におけるピクセル間隔を
決定する。In the preferred embodiment, the sample to be scanned is mounted on a stage that is automatically translatable in the X, Y and Z planes. A galvanometer-operated reflector scans the excitation beam in the Y-axis, while the stage moves the sample at a constant velocity in the X-axis. The sampling interval of each analog-to-digital converter multiplied by the scanned beam speed determines the pixel spacing in the Y-axis of the image. The X stage scan rate divided by the line rate determines the pixel spacing in the X axis of the image.
【００３６】
ステージはＸ軸において個々のサンプルを走査するだけでなく、顕微鏡の対物
レンズに対して多くのサンプルを左右に動かすことができる。このようにして、
いかなるオペレータも介入せずに、コンピュータ制御によって、多くの個々のサ
ンプルを順次走査することができる。このことが、器具のスループットを大幅に
増大させ、器具による臨床セッティング内の血液サンプルの高速での自動分析を
より行いやすくする。The stage not only scans individual samples in the X-axis, but can move many samples left and right with respect to the microscope objective. In this way
Computer controlled scanning of many individual samples can be done sequentially without any operator intervention. This greatly increases the throughput of the device and makes it easier to perform rapid automated analysis of blood samples within the clinical setting by the device.
【００３７】
本発明の望ましい実施形態では、ＳｕｒｒｏＳｃａｎのＭＬＳＣのステージが
、１つ以上の毛細管アレイを保持し、その各々が９６−ウェル・プレートのフッ
トプリントを持つ。各毛細管は、分析されるべきサンプルを保持する。多重チャ
ンネル・ピペットと互換性をもつ各々３２本の固定された毛細管及び間隔を持つ
使い捨ての毛細管アレイは、１９９９年４月２３日に提出された「Ｄｉｓｐｏｓ
ａｂｌｅ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｃｕｖｅｔｔｅ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ（使い捨ての
光学キュベット・カートリッジ）」、「Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃ
Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ Ｅｍｐｌｏｙｉｎｇ ａ Ｄｉｓｐｏｓａ
ｂｌｅ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｃｕｖｅｔｔｅ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ（使い捨ての光
学キュベット・カートリッジを使用する分光光度分析システム）」、及び「Ｖａ
ｃｕｕｍ Ｃｈｕｃｋ ｆｏｒ Ｔｈｉｎ Ｆｉｌｍ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｃｕｖ
ｅｔｔｅ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ（薄膜の光学キュベット・カートリッジ用の真空
チャック）」と題された米国仮特許出願の代理人登録第０３２５１７−００４号
、００５号及び００６号、並びに２０００年４月２１日に提出された「Ｄｉｓｐ
ｏｓａｂｌｅ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｃｕｖｅｔｔｅ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ（使い捨
ての光学キュベット・カートリッジ）」と題された共有される米国特許出願、に
おいて記述されていて、その全体がここに参考文献として組み込まれる。各アレ
イは、毛細管の内側の大きさを規定するように型抜きされている、２倍の粘質を
持つ粘着層で共に間にはさまれた２層のマイラーから造られる。その結果生じる
カートリッジは、フレックス−３２と呼ばれ、大量に低価格で製造されることが
できる。カートリッジは柔軟であり、そのために、真空圧力によって光学的に平
らな底板上に保持されることが可能であり、製造工程において平らであることに
対する要件が除去される。毛細管の間隔は、多重チャンネル・マイクロプレート
・ピペッタ及びロボット工学との互換性を保持するように設計された。In a preferred embodiment of the present invention, the SurroScan MLSC stage carries one or more capillary arrays, each of which has a 96-well plate footprint. Each capillary holds a sample to be analyzed. A disposable capillary array with 32 fixed capillaries and spaces, each compatible with multi-channel pipettes, was filed on April 23, 1999 in "Dispos
“Able Optical Cuvette Cartridge”, “Spectrophotometric”
Analysis System Employing a Disposa
ble Optical Cuvette Cartridge (spectrophotometric analysis system using a disposable optical cuvette cartridge) ”and“ Va
cum Chucks for Thin Film Optical Cuv
filed on Aug. 21, 2000, attorney registrations 032517-004, 005 and 006, of U.S. Provisional Patent Application entitled "ETTE Cartridge". "Disp
A shared U.S. patent application entitled "Osable Optical Cuvette Cartridge" is incorporated herein by reference in its entirety. Each array is made up of two layers of mylar sandwiched together with an adhesive layer having twice the viscosity, stamped to define the inner size of the capillaries. The resulting cartridge, called Flex-32, can be manufactured in large quantities and at low cost. The cartridge is flexible so that it can be held on an optically flat bottom plate by vacuum pressure, eliminating the requirement for flatness in the manufacturing process. The capillary spacing was designed to be compatible with multichannel microplate pipettors and robotics.
【００３８】
望ましい実施形態では、オペレータが、３２本の毛細管を持つ２つのプレート
を一度に取り付けることができる。プレートが走査され、イメージが処理されて
いる間は、オペレータの介入は必要ない。代案として、Ｉｍａｇｎ２０００（Ｖ
Ｃ１２０）用に設計された１６本の個別の毛細管が、別のホルダに取り付けられ
る。In a preferred embodiment, an operator can attach two plates with 32 capillaries at one time. No operator intervention is required while the plate is being scanned and the image is being processed. As an alternative, Imagn2000 (V
16 individual capillaries designed for C120) are mounted in separate holders.
【００３９】
ステージのＺ運動は、対物レンズの焦点平面に各サンプルを置くための手段を
提供する。またＺ運動は、各々の個別のサンプルに対する焦点平面イメージのス
タックを捕捉することができるよう走査されることが可能である。オペレータ介
入の必要性を回避するために、コンピュータ制御システムによって、各サンプル
に対する最適の焦点位置を、この走査されたＺイメージから決定できることが望
ましい。さらに、サンプルの２つの両端に対して、最適の焦点を決定することが
できる。サンプルがＸ軸において走査されている間、ステージは、２つの両端の
間の焦点差を通じて等速度で動かされ、そうしてサンプルあるいは取付具に存在
するかもしれないすべての傾斜を修正する。The Z movement of the stage provides a means for placing each sample in the focal plane of the objective lens. Also, the Z motion can be scanned to capture a stack of focal plane images for each individual sample. To avoid the need for operator intervention, it is desirable that a computer control system be able to determine the optimum focus position for each sample from this scanned Z image. Furthermore, the optimal focus can be determined for the two ends of the sample. While the sample is being scanned in the X-axis, the stage is moved at a constant velocity through the focus difference between the two ends, thus correcting any tilt that may be present on the sample or fixture.
【００４０】
レーザ光線の走査速度は、各ピクセルで光信号を統合するのに費やされる時間
量を決定するが、統合時間が長いほど、信号対雑音比が良くなる。また走査速度
は、システムのスループット速度に比例する。以前のＭＬＳＣ器具は、単一の速
度でサンプルを走査した。これは多くのアプリケーションにとって適切であるが
、本発明は走査速度が変更可能なシステムの使用を意図する。そのように走査速
度が変更可能なシステムであれば、各々の個別のサンプルに対してシステム感度
を最適化することが可能である。例えば、ある種の分析は、サンプル内に非常に
低濃度で存在する検体の検出を必要とするかもしれない。そのような低濃度の検
体からの蛍光信号は、バックグラウンド・ノイズに比べて、相当低い可能性があ
る。このような場合、走査をゆっくり行うことによりシステム感度を増大させる
ことができ、各ピクセルで光信号を統合するための時間をより多くすることが可
能である。このことにより、信号対雑音比内が大きく改善されることになる。対
照的に、ある種の分析では、サンプル内に検出される特定の検体の濃度が比較的
高いために、はるかに明るい蛍光信号の検出を伴うかもしれない。この場合、よ
り速い走査速度が望ましく、満足な信号対雑音比を達成する各ピクセルの信号を
統合するために必要な時間は少しでよい。また走査速度が速ければ、それだけ大
きなサンプル・スループットが得られる。したがって、ここで考えられている走
査速度が変更可能なシステムは、従来技術である走査速度が固定されたシステム
にとって大きな改善である、なぜならば、それは、ａ）各検体の信号対雑音比を
最適化することができ、そのために、各検体にとって可能な最も高い品質のデー
タを収集でき、そして、ｂ）可能な最も効率的なスループット速度でシステムを
機能させることができるからである。すべての場合に、検流計に取り付けられた
反射鏡の走査速度を調整することによって、及びサンプル・イメージング中にス
テージがＸ軸において移動する速さを調整することによって、その走査速度は変
更されることができる。The scanning speed of the laser beam determines the amount of time spent in integrating the optical signal at each pixel, the longer the integration time, the better the signal to noise ratio. Also, the scan rate is proportional to the throughput rate of the system. Previous MLSC instruments scanned the sample at a single rate. While this is suitable for many applications, the present invention contemplates the use of scan rate changeable systems. With such a variable scan speed system, system sensitivity can be optimized for each individual sample. For example, some assays may require detection of analytes present in the sample at very low concentrations. The fluorescence signal from such low concentrations of analyte can be significantly lower than background noise. In such cases, slower scanning can increase system sensitivity and allow more time to integrate the optical signal at each pixel. This will greatly improve the signal-to-noise ratio. In contrast, some assays may involve the detection of a much brighter fluorescent signal due to the relatively high concentration of the particular analyte detected in the sample. In this case a faster scan rate is desired and less time is required to integrate the signals of each pixel to achieve a satisfactory signal to noise ratio. Also, the faster the scanning speed, the greater the sample throughput obtained. Thus, the scan rate alterable system contemplated herein is a significant improvement over prior art fixed scan rate systems because it: a) Optimizes the signal-to-noise ratio of each analyte. Because it can collect the highest quality data possible for each analyte, and b) allow the system to function at the most efficient throughput rate possible. In all cases, the scanning speed was changed by adjusting the scanning speed of the reflector attached to the galvanometer and by adjusting the speed at which the stage moved in the X axis during sample imaging. You can
【００４１】
またＳｕｒｒｏＳｃａｎシステムは、各走査速度でシステム感度を最適化する
ために、アナログ処理回路に組み込まれる斬新な切り替え可能フィルタ・スキー
ムを提供する。低域通過フィルタは、一般に重要な信号を通過させるため、及び
測定工程で作られる不必要な高周波ノイズを拒絶するために用いられる。Ｓｕｒ
ｒｏＳｃａｎシステムでは、各走査速度に対する最適フィルタ帯域幅が、異なっ
ていて、通常は走査速度に比例する。望ましい実施形態では、少なくとも２つの
帯域幅が、切り替え可能なフィルタによって各チャンネルに提供される。特に望
ましい実施形態では、４つの帯域幅が提供される。図２Ａ及び２Ｂは、４、８、
１２、及び１６ｋＨＺ（６４、１２８、１９２、及び２５６ヘルツの走査速度用
の最適帯域幅にそれぞれ対応する）の帯域幅を提供する切り替え可能なフィルタ
・スキームのための回路図を示す。望ましい実施形態では、そのようなフィルタ
帯域幅スイッチング・スキームが、各光電子増倍管チャンネルと関係する。The SurroScan system also provides a novel switchable filter scheme that is incorporated into analog processing circuitry to optimize system sensitivity at each scan rate. Low pass filters are commonly used to pass important signals and reject unwanted high frequency noise created in the measurement process. Sur
In a roScan system, the optimum filter bandwidth for each scan rate is different and is usually proportional to scan rate. In the preferred embodiment, at least two bandwidths are provided for each channel by a switchable filter. In a particularly desirable embodiment, four bandwidths are provided. 2A and 2B show 4, 8,
FIG. 7 shows a schematic for a switchable filter scheme that provides bandwidths of 12 and 16 kHz (corresponding to optimal bandwidths for scan rates of 64, 128, 192, and 256 Hertz, respectively). In the preferred embodiment, such a filter bandwidth switching scheme is associated with each photomultiplier tube channel.
【００４２】
したがって、本システムは、１）システムの走査速度が信号対雑音比を最適化
するように変更可能であり、２）各信号チャネルでの各アナログ・フィルタの帯
域幅もまた信号対雑音比をさらに最適化するために変更されるという、２つの別
個の方法で最適化されるので、本発明は従来技術のＭＬＳＣシステムを越える大
きな改良である。この斬新な組合せは、相乗してＭＬＳＣ器具及びシステムの感
度及び効率を向上させる。Thus, the system is 1) variable in the scanning speed of the system to optimize the signal to noise ratio, and 2) the bandwidth of each analog filter in each signal channel is also signal to noise. The present invention is a significant improvement over prior art MLSC systems, as it is optimized in two separate ways, which is modified to further optimize the ratio. This novel combination synergistically improves the sensitivity and efficiency of MLSC instruments and systems.
【００４３】
本発明の望ましい実施形態では、ＳｕｒｒｏＳｃａｎシステムの最適の走査速
度及びフィルタ帯域幅が、各々の実行される特定の分析に対して決定される。こ
れらの変数は、後にオペレータが同じ分析の再実行を選択する場合に、これらの
設定値を自動的に選択することができる臨床プロトコル・データベース（以下を
参照）に格納される。このようにして、同じステージ上で、多くの様々な分析を
行うことが可能であり、コンピュータは、各サンプルに対して、前もって定義し
た最適の走査速度及びフィルタ設定を自動的に選択することができる。この利点
が、ＳｕｒｒｏＳｃａｎシステムの柔軟性に大きく寄与している。In a preferred embodiment of the present invention, the optimal scan rate and filter bandwidth of the SurroScan system is determined for each particular analysis performed. These variables are stored in a clinical protocol database (see below) that can automatically select these settings if the operator later chooses to rerun the same analysis. In this way, many different analyzes can be performed on the same stage, and the computer can automatically select the optimal pre-defined scan speed and filter settings for each sample. it can. This advantage contributes significantly to the flexibility of the SurroScan system.
【００４４】
上に記述されたすべての実施形態は、微粒子を検知するために、可視か、ある
いは電磁スペクトルの赤外線部分の近くで発する蛍光体のレーザ励起を使用する
ことに注目すること。しかしながら、本発明はまた、赤外線のような他のタイプ
の電磁放射及び放射プローブの使用を意図する。さらに、本発明は、ただの単一
のプローブだけではなく、プローブのアセンブリの使用を意図する。また本発明
は、制限されるものではないが、ラマン散乱、ミー散乱、ルミネセンス、及び燐
光を含む、蛍光以外の光散乱モードの使用を意図する。ＳｕｒｒｏＩｍａｇｅ画像分析ソフトウェア
イメージ処理は、レーザ・スキャニング・サイトメトリにとって、重大な要件
である。イメージ処理プログラムは、セルの蛍光又は他の微粒子の蛍光（チャン
ネル）の異なるスペクトル領域を描写する複数のバイナリ・イメージを処理する
必要がある、また、各チャンネルのバックグラウンド蛍光レベルを決定する必要
がある、また、ノイズからセル又は他の微粒子を数えあげることができるような
、各チャンネルの全体のノイズ、また、バブル、ゴミ微粒、及び他の「汚れ」や
「ほこり」の源といったような外来の信号を無視する必要がある、また、制限さ
れるものではないが、加重フラックス、サイズ、楕円率、並びに同じ位置にある
他チャンネル内の信号間の比率及び相関を含むパラメータをレポートするために
、各々の識別されたセル又は微粒子の特性を決定する必要がある。ＳｕｒｒｏＳ
ｃａｎシステムは、上記の基準を満たし、テキスト・リストモード・フォーマッ
トでの分析結果を出力するＳｕｒｒｏＩｍａｇｅシステムと呼ばれるイメージ処
理及び微粒子検出システムを含む。Note that all of the embodiments described above use laser excitation of a phosphor that emits in the visible or near the infrared portion of the electromagnetic spectrum to detect particulates. However, the invention also contemplates the use of other types of electromagnetic radiation and radiation probes such as infrared. Further, the present invention contemplates the use of an assembly of probes, rather than just a single probe. The present invention also contemplates the use of light scattering modes other than fluorescence, including but not limited to Raman scattering, Mie scattering, luminescence, and phosphorescence. SurroImage Image Analysis Software Image processing is a critical requirement for laser scanning cytometry. Image processing programs need to process multiple binary images that depict different spectral regions of cell fluorescence or other particulate fluorescence (channels), and need to determine the background fluorescence level for each channel. Yes, and also the total noise in each channel, such as the ability to enumerate cells or other particles from noise, and foreign sources such as bubbles, dust particles, and other sources of "dirt" or "dust". In order to report parameters including, but not limited to, weighted flux, size, ellipticity, and ratio and correlation between signals in other channels at the same position. , It is necessary to determine the properties of each identified cell or particle. SurroS
The can system includes an image processing and particulate detection system called the SurroImage system that meets the above criteria and outputs the analysis results in a text list mode format.
【００４５】
ＳｕｒｒｏＩｍａｇｅシステムについての次の説明は、バイナリ・イメージ入
力ファイル（．ｓｍｌ）で始まり、関連する様々なアルゴリズムの記述及び説明
を備えたテキスト・リストモード出力ファイル（．ｌｓｍ）までの、関数の形式
で与えられる。図３は、ＳｕｒｒｏＩｍａｇｅシステムによって実行される操作
のフローチャートを描く。後に続く有効にする記述において、ＳｕｒｒｏＩｍａ
ｇｅシステムは、セル検出のコンテキストで記述されることにも注意すること。
しかしながら、上に記述されるように、ＳｕｒｒｏＩｍａｇｅシステムは、抗体
標識付けされたビードのような、定義済みの物理パラメータを備えるいかなる構
造をも検知することができる。ＳｕｒｒｏＩｍａｇｅシステムは、制限されるも
のではないが、「Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍａｒｋｅｒ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａ
ｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（生物学的マーカ同定システム）」と題された米国暫定
特許出願第６０／１３１，１０５号、及びこの出願と同時に提出された「Ｐｈｅ
ｎｏｔｙｐｅ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍａｒｋｅｒ Ｉｄｅｎｔｉｆ
ｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（フェノタイプの生物学的マーカ同定システム）
」と題された共有される米国実用出願において記述されている実施形態を含めて
、従来技術において記述されるＭＬＳＣのいかなる実施形態での使用に対しても
意図される。入力
本発明の望ましい実施形態では、バイナリの組み合わせられたフォーマットが
、イメージデータを格納するために用いられる。図４に図解されたフォーマット
で、いかなる数の１６ビット・データ・チャネル（イメージ）でも組み合わされ
ることができる。チャンネル・イメージ・アレイは、各行に沿って格納される：
（行０：列０、列１、列２，．．．、列ｎ列；行１：．．．行ｎ行へ）、ただし
、ｎ列は通常２５０ピクセルで、ｎ行は通常１００００ピクセルである。図４に
示されるようなＳＭ１ヘッダは、記述子当たり４バイトを備えたヘッダ内に２８
バイトを持つ。各ファイル記述子は、下位−上位ワードの形式で配列される。「
４文字記述子」は「ＳＭ０１」のようなユニークなイメージ・タイプを記述する
任意の４文字でありうる。The following description of the SurroImage system begins with a binary image input file (.sml) and ends with a text list mode output file (.lsm) with a description and description of various algorithms involved. Given in the form. FIG. 3 depicts a flowchart of the operations performed by the SurroImage system. In the enabling statements that follow, SurroIma
Note also that the ge system is described in the context of cell detection.
However, as described above, the SurroImage System is capable of detecting any structure with defined physical parameters, such as antibody labeled beads. The SurroImage system includes, but is not limited to, "Biological Marker Identitya.
US Provisional Patent Application No. 60 / 131,105 entitled "Tion System (Biological Marker Identification System)", and "Phe" filed concurrently with this application.
nottype and Biological Marker Identif
ication System (phenotype biological marker identification system)
Is intended for use with any of the embodiments of MLSC described in the prior art, including those described in the shared US utility application entitled ". Input In the preferred embodiment of the invention, a binary combined format is used to store the image data. Any number of 16-bit data channels (images) can be combined in the format illustrated in FIG. The channel image array is stored along each row:
(Row 0: column 0, column 1, column 2, ..., column n column; row 1: ... to row n row), where n column is typically 250 pixels and n row is typically 10000 pixels is there. The SM1 header as shown in FIG. 4 has 28 bytes in the header with 4 bytes per descriptor.
Have a bite. Each file descriptor is arranged in the form of lower-higher word. "
A "four character descriptor" can be any four characters that describe a unique image type, such as "SM01".
【００４６】
本発明の１つの実施形態で、システムはピクセル当たり２バイトあるいは１６
ビットを使用しているので、各ピクセルは、６５５３６の値のうちのいずれかを
持つことができる。しかしながら、フィールド記述子「ピクセル当たりのバイト
」が、ワードからフロートまで、又は他のデータフォーマットまで、イメージタ
イプを拡張する柔軟性を可能にする。さらに、変数フィールド「ヘッダ内のバイ
ト」が、さらなるフィールド記述子を追加する能力を見込む。例えば、このフォ
ーマットを利用する４バイトのフロート・イメージは、１ピクセル当たりのバイ
ト＝４を設定することになり、次いで恐らく、さらなる記述子フィールドが、フ
ロートとしてフォーマット・タイプを記述するために追加される。その「インタ
ーリーブ」フィールドは、シーケンシャルモードでチャンネルを書くオプション
を与える。例えば、本発明のいくつかの実施形態では、走査システムが、チャン
ネル情報を同時にではなく、順次に集める、例えば、最初にチャンネル０のすべ
てのデータを格納し、次にチャンネル１が続くといった具合である。図４は、望
ましいファイル・フォーマットの図式を示す。In one embodiment of the present invention, the system uses 2 bytes or 16 pixels per pixel.
Because of the use of bits, each pixel can have any of the 65536 values. However, the field descriptor "bytes per pixel" allows the flexibility to extend the image type from word to float, or to other data formats. In addition, the variable field "Bytes in Header" allows for the ability to add additional field descriptors. For example, a 4-byte float image utilizing this format would set bytes per pixel = 4 and then perhaps a further descriptor field was added to describe the format type as float. R. The "interleaved" field gives the option of writing channels in sequential mode. For example, in some embodiments of the invention, the scanning system collects channel information sequentially rather than simultaneously, eg, first stores all data for channel 0, then channel 1, and so on. is there. FIG. 4 shows a schematic of the preferred file format.
【００４７】
望ましい実施形態では、＊．ＳＭ１ファイルが、ＳｕｒｒｏＩｍａｇｅから読
み取られ、各チャンネルがハンドル記述子を備えたメモリに格納される。データ
の各チャンネルに関する情報は、イメージ・ハンドル特性と共に、ＳｍＩｍａｇ
ｅＩｎｆｏと称されるクラスに格納されるが、ｈＩｍはその構造の１メンバであ
る。実行
：任意パラメータ
望ましい実施形態では、ＳｕｒｒｏＩｍａｇｅは実行可能なコマンド行である
。プログラムを実行するために、次のフォーマットが使用されることができる。
Ｃ：＞ＳｕｒｒｏＩｍａｇｅ｛ＳＭ１入力ファイル｝｛任意のＬＳＭ出力ファイ
ル｝｛任意パラメータ・リスト｝
ただし、
ＳＭ１入力ファイル： ＊．ｓｍ１ファイルへのフルパス、
任意のＬＳＭ出力ファイル： ＊．ｌｓｍの出力位置を指定する任意のフルパス
。このパラメータが省略される場合、ベース名＊を含む＊．ｓｍ１と同じパスが
使用される。
任意パラメータ・リスト： スペースで区切られた複数のパラメータが割り当て
られる。フォーマットの例は、
ＳｕｒｒｏＩｍａｇｅ Ｃ：／ＳＭ１＿Ｆｉｌｅｓ＼Ｉｍａｇｅ１．ｓｍ１ Ｃ
：＼ＬＳＭ＿Ｆｉｌｅｓ＼Ｉｍａｇｅ１．ｌｓｍ ＴｈｒｅｓｈＲａｔｉｏ＝１
．２ Ｗｒｉｔｅ ＲＡＷＦｉｌｅｓ
である。In the preferred embodiment, *. The SM1 file is read from the SurroImage and each channel is stored in memory with a handle descriptor. Information about each channel of data, along with image handle characteristics, is provided by SmImag.
Although stored in a class called eInfo, hIm is a member of its structure. Execution : Optional Parameters In the preferred embodiment, SurroImage is an executable command line. The following formats can be used to execute the program. C:> SurroImage {SM1 input file} {arbitrary LSM output file} {arbitrary parameter list} where SM1 input file: *. Full path to sm1 file, any LSM output file: *. An optional full path that specifies the output location of lsm. If this parameter is omitted, the *. The same path as sm1 is used. Optional parameter list: Multiple parameters separated by spaces are assigned. An example of the format is SurroImage C: / SM1_Files \ Image1. sm1 C
: \ LSM_Files \ Image1. lm ThreshRatio = 1
． 2 Write RAWFiles.
【００４８】
任意パラメータは、制限されるものではないが、以下のものを含む。
ＴｈｒｅｓｈＲａｔｉｏ： セル検知閾値レベルを決定するために使用される倍
数因子。
ｉＮｕｍＣｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｓ： チャンネルのｉＮｕｍＣｏｒｒｅｌａｔ
ｉｏｎｓ数への相関を提供する。
ＵｓｅＢａｎｄＰａｓｓＦｏｒＢｌｏｂ： １の場合、セルを検知するために濾
過されたイメージを使用する（ＵｓｅＰｅａｋｓＦｏｒＢｌｏｂｓと相
互排除でなければならない）。
ＵｓｅＰｅａｋｓＦｏｒＢｌｏｂｓ： １の場合、セルを検知するために、５ｘ
５核の中心と、外部ピクセルとの間の差分を使用する。
ＵｓｅＦｕｌｌＰｅｒｉｍＤｅｔｅｃｔ： １の場合、セルを見つけるために中
心と関連する外部のすべての周囲ピクセルを使用する。
Ｂｌｏｂａｒｅａｌｏ： 検知すべき最小のセル直径。
ＭａｘＣｅｌｌＳｉｚｅ： ＭａｘＣｅｌｌＳｉｚｅへのセルの直径を直径＞
ＭａｘＣｅｌｌＳｉｚｅに設定する。
ＲｏｗｓＰｅｒＮｏｉｓｅＢｌｏｃｋ： ピーク−ピーク・ノイズ計算において
、
ブロック当たりに使用する行の数
ＳａｍｐｌｅＲｏｗｓＰｅｒＮｏｉｓｅＢｌｏｃｋ： ノイズ計算用に各ブロッ
ク内でサンプリングすべき行の数
ＭａｘＢｌｏｂＰｉｘ： 閾値化されたメジアン減算ソースイメージが、特定の
セグメントをイメージ・マスクに追加されるべき「ブロブ」として指定
する、隣接ピクセルの数
ＭａｘＢｕｂｂｌｅＰｉｘ： 負に閾値化されたメジアン減算ソースイメージが
、
特定のセグメントをイメージ・マスクに追加されるべき「バブル」とし
て指定する、隣接ピクセルの数
ＢｕｂｂｌｅＴｈｒｅｓｈＦａｃｔｏｒ： バブル検出のためにメジアン減算ソ
ースイメージに適用される−ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ＊Ｎｏｉｓｅｆａｃｔ
ｏｒ。代わりに、Ｎｏｉｓｅｆａｃｔｏｒは、ベースライン値（本文参
照）に置き換えることができる。
ＢｌｏｂＴｈｒｅｓｈＦａｃｔｏｒ： 汚れ検出のためにメジアン減算ソースイ
メージに適用されるｔｈｒｅｓｈｏｌｄ＊Ｎｏｉｓｅｆａｃｔｏｒ。代
わりに、Ｎｏｉｓｅｆａｃｔｏｒは、ベースライン値（本文参照）に置
き換えることができる。
ＭａｓｋＤｉｌａｔｉｏｎＰｉｘ： 最終マスク・イメージは、拡大したＭａｓ
ｋＤｉｌａｔｉｏｎＰｉｘピクセルである。
ＷｒｉｔｅＲＡＷＦｉｌｅｓ： すべての中間の画像ファイルがＣ：＼Ａのディ
レクトリに書き込まれるべきかどうかを示す診断に用いるブール変数
ＳａｍｅＣｅｌｌＲａｄｉｕｓ： それらの重心間の距離（フロート・フォーマ
ットにおける）が、ＳａｍｅＣｅｌｌＲａｄｉｕｓ以下である場合、代
替チャネル内のセルは、同じセルと見なされる。
ＮｏｍＣｅｌｌＭｉｃｒｏｎｓ： 次の３つのパラメータは、すべてのセル計算
のために用いられる核・サイズを決定する。
ＢｅａｍＭｉｃｒｏｎｓ： ＮｏｍＣｅｌｌＰｉｘ＝ｈｙｐｏｔ（ＮｏｍＣｅｌ
ｌＭｉｃｒｏｎｓ、ＢｅａｍＭｉｃｒｏｎｓ）／ＭｉｃｒｏｎｓＰｅｒ
Ｐｉｘ
ＭｉｃｒｏｎｓＰｅｒＰｉｘ： ｉＮｏｍＣｅｌｌＰｉｘ＝（ｉｎｔ）（Ｎｏｍ
ＣｅｌｌＰｉｘ＋１．）で、ｉＮｏｍＣｅｌｌＰｉｘは（Ｋｅｒｎｅｌ
Ｓｉｚｅ−１）／２である。
ＰｒｉｎｔＭｏｄｅ： ＬＳＭファイルのテキスト出力フォーマットを決定する
ための数えられる変数で、０の場合は人間に読み取り易く、１の場合は
タブで区切られ、２の場合はカンマで区切られる。各チャンネルからのソースイメージの処理
ＳｕｒｒｏＩｍａｇｅ内の主要ルーチンは、ＳＭＰｒｏｃｅｓｓＩｍａｇｅｓ
（）と称される。望ましい実施形態では、制限されるものではないが、Ｓｕｒｒ
ｏＩｍａｇｅシステムが、各ソースイメージ、すなわち各チャンネルからのイメ
ージ上に、濾過を行い、マスクをし、汚れ及びバブルを見つけ、最初のセルリス
トを確立することを含めて、多くの機能を実行する。ＳｕｒｒｏＩｍａｇｅシス
テムの主要な機能は、発生している個々のチャンネルを合計することなく、各チ
ャンネルが別々に分析されるということである。手短かに言えば、ＳｕｒｒｏＩ
ｍａｇｅシステムは、ノイズ及びバックグラウンド機構（バブルや汚れのような
）を除去し、かつ識別される微粒子の空間特性を備えた特徴を増強させるために
、各ソースイメージ上で多くの操作を別々に実行する。またシステムは、各チャ
ンネルの微粒子決定用の閾値を決定し、この閾値及び微粒子パラメータに基づい
て、各チャンネルの微粒子を別々に識別し分析する。その後、システムは、微粒
子がそのチャンネルに対する閾値未満であったために微粒子が検知されなかった
残りのチャンネルにおいて、同じピクセルを発見し、それらのチャンネル内の微
粒子のパラメータも測定する。この方法で、ＳｕｒｒｏＩｍａｇｅシステムは、
微粒子が最初は識別されなかったチャンネルでさえ、各識別された微粒子のデー
タを収集する。Optional parameters include, but are not limited to: ThreshRatio: A multiple factor used to determine the cell detection threshold level. iNumCorrelations: Provides the correlation to the number of iNumCorrelations for the channel. UseBandPassForBlob: If 1, use filtered image to detect cells (must be mutually exclusive with UsePeaksForBlobs). UsePeaksForBlobs: If 1, use the difference between the center of the 5x5 kernel and the external pixel to detect the cell. UseFullPerimDetect: If 1, use all surrounding ambient pixels associated with the center to find the cell. Blobarealo: The smallest cell diameter to detect. MaxCellSize: Set the cell diameter to MaxCellSize to Diameter> MaxCellSize. RowsPerNoiseBlock: Number of rows to use per block in peak-to-peak noise calculation SampleRowsPerNoiseBlock: Number of rows to sample in each block for noise calculation MaxBlobPix: Thresholded median subtracted source image is a specific segment The number of adjacent pixels MaxBubblePix: Negatively thresholded median subtraction source image as a "bubble" that should be added to the image mask Number of neighboring pixels BubbleThreshFactor: applied to median subtraction source image for bubble detection -threshold * Noisefact o r. Alternatively, Noisefactor can be replaced with a baseline value (see text). BlobThreshFactor: A threshold * Noisefactor applied to the median subtraction source image for dirt detection. Alternatively, Noisefactor can be replaced with a baseline value (see text). MaskDilationPix: The final mask image is a magnified MaskDilationPix pixel. WriteRAWFiles: Boolean variable used to diagnose whether all intermediate image files should be written to the directory C: \ A SameCellRadius: The distance between their centers of gravity (in float format) is less than SameCellRadius. In some cases, cells in the alternate channel are considered the same cell. NomCellMicrons: The next three parameters determine the kernel size used for all cell calculations. BEAMMicrons: NomCellPix = hypot (NomCell Microns, BEAMMicrons) / MicronsPer Pix MicronsPerPix: iNomCellPix = (int) (NomCellPix + 1.), INo (cellKix + 1.) Pin, iNomPix). PrintMode: A variable that is counted to determine the text output format of the LSM file. When 0, it is easy for humans to read, when 1 is tab separated, and when 2 is comma separated. Processing source images from each channel The main routines in SurroImage are SMProcessImages.
It is called (). In the preferred embodiment, but not limited to, Surr
The oImage system performs many functions on each source image, ie, the image from each channel, including filtering, masking, finding dirt and bubbles, and establishing an initial cell list. The main function of the SurroImage system is that each channel is analyzed separately, without summing the individual channels that are occurring. In short, SurroI
The image system performs many operations separately on each source image to remove noise and background mechanisms (such as bubbles and dirt) and enhance features with the spatial characteristics of the particulates that are identified. Run. The system also determines a threshold for particle determination in each channel, and based on the threshold and particle parameters, identifies and analyzes the particles in each channel separately. The system then finds the same pixels in the remaining channels where no particles were detected because they were below the threshold for that channel, and also measures the parameters of the particles in those channels. In this way, the SurroImage system
Collect data for each identified particle, even in channels where particles were not initially identified.
【００４９】
望ましい実施形態では、１）濾過されたソースイメージ（たたみこみ核のアプ
リケーション）、２）メジアン減算ソースイメージ、及び３）一時記憶用に使用
される作業イメージ、を格納するために用いられる、多くの浮動小数点イメージ
にハンドルを開くことによって、ＳｕｒｒｏＩｍａｇｅシステムが始動する。さ
らに、多くのＢＹＴＥイメージが、後で説明されるマスク・イメージを含む、上
記の浮動小数点イメージの閾値バージョンを格納するために作成される。In a preferred embodiment, used to store 1) the filtered source image (convolutional kernel application), 2) the median subtracted source image, and 3) the working image used for temporary storage, Opening the handle to many floating point images starts the SurroImage system. In addition, many BYTE images are created to store the threshold version of the floating point image above, including the mask image described below.
【００５０】
各チャンネルに対して、ベースラインとなる分析を実行することにより、ルー
チンが始動することが望ましい。このサブルーチン・コールは、ｙ（注釈：後の
参考のために、ｘは、通常は４０ミリメートルあるいはｎ行＝１００００ピクセ
ルである長い毛細管の方向であり、ｙは、通常は１ミリメートルあるいはｎＣｏ
ｌｓ＝２５０ピクセルである検流計走査の方向である）に関するベースラインの
全体的な変動に対する統計値を返す。統計値は、ベースラインが、定義済みの制
限（一般に、最大値−最小値＞０．３メジアン値）を越えて変化したことを示す
ブーリアン値のＢａｓｅｌｉｎｅＥｒｒｏｒＦｌａｇを含めて、全体的に格納さ
れることができる。図５は、フローチャート形式でこのプロセスを描く。It is desirable that the routine be started by performing a baseline analysis for each channel. This subroutine call uses y (Note: for later reference, x is the direction of a long capillary, which is typically 40 millimeters or n rows = 10000 pixels, and y is typically 1 millimeter or nCo.
Returns the statistics for the overall variation of the baseline (for the direction of the galvanometer scan where ls = 250 pixels). Statistics should be stored globally, including a boolean BaselineErrorFlag that indicates that the baseline has changed beyond a defined limit (typically max-min> 0.3 median). You can FIG. 5 depicts this process in flow chart form.
【００５１】
それから望ましい実施形態では、１５ｘ１５のメジアン核が、ＴｕｒｂｏＭｅ
ｄｉａｎ（）と称される高速のメジアン・アルゴリズムを用いて、各ソースイメ
ージに適応される。核は、１５ｘｌ５核内の中心ピクセルを、核内の全ピクセル
のメジアン値に置き換えることにより作動する。各ピクセルにこのメジアン核を
適応することは、Ｙ軸におけるイメージに沿って生じる、ピクセル輝度内の緩や
かな変動を「スムーズにする」ように作用する。スムーズにする作業の第一の役
割は、セルによる輝度への寄与分を取り除くことであり、その結果、イメージの
バックグラウンド表示を得る。メジアンイメージは、ソースイメージから差し引
かれ、ｈＩｍｂｇｎｄと称されるグローバル・ハンドルに格納される。制限され
るものではないが、全フラックス、楕円率、及びセル直径（フィット・エリアと
も呼ばれる）を含むセルパラメータを決定するために、セルリストが生成された
後に、このイメージは使用されることができる。Then, in a preferred embodiment, the 15 × 15 median nucleus is TurboMe
A fast median algorithm called dian () is used to adapt each source image. The kernel works by replacing the central pixel in the 15x15 kernel with the median value of all pixels in the kernel. Applying this median kernel to each pixel acts to "smooth" the gradual variations in pixel intensity that occur along the image in the Y axis. The primary role of the smoothing task is to remove the contribution of cells to the brightness, resulting in a background display of the image. The median image is subtracted from the source image and stored in a global handle called hImbgnd. This image may be used after the cell list has been generated to determine cell parameters including, but not limited to, total flux, ellipticity, and cell diameter (also called fit area). it can.
【００５２】
その後、望ましい実施形態では、複数のイメージが、定義済み核でたたみみこ
まれ、ｉｍＢｌｏｂＳｒｃと称されるグローバル・ハンドルに格納される。その
ようなたたみこみ核は、この技術分野ではよく知られている。選択される核構造
（核の大きさ及び核内の加重値）は、検知されることになっている微粒子に依存
する。例えば、血液セルの決定であれば、７ｘ７核が、ほぼ血液セルの大きさで
あるので、通常はこの核が用いられる。本説明のためのたたみこみ核は７ｘ７核
であると仮定されるが、他の核が他の実施形態において有用であることが理解さ
れるべきである。このたたみこみの結果は、検知されようとしているセルタイプ
に対応する定義済みの空間成分でもってそれらの特徴を増強するフィルタ補正さ
れたイメージである。このイメージの閾値バージョンは、セル検出に対して、及
びさらに加重フラックス計算に対して、使用されることができる。Then, in the preferred embodiment, the images are convolved with a defined kernel and stored in a global handle called imBlobSrc. Such convolution kernels are well known in the art. The nuclear structure selected (nucleus size and weight in the nucleus) depends on the microparticles to be detected. For example, when determining a blood cell, a 7 × 7 nucleus is almost the size of a blood cell, and thus this nucleus is usually used. The convolutional nuclei for the purposes of this description are assumed to be 7x7 nuclei, but it should be understood that other nuclei are useful in other embodiments. The result of this convolution is a filtered image that enhances those features with a defined spatial component corresponding to the cell type being detected. The threshold version of this image can be used for cell detection and also for weighted flux calculations.
【００５３】
いくつかの実施形態では、検知されようとするセルタイプに対応する定義済み
の空間成分でもって、最初にそれらの特徴を増強するために、上に記述されたた
たみこみ法ではなく「ペリメータ」法が用いられる。ペリメータ法は、差分ソー
スイメージである「差分」イメージを作成し、異なる２つの方法で実行されるこ
とができる。ペリメータ法のいくつかの実施形態では、すべてのピクセルが、７
ｘ７核のそれと、外部の４つのピクセルとの間の最小差分に設定される。他の実
施形態では、各ピクセルが、７ｘ７核のその値と、外部のすべてのピクセルとの
間の最小差分に設定される。畳み込まれたイメージではなく、これらの「差分」
イメージを使用することは、ＵｓｅＰｅａｋｓＦｏｒＢｌｏｂｓと称されるブー
リアン・コマンド行の引数を介して指定することができる。この場合もやはり、
増強されたイメージは、グローバル・ハンドルｉｍＢｌｏｂＳｒｃに格納される
。図６は、フローチャートの形式で、ペリメータ法及びたたみこみフィルタ法の
使用を示す。In some embodiments, with a defined spatial component corresponding to the cell type to be sensed, a “perimeter” is used rather than the convolution method described above to initially enhance those features. Method is used. The perimeter method creates a "difference" image, which is the difference source image, and can be implemented in two different ways. In some embodiments of the perimeter method, every pixel is 7
It is set to the minimum difference between that of the x7 kernel and the four outer pixels. In another embodiment, each pixel is set to the minimum difference between its value of 7x7 kernels and all external pixels. These "differences" rather than the convolved images
The use of images can be specified via a boolean command line argument called UsePeaksForBlobs. In this case, too,
The enhanced image is stored in the global handle imBlobSrc. FIG. 6 shows the use of the perimeter method and the convolutional filter method in the form of a flow chart.
【００５４】
どちらの方法が最初の増強に対して用いられても、生じるイメージは閾値化さ
れ、細分化分析がセル位置を決定するために実施される。セル検出用の閾値を確
立するには、各ソースイメージ内のノイズを突き止めなければならない。望まし
い実施形態では、イメージのセグメントあるいはブロック上のピークピーク・ノ
イズを計算するアルゴリズムが使用される。図７は、フローチャートの形式でこ
のプロセスを示す。各ブロックは、ｎ列幅（イメージの全幅）で、ＲｏｗｓＰｅ
ｒＮｏｉｓｅＢｌｏｃｋ（コマンド行の引数）の長さである。各ブロックに対す
る各ノイズ値は、（ｉｎｔ）（ｎＲｏｗｓ／ＲｏｗｓＰｅｒＮｏｉｓｅＢｌｏｃ
ｋ）エレメントを持つアレイに格納される。その後、このアレイは、ｔｈｒｅｓ
ｈｒａｔｉｏ（コマンド行の引数）で乗算され、閾値判定に使用されるｎ行長さ
のアレイに挿入される。閾値のサブルーチンは、閾値判定されたＢＹＴＥイメー
ジであるｉｍＢｌｏｂＳｅｇを生成するために、畳み込まれたイメージ、あるい
は「差分」イメージのどちらかを使用する。Whichever method is used for the initial enhancement, the resulting image is thresholded and subdivision analysis is performed to determine cell position. To establish a threshold for cell detection, the noise in each source image must be located. In the preferred embodiment, an algorithm is used that calculates the peak-to-peak noise on a segment or block of the image. FIG. 7 illustrates this process in the form of a flow chart. Each block is n columns wide (full width of the image) and has a RowsPe
It is the length of rNoiseBlock (argument on the command line). Each noise value for each block is (int) (nRows / RowsPerNoiseBloc)
k) Stored in an array with elements. Then this array is thres
Multiplied by ratio (command line argument) and inserted into an n line long array used for thresholding. The threshold subroutine uses either the convolved image or the “difference” image to generate the thresholded BYTE image, imBlobSeg.
【００５５】
望ましい実施形態では、ソースイメージがチャンネル０と関連したものである
場合、ＭａｓｋＧｒｕｎｇｅＡｎｄＢｕｂｂｌｅｓ（）と呼ばれるサブルーチン
が、ｉｍＢｌｏｂＳｅｇ上で細分化又はセル検出を実行する前に呼び出される。
図８は、フローチャートの形式で、このサブルーチンを示す。チャンネル０は、
バブル及び汚れを発見するために用いられ、それらの領域がマスク・イメージに
追加される。これは、サンプルからの最短の放射波長に対応するこのチャンネル
内で、サンプル内のゴミが一貫して発生する傾向があるからである。しかしなが
ら、他の実施形態では、他のチャンネル（１つ以上）がマスク・イメージのため
に使用されることができる。In the preferred embodiment, if the source image is associated with channel 0, a subroutine called MaskGrungeAndBubbles () is called before performing subdivision or cell detection on imBlobSeg.
FIG. 8 shows this subroutine in the form of a flow chart. Channel 0 is
Used to find bubbles and stains, those areas are added to the mask image. This is because consistent debris within the sample tends to occur within this channel, which corresponds to the shortest emission wavelength from the sample. However, in other embodiments, other channels (one or more) can be used for the mask image.
【００５６】
マスク・バイト・イメージは、３つの異なる状態を介して付加される。Ｍａｓ
ｋＧｒｕｎｇｅＡｎｄＢｕｂｂｌｅｓ（）が、これらの状態をテストする。それ
は、バブルとボルブ閾値であるＢｕｂｂｌｅＴｈｒｅｓｈＦａｃｔｏｒ及びＢｌ
ｏｂＴｈｒｅｓｈＦａｃｔｏｒ（ピークピーク・ノイズ値を乗算された）をそれ
ぞれ適用するために、メジアン減算ソースイメージであるイメージｈＩｍｂｇｎ
ｄを用いる。例えば、バブルに関しては、ソースイメージの特定のブロックに対
してｈＩｍｂｇｎｄのいかなる部分も、−１＊ＢｕｂｂｌｅＴｈｒｅｓｈＦａｃ
ｔｏｒ＊ｐ−ｐＮｏｉｓｅ以下であり（バブルはバックグラウンド蛍光が無い事
によって示される）、かつ隣接のピクセル総数がＭａｘＢｕｂｂｌｅＰｉｘを超
過する場合、それらの対応するピクセルがマスク・イメージ内で「バブル」を示
す特定の値に設定される。同様に、ボルブ検出は、ＢｌｏｂＴｈｒｅｓｈＦａｃ
ｔｏｒ＊ｐ−ｐＮｏｉｓｅ及びＭａｘＢｌｏｂＰｉｘを用いてなされる。別の望
ましい実施形態では、バブル及びボルブの閾値判定が、ピークピーク・ノイズレ
ベルの因数ではなく、平均ベースライン値の百分率に基づく。したがって、バブ
ル及びボルブの閾値レベルは、それぞれＢｕｂｂｌｅＴｈｒｅｓｈＦａｃｔｏｒ
＊ＢａｓｅＬｉｎｅ（ｙ）、及びＢｌｏｂＴｈｒｅｓｈＦａｃｔｏｒ＊Ｂａｓｅ
Ｌｉｎｅ（ｙ）によって与えられ、その場合のＢａｓｅＬｉｎｅ（ｙ）とは、与
えられたｙ値に対してピクセルのｘ範囲を越えた（つまり毛細管の幅を越える）
ベースラインのメジアン値である。マスクへの最終追加は、セグメント化されフ
ィルタ補正されたｉｍＢｌｏｂＳｅｇイメージに基づいてなされる。またそれは
、コマンドラインにおいて与えられたのと同じＴｈｒｅｓｈＲａｔｉｏを用いる
が、ＭａｘＢｕｂｂｌｅＰｉｘを超過する場合にだけ、マスクに追加する。最終
的に、ｎ＝ＭａｓｋＤｉｌａｔｉｏｎＰｉｘのピクセルの拡張（バイナリ拡張と
は、そのピクセルが、領域の一部である別のピクセルに既に触れている場合、そ
の任意のバックグラウンド・ピクセルを「オン」に設定する）がマスク上でなさ
れ、セルがバブルの縁で識別されたりすることがないよう予防する。たたみこみ
フィルタのアーティファクトは、バブルの周縁が、誤ってセルとして識別される
ことがある輪に畳み込まれる傾向があるということである。拡張は、この誤差を
抑制するのに役立つ。The mask byte image is added via three different states. Mas
kGrangeAndBubbles () tests these states. It is the bubble and bubble thresholds BubbleThreshFactor and Bl.
The image hImbgn, which is the median subtracted source image, for applying each of the obThreshFactors (multiplied by the peak-peak noise value).
d is used. For example, for bubbles, any part of hImbgnd for a particular block of the source image will be -1 * BubbleThreshFac.
If less than tor * p-pNoise (bubbles are indicated by the absence of background fluorescence) and the total number of adjacent pixels exceeds MaxBubblePix, those corresponding pixels will show "bubbles" in the mask image. Set to a specific value. Similarly, the Volb detection is based on BlobThreshFac.
made using tor * p-pNoise and MaxBlobPix. In another preferred embodiment, bubble and volvo thresholding is based on a percentage of the average baseline value rather than a factor of peak peak noise level. Therefore, the threshold levels of the bubble and the bubble are respectively the BubbleThreshFactor.
* BaseLine (y), and BlobThreshFactor * Base
Given by Line (y), where BaseLine (y) is beyond the x range of the pixel for the given y value (ie beyond the width of the capillary).
The median value of the baseline. The final addition to the mask is made based on the segmented and filtered imBlobSeg image. It also uses the same ThreshRatio as given on the command line, but adds to the mask only if it exceeds MaxBubblePix. Finally, a pixel extension of n = MaskDilationPix (a binary extension is to set any background pixel to "on" if that pixel already touches another pixel that is part of the area. Is done on the mask to prevent cells from being identified at the edge of the bubble. An artifact of the convolutional filter is that the edges of the bubble tend to fold into a ring that can be mistakenly identified as a cell. The expansion helps suppress this error.
【００５７】
その後、望ましい実施形態では、ｉｍＢｌｏｂＳｅｇイメージ内のセルが、８
ポイント接続性ルールを用いて、検数される。図９は、フローチャート形式でこ
のプロセスを示す。いかなる数の隣接ピクセルもセルリストに追加され、基本パ
ラメータが各々に対して決定される。これらのパラメータは、制限されるもので
はないが、インデックス、最大のｘとｙのピクセル値、ピクセルの総数、均一に
閾値化されるセル領域に基づくｘ−ｙ重心値、並びに閾値を超過する同じピクセ
ルを用いるけれども、ソースイメージ内のピクセル値でそれらの位置に重みを加
える加重重心、を含む。この重心値は、すべての後の計算に対して用いられる浮
動小数点値である。重心値がマスク内の０でない領域にある場合（マスクに追加
された各々は、バブルのために追加されたものが、ブロブのために追加されたも
のと区別されるように、異なる「識別子」でそれらのピクセルに標識付けがなさ
れていることを思い出すこと）、そのセルはセルリストから削除される。ＳＭＰ
ｒｏｃｅｓｓＩｍａｇｅｓの中でなされる計算の最後の部分は、前述の要素（汚
れ、バブル、及びフィルタ・アーティファクト）の各々のために見えなくさせら
れるイメージの百分率を決定するマスク・イメージのヒストグラムである。また
イメージがマスクされたパラメータの全合計が計算される。これは、重要な部分
がマスクされる場合に、毛細管の容積を再計算できるようにする。Then, in the preferred embodiment, the cells in the imBlobSeg image are 8 cells.
Counted using the point connectivity rule. FIG. 9 illustrates this process in flowchart form. Any number of neighboring pixels are added to the cell list and the basic parameters are determined for each. These parameters include, but are not limited to, the index, the maximum x and y pixel value, the total number of pixels, the xy centroid value based on the uniformly thresholded cell area, and the same threshold exceeded. A weighted center of gravity, which uses pixels but weights their locations with pixel values in the source image. This centroid value is the floating point value used for all subsequent calculations. If the centroid value is in a non-zero region in the mask (each added to the mask will have a different "identifier" so that the one added for the bubble is distinguished from the one added for the blob. Remember that those pixels are labeled with the cell), the cell is removed from the cell list. SMP
The final part of the calculation made in processImages is a mask image histogram that determines the percentage of the image that is made invisible due to each of the aforementioned elements (dirt, bubbles, and filter artifacts). Also, the total sum of the image masked parameters is calculated. This allows the volume of the capillaries to be recalculated if a significant part is masked.
【００５８】
上で説明されたように、ＭＬＳＣシステムはまた、ＭＬＳＣ器具の操作のため
のパラメータ、例えば走査速度、フィルタ帯域幅値などを臨床プロトコル・デー
タベースに格納する。ＳｕｒｒｏＩｍａｇｅシステムを備えたＭＬＳＣ器具の操
作パラメータを、見事に調整する能力によって、各分析ができる限り最も効率的
で最も敏感な方法で、実行されるセル分析及びｌｓｍ出力
望ましい実施形態で、ＳｕｒｒｏＩｍａｇｅシステム内の大多数のセル分析及
びファイル出力は、ＷｒｉｔｅＬｓｍＦｉｌｅ（）ルーチン内で生じる。このル
ーチンの目的は、任意のチャンネルで検知されたすべてのセルイベントについて
のテキストベースのリストファイルを出力することである。さらに、＊．ＬＳＭ
ファイルのヘッダ部分は、全体的なセル統計値（各チャンネルに検知されたセル
の数、及び最小サイズと最大サイズ）だけでなく、イメージ統計値（ベースライ
ン・レベルで測定された雑音レベル、平均、メジアン値、及び標準偏差統計値、
バブル及びブロブのためにマスクされたイメージの百分率、並びにイメージ作成
日）を保持する。その所定のチャンネル用の検知閾値を超過する「ブロブ」を１
本のチャンネルが持っていても、セル特性情報がすべてのチャンネルに対して出
力される。例えば、１つの「ブロブ」がチャンネル１に検知され、そのブロブが
（ｘ＝２２．４、ｙ＝２３４２．３）という加重重心値を持っていたならば、７
ｘ７核の中心は（２２、２３４２）となり、どのチャンネルが閾値を超過したセ
ルを実際に持っていたかにかかわらず、その７ｘ７アレイ上で計算されるセル統
計値が、すべてのチャンネル・イメージにおいて決定される。各チャンネルのこ
のように統合された分析が、各セルに対するすべての蛍光データの収集を保証す
るので、ＭＬＳＣシステムの精度を非常に向上させる。このようにして、例えば
検知された分子が非常に低濃度であった場合でも、意味ある情報を供給する非常
に弱い蛍光性の信号は無視されない。２本のチャンネル走査用の＊．ＬＳＭファ
イルの一部の例が、テーブル１で示される。テーブル１内の例は、２つの独立し
たセルイベント用のセルデータを一覧にする。この特定の例において、パラメー
タ・イベントソースで分かるように、第１のセルが両方のチャンネルで検知され
た（１＝ＣＨ０、２＝ＣＨ１、４＝ＣＨ２等々で、多重チャネル検出がその値の
合計によって示されることに注目すること）。しかしながら、第２のセルは、チ
ャンネル０でのみ検知されたが、それでもパラメータは、チャンネル１の同じ位
置に対して計算された。そのことはこの例からは明白ではないけれども、＊．Ｌ
ＳＭ内のデータ出力がｙ−重心値によって完全に分類される。個々のチャンネル
セルリストからの望ましい実施形態の中で、このデータがどのようにして生成さ
れているかについての説明が続く。As explained above, the MLSC system also stores parameters for the operation of the MLSC instrument, such as scan rate, filter bandwidth values, etc. in a clinical protocol database. The ability to fine-tune the operating parameters of the MLSC instrument equipped with the SurroImage system allows each analysis to be performed in the most efficient and most sensitive manner possible for each cell analysis and ism output in the preferred embodiment, within the SurroImage system. The majority of the cell analysis and file output of the occurs in the WriteLsmFile () routine. The purpose of this routine is to output a text-based list file for all cell events detected on any channel. further,*. LSM
The header part of the file contains not only overall cell statistics (number of cells detected in each channel, and minimum and maximum size), but also image statistics (noise level measured at baseline level, average). , Median and standard deviation statistics,
Retains the percentage of images masked for bubbles and blobs, as well as the image creation date). 1 "blob" that exceeds the detection threshold for that given channel
Cell characteristic information is output to all channels, even if the channels of the book have it. For example, if one "blob" was detected on channel 1 and the blob had a weighted centroid of (x = 22.4, y = 2342.3), then 7
The center of the x7 nucleus will be (22, 2342), and the cell statistics calculated on that 7x7 array will be determined on all channel images, regardless of which channel actually had cells that exceeded the threshold. To be done. This integrated analysis of each channel ensures the collection of all fluorescence data for each cell, thus greatly improving the accuracy of the MLSC system. In this way, the very weakly fluorescent signal, which provides meaningful information, is not neglected, for example, even when the detected molecules are at very low concentrations. For scanning two channels *. Some examples of LSM files are shown in Table 1. The example in Table 1 lists cell data for two independent cell events. In this particular example, as can be seen in the parametric event source, the first cell was detected on both channels (1 = CH0, 2 = CH1, 4 = CH2, etc., and multi-channel detection sums the values). Note that is indicated by. However, the second cell was detected only on channel 0, but the parameters were still calculated for the same position on channel 1. Although it is not clear from this example, *. L
The data output in SM is completely classified by the y-centroid value. A description of how this data is generated in the preferred embodiment from the individual channel cell list follows.
【００５９】
そのルーチンは、各チャンネル内のセルリストの分類により始まる。「Ｆｉｎ
ｄＣｅｌｌ」ルーチンが、ｙ方角へ「少しずつ移動する」ことによって、それが
最初に見つけるすべてのセルペリメータをセルリストに添付するので、それはｙ
−重心値によって必ずしも並び替える必要はない。したがって、バブルの並び替
えが、このリストを生成するために用いられる（少ない数の再配列を行う必要が
ある場合に、バブルの並び替えが最良のソート・アルゴリズムである）。The routine begins by sorting the cell list within each channel. "Fin
Since the "dCell" routine attaches to the cell list all cell perimeters it finds first by "moving in small steps" in the y direction, it is y
-It is not always necessary to sort by the centroid value. Therefore, bubble reordering is used to generate this list (bubble reordering is the best sorting algorithm when a small number of rearrangements need to be made).
【００６０】
次のステップは、チャンネル内のセルを一緒にし、ｙ−重心によって並べ替え
た汎用セルリストを作成することである。このルーチンの詳細は、以下のとおり
である。処理されるべき次の利用可能なセル向けのインデックスは、ＣｅｌｌＦ
ｉｒｓｔＡｖａｉｌＩｎｄｅｘ［チャンネル］と呼ばれ、各チャンネルに対して
作成される。そのルーチンは、まだ印字されていない最低のｙ−重心値を備えた
セルを見つけるために、チャンネル上をループする。その後、このセルインデッ
クス、及びそれの対応するチャンネル番号が、一時的な設定の変数に保管される
。リストであるＣｅｌｌＰｒｉｎｔＬｉｓｔＩｎｄｅｘ［ＣｈａｎｎｅｌｓＭａ
ｘ］は、これまで見つけられたセルのＳａｍｅＣｅｌｌＲａｄｉｕｓ内にその重
心がある、別のチャネル内のセルのインデックスを含めて、作成される。このリ
ストのｎＣｈａｎエレメントを満たすために、そのルーチンはすべてのチャンネ
ル内のセルをループする。しかしながら、別のチャネル内のセルが、分析済みで
あるという「マーク」を既に付けられていた場合、それは読み飛ばして、その指
定されたチャンネル内の残りのセルへ移動する。（このループに入ると、ソース
セルインデックスは、ＣｅｌｌＰｒｉｎｔＬｉｓｔＩｎｄｅｘ［ｓｏｕｒｃｅ＿
ｃｈａｎｎｅｌ］エレメントに最初に追加される（つまり分析される「予定であ
る」というマークが付けられる）ことに注意すること）。それの重心が、元のセ
ルからのＳａｍｅＣｅｌｌＲａｄｉｕｓ距離未満であるいかなるセルも、Ｃｅｌ
ｌＰｒｉｎｔＬｉｓｔＩｎｄｅｘアレイにそのインデックスが追加される。The next step is to bring the cells in the channel together and create a general cell list sorted by the y-centroid. The details of this routine are as follows. The index for the next available cell to be processed is CellF
It is called irstAvailIndex [channel] and is created for each channel. The routine loops over the channel to find the cell with the lowest y-centroid value that has not yet been printed. This cell index and its corresponding channel number are then stored in a temporary setting variable. The list CellPrintListIndex [ChannelsMa
x] is created including the index of the cell in another channel whose centroid is in the SameCellRadius of the cell found so far. To fill the nChan element of this list, the routine loops through cells in all channels. However, if a cell in another channel was already "marked" as analyzed, it will skip and move to the remaining cells in that designated channel. (When entering this loop, the source cell index is CellPrintListIndex [source_
Note that it will be added first (i.e., marked as "scheduled" for analysis) to the [channel] element). Any cell whose centroid is less than SameCellRadius distance from the original cell is Cel
The index is added to the lPrintListIndex array.
【００６１】
いったん単一のセルイベントが、関連するチャンネルに適合すると、テキスト
ベースの．ＬＳＭファイルに出力される準備が整う。このサブルーチンＰｒｉｎ
ｔＣｅｌｌ（）は、ＷｒｉｔｅＬｓｍＦｉｌｅ（）ルーチンからコールされ、２
つの引数、セルチャンネル・リストへのインデックス、及び現在のセルイベント
・カウントを保持するＣｅｌｌＰｒｉｎｔＬｉｓｔＩｎｄｅｘアレイを得る。そ
のルーチンはすべてのチャンネルを通してループし、ＣｅｌｌＰｒｉｎｔＬｉｓ
ｔＩｎｄｅｘアレイ中でインデックスを付けられたセルの重心値にアクセスする
。その後、ルーチンは、数値が求められようとしている特定のセルに対して、チ
ャンネル間のｘ及びｙにおける平均重心値を計算する。その結果はＸ、Ｙにおい
て最も近い全ピクセルに丸められ、Ｘ、Ｙに関して中心にある７ｘ７ピクセル領
域内のセルパラメータを計算するＡｎａｌｙｚｅＣｅｌｌ（）と呼ばれる別のル
ーチンをコールするために用いられる。このルーチンはチャンネル番号を通じて
ループ内でコールされる。セル構造ＡｎａｌｙｚｅＣｅｌｌ（）が満たすＣ＋＋
は、以下のとおりである。Once a single cell event matches the associated channel, the text-based. Ready to output to LSM file. This subroutine Prin
tCell () is called from the WriteLsmFile () routine and 2
Get a CellPrintListIndex array holding one argument, an index into the cell channel list, and the current cell event count. The routine loops through all channels and calls CellPrintList
Access the centroid value of the indexed cell in the tIndex array. The routine then calculates the average centroid value in x and y between the channels for the particular cell whose numerical value is being sought. The result is rounded to the nearest whole pixel in X, Y and used to call another routine called AnalyzeCell () that calculates the cell parameters in the central 7x7 pixel region for X, Y. This routine is called in the loop through the channel number. C ++ satisfied by the cell structure AnalyzeCell ()
Is as follows.
【００６２】[0062]
【表１】 [Table 1]
【００６３】
ＡｎａｌｙｚｅＣｅｌｌ（）は、ｉｍＢｌｏｂＳｒｃイメージへのポインタを
得て、セルのＸ、Ｙ位置へそのポインタを再配置することにより始まる。Ｘ、Ｙ
位置及び呼出しチャンネル番号以外に、ＡｎａｌｙｚｅＣｅｌｌ（）に渡される
パラメータのうちの１つは、この特定チャンネルが「ソース」チャンネルだった
かどうか（つまり、セルがこのチャンネルで実際に検知されたかどうか）を示す
ブーリアン・フラグである。それがソース・チャンネルである場合、ｉｍＢｌｏ
ｂＳｒｃイメージ内の７ｘ７関心領域（ＲＯＩ）で見つけられた最大値の位置が
、返される。これが核の中央Ｘ、Ｙ位置と一致しない場合、この特定チャンネル
に対してグローバル・パラメータｎＢｌｏｂｓＯｆｆｓｅｔＦｒｏｍＰｅａｋが
増加させられる。このようにして、中央セル位置を判定するために使用される方
法が評価される。さらに、重複を明瞭にする手段として、セル構造それ自身にこ
のパラメータを追加することができる。AnalyzeCell () begins by getting a pointer to the imBlobSrc image and relocating the pointer to the X, Y position of the cell. X, Y
Besides the location and calling channel number, one of the parameters passed to AnalyzeCell () indicates if this particular channel was the "source" channel (ie if the cell was actually detected on this channel). It is a Boolean flag. ImBlo if it is the source channel
The position of the maximum found in the 7x7 region of interest (ROI) in the bSrc image is returned. If this does not coincide with the central X, Y position of the nucleus, the global parameter nBlobsOffsetFromPeak is increased for this particular channel. In this way, the method used to determine the center cell position is evaluated. Moreover, this parameter can be added to the cell structure itself as a means of clarifying the overlap.
【００６４】
ＡｎａｌｙｚｅＣｅｌｌ（）をコールしたチャンネル内で、セルが検知されよ
うが検知されまいが、加重フラックスは、ｉｍＢｌｏｂＳｒｃイメージ内のＸ，
Ｙ位置で単にピクセル値を評価することにより計算される。このピクセル値は、
下のテーブル２で与えられる定義済みの７ｘ７核によって加重される、７ｘ７領
域内のすべてのソースイメージ・ピクセル値の加重合計を表す。Whether or not cells are detected in the channel that calls AnalyzeCell (), the weighted flux is X, i in the ImBlobSrc image.
It is calculated by simply evaluating the pixel value at the Y position. This pixel value is
FIG. 5 represents a weighted sum of all source image pixel values within a 7 × 7 region, weighted by the defined 7 × 7 kernel given in Table 2 below.
【００６５】
別の実施形態では、ＡｎａｌｙｚｅＣｅｌｌ（）内で数値が求められる他のパ
ラメータは、制限されるものではないが、全フラックス、楕円率、及び平均直径
を含む。全フラックスと平均直径は、別の機能コールＣｏｍｐｕｔｅＭｅａｎＲ
ａｄｉｕｓ（）によって、数値が求められる。図１０はこの機能コールを、フロ
ーチャート形式で示す。ＣｏｍｐｕｔｅＭｅａｎＲａｄｉｕｓ（）は平均直径を
計算するだけでなく、全フラックスがメジアンを差し引いた同じイメージｈＩｍ
ｂｇｎｄから計算されるので、このルーチンにも含まれる。ｈＩｍｂｇｎｄを引
き出すために、１５ｘｌ５ピクセル・メジアン・フィルタがソースイメージに適
用され、その結果がソースイメージから減算されたことを思い起こすこと。平均
直径を決定するために、重心値が最初に計算される（注釈：この重心は、そのチ
ャンネル用の閾値を超過するピクセルから計算された以前の重心と対比して、７
ｘ７正方形内のピクセルから計算されるので、セルの中心を決定するために計算
された重心値とは異なる）。そうして数学的には次の式によって、示されるよう
に、各ピクセルの重心からの距離は、ピクセル値に対して加重される。In another embodiment, other parameters quantified in AnalyzeCell () include, but are not limited to, total flux, ellipticity, and average diameter. Total flux and average diameter is another function call ComputeMeanR
A numerical value is obtained by adius (). FIG. 10 shows this function call in flow chart form. ComputeMeanRadius () not only calculates the average diameter, but the same image hIm with the total flux subtracted the median.
It is included in this routine as it is calculated from bgnd. Recall that a 15xl5 pixel median filter was applied to the source image to derive hImbgnd and the result was subtracted from the source image. A centroid value is first calculated to determine the average diameter (Note: this centroid is 7 compared to the previous centroid calculated from pixels that exceed the threshold for that channel.
(It differs from the centroid value calculated to determine the center of the cell, as it is calculated from the pixels in the x7 square). Then, mathematically, the distance from the centroid of each pixel is weighted with respect to the pixel value, as shown by the following equation:
【００６６】[0066]
【数１】 [Equation 1]
【００６７】 ただし、重心値Ｃx及びＣyは、次式により与えられる。However, the centroid values C x and C y are given by the following equations.
【００６８】[0068]
【数２】 [Equation 2]
【００６９】
Ｐｘn，ｙnは位置ｘ，ｙでのピクセルの値であり、Ｎは７ｘ７核に対して４９
である。
小さな微粒子の直径を計算するためのこのモーメント法のアルゴリズムは、２
次元のガウス・フィット・ルーチン上でより良い性能を提供することが発見され
た。ガウス・フィット・ルーチンは、図１１に示されるように、低輝度のセルに
対する実際の直径を小さく見積もる傾向がある。この偏向は、モーメント法のア
ルゴリズムで発見されたが、非常に少ししか公言されていない。Px n , y n is the value of the pixel at position x, y, N is 49 for the 7 × 7 kernel
Is. The method of moments for calculating the diameter of small particles is 2
It has been found to provide better performance on the dimensional Gaussian fit routine. The Gaussian fit routine tends to underestimate the actual diameter for low intensity cells, as shown in FIG. This bias was discovered by the method of moments, but very little has been professed.
【００７０】
全フラックスは、方程式（１）及び（２）の分母によって簡単に与えられる。
全フラックスがゼロ以下である場合（それはバックグラウンドから差し引かれた
イメージ中で起こることがある）、合計はオーバーフローを防ぐために値１．０
に指定され、平均直径は０に設定される。The total flux is simply given by the denominator of equations (1) and (2).
If the total flux is less than or equal to zero (which can happen in the image subtracted from the background), the sum is 1.0 to prevent overflow.
And the average diameter is set to 0.
【００７１】
ＰｒｉｎｔＣｅｌｌ（）ルーチンで数値が与えられる他の２つのセルパラメー
タは、チャンネル間の比率及び相関の値を含む。比率（テーブル１の例を参照）
は、次式により与えられる。The other two cell parameters that are given numerical values in the PrintCell () routine include the ratio and correlation values between the channels. Ratio (see example in Table 1)
Is given by the following equation.
【００７２】[0072]
【数３】 [Equation 3]
【００７３】 ピアソンの相関、ρm,n係数は次式により計算される。The Pearson correlation, ρ m, n coefficient is calculated by the following equation.
【００７４】[0074]
【数４】 [Equation 4]
【００７５】
ここでＳm及びＳnは、それぞれチャンネルｍ及びｎにおけるソースイメージ（
ｉｍＳｒｃ）ピクセル値の標準偏差であり、バーは平均ピクセル値を表す。各セ
ルがチャンネルを横切ってグループ化するように、これらのセルパラメータの各
々は、シーケンシャルな方式で、＊．ＬＳＭファイルに書き込まれる。Here, S m and S n are the source images (,
imSrc) standard deviation of pixel values, bars represent mean pixel values. Each of these cell parameters is in a sequential manner, such that each cell is grouped across the channel, in the *. Written to LSM file.
【００７６】
ＷｒｉｔｅＬＳＭＦｉｌｅ（）ルーチンは、ｐｒｉｎｔＣｅｌｌ（）及びサブ
ルーチンＡｎａｌｙｚｅＣｅｌｌ（）をコールするたびに、すべてのセルを一定
の順序に配列する。セル数の合計は検数され、＊．ＬＳＭファイルのヘッダ部分
に書き込まれる。その後、ファイルが閉じられ、プログラムは終了する。The WriteLSMFile () routine arranges all cells in a fixed order each time it calls printCell () and the subroutine AnalyzeCell (). The total number of cells is counted, *. It is written in the header part of the LSM file. The file is then closed and the program ends.
【００７７】
ここで記述されるＳｕｒｒｏＩｍａｇｅシステムは、レーザ・スキャニング・
サイトメトリのコンテキストにおいて微粒子検出を行う従来技術システム上の実
質的な進歩である。１つのそのような従来技術システムは、その全体がここに参
考文献として組み入れられる、米国特許第５，５５６，７６４号（’７６４特許
）に記述されている。’７６４特許に記述されたシステムは、まず第１に個々の
チャンネルからのイメージを合計し、そして次に、その結果生じる合成イメージ
上の粒子を実行するが、’７６４システムは、いかなるブロブとバブルのマスキ
ングも実行しない。さらに、’７６４システムは、例えば、特定の粒径範囲内の
セルを検知するといったように、分析の対象である特定のタイプのセルに対し、
非常に選択的となるように設計されている。これとは対照的に、本システムはそ
れほど限定的でなく、このようにもっと様々なタイプのセルを検知する。ここで
記述されたブロブ及びバブルマスキング技術によって結び付けられた別々のチャ
ンネル分析によって、ＳｕｒｒｏＩｍａｇｅは、’７６４システムより多くの本
当のセルを、正確に識別することができ、かつそこからデータを収集することが
できる。従って、本システムは従来の技術システムより正確で、かつより感度が
よい。The SurroImage system described herein is a laser scanning system.
A substantial advance over prior art systems for particle detection in the context of cytometry. One such prior art system is described in US Pat. No. 5,556,764 (the '764 patent), which is incorporated herein by reference in its entirety. The system described in the '764 patent first sums the images from the individual channels and then executes the resulting particles on the composite image, while the' 764 system does not allow any blobs and bubbles. Does not perform masking. In addition, the '764 system allows for specific types of cells to be analyzed, such as detecting cells within a specific particle size range.
Designed to be very selective. In contrast, the system is less restrictive and thus detects more different types of cells. With separate channel analysis coupled by the blob and bubble masking techniques described herein, SurroImage can accurately identify and collect more real cells than the '764 system. You can Therefore, the system is more accurate and more sensitive than prior art systems.
【００７８】
ＳｕｒｒｏＩｍａｇｅシステムの別の利点は、セル会合分子の蛍光について種
々の形態構造、及び／又は異なるパターンあるいは輝度を備えた様々な異なるセ
ルの検出に対して、容易に最適化されることができるということである。さらに
、ＳｕｒｒｏＩｍａｇｅシステムは、セル以外の微粒子の検出に対して速やかに
最適化されることができる。例えば、本発明のいくつかの実施形態では、Ｓｕｒ
ｒｏＩｍａｇｅシステムは毛細管内のマイクロビーズを検知するために用いられ
、そのマイクロビーズは血液内に存在する特定の試薬に結び付く。ＳｕｒｒｏＩ
ｍａｇｅシステムとは対照的に、従来の技術システムは特定のセルだけを検知す
ることができ、重要なオペレータの介入なしでは、他の構造を検知するための型
の変更ができない。たたみこみ核の構造のようなＳｕｒｒｏＩｍａｇｅシステム
の個々のサブルーチンのパラメータは、これらの微粒子の検出を最適化するため
に速やかに変更されることができる。これらのパラメータは臨床プロトコル・デ
ータベースに格納されることができる（以下を参照）。したがって、Ｓｕｒｒｏ
Ｉｍａｇｅシステムは、ＭＬＳＣシステムの柔軟性を増大させ、感度において妥
協することなく種々の分析を実行することができる。情報処理システムのアーキテクチャ
本発明は、多くの重要な機能を実行する斬新な情報処理システム・アーキテク
チャを含む。システムの心臓部は、マルチパラメータ分析を設計し、測定計測器
を制御し、イメージ及びデータ分析を実行し、並びに結果をアーカイブするため
に必要とされる情報のすべてを統合するために用いられる関連データベースであ
る。システムは、別々の機能を実行する多くの連結されたモジュールを含む。図
１１は、このシステムが望ましい実施形態の中で作用する方法についてフローチ
ャートで表現したものを示す。手短かに言えば、計器制御ソフトウェアは、Ｓｕ
ｒｒｏＳｃａｎハードウェア（ＭＬＳＣ器具）を制御し、そうすることで、サン
プルを走査し、生の画像ファイル（．ＳＭ１ファイル）を作成する。その後、．
ＳＭ１ファイルは、（上の）ＳｕｒｒｏＩｍａｇｅ画像分析ソフトウェアによっ
て処理され、増強される。このモジュールは各イメージを増強し、各イメージ内
の各セル（あるいはいくつかのアプリケーション内の蛍光ビード）の位置及びサ
イズを決定し、次に、各チャンネル内での各セル（あるいはビード）の蛍光輝度
を計算する。その結果生じるＳｕｒｒｏＩｍａｇｅデータは、テキストファイル
（．ＬＳＭファイル）として格納され、次に、ＦＣＳ変換ソフトウェア（ＦＣＳ
Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）によって、業界標準の．ＦＣＳフ
ォーマットに変換されるか、又はその後の分析のための適切な他のファイル形式
に変換されることができる。測定器制御ソフトウェア、画像分析ソフトウェア及
びＦＣＳ変換ソフトウェアはすべて、臨床プロトコルの実行の中で用いられる各
タイプの分析のためのパラメータを格納する臨床プロトコル・データベースによ
って制御される。そのようなパラメータは、制限されるものではないが、ＭＬＳ
Ｃ器具の走査速度、ＭＬＳＣ器具の中で用いられるフィルタ帯域幅の値、及びＳ
ｕｒｒｏＩｍａｇｅシステムの中で用いられる核構造を含む。その後、その形式
、例えば．ＦＣＳ及び．ＬＳＭのファイル内のデータは、例えば市販のＦｌｏｗ
Ｊｏソフトウェアを用いて、データをさらに処理するために、サーバに送出され
ることができる。またそのデータは、アーカイブするため、及び第３次メディア
に周期的に送出するための、実験データファイル・サーバに送信され、またオラ
クルデータベースのような中央のデータベースにも送信される。中央のデータベ
ースは、制限されるものではないが、臨床プロトコル・データベースの整合性を
維持するため、器具結果、ファイル名、較正情報のための中央の貯蔵所として、
（ＭＬＳＣシステムを通して得られようが、又は従来のＥＬＩＳＡ分析を通して
得られようが）セルの分析測定値及び可溶性要素の測定値を格納するため、並び
に臨床アンケート情報を維持するために、使用される。Another advantage of the SurroImage system is that it can be easily optimized for the detection of various morphological structures for fluorescence of cell-associated molecules and / or various different cells with different patterns or intensities. It means that you can. Moreover, the SurroImage system can be quickly optimized for the detection of particulates other than cells. For example, in some embodiments of the invention, Sur
The roImage system is used to detect microbeads in capillaries, which bind to specific reagents present in blood. Surro I
In contrast to the mag system, prior art systems can only detect specific cells and cannot be retyped to detect other structures without significant operator intervention. The parameters of the individual subroutines of the SurroImage system, such as the structure of the convolution nucleus, can be rapidly modified to optimize the detection of these particulates. These parameters can be stored in the clinical protocol database (see below). Therefore, Surro
The Image system increases the flexibility of the MLSC system and can perform various analyzes without compromising sensitivity. Information Processing System Architecture The present invention includes a novel information processing system architecture that performs many important functions. The heart of the system is the association used to design multi-parameter analysis, control measurement instruments, perform image and data analysis, and integrate all the information needed to archive the results. It is a database. The system includes many linked modules that perform separate functions. FIG. 11 shows a flow chart representation of how the system operates in a preferred embodiment. In short, the instrument control software is Su
It controls the rroScan hardware (MLSC instrument) and in doing so scans the sample and creates a raw image file (.SM1 file). afterwards,.
SM1 files are processed and enhanced by SurroImage image analysis software (above). This module enhances each image, determines the position and size of each cell (or fluorescent bead in some applications) within each image, and then the fluorescence of each cell (or bead) within each channel. Calculate the brightness. The resulting SurroImage data is stored as a text file (.LSM file), which is then stored in FCS conversion software (FCS
Conversion Software). It can be converted to the FCS format, or to any other file format suitable for subsequent analysis. Instrument control software, image analysis software and FCS conversion software are all controlled by a clinical protocol database that stores parameters for each type of analysis used in the clinical protocol run. Such parameters include, but are not limited to, MLS.
C instrument scan rate, value of filter bandwidth used in MLSC instrument, and S
Includes the nuclear structure used in the uroImage system. Then its format, eg. FCS and. The data in the LSM file is, for example, commercially available Flow.
The Jo software can be used to send the data to a server for further processing. The data is also sent to an experimental data file server for archiving and periodically sending to tertiary media, and also to a central database such as the Oracle database. The central database is, but is not limited to, a central repository for instrument results, filenames, and calibration information to maintain the integrity of the clinical protocol database.
Used to store analytical and soluble component measurements of cells (whether obtained through the MLSC system or through conventional ELISA analysis) and to maintain clinical questionnaire information.
【００７９】
望ましい実施形態では、ＳｕｒｒｏＳｃａｎ情報処理システムが、（適切な関
連データベース・スキーマのこれまでの設計、及び較正された器具が使用可能で
あること、を仮定して）臨床研究のための次の方法で用いられる。まず第１に、
ユーザは、患者の数及び識別情報、患者当たりのサンプル数などのような情報を
含む、臨床研究プロトコルを定義する。臨床研究は、何十から何百人もの患者を
関与させ、何週間から何ヶ月も続く。またユーザは、分析プロトコルを定義し、
それが各特定患者のサンプルで実行される分析の各々を詳細に定義する。各分析
は、制限されるものではないが、使用される蛍光体、ターゲット分子、希釈、及
び蛍光補正パラメータを含めて、試薬の各々に対する詳細な識別子及び説明を含
む。サンプル調製方法及びサンプル希釈もまた含まれる。またプロトコルは、Ｓ
ｕｒｒｏＳｃａｎ器具及びデータ分析ソフトウェアを自動的に制御するのに必要
な情報を含む。患者サンプルが（データベース制御の下で自動化されることがで
きる）各分析に対して処理され、ＳｕｒｒｏＳｃａｎ上の測定カートリッジに取
り付けられた後、ユーザが、スキャナ・ソフトウェア（その後、それは詳細な走
査パラメータ例えばを決定するためにデータベースに質問する）にプロトコルＩ
Ｄ及びサンプルＩＤパラメータを入れ、そうして、そのソフトウェアが、詳細な
走査パラメータ、例えば、走査速度、フィルタ帯域幅設定値、ステージ移動速度
などを決定するために、データベースに質問する。走査が完了した後、器具は適
切な分析パラメータを学習するために再びデータベースに質問し、そうしてＦＣ
Ｓ出力ファイルを生成して、ＳｕｒｒｏＩｍａｇｅ及びＳｕｒｒｏＦＣＳのソフ
トウェア・モジュールでもって正しいタイプの分析を自動的に実行する。ＦＣＳ
出力ファイルは、市販のＦＣＳ分析ソフトウェアを用いて、さらに分析される。
その後、各患者サンプルに対するＦＣＳ出力データの要約が、ＦＣＳソフトウェ
アによって生成され、リレーショナル・データベース内のストレージを有効にす
るためにさらに処理される。その後、測定結果及び患者の臨床情報は、対象とな
る生物学的マーカを示すパターン及び相関を識別するための様々な統計的手法及
びビジュアル化の手法でさらに処理される。サンプル及び分析情報が、生のイメ
ージから、関連データベースへのリスト・モード・フォーマットまで、分析の全
体に渡って、そのデータと関連する。In the preferred embodiment, the SurroScan information processing system is used for clinical studies (assuming previous designs of appropriate relevant database schemas and calibrated instruments are available). Used in the method of. First of all,
The user defines a clinical research protocol that includes information such as patient number and identification information, number of samples per patient, and so on. Clinical studies involve dozens to hundreds of patients and last for weeks to months. The user also defines the analysis protocol,
It defines in detail each of the analyzes performed on each particular patient sample. Each assay includes a detailed identifier and description for each of the reagents, including but not limited to the fluorophore used, target molecule, dilution, and fluorescence correction parameters. Sample preparation methods and sample dilutions are also included. The protocol is S
Contains information needed to automatically control the urroScan instrument and data analysis software. After the patient sample has been processed for each analysis (which can be automated under database control) and mounted on the measuring cartridge on the SurroScan, the user can scan the scanner software (then it scans detailed scanning parameters such as Query the database to determine) protocol I
Enter the D and Sample ID parameters and the software will then query the database to determine detailed scan parameters such as scan speed, filter bandwidth settings, stage travel speed, etc. After the scan is complete, the instrument queries the database again to learn the appropriate analytical parameters and then FC
Generate an S output file to automatically perform the right type of analysis with the SurroImage and SurroFCS software modules. FCS
The output file is further analyzed using commercially available FCS analysis software.
A summary of FCS output data for each patient sample is then generated by the FCS software and further processed to validate storage in the relational database. The measurements and patient clinical information are then further processed with various statistical and visualization techniques to identify patterns and correlations indicative of biological markers of interest. Sample and analysis information is associated with that data throughout the analysis, from raw images to list-mode formats to relevant databases.
【００８０】
また本発明は、増強されたデータを如実に表示するためにイメージ・システム
の使用を意図する。このシステムは、ＳｕｒｒｏＶｉｅｗと名付けられるが、Ｓ
ｕｒｒｏＩｍａｇｅソフトウェアによって識別された個々のセルを表示し、その
イメージ内の真実のセルを他のセルの形をした擬似信号と区別するために、各識
別されるセルの周りに、１つのボックスを置くことができる。ＳｕｒｒｏＶｉｅ
ｗソフトウェアは特に、すばやく様々なタイプのシステム障害モードを診断する
のに役立つ。ＳｕｒｒｏＳｃａｎ器具の通常操作中に、セルのそのようなイメー
ジをオペレータが常に見ている必要はないことが指摘されるべきである。
テーブル１：リスト・モード出力の例。データは２チャンネル走査に対応する。The present invention also contemplates the use of an image system to display the enhanced data. This system is named SurroView
Place a box around each identified cell to display the individual cells identified by the urroImage software and to distinguish the true cells in the image from the pseudo signals in the form of other cells. be able to. SurroVie
The w software is especially useful for quickly diagnosing various types of system failure modes. It should be pointed out that during normal operation of the SurroScan instrument, the operator does not have to be constantly looking at such an image of the cell. Table 1: Example of list mode output. The data corresponds to 2-channel scanning.
【００８１】[0081]
【表２】 [Table 2]
【００８２】
テーブル２：フィルタ補正されたイメージｉｍＢｌｏｂＳｒｃを作成するために
使用されるたたみこみ核。ｉｍＢｌｏｂＳｒｃは、セル検出及びセルの加重フラ
ックス評価の両方に用いられる。Table 2: Convolution kernels used to create the filtered image imBlobSrc. imBlobSrc is used for both cell detection and cell weighted flux estimation.
【００８３】[0083]
【表３】 [Table 3]
【図１】 本発明の１つの望ましい実施形態におけるＭＬＳＣ器具の光アーキテ
クチャを示す。FIG. 1 illustrates the optical architecture of an MLSC instrument in one preferred embodiment of the present invention.
【図２】 図２Ａは切り替え可能なフィルタ・スキームの部分的な回路図である
。
図２Ｂは切り替え可能なフィルタ・スキームの部分的な回路図である。FIG. 2A is a partial schematic diagram of a switchable filter scheme. FIG. 2B is a partial schematic diagram of a switchable filter scheme.
【図３】 ＳｕｒｒｏＩｍａｇｅプロセスのフローチャートである。FIG. 3 is a flow chart of the SurroImage process.
【図４】 本発明によって意図される１つのファイル・ストレージの実施形態を
図式的に示す。Ｎチャンネルのデータが、拡張子＊．ｓｍ１で指定されるバイナ
リ・ファイルにインタリーブ・フォーマットで格納される。様々なデータフォー
マットが可能になるように、ヘッダが選定される。FIG. 4 diagrammatically illustrates one file storage embodiment contemplated by the present invention. Data of N channel has extension *. It is stored in the interleaved format in the binary file specified by sm1. The header is chosen so that various data formats are possible.
【図５】 ベースライン分析プロセスのフローチャートである。FIG. 5 is a flow chart of a baseline analysis process.
【図６】 セル検出プロセスのフローチャートである。FIG. 6 is a flow chart of a cell detection process.
【図７】 ノイズ分析プロセスを示す。FIG. 7 shows a noise analysis process.
【図８】 マスク生成プロセスのフローチャートである。FIG. 8 is a flowchart of a mask generation process.
【図９】 セルを見つけるための８ポイント接続性ルールを図示するフローチャ
ートである。FIG. 9 is a flow chart illustrating an 8-point connectivity rule for finding cells.
【図１０】 本発明によって意図される、可能ないくつかのタイプのセル分析を
示す。FIG. 10 illustrates some of the possible types of cell analysis contemplated by the present invention.
【図１１】 ガウス・フィット・アルゴリズムを、直径モーメント計算と比較し
たプロットである。イメージについて、各ポイントが、２５０カウントに等しい
ＲＭＳノイズで１０００個の粒子（セル）の擬似イメージの中から検出された微
粒子の平均直径値である。FIG. 11 is a plot comparing the Gaussian fit algorithm with diameter moment calculations. For the image, each point is the average diameter value of the particles detected in the simulated image of 1000 particles (cells) with an RMS noise equal to 250 counts.
【図１２】 ＳｕｒｒｏＳｃａｎシステムの情報処理システム構成のフローチャ
ートである。FIG. 12 is a flowchart of the information processing system configuration of the SurroScan system.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ， ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ， ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，Ｋ Ｐ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ， ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，Ｓ Ｇ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 チャン，チン−フア アメリカ合衆国カリフォルニア州94539， フレモント，プレイリー・ドッグ・レーン 93 (72)発明者 ノートン，スコット アメリカ合衆国カリフォルニア州94085， サニーヴェイル，エスカロン・アベニュー 100，アパートメント ビー2014 (72)発明者 ウィンクラー，ジェイムズ・エル アメリカ合衆国カリフォルニア州94086， サニーヴェイル，サウス・フェアオーク ス・アベニュー 655，ナンバーディー 313 (72)発明者 カンター，アーロン・ビー アメリカ合衆国カリフォルニア州94070， サン・カルロス，ラバース・レーン 30 (72)発明者 リー，バイロン アメリカ合衆国カリフォルニア州95111， サン・ホセ，アンブラー・コート 3971 (72)発明者 ツル，シャロム アメリカ合衆国カリフォルニア州94040， マウンテン・ビュー，エル・モンテ・アベ ニュー 1076 Ｆターム(参考） 2G043 AA01 BA16 CA03 DA02 DA06 EA01 FA01 FA02 GA25 GB21 HA01 HA02 JA02 KA02 KA05 KA09 LA02 NA01 NA02 NA05 2G045 AA25 CA25 CB01 CB03 CB04 CB07 CB08 CB11 CB12 CB14 DA30 DA36 DA60 FA12 FB07 FB12 JA01 ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continued front page (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, I T, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ , CF, CG, CI, CM, GA, GN, GW, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH, GM, K E, LS, MW, SD, SL, SZ, TZ, UG, ZW ), EA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AE, AG, AL, AM, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BY, CA, CH, C N, CR, CU, CZ, DE, DK, DM, DZ, EE , ES, FI, GB, GD, GE, GH, GM, HR, HU, ID, IL, IN, IS, JP, KE, KG, K P, KR, KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU , LV, MA, MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, S G, SI, SK, SL, TJ, TM, TR, TT, TZ , UA, UG, UZ, VN, YU, ZA, ZW (72) Inventor Chang, Chin-Hua California 94539, Fremont, Prairie Dog Lane 93 (72) Inventor Norton, Scott 94085, California, United States Sunnyvale, Escalon Avenue 100, Apartment B 2014 (72) Inventor Winkler, James L United States California 94086, Sunnyvale, South Fair Oak Suave Avenue 655, Number D 313 (72) Inventor Canter, Aaron Bee 94070, California, United States San Carlos, Lovers Lane 30 (72) Inventor Lee, Byron California 95111, San Jose Ambler Court 3971 (72) Inventor Tsuru, Shalom 94040, California, United States Mountain View, El Monte Abe New 1076 F-term (reference) 2G043 AA01 BA16 CA03 DA02 DA06 EA01 FA01 FA02 GA25 GB21 HA01 HA02 JA02 KA02 KA05 KA09 LA02 NA01 NA02 NA05 2G045 AA25 CA25 CB01 CB03 CB04 CB07 CB08 CB11 CB12 CB14 DA30 DA36 DA60 FA12 FB07 FB12 JA01
Claims (6)
す固定容積の毛細管において複数の検知可能な特性を持つターゲット粒子を検知
し特性を決定するために粒子を含有しているサンプルを分析するための方法であ
って、 （ａ） データの各チャンネルは明瞭な検知可能な特性及び明瞭なバックグラ
ウンド特性を含み、サンプルを含んでいる固定容積の毛細管を走査してデータの
複数のチャンネルを生成するステップと、、 （ｂ） データのチャンネルの各々をサンプリングして対応する組のピクセル
値を作成するステップと、 （ｃ） 各組のピクセル値を個別に修正することによって増強されたピクセル
値の組を生成し、ターゲット粒子を示す空間の特徴を選択的に増強するステップ
と、 （ｄ） １つ以上の組の増強されたピクセル値から、対応するチャンネルの明
瞭なバックグラウンド特性を取り除くステップと、 （ｅ） 増強された各組のピクセル値に対して、前記粒子を検出するためのノ
イズ閾値を別々に確立するステップと、 （ｇ） 増強された各組のピクセル値において、前記粒子の診断パターンに配
置された上記閾値ピクセルのグループを別々に識別するステップと、 （ｈ） 特定の組の増強されたピクセル値において診断パターンに配置された
上記閾値ピクセルの各グループに対して、残りの組の増強されたピクセル値にお
ける対応する閾値より下あるいは閾値のピクセルを別々に識別するステップと、 （ｉ） ステップ（ｇ）及び（ｈ）において別々に識別されたピクセルの分析
によって、サンプル内のターゲット粒子の特性を決定するステップと を含み、 粒子は、前記粒子の診断に用いるパターンに配置された上記閾値ピクセルによ
り、チャンネルにおいて最初に識別され分析され、その後、最初に識別された上
記閾値ピクセルと同じ位置にピクセルを配置することにより、残りのすべてのチ
ャンネルにおいて前記粒子は別々に分析されることを特徴とする方法。1. A sample containing a particle for detecting and characterizing a target particle having a fluorescent background and having a plurality of detectable properties in a fixed volume capillary exhibiting the background property. (A) each channel of data includes distinct detectable features and distinct background features, and a fixed volume capillary tube containing the sample is scanned to obtain multiple channels of data. Enhanced by: (b) sampling each of the channels of data to create a corresponding set of pixel values; and (c) individually modifying each set of pixel values. Generating a set of pixel values and selectively enhancing the spatial features representing the target particles, (d) enhancing one or more sets The distinct background characteristics of the corresponding channel from the enhanced pixel values, and (e) separately establishing a noise threshold for detecting the particles for each enhanced set of pixel values. (G) in each enhanced set of pixel values, separately identifying the group of threshold pixels located in the diagnostic pattern of the particle; and (h) at a particular set of enhanced pixel values. For each group of threshold pixels arranged in the diagnostic pattern, separately identifying pixels below or at a corresponding threshold in the remaining set of enhanced pixel values; (i) step (g) And (h) a step of characterizing the target particles in the sample by analysis of the separately identified pixels. The particles are first identified and analyzed in a channel by the threshold pixels arranged in a pattern used to diagnose the particles, and then the pixels are placed at the same positions as the first identified threshold pixels. The method wherein the particles are analyzed separately in all remaining channels.
子を含有しているサンプル上で微小体積レーザ・スキャニング・サイトメトリ（
ＭＬＳＣ）を実行するための器具において、 （ａ） 前記励起光のための１つ以上の光源と、 （ｂ） 複数の所定の走査速度で前記励起光を前記サンプル上に走査するため
の手段と、 （ｃ） 前記励起光に応答して前記サンプルによって放射された光を収集し走
査解除するための手段と、 （ｄ） 前記放射光線を複数の明瞭な成分波長に分け、各々の前記明瞭な成分
波長を別々の光学通路に沿って方向付けるための複数のダイクロイック・フィル
タ手段と、 （ｅ） 放射光線に反応し、明瞭な成分波長を収集するために配置され、可変
帯域幅を備えたアナログ・フィルタ手段に動作的に連結される、複数の光検出器
と、 （ｆ） 各アナログ・フィルタ手段に効果的に連結され、かつ各々の光検出器
からのデジタル信号出力を与えるために複数の所定のデジタル・サンプリング・
レートで操作することができる、デジタル・サンプリング手段と を含み、 前記走査速度、各前記アナログ・フィルタ手段の帯域幅、及びデジタル・サン
プリング・レートは、前記粒子の検出を最適化するために統合的に調整されるこ
とができることを特徴とする器具。2. Microvolume laser scanning cytometry on a sample containing particles that emit light with multiple wavelength components upon illumination with excitation light.
MLSC) instrument; (a) one or more light sources for the excitation light; and (b) means for scanning the excitation light onto the sample at a plurality of predetermined scan rates. (C) means for collecting and descanning the light emitted by the sample in response to the excitation light; (d) dividing the emitted light beam into a plurality of distinct component wavelengths, each of the distinct A plurality of dichroic filter means for directing the component wavelengths along separate optical paths; and (e) an analog with variable bandwidth arranged to collect a clear component wavelength in response to the emitted light. A plurality of photodetectors operatively coupled to the filter means, and (f) a plurality of photodetectors operatively coupled to each analog filter means and providing a digital signal output from each photodetector. Place Of digital sampling
A digital sampling means operable at a rate, wherein the scanning speed, the bandwidth of each of the analog filter means, and the digital sampling rate are integrated to optimize the detection of the particles. An instrument characterized in that it can be adjusted to.
た光を発する微粒子を含有しているサンプル上で微小体積レーザ・スキャニング
・サイトメトリ（ＭＬＳＣ）を実行するための器具であって、 （ａ） 前記励起光のための１つ以上の光源と、 （ｂ） 前記励起光を前記サンプル上に走査するための手段と、 （ｃ） 前記励起光に応答して前記サンプルによって放射された光を収集しス
キャニング解除するための手段と、 （ｄ） 前記放射光線を少なくとも４つの明瞭な成分波長に分け、各々の前記
明瞭な成分波長を別々の光学通路に沿って方向付けるための複数のダイクロイッ
ク・フィルタ手段と、 （ｅ） 各光検出器が明瞭な成分波長を収集するために配置され、デジタル・
サンプリング手段に効果的に連結される、放射光線に反応する少なくとも４つの
光検出器と を含むことを特徴とする器具。3. To perform micro-volume laser scanning cytometry (MLSC) on a sample containing light-emitting microparticles with at least four distinct wavelength components on illumination with excitation light. (A) one or more light sources for the excitation light; (b) means for scanning the excitation light onto the sample; (c) in response to the excitation light. Means for collecting and descanning the light emitted by the sample; (d) dividing the emitted light beam into at least four distinct component wavelengths, each distinct component wavelength being along a separate optical path. A plurality of dichroic filter means for directing, (e) each photodetector being arranged to collect a distinct component wavelength,
An instrument comprising at least four photodetectors responsive to a radiation beam operatively coupled to the sampling means.
サイトメトリ（ＭＬＳＣ）を実行するための統合システムであって、前記サンプ
ルが、励起光を備えた照明上に複数の波長成分を備えた光を発する微粒子を含有
する、統合システムにおいて、 （ａ） 前記励起光のための１つ以上の光源と、 （ｂ） 複数の所定の走査速度で前記励起光を、前記サンプル上に走査するた
めの手段と、 （ｃ） 前記励起光に応じて前記サンプルによって照射された光を収集しスキ
ャニング解除するための手段と、 （ｄ） 前記放射光線を複数の明瞭な成分波長に分け、各々の前記明瞭な成分
波長を別々の光学通路に沿って方向付けるための複数のダイクロイック・フィル
タ手段と、 （ｅ） 各光検出器が明瞭な成分波長を収集するために配置され、変更可能な
帯域幅を備えたアナログ・フィルタ手段に効果的に連結される、放射光線に反応
する複数の光検出器と、 （ｆ） 各アナログ・フィルタ手段に効果的に連結され、かつ各々の光検出器
からのデジタル信号出力を提供するために多くの所定のデジタル・サンプリング
・レートで操作することができる、デジタル・サンプリング手段と、 （ｇ） １つ以上のコンピュータからなる制御及びデータ分析システムであっ
て、 （i） 各々の臨床プロトコルが、 前記粒子を最適に検出するために必要とされる走査速度と、 前記粒子を最適に検出するために必要とされる各々の前記アナログ・フィルタ
手段の帯域幅と、 前記粒子を最適に検出するために必要とされるデジタル・サンプリング速度と
、 前記サンプルの分析条件と、 前記器官の医療歴と、 前記デジタル信号出力の分析用アルゴリズムと に関する情報を含む臨床プロトコルを格納するステップと、 （ii） 前記臨床プロトコルからの情報を用いて、前記走査する手段、前
記アナログ・フィルタ手段、及びデジタル・サンプリング手段を制御するステッ
プと、 （iii） 前記デジタル信号出力を受け取り、格納するステップと、 （iv） 前記粒子データに関するデータを提供するために、前記臨床プロ
トコルからの情報を用いて、前記デジタル信号出力を分析するステップと、 （v） 医療条件に関する情報を、前記微粒子に関するデータに格納する
ステップと、 （vi） （v）からの情報を用いて、前記器官の医療条件を決定するステ
ップと、 （７） 前記粒子に関するデータに、医療条件に関係する新情報を生成す
るステップと を行う能力がある、制御及びデータ分析システムと からなることを特徴とする統合システム。4. Microvolume laser scanning on a sample obtained from an organ
An integrated system for performing cytometry (MLSC), wherein the sample comprises light-emitting microparticles with multiple wavelength components on an illumination with excitation light, comprising: (a) One or more light sources for the excitation light; (b) means for scanning the sample with the excitation light at a plurality of predetermined scan rates; (c) the sample in response to the excitation light. Means for collecting and descanning the light emitted by: (d) splitting the emitted light beam into a plurality of distinct component wavelengths and directing each of the distinct component wavelengths along a separate optical path. A plurality of dichroic filter means, and (e) each photodetector is arranged to collect a distinct component wavelength and is effectively coupled to an analog filter means with a variable bandwidth. A plurality of photodetectors responsive to the emitted light; and (f) a number of predetermined photodetectors effectively coupled to each analog filter means and providing a digital signal output from each photodetector. (G) a control and data analysis system consisting of a digital sampling means operable at a digital sampling rate, and (g) one or more computers, (i) each clinical protocol optimizing said particles Scanning speed required for optimal detection of the particles, bandwidth of each of the analog filter means required for optimal detection of the particles, and required for optimal detection of the particles. Information about the digital sampling rate, the analysis conditions of the sample, the medical history of the organ, and the algorithm for analysis of the digital signal output. Storing a clinical protocol including: (ii) controlling the scanning means, the analog filter means, and the digital sampling means using information from the clinical protocol; (iii) the digital Receiving and storing a signal output, (iv) analyzing the digital signal output using information from the clinical protocol to provide data regarding the particle data, (v) relating to medical conditions Storing information in the data about the microparticles, (vi) determining the medical condition of the organ using the information from (v), (7) relating the data about the particle to the medical condition Characterized by comprising a control and data analysis system capable of generating new information Integrated system to be.
す、固定容積の毛細管内で、複数の検知可能な特性を持つターゲット粒子を検知
し特徴を決定するために、粒子を含有しているサンプルを分析するための方法に
おいて、前記方法は （ａ） データの複数のチャンネルを生成するように、サンプルを含んでいる
固定容積の毛細管を走査するステップであって、データの各チャンネルが明瞭な
検知可能な特性、及び明瞭なバックグラウンド特性を含む、ステップと、 （ｂ） 対応する組のソース・ピクセル値を作成するように、データのチャン
ネルの各々をサンプリングするステップと、 （ｃ） 合成イメージを生成するためにソース・ピクセル値の組を合計するス
テップと、 （ｄ） 前記合成イメージ内の粒子検出用の閾値を計算するステップと、 （ｅ） 前記閾値を用いて、前記合成イメージ内の粒子検出を実行するステッ
プと、 （ｆ） 前記合成イメージ内で識別された各粒子に対して、ソース・ピクセル
値の組内の対応するピクセルを識別するステップと、 （ｇ） ステップ（ｆ）で識別されたピクセルを分析するステップと を含み、改良点が、 （１） ソース・ピクセル値の各組内で、粒子検出用の閾値を別々に計算する
ステップと、 （２） ソース・ピクセル値の各組内で、対応する閾値を用いて、粒子検出を
別々に実行するステップと、 （３） ステップ（２）におけるソース・ピクセル値の特定の組内で識別され
た各ピクセルに対して、ソース・ピクセル値の残りの組内の対応するピクセルを
識別するステップと、 （４） ステップ（２）及び（３）で識別されたピクセルを分析するステップ
と を含むことを特徴とする方法。5. Containing particles for detecting and characterizing a target particle having a plurality of detectable properties in a fixed volume capillary that retains a fluorescent background and exhibits background properties. A method for analyzing a sample being analyzed, the method comprising the steps of: (a) scanning a fixed volume capillary tube containing the sample to generate multiple channels of data, each channel of data being Includes distinct detectable characteristics and distinct background characteristics; (b) sampling each of the channels of data to create a corresponding set of source pixel values; (c) B) summing the set of source pixel values to produce a composite image; (d) for detecting particles in said composite image Calculating a threshold; (e) performing particle detection in the composite image using the threshold; (f) a source pixel value for each particle identified in the composite image. Identifying corresponding pixels in the set of, and (g) analyzing the pixels identified in step (f), where the improvements are: (1) within each set of source pixel values, Calculating thresholds for particle detection separately, (2) performing particle detection separately using corresponding thresholds within each set of source pixel values, (3) step (2) For each pixel identified in the particular set of source pixel values in, the corresponding pixel in the remaining set of source pixel values is identified, and (4) steps (2) and (3). ) Analyzing the pixels identified in (1).
す、固定容積の毛細管内で、複数の検知可能な特性を持つターゲット微粒子を検
知するために、微粒子を含有しているサンプルを分析するための方法において、
前記方法が （ａ） データの複数のチャンネルを生成するように、サンプルを含んでいる
固定容積の毛細管を走査するステップであって、データの各チャンネルが明瞭な
検知可能な特性、及び明瞭なバックグラウンド特性を含む、ステップと、 （ｂ） ソース・ピクセル値の対応する組を作成するように、データのチャン
ネルの各々をサンプリングするステップと、 （ｃ） 合成イメージを生成するためにソース・ピクセル値の組を合計するス
テップと、 （ｄ） 前記合成イメージ内の微粒子検出用の閾値を計算するステップと、 （ｅ） 前記閾値を用いて、前記合成イメージ内の微粒子検出を実行するステ
ップと を含み、改良点が、 （１） ソース・ピクセル値の各組内で、最初にソースイメージを合計せずに
、微粒子検出用の閾値を別々に計算するステップと、 （２） ソース・ピクセル値の各組内で、対応する閾値を用いて、微粒子検出
を別々に実行するステップと を含むことを特徴とする方法。6. A sample containing microparticles for detecting a target microparticle having a plurality of detectable properties in a capillary of fixed volume, which retains a fluorescent background and exhibits background properties. In the method for analyzing
The method comprises the steps of: (a) scanning a fixed volume capillary containing a sample to produce multiple channels of data, each channel of data having a distinct detectable characteristic and a distinct background. And (b) sampling each of the channels of data to create a corresponding set of source pixel values, including ground properties, and (c) source pixel values to produce a composite image. And (d) calculating a threshold value for detecting particles in the composite image, and (e) performing particle detection in the composite image using the threshold value. The improvements are: (1) Within each set of source pixel values, separate thresholds for particle detection are calculated without first summing the source images. Steps and, (2) within each set of source pixel values, using the corresponding threshold value, a method which comprises the step of performing the fine detection separately for.
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