JP2003339384A

JP2003339384A - New purine nucleoside phosphorilase, gene for the same and method for producing the same phosphorilase

Info

Publication number: JP2003339384A
Application number: JP2002156077A
Authority: JP
Inventors: Takahide Kishimoto; 高英岸本; Atsushi Sogabe; 敦曽我部; Masanori Oka; 岡　　正則; Makishi Takakura; 麻貴子高倉; Kiyoshi Ito; 伊藤　　潔; Tadashi Yoshimoto; 忠芳本
Original assignee: Toyobo Co Ltd
Current assignee: Toyobo Co Ltd
Priority date: 2002-05-29
Filing date: 2002-05-29
Publication date: 2003-12-02

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a new purine nucleoside phosphorilase (hereinafter abbreviated as PNP) having the PNP activity, a gene encoding the PNP, a method for producing the PNP by utilizing a genetic engineering technology and further a use of the PNP. <P>SOLUTION: This new heat resistant PNP is characterized by maintaining ≥90% residual activity after being treated in a 50 mM phosphate buffer (pH 7.7) at 75°C for 30 min. <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】[0001]

【発明の属する技術分野】本発明は無機リンやイノシン
の定量に用いることのできるプリンヌクレオシドホスホ
リラーゼ（以下、ＰＮＰとも示す）活性を有する新規な
ＰＮＰ、ならびに該ＰＮＰをコードする遺伝子に関す
る。さらに、遺伝子工学技術による該ＰＮＰの製造法な
らびに該ＰＮＰの用途に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a novel PNP having a purine nucleoside phosphorylase (hereinafter also referred to as PNP) activity, which can be used for quantifying inorganic phosphorus and inosine, and a gene encoding the PNP. Furthermore, it relates to a method for producing the PNP by genetic engineering technology and uses of the PNP.

【０００２】[0002]

【従来の技術】臨床検査の分野では無機リンは慢性腎不
全、急性腎不全、糸球体ろ過率低下、副甲状腺ホルモン
分泌不全、甲状腺ホルモン受容機構障害、および原発性
甲状腺機能亢進症などの有用なマーカーであり、環境分
析においては富栄養化の重要な指標である。またイノシ
ンは食品分析において重要である一方、臨床検査の分野
でもアデノシンデアミナーゼや５‘−ヌクレオチダーゼ
活性測定における中間生成物として測定意義が大きい。2. Description of the Related Art In the field of clinical examination, inorganic phosphorus is useful for chronic renal failure, acute renal failure, decreased glomerular filtration rate, parathyroid hormone secretion deficiency, thyroid hormone receptor mechanism disorder, and primary hyperthyroidism. It is a marker and an important indicator of eutrophication in environmental analysis. While inosine is important in food analysis, it has great significance in the field of clinical testing as an intermediate product in measuring adenosine deaminase and 5'-nucleotidase activities.

【０００３】プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＥＣ
２．４．２．１）は次式のようにプリンヌクレオシド
やそのアナログの可逆的なリン酸化を触媒する。プリンヌクレオシド＋オルソリン酸→α―Ｄ−ペントー
スー１−リン酸＋プリンプリンヌクレオシドホスホリラーゼはこれまでヒト赤血
球や牛脾臓以外に多くのバクテリアでその性質が明らか
にされている。例えば、エシェリヒア・コリ（Escheric
hia coli）、サルモネラ・ティフィミュリウム（Salmo
nella typhimurium）（The Enzymes、Vol.VII、Third
Edi Tion、ed. by P.D.Boyer、AcAdemic Press I
nc, New York、1972、p483）、バチルス・ステアロサ
ーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）（特許
第２５４４４８０号公報）、エンテロバクター・クラカ
エ（Enterobacer Clacae）（Agric. Biol. Chem.，4
5(8)，1801〜1807，1981）、ストレプトコッカス・サー
モフィラス（Streptococcus thermophilus）（特開２０
０２−１７３５４号公報）などに由来するものがこれま
でに知られている。Purine nucleoside phosphorylase (EC
2.4.2.1) catalyzes the reversible phosphorylation of purine nucleosides and their analogs as shown below. Purine nucleoside + orthophosphate → α-D-pentose-1-phosphate + purine purine nucleoside phosphorylase has been characterized in many bacteria other than human erythrocytes and bovine spleen. For example, Escheric
hia coli), Salmonella typhimurium (Salmo
nella typhimurium) (The Enzymes, Vol.VII, Third)
Edi Tion, ed. By PDBoyer, AcAdemic Press I
nc, New York, 1972, p483), Bacillus stearothermophilus (Patent No. 2544480), Enterobacer Clacae (Agric. Biol. Chem., 4).
5 (8), 1801-1807, 1981), Streptococcus thermophilus (JP 20
No. 02-17354) has been known so far.

【０００４】従来からプリンヌクレオシドホスホリラー
ゼは、無機リン測定用酵素として、他の酵素、例えばペ
ルオキシダーゼあるいはカタラーゼと共に使用されてい
る。また、イノシン測定用酵素としても同様に使用され
ている。しかしながら、上述したような従来から報告
されているプリンヌクレオシドホスホリラーゼの耐熱性
は必ずしも十分ではなく、例えば液状臨床検査用試薬へ
の適応を考慮した場合、より安定性に優れた酵素が望ま
しい。[0004] Purine nucleoside phosphorylase has been conventionally used as an enzyme for measuring inorganic phosphorus together with other enzymes such as peroxidase or catalase. It is also used as an enzyme for measuring inosine. However, the above-mentioned conventionally reported purine nucleoside phosphorylases do not always have sufficient thermostability, and, for example, in consideration of application to a liquid clinical test reagent, an enzyme having more excellent stability is desirable.

【０００５】[0005]

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、耐熱
性の新規なプリンヌクレオシドホスホリラーゼを単離
し、そして該ＰＮＰをコードする遺伝子をクローニング
し、遺伝子工学的に該ＰＮＰを多量に製造する方法を提
供することにある。また、本発明の別な目的は、該ＰＮ
Ｐを改変することにより、理化学的性質の改良された新
規なプリンヌクレオシドホスホリラーゼを製造する方法
を導き出すことにある。The object of the present invention is to isolate a novel thermostable purine nucleoside phosphorylase, and to clone a gene encoding the PNP to genetically engineer a large amount of the PNP. To provide. Another object of the present invention is to provide the PN
It is intended to derive a method for producing a novel purine nucleoside phosphorylase having improved physicochemical properties by modifying P.

【０００６】[0006]

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記目的
を達成するために種々検討した結果、耐熱性プリンヌク
レオシドホスホリラーゼ生産菌として、サーマス・アク
アティカス（ThermusAquaticus）ＤＳＭ６２５を選び、
該菌体から新規なプリンヌクレオチドホスホリラーゼを
単離し、さらに該菌体より抽出した染色体からプリンヌ
クレオシドホスホリラーゼをコードする遺伝子を分離す
ることに成功し、該遺伝子より発現される新規なプリン
ヌクレオシドホスホリラーゼを単離した。さらに該遺伝
子の全塩基配列を決定し、該ＰＮＰを遺伝子工学的技術
により高価な誘導物質を培地に添加する必要なく、高生
産させることに成功し、高純度な該ＰＮＰを安価に大量
供給することを可能にした。[Means for Solving the Problems] As a result of various studies to achieve the above object, the present inventors selected Thermus aquaticus DSM625 as a thermostable purine nucleoside phosphorylase-producing bacterium,
We succeeded in isolating a novel purine nucleotide phosphorylase from the bacterium, further separating the gene encoding the purine nucleoside phosphorylase from the chromosome extracted from the bacterium, and synthesizing the novel purine nucleoside phosphorylase expressed by the gene. Released. Furthermore, the whole nucleotide sequence of the gene was determined, and the PNP was successfully produced at a high amount by a genetic engineering technique without the need to add an expensive inducer to the medium, and a large amount of the highly pure PNP was inexpensively supplied. Made it possible.

【０００７】すなわち、本発明は以下のような構成から
なる。（１）５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．７）中で７５
℃、３０分処理後の活性残存率が９０％以上であ
ることを特徴とする新規な耐熱性プリンヌクレオシドホ
スホリラーゼ。（２）下記理化学的性質を有する新規なプリンヌクレオ
シドホスホリラーゼ。作用：プリンヌクレオシド＋オルソリン酸→α−Ｄ−リ
ボース−１−リン酸＋プリン基質特異性：プリンヌクレオシドとしてイノシン、グア
ノシンを利用する熱安定性：５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．７）中で７
５℃、３０分処理後の活性残存率が９０％以上（３）下記理化学的性質を有する新規なプリンヌクレオ
シドホスホリラーゼ。作用：プリンヌクレオシド＋オルソリン酸→α−Ｄ−リ
ボース−１−リン酸＋プリン基質特異性：プリンヌクレオシドとしてイノシン、グア
ノシンを利用する熱安定性：５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．７）中で７
５℃、３０分処理後の活性残存率が９０％以上ｐＨ安定性：ｐＨ６〜１０の範囲で、３０℃、１９時間
処理後の活性残存率が９０％以上至適温度：７０〜７５℃ 至適ｐＨ：７．５〜８（４）以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質である新
規なプリンヌクレオシドホスホリラーゼ。（ａ）配列表の配列番号１に記載されるアミノ酸配列か
らなるタンパク質（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において、１若しくは数個の
アミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列
からなり、かつプリンヌクレオシドホスホリラーゼ活性
を有するタンパク質。（５）配列表の配列番号１に記載されるアミノ酸配列を
有する（１）〜（３）のいずれかのプリンヌクレオシド
ホスホリラーゼ。（６）以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質であるプ
リンヌクレオシドホスホリラーゼをコードする遺伝子。（ａ）配列表の配列番号１に記載されるアミノ酸配列か
らなるタンパク質（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において、１若しくは数個の
アミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列
からなり、かつプリンヌクレオシドホスホリラーゼ活性
を有するタンパク質。（７）配列表の配列番号１に記載されるアミノ酸配列か
らなるタンパク質であるプリンヌクレオシドホスホリラ
ーゼをコードする遺伝子。（８）以下の（ｃ）または（ｄ）のＤＮＡからなるプリ
ンヌクレオシドフォスフォリラーゼをコードする遺伝
子。（ｃ）配列表の配列番号２に記載される塩基配列からな
るＤＮＡ（ｄ）上記（ｃ）の塩基配列において、１若しくは複数
の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からな
り、かつプリンヌクレオシドホスホリラーゼ活性を有す
るアミノ酸配列をコードしているＤＮＡ（９）配列表の配列番号２に記載される塩基配列からな
るＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズ
し、かつプリンヌクレオシドホスホリラーゼ酵素活性を
有するタンパク質をコードする遺伝子。（１０）配列表の配列番号２に記載される塩基配列から
なるＤＮＡを含有するプリンヌクレオシドホスホリラー
ゼをコードする遺伝子。（１１）（６）〜（１０）のいずれかのプリンヌクレオ
チドホスホリラーゼをコードする遺伝子を含有してなる
組換えベクター。（１２）（１１）の組換えベクターにより宿主細胞が形
質転換されてなる形質転換体。（１３）（１２）の形質転換体を培養し、プリンヌクレ
オシドホスホリラーゼを生成させ、該プリンヌクレオシ
ドホスホリラーゼを採取することを特徴とするプリンヌ
クレオシドホスホリラーゼの製造法。（１４）サーマス・アクアティカス（Thermus aquatic
us）ＤＳＭ６２５を培養し、プリンヌクレオシドホスホ
リラーゼを生成させ、該プリンヌクレオシドホスホリラ
ーゼを採取することを特徴とするプリンヌクレオシドホ
スホリラーゼの製造法。（１５）（１）〜（５）いずれかのプリンヌクレオシド
ホスホリラーゼ、キサンチンオキシダーゼ、ならびにペ
ルオキシダーゼもしくはカタラーゼならびに過酸化水素
検出試薬を含有する無機リン測定用試薬。（１６）（１）〜（５）のいずれかのプリンヌクレオシ
ドホスホリラーゼ、キサンチンデヒドロゲナーゼおよび
酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを含有す
る無機リン測定用試薬。（１７）（１）〜（５）のいずれかのプリンヌクレオシ
ドホスホリラーゼ、キサンチンオキシダーゼ、ならびに
ペルオキシダーゼもしくはカタラーゼならびに過酸化水
素検出試薬を含有するイノシン測定用試薬。（１８）（１）〜（５）のいずれかのプリンヌクレオシ
ドホスホリラーゼ、キサンチンデヒドロゲナーゼおよび
酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを含有す
るイノシン測定用試薬。That is, the present invention has the following configuration. (1) 75 in 50 mM phosphate buffer (pH 7.7)
A novel thermostable purine nucleoside phosphorylase having a residual activity of 90% or more after treatment at 30 ° C for 30 minutes. (2) A novel purine nucleoside phosphorylase having the following physicochemical properties. Action: Purine nucleoside + orthophosphate → α-D-ribose-1-phosphate + purine substrate Specificity: Utilizing inosine and guanosine as purine nucleosides Thermostability: 7 in 50 mM phosphate buffer (pH 7.7)
90% or more of residual activity after treatment at 5 ° C for 30 minutes (3) A novel purine nucleoside phosphorylase having the following physicochemical properties. Action: Purine nucleoside + orthophosphate → α-D-ribose-1-phosphate + purine substrate Specificity: Thermal stability using inosine and guanosine as purine nucleosides: 7 in 50 mM phosphate buffer (pH 7.7)
90% or more of residual activity after treatment at 5 ° C for 30 minutes pH stability: 90% or more of residual activity after treatment at 30 ° C for 19 hours in the pH range of 6 to 10 Optimum temperature: 70 to 75 ° C Suitable pH: 7.5-8 (4) A novel purine nucleoside phosphorylase which is the following protein (a) or (b). (A) a protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 of the sequence listing (b) an amino acid sequence in the amino acid sequence (a) in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added, and purine A protein having nucleoside phosphorylase activity. (5) The purine nucleoside phosphorylase according to any one of (1) to (3), which has the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. (6) A gene encoding a purine nucleoside phosphorylase, which is the following protein (a) or (b). (A) a protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 of the sequence listing (b) an amino acid sequence in the amino acid sequence (a) in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added, and purine A protein having nucleoside phosphorylase activity. (7) A gene encoding a purine nucleoside phosphorylase, which is a protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing. (8) A gene encoding a purine nucleoside phosphorylase consisting of the following DNA (c) or (d). (C) a DNA consisting of the base sequence described in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing (d) a base sequence in which one or more bases have been deleted, substituted or added in the base sequence of (c) above, and DNA encoding an amino acid sequence having purine nucleoside phosphorylase activity (9) Hybridizes with a DNA consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing under stringent conditions and purine nucleoside phosphorylase enzyme activity A gene that encodes a protein that has. (10) A gene encoding a purine nucleoside phosphorylase containing a DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 in the sequence listing. (11) A recombinant vector containing the gene encoding the purine nucleotide phosphorylase according to any one of (6) to (10). (12) A transformant obtained by transforming a host cell with the recombinant vector according to (11). (13) A method for producing a purine nucleoside phosphorylase, which comprises culturing the transformant of (12) to produce a purine nucleoside phosphorylase, and collecting the purine nucleoside phosphorylase. (14) Thermus aquatic
us) A method for producing a purine nucleoside phosphorylase, which comprises culturing DSM625 to produce a purine nucleoside phosphorylase, and collecting the purine nucleoside phosphorylase. (15) An inorganic phosphorus measuring reagent containing the purine nucleoside phosphorylase, xanthine oxidase, peroxidase or catalase, and a hydrogen peroxide detection reagent according to any one of (1) to (5). (16) A reagent for measuring inorganic phosphorus containing the purine nucleoside phosphorylase according to any one of (1) to (5), xanthine dehydrogenase, and oxidized nicotinamide adenine dinucleotide. (17) A reagent for inosine measurement, which comprises the purine nucleoside phosphorylase, xanthine oxidase, and peroxidase or catalase according to any one of (1) to (5) and a hydrogen peroxide detection reagent. (18) An inosine measurement reagent containing the purine nucleoside phosphorylase, xanthine dehydrogenase, and oxidized nicotinamide adenine dinucleotide according to any one of (1) to (5).

【０００８】[0008]

【発明の実施の形態】本発明のプリンヌクレオシドホス
ホリラーゼは、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ生産
微生物、例えばサーマス・アクアティカスＤＳＭ６２５
から得ることができる。しかしながら、プリンヌクレオ
シドホスホリラーゼをコードする遺伝子を分離し、これ
より発現されるプリンヌクレオシドホスホリラーゼを単
離することより、本発明のプリンヌクレオシドホスホリ
ラーゼを簡便、かつ効率的に入手することもできる。本
発明のプリンヌクレオシドホスホリラーゼは５０ｍＭリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７．７）中で７５℃、３０分処理後の
活性残存率が９０％以上であることを特徴とするもので
ある。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION The purine nucleoside phosphorylase of the present invention is a purine nucleoside phosphorylase-producing microorganism such as Thermus aquaticus DSM625.
Can be obtained from However, the purine nucleoside phosphorylase of the present invention can be conveniently and efficiently obtained by separating the gene encoding the purine nucleoside phosphorylase and isolating the purine nucleoside phosphorylase expressed from the gene. The purine nucleoside phosphorylase of the present invention is characterized in that the residual activity rate after treatment at 75 ° C. for 30 minutes in a 50 mM phosphate buffer (pH 7.7) is 90% or more.

【０００９】本発明の別な実施態様としては、（ａ）配
列表の配列番号１に記載されるアミノ酸配列から成るタ
ンパク質、または（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において、
１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加さ
れたアミノ酸配列からなり、かつ、プリンヌクレオシド
ホスホリラーゼ酵素活性を有するタンパク質がある。ア
ミノ酸、欠失、置換、付加の程度については、基本的な
特性を変化させることなく、あるいはその特性を改善す
るようにしたものを含む。これらの変異体を製造する方
法は、従来から公知である方法に従う。Another embodiment of the present invention is (a) a protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, or (b) an amino acid sequence (a),
There is a protein having an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added, and having a purine nucleoside phosphorylase enzymatic activity. Regarding the degree of amino acids, deletions, substitutions, and additions, those which are such that the basic characteristics are not changed or the characteristics are improved are included. The method for producing these mutants follows conventionally known methods.

【００１０】本発明のプリンヌクレオシドホスホリラー
ゼをコードする遺伝子は、例えばサーマス・アクアティ
カスＤＳＭ６２５から抽出することができる。また化学
的に合成することも可能である。また、ポリメラーゼチ
ェーンリアクション（ＰＣＲ）の利用により、プリンヌ
クレオシドホスホリラーゼ遺伝子を含む断片を得ること
も可能である。The gene encoding the purine nucleoside phosphorylase of the present invention can be extracted from, for example, Thermus aquaticus DSM625. It can also be chemically synthesized. It is also possible to obtain a fragment containing the purine nucleoside phosphorylase gene by using polymerase chain reaction (PCR).

【００１１】上記ＰＮＰ遺伝子としては、例えば（ａ）
配列表の配列番号１に記載されるアミノ酸配列からなる
タンパク質をコードするＤＮＡ、または（ｂ）アミノ酸
配列（ａ）において、１若しくは数個のアミノ酸が欠
失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、か
つ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ活性を有するタ
ンパク質をコードするＤＮＡがある。ＤＮＡの欠失、置
換、付加の程度については、基本的な特性を変化させる
ことなく、あるいはその特性を改善するようにしたもの
を含む。これらの変異体を製造する方法は従来から公知
である方法に従う。Examples of the PNP gene include (a)
A DNA encoding a protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 of the Sequence Listing, or (b) an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence (a) In addition, there is a DNA encoding a protein having purine nucleoside phosphorylase activity. Regarding the degree of deletion, substitution and addition of DNA, it includes those in which basic characteristics are not changed or the characteristics are improved. The method for producing these mutants follows conventionally known methods.

【００１２】また、上記ＰＮＰ遺伝子として、（ｃ）配
列表の配列番号２に記載される塩基配列からなるＤＮ
Ａ、（ｄ）上記（ｃ）の塩基配列において、１若しくは
数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列か
らなり、かつプリンヌクレオシドホスホリラーゼ活性を
有するアミノ酸配列をコードしているＤＮA、さらに、
（ｅ）上記（ｃ）の塩基配列からなるＤＮＡとストリン
ジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、プリンヌ
クレオシドホスホリラーゼ活性を有するタンパク質をコ
ードする細菌由来のＤＮAが挙げられる。ここで、スト
リンジェントな条件とは、２×ＳＳＣ（３００ｍＭＮ
ａＣｌ、３０ｍＭクエン酸）、６５℃、１６時間であ
る。この場合、（ｃ）の塩基配列との相同性は９０％以
上有することが好ましい。Further, as the PNP gene, (c) a DN having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing
A, (d) a DNA consisting of a base sequence in which one or several bases have been deleted, substituted or added in the base sequence of (c) above, and which encodes an amino acid sequence having purine nucleoside phosphorylase activity, further,
(E) Examples include bacterially-derived DNA that hybridizes with the DNA having the nucleotide sequence of (c) above under stringent conditions and encodes a protein having a purine nucleoside phosphorylase activity. Here, the stringent condition means 2 × SSC (300 mM N
aCl, 30 mM citric acid), 65 ° C., 16 hours. In this case, it is preferable that the homology with the nucleotide sequence of (c) is 90% or more.

【００１３】本発明の遺伝子を得る方法としては、例え
ばサーマス・アクアティカスＤＳＭ６２５の染色体ＤＮ
Ａを分離、精製した後、超音波破砕、制限酵素処理等を
用いてＤＮＡを切断したものと、リニアーな発現ベクタ
ーとを両ＤＮＡの平滑末端または接着末端においてＤＮ
Ａリガーゼなどにより結合閉鎖させて組換えベクターを
構築する。こうして得られた組換えベクターは複製可能
な宿主微生物に移入した後、ベクターのマーカーと酵素
活性の発現を指標としてスクリーニングして、ＰＮＰを
コードする遺伝子を得る。次いで該微生物を培養し、該
培養菌体から該組換えベクターを分離・精製し、該組換
えベクターからＰＮＰ遺伝子を採取すれば良い。The method of obtaining the gene of the present invention includes, for example, chromosome DN of Thermus aquaticus DSM625.
After separating and purifying A, DNA that has been cleaved using ultrasonic disruption, restriction enzyme treatment, etc. and a linear expression vector are used for DN at the blunt or sticky ends of both DNAs.
A recombinant vector is constructed by binding and closing with A ligase or the like. The recombinant vector thus obtained is transferred to a replicable host microorganism, and then screened using the expression of the vector marker and enzyme activity as an index to obtain a gene encoding PNP. Then, the microorganism may be cultured, the recombinant vector may be separated and purified from the cultured cells, and the PNP gene may be collected from the recombinant vector.

【００１４】遺伝子供与体であるサーマス・アクアティ
カスＤＳＭ６２５の染色体ＤＮＡは、具体的には以下の
ように採取される。すなわち、供与微生物を例えば１〜
３日間攪拌培養して得られた培養液を遠心分離により集
菌し、次いでこれを溶菌させることによりＰＮＰ遺伝子
の含有溶菌物を調製することができる。溶菌の方法とし
ては、例えば、リゾチームやβ―グルカナーゼ等の溶菌
酵素により処理が施され、必要に応じてプロテアーゼや
他の酵素やラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等の界面
活性剤が併用される。さらに凍結融解やフレンチプレス
処理のような物理的破砕方法と組み合わせてもよい。The chromosomal DNA of Thermus aquaticus DSM625, which is a gene donor, is specifically collected as follows. That is, the donor microorganism is, for example, 1 to
A lysate containing the PNP gene can be prepared by collecting the culture solution obtained by stirring and culturing for 3 days by centrifugation and then lysing it. As a lysing method, for example, treatment is performed with a lysing enzyme such as lysozyme or β-glucanase, and if necessary, a protease or another enzyme and a surfactant such as sodium lauryl sulfate (SDS) are used in combination. Further, it may be combined with a physical disruption method such as freeze-thawing or French press treatment.

【００１５】このようにして得られた溶解物からＤＮＡ
を分離・精製するには、常法に従って、例えばフェノー
ル処理やプロテアーゼ処理による除蛋白処理や、リボヌ
クレアーゼ処理、アルコール沈殿処理などの方法を適宜
組み合わせることにより行うことができる。微生物から
分離、精製されたＤＮＡを切断する方法は、例えば超音
波処理、制限酵素処理などにより行うことができる。好
ましくは特定のヌクレオチド配列に作用するII型制限酵
素が適している。DNA from the lysate thus obtained
Can be separated and purified by a conventional method, for example, by appropriately combining methods such as deproteinization treatment with phenol treatment or protease treatment, ribonuclease treatment, and alcohol precipitation treatment. The method of cleaving the DNA separated and purified from the microorganism can be performed by, for example, ultrasonic treatment or restriction enzyme treatment. Type II restriction enzymes that act on specific nucleotide sequences are preferred.

【００１６】ベクターとしては、宿主微生物内で自律的
に増殖し得るファージまたはプラスミドから遺伝子組換
え用として構築されたものが適している。ファージとし
ては、エシェリヒア・コリを宿主微生物とする場合に
は、例えば、Lambda-gT10、Lambda-gT11などを使用でき
る。また、プラスミドとしては、エシェリヒア・コリを
宿主微生物とする場合には、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐ
ＵＣ１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐＴなどが例示される。Suitable vectors are those constructed for gene recombination from phages or plasmids capable of autonomous growth in host microorganisms. When Escherichia coli is used as the host microorganism, for example, Lambda-gT10, Lambda-gT11, etc. can be used as the phage. When Escherichia coli is used as a host microorganism, for example, pBR322, p
Examples include UC19 and pBluescriptT.

【００１７】このようなベクターを、上述したＰＮＰ遺
伝子供与体である微生物ＤＮＡの切断に使用した制限酵
素で切断してベクター断片を得ることができるが、必ず
しも該微生物ＤＮＡの切断に使用した制限酵素と同一の
制限酵素を用いる必要はない。微生物ＤＮA断片とベク
ター断片とを結合させる方法は公知のＤＮＡリガーゼを
用いる方法であれば良く、例えば微生物ＤＮA断片の接
着末端とベクター接着断片とのアニーリングの後、適当
なＤＮＡリガーゼの使用により微生物ＤＮＡ断片とベク
ターＤＮＡ断片との組換えベクターを作製する。必要で
あれば、アニーリングの後、宿主微生物に移入して生体
内のＤＮＡリガーゼを利用して組換えベクターを作製す
ることもできる。Such a vector can be cleaved with the restriction enzyme used for cleaving the microbial DNA which is the PNP gene donor described above to obtain a vector fragment. However, the restriction enzyme used for cleaving the microbial DNA is not always required. It is not necessary to use the same restriction enzyme as. The method for ligating the microbial DNA fragment and the vector fragment may be a method using a known DNA ligase. For example, after anneal of the cohesive ends of the microbial DNA fragment and the vector adhesive fragment, microbial DNA is prepared by using an appropriate DNA ligase. A recombinant vector of the fragment and the vector DNA fragment is prepared. If necessary, it is possible to prepare a recombinant vector by using an in vivo DNA ligase after transfer to a host microorganism after annealing.

【００１８】宿主微生物としては、組換えベクターが安
定、かつ自律増殖可能で外来性遺伝子の形質発現できる
ものであれば用いることが可能であるが、一般的には、
エシェリヒア・コリＷ３１１０、エシェリヒア・コリＣ
６００、エシェリヒア・コリＨＢ１０１、エシェリヒア
・コリＪＭ１０９、エシェリヒア・コリＤＨ５αなどを
用いることができる。ただし、エシェリヒア・コリに特
に限定されるものではない。宿主微生物に組換えベクタ
ーを移入する方法としては、例えば宿主微生物がエシェ
リヒア・コリの場合にはカルシウム処理によるコンピテ
ントセル法やエレクトロポーレション法などを用いるこ
とができる。As the host microorganism, any recombinant microorganism can be used as long as it is stable, capable of autonomous growth and capable of expressing a foreign gene, but generally,
Escherichia coli W3110, Escherichia coli C
600, Escherichia coli HB101, Escherichia coli JM109, Escherichia coli DH5α and the like can be used. However, it is not particularly limited to Escherichia coli. As a method for transferring the recombinant vector into the host microorganism, for example, when the host microorganism is Escherichia coli, the competent cell method by calcium treatment or the electroporation method can be used.

【００１９】このようにして得られた形質転換体である
微生物は、栄養培地で培養されることにより、多量のＰ
ＮＰを安定に生産し得る。宿主微生物への目的組換えベ
クターの移入の有無についての選択は、目的とするＤＮ
Ａを保持するベクターの薬剤耐性マーカーとプリンヌク
レオシドホスホリラーゼ活性を同時に発現する微生物を
検索すれば良く、例えば薬剤耐性マーカーに基づく選択
培地で生育し、かつＰＮＰ生成する微生物を選択すれば
良い。The thus obtained transformant microorganism is cultured in a nutrient medium to give a large amount of P.
It is possible to stably produce NP. Whether or not the target recombinant vector is transferred into the host microorganism is selected according to the target DN.
Microorganisms that simultaneously express the drug resistance marker of the vector carrying A and purine nucleoside phosphorylase activity may be searched, for example, microorganisms that grow in a selective medium based on the drug resistance marker and that produce PNPs may be selected.

【００２０】上記の方法により得られたＰＮＰ遺伝子の
塩基配列はサイエンス（Science）Vol.214, 1205-1210
(1981)に記載されたジデオキシ法により解読し、またＰ
ＮＰのアミノ酸配列については決定された塩基配列より
推定した。このようにして一度選択されたプリンヌクレ
オシドホスホリラーゼ遺伝子を保有する組換えベクター
は、形質転換微生物から取り出され、他の微生物に移入
することも容易に実施することができる。またプリンヌ
クレオシドホスホリラーゼ遺伝子を保持する組換えベク
ターから制限酵素やＰＣＲによりプリンヌクレオシドホ
スホリラーゼ遺伝子であるＤＮＡを回収し、他のベクタ
ー断片と結合させ、宿主微生物に移入することも容易に
実施できる。The nucleotide sequence of the PNP gene obtained by the above method is Science Vol.214, 1205-1210.
Decoding by the dideoxy method described in (1981),
The amino acid sequence of NP was estimated from the determined nucleotide sequence. The recombinant vector carrying the purine nucleoside phosphorylase gene thus selected once can be easily taken out from the transformed microorganism and transferred to another microorganism. It is also possible to easily recover the purine nucleoside phosphorylase gene DNA from a recombinant vector carrying the purine nucleoside phosphorylase gene by restriction enzyme or PCR, combine it with another vector fragment, and transfer it to a host microorganism.

【００２１】形質転換体である宿主微生物の培養形態
は、宿主の栄養生理学的性質を考慮して培養条件を選択
すればよく、通常多くの場合は液体培養で行うが、工業
的には通気攪拌培養を行うのが有利である。培地の栄養
源としては、微生物の培養に通常用いられるものが広く
使用され得る。炭素源としては資化可能な炭素化合物で
あればよく、例えば、グルコース、シュークロース、ラ
クトース、マルトース、糖蜜、ピルビン酸などが使用さ
れる。窒素源としては利用可能な窒素化合物であればよ
く、例えば、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイ
ン加水分解物、大豆粕アルカリ抽出物などが使用され
る。その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウ
ム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの
塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応
じて使用される。The culture form of the host microorganism that is a transformant may be selected by considering the nutritional physiological properties of the host and the culture conditions are usually selected. In most cases, liquid culture is carried out. It is advantageous to carry out culturing. As the nutrient source of the medium, those usually used for culturing microorganisms can be widely used. The carbon source may be any assimilable carbon compound, and examples thereof include glucose, sucrose, lactose, maltose, molasses, and pyruvic acid. Any available nitrogen compound may be used as the nitrogen source, and for example, peptone, meat extract, yeast extract, casein hydrolyzate, soybean meal alkali extract and the like are used. In addition, salts such as phosphates, carbonates, sulfates, magnesium, calcium, potassium, iron, manganese and zinc, specific amino acids, specific vitamins and the like are used as necessary.

【００２２】培養温度は菌が生育し、プリンヌクレオシ
ドホスホリラーゼを生産する範囲で適宜変更し得るが、
エシェリヒア・コリの場合、好ましくは２０〜４２℃程
度である。培養時間は条件によって多少異なるが、プリ
ンヌクレオシドホスホリラーゼが最高収量に達する時期
を見計らって適当時期に培養を完了すればよく、通常は
６〜７２時間程度である。培地のｐＨは菌が生育し、プ
リンヌクレオシドホスホリラーゼを生産する範囲で適宜
変更し得るが、好ましくはｐＨ６．０〜９．０程度の範
囲である。The culturing temperature can be appropriately changed within a range in which the bacterium grows and produces purine nucleoside phosphorylase.
In the case of Escherichia coli, the temperature is preferably about 20 to 42 ° C. The culturing time varies somewhat depending on the conditions, but it is sufficient to complete the culturing at an appropriate time in consideration of the time when the maximum yield of purine nucleoside phosphorylase is reached, and it is usually about 6 to 72 hours. The pH of the medium can be appropriately changed within a range in which the bacteria grow and produce purine nucleoside phosphorylase, but it is preferably in the range of about pH 6.0 to 9.0.

【００２３】培養液中のＰＮＰを生産する菌体を含む培
養液をそのまま採取し、利用することもできるが、一般
には、常法に従って、ＰＮＰが培養液中に存在する場合
は濾過、遠心分離などにより、ＰＮＰ含有溶液と微生物
菌体とを分離した後に利用される。ＰＮＰが菌体内に
存在する場合には、得られた培養液から濾過または遠心
分離などの手段により菌体を採取し、次いで、この菌体
を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊
し、また、必要に応じて、ＥＤＴＡ等のキレート剤及び
／又はトリトンＸ−１００等の界面活性剤を添加して酵
素を可溶化し、水溶液として分離採取する。The culture solution containing the PNP-producing cells in the culture solution can be directly collected and used, but generally, when PNP is present in the culture solution, filtration and centrifugation are performed. It is used after separating the PNP-containing solution and the microbial cells by, for example, When PNP exists in the microbial cells, the microbial cells are collected from the obtained culture solution by means such as filtration or centrifugation, and then the microbial cells are disrupted by a mechanical method or an enzymatic method such as lysozyme. Also, if necessary, a chelating agent such as EDTA and / or a surfactant such as Triton X-100 is added to solubilize the enzyme, and then separated and collected as an aqueous solution.

【００２４】このようにしてＰＮＰ含有溶液を、例え
ば、減圧濃縮、膜濃縮、さらに硫酸アンモニウム、硫酸
ナトリウムなどの塩析処理、あるいは親水性有機溶媒、
例えば、メタノール、エタノール、アセトンなどによる
分別沈殿法により沈殿せしめればよい。また、加熱処理
や等電点電気泳動も有効な精製手段である。その後さら
に、吸着剤あるいはゲルろ過、吸着クロマトグラフィ
ー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロ
マトグラフィー等を行うことにより、精製したプリンヌ
クレオシドホスホリラーゼを得ることができる。例え
ば、セファデックス（Sephadex）ゲルＧ−２５（アマシ
ャムバイオサイエンス製）などによるゲルろ過、ＤＥA
ＥセファロースＣＬ−６Ｂ（アマシャムバイオサイエン
ス製）、オクチルセファロースＣＬ−６Ｂ（アマシャム
バイオサイエンス製）等のカラムクロマトグラフィーに
より分離、精製し、精製酵素製品を得ることができる。
該精製酵素標品は電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）的に単
一のバンドを示す程度に純化されている。上記のように
して得られた精製酵素を、例えば凍結乾燥、真空乾燥や
スプレードライなどにより粉末化して流通させることが
可能である。その際、精製酵素はｐＨ６〜８程度のリン
酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液やＧＯＯＤの緩衝液等に
溶解しているものを用いることができる。Thus, the PNP-containing solution is concentrated under reduced pressure, membrane concentration, salting out with ammonium sulfate, sodium sulfate or the like, or with a hydrophilic organic solvent,
For example, it may be precipitated by a fractional precipitation method using methanol, ethanol, acetone or the like. Further, heat treatment and isoelectric focusing are also effective purification means. Thereafter, a purified purine nucleoside phosphorylase can be obtained by further performing an adsorbent or gel filtration, adsorption chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography and the like. For example, gel filtration with Sephadex gel G-25 (manufactured by Amersham Biosciences), DEA
E-Sepharose CL-6B (manufactured by Amersham Bioscience), octyl Sepharose CL-6B (manufactured by Amersham Bioscience), etc. can be separated and purified by column chromatography to obtain a purified enzyme product.
The purified enzyme preparation was purified to the extent that it showed a single band by electrophoresis (SDS-PAGE). The purified enzyme obtained as described above can be pulverized and distributed by, for example, freeze drying, vacuum drying, spray drying, or the like. At that time, as the purified enzyme, those dissolved in a phosphate buffer solution, a Tris-hydrochloric acid buffer solution, a GOOD buffer solution or the like having a pH of about 6 to 8 can be used.

【００２５】本発明のプリンヌクレオシドホスホリラー
ゼの一例は、以下に示す理化学的性質を有する。作用：プリンヌクレオシド＋オルソリン酸→α―Ｄ−リ
ボース−１−リン酸＋プリン基質特異性：プリンヌクレオシドとしてイノシン、キサ
ントシン、グアノシンを利用する熱安定性：５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．７）中で７
５℃、３０分処理後の活性残存率が９０％以上ｐＨ安定性：ｐＨ６〜１０の範囲で、３０℃、１９時間
処理後の活性残存率が９０％以上 An example of the purine nucleoside phosphorylase of the present invention has the following physicochemical properties. Action: Purine nucleoside + orthophosphate → α-D-ribose-1-phosphate + purine substrate Specificity: Inosine, xanthosine, and guanosine are used as purine nucleosides Thermal stability: in 50 mM phosphate buffer (pH 7.7) In 7
90% or more of residual activity after treatment at 5 ° C for 30 minutes pH stability: 90% or more of residual activity after treatment at 30 ° C for 19 hours at pH 6 to 10

【００２６】本発明の無機リン測定用試薬は、上記のよ
うなプリンヌクレオシドホスホリラーゼ、キサンチンオ
キシダーゼ、ならびにペルオキシダーゼもしくはカタラ
ーゼならびに過酸化水素検出試薬を含んでなる。キサ
ンチンオキシダーゼ、ペルオキシダーゼおよびカタラー
ゼは従来から公知のものを使用することができる。ここ
で、過酸化水素検出試薬とは、プリンヌクレオシドホス
ホリラーゼとキサンチンオキシダーゼにより生成した過
酸化水素をペルオキシダーゼまたはカタラーゼにより検
出する試薬であって、例えば、４−アミノアンチピリン
とフェノール誘導体またはアニリン誘導体等が挙げられ
るが、特にこれらのものには限定されない。The reagent for measuring inorganic phosphorus of the present invention comprises the above-mentioned purine nucleoside phosphorylase, xanthine oxidase, peroxidase or catalase, and hydrogen peroxide detection reagent. As the xanthine oxidase, peroxidase and catalase, conventionally known ones can be used. Here, the hydrogen peroxide detection reagent is a reagent for detecting hydrogen peroxide produced by purine nucleoside phosphorylase and xanthine oxidase by peroxidase or catalase, and examples thereof include 4-aminoantipyrine and a phenol derivative or an aniline derivative. However, it is not particularly limited to these.

【００２７】また本発明の無機リン測定用試薬の別な態
様としては、上記プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、
キサンチンオキシダーゼおよび酸化型ニコチンアミドア
デニンジヌクレオチドを含んでなる。キサンチンデヒド
ロゲナーゼは従来から公知のものを使用することができ
る。Another embodiment of the reagent for measuring inorganic phosphorus of the present invention is the above purine nucleoside phosphorylase,
It comprises xanthine oxidase and oxidized nicotinamide adenine dinucleotide. As the xanthine dehydrogenase, a conventionally known one can be used.

【００２８】また本発明のイノシン測定用試薬は、上記
プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、キサンチンオキシ
ダーゼ、ならびにペルオキシダーゼもしくはカタラー
ゼ、ならびに過酸化水素検出試薬を含んでなる。キサ
ンチンオキシダーゼ、ペルオキシダーゼおよびカタラー
ゼは従来から公知のものを使用することができる。また
本発明のイノシン測定試薬の別な態様としては、上記プ
リンヌクレオシドホスホリラーゼ、キサンチンオキシダ
ーゼおよび酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチ
ドを含んでなる。キサンチンデヒドロゲナーゼは従来か
ら公知のものを使用することができる。本発明のイノシ
ン測定用試薬には、例えばアデノシンデアミナーゼ測定
試薬や５'−ヌクレオチダーゼ測定試薬のように、反応
の中間生成物としてイノシンが生成するような試薬も含
有される。The reagent for measuring inosine of the present invention comprises the above purine nucleoside phosphorylase, xanthine oxidase, peroxidase or catalase, and a hydrogen peroxide detection reagent. As the xanthine oxidase, peroxidase and catalase, conventionally known ones can be used. Another aspect of the reagent for measuring inosine of the present invention comprises the above-mentioned purine nucleoside phosphorylase, xanthine oxidase, and oxidized nicotinamide adenine dinucleotide. As the xanthine dehydrogenase, a conventionally known one can be used. The reagent for measuring inosine of the present invention also includes a reagent such as adenosine deaminase measuring reagent and 5'-nucleotidase measuring reagent, which produces inosine as an intermediate product of the reaction.

【００２９】本発明において、プリンヌクレオシドホス
ホリラーゼ活性の測定は以下の条件で行う。＜試薬＞５０ｍＭＫ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．７）３２ｍＭイノシン水溶液キサンチンオキシダーゼ溶液（ロシュ製ＸＯＤを６Ｕ／
ｍｌに希釈する）In the present invention, the purine nucleoside phosphorylase activity is measured under the following conditions. <Reagent> 50 mM K-phosphate buffer solution (pH 7.7) 32 mM aqueous inosine xanthine oxidase solution (6 U of Roche XOD /
dilute to ml)

【００３０】＜測定条件＞上記Ｋ−リン酸緩衝液２．７
ｍｌ、イノシン溶液０．２ｍｌ、キサンチンオキシダー
ゼ溶液０．１ｍｌをキュベットに調製し、３７℃で約５
分間予備加温する。酵素溶液０．０５ｍｌを添加し、ゆ
るやかに混和後、水を対照に３７℃に制御された分光光
度計で、２９３ｎｍの吸光度変化を３〜４分間記録し、
その初期直線部分から１分間あたりの吸光度変化を測定
する。盲検は酵素溶液の代わりに蒸留水を試薬混液に加
えて、以下同様に吸光度変化を測定する。上記条件下で
１分間に１マイクロモルの尿酸を生成する酵素量を１単
位とする。<Measurement conditions> The above K-phosphate buffer solution 2.7
ml, 0.2 ml of inosine solution and 0.1 ml of xanthine oxidase solution were prepared in a cuvette, and the mixture was kept at 37 ° C for about 5
Preheat for minutes. After adding 0.05 ml of the enzyme solution and gently mixing, an absorbance change at 293 nm was recorded for 3 to 4 minutes with a spectrophotometer controlled at 37 ° C. with water as a control,
From the initial linear portion, the change in absorbance per minute is measured. In the blind test, distilled water is added to the reagent mixture instead of the enzyme solution, and the change in absorbance is similarly measured. One unit is the amount of enzyme that produces 1 micromol of uric acid per minute under the above conditions.

【００３１】[0031]

【実施例】以下、本発明を実施例により具体的に説明す
る。EXAMPLES The present invention will be specifically described below with reference to examples.

【００３２】実施例１染色体ＤＮＡの分離サーマス・アクアティカスＤＳＭ６２５の染色体ＤＮＡ
を次の方法で分離した。同菌株を０．５％肉エキスを含
むＬＢ培地で６５℃、一晩振とう培養した後、遠心分離
（８，０００ｒｐｍ、２０分間）により集菌した。１５
ｍＭクエン酸ナトリウム、０．１５Ｍ塩化ナトリウムを
含んだ溶液で菌体を洗浄した後、２０％シュークロー
ス、５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．６）、１ｍＭＥ
ＤＴＡを含んだ溶液５ｍｌに懸濁し、１ｍｌのリゾチー
ム溶液（１００ｍｇ／ｍｌ）を加えて、３７℃、３０分
間保温し、次いで１１ｍｌの１％ラウロイルサルコシ
ン、０．１ＭＥＤＴＡ（ｐＨ９．６）を含む溶液を加
えた。この懸濁液に臭化エチジウム溶液を０．５％塩化
セシウムを約１００％加えて攪拌混合し、５５，０００
ｒｐｍ、２０時間の超遠心分離によりＤＮＡを分取し
た。分取したＤＮＡは１ｍＭＥＤTＡを含んだ１０ｍＭ
トリス−塩酸（ｐＨ８．０）溶液（以下、ＴＥと略記す
る）で透析し、精製ＤＮＡ標品とした。これを等量のク
ロロホルム−フェノール溶液で処理後遠心分離により水
層を分取し、２倍量のエタノールを加えて上記方法でも
う一度ＤＮＡを分離し、２ｍｌのＴＥで溶解した。Example 1 Isolation of chromosomal DNA The chromosomal DNA of Thermus aquaticus DSM625
Was separated by the following method. The strain was cultivated in an LB medium containing 0.5% meat extract at 65 ° C. with shaking overnight, and then collected by centrifugation (8,000 rpm, 20 minutes). 15
After washing the cells with a solution containing mM sodium citrate and 0.15 M sodium chloride, 20% sucrose, 50 mM Tris-hydrochloric acid (pH 7.6), 1 mM E
Suspended in 5 ml of a solution containing DTA, added 1 ml of a lysozyme solution (100 mg / ml) and kept at 37 ° C. for 30 minutes, and then contained 11 ml of 1% lauroyl sarcosine and 0.1 M EDTA (pH 9.6). The solution was added. About 100% of 0.5% cesium chloride was added to this suspension of ethidium bromide solution, and the mixture was stirred and mixed at 55,000
DNA was fractionated by ultracentrifugation at rpm for 20 hours. Fractionated DNA is 10 mM containing 1 mM EDTA
It was dialyzed against a Tris-hydrochloric acid (pH 8.0) solution (hereinafter abbreviated as TE) to obtain a purified DNA sample. This was treated with an equal volume of chloroform-phenol solution, and then the aqueous layer was separated by centrifugation, twice the amount of ethanol was added, the DNA was separated again by the above-mentioned method, and dissolved with 2 ml of TE.

【００３３】実施例２プリンヌクレオシドホスホリラ
ーゼをコードする遺伝子を含有するＤＮＡ断片及び該Ｄ
ＮＡ断片を有する組換えベクターの調製既知のプリンヌクレオシドホスホリラーゼの塩基配列を
参考にし、ＰＣＲ用プライマーＭＰＮＰ２ｓ（配列番号
３）、ＭＰＮＰ３ａ（配列番号４）を作製した。実施
例１のＤＮＡを鋳型とし、TaｑＤＮAポリメラーゼを
用い、以下のサイクルでＰＣＲを行った。ステップ１：９５℃、４５秒ステップ２：４５℃、４５秒ステップ３：７２℃、４５秒（３０サイクル）得られたＰＣＲ産物を１％アガロースゲルにて泳動する
と、０．４１ｋｂの大きさの特異的バンドが認められた
ので、これを常法にて単離し、Gene images random pri
me module（アマシャムバイオサイエンス製）にてフル
オレセイン標識を行った。Example 2 DNA Fragment Containing Gene Encoding Purine Nucleoside Phosphorylase and D
Preparation of Recombinant Vector Having NA Fragment PCR primers MPNP2s (SEQ ID NO: 3) and MPNP3a (SEQ ID NO: 4) were prepared with reference to the known purine nucleoside phosphorylase nucleotide sequence. Using the DNA of Example 1 as a template and Taq DNA polymerase, PCR was performed in the following cycle. Step 1: 95 ° C., 45 seconds Step 2: 45 ° C., 45 seconds Step 3: 72 ° C., 45 seconds (30 cycles) When the obtained PCR product was electrophoresed on a 1% agarose gel, a size of 0.41 kb was obtained. Since a specific band was observed, this was isolated by a conventional method and the Gene images random pri
Fluorescein labeling was performed using a me module (Amersham Bioscience).

【００３４】次に実施例１のＤＮＡを種々の制限酵素で
切断後、１％アガロースゲルで分離し、Hybond N⁺メン
ブレン（アマシャムバイオサイエンス製）に転写した。
ＤＮＡは８０℃、２時間加温することにより固定し、５
０ｍＭＮａ−リン酸緩衝液、１Ｘliquid block（ア
マシャムバイオサイエンス製）と０．１％ＳＤＳを含む
５×ＳＳＣ中で６０℃、２時間プレハイブリダイゼーシ
ョンを行った。ハイブリダイゼーションは標識プローブ
を含む同溶液１０ｍｌで６０℃、１６時間行い、０．１
％ＳＤＳを含む１×ＳＳＣ１００ｍｌで２回洗浄し
た。次にキットに添付のプロトコールに従い、抗フルオ
レセイン抗体−アルカリホスファターゼ標識体、検出試
薬と反応させ、Ｘ線フィルムに露光させた。その結果、
プローブは染色体ＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩとＸｈｏＩで
消化して得られる断片とハイブリダイズしていることが
確認された。Next, the DNA of Example 1 was digested with various restriction enzymes, separated on a 1% agarose gel, and transferred to Hybond N ⁺ membrane (manufactured by Amersham Biosciences).
Fix DNA by heating at 80 ℃ for 2 hours,
Prehybridization was carried out at 60 ° C. for 2 hours in 5 × SSC containing 0 mM Na-phosphate buffer, 1 × liquid block (manufactured by Amersham Biosciences) and 0.1% SDS. Hybridization was carried out with 10 ml of the same solution containing the labeled probe at 60 ° C. for 16 hours, and then 0.1
It was washed twice with 100 ml of 1 × SSC containing% SDS. Then, according to the protocol attached to the kit, it was reacted with an anti-fluorescein antibody-alkaline phosphatase label and a detection reagent, and exposed to an X-ray film. as a result,
It was confirmed that the probe hybridized with a fragment obtained by digesting chromosomal DNA with HindIII and XhoI.

【００３５】そこで実施例１のＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩ
とＸｈｏＩで消化し，同じくＨｉｎｄＩＩＩとＸｈｏＩ
で消化して得られたｐＢｌｕｅｓｃｒｐＴIIＳＫ（−）
開環物とライゲーション後、エシェリヒア・コリＸＬ１
−Ｂｌｕｅを形質転換した。１００μｇ／ｍｌのアンピ
シリンを含むＬＢ培地に生育した形質転換体はHybondN⁺
メンブレンにレプリカし、溶菌させた。得られたメンブ
レンは固定後、コロニーハイブリダイゼーションを行っ
た。２０００個のコロニーより２個のポジティブクロー
ンが得られたが、これらは全て同じクローンであった。
該クローンをｐＴＡＭＰ６と命名した。Therefore, the DNA of Example 1 was replaced with HindIII.
Digested with XhoI and HindIII and XhoI
PBluescrpTIISK (-) obtained by digesting with
After opening and ligation, Escherichia coli XL1
-Blue was transformed. Transformants grown in LB medium containing 100 μg / ml ampicillin were Hybond N ^+.
The membrane was replicated and lysed. After fixing the obtained membrane, colony hybridization was performed. Two positive clones were obtained from 2000 colonies, but they were all the same clones.
The clone was named pTAMP6.

【００３６】実施例３塩基配列の決定ｐＴＡＭＰ６の約１．４ｋｂｐの挿入ＤＮＡについて、
BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit（Applied Bi
osystems製）とABI PRISM 310Genetic analyzer（PERKI
N ELMER製）を用いてプリンヌクレオチドホスホリラー
ゼ遺伝子の塩基配列を決定した。決定した塩基配列およ
びアミノ酸配列を配列表に示した。アミノ酸配列から求
められるタンパク質の分子量は約３１，０００であっ
た。Example 3 Determination of nucleotide sequence About 1.4 kbp of the inserted DNA of pTAMP6,
BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Bi
osystems) and ABI PRISM 310 Genetic analyzer (PERKI
NELMER) was used to determine the nucleotide sequence of the purine nucleotide phosphorylase gene. The determined nucleotide sequence and amino acid sequence are shown in the sequence listing. The molecular weight of the protein determined from the amino acid sequence was about 31,000.

【００３７】実施例４形質転換体の作製エシェリヒア・コリＪＭ１０９コンピテントセルをｐＴ
ＡＭＰ６で形質転換し、形質転換体エシェリヒア・コリ
ＪＭ１０９（ｐＴＡＭＰ６）を得た。Example 4 Preparation of Transformant Escherichia coli JM109 competent cells were treated with pT.
Transforming with AMP6, a transformant Escherichia coli JM109 (pTAMP6) was obtained.

【００３８】実施例５エシェリヒア・コリＪＭ１０９
（ｐＴＡＭＰ６）からのプリンヌクレオシドホスホリラ
ーゼの製造ＴＢ培地５００ｍｌを２Ｌフラスコに分注し、１２１
℃、２０分間オートクレーブを行い、放冷後、別途無菌
濾過した１００ｍｇ／ｍｌアンピシリン（ナカライテス
ク製）０．５ｍｌを添加した。この培地にＬＢ培地で予
め３０℃、１６時間振とう培養したエシェリヒア・コリ
ＪＭ１０９（ｐＴＡＭＰ６）の培養液５ｍｌを接種し、
３７℃で２２時間通気攪拌培養した。培養終了時のプリ
ンヌクレオシドホスホリラーゼ活性は約２２Ｕ／ｍｌで
あった。Example 5 Escherichia coli JM109
Production of purine nucleoside phosphorylase from (pTAMP6) 500 ml of TB medium was dispensed into a 2 L flask, and 121
After autoclaving at 20 ° C. for 20 minutes and allowing to cool, 0.5 ml of 100 mg / ml ampicillin (manufactured by Nacalai Tesque) separately sterile filtered was added. This medium was inoculated with 5 ml of a culture solution of Escherichia coli JM109 (pTAMP6) which had been shake-cultured in LB medium at 30 ° C. for 16 hours in advance,
The culture was performed at 37 ° C for 22 hours with aeration and stirring. Purine nucleoside phosphorylase activity at the end of culture was about 22 U / ml.

【００３９】上記菌体を遠心分離にて集菌し、５０ｍＭ
リン酸緩衝液（ｐＨ７．７）に懸濁した。上記菌体懸濁
液を超音波破砕後、遠心分離を行い、上清液を得た。得
られた粗酵素液をポリエチレンイミンによる除核酸処理
および硫安分画を行った後、セファデックス（Sephade
x）Ｇ−２５（アマシャムバイオサイエンス製）による
ゲル濾過により脱塩し、これについて６８℃で１時間の
加温処理を行った。生成した不溶性物質を遠心分離によ
り除去した後、ＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂ（アマ
シャムバイオサイエンス製）カラムクロマトグラフィー
により分離、精製を行い、精製酵素標品を得た。本方法
により得られたプリンヌクレオシドホスホリラーゼ標品
は、電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）的にほぼ単一なバン
ドを示し、この時の比活性は２４４Ｕ／ｍｇ−ｓタンパ
ク質であった。The above cells were collected by centrifugation to obtain 50 mM.
It was suspended in a phosphate buffer (pH 7.7). The cell suspension was ultrasonically disrupted and then centrifuged to obtain a supernatant. The obtained crude enzyme solution was subjected to nucleic acid removal treatment with polyethyleneimine and ammonium sulfate fractionation, followed by Sephadex (Sephade).
x) Desalted by gel filtration using G-25 (manufactured by Amersham Bioscience), and this was heated at 68 ° C. for 1 hour. After removing the generated insoluble substance by centrifugation, it was separated and purified by DEAE Sepharose CL-6B (manufactured by Amersham Biosciences) column chromatography to obtain a purified enzyme preparation. The purine nucleoside phosphorylase preparation obtained by this method showed an almost single band by electrophoresis (SDS-PAGE), and the specific activity at this time was 244 U / mg-s protein.

【００４０】以下に、上記方法により得られたプリンヌ
クレオシドホスホリラーゼの性質を示す。作用：プリンヌクレオシド＋オルソリン酸→α―Ｄ−リ
ボース−１−リン酸＋プリン基質特異性：プリンヌクレオシドとしてイノシン、グア
ノシンを利用する熱安定性：５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．７）中で７
５℃、３０分処理後の活性残存率が９７％ｐＨ安定性：ｐＨ６〜１０の範囲で、３０℃、１９時間
処理後の活性残存率が９０％以上 The properties of the purine nucleoside phosphorylase obtained by the above method are shown below. Action: Purine nucleoside + orthophosphate → α-D-ribose-1-phosphate + purine substrate Specificity: Thermal stability utilizing inosine and guanosine as purine nucleosides: 7 in 50 mM phosphate buffer (pH 7.7)
97% residual activity after treatment at 5 ° C for 30 minutes pH stability: 90% or more residual activity after treatment at 30 ° C for 19 hours in the pH range of 6-10.

【００４１】比較例１市販のプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（東洋紡製；
微生物由来）を５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．７）に
溶解し、５０〜８０℃の各温度で３０分熱処理後の活性
残存率を測定した。７５℃、３０分処理後の活性残存率
は４７％であった。Comparative Example 1 Commercially available purine nucleoside phosphorylase (manufactured by Toyobo;
Microorganism-derived) was dissolved in 50 mM phosphate buffer (pH 7.7), and the residual activity ratio after heat treatment for 30 minutes at each temperature of 50 to 80 ° C. was measured. The residual activity rate after treatment at 75 ° C. for 30 minutes was 47%.

【００４２】[0042]

【発明の効果】上述したように、本発明により、サーマ
ス属細菌より、優れた耐熱性を有する新規なプリンヌク
レオシドホスホリラーゼ遺伝子が単離された。また、遺
伝子工学的技術によるＰＮＰの大量供給と、無機リンも
しくはイノシンの定量への利用が可能になった。さら
に、該ＰＮＰ遺伝子を改変することより、理化学的性質
の改良された新規なプリンヌクレオシドホスホリラーゼ
を製造する方法を導き出すことができる。INDUSTRIAL APPLICABILITY As described above, according to the present invention, a novel purine nucleoside phosphorylase gene having excellent thermostability was isolated from a bacterium of Thermus genus. Further, it became possible to supply a large amount of PNP by genetic engineering technology and use it for quantification of inorganic phosphorus or inosine. Furthermore, by modifying the PNP gene, a method for producing a novel purine nucleoside phosphorylase having improved physicochemical properties can be derived.

【００４３】[0043]

【配列表】 <110> Toyo Boseki Kabushiki Kaisya <120> 新規プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、該遺伝子及び新規プリンヌクレオシドホスホリラーゼの製造法 <130> 02-0422 <141> 2002-05-29 <160> 4 <170> <210> 1 <211> 283 <212> PRT <213> サーマス・アクアティカス（Thermus aquaticus）DSM625 <400> 1 MET Arg Gly Lys Arg MET Asp Arg Gln Ala Ile Glu Lys Thr Ala Gly 1 5 10 15 His Leu Arg Pro Leu MET Pro Thr Pro Pro Glu Ile Gly Leu Ile Leu 20 25 30 Gly Ser Gly Leu Gly Val Leu Ala Asp Glu Ile Glu Glu Ala Val Arg 35 40 45 Ile Pro Tyr Glu Asp Ile Pro Gly Phe Pro Val Ser Thr Val Glu Gly 50 55 60 His Ala Gly Arg Leu Val Tyr Gly Arg Leu Glu Gly Ala Thr Val Val 65 70 75 80 Ala MET Gln Gly Arg Phe His Tyr Tyr Glu Gly Tyr Ser Leu Gln Glu 85 90 95 Val Thr Phe Pro Val Arg Val MET Lys Ala Leu Gly Val Arg Glu Leu 100 105 110 Ile Val Thr Asn Ala Ala Gly Gly Ile Asn Glu Arg Phe Gln Pro Gly 115 120 125 Asp Phe MET Ile Ile Ser Asp His Ile Asn Leu Leu Gly Thr Asn Pro 130 135 140 Leu Ile Gly Pro Asn Asp Pro Glu Leu Gly Pro Arg Phe Pro Asp MET 145 150 155 160 Thr Glu Ala Tyr Ser Arg Arg Leu Arg Glu Leu Ala Lys Glu Thr Ala 165 170 175 Ala Arg Leu Gly Val Arg Val His Glu Gly Val Tyr Val Ala Asn Thr 180 185 190 Gly Pro Ser Tyr Glu Thr Pro Ala Glu Ile Arg MET Ile Arg Thr Leu 195 200 205 Gly Gly Asp Ala Val Gly MET Ser Thr Val Pro Glu Val Ile Val Ala 210 215 220 Arg His Gly Gly Ile Glu Val Leu Gly Ile Ser Cys Ile Ser Asn MET 225 230 235 240 Ala Ala Gly MET Ser Asp Ala Pro Leu His His Asp Glu Val Val Glu 245 250 255 Thr Ala Glu Arg Val Lys Thr Asp Phe Leu Arg Phe Val Lys Ala Ile 260 265 270 Val Ala Glu MET Ala Lys Ser Lys Arg Lys Arg 275 280[Sequence list] <110> Toyo Boseki Kabushiki Kaisya <120> Novel purine nucleoside phosphorylase, the gene and novel purine nucleoside Method for producing oside phosphorylase <130> 02-0422 <141> 2002-05-29 <160> 4 <170> <210> 1 <211> 283 <212> PRT <213> Thermus aquaticus DSM625 <400> 1 MET Arg Gly Lys Arg MET Asp Arg Gln Ala Ile Glu Lys Thr Ala Gly 1 5 10 15 His Leu Arg Pro Leu MET Pro Thr Pro Pro Glu Ile Gly Leu Ile Leu 20 25 30 Gly Ser Gly Leu Gly Val Leu Ala Asp Glu Ile Glu Glu Ala Val Arg 35 40 45 Ile Pro Tyr Glu Asp Ile Pro Gly Phe Pro Val Ser Thr Val Glu Gly 50 55 60 His Ala Gly Arg Leu Val Tyr Gly Arg Leu Glu Gly Ala Thr Val Val 65 70 75 80 Ala MET Gln Gly Arg Phe His Tyr Tyr Glu Gly Tyr Ser Leu Gln Glu 85 90 95 Val Thr Phe Pro Val Arg Val MET Lys Ala Leu Gly Val Arg Glu Leu 100 105 110 Ile Val Thr Asn Ala Ala Gly Gly Ile Asn Glu Arg Phe Gln Pro Gly 115 120 125 Asp Phe MET Ile Ile Ser Asp His Ile Asn Leu Leu Gly Thr Asn Pro 130 135 140 Leu Ile Gly Pro Asn Asp Pro Glu Leu Gly Pro Arg Phe Pro Asp MET 145 150 155 160 Thr Glu Ala Tyr Ser Arg Arg Leu Arg Glu Leu Ala Lys Glu Thr Ala 165 170 175 Ala Arg Leu Gly Val Arg Val His Glu Gly Val Tyr Val Ala Asn Thr 180 185 190 Gly Pro Ser Tyr Glu Thr Pro Ala Glu Ile Arg MET Ile Arg Thr Leu 195 200 205 Gly Gly Asp Ala Val Gly MET Ser Thr Val Pro Glu Val Ile Val Ala 210 215 220 Arg His Gly Gly Ile Glu Val Leu Gly Ile Ser Cys Ile Ser Asn MET 225 230 235 240 Ala Ala Gly MET Ser Asp Ala Pro Leu His His Asp Glu Val Val Glu 245 250 255 Thr Ala Glu Arg Val Lys Thr Asp Phe Leu Arg Phe Val Lys Ala Ile 260 265 270 Val Ala Glu MET Ala Lys Ser Lys Arg Lys Arg 275 280

【００４４】 <210> 2 <211> 849 <212> DNA <213> サーマス・アクアティカス（Thermus aquaticus）DSM625 <400> 2 ATG AGG GGG AAA AGA ATG GAT CGA CAA GCG ATT GAA AAA ACC GCC GGT 48 MET Arg Gly Lys Arg MET Asp Arg Gln Ala Ile Glu Lys Thr Ala Gly 1 5 10 15 CAT TTG CGC CCA TTG ATG CCA ACT CCG CCT GAA ATC GGT CTC ATT CTC 96 His Leu Arg Pro Leu MET Pro Thr Pro Pro Glu Ile Gly Leu Ile Leu 20 25 30 GGC TCG GGG CTC GGC GTG CTC GCT GAT GAA ATC GAA GAG GCG GTT CGC 144 Gly Ser Gly Leu Gly Val Leu Ala Asp Glu Ile Glu Glu Ala Val Arg 35 40 45 ATT CCG TAT GAA GAT ATT CCC GGA TTT CCA GTG TCG ACC GTT GAA GGA 192 Ile Pro Tyr Glu Asp Ile Pro Gly Phe Pro Val Ser Thr Val Glu Gly 50 55 60 CAC GCT GGA CGG CTC GTA TAT GGG CGG CTT GAG GGG GCG ACC GTT GTC 240 His Ala Gly Arg Leu Val Tyr Gly Arg Leu Glu Gly Ala Thr Val Val 65 70 75 80 GCC ATG CAA GGG CGG TTT CAT TAT TAT GAA GGG TAT TCG CTT CAG GAA 288 Ala MET Gln Gly Arg Phe His Tyr Tyr Glu Gly Tyr Ser Leu Gln Glu 85 90 95 GTG ACG TTT CCC GTC CGG GTG ATG AAG GCG CTT GGC GTC CGC GAA TTG 336 Val Thr Phe Pro Val Arg Val MET Lys Ala Leu Gly Val Arg Glu Leu 100 105 110 ATC GTG ACA AAC GCT GCG GGC GGC ATC AAC GAA CGG TTC CAG CCC GGC 384 Ile Val Thr Asn Ala Ala Gly Gly Ile Asn Glu Arg Phe Gln Pro Gly 115 120 125 GAT TTC ATG ATC ATT TCC GAC CAT ATC AAC TTG CTG GGC ACA AAT CCG 432 Asp Phe MET Ile Ile Ser Asp His Ile Asn Leu Leu Gly Thr Asn Pro 130 135 140 CTC ATT GGT CCG AAC GAT CCG GAG CTT GGT CCG CGC TTT CCG GAC ATG 480 Leu Ile Gly Pro Asn Asp Pro Glu Leu Gly Pro Arg Phe Pro Asp MET 145 150 155 160 ACG GAA GCG TAC AGC CGG CGG CTG CGC GAG CTC GCC AAG GAA ACG GCG 528 Thr Glu Ala Tyr Ser Arg Arg Leu Arg Glu Leu Ala Lys Glu Thr Ala 165 170 175 GCG AGA CTT GGC GTT CGC GTG CAT GAA GGA GTA TAT GTC GCC AAT ACG 576 Ala Arg Leu Gly Val Arg Val His Glu Gly Val Tyr Val Ala Asn Thr 180 185 190 GGG CCG TCG TAC GAA ACG CCG GCG GAA ATC CGC ATG ATT CGT ACG CTC 624 Gly Pro Ser Tyr Glu Thr Pro Ala Glu Ile Arg MET Ile Arg Thr Leu 195 200 205 GGC GGC GAT GCG GTC GGC ATG TCG ACC GTC CCG GAA GTG ATC GTC GCC 672 Gly Gly Asp Ala Val Gly MET Ser Thr Val Pro Glu Val Ile Val Ala 210 215 220 CGC CAC GGC GGC ATT GAG GTG CTC GGC ATT TCG TGC ATT TCG AAT ATG 720 Arg His Gly Gly Ile Glu Val Leu Gly Ile Ser Cys Ile Ser Asn MET 225 230 235 240 GCT GCA GGG ATG TCG GAT GCT CCG CTT CAC CAC GAC GAA GTG GTT GAA 768 Ala Ala Gly MET Ser Asp Ala Pro Leu His His Asp Glu Val Val Glu 245 250 255 ACG GCC GAG CGG GTG AAG ACG GAC TTT TTG CGG TTT GTG AAA GCG ATT 816 Thr Ala Glu Arg Val Lys Thr Asp Phe Leu Arg Phe Val Lys Ala Ile 260 265 270 GTC GCC GAA ATG GCG AAA TCA AAA CGA AAA AGG 849 Val Ala Glu MET Ala Lys Ser Lys Arg Lys Arg 275 280[0044] <210> 2 <211> 849 <212> DNA <213> Thermus aquaticus DSM625 <400> 2 ATG AGG GGG AAA AGA ATG GAT CGA CAA GCG ATT GAA AAA ACC GCC GGT 48 MET Arg Gly Lys Arg MET Asp Arg Gln Ala Ile Glu Lys Thr Ala Gly 1 5 10 15 CAT TTG CGC CCA TTG ATG CCA ACT CCG CCT GAA ATC GGT CTC ATT CTC 96 His Leu Arg Pro Leu MET Pro Thr Pro Pro Glu Ile Gly Leu Ile Leu 20 25 30 GGC TCG GGG CTC GGC GTG CTC GCT GAT GAA ATC GAA GAG GCG GTT CGC 144 Gly Ser Gly Leu Gly Val Leu Ala Asp Glu Ile Glu Glu Ala Val Arg 35 40 45 ATT CCG TAT GAA GAT ATT CCC GGA TTT CCA GTG TCG ACC GTT GAA GGA 192 Ile Pro Tyr Glu Asp Ile Pro Gly Phe Pro Val Ser Thr Val Glu Gly 50 55 60 CAC GCT GGA CGG CTC GTA TAT GGG CGG CTT GAG GGG GCG ACC GTT GTC 240 His Ala Gly Arg Leu Val Tyr Gly Arg Leu Glu Gly Ala Thr Val Val 65 70 75 80 GCC ATG CAA GGG CGG TTT CAT TAT TAT GAA GGG TAT TCG CTT CAG GAA 288 Ala MET Gln Gly Arg Phe His Tyr Tyr Glu Gly Tyr Ser Leu Gln Glu 85 90 95 GTG ACG TTT CCC GTC CGG GTG ATG AAG GCG CTT GGC GTC CGC GAA TTG 336 Val Thr Phe Pro Val Arg Val MET Lys Ala Leu Gly Val Arg Glu Leu 100 105 110 ATC GTG ACA AAC GCT GCG GGC GGC ATC AAC GAA CGG TTC CAG CCC GGC 384 Ile Val Thr Asn Ala Ala Gly Gly Ile Asn Glu Arg Phe Gln Pro Gly 115 120 125 GAT TTC ATG ATC ATT TCC GAC CAT ATC AAC TTG CTG GGC ACA AAT CCG 432 Asp Phe MET Ile Ile Ser Asp His Ile Asn Leu Leu Gly Thr Asn Pro 130 135 140 CTC ATT GGT CCG AAC GAT CCG GAG CTT GGT CCG CGC TTT CCG GAC ATG 480 Leu Ile Gly Pro Asn Asp Pro Glu Leu Gly Pro Arg Phe Pro Asp MET 145 150 155 160 ACG GAA GCG TAC AGC CGG CGG CTG CGC GAG CTC GCC AAG GAA ACG GCG 528 Thr Glu Ala Tyr Ser Arg Arg Leu Arg Glu Leu Ala Lys Glu Thr Ala 165 170 175 GCG AGA CTT GGC GTT CGC GTG CAT GAA GGA GTA TAT GTC GCC AAT ACG 576 Ala Arg Leu Gly Val Arg Val His Glu Gly Val Tyr Val Ala Asn Thr 180 185 190 GGG CCG TCG TAC GAA ACG CCG GCG GAA ATC CGC ATG ATT CGT ACG CTC 624 Gly Pro Ser Tyr Glu Thr Pro Ala Glu Ile Arg MET Ile Arg Thr Leu 195 200 205 GGC GGC GAT GCG GTC GGC ATG TCG ACC GTC CCG GAA GTG ATC GTC GCC 672 Gly Gly Asp Ala Val Gly MET Ser Thr Val Pro Glu Val Ile Val Ala 210 215 220 CGC CAC GGC GGC ATT GAG GTG CTC GGC ATT TCG TGC ATT TCG AAT ATG 720 Arg His Gly Gly Ile Glu Val Leu Gly Ile Ser Cys Ile Ser Asn MET 225 230 235 240 GCT GCA GGG ATG TCG GAT GCT CCG CTT CAC CAC GAC GAA GTG GTT GAA 768 Ala Ala Gly MET Ser Asp Ala Pro Leu His His Asp Glu Val Val Glu 245 250 255 ACG GCC GAG CGG GTG AAG ACG GAC TTT TTG CGG TTT GTG AAA GCG ATT 816 Thr Ala Glu Arg Val Lys Thr Asp Phe Leu Arg Phe Val Lys Ala Ile 260 265 270 GTC GCC GAA ATG GCG AAA TCA AAA CGA AAA AGG 849 Val Ala Glu MET Ala Lys Ser Lys Arg Lys Arg 275 280

【００４５】 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> artificial sequence <400> 3 GGGCGGTTTC ATTHNTAYGA RGG 23[0045] <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> artificial sequence <400> 3 GGGCGGTTTC ATTHNTAYGA RGG 23

【００４６】 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <400> 4 GTTGACATGC CNACNGCRTC 20[0046] <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <400> 4 GTTGACATGC CNACNGCRTC 20

【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

【図１】本発明及び比較例のプリンヌクレオシドホスホ
リラーゼの熱安定性を示す図である。（５０ｍＭＫ−
リン酸緩衝液、ｐＨ７．７中）FIG. 1 shows the thermostability of purine nucleoside phosphorylases of the present invention and comparative examples. (50 mM K-
Phosphate buffer, pH 7.7)

【図２】本発明のプリンヌクレオシドホスホリラーゼの
ｐＨ安定性を示す図である。（５０ｍＭ酢酸緩衝液、
ｐＨ５−６、５０ｍＭＫ−リン酸緩衝液、ｐＨ６−
８、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液中、ｐＨ８−９、５０
ｍＭグリシン緩衝液、ｐＨ９−１１）FIG. 2 is a graph showing pH stability of purine nucleoside phosphorylase of the present invention. (50 mM acetate buffer,
pH 5-6, 50 mM K-phosphate buffer, pH 6-
8, 50 mM Tris-HCl buffer, pH 8-9, 50
mM glycine buffer, pH 9-11)

【図３】本発明のプリンヌクレオシドホスホリラーゼの
至適温度を示す図である。（５０ｍＭＫ−リン酸緩衝
液、ｐＨ７．７中）FIG. 3 is a graph showing the optimum temperature of the purine nucleoside phosphorylase of the present invention. (In 50 mM K-phosphate buffer, pH 7.7)

【図４】本発明のプリンヌクレオシドホスホリラーゼの
至適ｐＨを示す図である。（５０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐ
Ｈ４−６、５０ｍＭＫ−リン酸緩衝液、ｐＨ６−８、
５０ｍＭトリス塩酸緩衝液、ｐＨ８−９、５０ｍＭ
グリシン緩衝液、ｐＨ９−１０）FIG. 4 is a graph showing the optimum pH of purine nucleoside phosphorylase of the present invention. (50 mM acetate buffer, p
H4-6, 50 mM K-phosphate buffer, pH 6-8,
50 mM Tris-HCl buffer, pH 8-9, 50 mM
Glycine buffer, pH 9-10)

【図５】プリンヌクレオシドホスホリラーゼにより触媒
される反応、および、その無機リン定量試薬への利用を
示す。FIG. 5 shows a reaction catalyzed by purine nucleoside phosphorylase and its use as an inorganic phosphorus quantification reagent.

【図６】プリンヌクレオシドホスホリラーゼの基質特異
性を示す。FIG. 6 shows the substrate specificity of purine nucleoside phosphorylase.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｑ 1/48 ＺＣ１２Ｑ 1/26 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 1/48 5/00 Ａ (72)発明者高倉麻貴子長崎県長崎市田上２丁目12番45号 (72)発明者伊藤潔長崎県長崎市梁川町19番１−702号 (72)発明者芳本忠長崎県長崎市滑石２丁目29番10号Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA10 CA04 DA06 EA04 FA02 GA11 HA01 HA03 4B050 CC01 CC03 DD02 FF11 FF12 FF14 LL03 4B063 QA01 QA18 QQ01 QQ16 QR02 QR03 QR04 QR06 QR57 QS36 QX02 4B065 AA01Y AA26X AB01 BA01 CA29 CA46 ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (51) Int.Cl. ⁷ Identification code FI theme code (reference) C12N 9/10 C12Q 1/48 Z C12Q 1/26 C12N 15/00 ZNAA 1/48 5/00 A (72 ) Inventor Makiko Takakura 2-1245, Tagami, Nagasaki, Nagasaki Prefecture (72) Inventor Kiyoshi Ito 19-702, Ryokawacho, Nagasaki City, Nagasaki Prefecture (72) Inventor, Tadashi Yoshimoto 2-29, Taishi, Nagasaki City, Nagasaki Prefecture No. 10 F-term (reference) 4B024 AA11 BA10 CA04 DA06 EA04 FA02 GA11 HA01 HA03 4B050 CC01 CC03 DD02 FF11 FF12 FF14 LL03 4B063 QA01 QA18 QQ01 QQ16 QR02 QR03 QR04 QR06 QR57 QS36 QX02 4B065 AA01 BA01 YA01 AA01 BA01YAA26

Claims

【特許請求の範囲】[Claims]

【請求項１】５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．７）中
で７５℃、３０分処理後の活性残存率が９０％以上であ
ることを特徴とする新規な耐熱性プリンヌクレオシドホ
スホリラーゼ。1. A novel thermostable purine nucleoside phosphorylase having a residual activity ratio of 90% or more after treatment in a 50 mM phosphate buffer (pH 7.7) at 75 ° C. for 30 minutes.

【請求項２】下記理化学的性質を有する新規なプリン
ヌクレオシドホスホリラーゼ。作用：プリンヌクレオシド＋オルソリン酸→α−Ｄ−リ
ボース−１−リン酸＋プリン基質特異性：プリンヌクレオシドとしてイノシン、グア
ノシンを利用する熱安定性：５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．７）中で７
５℃、３０分処理後の活性残存率が９０％以上2. A novel purine nucleoside phosphorylase having the following physicochemical properties. Action: Purine nucleoside + orthophosphate → α-D-ribose-1-phosphate + purine substrate Specificity: Utilizing inosine and guanosine as purine nucleosides Thermostability: 7 in 50 mM phosphate buffer (pH 7.7)
90% or more of residual activity after treatment at 5 ° C for 30 minutes

【請求項３】下記理化学的性質を有する新規なプリン
ヌクレオシドホスホリラーゼ。作用：プリンヌクレオシド＋オルソリン酸→α−Ｄ−リ
ボース−１−リン酸＋プリン基質特異性：プリンヌクレオシドとしてイノシン、グア
ノシンを利用する熱安定性：５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．７）中で７
５℃、３０分処理後の活性残存率が９０％以上ｐＨ安定性：ｐＨ６〜１０の範囲で、３０℃、１９時間
処理後の活性残存率が９０％以上至適温度：７０〜７５℃ 至適ｐＨ：７．５〜８ 3. A novel purine nucleoside phosphorylase having the following physicochemical properties. Action: Purine nucleoside + orthophosphate → α-D-ribose-1-phosphate + purine substrate Specificity: Thermal stability using inosine and guanosine as purine nucleosides: 7 in 50 mM phosphate buffer (pH 7.7)
90% or more of residual activity after treatment at 5 ° C for 30 minutes pH stability: 90% or more of residual activity after treatment at 30 ° C for 19 hours in the pH range of 6 to 10 Optimum temperature: 70 to 75 ° C Suitable pH: 7.5-8

【請求項４】以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質
である新規なプリンヌクレオシドホスホリラーゼ。（ａ）配列表の配列番号１に記載されるアミノ酸配列か
らなるタンパク質（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において、１若しくは数個の
アミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列
からなり、かつプリンヌクレオシドホスホリラーゼ活性
を有するタンパク質。4. A novel purine nucleoside phosphorylase which is the following protein (a) or (b): (A) a protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 of the sequence listing (b) an amino acid sequence in the amino acid sequence (a) in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added, and purine A protein having nucleoside phosphorylase activity.

【請求項５】配列表の配列番号１に記載されるアミノ
酸配列を有する請求項１〜３のいずれかに記載のプリン
ヌクレオシドホスホリラーゼ。5. The purine nucleoside phosphorylase according to claim 1, which has the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing.

【請求項６】以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質
であるプリンヌクレオシドホスホリラーゼをコードする
遺伝子。（ａ）配列表の配列番号１に記載されるアミノ酸配列か
らなるタンパク質（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において、１若しくは数個の
アミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列
からなり、かつプリンヌクレオシドホスホリラーゼ活性
を有するタンパク質。6. A gene encoding a purine nucleoside phosphorylase which is the following protein (a) or (b). (A) a protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 of the sequence listing (b) an amino acid sequence in the amino acid sequence (a) in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added, and purine A protein having nucleoside phosphorylase activity.

【請求項７】配列表の配列番号１に記載されるアミノ
酸配列からなるタンパク質であるプリンヌクレオシドホ
スホリラーゼをコードする遺伝子。7. A gene encoding a purine nucleoside phosphorylase, which is a protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing.

【請求項８】以下の（ｃ）または（ｄ）のＤＮＡから
なるプリンヌクレオシドフォスフォリラーゼをコードす
る遺伝子。（ｃ）配列表の配列番号２に記載される塩基配列からな
るＤＮＡ（ｄ）上記（ｃ）の塩基配列において、１若しくは複数
の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からな
り、かつプリンヌクレオシドホスホリラーゼ活性を有す
るアミノ酸配列をコードしているＤＮＡ8. A gene encoding a purine nucleoside phosphorylase comprising the following DNA (c) or (d): (C) a DNA consisting of the base sequence described in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing (d) a base sequence in which one or more bases have been deleted, substituted or added in the base sequence of (c) above, and DNA encoding an amino acid sequence having purine nucleoside phosphorylase activity

【請求項９】配列表の配列番号２に記載される塩基配
列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブ
リダイズし、かつプリンヌクレオシドホスホリラーゼ酵
素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。9. A gene encoding a protein which hybridizes with a DNA consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 2 in the Sequence Listing under stringent conditions and has purine nucleoside phosphorylase enzyme activity.

【請求項１０】配列表の配列番号２に記載される塩基
配列からなるＤＮＡを含有するプリンヌクレオシドホス
ホリラーゼをコードする遺伝子。10. A gene encoding a purine nucleoside phosphorylase containing a DNA consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 2 in the Sequence Listing.

【請求項１１】請求項６〜１０のいずれかに記載のプ
リンヌクレオチドホスホリラーゼをコードする遺伝子を
含有してなる組換えベクター。11. A recombinant vector comprising a gene encoding the purine nucleotide phosphorylase according to any one of claims 6 to 10.

【請求項１２】請求項１１記載の組換えベクターによ
り宿主細胞が形質転換されてなる形質転換体。12. A transformant obtained by transforming a host cell with the recombinant vector according to claim 11.

【請求項１３】請求項１２記載の形質転換体を培養
し、プリンヌクレオシドホスホリラーゼを生成させ、該
プリンヌクレオシドホスホリラーゼを採取することを特
徴とするプリンヌクレオシドホスホリラーゼの製造法。13. A method for producing a purine nucleoside phosphorylase, which comprises culturing the transformant according to claim 12, producing the purine nucleoside phosphorylase, and collecting the purine nucleoside phosphorylase.

【請求項１４】サーマス・アクアティカス（Thermus
Aquaticus）ＤＳＭ６２５を培養し、プリンヌクレオシ
ドホスホリラーゼを生成させ、該プリンヌクレオシドホ
スホリラーゼを採取することを特徴とするプリンヌクレ
オシドホスホリラーゼの製造法。14. Thermus aquaticus (Thermus
Aquaticus) DSM625 is cultured, purine nucleoside phosphorylase is produced, and the purine nucleoside phosphorylase is collected, which is a method for producing the purine nucleoside phosphorylase.

【請求項１５】請求項１〜５のいずれかに記載のプリ
ンヌクレオシドホスホリラーゼ、キサンチンオキシダー
ゼ、ならびにペルオキシダーゼもしくはカタラーゼなら
びに過酸化水素検出試薬を含有する無機リン測定用試
薬。15. A reagent for measuring inorganic phosphorus containing the purine nucleoside phosphorylase, xanthine oxidase, and peroxidase or catalase according to claim 1, and a hydrogen peroxide detection reagent.

【請求項１６】請求項１〜５のいずれかに記載のプリ
ンヌクレオシドホスホリラーゼ、キサンチンデヒドロゲ
ナーゼおよび酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオ
チドを含有する無機リン測定用試薬。16. A reagent for measuring inorganic phosphorus, which comprises the purine nucleoside phosphorylase according to any one of claims 1 to 5, xanthine dehydrogenase, and oxidized nicotinamide adenine dinucleotide.

【請求項１７】請求項１〜５のいずれかに記載のプリ
ンヌクレオシドホスホリラーゼ、キサンチンオキシダー
ゼ、ならびにペルオキシダーゼもしくはカタラーゼなら
びに過酸化水素検出試薬を含有するイノシン測定用試
薬。17. A reagent for measuring inosine, which contains the purine nucleoside phosphorylase, xanthine oxidase, and peroxidase or catalase as described in any one of claims 1 to 5 and a hydrogen peroxide detection reagent.

【請求項１８】請求項１〜５のいずれかに記載のプリ
ンヌクレオシドホスホリラーゼ、キサンチンデヒドロゲ
ナーゼおよび酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオ
チドを含有するイノシン測定用試薬。18. A reagent for measuring inosine, which comprises the purine nucleoside phosphorylase, xanthine dehydrogenase, and oxidized nicotinamide adenine dinucleotide according to any one of claims 1 to 5.