JP2003277385A - Fluorescent probe - Google Patents

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a compound useful as a reagent for measuring nitrogen monoxide. <P>SOLUTION: The present invention provides the compound represented by general formula (I) [wherein R<SP>1</SP>and R<SP>2</SP>are each an amino group substituted at adjacent position on a phenyl ring and either one of the amino groups may have one alkyl group; R<SP>3</SP>and R<SP>4</SP>re each a hydrogen atom, a 1-6C alkyl group or a 1-6C alkoxy group; R<SP>5</SP>and R<SP>8</SP>are each a 1-6C alkyl group; R<SP>6</SP>and R<SP>9</SP>are each a hydrogen atom, a 1-6C alkyl group, a carboxy group, a 1-6C alkoxycarbonyl group or sulfonic acid group, provided that R<SP>6</SP>and R<SP>5</SP>together may form a condensed aryl ring together with two carbon atoms to which they are bonded and/or R<SP>9</SP>and R<SP>8</SP>together may form a condensed aryl ring together with two carbon atoms to which they are bonded; R<SP>7</SP>and R<SP>10</SP>are each a 1-6C alkyl group, an aryl group, a 1-6C alkoxycarbonyl group or a vinyl group] or its salts. <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】[0001]

【発明の属する技術分野】本発明は蛍光プローブに関す
る。より具体的には一酸化窒素を捕捉して蛍光を発する
蛍光プローブに関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a fluorescent probe. More specifically, it relates to a fluorescent probe that captures nitric oxide and emits fluorescence.

【０００２】[0002]

【従来の技術】最近、それ自体はほとんど蛍光性を有し
ない特定のフルオレセイン誘導体が、中性条件下で一酸
化窒素と容易に反応して高い蛍光強度を有するトリアゾ
ール化合物を与え、該トリアゾール誘導体が 495 nm 程
度の長波長の励起光により515 nm程度の強い蛍光を発す
ることができることが報告された（米国特許第5,874,59
0号明細書）。このフルオレセイン誘導体を一酸化窒素
測定試薬として用いると、汎用の蛍光顕微鏡に備えられ
た蛍光フィルターで励起光を容易に分光することがで
き、個々の細胞内の蛍光を測定することにより簡便に細
胞内の一酸化窒素濃度を測定できる。2. Description of the Related Art Recently, a specific fluorescein derivative having almost no fluorescence per se easily reacts with nitric oxide under neutral conditions to give a triazole compound having a high fluorescence intensity, and the triazole derivative is It has been reported that excitation light with a long wavelength of about 495 nm can emit strong fluorescence of about 515 nm (US Pat. No. 5,874,59).
Specification 0). When this fluorescein derivative is used as a reagent for measuring nitric oxide, the excitation light can be easily separated by a fluorescence filter equipped in a general-purpose fluorescence microscope, and intracellular fluorescence can be easily measured by measuring the fluorescence in each cell. Nitric oxide concentration can be measured.

【０００３】また、中性条件下において一酸化窒素と効
率よく反応でき、蛍光強度に優れたトリアゾール誘導体
を与えるジアミノローダミン誘導体が提案されている
（米国特許第6,201,134号明細書）。このジアミノロー
ダミン誘導体は上記フルオレセイン誘導体に比べて長波
長側にシフトしており、細胞の自家蛍光領域とほとんど
オーバーラップしないこと、並びに酸性領域においても
蛍光の減弱がないことから、生体組織や細胞に対してダ
メージを与えず、細胞の自家蛍光領域よりも長波長の蛍
光領域で一酸化窒素を測定することができる。Further, a diaminorhodamine derivative has been proposed (US Pat. No. 6,201,134) which can efficiently react with nitric oxide under neutral conditions to give a triazole derivative having excellent fluorescence intensity. This diaminorhodamine derivative is shifted to the longer wavelength side compared to the above fluorescein derivative, it hardly overlaps with the autofluorescence region of cells, and there is no attenuation of fluorescence even in the acidic region, so that it does not affect biological tissues or cells. On the other hand, it is possible to measure nitric oxide in a fluorescence region having a longer wavelength than the autofluorescence region of cells without causing damage.

【０００４】一方、アルカリ金属イオン又はカチオン測
定のために有用なイオン取り込み部を有するインダセン
誘導体が知られている(特開平10-338695号公報及び特開
平11-5796号公報)。しかしながら、このインダセン誘導
体の蛍光発色団を用いて一酸化窒素測定を測定する試み
については全く報告がない。On the other hand, there are known indacene derivatives having an ion-incorporating portion useful for measuring alkali metal ions or cations (JP-A-10-338695 and JP-A-11-5796). However, there is no report on an attempt to measure nitric oxide measurement using the fluorescent chromophore of the indacene derivative.

【０００５】[0005]

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は一酸化
窒素を特異的かつ効率的に捕捉して蛍光を発する蛍光プ
ローブを提供することにある。より具体的には、本発明
の課題は、一酸化窒素の測定に有用な化合物を提供する
ことにあり、中性条件下において一酸化窒素と効率よく
反応でき、蛍光強度に優れた蛍光性物質を与える化合物
を提供することにある。An object of the present invention is to provide a fluorescent probe that specifically and efficiently captures nitric oxide and emits fluorescence. More specifically, the object of the present invention is to provide a compound useful for the measurement of nitric oxide, which can react efficiently with nitric oxide under neutral conditions, and a fluorescent substance excellent in fluorescence intensity. To provide a compound that gives

【０００６】本発明者は上記の課題を解決すべく鋭意努
力した結果、下記の一般式(Ｉ)で表される化合物が一酸
化窒素を極めて効率的にトラップでき、蛍光強度に優れ
たトリアゾール誘導体を与えること、及び該化合物を用
いることにより高感度かつ正確な一酸化窒素測定が可能
になることを見出した。本発明はこれらの知見を基にし
て完成されたものである。The inventors of the present invention have made diligent efforts to solve the above problems, and as a result, the compound represented by the following general formula (I) can trap nitric oxide extremely efficiently and has excellent fluorescence intensity. It has been found that high sensitivity and accurate measurement of nitric oxide can be achieved by using the compound. The present invention has been completed based on these findings.

【０００７】すなわち、本発明は、下記の一般式(Ｉ)：That is, the present invention has the following general formula (I):

【化３】 （式中、R¹及びR²はそれぞれフェニル環上の隣接した位
置に置換するアミノ基を示し、該アミノ基のいずれか１
つは置換基を有していてもよいアルキル基を１個有して
いてもよく；R³及びR⁴はそれぞれ独立に水素原子、C_1-6
アルキル基、又はC_1-6アルコキシ基を示し、R⁵及びR⁸は
それぞれ独立に置換基を有していてもよいC_1-6アルキル
基を示し、R⁶及びR⁹はそれぞれ独立に水素原子、置換基
を有していてもよいC_1-6アルキル基、カルボキシル基、
C_1-6アルコキシカルボニル基、又はスルホン酸基を示す
が、R⁶はR⁵と一緒になってそれらが結合する２個の炭素
原子とともに縮合アリール環を形成してもよく（該アリ
ール環は置換基を有していてもよい）、及び／又はR⁹は
R⁸と一緒になってそれらが結合する２個の炭素原子とと
もに縮合アリール環を形成してもよく（該アリール環は
置換基を有していてもよい）、R⁷及びR¹⁰はそれぞれ独
立に置換基を有していてもよいC_1-6アルキル基、アリー
ル基、C_1-6アルコキシカルボニル基、又は置換基を有し
ていてもよいビニル基を示す）で表される化合物又はそ
の塩を提供するものである。[Chemical 3] (In the formula, R ¹ and R ² each represent an amino group which is substituted at an adjacent position on the phenyl ring, and any one of the amino groups
May have one alkyl group which may have a substituent; R ³ and R ⁴ are each independently a hydrogen atom, C _1-6
An alkyl group or a C _1-6 alkoxy group, R ⁵ and R ⁸ each independently represent a C _1-6 alkyl group which may have a substituent, and R ⁶ and R ⁹ each independently represent hydrogen. Atom, a C _1-6 alkyl group which may have a substituent, a carboxyl group,
A C _1-6 alkoxycarbonyl group or a sulfonic acid group is shown, but R ⁶ may form a condensed aryl ring together with R ⁵ together with the two carbon atoms to which they are bound (the aryl ring is May have a substituent), and / or R ⁹ is
A fused aryl ring may be formed together with R ⁸ and two carbon atoms to which they are bonded (the aryl ring may have a substituent), and R ⁷ and R ¹⁰ are each independently A C _1-6 alkyl group optionally having a substituent, an aryl group, a C _1-6 alkoxycarbonyl group, or a vinyl group optionally having a substituent) or a compound thereof It provides salt.

【０００８】この発明の好ましい態様によれば、R⁶及び
R⁹が水素原子であり、R⁵、R⁷、R⁸、及びR¹⁰がメチル基
である上記化合物又はその塩が提供される。また、本発
明により、上記の化合物又はその塩を含む一酸化窒素測
定用試薬が提供される。According to a preferred embodiment of the present invention, R ⁶ and
There is provided the above compound or a salt thereof, wherein R ⁹ is a hydrogen atom, and R ⁵ , R ⁷ , R ⁸ and R ¹⁰ are methyl groups. The present invention also provides a reagent for measuring nitric oxide, which comprises the above compound or a salt thereof.

【０００９】別の観点からは、本発明により、下記の一
般式(II):From another aspect, according to the present invention, the following general formula (II):

【化４】 ［式中、R¹¹及びR¹²は互いに結合してフェニル環上の隣
接した位置に環を形成する-N=N-NR³⁰- (式中、R³⁰は水
素原子又は置換基を有していてもよいアルキル基を示
す)で表される基を示すか、又はR¹¹及びR¹²はフェニル
環上の隣接した位置に置換するアミノ基（置換基を有し
ていてもよいアルキル基又はアミノ基の保護基を有して
いてもよい）及びニトロ基の組み合わせを示し；R¹³及
びR¹⁴はそれぞれ独立に水素原子、C_1-6アルキル基、又
はC_1-6アルコキシ基を示し、R¹⁵及びR¹⁸はそれぞれ独立
に置換基を有していてもよいC_1-6アルキル基を示し、R
¹⁶及びR¹⁹はそれぞれ独立に置換基を有していてもよいC
_1-6アルキル基、カルボキシル基、C_1-6アルコキシカル
ボニル基、又はスルホン酸基を示すが、R¹⁶はR¹⁵と一緒
になってそれらが結合する２個の炭素原子とともに縮合
アリール環を形成してもよく（該アリール環は置換基を
有していてもよい）、及び／又はR¹⁹はR¹⁸と一緒になっ
てそれらが結合する２個の炭素原子とともに縮合アリー
ル環を形成してもよく（該アリール環は置換基を有して
いてもよい）、R¹⁷及びR²⁰はそれぞれ独立に置換基を有
していてもよいC_1-6アルキル基、アリール基、C_1-6アル
コキシカルボニル基、又は置換基を有していてもよいビ
ニル基を示す］で表される化合物又はその塩が提供され
る。この発明の好ましい態様によれば、R¹⁶及びR¹⁹が水
素原子であり、R¹⁵、R¹⁷、R¹⁸、及びR²⁰がメチル基であ
る上記化合物又はその塩が提供される。[Chemical 4] [In the formula, R ¹¹ and R ¹² are bonded to each other to form a ring at an adjacent position on the phenyl ring, -N = N-NR ^30- (wherein, R ³⁰ has a hydrogen atom or a substituent) Optionally represents an alkyl group), or R ¹¹ and R ¹² are amino groups that substitute at adjacent positions on the phenyl ring (an alkyl group or an amino group which may have a substituent). R ¹³ and R ¹⁴ each independently represent a hydrogen atom, a C _1-6 alkyl group, or a C _1-6 alkoxy group; ¹⁵ and R ¹⁸ each independently represent an optionally substituted C _1-6 alkyl group, R
¹⁶ and R ¹⁹ are each independently C which may have a substituent.
_1-6 alkyl group, carboxyl group, C _1-6 alkoxycarbonyl group, or sulfonic acid group, but R ¹⁶ together with R ¹⁵ forms a condensed aryl ring with the two carbon atoms to which they are bonded (Wherein the aryl ring may have a substituent) and / or R ¹⁹ together with R ¹⁸ form a fused aryl ring with the two carbon atoms to which they are attached. At best (the aryl ring may have a substituent group), R ¹⁷ and R ²⁰ are each independently optionally substituted C _1-6 alkyl group, an aryl group, C _1-6 An alkoxycarbonyl group or a vinyl group which may have a substituent], or a salt thereof. According to a preferred embodiment of the present invention, there is provided the above compound or a salt thereof, wherein R ¹⁶ and R ¹⁹ are hydrogen atoms, and R ¹⁵ , R ¹⁷ , R ¹⁸ , and R ²⁰ are methyl groups.

【００１０】さらに別の観点からは、一酸化窒素の測定
方法であって、(a)上記の一般式(Ｉ)で示される化合物
を一酸化窒素と反応させる工程；及び、(b)上記工程(a)
において生成する一般式(II)の化合物［ただし、R¹¹及
びR¹²は互いに結合してフェニル環上の隣接した位置に
環を形成する-N=N-NR³⁰- (式中、R³⁰は水素原子又は置
換基を有していてもよいアルキル基を示す)で表される
基を示す］を検出する工程を含む方法が本発明により提
供される。From another point of view, there is provided a method for measuring nitric oxide, the method comprising: (a) reacting the compound represented by the general formula (I) with nitric oxide; and (b) the above step. (a)
A compound of the general formula (II), wherein R ¹¹ and R ¹² are bonded to each other to form a ring at an adjacent position on the phenyl ring -N = N-NR ^30- (wherein R ³⁰ is The present invention provides a method of detecting a hydrogen atom or a group represented by (which represents an alkyl group which may have a substituent).

【００１１】[0011]

【発明の実施の形態】本明細書において、特に言及しな
い場合にはアルキル基は直鎖状、分枝鎖状、環状、又は
それらの組み合わせのいずれでもよい。アルキル部分を
有する他の置換基（アルコキシ基）のアルキル部分につ
いても同様である。また、ある官能基について「置換基
を有していてもよい」と言う場合には、置換基の種類、
個数、置換位置は特に限定されないが、例えば、ハロゲ
ン原子（フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子
のいずれでもよい）、水酸基、アミノ基などを置換基と
して有していてもよい。また、本明細書においてアリー
ル基という場合には、単環性又は多環性のアリール基の
いずれであってもよいが、好ましくはフェニル基を用い
ることができる。アリール環についても同様である。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION In this specification, unless otherwise specified, the alkyl group may be linear, branched, cyclic, or a combination thereof. The same applies to the alkyl portion of another substituent (alkoxy group) having an alkyl portion. When a functional group is "may have a substituent", the kind of the substituent,
Although the number and the substitution position are not particularly limited, for example, it may have a halogen atom (which may be any of a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom and an iodine atom), a hydroxyl group, an amino group and the like as a substituent. In the present specification, the aryl group may be either a monocyclic or polycyclic aryl group, but preferably a phenyl group can be used. The same applies to the aryl ring.

【００１２】一般式(Ｉ)において、R³及び／又はR⁴がC
_1-6アルキル基又はC_1-6アルコキシ基を示す場合には、
それらの基はベンゼン環上の2-位及び6-位に結合するこ
とが好ましい。これらの基が存在すると量子収率や反応
速度が向上し検出感度を高めることができる場合があ
る。R³及びR⁴が示すアルキル基としてはメチル基が好ま
しく、アルコキシ基としてはメトキシ基が好ましい。R³
及びR⁴がともに水素原子であることも好ましい。一般式
(II)におけるR¹³及びR¹⁴についても同様である。In the general formula (I), R ³ and / or R ⁴ are C
_{When a 1-6} alkyl group or a C _1-6 alkoxy group is shown,
It is preferred that these groups be attached at the 2- and 6-positions on the benzene ring. The presence of these groups may improve the quantum yield and reaction rate and may improve the detection sensitivity. The alkyl group represented by R ³ and R ⁴ is preferably a methyl group, and the alkoxy group is preferably a methoxy group. R ³
It is also preferred that both R ⁴ and R ⁴ are hydrogen atoms. General formula
The same applies to R ¹³ and R ¹⁴ in (II).

【００１３】R⁶及びR⁹が示すC_1-6アルキル基としては、
メチル基又はエチル基などが好ましく、C_1-6アルコキシ
カルボニル基（本明細書において「C_1-6アルコキシカル
ボニル基」とはC_1-6アルコキシで置換されたカルボニル
基を意味する）としてはエトキシカルボニル基などが好
ましい。R⁶がR⁵と一緒になって縮合アリール環を形成す
る場合、及びR⁹がR⁸と一緒になって縮合アリール環を形
成する場合には、形成されるアリール環としてベンゼン
環が好ましい。R⁶及びR⁹が水素原子以外の基である場合
には、化合物の蛍光波長が長波長側にシフトする場合が
あり、また水溶性が高まる場合がある。The C _1-6 alkyl group represented by R ⁶ and R ⁹ is
A methyl group, an ethyl group or the like is preferable, and ethoxy is used as the C _1-6 alkoxycarbonyl group (in the present specification, the “C _1-6 alkoxycarbonyl group” means a carbonyl group substituted with C _1-6 alkoxy). A carbonyl group and the like are preferable. A benzene ring is preferred as the aryl ring formed when R ⁶ is taken together with R ⁵ to form a fused aryl ring and when R ⁹ is taken together with R ⁸ to form a fused aryl ring. When R ⁶ and R ⁹ are groups other than hydrogen atom, the fluorescence wavelength of the compound may shift to the long wavelength side, and the water solubility may increase.

【００１４】R⁷及びR¹⁰が示すアリール基としてはフェ
ニル基が好ましく、C_1-6アルコキシカルボニル基として
はエトキシカルボニル基が好ましい。ビニル基に存在す
る置換基としてはフェニル基、モノアミノフェニル基、
又はジアミノフェニル基（例えば3,4-ジアミノフェニル
基）などを挙げることができる。R⁷及びR¹⁰がアルキル
基以外の基である場合には、化合物の蛍光波長が長波長
側にシフトする場合がある。The aryl group represented by R ⁷ and R ¹⁰ is preferably a phenyl group, and the C _1-6 alkoxycarbonyl group is preferably an ethoxycarbonyl group. As the substituent present on the vinyl group, a phenyl group, a monoaminophenyl group,
Alternatively, a diaminophenyl group (eg, 3,4-diaminophenyl group) and the like can be mentioned. When R ⁷ and R ¹⁰ are groups other than alkyl groups, the fluorescence wavelength of the compound may shift to the long wavelength side.

【００１５】一般式(I)において、R⁶及びR⁹が水素原子
であることが好ましい。また、一般式(I)において、
R⁵、R⁷、R⁸、及びR¹⁰が置換基を有していてもよいC_1-6
アルキル基であることが好ましく、例えば、R⁵、R⁷、
R⁸、及びR¹⁰がいずれもメチル基である化合物は本発明
の好適な態様である。一般式(II)におけるR¹⁵、R¹⁶、R
¹⁷、R¹⁸、R¹⁹、及びR²⁰についても上記のR⁵、R⁶、R⁷、R
⁸、R⁹、及びR¹⁰と同様である。In the general formula (I), R ⁶ and R ⁹ are preferably hydrogen atoms. Further, in the general formula (I),
R ⁵ , R ⁷ , R ⁸ and R ¹⁰ may have a substituent C _1-6
It is preferably an alkyl group, for example, R ⁵ , R ⁷ ,
A compound in which R ⁸ and R ¹⁰ are both methyl groups is a preferred embodiment of the present invention. R ¹⁵ , R ¹⁶ and R in the general formula (II)
^{Also for 17} , R ¹⁸ , R ¹⁹ , and R ²⁰ , the above R ⁵ , R ⁶ , R ⁷ , and R
Similar to ⁸ , R ⁹ and R ¹⁰ .

【００１６】上記一般式(Ｉ) において、R¹及びR²はそ
れぞれフェニル環上の隣接した位置に置換するアミノ基
を示す。R¹及びR²が共に無置換のアミノ基であってもよ
いが、R¹及びR²のうちのいずれかは1個のアルキル基で
置換されていてもよく、該アルキル基は1個又は2個以上
の置換基を有していてもよい。アミノ基上に置換するア
ルキル基としては、例えば、直鎖又は分枝鎖のC_1-18 ア
ルキル基（好ましくはC_{1 -6}アルキル基）を挙げることが
でき、具体的には、例えば、メチル基、エチル基、n-プ
ロピル基、イソプロピル基、n-ブチル基、sec-ブチル
基、tert- ブチル基などを用いることができる。アルキ
ル基が置換基を有する場合の例としては、例えば、置換
若しくは無置換のアリール基が置換したC_1-6アルキル基
（アラルキル基）などを挙げることができる。アリール
置換アルキル基としては、例えば、ベンジル基、フェネ
チル基、パラメトキシベンジル基、パラエトキシカルボ
ニルベンジル基、パラカルボキシベンジル基などを用い
ることができる。In the above general formula (I), R ¹ and R ² each represent an amino group which substitutes at adjacent positions on the phenyl ring. Both R ¹ and R ² may be an unsubstituted amino group, but either R ¹ or R ² may be substituted with one alkyl group, and the alkyl group is 1 or It may have two or more substituents. As, for example, can be cited a straight chain or branched C _1-18 alkyl group (preferably a C _{1 -6} alkyl group), particularly an alkyl group substituted on the amino group, e.g., methyl Group, ethyl group, n-propyl group, isopropyl group, n-butyl group, sec-butyl group, tert-butyl group and the like can be used. Examples of the case where the alkyl group has a substituent include a C _1-6 alkyl group (aralkyl group) substituted with a substituted or unsubstituted aryl group. As the aryl-substituted alkyl group, for example, a benzyl group, a phenethyl group, a paramethoxybenzyl group, a paraethoxycarbonylbenzyl group, a paracarboxybenzyl group and the like can be used.

【００１７】上記の一般式(II)において、R¹¹及びR¹²は
互いに結合してフェニル環上の隣接した位置に環を形成
する-N=N-NR³⁰-基を示す。ここで、R³⁰は水素原子又は
置換基を有していてもよいアルキル基を示す。該アルキ
ル基としては、直鎖又は分枝鎖のC_1-18アルキル基（好
ましくはC_1-6アルキル基）を挙げることができ、該アル
キル基が置換基を有する場合の例として、例えば、置換
若しくは無置換のアラルキル基を挙げることができる。
該アラルキル基としては、例えば、ベンジル基、フェネ
チル基、パラメトキシベンジル基、パラエトキシカルボ
ニルベンジル基、パラカルボキシベンジル基などを用い
ることができる。In the above general formula (II), R ¹¹ and R ¹² represent a —N═N—NR ³⁰ — group which is bonded to each other to form a ring at an adjacent position on the phenyl ring. Here, R ³⁰ represents a hydrogen atom or an alkyl group which may have a substituent. Examples of the alkyl group include a linear or branched C _1-18 alkyl group (preferably a C _1-6 alkyl group), and examples of the alkyl group having a substituent include, for example, A substituted or unsubstituted aralkyl group can be mentioned.
As the aralkyl group, for example, a benzyl group, a phenethyl group, a paramethoxybenzyl group, a paraethoxycarbonylbenzyl group, a paracarboxybenzyl group or the like can be used.

【００１８】また、R¹¹及びR¹²はフェニル環上の隣接し
た位置に置換するアミノ基（１個の置換基を有していて
もよい）及びニトロ基の組み合わせを示すが、R¹¹及びR
¹²のいずれか一方はアミノ基を示し、他方はニトロ基を
示す。R¹¹及びR¹²のいずれか一方が示すアミノ基は無置
換であってもよいが、アルキル基、例えばC_1-18 アルキ
ル基、好ましくはC_1-6アルキル基を１個有していてもよ
い。該アルキル基は置換基を有していてもよく、例え
ば、置換若しくは無置換のアラルキル基などがアミノ基
に置換していてもよい。また、該アミノ基はアミノ基の
保護基、例えば、アセチル基、トリフルオロアセチル
基、ベンゾイル基などのアシル基；トリメチルシリル基
などのアルキルシリル基などを有していてもよい。ベン
ジル基などのアラルキル基を保護基として利用してもよ
い。Further, R ¹¹ and R ¹² show a combination of adjacent (which may have one substituent) amino group substituting at the position and nitro group on the phenyl ring, R ¹¹ and R
^{One of 12} represents an amino group and the other represents a nitro group. The amino group represented by either R ¹¹ or R ¹² may be unsubstituted, or may have one alkyl group, for example, a C _1-18 alkyl group, preferably one C _1-6 alkyl group. Good. The alkyl group may have a substituent, and for example, a substituted or unsubstituted aralkyl group may be substituted on the amino group. Further, the amino group may have an amino group protecting group, for example, an acyl group such as an acetyl group, a trifluoroacetyl group and a benzoyl group; an alkylsilyl group such as a trimethylsilyl group. An aralkyl group such as a benzyl group may be used as a protective group.

【００１９】上記一般式(Ｉ)又は一般式(II)で表される
本発明の化合物は塩を形成する場合もある。塩の種類は
特に限定されず、酸付加塩又は塩基付加塩のいずれであ
ってもよい。酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸
塩、硝酸塩などの鉱酸塩、又はメタンスルホン酸塩、ク
エン酸塩、p−トルエンスルホン酸塩、シュウ酸塩など
の有機酸塩を挙げることができる。また、塩基付加塩と
しては、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩など
の金属塩、アンモニウム塩、又はメチルアミン塩、トリ
エチルアミン塩などの有機アミン塩を挙げることができ
る。さらに、グリシンなどのアミノ酸の塩を形成する場
合もある。もっとも、本発明の化合物の塩はこれらの具
体例に限定されることはない。The compound of the present invention represented by the above general formula (I) or general formula (II) may form a salt. The type of salt is not particularly limited and may be an acid addition salt or a base addition salt. Examples of the acid addition salt include mineral acid salts such as hydrochlorides, sulfates and nitrates, and organic acid salts such as methanesulfonate, citrate, p-toluenesulfonate and oxalate. it can. Examples of the base addition salt include metal salts such as sodium salt, potassium salt and calcium salt, ammonium salt, and organic amine salts such as methylamine salt and triethylamine salt. Further, it may form a salt of an amino acid such as glycine. However, the salts of the compound of the present invention are not limited to these specific examples.

【００２０】上記一般式(Ｉ)又は一般式(II)で表される
本発明の化合物は１個または２個以上の不斉炭素を有し
ている場合がある。従って、１個または２個以上の不斉
炭素に基づく光学的に純粋な形態の任意の光学異性体、
光学異性体の任意の混合物、ラセミ体、純粋な形態のジ
アステレオ異性体、ジアステレオ異性体の混合物などは
いずれも本発明の範囲に包含される。また、本発明の化
合物は水和物や溶媒和物として存在する場合もあるが、
これらの物質も本発明の範囲に包含されることはいうま
でもない。The compound of the present invention represented by the above general formula (I) or general formula (II) may have one or more asymmetric carbons. Thus, any optical isomer in optically pure form based on one or more asymmetric carbons,
Any mixture of optical isomers, racemates, diastereoisomers in pure form, mixtures of diastereomers, etc. are included within the scope of the present invention. Further, the compound of the present invention may exist as a hydrate or a solvate,
Needless to say, these substances are also included in the scope of the present invention.

【００２１】上記の一般式(Ｉ)で表される化合物及び一
般式(II)で表される化合物（ただし、R¹¹ 及びR¹² がフ
ェニル環上の隣接した位置に置換するアミノ基及びニト
ロ基の組み合わせを示す化合物）のうち、代表的化合物
としてR³、R⁴、R⁶、及びR⁹が水素原子であり、R⁵、R⁷、
R⁸、及びR¹⁰がいずれもメチル基である化合物、並びにR
¹³、R¹⁴、R¹⁶、及びR¹⁹が水素原子であり、R¹⁵、R¹⁷、R
¹⁸、及びR²⁰がいずれもメチル基である化合物の製造例
を以下のスキームに示した。また、各合成ステップの詳
細は本明細書の実施例に具体的に説明されている。従っ
て、上記の一般式(II)で表される化合物が一般式(Ｉ)で
表される化合物の製造中間体として有用であることが理
解されよう。また、一般式(II)で示される化合物のう
ち、R¹¹ 及びR¹² が互いに結合してフェニル環上の隣接
した位置に環を形成する-N=N-NR³⁰-基を示す化合物につ
いては、スキーム中の末尾のステップに示すように、上
記一般式(Ｉ)で表される化合物と一酸化窒素とを反応さ
せることにより製造可能である。この化合物は、後述の
ように強い蛍光性を有しており、一酸化窒素の測定に有
用である。Compounds represented by the above general formula (I) and one
A compound represented by the general formula (II) (where R¹¹ And R¹² Is
Amino group and nit which substitute at adjacent positions on the phenyl ring
(B) Compounds showing a combination of groups
As R³, R^Four, R⁶, And R⁹Is a hydrogen atom and R^Five, R⁷,
R⁸, And R^TenA compound in which each is a methyl group, and R
¹³, R¹⁴, R¹⁶, And R¹⁹Is a hydrogen atom and R¹⁵, R¹⁷, R
¹⁸, And R²⁰Production examples of compounds in which each is a methyl group
Is shown in the following scheme. In addition, details of each synthesis step
The details are specifically described in the examples herein. Obey
The compound represented by the above general formula (II) is represented by the general formula (I)
It is considered to be useful as an intermediate for the production of the represented compound.
Be understood. In addition, the compound represented by the general formula (II)
Chi, R¹¹ And R¹² Adjacent to each other on the phenyl ring
A ring at the selected position-N = N-NR³⁰-For compounds showing groups
However, as shown in the last step in the scheme,
The compound represented by the general formula (I) is reacted with nitric oxide.
It can be manufactured by This compound is
It has a strong fluorescence and is suitable for the measurement of nitric oxide.
It is for.

【００２２】[0022]

【化５】 [Chemical 5]

【００２３】上記スキーム中の一般的な説明と実施例の
具体的説明を参照することにより、一般式(Ｉ)及び一般
式(II)に包含される化合物を容易に製造できることが当
業者には理解されよう。また、インダセン骨格について
は、例えば、特開平10-338695号公報及び特開平11-5796
号公報のほか、New J. Chem., 25, pp.289-292, 2001;T
etrahedron Letters, 42, pp.6711-6713, 2001; 及びAn
gew. Chem. Int. Ed.,40, pp.385-387, 2001などに合成
方法が示されているので、これらの刊行物を参照するこ
とにより当業者は本発明の化合物をさらに容易に製造可
能である。Those skilled in the art can easily prepare the compounds included in the general formula (I) and the general formula (II) by referring to the general description in the above scheme and the specific description of the examples. Be understood. Regarding the indacene skeleton, for example, JP-A-10-338695 and JP-A-11-5796.
Other publications, New J. Chem., 25, pp.289-292, 2001; T
etrahedron Letters, 42, pp.6711-6713, 2001; and An
Synthetic methods are described in gew. Chem. Int. Ed., 40, pp. 385-387, 2001, etc., and those skilled in the art can more easily prepare the compounds of the present invention by referring to these publications. It is possible.

【００２４】本発明の一般式(Ｉ)で表される化合物は、
中性条件下において一酸化窒素と効率的に反応して、収
率よく一般式(II)の化合物（ただし、R¹¹ 及びR¹² は互
いに結合してフェニル環上の隣接した位置に環を形成す
る-N=N-NR³⁰-基を示す化合物）を生成する性質を有して
いる。一般式(Ｉ)で表される化合物自体は、中性条件下
において485 nm程度の励起光を照射した場合にはほとん
ど蛍光を発しないが、上記一般式(II)の化合物は同じ条
件下において極めて強い蛍光を発する性質を有してい
る。従って、一般式(Ｉ)で表される化合物を生体組織中
や細胞内に取り込ませて一酸化窒素と反応させ、蛍光性
の上記一般式(II)の化合物を生成させてこの化合物の蛍
光を測定することにより、生体組織中や細胞内の一酸化
窒素を測定することができる。特に、本発明の一般式
(Ｉ)の化合物は一酸化窒素との反応性に優れており、高
感度かつ正確に一酸化窒素の測定を行なえるという優れ
た特徴を有している。The compound represented by the general formula (I) of the present invention is
Efficiently reacts with nitric oxide under neutral conditions to yield compounds of general formula (II) (provided that R ¹¹ and R ¹² bond to each other to form a ring at an adjacent position on the phenyl ring). to -N = N-NR ³⁰ - has a property to produce a compound) indicating the group. The compound represented by the general formula (I) emits almost no fluorescence when irradiated with excitation light of about 485 nm under neutral conditions, but the compound of the general formula (II) under the same conditions. It has the property of emitting extremely strong fluorescence. Therefore, the compound represented by the general formula (I) is incorporated into living tissues or cells and reacted with nitric oxide to produce a fluorescent compound of the above general formula (II), and the fluorescence of the compound is expressed. By measuring, it is possible to measure nitric oxide in living tissue or in cells. In particular, the general formula of the present invention
The compound (I) has excellent reactivity with nitric oxide, and has an excellent feature that nitric oxide can be measured with high sensitivity and accuracy.

【００２５】従って、本発明により提供される一酸化窒
素の測定方法は、一般式(Ｉ)で表される化合物と一酸化
窒素とを反応させて一般式(II)の化合物を生成させ、一
般式(II)の化合物（ただし、R¹¹ 及びR¹² は互いに結合
してフェニル環上の隣接した位置に環を形成する-N=N-N
R³⁰-基を示す化合物）の蛍光を測定する工程を含んでい
る。本明細書において「測定」という用語は、検出、定
量、定性など種々の目的の測定を含めて最も広義に解釈
されるべきである。上記反応は好ましくは中性条件下に
行うことができ、例えば、pH 6.0〜8.0 の範囲、好まし
くはpH 6.5〜7.8の範囲、より好ましくはpH 6.8〜7.6
の範囲で行うことができる。もっとも、本発明の化合物
を用いた一酸化窒素の測定は中性領域ないし弱酸性領域
に限定されることはなく、例えば、胃の粘膜細胞など強
酸性の条件においても測定が可能である。Therefore, the method for measuring nitric oxide provided by the present invention comprises reacting a compound represented by the general formula (I) with nitric oxide to produce a compound of the general formula (II), A compound of formula (II) where R ¹¹ and R ¹² bond together to form a ring at adjacent positions on the phenyl ring-N = NN
R ³⁰ -group)) is measured. In the present specification, the term “measurement” should be construed in the broadest sense including measurement for various purposes such as detection, quantification, and qualitative analysis. The above reaction can be preferably carried out under neutral conditions, for example, in the range of pH 6.0 to 8.0, preferably pH 6.5 to 7.8, more preferably pH 6.8 to 7.6.
Can be performed in the range of. However, the measurement of nitric oxide using the compound of the present invention is not limited to the neutral region or weakly acidic region, and for example, it can be measured even under strongly acidic conditions such as gastric mucosal cells.

【００２６】蛍光の測定は、従来公知の蛍光測定方法に
準じて行うことができる（例えば、Wiersma, J.H., Ana
l. Lett., 3, pp.123-132, 1970; Sawicki, C.R., Ana
l. Lett., 4, pp.761-775, 1971; Damiani, P. and Bur
ini, G., Talanta, 8, pp.649-652, 1986; Damiani, P.
and Burini, G., Talanta, 8, pp.649-652, 1986; Mis
ko, T.P., Anal. Biochem. 214, pp.11-16, 1993 など
の刊行物を参照）。本発明の一酸化窒素測定において
は、例えば、励起光として485 nm 程度の光を照射し、5
25 nm程度の蛍光を測定することが好ましい。このよう
な波長の光を用いると、汎用の蛍光顕微鏡に備えられた
蛍光フィルターでも効率的に分光することができ、特殊
なフィルターを用いずに高感度な測定が可能になる。Fluorescence can be measured according to conventionally known fluorescence measurement methods (eg, Wiersma, JH, Ana).
l. Lett., 3, pp.123-132, 1970; Sawicki, CR, Ana
l. Lett., 4, pp.761-775, 1971; Damiani, P. and Bur
ini, G., Talanta, 8, pp.649-652, 1986; Damiani, P.
and Burini, G., Talanta, 8, pp.649-652, 1986; Mis
See publications such as ko, TP, Anal. Biochem. 214, pp. 11-16, 1993). In the nitric oxide measurement of the present invention, for example, light of about 485 nm is irradiated as excitation light,
It is preferable to measure fluorescence at about 25 nm. When light of such a wavelength is used, it is possible to perform efficient spectral analysis even with a fluorescence filter provided in a general-purpose fluorescence microscope, and high-sensitivity measurement is possible without using a special filter.

【００２７】また、特に高感度な測定が必要な場合に
は、上記の一酸化窒素の測定を酸素源の存在下に行って
もよい。酸素源としては、例えば、酸素、オゾン、又は
オキシド化合物などを用いることが可能である。酸素と
しては、一般的には溶存酸素を用いることができるが、
必要に応じて、反応系内に酸素ガスを導入するか、酸素
発生用試薬（例えば、過酸化水素など）を添加してもよ
い。オキシド化合物としては N-O, S-O, P-Oなど容易に
酸素原子が開裂されるオキシド結合を有する化合物であ
れば特に限定されないが、例えば、PTIO(2- フェニル-
4,4,5,5- テトラメチルイミダゾリン-1- オキシル-3-
オキシド: Maeda, H., et al., J. Leuk. Biol., 56, p
p.588-592, 1994; Akaike, T., et al., Biochemistry,
32, pp.827-832, 1993)またはその誘導体（PTIOのフェ
ニル基のp-位にカルボキシル基が導入されたカルボキシ
PTIOなど）、トリフェニルホスフィンオキサイド、トリ
エチルアミンオキサイドなどを用いることができる。If particularly sensitive measurement is required, the above-mentioned measurement of nitric oxide may be carried out in the presence of an oxygen source. As the oxygen source, for example, oxygen, ozone, an oxide compound, or the like can be used. As oxygen, generally dissolved oxygen can be used,
If necessary, oxygen gas may be introduced into the reaction system or an oxygen generating reagent (for example, hydrogen peroxide) may be added. The oxide compound is not particularly limited as long as it is a compound having an oxide bond such as NO, SO, and PO that can easily cleave an oxygen atom, and for example, PTIO (2-phenyl-
4,4,5,5-Tetramethylimidazoline-1-oxyl-3-
Oxide: Maeda, H., et al., J. Leuk. Biol., 56, p
p.588-592, 1994; Akaike, T., et al., Biochemistry,
32, pp.827-832, 1993) or a derivative thereof (carboxy in which a carboxyl group is introduced at the p-position of the phenyl group of PTIO).
PTIO), triphenylphosphine oxide, triethylamine oxide, etc. can be used.

【００２８】上記のオキシド化合物のうち、 PTIO 及び
その誘導体（例えばカルボキシPTIOなど）は特に好まし
い化合物であり、当業者に容易に入手可能な化合物であ
る（東京化成株式会社、Organic Chemicals Catalog, 3
2, 1994 などに記載されている）。なお、オキシド化合
物はそれ自体を反応試薬として用いてもよいが、リポソ
ーム等に封入したものを用いることもできる。酸素源の
量は特に限定されないが、少なくとも測定すべき一酸化
窒素に対して 1μM 以上、好ましくは10〜30μM、より
好ましくは10〜20μM 程度の量であることが好ましい。
生体試料などの測定では、試料中に10〜20μM 程度の量
を添加することが好ましいが、一般的には、溶存酸素に
より必要量の酸素源が供給される。酸素源の量が極端に
少ないと測定感度が低下する場合があり、酸素源の量が
極端に多いと蛍光による発光に不都合を生じる場合があ
る。従って、測定すべき一酸化窒素の量を予試験若しく
は公知の方法で予測して適宜の濃度範囲の酸素源を添加
することが好ましい。反応は10〜25℃の温度範囲で行う
ことが可能である。なお、蛍光プローブを用いた一酸化
窒素の測定方法に関しては長野哲雄ら、化学と教育、4
7、pp.665-669、1999などに詳細に記載されているの
で、当業者は上記刊行物を参照しつつ、本発明の化合物
を用いて高感度に一酸化窒素を測定することができる。Among the above oxide compounds, PTIO and its derivatives (eg, carboxy PTIO) are particularly preferred compounds and compounds readily available to those skilled in the art (Tokyo Chemical Co., Organic Chemicals Catalog, 3).
2, 1994, etc.). The oxide compound may be used as a reaction reagent itself, or may be encapsulated in a liposome or the like. The amount of the oxygen source is not particularly limited, but it is preferably at least 1 μM, preferably 10 to 30 μM, more preferably about 10 to 20 μM with respect to the nitric oxide to be measured.
When measuring a biological sample or the like, it is preferable to add an amount of about 10 to 20 μM to the sample, but generally, a necessary amount of oxygen source is supplied by dissolved oxygen. If the amount of the oxygen source is extremely small, the measurement sensitivity may decrease, and if the amount of the oxygen source is extremely large, there may be a problem in the emission of light by fluorescence. Therefore, it is preferable to predict the amount of nitric oxide to be measured by a preliminary test or a known method and add an oxygen source in an appropriate concentration range. The reaction can be carried out in the temperature range of 10 to 25 ° C. Regarding the method for measuring nitric oxide using a fluorescent probe, Tetsuo Nagano et al., Chemistry and Education, 4
7, pp. 665-669, 1999 and the like, those skilled in the art can measure nitric oxide with high sensitivity using the compound of the present invention with reference to the above publications.

【００２９】実施例 以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する
が、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはな
い。以下の実施例中、化合物番号は上記スキーム中の化
合物番号に対応させてある。 例１ (a)化合物(2)の製造 氷冷下、濃硫酸6 mLに発煙硝酸1 mLを3回に分けて加え
て混酸を調製し、そこへ4-アセトアミドベンズアルデヒ
ド(1.91 g, 11.7 mmol)を少量ずつ加えた。添加終了
後、直ちに反応混合物を氷にあけ、析出晶を濾取した
後、冷水でよく洗浄して乾燥した。シリカゲルカラムク
ロマトグラフィー (展開溶媒; ジクロルメタン)で精製
し、水より再結晶して淡黄色の針状固体を得た(1.57 g,
収率64%)。¹ H-NMR (300MHz, CDCl₃) δ 2.36 (3H, s), 8.16 (1
H, dd, J=8.79, 1.65Hz),8.74 (1H, d, J=1.65Hz), 9.0
4 (1H, d, J=8.79Hz), 9.99 (1H,s), 10.63 (1H,s) MS(El) 208 (M⁺) m.p. 156℃EXAMPLES The present invention will be described in more detail below with reference to examples, but the scope of the present invention is not limited to the following examples. In the examples below, the compound numbers correspond to the compound numbers in the above scheme. Example 1 (a) Production of compound (2) Under ice-cooling, mixed acid was prepared by adding fuming nitric acid (1 mL) to concentrated sulfuric acid (6 mL) in 3 portions, and 4-acetamidobenzaldehyde (1.91 g, 11.7 mmol) was prepared. Was added in small portions. Immediately after completion of the addition, the reaction mixture was poured into ice, and the precipitated crystals were collected by filtration, washed well with cold water and dried. It was purified by silica gel column chromatography (developing solvent; dichloromethane) and recrystallized from water to obtain a pale yellow needle-shaped solid (1.57 g,
Yield 64%). ¹ H-NMR (300MHz, CDCl ₃ ) δ 2.36 (3H, s), 8.16 (1
H, dd, J = 8.79, 1.65Hz), 8.74 (1H, d, J = 1.65Hz), 9.0
4 (1H, d, J = 8.79Hz), 9.99 (1H, s), 10.63 (1H, s) MS (El) 208 (M ⁺ ) mp 156 ℃

【００３０】(b)化合物(3)の製造 化合物(2) (953 mg, 4.58 mmol)と2,4-ジメチルピロー
ル (0.94 mL, 9.16 mmol)を250 mLのジクロルメタンに
溶解し、アルゴン気流下で数滴のトリフルオロ酢酸を加
え、室温で一晩遮光して攪拌した。薄層クロマトグラフ
ィー(展開溶媒; ジクロルメタン, シリカゲル)で原料消
失を確認した後、DDQ (2,3-ジクロロ-5,6-ジシアノ-1,4
-ベンゾキノン, 1.07 g, 4.58 mmol)のジクロルメタン
溶液120 mLを加えた。15分攪拌後、水で一回洗い、無水
硫酸マグネシウムで乾燥して溶媒を減圧留去した。残渣
をアルミナカラムクロマトグラフィー (展開溶媒; ジク
ロルメタン)で精製して褐色固体 を得た(442 mg, 収率2
6%)。¹ H-NMR (300MHz, CDCl₃) δ 1.35 (6H, s), 2.33 (3
H, s), 2.35 (6H, s), 5.91 (2H, s), 7.60 (1H, dd, J
=8.61, 2.01Hz), 8.20 (1H, d, J=2.01Hz), 8.93(1H,
d, J=8.61Hz), 10.46 (1H, s) MS(El) 378 (M⁺)(B) Production of compound (3) Compound (2) (953 mg, 4.58 mmol) and 2,4-dimethylpyrrole (0.94 mL, 9.16 mmol) were dissolved in 250 mL of dichloromethane, and the mixture was dissolved under an argon stream. A few drops of trifluoroacetic acid were added, and the mixture was stirred overnight at room temperature in the dark. After confirming the disappearance of the raw materials by thin-layer chromatography (developing solvent; dichloromethane, silica gel), DDQ (2,3-dichloro-5,6-dicyano-1,4
120 mL of a solution of benzoquinone, 1.07 g, 4.58 mmol) in dichloromethane was added. After stirring for 15 minutes, the mixture was washed once with water, dried over anhydrous magnesium sulfate, and the solvent was distilled off under reduced pressure. The residue was purified by alumina column chromatography (developing solvent; dichloromethane) to give a brown solid (442 mg, yield 2
6%). ¹ H-NMR (300MHz, CDCl ₃ ) δ 1.35 (6H, s), 2.33 (3
H, s), 2.35 (6H, s), 5.91 (2H, s), 7.60 (1H, dd, J
= 8.61, 2.01Hz), 8.20 (1H, d, J = 2.01Hz), 8.93 (1H,
d, J = 8.61Hz), 10.46 (1H, s) MS (El) 378 (M ⁺ )

【００３１】(c)化合物(4)の製造 化合物(3) (285 mg, 0.75 mmol)をメタノール 20 mLに
溶かし、この溶液に1N HCl 20 mLを加え、100℃で1時間
加熱還流した。反応液を冷却後、2N NaOHで中和し、水
層をジクロルメタンで5回抽出した。ジクロルメタン層
を合わせて無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧留
去して褐色固体を得た(250 mg, 収率99%)。¹ H-NMR (300MHz, CDCl₃) δ 1.46 (6H, s), 2.34 (6H,
s), 5.91 (2H, s), 6.17 (2H, s), 6.90 (1H, d, J=8.
43Hz), 7.29 (1H, dd, J=8.43, 1.83Hz), 8.09 (1H, d,
J=1.83Hz) MS(El) 336 (M⁺)(C) Production of Compound (4) Compound (3) (285 mg, 0.75 mmol) was dissolved in 20 mL of methanol, 20 mL of 1N HCl was added to this solution, and the mixture was heated under reflux at 100 ° C. for 1 hour. The reaction solution was cooled, neutralized with 2N NaOH, and the aqueous layer was extracted 5 times with dichloromethane. The dichloromethane layers were combined and dried over anhydrous sodium sulfate, and the solvent was evaporated under reduced pressure to give a brown solid (250 mg, yield 99%). ¹ H-NMR (300MHz, CDCl ₃ ) δ 1.46 (6H, s), 2.34 (6H,
s), 5.91 (2H, s), 6.17 (2H, s), 6.90 (1H, d, J = 8.
43Hz), 7.29 (1H, dd, J = 8.43, 1.83Hz), 8.09 (1H, d,
J = 1.83Hz) MS (El) 336 (M ⁺ )

【００３２】(d)化合物(5)の製造 化合物(4) (250 mg, 0.74 mmol)を濃塩酸を飽和させジ
クロルメタン 50 mLに溶解した。この溶液を氷冷下で20
分間攪拌した後、SnCl₂-2H₂O (3.35 g, 14.9 mmol)を加
え、室温で一晩攪拌した。薄層クロマトグラフィー(展
開溶媒; メタノール/ジクロルメタン= 1/9, アルミナ)
で反応の進行を確認した後、反応液を2N NaOHで3回洗い
塩基性にした。NaOH層を合わせてジクロルメタンで3回
抽出した。ジクロルメタン層を合わせて無水硫酸ナトリ
ウムで乾燥し、溶媒を減圧留去して茶褐色固体を得た(2
15 mg, 収率95%)。¹ H-NMR (300MHz, CDCl₃) δ 1.46 (6H, s), 2.33 (6H,
s), 3.39 (2H, s), 3.49(2H, s), 5.89 (2H, s), 6.62
(1H, dd, J=8.25, 1.83Hz), 6.63 (1H, d, J=1.83Hz),
6.75 (1H, d, J=8.25Hz) MS(El) 306 (M⁺)(D) Production of compound (5) Compound (4) (250 mg, 0.74 mmol) was saturated with concentrated hydrochloric acid and dissolved in 50 mL of dichloromethane. This solution is cooled under ice
After stirring for 1 minute, SnCl ₂ -2H ₂ O (3.35 g, 14.9 mmol) was added, and the mixture was stirred at room temperature overnight. Thin layer chromatography (developing solvent; methanol / dichloromethane = 1/9, alumina)
After confirming the progress of the reaction with, the reaction solution was washed with 2N NaOH three times to make it basic. The NaOH layers were combined and extracted 3 times with dichloromethane. The dichloromethane layers were combined and dried over anhydrous sodium sulfate, and the solvent was distilled off under reduced pressure to obtain a brown solid (2
15 mg, yield 95%). ¹ H-NMR (300MHz, CDCl ₃ ) δ 1.46 (6H, s), 2.33 (6H,
s), 3.39 (2H, s), 3.49 (2H, s), 5.89 (2H, s), 6.62
(1H, dd, J = 8.25, 1.83Hz), 6.63 (1H, d, J = 1.83Hz),
6.75 (1H, d, J = 8.25Hz) MS (El) 306 (M ⁺ )

【００３３】(e)化合物(6) 化合物(5) (129 mg, 0.42 mmol)を20 mLのジクロルメタ
ンに溶解した。アルゴン気流下でDIEA (ジイソプロピル
エチルアミン, 1 mL, 5.7 mmol)を加え、室温で10分間
攪拌した。さらにBF₃-OEt₂ (1 mL, 7.9 mmol)を加えて4
0分間攪拌したところ、少しして蛍光が現れた。反応終
了後、反応液を水で1回、2N NaOHで2回洗い、水層とNaO
H層を合わせてジクロルメタンで3回抽出する。全てのジ
クロルメタン層を合わせて、無水硫酸ナトリウムで乾燥
して溶媒を減圧留去した。残渣をアルミナカラムクロマ
トグラフィー (展開溶媒; メタノール/ジクロルメタン=
1/20)で精製して橙色固体を得た(105 mg, 収率71%)。¹ H-NMR (300MHz, CD₃OD) δ 1.56 (6H,s), 2.46 (6H,
s), 6.01 (2H,s), 6.47 (1H, dd, J=7.86, 1.83Hz), 6.
60 (1H, d, J=1.83Hz), 6.83 (1H, d, J=7.86Hz) MS(El) 354 (M⁺)(E) Compound (6) The compound (5) (129 mg, 0.42 mmol) was dissolved in 20 mL of dichloromethane. DIEA (diisopropylethylamine, 1 mL, 5.7 mmol) was added under an argon stream, and the mixture was stirred at room temperature for 10 minutes. BF ₃ -OEt ₂ (1 mL, 7.9 mmol) was further added to add 4
After stirring for 0 minutes, fluorescence appeared after a while. After the reaction was completed, the reaction solution was washed once with water and twice with 2N NaOH, and the aqueous layer and NaO
The H layers are combined and extracted 3 times with dichloromethane. All the dichloromethane layers were combined, dried over anhydrous sodium sulfate, and the solvent was distilled off under reduced pressure. The residue was subjected to alumina column chromatography (developing solvent; methanol / dichloromethane =
Purification by 1/20) gave an orange solid (105 mg, yield 71%). ¹ H-NMR (300MHz, CD ₃ OD) δ 1.56 (6H, s), 2.46 (6H,
s), 6.01 (2H, s), 6.47 (1H, dd, J = 7.86, 1.83Hz), 6.
60 (1H, d, J = 1.83Hz), 6.83 (1H, d, J = 7.86Hz) MS (El) 354 (M ⁺ )

【００３４】(f)化合物(7) 化合物(6) (50 mg, 0.14 mmol)に2N HClを25 mL加え、
氷冷下で攪拌しながらNaNO₂ (10 mg, 0.15 mmol)の水溶
液を少量ずつ加えた。添加終了後、反応液を室温に戻し
て15分間攪拌した。反応液をジクロルメタンで3回抽出
し、無水硫酸ナトリウムで乾燥して溶媒を減圧留去し
た。残渣を分取クロマトグラフィー (展開溶媒; アセト
ニトリル/水= 1/1, 0.1% トリフルオロ酢酸)で精製して
赤褐色固体を得た(15 mg, 収率29%)。¹ H-NMR (300MHz, CDCl₃) δ 1.26 (6H, s), 2.57 (6
H, s), 5.99 (2H, s), 7.41 (1H, d, J=8.43Hz), 7.87
(1H, s), 8.07 (1H, d, J=8.43Hz) MS(El) 365 (M⁺)(F) Compound (7) To the compound (6) (50 mg, 0.14 mmol), 25 mL of 2N HCl was added,
An aqueous solution of NaNO ₂ (10 mg, 0.15 mmol) was added little by little while stirring under ice cooling. After the addition was completed, the reaction solution was returned to room temperature and stirred for 15 minutes. The reaction solution was extracted 3 times with dichloromethane, dried over anhydrous sodium sulfate, and the solvent was distilled off under reduced pressure. The residue was purified by preparative chromatography (developing solvent; acetonitrile / water = 1/1, 0.1% trifluoroacetic acid) to obtain a reddish brown solid (15 mg, yield 29%). ¹ H-NMR (300MHz, CDCl ₃ ) δ 1.26 (6H, s), 2.57 (6
H, s), 5.99 (2H, s), 7.41 (1H, d, J = 8.43Hz), 7.87
(1H, s), 8.07 (1H, d, J = 8.43Hz) MS (El) 365 (M ⁺ )

【００３５】例２：試験例 (a)蛍光スペクトル 化合物(6)及び化合物(7)の蛍光特性を測定した。量子収
率はF-4500 (日立)、それ以外のスペクトルはLS50B (Pe
rkin Elmer)で測定した。化合物(6)はジメチルスルホキ
シドを共溶媒として 0.1 M ナトリウム-リン酸バッファ
ー (pH 6.5)に溶解して20℃で測定した。量子収率は0.1
M NaOH水溶液中でのフルオレセインを0.85として算出し
た。その結果、化合物(6)及び化合物(7)のモル吸光係数
はそれぞれ9.0(496 nm)及び6.0（499 nm）（×10000/M/
cm、カッコ内は波長）であり、化合物(7)の最大蛍光波
長は507 nmであった。また、化合物(6)及び化合物(7)の
蛍光量子収率はそれぞれ0.001及び0.51であった。Example 2: Test Example (a) Fluorescence spectrum The fluorescence characteristics of compound (6) and compound (7) were measured. The quantum yield is F-4500 (Hitachi), and other spectra are LS50B (Pe
rkin Elmer). Compound (6) was dissolved in 0.1 M sodium-phosphate buffer (pH 6.5) using dimethyl sulfoxide as a cosolvent, and measured at 20 ° C. Quantum yield is 0.1
It was calculated by setting fluorescein in M NaOH aqueous solution to 0.85. As a result, the molar extinction coefficients of compound (6) and compound (7) were 9.0 (496 nm) and 6.0 (499 nm) (× 10000 / M /
cm, wavelength in parentheses), and the maximum fluorescence wavelength of compound (7) was 507 nm. The fluorescence quantum yields of the compound (6) and the compound (7) were 0.001 and 0.51, respectively.

【００３６】(b)一酸化窒素との反応 化合物(6)に一酸化窒素発生試薬であるNOC 13を添加し
て励起及び蛍光スペクトルの変化を測定した。化合物
(6)の10 μM溶液 (0.2% DMSO 共溶媒)にNOC 13を添加し
て37 ℃で1時間インキュベートしてから励起及び蛍光ス
ペクトルを測定した。測定はスリット幅をEx/Em = 7.5/
5.0 nmとし、励起波長を485 nm、蛍光波長を525 nmとし
て行った。極大からずらして測定しているのは散乱光の
影響を除くためである。結果を図１に示す。NOC 13の添
加濃度に依存して蛍光の増加が認められた。(B) Reaction with Nitric Oxide NOC 13 which is a nitric oxide generating reagent was added to the compound (6) to measure changes in excitation and fluorescence spectra. Compound
NOC 13 was added to a 10 μM solution of (6) (0.2% DMSO cosolvent), incubated at 37 ° C. for 1 hour, and then excitation and fluorescence spectra were measured. For the measurement, the slit width is Ex / Em = 7.5 /
The wavelength was set to 5.0 nm, the excitation wavelength was set to 485 nm, and the fluorescence wavelength was set to 525 nm. The reason why the measurement is deviated from the maximum is to eliminate the influence of scattered light. The results are shown in Fig. 1. An increase in fluorescence was observed depending on the concentration of NOC 13 added.

【００３７】(c)活性酸素種との反応性 化合物(6)の10 μM 溶液 (0.2% DMSO 共溶媒)に活性酸
素種を3分後に添加して、30分測定した。活性酸素種と
しては、一酸化窒素 (NO)、過酸化水素水(H₂O₂)、ヒド
ロキシルラジカル(・OH)を用いた。測定はスリット幅をE
x/Em = 5.0/2.5 nmとし、励起波長を495 nm、蛍光波長
を512 nmとして行った。これらの活性酸素種のほか、NO
から変化したNO₂ ^-やNO₃ ^-についても測定を行った。NOと
しては飽和NO水溶液 (1.9 mM)を10μL加え、H₂O₂は最終
濃度が1 mMになるように過酸化水素を加えた。・OHは1分
後に最終濃度が1 mMになるように過酸化水素を加え、そ
の2分後に最終濃度が100 μMになるように過塩素酸第一
鉄を加えた。NO₂ ^-及びNO₃ ^-は、最終濃度が100 μMにな
るようにそれぞれNaNO₂、NaNO₃を加えた。結果を図２に
示す。化合物(6)は一酸化窒素のみで顕著な蛍光の増加
を与えたが、それ以外の反応種とは全く反応せず、蛍光
の増加は認められなかった。(C) Reactive Oxygen Species Reactive oxygen species were added to a 10 μM solution (0.2% DMSO cosolvent) of the compound (6) after 3 minutes and measured for 30 minutes. Nitrogen monoxide (NO), hydrogen peroxide solution (H ₂ O ₂ ), and hydroxyl radical (.OH) were used as the active oxygen species. The slit width is measured by E
x / Em = 5.0 / 2.5 nm, the excitation wavelength was 495 nm, and the fluorescence wavelength was 512 nm. In addition to these reactive oxygen species, NO
Changed from NO ₂ ^- and NO ₃ ^- were also measured. As NO, 10 μL of saturated NO aqueous solution (1.9 mM) was added, and hydrogen peroxide was added to H ₂ O _{2 so} that the final concentration was 1 mM. -For OH, hydrogen peroxide was added to the final concentration of 1 mM after 1 minute, and ferrous perchlorate was added to the final concentration of 100 µM after 2 minutes. For NO ₂ ⁻ and NO ₃ ⁻ , NaNO ₂ and NaNO ₃ were added so that the final concentration was 100 μM. The results are shown in Figure 2. Compound (6) gave a remarkable increase in fluorescence only with nitric oxide, but it did not react with any other reactive species, and no increase in fluorescence was observed.

【００３８】[0038]

【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

【図１】 化合物(6)にNOC 13を添加して励起及び蛍光
スペクトルの変化を測定した結果を示した図である。図
中、(A)は励起スペクトル（Em: 525 nm）、(B)は蛍光ス
ペクトル(Ex: 485 nm)を示す。蛍光強度の高い曲線から
順にNOC 13濃度が2.0μM、1.0μM、0.50μM、0.33μM、
及び0μMの場合の結果を示す。FIG. 1 is a diagram showing the results of measuring changes in excitation and fluorescence spectra obtained by adding NOC 13 to compound (6). In the figure, (A) shows the excitation spectrum (Em: 525 nm) and (B) shows the fluorescence spectrum (Ex: 485 nm). The NOC 13 concentration is 2.0 μM, 1.0 μM, 0.50 μM, 0.33 μM, in order from the highest fluorescence intensity curve.
And the results for 0 μM are shown.

【図２】 化合物(6)に一酸化窒素のほか、各種の活性
酸素種を反応させた結果を示した図である。一酸化窒素
のみが時間経過とともに顕著な蛍光の増加を与えてお
り、それ以外の反応種では蛍光の増加が認められない。FIG. 2 is a diagram showing the results of reacting compound (6) with various active oxygen species in addition to nitric oxide. Only nitric oxide gives a remarkable increase in fluorescence with the passage of time, and no increase in fluorescence is observed in other reactive species.

フロントページの続き (72)発明者 浦野 泰照 神奈川県川崎市高津区末長498 ドミール 梶ヶ谷204 (72)発明者 長野 哲雄 東京都杉並区天沼１−28−15 Ｆターム(参考） 2G042 AA01 BB07 CA10 CB06 DA08 FA13 FB02 GA05 HA07 2G054 AA01 CA06 CE02 EA03 FB01 GA04 4H048 AA01 AA03 AB81 VA75 VB90Continued front page    (72) Inventor Yasuhisa Urano             498 Suenaga, Takatsu Ward, Kawasaki City, Kanagawa Prefecture             Kajigaya 204 (72) Inventor Tetsuo Nagano             1-28-15 Amanuma, Suginami-ku, Tokyo F term (reference) 2G042 AA01 BB07 CA10 CB06 DA08                       FA13 FB02 GA05 HA07                 2G054 AA01 CA06 CE02 EA03 FB01                       GA04                 4H048 AA01 AA03 AB81 VA75 VB90

Claims (6)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 下記の一般式(Ｉ)： 【化１】 （式中、R¹及びR²はそれぞれフェニル環上の隣接した位
置に置換するアミノ基を示し、該アミノ基のいずれか１
つは置換基を有していてもよいアルキル基を１個有して
いてもよく；R³及びR⁴はそれぞれ独立に水素原子、C_1-6
アルキル基、又はC_1-6アルコキシ基を示し、R⁵及びR⁸は
それぞれ独立に置換基を有していてもよいC_1-6アルキル
基を示し、R⁶及びR⁹はそれぞれ独立に水素原子、置換基
を有していてもよいC_1-6アルキル基、カルボキシル基、
C_1-6アルコキシカルボニル基、又はスルホン酸基を示す
が、R⁶はR⁵と一緒になってそれらが結合する２個の炭素
原子とともに縮合アリール環を形成してもよく（該アリ
ール環は置換基を有していてもよい）、及び／又はR⁹は
R⁸と一緒になってそれらが結合する２個の炭素原子とと
もに縮合アリール環を形成してもよく（該アリール環は
置換基を有していてもよい）、R⁷及びR¹⁰はそれぞれ独
立に置換基を有していてもよいC_1-6アルキル基、アリー
ル基、C_1-6アルコキシカルボニル基、又は置換基を有し
ていてもよいビニル基を示す）で表される化合物又はそ
の塩。1. The following general formula (I): (In the formula, R ¹ and R ² each represent an amino group which is substituted at an adjacent position on the phenyl ring, and any one of the amino groups
May have one alkyl group which may have a substituent; R ³ and R ⁴ are each independently a hydrogen atom, C _1-6
An alkyl group or a C _1-6 alkoxy group, R ⁵ and R ⁸ each independently represent a C _1-6 alkyl group which may have a substituent, and R ⁶ and R ⁹ each independently represent hydrogen. Atom, a C _1-6 alkyl group which may have a substituent, a carboxyl group,
A C _1-6 alkoxycarbonyl group or a sulfonic acid group is shown, but R ⁶ may form a condensed aryl ring together with R ⁵ together with the two carbon atoms to which they are bound (the aryl ring is May have a substituent), and / or R ⁹ is
A fused aryl ring may be formed together with R ⁸ and two carbon atoms to which they are bonded (the aryl ring may have a substituent), and R ⁷ and R ¹⁰ are each independently A C _1-6 alkyl group optionally having a substituent, an aryl group, a C _1-6 alkoxycarbonyl group, or a vinyl group optionally having a substituent) or a compound thereof salt. 【請求項２】 R⁶及びR⁹が水素原子であり、R⁵、R⁷、
R⁸、及びR¹⁰がメチル基である請求項１に記載の化合物
又はその塩。2. R ⁶ and R ⁹ are hydrogen atoms, and R ⁵ , R ⁷ ,
The compound or salt thereof according to claim 1, wherein R ⁸ and R ¹⁰ are methyl groups. 【請求項３】 請求項１又は２に記載の化合物又はその
塩を含む一酸化窒素測定用試薬。3. A reagent for measuring nitric oxide, which comprises the compound according to claim 1 or 2, or a salt thereof. 【請求項４】 下記の一般式(II): 【化２】 ［式中、R¹¹及びR¹²は互いに結合してフェニル環上の隣
接した位置に環を形成する-N=N-NR³⁰- (式中、R³⁰は水
素原子又は置換基を有していてもよいアルキル基を示
す)で表される基を示すか、又はR¹¹及びR¹²はフェニル
環上の隣接した位置に置換するアミノ基（置換基を有し
ていてもよいアルキル基又はアミノ基の保護基を有して
いてもよい）及びニトロ基の組み合わせを示し；R¹³及
びR¹⁴はそれぞれ独立に水素原子、C_1-6アルキル基、又
はC_1-6アルコキシ基を示し、R¹⁵及びR¹⁸はそれぞれ独立
に置換基を有していてもよいC_1-6アルキル基を示し、R
¹⁶及びR¹⁹はそれぞれ独立に置換基を有していてもよいC
_1-6アルキル基、カルボキシル基、C_1-6アルコキシカル
ボニル基、又はスルホン酸基を示すが、R¹⁶はR¹⁵と一緒
になってそれらが結合する２個の炭素原子とともに縮合
アリール環を形成してもよく（該アリール環は置換基を
有していてもよい）、及び／又はR¹⁹はR¹⁸と一緒になっ
てそれらが結合する２個の炭素原子とともに縮合アリー
ル環を形成してもよく（該アリール環は置換基を有して
いてもよい）、R¹⁷及びR²⁰はそれぞれ独立に置換基を有
していてもよいC_1-6アルキル基、アリール基、C_1-6アル
コキシカルボニル基、又は置換基を有していてもよいビ
ニル基を示す］で表される化合物又はその塩。4. The following general formula (II): [In the formula, R ¹¹ and R ¹² are bonded to each other to form a ring at an adjacent position on the phenyl ring, -N = N-NR ^30- (wherein, R ³⁰ has a hydrogen atom or a substituent) Optionally represents an alkyl group), or R ¹¹ and R ¹² are amino groups that substitute at adjacent positions on the phenyl ring (an alkyl group or an amino group which may have a substituent). R ¹³ and R ¹⁴ each independently represent a hydrogen atom, a C _1-6 alkyl group, or a C _1-6 alkoxy group; ¹⁵ and R ¹⁸ each independently represent an optionally substituted C _1-6 alkyl group, R
¹⁶ and R ¹⁹ are each independently C which may have a substituent.
_1-6 alkyl group, carboxyl group, C _1-6 alkoxycarbonyl group, or sulfonic acid group, but R ¹⁶ together with R ¹⁵ forms a condensed aryl ring with the two carbon atoms to which they are bonded (Wherein the aryl ring may have a substituent) and / or R ¹⁹ together with R ¹⁸ form a fused aryl ring with the two carbon atoms to which they are attached. At best (the aryl ring may have a substituent group), R ¹⁷ and R ²⁰ are each independently optionally substituted C _1-6 alkyl group, an aryl group, C _1-6 An alkoxycarbonyl group or a vinyl group which may have a substituent], or a salt thereof. 【請求項５】 R¹⁶及びR¹⁹が水素原子であり、R¹⁵、
R¹⁷、R¹⁸、及びR²⁰がメチル基である請求項４に記載の
化合物又はその塩。5. R ¹⁶ and R ¹⁹ are hydrogen atoms, and R ¹⁵ and
The compound or a salt thereof according to claim 4, wherein R ¹⁷ , R ¹⁸ and R ²⁰ are methyl groups. 【請求項６】 一酸化窒素の測定方法であって、(a)請
求項１に記載の一般式(Ｉ)で示される化合物を一酸化窒
素と反応させる工程；及び、(b)上記工程(a)において生
成する請求項４に記載の一般式(II)の化合物［ただし、
R¹¹及びR¹²は互いに結合してフェニル環上の隣接した位
置に環を形成する-N=N-NR³⁰- (式中、R³⁰は水素原子又
は置換基を有していてもよいアルキル基を示す)で表さ
れる基を示す］を検出する工程を含む方法。6. A method for measuring nitric oxide, comprising: (a) reacting a compound represented by the general formula (I) according to claim 1 with nitric oxide; and (b) the above step ( The compound of the general formula (II) according to claim 4, which is produced in a)
R ¹¹ and R ¹² are bonded to each other to form a ring at an adjacent position on the phenyl ring —N═N—NR ³⁰ — (In the formula, R ³⁰ is a hydrogen atom or an optionally substituted alkyl group. [Indicating a group] (indicating a group).