JP2003294679A - 電気化学式バイオセンサー - Google Patents
電気化学式バイオセンサーInfo
- Publication number
- JP2003294679A JP2003294679A JP2002093526A JP2002093526A JP2003294679A JP 2003294679 A JP2003294679 A JP 2003294679A JP 2002093526 A JP2002093526 A JP 2002093526A JP 2002093526 A JP2002093526 A JP 2002093526A JP 2003294679 A JP2003294679 A JP 2003294679A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- layer
- substance
- enzyme
- antibody
- measured
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
な電気化学的方法により測定することを可能にする電気
化学式バイオセンサーを提供すること。 【解決手段】 本発明に係る電気化学式バイオセンサー
は、測定すべき物質の抗体に基質との反応により電気化
学的に活性な物質を生成する酵素を結合させた酵素結合
抗体を含む第一層と、前記酵素結合抗体と結合する物質
が、少なくとも測定すべき物質よりも多い量、固定され
た第二層と、前記酵素との反応により電気化学的に活性
な物質を生成する基質を含有する第三層と、電極とを備
え、前記第一層から測定すべき物質を含有する試液を導
入し、第一層に導入された試液が、第二層を通過して第
三層に導入され、第三層での電気化学的な反応を前記電
極を介して測定することができるように構成したことを
特徴とする。
Description
センサーに関し、特に、電気化学的に活性な物質を介し
て間接的に試液中に存在する測定対象物質の量を測定し
得る電気化学式バイオセンサーに関する。
で吸収され尿にはわずかな量しか***されないが、腎不
全や腎機能障害になると、腎臓でアルブミンを再吸収で
きなくなるため尿中に***されるアルブミンの量が増加
する。このため、腎疾患の診断のために尿中のアルブミ
ンを測定することは重要である。特に、糖尿病では合併
症により腎疾患に至る可能性があるため尿中に***され
ているアルブミンの量の測定は重要である。上記したア
ルブミン測定方法としては、アルブミン抗体が固定され
た膜に、尿を滴下し、尿中に含まれるアルブミンと膜に
固定されたアルブミン抗体との相互作用を、光の強度変
化として検出できる物質とさらにカップリングさせるこ
とで検出する光学的測定方法が一般的に用いられてい
る。
的測定方法は、測定システムが煩雑で費用が多くかかる
という問題点があり、より簡便で、より低費用な測定方
法の開発が市場では求められている。簡便で、より低費
用な測定方法としては、物質の化学反応を電気信号とし
て取り出す電気化学的測定方法が挙げられるが、アルブ
ミンは、電気的に活性な物質ではないので、アルブミン
そのものを、この電気化学的測定方法を用いて測定する
ことはできないという問題がある。上記した問題は、ア
ルブミンに限らず、電気化学的に活性でない物質に共通
する問題である。発明者等は、上記した従来の問題点に
着目し、電気化学的に活性でない物質を、より簡便で、
より低費用で測定する方法を研究し、本発明を発明する
に至った。本発明は、電気化学的に活性でない物質を、
簡便で安価な電気化学的方法により測定することを可能
にする電気化学式バイオセンサーを提供することを目的
としている。
ために、本発明に係る電気化学式バイオセンサーは、測
定すべき物質の抗体に基質との反応により電気化学的に
活性な物質を生成する酵素を結合させた酵素結合抗体を
含む第一層と、前記酵素結合抗体と結合する物質が、少
なくとも測定すべき物質よりも多い量、固定された第二
層と、前記酵素との反応により電気化学的に活性な物質
を生成する基質を含有する第三層と、電極とを備え、前
記第一層から測定すべき物質を含有する試液を導入し、
第一層に導入された試液が、第二層を通過して第三層に
導入され、第三層での電気化学的な反応を前記電極を介
して測定することができるように構成したことを特徴と
するものである。
実施例を参照しながら本発明に係る電気化学式バイオセ
ンサーの実施の形態について説明していく。図1は、本
発明に係る電気化学式バイオセンサーの概略斜視図を示
している。図中符号1は基板を示しており、この基板1
上には、電極2がスクリーン印刷されている。電極2の
上部には、3つの層が積層されている。以下の説明で
は、これら3つの層を試液が通る順番に従って酵素結合
抗体層3、競合反応層4及び電気化学反応層5と称す
る。酵素結合抗体層3は、本願発明の第一層を形成する
最上部に位置する層であり、この酵素結合抗体層3に
は、測定すべき物質の抗体に、基質との反応により電気
化学的に活性な物質を生成する酵素を結合させた物質が
含まれている。ここで、基質との反応により電気化学的
に活性な物質を生成する酵素とは、例えば、基質がパラ
アミノフェニルガラクトピラノシドPAPGの場合に
は、β−ガラクトシダーゼ(β−Gal)であり、ま
た、例えば、基質がグルコースの場合には、グルコース
オキシダーゼであり得る。さらにまた、第三層には、酵
素反応に伴って共役的に酸化還元を行う電気化学的に活
性なフェリシアナイド若しくはフェロセン及びおよびそ
の誘導物質、又はキノン等の酸化還元物質を含ませるこ
ともできる。また、本明細書では、この測定すべき物質
の抗体に酵素を結合した物質のことを酵素結合抗体と称
する。この酵素結合抗体層3に含まれる酵素結合抗体の
量は、測定すべき物質に応じて適宜変更され得るが、競
合反応層での試液の展開中に測定すべき物質と競合反応
する量より多くしておく必要がある。例えば、β−ガラ
クトシダーゼ標識アルブミン抗体2.5μgが酵素結合抗体
層3に含まれ得る。競合反応層4は、本発明に係る第二
層を形成する層であり、酵素結合層3の下流に位置す
る。この競合反応層4には、酵素結合抗体層3に含まれ
た酵素結合抗体と結合し得る物質が固定されている。こ
の物質は、測定対象物質と同じ物質であり得るが、これ
に限定されることなく、酵素結合抗体層3に含まれてい
る酵素結合抗体と結合し得る物質であれば任意の物質で
よい。この競合反応層4に固定される物質の量は、測定
すべき物質の量と、酵素結合抗体層3に含まれる酵素結
合抗体の量とに応じて適宜決められ得るが、少なくと
も、酵素結合抗体層3において測定すべき物質が結合し
なかった余剰な酵素結合抗体と競合反応するのに充分な
量に設定される。電気化学反応層5は、本発明に係る第
三層を形成する層であり、最下流に位置し、電極2と直
接接触している。この電気化学反応層5には、酵素結合
抗体層3に含まれた酵素結合抗体における酵素と反応し
て電気化学的に活性な物質を生成する基質が含まれてい
る。具体的には、例えば、酵素がβ−ガラクトシダーゼ
(β−Gal)の場合には基質はパラアミノフェニルガ
ラクトピラノシドPAPGであり、酵素がグルコースオ
キシダーゼの場合には基質はグルコースになる。この電
気化学反応層5に含まれている基質の量は、第一層と同
様、測定すべき物質の量より多くしておく必要がある。
オセンサーの作用を説明する。以下の説明では、一例と
して、測定対象物質をアルブミンAlb、抗体をアルブ
ミン抗体Ab、酵素をβ−ガラクトシダーゼ(β−Ga
l)、基質をパラアミノフェニルガラクトピラノシドP
APGとして説明していく。酵素結合抗体層3から試液
として尿を導入すると、酵素結合抗体層において、尿中
にアルブミン抗体とβ−ガラクトシダーゼとを結合させ
た酵素結合抗体Ab+Galが溶け出す。尿中に溶け出
した酵素結合抗体Ab+Galは、尿中のアルブミンA
lbと結合して、β−ガラクトシダーゼが結合したアル
ブミン−抗体複合体(以下、酵素結合型アルブミン−抗
体結合体と称する。)となり競合反応層4に入る。競合
反応層4に入った尿には、酵素結合型アルブミン−抗体
結合体と、アルブミンAlbと結合できなかった酵素結
合抗体Ab+Galが含まれている。競合反応層4に
は、酵素結合抗体Ab+Galと結合する物質としてア
ルブミンAlbが予め固定されているので、余剰な酵素
結合抗体Ab+Galは、競合反応層4に固定されたア
ルブミンAlbと結合して競合反応層4に止まる。従っ
て、競合反応層4で競合反応により測定物質であるアル
ブミンと結合しない酵素結合抗体Al+Galは尿中か
ら取り除かれ、電気化学反応層5には、測定すべきアル
ブミンから生成された酵素結合型アルブミン−抗体結合
体だけが入る。電気化学反応層5には、β−ガラクトシ
ダーゼGalの基質であるパラアミノフェニルガラクト
ピラノシドPAPGが含まれているので、尿中に含まれ
ている酵素結合型アルブミン−抗体結合体のβ−ガラク
トシダーゼ(β−Gal)とパラアミノフェニルガラク
トピラノシドPAPGとの酵素反応によりパラアミノフ
ェノールPAPが生成される。ここで生成されるパラア
ミノフェノールPAPは電気化学的に活性な物質なの
で、それが生成された量を電気信号として取り出すこと
ができる。従って電極1で電気化学反応層5で生成され
たパラアミノフェノールPAPの量を電気信号として取
り出し、不図示の測定装置に出力することが可能にな
る。そして、この電気化学反応層で生成されるパラアミ
ノフェノールPAPの量は、尿中に含まれているアルブ
ミンAlbの量と比例関係を持つので、測定装置で、パ
ラアミノフェノールPAPの量から尿中に含まれている
アルブミンAlbの量を算出することが可能になる。
電気化学的バイオセンサーの第二の実施例について説明
していく。図2は電気化学的バイオセンサーの第二実施
例の概略上面図、図3は図2に示した電気化学的バイオ
センサーの一部断面概略斜視図、図4は図2のA−A断
面図、図5は図2のB−B断面図を各々示している。図
中符号10は絶縁性プラスチックフィルムからなる基板
を示しており、この基板10上には、導電性ペーストイ
ンク材料をスクリーン印刷してなる作用極11及び測定
極12が設けられている。上記した二つの電極11及び
12は電極部分及び端子部分を除いて絶縁性レジスト膜
13で被覆されている。上記したように構成された電極
11及び12の上には、酵素結合抗体層14、競合反応
層15及び電気化学反応層16が図3〜図5に示すよう
に設けられる。以下に、これら各層14〜16のレイア
ウトについて説明する。電気化学反応層16は電極11
及び12の上に設けられ、電極部分と直接接触するよう
に構成されている。競合反応層15は、ラテラルフロー
メンブレンから成り、基板10の後方(図2における左
側)から基板10の前方(図2における右側)に向かっ
て伸び、電気化学反応層16の上を微細な隙間17をあ
けて通過して、電気化学反応層16より前方で、基板1
0上に形成されているレジスト膜13に接触するように
湾曲され、その先端が前記レジスト膜13に固定され
る。前記競合反応層15は、その露出している上面部分
が液密にコーティングされている。また、競合反応層1
5とレジスト膜13の結合部分は、外側(電極の端子
側)には液が漏れないが、内側(電極部分側)には液が
漏れ出るようにコーティングされている。酵素結合抗体
層14は、競合反応層15の上流部分に、競合反応層1
5と直接接触するように設けられる。尚、図中、符号1
8はスペーサを示している。上記したように構成された
酵素結合抗体層14には酵素結合抗体が、競合反応層1
5には抗体と結合する物質が、電気化学反応層16には
酵素に対応する基質が各々含有又は固定されている。こ
れらの物質の種類や量については第一実施例で説明した
ので、ここでは、詳細な説明は省略する。
式バイオセンサーの作用について図6を参照しながら説
明していく。尚、各層における化学的又は電気化学的な
反応については既に第一実施例で説明しているので重複
する説明は省略し、ここでは、試液の流れについてのみ
説明していく。図6は図3の一部断面斜視図に試液の流
れを矢印で示した説明図である。酵素結合抗体層14に
導入された試液は、競合反応層15に流入する。競合反
応層15はセンサーの前後方向に試液が流れるように配
置されたラテラルフローメンブレンで形成されているの
で、競合反応層15に流入した試液は、競合反応層15
の先端に向かって流れる。競合反応層15の先端に到達
した試液は、競合反応膜15の先端から内側に漏れ出
し、毛細管現象により、電極リード部を形成することで
任意に基板10上に生じさせた段部に沿って電極11及
び12の電極部分に向かって流れ、さらに、競合反応膜
15と電気化学反応層16との間に形成された微細な間
隙17に引き込まれ、電気化学反応層16の上面から均
一に、電気化学反応層16に入り込むようになる。上記
したように構成することにより、ラテラルフローメンブ
レンを使用しているにもかかわらず試液が電気化学反応
層16により均一に流入するようになり、より良好な測
定結果を得ることが可能になる。
オセンサーを用いて実際に試液中に含まれるアルブミン
の量を測定した結果を図7に示す。この実験では、酵素
結合抗体層14に、アルブミン抗体とβ−ガラクトシダ
ーゼ(β−Gal)とを結合させた酵素結合抗体Ab+
Galを2.5μg含ませ、競合反応層15に、アルブミン
Albを20μg/cm2固定し、電気化学反応層16に、パ
ラアミノフェニルガラクトピラノシドPAPGを22μg
含ませ、予め1〜1000mg/Lのアルブミンを含ま
せた試液を酵素結合抗体層14から導入して電極での出
力電流量を測定した。図7の実験結果から、上記したよ
うに構成された電気化学式バイオセンサーを用いれば電
気化学的に不活性なアルブミン等の物質でも電気化学的
に測定することが可能になることがわかる。
オセンサーを、酵素結合抗体層、競合反応層及び電気化
学反応層の三つの層から形成しているが、必要に応じ
て、第一層を構成する酵素結合抗体層の上部に、試液中
に含まれる電気化学的に酸化されやすい物質を、予め酸
化して除去することができる物質を積層してもよい。こ
れにより、試液中に含まれていて電気的に酸化され易い
ので測定に影響を及ぼす可能性があるアスコルビン酸、
尿酸、アセトアミノフェン等の物質を予め除去しておく
ことが可能になる。この電気化学的に酸化されやすい物
質を、予め酸化して除去することができる物質として
は、例えば、二酸化鉛や二酸化すず等がある。
化学式バイオセンサーは、測定すべき物質の抗体に基質
との反応により電気化学的に活性な物質を生成する酵素
を結合させた酵素結合抗体を含む第一層と、前記酵素結
合抗体と結合する物質が、少なくとも測定すべき物質よ
りも多い量、固定された第二層と、前記酵素との反応に
より電気化学的に活性な物質を生成する基質を含有する
第三層と、電極とを備え、前記第一層から測定すべき物
質を含有する試液を導入し、第一層に導入された試液
が、第二層を通過して第三層に導入され、第三層での電
気化学的な反応を前記電極を介して測定することができ
るように構成しているので、電気化学的に不活性な物質
でも電気化学的に活性な物質を生成する酵素と基質との
化学反応を介して電気化学的に測定することが可能にな
るという効果を奏する。そして、これにより、従来、高
価な光学的手法に頼らざるをえなかった様々な物質の測
定を安価な電気化学的手法により測定することが可能に
なるという効果を奏する。
略斜視図である。
略上面図である。
部断面概略斜視図である。
示した説明図である。
ーを用いて実際に試液中のアルブミン量を測定した実験
結果を示すグラフである。
Claims (6)
- 【請求項1】測定すべき物質の抗体に基質との反応によ
り電気化学的に活性な物質を生成する酵素を結合させた
酵素結合抗体を含む第一層と、 前記酵素結合抗体と結合する物質が、少なくとも測定す
べき物質よりも多い量、固定された第二層と、 前記酵素との反応により電気化学的に活性な物質を生成
する基質を含有する第三層と、 電極と を備え、 前記第一層から測定すべき物質を含有する試液を導入
し、第一層に導入された試液が、第二層を通過して第三
層に導入され、第三層での電気化学的な反応を前記電極
を介して測定することができるように構成したことを特
徴とする電気化学式バイオセンサー。 - 【請求項2】前記酵素がβ−ガラクトシダーゼであり、 前記基質がパラアミノフェニルガラクトピラノシドであ
ることを特徴とする請求項1に記載の電気化学式バイオ
センサー。 - 【請求項3】前記酵素がグルコースオキシダーゼであ
り、 前記基質がグルコースであることを特徴とする請求項1
に記載の電気化学式バイオセンサー。 - 【請求項4】前記第三層に、酵素反応に伴って共役的に
酸化還元を行う電気化学的に活性なフェリシアナイド若
しくはフェロセン及びおよびその誘導物質、又はキノン
等の酸化還元物質を含むことを特徴とする請求項3に記
載の電気化学式バイオセンサー。 - 【請求項5】前記測定すべき物質が尿中に含まれたアル
ブミンであり、 前記抗体がアルブミン抗体であり、 酵素と基質との反応を介して間接的に尿中のアルブミン
量を測定することができるようにしたことを特徴とする
請求項1〜4の何れか一項に記載の電気化学式バイオセ
ンサー。 - 【請求項6】第一層の上部に試液中に含まれる電気化学
的に酸化されやすい物質をあらかじめ除去(酸化)する
物質を積層したことを特徴とする請求項1〜5の何れか
一項に記載の電気化学式バイオセンサー。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2002093526A JP4009480B2 (ja) | 2002-03-29 | 2002-03-29 | 電気化学式バイオセンサー |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2002093526A JP4009480B2 (ja) | 2002-03-29 | 2002-03-29 | 電気化学式バイオセンサー |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2003294679A true JP2003294679A (ja) | 2003-10-15 |
JP4009480B2 JP4009480B2 (ja) | 2007-11-14 |
Family
ID=29237944
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2002093526A Expired - Lifetime JP4009480B2 (ja) | 2002-03-29 | 2002-03-29 | 電気化学式バイオセンサー |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP4009480B2 (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2008038696A1 (fr) | 2006-09-27 | 2008-04-03 | National University Corporation Tokyo University Of Agriculture And Technology | Procédé de dosage d'une substance cible dans un échantillon, aptamère et son procédé de fabrication |
US20120132524A1 (en) * | 2009-06-04 | 2012-05-31 | Oxtox Limited | Combination Of Breathalyser And Electrochemical Saliva Drug Test |
-
2002
- 2002-03-29 JP JP2002093526A patent/JP4009480B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2008038696A1 (fr) | 2006-09-27 | 2008-04-03 | National University Corporation Tokyo University Of Agriculture And Technology | Procédé de dosage d'une substance cible dans un échantillon, aptamère et son procédé de fabrication |
US8143004B2 (en) | 2006-09-27 | 2012-03-27 | National University Corporation Tokyo University Of Agriculture And Technology | Method of assaying target substance in sample, aptamer molecule method of constructing the same |
US20120132524A1 (en) * | 2009-06-04 | 2012-05-31 | Oxtox Limited | Combination Of Breathalyser And Electrochemical Saliva Drug Test |
US9011657B2 (en) * | 2009-06-04 | 2015-04-21 | Oxtox Limited | Combination of breathalyser and electrochemical saliva drug test |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP4009480B2 (ja) | 2007-11-14 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP3971997B2 (ja) | バイオセンサ | |
US6776888B2 (en) | Biosensor | |
JP3267936B2 (ja) | バイオセンサ | |
JP4057521B2 (ja) | バイオセンサー | |
JP3135959B2 (ja) | バイオセンサーおよびそれを用いた分離定量方法 | |
JP4879459B2 (ja) | 液体サンプルの分析のための電気化学式バイオセンサストリップ | |
JP4646475B2 (ja) | コレステロールセンサおよびコレステロールの定量方法 | |
US7547383B2 (en) | Biosensor and method | |
KR100340174B1 (ko) | 전기화학적 바이오센서 테스트 스트립, 그 제조방법 및 전기화학적 바이오센서 | |
US5520787A (en) | Diagnostic flow cell device | |
EP0745843B1 (en) | Electrochemical immunobiosensor | |
CN1323293C (zh) | 电化学生物传感器 | |
KR101005559B1 (ko) | 바이오센서를 이용한 단백질 측정 장치 | |
EP0359831A1 (en) | Biosensor and process for its production | |
CN101943673A (zh) | 电化学生物传感器及其制备方法以及细胞积压校正的方法 | |
US8357275B2 (en) | Potentiometric cholesterol sensor for the quantitative estimation of total cholesterol in human blood serum | |
JPS63128252A (ja) | バイオセンサ | |
JP3487410B2 (ja) | バイオセンサ | |
CN101430336A (zh) | 利用电化学检测血红素或血比容的方法及检测试片 | |
KR20140110795A (ko) | 산화환원 순환을 이용한 바이오센서 스트립 | |
JP2003294679A (ja) | 電気化学式バイオセンサー | |
JP2003294680A (ja) | 電気化学式バイオセンサー | |
JP4129367B2 (ja) | 電気化学式バイオセンサー | |
Traipop et al. | Dual-label vertical flow-based electrochemical immunosensor for rapid and simultaneous detection of hepatitis B surface and e virus antigens | |
JP2002181757A (ja) | バイオセンサおよび基質の測定方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20050209 |
|
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20061026 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20061108 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20070105 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20070808 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20070903 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100907 Year of fee payment: 3 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 4009480 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100907 Year of fee payment: 3 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110907 Year of fee payment: 4 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120907 Year of fee payment: 5 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120907 Year of fee payment: 5 |
|
S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313117 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120907 Year of fee payment: 5 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120907 Year of fee payment: 5 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130907 Year of fee payment: 6 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
EXPY | Cancellation because of completion of term |