MXPA01012802A - Copolimeros para el transporte de acidos nucleicos a las celulas. - Google Patents

Copolimeros para el transporte de acidos nucleicos a las celulas.

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Abstract

La invencion se refiere a copolimeros formados por un polímero anfifílico, preferentemente polietilénglicol, y una molécula efectora cargada, en especial un péptido o derivado de péptido. Complejos de ácido nucléico, en los cuales los ácidos nucléicos están condensados con un, polication y en la superficie contienen ligado un copolímero cargado, para usarse como vectores no virales para la terapia genética.

Description

COPOLÍMEROS PARA EL TRANSPORTE DE ÁCIDOS NUCLEICOS A LAS CÉLULAS DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención se refiere al campo de la transferencia genética, en especial a vectores no virales . La disponibilidad de vectores genéticos más estables y eficientes es una condición para modificar clínicamente las estrategias terapéuticas genéticas. Hasta ahora han presentado problemas la mayoría de los vehículos de transferencia genética conocidos en el caso de la aplicación sistemática con el objeto de la terapia genética somática. Para una transferencia genética más eficiente m vi vo se deben resolver básicamente los siguientes dos problemas de transporte: 1) la transferencia del agente a transferir (por ejemplo ADN de plásmido, ol igonucléot idos ) del punto de aplicación en el organismo hacia la célula objetivo (el aspecto extracelular) y 2) la transferencia del agente a transferir desde la superficie celular al citoplasma o el núcleo celular (el aspecto celular) . Una condición esencial para la transferencia genética promovida por el receptor es la compactación del ADN en partículas del tamaño de un virus y la liberación REF: 134529 del ADN de las vesículas internas después de la recepción endocitósica en las células. Esta condición se obtiene por medio de la compactación del ADN con ciertos polímeros catiónicos, cuyas características garantizan la liberación de los complejos de ADN de las vesículas internas (endosomas, liposomas) después de la recepción endocitósica en las células (Boussif et al., 1995; Ferrari et al., 1997; Haensler & Szoka, 1993, Tang et. al., 1996) . Tal efecto se logra también por medio de la introducción en los complejos de ADN de péptidos destructores de la membrana dependientes del pH (Plank et. al. 1994; WO 93/07283) . En el caso de la composición adecuada de los complejos de ADN puede lograrse una recepción específica y una transferencia genética más eficiente en las células por medio de la interacción entre el receptor y los ligandos (Kircheis et al., 1997, Zanta et al., 1997) . Especialmente adecuados para la transferencia genética promovida por el receptor, son también los complejos de ADN con péptidos catiónicos (Gottschalk et al., 1996; Wadh a et 1., 1997; Plankl et al . , 1999) . La transformación clínica de los resultados de investigación muí t idi scipl inar ios , que se obtienen en la transferencia genética con vectores no virales, se dificulta entre otras cosas porque el aspecto extracelular del problema del transporte solo se ha resuelto de manera incompleta. Una de las causas de esos problemas lo son las condiciones fisicoquímicas de los vectores de transferencia genética no virales debido a que durante el uso sistemático se presentan fuertes interacciones con los componentes sanguíneos y de los tejidos (por ejemplo por medio opsom zación , la adherencia de la proteína sérica) , con lo cual se limita la transferencia genética promovida por el receptor en especial a las células objetivo det rminadas. Se mostró que la modificación superficial de complejos de ADN con pol i ( et i lengl icol ) reduce de manera decisiva sus propiedades de ligado a las proteínas sanguíneas (Plank et al., 1996; Ogris, 1998; WO 98/59064) . Otra limitación del uso de los vectores no virales consiste en la insuficiente solubilidad (o estabilidad) m vi vo de los complejos de ADN. Con los métodos conocidos hasta ahora no era posible el formar complejos de ADN con un policatión en concentraciones suficientemente altas para aplicaciones intravenosas (por ejemplo en el rango de 1 mg/ml) , porque los complejos de ADN se aglomeran bajo concentraciones salinas fisiológicas y se precipitan de la solución. Problemas similares se presentan también en el caso de la aplicación de compuestos químicos de bajo peso molecular. En el campo de los medicamentos "clásicos" se utilizan polímeros sintéticos biológicamente degradables, para compactar los fármacos en una forma tal que se garantice una permanencia en el organismo y que conduzca a la biodisponibilidad deseada en el órgano objetivo ("controled reléase") . Para esto se realiza la modificación superficial de las partículas coloidales con pol i et i lénglicol de tal forma que se reduce la opsonización indeseada. Sobre la síntesis y caracterización de polímeros biológicamente degradables para utilizarse en una multiplicidad de usos medicinales, existe mucha literatura (Coobes et al., 1997) . Dependiendo de la substancia y la aplicación se varían los enlaces químicos en la estructura polimérica. Por medio del posicionamiento adecuado de enlaces de esteres, amidas, péptidos o uretanos puede lograrse la labilidad deseada en el medio fisiológico, pudiéndose variar la sensibilidad frente al ataque de las enzimas. Para una síntesis rápida y eficiente de las substancias biológicamente activas se han demostrado como adecuados los principios de síntesis combinatorios (Balkenhohl et al., 1996) . Por medio de la variación sitemática de algunos parámetros se obtiene un gran numero de compuestos que presentan la estructura básica deseada (Brocchini et al. 1997) . Con un sistema de selección biológico determinativo adecuado pueden seleccionarse de este grupo de compuestos, aquellos que muestren las propiedades deseadas. En la patente norteamericana no. 5,455,027 se describen polímeros que consisten de unidades alternantes de un óxido de polialquileno y un alcano funcionalizado, estando en los grupos laterales funcionales del alcano acoplada covalentemente una substancia farmacológicamente activa. En el transcurso de los últimos años durante el uso de sistemas de transferencia genética no virales se han obtenido los siguientes conocimientos esenciales : a) Los complejos de ADN de plásmido y polímeros catiónicos son adecuados para la transferencia genética i n vi t ro e i n vi vo , y a los complejos con polímeros con grupos amino secundarios y terciarios también se les puede atribuir una inherente actividad endosomol í t ica , que conduce a una eficiente transferencia genética (Boussif et al., 1995; Tang et al., 1996) . b) Los péptidos catiónicos ramificados son adecuados a partir de una longitud de cadena determinada de la fracción catiónica, para el enlace eficiente al ADN y para la formación de complejos de ADN particulares (Plank et al., 1999) c) Los complejos pol icat ión-ADN sufren fuertes interacciones con los componentes sanguíneos y activan el sistema complementario (Plank et al . , 1996) . d) Las fuertes interacciones de las estructuras particulares con los componentes sanguíneos pueden reducirse o eliminarse por medio de la modificación con pol i et i léngl icol , esto se aplica también para los complejos policatión- ADN (Plank et al., 1996; Ogris et al., 1999) . La presente invención se propone la tarea de presentar un nuevo sistema mejorado para la transferencia genética no viral, a base de complejos de ácidos nucléicos-pol i cat iones . En la solución de la tarea propuesta en el marco de la presente invención se partió de la idea de recubrir al ácido nucleico o a los complejos de ácidos nucleicos con un polímero cargado, el cual estabiliza físicamente a los complejos y los protege de la opsoni zación . La presente invención se refiere en un primer aspecto a un copolímero cargado de la fórmula general I en donde R es un polímero anfifílico o un derivado homo- o hetero-bi funcional del mismo, y en donde X es i) un aminoácido o un derivado de aminoácido, un péptido o un derivado de péptido o una espermina o derivado de espermina; o ii) en donde X es en donde a significa H o eventualmente alquilo con de 1 a 6 átomos de carbono eventualmente substituido por halógeno o dialquilamino; y en donde b, c y d son iguales o diferentes y significan alquileno con de 1 a 6 átomos de carbono eventualmente substituido por halógeno o dialquilamino; o iii) en donde X es donde a significa H o eventualmente alquilo con de 1 a 6 átomos de carbono eventualmente substituido por halógeno o dialquilamino; y en donde b y c son iguales o diferentes y significan alquileno con de 1 a 6 átomos de carbono eventualmente substituido por halógeno o dialquilamino; o iv) en donde X es un compuesto aromático substituido con tres agrupaciones funcionales iYi?i, teniendo W, Y y Z los significados antes dados : en donde W,Y,Z son iguales o diferentes radicales CO, NH, O o S o son una agrupación de enlace reactiva con SH, OH, N H o NH2 ; Y en donde la molécula efectora E es un péptido o un derivado de péptido catiónico o aniónico o una esperamina o derivado de esperamina o un glucosaminogli.cano o un oligo/policatión o un oligo/polianión; en donde m y n independientemente entre sí son 0.1 o 2; en donde p es preferentemente 3 a 20; y en donde 1 es 1 a 5, preferentemente 1. Para el caso en el cual 1>1, entonces puede ser la unidad X-Zm-En igual o diferente. Aromático significa en el sentido de la invención un radical hidrocarburo monocíclico o bicíclico con de 6 a 10 átomos en el anillo que además de los- substituyentes antes mencionados independientemente del o de los otros substituyentes mencionados, puede estar substituido con uno, dos o tres substituyentes seleccionados del grupo formado por alquilo con de 1 a 6 átomos de carbono -O- ( alquilo con de 1 a 6 átomos de carbono) , halógeno, preferentemente flúor, cloro o bromo, ciano, nitro, amino, mono- ( Ci -C^-a 1 qui 1 ) amino , di-(C?-Cg-alqui 1 ) amino . Se prefiere al radical fenilo. Aromático en el sentido de la presente invención también puede ser un radical heteroarilo, esto es un radical hidrocarburo aromático monocíclico o bicíclico con de 5 a 10 átomos ene el anillo, que contenga uno, dos o tres átomos en el anillo seleccionados del grupo N, O o S independientemente entre sí, significando C los otros átomos del anillo. Alquilamino o dialquilmino es, en tanto no se diga otra cosa, un grupo amino el cual está substituido una o dos veces con radicales alquilo con de 1 a 6 átomos de carbono, en el caso de dos radicales alquilo, los dos grupos alquilo pueden formar también un anillo. Alquilo con de 1 a 6 átomos de carbono significa en general, en tanto no se diga otra cosa un radical hidrocarburo ramificado o no ramificado con de 1 a 6 átomos de carbono, que eventualmente puede estar substituido con uno o varios átomos de halógeno, preferentemente flúor, que entre sí pueden ser iguales o diferentes. Como ejemplos pueden mencionarse los siguientes radicales hidrocarburos: Metilo, etilo, propilo, 1-metiletilo (isopropilo), n-butilo, 1-met ilpropilo , 2-metilpropilo, 1 , 1 -dime t i le t i lo , pentilo, 1-metilbutilo, 2-met i lbut i lo , 3-met ilbut ilo , 1,1-dimetilpropilo, 1 , 2-dimet ilpropilo , 2,2-dimetilpropilo, 1-et i lpropi lo, hexilo, 1-metilpentilo, 2-metilpent ilo, 3-metilpentilo, 4-metilpentilo, 1 , 1 -dime ti lbut i lo , 1 , 2-dimet ilbut ilo , 1 , 3-dimet i lbut ilo , 2 , 2 -dimet i lbut i lo , 2,3-dimet ilbut ilo , 3 , 3-dimet ilbut ilo , 1 -et i Ibut i lo , 2-etilbutilo, 1 , 1 , 2-trimet ilpropilo , 1,2,2-t rimet ilpropilo , 1 -et i 1 - 1 -met i lpr opi lo y l-etil-2-met i lpr opi lo . Se prefieren en tanto no se indique otra cosa, radicales alquilo inferiores con de 1 a 4 átomos de carbono, como metilo, etilo, propilo, isopropilo, n-butilo, 1-met ilpropilo , 2 -met i lpropi lo o 1 , 1-dimet ilet ilo . Correspondientemente significa alquilo, un puente hidrocarburo de dos uniones, ramificado o sin ramificar, con de uno a seis átomos de carbono que eventualmente puede estar substituido con uno o varios átomos de halógeno, preferentemente flúor, los cuales pueden ser iguales o diferentes. El polímero anfifílíco R preferentemente es un óxido de polialquileno, polivinilpirrolidona, poliacrilamida, alcohol polivinílico o un copolímero de esos polímeros. Ejemplos de óxidos de polialquileno adecuados son pol iet i léngl i coles (PEG), polipropilenglicoles, poliisopropilenglicoles, pol ibutilengl icoles . Preferentemente en el marco de la presente invención se utilizan óxidos de polialquileno en especial PEG . El óxido de polialquileno puede encontrarse en el copolímero en su forma simple o también como derivado tio, carboxi o amino. El polímero R presenta preferentemente un peso molecular de 500 a 10000, preferentemente de 1000 a 10000. Para el caso (i) en el cual X es un aminoácido para la síntesis del copolímero puede utilizarse un aminoácido con tres grupos funcionales, estando dos de esos grupos capacitados para la copolimerización con el polímero y para un acoplamiento de la molécula efectora E ; en este caso puede omitirse a Z. Preferidos son los aminoácidos naturales tales como ácido glutamínico, ácido a spa ragini co , lisina, ornítina, y tirosina. En principio pueden utilizarse en vez de los amoniácidos naturales también aminoácidos sintéticos (por ejemplo correspondientemente espermina y derivados de espe rmina ) . En el caso (i) también puede utilizarse para la síntesis un derivado de aminoácido que contenga dos grupos funcionales para la copolimerización con el polímero y que se obtiene por medio de la modificación de uno de los aminoácidos (ácido glutaminico, ácido asparaginico , lisina u ornitina) con una agrupación de enlace para acoplar a la molécula efectora en donde se omite Z (m=0) ; ejemplos de las agrupaciones de enlace son los carboxilatos de piridil t iomercaptoalquilo (ver figura 1) o carboxilatos de maleimidoalcano . En el caso de (i) también puede X ser un (derivado de) péptido. En el caso de un péptido o derivado de péptido no cargado se encuentra E acoplado directamente o a través de Z. Para el caso en el cual X es un péptido o derivado de péptido o una espermina o derivado de espermina cargados positiva o negativamente, X representa la molécula efectora (se omiten Z y E, m=n= 0) . En el caso más sencillo consiste el péptido en este caso de una secuencia lineal de 2 o más aminoácidos naturales o sintéticos idénticos o diferentes seleccionándose los aminoácidos de tal forma que el péptido en general está cargado positiva o negativamente. Alterativamente, el péptido puede estar ramificado. En estos casos representa el péptido por sí mismo al efector, Z y E se omiten (n=m=0) . Ejemplos de péptidos catiónicos ramificados adecuados de este tipo, fueron descritos por Plank et.al, 1999.
Los derivados de péptidos aniónicos adecuados X presentan la siguiente fórmula general ( pépt ido ) n_B-separador- ( Xaa ) . El péptido es una secuencia de aminoácidos o de derivados aminoácidos con en general una carga negativa. Preferentemente consiste el péptido de hasta tres aminoácidos, especialmente consiste exclusivamente de radicales de ácido glutamínico y/o ácido asparagí nico . N representa el número de ramificaciones dependiendo de los grupos funcionales contenidos en B. B es una molécula ramificada, preferentemente lisina o una molécula del tipo X en el caso de (ii) a (iv) . El separador es un péptido consistente de 2 a 10 aminoácidos o un ácido aminocarboxílico orgánico con de 3 a 9 átomos de carbono en la estructura de ácido carboxílico, por ejemplo ácido 6-aminohexano . El separador sirve para la separación espacial de la molécula del efector cargada de la estructura polimérica. Xaa es preferentemente un aminoácido trifuncional, en especial ácido glutamínico o ácido asparagínico y puede en general ser un compuesto del tipo X, caso (i) - (iv) . Alternativamente, para el caso (i) puede ser X un derivado de péptido en el cual la modificación del péptido consiste de una agrupación cargada que es diferente de un aminoácido. Ejemplos de ese grupo de agrupaciones son agrupaciones de ácido sulfónico o radicales de hidrato de carbono cargados, como ácidos neuramínicos o glucosaminoglicanos sulfatados. La modificación del péptido puede realizarse de acuerdo con métodos estándares, ya sea directamente durante la síntesis del péptido o posteriormente en el péptido ya preparado. La molécula del efector E, como X en el caso (i), puede ser un péptido o derivado de péptido policatiónico o polianiónico o una espermina o un derivado de espermina. En el caso más sencillo, significa el péptido también en este caso una secuencia lineal de 2 o más aminoácidos naturales o sintéticos idénticos o diferentes, seleccionándose los aminoácidos que el péptido en total está cargado positiva o negativamente. Alternativamente puede el péptido estar ramificado. Ejemplos de péptidos catiónicos ramificados adecuados fueron descritos por Plank et al. 1999. Moléculas aniónicas E adecuadas presentan la fórmula general (péptido)n -B- separador -(Xbb) en donde Xbb preferentemente es un aminoácido con un grupo reactivo siendo acoplable directamente a Z o a través de Z . El acoplamiento del péptido efector E a Z o directamente a X se realiza a través de un péptido de un grupo reactivo ya existente o que fue introducido posteriormente, por ejemplo un grupo tiol (en una cisteína o por medio de la introducción de un grupo de ácido mer captoal cano ) alternativamente, dependiendo de Z puede realizarse el acoplamiento también a través de grupos amino o grupos de ácido carboxílico ya existentes o introducidos posteriormente . Alternativamente, puede E, como X en el caso (i) , ser un derivado de péptido consistiendo la modificación del péptido en una agrupación cargada que es diferente de un aminoácido, ejemplos de ese tipo de agrupaciones, son las agrupaciones de ácido sulfónico o los radicales carbohidrato cargados como los ácidos neuramínicos o los radicales hidrocarburos sulfatados. El acoplamiento a X se realiza en este caso también directamente o a través de Z. El copolímero de la fórmula general I, e s t á f o rma do p r e f e r en t eme n t e c omo un copolímero de bloque fuertemente alternante. Eventualmente, está modificado el copolímero con un ligando celular para las células objetivo (ligando receptor L) . En este caso, se encuentran una pluralidad de las posiciones del enlace Z ocupadas con E, intermediamente en algunas posiciones del enlace Z se encuentra acoplado un ligando celular en vez del efector E catiónico o aniónico. Alternativamente, se encuentra acoplado el ligando en algunas posiciones de la molécula del efector E. Preferentemente, la proporción E: L es de aproximadamente 10:1 a 4:1, el ligando receptor puede ser de origen biológico (por ejemplo t rans fer riña , anticuerpos radicales carbohidrato) o sintético (por ejemplo péptidos RGD, péptidos sintéticos, derivados de péptidos sintéticos); ejemplos de los ligandos adecuados se dan en WO 93/07283. Los copolímeros de acuerdo con la invención pueden producirse de acuerdo con el siguiente esquema de procedimiento: El miembro de copolimerización X o X-Zm-En, en tanto sea un péptido o un análogo de péptido se sintetiza de acuerdo con métodos estándar por ejemplo en fase sólida (Solid Phase Peptide Synthesis, SPPS) de acuerdo con el protocolo Fmoc (Fields et al., 1990) . La activación de los derivados de aminoácidos se realiza aquí con TBTU/HOBt o HBTU/HOBt (Fields et al., 1990) para las posiciones aminoácidas aniónicas se utilizan los siguientes derivados en su forma protegida Fmoc terminal n: a) Cadenas laterales catiónicas: R(Pbf), K(Boc,Trt), Ornitina (Boc), Carboxiespermina o espermina (Boc) . b) Cadenas laterales aniónicas: D (O-tert . Bu) , E ( O- 1 ert . Bu ) . Para el punto de ramificación B de la molécula ( pépt ido ) n-B- separador- ( Xaa ) o ( pépt ido ) n-B-separador- (Xbb ) se utiliza Fmoc-K ( Fmoc ) -OH . Los péptidos se separan de la resma con TFA/DCM. Cuando el miembro de polimerización X es un péptido con la estructura general ( pépt ido ) n-B-sepa rador- ( Xaa ) en la subsecuente copolimerización, entonces se utiliza en la posición Xaa ácido glutamínico o asparagínico que en una posición carboxilo está provista con un grupo de protección bencilo. Este se retira selectivamente por medio de hidrogenol isis (Félix et al., 1978) . Las posiciones a aminoácidas colocadas en la terminal N de la cadena de péptidos se cubren con aminoácidos protegidos con Boc, para poder realizar la separación de los grupos de protección después de la copolimerización del péptido con PEG en una sola etapa. Si el miembro de polimerización X es un derivado aminoácido que contiene una agrupación de enlace (por ejemplo ácido 3 -mercapt opropionico , ácido 6-aminohexano ) entonces puede obtenerse en fase líquida de acuerdo con los métodos clásicos de la química de péptidos. El ácido mercaptopropiónico se hace reaccionar con 2 , 2 ' -di t iodipi r idina y se purifica por medio de cromatografía. El producto de reacción se hace reaccionar con ácido glutamínico (0-t. butilo) protegido con carboxilo bajo activación HOBt/EDC (ver figura 1) . Análogamente se hace reaccionar el ácido 6- Fmoc-aminohexano . Los grupos de protección carboxilo se retiran en TFA/DCM, el derivado de ácido glutamínico resultante se purifica por medio de métodos croma t ográ f i cos . La preparación de los copolímeros es posible de acuerdo con los siguientes principios y se explicará con la ayuda de un copolímero PEG-péptido: 1) Matriz de Pol i ( PEG-O-OC- ) ("poliéster") : La copolimerización de los ácidos péptido -dicarboxílico o los derivados de ácido glutamínico o asparagínico iónicos parcialmente protegidos en la cadena lateral, con los macromonómeros de PEG en las regiones molares definidas (MW 400-20000 comerciales, por ejemplo Fluka) produce una matriz a base de éster de PEG, esta representa un sistema lábil a la hidrólisis en un medio fisiológico (Ulbrich et al., 1985) . Los copolímeros p ( PEG-pépt ido se forman así de acuerdo con métodos establecidos por ejemplo con disiclohexi lcarbodi imida /DEMAP , preferentemente en una secuencia estrechamente alternante (Zalipsky et al., 1984; Nathan A., 1992) . El monómero PEG se mezcla junto con un péptido o derivado de ácido glutamínico o asparagínico protegido en la cadena lateral, en solución de diclorometano con DCC/DEMAP. Después de retirar el derivado de urea formado, puede el polímero obtenerse por medio de precipitación con éter frío. La disociación de los grupos de protección de cadena lateral restantes, se realiza con TFA en diclorometano (bajo estas condiciones también es estable el enlace éster - PEG (Zalipsky et al., 1984)) . El polímero iónico se obtiene por medio de precipitación y una subsecuente etapa de cromatografía. La forma de realización de la reacción permite un control del grado de polimerización y de la fracción de carga por unidad PEG en el polímero. 2) Matriz .de pol i ( PEG-HN-OC ) ("poliamida") . Alternativamente al poliéster puede formarse una matriz polimérica amídica, en el caso que durante el uso de un complejo copolímero -ADN en una aplicación terapéutica genética se espere una capacidad de hidrólisis muy rápida y por lo tanto una alta inestabilidad durante la aplicación sistemática. En este caso, se utilizan derivados diamino de PEG en vez de los macromonómeros de PEG, que se copol imeri zan análogamente a la síntesis antes descrita con los péptidos iónicos o derivados de ácido glutamínico o asparagínico. En esta síntesis se obtiene una . estructura de amida estable a la hidrólisis. Los pol i et i léngl i coles modificados por diamino se obtienen comercialmente como materias primas en los rangos de masas molares definidos entre 500 y 20000 (por ejemplo Fluca) . Los grupos de protección de cadenas laterales lábiles a los ácidos del componente péptido residuales, se retiran por ejemplo con TFA/DCM, y los polímeros se purifican por medio de métodos cromatográ fieos . Los copolímeros de derivados 'de ácido glutamínico o asparagínico se hacen reaccionar en una etapa posterior con péptidos aniónicos o catiónicos que contienen un grupo reactivo adecuado. Por ejemplo, se hacen reaccionar copolímeros de ácido 3- ( 2 ' - 1 io-pi r idi 1 ) -mercapt opropionil-glutanímico con péptidos que contienen un grupo libre de cis teína- t iol . De los copolímeros que se originaron a partir de ácido 6-Fmoc-aminohexanoi 1 -glut amí ni co se retira el grupo de protección Fmoc bajo condiciones básicas. El producto se hace reaccionar con un péptido protegido activado con carboxilo. Los grupos de protección de péptidos (t-Boc o 0-t. butilo) se retiran en DCM/TFA el producto final se purifica croma tográf icamente . Alternativamente, el grupo amino de Ahx (ácido 6-aminohexano) se derivan con enlaces bifuncionales y a continuación se hace reaccionar con un péptido. El acoplamiento de ligando L puede realizarse directamente por medio de la activación de los grupos carboxilo en el efector E (preferentemente en el caso de copolímeros aniónicos) o en los ligandos o a través de una unión intermedia del enlace bifuncional como por ejemplo di t iopr opionat o de succinimidi 1 -piridilo (SPDP; Pierce o Sigma) y compuestos similares. La purificación del producto de reacción puede realizarse por medio de filtración de gel y cromatografía de intercambio de iones. La reacción de este producto de copolimerización, también puede realizarse por medio de - principios combinatorios. Como variables seleccionables se presentan aquí sobre todo aquellas del tipo y peso molecular (grado de polimerización de los polímeros R, la identidad del miembro de polimerización X-Zm-En o de la molécula del efector E (por ejemplo una serie de péptidos aniónicos con un número creciente de ácidos glut amínicos ) y el grado de polimerización total p. Por medio de la variación de las masas molares de los macromonómeros PEG, el tipo de las especies iónicas utilizadas así como su proporción de copolímeros y el grado de polimerización de la matriz polimérica-, puede obtenerse un sistema de varios parámetros que permite la construcción paralela rápida de una serie homologa de copolímeros di f e r enci abl es y como consecuencia diferentes vectores no virales después de formar complejos con el ácido nucleico. El concepto de síntesis se utiliza aquí en una medida de una placa de cultivo celular (por ejemplo 96 pozos por placa) . Para esto, se ajusta la síntesis química a la escala micrométrica requerida (volúmenes de reacción en el rango de 500µl. Esto permite la transferencia directa de los polímeros sintetizados paralelamente en el ensayo biológico y conduce así a una exploración rápida de una multiplicidad de sistemas y ayuda a encontrar rápidamente los compuestos adecuados. Para la realización del procedimiento de selección biológico en vista del uso preferido de los copolímeros de acuerdo con la invención para la transferencia genética, se mezclan los copolímeros por ejemplo con complejos de ADN y luego se realizan pruebas que permiten evaluar las propiedades del polímero en referencia a su uso deseado (por ejemplo la transferencia genética) . Esos procedimientos de selección, también pueden utilizarse para nanopartículas recubiertas con copolímeros. Esos procedimientos de exploración y selección, pueden servir por ejemplo en pruebas de activación complementarias en un formato de placas con 96 pozos (Plank et al., 1996), mediciones de turbiedad que se encuentran en el mismo formato por medio de la agregación inducida por la albúmina del suero o por sal, o estudios de transferencia genética in vitro con el mismo formato (Plank et al., 1999) o procedimientos ópticos de fluorescencia con el mismo formato . Esos estudios dan por ejemplo indicaciones de que copolímeros de un producto sintético combinado son adecuados para modificar la superficie de los complejos de ADN, de tal forma que su solubilidad sea suficiente para aplicaciones de transferencia genética in vivo cuya interacción con los componentes de la sangre y de los tejidos esté limitado de tal forma que su tiempo de permanencia y de efecto en el sistema circulatorio sanguíneo se lo suficientemente elevado para permitir la transferencia genética promovida por el receptor en las células objetivo. Los copolímeros de acuerdo con la invención se utilizan preferentemente para el transporte de ácidos nucleicos en células eucarióticas superiores. La presente invención se refiere por lo tanto, en otro aspecto a complejos que contengan una o varias moléculas de ácido nucleico y uno o varios copolímeros cargados de la fórmula general I. Preferentemente, la molécula de ácido nucleico está condensada con un policatión orgánico o con un lípido catiónico. En otro aspecto se refiere la invención a complejos de ácidos nucleicos y un policatión orgánico o un lípido catiónico que están caracterizados porque en su superficie tienen enlazado a un copolímero cargado de la forma general I, a través de un interacción iónica. Los ac±aos n le cos que han de ser transportados a las células pueden ser aquí ADN o ARN, no existiendo limitaciones con respecto a la secuencia nucleótida y al tamaño. Los ácidos nucleicos contenidos en los complejos de acuerdo con la invención, se definen sobre todo por el efecto biológico que se quiere obtener en la célula, por ejemplo, en el caso de usos en el marco de la terapia genética por medio del gen o de la fracción del gen que se hace expresar, o por medio de la substitución o reparación intencionada de un gen defectuoso o de la secuencia objetivo deseada (Yoon et al., 1996; Kren et al. 1998) o por medio de la secuencia objetivo de un gen que se va a inhibir (por ejemplo en el caso de la aplicación de ol igor r ibonucleót idos antisentido o de ribozimas) . Preferentemente, en el caso del ácido nucleico que ha de transportarse a la célula se trata de ADN de plásmido que contiene una secuencia codificante a una proteína terapéuticamente efectiva. Para la aplicación en el marco de una terapia contra el cáncer codifica la secuencia por ejemplo, a una o varias citosinas, como la inter leucina-2 , IFN-a , IFN-?, TNF-a, o un gen suicida que se usa en combinación con el substrato. Para utilizarse en la llamada vacunación tumoral genética, contiene los complejos ADN que codifica a uno o varios antígenos tumorales o sus fragmentos, eventualmente en combinación con ADN que codifica a una o varias citocinas. Otros ejemplos de ácidos nucleicos terapéuticamente efectivos se dan en la WO 93/07283. El copolímero de acuerdo con la invención tiene la propiedad de estabilizar estéricamente al complejo ácido nuc lé ico-pol i ca t ion y reducir o eliminar su interacción indeseada con los componentes de los fluidos corporales (por ejemplo con las proteínas séricas) . Se conocen los policationes orgánicos adecuados para formar complejos de ácidos nucleicos para el transporte en las células eucarióticas ; debido a su interacción con los ácidos nucleicos cargados negati amente se compactan estos y se llevar a una forma adecuada para ser recibidos en las células. Ejemplos de policationes, que han sido utilizados para la transferencia genética promovida con receptor (EP 0388 758; WO 93/07283), como los poliaminoácidos catiónicos lineales homólogos (como polilisina, poliarginina, poliornitina) o poliaminoácidos neutrales catíónicos mixtos lineales heterólogos (consistente de dos o más aminoácidos catiónicos y neutrales), péptidos catiónicos ramificados y lineales (Plank et 1., 1999; Wadh a et al. 1997), policationes no peptídicos (como polietileniminas, pol ipropi lenimina s ) , dendrimeros (policationes esferoidales, que pueden ser sintetizados con un diámetro bien definido y un numero exacto de grupos amino en la posición extrema (Haensler y Szoka, 1993; Tang et al., 1996; WO 95/02397), carbohidratos catiónicos, por ejemplo quitosana (Erbacher et al., 1998) . Los policationes también pueden estar modificados con lípidos (Zhou et al. 1994; WO 97/25070) . Otros cationes adecuados son los lipidos catiónicos (Lee et al., 1997), que parcialmente pueden obtenerse en el mercado (por ejemplo Lipo fect amina , Transfectam) . A continuación, cuando no se indique otra cosa, se usará el concepto "policatión" tanto para policationes como también para lípidos catiónicos. Los policationes preferidos en el marco de la presente invención son polietileniminas, polilisina y dendrímeros, por ejemplo dendrímeros de pol i ami doamino (dendrímeros "PANAM") . El tamaño y la carga de los policationes puede oscilar en un amplio rango; se seleccionan de tal forma que el complejo formado con ácido nucleico no se disocie en el caso de una concentración salina fisiológica, lo cual puede determinarse fácilmente por medio del ensayo de desplazamiento de bromuro de etidio ( Et hidiumbromide Displacement Assay) . (Plank et al. , 1999) . En otra etapa se incuba una cantidad definida de ácido nucleico con cantidades crecientes del policatión seleccionado, el complejo formado se aplica sobre las células que se van a transfectar y se mide la expresión genética (en general con la ayuda de una construcción, por ejemplo luciferasa) de acuerdo con métodos estándares. La construcción de los complejos de ácido nucleicos se realiza por medio de interacciones electrostáticas. El ADB puede estar presente en exceso en comparación con el policatión, de tal forma que ese tipo de complejo presente una carga superficial negativa; en el caso contrario cuando el policatión condensante del ácido nucleico se encuentre en exceso, los complejos tienen una carga superficial positiva. En el marco de la presente invención se prefiere que el policatión se encuentre en exceso. Preferentemente se ajusta la proporción policatión: ácido nucleico en el caso de un exceso de carga positivo, de tal modo que el potencial Zeta es de aproximadamente +20 a +50 mV . En el caso del uso de determinados policationes, por ejemplo polilisina, puede ser mayor. En el caso de un exceso de carga negativo el potencial Zeta es de aproximadamente -50 a -20 mV . La medición de la potencial zeta se realiza de acuerdo con métodos estándar establecidos, como por ejemplo lo descrito por Erbacher et al. 1998. El policatión está eventualmente conjugado con un ligando celular o anticuerpo; los ligandos adecuados se describen en WO 93/07283. Para la transfe encia genética dirigida a las células objetivo en el marco de la terapia tumoral se prefieren ligandos o anticuerpos para los receptores asociados a las células tumorales (por ejemplo CD87; uPA-R) , que estén en posición de aumentar la transferencia genética en las células tumorales. Durante la preparación de los complejos se incuba el ácido nucleico, en general el ADN de plásmido, con el policatión (eventualmente derivado con un ligando receptor) el cual se encuentra en un exceso de carga. Así se forman partículas que pueden ser recibidas en las células por medio de la endocitosis promovida por el receptor. A continuación se incuban los complejos con un copolímero cargado negativo de acuerdo con la invención, preferentemente un copolímero de poliet i léngli col . El efector E en el copolímero es preferentemente un péptido polianiónico. Alternativamente se mezcla primero el copolímero con el ácido nucleico y después se incuba con el policatión, o como tercera variante, primero se mezcla con el policatión luego se incuba con el ácido nucleico . Alternativamente el ácido nucleico se incuba con un policatión que se ' encuentra en un exceso electrostático y luego se agrega un copolímero catiónico. También aquí puede variarse la secuencia de las etapas de mezclado, como se describe antes para los copolímeros aniónicos. Las fracciones relativas de los componentes individuales se selecciones de tal forma que el complejo de ADN resultante presenta un potencial Zeta débilmente positivo, neutro o débilmente negativo (+10 V a -10 mV) . En el caso de uso de copolímeros positivamente cargados pueden estos utilizarse como las únicas moléculas ligandos y condensantes a los ácidos nucleicos; la fracción de un policatión o lípido catiónico puede por lo tanto omitirse. Las fracciones relativas de los componentes individuales se seleccionan en este caso también de tal manera que el complejo de ADN resultante presenta un potencial Zeta débilmente positivo, neutro o débilmente negativo ( + 10 V a -10 mV) . En los complejos se encuentran modificados también el policatión y/o el copolímero con ligandos celulares iguales o diferentes. Los complejos de ácido nucleico de acuerdo con la invención, que están estabilizados en sus dimensiones por medio de copolímeros unidos electrostáticamente de la fórmula general I y con esto están protegidos de la agregación, tienen la aventaja de que pueden almacenarse en solución durante periodos de tiempo más largos (semanas) . A partir de esto tienen la ventaja de que debido a su efecto de protección el copolímero o unido tiene una interacción reducida o nula con los componentes de los fluidos corporales (por ejemplo con las proteínas de suero ) . La invención se refiere en otro aspecto a una composición farmacéutica que contiene un ácido nucleico terapéuticamente efectivo, el copolímero de acuerdo con la invención y eventualmente un policatión orgánico o un lípido catiónico. La composición farmacéutica de acuerdo con la invención se encuentra preferentemente en forma de un liofilizado, eventualmente agregando azúcar como sacarosa o dextrosa, en una cantidad que en la solución lista para usarse da una concentración fisiológica. La composición también puede encontrarse en forma de un cr íoconcent r ado . La composición de acuerdo con la invención puede también encontrarse en estado congelado ( cr i oconservada ) o como solución enfriada. En otro aspecto los copolimeros cargados positiva o negativamente de acuerdo con la invención sirven para estabilizar esféricamente a las partículas coloidales ( "nanopart i culas " ) tales como las que han sido desarrolladas para la aplicación en medicamentos clasicos, asi como reducir y evitar las interacciones mdeseadas con los componentes de los fluidos corporales (por ejemplo con las proteínas del suero) . Ademas pueden utilizarse copol ímeros modificados con ligandos de receptor, de acuerdo con la invención, para proveer a las superficies de las nanopart i cula s con ligandos receptores, para transferir el medicamento con una mayor especificidad a las células objetivo ("Drug Targeting") . Explicación de las figuras: La figura 1: muestra la preparación de la estructura copolimérica a partir de ácido 3-(2'- tio-piridil) -mercaptopropionil- glutamínico y 0,0'-bis(2- aminoetil ) poli ( etilénglicol ) 6000 o O, O' -bis (2-aminoetil) poli (etilénglicol) 3400 La figura 2: Acoplamiento de los péptidos cargados a la estructura copolimérica Las figuras 3A y 3B: Preparación de la estructura copolimérica del péptido protegido E4EPR0T y y 0,0' -bis (2- aminoetil ) poli (etilénglicol) 6000 Las figuras 4A - 4D: Prueba de activación complementaria La figura 5: Pueba de lisis de eritrocitos La figura 6: Tomas con microscopio electrónico de complejos PEI-ADN (N/P = 8) en la presencia del copolímero P3YE5C Las figuras 7A y 7B: Potencial Zeta de complejos de PE- y DOTAP/ADN de colesterol dependiendo de la cantidad utilizada del copolímero P3YE5C o P6YE5C La figura 8: Preparación de complejos ADN/polication/copolimero La figura 9: Transferencia genética en las células K562 con complejos PEÍ (25kD)- ADN en la presencia y ausencia del copolímero P3Y5C Las figuras 10A y 10B: Transfección de la familia celular del cáncer mamario MDA-MB435S con complejos de polilisina-ADN y ausencia del polímero de recubrimiento P31NF7 La figura 11: Lipofección en células NIH3T3 en la presencia y ausencia del copolímero P3YE5C La figura 12: Transfección de células HepG2 con DOTAP/ADN de colesterol y PEI-ADN en la presencia y ausencia de P6YE5C La figura 13: Transfección de células HepG2 con complejos PEI-ADN en la presencia de diferentes cantidades de copolímeros a diferentes proporciones de carga Las figuras 14A - 14C: Dependencia de la eficiencia de transfección de la cantidad de copolímero, a la pureza del complejo y la presencia de la sal La figura 15: Transferencia genética intravenosa i n vi vo por medio de complejos ADN/policatión con recubrimiento copol imérico La figura 16: Transferencia genética í n vi vo con vect ore s PEI-ADN protegidos con copolímeros. P3YE5C-PEI-ADN en un modelo del linfoma de célula T en ratones DBA2 La figura 17: Transferencia genética con vectores PEI-ADN protegidos con copolímero i n vi vo PYE5C-PEI-AND en ratones DBA2 La figura 18: P6YE5C refuerza el transporte de complejos ADN-PEI en el tumor (Tumor Targeting) La figura 19: Interacción de complejos PEI-ADN y partes constitutivas del suero humano Ejemplo 1 Preparación de copolímeros cargados de la fórmula general I 1.1 Preparación de la estructura copolimérica a partir de ácido 3 - ( 2 ' - 1 i o-pi r idi 1 ) - mercaptopropionil-glutamínico y 0,0' -bis (2- aminoetil ) poli ( etilénglicol ) 6000 o y 0,0'- bis (2-aminoetil) pol i (etilénglicol) 3400 (diamino-PEG-34000; Fluka) En este caso la fórmula general I es: W=Y=NH X = ácido 3 -mer capt opropioni 1 -glut amí ni co , esto es un derivado de aminoácido de acuerdo con el caso i) , que por medio de acoplamiento del grupo de enlace ácido 3- ( 2 ' - 1 iopiridinil ) -mercaptopropiónico en ácido glutámico; Por lo tanto se omite Z(m=0) a) Reacción de ácido 3-merca?tpropionico con 2, 2' -ditiopiridina (1) : 1 g DTDP (Fluka) se disuelve en 4 ml de etanol absoluto (Merck) . Después de la adición de 100 µl de trietilamina (Aldrich) se agregan 87 µl (1 mmol) de ácido 3 -mer captopropióni co . Después de 1 hora se purifica la mezcla de reacción en alicuotas por medio de CLAP de fase inversa: columna preparativa C18 (Vydac, 218TP1022), tasa de flujo 25 ml/min, 0.1% de ácido trifluoroacético, 0-40% acetonitrilo en 24 minutos, 40-10% acetonitrilo en 5 minutos, 100% de acetonitrilo en 5 minutos. El pico del producto se eluyó con aproximadamente un 20% de acetonitrilo. Las fracciones del producto se purificaron y se ecaron por congelación. En u o ae .. " ~ - - ~ r. _. e esa sintesis antes de la purificación por medio de CLAP de fase inversa se precipita el DTPD en exceso por medio de la adición lenta de agua bajo agitación. El precipitado se toma dos veces en etanol y vuelve a precipitarse por medio de la adición de agua. Las fases acuosas unidas se purifican como se indica antes por medio de CLAP de fase inversa . b) Síntesis de 3- ( 2 ' -t io-piridi 1 ) - mercaptopropionil -glutamínico (2b) El producto 1 obtenido en a) (ver figura 1; 0.5 mmol) se disuelve en 25 ml de diclorometano. Bajo agitación y enfriamiento con hielo en tubos de polipropileno de 50 ml (Firma Peske) se agregan secuencialmente un mol de los siguientes éter di-t-biutilo de ácido glutamínico ( Glu ( Ot Bu ) Ot Bu , Bachem), 1 -hidroxiben zot riazol (Aldrich), N-etil-N'-(d?met?laminopropil)-carbodiimida (Aldrich) diisopropiletilamina (Aldrich) . Después de 48 horas de reacción se evapora la mezcla en el evaporador rotatorio hasta que se obtiene un residuo aceitoso, que fue tomado en 20 ml de acetato de etilo. Esa solución fue mezclada dos veces con ácido clorhídrico 0.5M, solución saturada de hidrocarbonat o de sodio y solución saturada de cloruro de sodio. La fase orgánica se extracta en el evaporador rotatorio hasta un residuo aceitoso y se seca durante la noche al alto vacío (Producto 2a; ver figura 1) . El producto 2a se toma sin mayor purificación para retirar los grupos de protección t-butilo en 30 ml de diclorometano: ácido trifluoroacético (2:1) y se agita dos horas a la temperatura ambiente. En el evaporador rotatorio se extracta hasta que queda un residuo aceitoso, el cual se lava con éter helado. Después de secar al alto vacío se disuelve el producto en 100 M de Hepes pH 7.4 y se purifica en alicuotas por medio de CLAP de fase inversa (mismas condiciones que para el producto 1) . Las fracciones del producto se purifican. El producto 2b (ver figura 1) se obtiene por separado con un rendimiento de 270 µmol (27% en todas las etapas) Peso molecular teórico: 344:05. Encontrado: 345.0 (MH+) . cl) Copolimerización de ácido piridil-(2- f i t i opr opioni 1 ) -gl ut arnini nico (2b) con 0,0' -bis (2 -aminoetil) poli (etilénglicol) 6000 (Diamino PEG-6000; Fluka) : El producto 2b se disuelve en 32 ml de dimetilformamida (Fluka) y se diluye con diclorometano hasta 20 ml . 5 ml de esa solución (67.5 µmol) se mezclan secuencialmente con 506 mg de diamino-PEG-6000 (84 µmol, corresponde a 1.25 equivalentes; Fluka); 30 mg de diciclohexilcarbodiimida (135 µmol, 2 equivalentes, 135 µl de una solución ÍM en DMF), y 2 mg de dimetilaminopiridina (0.25 equivalentes, solución ÍM en DMF) . Después de 2 horas se retiran 10 µl para una prueba de ninhidrina, que muestra una coloración azul aún muy débil. El producto crudo 3 se obtiene (ver figura 1) después de enfriar a -20° C por medio de precipitación de la mezcla de reacción con éter t-butil-metilo bajo agitación. El producto se seca al vacío. Alicuotas se toman en agua, y después del enfriamiento del residuo insoluble se purifica por medio de filtración en gel (Ultra-free MC, Millipore) . Para esto se rellena una columna XK 16/40 (PHARMACIA) con Superdex 75 (Pharmacia) de acuerdo con las indicaciones del fabricante. Alicuotas de sendos 20 mg del producto crudo 3 se purifican a una tasa de flujo de 1 ml/min con 20 mM de Hepes pH 7.3 como eluyente. La fracción principal se eluye a un peso molecular probable de 40,000 Da de acuerdo con las fracciones previas de alto peso molecular que estban claramente separadas que fueron reunidas por separado . c2) Copolimerización de ácido piridil-(2-di t i opr opioni 1 ) -glut amí n i co (2b) con 0,0'-bis(2-aminoetil ) poli ( etilénglicol ) 6000 o y 0,0'-bis(2-aminoetil) poli (etilénglicol) 3400 ( diamino- PEG- 34000 ; Fluka) El producto 4 se obtiene de acuerdo con la misma carga y la misma purificación que el producto 3. Como fracción principal (54% de las fracciones del producto) después de la filtración de gel se obtiene un producto el cual se eluye un peso molecular probable de 22.800 Da (las fracciones secundarias son un producto con 64 kD, 14% de la cantidad total, y un producto con 46 kV, 32% de la cantidad total) . El esquema de reacción de las etapas de síntesis a) a c) que forman la estructura copol ímér i ca , se representa en la figura 1: ácido 3-mercaptopropiónico se hace reaccionar con 2,2'-di t íopir idina , el producto (1) se acopla a ácido glutamínico protegido con carboxilo (producto 2a) . Después de la disociación de los grupos de protección t-butilo se obtiene ácido 3 - ( 2 ' - 1 io-pi r idi 1 ) -mer capt opropioni 1 -glut amínico (2b), que se copolimeriza bajo la activación DCC con 0,0'-bis(2-aminoetil ) poli ( etilénglicol ) 6000 o y 0,0'-bis(2-aminoet il ) poli ( et i lénglicol ) 3400. Se obtienen los product os 3 o 4. 1.2 Síntesis de péptidos Los péptidos se prepararon de acuerdo con el protocolo FastMoc™ en un sintetizador de péptidos de Applied Biosystems 431A. i) El péptido YE5C (secuencia [ Ac- YEEEEE ] 2 -ahx-C] se preparó usando 330 mg de resina de cloronitrilo )0.05 mmol/g; Bachem) con los grupos de protección tritilo (Cys), di-Fmoc (Lys) y O-t-butilo (Glu) . Se utiliza 1 mol de cada uno de los aminoácidos protegidos. Después del punto de ramificación (Lys) se realizaron continuamente acoplamientos dobles. La acetilación de las terminales N se realiza en resina de péptido con 2 mmol de hidruro de acetona en 2 ml de N-met i lpi rro 1 idona en la presencia de 2 mmol de di i s opropi let i 1 amina . El péptido se obtiene como producto crudo después de la disociación de la resina (500 µl agua, 500 µl tioanisol, 250 µl de etanditiol en 10 ml de ácido trifluoroacético) y precipitación con éter de dietilo. El producto crudo se disuelve en HEPES 100 mM pH 7.9 y se purifica por medio de cromatografía de perfusión (Poros 20 HG, Boehringer Mannheim, relleno con una columna PEEK de 4 x 100 mm, NaCl 0-0.5 M en 8 minutos, tasa de flujo 10 ml/min) . El coeficiente de extinción del péptido en 50 mM de amortiguador de fosfato de sodio en clorhidrato de guanidina 6M fue, a 280 nm de 2569 M^cm"1 (Gill y von Hippel 1989) . ii) El péptido INF7 (secuencia GLFEAIEGFIENGWEGMIDGWYGC) se sintetizo de acuerdo con el mismo procedimiento en 500 mg de resina de clorotritilo (0.5 mmol/g), se separa de la resina como se describe para YE5C y se precipita con éter de dietilo. El producto crudo se seca al vacío. Alicuotas de sendos 20 mg se disuelven en 500 µl de amortiguador de hidrocarbonat o de trietilamonio ÍM pH 8 y se purifican por medio de filtración de gel (Sephadex G-10 de Pharmacia dentro de una columna HR /30 de Pharmacia. Tasa de flujo 1 ml/min. Como eluyente sirven HEPES 20 mM pH 7.3&150 M NaCl o TEAB 100 Mm hidrocarbonato de amonio 100 mM) . Coeficientes de extinción: 278 nm 12600, 279 nm 12665; 280 nm 12660 M^cm"1. iii) El péptido SF029-ahx (secuencia K2K-ahn-C9 se sintetiza de manera análoga (500 mg resina de Fmoc-Cys ( Trt ) - clorotritilo de Bachem; 0.5 mmol/g) y se purifica por medio de métodos estándar (Sephadex G10 con 0.1% de TFA como eluyente; CLAP de fase inversa, gradiente de TFA-acetonitrilo de 0.1%) . La lisina en el punto de ramificación es alfa, epsilon-di- Fmoc-L- 1 i sina , las siguientes lisinas son alpha, Fmoc-eps ilon-Boc-L-lisina . iv) El péptido E4E (secuencia [EEEE]2KGGE) se sintetiza análogamente. El tamaño de la carga fue de 0.25 mmol de resina Fmoc-Glu ( Obz 1 ) -clorot r i t i lo . La aplicación de la resina se realiza por medio de la suspensión de cantidades correspondientes de resina de cloruro de O-clorot rit i lo (Alexis) en diclorometano absoluto y mezclado con sendos 2 eq. Der FmocGl u ( Obz 1 ) =OH y diisopropiletilamina. Después de agitación durante varias horas se filtra y se lava múltiples veces con dimetilformamida, metanol, isopropanol, diclorometano y éter de dietilo. Se utiliza un protocolo Fmoc modificado. El aminoácido de la terminal N porta un grupo de protección Boc, para obtener de la síntesis de fase sólida un derivado de péptido de bases estables completamente protegido con la secuencia (E(Boc) [ E ( t Bu ) ] 3 ) 2KGGE (Obzl) OH (E4EPR0T) . La disociación de la resina se realiza con di cl oromet ano /ácido acét ico /t r i f luoroetanol (1:1 en el caso de la temperatura ambiente. El grupo de protección del éster de bencilo del ácido glutámico terminal C se disocia selectivamente con H2/paladio sobre carbón activado siguiendo el método estándar. Las masas de los péptidos se determinan por medio de espectroscopia de masas por elect roaspers ion y con esto se confirma la identidad de los peptidos. 1.3 Acoplamiento de los peptidos a la estructura copolimerica (4) o (5) . Las soluciones de sendos 1.2 equivalentes de peptido que contienen cisterna en la terminal C y la estructura copol ímer ica , obtenidos en 1.1 (en relación a los grupos tiopipdilo en el polímero) , en Hepes 20 mM, pH7.4 se purifican y se agitan a la temperatura ambiente. Para determinar los equivalentes que deben de usarse, se determinan los puntos de enlace de t íopir ídi 1 i lo disponibles, por medio de mezclado con una solución diluida del polímero con 2-met capt oert anol y subsecuente medición de la extinción de la 2-t íopir idona liberada a una longitud de onda de 342 nm, y de la concentración de las funciones tiol libres del peptido que contiene cisterna con reactivo de Ellman a una longitud de onda de 412 nm de acuerdo con Lambert -Bee r . Después de transcurrida la reacción, cuya finalización completa se determina por medio de la absorción de la tiopiridona liberada a 342 nm, se extracta y se fracciona el producto por medio de filtración de gel (Superdex 75-Mater?al, Pharmacia) . 1.3.1. Producción del copolímero P3YE5C Se utiliza el péptido YE5C, secuencia ( YEEEEE ) 2K (ahx) C, que está acoplado a través de un puente de disulfuro del tiol de cisteína con la agrupación de ácido 3 -mer capt opropioni 1 -glut aminico . a) El copolímero P3Y35C se prepara a partir de la fracción (22.800 Da) del producto (4) y del péptido purificado. Como producto se obtiene un compuesto con un peso molecular probable de 35,000 Da. Considerando el peso molecular del péptido y el polímero de partida significa esto un grado de polimerización p=6 (6 unidades repetidas) . b) El copolímero P6YE5C se preparo de la fracción 3 (40,2000 Da) de producto (3) y del péptido purificado. Como producto se obtiene un compuesto' con un peso molecular probable de 55,800 Da. El grado de polimerización es de aproximadamente 7. 1.3.2 Preparación del copolímero P3INF7 Se utilizo el péptido endosmol i t i co INF7, que está acoplado con la agrupación de ácido 3-mercapto-propionil-glutaminico a través de un puente de disulfuro del tiol de cisteína. a) el copolímero P3INF7 se prepara a partir de la fracción 3 (22,800 Da) del producto(4) y el péptido de la influenza purificado. b) el copolímero P3INF7 se preparo a partir de la fracción 3 (40,200 Da) del producto (3) y el péptido de la influenza INF7 purificado. 1.3.3. Preparación de un copolímero modificado con un ligando receptor (" lact os i 1 i lado" ) Se utilizaron una parte del péptido lact os ililado SF029-ahx y 9 partes del péptido ramificado YE5C, que a través de un puente de disulfuro del tiol de cisteína están acoplados con la agrupación de ácido 3-mercaptopropioni 1-glutmí nico .
Sendos 3.32'µmol de copolímero (4) o (5) (en relación a los grupos de tiopiridilo obtenidos) disueltos en 1 ml de HEPES 20 mM pH 7,4 se mezclaron con una mezcla de 500 nmol de SF029-ahxz lact osi lilado y 4.48 µmol de péptido YE5C en 1.1 ml de amortiguador HEPES. Esto corresponde a un exceso del 1.5 de grupos tiol libres del péptido sobre los grupos tiopiridilo disponibles, y la fracción del péptido lact osi 1 i lado en el péptido total es del 10%. La reacción se completo durante la noche. Los productos se purifican como se describe por medio de filtración en gel (Superdex 75) . El esquema de reacción para acoplamiento de los péptidos a la estructura copolimérica de acuerdo con 1.3 se representa en la figura 2: en el producto 3 o 4 se acoplan los péptidos con grupos tiol libres, por ejemplo el péptido INF7 (izquierda) o el péptido YE5C. Se obtienen los productos P3INF7 (a partir de 0, 0' -bis (2-aminoetil) poli (etilénglicol) 3400), P6INF7 ( a partir de de 0,0'-bis(2-aminoetil ) poli ( etilénglicol ) 6000) y análogamente P3YE5C y P6YE5C. Ejemplo 2 Preparación de la estructura copolimérica a partir de ácido Fmoc- 6-aminohexnoil-glutamínico y con 0, 0' -bis ( 2-aminoetil ) poli (etilénglicol ) 6000 (Diamino PEG-6000; Fluka) o 0,0'-bis(2-aminoetil ) poli ( etilénglicol ) 3400 ( diamino-PEG- 3400 ; Fluka) . En este caso para la fórmula I es valido lo siguiente : W=Y=NH; X=Fmoc- 6-aminohexanoi 1 -glutamínico . Esto significa que X es de acuerdo con i) un derivado aminoácido que se obtiene por medio del acoplamiento de ácido Fmoc- 6-aminohexano al ácido glutamínico. Para el acoplamiento de la molécula de efector E puede omitirse Z o puede ser un enlace bifuncional como SPDP o EMCS . Un efector E adecuado para el acoplamiento a esa estructura polimérica puede ser un péptido del tipo E4EPR0T (Z se omite) o del tipo YE5C, reaccionando este a través de tiol de cisteína con la molécula de enlace Z (por ejemplo SPDP o EMCS) . a) Síntesis del dipéptido Fmoc-ácido 6-aminohexano-GluOH (6) 1 g de ácido 6-aminohexano protegido con Fmoc (2.82 mmol), 1.2 eq. Flu ( OtBu ) OtBu y 1.2 eq. De 1-hidroxibenzot riazol se disuelven en 200 ml de diclorometano. La mezcla después de ser enfriada a 0° C con 1.2 eq de N-et il-N '-( dimet ilaminopropil ) -carbodiimida y 1.7 ml de i i sopropi let i lamina (pH = 8) . Después de una hora a 0° C se agita todavía otras 18 horas a la temperatura ambiente. El solvente se elimina por destilación completamente, el residuo se toma en acetato de etilo, y se extrae con ácido clorhídrico 0.5 N, solución saturada de hidrocarbonat o de sodio y solución saturada de cloruro de sodio. Después de retirar el solvente se obtiene después del secado por congelación Fmoc-ácido 6-aminohexano-Glu (OtBu) OtBu (5) . El derivado (5) protegido con Di-t-butilo se disuelve en 30 ml de dicloromet ano/ácido trifluoroacético 2:1 y se agita durante una hora a la temperatura ambiente. Al término de la reacción (control de reacción por medio de CLAP de fase inversa) se reduce el solvente a aproximadamente el 5% del volumen inicial y el producto (6) se obtiene por medio de precipitación. La purificación subsecuente se realiza por medio de CLAP Fl con un gradiente de acetonitrilo/agua 0.1% TFA. b) Copolimerización de Fmoc-ácido 6-aminohexano-GluOH (6) con O, O' -bis (2-aminoetil) poli (etilénglicol) 3400' ( diamino- PEG-34000; Fluka) producto (7) 10 mg ( 6) , 1.5 eq . O, O' -bis (2-aminoetil)poli (etilénglicol 3400' , 2 eq . Di c i clohex i 1 carbodiimida y 0.25 eq . De 4- ( dimet i lamino ) -piridina se disuelven en 5 ml de diclorometano. Después de agitar durante 30 minutos la temperatura ambiente se filtra la solución después de la concentración y después de esto el solvente se destila completamente. El residuo se suspende en 500 µl de agua y se seca por congelación. Después de la disociación del grupo de protección Fmoc (20% de piperidina en dimetilformamida o diclorometano) del polímero, utilizando la química de acoplamiento de péptidos habitual puede conjugarse el copolímero con los péptidos con terminal C libre que se deseen. Ejemplo 3 Preparación de la estructura copolimérica a partir del péptido E4EPR0T y 0,0'-b?s(2-ammoetil) poli ( et i léngl i col ) 6000 (Diamino PEG-6000; Fluka) o O, O' -bis ( 2-ammoet íl ) pol i ( et i lengl icol ) 3400 (d?am?no-PEG-3400; Fluka) . En este caso en la formula general I es W=Y=NH; X= el péptido ramificado E4EPR0T . En este ejemplo un peptido polianiónico X de acuerdo con i) representa al efector; por lo tanto se omiten Z y E (m=n=o) La copolimenzacion de E4EPR0T con 0,0'-b?s(2-aminoetil ) poli ( et i lengl i col ) 6000' (Diammo PEG-6000; Fluka) (8 ) ; 50 µmol de E4EPR0T, 1.5 eq. 0,0'-b?s(2-ammoet 11 ) -pol i ( et i lengl icol ) 6000', 2 eq. De di ci clohexi 1 carbodi ímida y 0.25 eq. 4 -( dimet i lamino ) -piridma se disuelven en 10 ml de dicl oromet ano . Después de agitar durante 4 horas a 4° C se filtra la solución concentrada y el solvente se destila completamente. El residuo se suspende en 500 µl de agua y se seca por congelación. Para disociar los grupos de protección de cadena lateral lábiles a los ácidos restantes se procede como se describe en la literatura mezclándolos con acido t r i fluoroacé t ico utilizando hasta un 5% de depurador (preferentemente etanditiol, t r iet il si laño , tioanisol) y se agita durante dos horas a la temperatura ambiente. El aislado del producto crudo se realiza por medio de precipitación desde éter de dietilo. La purificación final se realiza como se describe antes por medio de filtración en gel (Superdex75, Pharmacia) . La figura 3: muestra el esquema de reacción: El grupo de protección de bencilo de carboxilato del ácido glutámico terminal C del péptido E4EPR0T completamente protegido se disocia selectivamente con H2/paladio sobre carbón activado. El producto se copolimeriza bajo activación DCC con 0,0'-bis(2-aminoetil ) poli (etilénglicol ) 6000 o 0,0'-bis(2-aminoet il ) pol i ( et i léngl icol ) 3400. En la ultima etapa se disocian los grupos de protección de los ácidos glutamínicos colocados en la terminal B con TFA en DCM . E j emplo 4 Estudios de activación complementarios. El estudio se realiza en lo esencial como lo describen Plank et . al. 1996. a) Complejos de pol i 1 is ina-ADN con y sin el copolímero P6INF7 Se producen complejos de polilisina (longitud de cadena media 170; Sigma) -ADN como solución cepa para lo cual, se agregan 60 µg de pCMVLUC (correspondiente a pCMVL descrita en la WO 93/07 283) en 800 µl de HBS a 256 µg de pL en 800 µl de HBS y se mezclaron con una pipeta. Esto corresponde a una proporción de carga calculada de 6.3. De esa suspensión (a continuación los complejos de ADN-policat ion son denominados también como "pol icomple j os" ) , como controles positivos se colocaron sendos 50 µl en la columna 1 A-F de una placa de 96 pozos y se mezcla con 100 µl de amortiguador GVB2+. Todos los demás pozos contienen 50 µl de amortiguador GVB2+. 100 µl de la columna 1 se transfieren a la columna 2, y se mezclan como lo describe Plank et al., 1996. Además se mezclan sendos 350 µl de la solución cepa de pol i 1 i s ina-ADN con 35, 70 y 105 nmol (se relación a la fracción de INF7) del polímero P6INF7 y después de 15 minutos de incubación con amortiguador GVB2+ se diluye a 1050 µl. Sendos 150 µl de la suspensión resultante se introducen en las filas A a F de la columna 1 de una placa de 96 pozos. Se realiza una serie de disolución al 1.5 en amortiguador GVB2+ y se continua con la prueba de activación complementaria como se describe antes y como lo describe Plank et al. 1996. La concentración final de los componentes en la columna 1 son para ADN 2/3 µg, para pL 8/3 µg y para el polímero 0, 5, 10, 15 nmol • (en relación a INF79 por 200 µl de volumen total. b) Complementación por medio de complejos de PEI-ADN La prueba se realiza de la siguiente manera: Complejos de PEÍ (25 Kd, Aldrich) -ADN se preparan por medio de la mezcla de volúmenes iguales de una solución de ADN (80 µg/ml, en HEPES 20 mM pH 7.4( y una solución PEÍ (83.4 µg/ml en HEPES 20 mM pH 7.4) . Los complejos de ADN, para retirar el PEÍ no ligado en exceso, se centrifugan tres veces durante 15 minutos a 350 c g en pequeños tubos filtrantes Cent ri con- 100 (Millipore), en donde entre centrifugaciones cada vez se diluye al volumen original con HEPES 20 M pH 7.4, Después del último paso de centrifugación se obtiene una solución cepa de complejo de ADN, que corresponde a una concentración de ADN de 300 µg/ml. 182 µl de esa solución se diluyen con HEPES 20 mM pH 7.4 hasta 2520 µl. Sendos 610 µl de esas soluciones (correspondientes a 13.2 µg ADN) se agregan con pipeta a soluciones de P6YE5C en sendos 277.6 µl HEPES 20 mM pH 7.4. Las soluciones resultantes se ajustan a una concentración de sal de 150 mM con la adición 4 NaCl 5 M. Sendos 150 µl de las soluciones resultantes se transfieren a la columna 1, líneas A a F de una placa de 96 pozos. La serie de disoluciones en amortiguador GVB2 " se realiza como se ha descrito (Plank et al . 1996) . Igualmente se incubaron sendos 610 µl de complejos PEI-ADN de mayor concentración (86 ng ADN por µl) con sendos 277.6 µl de soluciones del polímero P3YE5C. Las soluciones contienen 0,1,2,3 equivalentes de carga en relación al ADN utilizado del péptido YE5C. Después de 15 minutos se agregan sendos 27.45 µl de NaCl 5 M (volumen total resultante 915 µl) . Sendos 150 µl de la solución resultante se transfieren a la columna 1, filas A a F de una placa de 96 pozos (esto corresponde a sendos 8.6 µg de ADN y 9 µg de PEÍ) . La serie de disoluciones y el proceso de prueba posterior se realiza como se ha descrito antes para pL-ADN. Los resultados de las pruebas de activación complementaria se representan en la figura 4: A) Activación complementaria por medio de complejos de poli 1 i s ina-ADN en la presencia o en la secuencia del copolímero P6INF7. El valor CH50 se refiere a una disolución sérica determinada, que conduce a la lisis del 50% de los eritrocitos de oveja en esta prueba. El valor CH50max designa aquel valor CH50, con el cual se obtiene suero humano sin tratamiento. En las pruebas descritas se incubó suero humano con vectores genéticos. Los valores CH50, que se obtienen con el suero así tratado son menores a CH50r cuando los vectores activan la cascada complementaria. Esos datos se muestran en porcentajes de CH50max. La fuerte activación complementaria que se observa con los complejos de pol i 1 i s ina-ADN , puede evitarse completamente por medio del polímero envolvente P6INF7. B) El propio péptido INFF7 en forma libre o ligada a polímeros, presenta una débil activación complementaria. Introducido en el complejo pol i 1 i s ina -ADN se elimina esa activación complementaria . C) Activación complementaria por medio de complejos PEI-ADN (N/P=8) en la presencia del copolímero P3Y45C. El complejo de ADN no protegido es un fuerte activador del sistema complementario. El copolímero P3YE5C reduce la activación complementaria dependiendo de la cantidad utilizada de 'copolímero, lo conduce sin embargo en la zona estudiada a una protección incompleta. D) Por el contrario el copolímero P6YE5C ya en cantidades adicionadas pequeñas completamente de la activación complementaria. Ejemplo 5 Prueba de lísis de eritrocitos Las pruebas realizadas sirven para estudiar la capacidad de romper por lisis las membranas naturales de los péptidos dependiendo del pH . Los eritrocitos utilizados en este ejemplo se obtienen de la siguiente manera: se extraen 10 ml de sangre fresca a voluntarios e inmediatamente se toma esa sangre en 10 -mi de una solución Alseveres (Whaley 1985; Plank et al., 1996) . Alicuotas de sendos 3 1 se lavan 3 veces con el amortiguador correspondientes (sendos 40 ml de citrato o HBS) (después de la adición del amortiguador y agitación, centrifugación a 2500 x g y desecho del residuo superior) . La concentración de los eritrocitos se determino con un "coeficiente de extinción" de 2.394 x 10~8 ml/ células a 541 nm . Para introducir los coeficientes de extinción se determina el número de células en una alícuota con una cámara de Neubauer y subsecuentemente se determina la extensión de esa solución después de la adición 1 µl de Tritón X-100 al 1% a 541 n .
En una placa de 96 pozos se introdujeron en la columna 1 1NF7 o INF7 acoplado con copolímero (P31IN7) en 150 µl ce citrato de sodio 10 mM oH 5 /NaCl 150 mM o en amortiguador HBS (habitualmente 45 µmol de péptido) . En todos los demás pozos se introducen sendos 50 µl de amortiguador (citrato o HBS) . 100 µl se transfirieren de la columna l a la 2 con una pipeta de varios canales, y con esta se mezclan, 100 µl se transfieren de la columna 2 a la columna 3, etc. Los otros 100 µl de la columna 11 se desechan, en la columna 12 se encuentra solo amortiguador. La serie de disoluciones al 1.5 resultante se diluye con 50 µl de amortiguador (citrato o HBS) hasta 100 µl. A esto se agregan sendos 3 x 106 eritrocitos humanos, las placas se tapan con parafina y se agita en un incubador agitador (Incubator Shaker Series 25; New Brunswick Cientific Co.; NJ, Estados Unidos) . Durante 1 hora a 37° C. Después de esto se centrifugan las placas a 2500 x g, sendos 150 µl del residuo superior se transfiere a una placa de 96 pozos con piso plano y se mide la hemoglobina liberada a 410 nm cn un lector de placas ELISA. Se determina un 100% de lisis por medio de la adición de lµl de Tritón X-100 al 1% a los pozos individuales de la columna 12 (antes de la transferencia a la placa de piso plano) , una lisis del 0% se determina en las muestras de la columna 12 sin tratamiento. El resultado de la prueba de lisis de eritrocitos se representa en la figura 5; el péptido INF7 muestra una alta actividad especifica del pH .
De la síntesis del copolímero P3INF7 después de la separación cromatográfica (Superdex 75, Pharmacia) se obtienen cuatro fracciones (peso molecular decreciente de 1 a 4) . De estas mostraron las fracciones 2 y 3 una mayor actividad de lísis frente al péptido libre INF7. En todos los casos la actividad 'es fuertemente dependiente del pH, esto es no se presenta lisis en el caso de pH neutro (no se mué s t ra ) . E j emplo 6 Determinación del tamaño de los complejos de ADN por medio de dispersión de luz dinámica y de un microscopio electrónico Preparación de pol icomple j os de PEI-ADN y aplicación de la envoltura polimérica: Sendos 40 µg de ADN (pMCMVLuc) en 333 µl de HEPES 20 mM pH 7.4 se agregan con una pipeta a 41.7 µg de PEÍ (25 kD, Aldrich) en 333 µl HEPES pH 7.4 y se mezclan. Después de 10-15 minutos de incubación se agrega 0, 0.5, 1, 1.5, 2 o 3 equivalentes de carga (en relación a la carga del ADN utilizado) de los polímeros P3YE5C o P6YE5C en sendos 33 µl PES (o 0, 1, 2, 3, y 5 equivalentes en un segundo experimento) . Esto corresponde a una cantidad, en relación al péptido YE5C de 0, 152, 303, 455, 606 o 909 pmol de polímero por µg de ADN. Complejos de DOTAP /Colé sterol -ADN se preparan a partir de liposomas de DOTAP/colesterol (1:1 mol/mol) -liposomas en 330 µl de HEPES 20mM pH 7.4 y ADN en el mismo volumen con una proporción de carga de 5. Los 1 ipocomple j os se incuban con 0, 1,2,3 y 5 equivalentes del copolímero P3YE5C en 330 µl del amortiguador. La concentración final de ADN en el complejo es de 10 µg/ml. El tamaño del complejo de ADN se determino por un lado por medio de difusión de luz dinámica (Zetamaster 3000, Malvern Instruments) inmediatamente después de la adición del polímero y después en diferentes momentos durante varias horas, por otro lado con un microscopio electrónico como lo describen Erbacher et al., 1998 y Eberacher et al., 1999. La figura 6 muestra las tomas con el microscopio electrónico de los complejos PEI-ADN (N/P=8) en la presencia del copolímero p3YE5C. A) En presencia de un equivalente de carga (en relación a las cargas del ADN utilizado) del copolímero. El tamaño de partícula fue de 20 a 30 nm. B) En la presencia de dos equivalentes de carga del copolímero. La mayoría de las partículas presentan tamaños de aproximadamente 20 nm. Estos son complejos monomoleculares de ADN, esto es una molécula de plásmido empacada en una partícula. C) En la presencia de 1.5 equivalentes de carga del copolímero después de la adición de BSA a una concentración final de- 1 mg/ml de incubación durante la noche. Los complejos de ADN protegidos con copolímeros permanecen estables y no se aglomeran, contrariamente a los complejos PEI-ADN, que bajo esas condiciones se precipitan inmediatamente (esto no se mués tra) . Ejemplo 7 Determinación del potencial Zeta de complejos de ADN En las mismas muestras que en el ejemplo 6 se determinaron con los potenciales zeta con el aparato de Malvern, ajustándose los parámetros índice de refracción, la viscosidad y la constate dieléctica a los valores del agua desionizada, lo que solo es válida como aproxi ción. La figura 7a muestra el potencial zeta de complejos PEÍ y DOTAP /coles te-rol -ADN dependiendo de la. cantidad utilizada de copolímero. Esto muestra que el copolímero se enlaza a los complejos de ADN y compensa o reduce su carga electrostática. La figura 7B mue-stra el potencial Zeta de complejos purificados de PEI-ADN. La separación del PEÍ en seco se realiza como se describe en el ejemplo 4B. De la solución cepa de PEI-ADN, que es resultado de la purificación se toman alicuotas que corresponden a una cantidad de ADN de sendos µg, y se diluyen con HEPES 20mM pH 7.4 a sendos 666 µl. Las suspensiones resultantes de PEI-ADN se purificaron con soluciones de P3YE5C en sendos 333 µl de HEPES 20 M pH 7.4 y se mezclaron con pipeta. Las soluciones de P3YE5C contienen cantidades poliméricas correspondientes a 1, 2, 3 y 5equivalent es de carga en relación a la cantidad utilizada de ADN. Los potenciales zeta se determinan como se describe en el e j emplo 7A . Ejemplo 8 Preparación de complejos de ADN y transfecciones Para los experimentos de cultivo celular y transfecciones realizados en los siguientes ejemplos, si no se indica otra cosa, se utilizan los siguientes materiales y métodos: a) Trasferencia genética en un cultivo celular en una placa de 96 pozos Un día antes de la transfección se inocularon células adherentes en placas de piso plano en una proporción de 20,000-30,000 células por pozo (dependiendo de la tasa de división de las células, durante la transfección debe ser la confluencia aproximadamente 70-80%) . Antes de la transfección se extrae el medio.
Para la transfección se agregan 150 µl de medio sobre las células y entonces se agregan 50 µl de complejo de ADN. b) Composición de los complejos de ADN: preferentemente una concentración final de 1 µg/pozo; calculo para una cantidad correspondiente a 1.2 veces; 20 µl de volumen por componente (ADN, PEÍ, polímero) . Finalmente se utilizan 50 µl de complejo de ADN para la transfeccion: Amortiguador: HEPES 20 mM pH 7.4/ NaCl 150 . Los volúmenes utilizados de amortiguador permanecen constantes. Para el caso en el cual se requiera complejo de ADN para 96 pruebas individuales, se realiza el calculo ventajosamente de tal manera como si se fueran a realizar 100 pruebas: por ejemplo ADN: 1 µG X 100 X 1.2 = 120 µG EN 20 X 100 µL HBS = 2 ml de volumen total. Polietilenimina (PPEI): Para obtener una proporción N/P de 8 se calcula de acuerdo con la siguiente fórmula (µgPEI) 330 N/P= x 43 (µgADN) (µgPEI) 330 8 = x 43 (120) de tal forma que se requieren 125.09 µg de PEÍ y esto es en 20 x 100 µl = 2 ml HBS. Polímero envolvente: Si por ejemplo, para la cantidad dada de ADN y PEÍ se quiere utilizar el polímero envolvente en una cantidad d 2 equivalentes de carga (en relación al ADN) entonces se calcula de acuerdo con la siguiente formula: (µgADN) equivalente de carga µl (polímero envolvente) = 1000 x x 330 c(pol. Env. [/imol/ml]) el volumen necesario de polímero envolvente en el caso de una concentración c de 11.1 µmol /ml seria 120 2 µl (polímero envolvente) = 1000 x x = 65.5µl, 331 11.1 que igualmente se diluye hasta 2 ml con HBS. Esto es un ejemplo para 100 pruebas de 1 µg de ADN cada uno. Habitualmente se realizan aproximadamente 5 pruebas cada vez y por ejemplo se estudian proporciones N/p DE 4,5,6,7,8 con sendos 0,1,2,3 equivalentes de carga de polímero envolvente. c) Mezcla de los complejos de ADN: Después de la preparación de las pre-disoluciones necesarias, se agrega el ADN al PEÍ en un vórtice. Después de 15 minutos se agrega el polímero envolvente al complejo PEI-ADN previamente preparado, también en un vórtice. Después de otros 30 minutos se agregan sendos 50 µl de complejos de ADN a las células, que se encuentran en sendos 150 µl de medio . Los recipientes usados se seleccionan de acuerdo con el volumen total calculado. En el caso anterior se coloca el PEÍ ventajosamente en un tubo de polipropileno de 14 ml por ejemplo Falcon 2059), los otros dos componentes en tubos de 6 ml (por ejemplo Falcon 2063) . Para las pruebas individuales en placas de 96 pozos también pueden ser mezclados los componentes en placas de 96 pozos. Cuando el volumen total final del complejo de ADN es de 1-1.5 ml, son adecuados los tubos de Eppendorf. Para mezclar en vez de usar el vórtice puede pipetearse repetidamente usarse la micropipeta. Calculo para placas de 3 cm (placas de 6 pozos ) : Para placas de 3 cm (plaza de 6 pozos) se utilizan ventajosamente cantidades de 2 a 5 µg de ADN, utilizando un volumen de cada componente de aproximadamente 100 µl, realizándose el calculo análogamente a lo anterior. En una placa de 12 pozos se utilizan ventajosamente cantidades de aproximadamente µg de ADN por prueba. La figura 8 muestra esquemáticamente la formulación de complejos de ADN: preferentemente se incuba el policatión con ADN de plásmido, lo que conduce a un complejo de ADN con carga positiva (por ejemplo PEÍ, N/P= 8) . Entonces se agrega copolímero cargado negativamente, los que se enlazan electrostáticamente al complejo previamente formado. El copolímero puede estar modificado con ligandos de receptor, lo que se simboliza por medio de asteriscos (a la derecha ) . d) Amortiguador de substrato de luciferina Como amortiguador de substrato de luciferina se utiliza una mezcla de diet iotrei tol 60 mM, sulfato de magnesio 10 mM, ATP 1 mM , D- (-) -lucí fer ina 30 µM, en amortiguador de gl ici lo-gl icina 25 mM pH 7.8. e) Determinación de las proteínas en los lizados celulares El contenido de proteínas de lizados se determina con la prueba Bio-rad Protein Assay (firma Bio-Ra) : a 10 µl (o 5 µl) del lizado se le agregaron 150 µl /o 155 µl) de agua destilada y 40 µl de concentrado de colorante para el Bio-Rad Protein Assay en un pozo de una placa transparente de 96 pozos (tipo "fondo plano - fíat bottom", firma Nunc, Dinamarca) y se miden la absorción a 630 nm con el rector de absorbencia "Biolumin 690" y el programa de computadora "Xperiment" (ambos de la firma Molecular Dynamics; Estados Unidos) . Como curva de calibración se miden las concentraciones de 50, 33.3, 22.3, 15, 9.9, 6.6, 4.4, 2.9, 2.0, 1.3, 0.9 y 0 ng BSA/µl . . l úmina de suero bovino (BSA) se compara como el estándar II para la prueba Bio-Rad Proteína Assay.
Con esto pudo realizarse una determinación en pH de luciferasa por mg de proteína. Ejemplo 9 Transferencia genética en células K562 con complejos de PEI(25 kD)-ADN en la presencia y en la ausencia del copolímero P3YE5C Se cultivan células K562 (ATCC CCL 243) un medio RPMI-1640 bajo la adición de 10% de FCS, 100 unidades/ml de penicilina, 100 µg/ml de estreptomicina y glutamina 2mM a 37 °C en una atmósfera de C02 al 5%. Las células fueron mezcladas en la noche anterior a la transfección con des feroxamina hasta una concentración final de 10 µM. Directamente antes de la transfección se cambio el medio. Sendas 50,000 células en sendos 160 µl del medio se colocaron en los pozos de una placa con 96 pozos . Se preparó t rans fer r ina- PE I (hTf-PEI 25 kD) en lo esencial como lo describen Kircheis et al (Kircheis et al., 1997) por medio de aminación reductiva. Se obtiene un producto que en promedio tiene acoplada 1.7 moléculas de transferrina por molécula PEÍ .
En una prueba previa se determina la composición de pol icomple j os hTf-PEI, que de una alta transfección y con la cual pueda determinarse una influencia clara sobre el ligando de receptor. 32.4 µg hTf-PEI (los datos en cantidades se refieren a hTf) en 600 µl HBS se purifican con 36 µg PEIU (25 kDS9 en 600 µl HBS. A esta mezcla se le agregan con pipeta 40 µg de ADN (pCMVLuc) en 600 µl de HBS y se mezclan. Sendos 270 µl de la solución resultante se agregan después de 15 minutos a sendos 90 µl de las soluciones de polímeros P3YE5C en HBS o HBS únicamente. Esas soluciones contienen cantidades de polímeros que contienen 0(0.5/1/1.5/2/3 equivalentes de carga de la carga del ADN utilizado. Igualmente se producen complejos de ADN sin hTf con cantidades equivalentes de PEÍ (40 µg ADN + 42 µg PEÍ + polímero envolvente) . Sendos 60 µl de las mezclas resultantes (corresponde a una cantidad de sendos 1 µg de ADN /pozo) se colocan en 5 pozos de una placa de 96 pozos con piso redondo y se agregan 50,000 K562 en sendos 160 µl medio RPMI . Después de 24 horas las células se sedimentan por medio de centrifugación, el residuo superior se retira por medio de aspiración y se agregan sendos 100 µl de amortiguador de lisis (Tris 250mM pH 7.8; 0.1% Tritón X-100) . Después de 15 minutos de incubación se mezcla con pipeta y muestras de 10 µl cada una se transfieren en una placa negra (Costar) para la prueba de luciferasa en el formato de placa de 96 pozos y se agregaron sendos 100 µl de amortiguador de substrato de luciferina. La medición de la emisión de luz resultante se realiza por medio el contador de centelleo y luminiscencia de microplacas "Top Count" (Firma Canberra -Packard, Dreieich) . El tiempo de medición es de 12 segundos, el tiempo de procesamiento de la medición es de 10 minutos, y se obtienen automáticamente valores básicos. Como estándares se miden bajo las mismas condiciones 100, 50, 25, 12.6, 6.25, 3.13, 1.57, 0.78, 0.39, 0.2, 0.1, 0.05, 0.025, 0.013, 0.007 y 0 ng de luciferasa (Boehringer Mannheim) en sendos 10 µl de amortiguador de lisis (= serie doble de disoluciones) y a partir de esto se obtiene una curva de calibración. La figura 9 muestra el resultado de los experimentos de transferencia genética con complejos PEI-ADN' (N/P=8) en células K562 en la presencia y ausencia de transferrina como ligando de receptor utilizando el copolímero P3YE5C. El copólímero no interfiere con la transferencia genética e inclusive la aumenta cuando hay un ligando de receptor en el complejo de ADN. Se muestra la expresión del gen reportero o indicador luciferasa en relación a la cantidad total en el extracto celular (valores medios y desviaciones estándar en pruebas realizadas por triplicado) . Ejemplo 10 a) Transfección de la familia celular del cáncer mamario MDA-MB435S con complejos de pol i 11 s i na -ADN en la presencia o ausencia del polímero envolvente P3INF7 Células MDA-MB435S (ATCC 45526; familia celular del cáncer mamario humano) se cultivan en medio DMEM utilizando 10% de FCS, 100 unidades/ ml de penicilina, 100 µg/ml de estreptomicina y 2 mM glutamina a 37°C en una atmósfera de C02 al 5%. En la noche anterior a la transfección las células se colocan en una proporción de 20,000 células por pozo en una placa de 96 pozos (piso plano) . Los- complejos de ADN se preparan de la siguiente manera: Cálculo para un pozo: La cantidad que se desea obtener es 1 µg ADN por pozo, 4 µg P1170 en un volumen total de 60 µl HBS. Esas cantidades se multiplican por 1.2. Los complejos de ADN se mezclan como se indica en la siguiente tabla, adicionándose primero ADN a polilisina y después de 15 minutos al polímero P3INF7 o al amortiguador. Las pruebas se realizaron por triplicado. Se agregan sendos 60 µl de complejos de ADN a las células, y se recibe con 150 µl de medio. Después de 4 horas se cambia el medio, después de 24 horas se lava con PBS y la adición de 100 µl de amortiguador de lisis de la prueba de luciferasa y se realiza la prueba de proteína como se describe en el ejemplo 9.
La figura 10A muestra los experimentos de transferencia genética con complejos de polilisina-ADN en la familia celular del cáncer mamario MDA-MB435S en la presencia y la ausencia del copolímero P3INF7. En la presencia del copolímero no se presenta ninguna expresión del gen reportero que pueda ser medida. La actividad del copolímero dependiente del pH que destruye la membrana y por lo tanto es endosomolí t ica provoca una. eficiente transferencia genética. 5 nmol o 10 nmol de P2INF7 se refieren a la cantidad utilizada del péptido INF7 unido al pol imero . b) Transfección de la familia celular del cáncer mamario MDA-MB435S con complejos de pol i 1 i s ina -ADN en la presencia y ausencia del polímero envolvente P3INF7 En otra serie de pruebas con células MDA-MB435S se estudio la eficiencia de la transfección por medio de complejos de ADN-pol i 1 i s ina en la presencia y ausencia del polímero envolvente P3INF7 en el caso de diferentes proporciones de carga pL/ADN. Los resultados de esas pruebas se representan en la figura 10B .
E j emplo 11 Lipofección en la presencia del polímero envolvente (figura 11) Células NIH3T3 (ARTCC CRL 1658) se cultivan en un medio DMEM utilizando 10% de DCS, 100 unidades /ml de penicilina, 100 µg/ml de e s t ropt omicina y 2 mM de glutamina a 37° C en una atmósfera de C02 al 5%. En la noche anterior a la transfección en placas de 6 pozos se colocó una densidad de 500,000 células por pozo. Preparación de complejos de ADN: 16 µg de ADN en 240 µl de HEPES 20 mM pH 7,4 se mezclan en una solución de 242 nmol DOTAP/cole sterol - 1 iposomas en 240 µl del mismo amortiguador. Esto da una proporción de carga (+/-) de 5. 210 µl de la solución resultante se agregaron con pipeta a 105 µl de una solución, que contiene 6.36 nomol del polímero P3YE5C (en relación a la fracción de péptido YE5C; esto corresponde a 3 equivalentes de carga de ADN) . Para la prueba de control se vierten con pipeta 210 µl DOTAP/colesterol-ADN a 105 µl HEPES 20 mM pH 7.4. Sendos 90 µl del complejo de ADN resultante se agregan a las células, que se encuentran en 800 µl del medio fresco; esto corresponde a 2 µg ADN por pozo. Las pruebas fueron realizadas por triplicado. De igual manera se realiza la prueba con Lipofectamine® en vez de DOTAP/colesterol . En este caso se utiliza una cantidad de 1 ipo fect amina (DOSPA) , que conduce a una proporción de carga de 7 ( + /-) • 30 minutos después de la adición de los complejos de ADN se agregan a las células sendos 1 ml de medio fresco, después de otras 3 horas se agregan otros 2 ml . El medio no fue cambiado. 22 horas después de la adición del complejo se lavan las células con PBS y se lizan en 500 µl de amortiguador de lisis. Alicuotas del lizado celular se utilizan en la prueba de luciferasa y para la detección de proteínas . La figura 11 muestra el resultado de la lipofección en células NIH3TY3 en la presencia y ausencia del copolímero P3YE5C. Ni la transfección con DOTAP/colesterol-ADN ni aquella con 1 ipof ect amina se reduce significantemente (3 equivalentes de carga del copolímero; DOTAP/colesterol-ADN tiene en este composición un potencial Zeta neutro, ver figura 7A. ) . E j emplo 12 a) Transfección de células HepG2 con DOTAP/colesterol-ADN y ' PEI-ADN en la presencia y ausencia de P6YE5C Células HepG2 (ATCC HB 8065) se cultivan en medio DMEM bajo la adición del 10% de FCS, 100 unidades/ml de penicilina, 100 µg/ml estreptomicina y 2 mM glutamina a 37° C en una atmósfera de C02 al 5%. Dos días después de la transfección se colocaron las células en placas de 6 pozos con una densidad de 500,000 células por pozo. La transfección con DOTAP/colesterol se realizo exactamente como se describe para las células NIH3T3, utilizándose esta vez polímero P6YE5C. Además se usaron 7 µg de ADN en 105 µl amortiguador HEPES a 7.3 µg PEÍ 25 kD disuelto en el mismo volumen. Después de 15 minutos de incubación se agrega esta solución con pipeta a 105 µl de una solución del polímero P6YE5C, la cual contenía PYE5C con 3 equivalentes de carga de ADN. Sendos 90 µl de esa solución se agregan a las células. Las pruebas se realizan por triplicado. La figura 12 muestra la transferencia genética en las células HepG2 en la presencia y ausencia del copolímero P6YE5C (denominada en la figura como P6) . La transfección por medio de DOTAP/colesterol-ADN no se inhibe de manera significante. La transfección por medio de complejos PEI-ADN se reduce (3 equivalentes de carga del copolímero ) . Ejemplo 13 Transfección de células HepG2 con complejos PEI-ADN en la presencia de diferentes cantidades de P3YE5C o P6YE5C en el caso de diferentes proporciones de carga Los complejos se preparan en HEPES 20 M pH 7.4, como se muestra en el ejemplo 14, en el cual se utilizan complejos no purificados y antes de la adición de las células se ajusta una concentración de 5% de glucosa. Las pruebas cuyos resultados están representados en la figura 13, se realizan por triplicado, las columnas vacías representan la desviación estándar. Se demostró que los copolímeros envolventes con una mayor proporción de carga aumentan la eficiencia de la transfección. E j emplo 14 Transfecciones de células K-562, HepG2 y NIH3T3 Los complejos de ADN-PEI se preparan de la siguiente manera: los pol icomple j os (N/P= 8) se preparan como soluciones cepa en HEPS 20 mM pH 7.4, en la cual cada componente (ADN, policatión, copolímero) se dispersa en un mismo volumen, de tal forma que se obtiene una concentración final de 1 µg de ADN por cada 50 µl, que corresponde a la cantidad de células colocada en cada pozo de (en el caso de complejos purificados se agregan igualmente las mismas cantidades de complejo de ADN en el mismo volumen de amortiguador) . Primero se agrega el ADN al policatión bajo un vórtice suave o mezclado con una pipeta, después de 15 minutos se agregan los copolímeros P3YE5C o P6YE5C; después de otros 30 minutos o más se aplican los complejos sobre las células. En el caso del uso de complejos purificados, la purificación se realiza de la siguiente manera: soluciones cepa de complejos PEI-ADN (N/P=8; 100 µg ADN por ml en HEPES 20 mM pH 7.4) se centrifugan a través de membranas Centricon 100 (Millipore) 4 x 15 minutos a 500 g en un rotor Beckman JA-20 con un ángulo fijo. Entre centrifugaciones se diluyen las soluciones otra vez a las concentraciones originales. Teniéndose precaución de no rebasar la concentración de 500 µg de ADN por ml . La última centrifugación da complejos de 300-500 µg de ADN por ml . La concentración de ADN se determina por medio de su absorción a 260 nm (1 OD26o=0.45 µg por ml para dsAND en un complejo PEI-ADN, determinado en una disolución estándar de un complejo de ADN con un contenido de ADN conocido) . La cantidad de PEÍ libre no asociado al ADN se determina en los filtrados reunidos por medio de ensayo de ácido trinit roben zosul fóni co (Snyder y Sonocinski, 1975) . La figura 14 muestra la dependencia de la eficiencia de transfección de una cantidad de P3Y45C y P6YE5C, de la purificación de complejos por medio de ultrafiltración (no purificado: columnas obscuras; purificada: columnas rayadas) y en la presencia de sal durante o después de la formación de complejos (para los complejos purificados) (columnas obscuras: NaCl 150 mM; columnas grises: ninguna sal) . (A) : células K562; (B) : células HepG2; (C) : células NIH-3T3. E j emplo 15 Transferencia genética intravenosa i n vi vo a) Controles (PEI-ADN, N/P= 8) 150 µg ADN (pCLuc) en 337.5 µl HEPES 20 mM pH 7.4 se agregaron con pipeta a 156.4 µl (25 kD, Aldrich) en el mismo volumen de amortiguador HEPES. Después de 15 minutos se agregaron 75 µl de glucosa al 50%. De esta solución se inyectaron 100 µl en la vena de la cola de ratones (correspondiendo a una dosis de 20 µg de ADN por animal) . b) Controles (DOTAP/colesterol-ADN; proporción de carga +/- =5) : Se producen liposomas de DOTAP-col es t erol de acuerdo con las indicaciones estándar (Barron et al., 1998) . En esta caso se producen las liposomas con una proporción DOTAP a colesterol de 1:1 y una concentración final de DOTAP de 5 mM en glucosa al 5%. 130 µg de ADN en 91.1 µl de HEPES 20 mM pH 7.4 se agregan a 393.5 µl de suspensión de liposomas. Después de 15 minutos se agregaron 65 µl de glucosa al 50%. De esta solución se inyectan sendos 100 µl en la vena de la cola de ratones (correspondiendo a una dosis de 20 µg de ADN por animal) . c) PEI-ADN (N/P=8) con envoltura de copol i er o : 150 µg ADN en 2475 µl se agregan a 156.4 µg PEÍ (25 kD ( ) en el mismo volumen bajo un vórtice. Después de 15 minutos se agregan 3 equivalente (en relación a las cargas de la cantidad utilizada de ADN) al polímero P3YE5C en 2475 µl de amortiguador HEPES bajo un vórtice. Después de otros 30 minutos se concentran los complejos de ADN por medio de la centrifugación en tubos Centricon 30 hasta una concentración de ADN de 454 µg/ml. Esa solución entonces se llevo a una concentración final de 200 µg de ADN pr ml y 5% de glucosa por medio de la adición de 50% de glucosa y HEPES 20 mM 7.4. De esta solución se inyectan sendos 100 µl en la vena de la cola de ratones (correspondiendo a una dosis de 20 µg ADN por animal ) . d) DOTAP/colesterol-ADN (5:1) con envolvente de copolímero: 393.9 µl de suspensión de liposomas se agregan directamente con una pipeta de 130 µg ADN EN 65.3 µL de agua. Después de 15 minutos se agregan 3 equivalentes de . carga de P3YE5C en 216.9 µl de amortiguador HEPES y después de otros 30 minutos 75 µl de glucosa al 5%. De esa solución se inyectan sendos 115.5 µl en la vena de la cola de ratones (correspondiendo a una dosis de 20 µg ADN por anima 1 ) . La figura 15 muestra los resultados de los experimentos de transferencia genética in vivo: complejos PEI-ADN o DOTAP/colesterol-ADN con o sin estar ligados al copolímero P3YE5C (3 equivalentes de carga) se inyectan en la vena de la cola de ratones (N=6) . Los animales son sacrificados 24 horas después de la inyección, y se determina la expresión del gen reportero en los órganos. La actividad más alta se mide siempre en el punto de inyección, con PEI-ADN-copolímero se presenta una significante expresión del gen reportero en los pulmones y en el corazón, mientras que la transferencia genética en los pulmones por medio de DOTAP/colesterol-ADN se inhibe con el uso del copolímero. E j emplo 16 Estabilización estérica de complejo PEI-ADN Se preparan complejos de PEI-ADN exactamente como se describe en el ejemplo 6 (PEI-ADN N/P=8, copolímero P3YE5C o P6YE5C con 0/1, 5/3 equivalentes de carga) . El tamaño del complejo se determina por medio de difusión de luz dinámica y fue de 20 a 30 nm. Después de esto se agrega NaCl 5 mM hasta una concent ación final de 150 m . El PEI-ADN sin copolímero se aglomera inmediatamente (después de 5 minutos se puede medir una población de partículas mayores a 500 nm: después de 15 minutos la mayoría de las partículas eran mayores a 100 nm; durante la noche se precipitan los complejos en la solución) . En la presencia de P3YE5C o P6YE5C (1.5 o 3 equivalentes de carga) . Permanece estable el tamaño de las partículas cuando menos durante 3 días. Igualmente la adición de BSA hasta una concentración final de 2 mg/ml conduce a la precipitación inmediata de PEI-ADN. En la presencia de P3YE5C o P6YE5C (1.5 equivalentes de carga o más) permanece constante el tamaño de partícula cuando menos durante 24 horas (ver también la figura 6) . Ej emplo 17 Estudios de transferencia genética con vectores PEI-ADN protegidos con copolímero i n vi vo a) PEYE5C-PEI-ADN en un modelo de linfoma de célula T en ratones DBA2 En el día 0 se inyectaron 200,000 células tumorales en ratones (de 5 semanas de edad) int radé rmi camente como lo describe Kruger et al., 1994. El día 21 se inyectaron los animales a través de la vena de la cola con sendos 200 µl de complejo de ADN, que contenían sendos 50 µg de ADN (p55Pcmv-ibs-LUC+, proporcionado por Dr . Andrew Baker, Bayer Corp., Estados Unidos) . Complejo de ADN: ADN (250 µg en 700 µl HEPES 20 mM pH 7.4) se mezcla con pipeta con PEÍ (260.6 µg en 700 µL del mismo amortiguador) . Después de 15 minutos de incubación se agregan con pipeta los complejos de ADN a 400 µl de solución polimérica envolvente, que contiene P3YE5C con 5 equivalentes de carga. Después de otros 15 minutos se agregan 200 µl de glucosa al 50% (en agua) . Los complejos por medio de ultrafiltración como se describe en el ejemplo 4b se liberan del PEÍ en exceso. La suspensión de vector finalmente se diluye a un volumen de 1 ml con HEPES 20mM. Los animales de prueba son inyectados a través de la vena de la cola con sendos 200 µl. 24 horas después son sacrificados los animales y se determina la expresión del gen reportero en los órganos: los animales se narcotizan completamente por medio de la inyección intraperitoneal de 100 mg de ketamina y 5 mg de xilazina por kg de peso corporal. Después de esto se abre un orificio en el vientre y se perfunden 20 ml de solución isotónica de cloruro de sodio a través de la vena ca va ca uda l i s . Los órganos se transfieren a tubos de 2 ml con tapa roscada, que contienen el amortiguador de lisis de 500 µl (9.1 % Tritón X-100 Tris-HCl 250 mM pH 7.8) y granulos de circonio (diámetro de 2.5 mm; Biospec Broducts; Bartlesille, Estados Unidos) . Los muestras de tejido se homogeneizan 2 x 20 seg con un agitador Mini-bead (Biospect Producto) . Sendos 50 µl de homogeneizado de tejido se utilizan en la prueba de luciferasa (equipo de prueba Promega Liciferasa Assay Kit); los resultados se representan en la figura 16. b) P6YE5C-PEI-ADN en ratones DBA2 Complejos de ADN: Sendos 350 µg de ADN en 420 µl HEPES 20 mM pH 7.4 se mezclan con sendos 364 µg PEÍ en el mismo volumen del mismo amortiguador. Después de 5 minutos. De incubación se agregan y mezclan ya sea 420 µl de HEPES 20 mM o P6YE5C con 3 equivalentes de carga, en 420 µl de HEPES pH 7.4. Finalmente se agregaron 140 µl de glucosa al 50% en agua. Sendos 200 µl (correspondientes a 50 µg de ADN) son inyectados a los animales (edad: 5 semanas) a través de la vena de la cola. La evaluación de las pruebas se realiza como se describe antes, con la excepción de que esta vez se utilizaron 750 µl de amortiguador de lisis del equipo de prueba Promega Luciferase Assay Kit para la homogenización de los órganos y de que para la prueba de luciferasa se utilizan sendos 20 µl de homogenizado de tejido. El resultado se representa en la figura 17. E j emplo 18 P6YE5C aumenta el transporte de complejos de ADN-PEI en el tumor (direccionamiento al tumor Tumor-target ing ) Primero se obtienen tumores, formados al inyectar subcutáneamente lxlO6 células de melanoma de murina M3 (ATCC no. CCL 53.1) en 100 µl de solución de Ringer a ratones DBA/2.
Para la preparación de policomplejos se forman complejos con 50 µg de AEN de pCMVLuc con PEÍ (25) (N/P=6) en 0.5x HBS. Los complejos se incuban entonces durante 20 minutos a la temperatura ambiente. En el caso del uso de copolímeros envolventes se agregaron 3 equivalentes de P6YE5C, utilizando la fórmula: Cantidad P6YE5C (µl) = [1000* (µg de ADN) * equivalente de carga de P6YE5C]/330*19.3; en donde el equivalente de carga es el (3) antes definido y 19.3 es la concentración en pM de la solución utilizada de P6YE5C. Para la administración del complejo se mezcla con 2.5% de glucosa y para la inyección in vivo se proporciona una solución isotónica. días después del implante del tumor son tratados los ratones, los tumores tienen un tamaño promedio de 15 mm x 15 mm. Cada vez se inyectaron 250 µl de policomplejo por ratón de forma exclusivamente intravenosa (en la vena lateral de la cola) . Se trataron dos grupos consistentes de 3 ratones, recibiendo el primer grupo complejos de ADN-PEI sin protección y el segundo grupo complejos recubiertos con P6YE5C. Después de 24 horas se sacrificaron los animales y se extrajeron los órganos (hígado, bazo, ríñones, corazón y pulmones) así como los tumores existentes. El posterior tratamiento de los órganos así como la medición de la actividad de luciferasa se realiza de la manera descrita en los ejemplos anteriores; el resultado de las pruebas se representa en la figura 18. Ejemplo 19 Estudios con biosensor de la interacción de los complejos de PEI-ADN y las partes constitutivas de suero humano Para estudiar la interacción de los complejos de ADN y las partes constitutivas del suero humano, se realizan mediciones de resonancia en las plasmonas superficiales (BIAcore, Uppsala, Suecia) . Suero complementario humano (Sigma, Deishofen, Alemania) se disuelve de acuerdo con las indicaciones del fabricante y se .acopla de manera covalente a un chip sensor "calidad investigación" (CM5) de acuerdo con el protocolo estándar (Johnsson et al. 1991) . Para eso después de a activación con N-(3-dimetilaminopropil) -N' -etil-carbodiimida/N-hidroxisuccinima de los grupos carboxilato en el chip sensor se aplico una disolución de suero automáticapve nte sobre el chip (100 µg/ml en acetato de sodio 10 m.M pH 4) . El éster de N-hidr oxi succinimida sin reaccionar se inactiva con etanolamina ÍM, pH 8.5 en agua. El procedimiento de inmovilización y los estudios de enlace se realizan a 25° C con HEPES 10 mM pH 7.4/cloruro de sodio 150 mM/ 3.4 mM EDTA/0.05% de tensoactivo P20 como amortiguador de flujo continuo a una tasa de flujo de 5 µl/min. Los complejos de ADN se producen en HEPES 209mM pH 7.4 con una concentración de ADN final de 10 µg/ml como se ha descrito. Directamente antes de la inyección en el chip sensor se aplica automáticamente sobre el aparato cloruro de sodio 150 mM, esto es al mezclar solución de cloruro de sodio 5M . La figura 19 muestra los análisis de interacción bioespecí fieos (BIAcore) de los pol icomplej os de PEÍ en la presencia de copolímeros con partes constitutivas de suero: complejos PEI-ADN (N/P=8), incubados con las cantidades descritas de copolímeros se inyectan dos veces en el transcurso de 4 minutos sobre el chip sensor (flecha), seguido por pasos de lavado, hasta que se estabilice la señal medida (tasa de flujo 5 µl/min) . El enlace en el chip sensor cargado de suero se muestra por una señal medida creciente (Unidades de resonancia, RU, eje y) . El eje del tiempo en todo el experimento (eje x) fue de 1200 segundos. A la izquierda complejos protegidos con P3YE5C, a la derecha complejos protegidos con P6YE5C (sobreposición de los sensogramas individuales) . Es clara la reducción de la interacción con el chip cargado de suero en el caso de una cantidad creciente de copolímero. La señal de carga de los complejos PEI-ADN "no recubiertos" ("0 equivalentes") no alcanza un nivel constante debido a la continua aglomeración sobre el chip sensor durante la inyección en el amortiguador que contiene sal.
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Claims (9)

  1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes, Reivindicaciones : 1. Copolímero cargado de la fórmula general I caracterizado porque R es un polímero anfifílico o un derivado homo- o hetero-bifuncional del mismo, y porque X es i) un aminoácido o un derivado de aminoácido, un péptido excepto policisteina, polihistidina, ácido poliasparagínico y ácido poliglitamínico, o un derivado de péptido o una espermina o derivado de espermina; o ii) en donde X es en donde a significa H o eventualmente alquilo con de 1 a 6 átomos de carbono eventualmente substituido por halógeno o dialquilamino; y en donde b, c y d son iguales o diferentes y significan alquileno con de 1 a 6 átomos de carbono eventualmente substituido por halógeno o dialquilamino; o iii) en donde X es
  2. X donde a significa H o eventualmente alquilo con de 1 a 6 átomos de carbono eventualmente substituido por halógeno o dialquilamino; y en donde b y c son iguales o diferentes y significan alquileno 1 a 6 átomos de carbono eventualmente substituido por halógeno o dialquilamino; o iv) en donde X es un compuesto aromático substituido con tres agrupaciones funcionales W1Y1Z1, teniendo W, Y y Z los significados antes dados : en donde W,Y,Z son iguales o diferentes radicales CO, NH, O o S o son una agrupación de enlace reactiva con SH, OH,
  3. NH o NH2; y en donde la molécula efectora E es un péptido o un derivado de péptido catiónico o aniónico o una esperamina o derivado de espermina o un glucosaminoglicano o un oligo/policat ion o un oligo/polianión; en donde m y n independientemente entre sí son 0.1 o 2; en donde p es preferentemente 3 a 20; y en donde 1 es 1 a 5, preferentemente 1. 2. Copolímero de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque el polímero anfifílico es un óxido de polialquileno. 3. Copolímero de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque X es un péptido cargado, exceptuando policis teína, polihistidina, ácido poliasparagínico y ácido poliglutamínico o un derivado péptido.
  4. 4. Copolímero de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, caracterizado E es un péptido cargado o un derivado péptido.
  5. 5. Copolímero de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque está acoplado un ligando para una célula eucariótica superior .
  6. 6. Complejo caracterizado porque contiene una o varias moléculas de ácido nucleico y uno o más copolímeros de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 5.
  7. 7. Complejo que contiene una o varias moléculas de ácido nucleico, condensado con moléculas lípidas orgánicas, policationicas o catiónicas, caracterizado porque en su superficie tiene un copolímero de la fórmula general I unido por medio de interacciones iónicas. 8. Complejo de acuerdo con la reivindicación 6 o 7, caracterizado porque contiene una molécula de ácido nucleico terapéuticamente efectiva. 9. Composición farmacéutica, caracterizada porque contiene un complejo de acuerdo con la reivindicación
  8. 8.
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