JP2003503318A - 細胞培養のための表面 - Google Patents
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Abstract
Description
着細胞が表面から脱離することを可能にする表面に関連し、それは様々な治療的
および美容組織工学/外科処置に使用され得る。
興の科学である。より具体的には、組織工学は、組織および/または器官を機能
的な状態に戻すための、損傷したおよび/または病的な組織の置換および/また
は復元(restoration)および/または修復(repair)に関連
する。例えば、そして制限のためでなく、組織工学は挫傷、または熱傷、または
静脈または糖尿病性潰瘍による組織の治癒の失敗の結果として起こる創傷を修復
するための皮膚移植片の供給に有用である。さらに、組織工学はまた、関節炎の
ような変性疾患による関節の置換;様々な環境要因(例えば喫煙、食事)および
/または動脈/心臓弁の置換を含む先天的な心疾患の結果としての損傷による冠
動脈の置換;臓器移植;消化性潰瘍の修復;骨粗鬆症のような疾患によって起こ
る骨組織の置換;神経筋疾患または傷害による損傷の結果としての筋肉および神
経の置換、および泌尿器科学の疾患を阻止するための膀胱材料の置換の間に実施
される。
問題の一部分のみをあらわす。多くの例で、培養中の細胞の増殖は主な障害では
ない。さらにより面倒な問題は、細胞/組織が治療される患者に組み込まれるよ
うに、適当なビヒクル(例えば、そして制限のためでなく、培養ウェア(cul
ture wear)、人工器官、移植片、三次元マトリックス支持体、細胞外
マトリックスタンパク質をコートした包帯剤(dressing)、包帯、硬膏
)を介する細胞/組織の転移である。置換組織の転移に適切なビヒクルは、それ
らが組織工学で有用である場合、ある必要条件を満たさなければならない。例え
ば、転移ビヒクルは任意で以下の特徴を有する; i)それらは細胞がしっかりと接着し得る表面を提供する; ii)それらは接着細胞が接着表面に妨害されずに増殖および***することを可
能にする; iii)適当な場合、それらは接着細胞の分化(または未分化)状態に影響を与
えない接着表面を提供する; iv)それらは細胞を滅菌および免疫学的に無症候性状態に維持する; v)それらは患者に対して最小限に毒性である; vi)それらは細菌またはウイルス性疾患を伝達しない;そして vii)それらは接着細胞が容易に脱離し、そして続いて置換、復元または修復
が必要な組織部位に侵入する表面を提供する。
され、そして前述の特徴を発現する細胞型のすぐれた例はケラチノサイトである
。
るが、他のものも調査された(1)。例えば、コラーゲン−グリコサミノグリカ
ン(C−GAG)基板に播種または沈着させ、そして熱傷に移植して培養代用皮
膚(CSS)を形成して、14−28日後に永続する皮膚組織に発展した(2)
。ケラチノサイトはまた、インビトロで、合成親水性ポリマー支持体上で成長し
得る(3)。ケラチノサイトは、ポリ(ヒドロキシエチルメタクリレート)支持
体上に移植され、そしてこれらは再構築されていない表皮および正常ヒト皮膚の
サイトケラチンパターンにおいて違いのない、改善した創傷床の治癒を示した(
4)。以前の研究が、どのようにカルボン酸含有プラズマコポリマーが7日間ケ
ラチノサイトの接着および増殖を促進するのか示した(5)。
膚創傷床モデルへの転移に対する影響も研究された(6)。Matrigel、
コラーゲンIおよびIVは、最初の接着を増強し、RGD、ビトロネクチン、フ
ィブロネクチン、および照射3T3線維芽細胞はしないことが見出された。細胞
の増殖はまた、matrigel、コラーゲンIおよびIV、および照射3T3
線維芽細胞上で積極的に影響される(最初の接着より低い程度であるが)ことが
見出された。後者の基板上で増殖するケラチノサイトは、単純なインビトロ創傷
床モデルへ転移する能力を維持していた。
った。例えば、分化した細胞型の研究に通常使用される線維芽細胞は、培養中で
かなりの多形質発現を維持し、そして比較的培養しやすい。対照的に、ケラチノ
サイトは通常、インビボで基底表皮層(ここでケラチノサイトは、下にある真皮
と接着している基底膜と接触している)から上部表皮層へ、上向きに移動しなが
らプログラムされた分化を受ける。後者の層で、ケラチノサイトは核を失い、そ
して最終分化を受ける。一旦ある分化のポイントを通過すると、それらは移動ま
たは増殖できず、そして主に皮膚のバリア機能を果たす。
利な条件には未熟な分化によって反応する。従って、課題は、理想的にはそれ自
身は分化を促進せず、そして理想的には適当な培地と共に、ケラチノサイトのよ
うな細胞を増殖する表現型に維持し得る表面を確立することである。そこでそれ
らは接着、そして続いてインビトロ創傷床モデルに転移することが可能である。
ある。現在調査されている製品および可能性のある治療は、一般的に3つのカテ
ゴリーに入る:表皮置換、真皮置換および代用皮膚である。
イトからなり、そして通常インビトロでコンフルエントになるまで増殖した自己
由来(患者自身の)上皮細胞を培養することを含む。「既成の」解決として非自
己由来のバージョンが利用可能であるが、非自己由来細胞が適合性である証拠は
ない。しかし、それらは生物学的包帯として作用し得る。これらの理由のために
、非自己由来の製品(EpiceltmおよびActiceltm)の臨床的成功は
、まちまちであった。調査中の別の製品、Laserskinは、ケラチノサイ
ト送達システムとしてヒアルロン酸を使用するが、当業者が使用する場合、その
キャリアを照射3T3線維芽細胞の層と共にプライムしてケラチノサイトの増殖
を促進する。他もまた、インタクトなシートを形成する前のケラチノサイト転移
のためのフィルムキャリアを調査している。
接着、増殖および新マトリックス産生のための、支持構造または埋め込まれたマ
トリックスを含む。Integratmは、シリコンで裏打ちしたシート上でコン
ドロイチン−6−硫酸と架橋したウシ真皮コラーゲンIの真皮成分を使用する。
線維芽細胞および表皮細胞と共に播種された改変体も検討中である。合成マトリ
ックスは3/4週後に分解し、そして分層メッシュ移植の前の新真皮形成を促進
する。Allodermtmは、ドナーの線維芽細胞(スクリーニングした皮膚バ
ンクドナー由来)を含む、凍結乾燥ヒト脱表皮化(de−epidermise
d)真皮である。Xenodermtmは、同様に、ブタ真皮を利用する。それは
マトリックスの創傷床への組み込みを可能にし、低い免疫原性を示し、そして宿
主細胞との再集合(re−population)を可能にする。他はまた、支
持体としてコラーゲンを基にしたポリマー、または合成マトリックスを、実験的
創傷に播種されないで(unseeded)埋め込まれた場合に細胞内への成長
を支持することが示された、ケラチノサイトおよび線維芽細胞の伝達のために開
発中である。
細胞と共に播種されたPGA/PLAマトリックスを利用する。4週後に埋め込
まれたマトリックスの完全な吸収が見られ、そして細胞はコラーゲンI−III
−VI、エラスチン、フィブロネクチン、およびデコリンを沈着させる。播種さ
れないバージョンは、移植片のつきを支持しなかった。この製品の利点は、ケラ
チノサイトと共に播種された場合、創傷の収縮を遅らせることができることであ
り、そして非コラーゲン性のマトリックスは免疫原性/BSE転移に関連する問
題を克服する。
イトのコンフルエントなシートと組み合わせる。真皮病変(lesion)にお
ける同種異系のケラチノサイトおよび線維芽細胞の長期生存率について疑問があ
るが、生存能力のある同種細胞が修復過程を促進し得る生物学的メディエーター
(例えば成長因子)を伝達し得ることが可能である。
材料を使用するもの以外)は、感染性薬剤を寄付供給源から治療される患者へ転
移させる可能性に悩むことが、当業者に明らかである。さらに、異種移植は依然
として、組織工学においてヒト組織の使用の代替として、一般社会による一般的
な受け入れが必要である。
異系の細胞の使用に関するいくつかの問題はまた完全に解決されていないが、創
傷修復に対する組織工学アプローチは、存在する治療に比べて有意な治療的有用
性を示すことに疑いはほとんどない。上記の記述から、ケラチノサイトは組織工
学で使用する組織の研究にすぐれたモデルシステムを提供することが明らかであ
る。しかし、組織工学が直面する最も重要な問題は、細胞/組織の培養および患
者への転移のために理想的なビヒクルの、全ての必要条件を満たし得る基板の供
給である。
着、成長および増殖を可能にするポリマーから製造、またはそれでコートされる
。多くの場合、その基板/ビヒクルが培養細胞/組織を埋め込む手段として使用
される場合、それと結合して使用される埋め込みマトリックスは生物分解性であ
り得る(第WO90/12603号を参照のこと)。さらに、細胞の接着および
増殖を促進する基板の処理は、上記分野で周知である。例えば第WO89/02
457号および第WO90/02145号は、細胞の接着を促進する表面の化学
的修飾を開示している。第WO89/02457号は、ポリテトラフルオロエチ
レン(Teflon(登録商標)tm)および他のフルオロカーボンポリマーの化
学的修飾およびその内皮細胞培養における使用に関連する。第WO90/021
45号は、細胞/組織培養に使用する様々な型の基板をコートするのに使用する
、中和されたパーフルオロ−3,6−ジオキサ−4−メチル−7−オクテンスル
ホニルフッ化物のコポリマーおよびモノマーテトラフルオロエチレンの使用を記
載している。
するための、プラズマ重合可能ガス(例えば、アセトン、メタノール、エチレン
オキシド)の使用を記載している。コートした表面は、増強されたフィブロネク
チン(細胞接着ポリペプチド)の結合を示し、そして従って処理表面への細胞の
接着を促進する。このように処理した表面は、生物学的移植片および細胞培養ウ
ェアのための品物を提供するのに有用である。典型的には、ポリエステル、ポリ
テトラフルオロエチレンまたはポリウレタンのような材料を、プラズマ重合ガス
でコートし、そして次いでフィブロネクチンと接触させる。フィブロネクチン吸
着表面は、コントロール表面と比べた場合、増強されたマウス3T3細胞の接着
を示す。
ン、電子、中性のもの(neutrals)(ラジカル、準安定のもの、基底お
よび励起状態の種)および電磁放射を含む、高度に反応性の化学的環境である。
減圧下でレジメが達成され得、ここで電子の温度はイオンおよび中性のものの温
度と実質的に異なる。このようなプラズマは、「コールド」または「非平衡」プ
ラズマと呼ばれる。そのような環境において、多くの揮発性有機化合物(ニート
、または他のガス(例えば、Ar)と共に)は、重合化してプラズマおよびその
放電の下流と接触して両方の表面をコートすることが示された(H.K.Yas
uda、Plasma Polymerisation、Academic P
ress、London、1985)。その有機化合物は、多くの場合「モノマ
ー」と呼ばれる。沈着物は多くの場合「プラズマポリマー」と呼ばれる。そのよ
うな重合の様式の利点は、以下のものを含む:超薄層のピンホールのないフィル
ム沈着;プラズマポリマーは広い範囲の基板に沈着し得る;その過程は溶媒を含
まず、そしてプラズマポリマーは夾雑物を含まない。
、プラズマポリマー沈着を開発した(5、7、8)。薄いポリマーフィルムは揮
発性有機化合物のプラズマから得ることができる(10-2mmbarの減圧下、
そして理想的には<100℃)。プラズマポリマー沈着において、一般的に出発
化合物またはイオン化ガスの広範囲のフラグメンテーションおよび広い範囲の得
られたフラグメントが存在し、または官能基が望ましくなく沈着に組み込まれる
。本発明者らは、低いプラズマ入力パワー(低いプラズマパワー/モノマー流速
比)を採用することによって、高い程度の官能基保持を有するフィルムを作るこ
とが可能であることを示した。そのような低いパワー/速度比の例は、2W/2
.0sccmである。しかし、他の比較的低い比が使用され得、そして当業者に
公知である。
ジエン)とアクリル酸の共重合は、得られたプラズマコポリマー(PCP)にお
ける表面官能基の濃度に対してある程度のコントロールを可能にする(7)。P
CPは、ジオメトリーに関係なくほとんどの表面に直接沈着し得、これはPCP
を、ガーゼおよび線維、ならびに細胞培養のためのプラスチックウェアのような
表面を処理するのに理想的にさせる。これは明らかに、PCPを臨床的適用のた
めに有用にする。ここで細胞は、創傷床または組織修復/復元の部位へ適用する
前に、PCPでコートした2次元または3次元支持体上で増殖し得る。
チノサイトを培養した。低いパワー/モノマー流速比の使用は、酸を含むモノマ
ー(この例ではアクリル酸)の酸性官能基が、プラズマ−ガスからプラズマポリ
マー/コポリマー沈着までほとんど完全に保存される(保持される)プラズマポ
リマー/コポリマーを産生する。これらの沈着は他の官能基(例えば、後プラズ
マ酸化によって起こるヒドロキシル基)を含むが、「高酸性官能基」と記載され
、プラズマガスからプラズマポリマーフィルムまでの高い程度の酸保持の程度を
反映する。「高酸性官能基」は、酸を含むモノマー/炭化水素の共重合化比に依
存する、プラズマポリマー/コポリマー中の酸性官能基の量(濃度/密度)をい
わない。
よび増殖するだけでなく、表面から脱離してそして創傷床モデルに転移する。こ
の方法でケラチノサイトの転移を促進する表面は、創傷治癒の分野で非常に有望
であることを示す。本発明者らは、これらの好ましい特徴を、本発明者らの処理
表面の高酸性官能基および細胞の脱離を促進する接着表面の性質に帰する。
およびより理想的には20%より多い表面酸性官能基の量を有する表面を含むよ
う意図される。そのパーセンテージは、この型の環境における炭素原子のパーセ
ントをいう。例えば、20%の酸性官能基は、プラズマポリマー中100個の炭
素中20個が酸性型環境にあることを意味する。
そして高酸性官能基を有する少なくとも1つの細胞培養表面が提供される。
より多い表面酸性官能基を含む表面に関連する。
業者に明らかである(5、7、10−12)。本発明者らは、低いプラズマパワ
ー/モノマー流速比における細胞培養表面のプラズマ重合が、ポリマーでコート
された表面における高酸性官能基の保持を生じることを見出した。100%のア
クリル酸で処理した細胞培養表面で培養された細胞は、増強された処理表面から
の脱離を示し、それによって脱上皮化(de−epidermised)真皮(
DED)のケラチノサイトの浸透を促進する。100%のアクリル酸から産生さ
れたプラズマポリマーは、細胞接着のために最適な酸性官能基の割合を含まない
かもしれない。しかし、アクリル酸と炭化水素のプラズマ共重合(例えば、そし
て制限のためでなく、1,7−オクタジエン)は、沈着過程に対してある程度の
コントロールを可能にし、およびケラチノサイトが接着、増殖、およびそれから
脱離する表面の供給を可能にする。典型的には、モノマーフロー中50%を超え
るアクリル酸で処理した細胞培養表面は、使用した酸の濃度に依存して、5−2
1%の間の酸性官能基を有するプラズマポリマー表面を産生する。例えば、10
0%のアクリル酸で処理した表面は、約21%の酸性表面官能基を産生する。
よび増殖し得る基板を提供する。好ましくは、上記表面は、上記細胞の成長およ
び増殖を未分化状態で促進する。あるいは、上記表面は、組織の型に依存して、
上記細胞の成長および増殖を分化状態において促進する。
胞に免疫反応を誘発せず、その結果これらは、患者に伝達された場合に、免疫反
応を引き起こさない。
を有し、そしてそのためそれに接着した細胞が患者に伝達される場合、好ましく
ない反応を誘発しない。
、そしてより好ましくはヒト由来の細胞とともに使用するのに適当である。
か1つと共に使用するのに適当である;ケラチノサイト;軟骨細胞;骨芽細胞;
内皮細胞。理想的には、上記細胞はケラチノサイトである。
ン酸官能基によって提供される。
5%、そしてより通常には5〜20%の間の表面酸性官能基である。より理想的
には、まだ上記表面酸性官能基は、20%より多い。理想的には上記酸性官能基
は、アクリル酸によって提供される。あるいは、上記酸性官能基は、プロピオン
酸によって提供される。
板を酸性モノマーのプラズマコポリマーでコートすることによって提供される。
例えば、そして制限のためでなく、アクリル酸および炭化水素、例えば、そして
制限のためでなく、1,7−オクタジエンである。理想的には、アクリル酸は、
50〜100%で提供され、そして1,7−オクタジエンはガスフィード中で0
〜50%で提供される。
たは慢性および/または軽度のおよび/または重度の皮膚創傷(静脈および糖尿
病性潰瘍を含む);および/または軟骨修復;および/または骨修復;および/
または筋肉修復;および/または神経修復;および/または結合組織修復;およ
び/または血管修復;および/または膀胱修復に対する適用の前に、コートした
基板上で細胞が増殖し得る臨床的適用に有用であることが、当業者に明らかであ
る。本発明はまた、組織工学ビヒクルの不可欠の部分として上記表面を提供する
ことによって、任意の前述の細胞培養表面を提供する。
こで上記ビヒクルは、上記表面が高酸性官能基を有することで特徴付けられる、
少なくとも1つの細胞が可逆的に接着し得る細胞培養表面と一体化、またはそれ
に適用される。
あらゆる構造として定義され得る。例えば、そして制限のためでなく、人工器官
、移植片、マトリックス、ステント、細胞培養皿、ガーゼ、包帯、硬膏、生物分
解性マトリックスおよびポリマーフィルム。
を含む治療的ビヒクルが提供される。ここで上記治療的ビヒクルは、治療的組織
工学を必要とする患者に適用および/または埋め込むために適合させられる。
に細胞が接着した本発明による表面を含むマトリックス材料(例えば、そして制
限のためでなく、合成または天然に存在する、および長期間有効な、または生物
分解性のマトリックス材料)を含む治療的ビヒクルが提供される。
型のいずれか1つと共に使用するのに適当である:ケラチノサイト、軟骨細胞、
骨芽細胞、内皮細胞、尿路上皮細胞、上皮細胞。
サイトを含む。
の局面または実施形態による細胞培養表面を含む美容ビヒクルが提供される。
る表面を調製する方法が提供され、この方法は以下を包含する: i)選択された比の酸を含むモノマーおよび炭化水素をガスフィード中で混合す
る工程; ii)この混合物のプラズマを産生する工程;および iii)適当な基板をこのプラズマでコーティングして高酸性官能基を保持する
表面ポリマー/コポリマーを提供する工程。
パルスプラズマのいずれかを使用し得ることが、当業者に明らかである。
0sccmの流速を用いて、通常は持続波条件下で産生される。しかし、パルス
波が使用される場合、当業者に公知であるようにプラズマパワーおよび流速につ
いて対応する補正が行われる。
、そして特にジ−不飽和アルケン、例えば1,7−オクタジエンである。
0%の不飽和酸(例えばアクリル酸)、および0〜50%のヘキサンまたはジエ
ン(例えば1,7−オクタジエン)を含む。
以下の比; 酸(例えばアクリル酸)% アルケン(例えば1,7−オクタジエン)% 50 50 60 40 70 30 80 20 90 10 100 0 の酸(例えばアクリル酸)およびヘキサンまたはジエン(例えば1,7−オクタ
ジエン)を含む。
共にここで記載される; 表1は、アクリル酸および1,7−オクタジエンから形成されたPCPのXPS
結果のまとめを示す; 表2は、プロピオン酸から調製したPPのXPS結果のまとめを示す; 表3は、パルス(pulsed)アクリル酸から調製されたPPのXPS結果の
まとめを示す; 表4は、高パワーアクリル酸から調製されたPPのXPS結果のまとめを示す; 表5は、接触して4日後の、種々の表面のDEDに対する接着を示す。
h Chemical Co.(UK)から得た。全てのモノマーは、数回の凍
結−ポンプ/解凍サイクルの後、一般に認められたように使用した。2段階回転
ポンプによって排出される円筒形の反応容器(直径8cmおよび長さ50cm)
で重合を行った。プラズマを、反応容器に誘導的に連結した無線周波数(13.
56MHz)シグナル発生器および増幅器によって維持した。反応器中の基礎圧
は3×10-3mbarであった。
0sccmの全流速で共重合した。プラズマコポリマーを、キャリアポリマー、
ポリヒドロキシブチレート(Goodfellow、Cambridge、UK
)および清潔なアルミホイル(XPS分析のために)に沈着させた。共重合中の
圧は、典型的には4.0×10-2mbarであった。プロピオン酸を沈着させる
ためのさらなる重合を、同じ条件を用いて行った。それに加えて、アクリル酸を
、パルスプラズマ条件を用いて沈着させた。プラズマパワーは50Wであり、5
msのプラズマオンタイムおよび40msのプラズマオフタイムのデューティー
サイクルを用いた。モノマー流速は2.0sccmであった。最後に、アクリル
酸を持続波高パワー条件下で沈着させた。使用したパワーは7.5W、流速2.
0sccmであった。
した後、モノマー混合物を、さらに20分間流れさせた。これは、研究室の大気
に曝露された時に沈着による大気酸素の取り込みを最低限にするために行った。
得た。各試料についての調査スキャンスペクトル(0〜1100eV)および狭
スペクトル(narrow spectra)を、それぞれ50および20ev
の分析器通過エネルギーを用いて得た。スペクトルをSpectra6.0ソフ
トウェア(R.Unwin Software、Cheshire、UK)を用
いて得た。続く処理を、Scientaデータ処理ソフトウェア(Scient
a Instruments、Uppsala、Sweden)を用いて行った
。分光計を、84.00eVにおけるAu4f7/2ピークポジション、および
397.2eVで測定したPTFEの試料中のClsとFlsとの間のピークポ
ジションの分離を用いて較正した。これはBeamsonおよびBriggs(
13)によって報告された397.19eVの値とよく匹敵する。
に記載されたように(14)真皮/表皮接合部から単離した。細胞を完全Gre
en培地で培養した。これはコレラ毒素(0.1nM)、ヒドロコルチゾン(0
.4μg/ml)、EGF(10ng/ml)、アデニン(1.8×10-4M)
、トリヨード−l−チロニン(2×10-7M)、インスリン(5mg/ml)、
トランスフェリン(5μg/ml)、グルタミン(2×10-3M)、ファンギゾ
ン(0.625μg/ml)、ペニシリン(1000IU/ml)、ストレプト
マイシン(1000μg/ml)および10%胎児ウシ血清を含んでいた。細胞
を37℃、5%CO2雰囲気で培養した。全細胞計測および生存能力のある細胞
の数を、トリパンブルー染色および標準的な血球計算器箱(hemocytom
eter chamber)を用いて決定した。
ティングしたキャリアポリマー試料を、0.1Mの酢酸(200μg/ml)中
のコラーゲンI溶液(32μg/cm2)を、層流キャビネット中で一晩空気乾
燥させることによって調製した。
を平らに保つために直径10mmのステンレススチール環を用いて、3組の表面
に播種した。培養24時間後、各3組からの1つの試料におけるケラチノサイト
の接着を、MTT−ESTAアッセイ(15)を用いて決定した。これは、生存
可能な細胞数を見積もり、以前にヒトケラチノサイトの細胞数の増加と相関する
ことを示したアッセイである(16)。細胞をPBS中0.5mg ml-1のM
TTで40分間インキュベートした。染色を次いで酸性化イソプロピルアルコー
ルで溶出した。次いで光学密度測定を540nmで、630nmのタンパク質参
照波長を引いて行った。
にくるようにGreen培地を加えた。DED/表面創傷床モデルを37℃のイ
ンキュベーターに4日間置き、その後表面をDEDから分離して、そして表面か
らDEDへの細胞転移のレベルを、上記で記載したようにMTTアッセイを用い
て評価した。DEDのMTTは、染色の溶出の前にDEDをMTTと120分間
インキュベートすることを必要とした。
ンスペクトルは、沈着物における炭素および酸素のみを示した。O/C比を表1
に示す。O/C比はモノマーフィード中のアクリル酸のモル画分が増加するにつ
れて増加した。PCPのClsコアレベルスペクトルを、様々な酸素を含む官能
基に関してピークフィット(peak fitted)させた。最初に、炭化水
素シグナルを285eVにセットして試料荷電に関してスペクトルを補正した。
次いで以下の官能基をフィットさせた:+1.5eVのシフトでアルコール/エ
ーテル(C−OH/R);+3.0eVでカルボニル(C=O);+4.0eV
でカルボン酸/エステル(COOH/R);および+0.7eVでカルボキシレ
ートに結合したβシフトした炭素(C−COOH/R)。ピークフィッティング
の結果および例のピークフィット(Faa/Ftot=1)を表1に示した。ピーク
フィットにおいて成分ピークのFWHMを等しく保ち、そしてそれは1.4〜1
.6eVの範囲であった。成分ピークのGaussian対Lorentzia
n比(G/L比)も一定に保ち、そしてそれは0.8〜0.9の範囲であった。
XPSはカルボン酸とエステル基との間を区別できないが、プラズマ重合アクリ
ル酸のかすめ角赤外分光学は、この研究で採用された低パワーでは、XPスペク
トルのカルボキシレートピークは、エステルよりもむしろカルボン酸に割り当て
られ得ることを示した(10)。PCPに存在する他の炭素−酸素官能基として
は(カルボン酸以外に)、カルボニルおよびアルコール/エーテルが挙げられる
。これらは、プラズマにおけるモノマーのフラグメンテーションの結果として起
こる。沈着物と水との間の反応がプラズマ容器の壁から脱着し(重合中)、そし
て大気酸素および水(重合後)もまた寄与する。C−OH/Rピークは、主にヒ
ドロキシル基であると考えられる。以前の研究で、本発明者らは、アクリル酸/
1,7−オクタジエンのPCP(モノマーフィード中アクリル酸の様々なモル画
分を用いて調製した)における酸素を含む官能基の同一性について、より詳しく
調査した(11)。この研究に基づいて、本発明者らは、PCP表面において、
ケラチノサイトはC−OHでなくカルボン酸官能基に対して反応すると考える。
C−OHは、細胞接着を促進するためには高い濃度(25%)で存在しなければ
ならない(8)。
パワーアクリル酸からのXPスペクトルもまた、沈着中に炭素および酸素のみを
示し、そして上記でアクリル酸について概略を述べた同じ基準を用いてフィット
させた。プロピオン酸、パルスアクリル酸、および高パワーアクリル酸に関する
カーブフィッティングの結果をそれぞれ表2、3、および4に示す。本発明者ら
の研究室におけるパルスプラズマの以前の研究に基づいて、パルスプラズマにお
けるより低いデューティーサイクル(duty cycle)が、より高いカル
ボキシル保持の値を産生することが予期される(21)。表1および4を比較す
ることによって、プラズマパワーの増加は、約50%のカルボキシル官能基保持
の低下、およびアルコール/エーテルおよびカルボニル官能基の対応する増加を
もたらすことが明らかである。
XPS結果のまとめ Clsコアレベルにおける官能基%
炭化水素由来の+0.7eVにおける(C−COOH/R))をピークフィット
に加えた。
炭化水素由来の+0.7eVにおける(C−COOH/R))をピークフィット
に加えた。
炭化水素由来の+0.7eVにおける(C−COOH/R))をピークフィット
に加えた。
炭化水素由来の+0.7eVにおける(C−COOH/R))をピークフィット
に加えた。
を行った。それは97%の細胞生存(2.5×107全細胞)を示した。24時
間後に表面を、MTTアッセイを用いて調査した。 i)アクリル酸/1,7−オクタジエン 結果を図1に示す。データは、モノマーフロー中50%および100%のアク
リル酸で調製した酸含有表面は、コラーゲンIよりわずかによく機能したことを
示す。フロー中25%の酸で作成した表面はTCPSに匹敵したが、炭化水素表
面におけるケラチノサイトの接着は不十分であった。
も高いレベルの接着を示した。細胞接着のレベルは表面からDEDへのその後の
転移の程度についての予測変数ではないが、異なる前駆体モノマーおよび/また
はプラズマ条件を用いて産生した表面が、ケラチノサイトの接着を支持すること
を記載することは重要である。細胞接着は明らかに、続く転移が成功するための
必要条件である。
ゲンI表面およびガスフロー中100%で調製した表面は、DEDによく接着し
、ケラチノサイトの表面からDEDへの実質的な転移が起こったことを示す。モ
ノマーフロー中より少ない量の酸を含有する表面は、よりよく接着しなかったが
、キャリアおよび炭化水素表面は容易にDEDからはがれ、より低い程度の細胞
転移が起こったことを示す。
るMTTアッセイの結果を示し、そして図3はDEDにおけるMTTアッセイを
示す。表面に残る細胞の光学密度は、DEDに転移した細胞でみられるものと比
べて、全ての場合で非常に低かった。コラーゲンI上で増殖した細胞は、DED
への転移に関して調査した場合最も高い値を示し、キャリア単独でみられるもの
よりも約4倍高かった。25%の酸で処理した表面で増殖した細胞について、転
移は、キャリア単独で増殖した細胞でみられるものと同程度であった。しかし、
50%および100%の酸で処理した表面で増殖した細胞は、有意に高いDED
への転移を示した。炭化水素で処理した表面で増殖した細胞は、非常に低いDE
Dへの転移しか示さなかった。
写真の証拠を図4aおよび図4bに示す。炭化水素(1,7−オクタジエン)お
よびキャリア(biopol)表面は染色されないが、コラーゲンIおよび酸を
含む表面は、DED上のケラチノサイトによる特徴的な紫の染色を示す。図5は
、パルスアクリル酸PPからの細胞転移によるDED染色を示す。図6は、プロ
ピオン酸PPを用いた同じ結果を示す。図7に示したのは、高パワーアクリル酸
PP(不織布に沈着)からの転移によるDED染色である。
れは、ケラチノサイトの接着および増殖のためのPCP表面の使用を開示したが
、これらの細胞のDEDへの転移を扱わなかった。ケラチノサイトは、多くの基
盤上で不可逆的な最終分化を受けるので、そのような研究に特に難題となる。そ
のような細胞は、移動またはコロニーを形成する能力−再上皮形成を達成するた
めにケラチノサイトの支持表面から創傷床への転移を考える時に必要な特性を失
う。したがって、本発明者らの目的は、接着を促進する表面が、単純なインビト
ロ創傷モデルにおいて細胞の転移を促進する程度を調査することである。
培養した。接着した細胞の数は、ケラチノサイト培養の好ましい基盤であるコラ
ーゲンI上での細胞の能力に匹敵した。
、炭化水素プラズマポリマーをネガティブコントロールとして使用することが重
要である(17)。これらの心配は、製造中にTCPSに与えられる表面処理の
ために生じた。それは、表面における酸化レベルに依存して、TCPSを水性溶
液に対して不安定にし得る。異なるバッチのTCPSが正確に同じ量の表面酸化
を受けるかどうか、またはこの表面酸化が経年変化を受けやすいかどうかは不明
である。
チノサイトは以前に、低い2〜3%量の酸性官能基を有する表面上で接着が増強
されることが示された(11)。しかし、この研究で21%の酸を含む表面でも
接着が高いことが示された。酸性PCPは他のO−C官能基、主にC−OHも含
むことを思い出すべきである。そうとしても、本発明者らの以前の研究は、酸性
PCPが、コンフルエンシーの程度および細胞数(DNAアッセイによって決定
された)に関してコラーゲンIと匹敵することを示した。
)。酸性PCPの安定性は、モノマーフロー中のアクリル酸濃度に依存すること
が示された。高濃度の酸(全フローの>60%)は、より安定でない表面を生じ
る。この必要条件は、接着およびその後の増殖を促進するのに「理想的」である
といわれるような低濃度酸性表面(<5%)の開発を導いた。しかし、酸性表面
からの細胞転移に関しては、異なる基準が適用されるようである。酸性基の低濃
度は表面に安定性を与えるが、ケラチノサイトは十分によく接着し得て、転移が
阻害される。この主張は、転移実験の結果において支持される。ここでモノマー
フィード中25%の酸フロー(PCP表面において2.6%のカルボン酸)は、
最も低い程度のDEDへの転移を示した。対照的に、モノマー中100%の酸フ
ロー(PCP表面において>20%のカルボン酸)は、細胞の転移は有意により
高かった。コラーゲンIのみがこれらの表面よりすぐれていた。モノマーフロー
中50%の酸では、予期されたように、転移は高および低酸性官能基表面の中間
であった。これらの結果は、接着および増殖を促進する最適な表面は、最も高い
程度のPCPからDEDへのケラチノサイト転移を引き起こすものではないかも
しれないことを示す。炭化水素PPからの少ない量の転移は、そのような表面が
ケラチノサイトを増殖状態で支持できないことを確認する。官能基濃度に対する
細胞転移の依存は、まだ完全に調査されていないが、ケラチノサイトは多量の酸
性官能基を有する表面から増強された転移を示す。従って、増殖を促進する表面
(低酸性官能基)と転移を促進する表面(高酸性官能基)との間に妥協点が存在
することが明らかである。
に反応することが示された(19)。この界面のタンパク質層は、(ほとんど)
自然に吸着する。調査している基盤に対する細胞反応の違いは、吸着するタンパ
ク質の組成、またはこれらタンパク質の吸着後の活性のいずれか、あるいはこれ
ら両方の組み合わせに変化が存在することを示唆する。細胞接着は、フィブロネ
クチンおよびビトロネクチンのような、多くの接着性タンパク質によって支持さ
れることが示された。Tidwellら(12)は、異なる末端化学的性質のア
ルカンチオレートを用いるSAMに発達するタンパク質層における違い、および
それらは今度異なるレベルのウシ大動脈内皮細胞接着を支持することを示した。
細胞接着および拡散は、細胞増殖のための重要な条件であるが、それらは排他的
条件ではない。血清はまた、成長因子の供給源であり、そしてこれらは一次哺乳
類細胞の増殖に不可欠であることが示された。成長因子の細胞外マトリックス材
料への吸着が、その活性化に役割を果たすことが示唆された(20)。
示す。アクリル酸は、有機酸の不飽和ファミリーのメンバーであるが、プロピオ
ン酸は飽和有機酸である。従って、モノマーがプラズマ容器を流れるのに十分揮
発性であるなら、任意の有機酸を、ケラチノサイト接着および続くDEDへの転
移を示し得るPP表面の製造に使用し得ることが予期される。さらに、その結果
は広い範囲のプラズマ条件が、必要な細胞接着および転移を促進する表面を調製
することができることを示す。本発明者らは、持続波条件下で、望ましい特徴を
有するPPをうまく調製するために、低および高パワーレジメを両方使用し得る
ことを示した。それに加えて、プラズマをパルスすることは酸性官能基を表面に
沈着させる別の経路を提供する。他の考慮すべき事は、ある範囲のキャリア表面
をプラズマ沈着のために使用し得ることである。この研究で、生物分解性キャリ
ア(biopol)、および非生物分解性キャリア(ポリプロピレン、Deln
et−AET Specialty Netsから提供)はいずれも、それらが
DEDへのケラチノサイト細胞転移を促進するPPでコートされ得ることを示し
た。データは、キャリアフィルムがその性質が異なり得るが(例えば溶解性、吸
収性)、細胞の挙動に影響するのは主にこれらキャリア上のPP沈着であること
を示唆する(しかし織り方/孔径のような形態学的効果が、PPコーティングは
均一な「平らな」表面ではなく、キャリアの外形に沈着することを意味し得る。
従って、細胞は、PPコートキャリアをそれに適用した時にDEDと接触しない
かもしれない場所に接着し得る)。転移現象のあらゆる外科的使用は、キャリア
材料のコートされた外形内よりも、PP表面における細胞の最大限の接着を保証
するために、メッシュよりもフィルム様のキャリアを必要とすることが認識され
る。
る酸性PCPの成功は多因子であることが明らかである。しかし、本発明者らの
結果は、ケラチノサイト接着および転移は、カルボン酸官能基によって特異的に
促進されることを示す。これはおそらく血清から形成する界面タンパク質層の調
節による。
面と比べて、ケラチノサイト接着およびDEDへの転移を促進した。約20%の
酸性基を含む表面における最初の細胞接着は、培養中24時間後に、コラーゲン
I基盤における細胞接着と匹敵した。
も高かったが、転移はまた低酸性官能基濃度を有する表面からも観察された。細
胞転移は、飽和および不飽和有機酸から沈着されたPPを用いて達成された。持
続波条件下で、低および高パワーレジメはいずれも、細胞転移を促進するPPを
産生することができた。パルスされたプラズマもまた、転移を促進するPP表面
を製造する経路を提供した。
へのケラチノサイトの接着を示す。
水素の表面からDEDへのケラチノサイト転移による染色を示す。
ノサイト転移による染色を示す。
ケラチノサイト転移による染色を示す。
チノサイト転移による染色を示す。
ノサイト転移による染色を示す。
Claims (34)
- 【請求項1】 組織工学で使用する治療的ビヒクルであって、ここで該ビヒ
クルはプラズマ重合によって得られる細胞培養表面に一体化、または適用され、
それに対して少なくとも1つの細胞が可逆的に接着され得、該表面は少なくとも
5%の酸性官能基を含むことで特徴付けられる、ビヒクル。 - 【請求項2】 前記表面の酸性官能基が5〜20%の間である、請求項1に
記載のビヒクル。 - 【請求項3】 前記表面の酸性官能基が20%より多い、請求項1または2
に記載のビヒクル。 - 【請求項4】 前記表面の酸性官能基がカルボン酸によって提供される、請
求項1〜3のいずれかに記載のビヒクル。 - 【請求項5】 前記表面の酸性官能基がプロピオン酸によって提供される、
請求項1〜3のいずれかに記載のビヒクル。 - 【請求項6】 前記酸性官能基がアクリル酸によって提供される、請求項1
〜3のいずれかに記載のビヒクル。 - 【請求項7】 前記表面が、酸含有モノマーのプラズマコポリマーで基板を
コーティングすることによって提供される、請求項1〜3のいずれかに記載のビ
ヒクル。 - 【請求項8】 前記コポリマーがアクリル酸および炭化水素の混合物である
、請求項7に記載のビヒクル。 - 【請求項9】 前記炭化水素が1,7−オクタジエンである、請求項8に記
載のビヒクル。 - 【請求項10】 ガスフィード中でアクリル酸が50〜100%で提供され
、そして1,7−オクタジエンが0〜50%で提供される、請求項8または9に
記載のビヒクル。 - 【請求項11】 前記表面が哺乳類起源の細胞と使用するのに適当である、
請求項1〜10のいずれかに記載のビヒクル。 - 【請求項12】 前記哺乳類細胞がヒトである、請求項11に記載のビヒク
ル。 - 【請求項13】 前記表面が以下の細胞型のいずれか1つと使用するのに適
当である、請求項10または11に記載のビヒクル:ケラチノサイト;軟骨細胞
;骨芽細胞;内皮細胞;尿路上皮細胞;上皮細胞。 - 【請求項14】 前記細胞型がケラチノサイトである、請求項13に記載の
ビヒクル。 - 【請求項15】 前記ビヒクルがマトリックス材料を含む、請求項1〜14
のいずれかに記載のビヒクル。 - 【請求項16】 請求項1〜15のいずれかに記載の治療的ビヒクルの細胞
培養表面を調製する方法であって、以下: i)酸を提供する工程; ii)該酸のプラズマを産生する工程;および iii)基板を該プラズマでコーティングして、少なくとも5%の高い酸性官
能基を含む表面ポリマーを提供する工程 を包含する、方法。 - 【請求項17】 前記酸がアクリル酸またはプロピオン酸である、請求項1
6に記載の方法。 - 【請求項18】 請求項1〜15のいずれかに記載の治療的ビヒクルの細胞
培養表面を調製する方法であって、以下: i.ガスフィード中で選択された比の酸を含むモノマーおよび炭化水素を混合
する工程; ii.該混合物のプラズマを産生する工程;および iii.適当な基板を該プラズマでコーティングして、少なくとも5%の高い
酸性官能基を含む表面ポリマー/コポリマーを提供する工程、 を包含する、方法。 - 【請求項19】 前記プラズマが0〜50Wのプラズマパワーおよび0〜2
0sccmの流速を用いて持続波条件下で産生される、請求項18に記載の方法
。 - 【請求項20】 前記プラズマがパルス波条件を用いて産生される、請求項
19に記載の方法。 - 【請求項21】 前記酸がアクリル酸であり、そして前記炭化水素が1,7
−オクタジエンである、請求項18〜20のいずれかに記載の方法。 - 【請求項22】 前記プラズマが前記ガスフィード中で50〜100%のア
クリル酸および0〜50%の1,7−オクタジエンを含む、請求項21に記載の
方法。 - 【請求項23】 前記プラズマが以下の比: アクリル酸% 1,7−オクタジエン% 50 50 60 40 70 30 80 20 90 10 100 0 のアクリル酸および1,7−オクタジエンを含む、請求項22に記載の方法。
- 【請求項24】 前記プラズマが以下の比: 酸% 炭化水素% 50 50 60 40 70 30 80 20 90 10 100 0 の酸および炭化水素を含む、請求項18に記載の方法。
- 【請求項25】 皮膚創傷の治療のための、請求項1〜15のいずれかに記
載の治療的ビヒクルの使用。 - 【請求項26】 前記プラズマが0〜50Wのプラズマパワーおよび0〜2
0sccmの流速を用いて持続波条件下で産生される、請求項25に記載の方法
。 - 【請求項27】 前記プラズマがパルス波条件を用いて産生される、請求項
25に記載の方法。 - 【請求項28】 前記酸がアクリル酸であり、そして前記炭化水素が1,7
−オクタジエンである、請求項25〜27のいずれかに記載の方法。 - 【請求項29】 前記プラズマがガスフィード中に50〜100%のアクリ
ル酸および0〜50%の1,7−オクタジエンを含む、請求項28に記載の方法
。 - 【請求項30】 前記プラズマが、以下の比: アクリル酸% 1,7−オクタジエン% 50 50 60 40 70 30 80 20 90 10 100 0 のアクリル酸および1,7−オクタジエンを含む、請求項29に記載の方法。
- 【請求項31】 前記プラズマが以下の比: 酸% 炭化水素% 50 50 60 40 70 30 80 20 90 10 100 0 の酸および炭化水素を含む、請求項25に記載の方法。
- 【請求項32】 前記プラズマがガスフィード中に50〜100%のアクリ
ル酸および0〜50%の1,7−オクタジエンを含む、請求項31に記載の方法
。 - 【請求項33】 前記プラズマが、以下の比: アクリル酸% 1,7−オクタジエン% 50 50 60 40 70 30 80 20 90 10 100 0 のアクリル酸および1,7−オクタジエンを含む、請求項31に記載の方法。
- 【請求項34】 前記プラズマが以下の比: 酸% 炭化水素% 50 50 60 40 70 30 80 20 90 10 100 0 の酸および炭化水素を含む、請求項28に記載の方法。
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